JPH08500481A - ウイルスの複製を阻害するための方法および薬剤 - Google Patents

ウイルスの複製を阻害するための方法および薬剤

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JPH08500481A JP5520255A JP52025593A JPH08500481A JP H08500481 A JPH08500481 A JP H08500481A JP 5520255 A JP5520255 A JP 5520255A JP 52025593 A JP52025593 A JP 52025593A JP H08500481 A JPH08500481 A JP H08500481A
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メイセジャク，デニス・ジー
ホレセク，ジェイムズ・ジェイ
マモネ，ジェイ・アンソニー
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リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 ピコルナウイルスＲＮＡ、ウイルスの複製に必要な遺伝子、たとえばｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔまたはｒｅｖ遺伝子領域における免疫不全ウイルスＲＮＡ、肝炎Ｂ型ウイルスＲＮＡ、Ｔ細胞性白血病ウイルスＲＮＡ、肝炎Ｃ型ウイルスＲＮＡ、サイトメガロウイルスのｍＲＮＡまたはｒｈＲＮＡ、インフルエンザウイルスＲＮＡ、および単純ヘルペスウイルスｍＲＮＡ分子を特異的に開裂させる酵素的ＲＮＡ分子；ならびにリボザイムの選択および最適化に有用な方法および試薬。特に酵素的ＲＮＡ分子はハンマーヘッドモチーフ、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰ様ＲＮＡのモチーフで形成される。図面はハンマーヘッドモチーフの酵素的ＲＮＡ分子を図示したものである。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルスの複製を阻害するための方法および薬剤発明の背景 本発明は、ウイルスの複製、感染および遺伝子発現の阻害物質として有用な薬 剤に関するものである。発明の概要 本発明は、新規な酵素的ＲＮＡ分子、すなわちリボザイム、およびそれらをウ イルスの複製、たとえばピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイ ルス、肝炎Ａ型ウイルス、エコーウイルス、ヒトライノウイルス、カルジオウイ ルス、（たとえばメンゴウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）および口蹄疫ウイル ス）；免疫不全ウイルス（たとえばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、および関連のウイ ルス：ＦＩＶ−１およびＳＩＶ−１を含む）；肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）；パ ピローマウイルス；エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）；Ｔ−細胞性白血 病ウイルス、たとえばＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、および関連のウイルス： ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）およびサルＴ−細胞性白血病ウイルス（ＳＴＬＶ −Ｉ）を含む；肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ） ；インフルエンザウイルス；単純ヘルペスウイルス（ＨＣＶ）の複製の阻害に用 いる方法である。それらのリボザイムは、哺乳動物および他の霊長類を含めた他 の動物においてこれらのウイルスにより引き起こされる疾病の処置法に用いるこ とができる。実際に、これらのウイルスにより引き起こされる多くの疾病を治療 するために１種類のリボザイムを設計することができる。 リボザイムは、他の別個のＲＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的に反復開 裂しうる、酵素的活性をもつＲＮＡ分子である。これらの酵素的ＲＮＡ分子は実 質的にいかなるＲＮＡ転写体をも標的とすることができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効 果的な開裂が達成されている。キム（Kim）ら，84 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878 8,1987；ヘイゼロフおよびゲルラッハ（Haseloff,Gerlach）,334 Nature 585, 1988；セク(Cech)，260 JAMA 3030,1988；ならびにジェフェリーズ（Jefferies ） ら，17 Nucleic Acids Research 1371,1989。 リボザイムは、まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。この結合は、 標的ＲＮＡを開裂させる作用をするＲＮＡの酵素的部分に近接して保持された、 リボザイムの標的ＲＮＡ結合性部分により行われる。従ってリボザイムは、まず 標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対合により標的ＲＮＡに結合し、適正な 部位にいったん結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このよう な標的ＲＮＡの開裂法により、それがコードする蛋白質の合成を指令する能力を 破壊する。リボザイムはそれのＲＮＡ標的に結合して開裂させたのち、そのＲＮ Ａから離脱して他の標的を探し、新たな標的に反復結合して開裂させることがで きる。 リボザイムの酵素的性質は他の手法、たとえばアンチセンス法（この場合は核 酸分子が単に核酸標的に結合して、その転写を阻止するだけである）より有利で ある。療法処置を行うのに必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌ クレオチドのものより低いからである。この利点は、リボザイムが酵素的に作用 しうることを反映している。たとえば１個のリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ 分子を開裂しうる。さらにリボザイムは特異性の高い阻害物質であり、その阻害 の特異性は結合の塩基対合メカニズムのみでなく、その分子がそれの結合するＲ ＮＡの発現を阻害するメカニズムにも依存する。すなわち阻害はＲＮＡ標的の開 裂により引き起こされ、従って特異性は非標的ＲＮＡの開裂速度に対する標的Ｒ ＮＡの開裂速度の比率として定義される。この開裂メカニズムは、塩基対合に関 与するもの以外の因子に依存する。従って、リボザイムの作用の特異性は同じＲ ＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより大きいと考えら れる。 下記に詳述する特異的ウイルス領域のいずれかを標的とするリボザイムは、そ の分子の翻訳を阻害するようにそのＲＮＡを開裂し得なければならない。 従って第１の観点においては、本発明は以下のウイルス：ピコルナウイルス、 ＨＩＶ−１、ＨＢＶ、パピローマウイルス、ＥＢＶ、Ｔ−細胞性白血病ウイルス 、たとえばＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、インフルエンザウイルスおよびＨＣ Ｖ のいずれかのｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡまたは遺伝子を特異的に開裂する酵素的ＲＮ Ａ分子（すなわちリボザイム）である。 “遺伝子”は、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ｍＲＮＡの蛋白質コード領域、または そのｍＲＮＡの蛋白質合成もしくは安定性を制御する、ＲＮＡ中のいずれかの制 御領域を表すものとする；この語は、同族ポリペプチド生成物のＯＲＦをコード するｍＲＮＡ領域、およびプロウイルスゲノムをも表す。 “酵素的ＲＮＡ分子”とは、基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する 相補性を有し、かつその標的内のＲＮＡを特異的に開裂する作用をする酵素的活 性をも有するＲＮＡ分子を意味する。すなわち酵素的ＲＮＡ分子はＲＮＡを分子 間開裂し、これにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性 は、開裂を起こさせるのに十分なほど、標的ＲＮＡに酵素的ＲＮＡ分子をハイブ リダイゼーションさせる機能を有する。１００％の相補性が好ましいが、５０− ７５％程度の低い相補性も本発明に有用である。ウイルスに“均等な”ＲＮＡは 、ヒト、ネコ、サル、および他の霊長類を含めた種々の動物においてウイルスが 引き起こす疾病に関連する天然のウイルスにコードされる（ｖｉｒａｌ−ｅｎｃ ｏｄｅｄ）ＲＮＡ分子を包含するものとする。これらのウイルスＲＮＡまたはウ イルスにコードされるＲＮＡは互いに類似の構造および均等な遺伝子を有する。 好ましい態様においては、酵素的ＲＮＡ分子はハンマーヘッドのモチーフで形 成されるが、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、グループＩイントロン、またはＲ ＮａｓｅＰ様ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連する）のモチーフで形成されても よい。このようなハンマーヘッドモチーフの例はロッシ（Rossi）ら, 8 Aids Re search and Human Retroviruses 183,1992；ヘアピンモチーフの例はハンペルお よびトリッツ（Hampel,Tritz）, 28 Biochemistry 4929,1989 ならびにハンペル （Hampel,Tritz）ら, 18 Nucleic Acids Research 299,1990 に記載され；肝炎 デルタウイルスモチーフの例はペロッタおよびビーン（Perrotta,Been）, 31Bio chemistry 16,1992；ＲＮａｓｅＰモチーフの例はゲリエル−タケダ（Guerrier- Takeda）ら, 35 Cell 849,1983；グループＩイントロンはセク（Cech）ら，米国 特許第４，９８７，０７１号明細書に記載されている。これらの具体的なモ チーフは本発明を限定するものではなく、本発明の酵素的ＲＮＡ分子において重 要なすべては、それが１または２以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に対して相補的な 特異的基質結合部位を有し、かつその基質結合部位内またはその周囲にその分子 にＲＮΛ開裂活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることは、当業 者には認識されるであろう。 特に好ましい態様においては、ウイルスＲＮＡ内の開裂するＲＮＡは図６−１ ５に示す配列のうち１または２以上から選ばれる。 第２の関連する観点においては、本発明は上記の酵素的ＲＮＡ分子を含有する 哺乳動物または脊椎動物の細胞である。好ましくは、細胞はヒト細胞、たとえば 細胞表面にＣＤ４受容体分子を有するＴ４リンパ球、または他の霊長類細胞であ る。 第３の関連する観点においては、本発明はたとえば哺乳動物または脊椎動物の 細胞内でその酵素的ＲＮＡ分子の発現を可能にする様式でベクター内に位置する 、上記の酵素的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含有する発現ベクターである。こ のようなベクターには、ウイルスプロモーター、たとえばＥＢＶプロモーターの 制御下にあるリボザイムが含まれる。 第４の関連する観点においては、本発明はウイルス核酸またはウイルスにコー ドされる核酸を開裂する酵素的ＲＮＡ分子を患者に投与することにより、ウイル ス性疾患を処置するための方法である。 他の関連する観点においては、本発明は本発明のリボザイムでネコまたはサル を処置することである。それらのリボザイムはＨＩＶ−１ ＲＮＡを開裂しうる ものと等しくてもよく、またはＦＩＶおよびＳＩＶウイルスＲＮＡ内の類似の位 置を標的とするように修飾されてもよい。 他の関連する観点においては、本発明は本発明のリボザイムでウシまたはサル を処置することである。それらのリボザイムはＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩ ＲＮ Ａを開裂しうるものと等しくてもよく、またはＢＬＶおよびＳＴＬＶウイルスＲ ＮＡ内の類似の位置を標的とするように修飾されてもよい。 本発明は、ウイルス感染細胞またはビリオン粒子内のウイルス関連ＲＮＡに対 して高度の特異性を示す、一群の化学的開裂剤を提供する。所望によりそれらの リボザイムは、当技術分野で知られている方法により、均等な一本鎖ＤＮＡを標 的とするように設計することができる。リボザイム分子は、好ましくはこれらの ウイルスのすべてのタイプおよび株を単一のリボザイムで処置しうるように、ウ イルスの高度に保存された配列領域を標的とする。これらの酵素的ＲＮＡ分子は 、感染細胞に対し内的または外的に供与することができる。好ましいハンマーヘ ッドモチーフにおいては、分子が小型（４０ヌクレオチド未満、好ましくは３２ −３６ヌクレオチドの長さ）であるため他のリボザイムモチーフと比較して処置 の経費を低下させることができる。 ＨＩＶ感染の処置のために供与される、今日報告されている最も小さいリボザ イム（ロッシ（Rossi）ら，1992、前掲）は、１４２ヌクレオチドの長さのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写体である。１００ヌクレオチドを越える長さのリボザイムの合成 は自動化された方法によっては極めて困難であり、そのような分子の療法経費は 著しい。発現ベクターによるリボザイムの供与は、原則としてｅｘ ｖｉｖｏ処 置のみによって可能である。これがこの方法の有用性を制限している。本発明に おいては、小型のリボザイムモチーフ（たとえば一般的に図１に示すハンマーヘ ッド構造のもの）が外的供与のために用いられる。これらの分子の横造が簡単で あることも、リボザイムがｍＲＮＡ構造の標的領域内へ侵入する能力を高める。 従ってハンマーヘッド構造体がより長い転写体に含有される状況と異なり、リボ ザイム構造体の適正な折りたたみまたはｍＲＮＡ標的領域へのリボザイムの相補 的結合を妨害する非リボザイム−フランキング配列がない。 本発明の酵素的ＲＮΛ分子は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉお よびＨＴＬＶ−ＩＩの双方により引き起こされるものを含めたウイルス感染症の 処置に用いることができる。それらの処置は、サルおよびネコの免疫不全ウイル スならびにウシ白血病ウイルス白血病ウイルスを含めたヒト以外の霊長類に感染 する他の関連ウイルスにも拡張することができる。感染動物を増殖性感染または 潜在性感染の時期に治療することができる。この治療のタイミングは感染細胞に おけるウイルス負荷および遺伝子発現を低下させ、かつ増殖性感染のその後のい ずれかのラウンドにおけるウイルスの複製を不可能にする。これが可能なのは、 ウイルス蛋白質合成の開始が成功するのに必要な構造を、これらの好ましいリボ ザイムが不能にするからである。 トランスフォームされた頸管上皮または角化細胞の処置に関しては、本発明方 法は細胞の不朽化を引き起こすことが知られているウイルス遺伝子の発現を阻害 する。潜在性ウイルス感染の治療に関しては、本発明方法はウイルスのエピソー ムゲノムの維持に必要な遺伝子の発現を阻害する。トランスフォームされた肝細 胞の治療に関しては、本発明方法は細胞のトランスフォーメーションを引き起こ すと考えられるウイルス遺伝子の発現を阻害する。 本発明の好ましい標的は、他の標的より有利である。後者は増殖性感染に際し てウイルス吸着またはゲノム複製（逆転写）の時点で作用するだけでなく、潜在 性感染細胞およびウイルスによりトランスフォームされた細胞にも作用するから である。さらにそれらのリボザイムの存在下で感染の第１ラウンドにおいて放出 されるウイルス粒子は、それらのキャプシドまたはビリオンが無傷であるため、 なお免疫原性であろう。従って本発明の１方法によれば、欠損性ではあるが、免 疫原性であるウイルス粒子を形成し、従って処置動物において免疫反応を開始す る可能性を維持することができる。 さらに本発明の酵素的ＲＮＡ分子は、ウイルスに感染した、またはウイルスに よりトランスフォームされた細胞培養物にｉｎ ｖｉｔｒｏで使用して、無傷の キャプシドおよび欠損ゲノムＲＮＡを有し、または構造的に無傷ではあるが、生 物学的に欠損性であるビリオンを示す、欠損性ウイルス粒子を産生することがで きる。すなわちビリオンは安定ではあるが、吸着または貫通に必要な蛋白質を欠 如する。次いでこれらの粒子を、免疫反応を調べるために、予防的に、または感 染動物の治療に用いることができる。 さらに他の観点においては、本発明はウイルスを他のウイルスに感染した細胞 へ酵素的ＲＮＡ分子を運ぶベクターとして使用することである。これらのベクタ ーは標準法により作成することができる。 また本発明は、本発明方法により形成された欠損性ウイルス、たとえばＨＩＶ −１、ＥＢＶまたはＨＴＬＶ−Ｉ粒子（または関連の粒子）から調製された免疫 感作用調製物、およびこれらの欠損性粒子、たとえば適切なプロモーターの制御 下に本発明のリボザイムをコードするＤＮＡまたはベクターを含むものを用いて 免疫感作または予防接種する方法である。 本発明のリボザイムは、罹患細胞内における遺伝的浮動および突然変異を調べ る診断用具として用いることができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との 間に密接な関連があるため、分子のいかなる領域においても、標的ＲＮＡの塩基 対合および三次元構造を変化させる突然変異を検出することができる。本発明に 記載する多重リボザイムの使用により、ＲＮＡの構造および機能にとって重要な ヌクレオチド変化をｉｎ ｖｉｔｒｏで、ならびに細胞および組織内でマッピン グすることができる。リボザイムによる標的ＲＮＡの開裂を利用して遺伝子発現 を阻害し、疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割を（本質的に）判定しう る。この方法で、他の遺伝子標的がその疾病の重要な仲介物質であると判定され る可能性がある。これらの実験は、併用療法（たとえば異なる遺伝子を標的とす る多重リボザイム、既知の小分子型阻害物質と結合したリボザイム、あるいはリ ボザイムおよび／または他の化合物もしくは生体分子の併用による間欠的な処置 ）の可能性を提示することによって、疾病進行に対するより良い処置をもたらす であろう。 本発明の他の特色および利点は、以下の本発明の好ましい態様および請求の範 囲の記載から明らかであろう。好ましい態様の説明 まず図面につき簡単に説明する。図面 図１は、ハンマーヘッドモチーフのリボザイム図示したものであり、標的領域 と相互作用するステムＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（それぞれ（Ｉ）、（ＩＩ）および （ＩＩＩ）と符号を付けた）を示す。リボザイムおよび標的双方の５′および３ ′末端を示す。ダッシュは塩基対合したヌクレオチドを示す。 図２Ａおよび２Ｂは、ＨＩＶ−ＩおよびＨＩＶ−２の種々の遺伝子および遺伝 子領域を図示したものである。 図３Ａ−３Ｃは、本発明の３種類のリボザイムを図示したものである。 図４Ａ−４Ｇは、化学的に修飾した本発明のリボザイムを図示したものである （黒丸は修飾された塩基を示す）。 図５は、化学的に修飾した本発明のリボザイムを図示したものである（丸で囲 んだ塩基は２′−Ｏ−メチルで修飾されている）。 図６−１５は、それぞれピコルナウイルス、ＨＩＶ、ＨＢＶ、パピローマ、Ｅ ＢＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、インフルエンザおよびＨＳＶに関する好まし い標的である。 図１６、１７および１８は、本発明の種々のベクターを図示したものである。 図１９は、本発明のベクターの作成法を図示したものである。 図２０、２１および２２は、それぞれハンマーヘッド、ヘアピンおよびＨＤＶ リボザイムを図示したものである。 図２３および２４は、リボザイムが欠損配列（図２３）および他の汚染物質（ 図２４）から精製されたことを示すＨＰＬＣの結果のコピーである。 図２５は、緊密に束縛された構造と望ましくないゆるい構造との間の平衡状態 にあるハンマーヘッドリボザイムを図示したものである。 図２６は、有用な基質の組を得るための一般的図式である。 図２７は、基質濃度を上回る酵素濃度を用いたリボザイム活性の標準的な速度 論的分析の一例を示す。５′−［32Ｐ］−標識基質（一般に濃度１−２ｎＭ）を 種々の濃度のリボザイム（一般に濃度５−１００ｎＭ）と共に３７℃で、７５ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する緩衝液中でイ ンキュベートする。種々の時点でアリコートを取り出し、標準ホルムアミド／Ｅ ＤＴＡ／染料ゲル−装填用緩衝液に混入して反応を停止し、ゲル電気泳動用の試 料を調製する。生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、β 放射スキャナー（アンビス・システムズ、カリフォルニア州サンディエゴ）によ り定量する。 詳細には、図２７Ａは開裂せずに残された基質分子の画分の対数を時間の関数 としてプロットしたものを示す。酵素（ｅ）過剰の条件下では、基質の開裂は下 記方程式に従う： Ｓt＝Ｓoｅ-Kobs t 式中のＳtは時間ｔにおける基質濃度であり、Ｓ0は基質の出発濃度であり、ｋob s は観察された開裂速度である。従って： ｌｏｇc（Ｓt／Ｓ0） ＝ ｌｏｇc（Ｆ） ＝ −ｋobs ｔ 式中のＦ＝Ｓt／Ｓ0は時間ｔにおける基質画分である。従って図２７Ａの線の勾 配がグラフの右側に示した各リボザイム濃度に対するｋobsを与える。 図２７Ｂは、５種類の異なるリボザイムについてのｋobs−対−酵素濃度のプ ロットを示す。酵素過剰の条件下（かつ低い酵素濃度）では、曲線は下記方程式 に従う： ｋobs ＝ （ｋcat／Ｋm） ［酵素］ 従って各線の勾配がその酵素に関する（ｋcat／Ｋm）値を与える。勾配の急な線 ほど、より高いｋcat／Ｋm値をもち、より活性の高いリボザイムであることを示 す。この図においてはリボザイム＃４は活性が最も高く、リボザイム＃２は活性 が最も低い。 図２８は、本発明方法の一般的図式である。 図２９Ａは、本発明方法を図示したものである。 図２９Ｂは、時間に対する予想結合効率を示すグラフである。 図３０Ａ、ＢおよびＣは、本発明方法の幾つかのベクターを図示したものであ る。一般論として図３０に示した３種類のベクターはすべて、リボザイムをコー ドする頷域の上流にＴ７プロモーターを含有する。これらのベクターは、リボザ イム−コード配列の下流に位置するＴ７ターミネーターを含むこともできる。図 ３０Ａ示した最も簡単なベクターは、Ｔ７プロモーター、リボザイムコード配列 およびＴ７ターミネーターを含む。図３０Ｂに示すように、リボザイム−コード 配列の５′側および３′側の両方にヘアピン構造をコードする追加の配列が含ま れていてもよい。図３０Ｃにおいては、ポリ（Ａ）ポリメラーゼプロセシング部 位がリボザイム−コード配列の下流に含まれ、その後にＴ７ターミネーター配列 があってもなくてもよい。Ｔ７プロモーターは本発明にとって限定的ではない。 他のプロモーターを用いる場合（たとえばＨＳＶ ＩＰＣ４−反応性プロモータ ー、またはチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター）、Ｔ７終止配列は転写の終止 に有効でないことがある。その場合、ポリ（Ａ）プロセシング部位は転写体の適 正な終止を保証するのに有用であろう。 図３１Ａ−Ｅは、５′側および３′側フランキングヘアピン配列を含むリボザ イム配列の例を示す。詳細には、図３１Ａはリボザイム単独を示し、リボザイム は基質の不在下ではステムＩＩのみを形成し、他の二次構造を形成しないことを 示す。このリボザイムは、配列ＵＧＧＣＧＵＣＧＧＡＧＡＡを有するＨＳＶ Ｉ ＰＣ４遺伝子内の部位（Ｅ）を標的とする。リボザイムの各末端の６個のヌクレ オチドは、この配列の中心Ｃのそれぞれの側にある６ヌクレオチドに対して相補 的である。 図３１Ｂは、標的配列を含む小型のＲＮＡ基質に結合した図３０のＨＳＶ Ｉ ＰＣ４部位Ｅリボザイムを示す。この場合、ハンマーヘッドリボザイムの３ステ ム（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）が全部形成されている。 図３１Ｃは、５′側フランキングヘアピンにつき可能な１配列についての折り たたみ横造を示す。この配列は好ましい配列ＧＧＧＡＧで始まるので、Ｔ７プロ モーターからの転写体と適合する他の可能な配列にはＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＣ 、ＧＧＡＧＧＡＡＡＣＵＣＣ、およびＧＧＧＡＣＧＡＡＡＧＵＣＣＣが含まれる が、これらに限定されない。Ｕヌクレオチドは望ましくない不稔的転写を促進す るので、効果的なＴ７転写のためには、最初の９ヌクレオチド中にＵヌクレオチ ドの出現を避けるべきである。 図３１Ｄは、可能な３′側フランキングヘアピンの１つとして、ファージＴ７ 由来のＴφ終止配列の折りたたまれた構造（ダンおよびシュツゥディール（Dunn ,Stdier)，166,J.Mol.Biol.477,1983)を示す。ＲＮＡポリメラーゼの終止効果を 低下させることなく過剰の非構造ＲＮＡ配列を減少させるために、ヘアピンに対 して５′側の配列はなくてもよい。 図３１Ｅは、図３１Ｃおよび３１Ｄに示した５′側および３′ヘアピンと結合 した図３１Ａに示すリボザイムの構造を示す。 図３２Ａ−Ｆは、種々のヘアピン配列設計を有するハンマーヘッドを、それら のリボザイムから得られる開裂活性の概要と共に図示したものである。 図３３は、本発明の一般的方法を図示したものである。詳細には、種々の部位 における類似体を含むリボザイム集団を調製する。この集団を５′末端標識し、 開裂条件下でインキュベートする。活性および不活性リボザイムをサイズによっ てゲル精製し、類似体部位を決定しうる物質（たとえばＨ2Ｏ2）で処理し、次い でそれらの部位を決定する。 図３４は、発現ベクターに挿入するために調製されたＤＮＡフラグメントのリ ボザイムコード鎖を図示したものである。 図３５Ａおよび３５Ｂは、ＲＮａｓｅＨアクセス可能性のアッセイ法を図示し たものである。詳細には、図３５Ａは標的ＲＮＡ上の到達可能部位に結合した相 補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの図である。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドは Ａ、ＢおよびＣと表示された太い線で表される。標的ＲＮＡは細いねじれた線で 表される。図３５Ｂは切断されていない標的ＲＮＡを開裂した標的ＲＮＡから分 離するゲル分離法の図である。標的ＲＮＡの検出は、ボディー標識（ｂｏｄｙ− ｌａｂｅｌｅｄ）標的ＲＮＡのオートラジオグラフィーにより、標識された標的 ｃＤＮＡを用いるノーザーンブロッティングにより、または標識ＲＮＡによるＲ Ｎａｓｅ保護により行われる。各列中のバンドは切断されていない標的ＲＮＡを 表す。各線中の残りのバンドは開裂生成物を表す。 図３６は、ＨＳＶ ＩＣＰ２７ ｍＲＮＡの一部に対する５種類のプローブを 用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された標的ＲＮＡについて行われたＲＮａｓｅＨ アッセイのオートラジオグラムのコピーである。Ｊ、Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮと表示 されたプローブは、それぞれＩＣＰ２７上の異なる５部位に対して相補的な５種 類の１３ｍｅｒ ＤＮＡオリゴヌクレオチドを表す（表１参照）。Ｍと表示され た末端の列はＤＮＡサイズマーカーである（ＤＮＡのサイズは同図の左に示され ている）。０およびＨと表示された列は、転写直後（０）、またはＲＮａｓｅＨ と共に、ただしＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いずにインキュベーションした直 後（Ｈ）の標的ＲＮＡを表す。１０００、１００および１０と表示された列は、 それぞれ１０００ｎＭ、１００ｎＭおよび１０ｎＭのＤＮＡプローブの存在下で のＲＮａｓｅＨによる消化を表す。Ｓ−ＲＡＮと表示された列：ＵＵＣ、ＧＵＣ 、ＧＵＡおよびＡＵＣは、合計１２ヌクレオチドを含有し、中央の３個がそれぞ れＵＵＣ、ＧＵＣ、ＧＵＡおよびＡＵＣに対して相補的な配列からなるセミラン ダムＤＮＡオリゴヌクレオチド１０μＭの存在下での、ＲＮａｓｅＨによる標的 ＲＮＡの消化を表す。 位置：ＩＣＰ２７中の標的配列のヌクレオチド位置。転写開始は位置１において 行われる。セミランデムプローブにより行われる実際のＲＮａｓｅＨ開裂位置は 測定されなかった。 配列：その部位におけるアクセス可能性のためのＲＮａｓｅＨプローブとして用 いたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列。プローブ配列は標的配列に対して相補的 である。Ｎは分子集団を表し、４種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）す べてが表される。 図３７は、ＨＳＶ ＩＣＰ２７のヌクレオチド９５２−１３７６からの配列の 、コンピューター作成による折りたたみパターンてある。図３６で開裂のための 標的とした３部位を太線および表示（部位Ｊ、ＫおよびＬ）で示す。 図３８は、細胞抽出液に含有されるＨＳＶ ＩＣＰ２７ ｍＲＮＡにつき）４ 種類のＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われたＲＮａｓｅＨアッセ イのオートラジオグラムのコピーである。標的ＲＮＡはベロ（Vero）細胞に単純 ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を感染させることにより調製された。細胞抽出液を 核、細胞質および膜の画分に分離した。細胞質画分中のＩＣＰ２７ ＲＮＡを、 ＲＮａｓｅＨのアクセス可能性につき、部位Ｄ、Ｅ、Ｅ１またはＵに対して相補 的なＤＮＡオリゴヌクレオチド１５μＭの存在下で調べた。４００ヌクレオチド アンチセンスＲＮＡを用いて、開裂および全長の標的ＲＮＡをＲＮａｓｅ保護ア ッセイ法により検出した。全長メッセージは３６０ヌクレオチドバンドとして検 出され、一方開裂メッセージは２００−３３０ヌクレオチドのサイズ範囲のバン ドとして検出された。各部位につきＲＮａｓｅＨを添加せずに２回（“−”と表 示）、およびＲＮａｓｅＨの存在下で２回（“＋”と表示）試験した。部位Ｄに 関する“−”列の開裂生成物は、抽出液中に内因性ＲＮａｓｅＨが存在すること を確証する。 図３９は、ＨＳＶ ＩＣＰ２７上の種々の部位におけるＲＮａｓｅＨ開裂度の 定量を示すグラフである。部位ＫおよびＴはこのＤＮＡプローブ濃度での効果的 な開裂水準を示す；部位ＤおよびＬは低い開裂水準を示すにすぎない。 図４０は、ＤＮＡプローブ長さがＩＣＰ２７標的ＲＮＡ中の到達可能部位（Ｋ ）におけるＲＮａｓｅＨ開裂活性に及ぼす影響を示すグラフである。長さ７、９ 、１１および１３ヌクレオチドのＤＮＡプローブにつき、ＤＮＡプローブ濃度の 関数としての開裂活性（開製した標的ＲＮＡの％）のプロットを示す。７ヌクレ オチドのプローブは１μｍ濃度においてすら活性を示さず、これは７ヌクレオチ ドを越えるプローブ長さが好ましいことを示唆する。 図４１は、標的核酸を調製する方法を図示したものである。 図４２は、本発明方法を図示したものである；点線は２本のＲＮＡ分子（実線 ） の結合および連結反応を補助するスプリント鎖（ｓｐｌｉｎｔ ｓｔｒａｎｄ） を表す。 図４３および４４は、本発明方法により作成されたリボザイムを図示したもの であり、５′および３′フラグメントならびに基質が示される。 図４５は、本発明方法を図示したものであり、この場合は連結反応のためにス プリント鎖を必要とせず、むしろ２本のフラグメントが連結反応前にステムＩＩ において互いにハイブリダイズする。 図４６は、連結反応前の好ましい半リボザイム構造を図示したものである。 図４７Ａ−Ｄは、それぞれアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルの標 準的な塩基修飾体を図示したものである；各図の上列の修飾体は下列のものと比 較してより強い塩基対合能をもつ構造体を表す。 図４８は、放出用リボザイム（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ，ＲＲ ）および療法用リボザイム（ＴＲ）カセット間の相互作用の図である。（Ａ）は 効果的なＲＲ開裂活性に必要な、ＴＲコンカテマー間の非対合ヌクレオチドであ る。（ＴＲ）−１および（ＴＲ）−２は、ＲＲ開裂により放出される第１および 第２ＴＲモノマーである。 図４９は、ハンマーヘッドリボザイム：基質のコンプレックスを図示したもの である。Ｎ＝Ｇ、ＡまたはＣo Ｍ＝Ｕ、Ａ、Ｃo 垂直線はリボザイムと基質分子 間の分子内対合したヌクレオチドを表す。 図５０は、準ランダムリボザイムカセットのクローニングのためのフローダイ ヤグラムである。標的部位 ウイルスゲノムの選択された領域を標的とするリボザイムは、その核酸の発現 または翻訳を阻害するように選ぶことが好ましい。たとえば蛋白質合成またはゲ ノムの複製およびビリオン中へのパッケージングを阻害することにより、この翻 訳阻害が起こるか、またはウイルス複製が阻害されるように、遺伝子が選択され る。このような翻訳阻害により、一般にたとえば蛋白質合成を阻害することによ ってウイルスの複製が阻害されるであろう。これらの重要なウイルス核酸領域内 の 標的部位を開裂するのに有効なリボザイムの選択は、その標的核酸の種々のオリ ゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションしやすさを試験することに より行われる。これらの試験は、核酸プローブを使用し、ハイブリッド分子をＲ ＮａｓｅＨで開裂させることによりハイブリダイゼーションしやすさをアッセイ することによって実施しうる（下記を参照されたい）。あるいはこの試験には、 核酸の二次構造の予想により設計されたリボザイムプローブを使用し、開裂生成 物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりアッセイし、開裂分子 および非開裂分子の存在を検出することができる。 以下は適明な標的部位を同定しうる方法の例であり、本発明を限定するもので はない。一般にこれらの方法は、ハンマーヘッドリボザイムに対する潜在的な開 裂部位を同定し、次いで二次構造体の形成が最小となるのを保証することにより 、これらの部位それぞれにつき標的としてのそれらの適性を判定する試験を行う ことによる。実施例１ ：ピコルナウイルス ピコルナウイルスには、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、肝炎Ａ型ウ イルス、ヒトライノウイルス、エコーウイルス、カルジオウイルス（たとえばメ ンゴウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）および口蹄疫ウイルスと呼ばれるものが 含まれる。これらのウイルスはヒトおよび他の動物において多数の有害な疾病を 引き起こす。たとえばペレティエおよびゾーネンバーグ(Pelletier,Sonenberg)3 34 Nature 320,1988 を参照されたい。 ピコルナウイルスはヒトおよび農業における病原体の最大かつ最も重要な科の １つを構成する。この科は現在では４属に分類されている：エンテロウイルス属 、カルジオウイルス属、ライノウイルス属、およびアフトウイルス属（口蹄疫ウ イルス）。配列分析により、これらの分類はあまりにも表面的である可能性が示 された。ライノウイルスはエンテロウイルスと多数の配列類似性を共有し、一方 エンテロウイルス７２ （肝炎Ａ型ウイルス）は著しく異なっており、それ自身 の属に包含されるべきである。最後に、エンテロウイルスとして分類されている ネズミポリオウイルス（チーラーのウイルス(Thieler′s virus)）は カルジオウイルスの方に近縁である。 消化管に感染するためそのように呼ばれているエンテロウイルス属には、３血 清型のポリオウイルス、２３血清型のコクサッキーウイルス、３２血清型のエコ ーウイルス、および３７血清型の非ヒトエンテリックウイルスが含まれる。ヒト ライノウイルスは風邪および他の鼻咽頭感染症の重要な病因体である。１００を 越える血清型のライノウイルスがある。アフトウイルスは偶蹄動物、特にウシ、 ヤギ、ブタ、ヒツジ、および稀にヒトにすら感染する。７種類の免疫型のアフト ウイルスが単離されている。カルジオウイルス（コロンビアＳＫウイルス、脳心 筋炎［ＥＭＣ］ウイルス、ＭＥウイルス、ＭＭウイルスおよびメンゴウイルス） はすべて単一血清型に属し、ＥＭＣウイルスの株であると考えられる。これらの ウイルスは主としてネズミに感染するが、ヒト、ブタ、ゾウおよびリスにも感染 する。あるウイルス、たとえばウマライノウイルス１および２ならびに一群の昆 虫ピコルナウイルスは、属に割り当てられていない。これらのうちの１つである コオロギ麻痺ウイルスはＥＭＣウイルスと血清学的に交叉反応する。 ピコルナウイルスゲノムは一本鎖ｍＲＮＡからなり、ビリオンから抽出しうる 。単離されたＲＮＡは無傷のビリオンの場合の約１００万分の１の特異的感染性 を有する。この感染性の低下には２つの理由がある：（ｉ）ウイルスキャプシド の喪失により受容体仲介によるＲＮＡの取り込みが失なわれること、および（ｉ ｉ）遊離またはウイルス粒子内部のいずれであっても、ＲＮＡの１カ所の損傷が 感染性を破壊するのに十分である。キャプシドから単離されたウイルスＲＮＡは 、特にニックおよび損傷を受けやすい。 小型の蛋白質ＶＰｇ（ビリオン蛋白質、ゲノム）は、ゲノムＲＮＡの５′末端 −ｐＵｐＵｐに、チロシン残基のフェノール性ヒドロキシル基へのホスホジエス テル結合により結合している。ＶＰｇの長さはピコルナウイルス属の異なる種に おいてわずかに変動するにすぎない。ＶＰｇはピコルナウイルスＲＮＡ合成の開 始に際して、また恐らくビリオン内へのＲＮＡのパッケージングに際しても、重 要な役割を果たす。 ＲＮＡの５′側−非翻訳領域（ＮＴＲ）は、細胞性ｍＲＮＡの相同領域と比較 して通常は長く；それはＨＲＶ１４の６２４塩基からアフトウイルスの１２００ 塩基にまで及ぶ。コンピューター分析は５′−ＮＴＲ内の安定なステムおよびル ープの存在を予想させ、折りたたみパターンは各ウイルス群で相関する。たとえ ばライノウイルス５′ＮＴＲの最初の６００塩基はエンテロウイルスのものと良 好に整合するが、エンテロウイルスに見られるさらに１４０塩基のループを欠如 する。翻訳の内部開姶の制御におけるこれらの横造の役割は、ポリオウイルスそ の他につき示されている。 カルジオウイルス、アフトウイルスおよびチーラーのウイルスは、それぞれ特 有の折りたたみパターンを呈し、これは恐らくそれらのウイルスの翻訳の制御お よび／または組織栄養性発現（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｒｏｐｈｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ）に際して重要な役割を果たすと思われる。ポリオウイルス３のサビン（ ｓａｂｉｎ）株のヌクレオチド４７２において１個のＣがＵ塩基に変化すると、 神経毒性が増大する。 ３′ＮＴＲは比較的短く、ＨＲＶ１４の４７塩基からＥＭＣウイルスの１２６ 塩基の範囲である。その機能は分かっていないが、ポリオウイルスＲＮＡのこの 領域に８塩基を挿入すると、温度感受性の表現型が生じる。このＲＮΛの３′末 端にあるポリ（Ａ）配列は長さが不均一であり、平均長さは遺伝的に測定される 。ポリ（Ａ）の長さの範囲はＥＭＣウイルスの３６塩基からアフトウイルスの１ ００塩基にまで及ぶ。 このＲＮＡは、翻訳に際して開裂するポリプロテインと呼ばれる長いポリペプ チド鎖をコードする１本の長いＯＲＦを含む。３種類のウイルスプロテアーゼに より行われるカスケード開裂によって、最終的に１１種類の蛋白質産物が生成し 、リーダー（Ｌ）蛋白質をコードするウイルスの場合は１２種類が生成する。プ ロテアーゼ３Ｃまたはその前駆物質である３ＣＤが大部分の開裂を仲介する。プ ロテイン３ＤはＲＮＡテンプレートから形成されつつあるＲＮＡ鎖を延長しうる 酵素である。プロテイン２Ｃも恐らくは開始工程で、ＲＮＡ合成に関与する。２ Ｃ配列はポリプロテインにおいて最も強固に保存される配列である。突然変異分 析により、プロテイン２Ｂおよび２ＣはＲＮＡ合成に関与し、一方プロテイン２ Ａ は宿主の蛋白質合成の遮断に関与することが示された。 ピコルナウイルスを含めたＲＮＡウイルスにおいて組換えが行われる。ウイル スＲＮＡポリメラーゼがその最初のテンプレートから離脱し、第２テンプレート から形成されつつある鎖の合成を終結させる時点で、組換えが起こると提唱され た。このモデルを支持する研究は、連鎖切り換えはマイナス鎖の合成中に起こる 場合が最も多いことを示唆している。ＲＮＡ合成のエラー頻度はゲノム当たり１ 置換であり、一方組換え率は全ウイルスＲＮＡ分子の１０−２０％程度起こる可 能性がある。従って、ＲＮＡ合成に際しての異常に高いエラー頻度を、組換え率 が部分的に補正している可能性がある。 ヒトの場合、ポリオウイルスは鼻咽頭および消化管の細胞に感染するが、麻痺 形のポリオウイルスは脊髄の前角細胞（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｈｏｒｎ ｃｅｌｌ ）に対しても高い特異性を有する。鼻咽頭細胞にも感染するコクサッキーウイル スは、骨格筋および心筋細胞に対して偏向性（ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）を有する 。細胞の屈性（ｔｒｏｐｉｓｍ）の基礎となるメカニズムは分かっていない。細 胞屈性を説明するための最も信頼性のある仮説は、細胞がそれらの表面に特異的 受容体分子を保有するというものである。たとえばコクサッキーウイルスＡがマ ウス乳仔のみにおいて筋炎を生じる能方は、分化しつつある筋原細胞には特異的 受容体が存在するが他のマウス組織には存在しないことと相関する。ポリオウイ ルス、コクサッキーＢウイルス、エコーウイルス、および主要血清群のヒトライ ノウイルスに対する受容体は、すべて染色体１９上に位置し、ポリオウイルスお よびライノウイルスの受容体は免疫グロブリンスーパーファミリー分子の１員と して同定されている。主要なポリオウイルス受容体は４５ｋｄの蛋白質であり、 ライノウイルス受容体はＩＣＡＭ−１（細胞間付着分子−１）として同定されて いる。 エンテロウイルスは、緩和な熱病から、永続的な、場合によっては致死的な麻 痺にまで及ぶ臨床発現を伴う。エンテロウイルスに伴う感染症には下記のものが ある：灰白髄炎、頓挫性灰白髄炎、髄膜炎、無菌性髄膜炎、麻痺性灰白髄炎、上 皮性筋痛症、へルパンギナ、手足口病、種々の呼吸器系疾患、眼病、急性心筋症 、 慢性心臓血管疾患、新生児疾患および胎児欠損症、胃腸疾患、肝炎、ウイルス感 染後疲労症候群、および糖尿病。 ピコルナウイルス疾患の処置は、主としてポリオウイルスを用いる予防接種に 集中している。他のピコルナウイルスについては、存在することが知られている すべての多重血清型を標的とするのは不可能であるため、ワクチンは得られない 。ライノウイルス感染についてはインターフェロン処置が採用されているが、あ る人々はライノウイルス感染よりインターフェロン処置によってより高い罹患率 を経験している。特定のピコルナウイルス性疾患に対する処置の多数の候補が現 在臨床試験されている。これらの化合物は大部分が、ウイルスキャプシドに結合 してウイルス粒子の吸着または貫通／脱外被を阻害することにより作用する。ウ イルスキャプシドの三次元構造によらない他の別法が好ましい。２種類の有効な ポリオワクチンが得られるにもかかわらず、十分に予防接種された集団において すら、なお感受性個体が存在する。世界的に年間２００，０００例以上のポリオ が起こっている。 ピコルナウイルスに伴うＲＮＡの多数の領域がリボザイム攻撃に適した標的で ある。しかしゲノムＲＮＡの非翻訳領域が特に重要である。ピコルナウイルスの プラス鎖ゲノムはキャッピングされておらず、６００−１３００塩基の非翻訳領 域を有する。これらの領域は、ウイルスの属分類と良好に相関する広範な二次構 造を含む。ヒトピコルナウイルスの５′−ＮＴＲ内には広範な配列相同領域があ る。たとえば８種類のヒトピコルナウイルスのＲＮＡ配列を、翻訳開始およびポ リオウイルス毒性に影響を及ぼすことが知られている領域において比較した表２ を参照されたい。たとえばこの領域はすべてのヒトピコルナウイルスにつき良好 なリボザイム標的である。これらのピコルナウイルスにおいてこの領域を標的と するリボザイムは、それらの配列が未知である関連ウイルスの均等な領域を標的 とするために有用となりうる。 ＣｘＡ２１＝コクサッキーＡ２１、ＣｘＢ１＝コクサッキーＢ１、 ＣｘＢ３＝コクサッキーＢ３、ＣｘＡ９＝コクサッキーＡ９、 Ｐ１＝ポリオウイルス１、Ｐ３＝ポリオウイルス３、 ＨＲＶ８９＝ヒトライノウイルス８９およびＨＲＶＡ＝ヒトライノウイルスＡ 。 始原型配列と異なるヌクレオチドのみを挙げてある。 ヒトおよびヒト以外のピコルナウイルス５′側非翻訳領域の二次横造内には、 高度のヌクレオチド配列相同性がある。カルジオウイルスにつき特に有用な相同 領域はヌクレオチド４５０−８３４であり、ヒトウイルスについてはポリオウイ ルスの１２５−１６４、２３６−５３８および５６４−８２８、ならびに他のゲ ノムにおけるそれらの相同位置である。 ピコルナウイルスに関する好ましい開裂は、ウイルスの複製に必要な領域（た とえば蛋白質合成、たとえば５′側非翻訳領域）、ポリオウイルス２Ａまたは３ Ｃプロテアーゼ、ならびに３′−ＮＴＲ、および他のウイルスにおけるそれらに 相当する領域におけるものである。他の領域もこれらのウイルスゲノムのリボザ イム仲介による開裂の標的として使用しうる。各標的は下記に従って、たとえば 他のＲＮＡの二次横造、およびウイルスの複製におけるそれらのＲＮＡの個々の 役割を調べることにより選ぶことができる。その標的がウイルスの複製にとって 必須である蛋白質をコードする領域のポリプロテインの読み取り枠内に含まれる 場合、これら他の標的はリボザイムによる開裂およびそれに続くウイルス複製阻 害のための好ましい候補である。ポリオウイルス２Ａまたは３Ｃプロテアーゼお よび他のウイルスにおけるそれらの相同蛋白質をコードする領域が、そのような 好ましい標的の例である。 ピコルナウイルスのゲノムは、そのＲＮＡ含有およびゲノム複製のエラーの性 質のため、急激な遺伝的浮動を受ける可能性がある。しかしウイルスの複製に必 須であるゲノムの領域（遺伝子）は、長期間にわたって定常配列を維持する（す なわち保存する）と予想される。これらの領域は異なるタイプまたは株のピコル ナウイルス間で保存されやすく、従ってそれらのウイルスすべてを破壊するため に１種類のリボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は本発明にお いて好ましい標的部位である。このように１種類のリボザイムを用いて、すベて のピコルナウイルスを標的とすることができる。本発明者らはこれらのウイルス のこのようなＲＮＡ領域を幾つか選び、それらのヌクレオチド配列をこれらの領 域を標的とするリボザイムにより開裂しうる保存配列の存在につき調べた。詳細 に分析された３領域は５′側非翻訳領域、３′側非翻訳領域、、ならびに３Ａお よび２Ｃプロテアーゼ遺伝子である；他の遺伝子も下記のものと同様な様式で分 析することができる。 コンピューター作成による配列の比較に基づいて、ウイルス遣伝子中の有効標 的部位の予想がなされ、図６中の配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ）１−１０と同 定された。実施例２ ：ＨＩＶ 後天性免疫不全症候群（エイズ）はウイルスＨ 「Ｖ−１」の感染により引き 起こされると考えられる。現在、それはアジドチミジン（ＡＺＴ）の投与により 治療されており、これはこの疾患の進行を遅延させるが、、治癒させるのではな いと考えられる。ＨＩＶ−１のＡＺＴ耐性株は１年間の治療後に発現することが 認められた。ある患者においてはＡＺＴの有効性は限られており、不耐性である ことが 認められる場合がある。比較的最近、ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）およびジデ オキシシチジン（ＤＣ）などの薬物がエイズの治療用として試験された。これら の化合物はいずれも患者のウイルス負荷を低下させないが、それらは実際にこの 疾患の症状を治療する。 ロッシ(Rossi)ら，8 Aids Research and Human Retroviruses 183,1992は、抗 −ＨＩＶ−１療法薬としてのリボザイムの使用についての概説を示している。 彼らは下記のように述べている： ウイルス感染の治療における新たな戦術は、ウイルス転写体と対合してその発 現を遮断するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの使用である。ＲＮＡは情報分子 であるほかに．、酵素的活性をも保有しうる。従ってアンチセンス機能と酵素的 機能を単一の転写体中に組み込むことにより、触媒性ＲＮＡ、すなわちリボザイ ムを設計することができ、これは実質的にいかなるウイルスＲＮＡにも特異的に 対合して、特定の位置でホスホジエステル主鎖を開裂させ、これによりウイルス ＲＮＡを機能的に不活性化する。この開裂を行うに際してリボザイム自身は変化 せず、従って再循環させて他の分子を開裂させることができ、これによりそれは 真の酵素となる。酵素的活性を保有する数種類の異なる触媒モチーフがあり、こ れらのそれぞれを部位特異性開裂能を備えた酵素的アンチセンスに取り込むこと ができる。 ロッシらは、この研究は翻訳開始コドン付近のｇａｇ遺伝子ＲＮＡを標的とす るハンマーヘッドリボザイムが全細胞性ＲＮＡの複雑な環境でその標的を特異的 に開裂しうることを証明したとも述べている。ＨＩＶ−１中のリボザイム標的の 同定に関して、彼らは２種類の調節蛋白質ｔａｔおよびｒｅｖが明らかに優れた 標的であり、彼らはｔａｔ ｍＲＮＡ中、およびｔａｔとｒｅｖが共有するエキ ソン中の潜在的なリボザイム開裂部位を調べつつあると述べている。さらに彼ら は下記のように述べている： 標的選択の問題に対する合理的な研究方法は、下記の基準による。第１に、機 能的に重要な標的、たとえばｔａｔ、ｒｅｖ、 ｉｎｔ、ｐｓｉ（パッケージン グ部位）、またはｔＲＮＡlYS初回感作部位を選ぶべきである。遺伝子 または標的領域が決定されると、そのヌクレオチド配列を種々の単離体間での強 い配列保存性につき判定すべきである。これらの保存領域内で、潜在的開裂部位 、好ましくはＧＵＣまたはＧＵＡ（他は十分ではあるが、開裂効果がより低いよ うに思われる）を選ぶべきである。この領域を潜在的な二次構造につき調べ、次 いで最も有望な部位を選ぶべきである。最後に、細胞培養においてリボザイムを 試験する前に、長い（少なくとも１００ヌクレオチドの長さ）基質を用いて一連 のｉｎ ｖｉｔｒｏ開裂反応（好ましくは反応速度論的分析）を実施し、選ばれ た部位が開裂に対して真に好ましいことを証明することが推奨される。［引用文 献は省略。］ ロッシらはさらに、潜在的リボザイム開裂部位としてさらに考慮および試験す るに値ずる標的はウイルスパッケージングシグナルまたはｐｓｉ配列であると述 べている。 スードおよびドロリカ（Sioud,Drlica）．88 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7303, 1991は、ＨＩＶのインテグラーゼ遺伝子を開裂させるように設計されたリボザイ ムにつき記載している。彼らは、そのリボザイムが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のプ ラスミドから転写されると、それはインテグラーゼＲＮＡの破壊およびインテグ ラーゼ蛋白質合成の完全な遮断をもたらすと述べている。彼らは、ＨＩＶ−１イ ンテグラーゼ遺伝子は療法用リボナイムに対する有用な標的であろうと述べてい る。 ハイデンライヒおよびエックスタイン(Heidenreich,Eckstein)，267,J.Biol.C hem .1904,1992は、ＨＩＶ−１のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）ＲＮＡ上 の異なる部位を標的とする３種類のリボザイムにつき記載している。彼らは、リ ボザイム内の化学的修飾がＬＴＲ ＲＮＡの開裂に及ぼす影響についても記載し ている。これには２′−フルオロシチジン置換およびヌクレオチド間ホスホロチ オエート結合が含まれる。 ウィーラジンゲ（Weerasinghe）ら，65 J.Virology 5531,1991は、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの５′リーダー配列内の保存領域に対して設計されたリボザイムにつき 記載している。 チャン（Chang）ら，2 Clinical Biotechnology 23，1990は、ＨＩＶ−１ ｇ ａｇ遺伝子内の異なる２部位およびウイルス５′−ＬＴＲ領域内の１部位を標的 とすべく設計されたリボザイムにつき記載している。 ロレンツェン（Lorentzen）ら，5 Virus Genes 17,1991は、ＨＩＶ−１のビリ オン感染因子（ｖｉｆ）を標的とするリボザイムにつき記載している。 サーバー（Sarver）ら，247 Science 1222,1990は、、ＨＩＶ−１ ｇａｇ転 写体を標的とするハンマーヘッド群のリボザイムにつき記載している。彼らは、 ＨＩＶ−１で攻撃された細胞が非リボザイム発現細胞の場合と比較してＨＩＶ− １ｇａｇ ＲＮＡ水準の実質的低下を示し、このｇａｇ ＲＮＡの低下は抗原ｐ ２４水準の低下に反映されたと述べている。彼らは、この結果はＨＩＶ−１など のヒト病原体に対する療法薬としてのリボザイムの開発に実現性があることを示 唆すると述べている。 ハンペルら“特異的ＲＮＡ配列を開裂させるためのＲＮＡ触媒“−−１９８９ 年９月２０日出願、米国特許出願第０７／２４７，１００号明細書（１９８８年 ９月２０日出願）の一部継続出願−−はヘアピン型リボザイムにつき記載し，、 ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子に対して特異的であると思われるリボザイムの例を提 示している。ハンペルおよびトリッツ（Hampel,Tritz），28 Biochemistr 4929, 1989、ならびにハンペル（Hampel）ら，18 Nucleic Acids Research 4929,1989 もヘアピン型触媒性ＲＮＡモデルにつき記載し、１標的部位はＨＩＶ−１のｔａ ｔ遺伝子であると述べている。 ゴールドバーグら、国際特許出願公開第９１／０４３１９号、およびゴールド バーグ、国際特許出願公開第９１／０４３２４号明細書は、肝炎デルタベクター 内で発現したリボザイムにつき記載し、デルタウイルスのゲノムがＨＩＶのｅｎ ｖまたはｇａｇ ｍＲＮＡに対するリボザイムを保有する可能性があると述べて いる。ロッシら、国際特許出願公開第９１／０３１６２号明細書は、ＨＩＶ−１ ｇａｇ転写体または５′ＬＴＲスプライス部位を開裂するために用いられるキメ ラＤＮＡ−ＲＮＡ触媒配列につき記載している。 本発明はリボザイムを用いてこれらのウイルスのＲＮＡを開裂させることであ る。特に、本明細書に記載されるリボザイム分子はｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよ びｒｅｖウイルス遺伝子を標的とする。これらの遣伝子は当技術分野において知 られている。たとえばマツクラ（Matsukura）ら，86 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 4244,1989、チェンーマイヤー（Cheng-Mayer）ら，246 Science 1629,1989、ビ シジ(Viscidi)ら，246 Science 1606.1989、マリム（Malim）ら、86 Proc.Natl. Acad.Sci.USA 8222,1989、ターウィリガー(Terwilliger)ら，88 Proc.Natl.Acad .Sci.USA 10971,1991、およびバーテル（Bartel）ら．67 Cell 529,1991、なら びに図２Ａおよび２Ｂを参照されたい。 ＨＩＶに関する好ましい開裂は、ウイルスの複製（たとえば蛋白質合成）に必 要な頷域、たとえばｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｒもしくはｒｅｖ遺伝子領域、または ウイルスの遺伝子発現を調節することが知られている構造、たとえばｔａｒ、ｒ ｒｅもしくは３′ −ＬＴＲ領域においてである。 前記のように、ＨＩＶ−１のゲノムは、そのＲＮＡ含有および逆転写のエラー の性質のため、急激な遺伝的浮動を受ける。しかしウイルスの複製に必須である ゲノムの領域（遣伝子）は、長期間にわたって定常配列を維持する（すなわち保 存する）と予想される。これらの領域は異なるタイプまたは株の免疫不全ウイル ス間で比較的保存されやすく、従ってそれらのウイルスすべてを破壊するために １種類のリボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は本発明におい て好ましい標的部位である。このように１種類のリボザイムを用いて、すべての ＨＩＶ−１ウイルス、ならびにすべてのＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびＦＩＶウイル スを標的とすることができる。本発明者らはＨＩＶ−１のこのような遺伝子を幾 つか選び、それらのヌクレオチド配列をこれらの領域を標的とするリボザイムに より開裂しうる保存領域の存在につき調べた。２．５ｋｂのサブゲノムｍＲＮＡ を、特にｖｉｆおよびｎｅｆ蛋白質をコードする領域において詳細に分析した； ｔａｔ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｒｅｖ蛋白質もこのｍＲＮＡから合成することが できる。ヌクレオチド配列はロス・アラモスＨＩＶ遺伝子バンクから得られた。 ロス・アラモス・データバンクのＨＩＶ−１ゲノム配列を、ｖｉｆおよびｎｅ ｆ遺伝子をコードする領域において比較した。１５カ所の推定リボザイム開裂部 位が、１１株のウイルス配列間で高度に保存されることが見出された。これらの 部位は、これら２標的ＲＮＡ内のハンマーヘッドリボザイム開裂にとって好まし い部位である。ｎｅｆ遺伝子部位のうち２カ所はＨＩＶ−１ゲノムの３′−ＬＴ Ｒ内の領域が重複しており、これは療法上潜在的な価値のある他の標的である。 ｎｅｆ標的はすべてあらゆる既知のＨＩＶ−１ ｍＲＮＡ内に存在し、ＲＮＡの 効果的な翻訳または輸出に必要であると思われるｍＲＮＡの３′末瑞制御領域を 破壊する開裂の標的となる可能性がある。同様に、多数のｖｉｆ標的部位がｐｏ ｌ、ｔａｔおよびｖｐｒ ｍＲＮＡ内に存在する（図２参照）。 比較配列分析およびこの領域にわたる予想ＲＮＡ構造の分析を利用して、ＨＩ Ｖの２．５ｋｂザブゲノムｍＲＮＡにおける有効標的部位について下記の予想が 得られた（かつ図７において配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．）１−５８と同定 される）。［ＨＩＶＰＣＶ１２配列を分析用始原型株として用いた。表に示した ヌクレオチド番号はアルヤおよびガロ（Arya,Gallo）ら，83 Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 2209,1986の２．３ｋｂサブゲノムｍＲＮＡ配列の標的配列内の５′残基 に相当する。実施例３ ：ＨＢＶ 以下は関連技術についての考察である。これらはいずれも本発明の先行技術で あるとは認められない。以下に考察する技術の例には、カトウ(Kato)ら，266.J. Biol.Chem .22071，1991；プライス（Price）ら，86 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 41,1989；およびナッサル（Nassal）ら，63,Cell.1357,1990が含まれる。 ヒトの血清または血液に灌流暴露されたのちの急性肝炎は１００年以上前に認 識されていたが、１９６０年代にＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が発見され、 のちにウイルス性抗原であることが示されるまでは病原体が固定されなかった。 多くの肝臓感染は無症候性であるが、このウイルスは肝臓偏向性であり、数年間 存続する可能性がある。存続性感染には、肝臓損傷を伴うことはわずかである場 合が多いが、ＨＳＶを保有する患者における硬変または肝細胞癌の危険率は非保 有者の場合の２００倍以上高い可能性がある。 肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）はへパドナビリダ（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａ ｅ）として知られているウイルス科の始原型員子である。３．２ｋｂのゲノムは 、内部イニシエーターコドン（ＡＵＧ）を用いて種々の蛋白質を発現する、広範 に重複した読み枠を特徴とする。ＨＢＶゲノムから３種類の主要転写体が合成さ れるが、主要プレノゲノムｍＲＮＡ（長さ３２００ヌクレオチド）が恐らくＣお よびＰ遺伝子産物のＤＮＡ合成およひ翻訳のテンプレートであろう。Ｘ遺伝子が それから翻訳される転写体は不明である。原則として、これら３種類の転写体は いずれもポリシストロン性ｍＲＮＡとして機能し、Ｘ蛋白質を含めた蛋白質の翻 訳に用いられる可能性がある。すべてのＲＮΛがそれらの５′末端付近に８５ヌ クレオチドのキャプシド封入（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）シグナルを含むが 、最も短いｍＲＮＡのみがコアウイルス粒子内へ封入され、ウイルスゲノムへの 逆転写に用いられる。最近、８０ｓリボソームがキャプシド封入シグナルを含む 領域を通って前進するとこのシグナルの機能が妨害され、コア粒子内へのＲＮＡ の封入が阻止されることが証明された。従ってこのシグナルを破壊し、リボソー ムの前進を阻止することは、蛋白質の発現およびウイルス成熟を変化させるため に利用しうる。 ＨＢＶのビリオンは、脂質エンベロープで囲まれ、約３２００ヌクレオチドの 環状ＤＮＡゲノムを含む球形粒子である。ビリオンはＤＮＡポリメラーゼ（逆転 写酵素）活性およびウイルスコア蛋白質（ＨＢｃＡｇ）をも含む。ＨＢｓＡｇ蛋 白質はウイルスエンベロープ内に見られ、異なる３種類として存在する。ＨＢｓ Ａｇの抗原性の複雑さは、合成された３種類から予想されるものよりはるかに大 きい。臨床単離体には８種類以上のサブタイプのＨＢｓＡｇが見られる。Ｐ遺伝 子（ポリメラーゼ）は、多くのレトロウイルスＰｏｌ遺伝子内の配列との配列相 同性を有する。Ｘ遺伝子はウイルスの複製に際して未知の機能をもつポリペプチ ドをコードする。しかしそれは転写のトランス作用因子として作用する可能性が あり、従ってＨＢＶに感染した肝細胞の形態形成性トランスフォーメーションに おける腫瘍蛋白質の候補である。 軽症の肝炎に伴う肝細胞の損傷の多くは免疫学的防御、特に細胞毒性Ｔ細胞反 応により起こると考えられる。さらに、慢性保有者は感染細胞におけるインター フェロン保護を誘導する能力が損なわれていることが示された。肝細胞癌（ＨＣ Ｃ）への進行に際してのＨＢＶの投割は疫学的に支持されているが、いずれの遺 伝子産物が必須であるかは証明されていない。多数の症例においてＸ遺伝子はし ばしば欠失を伴う組込まれた形態て見出されるが、カモ（ｄｕｃｋ）ＨＢＶはＸ 遺伝子を含まず、従ってカモＨＣＣにおいてはＸの役割は支持されない。 ある疾病症候群については、ＨＢｓＡｇ−抗−ＨＢｓコンプレックスが発病に 際して役割をもち、通常はこれらの肝臓外発現は皮疹、糸球体炎、関節炎、また は壊死性脈管炎（ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）の形で起こ るという証明がある。生検で証明された結節性多発関節災を伴う患者の３分の１ は、存続性ＨＢＶ感染を有する。膜性糸球体腎炎の症例の一部は、慢性急性ＨＢ Ｖおよび存続性ＨＢＶ感染を伴う。免疫コンプレックス沈着物を糸球体基底膜の 上皮下表面に沿って見ることができる。病因は免疫コンプレックスにより仲介さ れた組織損傷であると思われる。 一般に慢性Ｂ型肝炎の治療は比較的不成功であった。コルチコステロイドおよ びアデニンアラビノシドは慢性Ｂ型肝炎の治療に際して有益でなかった。ただし 若干の患者は確かにステロイドによる治療に反応する。治療を停止したのち、こ れらの患者はステロイド治療に際して血液中に蓄積したＢ型肝炎水準の上昇に対 する免疫反応のため、血清アミノトランスフェラーゼ水準の反動を示す。 インターフエロンが慢性Ｂ型肝炎の治療に用いられている。α−インターフエ ロンはβ−またはγ−インターフェロンより有効であると思われるが、単一薬物 としてのその有効性はまだ判定されていない。 ＨＢＶに対するワクチンは存在するが、危険な状態の個体を回復させ、また暴 露前の予防を実施することには成功していない。疾病を適切に制御するには、ウ イルスサブユニットまたは死滅ウイルスのワクチンによる新生児の予防接種が必 要であろう。このような予防接種の認可には遠い。ＨＢｓＡｇ陽性物質の経皮接 種、経口摂取または直接的な粘膜接触後のＨＢＶ感染を阻止するためには、ワク チンまたはワクチンとＢ型肝炎免疫グロブリンを用いる暴露後予防で十分である 。この処置の成功にとっては、免疫グロブリンの初回投与のタイミングが重要で ある。ＨＢＶ暴露が７日以上前に起こった場合は、免疫予防処置を推奨する前例 はない。従って急性および慢性Ｂ型肝炎感染の双方の処置に現在用いられている もの以外のメカニズムで作用する抗ウイルス性阻害物質を利用する、この疾病の 有効な処置法が求められている。 本発明のリボザイムは、感染細胞内のウイルスｍＲＮＡのみに高度の特異性を 示す。高度に保存された配列領域を標的とするリボザイム分子は、単一化合物で 多数のヒトＨＢＶ株を処置することができる。ＨＢＶによる肝細胞のトランスフ ォーメーションに関与するウイルス遺伝子（１または２以上）の発現を特異的に 攻撃する治療法は、現在は存在しない。 本発明方法を利用して、ヒト肝炎Ｂ型ウイルス感染を処置することができ、こ れには増殖性ウイルス感染、潜伏性または存続性のウイルス感染、およびＨＢＶ 誘導性の肝細胞トランスフォーメーションが含まれる。この有用性は、それらの 感染が獣医学的に重要であるヒト以外の動物に感染する他のＨＢＶ種にまで拡大 することができる。 好ましい開裂部位は、ウイルスの複製、たとえば蛋白質合成に必要な遺伝子、 たとえばＨＢＶプレゲノムｍＲＮＡの最も５′側の１５００ヌクレオチドである 。配列の参考文献についてはレンバオ（Renbao）ら，30 Sci.Sin.507,1987 を参 照されたい。この領域はコア蛋白質（Ｃ）、Ｘ蛋白質（Ｘ）およびＤＮＡポリメ ラーゼ（Ｐ）遺伝子の翻訳発現を制御し、逆転写酵素に対するテンプレートとし て作用することによりウイルスＤＮＡの複製に際して投割を果たす。ＤＮＡのこ の領域を破壊すると、欠失蛋白質の合成および不完全なＤＮＡ合成（そして欠失 ゲノムからの転写阻害）が生じる。キャプシド封入部位の５′側が開裂すると開 裂した３′側ＲＮＡがコアビリオンに内包され、キャプシド封入部位の３′側が 開裂すると３′側および５′側フラグメント双方からの蛋白質の発現が低下する であろう。 プレゲノムｍＲＮＡの最も５′側の１５００ヌクレオチド以外の領域も、ＨＢ Ｖ複製のリボザイム仲介による阻害の適切な標的となる。このような標的には、 ウイルスＳ遺伝子をコードするｍＲＮＡ領域が含まれる。具体的な標的領域の選 択は、プレゲノムｍＲＮＡの二次構造に依存するであろう。副ｍＲＮＡ中の標的 も、特にこれら他のＲＮＡにおける折りたたみまたはアクセス可能性のアッセイ によりプレゲノムｍＲＮＡ種中に得られない追加の標的配列が明らかになる場合 は、用いることができる。 他のウイルスの場合と同様にＨＢＶのゲノムは、そのＲＮＡ含有および逆転写 のエラーの性質のため急激な遺伝的浮動を受ける可能性がある。しかしウイルス の複製に必須であるゲノムの領域（遺伝子）は、長期間にわたって定常配列を維 持する（すなわち保存する）と予想される。これらの領域は異なるタイプまたは 株のＨＢＶウイルス間で保存されやすく、従ってそれらのウイルスすべてを破壊 するために１種類のリボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は本 発明において好ましい標的部位である。このように１種類のリボザイムを用いて 、すべてのＨＢＶウイルスを標的とすることができる。本発明者らはこれらのウ イルスのこのような遺伝子を幾つか選び、それらのヌクレオチド配列をこれらの 領域を標的とするリボザイムにより開裂しうる領域の存在につき調べた。詳細に 分析された１領域は５′側の１５００塩基領域である；他の遺伝子も下記のもの と 同様な様式で分析することができる。 ウイルスのｍＲＮＡ配列をＲＮＡｆｏｌｄコンピューター分析により折りたた む。ｍＲＮＡの領域、すなわちこの場合は塩基対合が弱いか、または塩基対合し ていないヌクレオチドを含むと予想されるＨＢＶプレゲノムｍＲＮＡの最も５′ 側の１５００ヌクレオチドを、推定リボザイム認識モチーフにつき探査する。こ れらの部位は、これらの標的ＲＮＡ内のハンマーヘッドその他のリボザイムの開 裂に好ましい部位である。 これらの分析を利用して、コンピューター作成によるＲＮＡ構造の分析に基づ いて遺伝子内の有効標的部位の予想がなされた（図８中の配列番号（ＳＥＱ．Ｉ Ｄ．ＮＯ）１−３３を参照されたい。標的ヌクレオチドは、配列の左側に示した プレゲノムＲＮＡヌクレオチド数（ＨＢＶサブタイプａｄｒ−１プレゲノムｍＲ ＮＡ中の）として明記される。参考のためにフランキングヌクレオチドを示す。 これらの領域は、ポリメラーゼ、コア蛋白質およびＸ蛋白質をコードする遺伝子 から選ばれる。実施例４ ：パピローマ 以下に考察する技術の例には、シエフナー（Scheffner）ら，63,Cell 1129,19 90;ハウゼン（Hausen）, 184,Virology 9,1991；ジーンズ（Jones）ら，267,J． Biol.Chem .908,1992；マッカンス（McCance）ら，85 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7 169,1988；ストーレイ (Storey)ら，19 Nucleic Acids Research 4109,1991;グ リーンフィールド（Greenfield）ら，88 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 11217.1991が 含まれる。 パピローマウイルスは二本鎖ＤＮＡゲノムを含む小さなウイルスであり、それ らの遺伝子発現は幾つかの悪性腫瘍において病因学的に関与している。パピロー マウイルス複製と、ある良性落屑性上皮腫瘍との関係が、最初に認識されたウイ ルス誘導性の細胞トランスフォーメーションの例であった。多様な臨床的病変に 伴う６０以上の異なるヒトパピローマウイルスがあり、これらのうち２０以上は 肛門性器管の病変に密接に関係している。これらのうち幾つかは良性増殖性病変 のみを伴う（たとえばＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１）が、他は肝門性器領域の 新生物発生前の病変から癌へ進行する危険率が高いと考えられる（たとえばＨＰ Ｖ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５）。 パピローマウイルスは種特異性が高く、落屑性細胞に対して偏向性をもつ。ウ イルスの複製は、上皮の最も末端で分化した角化細胞に限定されるが、ウイルス ＤＮＡは乳頭腫の基底細胞または傍基底細胞内に見出される。ウイルス転写体は 上皮の基底細胞内に見出されたが、後期遺伝子発現は末端で分化した細胞におい てのみ起こる。従ってウイルスの複製は基底細胞においては潜伏性であり、上皮 の最上層内の、より末端で分化した細胞においては増殖性である。 パピローマウイルスはウイルスの転写を調節するトランス作用因子をコードす る。これらの因子のうち報告された第１は、Ｅ２プロテインであった。Ｅ２ Ｏ ＲＦはパピローマウイルス間で比較的良好に保存されたドメインを含む。Ｅ２プ ロテインは、より退化した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）中央領域によって連結され た、比較的保存された２ドメインからなるＤＮＡ結合性蛋白質である。Ｅ２プロ テインと細胞性癌遺伝子ｃ−ｍｏｓとの相同性は限られていることが注目されて いる。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ７遣伝子、ならびにＨＰＶ−１８の Ｅ６遣伝子はトランス作用性を示すことが報告されている。 ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）のＥ５ ＯＲＦは、下記の２ドメインから なる４４アミノ酸の蛋白質をコードする：（ｉ）そのアミノ末端にある疎水性の 強いドメイン、および（ｉｉ）静止細胞において細胞性ＤＮＡ複製を誘導する能 力をもつ、親水性のカルボキシ末端ドメイン。Ｅ５ ＯＲＦは、繊維性乳頭腫を 誘発するパピローマウイルス間で高度に保存され、ＨＰＶ−１６を含めた他の多 くのパピローマウイルスにおいて構造類似性をもつ。 ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７遺伝子の発現は、新生物形成性病変の発症にとって重 要である。Ｅ６プロテインは、天然の腫瘍抑制物質である細胞性ｐ５３プロテイ ンに結合し、ｐ５３プロテインの分解を引き起こす。この分解の結果、ｐ５３に より仲介される腫瘍抑制が失われる。Ｅ６の発現を排除すると、ウイルス複製能 が失われるだけでなく、前悪性細胞における腫瘍の正常な細胞性阻害の維持また は更新も失われる。 ＨＰＶ Ｅ７プロテインが発現すると、網膜芽腫増殖抑制蛋白質（ＲＢ）の結 合およびメチル化が生じる。ＲＢ蛋白質は細胞増殖の制御または調節にも関係す るので、この相互作用はある観点ではＨＰＶ感染上皮細胞のトランスフォーメー ションに関与する可能性がある。前記Ｅ７／ｐ５３の相互作用の場合と同様に、 Ｅ７発現の低下によりＨＰＶ遺伝子発現という重要な機能が阻害され、かつ細胞 増殖のＲＢ蛋白質制御の水準が増大するであろう。現在では、Ｅ６プロテインの 発現がＥ７発現の前提条件であると考えられている。適宜な動物系に導入された のちに正常な上皮細胞を転移性腫瘍を引き起こしうる細胞にトランスフォームす るために要求される２工程には、Ｅ６およびＥ７双方の発現が要求されるであろ う。 ＨＰＶ誘発新生物形成の研究に用いるモデル系の開発は、ウイルス複製用とし て許容される組織培養系、および正常な層化した（ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ）上皮 をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる簡単な方法が共に無かったことにより阻止され てきた。ＨＰＶ感染した組織をヌードマウスの腎臓被膜下に移植すると、ｉｎｖ ｉｖｏでのＨＰＶ感染の特色が生じるが、この方法はウイルスの遺伝子操作には 適さない。ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフォーメーションの研究は大部分がげっ歯 類において行われ、分化しつつある上皮細胞におけるトランスフォーメーション 過程を正確に模倣するものではない。 層化、および分化特異性ケラチンの産生が可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ系が開発さ れた。コパン（Kopan）ら，105,J.CellBiol. 427,1987。この系はＨＰＶ−１６ ＤＮＡのトランスフェクションコピーを含むヒト上皮細胞を使用し、細胞は層化 し、かつ分化特異性ケラチンを発現する能力を維持するが、それらの形態学的に 分化する能力を失っている。これらの角化細胞においてＨＰＶ ＤＮＡのトラン スフェクションにより生じた組織病理学的病変は、上皮内新生物形成に典型的な ものである 大部分の場合、いぼは良性の自己限定性増殖性病変である。いぼはすべて良好 に定まった境界および無傷の基底膜をもつ局在性上皮増生からなる。いぼには皮 膚の正常な層がすべてある。上皮の基底層のみが増殖の可能性をもつので、いぼ は基底細胞の感染、トランスフォーメーションおよび増殖により生じたものにち がいない。性器いぼにおけるこのような分枝系膨張（ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎ ｓｉｏｎ）についでの研究が、他のシナリオを示唆した。感染は恐らく上皮への わずかな外傷（たとえば性交、皮膚の摩擦または産道の通過に際しで起こるよう な外傷）ののち基底細胞が感染性ウイルス粒子に暴露された結果起こるのであろ う。ウイルスが基底細胞の増殖を刺激し、いぼの形成を開始させる。 ＨＰＶは天然の場合２群に分類される：皮膚ＨＰＶ（約３３タイプ）および粘 膜ＨＰＶ（約２５タイプ）。約１７の皮膚タイプが、いぼ状上皮発育異常症（Ｅ Ｖ）に罹患した患者から採取された。生殖管が粘膜ＨＰＶの主要な貯蔵所である が、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１は気道、口腔および結膜に感染するであろう 。ＨＰＶ−１３およびＨＰＶ−３２は専ら口腔に感染する。いぼの臨床的重要性 は、主としてそれらの位置、ウイルスのタイプ、および宿主の因子、たとえば免 疫反応能により判定される。いぼは一過性かつ自己限定性である場合が多い。声 帯上のいぼは致命的となる可能性がある。 すべてのいぼを治癒させる“１回”治療法はない。一方では自発退行、他方で は再発が見られるので、療法の有効性を評価するのは困難である。種々の療法に は、腐食薬（たとえばポドフィリン）、寒冷療法、ＤＮＡ複製阻害物質（たとえ ば５−フルオロウラシル）の使用、および外科療法が含まれる。免疫療法は不成 功であった。インターフェロン処置は、いぼのタイプおよび患者の免疫状態に応 じて様々な結果を与えた。効果的な免疫化の当座の望みはない。現在の非侵襲性 療法を用いて潜伏性ウイルス状態を排除するのは不可能である。 これらのリボザイムは、感染細胞のウイルスコードｍＲＮＡのみに高度の特異 性を示す。高度に保存された配列領域を標的とするリボザイム分子は、ヒトパピ ローマウイルスの多くの種を単一化合物で治療することを可能にするであろう。 毒性副作用を伴わない広域スペクトルの活性を示す、受容しうる治療法はない。 ＨＰＶによる上皮細胞のトランスフォーメーション、潜伏性感染細胞におけるエ ピソームゲノムの維持、または許容細胞におけるウイルスの増殖性複製に関与す るウイルス遺伝子発現を特異的に攻撃する治療法はない。 本発明方法は、いぼおよび上皮細胞トランスフォーメーションを含めたヒトパ ピローマウイルス感染の治療に用いることができる。この有用性は、それらの感 染が獣医学的に重要であるヒト以外の霊長類に感染する他のパピローマウイルス にまで拡大することができる。 好ましい開裂部位は、ウイルスの複製、たとえば蛋白質合成に必要な遺伝子、 たとえばＨＰＶ １６、Ｅ６およびＥ７ ｍＲＮＡ中の部位である。 Ｅ６およびＥ７遺伝子以外の領域も、ＨＰＶ複製のリボザイム仲介による阻害 の適切な標的となる。このような標的には、ウイルスＥ２トランス作用因子、お よびある動物ウイルス系において重要であることが示されたＥ５遺伝子が含まれ る。 前記のように、パピローマウイルスの複製に必須であるゲノムの領域（遣伝子 ）は、長期間にわたって定常配列を維持する（すなわち保存する）と予想される 。これらの領域は異なるタイプまたは株のパピローマウイルス間で保存されやす く、従ってすべてのウイルスのＲＮＡを破壊するために１種類のリボザイムが必 要であるにすぎないので、これらの領域は本発明において好ましい標的部位であ る。このように１種類のリボザイムを用いて、すべてのパピローマウイルスコー ドＲＮＡを標的とすることができる。本発明者らはこれらのウイルスのこのよう な遺伝子を幾つか選び、コードｍＲＮＡの構造をＲＮＡｆｏｌｄコンピューター により分析した。本発明者らは、これらの領域を標的とするリボザイムにより開 裂しうるＲＮＡにおける開放構造を同定した。詳細に分析された２領域はＨＰＶ −１６、Ｅ６およびＥ７ ｍＲＮＡである：他の遺伝子も下記のものと同様な様 式で分析することができる ウイルスのｍＲＮＡ配列を、上記領域全体にわたって分析する。推定リボザイ ム開裂部位は、ウイルスｍＲＮＡの塩基対合が弱いか、または塩基対合していな い領域であることが認められる。これらの部位は、これらの標的ＲＮＡ内のハン マーヘッドその他のリボザイムの開裂に好ましい部位である。 これらの分析を利用して、コンピューター作成による配列の比較に基づいてウ イルスｍＲＮＡ内の有効標的部位の予想がなされた（図９中の配列番号（ＳＥＱ ．ＩＤ．ＮＯ）１−１８を参照されたい）。標的ヌクレオチドを列記し、ゲノム ヌクレオチド数（ＨＰＶ−１６ゲノム中の）を塩基数として明記する。参考のた めにフランキングヌクレオチドを示す。実施例５ ：ＥＢＶ エプスタイン−バールウイルスはガンマヘルペスウイルス（ｇａｍｍａｈｅｒ ｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）に亜科に属する。これらのウイルスは、それらのｉｎｖ ｉｔｒｏ宿主範囲がＢ−リンパ球に限定されること、それらが潜伏性感染を確立 しうること、およびそれらの発癌性の傾向により識別される。ＥＢＶ類縁体が見 出されるのは旧世界霊長類においてのみである。他のリンパクリプトウイルス（ ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）における発現の詳細は十分には分かって いないが、これら他の種のある蛋白質はＥＢＶ特異性抗体と交叉反応性である。 少なくとも２タイプのＥＢＶが大部分のヒト集団内で同定されている。これらは ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の命名と平行してＥＢＶ−１およびＥＢＶ−２と呼 ばれているが、これらのＥＢＶタイプの方が配列相同性および制限酵素プロフィ ルにおいて、より密接な関連をもつ。 ＥＢＶは通常は口腔咽頭上皮において感染を開始する。これはウイルスの複製 を許容する。長年持続する存続作用性感染が続いて起こる。初回感染経過の初期 にＥＢＶはＢリンパ球に感染し、これが口腔咽頭の上皮基底膜近くへ移動する。 ＥＢＶはＢリンパ球内では複製しないが、潜伏性感染を確立する。この潜伏性感 染の確立に伴う事象はリンパ球をトランスフォームさせ、細胞の死またはアポプ トシスという正常な経過を阻止する。分子基準でのＥＢＶ遺伝子発現を理解する ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の多くを提供したのはこれらの潜伏性感染したＢリンパ球 集団の研究である。 潜伏性感染中に少なくとも９種類のＥＢＶ遺伝子が発現する。２種類は小型の 非ポリアデニル化ＲＮＡ（ＥＢＥＲ−１およびＥＢＥＲ−２）をコードする。６ 種類の遺伝子は核蛋白質（ＥＢＮＡ−１、−２、−３Ａ、−３Ｂ，−３Ｃまたは −ＬＰ）をコードする。１種類は、細胞の不朽化をもたらす様式で細胞性遣伝子 ｂｃｌ−１と相互作用することが知られている膜内在性蛋白質（ＬＭＰ−１）を コードする。ＥＢＮＡおよびＬＭＰ遣伝子は細胞性ポリメラーゼＩＩにより転写 されるのに対し、ＥＢＥＲプロモーター領域はポリメラーゼＩＩ分子により認識 されることが知られている元素をも含有するが、ＥＢＥＲ遺伝子は細胞性ポリメ ラーゼＩＩＩにより転写される。ＥＢＮＡ−３およびＥＢＮＡ−１ ｍＲＮＡは ＥＢＮＡ−２およびＥＢＮＡ−ＬＰ ｍＲＮＡより少ない。ＥＢＮＡ領域はすべ て５′側リーダー配列を共有する。ＥＢＮＡ−ＬＰは最も５′側のＯＲＦにより コードされるが、他の蛋白質はこの領域の３′側に位置するＯＲＦによりコード される。ＥＢＮＡ−２は５′側リーダー配列を欠如するｍＲＮＡから、より効果 的に翻訳され、これは長いリーダー配列を念むＥＢＮＡ−２ ｍＲＮＡが内部翻 訳開始を緩和する可能性があることを示唆する。ＥＢＮＡ−１およびＥＢＮＡ− ３蛋白質も３′−ＯＲＦから翻訳され、それらのＯＲＦ内に種々の長さのグリシ ン−アラニン反復モチーフを含む。 大部分のＥＢＮＡ蛋白質はＤＮＡセルロースに結合するが、ＥＢＮＡ−１のみ はＥＢＶゲノム内の特異的部位に高い親和性で結合する。そのゲノム内の３部位 に同族配列があり、それらのうち２部位はｏｒｉＰドメインからなる。ｏｒｉＰ ドメインへのＥＢＮＡの結合により、ウイルスＤＮＡが複製し、かつ潜伏性感染 細胞においてエピソームとして持続するのが可能になる。潜伏性感染細胞の核に おいて、ＥＢＮＡ−１はクロマチンと結合し、細胞蛋白質と相互作用してＥＢＶ エピソームを確実に子孫核へ分配することができる。ＥＢＮＡ−１ ｍＲＮＡの 数量が少ないことを考慮すると、核内のＥＢＮＡ−１の数量は不釣り合いに高い 。これは、ＥＢＮＡ−１の合成の翻訳アップレギュレーションがあることを示唆 する。 潜伏性感染におけるＥＢＮＡ−２の投割はほとんど知られていないが、ＥＢＮ Λ−２蛋白質が潜伏性感染およびウイルス遺伝子発現の直接的または間接的トラ ンス作用因子であるという証明がある。 ＬＭＰ遺伝子はより弱いプロモーターをもつにもかかわらず、ＥＢＮＡ遣伝子 のほぼ１０倍のｍＲＮＡを産生する。ＬＭＰ ｍＲＮＡは２つのイントロンを含 み、膜内在性蛋白質をコードする。ＬＭＰはリン酸化され、細胞骨格と結合する 。新生ＬＭＰは２−５時間の半減期をもち、これは細胞骨格と結合した形のＬＭ Ｐへの変換時間を表す。いったん細胞骨格内に装入されると、ＬＭＰは１６−２ ０時間の半減期をもつ。ＬＭＰはそれ自身または他の細胞膜成分と相互作用して 、大型の非共有結合した膜コンブレックスを形成すると思われる。比較的最近、 ＬＭＰは細胞性癌遺伝子ｂｃｌ−２の発現を調節し、後者はトランスフォームし た細胞におけるアポプトシスの喪失に関与することが示された。 １ｋｂのＢＺＬＦ１ ｍＲＮＡおよび２．８ｋｂのＢＲＬＦ１ ｍＲＮＡは、 ウイルス遣伝子発現の複製期における初期ＥＢＶ遺伝子発現の重要な即時型トラ ンス作用因子である。ＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１ ＯＲＦの双方からの領域、 ならびにＢＺＬＦ１／ＢＺＬＦ２遺伝子間領域で構成されるユニーク融合ｍＲＮ ＡであるＲＡＺ ＯＲＦ ｍＲＮＡは、同様に重要なＥＢＶ遺伝子発現の調節因 子であるユニークチロシンキナーゼ蛋白質をコードする。一過性トランスフェク ションの研究において、ＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１蛋白質の双方が強力なＥＢ Ｖ初期プロモーターをトランス活性化する。ＢＺＬＦ１ ｍＲＮＡは、ｃ−ｆｏ ｓ／ｃ−ｊｕｎ群の転写活性化因子と相同性をもつエキソンを含む。ｃ−ｆｏ ｓと同様に、ＢＺＬＦ１はＡＰ１様ＤＮＡセグメントに直接に結合するであろう 。 ＥＢＶのＤＮＡ複製はウイルスＤＮＡポリメラーゼにより触媒され、これは他 のヘルペスウイルスＤＮＡの複製に関して観察された状況に類似する。ＢＡＬＦ ２ ＯＲＦは１１０ｋｄ ＤＮＡポリメラーゼ蛋白質をコードする。ＥＢＶポリ メラーゼは、その塩感受性およびアンフィジコリン耐性においてＨＳＶポリメラ ーゼと異なる。ＨＳＶポリメラーゼとＥＢＶポリメラーゼのこの基本的相異が、 アシクロビルその他のＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性阻害物質に対するウイル ス感受性の相対的相異の原因である可能性がある。多数の他のＥＢＶ遺伝子が、 ウイルスＤＮＡ複製における補助因子であるウイルス蛋白質をコードすることが 知られている。 感染性単核細胞増加症（ＩＭ）は、ＥＢＶにより開始されるＢ細胞のポリクロ ーナルトランスフォーメーションである。自己抗体はＩＭ．ＥＢＶ感染の特徴で ある。ＩＭはポリクローナルＢ細胞活性化を生じ、これにはＥＢＶに感染してい ない多数の細胞の活性化すら含まれる。ＩＭの多くの臨床発現は増殖性Ｂ細胞に 対する免疫反応によるものであると思われる。 多数の最近の報文が、感染性単核細胞増加症の結果として起こる、悪性リンパ 腫の特徴をもつ拡散性リンパ球増殖性疾患の発現につき記載している。感染した 患者は男女双方であるが、半数の症例はＸ関連リンパ球増殖症候群（ＸＬＰＳ） を伴う男性である。このリンパ腫はＥＢＶ ＤＮＡを含み、ＥＢＮＡを発現する 。ＸＬＰＳを伴う男性は包括的に免疫不全性ではないが、彼らは事実ナチュラル キラー細胞活性の欠失を発現する。 ＥＢＶがブルキッツリンパ腫（ＢＬ）を伴うことはこのウイルスの発見以来知 られているが、そのウイルスがＢＬの病因および病原において果たす正確な役割 については、なお異論がある。これらの腫瘍の９０％以上がＥＢＶ ＤＮΛを含 み、ＥＢＮＡを発現する。リンパ芽球細胞系においては、すべて同定された潜在 性核生成物およびＬＭＰが発現する。しかしＢＬ細胞においては、ＥＢＮＡ−２ およびＬＭＰが抑制されるが、細胞はなおＥＢＮＡ−１を産生する。これは不朽 化に必要な同一遺伝子がＢＬ細胞の場合は不必要であり、これは他の何らかのメ カニズム、恐らくＢＬ細胞において起こることが知られている染色体転座による ｃ−ｍｙｃ活性の誘導により、不朽化されるのであろうということを意味する。 ＥＢＶと鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の関連は強い。ＥＢＶ ＤＮＡは、鑑別されてい ないＮＰＣのすべでの症例および鑑別されたＮＰＣの多数の症例に常に見出され る。ＮＰＣにおけるＥＢＶ遺伝子の発現はＢＬおよびＩＭにおいて見られるもの とは異なる。最も顕著な２つの特色は、潜在性蛋白質からＥＢＮＡ−１およびＬ ＭＰへの限られた発現、ならびに初期抗原コンプレックスの一部と考えられる数 種類の遺伝子の発現である。 ＥＢＶは胎児リンパ球増殖性疾患を誘発し、これは時に明白なリンパ腫の特色 を伴う。免疫不全患者におけるこれらの進行性リンパ球増殖性疾患には幾つかの 成分があると考えられる。生じる腫瘍はしばしば初期にはポリクローナルであり 、これはこれらの腫瘍が幾つかの独立したトランスフォーメーション事象から生 じることを意味する。経時的に腫瘍はオリゴクローナルまたはモノクローナルの 状態にすら進展する。大部分のＥＢＶ関連リンパ球増殖性病変は、ＢＬにつき見 られるものと同じ染色体転座を示さない。これらのタイプの腫瘍を示す患者には 、移植後受容者およびエイズ患者が含まれる。エイズ患者は３タイプのＥＢＶ関 連病変を発症する： （ｉ）しばしば鼻外部位、たとえば消化管および中枢神経 系における拡散性ポリクローナルリンパ腫、（ｉｉ）リンパ球性間隙性肺炎（Ｌ ＩＰ）、ならびに（ｉｉｉ）舌の毛髪状細胞白斑。ＬＩＰは主としてエイズを伴 う子供に起こり、進行性リンパ球増殖性疾患ではない。毛髪状白斑は舌の上皮細 胞におけるＥＢＶの慢性的産生を伴う。基底層にはＢＺＬＦ１遺伝子産物が見ら れ；上方の層には初期および後期ウイルス遺伝子産物が発現する。 本発明は、ＥＢＶ複製、特に上皮細胞の増殖性感染、またはＢリンパ球におけ る潜伏性ＥＢＶ感染の確立に対してリボザイム系阻害物質を使用することである 。本発明はＢリンパ球の不朽化または潜伏性ＥＢＶ感染を逆転させるために使用 しうる。 この新規な一群の化学的阻害物質であるリボザイムを用いてＥＢＶ ｍＲＮＡ またはｈｎＲＮＡを開裂させると、ウイルスＲＮＡの開裂によりウイルスの複製 を特異的に妨害し、またはＥＢＶ潜伏性を維持することができる。この一群の化 学的開裂物質は、感染細胞におけるウイルスＲＮΛに対してのみ高度の特異性を 示す。高度に保存された配列領域を標的とするリボザイム分子は、すべてのＥＢ Ｖ株を単一化合物で処置することができる。現在の治療法はいずれもＥＢＶ感染 に伴う潜伏状態またはトランスフォームした表現型には衝撃を与え得ない。ヌク レオシド類似体を用いる治療法はすべて静ウイルス性（ｖｉｒｕｓｔａｔｉｃ） であり、その効果は薬物を取り去ると逆転する。リボザイムはＥＢＶ感染に対す る不可逆的処置法を提供し、従って殺ウイルス性（ｖｉｒｕｃｉｄａｌ）である 。 本発明によれば、ヒトにおけるエプスタイン−バールウイルス感染を処置する ことができる。増殖性、存続性および潜伏性ＥＢＶ感染の処置に際して異なるリ ボザイム製剤を用いることができる。さらにＬＭＰ ｍＲＮＡを標的とするリボ ザイムは、リンパ球における不朽化事象を逆転させ、従って感染細胞におけるア ポプトシスを可能にするのに有用である。ＥＢＮＡ−１およびＲＡＺ ｍＲＮＡ を標的とするリボザイムを用いて、それぞれ潜伏期および増殖期のＥＢＶ感染を 妨害することができる。 好ましい開裂部位は、ウイルスの複製、たとえば蛋白質合成に必要な遺伝子ま たは領域、たとえば前記の遺伝子または領域、たとえばＥＢＮＡ−１およびＲＡ Ｚである。 これらのｍＲＮＡの上記領域のいずれかを標的とするリボザイムは、それらの 分子の翻訳を阻害する様式でｍＲＮΛを開裂させるように設計することができる 。ＥＢＮＡ−１およびＲＡＺ領域以外の他の領域も、ＥＢＶ遣伝子発現のリボザ イム仲介による阻害のための適切な標的となりうる。特に他の領域には、ＥＢＮ Ａ−２蛋白質、ＬＭＰ蛋白質、ウイルスＤＮΛポリメラーゼ、ならびにＢＺＬＦ １、ＢＲＡＦ１およびＢＭＲＦ１蛋白質をコードするｍＲＮＡが含まれる。これ らの蛋白質をコードするｍＲＮＡまたはｈｎＲＮＡの二次構造分析を利用して、 リボザイム標的領域を決定し、リボザイムによる開裂、これに続くウイルス複製 阻害、潜伏性ウイルス感染の妨害、またはＢ細胞不朽化の終止のための有望な候 補であるウイルスＲＮＡの、これら他の領域の選択を補肋することができる。 前記のように、ウイルスの複製に必須であるＥＢＶゲノムの遺伝子は長期間に わたって定常配列を維持する（すなわち保存する）と予想される。これらの領域 は異なるタイプまたは株のＥＢＶ間で比較的保存されやすく、従ってそれらのウ イルスすべてを破壊するために１種類のリボザイムが必要であるにすぎないので 、これらの領域は本発明において好ましい標的部位である。本発明者らはＥＢＶ のこのような遺伝子を幾つか選び、それらのヌクレオチド配列をこれらの領域を 標的とするリボザイムにより開裂しうる、ｍＲＮＡ中の塩基対合の弱い領域また は塩基対合していない領域の存在につき調べた。詳細に分析した２種類の遺伝子 はＥＢＮＡＩおよびＲＡＺ遺伝子である；前記の他の遺伝子も以下に記載するも のと同様に分析することができる。 ＥＢＶ ｍＲＮＡ配列を、ＥＢＮＡ１およびＲＡＺ遺伝子をコードする領域に おけるＰＣｆｏｌｄを用いて分析する。弱く塩基対合した、または塩基対合し， ていない推定リボザイム開裂部位が見出された。これらの部位はこれら２種類の 標的ＲＮＡ内のハンマーヘッドリボザイム開裂に対する好ましい部位である。 上記の分析を利用して、コンピューター作成による配列比較に基づいてＥＢＶ ゲノムの選ばれたｍＲＮＡ内の有効標的部位について下記の予想が得られる（図 １０参照）。参考のために標的配列をまず最も５′側のヌクレオチド数と共に列 記する。 コンピューター作成によるＲＮＡ構造に基づいて、ＥＢＮＡ−１およびＲＡＺ 遺伝子内の有効標的部位の予想を挙げる。実施例６ ：Ｔ細胞性白血病 成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）は最初に日本の研究者らにより報告された。タ カツキ（Takatsuki）ら，9 Jpn.J.Clin.Oncol.312,1979。それ以来、この疾病は 東洋の他の地域、カリブ海域、南アメリカおよび中央アフリカで発見された。疫 学的研究により、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、タイプＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）として 知られるレトロウイルスの存在との明白な関連が示された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで のリンパ珠のＨＴＬＶ−Ｉ感染は、腫瘍細胞と同じ細胞タイプの不朽化を生じ、 ＨＴＬＶ−Ｉは動物モデル系、たとえばウサギにおいて発癌性であることが証明 された。 ＨＴＬＶ−ＩはまずＨＵＴ １０２細胞系において同定され（ガロ（Gallo） ら，43 Cancer Res.3892,1983)、これは急性Ｔ細胞性白血病と診断された患者か ら樹立されたものであった。ヨシダ（Yoshida）ら，79 Pro.Natl.Acad.Sci.USA 2031,1982は、ＡＴＬを伴う患者に由来するＭＴ−１として知られる他の細胞系 にもＣタイプのレトロウイルスが潜伏していることを証明し、これがのちにＨＴ ＬＶ−Ｉと命名された。 最初のＡＴＬの報告およびＨＴＬＶ−Ｉの発見以来、このウイルスは他のヒト 疾病に関連することが示された。これらのうち最も注目ずべきものは、熱帯けい れん性パラペシス（ｐａｒａｐｅｓｉｓ．ＴＳＰ）、またはＨＴＬＶ−Ｉ関連脊 髄病（ＨＡＭ）として知られる神経障害である。 ＨＴＬＶ−ＩＩは最初に、毛髪状細胞性白血病と診断された患者に由来ずるＴ 細胞系において報告された。この細胞系（Ｍｏ−Ｔ）は脾臓組織に由来し、その 後ＨＴＬＡ−Ｉに関連する（たたしそれと異なる）ウイルスを潜伏させているこ とが示され、のちにＨＴＬＶ−ＩＩと命名された。ＨＴＬＶ−ＩＩはＨＴＬＶ− Ｉと同様にリンパ球を不朽化するであろう。しかしＨＴＬＶ−ＩＩが疾病に関連 した数は限られているため、このウイルスがヒトの悪性腫瘍において病因上の役 割をもつことは疫学的に証明されなかった。 ＨＴＬＶは、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）およびサルＴ細胞性白血病ウイル ス（ＳＴＬＶ−Ｉ）を包含するレトロウイルス群の１員である。これらのウイル スはオンコウイルス（ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）亜科に属し、他のヒト病原性レトロ ウイルス、たとえばレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ））亜科に属するヒ ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）とは異なる。白血病ウイルスは発癌性であるが、 それらは細胞ゲノムに由来する発癌性配列を潜伏させず、またそれらの複製はｔ ａｘ、ｒｅｘおよびｐｒｏとして知られる少なくとも３種類の他の遺伝子により 調節される。 ＨＴＬＶについて３種類のｍＲＮΛが同定された。５′ＬＴＲのＵ３−Ｒジャ ンクションから転写され、３′ＬＴＲのＲ−Ｕ５領域で終止する全長ＲＮＡがｇ ａｇおよびｐｏｌ遺伝子産物の合成に使用され、ビリオン中へパッケージングさ れるゲノムＲＮＡとして作用する。１つのイントロンが排除されたサブゲノムＲ ＮＡがｅｎｖ蛋白質合成のテンプレートとして作用し、第２イントロンが排除さ れた第２サブゲノムＲＮＡがｔａｘおよびｒｅｘ産物をコードする作用をする。 ｔａｘ開始コドンはｅｎｖ蛋白質のものと同一であり、第２エキソン内でコード される。ｒｅｘ開始コドンも第２エキソン内にあるが、ｔａｘおよびｅｎｖのも のに対し５９ヌクレオチドだけ５′側に位置する。 他のレトロウイルスのプロテアーゼ遣伝子と異なり、ＨＴＬＶプロテアーゼ遺 伝子はｇａｇ領域の３′側部分およびｐｏｌ領域の５′側部分に及ぶが、他の双 方のＯＲＦとは異なる読み枠によりコードされる。ＨＴＬＶ−Ｉの若干のクロー ンにおいては、プロテアーゼ領域の突然変異がクローンの感染性の欠如に関与す る可能性がある。プロテアーゼは、成熟ｇａｇ産物のプロセシングおよび自己触 媒反応による自己開裂に関与し、成熟プロテアーゼ分子を産生する。 ２種類の ユニーク遺伝子（ｔａｘおよびｒｅｘ）がＨＴＬＶ中に見られる。これらは３つ のエキソンを含む単一のスプライス（ｓｌｉｃｅ）されたｍＲＮＡから翻訳され た非ビリオン蛋白質をコードする。これら２遺伝子内の配列の欠失はＨＴＬＶ− １１の感染性クローンを非感染性となし、これはこれらの遺伝子がウイルス複製 に重要であることの証拠を提示する。 ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩのｔａｘ遺伝子はそれぞれ４０および３７ ｋｄの蛋白質をコードする。ｔａｘ蛋白質はトランス作用性転写活性化因子であ り、これらはプロウイルス５′ＬＴＲプロモーターからの転写開始速度を高める 。同時トランスフェクション法により、ｔａｘ蛋白質はＩＬ−２ならびにＧＭ− ＣＳＦｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｓｉｓに対するプロモーターを含めた異種プロモー ターをトランス活性化しうることが示された。 ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩのｒｅｘ遺伝子は、ＨＴＬＶ−Ｉについては２ ７および２１ｋｄの蛋白質を、ＨＴＬＶ−ＩＩについては２６および２４ｋｄの 蛋白質をコードする。これら２種類の蛋白質間の関係は確実ではない。証明によ れば、小さい方のｒｅｘ蛋白質が同一読み取り枠内の内部開始コドンから合成さ れることが示唆される。ｒｅｘ蛋白質は双方ともリン酸化され、感染細胞の核内 に局在する ｔａｘ遺伝子の産物と同様に、ｒｅｘ蛋白質はＨＴＬＶの複製にとって必須で ある。ｔａｘ蛋白質と周なり、ｒｅｘ蛋白質は転写後に作用してウイルス遺伝子 の発現を調節すると思われる。ＨＴＬＶ−Ｉに関しては、ｒｅｘは非スプライス ＲＮＡとｔａｘおよびｒｅｘをコードする完全スプライスｍＲＮＡとの比率を高 めることが示された。ＨＴＬＶ−ＩＩに関しては、ｒｅｘ蛋白質はｔａｘ蛋白質 と協力してトランス活性化の全体的水準を高めることが示された。さらにＨＴＬ Ｖ−ＩＩにおいては、ｒｅｘはウイルスｍＲＮＡ水準を低下させる負の調節役割 をもつ。ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞に対するｒｅｘの究極的作 用は、ビリオン成分をコードする遺伝子の発現水準を調節し、これにより感染性 ビリオンの産生を決定するものである。 ＨＴＬＶ ＲおよびＵ５領域は他のレトロウイルスと比較して異常に長い。こ れらの領域はすべてのウイルスｍＲＮＡの５′末端における非翻訳リーダー配列 をコードし、大きな二次構造を示し、かつ恐らくこれらのｍＲＮＡの翻訳の制御 に際して役割を演じると思われる。 ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩはヌクレオチド水準で約６５％の全配列相 同性を共有する。相同性はＬＴＲおよび非翻訳領域において最低であり、ｔａｘ およびｒｅｘ遣伝子において最高である。異なるＨＴＬＶ−Ｉ単離体間で、これ ら２領域において９６−９９％の相同性がある。配列相同性はＨＴＬＶ−ＩＩ単 離体間においても同様に高い。 効果的なＨＴＬＶ感染には直接的な細胞−対−細胞の接触が要求されると思わ れる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ感染は、通常は標的細胞とＸ線照射またはマイトマイシ ン処理したウイルス産生細胞とを一緒に培養することにより達成される。ＨＴＬ Ｖによる感受性細胞の感染は、他のレトロウイルス感染と比較して経過が緩慢で あり、効果がない。ＨＴＬＶによるヒト索（ｃｏｒｄ）または末梢血リンパ球の 感染の結果、ウイルスの産生および最終的に細胞の不朽化が起こる。Ｔ細胞のみ はＨＴＬＶによりトランスフォームすることが示された。ウイルスの複製は他の 細胞タイプにおいては特定の状況下で、たとえばＥＢＶトランスフォームしたＢ 細胞 においては起こる可能性がある。増殖性感染はリンパ球由来ではない数種類の細 胞、最も顕著にはヒト内皮細胞および二倍体ヒト繊維芽細胞において観察されて いる ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴＬＶによる細胞の感染は、通常はトランスフォーム すべき細胞とウイルス感染細胞とを一緒に培養することによってのみ連成される 。４週間以上の培養後に、増殖性のトランスフォームした細胞が優勢となる。ト ランスフォームしたリンパ球は大部分がＣＤ４+表現型のものであり、これはＡ ＴＬ患者における腫瘍はほとんど常にＣＤ４+タイプのものであるという所見を 反映する。しかし時にＣＤ８+腫瘍が報告され、ＨＴＬＶはＣＤ８+細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフォームすることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランス フォームした細胞はＲＮＡを転写し、ビリオンを産生し、これらの細胞を用いて 他の細胞をトランスフォームすることができる。ＡＴＬ腫瘍細胞においてＨＴＬ Ｖ遺伝子の発現がないことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフォーメーションがｉ ｎｖｉｖｏでの白血病クローンの形成と直接に平行してはいないことを示唆する 。これらの相異は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフォームしたクローンとｉｎ ｖｉｖｏでのものとの選択の困難さの相異を反映するであろう。 ＨＴＬＶ感染細胞の上清からのビリオン調製物は、静態ヒトＴ細胞に対しでマ イトシェン性である。活性Ｔ細胞は静態細胞より容易にＨＴＬＶによってトラン スフォームする。体内のＴ細胞の９５％は一般に静態であるから、このＨＴＬＶ のマイトジェン活性は重要な進化適応であろう。 ビリオンのマイトジェン活性は、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞を連続的に刺激 することにより連続的な細胞増殖が生じるＨＴＬＶトランスフォーメーションの メカニズムを示唆する。ｔａｘ蛋白質発現を同時に要求することは、ｉｎ ｖｉ ｔｒｏでげっ歯類の一次繊維芽細胞のトランスフォーメーションに際して見られ た状況と類似する。後者の場合は、細胞のトランスフォーメーションを起こさせ るために２種類の癌遺伝子、すなわち一方は核内で作用するものおよび他方は細 胞膜において作用するものの同時発現が必要である。従って他のレトロウイルス とは異なり、Ｔ細胞のトランスフォーメーションはＨＴＬＶによる感染につき普 通に起こる事象であると思われる。 ＡＴＬにおける段階につき幾つかのカテゴリーが報告されている。これらの段 階には下記のものが含まれる：（ｉ）無症候性保有者；（ｉｉ）白血病前状態（ ｐｒｅ−ΛＴＬ）；（ｉｉｉ）慢性／潜在性（ｓｍｏｌｄｅｒｉｎｇ）ＡＴＬ； および（ｉｖ）急性ＡＴＬ。場合によりこれらの段階は一時的に関係することも ある。急性ＡＴＬにおける唯一の重要な予後徴候因子は腹水の存在であり、これ は比較的短い生存を伴う。桔極的な化学療法にもかかわらず、急性ＡＴＬにおけ る平均生存は数カ月の期間である。 若干のＡＴＬ患者における疾病の形態は、白血病というよりむしろＴ細胞性リ ンパ腫のものである。ＡＴＬの鑑別診断には、他の悪性Ｔ細胞性腫瘍、たとえば 非ホシキンリンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、およびＴ細胞性慢性リンパ 球性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。ＨＴＬＶ−Ｉが役割を果たすと思われるＡＴ Ｌと異なる悪性腫瘍の１つは、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ細胞性ＣＬＬ ）である。ＡＴＬ患者および若干のＨＴＬＶ−Ｉ保有者における免疫反応の機能 障害に関する若干の証明がある。数例のウイルス感染に伴う白血病におけるＨＴ ＬＶ−ＩＩの役割は、研究に利用しうる症例が不十分であるため不明である。 ＡＴＬは、亜急性または急性疾患の生存が数カ月の期間である著しく悪性の疾 患である。わずか１％の患者が無症候性から急性疾患に進行するので、治療はか なり進行した疾患に限られる。他の攻撃的なリンパ腫および白血病に採用される 標準的な併用療法はＡＴＬには無効であった。他の薬剤、たとえばデオキシコホ ルマイシン、βインターフエロン、γインターフエロン、および抗Ｔａｃ抗体は 、ＡＴＬの治療に投立たなかった。 本発明は、リボザイムの使用によりこれらのウイルスのＲＮＡを開裂させるこ とでもある。特に本明細書に記載するリボザイム分子は、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｔａ ｔ、およびｒｅｖウイルス遺伝子を標的とする。これらの遺伝子は当技術分野で 知られている。下記を参照されたい：マツクラ（Matsukura）ら，86 Pro.Natl.A cad.Sci.USA 4244,1989、チェン−マイヤー（Cheng-Mayer）ら，246 Science 16 29,1989、ビシジ (Viscidi)ら，246 Science 1606.1989、マリム（Malim）ら， 8 6 Pro.Natl.Acad.Sci.USA 8222,1989、ターウィリガー（Terwilliger）ら，88 P ro.Natl.Acad.Sci.USA 10971,1991、およびバルテル（Bartel）ら，67 10971,19 91 好ましい開裂部位は、ウイルスの複製、たとえば蛋白質合成に必要な領域、た とえばＬａｘ、ｒｅｘもしくはｐｒｏ遺伝子領域、またはウイルスの遺伝子発現 を調節することが知られている横造、たとえば５′−ＬＴＲもしくは３′−ＬＴ Ｒ領域にある。 ＨＴＬＶ−ＩのゲノムはそのＲＮＡ含有および逆転写におけるエラーの性質に より遺伝子浮動を受けやすい。しかしウイルスの複製にとって必須であるゲノム の領域（遺伝子）は長期間にわたって定常配列を維持する（すなわち保存する） と予想される。これらの領域は免疫不全ウイルスの異なるタイプまたは株間で比 較的保存されやすく、従ってそれらのウイルスすべてを破壊するために１種類の リボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は本発明において好まし い標的部位である。従ってすべてのＨＴＬＶ−Ｉ、ならびにすべてのＨＴＬＶＩ Ｉ、ＢＬＶおよびＳＴＬＶウイルスを標的とするために１種類のリボザイムを用 いることができる。本発明者らは高度に保存されることが知られているＨＴＬＶ −Ｉの２種類の遺伝子を選び、それらのヌクレオチド配列をこれらの領域を標的 とするリボザイムにより開裂しうる領域の存在につき調べた。詳細に分析した２ 種類の遺伝子はｔａｘおよびｒｅｘ遺伝子である；ｐｒｏ遺伝子、５′−ＬＴＲ および他の上記遺伝子も以下に記載するものと同様に分析することができる。 ＨＳ−３５クローンのＨＴＬＶ−Ｉ ｍＲＮＡ配列を、ｔａｘおよびｒｅｘ蛋 白質をコードする領域において分析した。２３の推定リボザイム開裂部位がｍＲ ＮＡの開放（すなわち弱く塩基対合した）領域に存在することが見出された。こ れらの部位はこれら２種類の標的ＲＮＡ内のハンマーヘッドリボザイム開裂に対 する好ましい部位である。 上記の分析を利用して、コンピューター作成による配列比較に基づいてＨＴＬ Ｖ−Ｉゲノムのｔａｘおよびｒｅｘ遣伝子内の有効標的部位について下記の予想 が得られた（図１１参照）。参考のために標的配列をまず最も５′側のヌクレオ チド数と共に列記する。実施例７ ：ＨＣＶ 肝炎Ｃ型ウイルス群は非Ａ非Ｂ型肝炎の大部分の症例に関与する。非Ａ非Ｂ型 肝炎は多数の異なるウイルスにより引き起こされるが、主因はＨＣＶである。感 染は輸血（血友病患者の２５−５０％は慢性肝炎を伴う）、違法薬物の使用によ る皮下注射（すべての薬物使用者の２５−５０％は非Ａ非Ｂ型肝炎を伴う）、腎 臓器官の移植（この場合、後期死亡率の大部分は非Ａ非Ｂ型肝炎による）、およ び母体−新生児転移により伝搬する。肝炎の散在性出現のうち最高２０％はＨＣ Ｖにより引き起こされる。 そのウイルス粒子は直径３０−６０ｎＭであり、エンベロープをもち、かつ正 の極性の線状ＲＮＡゲノムからなり、かつ約１０ｋｂの解読情報を含む。この科 のウイルスに関しては、遺伝子発現またはコードされる蛋白質について多くは知 られていない。ウイルスゲノムはプラス鎖ＲＮＡ分子であり、これは読み取り枠 の組成および全サイズにおいてフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）群のも のに類似する。ＨＣＶゲノムと他のフラビウイルスまたはトガウイルス（Ｔｏｇ ａｖｉｒｕｓ、他のプラス鎖ＲＮＡウイルス）との間にはヌクレオチド相同性は ない。ＲＮＡは単一の読み取り枠から翻訳され、次いでポリペプチド前駆体がプ ロセシングされて、ウイルスの複製に必要な個々の蛋白質になると考えられる。 フラビウイルスに対するこのような表面的な類似性を別として、ＨＣＶ科はピコ ルナウイルス科のＲＮＡウイルスにも類似する。ピコルナウイルスの場合と同様 に、ＨＣＶゲノムの５′側非翻訳領域がウイルスＲＮＡの翻訳発現を制御する。 肝炎におけるＨＣＶの複製は、他の肝炎ウイルスの複製と一体に絡み合ってい る。肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）はＨＣＶと全く異なっているが、これら２ウ イルスの生活環は相互依存性である。普通はＨＤＶは、キャプシド蛋白質その他 の感染性ＨＤＶ粒子の組み立てに必要な機能を供給するために、肝炎Ｂウイルス （ＨＢＶ）の複製に依存する。ＨＣＶは同時感染した細胞においてＨＢＶおよび 肝炎Ａ型ウイルス（ＨＡＶ）の増殖を阻害するので、ＨＣＶの複製はＨＤＶの成 熟をも阻害する可能性がある。ＨＣＶ感染の治療のための遺伝子べクターとして ＨＤＶを使用することは、この干渉により影響されないであろう。ＨＤＶゲノム の遺伝子発現はＨＣＶにより明らかに阻害されないからである。 この一群の化学的開裂は感染細胞内のウイルスＲＮＡのみに対して高度の特異 性を示す。高度に保存された配列領域を標的とするリボザイム分子により、単一 化合物でヒトＨＣＶの多数の株を処置することができる。ＨＣＶのウイルス遺伝 子の発現を特異的に攻撃する治療法は存在しない。現在の治療プロトコル（イン ターフェロンおよびリバビリン）は、ウイルスの複製ではなく疾病の症状を治療 することからなる。現在の治療プロトコルを停止すると、続いて疾病の反動が起 こる。その治療法はウイルスの潜在性ウイルス複製に衝撃を与えるものではない からである。ウイルスＲＮＡ開裂は、ウイルスの複製および新たに感染した細胞 における潜伏性の確立を低下させる新規な処置法を提供する。 本発明方法を利用して、急性および慢性ウイルス感染ならびにＨＣＶ誘発性肝 細胞トランスフォーメーションの双方を含めたヒト肝炎Ｃ型ウイルス感染を処置 することができる。この有用性はこのような感染が獣医学的に重要である、ヒト 以外の動物に感染する他のＨＣＶ種にまで拡大することができる。 処置は活性ウイルス感染の時点で行われ、感染細胞におけるウイルス負荷を低 下させ、かつウイルス複製を不能にする。リボザイム処置はワクチンに使用しう る欠損ゲノムを作成する手段としても利用しうる。 好ましい開裂部位はウイルスの複製、たとえば蛋白質合成に必要な領域、たと えばＨＣＶゲノムの５′側非翻訳領域内にある。この領域はピコルナウイルスの キャップ非依存性（ｃａｐ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）翻訳制御を連想させる様 式でウイルス蛋白質の翻訳を制御すると考えられる。ＲＮＡのこの領域を妨害す ると、欠損蛋白質の合成および不完全なＤＮＡ合成（および欠損ゲノムからの転 写の阻害）が生じる。 ５′側非翻訳領域外の他の領域もＨＣＶ複製のリボザイム仲介による阻害の適 切な標的となる。このような標的には、ウイルスの構造性蛋白質をコードするｍ ＲＮＡ領域が含まれる。特定の標的領域の選択は、ゲノムの二次構造に依存する であろう。副ｍＲＮＡ内の標的も、特にこれら他のＲＮＡの折りたたみまたはア クセス可能性のアッセイによりゲノム中に無い他の標的配列が明らかになった場 合は用いることができる。本発明には２以上の異なるリボザイムを療法処置に使 用しうる。 上記のように、ＨＣＶのゲノムはそのＲＮＡ含有およびゲノム複製におけるエ ラーの性質によって急速な遺伝子浮動を受けやすい。しかしウイルスの複製にと って必須であるゲノムの領域（遺伝子）は長期間にわたって定常配列を維持する （すなわち保存する）と予想される。これらの領域は異なるタイプまたは株のＨ ＣＶウイルス間で比較的保存されやすく、従ってそれらのウイルスすべてを破壊 するために１種類のリボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は本 発明において好ましい標的部位である。従ってすべてのＨＣＶウイルスを標的と するために１種類のリボザイムを用いることができる。本発明者らはこれらのウ イルスのこのような幾つかの遺伝子を選び、それらのヌクレオチド配列をこれら の領域を標的とするリボザイムにより開裂しうる領域の存在につき調べた。詳細 に分析した１種類の遣伝子は５′側非翻訳領域である；他の遺伝子も以下に記載 するものと同様に分析することができる。 ウイルスのｍＲＮＡ配列をＲＮＡｆｏｌｄコンピューター分析により折りたた む。弱く塩基対合した、または塩基対合していないヌクレオチドを含むと予想さ れるｍＲＮＡ領域、この場合はＨＣＶの５′側ヌクレオチドを、推定リボザイム 認識モチーフにつき探査する。これらの部位はこれらの標的ＲＮＡ内のハンマー ヘッド型または他のリボザイムによる開裂に対する好ましい部位である。 これらの分析を利用して、コンピューター作成による構造分析に基づいてＨＣ ＶゲノムＲＮＡ内の有効標的部位について下記の予想が得られた（図１２参照） 。標的ヌクレオチドを配列の左側に挙げたゲノムヌクレオチド数（ＨＣＶゲノム 内の）と共に列記する。フランキングヌクレオチド配列を参考のために挙げる。実施例８ ：ＣＭＶ 以下は関連のＣＭＶの生物学的特性の一般的概要として提示される。 サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）はべータヘルペスウイルス（ｂｅｔａｈｅｒ ｐｅｓｖｉｒｕｓ）科に属し、複製および病原性に関して種特異性ウイルスであ る。天然宿主においてすら、増殖性感染に対して必ずしもすべての細胞が同等に 感受性ではない。ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）の場合、リンパ球の不稔感染が宿主の 免疫監視の侵入にすら関与する可能性がある。ＣＭＶ感染は、細胞培養および動 物宿主の双方においてアルファヘルペスウイルス（ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉ ｒｕｓ） （たとえばＨＳＶおよびＶＺＶ）の場合よりはるかに緩慢に進行する 。感染性ウイルスは長期間存続する可能性があり、その後ウイルスは潜伏性感染 を確立すると思われる。これらのウイルスはアルファヘルペスウイルスより少な くとも５０％高い配列複雑度をもつが、なお宿主細胞への依存性および密接な関 連がある。これらには、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化した細胞に対する増殖要 件、および宿主細胞の高分子合成の刺激が含まれる。 両方の科のヘルペスウイルスとも宿主に侵入してそれらの最初の組の遺伝子を 極めて迅速に（１−３時間）発現するが、ベータヘルペスウイルスはウイルスＤ ＮＡ合成を開始するのに１２−２４時間を必要とし、一方アルファヘルペスウイ ルスは４−６時間以内にウイルスＤＮＡ合成を開始する。同様にアルファヘルペ スウイルスは感染後２４−４８時間で細胞単層中にプラークを形成し、一方ベー タヘルペスウイルスは検出可能なプラークを形成するのに７−１４日を必要とす る。これらの結果が示唆するように、遺伝子発現の制御はＨＳＶまたはＶＺＶの 場合と比較してＣＭＶの場合はかなり異なる。 ＣＭＶは、それらの天然宿主内では他のヘルペスウイルスと同じ細胞タイプの 多くにおいて複製するが、この群のウイルスはｉｎ ｖｉｔｒｏでは繊維芽細胞 内での複製に限られる。その理由は不明である。 ＣＭＶゲノムは宿主細胞内に増殖性、永続性または潜伏性の状態で存続しうる ので、ウイルス遺伝子の発現を調節する多数の特色があるはずである。ＣＭＶの 即時型遺伝子の発現がウイルスの複製に際して重要な役割を果たす。これらの遺 伝子の産物は他のウイルス遺伝子、それら自身の遺伝子、および細胞遺伝子にす ら影響を及ぼすことが知られているからである。ｉｅｌ遺伝子は０．７３９−０ ． ７５１地図単位間の約２．８ｋｂに及び、１２１ヌクレオチドの５′側リーダー エキソン、これに続く８８，１８５および１，３４１ヌクレオチドの３エキソン からなる１．９５ｋｂのＲＮＡをコードする。ｍＲＮＡの読み取り枠（ＯＲＦ） は第２エキソンにおいて始まり、４９１ａａとポリペプチドをコードする。ｉｅ １蛋白質のサイズはＨＣＭＶの株間で若干異なるが、異なる種のＣＭＶ間ですら なお若干のｉｅ１ヌクレオチド配列相同性が保存される。 交互スプライシングパターンにより、ｉｅ１領域のエキソン１、２および３は ｉｅ２ ｍＲＮＡ上に連結反応して、２．２５および１．７０ｋｂの２つのｍＲ ＮＡを生じることができる。これらのｍＲＮＡによりコードされる蛋白質はｉｅ １のエキソン２および３に由来する８５アミノ酸を含有するが、大部分の蛋白質 は領域ｉｅ２ａに由来する。２．２５ｋｂと１．７０ｋｂのｍＲＮＡはｉｅ領域 ２ａにおける小さなスプライシングにより異なり、それらはそれぞれ７１および ５３ｋｄの蛋白質をコードすると予想される。より小さな１．４ｋｂのｍＲＮＡ もｉｅ領域２ａに由来する。このｍＲＮＡは感染サイクルの後期においてのみ、 独立したプロモーター制御下に転写される。 ＨＣＭＶ ＤＮＡポリメラーゼは宿主細胞のポリメラーゼと生理学的に異なる 。ウイルスのポリメラーゼは１４０ｋｄの蛋白質であり、これはポリメラーゼ関 連ＤＮＡ結合性蛋白質と呼ばれる５１−５８ｋｄのポリペプチドを伴う。このポ リメラーゼは他のヘルペスウイルスのポリメラーゼと相同領域を示すが、ＣＭＶ ポリメラーゼに独自の領域をも有する。大部分の抗ウイルス薬はＣＭＶポリメラ ーゼの阻害を目標とする。 他のウイルス蛋白質（ＵＬ９７遺伝子産物）は遺伝的にＣＭＶポリメラーゼと 関連することが抗ウイルス耐性の研究において見出された。ＵＬ９７遺伝子は、 ガンシクロビル耐性表現型を生じる、ウイルスＤＮＡポリメラーゼにおける同時 突然変異を示す多数の生存性株において突然変異することが認められている。Ｃ ＭＶゲノムＤＮＡの複製におけるこれら２種類の蛋白質の相互作用は不確実であ るが、ＵＬ９７遺伝子と他のヘルペスウイルス遣伝子（たとえばＵＬ１３遺伝子 またはＨＳＶ−１）との相同性があること、およびヘルペスウイルス間のｍＲＮ Ａをコードする転写ユニットが一般に保存されることは、この遺伝子がウイルス 複製の効率にとって重要であろうということを示唆する。ＵＬ９７遺伝子の推定 ＯＲＦ内には多数のプロテインキナーゼモチーフが存在し、ＨＳＶ ＵＬ１３蛋 白質は蛋白質リン酸化活性を保有することが知られている。従ってＨＣＭＶのＵ Ｌ９７遺伝子はあるＣＭＶ蛋白質、恐らくＤＮＡポリメラーゼのリン酸化により 、遺伝子発現の制御を補助すると仮定される。 ＣＭＶの多数の構造蛋白宵は感染の後期に発現される。すべての構造蛋白質は ビリオン粒子の形成またはインテグリティーにおいて投割を果たすと仮定される が、これらのうち最も関連性のあるものはウイルスの糖蛋白質である。ｇＢ相同 遣伝子は、他のヘルペスウイルス、たとえばＨＳＶ、ＶＺＶ、ＥＢＶおよび他の 動物のＣＭＶのｇＢ遺伝子と相同性を有する。このウイルス蛋白質は、プロテイ ン９０６ａａをコードする、長さ約３．９ｋｂのスプライシングされていないｍ ＲＮＡによりコードされる。そのアミノ酸配列は典型的な真核細胞シグナル配列 、および１７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、ならびにカルボキシ末端付近のト ランスメンブランドメインを含む。ＨＳＶ ｇＢはウイルス感染に際して膜の融 合を促進する機能をもつことが提唱された。ｇＢ遺伝子はヘルペスウイルス間で 極めて高度に保存されるので、ＣＭＶ ｇＢ蛋白質も感染に際して膜の融合事象 に関与するであろうと仮定するのは妥当である。ＨＳＶの場合と同様に、ＨＣＭ Ｖの他の糖蛋白質がウイルス感染に関与する可能性があり、これにはｇＨ相同体 、ｇｃＩ、ｇｃＩＩ、ｇｃＩＩＩおよびＨＸＬＦ群の糖蛋白質が含まれる。 ひとはＨＣＭＶの唯一の貯蔵所であると考えられ、伝達は直接または間接的な 対人接触により起こる。ウイルス源には、鼻咽頭分泌物、尿、頸部および膣分泌 物、精液、乳汁、涙、便および血液が含まれる。ウイルスの分泌は先天的、分娩 時および分娩後の初期に受けた感染ののち数年間続く。青年および若い成人の感 染には長期間のウイルス複製が続く可能性があり、成人においては間欠的脱落期 間が再発に伴う。 経口および呼吸による拡散が子供および成人における伝達の主要経路であると 思われる。輸血は初回および再発性ＣＭＶ感染双方の危険性の増大を伴う。ＣＭ Ｖ感染は免疫抑制処置された患者、たとえば癌に対する化学療法を受けているか 、または器官移植の準備中である患者においてはさらにいっそう著しく増加する 。恐らく最も危険性の高いグループはエイズに罹患した患者であろう。ＣＭＶ感 染の発生率がエイズ患者間で極めて高いので、一時はＨＣＭＶが病原体であると 考えられた ＣＭＶ感染の病理についての研究は、種々の感染組織における巨大細胞封入体 （ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉｃ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の分布を描き出す ことに集中した。疾病が著しく伝染している場合、ＣＭＶ感染の徴候は実質的に すべての器官系に見られる。ヒトの場合、細胞培養における増殖と異なり、ＣＭ Ｖは主として管上皮細胞に感染し、まれに繊維芽細胞が関係する。ウイルス尿（ ｖｉｒｕｒｉａ）はあらゆる年齢のグループにおけるＣＭＶ感染の共通の特色で あり、これは腎臓が関係した結果である。巨大細胞封入体は皮質領域付近の近位 尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ）に顕著に見られる場合が最も多い。 恐らく腎臓移植患者を例外として、ＣＭＶの腎臓感染により腎臓機能障害が生 じることはまれである。しかし腎臓移植患者の場合、ＣＭＶは機能障害において 、および移植片拒絶においてすら役割を果たす可能性がある。成人の場合、ＣＭ Ｖ肝炎は肝細胞中の巨大細胞封入体により顕性となる。肺臓感染の場合、封入体 は肺胞および細気管支の上皮に最も濃縮される。気管の粘膜が関係することはよ り少なく、大部分の肺臓感染は高齢の免疫抑制患者において起こる。ＣＭＶ肺炎 はエイズ患者における主要な死因の１つである。 従来、ＣＭＶはＣＩＤ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉｃ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｄｅ ｓｅａｓｅ）を生じる胎児感染の場合を除いてまれであった。近年、ＣＭＶの関 与はエイズを伴う成人において頻度が増大している。永久的な、通常は著しく広 汎性の脳障害が新生児のＣＩＤの特徴である。小児および成人の双方において、 グリア細胞および神経細胞が増殖性または不稔性感染される可能性がある。毛管 上皮に封入体を保有する細胞があることは、大部分の症例において血液による拡 融を示唆する。 胃腸の関与も増加している。ＣＭＶはエイズ関連の他の病原体と同時感染する 可能性があり、他の病変、たとえばカポージ肉腫と共に存在する場合がある。壊 死性病変に伴う予後は思わしくない。 感覚神経性（ｓｅｎｓｉｎｅｕｒａｌ）聴覚障害は先天性および新生児感染双 方の特色である。巨大細胞が、うずまき管および骨半規管の上皮細胞を含めた多 数の細胞に見られる。妥当な態度の発生率を伴う他の器官には、副腎、卵巣、骨 、膵臓および皮膚が含まれる。 ＣＭＶは他の発癌性ウイルスと、たとえば宿主細胞の高分子合成を刺激する能 力、およびオルニチンデカルボキシラーゼの合成を刺激する能力などの特性を共 有する。トランスフォーメーション能力を備えたＨＣＭＶの遺伝子配列が報告さ れている。さらにＣＭＶまたはその産物は、前立腺癌、結腸の腺癌、頸部癌、お よびカポージ肉腫を含めたヒト腫瘍に見られる。 本発明はこれらのウイルスがコードずるｍＲＮＡまたはｈｎＲＮＡをリボザイ ムの使用により開裂させることでもある。特に本明細書に記載するリボザイム分 子はｉｅ１およびｉｅ２ウイルス遺伝子を標的とする。これらの遺伝子は当技術 分野で知られている。たとえばステンバーグ(Stenberg)ら，56 J.Virol.665,198 5,アレリグ(Alerigg)ら，2 Virus Res.107,1985，ステンバーグ(Stenberg)ら．6 3 J.Virol.2699,1989，ヘルミストン(Hermiston)ら，61 J.Virol．3214.1987を 参照されたい。 好ましい開裂部位はウイルスの複製、たとえば蛋白質合成に必要な領域、たと えば即時型（ｉｅ）１および２ ｍＲＮＡをコードする領域のイントロン／エキ ソン領域内の領域である。この領域はその後のウイルス遺伝子発現のタイミング 、従ってウイルス複製開始の成功を制御する。ｍＲＮＡのこの領域が妨害される と、欠損のある蛋白質の合成および不完全なＤＮＡの合成が起こる。 ＨＣＭＶ ｉｅ外の他の領域もリボザイム仲介によるＨＣＭＶ複製の阻害に有 用な標的となる。本発明において好ましい他の標的には、ウイルスＤＮＡポリメ ラーゼ、ｇＢ相同体およびＵＬ９７遺伝子が含まれる。他のＨＣＭＶ遺伝子内の 標的を設計することができ、これら他のｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡにおけるアク セス可能性のアッセイ（後記参照）により、ＲＮＡ折りたたみプログラムからは 到連可能であると予想されない標的配列がさらに明らかになるであろう。ヒトに おけるウイルス複製に必須であるＲＮＡをコードする遺伝子をリボザイム開裂の 標的とすることができる。 サイトメガロウイルス、特にヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）の複製のリボザイム型阻 害物質を用いることにより、ＣＭＶ誘導による細胞トランスフォーメーション、 ＣＭＶ誘導による免疫不全、および潜伏性ＣＭＶ感染の保持を引き起こす遺伝子 発現のリボザイム特異性阻害が可能となる。 本発明は、ヒトザイトメガロウイルスの複製を阻害する新規方法、ならびにヒ トおよび他の動物種の双方においてこれらのウイルスにより引き起こされる疾病 を処置する方法を提供する。 これらのリボザイムは、感染細胞におけるウイルスＲＮＡに対してのみ高度の 特異性を示す。高度に保存された配列領域を標的とするリボザイム分子により、 多数のＨＣＭＶ株を単一化合物で処置することができる。ウイルスゲノムＤＮＡ の複製に関与するもの以外のウイルス遺伝子の発現を特異的に攻撃する処置法は ない。ＨＣＭＶ感染の臨床処置のために現在用いられている薬物は、著しい副作 用を呈し、このためすべての患者に使用することはできない。たとえばガンシク ロビルは不可逆的な生殖腺毒性を生じることが知られており、ホスホノホルミッ ク酸（ＰＦＡ）は好中球減少症および腎機能障害を生じる。後者の作用は双方と も器官移植患者において重大な間題である。 本発明は、増殖性ウイルス感染および潜伏性感染の双方、またはＨＣＭＶ誘導 性の細胞トランスフォーメーションを含めたヒトサイトメガロウイルス感染の処 置に用いることができる。この有用性は、ヒト以外の動物に感染し、それらの感 染が獣医学的に重要である他のサイトメガロウイルス種にまで拡大することかで きる 処置は活性、潜伏性または存続性ウイルス感染の時点で行われ、感染細胞にお けるウイルス負荷を低下させ、かつウイルスの複製を不能にする。トランスフォ ームした上皮細胞を処置するためには、本発明を利用してウイルス遣伝子、また は細胞のトランスフォーメーションを引き起こすと考えられる関連ＲＮＡの発現 を阻害する。 ＣＭＶのゲノムはそのＤＮＡ複製におけるエラーによって急速な遺伝子浮動を 受けやすい。しかしウイルスの複製にとって必須であるゲノムの領域（遺伝子） は長期間にわたって定常配列を維持する（すなわち保存する）と予想される。こ れらの領域は異なるタイプまたは株のＣＭＶウイルス間で比較的保存されやすく 、従ってそれらのウイルスすべてを破壊するために１種類のリボザイムが必要で あるにすぎないので、これらの領域は本発明において好ましい標的部位である。 従ってすべてのＣＭＶウイルスを標的とするために１種類のリボザイムを用いる ことができる。本発明者らはＣＭＶのこのような幾つかの遺伝子を選び、それら のヌクレオチド配列をこれらの領域を標的とするリボザイムにより開裂しうる開 放されたｍＲＮＡ領域の存在につき調べた。詳細に分析した２種類の遺伝子はｉ ｅ１およびｉｅ２遺伝子である；他の遺伝子も以下に記載するものと同様に分析 することができる。 ＣＭＶ ｍＲＮＡ配列をｉｅ１およびｉｅ２蛋白質をコードする配列内の弱く 塩基対合した、または塩基対合していない領域につき分析した。これら２標的Ｒ ＮＡ内のハンマーヘッドリボザイムに対する好ましい開裂部位である推定リボザ イム開裂部位が見出された。 これらの分析を利用して、コンピューター作成による構造分析に基づいてＣＭ Ｖゲノムのｉｅ１およびｉｅ２遺伝子内の有効標的部位について下記の予想が得 られた（図１３参照）。標的配列をまず最も５′側のヌクレオチド数と共に列記 する。標的ヌクレオチドにはアンダーラインを付け、各列の最初に参照ヌクレオ チド数を挙げる。リボザイム結合アームに対して相補的な領域の全部または一部 を構成するフランキングヌクレオチドを示す。これらの配列はＨＣＭＶのＡＤ１ ６９株のＤＮＡ配列から得た。実施例９ ：インフルエンザウイルス ３タイプのインフルエンザウイルス（Ａ、ＢおよびＣ型）がそれらの内部抗原 により識別される。これら３タイプを特徴付ける他の生物学的特性がある：（ａ ） インフルエンザＡ型ウイルスはヒトのほか多数の動物種から単離されているが、 ＢおよびＣ型ウイルスは主としてヒトの病原体である； （ｂ）インフルエンザ Ａ型ウイルスの表面の糖蛋白質はＢおよびＣ型ウイルス内のそれらの相同体より はるかに高い変動性を示す；（ｃ）Ｃ型ウイルスの形態学的および分子の特色は 、ＡおよびＢ型ウイルスのものと異なる。 インフルエンザウイルスの形態学的特色は遺伝的特質であるが、鶏卵黄内での 継代または組織培養ののちには球形の形態が支配的となる。形態を特定する遺伝 子は不確実であるが、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）エ ンベロープ表面蛋白質から別個に分離する。脂質エンベロープ内にはマトリック ス蛋白質（Ｍ）があり、これは構造性機能を果たす。このマトリックスシェル内 には、核蛋白質（ＮＰ）に結合した８種類のマイナスセンスの一本鎖ＲＮＡ分子 、ならびにＲＮＡの複製および転写に必要な３種類の大型蛋白質（ＰＢ１、ＰＢ ２およびＰＡ）がある。感染細胞においては少なくとも３種類のウイルスコード −非構造蛋白質（ＮＳ１、ＮＳ２およびＭ２）が形成される。 ビリオン内での８つのＲＮＡセグメントの体制は完全には解明されていない。 各セグメントはｉｎ ｖｉｖｏで核蛋白質コンプレックスとして存在するが、電 子顕微鏡による研究は、分断したビリオンからの内部成分は１つの大型ヘリック スであることを示した。ビリオン粒子はＲＮＡの周りの密な保護被膜であるとは 思われない。ビリオンのリボヌクレアーゼ消化によりＲＮＡセグメントはヌクレ オチドに還元されるからである。インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡはウイ ルスの複製に際して役割を果たす末端パンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）に、 より、ビリオンおよび感染細胞において環状のコンホメーションに保持される。 パンハンドル構造はゲノムＲＮＡのすべてのセグメント中に存在する。 ＨＡはウイルス蛋白質の２５％を占め、ビリオン表面に均一に分布する。これ は細胞へのウイルスの付着、および感染初期における細胞へのウイルスの貫通に 関与する。ＨＡモノマーは４番目の大きさのＲＮＡセグメントによりコードされ 、単一ポリペプチド鎖として合成され、これが３部位のうち最小の翻訳後開裂を 受ける。ＨＡ１およびＨＡ２へのＨＡポリペプチドの開裂がウイルス粒子感染性 にとって必要である。ＨＡ２のＣ末端の２５−３２疎水性アミノ酸の配列はＨＡ をウイルス膜中につなぎ止める作用をする。ＨＡ中の機能性ドメインが保存され るにもかかわらず、これらの蛋白質のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、 異なるサブタイプの単離体間でかなり変動する。 ＮＡはビリオンの第２のサブタイプ特異性糖蛋白質であり、単一ポリペプチド 鎖で構成される。ＮＡはビリオン表面に均一には分布せず、パッチ状に見られる 。ウイルスの生活環におけるＮＡの役割は不明である。ＮＡポリペプチドの翻訳 後開裂は起こらない。異なるＮＡ遺伝子単離体のヌクレオチド配列はサブタイプ 間でかなり変動する（たとえばＡ型およびＢ型ウイルスのアミノ酸相同性は２６ −２９％である）。Ｂ型インフルエンザのＮＡ遺伝子は２種類の蛋白質ＮＡおよ びＮＢをコードする。ＮＡはＡ型のＮＡに構造的および機能的に類似すると考え られる。ＮＢ蛋白質は長さ１００アミノ酸の、未知の機能をもつ糖蛋白質である 。 核蛋白質（ＮＰ）は、インフルエンザウイルスのＡ、ＢおよびＣ型インフルエ ンザウイルスを区別するタイプ特異性抗原の１つである。ＮＰは核蛋白質コンプ レックスの形成に際して構造上の投割を果たし、かつ転写および複製に際して役 割を果たすと推定される、多機能性蛋白質である。多数のインフルエンザ株を遺 伝的に分析することにより、ＮＰ遺伝子は５つの異なるグループの１つに分類し うることが解明された。トリ株はすべて２グルーブに属し、ウマ株はさらに２グ ループに属し、ヒトおよびブタの株すべてが最後のグループを形成する。特定の 種がこれらのグループに限定されることは、ＮＰ遺伝子が種特異性または宿主範 囲に影響を及ぼす可能性があることを示唆する。 ＲＮＡセグメント７は２種類のＭ蛋白質（Ｍ１およびＭ２）をコードずる。Ｍ １をコードするｍＲＮＡはＲＮＡセグメント７と共直線性（ｃｏｌｉｎｅａｒ） であり、これに対しＭ２はスプライスされたｍＲＮＡによりコードされる。これ ら２種類の蛋白質は蛋白質合成に関する同一の開始コドン、およびＭ２ ｍＲＮ Ａの５′側スプライスジャンクション前の８アミノ酸残基を共有する。Ｍ２の残 り８８のアミノ酸はヌクレオチド７４０−１１０４からの＋１読み枠内でコード される。ＲＮＡセグメント７のこの体制は、配列決定されたインフルエンザＡお よびＢ型ウイルスすべてに存在する。 Ｍ１蛋白質は糖蛋白質およびリボヌクレオ蛋白質コンプレックスの双方に近接 して脂質二重層に密に結合しているビリオン構造性蛋白質である。それはビリオ ン転写酵素活性のダウンレギュレーションにおいて役割を果たすとも考えられる 。この蛋白質に対する受身伝達されたモノクローナル抗体は、インフルエンザウ イルスによる感染に対する抵抗性を与えない。 Ａ型インフルエンザのＭ２蛋白質は細胞表面で発現する膜内在性蛋白質である 。Ｍ２蛋白質はビリオン当たり１４−６８分子のビリオン結合蛋白質であろう。 インフルエンザウイルスのアマンタジン耐性突然変異体は、Ｍ２蛋白質のトラン スメンブランドメインに突然変異を含む。アマンタジンは細胞内へのウイルスの 貫通を変化させるので、Ｍ２はビリオン内にあると思われる。 Ｈ３Ｎ２（Ｕｄｏｒｎ）およびＨ１Ｎ１（ＰＲ８）株のＲＮＡセグメント７配 列の比較により、これらのウイルスのＭ蛋白質コード配列（３８年間隔てて単離 された）は高度に保存されることが示される。ラム(Lamb)，“インフルエンザウ イルスの遺伝子および蛋白質”，クルグ(Krug）編，The Influenza Viruses,ニ ューヨーク、プレナム，１９８９。４３年間にわたって単離されたヒトＨ１Ｎ１ 、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２株由来のＲＮＡセグメント７を比較すると、同じセグ メント７がＨＡおよびＮＡの抗原性シフトを全体を通して保持されたことが示唆 される。ホールおよびエア(Hall,Air)，38 J.Virol.1,1981。 ＡおよびＢ型インフルエンザのＲＮＡセグメント８は別個のｍＲＮＡから翻訳 される２種類の構造蛋白質をコードすることが研究により示された。Ａ型インフ ルエンザのＮＳ１およびＮＳ２ポリペプチドはそれらのＮ末端の９アミノ酸を共 有し、ＮＳ２ ｍＲＮＡにはその後に４２３ヌクレオチド欠失がある；次いでＮ Ｓ２ ｍＲＮＡは＋１読み枠内のＮＳ１ ３′側領域に再結合する。ＮＳ１は感 染の初期に大量に合成される。ＮＳ２は感染の後期に作られるにすぎない。両蛋 白質は核局在化シグナルを共有し、感染細胞の核中に見られる。ヒトまたはトリ からの野外単離体のＮＳ１蛋白質のカルボキシ末瑞には大規模な欠失が起こり、 これはこのポリペプチドにおいてその機能に影響を及ぼすことなく高度の変異が 耐容されることを示す。 ビリオンの３種類の最大蛋白質（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ）はＮＰおよびビ リオンＲＮＡと会合しており、侵入性のウイルスＲＮＡを転写するポリメラーゼ 活性を保有することが見出された。ＰＢ１およびＰＢ２蛋白質は、他のビリオン 蛋白質またはＲＮＡの不在下で発現した場合にはコンプレックスを形成し、恐ら く相補的ＲＮＡ合成に必要であろう。ＰＡおよびＮＰはビリオンＲＮＡ合成に必 要である。Ｂ型インフルエンザのＰＢ１遺伝子はＡ型インフルエンザのものと６ １％の相同性を示す。 インフルエンザウイルスは、急激な隆起性筋肉痛、頭痛および咳の開始を特徴 とする気道の急性発熱性感染を生じる。肺炎が最も頻度の高い合併症である；そ れは一次ウイルス性（肺実質への侵入による）、二次細菌性、または混合ウイル ス性および細菌性肺炎であろう。それは重症かつ進行性であるか、または軽症か つ分節性である。より低い頻度で起こる他の合併症には、ライ症候群、心筋炎、 心膜炎、筋炎、脳障害および横断脊髄炎が含まれる。インフルエンザの直接経費 は年間１０億ドルを越え、３０−５０億ドルに達するであろうと推定されている 。総経費はこれより２−３倍高いであろう。 インフルエンザには２タイプのワクチンが用いられる。“スプリット（ｓｐｌ ｉｔ）”ワクチンは発熱成分を減少させるために化学的に処理されており、１３ 歳未満の年齢の子供に投与される唯一のタイプである。“全”ワクチンは一般に 成人に投与される。Ａ型インフルエンザ抗原を予防接種したのちの正常な対象の ９０％以上に保護抗体力価が存在するが、Ｂ型抗原に対する反応はこれよりはる かに低い。さらに高齢の対象および腎不全または免疫抑制を伴う患者は、予防接 種によってすら感染の危険率がはるかに高い。株の一致が良好であった場合にの み７０−８０％のワクチン効果が見られる。一致が近接していない場合、および 患者が免疫無防備状態であるか、またはウイルスが容易に伝搬する院内状況にあ る場合、これより低い効果が見られる。 ２種類の薬物、アマンタジンおよびリマンタジンはＡ型インフルエンザ感染の 予防においてインフルエンザワクチンと同程度に有効である。残念ながらそれら はＢ型インフルエンザに対してはそれほど有効でない。後者はすべてのインフル エンザ病因の２０％に関係し、ある年には蔓延する唯一のウイルスである場合が ある。アマンタジンは米国で認可されている；リマンタジンは認可されていない 。両薬物とも、ウイルス粒子を開放するのに必要な酸性化過程を遮断することに より感染細胞におけるウイルスＲＮＡの脱外被に障害を与えると思われる。 アマンタジンおよびリマンタジンに対する耐性は、実験室内でインフルエンザ Ａ型ウイルスの株を低濃度の薬物中で継代培養することによって容易に生じ、そ れらの単離体は両薬物に対して交叉耐性である。インフルエンザウイルスの薬物 耐性株はそれらの野生型先祖と同様に効果的に細胞の感染を開始しうる。耐性に は、Ｍ２蛋白質をコードするＲＮＡ配列中における点突然変異が伴う。これはア ミノ酸３１において最も高い頻度で起こるが、位置２７および３４においても起 こる場合があり、これらは上記蛋白質のトランスメンブランドメインを包含する 。Ｍ２蛋白質はウイルス粒子の酸性化を促進するイオンチャンネルとして作用し 、アマンタジンおよびリマンタジンはこのウイルスエンベローブポアを遮断する と仮定されている。 インフルエンザウイルスに伴う多数の領域がリボザイム攻撃の適切な標的であ る。インフルエンザウイルスのこれらの領域を標的とするリボザイムは、その配 列が未知である関連ウイルスの均等な領域を標的とするために有用であろう。 ヒトおよびヒト以外のインフルエンザウイルスゲノムおよびｍＲＮＡの配列内 に高度のヌクレオチド配列相同性がある。特に有用な領域には、すべてのインフ ルエンザＡ型およびＢ型ウイルスｍＲＮＡのゲノムＲＮＡセグメントの５′側お よび３′側領域、ならびに３′末端の相補的領域、ならびに他のゲノムにおける それらと相同の位置における配列が含まれる。さらにパンハンドル（ＣＣＵＧＣ ＵＵＵＵＧＣＵ）に関与する３′側配列はすべてのインフルエンザエンベロープ 単離体間で高度に保存され、ＲＮＡの比較的到達可能な領域に２つの推定リボザ イム開裂部位を含む。ＲＮＡの５′末端のパンハンドル配列（ＡＧＵＡＧＡＡＡ ＣＡＡＧＧ）も、適切なリボザイム標的部位を含む。５′側パンハンドルの相補 的配列（ＣＣＵＵＧＵＵＵＣＵＡＣＵ）はすべでのｍＲＮＡの３′末瑞に存在し 、さらにこれらの分子の到達可能領域（すなわち塩基対合した末端領域）内に生 じる４つのリボザイム標的部位を含む。インフルエンザの８つのＲＮＡセグメン ト（７つはＣ型インフルエンザ株）の配列についての詳細な情報、およひコード される蛋白質の分子量は分かっていない。 好ましい開裂は、ウイルスの複製に必要な領域（たとえば蛋白質合成、たとえ ばＭ蛋白質を調節またはコードするＲＮＡセグメント７中の領域）、ならびにパ ンハンドル構造に関与するゲノムＲＮＡセグメントの５′側および３′側保存領 域、ならびに５′側パンハンドル構造に相補的なすべてのｍＲＮＡの３′末瑞の 領域、ならびに他のウイルスにおけるそれらの均等領域におけるものである。他 の領域もこれらのウイルスゲノムのリボザイム仲介による開裂の標的として用い ることができる。各標的は後記に従って、たとえばＲＮＡの二次構造、およびウ イルスの複製におけるそれらのＲＮＡの個々の役割を研究することにより選択し うる。標的がウイルスの複製に必須である蛋白質をコードする領域の読み取り枠 内に含まれる場合、これら他の標的はリボザイムによる開裂、およびその後のウ イルス複製の阻害のための好ましい候補である。インフルエンザＡ型ウイルスＰ Ｂ１、ＰＢ２およびＰＡ蛋白質、ならびに他のウイルスにおけるそれらの相同蛋 白質は、このような好ましい標的の例である。 インフルエンザウイルスのゲノムはそのＲＮＡ含有およびゲノム複製における エラーの性質のため、急速な遺伝的浮動を受ける。しかしウイルスの複製に必須 であるゲノムの領域（遺伝子）は、長期間にわたって定常配列を維持する（すな わち保存される）と予想される。これらの領域は異なるタイプまたは株のインフ ルエンザウイルス間で保存されやすく、従ってそれらのウイルスすべてを破壊す るために１種類のリボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は本発 明において好ましい標的部位である。このように１種類のリボザイムを用いてす べてのインフルエンザウイルスを標的とすることができる。本発明者らはこれら のウイルスのこのようなＲＮＡ領域を幾つか選び、それらのヌクレオチド配列を これらの領域を標的とするリボザイムにより開裂しうる保存領域の存在につき調 べた。詳細に分析した３頷域は、３′側および５′側パンハンドル領域、すべて のｍＲＮＡ中に存在する相補的３′側領域、ならびにＭ蛋白質をコードするｍＲ ＮＡである；他の遺伝子も下記のものと同様に分析することができる。 上記ウイルスのゲノム配列をそれらの潜在的標的領域において比較する。推定 リボザイム開裂部位は株間および種間のウイルス配列において高度に保存される ことが見出された。これらの部位はこれらの標的ＲＮＡ内のハンマーヘッド型ま たは他のリボザイム開裂にとって好ましい部位である。 これらの分析を利用して、コンピューター作成による配列比較に基づきウイル ス遺伝子内の有効標的部位についての予想が得られた。これらは図１４に示した 配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．）１−３２と同定される。実施例１０：ＨＳＶ ヒトヘルペスウイルスは世界的に重大な水準の罹患率および死亡率をもたらす 多様な疾病を引き起こす。ＨＳＶ群は米国内で毎年１００万の新たな感染症例に 関係する。これらの感染は患者の生涯にわたって潜伏性ウイルス感染として持続 し、多様な因子により刺激されて再活性化する可能性がある。ＨＳＶ感染の発現 は口唇庖疹の軽症感染からヘルペス脳炎などのより重症の感染にまで及ぶ。 ＨＳＶはその中心コア内に二本鎖ＤＮＡゲノムを含み、分子量約１億であり、 少なくとも７０種類のポリペプチドをコードするゲノムを含む。ＤＮＡコアは２ ５面体対称に配置されたキャプソメアから構成されるキャプシドにより囲まれて いる。このキャプシドに密着してテグメントがあり、これは非晶質物質から構成 されると考えられる。キャプシドおよびテグメントをゆるく囲んで、ポリアミン 、脂質およびウイルス糖蛋白質を含有する脂質二重層エンベロープがある。これ らの糖蛋白質はウイルスに特有の特性を付与し、かつ宿主が反応しうる特異な抗 原 を提供する。たとえばグリコプロテインＧ（ｇＧ）はＨＳＶに抗原特異性を付与 し、従ってＨＳＶ−１（ｇＧ−１）をＨＳＶ−２（ｇＧ−２）と区別するために 利用しうる抗体反応を生じる。 ＨＳＶの複製は多段階プロセスである。感染開始に続いてＤＮＡが脱外被し、 そして宿主の核へ輸送される。種々の調節蛋白質をコードする即時型遺伝子の転 写がこれに続く。次いで即時型遺伝子産物の発現に続いて、初期遺伝子により、 次いで後期遺伝子によりコードされる蛋白質が発現する。これには構造蛋白質お よびウイルス複製に必要な蛋白質が含まれる。核内でウイルスコアおよびキャプ シドの組み立てが行われる。これに続いて、核膜におけるエンベロープ形成（ｅ ｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）が行われ、そして核から小胞体およびゴルジ装置を通っ て輸送され、ここでウイルスエンベロープ蛋白質がグリコシル化される。成熟し たビリオンが宿主細胞の外膜へ輸送され、子孫ウイルスの放出に伴って細胞は死 滅する。すべてのヘルペスウイルスにつき複製は非効率的であると考えられ、非 感染性ウイルス粒子／感染性ウイルス粒子の比率は高い。 ＨＳＶ−１ゲノムの完全配列が知られている。マックジオク（McGeoch）ら，6 9 J.Gen.Virol.1531，1988；マックジオク（McGeoch）ら．14 Nucleic Acids Re search 1727，1986；ＨＳＶ−２ゲノム配列の解明は現在世界中の研究室で行わ れている。ＨＳＶの２タイプ、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、はＤＮＡ水準では ６０−８０％相同であるが、知っている限りでは遺伝子内変動はこれより少ない 。 アシクロビルを含めた抗ウイルス性薬物がＨＳＶ感染の治療に効果的に用いら れているが、成功率は限られている。たとえばアシクロビルを用いる長期治療は アシクロビル耐性株の発現を生じた。ヌクレオチド類似体、たとえばアシクログ アノシンおよびトリフルオロチミジンが粘膜および眼のＨＳＶ感染の治療に現在 用いられているが、これらの化合物は再発性または二次感染（これらはＨＩＶ免 疫抑制患者の数が増加するのに伴って、より支配的になっている）に対する効果 は、たとえあったとしてもほとんどない。さらにヌクレオチド類似体は水溶液中 での溶解性に乏しく、細胞内で急速に異化され、また著しく毒性である可能性が ある。 本発明のリボザイムは、感染細胞内でウイルスによりコードされるｍＲＮＡに 対してのみ高度の特異性を示す。高度に保存された配列領域を標的とずるリボザ イム分子は、多数の種またはサブタイプのＨＳＶを単一化合物で処置することが できる。毒性副作用を伴わない広域スペクトルを与える、受容しうる治療法はな い。ＨＳＶによる上皮細胞のトランスフォーメーション、潜伏性感染細胞におけ るエピソ−ムゲノムの保持、または許容細胞におけるウイルスの増殖期複製に関 係するウイルス遺伝子発現を特異的に攻撃する治療法はない。 本発明方法は上記の疾病を含めたＨＳＶ感染の処置に利用することができる。 この有用性は、ヒト以外の霊長類に感染し、それらの感染が獣医学的に重要であ る他のＨＳＶ様ウイルスにまで拡大することができる。 本発明のリボザイムは、特定のウイルスｍＲＮＡ標的を特異的に開裂すること ができ、これにより翻訳に必要なｍＲＮＡ転写体のインテグリティーを破壊し、 従ってコードされる蛋白質の合成を阻止する。より詳細には本発明のリボザイム は、ウイルスゲノムの複製、ビリオンの構造、およびウイルスの感染性、潜伏状 態の維持などに必要な蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳を標的とし、これらを 阻止し、従ってウイルスの生存に必要な重要な事象を妨害する。こうしてＨＳＶ により引き起こされる疾病を、リボナイム仲介によるウイルス生活環の妨害によ って効果的に処置することができる。 好ましい開裂部位は、ウイルスの複製、たとえば蛋白質合成に必要な遺伝子、 たとえば即時型遺伝子（ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ２７）、 核酸の代謝（ＵＬ１３、３９、４０、５０）、宿主の遮断（ＵＬ４１）、後期ウ イルス蛋白質合成の制御（γ３４．５）、ＤＮＡの複製（ＵＬ５、８、９、２９ 、３０、４２、５３）に必要な遺伝子、および構造蛋白質コード遺伝子（ｇＢお よびｇＣ）にある 他の領域もリボザイム仲介によるＨＳＶ複製阻害の適切な標的となる。極めて 好ましい標的にはＩＣＰ４（ＩＥ３）、ＩＣＰ２７（ＵＬ５４）、ＵＬ３９、Ｕ Ｌ４０、ＵＬ５、γ３４．５およびＵＬ２７（ｇＢ）遺伝子が含まれる。以下に ＩＣＰ４遺伝子を標的とするリボザイムの例を提示するが、他のこれらのリボザ イムがこれら他の遺伝子において有用性をもつと期待される。 特に好ましい態様においては、開裂されるＲＮＡは図１５に示す配列のうち１ または２以上から選ばれるＨＳＶ ＩＣＰ４またはＵＬ５ ｍＲＮＡ領域である （ＵＬ５についてはヌクレオチド＃１を本発明者らの研究室でキャッブ部位の予 備マッピングにより決定し、ヌクレオチド２８００がＵＬ４蛋白質に対する翻訳 開始部位であり、その読み取り枠もＵＬ５ ｍＲＮＡに含まれる）。 ＨＳＶの複製に必須であるゲノムの領域（遺伝子）は、長期間にわたって定常 配列を維持する（すなわち保存される）と予想される。これらの領域は異なるタ イプまたは株のＨＳＶ間で保存されやすく、従ってすべてのウイルスＲＮＡを破 壊するために１種類のリボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は 本発明において好ましい標的部位である。このように１種類のリボザイムを用い てすべてのＨＳＶコードＲＮＡを標的とすることができる。本発明者らはこれら のウイルスのこのようなＲＮＡ領域を幾つか選び、コードｍＲＮＡの構造をＲＮ Ａｆｏｌｄコンビューター分析により調べた。本発明者らはこれらの領域を標的 とするリボザイムにより開裂しうるＲＮＡ中の開放構造を同定した。詳細に分析 した２頷域は、ＨＳＶ−１ ＩＣＰ４およびＵＬ５ ｍＲＮＡである；他の遺伝 子も下記のものと同様に分析することができる。 多数の類似ＨＳＶ遺伝子と有意の遺伝子内ヌクレオチド相同性を示す他のヘル ペスウイルス、特に水痘帯状庖疹ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）をも阻害すべく、 ＨＳＶ特異性リボザイムを設計することもできる。たとえばＶＺＶ即時型蛋白質 ＩＥ６２はＨＳＶ即時型初期調節蛋白質ＩＣＰ４／ＩＥ３とかなりのアミノ酸相 同性を示し、ＶＺＶ粒子の主成分である（キンヒントン（Kinhinton）ら，66 J. Virol .359，1992）。同様にある転写単位およびそれらがコードする蛋白質が進 化上多様なヒトヘルペスウイルスのゲノム内に保存され、従ってこれらの遺伝子 単位内のリボザイム標的は、療法上の広範な用途をもつリボザイムを設計する基 礎を提供する。 ウイルスのｍＲＮＡ配列を上記に述べた領域全体にわたって分析する（ＨＳＶ −１ ＩＣＰ４遺伝子（ＥＭＢＬ Ｎｏ．ＨＥＨＳＶ１Ｇ３、ヌクレオチド１１ ７６−５４３５）およびＵＬ５遺伝子のヌクレオチド配列を使用）。推定リボザ イム開裂部位はウイルスｍＲＮＡの弱く塩基対合しているか、または塩基対合し ていない領域であることが見出された。これらの部位はこれらの標的ＲＮＡ内の ハンマーヘッド型または他のリボザイム開裂にとって好ましい部位である。 これらの分析を利用して、コンピューター作成による構造分析に基づきウイル スｍＲＮＡ内の有効標的部位についての予想が得られた（配列番号（ＳＥＱ．Ｉ Ｄ．ＮＯ．）１−１１５を参照されたい）。標的領域を、塩基番号として記載し たヌクレオチド番号（ＨＳＶ−１ ＩＣＰ４またはＵＬ５ ｍＲＮＡ中の）と共 に挙げる。 上記の各実施例においては、各遺伝子部位に対応する短いＲＮＡ基質を設計す る。各基質は、対応するリボザイム認識領域と塩基対合しない、５′および３′ 末端における２−３ヌクレオチドからなる。これらの非対合領域は１２−１４ヌ クレオチドの中央領域をフランキングし、リボザイム中の相補的アームがこれに 対して設計される。 各基質配列の構造は、標準的な市販のＰＣ ｆｏｌｄコンビュータープログラ ムを用いて推定される。結合の正の自由エネルギーを生じる配列は受容される。 負の自由エネルギーを生じる配列は、各末端から１または２個の塩基をトリミン グすることにより修飾される。修飾された配列がなお強固な二次構造をもつと予 想される場合は、それらを不合格とする。 基質を選択したのち、ＲＮＡ基質それぞれに対するリボザイムを設計する。リ ボザイムの折りたたみもＰＣ ｆｏｌｄにより分析する。 ハンマーヘッドモチーフのステムＩＩ（図１参照）領域を形成し、かつ分子内 塩基対合が避けられるフランキングアームを含むリボザイム分子を探索する。リ ボザイムはしばしば、リボザイム末端から塩基をトリミングすることにより、ま たはステムＩＩに迫加の塩基対を導入して目的とする折りたたみを達成すること により修飾される。不適性な折りたたみを伴うリボザイムは不合格とする。適性 な分子内構造を含む基質／リボザイム対が見出されたのち、それらの分子を共に 折りたたんで分子間相互作用を予想する。リボザイムとその同族標的配列への配 位（ｃｏｏｒｄｉｎａｌｅ）塩基対合の模式図を図１に示す。 リボザイム標的として有用であると考えられる標的を、リボヌクレアーゼＨア ッセイ法（後記参照）により核酸プローブへのアクセス可能性につき試験するこ とができる。このアッセイ法はリボザイムを合成する必要なしに、標的部位の有 用性につき迅速に試験することができる。それを利用して、リボザイム攻撃に最 適な部位をスクリーニングしうる。リボザイムの合成 本発明に有用なリボザイムは、セク（Cech）（前掲）が述べた遺伝子転写法に より、または化学的合成法により調製することができる。ＲＮＡの化学合成はＤ ＮＡ合成の場合と類似する。しかしＲＮＡ中の追加の２′−ＯＨ基は、３′−５ ′ヌクレオチド間結合の形成に、かつ塩基の存在下でのＲＮＡの分解されやすさ に対処するために、異なる保護基対策を必要とする。最近開発された、２′−ヒ ドロキシル基の保護のためにｔ−ブチルジメチルシリル基を用いるＲＮＡ合成法 が、リボザイムの合成のための最も信頼性のある方法である。この方法によれば 、適正な３′−５′ヌクレオチド間結合が平均結合収率９９％以上で再現性をも って得られ、ポリマーの２工程脱保護を必要とするにすぎない。 Ｈ−ホスホネート化学に基づく方法は、ホスホルアミダイト化学に基づく方法 より相対的に低い結合効率を示す。これはＤＮＡ合成についても問題である。自 動オリゴヌクレオチド合成の規模拡大のための有望な方法が、Ｈ−ホスホネート につき最近報告された。適明な結合時間と“欠陥（ｆａｉｌｕｒｅ）”配列の追 加キャッピングとの併用により、結合工程で２当量程度の少量のモノマーを用い て１４μｍｏｌｅの範囲の規模でのオリゴヌクレオチドの合成において、高い収 率が得られた。他の別法は、通常の固体支持体の代わりに可溶性高分子支持体（ たとえばポリエチレングリコール）を用いるものである。この方法によれば、結 合工程で約３当量のモノマーを用いて、バッチ当たり１００ｍｇ規模の量の短い オリゴヌクレオチドが得られる。 リボザイムの有用性を高めるために、リボザイム構造に対する種々の修飾を行 うことができる。このような修飾は保存寿命、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの半減期、安 定性、および標的部位へのこれらのリボザイムの導人の容易さを高め（たとえば 細胞膜貫通を高めるために）、また標的細胞を認識し、かつ結合する能力を付与 する。 リボザイムの外的供与は主鎖の化学的修飾によって、たとえばリボザイム分子 の全体的な負の電荷が減少して細胞膜を通る拡散が促進されることによって、有 利になる。オリゴヌクレオチドの電荷を減少させるための本発明の対策には下記 のものが含まれる：エチルホスホネートまたはメチルホスホネートによるヌクレ オチド間結合の修飾、ホスホルアミダイトの使用、正に帯電した分子へのオリゴ ヌクレオチドの結合、ならびにオリゴヌクレオチド、脂質および標的細胞に対す る特異的受容体またはエフェクターから構成されるコンプレックスパッケージの 形成。これらの修飾の例には、ＲＮＡ内のヌクレオチド間結合としてホスホロチ オエートおよびホスホロジチオエートを含むイオウ含有リボザイムが含まれる。 このようなイオウ修飾リボザイムの合成は、イオウ伝達試薬、3Ｈ−１，２−ベ ンゼンジチオール−３−オン１，１−ジオキシドを用いて達成される。リボザイ ムはリボース修飾されたリボヌクレオチドをも含有しうる。ピリミジン類似体は ウリジンから、出発物質としてジエチルアミノイオウトリフルオリド（ＤＡＳＴ ）を用いる方法で調製される。リボザイムは電荷を減少させるためにポリマーカ チオンに静電的に、または共有結合により付着してもよい。このポリマーは、３ ′末端をリボヌクレオチドジアルデヒドに変換するだけで、リボザイムに結合さ せることができる。ジアルデヒドは末端２′，３′−シスジオール系を過ヨウ素 酸開裂することにより得られる。供与系に対する個々の要件に応じた他の可能な 修飾には、カルボキシ、アミノまたはチオール官能基を含む異なるリンカーアー ムが含まれる。さらに他の例には、メチルホスホネートおよび２′−Ｏ−メチル リボース、ならびにｍ7ＧｐｐｐＧまたはｍ3 2，2，7ＧｐｐｐＧによる５′また は３′キャッピングまたはブロッキングが含まれる。 たとえばキナーゼ処理したリボザイムをグアノシントリホスフェートおよびグ アニルトランスフェラーゼと接触させてｍ3Ｇキャップをリボザイムに付加する 。この合成ののち、リボザイムを標準法によりゲル精製することがてきる。リボ ザイムが目的活性を有することを確認するために、５′キャップを含むものおよ び含まないものにつき標準法により試験して、その酵素的活性およびその安定性 の双方につきアッセイすることができる。 種々の修飾を有するものを含めた合成リボザイムは、高圧液体クロマトグラフ ィー（ＨＰＬＣ）により精製しうる。シリカおよびポリマー系支持体上での逆相 カラムおよびアニオン交換体を用いる他の液体クロマトグラフィーも採用しうる 。発現ベクター 本発明においては合成リボザイムが好ましいが、発現ベクターにより産生され たものも使用しうる。適切なリボサイム発現ベクターを設計する際には、下記の 因子を考慮することが重要である。最終リボザイムはリボザイム内の望ましくな い二次構造を最小限に抑えるためにできるだけ小さく維持しなければならない。 比較的強力なプロモーターであり、かつｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ の双方で発現可能であるブロモーター（たとえばヒトサイトメガロウイルス即時 型領域プロモーター、またはヒトケラチン遺伝子由来のケラチンプロモーター） を選ぶべきである。このようなプロモーターは、標的ＲＮＡを破壊するのに十分 なリボザイムの産生を行うのに適した水準であるが、他の細胞活性の阻害が起こ るほど高すぎない水準で（細胞の死滅自体を目的としない限り）、リボザイムを 発現すべきである。 リボザイムの５′末瑞のヘアピンは、リボザイムを５′−３′エキソヌクレア ーゼから保護するために有用である。リボザイムの３′末端の選ばれたヘアピン は、３′−５′エキソヌクレアーゼから保護する作用をするので、有用である。 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ終止シグナルは長さ約３０ヌクレオチドであり（図３ １Ｄ）、リボザイムをエキソヌクレアーゼ消化から安定化するための良好なヘア ピン構造として作用しうるが、これより短い長さの他の３′側ヘアピンもＲＮＡ 安定性を付与するために採用しうる。これらのヘアピンは、標準リボザイムを適 切な配向で配置し、かつこれらの配列が結合した状態で発現することができるベ クター配列内に挿入することができる。 ポリ（Ａ）テイルもリボザイムの３′末端を保護するために有用である。これ らはポリ（Ａ）シグナルを発現ベクターに含有させる（ｉｎ ｖｉｖｏでポリ（ Ａ）テイルを付加するように細胞に信号を発する）か、またはポリ（Ａ）配列を 直接に発現ベクターに導入することにより得られる。第１の方法においては、シ グナルはリボザイムの他の部分との望ましくない二次構造を形成するのを阻止す る位置になければならない。第２の方法においては、ポリ（Ａ）の大きさはｉｎ ｖｉｖｏで発現された場合に経時的にサイズが縮小する可能性があり、従って ベクターを経時的に検査する必要があろう。さらにリボザイムがそれらの標的配 列に作用するのを阻止するポリ（Ａ）結合性蛋白質を結合させるポリ（Ａ）テイ ルについては注意を払うべきである。高収率のリボザイム調製法 リボザイムを細菌または真核細胞において発現させるための、およびそれらの リボザイムを大量に調製するための方法を以下に記載する。一般に本方法はリボ ザイムを低価格で調製するための特定のリボザイム構造をコードするマルチコピ ーカセットの調製法である。複数のリボザイムをコードするベクターを調製し、 これらのリボザイムはそのベクターから産生されたＲＮＡ転写体から、他のリボ ザイムにより開裂する。この系は、修飾または非修飾リボザイムのｉｎ ｓｉｔ ｕまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ調製の規模を高めるのに有用である。これらのベクタ ー系を用いて特定の細胞内で目的リボザイムを発現させるか、またはそれらをｉ ｎ ｖｉｔｒｏ系で用いて大量の目的リボザイムを発現させることができる。こ れらのベクターは、転写体の単離前または単離後にｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎｖ ｉｔｒｏで開裂するＲＮＡ転写体の形のリボザイムを高収率で合成しうる。 この方法により調製されたリボザイムの安定性は、リボザイム末端に本明細書 に記載する配列を付与することによって高めることができる。 本方法は既存の化学的リボザイム合成法と比較して低価格の転写体を基礎とす るプロトコルの採用によって高い収率のリボザイム合成法を提供し、かつ化学的 に合成されたオリゴヌクレオチドを精製するために現在採用されている単離法を 採用しうるので、有利である。従って本方法によれば、リボザイムを分析用、診 断用または療法用に高収率で低価格において合成することができる。 本方法はリボザイムをｉｎ ｖｉｔｒｏでリボザイムの構造的研究、酵素的研 究、標的ＲＮＡアクセス可能性の研究、転写阻害の研究、およびヌクレアーゼ保 護の研究のために合成するのにも有用であり、本明細書にそれらの多くを記載す る。 本方法は、目的とする療法用リボザイムの細胞内濃度を高めるために、または 単位長さのリボザイムをその後ｉｎ ｖｉｔｒｏで単離するためのコンカテマー 転写体を産生させるために、リボザイムをｉｎ ｓｉｔｕで産生させるのにも利 用しうる。目的リボザイムを用いて分子遣伝学的分析または感染細胞系における 遺伝子発現を阻害し、また療法用分子の有効性を試験し、または罹患細胞を治療 することができる。 従って一般に上記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド（ｐｈａ ｇｍｉｄ）、ウイルス、ウイロイド、またはファージのベクター内に細菌、ウイ ルスまたは真核細胞のプロモーターを含む。他のベクターも同様に適しており、 これらには、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅法により形成された二本鎖もしく は部分二本鎖ＤＮＡ、またはウイルスもしくはウイロイドＲＮＡゲノム内への部 位特異的相同組換えにより形成された二本鎖、部分二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ が含まれる。これらのベクターは環状である必要はない。第１リボザイムーコー ド領域、およびリボザイム開裂配列をコードするヌクレオチド配列（これは療法 その他の目的とする第２リボザイムをコートする領域のいずれかの側に配置され る）は、転写されるようにプロモーター領域に結合している。ＤＮＡべクターま たはＲＮＡ発現系の必要なＤＮＡベクターにおけるこのベクターの作成を容易に するために、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位を付与することができる。目的 とする第２リボザイムは目的とするタイブのいずれかのリボザイム、たとえばハ ノマーヘッド、ヘアピンまたは他の触媒中心であってもよく、また前記のように グループＩおよびグループＩＩイントロンを含むことができる。第１リボザイム はコードされる開裂配列を開裂するように選ばれ、目的とするいずれかのリボザ イム、たとえば肝炎デルタウイルス配列、テトラヒメナ由来のリボザイムであっ てもよく、これはたとえば自己認識配列の中心にベクターの作成を補助するため に挿入された制限エンドヌクレアーゼ部位を含むことができる。このエンドヌク レアーゼ部位はべクターの作成、およびその後のベクターの分析に有用である。 このようなベクターのプロモーターが活性化されると、第１および第２リボザ イム配列を含むＲＮＡ転写体が産生される。第１リボザイム配列は適切な条件下 で開裂部位において開裂を起こし、第２リボザイム配列を放出する作用をもつ。 次いでこれらの第２リボザイム配列がそれらの標的ＲＮＡ部位に作用し、または その後の使用もしくは分析のために単離することができる。 従って上記ベクターは、第１核酸配列（分子内開裂活性を有する第１リボザイ ムをコードする）、および第２核酸配列（分子間開裂性の酵素的活性を有する第 ２リボザイムをコードする）を含み、後者は第１リボザイムにより開裂してベク ターによりコ−ドされるＲＮＡ転写体から第２リボザイムを放出させるＲＮＡを コードする核酸配列によりフランキングされている。所望により第１リボザイム は別個のベクター上にコードされ、分子間開裂活性を有するものであっでもよい 。 前記のように、第１リボザイムはいずれかの自己開裂性リボザイムであるよう に選ぶことができ、第２リボザイムはいずれかの目的リボザイムであるように選 ぶことができる。フランキング配列は第１リボザイムが認識する配列を含むよう に選ばれる。ベクターにこれらの核酸配列からＲＮＡを発現させると、そのＲＮ Ａは適明な条件下でそれぞれのフランキング領域を開裂させ、これにより第２リ ボナイムのコピーを１または２以上放出させることができる。所望により同一ベ クターにより数種類の異なる第２リボサイムを産生させるか、または異なるリボ ザイムを産生させるために数種類の異なるベクターを同一の入れ物（ｖｅｓｓｅ ｌ）もしくは細胞に装入することができる。 好ましくはベクターは第２リホザイムをコードする複数の核酸配列を含み、こ れらがそれぞれ第１リボザイムにより認識される核酸配列によりフランキンダさ れている。極めて好ましくは、この複数には少なくとも６−９の核酸配列が含ま れる。他の好ましい態様においては、ベクターはベクターからのリボザイム類を コードする核酸の発現を調節するプロモーターを含み；かつベクターはプラスミ ド、コスミド、ファージミド、ウイルス、ウイロイド、またはファージから選ば れる。より好ましくは複数の核酸配列は等しく、かつそれぞれがプロモーターに 最も近接した位置に等しい末端をもつように順次配置される。所望により、ベク ターにより産生されるＲＮＡの安定性を高めるために、第１または第２リボザイ ノをコードする配列に隣接しでポリ（Ａ）配列が付与されてもよく；またベクタ ーの作成に際して第２リボザイムをコードずる核酸の挿入を可能にするために、 第１リボザイムをコードする核酸に隣接して制限エンドヌクレアーゼ部位が付与 されてもよい。 リボザイム発現ベクターを作成する方法には、前記のように第１リボザイムを コードする核酸を含むベクターを調製し、かつ前記のように第２リボザイムをコ ードする一本鎖ＤＮＡを調製することが含まれる。次いでこの一本鎖ＤＮＡをア ニーリングさせて部分二重らせんＤＮＡを形成させ、これを適宜な酵素で、たと えばｄＮＴＰの存在下にＤＮＡポリメラーゼで処理することによりフィルインし て二重らせんＤＮＡを形成させ、次いでこれをベクターにリゲートさせる。次い でこの方法で得られた大型ベクターを、第２リボザイムをコードする高いコピー 数の一本鎖ＤＮＡがベクターに確実に取り込まれるように選択する。 リボザイムの調製法は、上記に従ってベクターを作成し、このベクターからＲ ＮＡを発現させ、そして第１リボザイムにより開裂さぜて第２リボザイムを放出 させることによる 詳細には、図１６を参照すると、ベクター１０はプロモーター１２を備えてお り、これは第１リボザイムをコードする下流の核酸領域１４の発現を調節し、こ れに続いてＲＮＡ開裂配列１６をコードするＤＮＡがあり、これは第１リボザイ ムにより認識され、かつそのリボザイムにより点線１８で示した位置において対 応するＲＮＡ中のそのリボザイムにより開裂しうる。このような配列１６がベク ター内に数箇所設けられ、それらがそれぞれ１８と表示した線において開裂しう る。線１８における開裂により、反復配列１６それぞれの間に付与されたＤＮＡ ２０によりコードされる第２リボザイムが放出される。 図１７を参照すると、好ましい態様においては反復領域２０は等しい両端をも ち、それらがそれぞれプロモーター１２に最も近い側に同一末端（図中にｂとし て示す）をもつ。こうして各単位は配列ａ／ｂもち、これに対応するＲＮＡを第 １リボザイムが認識し、線１８において開裂することができる。 図１８を参照すると、ベクターはプロモーター（ＰＲＯ）、続いて第１放出用 リボザイム（ＰＲ）、次いで制限エンドヌクレアーゼ部位（ＲＥ）をもつことが できる。所望によりこれらは、放出用リボザイムに安定性を付与するためにポリ （Ａ）配列（ＡＡＡ）を備えていてもよい。次いで反復構造体は第２療法用リボ ザイム（ＴＲ）を囲むフランキング領域（１および２）を備えている。 目的とする第２リボザイムの実際の配列は、それが認識し、かつ開裂する標的 に依存する。これは選ばれた開裂部位１８、および選ばれた制限エンドヌクレア ーゼ部位（ＲＥ）の受容しうる配列に何らかの影響をもつであろう。すべての場 合、ベクター１０によりコードされるＲＮＡ転写体の領域間のいずれかの二次的 相互作用を最小限に抑えることが追求され、他の中間配列はＲＮＡの必要な折り たたみを可能にする臨界距離に間隔を置いて有効成分を配置することが要求され るであろう。他の方法は、本発明のベクターの転写体を適切に開裂させうるリボ ザイム活性を備えた他のＲＮＡを合成するために、第２転写部位をこのベクター 内に、または他のベクター内に設けることが含まれる。 ＲＮＡを開裂させて目的とする療法用リポザイムを実際に遊離させるのは、ベ クターを増殖させる細菌もしくは真核細胞内で行うことができ、または転写体Ｒ ＮΛを分離したのち必要な塩類および／または要求される他の補肋因子を添加す ることにより達成しうる。単位長さの療法用リボザイムをＲＮＡ混合物から単離 するのは、配列特異性アフィニティークロマトグラフィーにより達成しうるか、 またはリボザイムの電荷もしくは他の成分を他の適切な単離法において利用しう る。実施例１１ ： 本発明のベクターにおいて配列の好ましい配置は、開裂用リボザイムをコード する領域をベクターの５′側に、かつ療法用の第２リボザイムをコードする領域 をベクターの３′側に含むことである（図１６−１８に示すように）。第２リボ ザイムをコードする各配列は、開裂部位をコードするフランキング配列により囲 まれる。いかなる数のこのようなフランキング配列を付加してもよい。他のフラ ンキング構造、たとえば図１８に示すポリ（Ａ）配列を用いることもでき、また 有用な制限エンドヌクレアーゼ部位、たとえばＡＵに富む制限エンドヌクレアー ゼ部位を設けることにより柔軟性を高めることができる。これは細胞内の生理的 温度で、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出液中で大きな二次構造をとることのない、 クローニングに好都合な領域を与えるであろう。療法用リボザイムをフランキン グする領域における大きなＲＮＡ構造を最小限に抑えることは、リボザイムの触 媒活性を最適なものにするために必須である。たとえば選ばれた制限エンドヌク レアーゼ部位によりフランキングされた、目的とする第２リボザイムコード配列 を得ることができる。次いでこのような配列をコードするＤＮＡを他のこのよう な配列に容易にリゲートさせて、ＤＮＡ構造体中に望まれる複数の反復配列を得 ることができる。このような方法において、２つの異なる制限エンドヌクレアー ゼ部位をもつフランキング挿入配列はベクターの作成をより容易にする。 たとえば目的リボザイム（ＶＡＨＲ３６）に対する放出用リボザイムをコード するＨｉｎｄＩＩＩ／ ＳａｌＩフラグメントを、プラスミドｐＴＺ１９Ｕ内ヘ クローニングする（均等なベクターが当技術分野で知られている）。これらのフ ラグメントの配列は下記のとおりである： これらは制限エンドヌクレアーゼ処理し、かつべクターに挿入したのち、下記の 配列を有するクローンフラグメントを与えるであろう： このセグメントはＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に囲ま れた第１リボザイムをコードする。この放出用リボザイムは下記の配列をもつコ ンカタマー中のフラグメント配列を開裂させるであろう： 目的とする第２リボザイム、ＶＡＨＲ３６、は下記の配列をもつ： これは２つのフランキング配列ＧＣＧＵＣＵおよびＡＣＧＧＵＣＵをもつ。この 配列をコードするＤＮＡ挿入配列を作成するために用いられる、下記の配列を有 する２つのプライマーが合成される： これら２つのプライマーを図１８に示すようにコンカテマー形成に用いることが できる。これらのプライマーのハイブリダイゼーション、二本鎖挿入配列を作成 するための第２ＤＮＡ鎖の合成、および適切なベクター中へのこれらのフラグメ ントの挿入は、当業者に既知の方法により行うことができる。所望により、ｐＴ Ｚ１９Ｕその他の適切なベクターのＳａｌＩ部位へのクローニングを可能にする ために配列ＧＧＧＧＴＣＧをＴＲＳプライマーの５′末瑞に付加し、ＢａｍＨＩ 部位へのクローニングを可能にずるために配列ＧＧＧＧＴＡＣＣをＴＲＣプライ マーの５′末端に付加することができる。これらのプライマーを前記のように結 合させて、目的とするリボザイムベクターを合成しうる。ＲＮＡベクターについ ても同様な構造体が、発現ベクターを作成するためのこれらの方法を利用して得 られ、これらを用いてウイルス、ウイロイドまたはファージベクター中へのリボ ザイム配列の相同組換えに適したＲＮＡまたはＤＮＡ分子を合成することができ る。 作成されたベクターを真核細胞に供与したい場合、真核細胞内の細胞スプライ シング装置を取り込ませて、発現した転写体のフランキング配列内のリボザイム セグメントに対する認識配列をコードすることによりマルチマー状の療法用第２ リボザイムを開裂放出させることができる。代謝回転速度が療法用第２リボザイ ムの分解速度より遅い場合、目的とする療法用第２リボザイムの放出を高めるた めに、放出用第１リボザイムの多数のコピーを付与してもよい。たとえばこれら のベクターについては、適明な細胞コンパートメントへの輸送を高めるために細 胞質シグナルまたはポリ（Ａ）テイルを付与することができる。細菌細胞の場合 、適明な配列をベクター内に付与することによりｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾および特 定の細胞修飾を高めることができ、これらはリボザイムの代謝回転速度、開裂活 性およびヌクレアーゼ安定性を高めるために有用である。実施例１２ ： 図１９を参照すると、本発明のベクターを作成するための好ましい方法は、放 出用第１リボザイム（ＲＲ）に結合したプロモーター配列に、適宜な制限エンド ヌクレアーゼ部位（ＲＥ）を付与することである。次いで２つのフランキング領 域および療法用第２リボナイムをコードする一本鎖オリゴヌクレオヂドを付与す る。たとえば実施例１で設計したオリゴヌクレオチドに、フランキング領域での ハイブリダイゼーションにより部分二重らせんを形成させる。次いでＤＮＡポリ メラーゼオリゴヌクレオチドｄＮＴＰｓにより一本鎖領域をフィルインして、二 本鎖ＤＮＡを形成させ、次いでこれを制限エンドヌクレアーゼ部分にリゲートし て、目的とするベクターを作成することができる。 療法用リボザイムを単離するための好ましい方法は、クロマトグラフィー法に よるものである。本明細書に記載するＨＰＬＣ精製法および逆相ＨＰＬＣ精製法 を採用しうる。あるいは相補的オリゴヌクレオチドをセルロースまたは他のクロ マトグラフィーカラムに付着させると、たとえばフランキングアームと酵素的Ｒ ＮＡの間の領域へのハイブリダイゼーションにより療法用第２リボザイムを単離 することができる。このハイブリダイゼーションは、目的とする酵素的ＲＮＡを 含まない短いフランキング配列、および放出用第１リボザイムに対して選択する であろう。ハイブリダイゼーションはヌクレアーゼ分解を防止するためにカオト ロピック剤の存在下で実施することができる。マトリックス上のオリゴヌクレオ チドを、ヌクレアーゼ活性を低下させるために、たとえば２′−Ｏ−メチルＲＮ Ａオリゴヌクレオチドを得ることにより修飾しうる。カラムマトリックスに付着 したオリゴヌクレオチドのこのような修飾により、オリゴヌクレオチド分解が最 少の状態でカラムを多数回使用しうる。このような修飾が多数知られているが、 化学的に安定な非還元性修飾が好ましい。たとえばホスホロチオエート修飾も採 用しうる。 発現したリボザイムＲＮＡを細菌細胞または真核細胞からルーティン法、たと えば細胞溶解に続くグアニジンイソチオシアネート単離により単離することがで きる。実施例１３ ： テトラヒメナの現在知られている自己開裂部位を、本発明の他のベクター内に 用いることができる。所望により全長テトラヒメナ配列を用いるか、またはより 短い配列を用いることができる。５′開裂末端の自己開裂部位内の余分な配列を 少なくするために、テトラヒメナリボザイム中に普通存在するヘアピンは療法用 第２リボザイム３′側配列およびその相補体を含むことが好ましい。すなわち第 １放出用リボザイムをコードするＤＮＡが、目的とする第２リボザイムをコード するＤＮＡにより分離された２部分に付与される。たとえば療法用第２リボザイ ム認識配列がＣＧＧＡＣＧＡ／ＣＧＡＧＧＡである場合、ＣＧＡＧＧＡが自己開 裂部位内ループ内に付与され、従ってそれはテトラヒメナリボザイムにより認識 されるステム構造内にある。ステムのループは制限エンドヌクレアーゼ部位を含 むことができ、この中に目的とする第２リボザイムをコードするＤＮＡを装入す る。 所望により上記ベクターをレヒナー、“核酸の翻訳の調節”、国際特許出願公 開ＷＯ ９２／１３０７０号明細書に記載の系を用いて療法プロトコルに利用し 、療法用第２リボザイムの適時発現、および細胞または遺伝子の機能の適宜な遮 断を行うことができる。従ってベクターは、望ましくない生物または状態の存在 を示すＲＮＡまたは他の分子の存在下でのみ酵素的活性ＲＮＡを発現するプロモ ーターを含むであろう。次いでこの酵素的活性ＲＮＡは、上記レヒナーが述べる ようにそれが存在する細胞を死滅させ、もしくは障害を与えるか、または目的蛋 白質産物の発現を低下させる作用をするであろう。 本発明には多数の適切なＲＮＡベクターも使用しうる。これらのベクターには 、植物ウイロイド、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡゲノムを含む植物ウイルス、な らびにＲＮＡゲノムを含む動物ウイルス、たとえばピコルナウイルス、ミクソウ イルス、パラミクソウイルス、肝炎Ａ型ウイルス、レオウイルスおよびレトロウ イルスが含まれる。これらの多くの場合、これらのウイルスベクターの使用によ りリボザイムの組織特異性供与も得られる。コンカテマーリボザイム構造体のクローニング 以下は、転写単位内での多数の療法用リボザイム（ＴＲ）のクローニングを示 す具体例の１つである。転写体からのＴＲの放出には、新生転写体中のＴＲ単位 間を開裂させうる付加的な放出用リボザイム（ＲＲ）のクローニングが必要であ る。 コンカテマーリボザイムベクター構造体を試験するために、本発明者らはＨＳ Ｖ−１ ＩＣＰ４ ｍＲＮＡを標的とするリボザイムを選んだ。このリボザイム （ＲＰＩ １１９７、ＶＡＨＲ３６と同じ）を選んだのは、それが短鎖および長 鎖双方のＲＮＡ基質（それぞれＫcat／Ｋm＝４×１０7および３×１０4ｍｏｌ-1 ／ｍｉｎ-1）を用いて酵素的に広範に解明されており、組織培養研究において単 純ヘルペスウイルスの複製を阻害するために使用されているからである。これら のデータは本発明者らに重要な触媒価および療法価を提供し、これとコンカテマ ーべクターにつき観察されたリボザイム活性を比較することができる。 ＴＲを選択したのち、そのＴＲのテイル−ヘッド−コンカタマーを開裂しうる ＲＲを設計しなければならない。図４８に示すように、ＲＰＩ １１９７の配列 はＲＲの設計を極めて容易にした。それはコンカテマー間に１ヌクレオチド（Ａ ）を装入すると良好なリボザイム標的部位が得られるからである。本発明者らは 、ハンマーヘッドリボザイムのアームを１または２ヌクレオチドだけ延長しても 触媒活性は有意には低下しない（通常は＜３０％）ことを見出した。これにより 、ＴＲモノマーの設計に際してＲＲ開裂部位の配列を最適なものにする余分なヌ クレオチドを収容するために、若干の柔軟性が得られる。遺伝子中に存在するヌ クレオチドを用いて配列を操作し得ない場合、ＴＲの３′末端にＵＭ配列を装入 することが好ましい。ここでＭ＝Ｃ、ＵまたはＡである。この配列の修飾により 、ＴＲが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合は非対合塩基のＵＭトリヌクレオ チドが得られるであろう。ハンマーへッドリボザイムの３′末端における非対合 ヌクレオチドは、通常はそれらがリボザイムを酵素−基質コンプレックスより安 定な変異構造体となす場合にのみ、触媒活性が低下する。このように好ましくな い横造体を検出するための予備検査は、コンピューターに基づくＲＮＡ折りたた み アルゴリズムにより実施しうる。 迫加配列、たとえば細胞質局在化シグナルまたはポリアデニル化シグナルがＴ Ｒ中に望まれる場合、これらの配列はＲＲを設計する際に考慮すべきである。こ れらの構造体をＴＲのいずれかの末端に取り込ませるためには、本発明者らのク ローニングプロトコルを採用しうるが、本発明者らは多数の付加的な配列が適正 なＴＲ折りたたみを妨害することを見出した。この所見の例外は、強力な内部塩 基対合、たとえばヘアピンループまたはｔＲＮＡモチーフを含む配列である。 ＲＲモチーフの配列を決定したのち、そのＲＲがテイル−ヘッド−コンカテマ ーを開裂しうるＴＲジャンクションを開裂するかどうかを判定することが好まし いが、必要ではない。これは前記のように基質およびリボザイムＲＮＡを合成し 、次いで１０ｍＭ Ｍｇ+2の存在下で開裂反応を実施することにより達成しうる 。ＲＲの触媒活性を証明したのち、このＲＲモチーフをファージプロモーターの ３′側に多数のクローニング部位を含む適宜なべクター内へクローニングする。 このクローニング工程のために、本発明者らはＰＴＺ１９Ｒ（ＵＳＢ）の使用を 選んだ。方向性クローニングブロトコルを用いることにより、必要なスクリーニ ングは単離されたプラスミドＤＮＡの制限消化からなる。方向性プロトコルを用 いない場合、ステムＩまたはステムＩＩＩ頷域（図４８参照）が簡便な診断用制 限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む稀な場合を除いて、小型のＲＲ装入配列は 、適正なクローンを選ぶためにブラスミドＤＮＡの配列決定を必要とするであろ う。 ＰＴＺ１９Ｒ中へのＲＲフラグメントのクローニングには２つのオリゴヌクレ オチドを用いた： これらはそれぞれ５′および３′末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ制限エン ドヌクレアーゼ部位（肉太活字体）によりフランキングされたＲＲコード配列を 形成するであろう。各オリゴヌクレオチドの試料４μｇを、４μｌの１０×シー クエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）緩衝液、４μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰＮ、 ４μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、および１．５μｌのシークエナーゼボリメラーゼ（ ２０Ｕ，ＵＳＢ）を合計容量４０μｌ中に含有する反応混合物に添加した。混合 物を３７℃で１時間インキュベートしたのち、５μｌアリコートを取り出し、５ μｌの装填用緩衝液に添加し、次いで１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳 動処理した。ステインズオール（Ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ）（ＵＳＢ）で染色する ことによりバンドを視覚化した。残りの試料を−２０℃で凍結した。適切なフラ グメントが形成されたことを証明したのち、５μｌの凍結混合物を、それぞれ１ ０ＵのＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ、１．３×制限エ ンドヌクレアーゼ緩衝液、ならびに１０Ｕのエビ（ｓｈｒｉｍｐ）アルカリホス ファターゼ（ＵＳＢ）を含有する混合物１５μｌに添加し、最終混合物を３７℃ で１時間インキュベートしたのち、フェノール／クロロホルム／イソアミルアル コール抽出を行い、そしてＤＮＡをエタノールで沈殿させた。このぺレットを水 に溶解し、この挿人ＤＮＡフラグメント３０ｎｇを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａ ｌＩ酵素で消化されたのち低融点アガロース中で単離されたＰＴＺ１９Ｒ ＤＮ Ａフラグメント３００ｎｇに添加した。このプラスミド（ＰＴＺ１９Ｒ）：挿入 配列の濃度はそれぞれ適明なモル比１：１０を与えた。これらのＤＮＡ試料をリ ゲーション緩衝液に添加し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＵＳＢ）により室温で２時 間、次いで４℃で１８時間リゲーションした。リゲーション混合物の半量（８μ ｌ）を１００μｌのコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＤＨ５α−大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）細胞（ジブコ／ＢＲＬ）中へトランスフェクトし、アンピシリンを 含有するＬＢ寒天平板に乗せた。これらの平板から６クローンを採取し、プラス ミドＤＮＡの抽出および制限エンドヌクレアーゼ消化のために１０ｍｌのオーバ ーナイト調製物中で増殖させた。ＲＲ ＤＮＡの挿入を、ＨｉｎｄＩＩＩまたは ＳａｌＩ酵素で消化した場合はプラスミドＤＮＡサイズの増大により、またＰＴ Ｚ１９Ｒべクター中においてＲＲコードＤＮＡで置換されたＰｓｔＩ部位の消失 により証明した。新規なＲＲ含有プラスミドで形質転換した細菌調製物２５０ｍ ｌを増殖させ、単離されたプラスミドＤＮＡをＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限酵 素で消 化したのち、その後のコンカテマーＴＲ挿入体のクローニングのためのべクター として用いた。 ＴＲコンカテマークローニングに用いるために４種類のオリゴヌクレオチドを 合成した。これらのオリゴヌクレオチドは下記のものであった： ここでＴＲＳＳおよびＴＲＣＢにおいて太字活字体の配列はそれぞれＳａｌＩお よびＢａｍＨｌに対する制限エンドヌクレアーゼ認識配列である。それぞれ５： １：０．１：０．１のモル比のＴＲＳ（５μｇ）：ＴＲＣ：ＴＲＳＳ：ＴＲＣＢ オリゴヌクレオチドを、１５Ｕのシークエナーゼポリメラーゼおよび１×シーク エナーゼ緩衝液を合計容量１５μｌ中に含有する混合物に添加し、３７℃で２時 間インキュベートした。フィルイン反応を最適状態にするために、最初の４時間 のインキュベーションののち、さらに１０Ｕのシークエナーゼポリメラーゼを添 加した。混合物を１５０μｌに希釈し、Ｇ−５０セファデックスカラムによるス ビンクロマトグラフィーによって脱塩し、スピード−バク（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ ）中での凍結乾燥により約１５μｌの容量に再濃縮した。９μｌのＤＮＡ混合物 を、１μｌ）１０×リガーゼ緩衝液および２ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有す る他の試験管に移し、３７℃で２時間インキュベートして、ギャップ付きＤＮＡ 片をリゲートした。２μｌの１０×ＳａｌＩ消化用緩衝液、それぞれ１μｌ（５ Ｕ）のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ酵素、ならひに４μｌの水を添加し、混合物を ３７℃で３時間インキュベートした。制限消化後に混合物を０．８％アガロース ゲル中で電気泳動さ仕た。電気泳動はブロムフェノールブルーマーカーがゲル内 へ１．５インチ（３．８１ｃｍ）進入するまで実施された。これにより開裂した 末瑞フラグメントがコンカテマーＤＮＡから分離された。電気泳動後にＤＮＡを 含有するゲルの列をブロムフェノールブルー色素バンドのすぐ上の領域からゲル 装填領 域の約１ｍｍ下の領域まで切り取った。ＤＮＡをこの列から電気溶出させ、エタ ノールで沈殿させることにより濃縮した。このプロトコルにより多様なコンカテ マーのサイズが得られ、これを所望によりアガロースゲルからサイズ選別するこ とができる。あるいはコンカテマーをＲＲべクターＤＮＡ中へクローニングした のちに挿入配列のサイズを選別することもできる。 溶出したコンカテマーＤＮＡを、予めＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消 化したＲＲべクターのゲル精製フラグメントと混合することにより、コンカテマ ーＤＮＡを上記ＲＲ含有べクター中へクローニングした。本発明者らの実験に用 いたべクターＤＮＡ：挿入ＤＮＡのモル比（最初のＴＲ濃度から計算したもの） は１：１００であった。これにより、コンカテマーのサイズか平均２．３ｋｂで ある場合には約１：２の比率となる。本発明者らはこの比率がコンカテマーの多 重挿入配列を与えることを見出し、この比率を少なくとも３：１の比率のべクタ ー：挿入配列を含有すべく高めることを推奨する。本発明者らはこのプロトコル を用いて、制限分析およひＢａｍＨＩ直線化ＤＮＡフラグメントの転写により判 定して１２００−１５００ヌクレオチドの長さのコンカテマーフラグメントをク ローニングした コンカテマーカセットを発現させたのち、32Ｐ標識したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写 リボザイムを前記に従って１０ｍＭ Ｍｇ+2の存在下でインキュベートすること により、ＲＲによるＴＲコンカテマーの“自己”開裂を検査することができる。 適宜な期間後にアリコートをゲル電気泳動により分析すべきである。消化反応の 成功は、経時的に全長転写体が消失し、モノマーまたはマルチマー長さのリボザ イムが蓄積することにより例示される。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＲ活性を証明した のち、カセットをプラスミドベクターから切り取り、リボザイム転写および安定 性の細胞内分析のために真核細胞性発現べクター中へ挿入し、そしてＲＲおよび ＴＲの開裂活性を評価することができる。 本発明者らは、ＴＲＣおよびＴＲＣＢオリゴヌクレノオチドのサイズを限定す るのが好ましいことを見出した。アニーリングアームが長いほどコンカテマー形 成の程度が低下するからである。このクローニングブロトコルはいずれかのリボ ザ イムモチーフにつき使用するために変更してもよいが、細胞内へ効果的に導入し うるコードＤＮＡのサイズに対する限定のため、長い挿入配列を使用するほどい ずれかの転写体によりコードされるリボザイムの数が限定される。カセット中に 多数のリボザイムを使用したい場合、ＴＲコンカテマー（またはモノマー）およ び対応するＲＲを含む別個のミニカセットを、発現べクター中へ取り込ませるた めに調製すべきである。個々のカセットをフランキングする異なる５′側および ３′側制限エンドヌクレアーゼ部位を用いると、べクター中へのクローニングが 容易になる。細胞内でのリボザイム放出効率は細胞内塩類濃度に依存すると思わ れるので、ＴＲに用いるものと同じリボザイムモチーフをＲＲに用いることが好 ましい。これにより、両リボザイムは同一細胞タイプにおいて有効になるであろ う。与えられた標的細胞タイプにつき最良の開裂モチーフを同定するために、細 胞抽出液中でのリボザイム活性の予備アッセイが推奨される。他のべクター 適明なリボザイム発現べクターを設計する際には、下記の因子を考慮すること が重要である。 リボザイム内での望ましくない二次横造を最小限に抑えるために、かつ比較的 長鎖のＲＮＡに結合する可能性のある蛋白質因子の結合を阻止するために、最終 リボザイムはできるだけ小さく保持しなければならない。プロモーター（たとえ ばＣＭＶ即時型プロモーター）は、それにＲＮＡポリメラーゼが高い結合定数（ ＫB＞１０8Ｍ-1で結合し、かつ速やかに転写のための活性モードに入る（速度＞ １０-2ｓｅｃ-1）比較的強力なプロモーターとなるように選ぶべきである。この ようなプロモーターは、標的ＲＮＡを破壊するのに十分な量のリボザイムを産生 させるのに適した水準で、ただし他の細胞活性の阻害が起こるほど高い水準では なく（細胞の死滅自体を目的としない限り）、リボザイムを発現すべきである。 リボザイムの５′末端のヘアピン（すなわちそれ自体で塩基対合したＲＮＡ分 子）は、５′−３′エンドヌクレアーゼからリボザイムを保護するために有用で ある。リボザイムの３′末端の特定のヘアピンは、５′−３′エンドヌクレアー ゼによる消化から保護するために有用である。このようなへアピンは標準的なリ ボザイムを適宜な配向で配置しうるベクター配列内に挿入することができ、かつ このような配列が結合した状態で発現させることができる。 リボザイムの３′末端を保護するためにはポリ（Ａ）テイルも有用である。こ れは発現ベクター内にポリ（Ａ）シグナル部位を包含させることにより（細胞に ｉｎ ｖｉｖｏでポリ（Ａ）テイルを付加する信号を送る）、またはポリ（Ａ） コード配列を直接に発現べクターに導入することにより実施しうる。第１の方法 においては、シグナルはリボザイムの他の部分との望ましくない二次構造形成を 阻止するように配置されなければならない。ポリアデニル化のためには、特異的 な真核細胞エンドヌクレアーゼにより開裂するために、配列ＡＡＵＡＡが転写体 の３′末端またはその付近に適正な状態で存在しなければならない。次いでポリ （Ａ）ポリメラーゼが転写体の３′末端にＡ残基（約２５０）を付加する。第２ の方法においてはｉｎ ｖｉｖｏで発現した場合にポリ（Ａ）の大きさが経時的 に縮小する可能性があり、従ってベクターを経時的に検査する必要があろう。さ らに、リボザイムが作用するのを阻止するか、またはリボザイムを核から輸送す るポリ（Ａ）結合性蛋白質を結合さぜるポリ（Ａ）テイルに注意しなげればなら ない。このような特定の輸送はある種のリボザイム用途にとっては有利かも知れ ない。 ５′および３′保護基の適正な組み合わせは、本発明の発現ベクターを実際に 作成しなくでも判定することができる。このようなベクターを作成するのは時間 がかかるので、これは有利である。たとえばヘアピンは、化学的ＲＮＡ合成法に より、またはミリガン（Milligan）ら，15 Nucleic Acids Research 8783,1988 に記載の系を用いる転写により、リボザイムに付加することができる。ポリ（Ａ ）テイルは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼまたはボリヌクレオチドポスホリラーゼを 用いて直接にリボザイムに付加することができる。精製リボザイムの調製 以下は、純粋な酵素的活性リボザイム（２８−７０ヌクレオチド塩基の大きさ のもの）をナトリウム塩、カリウム塩またはマグネシウム塩の形で、２工程精製 法により調製する方法である。一般にこの方法は合成および酵素により調製され るリボザイムの双方に適用することができ、逆相カラム上での高性能液体クロマ トグラフィー（ＨＰＬＣ）法の使用を伴う。ゲル精製法とは異なり、本明細書に 記載するＨＰＬＣ精製法は実質的に制限のない量の精製材料に適用しうる。これ により各精製バッチでキログラム量のリボザイムが得られる。 従って本方法は、２８−７０ヌクレオチド塩基の酵素的ＲＮＡ分子を高圧液体 クロマトグラフィーカラムに導通することにより、酵素的ＲＮＡ分子を精製する 方法である。本発明者らは意外にも、酵素的活性リボザイムを目的塩の形で、上 記ＨＰＬＣ本により精製しうることを見出した。 好ましくは本方法は、酵素的活性ＲＮＡ分子を逆相ＨＰＬＣカラムに導通し； この酵素的活性ＲＮＡ分子は酵素的方法によってではなく化学的合成法により調 製されたものであり；酵素的ＲＮＡ分子を部分的にブロックし、そしてこの部分 的にブロックされた酵素的活性ＲＮＡ分子を逆相ＨＰＬＣカラムに導通して、そ れを他のＲＮＡ分子から分離することを含む。 より好ましくは、酵素的活性ＲＮＡ分子を逆相ＨＰＬＣカラムに導通したのち 脱ブロックし、そして第２の逆相ＨＰＬＣカラム（上記の逆相ＨＰＬＣカラムと 同一であってもよい）に導通して、酵素的活性ＲＮＡ分子を他の成分から分離す る。さらにカラムは少なくとも１２５Åの多孔度、および少なくとも２μｍ、好 ましくは５μｍの粒径を有するシリカまたは有機ポリマー系Ｃ４またはＣ８カラ ムである。 Ｎａ+．Ｋ+またはＭｇ2+塩の形の純粋なリボザイムが得られる。“純粋な”と は、リボザイムが好ましくは他の汚染物質を含有せず、かつ少なくとも８５％が 目的塩の形であることを意味する。 本方法は一般にリボザイムのＨＰＬＣ精製法である。この精製法の例を以下に 示す。その際、固相で調製された合成リボザイムがブロックされる。次いでこの 材料をメタノール性アンモニアで処理することにより固相から放出させ、次いで フッ化テトラブチルアンモニウムで処理し、逆相ＨＰＬＣにより精製して、部分 的にブロックされたリボザイムを“不合格”配列から分離する（図２３）。これ らの“不合格”配列は、目的とする酵素的ＲＮＡ分子のものよりランダムに１ま たは２以上の目的塩基だけ短いヌクレオチド塩基配列を有し、遊離の末端５′ヒ ドロキシル基を保有するＲＮＡ分子である。適正な配列を有するリボザイムにお けるこの末端５′−ヒドロキシルは、なお親油性ジメトキシトリチル基でブロッ クされている。このように部分的にブロックされた酵素的ＲＮＡを精製したのち 、これを標準法により脱ブロックし、そして同一または類似のＨＰＬＣ逆相カラ ムに導通して、他の汚染成分、たとえば脱ブロッキングおよび合成の過程で生成 した他のＲＮＡ分子もしくはヌクレオチドまたは他の分子を除去する（図２４） 。得られた分子は、高度に精製された形の天然酵素的活性をもつリボザイムであ る。 以下にこの方法の一例を示す。この例はグラム量、さらにはキログラム量のリ ボザイムの調製および精製が可能になる程度にまで、容易にスケールアップする ことができる。実施例１４ ： この例においては、リボザイムの合成に固相ホスホルアミダイト化学を採用し た。使用したモノマーは、ウリジンの２′−ｔ−ブチル−ジメチルシリルシアノ エチル−ホスホルアミダイト、Ｎ−ベンゾイル−シトシン、Ｎ−フェノキシアセ チル−アデノシン、およびグアノシン（グレン・リサーチ、バージニア州スター リング）であった。 固相合成はＡＢＩ３９４または３８０Ｂ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により、各 機械に伴う標準プロトコルを用いて実施された。唯一の例外は、結合工程を１０ 分から１２分に延長したことである。ホスホルアミダイト濃度は０．１Ｍであっ た。合成は１ｍｍｏｌの規模で、１ｍｍｏｌのＲＮＡ反応カラム（グレン・リサ ーチ）を用いて実施された。平均結合効率は、放出されたトリチルカチオンの熱 量測定法により測定して３９４モデルについては９７−９８％、３８０Ｂモデル については９７−９９％であった。 合成後に、ブロックされたリボザイムをＣＰＧ支持体から離脱させ、無菌バイ アル内で乾燥エタノール性アンモニア（２ｍＬ）中において５５℃で１６時間の インキュベーションにより、塩基およびジホスホエステル部分を脱保護した。反 応混合物をドライアイス上で冷却した。次いでこの冷却された液体を無菌のスク リューキャップ付きバイアルに移し、凍結乾燥した。 リボザイムから２′−ｔ−ブチル−ジメチルシリル基を除去するために、得ら れた残渣を乾燥ＴＨＦ（ＴＢＡＦ）中の１Ｍ フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモ ニウムに、各シリル基につき２０倍過剰の試薬を用いて周囲温度で１６時間、懸 濁した。反応を、等容量の無菌１Ｍ酢酸トリエチルアミン、ｐＨ６．５、の添加 により停止した。試料を冷却し、スピードバク（ＳｐｅｅｄＶａｃ）により最初 の容量の半分に濃縮した。 リボザイムを２工程で、Ｃ４ ３００Å ５μｍデルタパック（ＤｅｌｔａＰ ａｋ）カラム上でのアセトニトリル濃度勾配中におけるＨＰＬＣにより精製した 。 第１工程、すなわち“トリチル オン”工程は、５′−ＤＭＴ−保護リボザイ ム（１または２以上）を、５′−ＤＭＴを欠如した不合格配列から分離するもの であった。この工程に用いた溶剤は下記のものであった：Ａ（０．１Ｍ酢酸トリ エチルアンモニウム、ｐＨ６．８）およびＢ（アセトニトリル）。溶離プロフィ ルは下記のものであった：２０％Ｂで１０分間、次いで２０％Ｂから５０％Ｂま で５０分間にわたる直線濃度勾配、５０％Ｂで１０分間、５０％Ｂから１００％ Ｂまで１０分間にわたる直線濃度勾配、および１００％Ｂから０％Ｂまで１０分 間にわたる直線濃度勾配。 第２工程は、２％トリフルオロ酢酸または８０％酢酸で処理することにより完 全に脱ブロックされたリボザイムを、Ｃ４ ３００Å ５μｍデルタパックカラ ム上でアセトニトリル濃度勾配中において精製するものであった。この工程に用 いた溶剤は下記のものであった：Ａ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐ Ｈ６．８）およびＢ（８０％アセトニトリル、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニ ウム、ｐＨ６．８）。溶離プロフィルは下記のものであった：５％Ｂで５分間、 ５％Ｂから１５％Ｂまで６０分間にわたる直線濃度勾配、１５％Ｂで１０分間、 および１５％Ｂから０％Ｂまで１０分間にわたる直線濃度勾配。 トリエチルアンモニウム、塩の形のリボザイムを含有する画分を冷却し、スピ ードバクにより凍結乾燥した。固体残渣を最小量のエタノールに溶解し、アセト ン中の過塩素酸ナトリウムの添加によりナトリウム塩の形のリボザイムを沈殿さ せた。（Ｋ+またはＭｇ2+塩も同様な方法で調製しうる。）リボザイムを遠心分 離により採取し、アセトンで３回洗浄し、凍結乾燥した。好ましい標的 活性ハンマーヘッドリボザイムを設計するための改良法を本明細書に記載する 。これらのリボザイムは、リボザイム−基質コンプレックスにより形成される内 部ループに最も近接した位置に“強固な”塩基対合相互作用を生じる配列を含む ように選ばれる（配列特異的二重らせんの安定性に関するパラメーターは、フラ イヤー(Freier)ら、“ＲＮＡ二重らせんの安定性を推定するための改良されたパ ラメーター”，83 Pro.Natl.Acad.Sci.USA 9373,1986中に見られる）。たとえば これらのリボザイムは、基質配列ＸＸＵＨ／ＸＸを有する（ここでＸＸは“強固 な”二重らせんを形成する塩基であり、ＨはＵ、ＡまたはＣであり、斜線は開裂 部位を表す）。“強固な”二重らせんを形成する塩基は、ヘリックス成長（ｈｅ ｌｉｘ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）のジヌクレオチド自由エネルギーが−２．０ ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ以下を有するものとなるように選ばれる（すなわちＧＡ、Ｕ Ｃ、ＧＵ、ＡＣ、ＣＧ、ＧＣ、ＧＧ、ＣＣ：参照：フライヤーら）。これらのリ ボザイムは、ＸＸの位置に“弱い”二重らせんを形成する塩基を有する他のリボ ザイムより活性が高い。これらのリボザイムは基質ＲＮＡ分子の開裂において、 より有効である。このリボザイムは、触媒成分を開裂のために配置するのに十分 なほど緊密に基質に結合し、ただしなお反応を生成物ＲＮＡの解離により完了さ せるのに十分なほど弱く結合しうるからである。これらの位置に強固なリボザイ ム−基質相互作用を備えていることにより、リボザイムの中心ループに近接して 堅固な構造を形成することによって、最大の開裂活性が得られる。これにより、 リボザイムのステムＩおよぴＩＩＩの内部の部分が局所的な熱変動のため早期に 分離するのが阻止される。図２５は緊密に束縛された構造（“適王な配置”）と 望ましくないゆるい構造（“不適正な配置”）との間の平衡を示す図である。本 発明方法は、適正な配置を最大限にする、リボザイムと基質を選択することであ る。 ステムＩＩＩはこれに関しては限度がある。最も内部にある塩基対がＡＵであ り、このＵが基質中のものでなければならないからである。しかしステムＩはこ のような拘束がなく、内部ループに隣接して“強固な”二重らせんを形成する塩 基を含むリボザイムを選択することができる。 従って、より活性の高いハンマーヘッドリボザイムを提供するための方法には 、内部ループに最も近接した可変位置に“強固な”二重らせんを形成する塩基を 有するようにリボザイムを修飾することが含まれる。 さらに、ハンマーヘッドリボザイムがより高い活性を有する基質または標的部 位を選択する方法が提供される。この方法には、配列ＸＸＵＨ／ＸＸを有する基 質部位を選択する工程が含まれる（ここでＸＸは“強固な”二重らせんを形成す る塩基であり、ＨはＵ、ＡまたはＣであり、斜線は開裂部位を表す）。実施例１５ ：ＨＩＶ−１およびＨＳＶ標的リボザイム 以下は種々のリボザイムにより得たデータであり、内部ループに最も近接した 可変位置に強固な二重らせんを形成する塩基を有するリボザイムが望ましいこと を証明する。 表３および４には、ＨＩＶ−１およびＨＳＶ−１ゲノム中に見られる標的に対 して設計された配列および活性情報が含まれる。活性（ｋｃａｔ／ｋMとして） は、２−１００ｎＭのリボザイムを約１ｎＭの放射性標識した基質と共に種々の 期間、７５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2中でイン キュベートすることによって測定された。生成物を変性ポリアクリルアミド電気 泳動により分離し、ベータ放射スキャナーにより定量した（アンビス・システム ズ、カリフォルニア州サンディエゴ）。詳細にはデータをミカエリス−メントン によって過剰の酵素につき処理し、残存する基質の画分の負の対数を時間の関数 としてプロットする。得られた勾配を次いでリボザイム濃度の関数としてプロッ トする。従ってこの線の勾配はｋｃａｔ／ｋMである。 ステムＩに関して強固な塩基対の基準に適合するリボザイムは左瑞に“Ｉ”で マークした。これらのリボザイムの平均活性は４３×１０6／Ｍ・ｍｉｎであり 、これはこの基準に適合しないリボザイムについての平均より高い（２３×１０6 ／Ｍ・ｍｉｎ）。ステムＩＩＩに関して強固な塩基対の基準に適合するリボザ イムは左瑞に“ＩＩＩ”でマークした。これらのリボザイムの平均活性は、２８ ×１０6／Ｍ・ｍｉｎであり、この基準に適合しないものについては８×１０6／ Ｍ・ｍｉｎである。６種類のリボザイムは両ステムにおいて適切な強固な内部塩 基を含む。それらの平均活性は３７×１０6／Ｍ・ｍｉｎである。 最適な酵素的活性のためのアーム長さ リボザイム／基質相互作用領域の最適長さを判定するための迅速アッセイ法を 提供する。本発明者らは、特定のＲＮＡ配列を標的とするハンマーヘッドリボザ イムの相互作用領域、たとえばステムＩおよびステムＩＩＩの最適長さを知るこ とが重要であると判断した。同様に他のリボザイム、たとえばヘアピンリボザイ ム、および肝炎デルタウイルス横造体を基礎とするものについて、このようなパ ラメーターを測定することが重要である。 一般に、これらの領域の長さが異なる一連のリボザイムを作成し、リボザイム を精製し、それらのリボザイムにつき最良の配置を判定するために速度諭的アッ セイを行った。これらのリボザイムの合成および試験には約２週間を要する。従 って多数の異なる標的部位を部位当たり６−８種類のリボザイムにつき試験する ことは、時間および経費のかかる計画になる。 本発明者らは多数の異なるアーム長さの組み合わせを１組の実験で評価するこ とにより、最適アーム長さをより迅速に判定しうることを見出した。多数のリボ ザイム（同一基質を標的とずるもの）を１回の実験でアッセイするのは困難であ る。いずれのリボザイムがそれぞれの開裂事象に関与するかを区別するのが困難 だからである。しかし単一リボザイムを用いて作成した塩基対の数において異な る基質ＲＮΛの入れ子集合（ｎｅｓｔｅｄ ｓｅｔ）を作ることは可能である。 この反転実験は、使用するリボザイムが最長基質と相互作用するのに十分なほど 長い限り、目的とする実験（リボザイムの長さを変化させる）とほぼ同じ結果を 与える。リボザイムも最長基質もそれ自身が別形態の構造を形成しないことが好 ましい。本発明者らは、形成される塩基対が同一であり、かつ競合する二次構造 がないと場合ですら、長いリボザイムとトランケートした基質との相互作用自由 エネルギーは、長い基質とトランケートしたリボザイムとの相互作用自由エネル ギーに等しくないと認識する。それは、末端の積み重ね（ｓｔａｃｋ）が相互作 用自由エネルギーに０ないし−１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌｅの貢献をし、相互作用 自由エネルギーの差は２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅにもなる可能性があるからである。 従ってこれらの差を見過ごさないことを保証するためには、異なる長さのアーム をもつ数種類のリボザイムを作成および試験する必要がある。しかし作成および 試験する必要があるリボザイムの数量は、各基質ではなく異なるリボザイムそれ ぞれを合成しなければならない場合の数量より著しく少ないであろう。 従って酵素的ＲＮＡ分子を複数の基質ＲＮＡと接触させることにより酵的性Ｒ ＮＡ分子の最適アーム長さをアッセイする方法が提供される。それぞれの基質Ｒ ＮＡは、その分子と各基質ＲＮＡが形成する塩基対の長さまたは数において互い に異なる。本方法はＲＮＡ基質開裂条件下で実施し、基質ＲＮＡの開裂割合を測 定する。 好ましくはリボザイムはハンマーヘッド型、ヘアピン型、または肝炎デルタウ イルスリボザイムであり；各基質ＲＮＡは等しい５′または３′末端を有し；各 基質の開裂速度を測定する。 “速度諭的アッセイ”または“開裂速度”とは、標的ＲＮＡの開裂割合を測定 する実験を意味する。しばしば、リボザイムまたは基質の濃度を、このパラメー ターが開裂割合に及ぼす影響を判定するためにアッセイ毎に変化させる一連のア ッセイを実施する。 “開裂割合”とは、時間の関数としての開裂した標的ＲＮＡの量の尺度を意味 する。 “ＲＮＡの入れ子集合”とは、共通の配列を含むが、３′または５′末端（ま たは両方）からの配列のトランケーションの長さが異なる１組のＲＮＡ分子を意 味する。配列の組ＡＵ、ＡＵＧ、ＡＵＧＣ、ＡＵＧＣＧ、ＡＵＧＣＧＡは共通の ５′末瑞を含む入れ子集合であり、一方ＡＵＧＣＧＡ、ＵＧＣＧＡ、ＧＣＧＡ、 ＣＧＡ、ＧＡは共通の３′末端を含む入れ子集合である。 “リボザイム／基質相互作用領域”とは、リボザイムと標的ＲＮＡを相補的塩 基対合相互作用によって一緒にすることを意図した、リボザイム内の配列を意味 する；たとえばハンマーヘッドリボザイムのステムＩおよびＩＩＩ内の配列はリ ボザイム／基質相互作用領域を形成する（図２９参照）。 １組のＲＮＡ基質を調製するための方法も提供される。これは、制限水準のホ スホルアミダイトを用いて、またはヌクレオチド塩基が特定の工程で付加されて いない場合はＲＮＡ配列をキャッピングする条件下で、短縮された結合時間を用 いて、ＲＮＡ分子を合成するものである。実施例１６ ： 一例においては、各基質を別個に化学合成することにより、１組の基質を合成 する。被験基質はリボザイムより短いので、この方法は相当する１組のリボザイ ムを合成するより少ない試薬および時間を用いる。短いＲＮＡ分子の合成ほどよ り効果的であり、得られる生成物はより精製しやすい。実施例１７ ： 入れ子集合の基質を作成するための、時間的および経費的に効果的な方法は、 合成の初期の部分に結合効率の高い標準的化学合成を採用し、次いで基質ＲＮＡ の最後の数個の（５−９）ヌクレオチドを合成するための、効率の低い結合法に 切り換えるものである。効率の低い結合法は、ホスホルアミダイトの濃度を低下 させることにより、または結合反応に許される時間を短縮することにより達成し うる。この方法はマックスウィゲン(McSwiggen)（前掲）に概説される。最終的 に、共通の３′末端を共有するが、５′末端の長さが異なる１組の基質が得られ る。 この１組のＲＮＡを合成したのち、この１組の個々のＲＮＡを単離することが できる（たとえばゲル精製法により）。次いで単離されたＲＮＡを［γ−32Ｐ］ ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５′末端標識する。３′末端 もトランケートされた分子を作成するためには、個々の５′末端標識基質を制限 塩基加水分解（ｌｉｍｉｔｅｄ ｂａｓｅ−ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）またはエキ ソヌクレアーゼ処理し、０−５ヌクレオチドが３′末端から除去された基質をゲ ル精製する。この方法により、共通の５′末端を有するが、それらの３′末端が 短縮された１組のＲＮＡが得られる。 これら２方法と共に、５′末端合成に際して効率の低い化学合成を採用し、次 いで単離されたＲＮＡの塩基加水分解またはエキソヌクレアーゼ処理することに より、共通の中心配列を有するが、両末端の最後の５−９ヌクレオチドにおける 可能なあらゆるトランケーションの組み合わせを含む完全な１組のＲＮＡ基質が 得られる。′１回の′化学合成を実施するので、この完全な１組の基質を作成す る方法は個々の基質の化学合成より著しく有利である。完全な１組の被験基質を 作成するために必要な時間および試薬の方が少ない。実施例１８ ： 特定のリボザイムに対していずれが最良の基質であるかを判定するための標準 的な速度諭的アッセイにより、基質を試験する（図２７参照）。各基質を一定量 のリボザイムと混合し、一定期間にわたってインキュベートする。得られた生成 物を変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、開裂の程度を各時点で測定す る。速度諭的分析により、いずれの基質に対してリボザイムが最も活性が高いか が明らかになる。実施例１９ ： 試験するために個々の基質を互いに分離する必要はない。むしろ、たとえばそ れらの５′末端の長さのみが異なる１組の基質を、「γ−32Ｐ］ＡＴＰおよびＴ ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５′末端標識することができる。この１組の ５′標識基質をリボザイムと共にインキュベーションすると、単一基質とのイン キュベーションと同じ速度諭的分析が得られる。得られる開裂生成物もそれらの ５′末端において異なり、従って変性ポリアクリルアミドゲル上で相互に、また 全長分子から識別される（図２８参照）。組全体のの基質を速度諭的に分析する この方法は、共通の５′末端をもつが、それらの３′末端において異なる基質に ついても有効である。これらは［32Ｐ］−コルジセピンおよびポリ（Ａ）ポリメ ラーゼ、または［32Ｐ］標識ｐＣｐおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼにより、標準法 を用いて３′末端標識することができる。実施例２０ ： この方法は、リボザイム−基質相互作用に許容される最大長さの判定を含む。 候補を標準コンピュータープログラム、たとえばツッヒェル(Zucher)．244 Sci ence 48.1989に記載のものにより全長のリボザイムおよび基質オリゴヌクレオ チドに沿って折りたたみ、活性に影響を及ぼす可能性のある二次構造につき調ベ る。このような二次横造を避けるようにリポザイム／基質相互作用の長さを調整 する。全長リボザイムを作成し、かつ５′トランケーションを含む精製基質オリ ゴヌクレオチドを、たとえばＡＢＩ合成装置により合成する。ホスホルアミダイ ト濃度を低下させ、かつ不合格配列を確実に完全にキャッピングずることにより 、同一の３′末端を含むが、５′末端において異なる入れ子集合の基質ＲＮＡを 調製することかできる（マックスウィゲン(McSwiggen)（前掲）参照）。５′ト ランケーションされた基質をそれらの５′末端において［γ−32Ｐ］ＡＴＰおよ びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより標識し、そしてゲル精製する。確実に完 全な５′リン酸化が行われ、従って得られるＲＮＡが無標識ｎ＋１基質（ここで ｎは目的長さである）を含有しないためには、過剰のＡＴＰを使用する。あるい はこの１組のＲＮＡ分子をゲル精製し、次いで［γ−32Ｐ］ＡＴＰで５′未端標 識してもよい。 期待したＲＮＡが得られたことを確認するために、５′トランケーションされ た基質をＲＮＡ配列決定法により検査する。３′トランケーションされた基質は ５′トランケーションされた基質それぞれにつき、制限塩基加水分解または３′ ヌクレアーゼ消化（たとえばヌクレアーゼＰ）により得られる。塩基加水分解反 応物を中和し、直接に速度諭的反応に使用するか、または３′トランケーション された基質をより詳細な分析のためにゲル精製する。 次いで残留する最初の基質の画分につき、時間に対する速度論的分析を行う。 この場合、生成物のバンドは、それらの共通の５′末端において32Ｐ−末端標識 された特定の１組の３′トランケーション基質につき同じだからである。ＲＮＡ分子の組の合成 本発明者らは、１μｍｏｌｅの規模のリボザイム標準的化学合成により、初期 活性試験の実施に必要な量に比べて多量のリボザイムが生成することを認めた。 従って本発明者らは、このような合成法を多数のリボザイムまたは他のＲＮＡ分 子が１回の合成で調製されるのに最適なものとなしうる方法を考案した。これに より材料費および精製時間の両方を著しく節約しうる。 同一標的配列を標的とするが、異なる長さの基質結合アームを含む試験用のリ ボザイムの組を、ルーティンに作成する。この方法を用いて、種々の長さの５′ 側基質結合アームを含むリボザイムの組を化学的に合成することができる。１態 様においては、これは各合成工程で異なる長さの完成配列の生成を促進するため に、ＲＮＡ合成の最後の数工程（すなわち５′末端付近）に用いられるホスホル アミダイトの濃度を単に低下させることにより達成される。 従ってその組の各員子が異なる長さである１組の酵素的ＲＮＡ分子の合成法が 提供される。この方法において分子の合成は、第１濃度の試薬（好ましくは過剰 ）の使用、およびヌクレオチドの位置当たり少なくとも９５％の結合効率を可能 にするのに十分なインキュベーション時間の採用を伴う。数工程の合成（たとえ ば５′側基質結合領域の合成期間）ののち、高い結合効率を可能にするのには不 十分な第２濃度の試薬を使用する。あるいは不完全な結合が行われるように、各 結合反応にあてる時間を短縮する。 好ましくは制限試薬がホスホルアミダイトであり、または時間を制限とする； 制限となる濃度または時間は、８０−９０％、さらには７０−８０％の結合効率 が得られるのに十分なものである；長さがそれぞれ少なくとも１ヌクレオチド塩 基だけ異なる、少なくとも３種類（極めて好ましくは５−９種類）の異なるＲＮ Ａ分子が合成され、これらのＲＮＡ分子は異なる５′末端をもつ（図２９参照） 。実施例２１ ： 図２９を参照して、以下に本発明の一例を示す。均等な結果を得るために均等 な策を採用しうることは当業者に認識されるであろう。 ２台のＲＮＡ合成装置を用意し、一方には標準濃度のホスホルアミダイト（た とえば０．１Ｍ）を入れ、他方には標準的な合成条件下でわずか８０％の結合効 率を与えるように設定された低い濃度のホスホルアミダイトを入れる。この濃度 は各合成装置または反応体の組につき経験的に判定しうる。 ＲＮＡ合成は標準濃度のポスポルアミダイトから開姶し、欠陥配列が望まれる ５′末端にＲＮＡ配列が位置するまで継続する。 この時点でＲＮＡ合成カラムを第２の合成装置に移し、さらに７以上の位置ま で、各位置につき８０％の結合効率で合成を継続する。５′末端にｎ、ｎ−１、 ｎ−２、ｎ−３、ｎ−４、ｎ−５、ｎ−６ヌクレオチドを含むリボザイムがそれ ぞれ全体の２６％、７％、８％、１０％、１３％、１６％および２０％の濃度で 生成するであろう。標準法によりキャッピングを行う(ABI Bulletin 53:1-7(198 8))。 各カラムのＲＮＡを常法により脱保護し、かつ脱塩する。小型の欠陥配列は所 望によりゲル精製により排除することができるが、ｎ、ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３ 、ｎ−４、ｎ−５、およびｎ−６ＲＮＡを互いに分離することはできない。 脱塩ＲＮＡにつき塩基組成分析を実施する（７ＲＮＡにつき１回の塩基組成分 析で十分であろう）。個々のＲＮＡをイオン交換ＨＰＬＣまたはゲル精製により 精製する。１組全体を一緒に使用しうるので、場合により個々のＲＮＡを精製す る必要はないかもしれない。ｎ−１からのｎの分離が困難である場合、合成をさ らに１ヌクレオチド延長することができ、これにより比較的大量の全長ＲＮＡ（ この場合２６％）が最長の目的とする欠陥配列（この場合７％）がより容易に分 離される。 次いで精製リボザイムの５′末端を、Ｔ４ボリヌクレオチドキナーゼを用いて 「γ−32Ｐ］ＡＴＰで標識する。次いでこの32Ｐ標識リボザイムを純度につき検 査し、目的配列が得られたことを確認するために配列決定する。実施例２２ ： ｎ−４からｎまでの各結合工程において結合効率を調整すると、ｎ、ｎ−１、 ｎ−２、ｎ−３、ｎ−４などのＲＮＡのより均一な分布を得ることができる。結 合効率を任意に変化させるための最も直接的な方法は、ホスホルアミダイト濃度 を一定に保持しながら結合時間を変化させることである。標準的な結合反応は、 ９７−９９％の結合効率を得るために０．１Ｍのホスホルアミダイトおよび１２ −１５分間の結合時間を用いる。ホスホルアミダイト濃度を低下させることによ り、同じ水準の結合を得るために、より長い時間を必要とするであろう（０．１ Ｍのホスホルアミダイトは標準的反応においでＲＮＡ鎖を生長させるものより約 ２０モル倍過剰である：ホスホルアミダイト濃度が、生長しつつあるＲＮＡ鎖と １：１のモル比より低下しないことが重要である）。図３０は、ホスホルアミダ イト濃度が９９％の結合効率を得るために４３分を必要とするのに十分なほど低 下した仮定的状況を示す。結合効率は次式の曲線に従うと推定される（ｃｏｐｌ ｉｎｇ ｔｉｍｅ＝結合時間）： 結合効率 ＝ １−３-k(coupling time) この場合、結合効率は６．５分で５０％、１０．３分で６６．７％、１２．９ 分で７５％、１５分で８０％であろう。５種類のＲＮＡを等濃度で得たい場合、 下記に示す結合時間および収率が達成される： 改良されたリボザイム 改良されたリボザイムを得るために、１または２以上の安定化用ＲＮＡヘアピ ンをハンマーヘッド型またはヘアピン型リボザイムに付与することができる。こ れらのＲＮＡヘアピンは、ＲＮＡ分子の毒性の増大が最小限の状態で細胞内のＲ Ｎａｓｅからの保護をもたらす。これらの付加物はリボザイムを形成するＲＮＡ 配列に懸垂しているだけであるから、これらは既存の、または設計されたリボザ イムに容易に付加される。このようなヘアピンは化学合成により、遺伝子転写に より、またはＲＮＡリゲーション法により付加することができる。５′へアピン はリボザイムを５′−３′エキソヌクレアーゼから保護し、３′へアピンはリボ ザイムを３′−５′エキソヌクレアーゼから保護するために選ぶことができる。 従ってハンマーヘッド型またはヘアピン型リボザイムは、リボザイムの酵素的 活性を有意に低下させない５′または３′ＲＮＡヘアピンを保有しうる。 “へアピン”とは、ハンマーヘッド型リボザイムの一方の末端にリゲーション または他の形で結合しうるＲＮＡのヌクレオチド塩基配列を意味する。このＲＮ Ａはそれ自身で塩基対合して、一般にへアピンと呼ばれる折りたたみ構造を形成 する。この構造は、付近のリボザイム配列上に折りたたまれてもよい。ただしこ のような折りたたみがリボザイムの活性を有意に低下させない限りである。この ようなヘアピンはリボザイムの一方の末端から、１または２以上の非対合ヌクレ オチド塩基の付与により間隔を置いてもよい。 好ましいヘアピンには、安定なテトラヌクレオチドループ（たとえばＧＡＡＡ 、ＵＵＣＧ、ＧＮＲＡまたはＵＮＣＧ；Ｎ＝Ａ、Ｕ、ＣまたはＧ、Ｒ＝Ａまたは Ｇ）を備えたＧＣに富むステムが含まれる；極めて好ましいものはＧＧＣＣＧＡ ＡＡＧＧＣＣ、ＧＣＧＣＵＵＣＧＧＣＧＣおよびＧＧＡＧＧＡＡＡＣＵＣＣから 選ばれる配列を含むヘアピンであって、４−２０塩基対ステムおよび４−７ヌク レオチドループからなるヘアピンである。 ヘアピンはハンマーヘッド型リボザイムの５′または３′末端に容易に付加す ることができる。いかなる個々のハンマーヘッド型またはヘアピン型リボザイム を選んでも、その安定性はこのようなヘアピンを付与することによって高められ る。個々のリボザイムにつき最適なヘアピンは異なる可能性があるが、１または ２以上の普遍ヘアピンの使用によって高められた安定性が得られる。このような 普遍ヘアピンは、酵素的活性の速度諭的分析、および標準アッセイ法によるリボ ザイムの安定性に基づいて選ぶことができる。 最適ヘアピンを選ぶ際には、まず種々のリボザイム−ヘアピンの組み合わせの コンピューターによる折りたたみが、選ばれたヘアピンがリボザイムの折りたた み違い（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）を促進するか否かを指示するであろう。このよ うなヘアピンは避けるべきである。折りたたみ違いを生じないヘアピンの設計は 容易に実施しうる。リボザイムの折りたたみの立体障害も避けるべきである。さ もなければリボザイムの酵素的活性が低下する可能性がある。 いずれのヘアピンまたは非対合スペーサー配列が酵素的活性を有意に低下させ ることなく最適安定性を与えるかを判定するために、モデル系においてヘアピン の長さ、ならびにリボザイム基質結合部位または配列とヘアピンとの間の非対合 スベーサー配列の長さを変更することができる。細胞性因子へのｉｎ ｖｉｖｏ 結合を促進するヘアピンはリボザイム活性の低下を生じる可能性があるので、避 けるべきである。このような可能性は、細胞抽出物をアッセイ混合物に添加して 、この細胞抽出物の存在下でのリボザイム活性を測定する、ルーティンアッセイ 法によりアッセイすることができる。たとえば認識配列、たとえばｔａｔ認識配 列は、このようなヘアピンの設計に際して避けるべきである。 ３′または５′末端に付与した場合にリボザイムの酵素的活性を有意に低下さ せないヘアピンを選択したのち、特異的ＲＮａｓｅを添加して標準アッセイ法に より、または細胞抽出物中で試験することにより、リボザイムの安定性を試験す ることができる。大きいヘアピンほどエキソヌクレアーゼの攻撃に対するリボザ イムの安定化にいっそう有効であるが、短いヘアピンほどより合成しやすく、か つリボザイム活性がより低下しにくいと思われる。従って選ばれたいかなるリボ ザイムについても、このようなヘアピンの最適サイズを経験的に見出す必要があ ろう。 以下に適切な３′または５′ヘアピンをアッセイする方法の例を示す。これら の例は本発明を限定するものではなく、当業者はこれらの例の均等物が多数存在 することを認識するであろう。実施例２３ ： 強力な酵素的活性をもつリボザイム、たとえばＨＳＶ、ＩＣＰ４部位Ｅと呼ば れるもの（図３１Ａに示す）をモデルリボザイムとして選んだ。図３２Ａ−Ｆに 関しては、コアリポザイムを合成し、リボザイムの他の修飾は標準法により合成 した。これらには下記のものが含まれる：コアリボザイム（図３２Ａ）、最小の ３′ヘアピン（たとえばＧＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧ、図３２Ｂ）を含むコアリボ ザイム、同一の最小ヘアピンを有し、ただしリボザイム配列とヘアピンの間に１ 個のヌクレオチド非対合スペーサーを含むコアリボザイム（図３２Ｃ）、Ｔ７転 写開姶配列を含む最小の５′ヘアピン（ただし、不稔性開始を最小限に抑えるた めに、最初の９ヌクレオチド中にウラシルヌクレオチドを避ける：たとえばＧＧ ＡＣＧＡＡＡＧＵＣＣ：図３２Ｄ）を含むコアリボザイム、Ｔ７転写開始配列を 含む５′ヘアピンを有し、ただしヘアピン配列とリボザイムの間に１個のヌクレ オチドスぺーサーを含むコアリボザイム（図３２Ｅ）、ならびにその５′側にお いてＴ７転写開始部位を含むヘアピン、および１個のヌクレオチドスベーサーで 、かつその３′側において３′ヘアピンおよび１個のヌクレオチドスペーサーで フランキングされたコアリボザイム。他のヘアピン、または上記変異体のいずれ かの組み合わせであって、容易に合成しうるものも、試験し、使用することがで きる。次いでこれらすべてのリボザイムを、それらの酵素的活性につきｉｎ ｖ ｉｔｒｏで（図３２Ａ−Ｆに示す）、次いでｉｎ ｖｉｖｏで試験し、次いでそ れらの安定性につき、たとえば下記に提示するルーティンアッセイ法により試験 することができる。実施例２４ ：酵素的アッセイ リボザイムの末端における小型ステム−ループがｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性に 及ぼす効果を試験するために、図３２Ａ−Ｆに図示するリボザイムを作成し、短 い（１７ｍｅｒ）合成基質に対する開裂活性につき試験した。 活性（ｋｃａｔ／ｋMとして）は、２−１００ｎＭのリボザイムを約１ｎＭの 放射性標識基質と共に、７５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ2中で種々の期間インキュベートすることにより測定された。生成物を変性 ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ベータ放出スキャナー（アンビ ス・システムズ、カリフォルニア州サンディエゴ）により定量した。これらのデ ータをミカエリス−メンテンにより過剰の酵素につき処理し、詳細には、残留す る基質画分の負の対数を時間の関数としてプロットした。次いで得られた勾配を リボザイム濃度の関数としてプロットした。この線の勾配がｋｃａｔ／ｋMであ る。 これらのリボザイム構築体はずべて係数２以内の活性をもつ）。これは、末端 ステム−ループの付加がこのリボザイムの活性にとって阻害を示さないことを立 証する。 これらのリボザイムをさらに、標的部位を含む長い（４９６ヌクレオチド）Ｔ ７転写体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性につき試験した。この実験においては、 それぞれ４μＭのリボザイムを４７ｎＭのボディー標識した転写体と共に、上記 の緩衝液中で種々の期間インキュベートした。生成物を５％変性ゲルにより分離 し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。この結果は、各リボザイム（実 験以前に分解することが示された図３２Ｃのものを除く）による開裂が実質的に 等しい速度で起こったことを示した。実施例２５ ：安定性アッセイ リボザイム構築体、たとえば実施例２３および図３２Ａ−Ｆに記載したものを 、細胞抽出物中でのリボヌクレアーゼ分解に対する安定性につき試験することが できる。リボザイム構築体をまず標識する（たとえば32Ｐで）。これは［γ−32 Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ボリヌクレオチドキナーゼと共にインキュベーションして ５′末端を標識することにより、32Ｐ−コルジセピンンおよびポリ（Ａ）ポリメ ラーゼと共にインキュベーションして３′末端を標識することにより、または構 築体がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により作成しうるものである場合には、転写反応に 際して［32Ｐ］ＮＴＰを含有させることにより達成しうる。次いで種々の濃度の32 Ｐ−標識リボザイムを細胞抽出液と共にインキュベートする。アリコートを種 々の時 間で取り出し、ＥＤＴＡおよびホルムアミドを含有する停止用標準緩衝液と混合 し、変性ポリアクリルアミドゲルに装填する。全長リボザイムをサイズによって より小さな分解生成物と区別する。あるいは32Ｐ−標識全長リボザイムの消失と して完全分解を迫跡する。 本発明の修飾されたリボザイムは、転写されたＤＮＡテンプレートを用いて調 製するか、または標準法により化学合成することができる。これらのリボザイム は、リボザイムを標識し、細胞抽出物を用いて安定性アッセイにより試験するＲ Ｎａｓｅ実験用として合成しうる。活性リボザイムの調製法 特定の標的ＲＮＡ部位に対してリボザイムまたは酵素的ＲＮＡ分子が設計され ると、リボザイム内の種々のヌクレオチド塩基を修飾して、酵素的活性の損失な しに修飾しうる塩基、および酵素的活性を高める修飾が可能な塩基を判定するこ とがしばしば有用である。リボザイム中の各塩基位置を個々に修飾するのは、Ｒ ＮＡ分子中のこのような修飾に適した塩基を判定するには遅速な方法である。本 発明は、ランダムまたは非ランダムな様式で達成しうる、種々の修飾の迅速スク リーニング法である。 本方法においては、特定の塩基または結合の位置に、その化学修飾をのちに検 出しうる様式で化学修飾を含むリボザイムを合成する。このリボザイムは、それ が基質部分に結合し、または基質部分を含有しており、従ってそのリボザイムが 分子内で作用してシスにある基質を開裂させ、少なくとも２つのＲＮＡフラグメ ントを生成するように合成される。この方法で、修飾されたリボザイムをｉｎｖ ｉｔｒｏで、分子内開裂が起こりうる条件下にインキュベーすることにより、修 飾された各リボザイムの活性を試験することができる。リボザイムがこのような 開裂を起こすのを阻止する修飾は、このインキュベーションに際してそのリボザ イム分子に結合したまま残されるであろう。これらの結合している分子は開裂が 起こったものから容易に分離することができ、開裂した、または開裂しなかった ＲＮＡ分子中の修飾された塩基の位置は標準法により測定することができる。 従って本方法は、修飾されていないヌクレオチド塩基に対比しで検出可能な位 置にある修飾されたヌクレオチド塩基または非ヌクレオチド塩基を含むリボザイ ム分子が形成される、酵素的ＲＮＡ分子の合成法を伴うものである。ＲＮＡ分子 は、ＲＮＡ分子の酵素的部分が酵素的な様式で開裂させうる基質部分を含む状態 で形成される。 “非修飾ヌクレオチド”とは、β−Ｄ−リボフラノースの１′炭素に結合した アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル塩基のうち１つを意味する。この糖は ５′炭素に対するホスフェート結合をも有する。これらのヌクレオチドは１ヌク レオチドの３′炭素と次のヌクレオチドの５′炭素との間でホスホジエステルに より結合して、ＲＮＡを形成する。 “修飾されたヌクレオチド／ＲＮＡ”とは、下記に対する修飾を有するヌクレ オチドまたはＲＮＡを含むものとする：（１）塩基部分（たとえば２−ブロモ− ウラシル）；（２）糖部分（たとえば２′−Ｏ−メチル）；（３）ホスフエート 部分（たとえばチオホスフェート）。 好ましくは本方法は、３′または５′末端に結合した（たとえば酵素的反応の 産物の末端標識が可能な様式で）基質を含むハンマーヘッド、ヘアピンまたは肝 炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムであって、リボザイムと基質の分子内開 裂が達成されるリボザイムの合成を伴うものである。たとえばＨＤＶは開裂部位 の５′側に余分な（普通はＨＤＶリボザイムと結合していない）配列を含み、従 って活性リボザイムおよび不活性リボザイムをサイズに応じて互いに分離するこ とができる より好ましくは化学修飾はチオゴスフェートの使用を伴う。この様式で形成さ れた修飾された塩基結合は、過酸化水素による優先的開裂または過ヨウ素酸塩開 裂により、ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよびある種類の塩基特異性ＲＮａｓｅ による消化からの保護により、検出しうる。このような開裂は非修飾塩基類に対 する修飾された塩基（１または２以上）の配置を可能にする。 塩基はメチルホスホネートを用いて修飾してもよく、これらは塩基特異性ＲＮ ａｓｅを用いて開裂させ、これにより検出うる；またはこれらの塩基は２′− Ｏ−メチル、２′−フルオロ、２′−アミノヌクレオチド、または２′−デオキ シヌクレオチドを用いて修飾してもよい。これらの修飾の位置は塩基加水分解に 対する抵抗性により検出することができる。 さらに、リボザイム活性を排除することなく修飾しうるリボザイムのヌクレオ チド位置をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、リボザイムの酵 素的部分による基質の分子内開裂が可能な様式で結合した基質を含む化学合成リ ボザイムを提供すること、およびリボザイム中の１または２以上の塩基に対して 修飾がなされるようにリボザイムを合成することを伴う。次いでリボザイムを分 子内開裂条件下でインキュベートし、分子内開裂反応に際して排除される修飾、 または影響をもたない修飾の位置を決定する。 好ましくは本方法はさらに、分子内開裂活性に影響しないことが先に見出され ているヌクレオチド位置における修飾を含みうる他の修飾されたリボザイムの合 成である。この方法は、修飾しうる位置がすべて決定されるまで反復しうる。 最後に、分子内開裂活性を有する修飾されたリボザイムを、基質が結合した状 態または結合していない状態で試験し、それらの安定性および速度論的活性を非 修飾リボザイム分子、すなわち母体リボザイム分子と比較することができる。こ の方法で、そのリボザイム中においてのちに修飾しうる修飾部位を判定しうるだ けでなく、それらの修飾によって活性が高められるリボザイムをも判定しうる。実施例２６ ： 図３３を参照すると、基質が３′末端に結合した非修飾ハンマーヘッドリボザ イムを標準法により合成し、かつ精製する(ABI User Bulletins 1988,47:1-9:19 89,53:1-7)。次いでこの合成を、合成に際してリボザイム、塩基の約３％が化学 的に修飾される様式で反復する（３５ヌクレオチド残基当たり約１個の修飾を与 える）。このような化学的修飾には、他の試薬のうち特にチオホスフェートまた はメチルホスホネートの使用が含まれる。チオホスフェートは、自動合成に際し て３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドで限定処理 することにより、特定の塩基に導入しうる（アイエル(Iyer)ら，11 JACS 12 1,1990)。 次いでこのリボザイム−基質の分子集団を５′末端標識し、ＲＮＡ開裂条件下 でインキュベートし、生成物および出発原料の双方をゲル精製して、分子間開裂 したリボザイムを非開裂リボザイムから単離する。反応したリボザイム集団と反 応しなかったリボザイム集団とを、化学的修飾に対して感受性である方法を用い て比較することにより、分子内開裂を阻止する塩基位置を判定する。たとえばチ オホスフェート、過ヨウ素酸塩、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、または塩基特異 性ＲＮａｓｅを使用することができる。メチルホスホネートについては塩基特異 性ＲＮａｓｅを使用することができる。２′−Ｏ−メチル、２′−フルオロ、２ ′−アミノ、または２′−デオキシ修飾については塩基加水分解を採用しうる。 上記方法は、塩基が化学的に修飾される機会を各リボザイム位置が６−２０％ 有し（すなわち３５ヌクレオチドリボザイムにつき２−７の修飾）、かつ前工程 で分子内開裂が阻害されることが見出された位置を修飾しない様式でリボザイム を合成することにより、反復しうる。次いで、分子内開裂を阻止する化学修飾さ れたヌクレオチドの位置を上記に従って判定することができる。この操作を希望 する回数反復することができる。 許容部位において高い水準の修飾を含むが、許容されない部位においては修飾 されていないリボザイムを作成し、試験する方法により、最終的にはすべての許 容部位において完全に修飾され、かつ許容されない部位においては全く修飾され でいないリボザイムが得られる。これらのリボザイムを作成し，、基質が結合し た状態、または結合していない状態で標準アッセイ法により試験して、速度論的 実験におけるそれらの活性を、またｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにお けるそれらの安定性を測定することができる。参照：マックスウィゲン、“改良 されたリボザイム”、米国特許出願第０７／８８４，５２１号明細書、１９９２ 年５月１４日出願、本願と同一の出願人に譲渡。その全体（図面を含む）を本明 細書に参考として引用する。 次いで酵素的活性を有する修飾されたリボザイムの触媒活性は、特異的リボザ イムを別個の基質につき、そのリボザイムがこの別個の基質を開裂しうる状態で 試験することにより測定しうる。詳細には、目的とする修飾されたリボザイムお よびその基質を別個に合成し、精製する。２−１００ｎＭのリボザイムを約１ｎ Ｍの放射性標識基質と共に、７５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭＭ ｇＣｌ2中で種々の期間インキュベートすることにより、１回代謝回転活性が測 定される。生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ベータ 放出スキャナー（アンビス・システムズ、カリフォルニア州サンディエゴ）によ り定量する。これらのデータをミカエリス−メンテンにより過剰の酵素につき処 理する；詳細には残留する基質画分の負の対数を時間の関数としてプロットする 。次いで得られた勾配をリボザイム濃度の関数としてプロットする。この線の勾 配がｋｃａｔ／ｋMである。 これらのリボザイム、は、末端標識リボザイムを細胞抽出物中でのインキュベ ートすることにより、内因性細胞ヌクレアーゼに対する安定性についても試験し うる。あるいは標識リボザイムを培養細胞または動物に付与して、安定性を測定 することもできる。酵素的活性を備え、かつ安定であるリボザイムは、療法およ び他の用途に極めて有用である。 この節は、リボザイムの基質結合性部分に１または２以上の修飾されたヌクレ オチドを含有させることによりそれらの標的核酸基質に対する向上した、または 低下したアフィニティーおよび向上した酵素的活性を備えた酵素的ＲＮＡ分子す なわちリボザイム、たとえばハンマーヘッド、ヘアピン、または肝炎デルタウイ ルス由来のリボザイムを調製することにも関する。本発明者らは、リボザイムと 基質との間の塩基対合または水素結合の程度がごくわずかに変化しても、その基 質に対するリボザイムの酵素的活性に著しい影響を及ぼす可能性があることを認 識した。従って本発明者らは、リボザイムの基質結合アームに沿った水素結合の 程度の微細な変化を利用して、このような変化したヌクレオチドを含有しない未 変化リボザイムと比較してリボザイム活性を改良しうることを認識した。たとえ ばグアノシン塩基をイノシンと交換して、リボザイムとその基質のより弱い相互 作用を得ることができ、またはウラシルをブロモウラシル（ＢｒＵ）と交換して 、アデノシンとの水素結合性相互作用を高めることができる。４種類の標準リボ ヌ クレオチド塩基の交換の他の例を図４７Ａ−Ｄに示す。各図には、より弱い、ま たはより強い水素結合能を示す。 従って、１または２以上の修飾されたヌクレオチド塩基を含む、１または２以 上の基質結合アームを有する修飾されたリボザイムが提供される；これに関連し た観点において本発明は、１または２以上の修飾されたヌクレオチド塩基を基質 結合アーム中に含有させることによって、より高い活性を有する修飾されたリボ ザイム（非修飾リボザイムと比較して）を調製する方法である。 本発明は、標準アッセイ法により測定して、向上したｉｎ ｖｉｔｒｏおよび ｉｎ ｖｉｖｏ酵素的活性を備えたリボザイムを提供する。たとえばリボザイム の速度論的特色は、基質結合アーム中に適宜修飾された塩基を選択することによ って向上する。本発明者らは、基質に対するリボザイムの強い結合は特異性を高 めるが、それは開裂した基質からのリボザイムの分離を阻止する可能性があるこ とも認識している。従って本発明者らは、塩基対合を最適化を達成しうる手段を 提供する。詳細には本発明は、修飾されていない対応するリボザイムより少なく とも１．５倍（好ましくは２または３倍）またはそれ以上の酵素的活性を備えた 、修飾された塩基を含むリボザイムである。また本発明は、修飾された塩基をリ ボザイムに導入し、より高い酵素的活性を備えたものをスクリーニングすること によって、リボザイムの速度論的活性を最適化する方法である。この選択はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施しうる。 “酵素的部分”とは、ＲＮＡ基質の開裂にとって必須であるリボザイム部分を 意味する。 “基質結合アーム”とは、その基質の一部に対して相補的である（すなわちそ れと塩基対合しうる）リボザイム部分を意味する。一般にこの相補性は１００％ であるが、所望によりそれより少なくてもよい。たとえば１４中１０程度の塩基 が塩基対合すればよい。これらのアームは、リボザイムと標的ＲＮＡを相補的塩 基対合相互作用により一緒にするための、リボザイム内の配列を含む；たとえば 標準的ハンマーヘッドリボザイムのステムＩおよびIII内のリボザイム配列は、 基質結合ドメインを構成する（図１参照）。 好ましくは、修飾されたリボザイムはハンマーヘッド、ヘアピンまたは肝炎デ ルタウイルス由来のリボザイムであり、ハンマーヘッドリボザイムは３２−４０ ヌクレオチド塩基を含む。修飾された塩基の選択は、選択されたリボザイムの酵 素的活性（開裂の速度を測定する標準的な速度論的アッセイ法により観察された もの）を高めるように、すなわち修飾された塩基を含まない等しいヌクレオチド 塩基を含むリボザイムと比較して、リボザイムによる基質の開裂の速度または程 度を高めるように行うことが極めて好ましい。 リボザイムとその基質間には、最大のリボザイム活性を生じる結合の自由エネ ルギーの狭い範囲がある。このような結合エネルギーは、基質結合アーム中のＧ をＩ、ＵをＢｒＵで交換する（または均等な交換）ことにより最適化しうる。こ れにより、標的認識配列、これら２種類の基質結合アームの長さ、またはリボザ イムの酵素的部分を実際に変化させることなく、結合の自由エネルギーを操作す ることができる。自由エネルギー対リボザイム活性の曲線の形状は、各塩基（ま たは数個の塩基）を修飾し、または修飾せず、かつリボザイム／基質の相互作用 の大きさの変化という複雑さのない実験からのデータを利用して、容易に判定す ることができる。 これらの実験は、大部分の活性リボザイム構造を指示するであろう。結合の自 由エネルギーのごくわずかな変化（１塩基対の相互作用ですら）リボザイム活性 に劇的に影響する可能性があるので、１または２箇所の修飾が必要であるにすぎ ないと思われる：このように、修飾された塩基の使用は最大のリボザイム活性を 保証するために結合の自由エネルギーを“微細に同調”しうる。さらにこれらの 塩基の交換、たとえばＧの代わりにＩを用いることにより、非標的ＲＮＡの開裂 が問題になる場合に、比較的高い水準の基質特異性を得ることができる。方法 修飾された基質結合アームは、標準法により合成することができる。たとえば イノシンおよび５−ブロモウラシルのホスホルアミダイトを使用しうる。一般に ステムＩおよびＩＩＩの長さにつき最適化された（ハンマーヘッドリボザイムの 場合−−他のリボザイムも同様に処理しうる）、かつリボザイムのステムＩおよ びＩＩＩの部分にＧおよび／またはＵを含む標的部位を選ぶ。修飾されたリボザ イムは、種々のＧおよびＵ残基をリボザイムの合成に際して、それぞれＩおよび ＢｒＵて交換することにより作成しうる。次いでこれらの修飾されたリボザイム を標準法により試験して、速度論的パラメーターを測定する。リボザイムの結合 アフィニティーも標準法により、たとえばＴ−メルト、ゲル結合、または競合速 度論的アッセイ法により測定しうる。次いで結合アフィニティーおよびリボザイ ム活性を比較することにより、リボザイムの最適結合アフィニティーを見出すこ とができる。次いでＧ、Ｉ、Ｕ、ＢｒＵ、および他の塩基の他の組み合わせを、 ほぼ等しい結合自由エネルギーであるが、塩基配列の異なるものにつき試験して 、単純な結合自由エネルギー以外の因子が役割を果たしているか否かを判定する ことができる。 目的とするリボザイム−基質結合配列を選択するために、非修飾リボザイムを 修飾された基質（修飾された塩基を含むもの）と共に用いることにより、この種 類のルーティン実験を実施することが好ましい。すなわち上記と逆の実験を実施 する。基質は一般にリボザイムより短く、その二次構造に対する懸念なしに容易 に合成しうるので、このような実験はより容易に実施することができる。たとえ ば、いずれの基質がより良好な速度論的結果を与えるかを判定するために、１種 類のリボザイムを複数の修飾された基質に対して試験しうる。好ましい基質が確 認されると、次いでその選ばれた基質を反映するようにリボザイムを修飾し、そ して非修飾基質に対して試験することができる。 このような実験によって、基質結合アーム中に１または２以上の修飾された塩 基を含み、匹敵する非修飾リボザイムより大きなｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎｖ ｉｖｏでの酵素的活性を備えた．、本発明の有用なリボザイムが決定されるであ ろう。このような修飾は、それらがｉｎ ｖｉｖｏでの酵素分解に対するリボザ イムの抵抗性を高める場合にも有利であろう。リボザイム標的のｉｎ ｖｉｖｏ選択 本方法は、リボザイムを構築し、選択し、そして特にリボザイムを発現するベ クターを組織培養系内で増幅するためのものである。これらのリボザイムは、そ れらが特定の標的核酸（たとえばＲＮＡ）を開裂する能力、およびその分子また はそれがコードするいずれかの蛋白質の生物学的機能を阻害する能力に関して選 択される。細胞系内で活性リボザイム構築体を選択するために、標的ｍＲＮＡの ｍＲＮＡ配列、またはそのリボザイムの細胞内位置を知る必要はない。このｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングプロトコル（すなわち細胞の内部で実施されるもの）は 細胞外の系より多数の利点をもたらす。リボザイムの効率を評価する前に大量の ＲＮＡを合成する必要はないからである。 本発明者らは、特定のＲＮＡ標的を標的とするリボザイムを選択するためのｉ ｎ ｖｉｖｏ系を提供する。この系によれば、目的リボザイムの選択法における 多数の工程を迂回することができる。この系においては、異なる基質結合アーム を有する（従って異なるＲＮＡ配列において活性である）リボザイム集団を、標 的ＲＮＡ分子を含む細胞集団に導入する。これらの細胞は、有用なリボザイムを 含む細胞のみが生存し、または有用なリボザイムを含む細胞のみが検出可能な信 号を発するように設定される。こうして、ランダムまたは非ランダムに形成され たリボザイム分子の大きな集団を、そのリボザイムが療法薬として使用されるで あろう真の環境に近似する環境で試験することができる。 従って本方法は、特定のＲＮＡ標的において活性であるリボサイムをｉｎ ｖ ｉｖｏで選択するためのものである。この方法においては、異なる基質結合アー ムを有するリボザイムの第１集団を、ＲＮＡ標的を含有するか、またはのちに含 有させられた細胞の第２集団内へ導入し、そして標的ＲＮＡにおいて活性である リボザイムを含有する細胞を同定する。 好ましくはリボザイムは発現ベクターによりコードされ、本方法はこれらのリ ボザイムを細胞内でベクターから発現させることを含む。より好ましくは、同定 されたリボザイムを単離し、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を測定するための試験を行 い；ＲＮＡ標的はウイルスＲＮＡであり、同定工程にはそのウイルスＲＮＡによ り感染したのちの細胞の生存率を測定することか含まれ；ＲＮＡ標的は哺乳動物 ＲＮＡであり、かつ細胞は哺乳動物細胞であり：ベクターはリボザイムの５′ま たは３′側のヘアピンまたはポリ（Ａ）テイルをコードする配列を含み；リボザ イムは５−８ヌクレオチドを有する少なくとも１つの基質結合アームを備えたハ ンマーヘッドリボザイムであり；かつ同定工程にはＲＮＡ標的に結合した、また はそれにより調節されたリポーターＲＮＡの発現を検出することが含まれる。 より好ましくは、ＲＮＡ標的において活性であるリボザイムを両栄養性レトロ ウイルスベクター内へ再クローニングし、そのリボザイムを保有するか，または コードするレトロウイルスベクターを、ＲＮＡ標的におけるリボザイム活性につ き選択する。 また式５′ＮＣＮＡ３′の核酸分子の集団が提供される。この式中の各Ｎはリ ボザイムの基質結合アームであるか、またはそれをコードし、Ｃはリボザイムの 酵素的部分であるか、またはそれをコードし、Ａはボリアデニル化配列であり； この集団において式中のＮのうち少なくとも１つは各べクターにおいて異なる。 好ましくはこの式は５′ＲＮＣＮＡＳ３′であり、式中のＲおよびＳは制限エ ンドヌクレアーゼ部位であり；この式は５′ＲＬＮＣＮＬＡＬＳ３′であり、式 中のＬは無であるか、あるいは核プロセシングシグナル、ＲＮＡ安定化シグナル 、スプライシングングナル、またはリボザイム分子の輸送もしくは安定性に影響 を及ぼす他のヌクレオチドシグナルであるか、またはそれをコードする挿入領域 であり；この式は５′ＤＲＬＣＮＬＡＬＳＥ３′であり、式中のＤおよびＥはそ の核酸分子の増幅を開始するために用いられる特定のヌクレオチド配列であり、 またはその相補体がその核酸分子の増幅を開始するために用いられる。 また、それぞれが各ベクター内に位置する上記核酸分子集団の１員子を有する 発現ベクター集団、およびそれぞれが各細胞内に存在する該発現ベクター集団の １員子を有する細胞集団；ならびにリボザイムおよび肝炎デルタウイルスリボザ イムモチーフをコードするリボザイム発現ベクターであって、該モチーフがリボ ザイムを含むＲＮＡを開裂しうるものが提供される。 下記のものが提供される：リボザイムの発現ベクターであって真核細胞におい てそれらを選択する際に使用するためものを構築する方法−−これらのベクター はそれらが阻害リボザイムを発現する能力に関して選択される；リボザイム発現 ベクターを含むＤＮＡの維持のために予め選択された多分化能細胞系；目的とす るリボザイム発現領域の増幅方法、およびこれらの領域またはそれらの均等物を 治療、診断または予防のためのリボザイム投与に使用すること；ならびに化学的 に合成されたリボザイムまたはリボザイム含有転写体で処置しうるｍＲＮＡ中の アクセス可能部位を標的とする方法。リボザイム集団 一般に本発明方法を実施するためには、目的とする活性リボザイムを含有する 確率の高いＲＮＡ集団を作成する必要がある。これらの活性リボザイムをＲＮＡ 集団から選択する方法を提供する必要もある。所望によりＲＮＡ集団はそれらの ＲＮＡ分子をヌクレアーゼから保護するために、安定化構造体、たとえば３′お よび５′ヘアピンを含む状態で形成することができる。さらにＲＮＡはキャッピ ングされいてもよく、またはポリ（Ａ）テイルを備えていてもよい。被験リボザ イムは、リボザイムの折りたたみ違いまたは酵素的活性に対する有害な二次構造 の形成の可能性を確実に少なくするために、できるだけ小さくなければならない 。従って、リボザイムはできるだけ小さなフランキング配列を含む状態で形成さ れるべきであり、かつそれらのフランキング配列はそれがリボザイム配列の末端 に確実にヘアピンを形成する形で付与されるべきである。 リポザイムの基質結合アームの長さは、最適リボザイムを見出すことができな いほど短すぎず、かついずれか余分な配列がそれ自体で折りたたまれて結合を阻 止するほど長くすぎないように、最適化すベきである。長い基質結合アームは、 それらがランダム化に労力を要するという理由からも有用性が低い。短い基質結 合アームほど、適切なサイズ集団を形成し、スクリーニングし、そして試験する のに有用である。長さ６−８ヌクレオチドを有するハンマーヘッドリボザイムの 基質結合アームが最適であり；従って基質結合アームが８ヌクレオチドの長さで あり、ステムＩの３′末端に１個の非変異ヌクレオチドを含む場合のハンマーヘ ッドリボザイムについては、約１０9のリボザイムパーミューテーション（ｐｅ ｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を得るためには１５の位置をランダム化する必要があるに すぎない。ベクター系 リボザイムの一般式が選ばれると、ヌクレオチド変異の位置およびアイデンテ ィティーを標準法により選択することができる。一般にそれらのリボザイムはプ ラスミドその他のベクター系中に付与される。たとえばそのベクターは、強い構 成性発現を与えるヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーター領域、またはリ ボザイムの発現を制御しうる誘導性プロモーターを有するプラスミドであっても よい。ブロモーターに続いてヘアピン構造、リボザイムコードＤＮＡ配列、およ びコードされるリボザイム転写体の３′未端に安定性を付与するための最小Ｔ７ ターミネーターヘアピンがあってもよい。３′側終止配列または肝炎デルタウイ ルス“シス開裂性”リボザイムを３′末端ヘアピン構造の後に挿入して、リボザ イム転写体の３′末端を形成してもよい。このプラスミドはランダムまたは他の 合成されたリボザイムの集団を適宜な位置に容易に挿入しうるために、適切な制 限エンドヌクレアーゼ部位（１または２以上）を備えていてもよい。これらの配 列がリボザイム活性を妨害しないことを保証すべく注意を払わなければならない 。これは、それらの配列を特定のヘアピン構造内に含有させることにより達成し うる。あるいは制限エンドヌクレアーゼ配列を省き、標準的なＰＣＲ法によりク ローニングを達成することができる。 リボザイム集団の作成を補助するために、基質結合アームの長さが異なる一連 のライブラリーを形成し、次いでこれらのライブラリーを被験細胞の形質転換前 に混合することが好ましい。たとえば各側に４−８ヌクレオチドのランダム化さ れた基質結合アームを有する１６種類のライブラリーを形成することができる。選択 選択法は多様な形態をとりうる。好ましくは、開裂の標的であるＲＮＡは可能 な限り“自然”に近い配置にすべきである。これによって自然状態の標的部位に アクセスしうるであろう。可能ならば、選択は外来のフランキング配列を含まな い全長の標的ＲＮＡに対して実施すべきである。標的ＲＮＡをその自然な環境で ある細胞内において発現させることも好ましい。たとえばＲＮＡが哺乳動物ＲＮ Ａである場合、細菌性の発現細胞を避けるべきである。それは自然の標的真核細 胞ｍＲＮＡに結合するスプライシング因子および核輸送因子を含まないと思われ るからである。選択系は、特異的ＲＮＡ標的それぞれにつき個々に選ばなければ ならないであろう。 ＲＮＡ標的がウイルスＲＮＡである場合、そのウイルスＲＮＡに感染したのち の宿主細胞の生存につき選択する選択系を考案することができる。すなわちリボ ザイムの集団を宿主細胞に導入し、それらの細胞をウイルスに感染させる。その ウイルスＲＮＡを開裂しうるリボザイムを含む細胞はいずれも、その細胞を生存 させ、かつ増殖させることができるであろう。従って増殖している細胞はいずれ も目的リボザイムを潜在的に含む。選択されたリボザイムによりいずれのウイル ス遺伝子が開裂しているかを同定するのは困難であろう。ある時点では標的遺伝 子を同定することが重要であるかも知れないが、リボザイムが実際に作動してい る限り、いずれの遺伝子が標的となっているかは重要な問題ではない。 他の標的ＲＮＡについては、リポーターＲＮＡを標的ＲＮＡの末端に結合させ 、リボザイムの導入後にリポーター遺伝子活性の低下につき選択することができ る。 すなわち、ＲＮＡ標的をコードするＤＮＡにリポーターＤＮＡをリゲート させ、従って２種類のＲＮＡが１つのＲＮＡ分子として産生する。ＲＮＡの開裂 は、リポーターＲＮＡの発現を活性化または不活性化するように設計しうる。そ れが活性化される場合、細胞内に信号が生じる（たとえば酵素活性、たとえばβ −ガラクトシダーゼ）；それが不活性化される場合、その信号はそのＲＮＡが有 毒な細胞産物（たとえばコレラ毒素）をコードする際に細胞が生存することであ っても よい。この方法により、リボザイムは１種類の特定の標的ＲＮＡを選択すること ができる。 リポーターＲＮＡがリボザイム攻撃の標的でないことを確認するために、選択 されたリボザイムをスクリーニングする必要があろう。さらに、いずれかのリポ ーターＲＮＡが標的ＲＮＡへのアクセス可能性を変化させなかったことを確認す るために、それらをスクリーニングする必要があろう。この可能性はリポーター ＲＮＡに結合していない標的ＲＮＡを用いるその後のスクリーニングに際して容 易に調べることができる。 調節遺伝子によりコードされるＲＮＡがＲＮＡ標的である場合、リポーター遺 伝子を標的遺伝子産物の制御下に置くことができる。こうして、リポーターＲＮ Ａが標的ＲＮＡアクセス可能性につき懸念することなく、１種類の特定のＲＮＡ に対するリボザイムを選択することができる。 以下に説明のために本発明において有用な実施例を示す。これらの実施例は本 発明を限定するものではない。実施例２７ ：ランダムリボザイムコード挿入配列の合成および構築 ランダムリボザイムコード挿入配列は当業者に周知の多数の方法で構築するこ とができる。以下は挿入配列の種々の必須および必須でない特色を示す合成法の 一例にすぎない。 挿入配列として用いるＤＮＡフラグメントは、ＡＢＩ ３８０Ｂ合成装置によ り、製造業者が提供するプロトコルに従って合成される。ランダムヌクレオチド の挿入のためには、モノマー類の等モル混合物を装入したボトルから逐次サンプ リングし、結合および脱保護の時間を延長する。これらの対策により、構築のこ れらの重要な時点において適正な数の塩基が付加するのが保証されるであろう。 合成後に、混合物のＤＮＡ配列を32Ｐで末端標識してマキサマおよびギルバート （Ｍａｘａｍ，Ｇｉｌｂｅｒｔ）分析法により分析するか、または放射性標識さ れた相補的フラグメントをプライミングし、これを延長させ、シデオキシ配列決 定法により配列決定する。 図１を参照すると、一般的なハンマーヘッド構造体のリボザイムの一例が示さ れる。しかし、有用なリボザイムを選択するために望まれるリボザイム集団は、 標的と塩基対合する領域、すなわち基質結合アーム内に、ランダム化した配列を 含む。 ランダムリボザイムコード鎖のＤＮＡ配列は最初に合成される。一例を図３４ に示す。ここでＤ17は、ＤＮＡフラグメントのセンス鎖の増幅のための有効なプ ライミングを与えるために用いられるいずれか特定のヌクレオチド配列であり； Ｅ17は同様に合成をプライミングするために用いられる特定のヌクレオチド配列 （Ｆ17）の逆相補体であるが、この場合はフラグメントのアンチセンス鎖の合成 をプライミングし；Ｒ6およびＳ6は、それぞれＲＥ１およびＲＥ２酵素に対する 制限エンドヌクレアーゼであり；ＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡ ＡＡはハンマーヘッドモチーフリボザイムに関するコアハンマーヘッドリボザイ ム配列の一例にすぎず；Ｎ8は長さ８ヌクレオチドのランダム基質結合アームで あり；ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡnは不定の長さのポリアデニル化領域で あり；ＬＬＬはそれぞれ任意の挿入領域であって、核プロセシングシグナル、Ｒ ＮＡ安定性シグナル、スプライシングシグナル、または発現したリボザイム分子 の輸送もしくは安定性に影響を及ぼす可能性のあるメクレオチドシグナルである 。末端配列は、Ｄ17の３′末端とＥ17の５′末端の間に最小の相同性を有するよ うに選ばれる。ＲＥ１およびＲＥ２は、配列クローニング操作に必要ないずれか の制限エンドヌクレアーゼ酵素である。これらの領域の厳密な長さはいずれも、 異なる構築体において変動するが、一般的な構造および種々の領域のアレインジ メントが本発明に有用である。 オリゴヌクレオチドの末端３′ヌクレオチドが合成のための支持体に結合する ので、それはＡ含有ＣｐＧビーズ（ｂｅａｄ）から開始し、次いで３′側ランダ ム結合アームの８ヌクレオチドを延長し、コアリボザイム（酵素的）配列、５′ ランダム結合アームの８ヌクレオチド、制限酵素（ＲＥ１）認識配列（Ｒ6）を 続け、そして５′末端のプライマー配列（Ｄ17）で終止することが好ましい。キ ャッピング、脱共役、および脱保護は標準法により行われる。 ランダムリボザイムコード配列の３′末端は、標準プロトコルに従ってターミ ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりポリアデニル化しうる。 ＤＮＡフラグメントの３′末端にポリ（Ａ）テイルを付加したのち、これらのフ ラグメントを抽出により部分精製し、熱変性し、Ｆ17配列からなるヌクレオチド プライマーの５′末端に、次いで予め定められた６ヌクレオチドのＲＥ２認識配 列（Ｓ6）にアニーリングし、そして（ｄＴ）25で終止することができる。 第２鎖の合成は、Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ、適宜な塩類、およびヌクレオ チド基質を添加し、６５℃で１６分間インキュベートすることにより達成される 。得られた混合物は、平滑末端からなる二本鎖ランダムリボザイム挿入配列を含 有する。これらのフラグメントのコード鎖は、Ｄ17プライマー配列、次いでＲＥ １部位、ランダムリボザイムコード配列、可変長さのポリ（Ａ）領域、ＲＥ２部 位、およびＦ17プライマーに対する３′末端のアニーリング領域を含む。これら の二本鎖フラグメントをＴａｇポリメラーゼおよび適宜なＤＮＡプライマーフラ グメント（Ｄ17およびＦ17）により増幅させたのち、目的ベクター中へクローニ ングする。 発現ベクター中へリゲーションしたのち、ＤＮＡ混合物を制限酵素で消化して 、特定の５′末端および３′末端を含むフラグメントを形成し、ベクター中へ直 接にクローニングすることができる。混合物をフェノール抽出し、カラムクロマ トグラフィーにより精製して、脱塩し、かつ末端から開裂した目的外のヌクレオ チドフラグメントを除去する。あるいは末端は平滑末端を含む可能性があり、後 続の発現ベクター中へのクローニングは確立されているプロトコルに従ってＤＮ Ａフラグメントをクレノウフラグメントで処理したのち行うことができる。 所望によりポリアデニル化配列を省き、ランダムリボザイムコード鎖の３′領 域に対して相補的な制限酵素プライマーまたは平滑末端プライマー含有領域を用 いて第２ＤＮＡ鎖の合成を開始してもよい。後者のうちいずれかの方法が好まし い場合、最初のランダム化リボザイムコード配列は第２鎖合成を促進するために ３′末端に１５−２５ヌクレオチドの共通ＤＮＡ配列を含むべきである。この共 通ＤＮＡ配列はランダム配列のサブセットに対して相補的である場合があり、リ ボザイム結合配列と塩基対合し、適正なリボザイム／基質相互作用の形成を阻止 することにより本発明の有用性を制限する可能性がある。 リボザイム結合領域のランダム配列の形成により、ＤＮＡをベクター中へクロ ーニングするために用いられる制限エンドヌクレアーゼ開裂部位も形成されるこ とは認められるであろう。従って同族の制限エンドヌクレアーゼによる開裂の結 果、この制限酵素認識部位を含むリボザイム構築体はいずれも失われる可能性が ある。このため、構築体ライブラリーの形成にはそれぞれ、５′末端および３′ 末端に少なくとも２つの異なる制限酵素配列を用いる（たとえばＳａｌＩおよび ＰｖｕＩＩに対する認識配列は、それぞれＧＴＣＧＡＣおよびＣＴＧＣＡＧであ る）。一連の、５′末端にＥｃｏＲＩ部位および３′ 末端にＰｖｕＩＩまたは ＳａｌＩ部位を含むフラグメント、ならびに３′末端にＥｃｏＲＩ部位および５ ′末端にＳａｌＩまたはＰｖｕＩＩ部位を含むフラグメントは、発現ベクター中 に可能性のあるあらゆるヌクレオチド配列を示すのに十分な縮重をコード領域内 に含むリボザイムコードフラグメントを形成する。実施例２８ ：リボザイム発現ベクターの構築 組織培養および動物におけるｍＲＮＡ構築体の発現に適した多数のベクターが 文献に記載されており、リボザイムの療法用発現に有効なベクターとして使用し うる。安定に形質転換された細胞系は、最適リボザイム発現ベクターの開発に必 要な発現パラメーターを確立するために最良の試験系である。これらの細胞タイ プ（たとえばＨｅＬａ細胞）に容易にＤＮＡフラグメントを導入し、これらの新 規なＤＮＡフラグメントからの発現の維持に関して選択することができる（たと えば細胞の生存に選択的利点を付与する第２遺伝子の同時発現を利用することに より）。たとえばリボザイム発現ベクターの効果的な構築のためには、多数の特 質を初期プラスミドＤＮＡ構築体に組み込むことができる；これらには下記のも のが含まれる：リボザイムコード配列の５′側に隣接して位置する真核細胞転写 エンハンサー／プロモーターコンプレックス、リボザイムコード配列の３′側に 隣接して位置する自己開裂性（たとえば肝炎デルタウイルス）リボザイムモチー フの存在、その発現が真核細胞ブロモーターおよびボリアデニル化シグナル配列 により制御される第２コード配列の存在、細菌性の複製起点、ならびに抗生物質 耐性遺伝子。細菌性の複製起点、および抗生物質耐性遺伝子は、細胞系に導入す る前にプラスミド構築体の生長を助成するために存在する。 多数のトランスフォームされたヒト細胞系が、ＳＶ４０初期プロモーター領域 を活性化しうるトランス作用因子を発現する。このため、ＳＶ４０初期プロモー ターの転写制御下にある選択遺伝子を含む発現ベクターを用いることが好ましい 。普通は適切な転写活性化因子が存在しない細胞タイプの場合、このプロモータ ーを活性化するために特定の化学物質を外部から添加しうる。他の好ましいプロ モーターはメタロチオネインプロモーターであり、これはグルココルチコイドま たは重金属塩を細胞に添加することにより誘導されて活性化しうる。細胞が容易 に利用しうる内因性の、または細胞外物質により誘導されうる他のプロモーター は、本発明における代替プロモーターとして考慮される。リボザイムコード配列 は選択遺伝子と同じプロモーター配列により誘導することもできるが、リボザイ ム構築体は目的とする標的の疾病状態により活性化されるいかなるプロモーター も利用しうる（たとえば特定のウイルス遺伝子、たとえば単純ヘルペスウイルス ＩＣＰ２７遺伝子の発現を阻害することを標的とするリボザイムは、そのウイル ス遺伝子と同じプロモーター、たとえばＩＣＰ２７プロモーターを利用しうる） 。好ましい状態は、極めて強い構成性プロモーター、たとえばヒトサイトメガロ ウイルス即時領域プロモーター（ＣＭＶ ｉｅ１プロモーター）または多数のハ ウスキーピング遺伝子プロモーター（たとえばベータアクチンプロモーター）に よるプロモーター制御下で作動するリボザイム遺伝子を伴うものである。多数の 好ましいプロモーターが、最適プロモーター活性に必要なＤＮＡ配列内にエンハ ンサー配列を含むことが認められる。天然エンハンサー配列を含むプロモーター を利用することが好ましい。あるプロモーター領域の上流に特定のエンハンサー 様領域を付加すると、プロモーター活性が抑制される場合があるからである。 リボザイムの触媒領域外の余分なヌクレオチドはその分子の酵素的機能を不活 性化する二次構造を形成させる可能性があるので、ベクター構築体は必ずしも転 写体の適正なポリアデニル化または転写の終止に必要な分子内シグナル形成配列 を含まない。リボザイム構築体に導入されたポリ（Ａ）配列がポリアデニル化シ グナルを代替するであろうが、終止シグナルは少なくとも２５ヌクレオチドの長 さであると考えられる不定の配列である。各ベクター構築体は、終止シグナル配 列の代わりに前記のリボザイムコードフラグメントの３′末端にある制限酵素ク ローニング部位の３′側に隣接して取り込まれた自己プロセシング（たとえば肝 炎デルタウイルス）リボザイム配列を含むことができる。この配列は、転写がこ の領域を過ぎて進行するのに伴ってリボザイム転写体を開裂することができ、リ ボザイム転写体のための人工転写ターミネーターとして機能するであろう。肝炎 デルタリボザイム開裂は、制限酵素挿入部位（ＲＥ２）の３′側に１個の余分な ヌクレオチドを残すであろう。特定の制限酵素認識配列を用いると、制限部位内 またはポリ（Ａ）鎖の３′末瑞において開裂する肝炎デルタリボザイムを工学的 に作成することができる。適宜な肝炎デルタウイルス（またはヘアピンその他の リボザイム）リボザイムを、標準的な突然変異形成法により発現ベクターのＲＥ ２部位の３′側に隣接して工学的に導入することができる。 適宜な発現ベクターを構築し、ランダムリボザイム挿入配列を適所に配置した のち、これらの構築体を発現のために細胞系内へ安定に導入しなければならない 。安定な組込みおよび発現は、有毒化学物質、たとえばＧ４１８（ゲンタマイシ ン）またはヒポキサンチン／ピューロマイシン／チミジン（ＨＰＴ）混合物で処 理することにより細胞に負荷される選択的抑圧により駆動される。ネオマイシン 耐性またはチミジンキナーゼの発現はそれぞれ、形質転換された発現細胞を生存 させ、同時に、形質転換に際して導入されたランダムリボザイム遺伝子からの転 写体の発現に必要なＤＮＡを生存細胞に供与するであろう。実施例２９ ：細胞系内へのリボザイム発現ベクターの安定な導入 ＤＮＡを細胞内へ安定に導入する多数の方法が文献中に知られており、これら にはＣａ2ＰＯ4沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン沈殿法、およびエレクトロポレー ションが含まれるが、これらに限定されない。一般に１μｇのＤＮＡを、細胞の サブコンフルエント培養物（約３００−４００万細胞）を入れた１００ｍｍの組 織培養皿に添加する。最初に各リボザイムＤＮＡ調製物につき少なくとも１０皿 をトランスフエクトする。ＤＮＡの取り込みに適宜な期間を与えたのち、細胞を 緩衝培地中ですすぎ、次いで補足培地を再供給する。場合によりグリセリンショ ック工程を含め、または誘発性化学物質（たとえばメタロチオネインプロモータ ー発現を誘導するためのグルココルチコイドホルモンまたは重金属）を添加して 、選択遺伝子産物（たとえばチミジンキナーゼまたはネオマイシン耐性蛋白質） の合成を開始させることが好ましい。 １０−１８時間後に、細胞をトリプシン処理し、生存する非形質転換細胞に対 して選択のために使用する有毒化学物質（たとえばＨｅＬａ細胞中に２５０−３ ５０μＭのＧ４１８）を含有する選択培地に再接種する。この培地は細胞の生存 に必要な、いずれかの遺伝子産物の継続発現のために要求される化学物質をも含 有しうる。生存細胞内に選択遺伝子誘導が継続して存在することが、リボザイム 含有プラスミドを維持するために要求されるであろう。トランスフェクトしたＤ ＮＡは通常は単位として遺伝し、これが上記プロトコルに用いられた選択的抑圧 下に維持されるからである。選択的抑圧が除かれると、形質転換された細胞にお いてしばしば外来ＤＮＡが喪失するか、または調節解除される。細胞は化学物質 の存在下に維持されるので、その後のリボザイム活性または細胞系内への感染因 子の導入を妨害する物質の使用を避けるように注意を払うべきである。 選択された細胞を集密的培養に達するまで、３日毎に培地を交換しながら増殖 させる。細胞が組織培養容器を満たしたのに伴って、それらをトリプシン処理し 、より大きな容器に移し、１０8-9細胞を凍結保存材料の調製用に採集しうるま で培養する。各細胞が１ｎｇのＤＮＡを含有すると、プラスミドの平均サイズが ７０００ヌクレオチドである場合、これは５００種類の異なるリボザイム構築体 になると推定される。ランダムリボザイムアームがハイブリダイゼーション用と して各末端に８フランキングヌクレオチドを含む場合、これは４16または４．２ ９×１０10のユニーク分子を与えるであろう。トランスフェクション／選択過程 で細胞当たりわずか１００のリボザイム構築体が得られるならば、これらの分子 の 全体像が容易に見出されるであろう。この細胞培養物中に４16のリボザイムが発 現すると、標的となしうるユニークｍＲＮＡ配列を実質的にいずれもハイブリダ イズおよび開裂しうる配列を与えるてあろう。ヒトゲノムからはわずか４12のユ ニ−クＲＮＡ配列が発現すると推定されている。明らかに、いかなる感染因子も これらの多能性リボザイム発現系が標的となしうるものより大幅に少ないユニー クＲＮＡ配列を発現するであろう。実施例３０ ：療法用リボザイムを発現する細胞の選択 療法上有効なリボザイムを発現する細胞を選択しうる方法は多数ある。いずれ の場合も、目的リボザイムを発現する細胞をスクリーニングし、クローニングし 、ベクターの単一コピーを新たな細胞系内へ導入しうる新たなベクター中へこれ らの構築体をサブクローニングするために拡大（ｅｘｐａｎｄ）しなければなら ない。発現／選択プロトコルを提示する。 この例には、ＨＣＭＶ ｉｅ１ブロモーターにより転写制御されるリボザイム ベクターを用いた。このプロモーターは、すべての細胞に存在する転写因子によ って制御される極めて強力な構成的作用性プロモーターである。このプロモータ ーまたはいずれか類似のプロモーターを用いることにより、ホルモンまたは化学 物質による転写の予備誘導（ｐｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は一般に不必要である 。さらにＨＣＭＶ ｉｅ１プロモーターは、細胞に異種ウイルスを感染させる際 の遺伝子発現を制御する多数の因子により転写活性化される（たとえばｉｅ１プ ロモーターは単純ヘルペスウイルス［ＨＳＶ］遺伝子の発現を制御するＩＣＰ４ およびＩＣＰ０蛋白質により活性化される）。リボザイム発現細胞以外のすべて の細胞を死滅させる選択的抑圧がウイルス感染として提示される（たとえばＨｅ Ｌａ細胞のＨＳＶ感染）。この感染は、約５０％の細胞を１複製サイクルで死滅 させる組織培養感染用量で実施すべきである。細胞をウイルスの３感染サイクル 期間（ＨＳＶ−１については３日間）、ウイルスで処理し、次いで生存細胞の一 部からＨＳＶを採集し、転写ベクターからのリボザイム分子の発現を証明する。 生存細胞を凍結保存材料の調製のために拡大する。保存材料は標準法により調製 さ れる。耐性細胞の培養物を、ＤＮＡの調製、および細胞が標的ウイルスの感染に 対して耐性であることの証明（たとえば耐性の証明は生存細胞をＨＳＶ−１で再 感染させることにより判定される）のために、増殖させる。実施例３１ ：リボザイム発現ベクターＤＮＡの再クローニング 上記の節に記載したプロトコルにより選択された耐性リボザイム発現細胞を、 これらの細胞において発現するリボザイムカセットの抽出のために拡大する。全 細胞ＤＮＡを標準法により細胞から単離および精製する。このＤＮＡ調製物を、 発現ベクター中に存在する、リボザイムカセットの５′側および３′側の少なく とも５０ヌクレオチドである部位を認識しうる酵素により制限酵素消化する。こ の方法を用いることにより、リボザイムカセットの上流および下流に存在するＤ ＮＡ配列を用いてプライマーＤＮＡフラグメントをハイブリダイズする。制限Ｄ ＮＡ調製物へのプライマーのハイブリダイゼーションののち、リボザイムカセッ トを、適宜な塩類、ヌクレオチド前駆物質およびＴａｇポリメラーゼ（ユナイテ ッド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレーション）と共に６５℃でインキュ べートすることにより増幅しうる。得られた増幅ＤＮＡフラグメントを２％アガ ロースまたは他の適切なマトリックス中での電気泳動により、他のＤＮＡから分 離することができる。ＤＮＡカセットは増幅されたＤＮＡから、最初のクローニ ングに用いたＲＥ１およびＲＥ２部位を認識する制限エンドヌクレアーゼで消化 することにより放出される。発現ベクター配列に相当する増幅ＤＮＡの目的外末 端から目的カセットを精製するために、２回目のアガロースゲル処理を行う。次 いでリボザイムカセットを標準法により適宜な両栄養性レトロウイルスベクター 中へクローニングする。 これらのベクターは、誘導性／選択性遺伝子、たとえば誘導性または強力な構 成性のプロモーターの下流にあるネオマイシン耐性ならびに制限酵素クローニン グ部位ＲＥ１およびＲＥ２を含むべきである。組換えＤＮＡを両栄養性ウイルス 粒子中へパッケージングし、そして細胞中へトランスフェクトするためのプロト コルは周知である。これらのベクターにより細胞を感染させ、選択すると、細胞 当たり１リボザイムベクターのみの取り込みが得られるであろう。実施例３２ ：療法用リボザイム発現カセットの再選択 レトロウイルスベクター内にリボザイム発現カセットを含む細胞系を調製した のち、細胞を感染因子から保護するか、または望ましくない遺伝的特質の発現を 阻止するリボザイムの発現に関して、細胞を再選択する。選択プロトコルは１回 目の選択に関して記載したものと同様である（すなわち適宜なウイルス濃度にお いてＨＳＶ−１に感染させ、３ウイルス複製サイクル期間増殖させ、そして生存 細胞をクローン拡大する）。保存細胞を調製したのち、細胞をウイルス耐性につ き再検査し、レトロウイルスベクターを標準法（たとえば化学物質処理）により 複製すべく誘導する。ウイルス粒子を単離し、ウイルスゲノムの直接配列決定法 により療法用リボザイムの配列を決定する。レトロウイルスの複製を誘導し、粒 子を単離し、ゲノムの配列を決定する分子的方法は当業者に知られている。 本明細書に記載の方法により療法用リボザイムの配列が決定されると、そのリ ボザイムをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成もしくは遺伝子療法のために発現ベクターに取 り込ませるか、またはそのリボザイムを外的供与法により使用するために化学的 に合成することができる。有用な系の説明は前記に引用した技術により得られ、 これらをすべて本明細書に参考として引用する。準ランダム法 以下は、準ランダムリボザイムを発現ベクター内へクローニングする方法、好 ましい触媒活性を与えるリボザイム構造特質を最適化するためのアッセイ法、お よびコンカテマーリボザイムのクローニング法を例示する。 以下に記載する技術を用いて、遺伝子内の転写体の正確な位置が不確実である 場合ですら、目的とするいかなる標的に対しても、有効な療法用リボザイムを見 出すことができる。選ばれたリボザイムをｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ用の細胞抽 出物を用いて触媒活性に関して最適化しうる方法を記載する。準ランダムリボザイムのクローニング 準ランダムリボザイムの形成のために、４種類の新規なクローニングベヒクル を構築した。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ；ワーグナー(Wagne r)ら．78 Pro.Natl.Acad.Sci.USA 1441,1981）遺伝子をクローニングのための始 原タイプ遺伝子標的として用いた。クローニングベヒクルを形成し、ＴＫ ＤＮ Ａフラグメントを挿入し、この構築体にハンマーヘッドリボザイムモチーフを取 り込ませる方法を以下に記載する。この方法を用いることにより、一次ＤＮＡ配 列、またはｍＲＮＡコード領域の方向および大きさが不確実である場合ですら、 いかなるＤＮＡフラグメントからも標的特異性リボザイムをクローニングするこ とができる。次いで目的クローンの生物学的選択および増幅を採用することによ り、潜在的に有利な遺伝子活性または療法活性を有するリボザイム構築体を形成 することができる。 このプロトコルにおけるクローニングベクターの基本的要件は、クローニング された標的ＤＮＡ配列の５′側に隣接して位置する制限エンドヌクレアーゼ部位 が、認識配列の３′側に間隔を置いた（ｘヌクレオチド）標的ＤＮＡを開裂する 制限酵素により認識されることである。認識配列と開裂部位の間隔（ｘ）が（ク ローニングのために選択されたＤＮＡフラグメントのサイズと共に）、準ランダ ム構築体におけるリボザイム結合アームの長さを指示するであろう。挿入された ＤＮＡフラグメント中へのハンマーヘッドリボザイム触媒配列のクローニングは 、開裂して長さ２ヌクレオチドのオーバーハング３′末端を与える制限酵素の使 用によって大幅に促進される。クローニングプロトコルによりこれらの２塩基は 欠失し、制限酵素開裂部位にリボザイム触媒コアが挿入される。５′側オーバー ハング、平滑末端フラグメント、または１ヌクレオチドの３′側オーバーハング 末端を与える制限部位の使用により、もはや最初のＤＮＡ配列またはリボザイム を反映しないフランキング配列が得られ、これは有効なハンマーヘッドリボザイ ム開裂に必要なＲＮＡ基質中の非対合塩基（Ｍ）を含まない。図４９および５０ を参照されたい。 クローニング部位は、リボザイム発現カセットを最初のプラスミドベクターか ら切除して真核細胞ベクターに挿入しうるように構築された。制限エンドヌクレ アーゼ部位は標的ＤＮＡのランダムフラグメント中に存在するので、各シリーズ の構築体につき多数の放出およびコア挿入開裂部位が得られるべきである。異な る放出およびコア挿入制限エンドヌクレアーゼ部位を含む構築体を用いることに より、わずか４つのクローニングベヒクルにつきあらゆるランダムリボザイム認 識部位を得ることにかなり確信をもつことができる。ＰＧＥＭ４およびｐＳＰ７ ２（プロメガ・コーポレーション；ワイオミング州マディソン）ベクター中に使 用するものとして、２つのクローニング挿入配列が設計された。ＰＧＥＭ４ベク ターについては、ＢｐｍＩ／ＳｍａＩおよびＢｓｇＩ／ＳｍａＩクローニング配 列が５′および３′末端においてそれぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限 エンドヌクレアーゼ部位によりフランキングされた。ｐＳＰ７２ベクターについ ては、５′および３′側フランキング制限エンドヌクレアーゼ部位はそれぞれＢ ｇＩＩＩおよびＸｈｏＩであった。これらの各ベクターはクローニング部位の５ ′および３′末端にそれぞれＴ７およびＳＰ６プロモーター領域を含む。ファー ジＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、リボザイム挿入配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写、および真核細胞発現ベクター中への挿入前のリボザイム活性試験を可能に する。 ＰＧＥＭ４およびｐＳＰ７２ベクター中へクローニングするために用いた４対 のＤＮＡオリゴヌクレオチド（ミッドランド・サーティファイド・リエージェン ト・コーポレーション；テキサス州ミッドランド）は下記のものであった： ＡおよびＣ対はＰＧＥＭ４中へ、ＢおよびＤ対はｐＳＰ７２中へクローニングさ れた。クローニング挿入配列をプラスミド中へ取り込ませるために、各１０μｇ のオリゴヌクレオチドをその対合オリゴヌクレオチドと１：１の比率で混合し、 ＴＭＮ溶液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および １００ｍＭ ＮａＣｌ）中において９０℃で２分間インキュベートし、次いで徐 々に２５℃に冷却した。アニールした混合物の１／１０（２μｇ）を直線化され た適宜なベクターフラグメントにリゲートした。リゲーション反応に添加する前 に、ベクターＤＮＡを適宜な制限酵素（ＰＧＥＭ４についてはＨｉｎｄＩＩＩお よびＥｃｏＲＩ、ｐＳＰ７２についてはＢｇＩＩＩおよびＸｈｏｌ）で消化し、 リゲートしたフラグメントをマニアチス(Maniatis)ら，1982,Molecular Cloning : A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、の 記載に従って低融点アガロースにより単離した。リゲーションは全容量２０μｌ で１４℃において１８−２４時間実施された。緩衝液は製造業者（ユナイテッド ・ステーツ・バイオケミカル・コーポレーション（ＵＳＢ）、オハイオ州クリー ブランド）により指示されたものであった。挿入配列をベクター中へリゲートし たのち、細菌（ＨＢ１０１）を約１００ｎｇのベクターＤＮＡ（反応容量の１／ １０、２μｌ）により３７℃で２０分間形質転換した。アンピシリンを含有する アガロース平板上で細菌のコロニーを選択し、次いで適切なクローニングベヒク ルの同定のために３ｍｌの培養において増幅した。ＰＧＥＭ４およびｐＳＰ７２ ベヒクル中へのクローニング挿入配列の存在を、プラスミドＤＮＡ調製物の制限 エンドヌクレアーゼ消化により分析した。適切に形質転換された細菌の試料を同 定し、２５０ｍｌの細菌培養物を増殖させた。プラスミドＤＮＡを２５０ｍｌの 培養物から、キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（キアジェン・インコーポレー テッド；カリフォルニア州チャッツワース）および製造業者が指示するプロトコ ルにより精製した。こうして形成された４種類のプラスミドベクターを同様なプ ロトコルに用いて、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のラ ンダムＤＮＡ挿入配列をクローニングした。 ＴＫ遺伝子フラグメントをクローニングするために、５０μｇのＴＫ ＤＮＡ （２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントＮ）を、このフラグメントを含むプラス ミドＤＮＡのＥｃｏＲＩ／ＳｃａＩ消化により切除した。ＳｃａＩ消化は、同様 に長さ２．７ｋｂであるｐＳＰ７２のプラスミドバンドを除去するために採用し た。ＥｃｏＲＩフラグメントＮを、低融点アガロース中での電気泳動、続いて標 準プロトコルによる溶離により単離した（マニアチス(Maniatis)ら，1982）。単 離およびエタノール／塩沈殿による濃縮ののち、ＥｃｏＲＩフラグメントＮＤＮ ＡをＤＮａｓｅＩで限定消化することによりフラグメント化した。消化は、２０ μｇのＴＫ ＤＮＡおよび２単位のＤＮａｓｅＩ（ＵＳＢ）を、５０ｍＭトリス −ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１０μｇウシ血清アルブミ ン（ＢＳＡ）を含有する全容量２００μｌ中で混合することにより実施された。 混合物を３７℃でインキュベートし、１、２．５、５および１０分後に５０μｌ アリコートを取り出し、５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡと混合した。反応アリコー トをすべて８％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動して、各片をサイズ分画し た。長さ２０−４０ヌクレオチドのフラグメントをゲルから切り取り、マニアチ ス(Maniatis)ら，1982、の方法に従って溶離した。消化プロトコルはＤＮＡの塩 基組成に依存し、消化すべき各フラグメントに最適なものとすべきである。本発 明者らは、ＨＳＶ ＴＫ遺伝子の最適消化時間は約２．５分であることを見出し た。溶出したＤＮＡフラグメントをＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント で修復し、上記プラスミドクローニングベヒクル中へのクローニングに用いる平 滑末端フラグメントを形成した。修復反応は製造業者（ＵＳＢ）が記載するプロ トコルに従って２０μｌ容量で室温において１時間実施された。 末端を修復したのち、それらのＤＮＡフラグメントをウシ腸ホスファターゼ酵 素（ＣＩＰ、ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレーション）と 共にインキュベーションすることにより脱リン酸化し、そしてフラグメントをフ ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２４：２４：１）中に 抽出し、エタノール沈殿させることにより、クローニングベクター中への挿入用 に調製した。それぞれ１．０μｇのクローニングベヒクルをＳｍａＩ制限エンド ヌクレアーゼで消化することにより直線化し、直線化したフラグメントを１％低 融点 アガロースゲル中で電気泳動して、未消化ベクターを除去した。アガロースから の溶離は製造業者の記載に従った。１μｇのベクターを１μｇのＤＮＡフラグメ ント調製物（それぞれモル比１：１００のベクター：挿入配列）と混合し、次い でフラグメントを全容量２０μｌで２５℃において１８−２４時間リゲーション した。細菌を形質転換する前に、リゲーション混合物をＸｍａＩ制限エンドヌク レアーゼで消化して（５単位の酵素、容量２０μｌで３時間）、リゲーションに 際して閉環したベクター片を直線化した。（ＸｍａＩはＳｍａＩのアイソシゾマ ーである。）次いで消化した調製物を前記に従ってＨＢ１０１細胞中へ形質転換 した。得られたアンピシリン耐性菌の集団をバッチ培養で増殖させて、リボザイ ム触媒コア配列をＴＫ ＤＮＡフラグメント中へ挿入するためにすべてのプベヒ クルを採集した。 リボザイム触媒コアをＴＫ ＤＮＡフラグメント中へクローニングする前に、 プラスミドを適宜な酵素（ＢｐｍＩまたはＢｓｇＩ；ニュー・イングランド・バ イオラボズ；マサチュセッツ州ビバリー）で消化し、直線化したプラスミドを低 融点アガロースゲル中で電気泳動したのち単離した。直線化した調製物をＴＫＤ ＮＡポリメラーゼで消化して平滑末端を形成し、これらのＤＮＡをＣＩＰ酵素で 処理することにより脱リン酸化した。フェノール／クロロホルム／イソアミルア ルコール抽出後に、ＤＮＡフラグメントをエタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液（ １０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。下 記のオリゴヌクレオチドを前記に従ってアニーリングナることにより、触媒コア 配列を直線化したプラスミドＤＮＡに挿入した： アニーリング後に０．１μｇのオーリゴヌクレオチド混合物を、リゲーション緩 衝液中の直線化した平滑末端プラスミド調製物１μｇに添加して（モル比１０： １０の挿入配列：ベクターとなる）、２０μｌの最終反応容量を得た。混合物を １６℃で一夜インキュベートし、次いで全容量の１／１０（２μｌ）を、ＨＢ１ ０ １細胞を含有する形質転換溶液１００μｌに添加した。細胞の形質転換後に細菌 調製物１０ｍｌを増殖させ、前節に従って５ｍｌの調製物からプラスミドＤＮＡ を単離した。残り５ｍｌの細菌を３本の試験管に分配し、等容量の４０％グリセ リンと混合し、保存溶液として−８０℃で凍結した。 準ランダムリボザイムクローニングを採用することにより、センス配向および アンチセンス配向の双方で存在する遺伝子フラグメントおよび触媒コアが得られ る。転写体をＤＮＡフラグメントの両方の鎖から開裂するリボザイムが形成され るので、この挿入体混合物はリボザイム活性の細胞選択を求める場合、および標 的ＤＮＡ内の転写の方向が分からない場合に有利である。ランダム挿入法はセン ス鎖開裂リボザイムと相補鎖開裂リボザイムの１：１混合物を生じるであろう。 ＤＮＡ挿入配列の両端にＲＮＡポリメラーゼプロモーターが存在することにより 、転写プロトコル選択の多様性が得られ（いずれの系列の転写体についてもほぼ 等しい分布のリボザイム構造および特異性が得られるであろうから）、ベクター 中への非ランダム方向挿入が相殺される。 準ランダムリボザイム集団内の触媒活性をおおまかに調べるために、上記で調 製したプラスミドＤＮＡテンプレートからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写体を合成した。 プラスミドＤＮＡ調製物を、制限エンドヌクレアーゼによる消化、およびＴ７ま たはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために２画分（ それぞれの画分におけるＤＮＡ収量は約１０μｇである）に分けた。ＰＧＥＭ４ 系プラスミドを、Ｔ７転写体についてはＥｃｏＲＩにより、ＳＰ６転写体につい てはＨｉｎｄＩＩＩにより開裂した。ｐＳＰ７２系プラスミドを、Ｔ７転写体に ついてはＸｈｏＩにより、ＳＰ６転写体についてはＢｇＩＩＩにより開裂した。 １μｇの直線化ＤＮＡテンプレートを、下記を含有する転写用混合物に添加した ；２０μｌの５×緩衝液（２００ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；５０ｍＭ ＭｇＣｌ2；１０ｍＭスペルミジン、および５０ｍＭ ＮａＣｌ）、１０μｌの １００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）；５μｌのＲＮＡｓｉｎ（２０，００ ０Ｕ／ｍｌ；ジブコ／ＢＲＬ、マリーランド州カイザースバーグ）；５μｌのＮ ＴＰ混合物（それぞれ２０ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ）および 最終容量９５μｌとなすのに十分な水。１００単位のＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡ ポリメラーゼ（ＵＳＢ）を添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした のち、ＲＮａｓｅを含有しないＤＮａｓｅＩを添加し、反応物を３７℃でさらに １５分間インキュベートした。この溶液を１５０μｌの容量となし、フェノール ／クロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出し、吸着床容量１ｍｌのＧ− ５０セファデックス（ファルマシア、ウプサラ）によりスピンクロマトグラフィ ー処理した。一般的な転写によりＤＴＴテンプレートのμｇ当たり１０−１５μ ｇのＲＮＡが得られる。 32Ｐ標識ＴＫ基質ＲＮＡを合成するために、下記プライマーを用いるＰＣＲ増 幅法によりテンプレートＤＮＡを調製し； これによりＴＫ ｍＲＮＡコード配列（１２６２ヌクレオチド）の５′側に隣接 して位置するＴＫ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域を含む二本鎖ＤＮＡテ ンプレートが形成された。転写反応は本質的にはリボザイム合成に関して記載し たものと同じであるが、ただし全反応容量を２０μｌに減少させ、わずか２０単 位のＴ７ポリメラーゼを含有し、１μｌの２０ｍＭ ＮＴＰの代わりに１μｌの ２０ｍＭ ＡＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）、ならびに２μｌのα−32Ｐ−ＣＴＰ （８０μＣｉ；８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；デュポン／ＮＥＮ；マサチュセッツ州ボ ストン）を用いた。ＲＮＡをＧ−５０セファデックスカラムによるスピンクロマ トグラフィーにより精製した。十分に同定されていないＤＮＡを挿入フラグメン ト源として用いる場合、標的ＲＮＡの転写用テンプレートはｐＳＰ７２、ＰＧＥ Ｍ４または他の適切な転写ベクター中へＤＮＡを平滑末端リゲーションすること により調製しうる。 ＴＫ転写体のリボザイム開裂を分析するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写体を５ ０，０００ｃｐｍのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＴＫ ＲＮＡと混合し、５μｌの１０ ×リボザイム開裂用緩衝液（７５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、および１００ｍＭ ＭｇＣｌ2）を含有する５０μｌの全容量、および０．１−１０μＭの異なる最 終リボザイム濃度において、３７℃でインキュベートした。対照反応物はリボザ イム混合物の代わりに１０ｎｇの酵母ｔＲＮＡを含有していた。一定の期間毎に アリコートを取り出し、溶液（２０ｍＭ ＥＤＴＡ、９５％ホルムアミド、なら びに０．１％ブロムフェノールブルーおよびキシレンシアノールを含有）の添加 により反応停止した。試料を９０℃に１０分間加熱し、直ちに氷冷し、ＴＫ Ｒ ＮＡの開裂生成物を３％ポリアクリルアミドゲル中での試料の電気泳動により同 定し、次いでオートラジオグラフィーにより開裂ＲＮＡフラグメントを視覚化し た。その転写体がＴＫ ＲＮＡに特異的なリボザイム活性を示したＤＮＡ調製物 を、母体細菌保存材料の２５０ｍｌ培養物の増殖により増幅した。これらの保存 材料から単離したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩまたはＢｇｌ ＩＩ／ＸｈｏＩ制限酵素の組み合わせにより消化し、放出されたリボザイムコー ド配列をゲル電気泳動により単離し、組織培養実験に用いるために、適宜な真核 細胞発現ベクター中へクローニングした。 細胞内で標的ＲＮＡを開裂するリボザイムベクターのスクリーニングおよび同 定は時間がかかり、その発現が細胞に負の選択的利点をもたらす標的ｍＲＮＡの 選択に依存する（たとえばＨＳＶ ＴＫ発現は、細胞をアサイクログアノシン［ ＡＣＶ］処理に対して感受性にするであろう）。ＴＫ発現細胞をＡＣＶおよびリ ボザイム発現ベクターの存在下で増殖させることにより、阻害性リボザイムを含 む細胞のみを選択および増殖させることができる。真核細胞発現ベクター内のフ ランキング領域は知られているので、有効リボザイムをコードするＤＮＡを抽出 し、標準法によりＰＣＲ増幅させることができる。有効リボザイム配列を同定し たのち、適宜な療法用発現ベクター中へ挿入する前に下記のｉｎ ｖｉｔｒｏ法 によりリボザイム構造体を最適化することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏリボザイム最適化 有効な準ランダムリボザイム構築体を細胞により選択するための補助的方法は 、上記の節に記載したｉｎ ｖｉｔｒｏリボザイム活性アッセイ法の変法を用い る。リボザイム活性の検査のために均一に標識された転写体を用いる場合、転写 体内での多数の開裂は感受性ＲＮＡ構造体の同定を妨害する。いずれか特定の準 ランダムリボザイム集団については、可能なリボザイム分子の数は約２（ｘ−ｙ ）／４であり、ｘは１本のＤＮＡ鎖の長さであり、ｙはベクターに挿入されたＤ ＮＡフランキングの平均長さである。リボザイム結合アームの長さは大部分の遺 伝子のサイズと比較して短いので、スクリーニングされるリボザイムの数はＤＮ Ａのコード鎖中のヌクレオチド数のほぼ半分であろう。ＴＫ ＤＮＡの２．７ｋ ｂについては、約１３５０リボザイム（ＴＫコード領域の約６３２リボザイムヌ クレオチド）と予想される。これらのリボザイムの多くは、標的ｍＲＮＡ内のア クセス不可能な構造を標的とするか、またはそれらの触媒活性を低下させる不和 合性二次構造を有するであろう。 活性リボザイムがアクセス可能であるＲＮＡ内の限定部位を決定するためには 、ユニーク標識部位を有する（５′または３′標識された）基質を用いてリボザ イム活性をアッセイすることが好ましい。開裂した基質のフラグメントサイズを 分析すると、基質内のリボザイム開裂が起こるおおまかな位置が求められるであ ろう。標的ＲＮＡを包含する種々のサイズの基質を用いることにより、大部分の 好ましいリボザイム標的部位を標的ＲＮＡの３′または５′末端から一定の距離 に配置することができる。これらの領域のＤＮＡテンプレートの配列決定によっ て確実なリボザイム認識配列が明らかになり、これは２０−４０ｍｅｒの基質Ｒ ＮＡを合成して準ランダムリボザイム調製物の存在下で開裂を調べることにより 証明することができる。このサイズ範囲のＲＮＡ分子の合成は、確立されたプロ トコルにより酵素的または化学的に達成しうる。 標的領域が同定されたのち、この標的配列に対するリボザイムを合成すること ができ、これらは真核細胞発現ベクターから過渡的アッセイ法においで合成され た場合、細胞抽出物中における触媒速度もしくはヌクレアーゼ安定性を高め、お よび／または細胞内位置を変化させる、配列修飾または付加を含む。細胞抽出物 中において標的ＲＮＡのリボザイム開裂をアッセイするための再現性のある簡単 な方法を以下に記載する。 ＴＫ遺伝子を包含するアンチセンスＲＮＡプローブの合成に用いられるＤＮＡ テンプレートを、１０ｎｇのＨＳＶ−１（ＫＯＳ株）ＤＮＡから下記のプライマ ーを用いて増幅した； プライマーＡはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。比活性１．８× １０6ｄｐｍ／ｎｇのプローブを、ＰＣＲ増幅したテンプレートＤＮＡから直接 にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）を用いて製造業者の記載に従って、32Ｐ 標識ＣＴＰ（デュポン／ＮＥＮ）の存在下に合成した。ＨＳＶ感染したベロ（Ｖ ｅｒｏ）細胞（ＭＯＩ＝１、ＨＳＶ−１、ＫＯＳ株）由来の細胞質抽出物（４０ μｌ）を５μｌの１０×リボザイム開裂用緩衝液（７５０ｍＭトリス、ｐＨ７． ５、および１００ｍＭ ＭｇＣｌ2）、およびリボザイム（５μｌの水中に希釈 、０．１−１０μＭの異なる最終リボザイム濃度）と混合し、３７℃で種々の期 間インキュベートした。リボザイム開裂後に抽出物を４Ｍグアニジンチオシアネ ート分解緩衝液で４００μｌに希釈し、記載に従って（コムジンスキーおよびサ ッチ（(Chomszynski,Sacchi),162 Anal.Biochem.156,1987）ＲＮＡを抽出した。 ＲＮＡを４５μｌの分解緩衝液に再懸濁し、開裂部位を包含するアンチセンスＴ Ｋプローブ（５μｌの分解緩衝液中１−５×１０5ｃｐｍ）を添加し、次いでハ イブリダイゼーション反応物を３０μｌの鉱油で覆い、５５℃で１８−２０時間 インキュベートした。ハイブリダイゼーション後に、５００μｌのＲＮａｓｅ溶 液（０．４Ｍ ＮａＣｌ，２０Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ，２Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓ ｅＴ１，および１０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を添加し、反応物を３７ ℃で３０分間インキュベートした。ヌクレアーゼ消化後に、１０μｌの２０％Ｓ Ｄ Ｓおよび１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを添加し、反応物を３７℃ にさらに３０分間加熱し、ハイブリッドを５００μｌのイソプロパノールで沈殿 させた。９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ブロムフェノール ブルーおよび０．１％キシレンシラノール（ＵＳＢ）を含有する溶液１０μｌに ペレットを再懸濁し、９５℃に４分間加熱し、次いで５％ポリアクリルアミド／ ７Ｍ尿素ゲルに装填し、６５Ｗの定電力で電気泳動した。ゲルを乾燥させ、保護 されたＲＮＡフラグメントに対応する放射能をオートラジオグラフィーにより視 覚化し、ＡＭＢＩＳ検出器を用いて定量した。コンカテマーリボザイム構築体のクローニング 細胞または抽出物中の標的ＲＮＡの効果的開裂に関してリボザイムを選択し、 触媒速度、細胞内安定性、および細胞下局在性（ｓｕｂｃｅｌｌｕｊａｒ ｌｏ ｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）につき最適化したのち、効果的なリボザイム発現ベクタ ー設計の最終工程は、転写単位内の多数の療法用リボザイム（ＴＲ）のクローニ ングを伴う。転写体からのＴＲの放出には、新生転写体中のＴＲ単位間で開裂し うる追加の放出用リボザイム（ＲＲ）のクローニングが必要である。このフムロ トコルは前節に記載されている。リボザイム標的部位のアッセイ 本発明者らは、リボザイムに関するいずれか特定の標的部位のアクセス可能性 をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで測定しうる方法を考案した。このア ッセイ法は、ｉｎ ｖｉｖｏで標的配列に局在または結合し得ない高活性リボザ イムの開発に時間とエネルギーを浪費しないことを保証するために重要である。 その標的配列はリボザイムがアクセス不可能であることがのちに見出されるから である。このようなアクセス不能性は標的ＲＮＡの二次横造により、または標的 配列に結合する蛋白質因子により引き起こされる可能性がある。このような標的 部位アクセス可能性のアッセイ法は、潜在的な標的部位それぞれに対する多数の リボザイムを形成する必要なしに実施することができる。 一般に本方法は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重らせんを認識し、かつその二重らせん中 のＲＮＡを開裂しうる酵素の使用を伴う。たとえばＤＮＡに結合したＲＮＡを開 裂するためにＲＮａｓｅＨを使用しうる。本発明者らは、リボザイムに関する標 的部位はＲＮＡ基質分子であり、適切な相補的ＤＮＡを付与することによりこの 標的部位とＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんを形成しうることを認めた。本方法は、１ または２以上のこのようなＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは分子を調製し（これ らはＤＮＡ合成装置によって迅速かつ安価に合成しうる）、これらのＤＮＡ分子 に標的ＲＮＡを接触させ、そのＲＮＡ標的がＲＮａｓｅＨによって開裂に対し感 受性になるか否かを測定することを伴う。この開裂は、標識された標的ＲＮＡの ゲル電気泳動、またはノーザンブロッティングにより、および当技術分野で周知 の方法により測定することができる。 本発明方法によれば、種々のサイズのＤＮＡプローブを、それらがリボザイム 結合部位のサイズおよび形状と近似し、従ってリボザイム構造体のアクセス可能 性を評価しうるように選ぶことができる。さらに、多くの真核細胞は内因性ＲＮ ａｓｅＨを含有するので、本方法を利用して、内因性ＲＮａｓｅＨが細胞内で形 成されたＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんを開裂する条件下にそれらの細胞にこれらの ＤＮＡオリゴヌクレオチドを供与することにより、生存する全細胞において標的 部位アクセス可能性を評価することができる。 従って本発明は、ＲＮＡ標的部位に対して相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド を調製し、そのＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＮＡ−ＲＮＡ特異性開裂因子、た とえばＲＮａｓｅＨの存在下にＲＮＡ標的と接触させることにより、リボザイム にとってのＲＮＡ標的部位アクセス可能性を測定する方法であり、従ってＲＮａ ｓｅＨはＤＮＡとＲＮＡが二重らせんを形成した場合にＲＮＡ標的を開裂する。 開裂の発生は標準法、たとえばノーザンブロッティングまたはゲル電気泳動によ り検出される。検出可能な水準の開裂を生じるＤＮＡオリゴヌクレオチドは、そ の相補的ＲＮＡ標的部位がリボザイムにとってアクセス可能であることを示す。 次いでこれらの標的部位に対するリボザイムを標準法により合成し、検査して、 そのＲＮＡ標的部位がリボザイムにとって実際にアクセス可能であることを判定 することができる。 “標的部位”とは、標的ＲＮＡ内において下記の開裂の“標的となる”配列を 意味する；（ｉ）その基質結合ドメイン内に標的配列に対して相補的である配列 を含むリボザイムによる開裂、または（ｉｉ）ＤＮＡ／ＲＮＡ開裂因子、たとえ ばＲＮａｓｅＨによる開裂、次いで標的配列への相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチ ドの結合。 “基質結合ドメイン”とは、リボザイム内においてリボザイムと標的ＲＮＡを 相補的塩基対合相互作用により一緒にすることを意図した配列を意味する；たと えば標準的ハンマーヘッドリボサイムのステムＩおよびＩＩＩ内のリボザイム配 列は、基質結合ドメインを構成する（図３５参照）。 “ＤＮＡオリゴヌクレオチド”とは、短いＤＮＡ配列を意味する；本発明にお いては、この配列は７−２０ヌクレオチド、好ましくは９−１３ヌクレオチドの 範囲である。 “ＲＮａｓｅＨ”とは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド二重らせんのＲＮＡ部分 を分解するエンドリボヌクレアーゼを意味する。ＲＮａｓｅＨは多くの生物に見 出される；大腸菌ＲＮａｓｅＨは多数の業者により市販されている。 “検出可能な水準の開裂”とは、標的ＲＮＡのランダム分解によって生成した ＲＮＡのバックグラウンドより高い状態で開裂生成物を識別するのに十分な程度 の標的ＲＮＡの開裂（および開裂生成物ＲＮＡの形成）を意味する。標的ＲＮＡ の１−５％の開裂生成物の生成が、大部分の検出法にとってバックグラウンドよ り高く検出するのに十分である。 好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドは９−１５塩基の長さであり、かつ標的 部位に対して完全に相補的である。 より好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドは式ＮＧＡＮ、ＮＵＡＮ、またはＮ ＸＹＺＮのものであり、これらにおいてＮはそれぞれ０−１２ヌクレオチドのい ずれかのヌクレオチド配列であり、ＸＹＺはＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、 ＵＡＡ、ＵＡＣ、ＵＡＧおよびＵＡＵよりなる群から選ばれ；ＤＮＡオリゴヌク レオチドは標的ＲＮＡをコートする遺伝子の一本鎖フラグメントであり；かつＤ ＮＡオリゴヌクレオチドは非対称増幅に次いで下記より選ばれる方法で分画する ことにより得られる；（ａ）チオホスフエートの取り込み、次いで過酸化物分解 、（ｂ）化学的開裂、および（ｃ）ＤＮａｓｃＩ消化。方法 本発明方法は一般的に以上に記載される。本発明方法の実施例を以下および図 ３５−４０に記載する。これらは本発明を限定するものではない。当業者は、こ れらの方法の均等物を多数採用しうることを認識するであろう。 本発明のアッセイ法は標的部位アクセス可能性の最終試験を提供するのではな く、むしろ予備試験を提供する。試験において多数の因子がアクセス可能な部位 および可能でない部位の状態をゆがめる可能性がある。たとえば使用する酵素、 たとえばＲＮａｓｅＨはＤＮＡオリゴヌクレオチドがごく部分的に結合している 部分で標的ＲＮＡを切断する可能性がある。従ってこのような部位はＲＮａｓｅ Ｈ開裂に対してごく部分的に感受性であるにすぎず、必ずしもすべてがリボザイ ムにとってアクセス可能であるとは限らない。このような誤りによる偽陽性の結 果の発生は、１組のオーバーラップＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて各ＲＮＡ 標的部位を試験することによって少なくすることができる。さらにＤＮＡオリゴ ヌクレオチドはＲＮＡオリゴヌクレオチドと必ずしも全く同じ結合アフィニティ ーをもつわけではないので、ＤＮＡプローブがアクセスし得ない部位であっても ＲＮＡプローブであればアクセス可能である場合があり、またはその逆の場合も ある。大部分の場合このような差は小さく、偽陰性の結果は稀である、この場合 もこのような偽りの結果による誤った判断は、各試験部位につき幾つかの異なる ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いることにより避けられる。 使用するＤＮＡオリゴヌクレオチドが、１らせんだけでリボザイム結合部位を 完全に包含する場合もある（すなわち塩基ミスマッチ、バルジまたはループなし に）。これに対し同じ部位における均等なリボザイム結合がコア配列により分断 された２結合領域を含む場合がある。たとえばこれはハンマーヘッドリボザイム の場合である。このような中心コアの存在は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較 してリボザイムの結合アフィニティーを７．０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ程度低下させ る可能性がある；従ってＤＮＡオリゴヌクレオチドは均等なリボザイムより何倍 も強く結合する可能性がある。この不一致の可能性は、短いＤＮＡオリゴヌクレ オチド（９−１３塩基）を用いることによって少なくすることができる。短いオ リゴヌクレオチドは必ずしもリボザイムと同一部位に結合するとは限らないので 、各組の実験に比較的短いオーバーラップＤＮＡを多数用いるべきである。 一般にこの方策は、幾つかの選ばれたＲＮＡ標的部位に対して相補的なＤＮＡ オリゴヌクレオチドの形成を伴う。標的ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで標識ヌクレ オチド三リン酸を用いて転写し、直接にＲＮａｓｅＨアッセイ混合物に添加する ことができる。標識ＲＮＡはその配置をできるだけ天然のｉｎ ｖｉｖｏ環境に おけるものに近い状態に保持するために、精製しないことが好ましい。ＤＮＡオ リゴヌクレオチドを種々の濃度で、過剰のＲＮａｓｅＨおよび標識された標的Ｒ ＮＡと混合し、３７℃でインキュベートする。試料を種々の時点で取り出し、配 列決定用ゲルに装填する。最も有用なＲＮＡ標的部位は、最短時間で最大の開裂 度を示すものである。 標的ＲＮＡを標識する必要がなく、細胞抽出物中で供給しうるという点以外は 上記と同様にして、ＲＮａｓｅＨ実験を実施することもできる。次いでＲＮＡの ノーザンブロッティング（または他の手段、たとえばＲＮａｓｅ保護）を利用し てＲＮＡの開裂を検出しうる。 ある型の実験においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたボディー標識ＲＮＡを 高濃度のＲＮａｓｅＨの添加により、標的上の特異的部位に対して相補的な種々 の濃度の９−１５ｍｅｒ ＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下で消化する。高濃 度のＲＮａｓｅＨは、ＲＮａｓｅＨによる開裂が反応における速度制限工程であ るという確率を低下させる。従ってＲＮＡ開裂速度（および程度）の差は、ＤＮ Ａオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡ上のそれら個々の部位との結合速度（および 程度）の差を表すと解釈される。ＲＮａｓｅＨがアクセスして開裂しうる部位は 、よりいっそうリボザイムによって標的となりやすい。 他の実験において本発明者らは、標的ＲＮＡアクセス可能性のＲＮａｓｅＨプ ローブとしてセミランダムＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。セミランダムプ ローブは式ＮＸＹＺＮのものであり、式中のＮはランダム化位置（すなわちＡ、 Ｃ、ＧもしくはＵであり；またはＮはそれぞれ０−２２ヌクレオチドであり、オ リゴヌクレオチドは少なくとも８−１２ヌクレオチドを含む）を表し、ＸＹＺは 好ましいリボザイム開裂配列の１つ（たとえばＧＣＵ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＡ ）を表す。完全ランダム化ＤＮＡプローブは不満足な結果を与える；標的ＲＮＡ の開裂は高プローブ濃度においてのみ、かつ識別できるバンドを形成することな く起こる。上記のセミランダムプローブによれば、１回の反応で多数の潜在的な 標的部位を評価することができる。しかしセミランダムプローブ中に表される異 なる配列の数は完全ランダムプローブ中に存在する配列のごく一部（４-3、すな わち１．６％）である。これは、解釈すべきバンドの数を処理しうる数に維持し た状態でその配列の濃度が高められるという利点をもつ。実施例３３ ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＲＮａｓｅＨ 以下の試薬を用いた： ５×緩衝液： １００ｍＭ トリス，ｐＨ７．９ ５００ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ０．５ｍＭ ＤＴＴ ＲＮａｓｅＨ： ベテスダ・リサーチ・ラボ（ＢＲＬ）から入手。２．５Ｕ／μｌ。 ホルムアミド染色停止液： ９５％ホルムアミド ２０ｍＭ ＥＤＴＡ ０．１％ブロムフェノールブルー ０．１％キシレンシアノール ＤＮＡオリゴヌクレオチド（一般に１３ヌクレオチドの長さ）、１０、１およ び０．１μＭの１０×濃度。 本方法は下記の工程を伴う； １．標準転写反応物（細胞溶解物または試験管中での転写により形成された標 的ＲＮＡを含有）を適宜なｃｐｍ／μｌ、１０×濃度に希釈する； ２．反応混合物を調製する；（一般的反応） ５×緩衝液 ２．０ μｌ ボディー標識標的 ＲＮＡ 50.000（ｃｐｍ／λ） １．０ μｌ ＲＮａｓｅＨ（２．５Ｕ／λ） ０．３２μｌ Ｈ2Ｏ ５．６８μｌ ９．０ μｌ ３．反応混合物を３７℃に予熱し、次いで１μｌのＤＮＡオリゴヌクレオチド を添加する。３７℃で１０分間インキュベートし、次いで５μｌのホルムアミド 停止液を添加する。短時間遠心分離し、試験管壁から濃縮物を取り出し、次いで 変性アクリルアミドゲルに装填する前に少なくとも９０℃に３分間加熱する。実施例３４ ：細胞抽出物中におけるＲＮａｓｅＨ 以下の試薬を用いた； ５×緩衝液： １００ｍＭ トリス，ｐＨ７．９ ５００ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ０．５ｍＭ ＤＴＴ ＲＮａｓｅＨ： ＢＲＬ ２．５Ｕ／μｌ 細胞溶解用緩衝液； ４Ｍ グアニジンチオシアネート ０．５％ サルコシル ２５ｍＭ クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．４ ホルムアミド染色停止液； ９５％ホルムアミド ２０ｍＭ ＥＤＴＡ ０．１％ブロムフェノールブルー ０．１％キシレンシアノール ＲＮａｓｅ溶液； ０．４Ｍ ＮａＣｌ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２０／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミ カル・コーポレイション、オハイオ；ＵＳＢ） ２Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ｔ１（ＵＳＢ） ４Ｕ／ｍｌ ＤＮａｓｅ １．ＲＮａｓｅ不含（ＵＳＢ） ２０％ ＳＤＳ プロティナーゼＫ：２０ｍｇ／ｍｌ フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール ２５：２５：１ イソプロパノール ｔＲＮＡ：２μｇ／μｌ ＤＮＡオリゴヌクレオチド（一搬に１３ヌクレオチドの長さ）、１５０μＭの １０濃度。 標準法により細胞溶解物を調製したのち（標的ＲＮＡを含有する細胞から）、 本方法は下記の工程を伴う： １．試験管（０．５ｍｌ）に下記を添加する： ５×緩衝液 ３ μｌ 細胞溶解物 １０ μｌ ＲＮａｓｅＨ ０．３ μｌ Ｈ2Ｏ １．６８μｌ １４ μｌ ２．３７℃に予熱し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの１０×原液１μｌを添加し 、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで４０μｌの細胞溶解用緩衝液の添 加により反応を停止する。 ３．標識ＲＮａｓｅ保護プローブＲＮＡ（２００，０００ｃｐｍ／λ）５μｌ を添加し、２５μｌの鉱油で覆い、５５℃で一夜ハイブリダイズする。 ４．５００μｌのＲＮａｓｅ溶液を入れた１．５ｍｌの試験管に移し、３７℃ て３０分間インキュベートする。 ５．１０μｌの２０％ ＳＤＳおよび１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナー ゼＫを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。 ６．フェノール；クロロホルム；イソアミルアルコールの２５：２５：１混合 物５００μｌで１回抽出し、短期間渦式撹拌し、水層を、５００μｌのイソプロ ピルアルコールを入れた１．５ｍｌの試験管にｔＲＮＡと共に移す。 ７．室温（約２０℃）で８分間ペレット化する。 ８．１０μｌのホルムアミド停止液に再懸濁する。 ９．９０℃以上に３分間以上加熱し、変性アクリルアミドゲルに装填する。 上記２実施例の結果を図面に示す。これらの結果は上記の標準法および当技術 分野で周知の標準プロトコルを用いて得られた。 前記のように、本発明においては複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドを付与する ことが重要である。適切なオリゴヌクレオチドの選択が実験の結果にとって重要 である。これらの選択の幾つかの例を以下に示す。各選択は要求されるデータ、 たとえばゲノム内の標的部位が必要か、または遺伝子内の標的部位が必要かに応 じて有用である。実施例３５ ： たとえば１例においては、完全ランダム化オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装 置により調製することができる。これは１回の合成、および標的部位を選択する ための１回の試験を要するにすぎないので、最も簡単な方法である。ランダム６ ｍｅｒおよび１１ｍｅｒを試みたが、成功しなかった。しかし不成功は、種々の オリゴヌクレオチド間のオーバーラップが多すぎたこと、またはオリゴヌクレオ チドがＲＮＡを軽く覆い、すべての部位を開裂な対してわずかに感受性にするた めであろう。実施例３６ ： 別法は、多数の異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドを調製し、それらをアッセイ に際して試験する前に混合することを伴う。この方法は各オリゴヌクレオチドを 個別に試験するより時間の節約になる。オリゴヌクレオチドは、どの部位にアク セス可能であるかを判定するのが困難なほどそれらが互いに近似しないように選 択することが最良である。実施例３７ ： 他の方法は、選ばれた標的遺伝子の一部を切り取り、その混合物をアッセイに 際してＤＮＡオリゴヌクレオチド材料として使用するものである。この方法は、 目的外の配列が最少の状態で、標的ＲＮＡに調和するオリゴヌクレオチドの完全 な１組を提供する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの調製に相補鎖のみを使用するた めに、まずＤＮＡ鎖を分離する必要がある（他の鎖はそのＤＮＡオリゴヌクレオ チドに対する競合体として作用するからである）。狭いサイズ範囲のフラグメン ト分布を得るために、ＤＮＡを比較的均一に切断することも最良である。非対称 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、一本鎖ＤＮＡを調製するための最良の方法 である。ＲＮＡの開裂は下記によって達成しうる；（ｉ）ＤＮＡ中へのチオホス フェートヌクレオチドの取り込み、これに続くＨ2Ｏ2分解、（ｉｉ）ＤＭＳ（Ｇ において）もしくはＤＥＰＣ（Ａにおいて）もしくはヒドラジン（ＵまたはＣに おいて）を用いる化学的なＤＮＡ開裂、または（ｉｉｉ）ＤＮａｓｅＩによる消 化。 非対称ＰＣＲでは、標的配列に対して相補的な一本鎖ＤＮＡが十分量得られな い場合がある。別法は、標的遺伝子または配列をＭ１３ベクター中へクローニン グし、次いで標的遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡベクターを大量に単離するものであ る（Ｍ１３はその生活環に一本鎖および二本鎖成分の両方を有する一本鎖ＤＮＡ ファージである）。余分なベクター配列の除去は（必要な場合は）、２本の相補 的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、標的遺伝子または配列をフランキングする領域 にアニーリングし、次いでこれらの二重らせん領域内に位置する部位についての 制限酵素を用いて、これらの二重らせん領域内でＤＮＡを切断することにより達 成される（図４１参照）。実施例３８ ： 適切なＤＮＡオリゴヌクレオチドを調製するための他の方法は、部分ランダム オリゴマーを形成することである。この方策は、リボザイムのアクセス可能性は それらのリボザイムにより開裂しうる部位においてのみ調べることが好ましいと いう事実に基づく。すなわち配列中のＵＣまたはＵＡを含む部位である。従って 、式５′−ＮＧＡＮまたは５′−ＮＵＡＮ（これらのオリゴヌクレオチドはＵＣ またはＵＡ部位に対して相補的であり、式中のＮはそれぞれ０−１２ヌクレオチ ドのいずれかのヌクレオチド配列である）を、アッセイに用いるものとして調製 しうる。正確に解明された中心の３ヌクレオチド（たとえばＧＡＡ、ＧＡＣ、Ｇ ＡＧ、ＧＡＵ、ＵＡＡ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、ＵＡＵ、下記参照）につき多数の異な る合成法を実施した場合、さらに大きな特異性を達成しうる。各オリゴヌクレオ チドプローブを別個のアッセイにおいで試験することができる。この方法の利点 は下記のとおりである；（ｉ）オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置により調製 しうる、（ｉｉ）３つの比較的少ない部位をランダム化するので、各オリゴヌク レオチド配列が６４倍（４3）高い濃度で存在する、（ｉｉｉ）各中心配列は約 ６４（４3）ヌクレオチドごとにランダムに現れるにすぎないので、オーバーラ ップオリゴヌクレオチドについて起こる可能性のある問題が最少限に抑えられる 、および（ｉｖ） ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列の一部が知られており、従っ て開裂位置を約６４ヌクレオチド内に同定しうるので、アクセス可能部位の同定 がより容易である。 本発明のアッセイ法は標的部位アクセス可能性の最終試験を提供するものでは なく、むしろ予備試験を提供するものである。試験において多数の因子がアクセ ス可能な部位および可能でない部位の状態をゆがめる可能性がある。たとえば使 用する酵素、たとえばＲＮａｓｅＨはＤＮＡオリゴヌクレオチドがごく部分的に 結合している部分で標的ＲＮＡを切断する可能性がある。従ってこのような部位 はＲＮａｓｅＨ開裂に対してごく部分的に感受性であるにすぎず、必ずしもすべ てがリボザイムにとってアクセス可能であるとは限らない。このような誤りによ る偽陽性の結果の発生は、１組のオーバーラップＤＮＡオリゴヌクレオチドを用 いて各ＲＮＡ標的部位を試験することによって少なくすることができる。さらに ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＲＮＡオリゴヌクレオチドと必ずしも全く同じ結合 アフィニティーをもつわけではないので、ＤＮＡプローブがアクセスし得ない部 位であってもＲＮＡプローブであればアクセス可能である場合があり、またはそ の逆の場合もある。大部分の場合このような差は小さく、偽陰性の結果は稀であ る。この場合もこのような偽りの結果による誤った判断は、各試験部位につき幾 つかの異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いることにより避けられる。 使用するＤＮＡオリゴヌクレオチドが、１らせんだけでリボザイム結合部位を 完全に包含する場合もある（すなわち塩基ミスマッチ、バルジまたはループなし に）。これに対し同じ部位における均等なリボザイム結合がコア配列により分断 された２結合領域を含む場合がある。たとえばこれはハンマーヘッドリボザイム の場合である。このような中心コアの存在は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較 してリボザイムの結合アフィニティーを７．０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ程度低下させ る可能性がある；従ってＤＮＡオリゴヌクレオチドは均等なリボザイムより何倍 も強く結合する可能性がある。この不一致の可能性は、短いＤＮＡオリゴヌクレ オチド（９−１３塩基）を用いることによって、またはアクセス可能性アッセイ におけるＤＮＡプローブの濃度を低下させることによって少なくすることができ る。 一般にこの方策は、幾つかの選ばれたＲＮＡ標的部位に対して相補的なＤＮＡ オリゴヌクレオチドの形成を伴う。標的ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで標識ヌクレ オチド三リン酸を用いて転写し、直接にＲＮａｓｅＨアッセイ混合物に添加する ことができる。標識ＲＮＡはその配置をできるだけ天然のｉｎ ｖｉｖｏ環境に おけるものに近い状態に保持するために、精製しないことが好ましい。ＤＮＡオ リゴヌクレオチドを種々の濃度で、過剰のＲＮａｓｅＨおよび標識された標的Ｒ ＮＡと混合し、３７℃でインキュベートする。試料を種々の時点で取り出し、配 列決定用ゲルに装填する。最も有用なＲＮＡ標的部位は、最短時間で最大の開裂 度を示すものである。 標的ＲＮＡを標識する必要がなく、細胞抽出物中で供給しうるという点以外は 上記と同様にして、ＲＮａｓｅＨ実験を実施することもできる。次いでＲＮＡの ノーザンブロッティングまたはＲＮａｓｅ保護を利用してＲＮＡの開裂を検出し うる。 ある型の実験においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたボディー標識ＲＮＡを 高濃度のＲＮａｓｅＨの添加により、標的上の特異的部位に対して相補的な種々 の濃度の９−１３ｍｅｒ ＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下で消化する。高濃 度のＲＮａｓｅＨは、ＲＮａｓｅＨによる開裂が反応における速度制限工程であ るという確率を低下させる。従ってＲＮＡ開裂速度（および程度）の差は、ＤＮ Ａオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡ上のそれら個々の部位との結合速度（および 程度）の差を表すと解釈される。ＲＮａｓｅＨがアクセスして開裂しうる部位は 、よりいっそうリボザイムによって標的となりやすい。実施例３９ ： 他の実験において本発明者らは、標的ＲＮＡアクセス可能性のＲＮａｓｅＨプ ローブとしてセミランダムＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。セミランダムプ ローブは式ＮＸＹＺＮのものであり、式中のＮは上記のランダム化配列位置を表 し、ＸＹＺは好ましいリボザイム開裂配列の１つを表す（たとえばＧＵＣ、ＧＵ Ａ、ＣＵＣ、ＣＵＡ）。完全ランダム化ＤＮＡプローブは不満足な結果を与える ；標的ＲＮＡの開裂は高いプローブ濃度においてのみ、かつ識別できるバンドを 形成することなく起こる。上記のセミランダムプローブによれば、１回の反応で 多数の潜在的な標的部位を評価することができる。しかしセミランダムブローブ 中に表される異なる配列の数は完全ランダムブローブ中に存在する配列のごく一 部 （４-3、すなわち１．６％）である。これは、解釈すべきバンドの数を処理しう る数に維持した状態でその配列の濃度が高められるという利点をもつ。リボザイムの合成 リボザイムの２以上の部分を別個に合成し、次いでそれらをリゲーションして 酵素的活性リボザイムを形成することによる、自動化された化学的リボザイム合 成法を提供する。この方法は他の方法より高い最終リボザイム収率を与え、それ らのリボザイムの調製を安価にする。従来の長いＲＮＡ分子を合成する非効率的 な方法は，本方法によって削減または排除される。１または２以上のリボザイム 部分を数種類の異なるリボザイムの一部として使用し、他の合成部分と結合しう る。さらに各リボザイムフラグメントは二次構造を含む傾向がより低いと思われ 、従ってＨＰＬＣによってより高い分離能において精製しうる。これに対し，全 長リボザイムは多重ピークとして溶出する可能性がある。従って２フラグメント から得られるリボザイムの純度は、リボザイムが単一オリゴヌクレオチドとして 形成された場合より高い。 詳細には本発明は、ＲＮＡリガーゼ（たとえばバクテリオファージＴ４由来の もの）により結合させて“全長”の酵素的活性リボザイム分子を得ることができ る２つの“半リボザイム”としてリボザイムを形成する、自動化された化学合成 法である。本方法は非効率的な長鎖ＲＮＡの合成法が最終収率に与える影響を最 少限に抑える。この方式は、経費のかかる追加の合成を必要とせずに、異なる半 リボザイムを混合および調和させて多数の半リボザイムの組み合わせの特性を解 明するためにも利用しうる。 従って１または２以上のリボザイム部分を調製し、これらの部分を一緒にリゲ ーションして活性リボザイムを形成することによる、酵素的活性リボザイムの合 成法が提供される。リボザイムはＲＮＡのみ、ＲＮＡとＤＮＡから形成すること ができ、または修飾された塩基を含有してもよい。 “リボザイムの部分”という句は、少なくとも１つの他のＲＮＡ分子を調製し 、これにリゲーションまたは他の形で並置する（ｊｕｘｔａｐｏｓｅ）ことによ り 酵素的活性ＲＮＡ分子を形成するために使用しうるＲＮＡ（または修飾ＲＮＡ） 分子を意味する。たとえば部分はこのような他のＲＮＡ分子と結合するまでは酵 素的活性を示さない。好ましくは、完全な酵素的活性を示すリボザイムを形成す るために２または３つのこのような部分を必要とするにすぎない。このような酵 素的活性リボザイムは、特異的な標的ＲＮＡを開裂するか、または分子内開裂す る活性を有する。 好ましくは、リボザイムは３４−４０ヌクレオチドを有するハンマーヘッドリ ボザイムであり、各部分は１５以上のヌクレオチドを含む；これらの部分を各部 分に対して相補的であるＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ、このハイブリダイゼー ションにより並置させる；これらの並置された部分を一緒にＲＮＡリガーゼ、た とえばＴ４ ＲＮＡリガーゼにより結合させる；１つの部分をリン酸化する；リ ゲーション後に、リゲーションした部分を精製する；本方法においては２以上の 部分が得られ、複数の異なるリボザイムが同時に形成される。 このような並置は、半リボザイムそれぞれをリボザイムのステムＩＩにおいて 対合させることにより達成しうる（図２０参照、これは４−７塩基対、好ましく は６塩基対を含みうる）。このような対合は、ステムＩＩの長さを延長すること により増強しうる。“並置”という語は、これらのリボザイム部分がリゲーショ ンするのに、または酵素的活性を有するのに十分なほど互いに接近することを示 すために用いられるにすぎない。 以下に本発明の実施例を示す。これらの実施例は本発明を限定するものではな く、当業者は他の均等な方法を採用しうることを認識するであろう。一般に本発 明方法によればいかなるリボザイムをも合成することができ、これらは分子内ま たは分子間のいずれで開裂する酵素的活性をも有しうる。リボザイムの各部分は 一般にごく限られたこのような活性をもつか、またはもたず、この活性はすべて の部分が互いにリゲーション（または他の形で並置）した場合に実質的に増大す る（少なくとも５−１０倍）。以下の具体例はハンマーヘッドリボザイムに関す るものであるが、本発明は特にヘアピンリボザイム、グループＩイントロン型リ ボザイム、および肝炎デルタウイルス型リボザイムにも同様に適用しうる。実施例４０ ：ハンマーヘッドリボザイムの合成 本発明以前には、リボザイムの合成は全長のハンマーヘッドリボザイム、たと えば図２０に示すようにステムＩおよびＩＩＩが約５−８ヌクレオチドの長さで あり、全長リボザイムが３２−３８ヌクレオチドを含む構造を有するものを化学 的に合成するものであった。 ＲＮＡ合成はＤＮＡ合成より効率が低い。ＲＮＡ合成の段階的結合定数はわず か約９６−９８％である（使用するホスホルアミダイトの種類に依存する）。従 って特定の合成につき全長リボザイムの最大収率は（結合定数９７％と推定して ）、３２ｍｅｒについては（０．９７）32、すなわち約３８％であり、３８ｍｅ ｒについては（０．９７）38、すなわち約３１％である。 本発明方法は一般的に図４２に示され、２つ（またはそれ以上）の比較的短い “半”リボザイムを合成し、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いてそれらを互いにリゲ ーションさせることを特色とする。図４２を参照すると、２つの１７ｍｅｒを合 成し、１つをリン酸化し、そして両者を精製する。これらの精製された１７ｍｅ ｒを、両１７ｍｅｒに対して相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡまたは他の核酸スプ リント鎖にアニーリングする。このスプリント鎖は、これら２部分がそれぞれの １端を互いに隣接させて位置するように設計された配列を有する。次いでこれら の並置されたＲＮＡ分子をＡＴＰの存在下にＴ４ ＲＮＡリガーゼで処理する。 次いでこうして形成された３４ｍｅｒ ＲＮＡをＨＰＬＣ精製する。 この方法における具体的工程につき以下に述べる；ＲＮＡ １７ｍｅｒの合成 は実際にありふれたものである。１７ｍｅｒの最大収率は約（０．９７）17、す なわち６０％（３４ｍｅｒについての約３０％と対比）である。１７ｍｅｒのゲ ル精製は１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で単一ヌクレオチド分離によって 容易に達成することができ、分離された１７ｍｅｒはゲルスライスから容易に採 取される。その不合格配列からの１７ｍｅｒのＨＰＬＣ精製は、３４ｍｅｒの精 製よりはるかに高い分離度において達成される。３４ｍｅｒの分離度は、リボザ イム分子に固有の二次構造によってさらに低下する。 リボザイムの３′側セグメントまたは部分の精製後に、リゲーションに必要な ５′ホスフェートを付与するためにそれをリン酸化する。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ は、精製ＲＮＡ分子を第３の“スプリント”鎖により整合したのち、リンネ(Lin ne)ら，42 Eur.J.Biochem.157,1974の記載に従って、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと同 様な様式で（ファリード(Fareed)ら，246 J.Biol.Chem.925,1978）結合させるこ とができる。図４２に示した様式は、この唯一の５′ホスフェート（３′ＲＮＡ フラグメント上の）を５′フラグメントの３′ＯＨと並置する。スプリント鎖は 一般的に使用しうるように選ぶことができ、目的とするコア配列を有するいかな るリボザイムにも、たとえば図４２に示したものに使用しうる（フォルスターお よびシモンズ(Forster,Symons).50 Cell 9,1987）。ＤＮＡの長さは必要に応じ て調整しうる。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによるリゲーションは、Ｔ４ ポリヌクレ オチドキナーゼの場合と同じ緩衝液（すなわち５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７． ５），２０ｍＭ ＭｇＣｌ2，３ｍＭ ＤＴＴ，１０μｇ／７ｍｌヌクレアーゼ 不含ＢＳＡ）中で行うことができる。３′フラグメントはリン酸化反応からその まま使用しうるので、これによって合成が促進される（ベケットおよびウーレン ベック(Beckett,Uhlenbeck),Oligonucleotide Synthesis; A PracticalApproach .8章，185-197頁）。 リゲーション後にＲＮＡ生成物、ＤＮＡスプリント、ＲＮＡ出発原料、および 蛋白質、ならびに塩類化合物が得られる。これらは逆相クロマトグラフィーによ り、またはゲル精製により分離することができる。スプリント鎖の除去を補助す るために変性剤を使用しうる。実施例４１ ：数種のリボザイムの同時合成 １標的部位に対する異なるアーム長さのリボザイムを合成することが、場合に より有用である。それらのリボザイムを研究することにより、この標的部位にお ける“最適”アーム長さを同定することができる。各アームに５、６、７または ８ヌクレオチドの長さを含むように各アームを変化させるには（すなわち１６種 類のアーム長さの組み合わせ）、１６種類の全長リボザイムを合成する必要があ る。 しかし本発明方法を利用すると、４種類の５′フラグメントおよび４種類の３ ′フラグメントのみを合成する必要があるにすぎず、これは経費および時間にお いて１６種類の異なるリボザイムの合成よりかなりの節約となる。これら４種類 の半リボザイム２組を用いて、混合およびマッチさせて目的とするアーム長さの 組み合わせを得ることができる。また種々のリボザイムからのアームを組み合わ せて種々の配列を試験し、いずれが高活性リボザイムを形成するかを判定するこ ともできる。これら４種類のリボザイムの迅速合成のための１経路は、４種類の ホスホリル化３′フラグメントそれぞれと選ばれた５′フラグメントとを、適宜 なＤＮＡスプリント分子を用いてリゲーションすることによる。得られた生成物 をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離することができる（各生成物は長 さ１ヌクレオチド塩基だけ異なるからである）。この方法を他の３種類の５′フ ラグメントについて反復する。こうして４回の反応および１回のゲルで、目的と する１６種類の異なるリボザイムを得るのに十分な材料を精製することができる 。実施例４２ ：並置ＲＮＡ部分 ２部分または３部分リボザイムをリゲーション工程なしに形成することができ る。たとえばこれらのリボザイムを用いて、アーム長さの関数としてのリボザイ ム活性を調べることができる。図４３を参照すると、ステムＩＩループが閉じて いないリボザイムを示す。この例においては、等モル量で混合してアーム長さを マッチさせる必要があるにすぎない。ステムＩＩの方を長く作成して、有意量の ５′フラグメント；３′フラグメントコンプレックスを３７℃で形成させること ができる。実施例４３ ：スプリントを用いない方法 図４５を参照すると、スプリント鎖を用いずにリボザイムをリゲーションしう る別経路が示される。詳細には、２本の半リボザイムを、それらが互いにハイブ リダイズしてリゲーションを促進するように構築する。この方法は、スプリント 鎖をのちに除去する必要がないので上記方法より有利である。この方法によるリ ゲーションはほとんど定量的であり、１時間以内に完了する。実施例４４ ：リゲーションしたＨＩＶ半リボザイムの触媒活性 ５′および３′フラグメントの両方につき、図４４に示したヌクレオチド塩基 配列を有するＲＮＡ分子を化学的に合成した。それらの５′末端に３個のＵを含 むのではなく０、１または２個のＵを含む点以外は等しい３つの５′フラグメン トを合成した。それらの３′末端にＣＵＧを含むのではなくＣＵ、Ｃのみを含む か、または何も含まない点以外は等しい３つの３′フラグメントをも合成した。 この図から明らかなように、３′フラグメントと５′フラグメントはステムＩＩ においてハイブリダイズすることができ、このハイブリダイズしたコンプレック スが平滑末端のものであるため、リゲーションすることができない。この構造体 が基質にハイブリダイズした場合に、リボザイム構造が形成される。 適宜な３′および５′フラグメントの混合物４０ｎＭを１−５ｎＭの基質と共 に種々の期間、７５ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣ１2中 でインキュベートしたところ、全長の合成リボザイムの場合の約半分の活性で基 質を開裂させることが示された。実施例４５ ：好ましい半リボザイム 図４６を参照すると、２つの半リボザイムの一般構造が示され、ここでＮは希 望するいずれかのヌクレオチド塩基である。たとえば３′および５′フラグメン トは両方とも約２１塩基を含み、ステムＩＩは少なくとも２塩基、好ましくは３ −５塩基の塩基対合領域を有し、少なくとも４塩基を含むループ領域を備えてい る（たとえば３′フラグメント上に）。ステムＩおよびＩＩＩは少なくとも３塩 基対、好ましくは４−８塩基対を含むように設計される。リボザイムの試験 目的リボザイムを選択し、合成し、精製すると、それらを速度諭的その他の実 験において試験して、それらの有用性を判定する。この方法の例を以下に提示す る。リボザイムの調製 粗製の合成リボザイム（一般に一度に３５０μｇ）を１５％変性ポリアクリル アミドゲル（厚さ０．７５ｍｍ、長さ４０ｃｍ）上で分離し、ＵＶシャドウイン グにより視覚化する。全長リボザイムを含有するゲルを切り取り、５ｍｌのゲル 溶離緩衝液（０．５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に一夜、４℃で撹 拌しながら浸漬する。溶出液をＣ−１８マトリックス（セプ−パック（Ｓｅｐ− Ｐａｋ）カートリッジ、ミリポア、マサチュセッツ州ミルフォード）上で脱塩し 、真空乾燥させる。乾燥したＲＮＡを５０−１００μｌのＴＥ（トリス１０ｍＭ ，ＥＤＴＡ １ｍＭ，ｐＨ７．２）に再懸濁する。この溶液のアリコートを１ｍ ｌのＴＥ中に１００倍に希釈し、その半量を用いてリボザイム溶液を分光測光方 により定量する。この希釈原液の濃度は一般に１５０−８００ｎＭである。変性 ポリアクリルアミドゲル上に単一バンドが存在することによりリボザイムの純度 が確認される。 リボザイムを２以上の部分に分けて合成することが有利であろう。リボザイム の各部分はごく限られた酵素的活性を示すか、または示さず、すべての部分が互 いにリゲーション（または他の形で並置）すると、活性は実質的に高まる。ハン マーへッドリボザイム合成の具体例を以下に示す。 本方法は、２つ（またはそれ以上）の比較的短い“半”リボザイムを合成し、 Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによりそれらを互いにリゲーションすることを伴う。たと えば３４ｍｅｒリボザイムを作成するためには、２つの１７ｍｅｒを合成し、１ つをリン酸化し、そして両者をゲル精製する。次いでこれらの精製された１７ｍ ｅｒを、２つの１７ｍｅｒに対して相補的なＤＮＡスプリント鎖にアニーリング する。このＤＮＡスプリントは、２つの１７ｍｅｒをそれぞれの１端が互いに隣 接する状態で配置するように設計された配列を有する。次いで並置されたＲＮＡ 分子をＡＴＰの存在下でＴ４ ＲＮＡリガーゼにより処理する。あるいは相補的 結合が２つのＲＮＡ分子のリゲーションに有利に作用する場合は、ＤＮＡスプリ ント鎖をリゲーション反応から省くことができる。次いでこうして形成された３ ４ｍｅｒ ＲＮＡをＨＰＬＣ精製することができる。基質の調製 約１０−３０ｐｍｏｌｅの未精製基質を、２５ｐｍｏｌｅの［γ−32Ｐ］ＡＴ Ｐを用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５′末瑞−放射性標識する。標 識混合物全体を２０％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグ ラフィーにより視覚化する。全長バンドを切り取り、１００μｌのＴＥ（１０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に一夜４℃で浸漬す る。速度論的反応 短い基質（８−１６塩基）を用いる反応のために、アッセイ用緩衝液（７５ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）中に、基質濃度が１ｎＭ未満になるように基質溶液を１×で調製する。リボザ イム溶液（一般に２０ｎＭ）をアッセイ用緩衝液中に１×で調製し、１×アッセ イ用緩衝液を用いて４種類の希釈液を調製する。各リボザイム希釈液（すなわち ２０、１６、１２、８および４ｎＭ）１５μｌを別個の試験管に装入する。これ らの試験管および基質試験管を、３７℃で少なくとも５分間プレインキュベート する。 １５μｌの基質をリボサイム試験管中へ迅速ピペッティングにより混入するこ とにより反応を開姶する（最終リボザイム濃度が１０、８、６、４、２ｎＭであ ることを留意する）。５μｌアリコートを１５秒または３０秒間隔で取り出し、 ５μｌの停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、キシレンシアノー ルおよびブロムフェノールブルー染料）で停止する。最終リボザイムの時点で残 りの基質のうちアリコートをゼロリボザイム対照として取り出す。 これらの試料を１５％または２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。各 ゲルを視覚化し、アンビス（Ａｍｂｉｓ）ベータスキャナー（アンビス・システ ムズ、カリフォルニア州サイディエゴ）で定量する。 大部分の活性リボザイムにつき、ＫmおよびＫcat値を測定するために速度諭的 分析を基質過剰で実施する。 長鎖ＲＮＡ基質（長さ１５塩基を越えるもの）を用いる速度諭的反応のために 、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７プロモーター、およびウイルスＲＮ Ａの適宜なヌクレオチドをコードするＤＮＡを含む特定のテンプレートを用いる 転写により、基質を調製する。基質溶液はアッセイ用緩衝液（７５ｍＭトリス− ＨＣｌ、ｐＨ７．６；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2）中に１× で調製され、５８ｎＭ濃度の長鎖ＲＮＡ分子を含有する。ゲル精製リボザイムを １μＭ濃度となるように添加することにより、反応を開始する。アリコートを２ ０、４０、６０、８０および１００分の時点で取り出し、次いで５μｌの停止液 の添加により停止する。変性ＰＡＧＥにより開裂生成物を分離する。バンドを視 覚化し、アンビスベータスキャナーで定量する。一例においては、ＨＳＶ−１ ＩＣＰ４ ｍＲＮＡのヌクレオチド１−４９３に対応する長鎖基質ＲＮＡ転写体 を、ｉｎ ｖｉｌｒｏでＴ７ ＲＮΛボリメラーゼにより、Ｔ７プロモーターお よびＩＣＰ４のＤＮＡコードヌクレオチド１−４９３を含むテンプレートから合 成する。速度論的分折 リボザイム仲介による開裂に関する簡単な反応メカニズムは： であり、式中のＲ＝リボザイム、Ｓ＝基質、およびＰ＝生成物である。四角で囲 んだ工程は基質過剰の場合にのみ重要である。リボザイム濃度は基質濃度より過 剰であるので、リボザイムー基質コンプレックス（［Ｒ：Ｓ］）の濃度はコンプ レックスが最初に形成されるごく短期間を除いて、経時的に一定である。すなわ ち： （ここでｔ＝時間）であり、従って： （Ｒ） （Ｓ）Ｋ1 ＝ （ＲＳ） （Ｋ2＋Ｋ1） である。反応速度は基質が経時的に消失する速度である： これらの式を置換すると： または となる。この式を時間収率につき積分すると： となり、ここでＳ0＝初期基質である。従って非切断基質画分の負の対数を時間 （分）に対してプロットすると、下記の勾配をもつ直線が得られる： ここでｋobs＝実測された速度定数である。勾配（ｋobs）をリボザイム濃度に対 してプロットすると、下記の勾配をもつ直線が得られる： これらの方程式を用いると、速度諭的実験より得られたデータからいずれの被 験リボザイムが最も有用であるか、すなわち活性であるかを判定するために必要 な情報が得られる。これらのリボザイムを選択し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ系で試験することがてきる。リポソームデリバリーべヒクル中でリボザ イムを調製する例を以下に示す。リポソームの調製 リポソームドラッグデリバリーべヒクル内にリボザイム分子を捕獲する例を以 下に示す。脂質分子を揮発性有機溶剤（ＣＨＣｌ3、メタノール、ジエチルエー テル、エタノールなど）に溶解した。有機溶剤を蒸発により除去した。この脂質 を０．１Ｔ：リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で水和懸濁し、次いで液体窒素 を用いて３回凍結乾燥し、室温でインキュベートした。懸濁液を順次０．４μｍ 、０．２μｍおよび０．１μｍのポリカーボネートフィルターから最大圧力８０ ０ｐｓｉ（約５６．２ｋｇ／ｃｍ2）で押出した。押出されたリポソーム懸濁液 とリボザイムを混合し、凍結乾燥した。この脂質／リボザイム粉末を水で元の容 量の１／１０に再水和した。懸濁液を押出しに必要な最小容量（１．５ｍｌのバ レルに対しては０．４ｍｌ、１０ｍｌのバレルに対しては１．５ｍｌ）に１×Ｐ ＢＳで希釈し、０．４μｍ、０．２μｍ、０．１μｍのポリカーボネートフィル ターから再度押出した。このリポソームに捕獲されたリボザイムを捕獲されてい ないリボザイムからゲル濾過クロマトグラフィー（セファロース ＣＬ−４Ｂ， バイオゲル Ａ５Ｍ）により分離した。リポソーム抽出物をプールし、０．２μ ｍフィルターで濾過することにより滅菌した。遊離リボザイムをプールし、エタ ノール沈殿により回収した。リポソーム濃度は放射性脂質の取り込みにより測定 された。リボザイム濃度は32Ｐで標識することにより測定された。ロッシ（Ross i）ら，1992（前掲）（およびそこに引用される参考文献）にリポソームを調製 するための他の方法が記載されている。 合成脂質誘導体、ジステアロイルホスファチヂルエチルアミドチオアセチルス クシンイミド（ＤＳＰＥ−ＡＴＳ）をジパルミトイルホスファチヂルコリンおよ びコレステロールと配合したものからなるリポソーム配合物を用いる実験におい て、本発明者らは直径１００−２００ｎｍのリポソームの取り込みを同様な速度 諭的状態で観察した。大きい粒子ほどより多数の捕獲分子、またはより大きな分 子量の分子、たとえば発現プラスミドを収容した。これらの粒子は供給された脂 質用量と蛍光の平均対数（リポソームの取り込みを迫跡するためにカルシンを用 いた）との間で直線関係を示した。２００μＭ用量についてすら細胞毒性は観察 されなかった。これらのリポソームはＣＤ４細胞集団へのデリバリーに特に有用 である。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ 選ばれたリボザイムの作用の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで、選ばれたウイルスに 対して感受性である細胞培養物を用いて、標準法により試験しうる。たとえばウ イルス感受性またはウイルス発現性細胞の単層培養物を、確立された方法で増殖 させる。細胞を６もしくは９６ウェル組織培養プレート中で、またはウイルス許 容細胞のラフト（ｒａｆｔ）培養物中で、先の報告に従って増殖させる。コパン （Kopan）ら，105 J.Cell Biol.427,1987。ウイルスに感染させる前に、培養物 を３−２４時間、リボザイム含有リポソームで処理する。次いで細胞をリン酸緩 衝生理的食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、ウイルスを１−１００ｐｆｕ／細胞の多重 度で添加する。１時間吸着させたのち、自由ウイルスをＰＢＳですすぎ去り、ウ イルスＲＮＡを分析用に採集する。あるいは細胞を３−５日間、適宜なリポソー ム調製物で新鮮な培地に交換して処理する。次いで細胞に新鮮な培地を再供給し 、再度インキュベートする。ウイルスは細胞から上層の培地中へ採集される。細 胞を−７０℃および３７℃で各温度につき３０分間の３サイクルのインキュベー ションにより破壊し、確立された方法を用いるプラクアッセイ法によりウイルス 力価を測定する。これらの方法は個々の被験ウイルスにつき変更することができ る。ウイルスＲＮＡはグアニジニウムイソチオシアネート法により採集すること ができ、得られたＲＮＡ調製物はＲＮａｓｅ保護アッセイ法により分析される。 あるいはトランスフォームされた細胞タイプ（たとえばＨＰＶ−１８ Ｅ６お よびＥ７ ｍＲＮΛの発現のためにはＨｅＬａ細胞、またはＨＰＶ−１８ Ｅ６ およびＥ７ ｍＲＮＡ／Ｖｅｒｏ細胞の発現のためにはＣａｓｋｉ細胞）を用い て、リボザイム調製物がＨＰＶ／ＨＳＶ ｍＲＮＡを開裂し、標的蛋白質の発現 を低下させる能力を評価する。リボザイムを含有するリポソーム調製物で細胞単 層を３−９６時間処理する。ＲＮＡ分析のためには、細胞をグアニジンイソチオ シアネート溶液で溶解し、ＲＮＡをＲＮａｓｅ保護アッセイ法により分析する。 蛋白質の定量のためには、当業者に既知の方法に従って細胞溶解物を調製し、抗 ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７／抗ＨＳＶ蛋白質特異性抗体を用いる免疫分析により蛋 白質を定量する。 ＨＢＶについては、細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、ＨＢ Ｖ ＤＮＡをリン酸カルシウム法により細胞内へトランスフエクトする。細胞を ３−５日間、適宜なリポソーム調製物で新鮮な培地に交換して処理する。ＨＣＶ については、全細胞ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート法により採集し、ウ イルスｍＲＮＡの量を定量し、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法によりリボザイ ム仲介による開裂を評価する。あるいは細胞溶解物を調製し、製造業者の指示に 従ってプロテインＡ−セファロースに吸着させたポリクローナル抗コア抗血清を 用いてウイルスのコア粒子を免疫沈殿させることができる。沈殿したコアをリボ ヌクレアーゼで処理して、キャプシド封入されていないＲＮＡを消化し、コア蛋 白質をプロデイナーゼＫ／フェノール抽出により消化する。通常は全ＲＮＡの半 量および抽出されたＲＮＡの半量をリボヌクレアーゼ保護アッセイ法により分析 する。リボザイムの安定性 選ばれたリボザイムをその安定性、従ってその潜在的有用性を調べるために、 試験することができる。このような試験は種々の化学的修飾（たとえばポリ（Ａ ）テイルの付加）がリボザイムの安定性に及ぼす影響を調べるためにも利用する ことができ、従ってより安定なリボザイムの選択の補肋となる。たとえば反応混 合物は１−５ｐｍｏｌｅの５′（キナーゼ処理）および／または３′標識リボザ イム、１５μｇの細胞質ゾル、および２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を全容量１００μ ｌ中に含有する。反応物を３７℃でインキュベートする。８μｌアリコートを一 定時間毎に取り出し、８μｌの停止混合物（２０ｍＭ ＥＤＴＡ，９５％ポルム アミド）と混合する。試料を１５％アクリルアミドゲル上で分離し、フィルムに 露光し、アンビス（Ａｍｂｉｓ）で走査する。 ３′標識リボザイムは、32Ｐ標識コルジセピンをポリ（Ａ）ポリメラーゼによ り３′ＯＨにおいて取り込ませることにより形成しうる。たとえばポリ（Ａ）ポ リメラーゼ反応物は、４０ｍＭトリス、ｐＨ８，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，２５０ ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＭｎＣｌ2；３μｌ 32Ｐコルジセピン，５００ Ｃｉ／ｍＭ；および６単位のポリ（Ａ）ポリメラーゼを全容量５０μｌ中に含有 する。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。塩基置換がリボザイム活性に及ぼす影響 いずれの一次構造特性がリボザイムによる基質の開裂を変化させるかを判定す るために、特異的リボザイムにより認識される基質開裂領域において塩基をわず かに変化させる。たとえば基質配列を中心の“Ｃ”ヌクレオチドにおいて変化さ せて、開裂部位をＧＵＣからＧＵＡモチーフに変化さぜることができる。次いで 各基質を用いた開裂についてのＫcat／Ｋm値を分析して、その変化がリボザイム 開裂速度を高めるか否かを判定する。リボザイム結合アームに対して相補的な塩 基を変化させる影響をアドレスするために、同様な実験を行うことができる。相 補的基質に対する強固な結合を維持することが予想される変化が好ましい。ヌク レオチド含量のわずかな変化が、結合強度のみに基づいて予想し得ない様式でリ ボザイム／基質の相互作用を変化させる可能性がある。リボザイムの触媒コア領 域の構造は、基質の構造、またはリボザイム／基質コンプレックスの三次元構造 のわずかな変化を認識する。 最適なリボザイム設計を姶めるために、種々のアーム長さを有するが、同じ長 さの短いＲＮＡ基質を標的とするリボザイムの開裂速度を調べることができる。 最小のアーム長さが必要であり、有効な開裂はリボザイム／基質の組み合わせに 応じて異なる。 選ばれたリボザイムの開裂活性は、ウイルスもしくはウイルス−相同ＲＮＡ基 質またはウイルスゲノムＲＮＡを用いて評価することができる。アッセイはリボ ザイム過剰で実施され、おおまかなＫcat／Ｋmin値が得られる。短い基質または 長い基質を用いて得られる数値を比較すると、ｉｎ ｖｉｖｏでのリボザイムの 有用性が示される。リポソームデリバリーによるリボザイムの細胞内安定性 選ばれたリボザイムのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を試験するためには、下記の試験 が有用である。リボザイムを32Ｐ末端標識し、リポソーム内に捕獲し、ウイルス 感受性細胞に３時間付与する。細胞を分画し、リボザイムをフェノール／クロロ ホルム抽出により精製する。細胞（１×１０7、Ｔ−１７５フラスコ）をフラス コの表面から掻き取り、低温のＰＢＳで２回洗浄する。細胞を４ｍｌのＴＥＳ（ １０ｍＭトリス、ｐＨ７．４，０．２５Ｍ 蔗糖，ｍＭ ＥＤＴＡ）で３５回ダ ウンシング（ｄｏｕｎｃｉｎｇ）することによりホモジナイズする。核を１００ ×ｇで１０分間ぺレット化する。細胞下小器官（膜画分）をＳＷ６０ローターに より２００，０００×ｇで２時間ぺレット化する。ペレットを１ｍｌのＨ緩衝液 （０．２５Ｍ 蔗糖，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。上清 液は細胞質画分を含有する（約３．７ｍｌ中に）。核ぺレットをＴＭ（５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４，２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）中の６５％蔗糖１ｍｌに再懸濁 し、蔗糖の段階濃度勾配（１ｍｌの６５％蔗糖ＴＭ中の核、１ｍｌの６０％蔗糖 ＴＭ、１ｍｌの５５％蔗糖ＴＭ、５０％蔗糖ＴＭ、３００μｌの２５％蔗糖ＴＭ ）上でＳＷ６０ローターにより３７，０００×ｇで１時間バンド形成させる。核 のバンドを採集し、ＴＭ緩衝液で１０％蔗糖となるように希釈する。核をＳＷ６ ０ローターにより３７，０００×ｇで１５分間ぺレット化し、ぺレットを１ｍｌ のＴＭ緩衝液に再懸濁する。アリコートを変性ポリアクリルアミドゲル上でサイ ズ分画し、細胞内局在を測定する。新規に合成されたリボザイムの移動率を比較 することにより、無傷のリボザイムを含有する種々の画分を測定することができ る。 細胞内でのリボザイム分子の半減期を延長する修飾を調べるために、細胞を上 記により分画し、それぞれの画分の純度をその画分に存在することが知られてい る酵素活性の評価により評価することができる。 種々の細胞画分を−７０℃で凍結し、修飾されたリボザイム分子の相対的なヌ クレアーゼ耐性の判定に利用する。リボザイム分子は５ホスホロチオエート（ｐ ｓ）により、または分子の各末端における２′−Ｏ−メチル（２′−ＯＭｅ）修 飾により合成することができる。これらの分子およびホスホジエステル型のリボ ザイムを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより32ＰおよびＡＴＰで末瑞標識す る。等濃度を細胞質抽出物に添加し、それぞれのアリコートを１０分間隔で採取 する。試料を変性ＰＡＧＥによりサイズ分画し、相対的なヌクレアーゼ耐性度を アンビス（Ａｍｂｉｓ）ベータスキャナーでゲルを走査することにより分析する 。それらの結果は、リボザイムが細胞質抽出物で消化されたか否か、またいずれ の型が相対的にヌクレアーゼ耐性が高いかを示す。短いＲＮＡ基質を用いた場合 、修飾されたリボザイムは一般に天然リボザイムの触媒活性の８０−９０％を保 持する。 非標識、５′末端標識、または３′末端標識リボザイムをアッセイに使用しう る。これらの実験は、所見を証明するためにヒト細胞抽出物を用いて実施するこ ともできる。リボザイムの投与 選ばれたリボザイムを予防的に、またはウイルス感染患者に、たとえば適宜な デリバリーべヒクル、たとえばリポソーム、制御放出べヒクルにより、イオント ホレシス、エレクトロポレーションもしくはイオン対合分子、または共有結合付 加物、あるいは他の薬理学的に許容されるデリバリー法を用いて、感染組織に外 的に付与することにより投与しうる。投与経路には、筋肉内、エアゾール、経口 （錠剤または丸薬の形）、局所的、全身的、眼内、腹腔内、および／または鞘内 （ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）が含まれる。リボザイムによる免疫化および／また はリボザイムのデリバリーのための発現べクターも適切である。特に有用なもの は、ＣＭＶ即時型プロモーターを発現べクター中に用いることである。このプロ モーターは上皮細胞を含めた多数の細胞タイプにおいて極めて良好な活性を示す ことが知られているからである。 選ばれたリボザイムの個々のデリバリー経路はリボザイムの用途に依存するで あろう。一般に各リボサイムについての個々のデリバリープログラムは、細胞内 局在、次いで効力の証明に関連した裸のリボザイムの取り込みに注目されるであ ろう。あるいは動物の器官または組織における、これらと同じ細胞へのデリバリ ーを追及することができる。取り込み試験には、デリバリーべヒクルまたは方策 に関係なく、細胞のオリゴヌクレオチド取り込みを評価するための取り込みアッ セイが含まれる。これらのアッセイは、取り込み後のリボザイムの細胞内局在を も測定し、最終的には標的配列を含む細胞コンパートメント（核および／または 細胞質）内の定常状態濃度の維持のための要件を確立する。次いで効力および細 胞毒性を調べる。毒性には細胞の生存性のみでなく、細胞の機能も含まれる。 採用しうるデリバリー法には下記のものが含まれる： ａ．リポソーム内に封入 ｂ．レトロウイルスベクターによる形質導入 ｃ．コレステロールとの併用 ｄ．大部分のｓｎＲＮＡまたは核蛋白質に見られる抗原結合部位または核標的 部位を利用した、核コンパートメントへの局在化 ｅ．ヌクレオチド誘導体を用いた、リボザイムの電荷の中和 ｆ．リボザイムを全身に分布させるための血液幹細胞の利用 本発明には、下記を含めた少なくとも３種類のデリバリー方策が有用である： リボザイムの修飾、粒子キャリヤー型ドラッグデリバリーべヒクル、およびレト ロウイルス発現べクター。大部分の小分子同様に非修飾リボザイムは、徐々にで はあるが細胞に取り込まれる。細胞の取り込みを高めるために、リボザイムは本 質的にはランダムに、その電荷を減少させ、ただし特異的な官能基を保持する様 式で修飾されていてもよい。これにより、細胞膜を越えて拡散することができ、 従って透過バリヤーが除かれる。 電荷を減少させるためのリボザイムの修飾は、細胞によるこれらの大型分子の 取り込みを高める１つの方法である。しかし、ランダムな方法は推奨できない。 リボザイムば小型の薬物より構造的および機能的に複雑だからである。リボザイ ムの触媒活性を維持するために必要な構造上の要件は当業者に周知である。細胞 へのデリバリーを高める修飾を設計する際には、これらの要件を考慮する。修飾 はヌクレアーゼ分解に対する感受性を低下させるためにも設計される。これらの 特性は双方ともリボザイムの効力を大幅に改良するであろう。リボザイム開裂活 性に必要なホスホジエステル結合を変化させることなしに、細胞による取り込み を数オーダ増大させることができる。 ホスフェート主鎖の化学的修飾は負の電荷を減少させ、これにより膜を越えた 自由拡散が可能になるであろう。この原理はアンチセンスＤＮＡ技術につき有効 であることが立証された。ＤＮＡとＲＮＡの化学組成の類似性が、これを実現可 能な方法にする。体内においては、組織細胞内への修飾リボザイムの拡散を駆動 させるために外部濃度の維持が必要であろう。罹患組織を一時的に高い濃度の薬 物に暴露し、これが徐々に全身吸着により消費されうる投与経路が好ましい。リ ボザイムの循環半減期を高めるように設計された薬物キャリヤーを用いる静脈内 投与を採用しうる。薬物キャリヤーのサイズおよび組成が、血流からの急速な消 失を制限する。感染部位に蓄積するように調製されたキャリヤーは、リボザイム を分解プロセスから保護しうる。 ドラッグデリバリーべヒクルは全身投与および局所投与の双方に有効であろう 。それらは徐放性レザバーとして作用するように、またはそれらの内容物を標的 細胞にデリバリーするように設計することができる。直接デリバリードラッグベ ヒクルを用いることの利点は、１回の取り込み当たり多数の分子がデリバリーさ れることである。これらのべヒクルは、さもなれば血流から急速に消失するであ ろう薬物の循環半減期を高めることが示された。このカテゴリーに属する特殊な ドラッグデリバリーべヒクルの若干例はリポソーム、ヒドロゲル、サイクロデキ ストリン、生物分解性ナノカプセル、、および生物吸着性マイクロスフェアであ る。 このカテゴリーに属するデリバリーシステムのうちではリポソームが好ましい 。リポソームは細胞内安定性を高め、取り込み効率を高め、かつ生物学的活性を 改良する。 リポソームは、細胞膜を構成する脂質と類似の様式で配列した脂質からなる中 空の球状小胞である。それらは水溶性化合物を閉じ込めるための内部水性空間を 備え、直径０．０５ミクロンから数ミクロンに及ぶサイズである。幾つかの研究 から、リポソームはＲＮＡを細胞へデリバリーすることができ、かつそのＲＮＡ は生物学的に活性な状態に維持されることが示された。 たとえば最初は研究道具として設計されたリポソームデリバリーべヒクルが無 傷のｍＲＮＡ分子を細胞へデリバリーし、これにより対応する蛋白質が産生する ことが示された。他の研究においては、長さ３，５００ヌクレオチドであり、Ｈ ＩＶの構造蛋白質に対してアンチセンスであるＲＮＡ分子を内包する、抗体を標 的とするリポソームデリバリーシステムが、ウイルスの増殖を配列特異的様式で 阻害した。その抗体は感染細胞をリポソームの標的にするだけでなく、感染細胞 によるリポソームのインターナライゼーションをもトリガーした。エンドサイト ーシスをトリガーすることは、ウイルスの阻害にとって有用である。最後に、リ ポソームによりデリバリーされたリボザイムはＨ９細胞（ＨＩＶ感受性細胞の一 例）内に濃縮され、かつそれらの細胞内での配列開裂により証明されるように機 能性であることが示された。比較的小さなリボザイム（長さ１４２ヌクレオチド 未満）を用いる他の細胞タイプへのリポソームデリバリーは、異なる細胞内局在 を示した。 リポソームは幾つかの利点をもたらす：それらは無毒性であり、生物分解性の 組成である；それらは長い循環半減期を示す；および組織を標的とするために、 それらの表面に認識分子を容易に結合させることができる。最後に、懸濁液また は凍結乾燥製品の状態のリポソーム系薬剤が経費的に有効に製造されることは、 許容しうるドラッグデリバリーシステムとしてこの技術が生き残りうることを証 明した。 他の制御放出ドラッグデリバリーシステム、たとえばナノ粒子およびヒドロゲ ルは、リボザイムの有効なデリバリーべヒクルであろう。これらのキヤリヤーは 化学療法薬および蛋白質系薬剤のために開発されたものであり、従ってリボザイ ムのデリバリーに適している。 リボザイムの局所投与は、最小の全身吸収において投与部位に局在濃縮を可能 にするので有利である。これによって罹患部位へのリボザイムのデリバリー方策 が簡単になり、毒性の程度が少なくなる。さらに、適用される材料の量が他の投 与経路に必要なものよりはるかに少ない。効果的なデリバリーのためには、リボ ザイムが感染細胞内へ拡散することが必要である。負の電荷を中和するためにリ ボザイムを修飾することが、透過に必要なすべてである。しかし電荷の中和が不 十分である場合、修飾されたリボザイムをリポソーム内に透過促進剤、たとえば アゾン（Ａｚｏｎｅ）またはオレイン酸と共に配合することができる。リポソー ムは修飾リボザイムおよび透過促進剤がリポソームから感染細胞内へ移行する徐 放性べヒクルであってもよく、またはリポソームのリン脂質が修飾リボザイムお よび透過促進剤と共に細胞へのデリバリーの促進に直接に関与することもできる 。場合により、リボザイムおよび透過促進剤の双方を徐放のための坐剤配合物中 に配合することができる。 リボザイムは全身的に投与することもできる。全身吸収は、薬物が血流中に蓄 積し、次いで全身に分布することを意味する。全身吸収を生じる投与経路には、 静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内、鞘内、および眼内投与が含まれる。これらの投 与経路はそれぞれリボザイムをアクセス可能な罹患組織にデリバリーする。皮下 投与は局所リンパ節中へ排液し、リンパネットワーク内を通って前進し、、循環 中へ進入する。循環中へ進入する速度は分子量またはサイズの関数であることが 示された。リポソームその他の薬物キャリヤーを用いると、リボザイムはリンパ 節に局在する。リボザイムを細胞内へ拡散するように修飾するか、またはリポソ ームが細胞への非修飾もしくは修飾リボザイムのデリバリーに直接関与すること もできる。この方法は特に、本発明の抗ＨＩＶ／ＨＴＬＶリボザイムを用いるエ イズ／Ｔ細胞の処置に有用である。 リボザイムをリンパ球およびマクロファージへデリバリーしうるリポソーム配 合物は、初期のエンテロウイルス複製部位が鼻咽喉および消化管のリンパ組織で ある場合にも有用である。リンパ球をリボザイム含有リポソームでコーティング すると、リボザイムはウイルス表面抗原を発現する感染細胞を標的とするであろ う。全血の研究により、この配合物は３７℃で８時間後に９０％までがリンパ球 に取り込まれることが示される。生物内分布および薬物動力学的予備研究によれ ば、静脈内投与の１時間後に組織のｇ当たり注射量の７０％が脾臓において得ら れた。 同様にエイズ療法において好ましいのは、オリゴヌクレオチドをリンパ珠およ びマクロファージへデリバリーしうるリポソーム配合物の使用である。このオリ ゴヌクレオチドデリバリーシステムは、感染した一次免疫細胞におけるＨＩＶ増 殖を阻害する。全血の研究により、この配合物は３７℃で８時問後に９０％まで がリンパ球に取り込まれることが示される。生物内分布および薬物動力学的予備 研究によれば、静脈内投与の１時間後に組織のｇ当たり注射量の７０％が脾臓に おいて得られた。この配合物は２つの理由から、抗エイズリボザイムのための卓 越したデリバリーベヒクルを提供する。第１に、Ｔヘルパーリンパ珠およびマク ロファージはウイルスに感染する一次細胞であり、第２に、皮下投与はリボザイ ムをリンパ節内の常在性ＨＩＶ感染リンパ球およびマクロファージへデリバリー する。次いでリポソームはリンパ系から排出され、循環系に進入し、脾臓に蓄積 し、ここでリボザイムが常在性リンパ球およびマクロファージへデリバリーされ る。 リボザイムをリンパ球およびマクロファージの表面と結合させうるリポソーム 配合物も有用である。これにより、マクロファージおよびリンパ球が感染細胞を 免疫的に認識する特異性を利用して、、ＨＩＶ感染細胞へのデリバリーが高めら れるであろう。全血の研究により、この配合物は３７℃で８時間後に９０％まで がリンパ球に取り込まれることが示される。生物内分布および薬物動力学的予備 研究によれば、静脈内投与の１時間後に組織のｇ当たり注射量の７０％が脾臓に おいて得られた。 ＥＢＶ療法において好ましいものは、オリゴヌクレオチドをリンパ球およびマ クロファージへデリバリーしうるリポソーム配合物である。このオリゴヌクレオ チドデリバリーシステムは、感染した一次免疫細胞におけるＥＢＶの増殖を阻害 する。全血の研究により、この配合物は３７℃で８時間後に９０％までがリンパ 球に取り込まれることが示される。生物内分布および薬物動力学的予備研究によ れば、静脈内投与の１時間後に組織のｇ当たり注射量の７０％が脾臓において得 られた。この配合物は２つの理由から、抗ＥＢＶリボザイムのための卓越したデ リバリーべヒクルを提供する。第１に、Ｔヘルパーリンパ球およびマクロファー ジはウイルスに感染する一次細胞であり、第２に、皮下投与はリボザイムをリン パ節内の常在性ＨＩＶ感染リンパ球およびマクロファージヘデリバリーする。次 いでリポソームはリンパ系から排出され、循環系に進入し、脾臓に蓄積し、ここ でリボザイムが常在性リンパ球およびマクロファージヘデリバリーされる。 Ｔ細胞性白血病療法において好ましいものは、オリゴヌクレオチドをリンパ球 およびマクロファージヘデリバリーしうるリポソーム配合物である。このオリゴ ヌクレオチドデリバリーシステムは、感染した一次免疫細胞におけるＨＴＬＶの 増殖を阻害する。全血の研究により、この配合物は３７℃で８時間後に９０％ま でがリンパ球に取り込まれることが示される。生物内分布および薬物動力学的予 備研究によれば、静脈内投与の１時間後に組織のｇ当たり注射量の７０％が脾臓 において得られた。この配合物は２つの理由から、抗ＨＴＬＶ−ＩまたはＩＩリ ボザイムのための卓越したデリバリーベヒクルを提供する。第１に、Ｔヘルパー リンパ球はウイルスに感染する一次細胞であり、第２に、皮下投与はリボザイム をリンパ節内の常在性ＨＴＬＶ感染リンパ球へデリバリーする。次いでリポソー ムはリンパ系から排出され、循環系に進入し、脾臓に蓄積し、ここでリボザイム が常在性リンパ球およびマクロファージへデリバリーされる。 リボザイムをリンパ球およびマクロファージへデリバリーしうるリポソーム配 合物は、初期のインフルエンザウイルス複製部位が鼻咽喉および呼吸系の組織で ある場合にも有用である。リンパ球をリボザイム含有リポソームでコーティング すると、リボザイムはウイルス表面抗原を発現する感染細胞を標的とするであろ う。全血の研究により、この配合物は３７℃で８時間後に９０％までがリンパ球 に取り込まれることが示される。生物内分布および薬物動力学的予備研究によれ ば、静脈内投与の１時間後に組織のｇ当たり注射量の７０％が脾臓において得ら れた。 リボザイムをリンパ球およびマクロファージの表面と結合させうるリポソーム 配合物も有用である。これにより、マクロファージおよびリンパ球が感染細胞を 免疫的に認識する特異性を利用して、ＨＳＶ感染細胞へのデリバリーが高められ るであろう。全血の研究により、この配合物は３７℃で８時間後に９０％までが リンパ球に取り込まれることが示される。生物内分布および薬物動力学的予備研 究によれば、静脈内投与の１時間後に組織のｇ当たり注射量の７０％が脾臓にお いて得られた。 腹腔内投与も循環系への進入をもたらし、この場合もリボザイムデリバリーベ ヒクルコンプレックスの分子量およびサイズが進入速度を制御する。 静脈内注射されたリボソームは肝臓、肺臓および脾臓内への蓄積を示す。この 蓄積が注射量の３０−４０％となるように組成およびサイズを調整することがで きる。残りは最高２４時間、血流中で循環した状態にある。 選ばれたデリバリー法により罹患細胞における細胞質蓄積が起こるので、最適 投与のためには分子はある程度のヌクレアーゼ耐性をもつべきである。核へのデ リバリーも採用しうるが、好ましさの程度は比較的低い。極めて好ましいデリバ リー法には、リポソーム（１０−４００ｎｍ）、ヒドロゲル、制御放出ポリマー 、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーション（ｅｘ ｖｉｖｏ 処置用）、および他の薬剤学的に適用しうるベヒクルが含まれる。用量は適応症 および投与経路に依存するが、１００−２００ｍｇ／体重ｋｇ／日であろう。処 置期間は病的症状の経過期間全体に及び、通常は少なくとも１４−１６日間、恐 らく連続的であろう。局所適用、眼内適用および膣内適用のためには、１日多数 回の投与が考慮される。投与回数は疾病へのデリバリーベヒクルおよび臨床試験 による有効性データに依存するであろう。 細胞内における療法水準のリボザイムの確立は、取り込みおよび分解の速度に 依存する。分解度を低下させるど、リボザイムの細胞内半減期が延長される。従 って化学的に修飾されたリボザイム、たとえばホスフェート主鎖の修飾、または ヌクレオチド類似体によるリボザイムの５′および３′末端のキャッピングを含 むものは、異なる投与形態を必要とするであろう。有用な系についての記載は前 記に引用した先行技術により提供され、それらすべてを本明細書に参考として引 用する。 本発明のリボザイムは、試料中の標的ＲＮＡの存在を特異的または非特異的に 検出するための診断用具としても有用である。すなわち試料中に標的ＲＮＡが存 在する場合、それはリボザイムによって特異的に開裂し、従ってより小型のＲＮ Ａ種として容易にかつ特異的に検出することができる。このような小型のＲＮＡ 種の存在は、試料中に標的ＲＮＡが存在することを指示する。実施例４６ ：ＨＩＶ ｔａｔリボザイム ｔａｔの５′エキソンは多数の潜在的開裂部位を含む。これらのうち１８、す なわち２ＧＣＵ部位、３ＧＵＡ部位、５ＡＵＣ部位、３ＵＣＣ部位、および５Ｃ ＵＣ部位をコンピューター折りたたみおよびＲＮａｓｅＨアッセイにより試験し 、リボザイム開裂に対するそれらのアクセス可能性を評価した。 下記様式の１３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの結合に対する各部位のアクセス可 能性の測定が選ばれた： （ａ）クローンＶ配列（このクローンはロッシ（Rossi）博士［シティー・オ ブ・ホープ・メディカル・センター；カリフォルニア州デュアルテ］により提供 され、ヌクレオチド１５１−３６６の５′ｔａｔエキソンを含む）の最初の４２ ５ヌクレオチドをルナフォールド（ＲＮＡＦＯＬＤ）４．０（一般に入手される プログラム）により折りたたんで、折りたたみドメイン、すなわちステムにより 閉じられた自己充足構造（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ）の存在につき調べた。 （ｂ）潜在的開裂部位それぞれにつき、その部位を含むドメインを折りたたん で、それが（ａ）部の場合と同様に折りたたまれることを確認し；次いでそのド メインを、開裂部位およびその周囲のヌクレオチド（全体で１１−１６ヌクレオ チド）に非対合状態を維持させながら再度折りたたんだ。これら２つの折りたた みにおける自由エネルギーの差を、リボザイムまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド が塩基対合するためにこの領域をメルトアウトするコストと解釈した。 （ｃ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドの長さは、−１７ないし−１８ｋｃａｌ／ｍ ｏｌｅの予想デルタ−Ｇ（結合）を与えるように調整された。従って全結合エネ ルギーの差は（ｂ）部で計算したエネルギー差に反映されると予想された。計算 値を表５に示す。 ［部位は開裂したホスフェートの５′側のヌクレオチドに関するものである］ 表５に挙げる１８の標的部位を標的とする１８のＤＮＡオリゴヌクレオチドを 作成した。約１００ｎＭのボディー標識ＲＮＡ転写体（クローンＶ）、０．０８ Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ（過剰のＲＮａｓｅＨ）、ならびに１ｍＭ、１０μＭま たは１μＭ ＤＮＡオリゴヌクレオチドの２×希釈液を用いて、ＲＮａｓｅＨ実 験を行った。結果を表６に示す。１８部位のうち８部位は、１０分間のインキュ ベーション後に５μＭで４０％以上の開裂を示した。最も活性の高い配列（Ｈ３ ３２，Ｈ３３７ｂ，Ｈ３５２，表６参照）に対する３種類のリボザイムを設計し た。 これら３種類のリボザイムを図３Ａ、ＢおよびＣに示し、それぞれＨＤＨ、ＨＥ ＨおよびＨＦＨと表示する。実施例４７ ：チオホスフェートを含むリボザイム この例の目的は、主鎖のある位置にホスフェートの代わりにチオホスフェート 置換体を含むリボザイムの活性を評価することであった。 ＨＩＶ−１ ｔａｔ遺伝子に対するリボザイムを、標準的なホスホルアミダイ ト化学を用いてＡＢＩ合成装置により合成した。ただし、チオホスフェートが主 鎖に取り込まれる工程で、標準的な酸化工程（ヨウ素を用いる）に代わりにビュ ーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）イオウ伝達試薬を用いた。脱保護および脱塩され たＲＮＡをゲル精製し、溶離し、配列決定して、その配列が適正であることを確 認した。末端標識ＲＮＡを同様にＨ２０２で処理した。これはチオホスフェート を含有する位置における開裂を優先的に促進する。 リボザイム活性を、短い（１２ヌクレオチド）末端標識基質ＲＮＡの開裂に対 して試験した。基質濃度は約１ｎＭであり；リボザイム濃度は５−１００ｎＭで あり；インキュベーションは３７℃で、７５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣ１2中において、２−４０分間であった。開 裂程度をゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により測定し、次いでＡＭＢＩＳにより定量 した。 これらのリボザイムを図４Ａ−４Ｇに示す。下記のリボザイムは本質的に１０ ０％の活性を示した：ｒ３７（非修飾）、ｒ３７ｓ２（５′アーム上の１チオ、 ３′アーム上の２チオ）、ｒ３７ｓ４（各アーム上の３チオ修飾）、ｓ３７Ａ（ ３′アーム上の３修飾）、ｓ３７Ｂ（３′アーム上の交互の３修飾）。 完全修飾されたリボザイムは若干の活性低下を示した。たとえばｓ３７Ｃ（基 質結合アーム上においてほとんど完全に修飾されている）は非修飾に対して３倍 の活性低下を示し、ｓ３７Ｄ（ステムＩ、ＩＩおよびＩＩＩにおいてチオ修飾） は非修飾に対して９倍の活性低下を示した。実施例４８ ：２′−Ｏ−メチル含有リボザイム ＡＢＩ合成装置により標準的なホスホルアミダイト化学を用いて、標準的なヌ クレオチドの代わりに２′−Ｏ−メチルホスホルアミダイトヌクレオチドを使用 して、リボザイムを作成した。リボザイム活性を上記の方法でＰＡＧＥ分析によ り測定した。 図５を参照すると、基質と塩基対合するすべての位置（ステムＩＩＩの５′側 のＡを除く）に２′−Ｏ−メチルを含むリボザイムを合成した。２′−Ｏ−メチ ルリボザイムに関するＫcat／Ｋmは、非修飾に関する４１×１０6ｍ-1ｍｉｎ-1 、およびチオホスフェート修飾リボザイムに関する３２×１０6と比較して、４ ４×１０6Ｍ-1ｍｉｎ-1であった。従って２′−Ｏ−メチルリボザイムは１００ ％の活性を保持する。実施例４９ ：ＩＣＰ４遺伝子標的に対応する短鎖基質ＲＮＡの開裂 基質／リボザイム対を前記に従って予想構造特性につき評価した。９種類の基 質／リボザイム対候補を、それらが基質ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで開裂する能 力につき、前記のリボザイム開裂アッセイ法により試験した。これら９種類のリ ボザイムのうち７種類はＩＣＰ４ ｍＲＮＡの５′末端を標的とし、２種類のリ ボザイムはこのｍＲＮＡの５′末端を標的とした。これらのリボザイムそれぞれ につき、アッセイ反応に基づいてｋcat、ｋmおよびｋcat／ｋm値（開裂定数）を 実験的に測定した。結果を表７に示す。これらのリボザイムのうち数種類につい てのｋcat／ｋm値は、本発明者らの研究室でＨＩＶ特異性ウイルスにつき最近観 察されたものより高い。リボザイムＧはこのアッセイにおいて極めて活性が高く 、約１×１０8Ｍ-1ｍｉｎ-1のｋcat／ｋm計算値であり、このアッセイを用いて 最高水準の活性が観察された。全般に高い水準の活性が観察されたことは、適正 な折りたたみおよびＧＵＣ開裂領域以外の因子がリボザイム−基質相互作用に影 響を及ぼずことを示唆する。 実施例５０：ＩＣＰ４遣伝子標的に対応する長鎖基質ＲＮＡの開裂 ３種類のリボザイムが約４９０ヌクレオチド長さの、前記により調製されたＩ ＣＰ４ ＲＮＡ基質（ＩＣＰ４のヌクレオチド１−４９３に対応する）の開裂を 触媒する能力を、前記のリボザイム開裂アッセイ法により測定した。アッセイは リボザイム過剰で実施され、おおまかなｋcat／ｋm値が計算された。結果を表８ に示す。比較のため、各リボザイムによる短鎖基質開裂の開裂定数も含まれる。 これらの結果は、長鎖基質の使用によって開裂活性は除かれるわけではないが 、一般にリボザイム開裂は短鎖基質に対する開裂活性と比較して低い速度で進行 することを示す。長鎖基質を使用する効果は５種類の被験リボザイム間で異なり 、これは異なる開裂部位のアクセス可能性および構造パラメーターは長鎖ＲＮＡ 基 質に関して提示された場合には予測不可能であることを示す。 ３種類のリボザイムすべてが、短鎖基質に対するそれらの活性と比較して長鎖 基質を触媒する能力が低いことを示した。２種類のリボザイム、リボザイムＡお よびＥは、長鎖基質ＲＮＡの開裂を触媒するに際して比較的有効であった。 これらの結果は、基質ＲＮＡの構造特性がリボザイムの触媒活性に影響を及ぼ す可能性があることを証明する。 実施例５１：ベロ細胞への安定なリボザイムのデリバリー リボザイムを前記に従って末端標識し、リポソームに封入し、ベロ細胞へデリ バリーした。細胞内リボザイムをフェノール／クロロホルム抽出により細胞画分 から精製し、アリコートを新たに合成されたリボザイム試料と共に変性ポリアク リルアミドゲル上でサイズ分画し、無傷リボザイムの細胞内位置を調べた。新た に合成されたリボザイムの移動率と比較することにより、細胞質画分のみが無傷 のリボザイムを含有することが認められた。細胞質画分から回収された無傷のリ ボザイムはリポソーム調製物中に封入されたものの割合は比較的低かったが、こ れらの結果はリボザイムをリポソームデリバリーベヒクルによって細胞質内へデ リバリーし、かつ安定に保持しうることを証明する。実施例５２ ：ヌクレアーゼ消化に対する高められた耐性を有する修飾リボザイム の合成 分子の各末端において５ホスホロチオエート（ＰＳ）または２′−Ｏ−メチル （２′−Ｏ−Ｍｅ）修飾された修飾リボザイムを合成し、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼにより32Ｐ−γＡＴＰで末端標識した。非修飾（ホスホジエステル）リ ボザイムを前記に従って合成し、同様に末端標識した。 培養ベロ細胞を前記に従って分画した。それぞれの画分の純度を、その画分中 に存在することが知られている酵素の活性をアッセイすることにより評価した。 表１０に示すように、試験したすべての酵素活性が主として適宜な細胞画分中に 見出され、許容しうる水準の純度であることが示された。細胞画分をヌクレアー ゼ耐性アッセイに使用するまで−７０℃に凍結した。 等濃度（１−２ｐｍｏｌｅ／１００μｌ）の非修飾およびＰＳまたは２′−Ｏ −Ｍｅ修飾リボザイムをベロ細胞の細胞質抽出物に添加し、３７℃で０−６０分 間インキュベートした。それぞれのアリコートを１０分間隔で採取し、変性ポリ アクリルアミドゲル（１５％）上での電気泳動によりサイズ分画した。ゲルをア ンビスベータスキャナーで走査することにより、相対的なヌクレアーゼ耐性の尺 度として相対的なリボザイム分解率を分析した。 本発明者らは、非修飾リボザイムは細胞質抽出物によって速やかに消化される が、ＰＳおよび２′−Ｏ−Ｍｅ修飾リボザイムはさほど速やかには消化されず、 従って相対的にヌクレアーゼ耐性がより高いことを見出した。ＰＳおよび２′− Ｏ−Ｍｅ修飾リボザイムはそれらの非修飾リボザイム対応物につき観察された触 媒活性の８０−９０％を保持し、ヌクレアーゼ消化に対する耐性がより良好であ り、従ってｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が延長されるであろう。この点で、ＰＳお よび２′−Ｏ−Ｍｅ修飾リボサイムは療法用として用いるために非修飾リボザイ ムに優る利点を有するであろう。 さらに本発明者らは、非標識、５′末端標識、および３′末端標識された非修 飾リボザイムにつきほぼ均等なヌクレアーゼ耐性アッセイ結果が得られることを 見出した。これはＰＳおよび２′−Ｏ−Ｍｅ修飾リボザイムにおいて観察された 放射能水準の損失が５′末端標識のリン酸化によるものではなく、むしろ細胞質 ヌクレアーゼによる分解を反映していることを示す。これはベロ細胞のヌクレア ーゼ活性の有意成分がエンドヌクレオリティック（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔ ｉｃ）な性質のものであり、従ってヌクレアーゼ耐性を最良のものにするために は、リボザイム分子の内部領域に同様な修飾を導入するのが望ましいことを示唆 する。実施例５３ ：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける単一塩基置換された基質のリボザイム開 裂 ＨＳＶ−１のＩＣＰ４遺伝子内の標的に対して特異的な非修飾リボザイムＩお よびＥを、前記に従って合成および精製した。 リボザイムＩが認識する基質開裂部位に単一ヌクレオチドの交換を取り入れた 。詳細には、基質配列ＣＣＧＧＧＧＧＵＣＵＵＣＧＣＧＣＧを中心のＣヌクレオ チドにおいて交換してＣＣＧＧＧＧＧＵＡＵＵＣＧＣＧＣＧとなし、従ってＧＵ Ｃ開裂部位がＧＵＡとなった。この修飾された基質を合成し、前記の開裂アッセ イ法を採用してリボザイムＩによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの開裂につき試験した。 リボザイムＩおよびＥが認識する基質ＲＮＡ中のリボザイム結合アームに対し て相補的な領域に、後記の表１１に示す単一ヌクレオチドの交換を取り入れた。 コンピューターによるリボザイム／基質折りたたみ分析から、これらの交換によ ってリボザイム／基質強度は保持されると予想された。このような修飾基質４種 類を合成し、それらの“天然”基質対応物と並行してリボザイムＩまたはＥによ るｉｎ ｖｉｔｒｏでの開裂につき試験した。 リボザイムＩを、それが基質開裂部位の単一塩基が異なる２種類の基質配列を 開裂する能力につき試験した。一方の基質はＩＣＰ４ ｍＲＮＡ配列のヌクレオ チド３５５０−３５６６に相当し、他方は開裂部位において単一塩基置換された 同じ配列に相当する。両基質の開裂に関するｋcat／ｋm値は、天然部位および修 飾された部位につきそれぞれ５．３×１０7Ｍ-1ｍｉｎ-1のおよび７．３×１０7 Ｍ-1ｍｉｎ-1である。これらの結果は、リボザイムＩがＧＵＣ部位を含む修飾さ れた方の基質の開裂において有意に有効であることを示す。従ってリボザイムＩ は“天然”ＩＣＰ４ ｍＲＮＡ標的を認識および開裂しうるだけでなく、開裂部 位の点突然変異を含む同じＩＣＰ４ ｍＲＮＡ標的をも認識および開裂しうる。 感染した宿主細胞内でウイルスＲＮＡの特定の開裂部位に自然突然変異が起こる 可能性はある。従ってリボザイムＩはその標的認識の多能性のため、特に良好な 療法用リボザイムとなりうる。これらの結果は、ＧＵＣ部位を含むＩＣＰ４ ｍ ＲＮＡ標的は好ましいリボザイム基質ではないとしても許容しうることをも示唆 する。 リボザイムＩおよびＥを、それらが相補的領域に単一ヌクレオチド修飾を含む 基質を開裂する能力についても試験した。表１１に示す結果は、両リボザイムが ヌクレオチド点突然変異を含む基質を認識し、かつ効果的に開裂しうることを示 す。これらの結果は、基質配列における比較的微小な変化が結合強度のみからは 予測されない形でリボザイム／基質相互作用に影響を及ぼす可能性があることを も示す。 実施例５４：リボザイムのアーム長さが開裂活性に及ぼす影響 比較的長い結合アームをもつリボザイムＥおよびＩの変異体を設計し、合成し 、それらの始原型リボザイムと共に、始原型が認識する基質の開裂につきリボザ イム開裂アッセイ法により試験した。 結果は表１１にまとめられ、効果的な開裂に必要な最小結合アッセイ長さがリ ボザイム毎に異なることを示す。これは、選ばれるリボザイムそれぞれをその構 造において個々に最適化する必要があることを示す。 実施例５５： 本発明者らは、感染ベロ細胞内におけるＨＳＶ ＩＣＰ４およびＩＣＰ２７ ｍＲＮＡの局在を測定するためにリボヌクレアーゼ保護アッセイ法を用いた。ウ イルスｍＲＮＡの＞８０％が感染の４時間後に感染細胞の細胞質内に存在するこ とが見出された。ＨＳＶ ＩＣＰ４ ｍＲＮＡ内の、ＲＮａｓｅＨアッセイにお いてアクセス可能な部位がその後の研究のために選ばれた。本発明者らは、リボ ザイム結合アームの変更が触媒活性に及ぼす影響を調べ、６ヌクレオチドの結合 アームを有するリボザイムを選んだ。これを分子ＲＰＩ １１９７と呼ぶ。本発 明者らはＲＰＩ １１９７が感染細胞からの細胞溶解物中においてＩＣＰ４ ｍ ＲＮＡを開裂する能力を調べ、添加したＲＰＩ １１９７により開裂されるＩＣ Ｐ４の量が経時的に増加し、予想された開裂生成物を与えることを見出した。リ ボザイムを細胞の細胞質ヘデリバリーするリポソーム配合物を用いて、２種類の リボザイム分子（ＲＰＩ １１９７およびＲＰＩ １２００［１１９７の２′− Ｏ−メチル置換型］）で細胞を前処理し、それらがウイルスＩＣＰ４ ｍＲＮＡ の細胞内水準を低下させ、ウイルスの複製を阻害する能力につき試験した。ＲＰ Ｉ １１９７およびＲＰＩ １２００はｍＲＮＡ水準をそれぞれ１０％および３ ６％低下させ、かつウイルス負荷をそれぞれ６％および１８％低下させることが 見出された。 ＲＮａｓｅＨアッセイ法によるＵＬ５転写体のアクセス可能部位についての初 期の試験から、転写体内の多数の領域がリボザイムの結合に対してアクセス可能 であることが証明された。本発明者らはＵＬ５ ＲＮＡの６２２ヌクレオチド領 域（領域Ｄ）を用いて、弱く、および強くアクセス可能な部位の両方を標的とす るリボザイムの開裂能を調べた。ＲＮＡのこのフラグメントにおけるリボザイム 舌性は、部位のアクセス可能性とリボザイムがそれらの部位において標的ＲＮＡ を開裂する能力との間に良好な相関を示すことが見出された。予備実験において 、ＲＮａｓｅＨアッセイの結果は、相補的核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）片を標的 ＲＮＡに結合させ、その混合物をゲルにより電気泳動してオリゴ／標的コンプレ ックスの形成を観察するゲル結合アッセイ法によっても模倣しうることが認めら れた。オリゴヌクレオチドの濃度を変更することにより、ＲＮＡのアクセス可能 領域、およびその領域に対するオリゴヌクレオチドの結合アフィニティーを判定 しうる。ＵＬ５ ＲＮＡ分子内の個々の部位における結合コンプレックスの強度 とそれらの部位におけるリボザイム活性との間に、良好な相関が認められた。 他の態様は以下の請求の範囲に包含される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/02 8615−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 7/00 8931−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ 8310−2Ｊ (31)優先権主張番号 ０７／８８２，７１３ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８２，７１４ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８２，８２３ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８２，８２４ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８２，８８６ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８２，８８８ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８２，８８９ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８２，９２１ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８２，９２２ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８３，８２３ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８３，８４９ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８４，０７３ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８４，０７４ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８４，３３３ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８４，４２２ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８４，４３１ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８４，４３６ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／８８４，５２１ (32)優先日 1992年５月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９２３，７３８ (32)優先日 1992年７月31日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９３５，８５４ (32)優先日 1992年８月26日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９３６，０８６ (32)優先日 1992年８月26日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９４８，３５９ (32)優先日 1992年９月18日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９６３，３２２ (32)優先日 1992年10月15日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９８７，１２９ (32)優先日 1992年12月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９８７，１３０ (32)優先日 1992年12月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９８７，１３３ (32)優先日 1992年12月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 マクスウィゲン，ジェイムズ・エイ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボウル ダー，ノウブル・コート 3234 (72)発明者 メイセジャク，デニス・ジー アメリカ合衆国コロラド州80220，デンヴ ァー，ナイアグラ・ストリート 1160 (72)発明者 ホレセク，ジェイムズ・ジェイ アメリカ合衆国オハイオ州44139，ソロン, クロムウェル・ドライブ 7373 (72)発明者 マモネ，ジェイ・アンソニー アメリカ合衆国オハイオ州44134，パーマ, タクシードウ・アヴェニュー 1107

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ピコルナウイルス、ｖｉｆおよびｎｅｆから選ばれる遺伝子における免疫 不全ウイルス、肝炎Ｂ型ウイルス、パピローマウイルス、エプスタイン−バール ウイルス、Ｔ細胞性白血病ウイルス、肝炎Ｃ型ウイルス、サイトメガロウイルス 、インフルエンザウイルス、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）よりなる 群から選ばれるウイルスの、またはそれらのウイルスによりコードされる、ゲノ ムＲＮＡ、またはｍＲＮＡ、またはｈｎＲＮＡを特異的に開裂させる活性を有す る酵素的ＲＮＡ分子。 ２．下記よりなる群から選ばれる遺伝子によりコードされるＲＮＡまたはｍＲ ＮＡを開裂させる、請求項１に記載の酵素的ＲＮＡ分子： ピコルナウイルスの５′側非翻訳領域およびプロテアーゼ遺伝子から選ばれる 領域； ヒト免疫不全ウイルスのｒｅｖ、ｔａｒ、ｖｐｒ、ｒｒｅ遺伝子および３′Ｌ ＴＲ領域、ならびに他の免疫不全ウイルスの均等な領域； 肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）の５′側１５００塩基； パピローマウイルスのＥ６、Ｅ７、Ｅ２およびＥ５領域； エプスタイン−バールウイルスのＲＡＺ、ＥＢＥＲ−１、ＥＢＥＲ−２、ＥＢ ＮＡ−１、−２、−３Ａ、−３Ｂ、−３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ−１、ＢＺ ＬＦ１およびＢＲＬＦ１領域； ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＳＴＬＶ−ＩおよびＢＬＶの領域； ＨＣＶの５′側非翻訳領域； ＣＭＶのｉｅ遺伝子領域； インフルエンザウイルスのＭ蛋白質を制御またはコードする領域、パンハンド ル構造に関与する５′および３′側領域または該構造に対して相補的な核酸、な らびにＰＢ１、ＰＢ２またはＰＡ蛋白質をコードする領域から選ばれる領域； ＨＳＶのＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＵＬ５、ＵＬ８、Ｕ Ｌ９、ＵＬ３０、ＵＬ４２、ＵＬ５３、ｇＢおよびｇＣから選ばれる遺伝子； ＨＴＬＶ−Ｉの５′ＬＴＲおよび３′ＬＴＲ ｔａｘ、ｒｅｘおよびｐｒｏ遺 伝子領域、ならびにＨＴＬＶ−ＩＩ、ＳＴＬＶ−ＩおよびＢＬＶの均等な遺伝子 領域； ＨＢＶのＳ蛋白質、コア蛋白質、Ｘ蛋白質またはＤＮＡポリメラーゼの発現を 制御する領域；ならびに ＣＭＶのｉｅ１、ｉｅ２、ＵＬ９７、ｇＢ、およびｇｃＩ、ｇｃＩＩ、ｇｃＩ ＩＩをコードする遺伝子から選ばれる遺伝子。 ３．ＲＮＡ分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項１に記載の酵 素的ＲＮＡ分子。 ４．ＲＮＡ分子がヘアピン、肝炎デルタウイルス、グループ１イントロン、ま たはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡモチーフのものである、請求項１に記載の酵素的ＲＮ Ａ分子。 ５．図６の配列番号１−１０、図７の配列番号１−５８、図８の配列番号１− ３３、図９の配列番号１−１０、図１０の配列番号１−３８、図１１の配列番号 １−２５、図１２の配列番号１−８、図１３の配列番号１−６７、図１４の配列 番号１−３２、および図１５の配列番号１−１１５のいずれかに示される配列を 開裂させる、請求項１に記載の酵素的ＲＮＡ分子。 ６．リボザイムが該遺伝子または領域のＲＮＡに対して相補的な５−２３塩基 を含む、請求項１−５のいずれか１項に記載の酵素的ＲＮＡ分子。 ７．リボザイムが該遺伝子または領域のＲＮＡに対して相補的な１０−１８塩 基を含む、請求項６に記載の酵素的ＲＮＡ分子。 ８．請求項１−５のいずれか１項に記載の酵素的ＲＮＡ分子を含有する哺乳動 物細胞。 ９．細胞がヒト細胞である、請求項８に記載の細胞。 １０．細胞がその細胞表面にＣＤ４受容体分子を有するＴ４リンパ球である、 請求項９に記載の細胞。 １１．請求項１−５のいずれか１項に記載の酵素的ＲＮＡ分子をコードする核 酸を、哺乳動物細胞内での該酵素的ＲＮＡ分子の発現が可能な状態で含む発現ベ クター。 １２．請求項１−５のいずれか１項に記載の酵素的ＲＮＡ分子を患者に投与す ることにより、ピコルナウイルス、ＨＢＶ、パピローマウイルス、Ｔ細胞性白血 病ウイルス、ＨＣＶまたはＨＣＶ遺伝子もしくはＨＣＶ遺伝子の一部の発現、Ｃ ＭＶ、インフルエンザウイルス、免疫不全ウイルス、ＥＢＶ、ＨＳＶよりなる群 から選ばれるウイルスにより起こる疾病を処置する方法。 １３．ピコルナウイルス、免疫不全ウイルス、肝炎Ｂ型ウイルス、パピローマ ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、Ｔ細胞性白血病ウイルス、肝炎Ｃ型 ウイルス、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイ ルスよりなる群から選ばれるウイルスに感染した細胞を、ウイルスの複製に必要 な、またはウイルスの蛋白質合成に必要な遺伝子またはｍＲＮＡを開裂させる活 性を有する酵素的ＲＮＡ分子と接触させる工程を含む、欠損性ウイルス粒子を産 生する方法。 １４．ｍＲＮＡがＨＳＶのＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、Ｕ Ｌ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ４２、ＵＬ５３、ｇＢおよびｇＣ遺伝子 の産物であり；あるいは核酸がピコルナウイルスの５′側非翻訳領域またはプロ テアーゼ中にあり；あるいは遺伝子がＨＩＶのｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｒもしくは ｒｅｖ遺伝子であり；あるいは核酸がＨＢＶの５′側１５００塩基中にあり；あ るいは遺伝子がＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＳＴＬＶ−ＩおよびＢＬＶのｔ ａｘ、ｒｅｘもしくはｐｒｏ遺伝子領域、または５′ＬＴＲもしくは３′ＬＴＲ 領域であり；あるいはｍＲＮＡがパピローマウイルスのＥ６、Ｅ７、Ｅ２または Ｅ５領域の産物であり；あるいは核酸がＨＣＶの５′側非翻訳領域中にあり；あ るいはｍＲＮＡがＥＢＶのＲＡＺ、ＥＢＥＲ−１、ＥＢＥＲ−２、ＥＢＮＡ−１ 、−２、−３Ａ、−３Ｂ、−３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＭＰ、ＬＭＰ−１、ＢＺＬＦ１ およびＢＲＬＦ１領域の産物であり；あるいは核酸がインフルエンザウイルスの ５′もしくは３′パンハンドル領域、該パンハンドル領域に対して相補的な３′ ｍＲＮＡ領域、またはＭ蛋白質をコードするｍＲＮＡから選ばれる、請求項１３ に記載の方法。 １５．ウイルスに感染した細胞とウイルスの複製に必要な遺伝子を開裂させる 活性を有する酵素的ＲＮＡ分子とを接触させることにより産生される、欠損性ウ イルス粒子。 １６．ヒトにおいて免疫反応を誘導し、または抗−ＨＢＶ／ＨＣＶ免疫グロブ リンの産生を誘導する方法であって、ＨＢＶ／ＨＣＶに感染した細胞とウイルス の複製に必要な遺伝子を開裂させる活性を有する酵素的ＲＮＡ分子とを接触させ ることにより産生される欠損性ウイルス粒子を投与する工程を含む方法。 １７．下記を含む１または２以上のべクター：分子内または分子間開裂活性を 有する第１リボザイムをコードする第１核酸配列、および分子間開裂性の酵素的 活性を有する第２リボザイムをコードする第２核酸配列を含み、第２核酸配列は 、第１リボザイムにより開裂して該ベクターによりコードされるＲＮＡから第２ リボザイムを放出させるＲＮＡをコードする他の核酸配列によってフランキング され；第１および第２核酸配列は同一核酸分子上にあってもよく、または別個の 核酸分子上にあってもよい。 １８．第１リボザイムにより開裂して該べクターによりコードされるＲＮＡか ら第２リボザイムを放出させるＲＮＡをコードする他の核酸配列によってそれぞ れフランキングされた、第２リボザイム、をコードする複数の第２核酸配列をべ クターが含む、請求項１７に記載の１または２以上のべクター。 １９．リボザイム発現べクターの調製方法であって： 分子内または分子間開裂活性を有する第１リボザイムをコードする核酸を含有 する１または２以上のべクターを調製し、 それらの二本鎖形態において、分子間開裂性の酵素的活性を有する第２リボザ イムをコードする、複数の一本鎖ＤＮＡを調製し、 これらの一本鎖ＤＮＡをアニーリングして部分二重らせんＤＮＡを形成し、そ して 部分二重らせんＤＮＡを処理して二重らせんＤＮＡを形成する 工程を含む方法。 ２０．下記を含む１または２以上のべクターを調製し；分子内または分子間開 裂活性を有する第１リボザイムをコードする第１核酸配列、 および分子間開裂性の酵素的活性を有する第２リボザイムをコードする第２核酸 配列を含み、第２核酸配列は、第１リボザイムにより開裂して該べクターにより コードされるＲＮＡから第２リボザイムを放出させるＲＮＡをコードする、他の 核酸配列によってフランキングされ；第１および第２核酸配列は同一核酸分子上 にあってもよく、または別個の核酸分子上にあってもよく、 第１および第２核酸配列を発現させて１または２以上のＲＮＡ転写体を産生さ せ、そして 第１リボザイムにより、第２リボザイムを含有する転写体から第２リボザイム を開裂させる 工程を含む、目的リボザイムの調製方法。 ２１．酵素的ＲＮＡ分子を高圧液体クロマトグラフィーカラムに導通すること により酵素的ＲＮＡ分子を精製する方法。 ２２．該方法が、酵素的活性ＲＮＡ分子を逆相ＨＰＬＣカラムに導通すること を含む、請求項２１に記載の方法。 ２３．酵素的ＲＮＡ分子が部分的にブロックされており、この部分的にブロッ クされた酵素的活性ＲＮＡ分子を逆相ＨＰＬＣカラムに導通して、それを他のＲ ＮＡ分子から分離する、請求項２２に記載の方法。 ２４．酵素的ＲＮＡ分子を逆相ＨＰＬＣカラムに導通したのち脱ブロックし、 そしてそれを上記の逆相ＨＰＬＣカラムと同じであってもよい第２の逆相ＨＰＬ Ｃカラムに導通して、酵素的ＲＮＡ分子を他の成分から分離する、請求項２３に 記載の方法。 ２５．ナトリウム、カリウムまたはマグネシウム塩の形の純粋な酵素的ＲＮＡ 分子。 ２６．ＸＸＵＨ／ＸＸヌクレオチド配列からなり、これらは強い二重らせん形 成塩基を含み、ＨはＵ、ＡまたはＣであり、斜線は開裂部位を表すものである部 位を選択する工程を含む、ハンマーへッドリボザイム標的部位を選択する方法。 ２７．リボザイムとその基質とのコンプレックスにより形成される内部ループ に最も近接した基質結合部分の可変位置に強い二重らせん形成塩基を有するハン マーヘッドリボザイムを選択する工程を含む、活性ハンマーヘッドリボザイムを 選択する方法。 ２８．酵素的ＲＮＡ分子中の最適アーム長さをアッセイする方法であって、該 分子と、ある基質ＲＮＡは各基質ＲＮＡが該分子と共に形成する塩基対の長さに おいて他と異なるものである複数の基質ＲＮＡとを、ＲＮＡ基質開裂条件下で接 触させ、そしてそれらの基質ＲＮＡの開裂速度を測定することを含む方法。 ２９．制限された水準のホスホルアミダイトにより、または短縮された結合時 間を用いて、いずれの工程においてもヌクレオチド塩基が付加されない場合にＲ ＮＡ配列がキャッピングされる条件下で、ＲＮＡ分子を合成することを含む、１ 組のＲＮＡ基質の調製方法。 ３０．ヌクレオチドの位置当たり少なくとも９５％の結合効率を得るのに十分 な第１濃度の試薬を使用し、次いでこの結合効率を得るのには不十分な第２濃度 の試薬または結合時間を使用してＲＮＡ分子を合成する工程を含む、１組の異な る長さのＲＮＡ分子を合成する方法。 ３１．第２濃度または結合時間が８０−９０％の結合効率を得るのに十分なも のである、請求項３０に記載の方法。 ３２．５′または３′ヘアピンを有するリボザイムを発現するのに適したリボ ザイム発現ベクターであって、該ヘアピンがエキソヌクレアーゼからリボザイム を保護し、または終止配列を提供し、またはｉｎ ｖｉｖｏでのリボザイム安定 性を高めるの適しているベクター。 ３３．リボザイムの３′末端にポリ（Ａ）テイルを有するリボザイムを発現す るのに適したリボザイム発現ベクター。 ３４．５′または３′へアピンを有するリボザイムを発現するのに適したリボ ザイム発現ベクターであって、該ヘアピンがエキソヌクレアーゼからリボザイム を保護し、または終止配列を提供し、またはｉｎ ｖｉｖｏでのリボザイム安定 性を高めるのに適しているベクター中へ、リボザイムをコードする核酸を挿入す る工程を含む、リボザイムの発現方法。 ３５．ベクターからリボザイムの３′末端において合成されるようにプラスミ ド中に位置するポリ（Ａ）テイルを有する発現ベクター中へ、リボザイムをコー ドする核酸を挿入する工程を含む、リボザイムの発現方法。 ３６．５′または３′ヘアピンを有するハンマーへッド型またはヘアピン型リ ボザイム。 ３７．へアピンが安定なテトラヌクレオチドループを含むＧＣに富むステムか らなる、請求項３６に記載のリボザイム。 ３８．ヘアピンがＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣ、ＧＣＧＣＵＵＣＧＧＣＧＣ、Ｇ ＧＡＧＧＡＡＡＣＵＣＣから選ばれる配列からなる、請求項３６に記載のリボザ イム。 ３９．ヘアピンが４−２０塩基対のステムおよび４−７ヌクレオチドのループ からなる、請求項３６に記載のリボザイム。 ４０．酵素的ＲＮＡ分子の合成方法であって：非ヌクレオチド塩基、または該 分子中の非修飾ヌクレオチド塩基に対して検出可能な状態で位置しうる修飾され たヌクレオチド塩基を用いて、かつそれを酵素的ＲＮＡ分子が開裂させて２部分 の酵素的ＲＮＡ分子を形成しうる基質部分を用いて、酵素的ＲＮＡ分子を形成す る工程を含む方法。 ４１．分子が開裂部位の５′側に余分な配列を含む肝炎デルタウイルスリボザ イムであり、これにより活性リボザイムと不活性リボザイムをサイズに基づいて 互いに分離しうる、請求項１に記載の方法。 ４２．修飾されたヌクレオチド塩基がチオホスフェートから形成され、これが 過酸化水素、過ヨウ素酸塩、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、およびヌクレオチド 塩基特異性ＲＮａｓｅよりなる群から選ばれる試薬の使用によって優先的に開裂 しうる、請求項４０に記載の方法。 ４３．修飾されたヌクレオチド塩基がメチルホスホネートの使用により形成さ れ、これを塩基特異性ＲＮａｓｅの使用により検出しうる、請求項４０に記載の 方法。 ４４．酵素的ＲＮＡ分子中において酵素的活性を失わせることなく修飾しうる １または２以上のヌクレオチド位置をスクリーニングする方法であって、いずれ かの内因性の酵素的ＲＮＡ開裂活性に対する、該活性により分子内開裂しうる様 式で結合した基質を有する分子集団を化学的に合成し、その際１または２以上の 分子中の１または２以上の塩基を修飾し；該ＲＮＡ分子集団を分子内開裂条件下 でインキュベートし；そして分子内開裂活性を失わせる修飾を判定する工程を含 む方法。 ４５．分子内開裂活性に影響を及ぼさないことが予め判定されたヌクレオチド 位置に塩基修飾を含みうる、さらに修飾されたＲＮＡ分子を合成する工程をさら に含む、請求項４４に記載の方法。 ４６．合成する工程および判定する工程が複数回反復される、請求項４５に記 載の方法。 ４７．修飾されたヌクレオチド塩基が２′−Ｏ−メチル、２′−フルオロ、２ ′−アミノ、または２′−デオキシを含む、請求項４０に記載の方法。 ４８．特定のＲＮＡ標的に対して活性であるリボザイムのｉｎ ｖｉｖｏ選択 方法であって： 各リボザイムが異なる基質結合アームを有する第１リボザイム集団を、該ＲＮ Ａ標的を含む第２細胞集団に導入し、そして 該ＲＮＡ標的において活性であるリボザイムを含有する細胞を同定する 工程を含む方法。 ４９．リボザイムが、５−８ヌクレオチドからなる少なくとも１つの基質結合 アームを有するハンマーヘッドリボザイムである、請求項４８に記載の方法。 ５０．リボザイム標的部位アクセス可能性を判定する方法であって： 標的ＲＮＡに対して相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡ−ＤＮＡ二 重らせんのＲＮＡを開裂させるのに適した物質の存在下にＲＮＡ開裂条件下で、 該標的ＲＮＡと接触させる 工程を含む方法。 ５１．式ＮＸＹＺＮの複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドを供給し、ここでＮは それぞれ長さ０−１２ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド配列であり、ＸＹ Ｚは特異的塩基配列であり、かつ該オリゴヌクレオチドが少なくとも８ヌクレオ チドを含む、請求項５０に記載の方法。 ５２．リボザイムによる開裂に対してアクセス可能なＲＮＡ領域を同定する方 法であって 開裂すべきＲＮＡに対して相補的な複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＲＮ Ａ−ＤＮＡ二重らせんのＲＮＡを開裂させるのに適した物質の存在下にＲＮＡ開 裂条件下で接触させ、その際ＤＮＡオリゴヌクレオチドは該ＲＮＡに複数の領域 でハイブリダイズすべく選ばれ；そしてリボザイムにとって最もアクセス可能な ＲＮＡ領域の位置を指示するものとしてＲＮＡの開裂を検出する 工程を含む方法。 ５３．ＤＮＡオリゴヌクレオチドが式ＮＧＡＮ、ＮＵＡＮ、またはＮＸＹＺＮ のものであり、ここでＮはそれぞれ長さ０−１２ヌクレオチドのいずれかの配列 であり、ＸＹＺはＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＵＡＡ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、 およびＵＡＵよりなる群から選ばれ、かつ該オリゴヌクレオチドが少なくとも８ ヌクレオチドの長さを有する、請求項５２に記載の方法。 ５４．２以上のリボザイム部分を供給し、これらの部分を互いにリゲーション して活性リボザイムを形成することを含む、酵素的活性を有するリボザイムの合 成方法。 ５５．それらの部分がＲＮＡリガーゼにより互いにリゲーションされる、請求 項５４に記載の方法。 ５６．リボザイムが３４−４０ヌクレオチドを有するハンマーヘッドリボザイ ムであり、かつ各部分が１５以上のヌクレオチドを含む、請求項５４に記載の方 法。 ５７．それらの部分が、各部分に対して相補的なＤＮＡ鎖にハイブリダイズさ れ、かつそのハイブリダイゼーションにより並置される、請求項５６に記載の方 法。 ５８．修飾リボザイムと同一基質を認識する非修飾リボザイムに比較してより 高い生物学的活性を有する修飾リボザイムの調製方法であって、これらの修飾リ ボザイムと非修飾リボザイムとは同一の酵素的部分を有し、修飾リボザイムの基 質結合アーム中に１または２以上の修飾された塩基を含む修飾リボザイムを形成 する工程を含む方法。 ５９．修飾された塩基が、アデノシン、グアノシン、シトシンまたはウラシル から選ばれるヌクレオチド塩基の化学構造中に、水素結合の強度を増大または低 下させることによりその塩基がそれの普通の相補的塩基と水素結合する能力に影 響を及ぼす修飾を有する、請求項５８に記載の方法。 ６０．特定のＲＮＡ標的に対して活性であるリボザイムのｉｎ ｖｉｖｏ選択 方法であって： 各リボザイムが異なる基質結合アームを有する第１リボザイム集団を第２細胞 集団に導入し； 該ＲＮＡ標的を第２細胞集団に付与し、そして 該ＲＮＡ標的において活性であるリボザイムを含有する細胞を同定する工程を 含む方法。 ６１．同定が、ＲＮＡ標的に結合した、またはＲＮＡ標的により制御されるレ ポーターＲＮＡの発現を検出することを含む、請求項６０に記載の方法。 ６２．ＲＮＡ標的において活性であるリボザイムを両栄養性レトロウイルスべ クター中へ再クローニングする、請求項６０に記載の方法。 ６３．式５′ＮＣＮＡ３′を有し、式中のＮがそれぞれリボザイム基質結合ア ームであるか、またはそれをコードし、Ｃがリボザイムの酵素的部分であるか、 またはそれをコードし、Ａがポリアデニル化配列であり；集団中の少なくとも１ つのＮがその各ベクターにおいて異なる、核酸分子の集団。 ６４．式が５′ＲＮＣＮＡＳ３′であり、式中のＲおよびＳが制限エンドヌク レアーゼ部位である、請求項６３に記載の集団。 ６５．式が５′ＲＬＮＣＮＬＡＬＳ３′であり、式中のＬがそれぞれ独立して 無であるか、あるいは核プロセシングシグナル、ＲＮＡ安定化シグナル、スプラ イシングシグナル、またはリボザイム分子の輸送もしくは安定性に影響を及ぼす 他のヌクレオチドシグナルであるか、またはそれらをコードする挿入領域である 、請求項６４に記載の集団。 ６６．式が５′ＲＬＣＮＬＡＬＳＨ３′であり、式中のＨが該Ｓの３′側を開 裂させるヘアピンリボザイムまたは肝炎デルタリボザイムであるか、またはそれ らをコードする、請求項６５に記載の集団。 ６７．式が５′ＤＲＬＣＮＬＡＬＳＥ３′であり、式中のＤおよびＥが該分子 の増幅をプライミングするために使用しうる、またはその相補体を該分子の増幅 をプライミングするために使用しうる特定のヌクレオチド配列である、請求項６ ５に記載の集団。 ６８．リボザイムおよび肝炎デルタウイルスリボザイムモチーフをコードし、 該モチーフが該リボザイムを含有するＲＮＡを開裂させうる、リボザイム発現ベ クター。
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