ES2200150T3 - Procedimiento de cribaje de peptidos efectores transdominantes y moleculas de arn. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION FACILITA METODOS Y COMPOSICIONES PARA EL CRIBADO DE PEPTIDOS DIANA TRANSDOMINANTES Y MOLECULAS DE ADN SELECCIONADOS DEL INTERIOR DE CELULAS VIVAS A PARTIR DE DEPOSITOS ALEATORIOS.

Description

Procedimiento de cribaje de péptidos efectores transdominantes y moléculas de ARN.

Campo de la invención

La presente invención trata de los procedimientos para realizar un cribaje de péptidos efectores transdominantes, seleccionados de partir de mezclas aleatorias en las células vivas de mamíferos.

Antecedentes de la invención

A menudo, las vías de señalización en las células se inician con un estímulo efector que conduce a un cambio descriptible fenotípicamente en la fisiología de la célula. A pesar del papel clave desempeñado por las vías de señalización intracelular en la patogénesis de la enfermedad, en muchos casos, poco se sabe acerca de una vía de señalización distinta a la del estímulo inicial y la respuesta celular final.

Históricamente, la transducción de la señal se ha analizado bioquímica o genéticamente. La aproximación bioquímica disecciona una vía de manera "progresiva": hallar una molécula que actúe en, o esté implicada en, un extremo de la vía, aislar cantidades analizables y luego intentar determinar la próxima molécula en la vía, bien cadena arriba o cadena abajo de la molécula aislada. La aproximación genética es clásicamente un "disparo en la oscuridad": inducir u obtener mutantes en una vía de señalización y localizar el locus mediante cruzamiento genético, o complementar la mutación con una librería de cDNA. Las limitaciones de las aproximaciones bioquímicas incluyen una dependencia de la cantidad significativa del conocimiento pre-existente sobre los constituyentes del estudio y el requisito de realizar estos estudios in vitro, post-mortem. En las aproximaciones puramente genéticas, las limitaciones requieren en primer lugar encontrar la vía y luego caracterizarla antes de proceder con la identificación y el clonaje del gen.

El cribaje de librerías moleculares de compuestos químicos en busca de fármacos, que regulen los sistemas de señalización ha conducido a importantes descubrimientos de una gran relevancia clínica. La ciclosporina A (CsA) y el FK506, por ejemplo, se seleccionaron en cribajes farmacéuticos estándares para la inhibición de la activación de células T. Es de notar, que aunque estos dos fármacos se unen a proteínas celulares completamente distintas - ciclofilina y la proteína de unión FK506 (FKBP), respectivamente, el efecto de cualquiera de estos fármacos es virtualmente el mismo - supresión importante y específica de la activación de células T, observable fenotípicamente en las células T por la inhibición de la producción de mRNA dependiente de los factores de transcripción como el NF-AT y el NF-KB. También, se han cribado con éxito librerías de péptidos pequeños en ensayos in vitro de bioactividad. La bibliografía está repleta de ejemplos de péptidos pequeños capaces de modular una gran variedad de vías de señalización. Por ejemplo, se ha demostrado que un péptido obtenido de las proteínas de la cubierta de VIH-1 bloquea la acción de la calmodulina celular.

Una de las limitaciones importantes de los cribajes in vitro convencionales es la liberación de la molécula. Mientras que únicamente se necesitan cantidades muy pequeñas para modular una respuesta celular determinada, la liberación de una cantidad suficiente para localizar subcelularmente las moléculas requiere la exposición de la célula, o del sistema diana a concentraciones relativamente masivas del agente. El efecto de dichas concentraciones puede enmascarar o impedir la respuesta esperada.

Así, es un objetivo de la presente invención proporcionar los procedimientos y composiciones para la introducción eficaz de librerías aleatorias en las células con el fin de realizar un cribaje de compuestos bioactivos.

Bibliografía relevante

Mann y col. (1983) Cell 33, 153-159, Pear y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (18):8392-6 y WO 94/19478 describen el sistema retroviral BOSC y BING de utilidad como vectores de liberación para los procedimientos descritos.

Scott y Craig (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:40-48 presentan una revisión sobre librerías peptídicas aleatorias. Hupp y col. (1995) describen péptidos pequeños que inactivan la función latente de unión del DNA de secuencia específica de p53. Palzkill y col. (1994) describen la selección de sitios de corte de las señales funcionales de una librería de secuencias aleatorias introducidas en la TEM-1 lactamasa.

La patente internacional WO 95/04824 describe los procedimientos de generación y expresión de librerías de cDNA utilizando vectores retrovirales. La patente internacional WO 96/23899, referida en el Art54(3) EPC, describe un sistema de doble híbrido de levaduras en el que se selecciona un péptido aleatorio que se une a una proteína diana.

La patente internacional WO 96/38553, referida en el Art 54(3) EPC, describe los procedimientos de identificación de péptidos y ácidos nucleicos biológicamente activos.

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Resumen de la invención

La invención proporciona los procedimientos para el cribaje de péptidos generados de forma aleatoria, como por ejemplo los de utilización farmacológica. La invención proporciona el acceso a moléculas o dianas dentro de las células vivas de mamífero y proporciona la selección directa de aquellos péptidos con los efectos fenotípicos deseados.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de cribaje de un péptido generado de forma aleatoria, capaz de alterar el fenotipo de una célula de mamífero mediante la interacción con una molécula diana celular, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una pluralidad de células de mamífero que comprenda una librería retroviral conteniendo ácidos nucleicos candidatos y generados de forma aleatoria, en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácido nucleico diferente unida a una pareja de fusión que comprende, a su vez, una secuencia de presentación capaz de presentar los péptidos aleatorios expresados en una forma restringida conformacionalmente y en donde los mencionados ácidos nucleico se expresan para producir péptidos aleatorios;

(b) realizar un cribaje de la mencionada pluralidad para obtener una célula que presente un fenotipo alterado, en donde el mencionado fenotipo alterado es debido a la interacción de un péptido generado de forma aleatoria con una molécula diana celular; y

(c) aislar el mencionado péptido generado de forma aleatoria de dicha célula que presenta un fenotipo alterado.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para el cribaje de un péptido generado de forma aleatoria, capaz de alterar el fenotipo de una célula de mamífero mediante la interacción con una molécula diana celular, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una librería retroviral que comprende ácidos nucleicos generados de forma aleatoria en una primera pluralidad de células de mamífero, en donde cada uno de los mencionados ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácido nucleico distinta unida a una pareja de fusión, que a su vez comprende una secuencia de presentación capaz de presentar los péptidos expresados y generados de forma aleatoria en una forma restringida conformacionalmente, y en donde los mencionados ácidos nucleicos se expresan para producir los péptidos generados de forma aleatoria;

(b) contactar dicha primera pluralidad de células con una segunda pluralidad de células;

(c) realizar un cribaje de la mencionada pluralidad de células para obtener una célula que presente un fenotipo alterado, en donde dicho fenotipo alterado es debido a la interacción de un primer péptido generado de forma aleatoria con una molécula diana celular; y

(d) aislar dicho péptido generado de forma aleatoria a partir de la mencionada célula que presenta un fenotipo alterado.

Descripción resumida de las figuras

Figura 1. Creación mediante PCR de una librería de péptidos aleatorios en una construcción de DNA retroviral.

Figura 2. Creación mediante síntesis cebada de DNA de una librería de péptidos aleatorios en una construcción de DNA retroviral.

Figura 3. Construcciones para la localización de las estructuras de presentación en sitios celulares específicos.

Figura 4. Esquema de una construcción retroviral.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona los procedimientos para introducir eficazmente en las células de mamífero péptidos generados de forma aleatoria y para realizar el cribaje de los que afecten una vía de señalización. No se necesita un conocimiento previo sobre la vía de señalización, exceptuando el suceso presumible de señalización y de un cambio fisiológico observable en la célula diana. Los procedimientos descritos se diferencian conceptualmente de los procedimientos de búsqueda de la librería anterior, en que son una estratagema in vivo para acceder a los mecanismos de señalización intracelular. La invención proporciona también los procedimientos de aislamiento de los constituyentes de la vía, las herramientas para caracterizar la vía y los compuestos principales para el desarrollo farmacéutico.

La presente invención proporciona los procedimientos para el cribaje de los péptidos generados de forma aleatoria que son capaces de alterar el fenotipo de las células de mamífero que los contienen. Los procedimientos de la presente invención proporcionan una mejora significativa sobre las técnicas de cribaje convencionales, ya que permiten el cribaje rápido de un gran número de péptidos generados de forma aleatoria en una sola etapa in vivo. Así, liberando los oligonucleótidos aleatorios a las células y seleccionando estas células, sin necesidad de recoger o sintetizar in vitro los péptidos generados de forma aleatoria, se realiza un cribaje altamente eficiente. Además, los procedimientos actuales permiten el cribaje en ausencia de una caracterización previa significativa del defecto celular per se.

Por ello, la presente invención proporciona los procedimientos de cribaje para péptidos generados de forma aleatoria capaces de alterar el fenotipo de una célula. En esta patente, el término "agente bioactivo" se utiliza para referirse a los péptidos generados de forma aleatoria utilizados en los procedimientos de cribaje de la presente invención.

En general, se pueden utilizar péptidos generados de forma aleatoria de un tamaño aproximado de 4 a 100 aminoácidos, prefiriéndose los péptidos de entre 5 a aproximadamente 50 aminoácidos, más preferentemente los péptidos de 5 a aproximadamente 30 y especialmente los de 6 a 20 aminoácidos.

Como mínimo, cada péptido aleatorio tiene una porción generada de forma aleatoria, tal como se define más adelante, que es la base de los procedimientos de cribaje aquí descritos y una pareja de fusión que comprende una secuencia de presentación. Además de la porción generada de forma aleatoria, el péptido aleatorio candidato también puede incluir una pareja de fusión que tenga una función adicional, tal como se describe más adelante.

El término "pareja de fusión" o "grupo funcional" hace referencia a una secuencia que está asociada con el péptido candidato aleatorio y confiere a todos los miembros de la librería de dicha clase una función o capacidad común. Las parejas de fusión pueden ser heterólogas (es decir, no originarias de la célula huésped), o sintéticas (no originarias de ninguna célula). Las parejas de fusión adecuadas incluyen, sin limitarse a, lo siguiente: a) estructuras de presentación, tal como se definirá más adelante, que proporcionan los péptidos aleatorios candidatos en una forma conformational restringida o estable; b) secuencias diana, definidas más adelante, que permiten la localización de los péptidos aleatorios candidatos en un compartimiento subcelular o extracelular; c) secuencias de rescate tal cómo se define más adelante, que permiten la purificación o aislamiento de cualquiera de los péptidos aleatorios candidatos; d) secuencias de estabilidad, que confieren a los péptidos aleatorios candidatos estabilidad o protección frente a la degradación, por ejemplo, la resistencia a la degradación proteolítica; e) secuencias de dimerización, para permitir la dimerización del péptido; o f) cualquier combinación de a), b), c), d) y e), así como las secuencias de unión si es necesario.

Tal como se mencionó anteriormente, los procedimientos que se describen aquí utilizan una pareja de fusión que es una estructura de presentación. El término "estructura de presentación" o sus equivalentes gramaticales hacen referencia a una secuencia que, al fusionarse con los péptidos aleatorios candidatos, provoca que éstos péptidos asuman una forma conformacional restringida. Las proteínas interactúan unas con otras a través de sus dominios restringidos conformacionalmente. Aunque los péptidos pequeños con extremos amino y carboxilo de rotación libre pueden tener funciones potentes, tal como se conoce en la materia, la conversión de estas estructuras peptídicas en agentes farmacológicos es difícil, debido a la incapacidad para predecir las posiciones de las cadenas laterales en la síntesis péptido-mimética. En consecuencia, la presentación de los péptidos en las estructuras restringidas conformacionalmente beneficiará tanto la generación posterior de los fármacos, como conducirá probablemente a interacciones de mayor afinidad del péptido con la proteína diana. Ello se ha tenido en cuenta en los sistemas de generación de librerías combinatoriales utilizando péptidos cortos generados biológicamente en sistemas de fagos bacterianos. Varios investigadores han construido moléculas de dominios pequeños en donde se pueden presentar las estructuras peptídicas generadas de forma aleatoria.

Así, las estructuras de presentación sintéticas, es decir los polipéptidos artificiales, son capaces de presentar un péptido aleatorio como un dominio restringido conformacionalmente. En general, dichas estructuras de presentación comprenden una primera porción unida al extremo N-terminal del péptido aleatorio y una segunda porción unida al extremo C-terminal del péptido; es decir, el péptido se inserta en la estructura de presentación, aunque se pueden realizar variaciones, tal como se indica más adelante. Para incrementar el aislamiento funcional del producto de expresión aleatorio, las estructuras de presentación se seleccionan o diseñan para conseguir una actividad biológica mínima cuando se expresen en la célula diana.

La estructura de presentación preferida maximiza la accesibilidad del péptido exponiéndolo en un bucle exterior. Según ello, las estructuras de presentación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, estructuras de minicuerpos, bucles en giros de hoja-beta y estructuras súper enrolladas en donde los residuos no críticos de la estructura son aleatorios, dominios de dedos de zinc, estructuras unidas por cisteínas (puentes disulfuros), estructuras unidas a transglutaminasas, péptidos cíclicos, estructuras de bucles-B, barriles o haces, motivos de cremalleras de leucina, etc.

En una realización preferida, la estructura de presentación es una estructura súper-enrollada, lo que permite la presentación del péptido aleatorio en un bucle exterior. Ver, por ejemplo, Myszka y col., Biochem. 33:2362-2373 (1994), incorporado aquí mediante referencias y la Figura 3. Utilizando este sistema, se han aislado péptidos capaces de interaccionar con la diana adecuada con una elevada afinidad. En general, las estructuras súper-enrolladas permiten entre unas 6 a 2b posiciones generadas de forma aleatoria.

Una de las estructuras de presentación súper-enrollada preferidas es la siguiente: MGCAALESEVSALESEVAS LESEVAAL GRDMP LAAVKS KLSAVKSLASVKSKLAA CGPP. Las regiones subrayadas representan una región de cremalleras de leucina súper-enrolladas, definida anteriormente (ver Martin y col., EMBO J 13(22):5303-5309 (1994), incorporado aquí mediante referencias). La región en negrita GRDMP representa la estructura del bucle y cuando se reemplaza con los péptidos aleatorios adecuados (es decir, los agentes bioactivos candidatos, generalmente indicados aquí como (X)_{n}, en donde X es un residuo aminoacídico y n es un número entero de por lo menos 5 o 6 aminoácidos), puede ser de longitud variable. El reemplazo de la región en negrita se facilita mediante dianas de endonucleasas de restricción codificadas en las regiones subrayadas, que permiten la incorporación directa de oligonucleótidos aleatorios en estas posiciones. Por ejemplo, una realización preferida genera una diana XhoI en el sitio LE subrayado en doble y una diana HindIII en el sitio KL subrayado en doble.

En una realización preferida, la estructura de presentación es una estructura de minicuerpo. Un "minicuerpo" está compuesto esencialmente de una región mínima complementaria del anticuerpo. La estructura de presentación de minicuerpos proporciona generalmente dos regiones aleatorias que en la proteína plegada se presentan en una sola cara de la estructura terciaria. Ver, por ejemplo Bianchi y col., J Mol Biol 236(2):649-59 (1994) y las referencias allí citadas, habiéndose incorporado todas ellas como referencias). Los investigadores han demostrado que este dominio mínimo es estable en solución y se han utilizado sistemas de selección de fagos en las librerías combinatoriales para seleccionar minicuerpos con las regiones peptídicas que presentan una elevada afinidad, Kd=10^{-7}, para la citoquina pro-inflamatoria IL-6.

Una de las estructuras preferidas de presentación de minicuerpos es la siguiente: MGRNSQATSGFT F SHFYMEW
VRGGEYIAASRHKHNKYTTEYSASVKGRYIVSRDTS QSILYLQKKKGPP. Las regiones subrayadas, en negrita, son las regiones que pueden generarse de forma aleatoria. La fenilalanina en cursiva debe ser invariable en la primera región de generación de forma aleatoria. El péptido entero se clona en una variación de tres oligonucleótidos de la realización súper-enrollada, permitiendo así que se incorporen simultáneamente dos regiones de generación aleatoria distintas simultáneamente. Esta realización utiliza dianas BstXI no-palindrómicas en los extremos.

En una realización preferida, la estructura de presentación es una secuencia que contiene generalmente dos residuos de cisteína, para que pueda formarse un enlace disulfuro, dando como resultado una secuencia restringida conformacionalmente. Esta realización se prefiere, en particular, cuando se utilizan secuencias de direccionamiento secretoras. Como se apreciará por los expertos en la materia, cualquiera de las secuencias aleatorias, con o sin secuencias espaciadoras o de unión, puede estar flanqueada por residuos de cisteína. En otras realizaciones, pueden generarse, por las propias regiones aleatorias, estructuras de presentación eficaces. Por ejemplo, las regiones aleatorias pueden estar "dopadas" con residuos de cisteína y en condiciones redox adecuadas, pueden dar como resultado conformaciones estructuradas altamente unidas, parecidas a las estructuras de presentación. De modo similar, las regiones generadas de forma aleatoria pueden controlarse para que contengan un cierto número de residuos con el fin de proporcionar estructuras en hoja-\beta, o hélice-\alpha.

En algunas realizaciones, la pareja de fusión puede también comprender una secuencia de direccionamiento. Tal como se apreciará por los expertos en la materia, la localización de proteínas dentro de una célula es un procedimiento sencillo para incrementar la concentración efectiva y la función determinante. Por ejemplo, el RAF1, cuando se localiza en la membrana mitocondrial, puede inhibir el efecto efector anti-apoptótico de BCL-2. De modo similar, Sos unido a la membrana induce la señalización en linfocitos T mediada por Ras. Estos mecanismos, se cree que están basados en el principio de limitación del espacio de búsqueda de los ligandos, es decir, la localización de una proteína en la membrana plasmática limita la búsqueda de su ligando, ya que el espacio dimensional próximo a la membrana está más limitado, al contrario que el espacio tridimensional del citoplasma. Alternativamente, la concentración de una proteína puede también estar simplemente aumentada por la naturaleza de la localización. El transporte de las proteínas al núcleo las confina en un espacio menor, con lo que se incrementa su concentración. Por último, el ligando o la diana pueden localizarse en un compartimiento específico y los inhibidores deben de estar localizados adecuadamente.

Así, las secuencias de direccionamiento adecuadas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de unión capaces de provocar la unión del producto expresado con una molécula, o clase de moléculas, predeterminada mientras se retenga la bioactividad del producto de expresión (por ejemplo, utilizando un inhibidor enzimático o secuencias sustrato para marcar una clase de enzimas relevantes); secuencias de señalización de degradación selectiva, de las propias o proteínas co-unidas; y secuencias señal capaces de localizar constitutivamente los productos de expresión candidatos para una localización celular predeterminada, incluyendo: a) localizaciones subcelulares como el aparato de Golgi, el retículo endoplásmico, el núcleo, el nucleolo, la membrana nuclear, la mitocondria, el cloroplasto, las vesículas secretoras, los lisosomas y la membrana celular; y b) localizaciones extracelulares mediante una señal secretora. Se prefiere en particular la localización en cualquier compartimiento subcelular o en la vía externa de secreción celular.

En una realización preferida, las secuencia diana es una señal de localización nuclear (NLS). Estas secuencias NLS son generalmente dominios cortos, cargados positivamente (básicos), que sirven para dirigir la proteína entera, en donde se halla dicha señal, al núcleo de la célula. Se han descrito numerosas secuencias NLS incluyendo las NLS básicas, como la del gran antígeno T del SV40 (virus del mono) (Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val), Kalderon (1984) y col., Cell, 39,:499-509; la señal de localización nuclear del receptor-\beta nuclear del ácido retinoico (ARRRRP); NFKB p50 (EEVQRKRQKL; Ghosh y col., Cell 62:1019 (1990); NFKB p65 (EEKRKRTYE; Nolan y col., Cell 64:961 (1991); y otros (ver por ejemplo Boulikas, J. Cell. Biochem. 55(1):32-58 (1994), incorporado aquí mediante referencias) y las NLS básicas dobles ejemplificadas aquí por la secuencia de la proteína de Xenopus (sapo africano), la nucleoplasmina (Ala Val Lys Arg Pro Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp), Dingwall, y col., Cell, 30:449-458, 1982 y Dingwall y col. , J. Cell Biol., 107:641-849; 1988). Numerosos estudios de localización han demostrado que las NLSs incorporadas en péptidos sintéticos o insertadas en proteínas reporteras normalmente no dirigidos hacia el núcleo celular causan que estos péptidos y proteínas reporteras se concentren en el núcleo. Ver, por ejemplo, Dignwall y Laskey, Ann. Rev. Cell. Biol., 2:367-390, 1986; Bonnerot y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6795-6799, 1987; Galileo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 458-462, 1990.

En una realización preferida, la secuencia de direccionamiento es una secuencia señal de anclaje en membrana. Esto es particularmente de interés, ya que muchos parásitos y patógenos se unen a la membrana y que muchos sucesos intracelulares tienen su origen en la membrana plasmática. Así, las librerías de péptidos unidos a membranas son útiles tanto para la identificación de elementos importantes en estos procesos, como para el descubrimiento de inhibidores eficaces. La invención proporciona procedimientos para la presentación del producto aleatorio de expresión en el interior de la célula o en el espacio citoplasmático; ver Fig. 3. Para una presentación extracelular, se proporciona una región de anclaje a membrana en el extremo carboxi-terminal de la estructura de presentación del péptido. La región del producto aleatorio de expresión se expresa en la superficie celular y se expone al espacio extracelular, de manera que se puede unir con otras moléculas de la superficie (que afectan su función), o con las moléculas presentes en el medio extracelular. La unión de dichas moléculas podría proporcionar una función a las células que expresen un péptido que se una a la molécula. La región citoplasmática podría ser neutral o podría contener un dominio que, cuando se une a la región del producto aleatorio de expresión extracelular, proporciona una función a las células (activación de una quinasa, fosfatasa, unión de otros componentes celulares para hacer efectiva la función). De modo similar, la región que contiene el producto aleatorio de expresión podría estar contenida en una región citoplasmática, permaneciendo constantes las regiones transmembrana y extracelular o tienen una función definida.

Las secuencias de anclaje en membrana son bien conocidas en la materia y están basadas en la geometría genética de las moléculas transmembrana de mamíferos. Los péptidos se insertan en la membrana dependiendo de una secuencia señal (denominada aquí como ssTM) y necesitan un dominio transmembrana hidrofóbico (TM). Las proteínas transmembrana están insertadas en la membrana de manera que las regiones codificadas por el extremo 5' del dominio transmembrana son extracelulares y las codificadas por secuencias 3' son intracelulares. Desde luego, si estos dominios transmembrana se colocan 5' de la región variable, servirán para anclarse como un dominio intracelular, lo que puede ser deseable en algunas realizaciones. Las secuencias ssTMs y TMs son comunes a una gran variedad de proteínas de unión a membrana, por lo que estas secuencias pueden utilizarse bien como parejas de una proteína determinada, o con cada uno de los componentes obtenidos de una proteína distinta, o alternativamente, las secuencias pueden ser sintéticas y derivarse enteramente de los dominios de liberación consensos o artificiales.

Como podrá apreciarse por los expertos en la materia, las secuencias de anclaje a membranas, incluyendo tanto las ssTM como las TM, son comunes a una gran variedad de proteínas y por tanto puede utilizarse cualquiera de éstas. Secuencias de anclaje a membrana especialmente preferidas incluyen, pero no se limitan a, las derivadas de CD8, ICAM-2, IL-8R, CD4 y LFA-1.

Las secuencias de utilidad incluyen secuencias de: 1) proteínas de membrana íntegra de clase I como la cadena beta del receptor de IL-2 (los residuos 1-26 son la secuencia señal, 241-265 son los residuos transmembrana, ver Hatakeyama y col., Science 244:551 (1989) y von Heijne y col., Eur. J. Biochem. 174:671 (1988)) y la cadena beta del receptor de la insulina (los residuos 1-27 son la secuencia señal, 957-959 son el dominio transmembrana y 960-1382 son el dominio citoplasmático; ver Hatakeyama, supra y Ebina y col., Cell 40:747 (1985)); 2) proteínas de membrana íntegra de clase II como la endopeptidasa neutral (los residuos 29-51 son el dominio transmembrana, 2-28 son el dominio citoplasmático; ver Malfroy y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:59 (1987)), 3) proteínas de tipo III como el citocromo P450 humano NF25 (Hatakeyama, supra); y 4) las proteínas de tipo IV como la P-glicoproteína (Hatakeyama, supra). En particular, son preferibles el CD8 y el ICAM-2. Por ejemplo, las secuencias señal de CD8 e ICAM-2 se hallan en el extremo 5' del tránscrito. Esto consiste de los aminoácidos 1-32 en el caso del CD8 (MASPLTRFLSLNLLLLGESILGSGEAKPQAP; Nakauchi y col., PNAS USA 82:5126 (1985) y 1-21 en el caso de ICAM-2 (MSSFGYRTLTVALFTLICCPG; Stauton y col., Nature (London) 339:61 (1989)). Las secuencias líder liberan la construcción a la membrana, mientras que los dominios transmembrana hidrofóbicos, colocados en 3' de la región del candidato aleatorio, sirven como anclaje de la construcción en la membrana. Estos dominios transmembrana están comprendidos por los aminoácidos 145-195 de CD8 (PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVA
LLLSLIITLICYHSR; Nakauchi, supra) y 224-256 de ICAM-2 (MVIIV7VVSVLLSLFVTSVLLCFIFGQHLRQQR; Stauton, supra).

Alternativamente, las secuencias de anclaje a membrana incluyen el anclaje GPI, que produce un enlace covalente entre la molécula y la bicapa lipídica mediante un enlace glicosilfosfatidilinositol, por ejemplo en el DAF (PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFLTGLLGTLVTMGLLT, con la serina en negrita en el sitio de anclaje; ver Homans y col., Nature 333 (6170):269-72 (1988) y Moran y col., J. Biol. Chem. 266:1250 (1991)). Con el fin de obtener todo lo anterior, la secuencia GPI de Thy-1 se puede incluir en una caja 3' de la región variable, en lugar de una secuencia transmembrana.

De forma similar, las secuencias de miristilación pueden servir como secuencias de anclaje a membrana. Se sabe que la miristilación de c-src lo dirige a la membrana plasmática. Esto es un procedimiento sencillo y eficaz de ubicación en membrana, dado que los primeros 14 aminoácidos de la proteína son los únicos responsables de esta función: MGSSKSKPKDPSQR (ver Cross y col., Mol. Cell Biol. 4(9):1834 (1984); Spencer y col., Science 262:1019-1024 (1993), incorporados ambos mediante referencias). Este motivo también ha demostrado ser eficaz en la localización de genes reporteros y puede utilizarse para anclar la cadena zeta del TCR. Este motivo se coloca 5' de la región variable con el fin de localizar la construcción de la membrana plasmática. Otras modificaciones, como la palmitoilación pueden utilizarse para anclar las construcciones en la membrana plasmática; por ejemplo, las secuencias de palmitoilación derivadas de la secuencia GRK6 de la quinasa de receptor acoplada a proteína G (LLQRLFSRQDCCGNCSDSEEEL
PTRL, siendo las cisteínas en negrita las palmitoiladas; Stoffel y col., J. Biol. Chem. 269:2779 (1994)); de rodopsina (KQERNCMLTSLCCGKNPLGD; Bamstable y col., J. Mol. Neurosci. 5(3):207 (1994)); y la proteína 1 de p21 Hras (LNPPDESGPGCMSCKCVLS; Capon y col., Nature 302:33 (1983)).

En una realización preferida, la secuencia de direccionamiento es una secuencia de dirección lisosomal, incluyendo, por ejemplo, una secuencia de degradación lisosomal como la Lamp-2 (KFERQ; Dice, Ann. N.Y. Acad. Sci. 674:58 (1992); o las secuencias de membrana lisosomales de Lamp-1 (MLIPIAGFFALAGLVLIVLIAYLIAYLI GRKR SHAGYQTI, Uthayakumar y col., Cell Mol. Biol. Res. 41:405 (1995)) o la Lamp-2 (LVPIAVGAALAGVLILVLLAYFIG
LKHHHAGYEQF, konecki y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205:1-5 (1994), mostrando ambas los dominios transmembrana en itálica y la secuencia señal de direccionamiento citoplasmático subrayada).

Alternativamente, la secuencia de direccionamiento puede ser una secuencia de localización mitocondrial, incluyendo las secuencias de matriz mitocondrial (p.ej., la alcohol deshidrogenasa de levaduras III; MLRTSSLFTRRVQPS
LFSRNILRLQST; Schatz, Eur. J. Biol. Chem. 165:1-6 (1987)); las secuencias de membrana interna mitocondrial (subunidad IV de la citocromo oxidasa c de levadura; MLSLRQSIRFFPATRTLCSSRYLL; Schatz, supra); las secuencias del espacio intermembrana mitocondrial (citocromo c1 de levadura; MFSMLSKRWAQRTLSKSFYSTAT
GAASKSGKLTQKLVTAGVAAAGITASTLLYADSLT AEAMTA; Schatz, supra), o las secuencias de membrana externa mitocondrial (proteína de membrana externa de 70 KDa de levadura); MKSFITRNKTAILATVAATGAYYYYN
QLQQQQQRGKK; Schatz, supra).

Estas secuencias de direccionamiento también pueden ser secuencias del retículo endoplasmático, incluyendo las secuencias de la calreticulina (KDEL; Pelham, Royal Society London Transactions B; 1-10 (1992)), o la proteína E3/19K de adenovirus (LYLSRRSFIDEKKMP; Jackson y col., EMBO J. 9:3153 (1990).

Además, las secuencias de direccionamiento también incluyen las secuencias de peroxisomas (por ejemplo, la secuencia de la matriz de peroxisoma de la Luciferasa; SKL; Keller y col., PNAS USA 4:3264 (1987)); las secuencias de farnesilación (por ejemplo, P21 H-ras 1; LNPPDESFPGCMSCKCVLS, con las cisteína farnesilada en negrita; Capon, supra); las secuencias de geranilgeranilación (por ejemplo, la proteína rab-5A; LTEPTQPTRNQCCSN, con las cisteínas geranilgeraniladas en negrita; Farnsworth, PNAS USA 91:11963 (1994)); o las secuencias de destrucción (ciclina B1 RTALGDIGN; Klotzbucher y col., EMBO J 1:3053 (1996)).

En una realización preferida, la secuencia de direccionamiento es una secuencia señal secretora capaz de provocar la secreción del producto de traducción candidato. Existe un gran número de secuencias señal secretoras que se hallan 5' de la región peptídica variable y son escindidas de la región peptídica para efectuar la secreción en el espacio extracelular. Las secuencias señal secretoras y su capacidad de transferencia a proteínas no relacionadas son bien conocidas en la materia, p.ej., Sihavy y col., (1985) Microbiol. Rev. 49, 398-418. Esto es particularmente útil para generar un péptido capaz de unirse a la superficie de, o de afectar a la fisiología de, una célula diana distinta a la célula huésped; p.ej., la célula infectada con el retrovirus. En una aproximación preferida, se configura un producto de fusión para contener, en series, péptido señal de secreción-estructura de presentación- región del producto aleatorio de expresión, ver Figura 3. De esta forma, las células diana que crecen en la proximidad de las células que expresan la librería peptídica, están en contacto con el péptido secretado. Las células diana expresan un cambio fisiológico en respuesta a la presencia de un péptido, p.ej., mediante la unión del péptido a la superficie del receptor, o mediante la internalización y unión a dianas intracelulares. Así, las células secretoras se localizan mediante cualquiera de los diversos esquemas de selección, pudiéndose determinar el péptido causante del efecto determinado. Algunos ejemplos de efectos incluyen entre otros, una citoquina de diseño (es decir, un factor de célula madre capaz de provocar la división de las células madres y de mantener su totipotencialidad), un factor que provoca que las células cancerosas entren espontáneamente en apoptosis, un factor que se une a la superficie celular de las células diana y las marca de forma específica, etc.

Las secuencias secretoras adecuadas son conocidas, incluyendo las señales de IL-2 (MYRMQLLSCIALSLALVT
NS; Villinger y col., J. Immunol. 155:3946 (1995)), la hormona de crecimiento (MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQE
GSAFPT; Roskam y col., Nucleic Acids Res. 7:30 (1979)); preproinsulina (MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA
FVN; Bell y col., Nature 284:26 (1980)); y la proteína HA de influenza (MKAKLLVLLYAFAGDQI; Sekiwawa y col., PNAS 80:3563)), con corte entre la unión de aminoácidos no subrayados con los subrayados. Una secuencia señal secretora preferida es la secuencia señal líder de la citoquina secretada IL-4, que comprende los primeros 24 aminoácidos de la IL-4: MGLTSQLLPPLFFLLACAGFVHG.

En una realización preferida, la pareja de fusión también puede comprender una secuencia de rescate. Una secuencia de rescate es una secuencia que puede utilizarse para purificar o aislar el agente candidato o el ácido nucleico que lo codifica. Así, por ejemplo, las secuencias de rescate peptídicas incluyen las secuencias de purificación como la marca de His_{6} para utilizar con columnas de afinidad de Ni y las marcas epitópicas para la detección, la inmunoprecipitación o el FACS (selector de celular activado por fluorescencia). Marcas epitópicas adecuadas incluyen la marca myc (para utilizar con el anticuerpo 9E10 disponible comercialmente), la secuencia diana de biotinilación BSP de la enzima bacteriana BirA, marcas de flu, lacZ y GST.

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Alternativamente, la secuencia de rescate puede ser una secuencia oligonucleotídica que sirve como el sitio diana que permite el aislamiento rápido y sencillo de la construcción retroviral, mediante PCR, técnicas relacionadas, o hibridación.

En una realización preferida, la pareja de fusión puede también comprender una secuencia de estabilidad, para proporcionar estabilidad al péptido aleatorio candidato o al ácido nucleico que lo codifica. Así, por ejemplo, los péptidos pueden estabilizarse mediante la incorporación de glicinas después de la metionina de iniciación (MG o MGG0), para la protección del péptido para la ubiquitinación según la regla del extremo N- de Varshavsky, lo que le confiere una vida larga en el citoplasma. De modo similar, dos prolinas en el extremo C-terminal transmite a los péptidos una gran resistencia a la acción de las carboxipeptidasas. La presencia de dos glicinas antes de las prolinas proporciona flexibilidad y evita que las estructuras inicien eventos en la di-prolina que se propagarían en la estructura del péptido candidato. Así, las secuencias de estabilidad preferidas son las siguientes: MG(X)_{n}GGPP, en donde X es cualquier aminoácido y n es un número entero igual o superior a 4.

En una realización, la pareja de fusión puede también comprender una secuencia de dimerización. Una secuencia de dimerización permite la asociación no- covalente de un péptido aleatorio con otro péptido aleatorio, con suficiente afinidad para permanecer asociados en condiciones fisiológicas normales. Esto permite de forma eficaz que librerías pequeñas de péptidos aleatorios (por ejemplo, 10^{4}) se transformen en librerías grandes si se generan dos péptidos por célula que luego dimerizan, para formar una librería efectiva de 10^{8} (10^{4}x10^{4}). También permite la formación de péptidos aleatorios mayores, si es necesario, o de moléculas peptídicas aleatorias estructuralmente complejas. Los dímeros pueden ser homo- o heterodímeros.

Las secuencias de dimerización pueden ser una secuencia única que forma agregados con ella misma, o dos secuencias, cada una de las cuales está generada por una construcción retrovírica distinta. Es decir, los ácidos nucleicos que codifican el primer péptido aleatorio con la secuencia 1 de dimerización y el segundo péptido aleatorio con la secuencia 2 de dimerización, de modo que después de la introducción en una célula y la expresión del ácido nucleico, la secuencia 1 de dimerización se asocia con la secuencia 2 de dimerización para formar una nueva estructura peptídica aleatoria.

Las secuencias de dimerización adecuadas abarcarán una gran variedad de secuencias, siendo bien conocidos los sitios de interacción proteína-proteína. Además, las secuencias de dimerización también pueden elucidarse utilizando procedimientos estándares como el sistema del doble híbrido de levaduras, los estudios tradicionales de afinidad de unión, o incluso los procedimientos de la presente invención.

Las parejas de fusión pueden colocarse en cualquier lugar (es decir, en el extremo N-terminal, C-terminal, o en el interior) de la estructura según permitan las posibilidades biológicas y de actividad.

En una realización preferida, la pareja de fusión incluye una secuencia adaptadora o de unión. Las secuencias de unión entre las diversas secuencias de direccionamiento (por ejemplo, secuencias de dirección de membrana) y los otros componentes de las construcciones (como los agentes candidatos aleatorios) pueden ser deseables para permitir que los agentes candidatos interactúen con las dianas potenciales sin estorbos. Por ejemplo, cuando el agente bioactivo candidato es un péptido, las moléculas de unión de utilidad incluyen los polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)_{n}, (GSGGS)_{n} y (GGGS)_{n}, en donde n es un número entero igual o superior a 1), los polímeros de glicina-alanina, los polímeros de alanina-serina y otras moléculas de unión flexibles como la del canal de potasio y una gran variedad de otras moléculas de unión, como se apreciará por los expertos en la materia. Son preferibles los polímeros de glicina-serina, ya que ambos aminoácidos están relativamente no estructurados y en consecuencia pueden se capaces de servir como uniones neutrales entre los compuestos. En segundo lugar, la serina es hidrofílica y en consecuencia es capaz de solubilizarse lo que podría ser una cadena globular de glicinas. En tercer lugar, las cadenas similares han demostrado que son eficaces en la unión de subunidades de proteínas recombinantes, como los anticuerpos de cadena sencilla.

Además, las parejas de fusión, incluyendo las estructuras de presentación, pueden modificarse de forma aleatoria y/o madurar para alterar la orientación de presentación del producto aleatorio de expresión. Por ejemplo, pueden modificarse los determinantes en la base del bucle, para modificar ligeramente la estructura terciaria del péptido del bucle interno, manteniendo así la secuencia aminoacídica aleatoria.

En una realización preferida, se utilizan combinaciones de parejas de fusión. Así, por ejemplo, se puede utilizar cualquier combinación de estructuras de presentación, secuencias de rescate de secuencias de direccionamiento y secuencias de estabilidad, con o sin secuencias de unión. Tal como se describe con mayor detalle más adelante, en una caja, se pueden unir diversas parejas de fusión 5' y 3' de la librería, utilizando un vector base que contenga una diana de clonaje para recibir las librerías aleatorias y/o sesgadas. En la Tabla 1 se muestran algunas de las combinaciones posibles (sin especificar las estructuras de presentación), en donde V es la diana de clonaje variable para las librerías de ácidos nucleicos aleatorios y cada pareja de fusión se representa por otra letra (por ejemplo, N para la secuencia de localización nuclear), cada construcción puede denominarse como una serie de letras que se leen de 5' a 3' para el ácido nucleico, o del extremo N-terminal al C-terminal para la proteína, como NV, o si está clonada cadena abajo de la región variable, VN. Tal como se indica aquí, las secuencias de parejas de fusión están clonadas en dianas en cada uno de los lados de la región variable. C hace referencia a citoplásmico (es decir, sin secuencia de localización), E es una secuencia de rescate como el epítopo de myc, G es una secuencia de unión (G10 es una cadena de glicina-serina de 10 aminoácidos y G20 es una cadena de glicina-serina de 20 aminoácidos), M es una secuencia de miristilación, N es una secuencia de localización nuclear, ssTM es la secuencia señal para una secuencia de anclaje a membrana, TM es la secuencia de anclaje transmembrana, GPI es una secuencia de anclaje a membrana GPI; S es una secuencia señal secretora, etc. Como podrá apreciarse por los expertos en la materia, se puede realizar cualquier combinación, además de las listadas a continuación.

TABLA 1

citoplasmática	CV
	CEV
	CVE
secretada	SV
	SEV
	SVE
miristilada	MV
	MEV
	MEG20V
transmembrana (intracelular)	ssTMV
	ssTM V TM
	ssTM V E TM
	ssTM V G20 E TM
	ssTM V E
transmembrana (unida a GP)	ssTM V GETM
localización nuclear	NEV
	NVE

Como podrá apreciarse por los expertos en la materia, se pueden utilizar estos módulos de secuencias en un gran número de combinaciones y variaciones. Además, tal como se discutió anteriormente, es posible tener más de una región variable en una construcción, bien para formar conjuntamente una nueva superficie o para poner las otras dos moléculas juntas.

En una realización preferida, se añadió un péptido aleatorio candidato unido a una estructura de presentación a la diana de clonaje de la región variable, V, anterior. Alternativamente, no se utilizó ninguna estructura de presentación, lo que prqporcionó un péptido o producto de expresión "libre" o "no-restringido".

Las realizaciones preferidas incluyen:

a) péptido libre, unido (es decir, amarrado), anclado a membrana e intracelular: MRPLAGGEHTMASPLERFLS LSLNLLLLGESIILGSG PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFAC \qquad\qquad\qquad DIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICY
HSRGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGGG-(X)_{n}-GGPP, con la secuencia señal de CD8 murino en negrita, la región transmembrana de CD8 subrayado y la molécula de unión, para proporcionar flexibilidad (glicina) y solubilidad (serina) en itálica. (X)_{n} representa el péptido aleatorio, en donde n es un número entero superior a 6. Una realización preferida que utiliza esta estructura emplea péptidos derivados, tal como se describe más adelante, por ejemplo utiliza librerías de péptidos derivados del dominio de unión SH-3 en las estructuras peptídicas no restringidas, ya que algunos sistemas de señalización de receptores de superficie utilizan dominios SH-3 como parte del aparato de señalización.

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b) intracelular, unido a membrana, bobina enrollada unida: MRPLAFFEHTMASPLTRFLSLNLLLLGESIIL
GSG PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFAC DIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHSR GSGGSGSGGSGSGGSGSGGS
GSGGSGGGC AALESEVALESEVAS LESEVAAL-(X) N-LAAVKSKLSAVKSKLASVKSKLAA CGPP, con la estructura de bobina enrollada en itálica y subrayada.

c) extracelular anclado a superficie, no-restringido: MRPLAFFEHTMASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGGG-(X)N- GSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGGG PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSL
IITLICYHSRGGPP.

d) anclado a superficie, extracelular restringido: MRPLAFFEHTMASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGGGC A ALESEVALESEVAS LESEVAAL -(X)_{n}- LAAVKSKLSAVKSKLASVKSKLAA CGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSG
GG PQRPE DCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHSRGGPP.

e) secretado, no restringido: MRPLAFFEHTMASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGG-(X)_{n}-GGPP.

f) secretado, restringido: MRPLAFFEHTMASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGGG AALESEVALESEV\qquadA AL -(X)_{n}- LAAVKSKLSAVKSKLASVKSKLAA CGPP.

Los péptidos aleatorios candidatos, también denominados aquí agentes bioactivos candidatos, tal como se describe más adelante, están codificados por ácidos nucleicos candidatos. El término "ácidos nucleicos candidatos" hace referencia a un ácido nucleico, generalmente RNA cuando se utilizan vehículos de liberación retrovírica, que pueden expresarse para formar agentes bioactivos candidatos; es decir, los ácidos nucleicos candidatos codifican los agentes bioactivos candidatos y las parejas de fusión, si las hubiera. Además, los ácidos nucleicos también contienen, generalmente, suficiente secuencia extra como para efectuar la traducción o la transcripción, si fuera necesario. En una librería peptídica, el ácido nucleico candidato contiene generalmente dianas de clonaje que están colocadas para permitir la expresión en el marco de lectura de los péptidos aleatorios y las parejas de fusión como, por ejemplo, las estructuras de presentación. Por ejemplo, una estructura de presentación contendrá generalmente el codón de inicio ATG, como parte del vector parental. En una librería de RNA, los ácidos nucleicos candidatos están construidos generalmente con un promotor CMV interno, el promotor tRNA o el promotor específico celular diseñado para la expresión inmediata y adecuada de la estructura del RNA en el sitio de inicio de la síntesis del RNA. El RNA se expresa en dirección anti-sentido a la dirección de la síntesis retroviral y se finaliza tal como se conoce, por ejemplo con una secuencia finalizadora específica de orientación. En la célula diana, la interferencia de la transcripción cadena arriba se atenúa con la deleción de la propia inactivación, una característica común de algunos sistemas de expresión retrovirales.

En general, los ácidos nucleicos candidatos se expresan dentro de las células para producir péptidos aleatorios candidatos.

Los péptidos aleatorios candidatos y los ácidos nucleicos candidatos son aleatorios, bien se han generado de forma completamente aleatoria, o de forma sesgada, p.ej., generalmente en la frecuencia de nucleótido/residuo, o en su posición. El término "aleatorio" o los equivalentes gramaticales hacen referencia a que cada ácido nucleico y péptido consisten de nucleótidos y aminoácidos esencialmente aleatorios, respectivamente. Tal como se describe con mayor detalle más adelante, los ácidos nucleicos candidatos que producirán los productos de expresión candidatos se sintetizan químicamente y por ello pueden incorporar cualquier nucleótido en cualquier posición. Así, cuando se expresan los ácidos nucleicos candidatos para formar péptidos, se puede incorporar cualquier residuo aminoacídico en cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar ácidos nucleicos aleatorios, para permitir la formación de todas o la mayoría de combinaciones posibles a lo largo del ácido nucleico, formando así una librería de ácidos nucleicos aleatorios candidatos.

La librería debería proporcionar una población suficientemente diversa estructuralmente de productos de expresión aleatorios para lograr un intervalo probabilístico suficiente de respuestas celulares, con el fin de proporcionar una o más células que presenten una respuesta deseada. Según ello, una librería de interacción debe ser suficientemente amplia para que, por lo menos, uno de sus miembros tenga una estructura que le proporcione afinidad con algunas moléculas, proteínas, u otros factores cuya actividad es necesaria para llevar a cabo la vía de señalización. Aunque es difícil estimar el tamaño absoluto requerido de una librería de interacción, la naturaleza proporciona ejemplos con la respuesta inmune: una diversidad de 10^{7}-10^{8} anticuerpos distintos proporciona por lo menos una combinación con suficiente afinidad para interactuar con los antígenos potenciales expresados por un organismo. Las técnicas de selección in vitro publicadas, también han demostrado que un tamaño de librería de 10^{7} a 10^{8} es suficiente para hallar estructuras con afinidad por la diana. Una librería de todas las combinaciones de un péptido de 7 a 20 aminoácidos de tamaño, como el propuesto para la expresión en retrovirus, tiene el potencial de codificar para 20^{7} (10^{9}) a 20^{20}. Así, con librerías de 10^{7} a 10^{8} de partículas retrovirales por ml, los procedimientos actuales permiten teóricamente un subgrupo de "trabajo" de una librería de interacción completa para 7 aminoácidos y un subgrupo de estructuras para la librería de 20^{20}. En consecuencia, en una realización preferida, se analizan simultáneamente en los procedimientos de la presente invención 10^{6} productos de expresión, preferentemente un mínimo de 10^{7}, más preferentemente un mínimo de 10^{8} y todavía más preferentemente 10^{9}, por lo menos. Los procedimientos preferidos maximizan el tamaño de la librería y su diversidad.

Es importante comprender que cualquier sistema de librerías codificado por síntesis de oligonucleótidos no puede tener un control completo sobre los codones que se incorporarán eventualmente en la estructura peptídica. Esto es especialmente cierto en el caso de los codones que codifican para señales de parada (TAA, TGA, TAG). En una síntesis con NNN como la región aleatoria, existe un 3/64 o un 4,69% de probabilidades de que el codón sea un codón de parada. Por lo tanto, en un péptido de 10 residuos, existe una elevada probabilidad inaceptable de que el 46,7% de los péptidos se termine prematuramente. Para las estructuras de péptidos libres, esto quizás no es un problema, pero para estructuras mayores, como las que se indican aquí, dicha finalización conducirá a la expresión de un péptido estéril. Para reducir esta posibilidad, los residuos aleatorios se codifican como NNK, en donde K = T o G. Ello permite codificar todos los aminoácidos potenciales (cambiando ligeramente su representación relativa), pero evitando de forma importante la codificación de dos codones de parada, TAA y TGA. En consecuencia, las librerías que codifican un péptido de unos 10 aminoácidos tendrán una probabilidad del 15,6% de finalizarse prematuramente. Para los ácidos nucleicos que no estén diseñados para generar productos de expresión peptídicos, esto no es necesario.

En una realización, la librería se genera de forma totalmente aleatoria, sin preferencias de secuencia o constantes en ninguna posición. En una realización preferida, la librería se genera de forma sesgada. Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia permanecen constantes o se seleccionan de entre un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en una realización preferida, se generan de forma aleatoria los nucleótidos o los residuos aminoacídicos dentro de una clase determinada, por ejemplo, los aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrofílicos, residuos sesgados estéricamente (bien pequeños o grandes), hacia la creación de cisteínas, para la unión de, por ejemplo, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc., o a purinas, etc.

En una realización preferida, el sesgo se realiza hacia péptidos o ácidos nucleicos que interactúan con una clase conocida de moléculas. Por ejemplo, se sabe que una gran parte de la señalización celular se lleva a cabo mediante regiones cortas de polipéptidos que interactúan con otros polipéptidos a través de dominios peptídicos pequeños. Por ejemplo, anteriormente ya se había demostrado que una corta región del dominio citoplasmático de la cubierta de VIH-1 bloquea la acción de la calmodulina celular. Las regiones del dominio citoplasmático de Fas, que muestra homología con la toxina Mastoparan de avispas, pueden limitarse a una región corta con funciones de inducción de muerte por apoptosis, o de inducción de proteínas G. El Magainin, un péptido natural derivado de Xenopus, puede tener una actividad potente antitumoral o anti-microbiana. También, se ha visto que fragmentos peptídicos cortos de una isoenzima de proteína quinasa C (\betaPKC) bloquean la translocación nuclear de \betaPKC en oocitos de Xenopus después de la estimulación. Y, también se han utilizado péptidos diana de SH-3 cortos como pseudosustratos para la unión específica a proteínas SH-3. Esto es, desde luego, una corta lista de los péptidos disponibles con actividad biológica, existiendo una densa literatura en dicha área. Por ello, existen muchos precedentes para que los péptidos pequeños presenten un potencial de actividad en las cascadas de señalización celular. Además, también se pueden utilizar agonistas y antagonistas como base de la generación aleatoria sesgada de los péptidos candidatos aleatorios.

Así, varias moléculas o dominios proteicos son adecuados como puntos de inicio para la generación sesgada de agentes bioactivos candidatos aleatorios. Se conoce un gran número de dominios de moléculas pequeñas, que confieren una función, estructura o afinidad común. Además, como se aprecia en la materia, áreas de identidad aminoacídica débil pueden tener una fuerte identidad estructural. Varias de estas moléculas, dominio y/o secuencias consenso correspondientes, son conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, dominios SH-2, dominios SF-3, dominios de muerte celular, Pleckstrin, sitios de reconocimiento de proteasas, inhibidores enzimáticos, sustratos enzimáticos, Traf, etc. De forma similar, existen varias proteínas de unión a ácidos nucleicos que contienen dominios adecuados para utilizar en la invención. Por ejemplo, las conocidas secuencias consenso de cremallera de leucinas.

Si el producto último de expresión es un ácido nucleico, se necesitan por lo menos 10 posiciones nucleotídicas, preferentemente 12, más preferentemente 15 e idealmente 21 para generarse de forma aleatoria, sobre todo si este sistema de generación aleatoria no es perfecto. De forma similar, se necesitan por lo menos 5 posiciones aminoacídicas, preferentemente 6 y más preferentemente 7 para ser generadas de forma aleatoria; de nuevo, se necesitarán más posiciones si la generación de forma aleatoria no es perfecta.

En una realización preferida, se generaron oligonucleótidos de unión al dominio SH3/péptidos de forma sesgada. Los dominios SH-3, se sabe que reconocen motivos diana cortos (péptidos de unión al dominio SH3), aproximadamente 10 a 12 residuos en una secuencia lineal, que puede estar codificada como péptidos cortos con elevada afinidad para el dominio SH-3 diana. Se han propuesto secuencias consenso para las proteínas de unión al dominio SH-3. Así, en una realización preferida, se generaron los oligos/péptidos con los siguientes sesgos:

1. XXXPPXPXX, en donde X es un residuo aleatorio.

2. (dentro de las posiciones de residuos 11-2).

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En esta realización, se sugiere que la región flanqueante del extremo N-terminal presenta los mayores efectos sobre la afinidad de unión y por ello se genera totalmente de forma aleatoria. "Hyd" indica un sesgo hacia un residuo hidrofóbico, es decir, -Val, Ala, Gly, Leu, Pro, Arg. Para codificar el residuo sesgado hidrofóbicamente, se utiliza la estructura de codón sesgado "sbk". El examen del código genético de los codones asegurará que se codifique en general los residuos hidrofóbicos. s=g, c; b=t, g, c; v=a, g, c; m=a, c; K=t, g; n=a, t, g, c.

Los ácidos nucleicos se introducen en las células para cribar los péptidos aleatorios capaces de alterar el fenotipo de una célula de mamífero. El término "introducido en" o los equivalentes gramaticales hacen referencia a que los ácidos nucleicos entran en las células de forma adecuada, para la expresión posterior del ácido nucleico. El procedimiento de introducción viene dictado en mayor parte por el tipo de célula de mamífero a quien se dirige, tal como se discute más adelante. Ejemplos de procedimientos incluyen la precipitación con CaPO_{4}, la fusión de liposomas, el lipofectin®, la electroporación, la infección viral, etc. Los ácidos nucleicos candidatos pueden integrarse de forma estable en el genoma de la célula huésped (por ejemplo, con introducción retroviral, tal como se describe más adelante), o pueden existir de forma transitoria o estable en el citoplasma (es decir, mediante la utilización de plásmidos tradicionales, utilizando secuencias reguladoras estándares, la selección de marcadores, etc.). Dado que muchos cribajes de importancia farmacéutica requieren dianas de células humanas o de un modelo de mamífero, se prefieren los vectores retrovirales capaces de transfectar dichas dianas.

En una realización preferida, los ácidos nucleicos son parte de una partícula vírica que infecta las células. En general, la infección de las células está relacionada directamente con la aplicación del agente reactivo incrementador de la infección, el polibreno, que es un policatión que facilita la unión vírica con la célula diana. La infección puede optimizarse de modo que cada célula exprese generalmente una única construcción, utilizando la proporción adecuada de partículas víricas respecto al número de células. La infección sigue una distribución de Poisson.

Los ácidos nucleicos candidatos se introducen en las células utilizando vectores retrovirales. Actualmente, las metodologías más eficientes utilizan la capacidad de los virus diseñados, como los retrovirus, para saltar las barreras naturales de la entrada de ácidos nucleicos exógenos. La utilización de retrovirus recombinantes se realizó por primera vez por Richard Mulligan y David Baltimore con las líneas Psi-2 y los sistemas de empaquetamiento de retrovirus análogos, basados en células NIH 3T3 (ver Mann y col., Cell 33:153-159 (1993), incorporados aquí mediante referencias). Estas líneas de empaquetamiento defectuoso auxiliares son capaces de producir todas las proteínas trans necesarias: gag, pol y env, que se necesitan para el empaquetamiento, procesado, transcripción inversa e integración de genomas recombinantes. Las moléculas de RNA que tienen la señal de empaquetamiento \psi en cis se empaquetan en los viriones maduros. Por numerosas razones, se prefieren los retrovirus. En primer lugar, su modificación es fácil. En segundo lugar, al contrario que la liberación de genes mediada por adenovirus (los adenovirus no se integran), la expresión de los retrovirus es de larga duración. Los virus adeno-asociados tienen un espacio limitado para la introducción de genes y unidades reguladoras y por ello existe cierta controversia sobre su capacidad para integrarse. Los retrovirus, en cambio, ofrecen el mejor compromiso actual en términos de expresión de larga duración, flexibilidad genómica e integración estable entre otras características. La principal ventaja de los retrovirus es que su integración en el genoma del huésped permite su transmisión estable a través de las divisiones celulares. Ello asegura que en los tipos celulares que llevan a cabo múltiples etapas de maduración independientes, como la progresión celular hematopoyética, la construcción de retrovirus continuará siendo permanente y por lo tanto expresándose.

Cualquier sistema de transfección retroviral adecuado se describe en Mann y col., supra; Pear y col., PNAS USA 90(18):8392-6 (1993); Kitamura y col., PNAS USA92:9146-9150 (1995); kinsella y col., Human Gene Therapy 7:1405-1413; Hofmann y col., PNAS USA 93:5185- 5190; Choate y col., Human Gene Therapy 7:2247 (1996); y la patente internacional WO 94/19478.

En una realización de la invención, la librería se genera en el armazón de una construcción de DNA retroviral, tal como se describe en los ejemplos. La síntesis de oligonucleótidos estándares se realiza para generar la porción aleatoria del agente bioactivo candidato, utilizando técnicas bien conocidas en la materia (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, IRL Press Oxford University Press, 1991); las librerías se pueden obtener comercialmente. Las librerías con más de 10^{9} secuencias únicas pueden generarse fácilmente en dichos armazones de DNA. Después de la generación de la librería de DNA, la librería se clona en un primer cebador. Este primer cebador sirve como una "caja", que se inserta en la construcción retroviral. ,El primer cebador generalmente contiene varios elementos, incluyendo por ejemplo, las secuencias reguladores requeridas (p.ej., traducción, transcripción, promotores, etc.), parejas de fusión, dianas de endonucleasas de restricción (clonaje y subclonaje), codones de parada (preferentemente en los tres marcos de lectura), regiones de complementariedad para el cebado de la segunda cadena (preferentemente al final de la región del codón de parada, en donde tienen lugar deleciones o inserciones de poca importancia en la región aleatoria), etc.

Se añade a continuación un segundo cebador, que consiste generalmente de una parte o de toda la región complementaria que hibrida con el primer cebador y opcionalmente de secuencias necesarias para una segunda diana de restricción para el subclonaje. Se añade la DNA polimerasa, para obtener los oligonucleótidos de cadena doble. Éstos se cortan con las endonucleasas de restricción adecuadas para el subclonaje y se subclonan en los vectores retrovirales diana, que se describen más adelante.

Se puede utilizar cualquier número de vectores retrovirales adecuados. Generalmente, los vectores retrovirales pueden incluir: genes marcadores seleccionables bajo el control de dianas internas de entrada de ribosomas (IRES), que permiten la acción de operones bicistrónicos y así facilitan en gran manera la expresión celular de los péptidos a niveles uniformemente elevados; y los promotores que dirigen la expresión de un segundo gen, colocado en sentido directo o anti-sentido en relación con el LTR 5'. Los genes de selección adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes de resistencia a la neomicina, blastocidina, bleomicina, puromicina e higromicina, así como los marcadores auto-fluorescentes como la proteína fluorescente verde, los marcadores enzimáticos como el lacZ y las proteínas de superficie como el CD8, etc.

Los vectores preferidos incluyen un vector basado en los virus de células madres murinas (MSCV) (ver Hawley y col., Gene Therapy 1:136 (1994)) y un virus MFG modificado (Riviere y col., Genetics 92:6733 (1995)) y pBABE, subrayado en los ejemplos. Un esquema general de la construcción retroviral se muestra en la Fig. 4.

Los retrovirus pueden incluir promotores inducible y constitutivos. Por ejemplo, existen situaciones en donde es necesario inducir la expresión del péptido únicamente durante ciertas fases del proceso de selección. Por ejemplo, un programa para proporcionar citoquinas pro-inflamatorias en algunos casos debe incluir la expresión inducida de los péptidos. Ello es debido a que los fármacos pro-inflamatorios sobre-expresados pueden ser a largo plazo perniciosos para el crecimiento celular. Según ello, la expresión constitutiva no es deseable y únicamente se expresará el péptido durante una fase determinada del proceso de selección, cuando el fenotipo lo requiera, y a continuación se apaga la expresión del péptido al parar la expresión retrovírica, con el fin de confirmar el efecto o asegurar la supervivencia a largo plazo de las células productoras. Se conocen en la materia un gran número de promotores inducibles y constitutivos.

Además, es posible configurar un vector retroviral que permita la expresión inducible de los insertos retrovirales después de la integración de un único vector en las células diana; estando contenido el sistema entero en el vector único. Los retrovirus Tet-inducibles se han diseñado para incorporar la característica de propia inactivación (SIN) del mutante de deleción retroviral 3'LTR incrementador/promotor (Hoffman y col., PNAS USA 93:5185 (1996)). La expresión de este vector en las células es apenas detectable en presencia de tetraciclina o con otros análogos activos. Sin embargo, en ausencia de tetraciclina, la expresión es máxima a las 48 horas después de la inducción, con una expresión que aumenta de forma uniforme en la población total de células que contienen el retrovirus inducible, lo que indica que la expresión está regulada uniformemente en la población de células infectadas. Un sistema similar relacionado utiliza un dominio de unión a DNA-Tet, de modo que se une al DNA en presencia de Tet y se retira en ausencia de Tet. Cualquiera de estos sistemas es adecuado.

De esta forma los cebadores crean una librería de fragmentos, conteniendo cada uno una secuencia de nucleótidos aleatorios distinta que puede codificar un péptido distinto. Los productos de ligación se transforman a continuación en las bacterias, como E. coli, y el DNA se prepara a partir de la librería resultante, tal como se describe de forma general por Kitamura, PNAS USA 92:9146-9150 (1995).

La liberación de la librería del DNA en un sistema de empaquetamiento retroviral da como resultado la conversión a virus infecciosos. Las líneas celulares de sistemas de empaquetamiento retroviral adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las líneas Bing y BOSC23 descritas en la patente internacional WO 94/19478; Soneoka y col., Nucleic Acids Res. 23 (4):628 (1995); Finer y col., Blood 83:43 (1994); las líneas de empaquetamiento Phoenix como PhiNX-eco y PhiNX-ampho, descritas más adelante; 292T+ gag-pol y la cubierta del retrovirus; PA317; y las líneas celulares descritas por Markowitz y col., Virology 167:400 (1988), Markowitz y col., J. Virol. 62:1120 (1988), Li y col., PNAS USA 93:11658 (1996), kinsella y col., Human Gene Therapy 7:1405 (1996).

Los sistemas preferidos incluyen las líneas celulares PhiNX-eco y PhiNX-ampho y similares. Dichas dos líneas se describen a continuación. Estas líneas están basadas en las líneas celulares Bing y BOSC23 descritas en la patente europea WO 94/19478, que a su vez están basadas en la línea celular 293T (una línea de riñón embrional humano transformada con adenovirus Ela y que tiene un antígeno-T termo-sensible co-seleccionado con neomicina). La única característica de esta línea celular es que es altamente transfectable por protocolos de transfección mediados por fosfato cálcico, o de transfección basada en lípidos - más del 50% de células 293T pueden transfectarse de forma transitoria con el DNA plasmídico. Así, la línea celular podría ser un medio celular donde podrían producirse rápidamente las proteínas estructurales retrovirales y el RNA genómico viral para generar el virus defectuoso auxiliar. En consecuencia, las células 293T se diseñaron con construcciones defectuosas, integradas de forma estable y capaces de producir gag-pol y la proteína de la cubierta (env) para virus ecotrópicos o amfotrópicos. Estas líneas se denominaron BOSC23 y Bing, respectivamente. La utilidad de estas líneas consistió en la posibilidad de producir cantidades pequeñas de virus recombinantes de forma transitoria para utilizar en experimentos a pequeña escala. Las líneas ofrecen ventajas sobre los sistemas estables anteriores, ya que los virus podrían producirse en días en lugar de meses.

Con estas líneas de primera generación, se han hecho evidentes dos problemas después de los dos años de amplia utilización. En primer lugar, la expresión de gag-pol y env fue inestable y las líneas necesitaron un control exhaustivo de la capacidad de producción retroviral; en segundo lugar, la estructura de los vectores utilizados para la producción de proteínas no se consideró completamente "segura" para la producción de virus auxiliares; y en tercer lugar, una de las líneas portaba de forma desapercibida un retrovirus-higromicina. Aunque las líneas BIMG y BOSC23 son útiles en la presente invención, todas las soluciones a estos problemas potenciales se han dirigido a las líneas de segunda generación PhiNX. Están líneas están también basadas en las células 293T, con las siguientes mejoras. En primer lugar, la capacidad de producción de gag-pol célula a célula se generó mediante la introducción de una caja de un marcador de superficie IRES-CD8, cadena abajo del marco de lectura de la construcción gag-pol (además, también son útiles otros marcadores de superficie CD8). Las secuencias IRES (dianas internas de entrada) permiten la traducción de proteínas secundarias o terciarias a partir de un transcrito de mRNA. Ya que la expresión de CD8 es un reflejo directo de gag-pol intracelular, se puede controlar directamente mediante citometría de flujo la estabilidad de la capacidad de la población celular para producir gag-pol. En segundo lugar, se utilizaron tanto para las construcciones de gag-pol como de env los promotores no-Moloney, con el fin de minimizar el potencial de recombinación con las construcciones retrovirales introducidas y se utilizaron promotores distintos para gag-pol y env para minimizar su potencial de recombinación interna. Los promotores utilizados fueron CMV y RSV. Se generaron dos líneas celulares, PHEONIX-ECO y PHEONIX-AMPHO. Se introdujo gag-pol con higromicina como marcador de selección y se introdujo env con la resistencia a la difteria como marcador co-seleccionable. Por último, las células se cribaron para hallar un tipo de célula relativamente raro que produjera gag-pol y env con una distribución uniforme, aunque ello no fuera un requisito. Además, se generó una línea denominada PHEONIX-gp que expresaba únicamente gag-pol. Esta línea está disponible para posteriores pseudotipados de viriones retrovíricos con otras proteínas de la cubierta, como las de la cubierta del virus de la leucemia del gibón, o la proteína de VSV-G vesicular estomatitis. También se pueden añadir proteínas de la cubierta xenotrópicas o redirectoras.

Para la producción de virus auxiliares, se analizaron las líneas PHEONIX-ECO y PHEONIX-AMPHO, reconociéndose ambas exentas de virus auxiliares. Ambas líneas pueden contener episomas para la creación de líneas celulares estables que pueden utilizarse para producir retrovirus. Estas líneas son fácilmente analizables mediante citometría de flujo para comprobar la estabilidad de la expresión de gag-pol (CD8) y env; al cabo de varios meses del análisis de las líneas, éstas permanecían estables, y no demostraron pérdida de título como sucedió con la primera generación de líneas BOSC23 y Bing (parcialmente debido a la elección de promotores que dirigen la expresión de gag-pol y env). Ambas líneas, también se pueden utilizar para producir virus de forma transitoria en unos pocos días. Así, estas nuevas líneas son completamente compatibles con la expresión episomal transitoria y estable y con la generación de una librería para los experimentos de transferencia de genes retrovirales. Por último, se analizaron los títulos producidos por estas líneas. Utilizando la infección retroviral estándar incrementada por polibreno, se alcanzaron títulos de aproximadamente 10^{7} por ml para PHEONIX-eco y PHEONIX-ampho, con las construcciones episomales. Cuando se realizó una producción transitoria de virus, los títulos fueron generalmente de 1/2 a 1/3 de su valor.

Estas líneas están exentas de virus auxiliares, llevan episomas para una producción estable a largo plazo de retrovirus, producen de forma estable gag-pol y env y no demuestran pérdida del título viral con el tiempo. Además, PhiNX-eco y PhiNX-ampho son capaces de producir títulos cercanos a 10^{7} por ml cuando llevan las construcciones episomales, que, con la concentración del virus, pueden llegar a 10^{8}-10^{9} por ml.

En una realización preferida, las líneas celulares descritas anteriormente, y otros procedimientos para la producción de retrovirus, son de utilidad para la producción de virus mediante transfección transitoria. El virus puede utilizarse directamente, o bien utilizarse para infectar otra línea celular productora de retrovirus para la "expansión" de la librería.

La concentración del virus puede realizarse de la manera siguiente. En general, los retrovirus se titulan aplicando un sobrenadante que contiene retrovirus en células indicadoras, como por ejemplo células NIH3T3 y luego se cuantifica el porcentaje de células que expresan consecuencias fenotípicas de la infección. La concentración de virus se determina multiplicando el porcentaje de células infectadas por el factor de dilución implicado y considerando el número de células diana disponibles para obtener un título relativo. Si el retrovirus contiene un gen reportero, como el lacZ, entonces la infección, la integración y la expresión del virus recombinante se cuantifican mediante tinción histológica para la expresión de lacZ o mediante citometría de flujo (FACS). En general, los títulos retrovirales generados, incluso de las mejores células productoras, no exceden 10^{7} por ml, salvo que se realice una concentración mediante aparatos sofisticados y relativamente caros. Sin embargo, tal como se postuló recientemente, ya que una partícula tan grande como un virus no se mueve muy lejos debido al movimiento browniano en un líquido, la dinámica de fluidos predice que la mayoría de virus no entran nunca en contacto con las células para iniciar el proceso de infección. Sin embargo, si las células se crecen en filtros porosos y se permite a los virus que se muevan hacia las células mediante un flujo gravitométrico gradual, puede lograrse una concentración elevada de virus alrededor de las células y mantenerse durante todo el tiempo. De este modo, se ha podido obtener hasta una infectividad 10 veces superior infectando las células en una membrana porosa y permitiendo al sobrenadante del retrovirus fluir a través de la membrana. Esto debería proporcionar títulos de 109 después de la concentración.

Los ácidos nucleicos candidatos, como parte de la construcción retroviral, se introducen en las células para seleccionar los péptidos aleatorios transdominantes capaces de alterar el fenotipo de una célula.

Tal como se apreciará por los expertos en la materia, el tipo de células de mamífero en la presente invención puede variar ampliamente. Básicamente, puede utilizarse cualquier célula animal, siendo las células preferidas las de ratón, rata, primates y humanas, aunque como se apreciará por los expertos en la materia, las modificaciones del sistema por pseudotipaje permiten utilizar todas las células eucariotas, preferentemente las eucariotas superiores. Tal como se describe con más detalle posteriormente, se ajustará un cribaje de modo que las células, en presencia de un péptido aleatorio, presenten un fenotipo seleccionable. Como se describe más completamente posteriormente, los tipos celulares implicados en una gran variedad de enfermedades son de particular utilidad, siempre y cuando se pueda diseñar un cribaje adecuado para permitir la selección de las células que presenten un fenotipo alterado como consecuencia de la presencia de un péptido aleatorio transdominante dentro de la célula.

Según ello, los tipos celulares adecuados incluyen, pero no se limitan a, células tumorales de todo tipo (en particular melanomas, leucemia mieloide, carcinomas de pulmón, mama, ovarios, colon, riñón, próstata, páncreas y testículos), cardiomiocitos, células endoteliales, células epiteliales, linfocito? (células T y células B), mastocitos, eosinófilos, células vasculares de la íntima, hepatocitos, leucocitos incluyendo leucocitos mononucleares, células madre como las hematopoyéticas, neuronales, de la piel, pulmón, riñón, hígado y células madre de miocitos (para utilizar en un cribaje para la diferenciación y des-diferenciación de factores), osteoclastos, condrocitos y otras células del tejido conectivo, queratinocitos, melanocitos, células hepáticas, células renales y adipocitos. También se incluyen dentro de las células adecuadas, las células conocidas para investigación, pero sin limitarse a, células T Jurkat, células NIH3T3, CHO, COS, etc. Ver las líneas celulares del catálogo de ATCC. En una realización, las células pueden diseñarse genéticamente, es decir, contienen ácido nucleico exógeno, por ejemplo, contienen moléculas diana. En una realización preferida, se realiza el cribaje de una pluralidad de células. Es decir, se criban las células, en las que se introducen los ácidos nucleicos candidatos, para un fenotipo alterado. En consecuencia, en esta realización, el efecto del agente bioactivo transdominante se observa en las mismas células en las que se produce; es decir, un efecto autocrino.

Por "pluralidad de células" se entiende aproximadamente de 10^{3} a 10^{8} células, o 10^{9}, prefiriéndose de 10^{6} a 10^{8} células. Estas células comprenden una librería celular, en donde generalmente cada célula dentro de la librería contiene un miembro de la librería molecular retroviral, es decir, un ácido nucleico candidato distinto, aunque como se apreciará por los expertos en la materia, algunas células dentro de la librería no contienen un retrovirus y algunas pueden contener más de uno. Cuando se utilizan procedimientos distintos a la infección con retrovirus para introducir los ácidos nucleicos candidatos en una pluralidad de células, la distribución de los ácidos nucleicos candidatos, en los miembros celulares individuales de la librería celular, puede variar ampliamente, con lo que es difícil controlar el número de ácidos nucleicos que entran en una célula durante la electroporación, etc.

En una realización preferida, los ácidos nucleicos candidatos se introducen en una primera pluralidad de células y se rastrea el efecto de los agentes bioactivos candidatos en una segunda o tercera pluralidad de células, distintas de las primeras; es decir, generalmente un tipo celular distinto. Así, el efecto de los agentes bioactivos transdominantes es debido a un efecto transcelular en una segunda célula; es decir, un efecto endocrino o paracrino. Este procedimiento se realiza utilizando técnicas estándares. La primera pluralidad de células puede crecer en, o sobre un medio, permitiéndose que el medio toque una segunda pluralidad de células, y por último se cuantifica el efecto. Alternativamente, puede ser un contacto directo entre las células. Por ello, "contactar" implica un contacto funcional e incluye tanto el directo como el indirecto. En esta realización, se puede, o no, rastrear la primera pluralidad de células.

Si es necesario, las células se tratan en condiciones adecuadas para la expresión de los ácidos nucleicos candidatos (por ejemplo), cuando se utilizan promotores inducibles), para producir los productos de expresión candidatos, productos de traducción o de transcripción.

Por ello, los procedimientos de la presente invención comprenden la introducción de una librería molecular de ácidos nucleicos candidatos aleatorios en una pluralidad de células de mamífero, una librería celular. Cada uno de los ácidos nucleicos comprende una secuencia nucleotídica distinta, generalmente aleatoria. Dicha pluralidad de células de mamífero se criba a continuación, tal como se especifica, con mayor detalle más adelante, para un determinado fenotipo. El fenotipo alterado es debido a la presencia de un péptido aleatorio transdominante.

Por "fenotipo alterado" o "cambio fisiológico" u otros equivalentes gramaticales, se hace referencia a que el fenotipo de la célula de mamífero está alterado de alguna forma, preferentemente de forma detectable y/o cuantificable. Tal como se apreciará en la materia, una dificultad de la presente invención es la gran variedad de tipos de células de mamífero y de cambios fenotípicos potenciales que pueden analizarse utilizando los procedimientos actuales. Según ello, cualquier cambio fenotípico que pueda observarse, detectarse o cuantificarse puede ser la base de los procedimientos de cribaje. Los cambios fenotípicos adecuados incluyen, pero no se limitan a: grandes cambios fisiológicos como cambios en la morfología, crecimiento celular, viabilidad celular, adhesión a sustratos u otras células, y densidad celular; cambios en la expresión de uno o más RNAs, proteínas, lípidos, hormonas, citoquinas, u otras moléculas; cambios en el estado de equilibrio (es decir, vida media) o uno o más RNAs, proteínas, lípidos, hormonas, citoquinas u otras moléculas; cambios en la localización de uno o más RNAs, proteínas, lípidos, hormonas, citoquinas u otras moléculas; cambios en la bioactividad o actividad específica de uno o más RNAs, proteínas, lípidos, hormonas, citoquinas, receptores, u otras moléculas; cambios en la secreción de iones, citoquinas, hormonas, factores de crecimiento, u otras moléculas; alteraciones en los potenciales de membrana celular, polarización, integridad o transporte; cambios en la infectividad, susceptibilidad, latencia, adhesión y entrada de virus y patógenos bacterianos; etc. Por "capaz de alterar el fenotipo" se entiende que el péptido aleatorio puede cambiar el fenotipo de la célula de mamífero de alguna forma detectable y/o cuantificable.

El fenotipo alterado puede detectarse de muchas maneras, tal como se describe con mayor detalle posteriormente, y dependerá y corresponderá generalmente con el fenotipo que se cambia. En general, el fenotipo cambiado se detecta utilizando, por ejemplo: el análisis microscópico de la morfología celular; ensayos de viabilidad celular estándar, incluyendo el incremento de la muerte celular y de la viabilidad celular, por ejemplo, las células que son ahora resistentes a la muerte celular mediante virus, bacterias, o toxinas bacterianas o sintéticas; ensayos de marcaje estándar como los ensayos indicadores fluorimétricos para la presencia o el nivel de una célula o molécula determinada, incluyendo el FACS u otras técnicas de tinción; la detección bioquímica de la expresión de los compuestos diana después de eliminar las células; etc. En algunos casos, tal como se describe con mayor detalle más adelante, el fenotipo alterado se detecta en la célula en la que se introdujo el ácido nucleico aleatorio; en otras realizaciones, el fenotipo alterado se detecta en una segunda célula que responde a alguna señal molecular de la primera célula.

Un fenotipo alterado de una célula indica la presencia de un agente bioactivo transdominante. Por "transdominante", se entiende que el agente bioactivo causa indirectamente el fenotipo alterado actuando sobre una segunda molécula, que conduce a un fenotipo alterado. Es decir, un producto de expresión transdominante tiene un efecto que no se produce en cis, es decir, un suceso trans tal como se define en términos genéticos o bioquímicos. Un efecto transdominante es un efecto diferenciable por una entidad molecular (es decir, el péptido o RNA codificado) sobre una diana separada y diferenciable; es decir, no es un efecto sobre la propia identidad codificada. Así, los efectos transdominantes incluyen los efectos bien conocidos por los agentes farmacológicos sobre las moléculas o vías diana en las células o sistemas fisiológicos; por ejemplo, los antibióticos \beta-lactama tienen un efecto transdominante sobre la síntesis de péptido-glicanos en las bacterias mediante la unión a de unión a penicilina e interrupción de las funciones. Un efecto transdominante de un péptido es la capacidad de inhibir la señalización NF-KB mediante la unión a I\kappaB-\alpha en una región crítica para su función. De este modo, en presencia de cantidades suficientes del péptido (o de la entidad molecular), se inhiben las vías de señalización, que normalmente conducen a la activación de NF-\kappaB a través de la fosforilación y/o degradación de I\kappaB-\alpha, impidiendo que actúen sobre I\kappaB-\alpha debido a la unión del péptido o entidad molecular. En otro ejemplo, las vías de señalización, normalmente activadas para secretar IgE, se inhiben en presencia del péptido. O, las vías de señalización en los tejidos adiposos, normalmente quiescentes, se activan para metabolizar grasa. O, en presencia de un péptido, se inhiben los mecanismos intracelulares para la replicación de ciertos virus, por ejemplos, el VIH-I, o los miembros de la familia de virus Herpes, o el virus sincitial respiratorio.

Un efecto transdominante sobre una vía proteica o molecular se distingue claramente de la generación aleatoria, cambio o mutación de una secuencia dentro de una proteína o molécula de función conocida o desconocida para incrementar o disminuir una capacidad bioquímica que todavía manifiesta la proteína o molécula. Por ejemplo, se podría aumentar o disminuir la actividad de una proteína que corta enzimáticamente los antibióticos \beta-lactama, una \beta-lactamasa, mutando las secuencias internas a su estructura que aumenten o disminuyan la capacidad de esta enzima para actuar sobre y cortar los antibióticos \beta-lactama. Esto podría denominarse una mutación cis en la proteína. El efecto de esta proteína sobre los antibióticos \beta-lactama es una actividad ya manifestada por la proteína, pero a un nivel distinguible. De modo similar, una mutación en la secuencia líder que incremente la exportación de esta proteína a los espacios extracelulares en donde puede encontrar moléculas \beta-lactama más fácilmente, o una mutación dentro de la secuencia que incremente la estabilidad de la proteína, se denominaría mutación cis en la proteína. Por comparación, un efecto transdominante de esta proteína incluiría un agente, independiente de la \beta-lactamasa, que se une a la \beta-lactamasa de modo que aumenta o disminuye la función de la \beta-lactamasa en virtud de su unión con la \beta-lactamasa.

En general, los efectos cis son efectos dentro de las moléculas en donde los elementos que interaccionan están covalentemente unidos unos a otros, aunque estos elementos pueden manifestarse individualmente como dominios separados. Los efectos trans (transdominante ya que en ciertas condiciones celulares, se manifiesta el efecto deseado) son aquellos efectos observados entre entidades moleculares distintas, así, por ejemplo, la entidad molecular A (no unida covalentemente a la entidad molecular B) se une a, o dicho de otra manera tiene un efecto sobre las actividades de B. De este modo, muchos agentes farmacológicos conocidos son efectores transdominantes.

En una realización preferida, una vez se ha detectado una célula de mamífero con un fenotipo alterado, la célula se aísla de la pluralidad de células que no tienen fenotipos alterados. Ello se puede llevar a cabo de muy diversas maneras, tal como se conoce en la materia, y en algunos casos depende del ensayo o cribaje. Las técnicas de aislamiento adecuadas incluyen pero no se limitan a, el FACS, la selección por lisis utilizando el complemento, el clonaje celular, el cribaje mediante Fluorimager, expresión de una proteína "de supervivencia", la expresión inducida de una proteína de superficie celular u otra molécula que pueda convertirse en fluorescente o en una diana marcable para el aislamiento físico; la expresión de una enzima que convierte una molécula no-fluorescente en una fluorescente; el sobre-crecimiento frente a unos antecedentes de crecimiento nulo o lento; la muerte celular y aislamiento del DNA u otros colorantes indicadores de la viabilidad celular; etc.

En la presente invención, el péptido aleatorio se aísla de la célula positiva. Ello se puede realizar de muy diversas maneras. En una realización preferida, los cebadores complementarios a las regiones del DNA comunes a las construcciones retrovíricas, o a componentes específicos de la librería como una secuencia de rescate, anteriormente definida, se utilizan para "rescatar" la secuencia aleatoria única. Alternativamente, el agente bioactivo se aísla utilizando una secuencia de rescate. Así, por ejemplo, las secuencias de rescate comprenden etiquetas epitópicas o secuencias de purificación que se pueden utilizar para extraer el agente bioactivo, utilizando inmunoprecipitación o columnas de afinidad. En algunos casos, tal como se describe más adelante, también puede ser extraído de la molécula diana primaria, si existe una interacción de unión suficientemente fuerte entre el agente bioactivo y la molécula diana.

Alternativamente, el péptido puede detectarse utilizando espectrometría de masas.

Una vez obtenido, se determina la secuencia del agente bioactivo y/o ácido nucleico. Esta información puede utilizarse de muy diversas maneras.

En una realización preferida, el agente bioactivo se resintetiza y reintroduce en las células diana, para verificar el efecto. Esto puede realizarse utilizando retrovirus, o alternativamente utilizando fusiones con la proteína Tat de VIH-1 y análogos y proteínas relacionadas, que permiten una incorporación muy elevada por parte de las células diana. Ver por ejemplo, Fawell y col., PNAS USA 91:664 (1994); Frankel y col., Cell 55:1189 (1988); Savion y col., J. Biol. Chem. 256:1149 (1981); Derossi y col., J. Biol. Chem. 269:1044 (1994); y Baldin y col., EMBO J. 9:1511 (1990).

En una realización preferida, la secuencia del agente bioactivo se utiliza para generar más agentes bioactivos candidatos. Por ejemplo, la secuencia del agente bioactivo puede ser la base de una segunda tanda de generación de forma aleatoria (sesgada), para desarrollar agentes bioactivos con actividades aumentadas o alteradas. Alternativamente, la segunda tanda de generación de forma aleatoria puede cambiar la afinidad del agente bioactivo. Además, puede ser deseable colocar la región aleatoria identificada del agente bioactivo en otras estructuras de presentación, o alterar la secuencia de la región constante de la estructura de presentación, para alterar las conformaciones/formas del agente bioactivo. Puede también ser deseable el "caminar" por un potencial sitio de unión, de forma similar a la mutagénesis de un bolsillo de unión, manteniendo un extremo de la región del ligando constante y generando de forma aleatoria el otro extremo para desplazar la unión del péptido.

En una realización preferida, tanto el agente bioactivo como el ácido nucleico bioactivo codificantes se utilizan para identificar las moléculas diana, es decir, las moléculas que interfieren con las interacciones de los agentes bioactivos. Tal como se apreciará por los expertos en la materia, pueden haber moléculas diana primarias, a las que se une el agente bioactivo o actúa sobre ellas directamente, y pueden haber moléculas diana secundarias, que son parte de la vía de señalización afectada por el agente bioactivo; estas moléculas deberían denominarse "dianas validadas".

En una realización preferida, se utiliza el agente bioactivo para extraer las moléculas diana. Por ejemplo, tal como se describe aquí, si las moléculas diana son proteínas, la utilización de etiquetas epitópicas o secuencias de purificación puede permitir la purificación de moléculas diana primarias mediante medios bioquímicos (co-inmunoprecipitación, columnas de afinidad, etc.). Alternativamente, el péptido, cuando se expresa en la bacteria y se purifica, puede utilizarse como una sonda contra una librería de expresión de cDNA realizada a partir del mRNA del tipo diana. O, se pueden utilizar los péptidos como "anzuelos" tanto en sistemas de doble o triple híbrido en levaduras y mamíferos. Dicha interacción de las aproximaciones de clonaje ha sido muy útil para aislar proteínas de unión al DNA y otros componentes proteicos que interaccionan. El péptido(s) puede combinarse con otros activadores farmacológicos para estudiar las relaciones epistáticas de las vías de transducción de señal en cuestión. También es posible preparar sintéticamente el agente bioactivo del péptido marcado y utilizar para cribar una librería de DNA expresada en bacteriófagos para seleccionar los cDNAs que se unen al péptido. Además, también es posible utilizar el clonaje del DNA mediante librerías retrovirales para "complementar" el efecto inducido por el péptido. En dicha estrategia, el péptido podría ser un medio de valoración estequiométrico de algún factor importante para una vía de señalización específica. Si esta molécula o actividad se produjera mediante sobre-expresión de un cDNA a partir de una librería de cDNAs, entonces se puede clonar la diana. De modo similar, los cDNAs clonados por cualquiera de los sistemas anteriores de levaduras o bacteriófagos se pueden reintroducir en células de mamífero y de esta forma confirmar que actúan para complementar la función en el sistema sobre el que actúa el péptido.

Una vez se han identificado las moléculas diana primarias, se pueden identificar las moléculas diana secundarias de la misma manera, utilizando la diana primaria como el "anzuelo". De esta forma, se pueden comprender mejor las vías de señalización. De modo similar, también se pueden descubrir los agentes bioactivos específicos para moléculas diana secundarias, con el fin de permitir que actúe un cierto número de agentes bioactivos sobre una vía única, por ejemplo para combinación de terapias.

Los procedimientos de cribaje de la presente invención pueden ser útiles para cribar un gran número de tipos celulares en muy diversas condiciones. En general, las células huésped son células que están implicadas en los estados de la enfermedad y se analizan o seleccionan en condiciones que se producen normalmente en consecuencias no deseables en las células. Cuando se halla un agente bioactivo adecuado, el efecto no deseado puede reducirse o eliminarse. Alternativamente, se pueden reducir o eliminar las consecuencias normalmente deseables, teniendo en cuenta la mejor comprensión de los mecanismos celulares asociados con el estado de la enfermedad o la vía de señalización.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son útiles en aplicaciones contra el cáncer. La capacidad para eliminar rápidamente y de forma específica las células tumorales es la piedra angular de la quimioterapia del cáncer. En general, utilizando procedimientos de la presente invención, se pueden introducir librerías aleatorias en cualquier célula tumoral (de cultivo primario o cultivadas) e identificar los péptidos que inducen apoptosis, muerte celular, pérdida de la división celular o disminución del crecimiento celular. Esto se puede realizar de novo o mediante la generación de forma aleatoria y sesgada de agentes peptídicos conocidos, como la angiostatina, que inhibe el crecimiento de la pared de los vasos sanguíneos. Alternativamente, los procedimientos de la presente invención se pueden combinar con otras terapias cancerosas (p.ej., fármacos o radiaciones) para sensibilizar las células e inducir la apoptosis rápida y específica, la muerte celular, la pérdida de la división celular o la disminución del crecimiento celular después de la exposición a un agente secundario. De modo similar, los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar junto con terapias contra el cáncer para seleccionar antagonistas con el fin de obtener terapias más efectivas y menos tóxicas. Esto es especialmente deseable cuando la quimioterapia es muy cara de producir, como por ejemplo el taxol.

Los oncogenes conocidos como el v-Abl, v-Src, v-Ras y otros inducen un fenotipo transformado que conduce al crecimiento celular anómalo cuando se transfectan en ciertas células. Ello representa también un problema importante en las micro-metástasis. Así, en una realización preferida, las células no-transformadas pueden transfectarse con estos oncogenes y se pueden introducir las librerías aleatorias en estas células, para seleccionar agentes bioactivos que inviertan o corrijan el estado transformado. Una de las características más señaladas de la transformación de células por los oncogenes es la pérdida de inhibición por contacto y la capacidad de crecer en agar blando. Cuando se construyen virus transformantes que contienen v-Abl, v-Src, o v-Ras en vectores retrovirales IRES-puros, se infectan en células diana 3T3 y se someten a la selección por puromicina, todas las células 3T3 se hiper-transforman y se desenganchan de la placa. Las células pueden extraerse mediante lavados con medio fresco. Ello puede servir como base de un cribaje, ya que las células que expresen un agente bioactivo permanecerán adheridas a la placa y formarán colonias.

De modo similar, el crecimiento y/o la expansión de ciertos tumores se incrementa mediante respuestas estimuladoras de los factores de crecimiento y citocinas (PDGF, EGF, Heregulina y otros), que se unen a receptores en la superficie de tumores específicos. En una realización preferida, los procedimientos de la invención se utilizan para inhibir o parar el crecimiento y/o la propagación tumoral, hallándose agentes bioactivos capaces de bloquear la capacidad del factor de crecimiento, o de la citoquina para estimular la célula tumoral. La introducción de librerías aleatorias en células tumorales específicas con la adición del factor de crecimiento o citoquina, se prosigue con la selección de agentes bioactivos que bloquean la unión, la señalización, las respuestas fenotípicas y/o funcionales de estas células tumorales al factor de crecimiento o a la citoquina en cuestión.

De modo similar, la propagación de las células cancerosas (invasión y metástasis) es un problema importante que limita el éxito de las terapias contra el cáncer. La capacidad de inhibir la invasión y/o la migración de células tumorales específicas podría ser una ventaja significativa en la terapia contra el cáncer. Así, en las células tumorales que tienen un elevado potencial metastático (por ejemplo, el melanoma, el carcinoma pulmonar, el carcinoma de mama y el de ovario) se podrían introducir librerías aleatorias y seleccionar péptidos que, en un ensayo de migración o invasión, inhibirían la migración y/o la invasión de células tumorales específicas. Aplicaciones particulares para la inhibición del fenotipo metastático, que podrían permitir una inhibición más específica de la metástasis, incluyen el gen NM23 supresor de la metástasis, que codifica para una dinucleósido difosfato quinasa. Así, los activadores del péptido intracelular de este gen podrían bloquear la metástasis y podría ser de interés un cribaje para su regulación positiva (fusionándolo a un gen reportero). Muchos oncogenes también incrementan la metástasis. Los péptidos que inactivan o contrarrestan los oncogenes mutados RAS, v-MOS, v-RAF, A-RAF, v-SRC, v-FES y v-FMS también podrían actuar como anti-metastáticos. Los péptidos que actúan intracelularmente para bloquear la liberación de combinaciones de proteasas requeridas para la invasión, como las metaloproteasas de matriz y las uroquinasas, podrían ser también antimetastáticos eficaces.

En una realización preferida, se realiza un cribaje de las librerías aleatorias de la presente invención que se introducen en las células tumorales conocidas, para inactivar los genes supresores e invertir con éxito el efecto, bien mediante la reactivación o la compensación del knockout y restaurar así el fenotipo normal. Un ejemplo principal es la inversión de las mutaciones inactivadoras de p53, que se hallan en el 50%, o más, de todos lo cánceres. Dado que las acciones de la p53 son complejas e implican una acción como factor de transcripción, hay probablemente numerosas vías potenciales por las que un péptido o molécula pequeña derivada de un péptido podría invertir la mutación. Un ejemplo podría ser la regulación positiva de la ciclina inmediatamente cadena abajo, dependiente de la quinasa p21CIP1/WAF1. Dicho efecto de inversión, para ser útil debería funcionar con muchas de las mutaciones diferentes conocidas de p53. Ello es en la actualidad objeto de la terapia génica; en donde sería deseable obtener una o más moléculas pequeñas con dicha acción.

Otro ejemplo incluye el cribaje de agentes bioactivos que restauran la función constitutiva de los genes bcra-1 o bcra-2 y de otros genes supresores tumorales importantes en el cáncer de mama, como el gen de la poliposis adenomatosa (APC) y el gen de discos grandes de Drosophila (Dlg), que son componentes de las uniones célula-célula. Las mutaciones de bcra-1 son importantes en los cánceres hereditarios de ovario y de mama y constituyen una aplicación adicional de la presente invención.

En una realización preferida, se utilizan los procedimientos de la presente invención para crear líneas celulares nuevas derivadas de cánceres de pacientes. Un péptido corto de liberación retroviral que inhibe la vía común final de la muerte celular programada podría permitir el establecimiento de líneas celulares a corto y posiblemente a largo plazo. Para ello, se establecerán las condiciones del cultivo in vitro y de la infección de células humanas de leucemia. Existe una necesidad real de procedimientos que permitan el mantenimiento de determinadas células tumorales en cultivo a largo plazo para proseguir con los estudios fisiológicos y farmacológicos. Actualmente, han sido establecidas algunas líneas celulares mediante la utilización de agentes transformantes como el virus de Epstein-Barr, que altera de forma considerable la fisiología existente de la célula. A veces, las células crecerán por ellas mismas en cultivo, aunque ello es un suceso aleatorio. La muerte celular programada (apoptosis) tiene lugar mediante vías complejas de señalización dentro de las células, que por último activan una vía común final produciendo los cambios característicos en la célula que conducen a la destrucción no-inflamatoria de la célula. Es bien conocido que las células tumorales tienen un índice apoptótico elevado, o presentan una propensión a entrar en apoptosis in vivo. Cuando se colocan las células en cultivo, se eliminan los estímulos in vivo del crecimiento celular maligno y las células entran rápidamente en apoptosis. El objetivo podría ser el desarrollo de la tecnología para establecer líneas celulares de cualquiera de las células tumorales primarias, por ejemplo las células de cultivo primario de leucemia humana, de una manera reproducible sin alterar la configuración nativa de las vías de señalización en estas células. De este modo, introduciendo los ácidos nucleicos que codifican para los péptidos que inhiben la apoptosis, se logra incrementar la supervivencia celular in vitro y por lo tanto la oportunidad para estudiar las vías de transducción de señal en las células tumorales humanas. Además, estos procedimientos pueden utilizarse para el cultivo primario de células, por ejemplo de células no tumorales.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son de utilidad en aplicaciones cardiovasculares. En una realización preferida, se pueden seleccionar los cardiomiocitos para prevenir la lesión celular o la muerte en presencia de condiciones normalmente dañinas, incluyendo, pero sin limitarse a, la presencia de fármacos tóxicos (en particular fármacos quimioterapéuticos), por ejemplo, para prevenir el fallo cardíaco después del tratamiento con adriamicina; la anoxia, por ejemplo en la oclusión de la arteria coronaria; y en la lesión celular auto-inmune provocada por el ataque de células linfoides (por ejemplo el observado en la miocarditis post-viral y el lupus). Los agentes bioactivos candidatos se insertan en los cardiomiocitos, las células se someten a la lesión y se seleccionan los agentes bioactivos que prevengan cualquiera o todos los efectos siguientes: apoptosis; despolarización de membrana (es decir, disminución del potencial arritmogénico de la lesión); la hinchazón celular; o la pérdida de iones intracelulares específicos; segundos mensajeros y moléculas activadoras (por ejemplo, ácido araquinóico y/o ácido lisofosfatídico).

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención se utilizan para seleccionar en los cardiomiocitos un potencial de arritmia disminuido. Los cribajes comprenden la introducción de los ácidos nucleicos candidatos que codifican para los agentes bioactivos candidatos, seguido de la aplicación de las lesiones arritmogénicas, con el cribaje de agentes bioactivos, que bloquean la despolarización específica de membrana celular. Esto se puede detectar realizando estudios zonales de corriente, o mediante técnicas de fluorescencia). De forma similar, la actividad del canal (por ejemplo, los canales de potasio y cloruro) en los cardiomiocitos podría regularse utilizando los procedimientos de la presente invención con el fin de aumentar la contractibilidad y prevenir o disminuir las arritmias.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención se utilizan para seleccionar en los cardiomiocitos propiedades contráctiles aumentadas y disminuir el fallo cardíaco potencial. La introducción de las librerías de la invención seguido de la cuantificación de la tasa de cambio de la polimerización/despolimerización de la miosina se puede realizar mediante técnicas de fluorescencia. Los agentes bioactivos que incrementan la tasa de cambio de este fenómeno pueden dar como resultado una respuesta contráctil mayor que la del miocardio entero, parecida al efecto observado con los medicamentos digitálicos.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son de utilidad para identificar agentes que regulan el ciclo del calcio intracelular y del sarcolema en los cardiomiocitos, con el fin de prevenir las arritmias. Los agentes bioactivos se seleccionan para regular el intercambio de sodio-calcio, la función de la bomba de protones de sodio y la regulación de la actividad de la ATPasa dependiente de calcio.

En una realización preferida, se seleccionan los procedimientos de la presente invención que son útiles para identificar agentes que disminuyan los fenómenos embólicos en arterias y arteriolas que desembocan en infartos (y otros sucesos oclusivos que conducen a un fallo del riñón e isquemia límbica) y en la angina que precipita el infarto de miocardio. Por ejemplos, los agentes bioactivos que disminuirán la adhesión de plaquetas y leucocitos, disminuirán los sucesos de oclusión. La adhesión en este caso puede inhibirse por las librerías de la invención que se insertan en las células endoteliales (células quiescentes, o activadas por citoquinas, es decir, IL-1 y factores de crecimiento, por ejemplo PDGF/EGF) y a continuación se puede realizar el cribaje de los péptidos que: 1) regulan negativamente la expresión de moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales (ensayo de unión); 2) bloquean la activación de moléculas de adhesión sobre la superficie de estas células (ensayo de señalización); o 3) liberan de forma autocrina péptidos que bloquean la unión del receptor con el receptor afín sobre la célula adherente.

Los fenómenos embólicos también pueden tratarse activando enzimas proteolíticas en las superficies celulares de las células endoteliales, por lo que se liberan enzimas activas que pueden digerir coágulos de sangre. De esta manera, se lleva a cabo la liberación de las librerías de la presente invención a las células endoteliales, seguido de ensayos fluorogénicos estándares, que permiten controlar la actividad proteolítica en la superficie de la célula dirigida hacia un sustrato conocido. Se pueden seleccionar los agentes bioactivos que activan enzimas específicas dirigidas a determinados sustratos.

En una realización preferida, la inflamación arterial en el caso de la vasculitis y el post-infarto se puede regular disminuyendo las respuestas quimiotácticas de los leucocitos y de los leucocitos mononucleares. Esto se puede lograr bloqueando los receptores quimiotácticos y sus correspondientes vías en estas células. Se pueden insertar en estas células las librerías bioactivas candidatas y se puede inhibir la respuesta quimiotáctica contra diversas quimioquinas (por ejemplo, la familia de la IL-8 de quimioquinas, RANTES) en los ensayos de migración celular.

En una realización preferida, la restenosis arterial después de la angioplastia coronaria puede controlarse regulando la proliferación de las células de la íntima vascular y capilares y/o células endoteliales arteriales. En estos tipos de células, se pueden insertar las librerías de agentes bioactivos candidatos y controlarse su proliferación en respuesta a los estímulos específicos. Una aplicación podría implicar los péptidos intracelulares que bloquean la expresión, o la función de c-myc y de otros oncogenes en las células del músculo liso para parar su proliferación. Una segunda aplicación puede implicar la expresión de librerías en las células del músculo liso vascular para inducir selectivamente su apoptosis. La aplicación de moléculas pequeñas derivadas de estos péptidos puede requerir la liberación del fármaco dirigido; ello es posible gracias al recubrimiento con hidrogel, cánulas y sistemas de catéteres para infusión. También pueden ser candidatos terapéuticos, los péptidos que regulan negativamente los receptores de la endotelina-1A, o los que bloquean la liberación de la endotelina-1A, potente mitógeno celular del músculo liso vascular vasoconstrictor. Los péptidos que pueden aislarse a partir de estas librerías, inhiben el crecimiento de estas células o previenen la adhesión de otras células en la circulación que liberan factores de crecimiento autocrino como, por ejemplo, las plaquetas (PDGF) y los leucocitos mononucleares.

El control del crecimiento de los capilares y de los vasos sanguíneos es un importante objetivo para promover un flujo sanguíneo aumentado en las áreas isquémicas (crecimiento), o para cortar el aporte de sangre (inhibición de la angiogénesis) de los tumores. Las librerías de agentes bioactivos candidatos pueden insertarse en las células endoteliales capilares y controlar su crecimiento. Los estímulos, como una tensión baja de oxígeno y diversos grados de factores angiogénicos, pueden regular las respuestas y así se pueden aislar los péptidos que produzcan el fenotipo adecuado. También podría ser de utilidad la selección por antagonismo del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares, importante en la angiogénesis.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son útiles en el cribaje y selección de péptidos reguladores del metabolismo de las LDL y HDL, según generen una disminución en los mecanismos productores de aterosclerosis. Las librerías candidatas se pueden insertar en las células adecuadas (incluyendo hepatocitos, leucocitos mononucleares, células endoteliales) y a continuación se pueden seleccionar los péptidos que conducen a una disminución de la liberación de LDL o a una reducción de la síntesis de LDL, o a la inversa para un incremento en la liberación o síntesis de HDL. Los agentes bioactivos también pueden aislarse de las librerías candidatas que reducen la producción de LDL oxidadas, quienes están implicadas en la arterosclerosis y se han aislado a partir de lesiones ateroscleróticas. Ello puede suceder al disminuir su expresión, activando los sistemas o enzimas reductoras, o bloqueando la actividad o la producción de enzimas implicadas en la producción de las LDL oxidadas, como por ejemplo la 15-lipoxigenasa en macrófagos.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención se utilizan para regular la obesidad mediante el control de mecanismos de ingesta de alimentos, o la disminución de respuestas de las vías de señalización del receptor que regulan el metabolismo. Los agentes bioactivos que regulan o inhiben las respuestas del neuropéptido Y (NPY), receptores de la colecistoquinina y galanina, son particularmente deseables. Las librerías candidatas se pueden insertar en las células que contienen estos receptores clonados, y se pueden seleccionar los péptidos inhibidores que se secretan de forma autocrina y que bloquean las respuestas de señalización a la galanina y el NPY. De forma similar, pueden hallarse péptidos que regulan el receptor de la leptina.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son útiles en las aplicaciones de neurobiología. Las librerías candidatas pueden utilizarse para seleccionar anti-apoptóticos para preservar la función neuronal y prevenir la muerte neuronal. Los cribajes iniciales se realizarán en cultivos celulares. Una aplicación incluirá la prevención de la muerte neuronal, por apoptosis, en la isquemia cerebral que provoca el infarto. La apoptosis, se bloquea por la proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP); la selección por su regulación positiva, o la realización de cualquier etapa acoplada proporcionaría péptidos que bloquean selectivamente la apoptosis neuronal. Otras aplicaciones incluyen las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Huntington.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son de utilidad en aplicaciones de biología ósea. Se sabe que los osteoclastos desempeñan un papel en el remodelaje del hueso mediante la destrucción del hueso "viejo", de este modo los osteoclastos producen hueso "nuevo". En la osteoporosis, se produce un desequilibrio de este proceso. La super-actividad de los osteoclastos puede regularse insertando librerías candidatas en estas células y buscando a continuación los agentes bioactivos que producen: 1) reducción del procesamiento del colágeno en estas células; 2) reducción de la formación de agujeros en las astillas óseas; y 3) reducción de la liberación del calcio de los fragmentos óseos.

Los procedimientos de la presente invención también pueden utilizarse para seleccionar agonistas de las proteínas morfogénicas del hueso y miméticos hormonales para estimular, regular o aumentar la formación de hueso nuevo (de forma similar a la hormona paratiroidea y la calcitonina, por ejemplo). Todos ellos tienen una utilización en la osteoporosis, en las fracturas de curación pobre y para acelerar la tasa de curación de las nuevas fracturas. Además, las líneas celulares originarias de tejido conectivo pueden tratarse con librerías candidatas y seleccionarse por su crecimiento, proliferación, actividad estimuladora del colágeno y/o la capacidad de incorporar prolina en los osteoblastos diana. Alternativamente, las librerías candidatas se pueden expresar directamente en osteoblastos o condrocitos y seleccionarse por su producción de colágeno o hueso.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son útiles en aplicaciones de biología de la piel. Las respuestas de los queratinocitos a una diversidad de estímulos pueden dar como resultado la psoriasis, un cambio proliferativo en estas células. Las librerías candidatas se pueden insertar en las células extraídas de las placas psoriáticas activas y seleccionar los agentes bioactivos que reducen la tasa de crecimiento de estas células.

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En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son de utilidad en la regulación o la inhibición de la formación de queloides (es decir, cicatrización excesiva). Las librerías candidatas se insertan en las células del tejido conectivo procedente de individuos con esta condición y se aíslan los agentes bioactivos que reducen la proliferación, la formación de colágeno o la incorporación de prolina. Los resultados de este trabajo se pueden extender al tratamiento de la cicatrización excesiva que tiene lugar en los pacientes quemados. Si se halla un motivo peptídico común en el contexto del queloide, entonces se puede utilizar de manera tópica para disminuir la cicatrización post-quemadura.

De forma similar, la curación de heridas en las úlceras diabéticas y otras condiciones crónicas de "fallo de curación" en la piel y las extremidades se puede regular proporcionando señales adicionales a las células que pueblan la piel y las capas dérmicas. Los miméticos de factores de crecimiento pueden, de hecho, ser muy útiles para esta condición. Se pueden insertar las librerías candidatas en las células de tejido conectivo de la piel y a continuación se pueden aislar los agentes bioactivos que promueven el crecimiento de estas células en condiciones "severas", como por ejemplo la tensión de oxígeno baja, pH bajo y la presencia de mediadores inflamatorios.

Las aplicaciones cosméticas de la presente invención incluyen el control de la producción de melanina en los melanocitos de la piel. Un péptido que tiene lugar de forma natural, arbutina, es un inhibidor de la tirosina hidroxilasa, una enzima clave en la síntesis de melanina. Las librerías candidatas se pueden insertar en los melanocitos y se pueden aplicar a estas células los estímulos conocidos que incrementan la síntesis de melanina. Así, se, se pueden aislar los agentes bioactivos que inhiben la síntesis de melanina en estas condiciones.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son de utilidad en aplicaciones endocrinológicas. La tecnología de las librerías peptídicas retrovirales se puede aplicar ampliamente a cualquier cadena endocrina, de factores de crecimiento, citoquinas o quimioquinas que implique un péptido de señalización, o una proteína que actúe de forma endocrina, paracrina o autocrina, que se una o dimerice con un receptor y active una cascada de señalización que tenga consecuencias fenotípicas o funcionales conocidas. Los procedimientos se aplican de modo que se aísla un péptido que mimetice la hormona deseada (por ejemplo, la insulina, la leptina, la calcitonina, PDGF, EGF, EPO, GMSCF, IL-17 y miméticos) o inhiba su acción de bloquear la liberación de la hormona, bloqueando su unión a un receptor específico o proteína transportadora (por ejemplo, la proteína de unión a CRF), o inhibiendo las respuestas intracelulares de las células diana específicas a la hormona. La selección de los péptidos que incrementan la expresión o la liberación de hormonas de las células que los producen normalmente podría tener muchas aplicaciones en las condiciones de deficiencia hormonal.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son útiles en las aplicaciones de enfermedades infecciosas. La latencia viral (virus herpes como el CMV, EBV, HBV y otros virus como el VIH) y su reactivación son un problema importante, en particular en pacientes inmunosuprimidos (pacientes con SIDA y pacientes transplantados). La capacidad para bloquear la reactivación y la propagación de estos virus es un objetivo importante. Las líneas celulares conocidas que contienen o son susceptibles a la infección de virus latentes pueden infectarse con el virus específico y luego aplicarles los estímulos que han demostrado que conducen a la reactivación y la replicación viral. Esto puede proseguirse por la cuantificación de los títulos virales en el medio y la evaluación de células según sus cambios fenotípicos. Las librerías candidatas pueden a continuación insertarse en estas células en las condiciones anteriores y se pueden aislar los péptidos que bloquean o disminuyen el crecimiento y/o la liberación de los virus. Al igual que con los quimioterapéuticos, estos experimentos también pueden realizarse con fármacos que son solamente parcialmente eficaces con respecto a estos resultados y se pueden aislar los agentes bioactivos que incrementan el efecto viricida de estos fármacos.

Una característica común de muchos de estos agentes bioactivos es la capacidad para bloquear la infección de VIH-1. El VIH-1 requiere de CD4 y un co-receptor que puede ser uno de los siete receptores acoplados a proteínas G transmembranas. En el caso de la infección de macrófagos, el CCR-5 es el co-receptor requerido, existiendo una fuerte evidencia de que sea un bloque de CCR-5 el que proporcione la resistencia a la infección por VIH-1. Existen dos evidencias para esta hipótesis. En primer lugar, se sabe que los ligandos naturales para CCR-5, las quimioquinas RANTES, MIP1a y MP1b son responsables de la resistencia a VIH-1 mediada por CD8+. En segundo lugar, los individuos homocigotos para un alelo mutado de CCR-5 son completamente resistentes a la infección por VIH. Así, un inhibidor de la interacción de CCR-5/VIH podría ser de gran interés tanto para los biólogos como para los clínicos. Las construcciones ancladas extracelularmente ofrecen muy buenas herramientas para dicho descubrimiento. En las construcciones con un amarre de glicina-serina, marcador epitópico, transmembrana (ssTMV G20 E TM), se puede colocar una librería peptídica ciclada y aleatoria de secuencia general CNNNNNNNNNNC o C-(X)_{n}-C. Y a continuación se infecta una línea celular que exprese el CCR-5 con los retrovirus que contienen esta librería. Utilizando un anticuerpo contra CCR-5 se puede utilizar el FACS para separar las células deseadas según la unión de este anticuerpo con el receptor. Se asumirá que todas las células que no se unan al anticuerpo contienen inhibidores de este sitio de unión al anticuerpo. Estos inhibidores, se pueden analizar posteriormente en la construcción retroviral por su capacidad para inhibir la entrada de VIH-1.

Se sabe que los virus entran en las células utilizando receptores específicos para unirse a éstas (por ejemplo el VIH utiliza el CD4, los coronavirus utilizan el CD13, el virus de la leucemia murina utiliza la proteína de transporte y el virus del sarrampión utiliza el CD44) y para fusionarse con ellas (el VIH utiliza el receptor de la quimioquina). Las librerías candidatas se pueden insertar en las células diana conocidas por ser permisibles a estos virus y los agentes bioactivos que bloquean la capacidad de estos virus para unirse y fusionarse con las células diana específicas.

En una realización preferida, la presente invención halla una utilización con los organismos infecciosos. Los organismos intracelulares como las micobacterias, listeria, salmonella, pneumocystis, yersinia, leishmania, T. cruzi, pueden permanecer y replicarse dentro de estas células, convirtiéndose en activos en pacientes inmunosuprimidos. En la actualidad existen fármacos en el mercado y en desarrollo que son parcialmente eficaces o ineficaces contra estos organismos. Estas librerías candidatas se pueden insertar en células específicas infectadas con estos organismos (pre- o post-infección) y se pueden seleccionar los agentes bioactivos que promueven la destrucción intracelular de estos organismos de una manera análoga a los "péptidos antibióticos" intracelulares, parecido a las magaininas. Además, se pueden seleccionar péptidos que incrementen las propiedades germicidas de los fármacos ya en investigación y que tienen una potencia insuficiente por ellos mismos; pero que en combinación con un péptido específico de una librería candidata son dramáticamente más potentes gracias a un mecanismo sinergístico. Por último, se pueden aislar agentes bioactivos que alteren el metabolismo de estos organismos intracelulares, de modo que finalicen su ciclo vital intracelular al inhibirse un suceso clave del organismo.

Los fármacos antibióticos que se utilizan ampliamente presentan cierta dependencia de la dosis y toxicidades tisulares específicas. Por ejemplo, se observa toxicidad renal con la utilización de gentamicina, tobramicina y amfotericina; hepatoxicidad con la utilización de INH y rifampicina; toxicidad de la médula ósea con cloramfenicol; y toxicidad plaquetaria con la ticarcilina, etc. Estas toxicidades limitan su utilización. Las librerías candidatas se pueden introducir en los tipos específicos de células, si se produjeran por los antibióticos cambios específicos que conducen a la lesión celular o la apoptosis, y a continuación se podrían aislar los agentes bioactivos que confieren protección, cuando estas células se tratan con estos antibióticos específicos.

Además, la presente invención halla utilización en la selección de agentes bioactivos que bloquean los mecanismos de transporte de antibióticos. La secreción rápida desde la circulación sanguínea de determinados antibióticos limita su utilización. Por ejemplo, las penicilinas se acumulan rápidamente por determinados mecanismos de transporte en el riñón y el plexo coroideo del cerebro. La probenecida se sabe que bloquea este transporte e incrementa los niveles séricos y tisulares. Los agentes candidatos se pueden insertar en células específicas derivadas del riñón y de células del plexo coroideo, conocido por tener mecanismos de transporte activo para los antibióticos. Así, se pueden aislar agentes bioactivos que bloqueen el transporte activo de antibióticos específicos y por ello prolonguen la vida media en el suero de estos fármacos.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son útiles en las aplicaciones relacionadas con la resistencia a fármacos y la toxicidad de los fármacos. La toxicidad del fármaco es un problema clínico importante. Esto puede manifestarse como lesión celular o específica de tejido, limitándose así la eficacia del fármaco. Los ejemplos incluyen la mielo-ablación en dosis elevadas de quimioterapia contra el cáncer, lesión en células epiteliales de vías aéreas e intestino y en la pérdida capilar. Ejemplos específicos incluyen la muerte de cardiomiocitos inducida por la adriamicina, la toxicidad renal inducida por la cisplatinina, los trastornos de motilidad intestinal inducidos por la vincristina y la lesión renal inducida por la ciclosporina. Las librerías candidatas se pueden introducir en tipos celulares específicos, obteniéndose respuestas fenotípicas o funcionales inducidas por el fármaco, en presencia de los fármacos y se pueden aislar los agentes que invierten o protegen el tipo celular específico contra los cambios tóxicos frente a la exposición al fármaco. Estos efectos se manifiestan bloqueando la apoptosis de la célula inducida por el fármaco, por lo que se realizarán cribajes iniciales de supervivencia celular en presencia de niveles elevados de fármacos, o combinaciones de fármacos utilizados en quimioterapia combinatoria.

La toxicidad del fármaco puede ser debida a un metabolito específico producido en el hígado o el riñón que sea altamente tóxico en células específicas, o debido a las interacciones del fármaco en el hígado que bloquean o incrementan el metabolismo de una fármaco administrado. Las librerías candidatas se pueden introducir en las células hepáticas o renales después de la exposición de estas células al fármaco conocido para producir los metabolitos tóxicos. Se pueden aislar los agentes bioactivos que alteren la forma en que se metaboliza el fármaco por las células renales o hepáticas y en consecuencia se pueden identificar los agentes específicos que previenen la generación de un metabolito tóxico específico. La generación del metabolito puede controlarse mediante espectrometría de masas, pudiéndose valorar los cambios fenotípicos mediante microscopía. También se puede realizar un cribaje de este tipo con hepatocitos en cultivo, co-cultivados con células de lectura, especialmente sensibles al metabolito tóxico. Las aplicaciones incluyen inhibidores reversibles (para limitar la toxicidad) de enzimas implicadas en el metabolismo del fármaco.

La resistencia múltiple de fármacos, y por lo tanto la selección de células tumorales, el sobre-crecimiento y la recaída conducen a la morbilidad y mortalidad en los pacientes de cáncer. Las librerías candidatas se pueden introducir en líneas celulares tumorales (primarias y cultivadas) que han demostrado una resistencia específica o múltiple a fármacos. A continuación, se pueden identificar los agentes bioactivos que confieren la sensibilidad al fármaco cuando se exponen las células al fármaco de interés, o a los fármacos utilizados en la quimioterapia combinatorial. La lectura puede ser la aparición de apoptosis en estas células, los cambios de permeabilidad de membrana, la liberación de iones intracelulares y los marcadores fluorescentes. Las células, en las que la multi-resistencia a fármacos implica a los transportadores de membrana, se pueden precargar con sustratos fluorescentes transportadores y la selección se lleva a cabo para los péptidos que bloquean el flujo normal del fármaco fluorescente de estas células. Las librerías candidatas son particularmente adecuadas para realizar un cribaje de péptidos que inviertan los mecanismos intracelulares poco caracterizados, o de reciente descubrimiento de resistencia, o los mecanismos para los que pocos o ningún quimiosensibilizador exista actualmente, como por ejemplo los mecanismos que implican la LRP (proteína de resistencia del pulmón). Esta proteína está implicada en la multi-resistencia a fármacos en el carcinoma de ovario, el melanoma maligno metastático y la leucemia mieloide aguda. Son de especial interés los ejemplos que incluyen el cribaje de agentes que inviertan más de un mecanismo de resistencia importante en una única célula, lo que sucede en un subgrupo de la mayoría de células resistentes al fármaco, las cuales son también dianas importantes. Las aplicaciones deberían incluir el cribaje de péptidos inhibidores de MRP (proteínas relacionadas con la multi-resistencia a fármacos) y la LRP para el tratamiento del melanoma metastático de células resistentes, para inhibidores de la p-glicoproteína y de la LRP en la leucemia mieloide aguda y para la inhibición (mediante cualquier mecanismo) de las tres proteínas para el tratamiento de células pan-resistentes.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son útiles para mejorar la realización de fármacos existentes o en desarrollo. El metabolismo del primer paso limita la biodisponibilidad oral de los fármacos administrados oralmente y puede dar como resultado una disminución de la eficacia, así como la necesidad de administrar más fármaco para un efecto deseado. Los inhibidores reversibles de las enzimas implicadas en el metabolismo del primer paso pueden, en consecuencia, ser un incrementador adicional de la eficacia de estos fármacos. El metabolismo del primer paso tiene lugar en el hígado, por lo que los inhibidores de las enzimas catabólicas correspondientes pueden aumentar el efecto de los fármacos afines. Los inhibidores reversibles se deberían liberar al mismo tiempo que, o ligeramente antes, el fármaco de interés. Así, podría ser de interés realizar un cribaje de librerías candidatas en hepatocitos para buscar inhibidores (mediante cualquier mecanismo, como una proteína reguladora negativamente, así como una inhibición directa de la actividad) de isoenzimas especialmente problemáticas. Estas incluyen las isoenzimas CYP3A4 del citocromo P450, que están implicadas en el metabolismo del primer paso de los fármacos anti-VIH saquinavir y indinavir. Otras aplicaciones podrían incluir los inhibidores reversibles de la UDP-glucuroniltransferasas, las sulfotransferasas, las N-acetil-transferasas, las epóxido-hidrolasas y la glutatión S-transferasa, dependiendo del fármaco. Los cribajes se deberían realizar en hepatocitos en cultivo o en microsomas de hígado y podrían implicar anticuerpos que reconozcan la modificación específica realizada en el hígado, o en células de lectura co-cultivadas, si el metabolito tuviera una bioactividad distinta a la del fármaco no transformado. Las enzimas modificadoras del fármaco podrían no ser necesariamente conocidas, si el cribaje fuera para una ausencia de alteración del fármaco. En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son de utilidad en aplicaciones de respuestas inmunobiológicas, inflamatorias y alérgicas. La regulación de las respuestas de linfocitos T es un objetivo deseado con el fin de modular las enfermedades inmuno-mediadas de una forma específica. Las librerías candidatas se pueden introducir en subgrupos de células T específicas (TH1, TH2, CD4+, CD8+ y otros) y las respuestas que caracterizan esos sustratos (generación de citocinas, citotoxicidad, proliferación en la respuesta al antígeno presentado por un leucocito mononuclear y otras) ser modificadas por miembros de la librería. Se pueden seleccionar los agentes que incrementan la respuesta fisiológica de un subgrupo de células T conocidas. Esta aproximación será de utilidad en cualquier condición, incluyendo: 1) enfermedades auto-inmunes en donde se desea inducir un estado tolerante (seleccionar un péptido que inhiba el subgrupo de células T para reconocer un antígeno de la propia célula); 2) enfermedades alérgicas, en donde se desea disminuir la estimulación de células productoras de IgE (seleccionar un péptido a partir de subgrupos de células T, que bloquee la liberación de citoquinas estimuladoras de células B); 3) en pacientes trasplantados, si se desea inducir una inmunosupresión selectiva (seleccionar el péptido que disminuya las respuestas proliferativas de las células T contra antígenos extraños); 4) en estados linfoproliferativos, si se desea inhibir el crecimiento o sensibilizar un tumor de célula T específico a la quimioterapia y/o la radiación; 5) en la vigilancia tumoral, si se desea inhibir la eliminación celular provocada por células T citotóxicas mediante el ligando Fas portado por las células tumorales; y 5) en las enfermedades inflamatorias mediadas por células T como la artritis reumatoide, las enfermedades del tejido conectivo (SLE), la esclerosis múltiple y la enfermedad inflamatoria de los intestinos, si se desea inhibir la proliferación de las células T causantes de la enfermedad (promover su apoptosis selectiva) y la destrucción selectiva resultante de los tejidos diana (cartílago, tejido conectivo, oligodendrocitos, células endoteliales del intestino, respectivamente).

La regulación de las respuestas de las células B permitirá una modulación más selectiva del tipo y cantidad de inmunoglobulina generada y secretada por los subgrupos celulares B específicos. Las librerías candidatas pueden insertarse en las células B y seleccionarse a continuación los agentes bioactivos que inhiban la liberación y síntesis de una inmunoglobulina específica. Esto puede ser útil en las enfermedades auto-inmunes caracterizadas por la sobreproducción de auto-anticuerpos y la producción de anticuerpos causantes de alergia, como las IgE. También pueden identificarse los agentes que inhiben o incrementan la unión de una subclase de inmunoglobulina específica a un antígeno específico, bien propio o foráneo. Por último, se pueden seleccionar los agentes que inhiben la unión de una subclase se inmunoglobulina específica a su receptor en tipos celulares específicos.

De forma similar, se pueden seleccionar los agentes que afectan la producción de citoquinas, generalmente utilizando dos sistemas celulares. Por ejemplo, es posible evaluar la producción de citoquinas a partir de macrófagos, monocitos, etc. De forma similar, es posible seleccionar los agentes que mimetizan las citoquinas, por ejemplo la eritropoyetina y la IL-7, o los agentes que se unen a citoquinas como el TNF-\alpha, antes de que se unan al receptor.

El procesamiento de antígenos por los leucocitos mononucleares (ML) es una etapa temprana importante en la capacidad del sistema inmune para reconocer y eliminar las proteínas foráneas. Los agentes candidatos se pueden insertar en las líneas celulares ML y en consecuencia se pueden seleccionar los agentes que alteran el procesamiento intracelular de los péptidos foráneos y la secuencia del péptido foráneo que se presenta a las células T por los MLs en su superficie celular en el contexto de Clase II MHC. Es posible buscar los miembros de la librería que incrementan las respuestas inmunes de un subgrupo de células T particular (por ejemplo, el péptido podría de hecho trabajar como una vacuna), o buscar un miembro de la librería que se una con mayor fuerza al MHC, con lo que desplazaría los péptidos naturales, aunque sin embargo el agente sería menos inmunogénico (menos estimulador para un clon de célula T específico). Este agente induciría de hecho una tolerancia inmune y/o disminuiría las respuestas inmunes a las proteínas foráneas. Esta aproximación podría utilizarse en el trasplante, las enfermedades autoinmunes y las enfermedades alérgicas.

La liberación de mediadores inflamatorios (citoquinas, leucotrinas, prostaglandinas, factor de activación plaquetaria, histamina, neuropéptidos y otros mediadores peptídicos y lipídicos) es un elemento clave en el mantenimiento y la amplificación de respuestas inmunes aberrantes. Es posible insertar las librerías candidatas en MLs, mastocitos, eosinófilos y otras células que participan en una respuesta inflamatoria específica y seleccionar a continuación los agentes bioactivos que inhiben la síntesis, la liberación y la unión del receptor afín de cada uno de estos tipos de mediadores.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención son de utilidad en aplicaciones biotecnológicas. La expresión de la librería candidata en células de mamífero puede también considerarse para otras aplicaciones farmaceúticas relacionadas, como las modificaciones de la expresión de proteínas, el plegamiento de proteínas, o la secreción de proteínas. Uno de estos ejemplos podría hallarse en la producción comercial de fármacos proteicos en células CHO u otras células. Las librerías candidatas se podrían utilizar para generar agentes bioactivos seleccionados para producir un incremento en la tasa de crecimiento celular (quizás péptidos que mimeticen los factores de crecimiento, o actúen como agonistas de las vías de transducción de señal de factores de crecimiento), para la resistencia de patógenos (ver la sección anterior), para la ausencia de sialilación o glicosilación (bloqueando las glicotransferasas, o reconduciendo el tráfico de la proteína en la célula), para permitir el crecimiento en medio autoclavado, o para el crecimiento en medio exento de suero. Todas estos sistemas permitirían incrementar la productividad y disminuirían los costes en la producción de fármacos proteicos.

Los péptidos aleatorios expresados en la superficie de las células circulantes se pueden utilizar como herramientas para identificar secuencias peptídicas diana específicicas de órganos, tejidos y células. Cualquier célula introducida en la corriente sanguínea de un animal que expresa una librería direccionada en la superficie celular se puede seleccionar para dirigirse a un órgano o tejido específico. A continuación, se puede acoplar la secuencia del agente bioactivo identificada a un anticuerpo, enzima, fármaco, agente o sustancia utilizada en la obtención de imágenes del órgano que se desee visualizar.

Se pueden seleccionar otros agentes utilizando la presente invención, éstos incluyen: 1) agentes que bloquean la actividad de los factores de transcripción, utilizando líneas celulares con genes reporteros; 2) agentes que bloquean la interacción de dos proteínas conocidas en las células, utilizando la ausencia de funciones celulares normales, el sistema del doble híbrido de mamíferos o los mecanismos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia para la detección; y 3) se pueden identificar los agentes mediante la unión de un aleatorio a una región de la proteína de unión, para permitir las interacciones con las moléculas cerradas estéricamente, es decir, dentro de una vía de señalización, para localizar los efectos de un área funcional de interés.

Los ejemplos siguientes sirven para describir más completamente la forma de utilizar la invención anteriormente descrita, así como para ajustar las mejores formas contempladas para llevar a cabo diversos aspectos de la invención. Se entenderá que estos ejemplos de ninguna manera sirven para limitar el verdadero ámbito de esta invención, sino que se presentan con propósitos ilustrativos. Todas las referencias aquí citadas se han incorporado aquí en su totalidad como referencias bibliográficas.

Ejemplos Ejemplo 1 Prueba de experimentos conceptuales

Se utilizaron numerosos sistemas para demostrar que las construcciones retrovirales subrayadas aquí son capaces de producir un fenotipo seleccionable.

Protección de Bcl2 y CPP32 de la apoptosis

Se sabe que los péptidos Bcl2 y CPP32 son capaces de inhibir la apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral y por la cicloheximida.

Ensayo Apotag: TUNEL (TdT-mediated dUTP-fluorescein nick end labeling) equipo de Boehringer Mannheim, catálogo n°. 168795

Las células 3T3 infectadas transitoriamente con los plásmidos MFGLacZ, BCL2 o CPP322 crecidas a una confluencia del 50% en el momento de la inducción con hTNFa (50 ng/ml de medio) y cicloheximida (100 mg/ml medio) durante 6 horas. A las 6 horas, se lavaron las células y se cosecharon 24 h después de la inducción. Para obtener las células, se eliminó primero todo el medio de cultivo (con el fin de no recoger ninguna célula apoptótica, células flotantes) incluyendo el medio de los lavados. Las células se tripsinizaron, se centrifugaron y se lavaron con PBS y BSA al 1% y se transfirieron a un tubo eppendorf, repitiéndose el lavado.

Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30 minutos, se lavaron con PBS/BSA y luego se resuspendieron en tampón de permeabilización durante 2 minutos en hielo. Después de la permeabilización, las células se lavaron dos veces en PBS/BSA y se incubaron a 37°C durante 1 hora con el tampón de marcaje que contenía dUTP marcado con fluoresceína, una mezcla de nucleótidos no marcados y la terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT). Las células se lavaron dos veces con PBS/BSA, se resuspendieron en PBS/BSA y se transfirieron a un tubo FACS para su análisis. Las muestras se visualizaron también en el microscopio de fluorescencia. Los resultados mostraron que la expresión del péptido Bcl2 o del CPP32 en las células 3T3 a partir de un promotor retroviral MSCV in vivo fue capaz de inhibir la apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral y la cicloheximida.

Tinción con yoduro de propidio de las células fijadas para el ensayo de apoptosis: (Sherwood y Schimke, Methods in Cell Biology, 46:77-87, 1995)

Las células infectadas transitoriamente con MFGLacZ, Bc12 o CPP32 se plaquearon y trataron con TNF/CXH, tal como se describió anteriormente y a continuación se recogieron y lavaron como antes. Las células se resuspendieron en etanol al 70% en PBS a 4ºC y se mantuvieron a 4°C durante toda la noche. Cuando estuvieron preparadas para el FACS, las células se tiñeron con yoduro de propidio de la manera siguiente. Las células se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 segundos y se lavaron una vez con PBS/BSA. A continuación, se resuspendieron en 50 ml de solución de coloración (PBS con 50 mg/ml de RNasa A (sin DNasa) con 10 mg/ml de yoduro de propidio) y se incubaron a 37°C durante por lo menos 1 h. Las células se centrifugaron y resuspendieron en solución de PBS/BSA con 10 mg/ml de yoduro de propidio y se analizaron mediante rastreo de FACS. Los resultados mostraron que la expresión del péptido BCL2 o del CPP32 en las células 3T3 fue capaz de inhibir la apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral y la cicloheximida, según se analizó por la tinción con PI de las células, lo que amplió los resultados previos.

Tinción de bromuro de etidio/naranja de acridina de las células BAF3 para estudiar su morfología celular

Las células BAF3 se infectaron con vectores retrovirales WZL IRES NEP que no contenían inserto o que contenían el DNA codificante para el péptido LacZ(ZIN), Bc12 (BIN), CPP32 (CIN), o una mezcla de péptidos controles (PIN). Se seleccionaron las células con G418 después de la infección con los vectores retrovirales anteriores y los supervivientes se estimularon con 5 mg/ml del anticuerpo FAS. Después de la estimulación, las células se tiñeron con bromuro de etidio y naranja de acridina (2 mg/ml cada uno) y se visualizaron al microscopio de fluorescencia utilizando un filtro de ultravioleta. Se contaron 250 células y se calculó el porcentaje de las apoptóticas. Se obtuvieron resultados similares a los obtenidos con las células 3T3 estimuladas con TNF/CXH, los vectores que codificaban para el CPP32 fueron capaces de inhibir la apoptosis inducida por FAS. El péptido control también presentó un efecto en este sistema, se observó aproximadamente la mitad de lo observado con el péptido BCL2 o CPP32.

Ensayo enzimático de la actividad de CPP32

Equipo de ensayo de CPP32: equipo de ensayo colorimétrico Clontech CPP32 (cat. K2027-2): las células se infectaron con los vectores descritos en el Apartado I de la sección C y se seleccionaron en medio G418 antes del ensayo. Placas de 6 pocillos de células 3T3 casi confluentes se estimularon con TNF/CXH, tal como se describió anteriormente y se cosecharon a los 30 min, 1, 2 y 4 horas después de estimular de la manera siguiente. Las células se tripsinizaron y se recogieron tal como se describió anteriormente. Después de transferirlas a un tubo eppendorf, las células se centrifugaron y se resuspendieron en 50 ml de tampón de lisis de células frío. Las células se incubaron durante 10 minutos en hielo, luego en 50 ml de 2X tampón de reacción con DTT. Se añadieron 5 ml del sustrato conjugado colorimétrico (DEVD-paranitroanilida, 50 mM concentración final) a cada tubo, incubándose a 37°C durante 30 minutos. Las muestras se transfirieron a una placa de 96 pocillos y luego se realizó la lectura en un espectrofotómetro a D.O. de 405 nm. Los resultados mostraron que los extractos celulares de células WIN incrementaban la actividad enzimática de CPP32 a las 2 horas, según se cuantificó mediante el corte del sustrato DEVD-pNA a su forma colorimétricamente detectable. A las 4 horas, las células empezaron a morir y la actividad disminuyó. En las células que contenían el inhibidor del péptido BCL2 o el de CPP32, no se observó este incremento de la actividad. En el caso de BCL2, esto debería estar causado por la inhibición de la apoptosis cadena arriba de la enzima. Con el péptido inhibidor de CPP32, estaría causado por la inhibición directa de la actividad enzimática. Estos resultados in vitro son consistentes con los resultados observados en los ensayos de muerte celular descritos anteriormente.

Estudios de localización, utilizando el inhibidor de PKC

Las células del clon 8 de 10T1/2 murinas se estimularon con PMA, que causa la translocación del PKC desde el citoplasma al núcleo. Esta translocación se piensa que está mediada por la unión a una proteína en el sitio de acción, denominada proteína RAC (receptor para la proteína quinasa C activada). Las células del clon 8 no infectadas se compararon con las células infectadas con las construcciones retrovirales pBabe puro que contenían las secuencias codificantes para los péptidos control mezclados etiquetados con el epítopo Flu (MGGGYPYDVPDYAGSLZ), o con el péptido inhibidor (GKQKTKIKGPP) que es idéntico a la región C2 de todas las enzimas PKC. A continuación se analizaron las células mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo específico para PKCa y se visualizó con una anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano.

Este experimento se realizó a dos densidades celulares distintas, de la manera siguiente:

1. Se plaquearon células a 2.000 células/cm^{2} en cubreobjetos de 22 mm^{2} recubiertos con poli-lisina y se permitió el crecimiento durante 2 días. En 3/20, las células fueron casi confluentes. Las células se replaquearon a una densidad inferior y se analizaron en condiciones idénticas en 3/27.

2. Se añadió PMA a 10^{-5} M al medio durante 30 minutos a 37°C.

3. Se lavaron las células con tampón SCB (tampón fisiológico precalentado a 37°C antes de su utilización) y luego se colocaron en glutaraldehido al 3,7% en tampón SCB durante 20 minutos a 37°C.

4. Las células se lavaron a continuación en tampón SCB y se incubaron con glutaraldehido en tampón SCB durante 20 minutos a 37°C. Las células se lavaron en tampón SCB y luego se incubaron con SCBT (SCB con Triton-X-100 al 0,1%) durante 10 minutos a temperatura ambiente.

5. Se extrajeron los cubreobjetos de la placa de 6 pocillos y se lavaron mojándolo en PBS/Tween al 1% a temperatura ambiente, colocándolos luego sobre un parafilm en un recipiente cubierto.

6. Los cubreobjetos se incubaron con suero de cabra bloqueante al 1,5% en PBS con agitación en un entorno humidificado a temperatura ambiente.

7. Se aspiraron las soluciones de los cubreobjetos y luego se lavaron con PBS. Se depositó el anticuerpo primario anti-PKCa sobre los cubreobjetos y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente como antes. En todos los experimentos, se utilizó una dilución 1:500 de anticuerpo.

8. A continuación, se lavaron los cubreobjetos con PBS tres veces y luego se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con un anticuerpo de la segunda etapa, conjugado a biotina, tal como se indica en el equipo de Santa Cruz ABC ImmunoStain Systems Ki. A continuación se lavaron los cubreobjetos tres veces con PBS.

9. Los cubreobjetos se incubaron con el reactivo enzimático avidina biotina (tal como se proporciona con el equipo) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron los cubreobjetos durante 10 minutos en PBS antes de ser colocados de nuevo en las placas de 6 pocillos.

10. Los cubreobjetos se lavaron con PBS/TritonX-100 al 0,5% durante 30 segundos y se incubaron en solución DAB durante 5 minutos. La reacción se paró mediante adición de agua destilada a cada pocillo.

11. Los cubreobjetos se deshidrataron a continuación con baños de alcoholes y xileno y se montaron en portaobjetos con Permount, visualizándose y fotografiándose al microscopio óptico.

El resultado mostró que, básicamente, las células control del clon 8 mostraban predominantemente una tinción citoplasmática y perinuclear, mientras que las células inducidas por PMA mostraban de forma consistente la translocación al núcleo. Las células infectadas con las construcciones codificantes para el péptido de mezcla mostraron una tinción similar. Las células infectadas con las construcciones codificantes para péptidos idénticos a la región C2 de PKC mostraron predominantemente una tinción citoplasmática y perinuclear, tanto en las células control como en las inducidas por PMA, lo que sugiere que dicho péptido es capaz de inhibir específicamente la translocación de la PKCa activada a su proteína RAC después de la estimulación de las células con PMA. También es posible observar los resultados cadena abajo, utilizando células infectadas de forma similar, para ver los resultados cadena abajo de la expresión peptídica después de la actividad génica. Las células se infectaron con los retrovirus que expresaban el péptido PKCb2.1, PKC2.1, una proteína control ras negativa dominante, combinaciones de estos virus, o sin virus. Las células se estimularon con PMA a 100 ng/ml, PDGF-AA, o PDGF-BB. Se preparó el mRNA y se realizaron transferencias de Northern para la expresión del gen fos (inducida por la activación de PKC) o la proteína ribosomal P0, un control de carga de mRNA cuya expresión no se sabe que actúe sobre los sistemas de señalización inducidos por PKC. Los péptidos de PKC pueden reducir de forma marcada la expresión del mRNA del gen fos. Un resultado inesperado fue que bajo ciertas condiciones existe una activación de la expresión del mRNA. Estos últimos resultados confirman que pueden producirse consecuencias nuevas tras la expresión de los péptidos en las células.

Ejemplo 2 Librerías retrovirales de pBabe Puro y apoptosis

Se diseñaron series de construcciones retrovirales para la expresión de péptidos aleatorios y sesgados en las poblaciones de células diana. El péptido se expresa a partir de una forma retroviral. La unidad de traducción tiene algunos componentes importantes. La Glicina, después del iniciador metionina en el extremo amino, estabiliza el péptido e incrementa la vida media citoplasmática, de acuerdo con la Regla del extremo N de Varshavsky. En algunas construcciones, se ha incorporado una etiqueta del epítopo flu de 9 aminoácidos para permitir la co-precipitación del péptido raro y de cualquier molécula por la que tenga afinidad, utilizando anticuerpos monoclonales contra el epítopo. Las glicinas están codificadas antes y después de las regiones codificantes para el producto de expresión aleatorio/sesgado, para proporcionar cierta flexibilidad molecular.

Las dos prolinas carboxi-terminales están codificadas para conferir estabilidad frente a la carboxipeptidasa.

Para la construcción de una librería amplia, se generaron los dos cebadores (esquematizado en la Figura 1). El primero, cebador del péptido aleatorio, consiste de:1) una región complementaria para la hibridación con el vector, 2) las regiones mencionadas anteriormente y 3) una región del producto de expresión aleatorio o sesgado, que se representan como una secuencia de 30 bases que codifica para un péptido de 10 aminoácidos de longitud. Además, se insertó un codón de parada en los tres marcos de lectura en caso de deleciones o inserciones pequeñas en la región aleatoria. El diseño del cebador asegura una terminación glicina/prolina en la mayoría de los marcos de lectura. El segundo cebador se halla cadena abajo en el vector e híbrida con una región del plásmido que contiene una única diana Not I. Estos cebadores se utilizan para crear una librería de fragmentos, conteniendo cada uno una secuencia nucleotídica que codifica potencialmente para un péptido distinto. Estas familias de fragmentos se ligan a los fragmentos del vector que contienen la secuencia de selección de puromicina, una LTR3' y un origen bacteriano de replicación. Los productos de ligación se electroporan a continuación en E. coli y se prepara el DNA de la librería resultante. Utilizando esta técnica, se construyeron librerías aleatorias independientes con hasta 2x10^{8} insertos únicos. La secuenciación de múltiples insertos individualmente demuestra que presentan la estructura definida por el Cebador 1, y los péptidos codificados son aleatorios. Dichas librerías así construidas contienen subgrupos del total de los 10^{13} péptidos predichos.

Generación de librerías peptídicas retrovirales

Un esquema para la generación de una librería peptídica en el vector pBabe Puro se muestra en la Figura 2. Los cebadores para la PCR se sintetizaron, purificaron y desprotegieron de acuerdo con los protocolos estándares. El cebador 1, complementario a las secuencias del poliengarce en la construcción retroviral de pBabe Puro, tiene la secuencia 5'- GCT TAG CAA GAT CTC TAC GGT GGA CCK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNC CCC ACT CCC ATG GTC CTA CGT ACC ACC ACA CTG GG-3'. N representa cualquiera de las cuatro bases; K se limita a G o T. El cebador 2 3 tiene la secuencia 5'-GCT TAG CAA GAT CTG TGT GTC AGT TAG GGT GTG G-3' y es complementario con las secuencias dentro del origen de replicación de pUC18. La PCR se llevó a cabo durante 8 ciclos utilizando el cebador 1, cebador 2, Babe Puro como molde y una mezcla de Taq DNA polimerasa (Promega) y Deep Vent DNA polimerasa (New England Biolabs) en una proporción de 128 Taq:1 Deep Vent, tal como se describe en Barnes (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp. 2216-2220. El producto de PCR amplificado se purificó, digirió con enzimas de restricción BgIII y Not (Promega), se purificó de nuevo y se ligó con el fragmento correspondiente BamHI-NotI de pBabe Puro. Después de la transformación, la librería resultante contenía 2x10^{8} clones, en donde más del 80% contenían insertos.

Librerías de construcciones retrovirales pMSCV-PC y pBabeMN-PC

Los oligonucleótidos se sintetizaron y purificaron de acuerdo con los protocolos estándares. Los oligonucleótidos de la "librería" tienen la secuencia 5'-CTG GAG AAC CAG GAC CAT GGG C (NNK) 10 GGG CCC CCT TAA ACC ATT AAA T-3' o 5'-CTG GAG AAC CAG GAC CAT GGG CNN KNN KNN KCC TCC CNN KCC TNN KNN KGGGCC CCC TTA AAC CATTAA AT - 3'. Un tercer oligonucleótido ("constante"), complementario a los extremos 3' de los oligonucleótidos de la librería, tiene la secuencia 5'-TCA TGC ATC CAA TTT AAT GGT TTA AG-3'. Tal como se muestra en la Fig. 3, cada uno de los oligonucleótidos de la librería se anilla al oligonucleótido constante, convertido en DNA de cadena doble con la Sequanase (United States Biochemical) o Klenow (Promega), se digiere con la enzima de restricción BstXI (New England Biolabs) y se purifica y liga con la construcción retroviral digerida con BstXI adecuada. Las eficiencias de transformación fueron de 2x10^{8} clones por microgramo de DNA ligado, donde más del 90% contiene un inserto. Un retrovirus representativo se muestra en la Fig. 4; ver también la secuencia nucleotídica retroviral siguiente:

Vector retroviral con la construcción de presentación

(Lista de Secuencias pasa a página siguiente)

\newpage

1

2

3

Infección de la librería peptídica de una línea dependiente de un factor y crecimiento de una línea resistente a apoptosis

La línea celular Baf/3 es una línea dependiente de IL3 que entra rápidamente en apoptosis en ausencia de IL-3. Por ello, es una línea celular atractiva para analizar los péptidos efectores dominantes. Las células que expresan un péptido que inhibe la apoptosis se seleccionan fácilmente con relación al fondo de células que mueren. Se eligió esta línea celular como un modelo para demostrar la selección del péptido.

Una librería retroviral que contiene 5x10^{6} insertos peptídicos independientes se transfectó en células BOSC23, produciendo retrovirus con un título aproximado de 5x10^{5} por ml. Doce ml del sobrenadante viral se utilizaron para infectar 6x10^{6} células Baf/3 (2 ml por infección de 1x10^{6} células en infecciones independientes). Las células crecieron durante 3 días después de la infección en presencia de IL-3, para permitir la integración retroviral y la expresión peptídica. Al cabo de tres días, se eliminó la IL-3 y se permitió que las células crecieran durante dos semanas. A las dos semanas, un pocillo de los seis había crecido con células que sobrevivieron en ausencia de IL-3, lo que indicaba la presencia de un péptido inhibidor de la apoptosis. Los péptidos derivados de esta forma pueden generar una independencia de IL-3 mediante dominancia positiva (es decir, mimetizando o eludiendo el papel regulador positivo de la IL-3) o mediante inhibición (es decir, evitando el proceso de apoptosis después de retirar la IL-3).

Ejemplo 3 Construcción del vector pMSCVpc y apoptosis

El vector retroviral pMSCVpc se preparó mediante clonaje de un inserto que contiene secuencias que codifican para una secuencia Kozak de inicio de la traducción, dianas BstXI para el clonaje de los insertos de la librería, dianas Nrul y Xhol y codones de parada en los tres marcos de lectura, en las dianas EcoRI y BamHI del vector pMSCVneo.

Digestión con la enzima de restricción BstXI

Se combinaron 200 \mug de DNA del vector pMSCVpc con 40 \mul de l0Xtampón NE 3 y 30 \mul de BstXI (10 unidades/\mul) en volumen total de 400 \mul. La muestra se incubó durante toda la noche a 55°C, se extrajo con fenol y se digirió con XhoI luego se purificó en un gradiente de acetato potásico utilizando soluciones al 10, 15, 20 y 25% de acetato potásico. El DNA se precipitó y se recuperó un 40%.

Preparación de los insertos de la librería Síntesis de oligonucleótidos

Se sintetizaron los oligonucleótidos (OL) con las secuencias siguientes:

OL-1:5'-CTG GAG AAC CAG GAC CAT GGG CAA GAG AAA GGG CGA TGA GGT GGA TGG AGT GGG GCC CCC TTA AAC CAT TAA AT-3'

La región subrayada codifica para un péptido con la secuencia MGKRKGDEVDGVGPP. Este péptido demostró que inhibía la apoptosis mediada por Fas e inducida por staurosporina cuando se expresaba en células con un retrovirus.

OL-2:5'-CTG GAG AAC CAG GAC CAT GGG CAA GAG' AAA GGG CNN KNN KNN KGA KNN KGT GGG GCC CCC TTA AAC CAT TAA AT-3'

Región variable: N = A, C, G, T (equimolar), K = G,T (equimolar). Al limitarse la posición K de cada codón se limitó a G o T, se redujo la generación de codones de parada y el sesgado del uso de codones. La región subrayada codifica para un péptido aleatorio con la secuencia MKRKGXXXD/EXVGPP.

OL-3': 5'-TCA TGC ATC CAA TTT AAT GGT TTA AG-3'

Las 15 bases 3' del OL-3 son complementarias a las 15 bases 3' del OL-1 y OL-2.

Los oligos OL-1 y OL-2 se sintetizaron a una escala de 1 \muM, mientras que el OL-3 se sintetizó a escala estándar de 40 nM. Todos los oligos se sintetizaron con tritil-on, se desprotegieron y purificaron sobre columnas de OPC de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes (Applied Biosystems). Cada oligo se resuspendió en 200 \mul de Tris 10 mM, pH 8,0 sin EDTA. La concentración del DNA se determinó cuantificando la absorbancia a 260 nm.

La PCR se realizó con 50 pmol de OL-1 u OL-2 y con 50 pmol de OL-3. Se realizó una extracción con fenol y una precipitación con etanol, el DNA resultante se migró en un gel de acrilamida no desnaturalizante al 10%, con bromuro de etidio.

Las muestras se cuantificaron, se ligaron, precipitaron y electroporaron en un sistema electrocompetente TOP10F' en E. coli (Invitrogen) utilizando técnicas estándares (ver Current Protocols en Molecular Biology, sección 1.8.4). Un control de transformación proporcionó 5x10^{9} transformantes por \mug de DNA de pUC. Después de la transformación, la eficiencia de transformación se determinó plaqueando diluciones en placas de LB (100 mg/ml de ampicilina) y contando las colonias supervivientes. Para los insertos de la librería generados a partir de OL-2, una proporción molar de ligación de 4:1 de inserto:vector proporcionó una eficiencia de transformación de 3,98x10^{7} transformantes por gg de DNA del vector utilizado en la ligación, con una eficiencia de transformación a gran escala de 4,8x10^{7} transformantes por \mug de vector. La ligación realizada solamente con el vector generó 40 veces menos transformantes. Se picaron 10 colonias de la transformación con la ligación del inserto de OL-1, se cultivaron y se preparó el DNA y se secuenció para identificar el clon correcto.

El resto de la mezcla de transformación de la librería de OL-2 en medio SOC se inoculó en 500 \mul de LB-amp (100 \mug/ml de ampicilina) y se incubó a 37°C con agitación (300 rpm).

Se controló la Abs_{600} del cultivo de la librería. Cuando el cultivo alcanzó una Abs_{600} de 0,8 (aproximadamente a las 5 horas), se extrajeron 100 \mul, se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en 10 ml de LB/glicerol al 15% y se guardaron en alícuotas de 1 ml a -80°C (una Abs_{600} de 0,8 equivale a una concentración celular de aproximadamente 10^{9} células por ml. En consecuencia, para una librería de 4,8x10^{7} cada alícuota congelada contendrá el equivalente a 200 librerías).

Análisis de la diversidad de la librería

Las colonias supervivientes plaqueadas anteriormente se seleccionaron mediante PCR con cebadores flanqueantes de la región degenerada para determinar la fracción de los clones que contenían el inserto (>90%). Se picaron 8 clones que contenían inserto y se determinaron las secuencias nucleotídicas de las regiones degeneradas y flanqueantes no-degeneradas. Cada nucleótido estuvo representado en las posiciones N con aproximadamente una frecuencia del 25%, mientras que G o T (pero ni A ni C) se representaron en las posiciones K con aproximadamente una frecuencia del 50%. La frecuencia de los codones de parada generados en la región degenerada puede determinarse también por dicho método.

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Generación de los retrovirus de la librería e infección de las células Jurkat

Día 0

Preparación de las células Phoenix productoras de retrovirus para la transfección

18-24 h antes de la transfección, las células Phoenix se plaquearon a 1,5-2 millones de células por placa de 60 mm en medio de crecimiento de células productoras (DMEM: FCS al 10%, Penicilina-Estreptomicina al 1%, Glutamina al 1%). Se permitió la adhesión de las células en las placas durante 20 horas.

Día 1

Transfección transitoria

Las mayores frecuencias de transfección se obtuvieron con células Phoenix, confluentes en un 70-80% en el momento de la transfección. Para la aplicación a células Phoenix, se preparó el DNA en HBS (2XHBS= 8,0 g de NaCl, 6,5 g de HEPES, 10 ml de solución madre de Na_{2}HPO_{4} (5,25 g del dibásico en 500 ml de agua), se ajustó a pH 7, a un volumen final de 500 ml, con un pH ajustado a 7). Aproximadamente 5 min antes de la transfección, se añadió cloroquina (Sigma) a cada placa a 25 \muM (solución madre de cloroquina: 50 mM en ddH2O; para 3 ml de medio + 1 ml de DNA, añadir 2 \mul). A un tubo cónico de 15 ml, se añadió lo siguiente (por cada placa de 6 cm, 5 placas totales, con todos los reactivos a temperatura ambiente):

5 \mug del DNA de la librería (se añadió el DNA en una gota por el lateral del tubo)

1 \mug del vector viral pMSCVpc lacZ

438 \mul de CaCl_{2} 2 mM (Mallinkrodt, catálogo #4160; se realizó con agua, se filtró estérilmente y se guardó tapado a 4°C).

Volumen final de 500 \mul.

Las muestras se mezclaron brevemente golpeando con 1 el dedo. Las transfeccciones se llevaron a cabo con 5 \mug de pMSCVplacZ y el DNA del vector de OL-1 para utilizar como controles negativos y positivos, respectivamente. Se añadieron 0,5 ml de 2XHBS a cada tubo rápidamente; la solución se burbujeó vigorosamente con la pipeta automática manteniendo el botón de eyección presionado durante 10 segundos (la duración real del tiempo de burbujeo depende de cada lote de 2XHBS). La solución de HBS/DNA se dispersó gota a gota y uniformemente por todo el medio en cada placa de células Phoenix (suave y rápidamente). Las placas se observaron al microscopio; fueron visibles partículas negras pequeñas, distribuidas uniformemente del precipitado de DNA (como pepitas). Las placas se colocaron en un incubador a 37°C y se balancearon hacia delante y hacia atrás varias veces para distribuir uniformemente las partículas de DNA/CaPO4. Al cabo de 6-8 h después de la post-transfección, se cambió el medio con 3 ml de DMEM fresco, con CS al 10%. Antes de cambiar el medio, el precipitado de DNA fue mayor y más claramente visible al microscopio.

Día 2

Segundo cambio de medio

El medio se cambió de nuevo con 3 ml de medio DMEM fresco y FCS al 10% 24 h después de la post-transfección. Las células se colocaron a 32°C (el virus es más estable si la incubación se lleva a cabo a 32°C, aunque 37°C es mejor).

Día 3

Transducción de las células Jurkat EcoR

Un filtro de jeringa estéril de 0,45 \mum Acrodisc (Gelman Sciences) se unió al extremo de una jeringa de 10 ml estéril y se retiró estérilmente el tope de la jeringa de su émbolo. A las 48 h post-transfección, se retiró el sobrenadante de las células Phoenix y se depositó en la jeringa. Se colocó de nuevo el émbolo y el virus se inyectó gota a gota en un tubo nuevo, cónico y estéril. Las placas de las células Phoenix se reservaron para la coloración con X-Gal (ver más adelante). Se añadió el polibreno a cada sobrenadante viral (Sigma:2,5 mg/ml en ddH2O = 500X, guardado a -20°C) a una concentración final de 5 mg/ml. 4,5 x10^{6} células Jurkat EcoR (células Jurkat que expresan de forma estable el receptor del retrovirus ecotrópico) se sedimentaron a 1400 rpm durante 5 min y se resuspendieron en 9 ml de sobrenadante del virus de la librería OL-2. Las células se distribuyeron en alícuotas de 1 ml, o 5x10^{5} células, en los pocillos de placas de 24 pocillos. Se trataron de forma similar 1,5x10^{6} células Jurkat EcoR con 3 ml de cada sobrenadante viral de lacZ y el sobrenadante viral de OL-1. Cada placa celular se envolvió en parafilm, se colocó en una cesta para placas (DuPont) y se centrifugó a 2500 rpm durante 90 min a 32°C en una centrífuga de mesa DuPont/Sorvall RT 6000B. Después de la centrifugación, se observaron las células al microscopio. La presencia de cuerpos grandes de forma irregular representando las Jurkat fusionadas (cada una tan grande como 5-10 células no fusionadas) sugirió una infección exitosa. El parafilm se retiró y la placa se colocó a 32°C. Después de 16 h adicionales a 32°C, las células se desengancharon del fondo de cada pocillo con una ligera agitación y se trasvasaron a un tubo cónico de 15 ml. Los tubos se centrifugaron a 1400 rpm durante 5 min para sedimentar las células. Las células se resuspendieron en 5 ml de RPMI fresco, FCS al 10% por cada tres pocillos de células y se añadieron a una placa de 60 mm (3 pocillos de células por placa). Se añadió 1 ml de RPMI fresco con FCS al 10% a cada pocillo de células que permanecieron en las placas de 24 pocillos. Las placas se mantuvieron a 37°C durante 72h, después de lo cual las células transducidas con cada uno de los virus se combinaron y una alícuota de células Jurkat se tiñó con X-Gal. El sobrenadante viral no utilizado se guardó a -80°C para futuras transducciones, aunque el título decayó a la mitad en cada ciclo de congelación-descongelación.

Determinación de la eficiencia de transfección

Se tiñeron tanto las células Phoenix transfectadas como las Jurkat transducidas para analizar las eficiencias de transfección y transducción. El propósito de la co-transfección del vector del virus pMSCVpc lacZ con el vector viral de la librería, tal como se describió anteriormente, fue permitir una valoración indirecta de las eficiencias de transfección y transducción. Preparación de soluciones: fijador: PBS/0,10% glutaraldehido. La solución madre de glutaraldehido (Sigma cat. G5882) es una solución al 25%, o 250X; las soluciones madre de tinción: i) solución de 25Xferrocianato/300 mM: 25,3 g de K_{4}Fe (CN)6.H2O (Mallinckrodt) + 2,48 g de MgCl_{2} (Sigma) en 200 ml de H2O; guardar a 4°C; ii) solución de ferricianato 25X/300mM: 19,75 g de K_{3}Fe(CN)6 (Sigma) +2,48 MgCl2 en 200 ml de H2O; guardar a 4°C; iii) XGal (Molecular Probes) se realiza como una solución de 40 mg/ml en DMF; guardar a -20°C en la oscuridad; iv) solución 1X ferro/ferricianato: añadir 4 ml de solución de ferrocianato 300 mM/25X y 4 ml de solución de ferricianato 300 mM/25X a 196 ml de PBS; guardar a 4°C hasta un mes como máximo; v) solución de tinción activa: preparar cada vez que se necesite teñir las células, añadir 100 \mul de XGal 40 mg/ml a cada 3 ml de solución 1X ferro/ferricianato; solución de lavado: PBS para células Phoenix y otras células adherentes; FCS al 1% en BS para células Jurkat y otras células no adherentes.

Se retiró el medio de las placas de 60 mm de células Phoenix, o se sedimentaron 5x10^{5} células Jurkat en un tubo cónico de 15 ml a 1400 rpm durante 5 min. Se añadieron 2 ml de fijador a cada placa de 60 mm de células Phoenix, o 1 ml fijador para las células Jurkat y se resuspendieron, dejándose actuar el fijador durante 2 min. Para las células Phoenix, el fijador se retiró el fijador decantando y las células se lavaron tres veces con PBS (los dos primeros lavados fueron rápidos; para el tercer lavado, el PBS se dejó en las células durante 3 min). Para las células Jurkat, se paró la acción del fijador añadiendo 5-10 ml de PBS/FCS 1% a cada tubo cónico, invirtiendo el tubo 5 veces y sedimentando por centrifugación como antes. Se depositaron 3 ml de la solución de tinción activa sobre cada placa de 60 mm de células Phoenix, o cada sedimento celular de 5x10^{5} células Jurkat se resuspendió en 1 ml de solución de tinción activa y se dispuso en una pocillo de una placa de 24 pocillos. Todas las células se incubaron a 37°C. Las células se observaron al microscopio 24 h después. La eficiencia de transfección de las células Phoenix estándar se estimó como el porcentaje de células azules por campo. La eficiencia de transducción de las células Jurkat se estimó contando las células azules en un hemocitómetro. La transfección con 5 \mug del vector lacZ produjo el 50% de células Phoenix azules. La transducción de células Jurkat con el virus resultante produjo el 30% de células Jurkat azules. La co-transfección de 1 \mug del vector viral lacZ con 5 \mug del vector viral de la librería produjo del 5-10% de células Phoenix azules. La transducción de Jurkats con el virus resultante produjo un 3-10% de células Jurkat azules.

Selección de células Jurkat con IgM y anti-Fas

Título de IgM y anti-Fas: un lote nuevo del anticuerpo IgM CH-11 contra Fas humano (Kamiya Biomedical Company; cat. MC-060) se analizó para determinar la eficacia de la inducción de apoptosis. 5x10^{5} células Jurkat EcoR se sedimentaron a 1500 rpm durante 5 min y se resuspendieron en 1 ml de RPMI/2,5% FCS más diluciones seriadas del anticuerpo CH-11, a concentraciones finales de 50 ng/ml, 10ng/ml, 2,0 ng/ml y 0,5 ng/ml. Las células en cada dilución de anticuerpo se colocaron en un pocillo de una placa de 24 pocillos a 37°C durante 48 horas. A continuación se añadieron 4 ml de naranja de acridina/bromuro de etidio (Sigma; 100 \mug/ml cada uno en PBS; a 4°C en oscuridad) a 100 ml de células en hielo. Las células se examinaron en un hemocitómetro con un objetivo de 20x con una combinación de filtros adecuados para la lectura de fluoresceína.

2. Se contaron 100 células de cada muestra y se registró el número de células en los siguientes grupos:

1.

Células vivas con núcleo normal (cromatina verde brillante con estructura organizada).

2.

Células apoptóticas tempranas (EA; cromatina verde brillante altamente condensada o fragmentada).

3.

Células apoptóticas tardías (LA; cromatina naranja brillante altamente condensada o fragmentada).

Se calculó el % de células apoptóticas como EA+LA/número total de células contadas X 100. Se observó apoptosis en >95% de las células Jurkat utilizando 10 ng/ml del anticuerpo CH-11.

Selección de IgM anti-Fas de las células Jurkat que expresan la librería

Se sedimentaron 9,6x10^{6} células Jurkat transducidas con la librería OL-2 y se resuspendieron en 96 ml de RPMI/FCS 2,5% + 10 ng/ml del anticuerpo CH-11. Las células se distribuyeron en alícuotas de 1 ml de 1x10^{5} células en cada pocillo de las placas de 24 pocillos. Se trataron de forma similar 4,8x10^{6} células Jurkat transducidas con lacZ y las Jurkat transducidas con OL-1, distribuyéndose en los pocillos de las placas de 24 pocillos. Las placas se colocaron a 37°C durante 5 días. Cada día, se analizaron las placas para controlar que no hubiera contaminación de bacterias o levaduras. Si hubo contaminación, se eliminaron las células del pocillo contaminado y se añadió 2 ml de NaOH a los pocillos vacíos para reducir el riesgo de propagar la contaminación a los pocillos. Al cabo de 2-3 días, se observaron pocas o ninguna célula al microscopio, confirmándose por el color rojo del medio que no se habían gastado los nutrientes del medio. Cinco días después del tratamiento inicial con IgM anti-Fas, se añadió 1 ml de RPMI/20% FCS a cada pocillo. Las células se dejaron a 37°C durante 10-14 días. Las placas se controlaron frecuentemente por la contaminación y se trataron como antes. Diez días después de la adición del medio RPMI/20%FCS, casi todos los pocillos de células transducidas con OL-1 contenían colonias celulares vivas, confirmándose por el color anaranjado del medio que indicaba un agotamiento de nutrientes. El medio en todos los pocillos de células transducidas con lac-Z permaneció rojo y se observó poco crecimiento celular en dichos pocillos. Los pocillos seleccionados de las células transducidas con la librería de OL-2 contenían células vivas y medio agotado en nutrientes. Durante las dos semanas siguientes, se extrajeron las células de los pocillos que había un crecimiento celular significativo, estimado por la observación directa de las células al microscopio y controlando el creciente agotamiento de nutrientes. Las células de cada pocillo se resuspendieron en 5 ml de medio fresco RPMI/10% FCS y se dispusieron en una placa de 60 mm a 37°C durante 2-3 días.

Aislamiento de RNA

El RNA se aisló a partir de cada pocillo con población superviviente de células Jurkat transducidas con la librería OL-2 (17 pocillos), así como de 5 poblaciones de pocillos supervivientes de células transducidas con la librería OL-1, utilizando el equipo mRNA Capture de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer-Manheim cat. 1787 896). En resumen:

De cada pocillo, se sedimentaron 5x10^{5} células mediante centrifugación a 1400 rpm durante 5 min en un tubo Eppendorf, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 200 ml de tampón de lisis. El sedimento celular se desmenuzó pasándolo 6 veces a través de una aguja de calibre 21 unida a una jeringa de 1 ml. Se añadieron a cada muestra, 4 ml de una dilución 1:20 de oligo(dT) biotinilado y se incubó durante 3 min a 37°C. Se retiró la mezcla de cada tubo. Los tubos se lavaron tres veces con 200 ml de tampón de lavado. Las células se guardaron también en FCS 90%/DMSO 10% en alícuotas de 1 ml de 1x10^{6} células en nitrógeno líquido.

Rescate mediante RT-PCR de los insertos que codifican para los péptidos a partir de las células seleccionadas

La PCR se llevó a cabo utilizando Titan TM RT-PCR System (Boehringer Mannheim cat. 1855476), utilizando dos cebadores: el cebador 5'pBL tiene la secuencia 5'-GAT CCT CCC TTT ATC CAG-3' y es complementario con los nucleótidos 1364-1381 de todos los vectores basados en pMSCVpc y el mRNA retroviral, justo cadena arriba del inserto clonado. El cebador 3A tiene la secuencia 5'-CTA CAG GTG GGG TCT TTC-3' y es complementario a una secuencia en todos los vectores basados en pMSCVpc y el mRNA retroviral, cadena abajo del inserto clonado.

Re-clonaje de los insertos que codifican para los péptidos rescatados

Cada muestra rescatada con PCR se extrajo con fenol-cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en 25 ml de Tris 10 mM pH 8,5. Se añadieron 3 ml de colorante de gel para DNA no desnaturalizante a los 10 ml 1 de cada muestra y éstas se migraron en un minigel de acrilamida al 10% con los estándares de cuantificación oligonucleotídicos y un marcador de peso molecular escalado de 10 en 10 pb, tal como se describió anteriormente. Cada carril contenía una banda prominente con el peso molecular esperado de 216 pb y bandas de fondo menores. La molaridad de cada muestra se cuantificó utilizando el NIH Image como antes. Cada muestra se digirió con la enzima de restricción BstXI, se extrajo con fenol, se precipitó con etanol y se resuspendió en 25 ml de Tris 10 mM, pH 8,5. Las muestras purificadas se cargaron en geles de acrilamida al 10% y se cuantificaron como antes. Todas las muestras contenían una banda prominente de 55 pares de bases, el pero molecular esperado para el inserto digerido por restricción, así como las bandas de 100 pb y 51 pb correspondían con cada uno de los extremos del inserto de DNA rescatado, extraído mediante restricción enzimática. Cada uno de los insertos rescatados por PCR y digeridos por restricción enzimática se ligaron a una proporción molar de 4:1 de inserto:vector con 100 ng del DNA del vector pMSCVpc, se precipitaron y electrotransformaron como antes. Las colonias supervivientes para cada transformación se cribaron mediante PCR utilizando los cebadores 5'pNL y 3A. Para cada transformación, las colonias que contenían de 8-10 insertos se cultivaron durante toda la noche, se agruparon los cultivos y se realizó una mini-preparación de DNA para cada agrupado.

Clones peptídicos Fas-seleccionados: Todos los péptidos tienen la secuencia: MET GLY LYS ARG LYS GLY XXX XXX XXX D/E XXX VAL GLY PRO PRO. Únicamente los aminoácidos xxx xxx xxx D/E xxx se escriben por encima de cada secuencia de DNA de más adelante.

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A partir del pocillo de selección de la primera librería:

Clones individuales L1B3, Fas-seleccionados

4

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A partir del pocillo de selección de la segunda librería:

Clones individuales L2A5, Fas-seleccionados

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Ejemplo 3 Selección con staurosporina de células NIH 3T3 transducidas con la librería peptídica de pBabe Puro

A. Construcción de la librería. La construcción de la librería de péptidos aleatorios en pBabe Puro se describió anteriormente en la patente. El péptido aleatorio tiene la secuencia: MGXXXXXXXXXXGGPP. La diversidad de la librería es de 2x10^{8} a nivel de insertos de DNA.

B. Transfección de la librería. Las transfecciones se llevaron a cabo tal como se describió para la selección por Fas, pero en placas de 15 cm de 10^{7} células Phoenix. La solución de DNA añadida a cada placa consistió de: 50 \mug de DNA de la librería, 5 \mug del vector lacZ, 4340 \mul de ddH2O, 610 ml de CaCl_{2} 2M y 5000 \mul de 2xHBS.

C. Transducción de la librería. 24 horas antes de la transducción, se plaquearon 2x10^{7} células NIH 3T3 en cada uno de las placas de 15 cm con 25 ml de DMEM y suero bovino fetal al 10%. Se añadieron 5 ml de sobrenadantes virales a cada placa (más polibreno como antes). 24 horas después de la transducción, se cambió el medio a 25 ml de DMEM fresco, BCS al 10%. Las células se tiñeron con X-gal 48 h después de la post-transducción. La eficiencia de transducción se estimó en un 40-50%.

D. Selección por staurosporina. La Staurosporina, alcaloide de Streptomyces sp., es un potente inhibidor de amplio espectro de proteína-quinasas que se une al sitio de ATP. La adición de staurosporina 1 \muM en el medio libre de suero a células NIH3T3 indujo >99% de apoptosis a las 24horas, tal como se determinó mediante doble tinción con bromuro de etidio/naranja de acridina, como se describió para la selección por Fas.

Se plaquearon 2x10^{6} células NIH 3T3 transducidas por la librería en cada una de las 10 placas de 15 cm. Se permitió la adhesión de las células durante 24 horas y al cabo de dicho tiempo se añadió la staurosporina a 1 \muM en medio DMEM libre de suero. Las células NIH 3T3 transducidas con LacZ y las transducidas con BCL-2 se utilizaron como controles negativos o positivos, respectivamente. 24 horas después del tratamiento con staurosporina, se cambió el medio con 25 ml de DMEM fresco con BCS al 10%. El medio se cambió cada dos días durante 1 mes, hasta que las células supervivientes presentaron un aspecto saludable (morfología típica de 3T3), y entonces se añadió de nuevo staurosporina 1 \muM en medio libre de suero. El medio se cambió a DMEM, BCS al 10% como antes. El tratamiento con staurosporina se llevó a cabo de nuevo durante un total de tres tratamientos, con lo que el número de células supervivientes transducidas con la librería fue mayor al de las células transducidas con lac-Z pero inferior al de las células transducidas con BCL-2).

E. Transferencia de Moloney. Después del segundo tratamiento con staurosporina, se infectaron alícuotas de células supervivientes con el sobrenadante del virus de la leucemia murina Moloney (generado mediante transfección de las células Phoenix con el vector retroviral pZap). Se dejó propagar el virus por el cultivo durante 1 semana (replaqueando las células cada 2-3 días). Las células se plaquearon como antes y se trataron con Staurosporina antes de proceder al aislamiento del RNA y al rescate mediante PCR.

F. Aislamiento de RNA. Se resuspendieron alícuotas de células supervivientes en cada placa en FCS/90% y DMSO al 10% y se guardaron en nitrógeno líquido. Se preparó el RNA con el reactivo Trizol (GibcoBRL, cat. 15596-026). En resumen, se añadió 1 ml de reactivo de Trizol a una monocapa de células de 10 cm^{2} y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Los lisados de células se transfirieron a tubos cónicos de 15 ml. (Nota: en este punto, se utilizaron exclusivamente soluciones y material de vidrio tratados con DEPC). Se añadieron 0,2 ml de cloroformo por cada ml de Trizol utilizado. Se agitaron los tubos durante 15 s, se incubaron durante 3 min a temperatura ambiente y se centrifugaron a 12000xg durante 15 min a 4°C. La fase acuosa superior que contenía el RNA se recuperó y se le añadió 0,5 ml de isopropanol por cada ml de Trizol utilizado en la homogeneización inicial. Las muestras se mezclaron e incubaron a temperatura ambiente durante 10 min seguido de centrifugación como antes. El sobrenadante se recuperó y el RNA sedimentado se resuspendió con etanol al 75% (1 ml por cada 1 ml de Trizol). Las muestras se agitaron y se centrifugaron a 7500xg durante 5 min a 4°C. El sedimento de RNA se secó al aire libre durante 10 minutos y se resuspendió en agua libre de RNasa, incubándose 10 min en agitación a 60°C para disolver el sedimento. La concentración de RNA se determinó cuantificando la absorbancia a 260 nm.

G. Rescate por PCR. El rescate por PCR se llevó a cabo al igual que para la selección por Fas, utilizando los cebadores 5'pBL y SV40-cadena abajo. El segundo cebador tiene la secuencia: 5'-CTG ACA CAC ATT CCA CAG -3' y es complementario en las posiciones 1424-1441 del vector retroviral pBabe Puro. Las reacciones de PCR se extrajeron con fenol-cloroformo, se precipitaron con etanol y se digirieron con BamHI y SalI antes de la ligación con el vector retroviral pWZL neo. La figura muestra un gel de acrilamida al 10% de los insertos generados por PCR:

Carril 1: marcador de PM escalonado de 10 en 10 pb.

Carril 2: inserto de PCR no digerido de la población de células seleccionadas con staurosporina.

Carril 3: inserto de PCR no digerido de la misma población celular, después del rescate de Moloney y la selección con staurosporina.

Carriles 4 y 5: igual que en los carriles 2 y 3, después de la digestión por restricción.

H. Cribaje secundario. Los vectores pWZI neo que contenían los insertos rescatados se transfectaron en las células Phoenix y los virus resultantes se utilizaron para transducir las células NIH3T3.

La selección por staurosporina se repitió tres veces al igual que antes, antes de la preparación de RNA y del rescate por PCR.

I. Las secuencias de los 9 primeros positivos son las siguientes:

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Secuencia de 2P1

6

Secuencia de 4P1

7

Secuencia de 5P1

8

Secuencia de 6P1

9

Secuencia de 7P1

10

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Secuencia de 8P1

11

Secuencia de 9P1

12

Secuencia de 10P1

13

Ejemplo 4 Utilización de NF-\kappaB y NFAT en la señalización

El complejo NF-\kappaB/l\kappaB es el clásico sistema de mensajero secundario pro-inflamatorio, conocido por estar implicado como un regulador positivo de varios procesos pro-inflamatorios y citoquinas. Estos incluyen, pero no se limitan a IL-1, IL-6, IL-8 y TNF-\alpha. Así como las interleucinas, como la IL-4, que pueden conducir a la modulación negativa de NF-\kappaB en fibroblastos sinoviales y la consiguiente regulación negativa de la producción de IL-6. El complejo NF-\kappaB/l\kappaB es un sistema de activación transcripcional de respuesta rápida en fase aguda y de amplia propagación. Este sistema opera en la mayoría de los tipos celulares analizados, pero conduce a diferentes resultados dependiendo del tipo celular y de la naturaleza del estímulo iniciador. Los activadores de NF-KB incluyen el LPS, TNF-\alpha, IL-1, los inductores de la activación de células T, los inhibidores de la síntesis de proteínas, los ésteres de forbol y una IgM. Otros inductores incluyen los virus Adenovirus, el HLTVI, el citomegalovirus, el virus Sendai y el Herpes simplex I, agentes que causan lesión celular como la luz ultravioleta y los peróxidos y los inhibidores de fosfatasas como el ácido okadaico. Estos inductores actúan a través de las vías dependientes de PKA y PKC, quinasa dependiente de RNA de doble cadena y de otras vías. Los reguladores farmacológicos reguladores de NF-\kappaB, como el salicilato y los glucocorticoides, actúan previniendo la degradación de l\kappaB-\alpha o conduciendo a la regulación positiva de la transcripción de 1\kappaB-\alpha y a los niveles del estado de equilibrio, actuando en consecuencia para prevenir la activación de este factor crítico.

El NF-\kappaB (factor nuclear que se une al locus k del sitio B) está presente en el citoplasma de muchas células en una forma inactiva formando un complejo con el l\kappaB (inhibidor del NF-\kappaB). Algunos de los estímulos recibidos por las células se procesan mediante mecanismos de señalización celular y se integran en la fosforilación específica de l\kappaB y su degradación. La regulación de la función de l\kappaB-a se realiza a través de un elemento de respuesta a una señal (SRE) en el extremo amino-terminal de la molécula. La fosforilación de los residuos de serina 32 y 36 conduce al reconocimiento de la molécula l\kappaB-a por la maquinaria de ubiquitinación, a la liberación de NF-\kappaB al núcleo y a la degradación de l\kappaB. Por tanto, dependiendo del estado de fosforilación/degradación de l\kappaB, el NF-\kappaB se mantiene en el citoplasma o se libera al núcleo. En el núcleo, el NF-\kappaB se une a un motivo de DNA consenso que se halla cerca de las regiones reguladoras de muchos genes caracterizados y por tanto actúa como un regulador transcripcional. Desde el punto de vista de la enfermedad infecciosa, es importante considerar que el NF-\kappaB es un activador primario del virus de la inmudeficiencia humana (VIH). Genes inducidos adecuados incluyen el TNF-\alpha y la IL-6.

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Bioquímicamente, el NF-\kappaB se define como un heterodímero de dos polipéptidos, p50 y p65, de masa molecular correspondiente con 50 y 65 KD, respectivamente. El p50 se procesa a partir de una proteína precursora de 50 KD gracias a un mecanismo todavía hoy no caracterizado. La p65 es el receptor del IKB y la molécula a través de la cual se ejerce su efecto inhibidor/regulador sobre NF-\kappaB. Estos son factores de transcripción prototípicos que definen una gran familia de factores clásicos, Rel/NF-KB.

El clonaje de los componentes de p50 y p65 de NF-\kappaB conduce al descubrimiento de una familia de factores relacionados, denominada Rel. Tanto la p50 como la p65 tienen un motivo de 300 aa (Rel) en su extremo amino-terminal que se describió originalmente en el proto-oncogen c-rel y la determinación del gen del eje de Drosophila, Dorsal. La familia de polipéptidos demostró que p50 y p65 solapan especificidades de unión al DNA, distribución de tejido diferencial y fenómenos reguladores complejos. La p105 (p50) es representativa de las proteínas Rel que contienen un motivo de anquirina y son procesadas en el citoplasma a proteínas más pequeñas carentes del extremo carboxilo. Dicho extremo de p105 muestra homologías estructurales y funcionales con IKB (que también posee los motivos de anquirina) y funciona con una actividad similar a IKB tanto en cis como en trans. La p65 es representativa de un segundo grupo de proteínas Rel que presentan extremos carboxilo divergentes - se ha sugerido que estas regiones codifican dominios de activación transcripcionales. Los 300 aa de los dominios Rel manifiestan cuatro funciones importantes: 1) unión al DNA en aproximadamente 1/3 del extremo amino-terminal del dominio, 2) dimerización en la porción carboxilo del dominio, 3)interacción con las proteínas similares a IKB que contienen una ankirina y 4) señal de localización i nuclear en el extremo carboxilo del dominio Rel. En el dominio Rel de p50 también se incluye un dominio de activación de la transcripción.

El NFAT, factor nuclear de células T activadas es el factor respuesta de la fase aguda inmediatamente temprana para la activación de células T. La inhibición de NFAT por la ciclosporina A (CsA) conduce al bloqueo de la producción de IL-2 y a la pérdida de células T comprometidas con la activación. El NFAT, un componente crítico de los sucesos pro-inflamatorios portado por las células T, también es el factor bloqueado por la CsA en el trasplante. El clonaje de NFAT demostró que contenía una región de la molécula implicada en la unión del DNA que tiene una homología significativa con la familia Rel de proteínas. Basándose en consideraciones estructurales, en las comparaciones de identidad y modos de acción similares, así como en las estructuras genómicas de las moléculas, se demuestra que las uniones intrón/exón son similares en las familias de NF-KB y NFAT, por lo que NFAT debe pertenecer realmente a la familia Rel de factores mediante descendencia lineal y su interacción con factores reguladores de la transcripción pro-inflamatoria de la familia bZIP podría cumplir las reglas generales de las interacciones NF-KB/bZIP.

Se ha demostrado que NFAT está implicado en la respuesta pro-inflamatoria a los mitógenos en la activación de VIH-1 (S. Kinoshita y G.P.N., propuesto para publicación) y que la unión de NFAT a los sitios solapantes con los sitios NF-KB de VIH-1 es responsable de este proceso. Este trabajo es la continuación de otros que demuestran que NFAT puede regular la activación del TNF en la interacción con ATF-2/Jun y GM-CSF. El NFAT también parece estar implicado en la regulación de la liberación por los mastocitos de IL-4, un importante regulador de citoquinas pro-inflamatorias, como la IL-1\beta, TNF-\alpha e IL-6. La actividad del NFAT en estos sistemas también ha demostrado que se modula farmacológicamente por la CsA. Así, aunque el NFAT se descubrió originalmente como un factor específico de células T, posteriormente se halló que era responsable de un sinfín de actividades de respuesta en fase aguda inmediatamente tempranas, así como de la regulación directa de IL-4.

Por lo tanto, las familias Rel extensas de NF-KB y NFAT son dianas atractivas para la inhibición y modulación de la acción pro-inflamatoria. Su implicación en numerosas vías reguladoras y sus funciones decisivas en dichos procesos, incluyendo las interacciones específicas con las proteínas bZIP, las hacen unas dianas específicamente atractivas para la inhibición.

Genes reporteros para la detección del TNF-\alpha y la actividad del promotor de IL-1.

Se diseñó un sistema de genes reporteros retrovirales con luciferasa y conducidos por un promotor mínimio y dos sitios IgK NF-KB. En las construcciones aquí presentadas, se introdujeron deleciones más extensas que las publicadas previamente, ya que se había demostrado por experimentos preliminares que en las construcciones comúnmente disponibles todavía residía una actividad incrementadora residual (Nolan, Saksela y Baltimore, resultados no publicados). Los vectores diseñados fueron pSinII-luc (que contenía un gen de luciferasa en la orientación sentido de transcripción, para analizar la actividad promotora residual en la construcción base), pSinll-fosluc (idéntico a pSinII luc excepto que contiene un elemento promotor mínimo de fos para analizar la actividad incrementadora residual en la construcción base) y pSinII-2kBfosluc (derivado de pSinII-fosluc con 2 sitios IgK KB clonados 5' proximales al promotor mínimo de fos como un gen reportero de la actividad de NF-KB). Estos tres vectores se utilizaron para infectar 1x10^{6} 70Z/3 células. 70Z/3 es una línea celular pre- B murina utilizada originalmente en la caracterización de NF-KB. Al cabo de 48 horas, las células infectadas se dividieron en dos fracciones (las estimuladas con LPS y las no estimuladas). Seis hora más tarde, los extractos celulares se prepararon y analizaron para conocer su actividad luciferasa (para cada punto, se utilizó un extracto de 10^{4} células). Los resultados demostraron que SinII-luc no presentó ninguna inducción, SinII-fosluc presentó en general un incremento de lx y SinII-2kBfosluc presentó una inducción de 4x en la actividad de luciferasa. Según ello, las construcciones basadas en retrovirus pueden utilizarse para reportar de forma sensible la actividad de NF-KB en la cromatina nativa. Ahora, es posible combinar la tecnología de genes reporteros con la liberación retroviral de péptidos efectores. Las células no estimuladas y los controles estimulados (no infectados y SinII-luc) mostraron poca o ninguna actividad. Fue importante el hecho de que la liberación retroviral no diera como resultado una inducción de fondo significativa de actividad de NF-KB, un problema que sucedió con otros procedimientos de transfección. Los controles de SinII-luc y pSinII-fosluc no mostraron una actividad residual del promotor o del incrementador en la construcción. No se detectó ninguna translectura significativa de los loci genómicos endógenos o de la actividad incrementadora endógena que pudiera obstaculizar las lecturas. Estos últimos resultados son consistentes con el trabajo previo utilizando la búsqueda de genes de retrovirus utilizando lacZ y citometría de flujo. En estos estudios, menos del 0,1% de los sucesos de integración aleatoria mostraron regulación cis endógena de las construcciones integradas.

Estos diseños de construcciones se utilizarán como la base para una creación rápida y el análisis de los estudios de TNF-\alpha y del promotor de Il-1 en las células T, macrófagos y células sinoviales. En lugar de la luciferasa, se incorporarán los cDNAs de lacZ o de GFP para el ensayo de FACS. Se colocarán hasta 3-4 Kb de TNF-\alpha o de la región promotora de IL-1 en lugar del promotor mínimo utilizado aquí. Estas construcciones se utilizarán como una medida de referencia de la actividad del TNF-a y del promotor de IL-1 y servirán para permitir la búsqueda de péptidos, a partir de nuestras librerías, que actúen sobre NF-KB o NFAT, así como de vías de señalización desconocidas que sean independientes de NF-KB o de NFAT y críticas para TNF-\alpha y la señalización de IL-1.

Las líneas de células B utilizadas fueron 70Z/3. Las células T a utilizar son las Jurkat humanas. Las líneas de macrófagos a utilizar son las Raw 309 y la línea P388D 1, que es altamente sensible a la inducción por PMA de la secreción de IL-1. Las células sinoviales a utilizar son la HIG-82 y pueden activarse con la IL-1 para inducir las metaloproteasas y con el TNF-\alpha para inducir el NF-KB. La inducción de metaloproteasas por Il-1 actúa a través 1 del NF-KB sobre la colagenasa y otras metaloproteasas de este grupo. Así, se demostró que el \beta-gal fusionado con IKN-\alpha y liberado mediante un retrovirus a las células, responde a estímulos que degradan el IKB-\alpha de la manera siguiente: a) células pre-B 70Z/3 se infectaron con un retrovirus que expresaba una fusión de \beta-gal con el IKB-\alpha de tipo salvaje o uno inactivo, IKB-\alpha dominante negativo; la eficacia de infección fue de aproximadamente del 30%. Las células se estimularon con LPS durante diversos tiempos y luego se cargaron con FDG para cuantificar la expresión de \beta-gal mediante FACS. b) Las células de (a) se indujeron para obtener una inducción LPS máxima de la degradación de IKB-\alpha y se trataron con salicilato o con el control. El salicilato bloquea la degradación de la fusión \beta-gal-IKB con la misma magnitud que el IKB-\alpha dominante negativo.

Detección directa en las células vivas de los niveles de estado de equilibrio de IKB-\alpha

Como primera aproximación, la activación de NF-KB se cuantificará utilizando el sistema reportero móvil IKB-\alpha desarrollado en la presente invención, tal como se describió anteriormente. En esta aproximación, el extremo N-terminal de IKB-\alpha se ha traducido fusionado al gen lacZ. En las células de mamífero, la expresión de la \beta-galactosidasa se puede cuantificar utilizando el seleccionador de células activado por fluorescencia (FACS), célula por célula. Al acoplar el \beta-gal a IKB-\alpha, la estabilidad del \beta-gal es funcionalmente dependiente de IKB-a. Dado que las señales en las células que activan el NF-KB conducen a la degradación de IKB, el \beta-gal se degradó de forma similar. Al igual que antes, las células se infectaron con un retrovirus que contenía una fusión \beta-gal-IKB-\alpha y se indujeron con estímulos que condujeron a la activación de NF-KB. Se puede utilizar el seleccionador de células para distinguir las células que han degradado el IKB-\alpha mediante una PCR a tiempo real y no a través de la activación de genes reporteros de referencia. Según ello, estas líneas respondieron después del tratamiento con el agente anti-inflamatorio, el salicilato (aspirina), que había demostrado ser un inhibidor directo de la activación de NF-KB. Se utilizaron este y otros protocolos relacionados en las células B para seleccionar los nuevos mutantes de IKB-\alpha y definir, en consecuencia, nuevas regiones de la molécula de IKB-\alpha que respondían a la señalización diferencial (J. Caldwell y G. Nolan, resultados no publicados).

Se infectaron 1x10^{7} células que portaban el gen reportero a una elevada eficiencia con las librerías moleculares descritas aquí. Las células se estimularon con LPS, TNF-\alpha, IL-1 o PMA y luego se utilizaron para la seleccionar por FACS aquellas células que NO degradaron el \beta-gal. Después de crecer las células, la población se re-estimuló como antes y se pasó de nuevo por el FACS. Las células se seleccionaron hasta obtener una población del 100% para el fenotipo de ausencia de degradación de carácter hereditario. Los insertos se rescataron de nuevo, se reclonaron en una construcción retroviral y se seleccionaron de nuevo hasta confirmar el fenotipo-trans. Los péptidos se secuenciaron como se indicó anteriormente.

Selección de la deficiencia de NFAT utilizando la inducción de la muerte celular por vías dependientes de NFAT

Se dispuso de un sistema para la selección del bloqueo de la señalización de NFAT en las células que pueden utilizarse con las librerías retrovirales de la presente invención. El sistema se basa en los hallazgos de Serafin y colegas, en los que fueron capaces de crear una línea celular cuya muerte fue dependiente de la activación de NFAT. Las células se estimularon con activadores de células T o NFAT y se procedió a la activación de NFAT y a su translocación al núcleo. La activación condujo a la inducción del gen de la toxina de la difteria A, de modo que las células entraron rápidamente en un proceso de muerte celular. Esto se demuestra utilizando yoduro de propidio para cuantificar la viabilidad celular. Así, en una población grande, sobrevivirán aquellas células que estén bloqueadas para la activación de NFAT por péptidos que interfieren con el sistema de señalización. Serafini y colaboradores utilizaron esta aproximación para seleccionar los mutantes en la señalización de células T. En la presente invención, se utilizó este sistema NFAT-dipA probado en las selecciones de los péptidos.

De nuevo, las células se infectarán como antes con las librerías peptídicas adecuadas y se realizará un cribaje teniendo en cuenta el bloqueo de la señalización de NFAT. Esta aproximación básica, si tiene éxito, puede aplicarse de forma similar a la señalización de TNF-\alpha o de IL-1. Se espera que existan sistemas de señalización cuyo propósito sea proporcionar la señalización pro-inflamatoria y la anti-inflamatoria. Tal como se indicó anteriormente, la IL-4 puede por ejemplo bloquear la señalización de IL-6 en las células. La inducción de la expresión de glucocorticoides conduce a la regulación positiva de IKB y por tanto bloquea la activación de NF-IKB. La activación de vías anti-oxidantes es bien conocida por ser semejante a la anti-inflamatoria. El salicilato bloquea el BF-BK a través de la regulación de los niveles de oxigenasas celulares. Aunque con las búsquedas de péptidos indicadas anteriormente se puedan hallar moléculas que desempeñen un papel en dichas vía intracelulares, se decidió buscar moléculas de superficie que puedan iniciar dicha cascada protectora.

Se utilizarán librerías peptídicas en las construcciones para péptidos secretados y péptidos amarrados, en las células T, en macrófagos y sistemas de células B para seleccionar el bloqueo o la activación de la inducción de NF-KB. Los estímulos incluirán el TNF-\alpha y la IL-1 para el bloqueo. La activación utilizará sistemas basados en FACS a la "inversa". Es decir, se seleccionarán los péptidos que conduzcan a la activación constitutiva de la construcción del gen reportero de NF-KB. En este caso, la construcción del gen reportero puede ser un gen reportero TNF-\alpha con lacZ o GFP. La construcción puede ser también IL-1 con lacZ o GFP. Para loci endógenos, se pueden seleccionar por FACS las células que inducen la expresión de VCAM o ICAM-1 después de la señalización de IL-1. Ambos, VCAM o ICAM-1, se pueden utilizar tanto para una selección positiva como para una negativa. Para las células que expresan péptidos con amarres, la selección es sencillamente como la selección anterior de los péptidos intracelulares. Será necesaria la post-definición de la secuencia peptídica para sintetizar el péptido sin el amarre sintético y determinar si el péptido puede trabajar en ausencia del amarre.

Para los péptidos secretados, la puesta a punto es más difícil, ya que la célula que ha de responder debe expresar el fenotipo y por tanto se debe averiguar el origen del péptido en la célula SECRETORA. Para esta aproximación, se puede utilizar cualquier gen reportero o gen endógeno en las células diana como marcador de lectura. Las células que se infectarán y que secretarán los péptidos serán las NIH3T3. Se infectarán 1x10^{7} células 3T3 con una librería completamente representativa, tal como se indicó anteriormente. Después de la infección, se dejarán crecer las células hasta formar colonias de 10-20 células. En este punto, se retirará el medio y las células se recubrirán con una capa fina de agar al 0,25% en medio. Una vez solidificado, se colocará una membrana porosa y fina sobre las células, cubriéndose así en esta placa las células de respuesta a densidad elevada, también en agar al 0,3%.

Las placas y las membranas se marcarán con negro indigo. De esta forma el producto secretado puede difundir de las células de respuesta. Para la selección de los péptidos secretados PRO-inflamatorios, después de 48 h, las células se desenganchan de la placa quedando sobre la membrana y luego la membrana/células/agar se pone en contacto con una membrana de nitrocelulosa de tamaño adecuado. Las células se lisan in situ con Sarcosil u otro detergente adecuado y se aplica sobre la membrana una solución de elevada concentración salina, succionándose por debajo de la nitrocelulosa. De este modo, las proteínas celulares lixivian fuera de la matriz de agar y se unen a la nitrocelulosa. La nitrocelulosa se puede tratar a continuación como para una "transferencia de Western" para la inducción o el bloqueo de cualquiera de las numerosas proteínas celulares distintas. En ensayos iniciales, se utilizarán genes reporteros de enzimas como el \beta-gal o la fosfatasa alcalina para asegurar la sensibilidad. Con el ensayo perfeccionado es posible ajustar cuantificaciones directas de ciertos loci endógenos (como por ejemplo el TNF-\alpha, NF-KB, p65 y etc.). Una vez que se aprecien las áreas celulares en la membrana, se puede averiguar su origen en las células secretoras mediante el marcaje con indigo de las placas. Las "zonas" celulares correspondientes con el área adecuada se pueden picar, ampliar y re-ensayar. Como un control positivo, se utilizarán los virus que expresan el TNF-\alpha o la IL-1 en modelo inicial a escala para calibrar la sensibilidad de la búsqueda de péptidos pro-inflamatorios.

De modo similar, se puede realizar una búsqueda para el bloqueo de la señalización pro-inflamatoria. En este caso, a las 24-36 horas post-plaqueo de las células de respuesta, se añadirá una citoquina pro-inflamatoria como la IL-1 o el TNF-\alpha a las capas de agar en un líquido de recubrimiento de las células de respuesta en agar. La placa está compuesta ahora, desde la base a la parte superior por: células secretoras/membrana/células de respuesta/líquido de recubrimiento. El inductor pro-inflamatorio difundirá a la capa de células de respuesta rápidamente. Aquellas células que han estado protegidas de los sucesos pro-inflamatorios por la presencia localizada de un péptido secretado anti-inflamatorio no responderán a los estímulos. Como antes, estos péptidos se pueden detectar sobre un fondo de células de respuesta mediante un ensayo en nitrocelulosa de la actividad enzimática. Este último ensayo, que busca "agujeros" contra un fondo de crecimiento positivo en la nitrocelulosa, se puede utilizar para rastrear los inhibidores de los sucesos pro-inflamatorios. Como control positivo, se utilizarán en un modelo inicial los virus que expresan la IL-4 para calibrar la sensibilidad de la búsqueda de péptidos anti-inflamatorios.

Claims (7)

1. Procedimiento para el cribaje de un péptido aleatorio capaz de alterar el fenotipo de una célula de mamífero mediante la interacción con una molécula diana celular, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una pluralidad de células de mamífero que comprenda una librería retroviral que comprende ácidos nucleicos candidatos aleatorios, en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácido nucleico diferente unida a una pareja de fusión que comprende, una secuencia de presentación capaz de presentar los péptidos aleatorios expresados en una forma restringida conformacionalmente y en donde los mencionados ácidos nucleicos candidatos se expresan para producir péptidos aleatorios;

(b) realizar un cribaje de dicha pluralidad para obtener una célula que presente un fenotipo alterado, en donde dicho fenotipo alterado se debe a la interacción de un péptido generado de forma aleatoria con una molécula diana celular; y

(c) aislar dicho péptido generado de forma aleatoria de dicha célula que presenta un fenotipo alterado.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la pareja de fusión comprende además una secuencia de direccionamiento.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha secuencia de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en:

(a) una secuencia señal de localización capaz de ubicar de manera constitutiva dicho producto de traducción en una zona subcelular predeterminada;

(b) una secuencia señal de anclaje a membrana capaz de ubicar dicho producto de traducción en una membrana celular; y

(c) secuencia señal secretora capaz de efectuar la secreción de dicho producto de traducción.

4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha librería comprende por lo menos 106 ácidos nucleicos diferentes.

5. Procedimiento de cribaje para un péptido generado de forma aleatoria capaz de alterar el fenotipo de una célula de mamífero mediante la interacción con una molécula celular diana, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una librería retroviral que comprenda ácidos nucleicos generados de forma aleatoria en una primera pluralidad de células de mamífero, en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácido nucleico distinta unida a una pareja de fusión, que comprende una secuencia de presentación capaz de presentar los péptidos expresados generados de forma aleatoria en una forma restringida conformacionalmente, y en donde dichos ácidos nucleicos candidatos se expresan para producir los péptidos generados de forma aleatoria;

(b) contactar dicha primera pluralidad de células con una segunda pluralidad de células;

(c) realizar un cribaje de dicha pluralidad de células para obtener una célula que presente un fenotipo alterado, en donde dicho fenotipo alterado sea debido a la interacción de un primer péptido generado de forma aleatoria con una molécula diana celular; y

(d) aislar dicho péptido generado de forma aleatoria a partir de dicha célula que presenta un fenotipo alterado.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la mencionada pareja de fusión comprende además una secuencia de direccionamiento.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha secuencia de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en:

(a) una secuencia señal de localización capaz de ubicar constitutivamente dicho producto de traducción en una zona subcelular predeterminada;

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(b) una secuencia señal de anclaje a membrana capaz de ubicar dicho producto de traducción en una membrana celular;

(c) una secuencia señal secretora capaz de efectuar la secreción de dicho producto de traducción.