BR112014020824B1 - Lipídeo, partícula de lipídeo e composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

LIPÍDEO, PARTÍCULA DE LIPÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA INTRODUZIR UM AGENTE TERAPÊUTICO EM UMA CÉLULA. A presente invenção fornece composições e métodos para a distribuição de agentes terapêuticos a células. Em particular, estes incluem novos lipídeos catiônicos de trialquila e ácido nucleicopartículas de lipídeo que fornecem encapsulamento suficiente de ácidos nucleicos e distribuição eficaz do ácido nucleico encapsulado para células in vivo. As composições da presente invenção são altamente potentes, desse modo permitindo redução eficaz de uma proteína alvo específica em doses relativamente baixas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório US 61/602.990, depositado em 24 de fevereiro de 2012, que está incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO I. Campo da Invenção
[0002] A presente invenção se refere a novos lipídeos catiônicos de trialquila, partículas de lipídeo compreendendo um ou mais dos lipídeos catiônicos de trialquila, métodos para fazer as partículas de lipídeo e métodos para distribuir e/ou administrar as partículas de lipídeo (por exemplo, para tratar doença em mamíferos).
II. Descrição da Técnica Relacionada
[0003] Ácidos nucleicos terapêuticos incluem, por exemplo, RNA interferente pequeno (siRNA), microRNA (miRNA), oligonucleotídeos antissenso, ribozimas, plasmídeos e ácidos nucleicos imunoestimula- dores. Estes ácidos nucleicos agem via uma variedade de mecanismos. No caso de moléculas de RNA interferente, tal como siRNA e miRNA, estes ácidos nucleicos podem infrarregular níveis intracelulares de proteínas específicas por meio de um processo denominado Interferência de RNA (RNAi). Em seguida à introdução de RNA interferente no citoplasma da célula, estes constructos de RNA de fita dupla podem ligar a uma proteína denominada RISC. A fita senso do RNA interferente é deslocada do complexo RISC, proporcionando um modelo dentro da RISC que pode reconhecer e ligar mRNA com uma sequência complementar àquela do RNA interferente ligado. Tendo ligado o mRNA complementar, o complexo RISC cliva o mRNA e libera as fitas clivadas. RNAi pode fornecer infrarregulação de proteínas específicas tendo como alvo a destruição específica do mRNA corres- pondente que codifica para síntese de proteína.
[0004] As aplicações terapêuticas de RNAi são extremamente am plas, uma vez que constructos de RNA interferente podem ser sintetizados com qualquer sequência de nucleotídeos dirigida contra uma proteína alvo. Até hoje, constructos de siRNA demonstraram a capacidade de infrarregular especificamente proteínas alvo em ambos os modelos in vitro e in vivo. Além disso, constructos de siRNA atualmente estão sendo avaliados em estudos clínicos.
[0005] No entanto, dois problemas enfrentados atualmente por cons- tructos de RNA interferente são, em primeiro lugar, sua suscetibilidade à digestão de nuclease em plasma e, em segundo lugar, sua capacidade limitada para obter acesso ao compartimento intracelular onde eles podem ligar RISC quando administrados sistemicamente como moléculas de RNA interferente livres. Esses constructos de fita dupla podem ser estabilizados pela incorporação de lignates de nucleotídeo quimicamente modificados dentro da molécula, por exemplo, grupos fosfotioato. No entanto, tais ligantes quimicamente modificados fornecem apenas limitada proteção da digestão da nuclease e podem diminuir a atividade do constructo. A distribuição intracelular de RNA interferente pode ser facilitada pela utilização de sistemas transportadores, tal como polímeros, li- possomas catiônicos, ou pela fixação covalente de uma fração de colesterol à molécula. No entanto, sistemas de distribuição melhorados são necessários para aumentar a potência de moléculas de RNA interferente, tal como siRNA e miRNA, e para reduzir ou eliminar a exigência de ligan- tes de nucleotídeo modificados quimicamente.
[0006] Além disso, subsistem problemas com a capacidade limita da de ácidos nucleicos terapêuticos, tal como RNA interferente, atra-vessarem as membranas celulares (ver, Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta, 1197:95-1082 (1994)) e nos problemas associados com toxicidade sistêmica, tal como anafilaxia mediada por complemento, propriedades coaguladoras modificadas e citopenia (Galbraith et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des., 4:201-206 (1994)).
[0007] Para tentar melhorar a eficácia, os investigadores também empregaram sistemas veículos baseados em lipídeos para distribuir ácidos nucleicos terapêuticos quimicamente modificados ou não modificados. Zelphati et al. (J. Contr. Rel., 41:99-119 (1996)) descreve o uso de lipossomas aniônicos (convencionais), lipossomas sensíveis a pH, imunolipossomas, lipossomas fusogênicos e agregados lipídeo catiônico/antissenso. Da mesma forma, siRNA tem sido administrado sistemicamente em lipossomas catiônicos, e estas partículas de ácido nucleico de lipídeo foram relatadas como fornecendo infrarregulação melhorada de proteínas alvo em mamíferos, incluindo primatas não ser humanos (Zimmermann et al., Nature, 441: 111-114 (2006)).
[0008] Apesar deste progresso, ainda permanece uma necessidade na arte de composições de ácido nucleico terapêutico de lipídeo melhoradas que são adequadas para uso terapêutico geral. De preferência, estas composições encapsulariam ácidos nucleicos com alta eficiência, têm altas razões fármaco:lipídeo, protegem o ácido nucleico encapsulado de degradação e depuração no soro, são adequadas para distribuição sistêmica e fornecem distribuição intracelular do ácido nucleico encapsulado. Além disso, estas partículas de ácido nucleico-lipídeo devem ser bem toleradas e fornecer um índice terapêutico adequado, de modo que o tratamento do paciente em uma dose eficaz do ácido nucleico não seja associado com toxicidade significativa e/ou risco para o paciente.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] A presente invenção fornece novos lipídeos catiônicos (amino) de trialquila e partículas de lipídeo compreendendo estes lipídeos, os quais são vantajosos para a distribuição in vivo de ácidos nu- cleicos, assim como composições de ácido nucleico-partícula de lipídeo adequadas para uso terapêutico in vivo. A presente invenção também fornece métodos para fazer estas composições, assim como métodos para introduzir ácidos nucleicos em células usando estas composições, por exemplo, para o tratamento de várias condições de doença. A presente invenção também inclui todos os novos compostos e intermediários divulgados neste documento.
[00010] Como descrito no Exemplo 2 deste documento, lipídeos ca- tiônicos de trialquila da presente invenção são mais potentes, em um ensaio ApoB siRNA murino, do que lipídeos de outro modo idênticos tendo cadeias alquila mais longas.
[00011] Em um aspecto, a presente invenção fornece um lipídeo catiônico tendo uma Fórmula estrutural (I): X-A-Y-Z; (I) ou sais, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, em que: X é alquilamino; A é alquil C1 a C6 opcionalmente substituído, em que a dito alquila C1 a C6 opcionalmente substituído pode ser saturado ou insatu- rado, e em que A pode ou não pode estar presente; Y é selecionado do grupo consistindo em cetal, éster, car- bamato opcionalmente substituído, éter, e amida opcionalmente substituída; e Z é uma fração hidrofóbica consistindo em três cadeias alquila em que cada uma das cadeias alquila tem um comprimento de C8 a C11, em que cada uma das três cadeias alquila pode ser saturada ou insaturada, e em que cada uma das três cadeias alquila é opcionalmente substituída.
[00012] Com respeito aos lipídeos de Fórmula (I), exemplos representativos de grupos alquilamino incluem dimetilamino, dietilamino e etilmetilamino.
[00013] Novamente com respeito a lipídeos de Fórmula (I), um exemplo representativo de um substituinte opcional presente nos grupos carbamato e/ou amida é um grupo alquil saturado ou insaturado (por exemplo, C1-C6 alquil).
[00014] Novamente com respeito a lipídeos de Fórmula (I), um exemplo representativo de um substituinte opcional que pode estar presente em uma ou mais das três cadeias alquila da fração hidrofóbi- ca Z é um grupo hidroxila.
[00015] Novamente com respeito a lipídeos de Fórmula (I), será entendido que quando uma cadeia alquil da fração hidrofóbica Z contém uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas, então, essa cadeia alquil é denominada como insaturada.
[00016] Novamente com respeito a lipídeos de Fórmula (I), será entendido, para evitar dúvidas, que uma ou mais cadeias alquila da fração hidrofóbica Z pode incluir um grupo cicloalquil (por exemplo, um ciclopropil).
[00017] Novamente com respeito a lipídeos de Fórmula (I), será entendido que o termo "éster" inclui ésteres tendo a estrutura -C(=O)O- ou -OC(=O)-. O termo "amida" inclui amidas tendo a estrutura - C(=O)NR- ou -NR(=O)C-. O termo "carbamato" inclui carbamatos tendo a estrutura -OC(=O)NR- ou -NRC(=O)O-.
[00018] Lipídeos de Fórmula (I) são úteis, por exemplo, para fazer as partículas de lipídeo da invenção que são úteis, por exemplo, para distribuir agentes terapêuticos (por exemplo, moléculas de ácido nu- cleico biologicamente ativas, tal como siRNAs) para um mamífero (por exemplo, ser humano) em necessidade do mesmo.
[00019] Em algumas modalidades dos lipídeos de Fórmula (I), Z tem a fórmula:
Figure img0001
em que, R1, R2 e R3 são cada um independentemente sele-cionados do grupo consistindo em C8 a C11 alquila, em que cada um de R1, R2 e R3 pode independentemente ser saturado ou insaturado, e em que cada um de R1, R2 e R3 é opcionalmente substituído.
[00020] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma partícula de lipídeo compreendendo um ou mais dos lipídeos catiôni- cos acima de Fórmula I ou sais, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo. Em certas modalidades, a partícula de lipídeo ainda compreende um ou mais lipídeos catiônicos, tal como lipídeos neutros. Em certas outras modalidades, a partícula de lipídeo ainda compreende um ou mais lipídeos conjugados capazes de reduzir ou inibir agregação de partícula. Em modalidades adicionais, a partícula de lipídeo ainda compreende um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos.
[00021] Em certas modalidades, o componente de lipídeo não ca- tiônico da partícula de lipídeo pode compreender um fosfolipídeo, colesterol (ou derivado de colesterol), ou uma mistura dos mesmos. Em uma modalidade particular, o fosfolipídeo compreende dipalmitoilfosfa- tidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, o componente de lipídeo conjugado da partícula de lipídeo compreende um conjugado polietile- noglicol (PEG)-lipídeo. Em certos casos, o conjugado PEG-lipídeo compreende um conjugado PEG-diacilglicerol (PEG-DAG), um conjugado PEG-dialquiloxipropil (PEG-DAA) ou uma mistura dos mesmos. Em outras modalidades, o conjugado de lipídeo compreende um conjugado polioxazolina (POZ)-lipídeo, tal como um conjugado POZ-DAA.
[00022] Em algumas modalidades, o agente ativo ou agente terapêutico compreende um ácido nucleico. Em certos casos, o ácido nu- cleico compreende uma molécula de RNA interferente tal como, por exemplo, um siRNA, aiRNA, miRNA, dsRNA de substrato Dicer, shR- NA ou misturas dos mesmos. Em certos outros casos, o ácido nucleico compreende DNA de fita simples ou fita dupla, RNA ou um hibrido DNA/RNA tal como, por exemplo, um oligonucleotídeo antissenso, uma ribozima, um plasmídeo, um oligonucleotídeo imunoestimulador ou misturas dos mesmos.
[00023] Em outras modalidades, o agente ativo ou agente terapêutico é totalmente encapsulado dentro da porção lipídica da partícula de lipídeo, de modo que o agente ativo ou agente terapêutico na partícula de lipídeo seja resistente em solução aquosa a degradação enzimáti- ca, por exemplo, por uma nuclease ou protease. Em outras modalidades, a partícula de lipídeo é substancialmente não tóxica para mamíferos, tal como ser humanos.
[00024] Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) compreendendo: (a) um ou mais ácidos nucleicos, tal como moléculas de RNA interferente; (b) um ou mais lipídeos catiônicos de Fórmula I ou sais, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis, dos mesmos; (c) um ou mais lipídeos catiônicos; e (d) um ou mais lipídeos conjugados que inibem agregação de partículas.
[00025] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) compreendendo: (a) um ou mais ácidos nucleicos; (b) um ou mais lipídeos catiônicos de Fórmula I ou sais, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis, dos mesmos compreendendo de cerca de 50% em mol a cerca de 85% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) um ou mais lipídeos catiônicos compreendendo de cerca de 13% em mol a cerca de 49,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um ou mais lipídeos conjugados que inibem agregação de partículas compreendendo de cerca 0,5% em mol a cerca de 2% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00026] Em um aspecto desta modalidade, a partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) compreende: (a) um ácido nucleico; (b) um lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal, por exemplo, um sal farmaceutica- mente aceitável, do mesmo compreendendo de cerca de 52% em mol a cerca de 62% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) uma mistura de um fosfolipídeo e colesterol ou um derivado do mesmo compreendendo de cerca de 36% em mol a cerca de 47% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um conjugado PEG-lipídeo compreendendo de cerca de 1% em mol a cerca de 2% em mol do lipídeo total presente na partícula. Esta modalidade de partícula de ácido nucleico-lipídeo é geralmente denominada neste documento como a formulação "1:57". Em uma modalidade particular, a formulação 1:57 é um sistema de quatro componentes compreendendo cerca de 1,4% em mol de conjugado PEG-lipídeo (por exemplo, PEG2000-C-DMA), cerca de 57,1% em mol de lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo, cerca de 7,1% em mol de DPPC (ou DSPC) e cerca de 34,3% em mol de colesterol (ou derivados do mesmo).
[00027] Em outro aspecto desta modalidade, a partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) compreende: (a) um ácido nucleico; (b) um lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal, por exemplo, um sal farmaceutica- mente aceitável, do mesmo compreendendo de cerca de 56,5% em mol a cerca de 66,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) colesterol ou um derivado do mesmo compreendendo de cerca de 31,5% em mol a cerca de 42,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um conjugado PEG-lipídeo compreendendo de cerca de 1% em mol a cerca de 2% em mol do lipídeo total presente na partícula. Esta modalidade de partículas de ácido nucleico-lipídeo geralmente é denominada neste documento como a formulação "1:62". Em uma modalidade particular, a formulação 1:62 é um sistema de três componentes que é livre de fosfolipídeo e compreende cerca de 1,5% em mol de conjugado PEG-lipídeo (por exemplo, PEG2000-C-DMA), cerca de 61,5% em mol de lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo e cerca de 36,9% em mol de colesterol (ou derivados do mesmo).
[00028] Modalidades adicionais relacionadas às formulações 1:57 e 1:62 são descritas na Publicação PCT N.° WO 09/127060, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os propósitos.
[00029] Em outras modalidades, a presente invenção fornece partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) compreendendo: (a) um ou mais ácidos nucleicos; (b) um ou mais lipídeos catiônicos de Fórmula I ou II ou sais, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo compreendendo cerca de 2% em mol a cerca de 50% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) um ou mais lipídeos catiônicos compreendendo de cerca de 5% em mol a cerca de 90% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um ou mais lipídeos conjugados que inibem agregação das partículas compreendendo de cerca 0,5% em mol a cerca de 20% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00030] Em um aspecto desta modalidade, a partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) compreende: (a) um ácido nucleico; (b) um lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal, por exemplo, um sal farmaceutica- mente aceitável, do mesmo compreendendo de cerca de 30% em mol a cerca de 50% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) uma mistura de um fosfolipídeo e colesterol ou um derivado do mesmo compreendendo de cerca de 47% em mol a cerca de 69% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um conjugado PEG-lipídeo compreendendo de cerca de 1% em mol a cerca de 3% em mol do lipídeo total presente na partícula. Esta modalidade de partícula de lipídeo é geralmente denominada neste documento como a formulação "2:40". Em uma modalidade particular, a formulação 2:40 é um sistema de quatro componentes que compreende cerca de 2% em mol de conjugado PEG-lipídeo (por exemplo, PEG2000-C-DMA), cerca de 40% em mol de lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo, cerca de 10% em mol de DPPC (ou DSPC) e cerca de 48% em mol de colesterol (ou derivado do mesmo).
[00031] Em outras modalidades, a presente invenção fornece partículas de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP) compreendendo: (a) um ou mais ácidos nucleicos; (b) um ou mais lipídeos catiônicos de Fórmula I ou sais, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo compreendendo de cerca de 50% em mol a cerca de 65% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) um ou mais lipídeos ca- tiônicos compreendendo de cerca de 25% em mol a cerca de 45% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um ou mais lipídeos conjugados que inibem agregação de partículas compreendendo de cerca de 5% em mol a cerca de 10% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00032] Em um aspecto desta modalidade, a partícula de ácido nu- cleico-lipídeo compreende: (a) um ácido nucleico; (b) um lipídeo catiô- nico de Fórmula I ou um sal, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável, do mesmo compreendendo de cerca de 50% em mol a cerca de 60% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) uma mistura de um fosfolipídeo e colesterol ou um derivado do mesmo compreendendo de cerca de 35% em mol a cerca de 45% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um conjugado PEG-lipídeo compreendendo de cerca de 5% em mol a cerca de 10% em mol do lipídeo total presente na partícula. Esta modalidade de partícula de ácido nucleico- lipídeo geralmente é denominada neste documento como a formulação "7:54". Em certos casos, a mistura de lipídeo não catiônico na formulação "7:54" compreende: (i) um fosfolipídeo de cerca de 5% em mol a cerca de 10% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (ii) colesterol ou um derivado do mesmo de cerca de 25% em mol a cerca de 35% em mol do lipídeo total presente na partícula. Em uma modalida- de particular, a formulação 7:54 é um sistema de quatro componentes que compreende cerca de 7% em mol de conjugado PEG-lipídeo (por exemplo, PEG750-C-DMA), cerca de 54% em mol de lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo, cerca de 7% em mol de DPPC (ou DSPC) e cerca de 32% em mol de colesterol (ou derivado do mesmo).
[00033] Em outro aspecto desta modalidade, a partícula de ácido nucleico-lipídeo compreende: (a) um ácido nucleico; (b) um lipídeo ca- tiônico de Fórmula I ou um sal, por exemplo, um sal farmaceuticamen- te aceitável, do mesmo compreendendo de cerca de 55% em mol a cerca de 65% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) colesterol ou um derivado do mesmo compreendendo de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um conjugado PEG-lipídeo compreendendo de cerca de 5% em mol a cerca de 10% em mol do lipídeo total presente na partícula. Esta modalidade de partícula de ácido nucleico-lipídeo geralmente é denominada neste documento como a formulação "7:58". Em uma modalidade particular, a formulação 7:58 é um sistema de três componentes o qual é livre de fosfolipídeo e compreende cerca de 7% em mol de con-jugado PEG-lipídeo (por exemplo, PEG750-C-DMA), cerca de 58% em mol de lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo e cerca de 35% em mol de colesterol (ou derivado do mesmo).
[00034] Modalidades adicionais relacionadas com as formulações 7:54 e 7:58 são descritas no Pedido de Patente Publicado US2011/0076335, depositado em 30 de junho de 2010, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os propósitos.
[00035] A presente invenção fornece também composições farmacêuticas compreendendo uma partícula de lipídeo, tal como uma partícula de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP) e um veículo farma- ceuticamente aceitável.
[00036] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para introduzir um ou mais agentes terapêuticos, tal como ácidos nu- cleicos, em uma célula, o método compreendendo contatar a célula com uma partícula de lipídeo descrita neste documento (por exemplo, LNP). Em uma modalidade, a célula está em um mamífero e o mamífero é um ser humano.
[00037] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para a distribuição in vivo de um ou mais agentes terapêuticos, tal como ácidos nucleicos, o método compreendendo administrar a um mamífero uma partícula de lipídeo descrita neste documento (por exemplo, LNP). Em certas modalidades, as partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) são administradas por uma das seguintes rotas de administração: oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-articular, intralesional, intratraqueal, subcutânea e intradérmi- ca. Em modalidades particulares, as partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) são administradas sistemicamente, por exemplo, via rotas de administração enterais ou parenterais. Em modalidades preferidas, o mamífero é um ser humano.
[00038] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para tratar uma doença ou distúrbio em um mamífero em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) compreendendo um ou mais agentes terapêuticos, tal como ácidos nucleicos. Exemplos não limitantes de doenças ou distúrbios incluem uma infecção viral, uma doença ou distúrbio do fígado e câncer. De preferência, o mamífero é um ser humano.
[00039] Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar uma doença ou distúrbio do fígado administrando um ácido nucleico, tal como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) em partículas de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP), sozinho ou em combinação com um agente de redução de lipídeo. Exemplos de doenças e distúrbios do fígado incluem, mas não estão limitados a, dislipidemia (por exemplo, hiperlipidemias, tal como níveis de triglicerí- deos elevados (hipertrigliceridemia) e/ou níveis elevados de colesterol (hipercolesterolemia)), aterosclerose, doença cardíaca coronariana, doença arterial coronariana, doença cardiovascular aterosclerótica (CVD), doença do fígado gordo (esteatose hepática), metabolismo lipí- dico anormal, metabolismo anormal de colesterol, diabetes (incluindo diabetes Tipo 2), obesidade, doença cardiovascular e outros distúrbios relacionados ao metabolismo anormal. Exemplos não limitantes de agentes de redução de lipídeo incluem estatinas, fibratos, ezetimibe, tiazolidinodionas, niacina, beta-bloqueadores, nitroglicerina, antagonistas de cálcio e óleo de peixe.
[00040] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um método para abaixar ou reduzir níveis de colesterol em um mamífero (por exemplo, humano) em necessidade do mesmo (por exemplo, um mamífero com níveis de colesterol no sangue elevados), o método compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma partícula de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, uma formulação LNP) descrita neste documento compreendendo um ou mais RNAs interferentes (por exemplo, siRNAs) que têm como alvo um ou mais genes associados a doenças e distúrbios metabólicos. Em outra modalidade particular, a presente invenção fornece um método para abaixar ou reduzir níveis de triglicerídeos em um mamífero (por exemplo, humano) em necessidade do mesmo (por exemplo, um mamífero com níveis de triglicerídeos do sangue elevados), o método compreendendo administrar ao mamífero uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de uma partícula de ácido nucleico- lipídeo (por exemplo, uma formulação LNP) descrita neste documento compreendendo um ou mais RNAs interferentes (por exemplo, siR- NAs) que têm como alvo um ou mais genes associados a doenças e distúrbios metabólicos. Estes métodos podem ser realizados in vitro usando técnicas de cultura de tecido padrão ou in vivo administrando o RNA interferente (por exemplo, siRNA) usando qualquer meio conhecido na arte. Em modalidades preferidas, o RNA interferente (por exemplo, siRNA) é distribuído para uma célula do fígado (por exemplo, hepatócito) em um mamífero, tal como um ser humano.
[00041] Modalidades adicionais relacionadas ao tratamento de uma doença ou distúrbio do fígado usando uma partícula de lipídeo são descritas, por exemplo, no pedido PCT N.° PCT/CA2010/000120, depositado em 26 de janeiro de 2010, e Publicação de Pedido de Patente US 2006/0134189, as divulgações dos quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[00042] Em outras modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar distúrbio proliferativo de célula, tal como câncer, administrando um ácido nucleico, tal como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) em partículas de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP), sozinho ou em combinação com um fármaco de quimioterapia. Os métodos podem ser realizados in vitro usando técnicas de cultura de tecido padrão ou in vivo administrando o RNA interferente (por exemplo, siRNA) usando qualquer meio conhecido na arte. Em modalidades preferidas, o RNA interferente (por exemplo, siRNA) é distribuído para uma célula de câncer em um mamífero, tal como um ser humano, sozinho ou em combinação com um fármaco de quimioterapia. As partículas de ácido nucleico-lipídeo e/ou fármacos de quimioterapia também podem ser coadministradas com agentes convencionais hormonais, imunoterapêuticos e/ou radioterapêuticos.
[00043] Modalidades adicionais relacionadas ao tratamento de um distúrbio proliferativo de célula usando uma partícula de lipídeo são descritas, por exemplo, na Publicação PCT WO 09/082817, Publica- ção de Pedido de Patente US 2009/0149403 e Publicação PCT WO 09/129319, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00044] Em modalidades adicionais, a presente invenção fornece métodos para prevenir ou tratar uma infecção viral, tal como um are- navírus (por exemplo, Lassa vírus) ou infecção por filovírus (por exemplo, vírus Ebola, vírus Marburg, etc.) que causa febre hemorrágica ou uma infecção por hepatite (por exemplo, vírus da Hepatite C) que causa hepatite aguda ou crônica administrando um ácido nucleico, tal como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) em partículas de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP), sozinho ou em combinação com a administração de agentes convencionais utilizados para tratar ou melhorar a condição viral ou qualquer um dos sintomas associados com a mesma. Os métodos podem ser realizados in vitro usando técnicas de cultura de tecido padrão ou in vivo administrando o RNA interferente usando qualquer meio conhecido na arte. Em certas modalidades, o RNA interferente (por exemplo, siRNA) é distribuído para células, tecidos ou órgãos de um mamífero, tal como um ser humano, que estão infectados e/ou são suscetíveis a estarem infectados com o vírus da febre hemorrágica tal como, por exemplo, células do sistema retículo-endotelial (por exemplo, monócitos, macrófagos, etc.). Em certas outras modalidades, o RNA interferente (por exemplo, siRNA) é distribuído para células, tecidos ou órgãos de um mamífero, tal como um ser humano, que estão infectados e/ou são suscetíveis a estarem infectados com o vírus da hepatite tal como, por exemplo, células do fígado (por exemplo, hepatócitos).
[00045] Modalidades adicionais relacionadas com a prevenção ou o tratamento de uma infecção viral usando uma partícula de lipídeo são descritas, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US 2007/0218122, Publicação de Pedido de Patente US 2007/0135370 e Pedido PCT N.° PCT/CA2010/000444, intitulado "Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression", depositado em 19 de março de 2010, as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00046] As partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP), compreendendo um ou mais lipídeos catiônicos de Fórmula I ou sais, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis, dos mesmos, são particularmente vantajosas e adequadas para uso na administração de ácidos nucleicos, tal como RNA interferente, a um indivíduo (por exemplo, um mamífero tal como um ser humano), porque elas são estáveis em circulação, de um tamanho exigido para comportamento farmacodinâmico resultando em acesso a sítios extravasculares e são capazes de alcançar populações de células alvo.
[00047] Outros objetos, características e vantagens da presente invenção serão aparentes para aqueles versados na técnica a partir da seguinte descrição detalhada e figuras.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Introdução
[00048] A presente invenção é baseada, em parte, na descoberta de novos (amino) lipídeos catiônicos que fornecem vantagens quando usados em partículas de lipídeo para a distribuição in vivo de um agente ativo ou terapêutico, tal como um ácido nucleico para uma célula de um mamífero. Em particular, a presente invenção fornece composições de partícula de ácido nucleico-lipídeo compreendendo um ou mais dos novos lipídeos catiônicos aqui descritos que fornecem atividade elevada do ácido nucleico (por exemplo, RNA interferente) e tole- rabilidade melhorada das composições in vivo, resultando em um aumento significativo do índice terapêutico em comparação com composições de partícula de ácido nucleico-lipídeo descritas anteriormente.
[00049] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece novos lipídeos catiônicos que permitem a formulação de composições melhoradas para a distribuição in vitro e in vivo de RNA interferente, tal como siRNA. Aqui é mostrado que estas composições de partícula de lipídeo melhoradas são eficazes na infrarregulação (por exemplo, si- lenciamento) dos níveis de proteína e/ou níveis de mRNA de genes alvo. Além disso, é mostrado aqui que a atividade destas composições de partícula de lipídeo melhoradas é dependente da presença dos novos lipídeos catiônicos da invenção.
[00050] As partículas de lipídeo e as composições da presente invenção podem ser usadas para uma variedade de finalidades, incluindo a distribuição de agentes terapêuticos encapsulados ou associados (por exemplo, complexados), tal como ácidos nucleicos, para células, tanto in vitro como in vivo. Por conseguinte, a presente invenção ainda fornece métodos de tratar doenças ou distúrbios em um indivíduo em necessidade dos mesmos contatando o indivíduo com uma partícula de lipídeo que encapsula ou está associada a um agente terapêutico adequado, em que a partícula de lipídeo compreende um ou mais dos novos lipídeos catiônicos aqui descritos.
[00051] Conforme descrito neste documento, as partículas de lipídeo da presente invenção são particularmente úteis para a distribuição de ácidos nucleicos incluindo, por exemplo, moléculas de RNA interferente, tal como siRNA. Portanto, as partículas de lipídeo e as composições da presente invenção podem ser usadas para diminuir a expressão de genes alvo e proteínas tanto in vitro como in vivo contatando as células com uma partícula de lipídeo compreendendo um ou mais novos lipídeos catiônicos descritos neste documento, em que a partícula de lipídeo encapsula ou está associada a um ácido nucleico que reduz a expressão do gene alvo (por exemplo, um siRNA). Alternativamente, as partículas de lipídeo e as composições da presente invenção podem ser usadas para aumentar a expressão de uma proteína desejada tanto in vitro como in vivo contatando células com uma partícula de lipídeo compreendendo um ou mais novos lipídeos catiônicos descritos neste documento, em que a partícula de lipídeo encapsula ou está associada a um ácido nucleico que intensifica a expressão da proteína desejada (por exemplo, um plasmídeo codificando a proteína desejada).
[00052] Várias modalidades exemplares dos lipídeos catiônicos da presente invenção, partículas de lipídeo e composições compreendendo os mesmos e a sua utilização para distribuir agentes ativos ou terapêuticos, tal como ácidos nucleicos, para modular a expressão de gene e proteína, são descritas em mais detalhes abaixo.
II. Definições
[00053] Como usado aqui, os seguintes termos têm os significados atribuídos a eles, a menos que especificado em contrário.
[00054] O termo "cerca de" quando usado em conexão com a quantidade de um componente em uma partícula de lipídeo ou formulação da presente invenção engloba valores que são mais ou menos 5% da quantidade declarada do componente (por exemplo, cerca de 10% engloba valores de 9,5% a 10,5%). O termo "cerca de", portanto, também engloba valores que são mais ou menos 1%, 2%, 3% ou 4% da quantidade declarada do componente.
[00055] O termo "RNA interferente" ou o "RNAi" ou "sequência de RNA interferente" como usado neste documento inclui RNA de fita simples (por exemplo, miRNA maduro, oligonucleotídeo ssRNAi, oligo- nucleotídeo ssDNAi) ou RNA de fita dupla (isto é, RNA dúplex, tal como siRNA, dsRNA de substrato Dicer, shRNA, aiRNA ou pre-miRNA) que é capaz de reduzir ou inibir a expressão de um gene ou uma sequência alvo (por exemplo, mediando a degradação ou inibindo a tradução de mRNAs que são complementares à sequência de RNA interferente) quando o RNA interferente está na mesma célula que o gene ou a sequência alvo. RNA interferente, portanto, se refere ao RNA de fita simples que é complementar a uma sequência de mRNA alvo ou ao RNA de fita dupla formado por duas fitas complementares ou por uma fita única, auto-complementar. RNA interferente pode ter identidade substancial ou completa para o gene ou sequência alvo, ou pode compreender uma região de não combinação (isto é, um motivo de não combinação). A sequência de RNA interferente pode corresponder ao gene alvo de comprimento completo, ou uma subsequência do mesmo. De preferência, as moléculas de RNA interferente são sintetizadas quimicamente.
[00056] RNA interferente inclui "RNA interferente pequeno" ou "siRNA", por exemplo, RNA interferente de cerca 15-60, 15-50, ou 1540 (dúplex) nucleotídeos de comprimento, mais tipicamente cerca de 15-30, 15-25 ou 19-25 (dúplex) nucleotídeos de comprimento, e de preferência cerca de 20-24, 21-22, ou 21-23 (dúplex) nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cada sequência complementar do siRNA de fita dupla é de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 ou 19-25 nucleotí- deos de comprimento, de preferência cerca de 20-24, 21-22 ou 21-23 nucleotídeos de comprimento e o siRNA de fita dupla é de cerca de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 ou 19-25 pares de base de comprimento, de preferência cerca de 18-22, 19-20 ou 19-21 pares de base de comprimento). siRNA dúplex podem compreender pendenes 3' de cerca de 1 a cerca de 4 nucleotídeos ou cerca de 2 a cerca de 3 nu- cleotídeos e 5’ fosfato terminais. Exemplos de siRNA incluem, sem li-mitação, uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla montada a partir de duas moléculas de fita separadas, em que uma fita é a fita senso e a outra é a fita antissenso complementar; uma molécula de polinu- cleotídeo de fita dupla montada a partir de uma molécula de fita simples, onde as regiões de senso e antissenso estão ligadas por um li- gante à base de ácido nucleico ou não à base de ácidos nucleico; uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla com uma estrutura secundá- ria de grampo (hairpin) tendo regiões de senso e antissenso autocom- plementares; e uma molécula de polinucleotídeo de fita simples circular com duas ou mais estruturas de alça e um tronco tendo regiões senso e antissenso autocomplementares, onde o polinucleotídeo circular pode ser processado in vivo ou in vitro para gerar uma molécula de siRNA de fita dupla ativa.
[00057] De preferência, siRNA são sintetizados quimicamente. siRNA também pode ser gerado por clivagem de dsRNA mais longo (por exemplo, dsRNA maior que cerca de 25 nucleotídeos de comprimento) com a RNase III ou Dicer de E. coli. Estas enzimas processam o dsR- NA em siRNA biologicamente ativo (ver, por exemplo, Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002); Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:14236 (2002); Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1):4-6 (2003); Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003); Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001); e Robertson et al., J. Biol Chem., 243:82 (1968)). De preferência, dsRNA são de pelo menos 50 nucleotídeos a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotí- deos de comprimento. Um dsRNA pode ser tão longo quanto 1000, 1500, 2000, 5000 nucleotídeos de comprimento, ou mais. O dsRNA pode codificar para um transcrito de gene inteiro ou um transcrito de gene parcial. Em certos casos, siRNA pode ser codificado por um plasmídeo (por exemplo, transcrito como sequências que automaticamente dobram em dúplices com grampos (hairpin)).
[00058] Como usado aqui, o termo "motivo de não combinação" ou "região de não combinação" se refere a uma porção de uma sequência de RNA interferente (por exemplo, siRNA) que não tem 100% de complementaridade para sua sequência alvo. Um RNA interferente pode ter pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais regiões de não combinação. As regiões de não combinação podem ser contíguas ou podem ser separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais nucleotídeos. Os motivos ou regiões de não combinação podem com-preender um único nucleotídeo ou podem incluir dois, três, quatro, cinco ou mais nucleotídeos.
[00059] A frase "inibindo a expressão de um gene alvo" se refere à capacidade de um RNA interferente (por exemplo, siRNA), ou outro agente terapêutico, silenciar, reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo. Para examinar a extensão do silenciamento do gene, uma amostra de teste (por exemplo, uma amostra de células em cultura expressando o gene alvo) ou um mamífero de teste (por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano ou modelo animal, tal como um roedor (por exemplo, camundongo) ou um modelo de primata não ser humano (por exemplo, macaco)) é contatado com um RNA interferente (por exemplo, siRNA) que silencia, reduz ou inibe expressão do gene alvo. Expressão do gene alvo na amostra de teste ou no animal de teste é comparada à expressão do gene alvo em uma amostra de controle (por exemplo, uma amostra de células em cultura expressando o gene alvo) ou um mamífero de controle (por exemplo, um mamífero, tal co-mo um ser humano ou um modelo animal, tal como um roedor (por exemplo, camundongo) ou modelo de primata não ser humano (por exemplo, macaco)) que não é contatado com ou é administrado com o RNA interferente (por exemplo, siRNA). À expressão do gene alvo em uma amostra de controle ou um mamífero de controle pode ser atribuído um valor de 100%. Em modalidades particulares, silenciamento, inibição ou redução de expressão de um gene alvo é alcançado quando o nível de expressão de gene alvo na amostra de teste ou no mamífero de teste em relação ao nível de expressão de gene alvo na amostra de controle ou no mamífero de controle é de cerca de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 0%. Em outras palavras, o RNA interferente (por exemplo, siRNA) silencia, reduz ou inibe a expressão de um gene alvo por pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% em uma amostra de teste ou um mamífero de teste em relação ao nível de expressão de gene alvo em uma amostra de controle ou um mamífero de controle não contatado com ou não administrado com o RNA interferente (por exemplo, siRNA). Ensaios adequados para determinar o nível de expressão de gene alvo incluem, sem limitação, exame de níveis de proteína ou mRNA usando técnicas conhecidas daqueles de habilidade na arte, tais como, por exemplo, dot blots, Northern blots, hibridização in situ, ELISA, imunoprecipita- ção, função de enzima, bem como ensaios fenotípicos conhecidos daqueles de habilidade na arte.
[00060] Uma "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente ativo ou agente terapêutico, tal como um RNA interferente, é uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, por exemplo, uma inibição de expressão de uma sequência alvo em comparação com o nível de expressão normal detectado na ausência de um RNA interferente. Inibição de expressão de um gene alvo ou sequência alvo é alcançada quando o valor obtido com um RNA interferente em relação ao controle é de cerca de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 0%. Ensaios adequados para medir expressão de um gene alvo ou sequência alvo incluem, por exemplo, exame de níveis de proteína ou RNA usando técnicas conhecidas daqueles de habilidade na arte, tal como dot blots, Northern blots, hibridização in situ, ELISA, imunoprecipitação, função de enzima, bem como ensaios fenotípicos conhecidos daqueles de habilidade na arte.
[00061] Por "diminuir", "diminuição", "reduzir" ou "redução" de uma resposta imune por um RNA interferente queremos dizer uma diminuição detectável de uma resposta imune para um dado RNA interferente (por exemplo, um RNA interferente modificado) ou outro agente terapêutico. A quantidade de diminuição de uma resposta imune por um RNA interferente modificado pode ser determinada em relação ao nível de uma resposta imune na presença de um RNA interferente não modificado. Uma diminuição detectável pode ser de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, ou mais baixa que a resposta imune detectada na presença do RNA interferente não modificado. Uma diminuição na resposta imune para RNA interferente é tipicamente medida por uma diminuição na produção de citocina (por exemplo, IFNY, IFNα, TNFα, IL-6 ou IL-12) por uma célula respondente in vitro ou uma diminuição na produção de citocina nos soros de um indivíduo mamífero após administração do RNA interferente.
[00062] Como usado aqui, o termo "célula respondente" se refere a uma célula, de preferência uma célula de mamífero, que produz uma resposta imune detectável quando contatada com um RNA interferente imunoestimulador, tal como um siRNA não modificado. Células res- pondentes exemplares incluem, por exemplo, células dendríticas, ma- crófagos, células mononucleares do sangue periférico (PBMC), esple- nócitos e afins. Respostas imunes detectáveis incluem, por exemplo, produção de citocinas ou fatores de crescimento, tal como TNF-α, IFN- α, IFN-β, IFN-Y, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF e combinações dos mesmos. Respostas imunes detectáveis também incluem, por exemplo, indução de proteína induzida por interferon com mRNA de repetições de tetratricopeptídeo 1 (IFIT1).
[00063] "Identidade substancial" se refere a uma sequência que hi- bridiza a uma sequência de referência sob condições rigorosas, ou a uma sequência que tem uma identidade percentual especificada através de uma região especificada de uma sequência de referência.
[00064] A frase "condições rigorosas de hibridização" se refere a condições sob as quais um ácido nucleico hibridizará a sua sequência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas não a outras sequências. Condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um extenso guia para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para serem de cerca de 5-10°C mais baixas que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica a um pH de intensidade iônica definida. A Tm é a temperatura (sob intensidade iônica definida, pH e concentração de ácido nucleico) na qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à sequência alvo no equilíbrio (quando as sequências alvo estão presentes em excesso, na Tm, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio). Condições rigorosas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Para hibridação seletiva ou específica, um sinal positivo é de pelo menos duas vezes o fundamental, preferivelmente 10 vezes a hibridização fundamental.
[00065] Condições de hibridização rigorosas exemplares podem ser da seguinte forma: 50% de formamida, 5x SSC e 1% de SDS, incubação em 42°C, ou 5x SSC, 1% de SDS, incubação a 65°C, com lavagem em 0,2x SSC e 0,1% de SDS a 65°C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36°C é típica para a amplificação de baixo rigor, embora temperaturas de anelamento possam variar entre cerca de 32°C e 48°C, dependendo do comprimento do iniciador. Para amplificação PCR de alto rigor, uma temperatura de cerca de 62°C é típica, embora temperaturas de anelamento de alta rigorosidade possam variar de cerca de 50°C a cerca de 65°C, dependendo do comprimento e da es- pecificidade do iniciador. Condições de ciclo típicas para ambas as amplificações de alto e baixo rigor incluem uma fase de desnaturação de 90°C-95°C por 30 s a 2 min., uma fase de anelamento durando 30 s a 2 min. e uma fase de extensão de cerca de 72°C por 1 a 2 min. Protocolos e orientações para reações de amplificação de baixo e alto rigor são fornecidos, por exemplo, em Innis et al, PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. NY (1990).
[00066] Ácidos nucleicos que não hibridizam entre si em condições rigorosas ainda são substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam são substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos nucleicos tipicamente hibridizam em circunstâncias de hibridização moderadamente rigorosas. "Condições de hibridi- zação moderadamente rigorosas" incluem uma hibridização em um tampão de 40% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS a 37°C e uma lavagem em 1X SSC em 45°C. Uma hibridização positiva é de pelo menos duas vezes o fundo. Aqueles de habilidade comum prontamente reconhecerão que hibridização alternativa e condições de lavagem podem ser utilizadas para fornecer condições de rigor semelhantes. Orientações adicionais para a determinação de parâmetros de hibridi- zação são fornecidas em numerosas referências, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.
[00067] Os termos "substancialmente idênticos" ou "identidade substancial", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma percentagem especificada de nucleotídeos que são os mesmos (isto é, pelo menos cerca de 60%, de preferência pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade através de uma região especificada), quando comparados e alinhados para máxima correspondência através de uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição, quando o contexto indica, também se refere analogamente ao complemento de uma sequência. De preferência, a identidade substancial existe através de uma região que é pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 nucleotídeos de comprimento.
[00068] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência, à qual sequências teste são comparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de sequência, sequências teste e de referência são inseridas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência, em seguida, calcula as identidades de sequência percentuais para as sequências teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.
[00069] Uma "janela de comparação", como usada aqui, inclui referência a um segmento de qualquer uma de uma série de posições contíguas selecionadas do grupo consistindo em de cerca de 5 a cerca de 60, geralmente cerca de 10 a cerca de 45, mais geralmente cerca de 15 a 30, no qual uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois de as duas sequências serem otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na arte. Alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP,BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (suplemento de 1995)).
[00070] Exemplos não limitantes de algoritmos que são adequados para determinar identidade de sequência percentual e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são utilizados com os parâmetros descritos neste documento para determinar identidade de sequência percentual para os ácidos nucleicos da invenção. Software para realizar análises BLAST é publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Outro exemplo é um algoritmo de alinhamento global para determinar identidade de sequência percentual, tal como o algoritmo Needleman-Wunsch para alinhar sequências de proteína ou nucleotídeo (por exemplo, RNA).
[00071] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin e Al- tschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N)) a qual fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeo ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade de menor soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nu- cleico de referência for menor que cerca de 0,2, de mais preferência menor que cerca de 0,01 e de mais preferência menor que cerca de 0,001.
[00072] O termo "ácido nucleico" como usado neste documento se refere a um polímero contendo pelo menos dois desoxirribonucleotí- deos ou ribonucleotídeos em qualquer forma de fita simples ou dupla e inclui DNA e RNA. DNA pode ser na forma de, por exemplo, moléculas antissenso, DNA de plasmídeo, DNA pré-condensado, um produto PCR, vetores (P1, PAC, BAC, YAC, cromossomos artificiais), cassetes de expressão, sequências quiméricas, DNA cromossômico ou derivados e combinações destes grupos. RNA pode ser na forma de RNA interferente pequeno (siRNA), dsRNA de substrato Dicer, RNA de grampo (hairpin) pequeno (shRNA), RNA interferente assimétrico (aiRNA), microRNA (miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, RNA viral (vRNA), RNA multivalente (MV RNA) e combinações dos mesmos. Ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos contendo análogos de nu- cleotídeo conhecidos ou resíduos ou ligações de espinha dorsal modificada, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural e que têm propriedades de ligação semelhantes ao ácido nu- cleico de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, fosfonatos quiral- metila, 2'-O-metil ribonucleotídeos e peptídeo-ácidos nucleicos (PNAs). A menos que especificamente limitado, o termo engloba ácidos nuclei- cos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades semelhantes de ligação como o ácido nucleico de referência. Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico particular também implicitamente abrange variantes conservadoramente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degeneradas), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substitui- ções de códon degeneradas podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desóxi- inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem, 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). "Nucleotídeos" contêm um açúcar desoxirri- bose (DNA) ou ribose (RNA), uma base e um grupo fosfato. Nucleotí- deos são ligados juntos por meio dos grupos fosfato. "Bases" incluem purinas e pirimidinas, as quais incluem ainda compostos naturais ade- nina, timina, guanina, citosina, uracila, inosina e análogos naturais e derivados sintéticos de purinas e pirimidinas que incluem, mas não estão limitados a modificações que colocam novos grupos reativos tais como, mas não se limitando a, aminas, álcoois, tióis, carboxilatos e alquilhaletos.
[00073] O termo "gene" se refere a uma sequência de ácido nuclei- co (por exemplo, DNA ou RNA) que compreende sequências de codificação de comprimento parcial ou comprimento total necessárias para a produção de um polipeptídeo ou polipeptídeo precursor.
[00074] "Produto de gene", como usado aqui, se refere a um produto de um gene, tal como um transcrito de RNA ou um polipeptídeo.
[00075] O termo "lipídeo" se refere a um grupo de compostos orgânicos que incluem, mas não estão limitados a ésteres de ácidos graxos e são caracterizados por serem insolúveis em água, mas solúveis em muitos solventes orgânicos. Eles são geralmente divididos em pelo menos três classes: (1) "lipídeos simples" os quais incluem gorduras e óleos, bem como ceras; (2) "lipídeos compostos" os quais incluem fos- folipídeos e glicolipídeos; e (3) "lipídeos derivados", tal como esteroides.
[00076] O termo "partícula de lipídeo" inclui uma formulação de lipídeo que pode ser usada para distribuir um agente ativo ou agente terapêutico, tal como um ácido nucleico (por exemplo, um RNA interfe- rente), para um sítio de interesse alvo (por exemplo, célula, tecido, órgão e afins). Em modalidades preferenciais, a partícula de lipídeo da invenção é uma nanopartículas de lipídeo a qual tipicamente é formada de um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e, opcionalmente, um lipídeo conjugado que impede agregação da partícula. Em outras modalidades preferenciais, que podem ser chamadas de "partículas de ácido nucleico-lipídeo", o agente ativo ou agente terapêutico, tal como um ácido nucleico, pode ser encapsulado na porção de lipídeo da partícula, desse modo protegendo-a contra a degradação enzimática.
[00077] Como usado aqui, o termo "LNP" se refere a uma nanopar- tículas de lipídeo. Uma LNP representa uma partícula feita de lipídeo (por exemplo, um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e opcionalmente um lipídeo conjugado que impede a agregação da partícula), em que o ácido nucleico (por exemplo, um RNA interferente) é totalmente encapsulado dentro do lipídeo. Em certos casos, LNP são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, pois eles podem exibir tempos de vida em circulação estendidos em seguida a injeção intravenosa (i.v.), eles podem acumular em sítios distais (por exemplo, sítios fisicamente separados do sítio de administração), e eles podem mediar o silenciamento da expressão do gene alvo nestes sítios distais. O ácido nucleico pode ser complexado com um agente de condensação e encapsulado dentro de uma LNP conforme estabelecido na Publicação PCT WO 00/03683, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[00078] As partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP) tipicamente têm um diâmetro médio de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 90 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 70 a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 80 nm, ou cerca de 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, ou 150 nm e são substancialmente não tóxicas. Além disso, ácidos nucleicos, quando presentes nas partículas de lipídeo da presente invenção, são resistentes em solução aquosa a degradação com uma nuclease. Nanopartículas de lipídeo e seu método de preparação são divulgados em, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US 2004/0142025 e 2007/0042031, as divulgações das quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[00079] Como usado aqui, "encapsulado com lipídeo" pode se referir a uma partícula de lipídeo que fornece a um agente ativo ou agente terapêutico, tal como um ácido nucleico (por exemplo, um RNA interferente), encapsulamento completo, encapsulamento parcial ou ambos. Em uma modalidade preferencial, o ácido nucleico é totalmente encapsulado na partícula de lipídeo (por exemplo, para formar uma LNP).
[00080] O termo "conjugado de lipídeo" se refere a um lipídeo conjugado que inibe agregação de partículas de lipídeo. Tais conjugados de lipídeo incluem, mas não estão limitados a, conjugados PEG-lipídeo tais como, por exemplo, PEG acoplado a dialquiloxipropil (por exemplo, conjugados PEG-DAA), PEG acoplado ao diacilglicerois (por exemplo, conjugados PEG-DAG), PEG acoplado a colesterol, PEG acoplado a fosfatidiletanolaminas, e PEG conjugado com ceramidas (ver, por exemplo, Patente US 5.885.613), lipídeos de PEG catiônicos, conjugados polioxazolina (POZ)-lipídeo, oligômeros de poliamida (por exemplo, conjugados ATTA-lipídeo) e misturas dos mesmos. Exemplos adicionais de conjugados POZ-lipídeo são descritos na Publicação PCT WO 2010/006282. PEG ou POZ podem ser conjugados dire- tamente ao lipídeo ou podem ser ligados ao lipídeo via uma fração li- gante. Qualquer fração ligante apropriada para acoplar o PEG ou o POZ a um lipídeo pode ser usada incluindo, por exemplo, frações li- gantes não contendo éster e frações ligantes contendo éster. Em certas modalidades preferenciais, frações ligantes não contendo éster, tal como amidas ou carbamatos, são usadas. As divulgações de cada um dos documentos de patentes acima são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[00081] O termo "lipídeo anfipático" se refere, em parte, a qualquer material apropriado em que a porção hidrofóbica do material de lipídeo orienta para uma fase hidrofóbica, enquanto a porção hidrofílica orienta em direção à fase aquosa. Características hidrofílicas derivam da presença de grupos polares ou carregados, tal como carboidratos, fosfato, carboxílico, sulfato, amino, sulfidrila, nitro, hidroxila e outros grupos similares. Hidrofobicidade pode ser conferida pela inclusão de grupos apolares que incluem, mas não estão limitados a grupos de hidrocarboneto alifático saturados e insaturados de cadeia longa e tais grupos substituídos por um ou mais grupos aromáticos, cicloalifáticos ou heterocíclicos. Exemplos de compostos anfipáticos incluem, mas não estão limitados a fosfolipídeos, aminolipídeos e esfingolipídeos.
[00082] Exemplos representativos de fosfolipídeos incluem, mas não estão limitados a fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilse- rina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina e dilinoleoilfosfatidilco- lina. Outros compostos carentes de fósforo, tal como esfingolipídeo, famílias glicoesfingolipídeo, diacilglicerois e p-aciloxiácidos, também estão dentro do grupo designado como lipídeos anfipáitcos. Além disso, os lipídeos anfipáticos descritos acima podem ser misturados com outros lipídeos incluindo triglicerídeos e esterois.
[00083] O termo "lipídeos neutros" se refere a um número de espécies de lipídeos que existe seja em uma forma zwitteriônica não carregada ou neutra em um pH selecionado. Em pH fisiológico, tais lipídeos incluem, por exemplo, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrosídeos e diacil- glicerois.
[00084] O termo "lipídeo não catiônico" se refere a qualquer lipídeo anfipático, bem como qualquer outro lipídeo neutro ou lipídeo aniônico.
[00085] O termo "lipídeo aniônico" se refere a qualquer lipídeo que é carregado negativamente em pH fisiológico. Estes lipídeos incluem, mas não estão limitados a fosfatidilglicerois, cardiolipinas, diacilfosfati- dilserinas, ácidos diacilfosfatídicos, N-dodecanoil fosfatidiletanolami- nas, N-succinil fosfatidiletanolaminas, N-glutarilfosfatidiletanolaminas, lisilfosfatidilglicerois, palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG) e outros grupos modificadores aniônicos unidos a lipídeos neutros.
[00086] O termo "lipídeo hidrofóbico" se refere a compostos tendo grupos apolares que incluem, mas não estão limitados a grupos de hidrocarbonetos alifáticos saturados e insaturados de cadeia longa e tais grupos, opcionalmente, substituídos por um ou mais grupos aromáticos, cicloalifáticos ou heterocíclicos. Exemplos adequados incluem, mas não estão limitados a diacilglicerol, dialquilglicerol, N-N- dialquilamino, 1,2-diacilóxi-3-aminopropano e 1,2-dialquil-3- aminopropano.
[00087] O termo "fusogênico" se refere à capacidade de uma partícula de lipídeo, tal como uma LNP, fundir com as membranas de uma célula. As membranas podem ser a membrana plasmática ou membranas circundando organelas, por exemplo, endossomo, núcleo, etc.
[00088] Como usado aqui, o termo "solução aquosa" se refere a uma composição compreendendo no todo ou em parte, água.
[00089] Como usado aqui, o termo "solução de lipídeo orgânico" se refere a uma composição compreendendo no todo ou em parte, um solvente orgânico tendo um lipídeo.
[00090] "Sítio distal", como usado aqui, se refere a um sítio fisicamente separado que não está limitado a um leito capilar adjacente, mas inclui sítios amplamente distribuídos por todo o organismo.
[00091] "Estável em soro" em relação a partículas de ácido nuclei- co-lipídeo, tal como LNP, significa que a partícula não é degradada significativamente após exposição a um ensaio de soro ou nuclease que degradaria significativamente DNA ou RNA livres. Ensaios adequados incluem, por exemplo, um ensaio de soro padrão, um ensaio de DNAse ou um ensaio de RNAse.
[00092] "Distribuição sistêmica", como usada aqui, se refere à dis tribuição de partículas de lipídeo que leva a uma ampla biodistribuição de um agente ativo, tal como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) dentro de um organismo. Algumas técnicas de administração podem levar à distribuição sistêmica de certos agentes, mas não outros. Distribuição sistêmica significa que uma quantidade útil a, de preferência terapêutica, de um agente é exposta à maioria das partes do corpo. Obter ampla biodistribuição geralmente requer um tempo de vida no sangue tal que o agente não seja rapidamente degradado ou depurado (tal como por órgãos de primeiro passe (fígado, pulmão, etc.) ou por ligação de celular rápida, inespecífica) antes de alcançar um sítio de doença distal ao sítio de administração. Distribuição sistêmica de partículas de lipídeo pode ser por qualquer meio conhecido da arte incluindo, por exemplo, intravenoso, subcutâneo e intraperitoneal. Em uma modalidade preferencial, a distribuição sistêmica de partículas de lipídeo é por distribuição intravenosa.
[00093] "Distribuição local", como usada aqui, se refere a distribuição de um agente ativo, tal como um RNA interferente (por exemplo, siRNA), diretamente para um sítio alvo dentro de um organismo. Por exemplo, um agente pode ser distribuído localmente por injeção direta em um sítio de doença, tal como um tumor ou outro sítio alvo, tal como um sítio de inflamação, ou um órgão alvo, tal como o fígado, coração, pâncreas, rim e afins.
[00094] O termo "mamífero" se refere a qualquer espécie de mamífero, tal como um ser humano, camundongo, rato, cão, gato, hamster, porquinho-da-índia, coelho, gado e afins.
[00095] O termo "câncer" se refere a qualquer membro de uma classe de doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células aberrantes. O termo inclui todos os cânceres conhecidos e condições neoplásicas, sejam caracterizados como malignos, benignos, tecido macio ou sólido, e cânceres de todos os estágios e graus incluindo cânceres pré e pós-metastáticos. Exemplos de diferentes tipos de câncer incluem, mas não estão limitados a, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer retal, câncer anal, câncer do duto biliar, câncer do intestino delgado, câncer de estômago (gástrico), câncer esofágico; câncer de vesícula biliar, câncer pancreático, câncer de apêndice, câncer de mama, câncer ovariano; câncer cervical, câncer de próstata, câncer renal (por exemplo, carcinoma de célula renal), câncer do sistema nervoso central, glioblastoma, câncer de pele, linfomas, coriocarcinomas, cânceres de cabeça e pescoço, sarcomas osteogênicos e cânceres do sangue. Exemplos não limitantes de tipos específicos de câncer de fígado incluem carcinoma hepatoce- lular (HCC), câncer de fígado secundário (por exemplo, causado por metástase de algum outro tipo de célula de câncer não de fígado) e hepatoblastoma. Como usado aqui, um "tumor" compreende uma ou mais células cancerosas.
[00096] O termo "RNA Multivalente", abreviado como "MV RNA", se refere a um complexo de polinucleotídeo composto de pelo menos três polinucleotídeos, em que cada polinucleotídeo é hibridizado, ao longo de todo ou parte do seu comprimento, a pelo menos dois dos outros polinucleotídeos do complexo e em que um ou mais dos polinucleotí- deos opcionalmente incluem uma região de alvo que é capaz de hibri- dizar a uma sequência de ácido nucleico alvo. Cada polinucleotídeo pode ser, por exemplo, de 10 a 60 nucleotídeos de comprimento. A região(ões) de alvo dentro de um polinucleotídeo pode(m) ser ca- paz(es) de hibridizar a uma sequência de ácido nucleico alvo que é a mesma ou diferente da(s) sequência(s) de ácido nucleico alvo à(s) qual(is) a região(ões) alvo dos outros polinucleotídeos do complexo. Um RNA Multivalente pode ser sintetizado in vitro (por exemplo, por síntese química) ou, por exemplo, ele pode ser processado de um precursor dentro de uma célula viva. Por exemplo, um precursor pode ser um polinucleotídeo linear que inclui cada um dos polinucleotídeos do RNA Multivalente que é introduzido em uma célula viva e é clivado na mesma para formar um RNA Multivalente. O termo "RNA Multivalente" inclui tal precursor que se destina a ser clivado dentro de uma célula viva. O termo "RNA Multivalente" também abrange, a título de exemplo, os complexos de polinucleotídeo tripartite descritos, especifica-mente ou genericamente, no pedido de patente internacional publicado, tendo o número de pedido internacional PCT/US2010/036962.
I. Novos Lipídeos Catiônicos
[00097] A presente invenção fornece, entre outros, novos lipídeos ca- tiônicos (amino) que podem ser usados vantajosamente nas partículas de lipídeo aqui descritas para a distribuição in vitro e/ou in vivo de agentes terapêuticos, tal como ácidos nucleicos, para as células. Os novos lipídeos catiônicos da invenção têm as estruturas estabelecidas na Fórmula I aqui e incluem os (R) e/ou (S) enantiômeros dos mesmos.
[00098] Em algumas modalidades, um lipídeo da presente invenção compreende uma mistura racêmica. Em outras modalidades, um lipídeo da presente invenção compreende uma mistura de um ou mais diastereômeros. Em determinadas modalidades, um lipídeo da presente invenção é enriquecido em um enantiômero, tal que o lipídeo compreenda pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de excesso enantiomérico. Em certas outras modalidades, um lipídeo da presente invenção é enriquecido em um diastereô- mero, tal que o lipídeo compreenda pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de excesso diastereomérico. Em certas modalidades adicionais, um lipídeo da presente invenção é quiralmente puro (por exemplo, compreende um único isômero ótico). Em outras modalidades, um lipídeo da presente invenção é enriquecido em um isômero óptico (por exemplo, um isômero opticamente ativo), tal que o lipídeo compreenda pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de excesso isomérico. A presente invenção fornece a síntese dos lipídeos catiônicos de Fórmula I como uma mistura racêmica ou em forma opticamente pura.
[00099] Os termos "lipídeo catiônico" e "amino lipídeo" são usados intercambiavelmente aqui para incluir esses lipídeos e sais, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos tendo um, dois, três ou mais ácido graxo ou cadeias alquila graxas e um grupo de cabeça amino pH-titulável (por exemplo, um grupo de cabeça alquilamino ou dialquilamino). O lipídeo catiônico é tipicamente protonado (isto é, carregado positivamente) em um pH abaixo do pKa do lipídeo catiônico e é substancialmente neutro em um pH acima do pKa. Os lipídeos ca- tiônicos da invenção podem também ser denominados lipídeos catiô- nicos tituláveis.
[000100] O termo "sais" inclui qualquer complexo aniônico e catiôni- co, tal como o complexo formado entre um lipídeo catiônico divulgado neste documento e um ou mais ânions. Exemplos não limitantes de ânions são incluem ânions inorgânicos e orgânicos, por exemplo, hi- dreto, fluoreto, cloreto, brometo, iodeto, oxalato (por exemplo, he- mioxalato), fosfato, fosfonato, hidrogênio fosfato, di-hidrogênio fosfato, óxido, carbonato, bicarbonato, nitrato, nitrito, nitreto, bissulfito, sulfeto, sulfito, bissulfato, sulfato, tiossulfato, hidrogênio sulfato, borato, formato, acetato, benzoato, citrato, tartarato, lactato, acrilato, poliacrilato, fumarato, maleato, itaconato, glicolato, gluconato, malato, mandelato, tiglato, ascorbato, salicilato, polimetacrilato, perclorato, clorato, clorito, hipoclorito, bromato, hipobromito, iodato, um alquilsulfonato, um arilsulfonato, arseniato, arsenito, cromato, dicromato, cianeto, cianato, tiocianato, hidróxido, peróxido, permanganato e suas misturas. Em modalidades particulares, os sais dos lipídeos catiônicos divulgados neste documento são sais cristalinos. Em modalidades particulares, "sais" são "sais farmaceuticamente aceitáveis."
[000101] O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" se refere a sais farmaceuticamente aceitáveis de um composto, cujos sais são derivados de uma variedade de contraíons orgânicos e inorgânicos bem conhecidos na arte. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem ambos os sais metálicos (inorgânicos) e sais orgânicos incluindo, mas não se limitando a, aqueles listados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a edição, pág. 1418 (1985). Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, a título de exemplo somente, sais de ácidos inorgânicos, tal como cloridrato, sulfato, fosfato, difosfato, bromidrato e nitrato ou sais de um ácido orgânico, tal como malato, maleato, fumarato, tar- tarato, succinato, citrato, acetato, lactato, metanossulfonato, p- toluenossulfonato ou palmoato, salicilato e estearato. Da mesma forma cátions farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a sódio, potássio, cálcio, alumínio, lítio e amônio (especialmente sais de amônio com aminas secundárias). Sais particulares desta invenção pelas razões citadas acima incluem sais de potássio, sódio, cálcio e amônio.
[000102] O termo "alquila" inclui um hidrocarboneto alifático saturado de cadeia reta ou ramificado, não cíclico ou cíclico contendo de 1 a 24 átomos de carbono. Alquis de cadeia saturados representativos incluem, mas não se limitam a, metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n- hexila e semelhantes, enquanto alquis ramificados saturados incluem, sem limitação, isopropila, sec-butila, isobutila, tert-butila, isopentila e similares. Alquis cíclicos saturados representativos incluem, mas não estão limitados a, C3-8 cicloalquis descritos neste documento, enquanto alquis cíclicos insaturados incluem, sem limitação, C3-8 cicloalquenis descritos neste documento.
[000103] O termo "heteroalquila" inclui um hidrocarboneto alifático saturado de cadeia reta ou ramificado, não cíclico ou cíclico como definido acima tendo de cerca de 1 a cerca de 5 heteroátomos (isto é, 1, 2, 3, 4 ou 5 heteroátomos) tal como, por exemplo, O, N, Si e/ou S, em que o nitrogênio e os átomos de enxofre, opcionalmente, podem ser oxidados e o heteroátomo de nitrogênio, opcionalmente, pode ser qua- ternizado. O grupo heteroalquil pode ser fixado ao restante da molécula por meio de um átomo de carbono ou um heteroátomo.
[000104] O termo "alquila cíclica" inclui qualquer um dos grupos ci- cloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila e heterocicloalquenil subs-tituídos ou não substitituídos descritos abaixo.
[000105] O termo "cicloalquila" inclui um grupo alquila cíclica substituído ou não substitituído tendo de cerca de 3 a cerca de 8 átomos de carbono (isto é, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono) como vértices de anel. Grupos cicloalquila preferenciais incluem aqueles que têm de cerca de 3 a cerca de 6 átomos de carbono como vértices de anel. Exemplos de grupos C3-8 cicloalquila incluem, mas não se limitam a, ciclopropila, metil-ciclopropila, dimetil-ciclopropila, ciclobutila, metil- ciclobutila, ciclopentila, metil-ciclopentila, ciclohexila, metil-ciclohexila, dimetil-ciclohexila, cicloheptila e ciclo-octila, bem como outros grupos C3-8 cicloalquil substituídos.
[000106] O termo "heterocicloalquila" inclui um grupo alquila cíclica substituído ou não substitituído, conforme definido acima tendo de cerca de 1 a cerca de 3 heteroátomos como membros de anel selecionados do grupo consistindo em O, N, Si e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre, opcionalmente, podem ser oxidados e o heteroátomo de nitrogênio, opcionalmente, pode ser quaternizado. O grupo hetero- cicloalquil pode ser fixado ao restante da molécula por meio de um átomo de carbono ou um heteroátomo.
[000107] O termo "cicloalquenila" inclui um grupo alquenila cíclica substituído ou não substituído tendo de cerca de 3 a cerca de 8 átomos de carbono (isto é, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono) como vértices de anel. Grupos cicloalquenil preferidos são aqueles que têm de cerca de 3 a cerca de 6 átomos de carbono como vértices de anel. Exemplos de grupos C3-8 cicloalquenil incluem, mas não estão limitados a ciclopropenila, metil-ciclopropenila, dimetil-ciclopropenila, ciclo- butenila, ciclopentenila, ciclohexenila, cicloheptenila e ciclo-octenila, bem como outros grupos C3-8 cicloalquenil substituídos.
[000108] O termo "heterocicloalquenila" inclui um grupo alquenila cíclica substituído ou não substituído, conforme definido acima, tendo de cerca de 1 a cerca de 3 heteroátomos como membros de anel selecionados do grupo consistindo em O, N, Si e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre, opcionalmente, podem ser oxidados e o heteroá- tomo de nitrogênio, opcionalmente, pode ser quaternizado. O grupo heterocicloalquenil pode ser fixado ao restante da molécula por meio de um átomo de carbono ou um heteroátomo.
[000109] O termo "alcóxi" inclui um grupo da fórmula alquil-O-, em que "alquila" tem a definição dada anteriormente. Exemplos não limi- tantes de grupos alcóxi incluem metóxi etóxi, n-propóxi, iso-propóxi, n- butóxi, iso-butóxi, sec-butóxi e terc-butóxi.
[000110] O termo "alquenila" inclui um alquila, conforme definido acima, contendo pelo menos uma ligação dupla entre átomos de carbono adjacentes. Alquenis incluem ambos os isômeros cis e trans. Al- quenis de cadeia reta e ramificados representativos incluem, mas não estão limitados a etilenila, propilenila, 1-butenila, 2-butenila, isobutileni- la, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila, 2,3- dimetil-2-butenila e semelhantes. Alquenis cíclicos representativos são descritos acima.
[000111] O termo "alquinila" inclui qualquer alquil ou alquenila, conforme definido acima, que, além disso, contém pelo menos uma ligação tripla entre carbonos adjacentes. Alquinis de cadeia reta e ramificados representativos incluem, sem limitação, acetilenila, propinila, 1- butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-metil-1-butinila e similares.
[000112] O termo "arila" inclui um grupo hidrocarboneto tipicamente aromático poli-insaturado, que pode ser um anel simples ou anéis múltiplos (até três anéis) que são fundidos juntos ou ligados covalente- mente, e que, opcionalmente, carrega um ou mais substituintes, tal como, por exemplo, halogênio, trifluormetila, amino, alquila, alcóxi, al- quilcarbonila, ciano, carbamoila, alcoxicarbamoila, metilenodióxi, car- bóxi, alcoxicarbonila, aminocarbonila, alquilaminocarbonila, dialquila- minocarbonila, hidróxi, nitro e similares. Exemplos não limitantes de grupos aril substitituídos incluem fenila, naftila e bifenila. Exemplos de grupos aril substituídos incluem, mas não estão limitados, fenila, cloro- fenila, trifluormetilfenila, clorfluorfenila e aminofenila.
[000113] Os termos "alquiltio", "alquilsulfonil", "alquilsulfinila" e "arilsulfonila" incluem grupos tendo a fórmula -S-Ri, -S(O)2-Ri, -S (O)-Ri e -S(O)2Rj, respectivamente, em que Ri, é um grupo alquil como anteriormente definido e Rj é um grupo aril como anteriormente definido.
[000114] Os termos "alquenilóxi" e "alquinilóxi" incluem grupos tendo a fórmula -O-Ri, onde Ri é um grupo alquenil ou alquinila, respectivamente.
[000115] Os termos "alqueniltio" e "alquiniltio" incluem grupos tendo a fórmula -R-Sk, em que Rk é um grupo alquenil ou alquinila, respectivamente.
[000116] O termo "alcoxicarbonila" inclui um grupo tendo a fórmula - C(O)O-Ri, onde Ri é um grupo alquil conforme definido acima e em que o número total de átomos de carbono se refere às frações alquila e carbonil combinadas.
[000117] O termo "acila" inclui qualquer alquila, alquenil ou alquinila, em que o carbono no ponto de fixação é substituído por um grupo oxo, conforme definido abaixo. A seguir, estão exemplos não limitantes de grupos acil: -C(=O)alquila, -C(=O)alquenila e -C(=O)alquinila.
[000118] O termo "heterociclo" inclui um anel monocíclico de 5 a 7 membros, bicíclico de 7 a 10 membros, heterocíclico que é ou saturado, insaturado ou aromático, e que contém 1 ou 2 heteroátomos selecionados independentemente de nitrogênio, oxigênio e enxofre, e em que os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado, incluindo anéis bicíclicos nos quais qualquer um dos heterociclos acima é fundido a um anel de benzeno. O heterociclo pode ser fixado através de qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Heterociclos incluem, mas não estão limitados a heteroaris, conforme definidos abaixo, bem como morfolinila, pirrolidinonila, pirrolidinila, piperidinila, piperizinila, hidantoinila, valerolactamila, oxiranila, oxetanila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidropiranila, tetra-hidropiridinila, tetra-hidroprimidinila, tetra-hidrotiofenila, tetra- hidrotiopiranila, tetra-hidropirimidinila, tetra-hidrotiofenila, tetra- hidrotiopiranila e semelhantes.
[000119] O termo "heteroarila" inclui um heterociclo de 5 a 10 membros aromático que contém um, dois ou mais heteroátomos selecionados de nitrogênio (N), oxigênio (O) e enxofre (S). O heteroaril pode ser substituído em um ou mais átomos de carbono por substituintes, tal como, por exemplo, halogênio, alquila, alcóxi, ciano, haloalquil (por exemplo, trifluormetil), heterociclil (por exemplo, morfolinil ou pirroli- dinil) e similares. Exemplos não limitantes de heteroaris incluem piri- dinila e furanila.
[000120] O termo "halogênio" inclui flúor, cloro, bromo e iodo.
[000121] Os termos "alquila opcionalmente substituída", "alquila cíclica opcionalmente substituído", "alquenila opcionalmente substituída", "alquinila opcionalmente substituída", "acila opcionalmente substituída" e "heterociclo opcionalmente substituído" significam que, quando substituídos, pelo menos um átomo de hidrogênio é substituído por um substituinte. No caso de um substituinte "oxo" (=O), dois átomos de hidrogênio são substituídos. Exemplos não limitantes de substituintes incluem oxo, halogênio, heterociclo, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx e - SOnNRxRy, em que n é 0, 1 ou 2, Rx e Ry são os mesmos ou diferentes e são independentes hidrogênio, alquil ou heterociclo e cada um dos substituintes alquila e heterociclo pode ser substituído ainda por um ou mais de oxo, halogênio, -OH, -CN, alquila, -ORx, heterociclo, -NRxRy, - NR C(=O)R , -NR SO2R , -C(=O)R , -C(=O)OR , -C(=O)NR R , -SOnR e -SOnNRxRy. O termo "opcionalmente substituído," quando usado antes de uma lista de substituintes, significa que cada um dos substituin- tes na lista pode ser opcionalmente substituído conforme descrito neste documento.
[000122] Em um aspecto, a presente invenção fornece um lipídeo catiônico tendo uma Fórmula estrutural (I): X-A-Y-Z; (I) ou sais do mesmo, em que: X é alquilamino; A é C1 a C6 alquila opcionalmente substituída, onde o refe- rido C1 a C6 alquila opcionalmente substituída pode ser saturado ou insaturado, e em que A pode ou não estar presente; Y é selecionado do grupo consistindo em cetal, éster, car- bamtato opcionalmente substituído, éter e amida opcionalmente substituída; e Z é uma fração hidrofóbica consistindo em três cadeias al-quila em que cada uma das cadeias alquila tem um comprimento de C8 a C11, em que cada uma das três cadeias alquila pode independente-mente ser saturada ou insaturada e em que cada uma das três cadeias alquila é substituída opcionalmente.
[000123] Em algumas modalidades dos lipídeos de Fórmula (I), Z tem a fórmula:
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em que, R1, R2 e R3 são cada um selecionados indepen-dentemente do grupo consistindo em C8 a C11 alquil; em cada um de R1, R2 e R3 pode independentemente ser saturado ou insaturado; e em cada um de R1, R2 e R3 é opcionalmente substituído.
[000124] Em modalidades particulares, um lipídeo de Fórmula (I) tem uma das seguintes estruturas:
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[000125] Em algumas modalidades, os lipídeos catiônicos formam um sal (por exemplo, um sal cristalino) com um ou mais ânions. Em uma determinada modalidade, o lipídeo catiônico é o sal oxalato (por exemplo, hemioxalato) do mesmo, que é preferencialmente um sal cristalino. Em modalidades particulares, o lipídeo catiônico forma um sal farmaceuticamente aceitável com um ou mais ânions.
[000126] Também estão incluídos dentro do escopo desta invenção formas de cristal, hidratos e solvatos dos compostos descritos neste documento.
[000127] Os compostos da invenção podem ser preparados por téc-nicas de síntese orgânica conhecidas, incluindo os métodos descritos nos Exemplos. Em algumas modalidades, a síntese dos lipídeos catiô- nicos da invenção pode exigir a utilização de grupos de proteção. Me-todologia de grupo de proteção é bem conhecida daqueles qualificados na arte (ver, por exemplo, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Green, T.W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Resumidamente, grupos de proteção dentro do contexto desta invenção são qualquer grupo que reduz ou elimina a reatividade inde- sejada de um grupo funcional. Um grupo de proteção pode ser adicionado a um grupo funcional para mascarar sua reatividade durante certas reações e, então, removido para revelar o grupo funcional original. Em certos casos, é usado um "grupo de proteção álcool". Um "grupo de proteção álcool" é qualquer grupo que diminui ou elimina a reativi- dade indesejada de um grupo funcional álcool. Grupos de proteção podem ser adicionados e removidos usando técnicas bem conhecidas na arte.
[000128] Em determinadas modalidades, os lipídeos catiônicos da presente invenção têm pelo menos um grupo protonável ou deproto- nável, de modo que o lipídeo seja carregado positivamente em um pH em ou abaixo de pH fisiológico (por exemplo, pH 7,4) e neutro em um segundo pH, de preferência em ou acima de pH fisiológico. Será com-preendido por aqueles de habilidade ordinária na arte que a adição ou remoção de prótons em função do pH é um processo de equilíbrio, e que a referência a um lipídeo carregado ou neutro se refere à natureza da espécie predominante e não exige que todos os lipídeos estejam presentes na forma carregada ou neutra. Lipídeos que têm mais de um grupo protonável ou deprotonável, ou que são zwiteriônicos, não estão excluídos do uso na invenção.
[000129] Em certas outras modalidades, lipídeos protonáveis de acordo com a invenção têm um pKa do grupo protonável na faixa de cerca de 4 a cerca de 11. Mais preferido é um pKa de cerca de 4 a cerca de 7, porque estes lipídeos serão catiônicos em um estágio de formulação de pH mais baixo, enquanto as partículas serão grandemente (embora não completamente) neutralizadas na superfície em pH fisiológico de em torno de pH 7,4. Uma dos benefícios deste pKa é que pelo menos algum ácido nucleico associado com a superfície externa da partícula perderá sua interação eletrostática em pH fisiológico e será removido por diálise simples, assim reduzindo em grande parte a suscetibilidade da partícula à depuração.
I. Agentes ativos
[000130] Agentes ativos (por exemplo, agentes terapêuticos) incluem qualquer molécula ou composto capaz de exercer um efeito desejado em uma célula, tecido, órgão ou indivíduo. Tais efeitos podem ser, por exemplo, biológicos, fisiológicos e/ou cosméticos. Agentes ativos po-dem ser qualquer tipo de molécula ou composto incluindo, mas não se limitando a, ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos, pequenas mo-léculas e misturas dos mesmos. Exemplos não limitantes de ácidos nucleicos incluem moléculas de RNA interferente (por exemplo, siRNA, dsRNA de substrato Dicer, shRNA, aiRNA e/ou miRNA), oligonucleotí- deos antissenso, plasmídeos, ribozimas, oligonucleotídeo imunoesti- muladores e misturas dos mesmos. Exemplos de peptídeos ou poli- peptídeos incluem, sem limitação, anticorpos (por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos; anti-corpos humanizados, anticorpos recombinantes, anticorpos humanos recombinantes e/ou anticorpos Primatized™), citocinas, fatores de crescimento, fatores apoptóticos, fatores de indução de diferenciação, receptores de superfície de célula e seus ligantes, hormônios e mistu-ras dos mesmos. Exemplos de pequenas moléculas incluem, mas não são limitados a pequenas moléculas orgânicas ou compostos tais como qualquer agente convencional ou fármacos conhecido por aqueles de habilidade na arte.
[000131] Em algumas modalidades, o agente ativo é um agente te-rapêutico, ou um sal ou derivado do mesmo. Derivados de agente te-rapêutico podem ser eles mesmos terapeuticamente ativos ou eles podem ser pró-fármacos que se tornam ativas mediante modificação adicional. Assim, em uma modalidade, um derivado de agente tera-pêutico retém parte ou toda a atividade terapêutica em comparação com o agente sem modificação, enquanto em outra modalidade, um derivado de agente terapêutico é um pró-fármaco que carece de ativi-dade terapêutica, mas torna-se ativa mediante modificação adicional.
A. Ácidos nucleicos
[000132] Em determinadas modalidades, partículas de lipídeo da presente invenção estão associadas com um ácido nucleico, resultan-do em uma partícula de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP). Em algumas modalidades, o ácido nucleico é totalmente encapsulado na partícula de lipídeo. Como usado aqui, o termo "ácido nucleico" inclui qualquer oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, com fragmentos conten-do até 60 nucleotídeos geralmente denominados oligonucleotídeos e fragmentos mais longos denominados polinucleotídeos. Em modalida-des particulares, oligonucleotídeos da invenção são de cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento. Ácido nucleico pode ser administrado sozinho nas partículas de lipídeo da invenção, ou em combinação (por exemplo, coadministrado) com partículas de lipídeo da invenção compreendendo peptídeos, polipeptídeos ou moléculas pequenas tais como fármacos convencionais.
[000133] No contexto desta invenção, os termos "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" se referem a um polímero ou oligômero de nucleotí- deo ou monômeros de nucleosídeo consistindo em bases ocorrendo naturalmente, açúcares e ligações interaçúcar (espinha dorsal). Os termos "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" também incluem políme-ros ou oligômeros compreendendo monômeros não ocorrendo natu-ralmente, ou porções dos mesmos, que funcionam da mesma forma. Tais oligonucleotídeo modificados ou substituídos são muitas vezes preferidos sobre formas nativas por causa de propriedades tais como, por exemplo, absorção celular intensificada, imunogenicidade reduzida e estabilidade elevada na presença de nucleases.
[000134] Oligonucleotídeos são geralmente classificados como de- soxirribo-oligonucleotídeos ou ribo-oligonucleotídeos. Um desoxirribo- oligonucleotídeo consiste em um açúcar de 5 carbonos chamado de- soxirribose unido covalentemente a fosfato nos carbonos 5' e 3' deste açúcar para formar um polímero alternado, não ramificado. Um ribo- oligonucleotídeo consiste em uma estrutura de repetição semelhante, onde o açúcar de 5 carbonos é ribose.
[000135] O ácido nucleico que está presente em uma partícula de ácido nucleico-lipídeo de acordo com esta invenção inclui qualquer forma de ácido nucleico que é conhecido. Os ácidos nucleicos neste documento podem ser DNA ou RNA de fita simples ou DNA ou RNA de fita dupla ou híbridos DNA-RNA. Exemplos de DNA de fita dupla são aqui descritos e incluem, por exemplo, genes estruturais, genes incluindo regiões de controle e terminação e sistemas de autorreplica- ção, tal como DNA viral ou de plasmídeo. Exemplos de RNA de fita dupla são aqui descritos e incluem, por exemplo, siRNA e outros agen-tes de RNAi, tal como dsRNA de substrato Dicer, shRNA, aiRNA e pre- miRNA. Os ácidos nucleicos de fita simples incluem, por exemplo, oli- gonucleotídeos antissenso, ribozimas, miRNA maduro e oligonucleotí- deo de formação triplex.
[000136] Ácidos nucleicos da invenção podem ser de diversos com-primentos, geralmente dependentes da forma particular de ácido nu- cleico. Por exemplo, em modalidades particulares, plasmídeos ou ge-nes podem ser de cerca de 1.000 a cerca de 100.000 resíduos de nu- cleotídeo de comprimento. Em modalidades particulares, oligonucleo- tídeos podem variar de cerca de 10 para cerca de 100 nucleotídeos de comprimento. Em várias modalidades relacionadas, oligonucleotídeos, tanto de fita simples como de fita dupla e de fita tripla podem variar em comprimento de cerca de 10 a 60 nucleotídeos, de cerca de 15 a 60 nucleotídeos, de cerca de 20 a 50 nucleotídeos, de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos, ou de cerca de 20 a 30 nucleotídeos de com-primento.
[000137] Em modalidades particulares, um oligonucleotídeo (ou uma fita do mesmo) da invenção especificamente hibridiza ou é complemen-tar a uma sequência de polinucleotídeo alvo. Os termos "especificamente hibridizável" e "complementar" como usados neste documento indicam um grau suficiente de complementaridade, de modo que ligação estável e específica ocorre entre o DNA ou RNA alvo e o oligonucleotí- deo. Entende-se que um oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar sua sequência de ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. Em modalidades preferidas, um oligonucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo à sequência alvo interfere com a função normal da sequência alvo para causar uma perda de utilidade ou expressão da mesma, e há um suficiente grau de complementaridade para evitar ligação não especifica do oligonucleotídeo a sequências não alvo em condições nas quais a ligação específica é desejada, ou seja, em condições fisiológicas no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico ou, no caso de ensaios in vitro em condições nas quais os ensaios são realizados. Assim, o oligo- nucleotídeo pode incluir 1, 2, 3 ou mais substituições de base em com- paração com a região de um gene ou sequência de mRNA que ele tem como alvo ou a qual ele especificamente hibridiza.
1. siRNA
[000138] O componente de siRNA das partículas de ácido nucleico- lipídeo da presente invenção é capaz de silenciar a expressão de um gene alvo de interesse. Cada fita do dúplex de siRNA é tipicamente de cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, de preferência cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Em de-terminadas modalidades, o siRNA compreende pelo menos um nu- cleotídeo modificado. O siRNA modificado é geralmente menos imu- noestimulador do que uma sequência de siRNA sem modificações cor-respondente e retém a atividade de RNAi contra o gene alvo de inte-resse. Em algumas modalidades, o siRNA modificado contém pelo menos um nucleotídeo 2'OMe purina ou pirimidina, tal como um oligo- nucleotídeo 2'OMe-guanosina, 2'OMe-uridina, 2'OMe-adenosina e/ou 2'OMe-citosina. Os nucleotídeos modificados podem estar presentes em uma fita (isto é, senso ou antissenso) ou ambas as fitas do siRNA. Em algumas modalidades preferidas, um ou mais dos nucleotídeos uridina e/ou guanosina são modificados (por exemplo, 2’OMe- modificado) em uma fita (isto é, senso ou antissenso) ou amas as fitas do siRNA. Nestas modalidades, o siRNA modificado ainda pode com-preender um ou mais dos nucleotídeos de adenosina modificada (por exemplo, 2’OMe-modificada) e/ou citosina modificada (por exemplo, 2’OMe-modificada). Em outras modalidades preferidas, somente nu- cleotídeos de uridina e/ou guanosina são modificados (por exemplo, 2'OMe-modificados) em uma fita (isto é, senso ou antissenso) ou am-bas as fitas do siRNA. As sequências de siRNA podem ter saliências (por exemplo, saliências 3' ou 5' conforme descrito em Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) ou Nykanen et al., Cell, 107:309 (2001)), ou podem não ter saliências (isto é, têm extremidades cegas).
[000139] Em modalidades particulares, a incorporação seletiva de nucleotídeos modificados, tal como nucleotídeos 2'OMe uridina e/ou guanosina na região de fita dupla de cada uma ou de ambas as fitas do siRNA reduz ou revoga completamente a resposta imune para essa molécula de siRNA. Em certos casos, as propriedades imunoestimula- doras de sequências específicas de siRNA e sua capacidade de silen-ciar expressão de gene podem ser equilibradas ou otimizadas pela in-trodução de modificações 2'OMe mínimas e seletivas dentro da região de fita dupla do dúplex de siRNA. Isto pode ser conseguido com doses de siRNA terapeuticamente viáveis sem indução de citocina, toxicidade e efeitos fora do alvo associados ao uso de siRNA não modificado.
[000140] O siRNA modificado geralmente compreende de cerca de 1% a cerca de 100% (por exemplo, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) de nucleotídeos modificados na região de fita dupla do dúplex de siRNA. Em determinadas modalidades, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos modificados. Em certas outras modalidades, alguns ou todos os nucleotídeos modificados na região de fita dupla do siRNA são 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotídeos separados um do outro. Em uma modalidade preferencial, nenhum dos nucleotídeos modificados na região de fita dupla do siRNA é adjacente um ao outro (por exemplo, há um hiato de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos não modificados entre cada nucleotídeo modificado).
[000141] Em algumas modalidades, menos de cerca de 50% (por exemplo, menos de cerca de 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37% ou 36%, de preferência menos de cerca de 35%, 34%, 33%, 32%, 31% ou 30%) dos nucleotídeos na re-gião de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos modificados (por exemplo, 2'OMe). Em um aspecto destas modalidades, menos de cerca de 50% dos nucleotídeos de uridina e/ou guanosina na região de fita dupla de uma ou de ambas as fitas do siRNA são seletivamente (por exemplo, apenas) modificados. Em outro aspecto destas modali-dades, menos de cerca de 50% dos nucleotídeos na região de fita du-pla do siRNA compreendem nucleotídeos 2'OMe, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2'OMe em ambas as fitas do siRNA, em que o siRNA compreende pelo menos um nucleotídeo 2'OMe-guanosina e pelo menos um nucleotídeo 2'OMe-uridina e em que nucleotídeos 2'OMe-guanosina e 2'OMe-uridina são os únicos nucleotídeos 2'OMe presentes na região de fita dupla. Em ainda outro aspecto destas mo-dalidades, menos de cerca de 50% dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos 2'OMe, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2'OMe em ambas as fitas do siRNA modifi-cado, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2'OMe selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 2’OMe-guanosina, nucleotídeos 2'OMe-uridina, nucleotídeos 2'OMe-adenosina e suas misturas, e em que o siRNA não compreende nucleotídeos 2’OMe-citosina na região de fita dupla. Em outro aspecto destas modalidades, menos de cerca de 50% dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreen-dem nucleotídeos 2'OMe, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe em ambas as fitas do siRNA, em que o siRNA compreende pelo menos um nucleotídeo 2’OMe-guanosina e pelo menos um nucleo- tídeo 2’OMe-uridina, e em que o siRNA não compreende nucleotídeos 2’OMe-citosina na região de fita dupla. Em outro aspecto destas moda-lidades, menos de cerca de 50% dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos 2’OMe, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe em ambas as fitas do siRNA modifi- cado, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 2’OMe-guanosina, nucleotídeos 2’OMe-uridina, nucleotídeos 2’ OMe-adenosina e suas misturas, e em que os nucleotídeos 2’OMe na região de fita dupla não são adjacentes uns aos outros.
[000142] Em outras modalidades, de cerca de 1% a cerca de 50% (por exemplo, de cerca de 5%-50%, 10%-50%, 15%-50%, 20%-50%, 25%-50%, 30%-50%, 35%-50%, 40%-50%, 45%-50%, 5%-45%, 10%- 45%, 15%-45%, 20%-45%, 25%-45%, 30%-45%, 35%-45%, 40%- 45%, 5%-40%, 10%-40%, 15%-40%, 20%-40%, 25%-40%, 25%-39%, 34%-39%, 34%-38%, 34%-37%, 34%-36%, 35%-40%, 5%-35%, 10%- 35%, 15%-35%, 20%-35%, 21%-35%, 22%-35%, 23%-35%, 24%- 35%, 25%-35%, 26%-35%, 27%-35%, 28%-35%, 29%-35%, 30%- 35%, 31%-35%, 32%-35%, 33%-35%, 34%-35%, 30%-34%, 31%- 34%, 32%-34%, 33%-34%, 30%-33%, 31%-33%, 32%-33%, 30%- 32%, 31%-32%, 25%-34%, 25%-33%, 25%-32%, 25%-31%, 26%- 34%, 26%-33%, 26%-32%, 26%-31%, 27%-34%, 27%-33%, 27%- 32%, 27%-31%, 28%-34%, 28%-33%, 28%-32%, 28%-31%, 29%- 34%, 29%-33%, 29%-32%, 29%-31%, 5%-30%, 10%-30%, 15%-30%, 20%-34%, 20%-33%, 20%-32%, 20%-31%, 20%-30%, 21%-30%, 22%-30%, 23%-30%, 24%-30%, 25%-30%, 25%-29%, 25%-28%, 25%-27%, 25%-26%, 26%-30%, 26%-29%, 26%-28%, 26%-27%, 27%-30%, 27%-29%, 27%-28%, 28%-30%, 28%-29%, 29%-30%, 5%- 25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-29%, 20%-28%, 20%-27%, 20%- 26%, 20%-25%, 5%-20%, 10%-20%, 15%-20%, 5%-15%, 10%-15%, ou 5%-10%) dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA com-preendem nucleotídeos modificados. Em um aspecto destas modali-dades, de cerca de 1% a cerca de 50% dos nucleotideos de uridina e/ou guanosina na região de fita dupla de uma ou ambas as fitas do siRNA são seletivamente (por exemplo, apenas) modificados. Em outro aspecto destas modalidades, de cerca de 1% a cerca de 50% dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotí- deos 2’OMe, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2'OMe em ambas as fitas do siRNA, em que o siRNA compreende pelo menos um nucleotídeo 2’OMe-guanosina e pelo menos um nucleotídeo 2’OMe-uridina e em que os nucleotídeos 2’OMe-guanosina e os nucle- otídeos 2’OMe-uridina são os únicos nucleotídeos 2’OMe presentes na região de fita dupla. Em ainda outro aspecto destas modalidades, de cerca de 1% a cerca de 50% dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos 2’OMe, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe em ambas as fitas do siRNA modificado, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe selecionados do grupo consistindo em oligonucleotídeos 2’OMe-guanosina, nucleotí- deos de 2’OMe-uridina, nucleotídeos 2’OMe-adenosina e suas misturas, e em que o siRNA não compreende nucleotídeos 2’OMe-citosina na região de fita dupla. Em outro aspecto destas modalidades, de cerca de 1% a cerca de 50% dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos 2’OMe, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe em ambas as fitas do siRNA, em que o siRNA compreende pelo menos um nucleotídeo 2’OMe-guanosina e pelo menos um nucleotídeo 2’OMe-uridina, e em que o siRNA não compre-ende nucleotídeos 2’OMe-citosina na região de fita dupla. Em outro aspecto destas modalidades, de cerca de 1% a cerca de 50% dos nu- cleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotí- deos 2’OMe, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe em ambas as fitas do siRNA modificado, em que o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe selecionados do grupo consistindo em nucleotí- deos 2’OMe-guanosina, nucleotídeos de 2’OMe-uridina, nucleotídeos 2’OMe-adenosina e suas misturas, e em que os nucleotídeos 2’OMe na região de fita dupla não são adjacentes uns aos outros.
[000143] Faixas, percentagens e padrões de modificações adicionais que podem ser introduzidos no siRNA são descritos na Publicação de Pedido de Patente US 2007/0135372, cuja divulgação é aqui incorpo-rada por referência na íntegra para todos os fins.
a) Seleção de sequências de siRNA
[000144] Sequências de siRNA apropriadas podem ser identificadas usando qualquer meio conhecido na arte. Tipicamente, os métodos descritos em Elbashir et al., Nature, 411:494-498 (2001) e Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001) são combinados com regras de projeto racionais definidas em Reynolds et al. Natureza Biotech., 22(3):326-330 (2004).
[000145] Como um exemplo de não limitação, a sequência de nucle- otídeo 3’ do códon de partida AUG de um transcrito do gene alvo de interesse pode ser varrida para sequências de dinucleotídeo (por exemplo, AA, NA, CC, GG ou UU, em que N = C, G ou U) (ver, por exemplo, Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001)). Os nucleotí- deos imediatamente 3’ para as sequências de dinucleotídeo são identi-ficados como potenciais sequências de siRNA (isto é, uma sequência alvo ou uma sequência de fita senso). Tipicamente, os 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 ou mais nucleotídeos imediatamente 3’ para as se-quências de dinucleotídeos são identificados como potenciais sequên-cias de siRNA. Em algumas modalidades, a sequência de dinucleotí- deo é uma sequência AA ou NA e os 19 nucleotídeos imediatamente 3’ para o dinucleotídeo AA ou NA são identificados como potenciais sequências de siRNA. Sequências de siRNA geralmente são espaça-das em diferentes posições ao longo do comprimento do gene alvo. Para intensificar ainda mais a eficiência de silenciamento das sequên-cias de siRNA, as sequências de siRNA potenciais podem ser analisa-das para identificar sítios que não contêm regiões de homologia para outras sequências de codificação, por exemplo, na célula ou no orga-nismo alvo. Por exemplo, uma sequência de siRNA apropriada de cer-ca de 21 pares de bases tipicamente não terá mais de 16 a 17 pares de bases contíguos de homologia para sequências de codificação na célula ou no organismo alvo. Se as sequências de siRNA forem ex-pressas de um promotor RNA Pol III, sequências de siRNA carecendo mais de 4 A’s ou T’s contíguos é são selecionadas.
[000146] Uma vez que uma sequência de siRNA potencial foi identifi-cada, uma sequência complementar (isto é, uma sequência de fita antis- senso) pode ser projetada. Uma sequência de siRNA potencial também pode ser analisada usando uma variedade de critérios conhecidos na arte. Por exemplo, para aumentar sua eficiência de silenciamento, as sequências de siRNA podem ser analisadas por um algoritmo de projeto racional para identificar sequências que têm uma ou mais das seguintes características: (1) conteúdo de G/C de cerca de 25% a cerca de 60% de G/C; (2) pelo menos 3 A/Us nas posições 15-19 da fita senso; (3) sem repetições internas; (4) um A na posição 19 da fita senso; (5) um A na posição 3 da fita senso; (6) um U na posição 10 da fita senso; (7) nenhum G/C na posição 19 da fita senso; e (8) nenhum G na posição 13 da fita senso. Ferramentas de projeto de siRNA que incorporam algoritmos que atribuem valores apropriados de cada uma destas características e são úteis para a seleção de siRNA podem ser encontradas em, por exemplo, http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html. Alguém versado na técnica apreciará que sequências com uma ou mais das características acima mencionadas podem ser selecionadas para análise mais aprofundada e testes como potenciais sequências de siRNA.
[000147] Além disso, potenciais sequências de siRNA com um ou mais dos seguintes critérios, muitas vezes podem ser eliminadas como siRNA: (1) sequências compreendendo um trecho de 4 ou mais da mesma base em uma fila; (2) sequências compreendendo homopolí- meros de Gs (isto é, para reduzir possíveis efeitos não específicos de-vido às características estruturais destes polímeros; (3) sequências compreendendo motivos de base tripla (por exemplo, GGG, CCC, AAA ou TTT); (4) sequências compreendendo trechos de 7 ou mais G/Cs em uma fileira; e (5) sequências compreendendo repetições diretas de 4 ou mais bases dentro dos candidatos resultando em estruturas internas de dobra para trás. No entanto, alguém versado na técnica apreciará que sequências com uma ou mais das características acima mencionadas ainda podem ser selecionadas para uma análise mais aprofundada e testes como potenciais sequências de siRNA.
[000148] Em algumas modalidades, sequências de siRNA potenciais podem ser ainda analisadas com base na assimetria dúplex de siRNA, conforme descrito em, por exemplo, Khvorova et al., Cell, 115:209-216 (2003); e Schwarz et al., Cell, 115:199-208 (2003). Em outras modalida-des, sequências de siRNA potenciais podem ser ainda analisadas com base na estrutura secundária no sítio alvo, conforme descrito em, por exemplo, Luo et al., Byophys. Res Commun., 318:303-310 (2004). Por exemplo, a estrutura secundária no sítio alvo pode ser modelada usando o algoritmo Mfold (disponível em http://mfold.burnet.edu.au/rna_form) para selecionar sequências de siRNA que favorecem a acessibilidade no sítio alvo onde menos estrutura secundária na forma de emparelhamento de base alças de haste está presente.
[000149] Uma vez que foi identificada uma potencial sequência de siRNA, a sequência pode ser analisada para a presença de quaisquer propriedades imunoestimuladoras, por exemplo, usando um ensaio do citocina in vitro ou um modelo animal in vivo. Motivos na fita senso e/ou antissenso da sequência de siRNA, tal como motivos ricos em GU (por exemplo, 5’-GU-3’, 5’-UGU-3’, 5’-GUGU-3’, 5’-UGUGU-3’, etc.), também podem fornecer uma indicação se a sequência pode ser imunoestimuladora. Uma vez que uma molécula de siRNA é conside-rada ser imunoestimuladora, então, ele pode ser modificada para dimi-nuir suas propriedades imunoestimuladoras conforme descrito neste documento. Como um exemplo de não limitação, uma sequência de siRNA pode ser contatada com uma célula responsiva de mamífero em condições tais que a célula produza uma resposta imune detectá- vel para determinar se o siRNA é um siRNA imunoestimulador ou não imunoestimulador. A célula de mamífero responsiva pode ser de um mamífero naive (isto é, um mamífero que não tenha sido previamente contatado com o produto de gene da sequência de siRNA). A célula responsiva de mamífero pode ser, por exemplo, uma célula mononu-clear do sangue periférico (PBMC), um macrófago e afins. A resposta imune detectável pode compreender produção de uma citocina ou fator de crescimento, tal como, por exemplo, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-Y, IL-6, IL-12, ou uma combinação destes. Uma molécula de siRNA iden-tificada como sendo imunoestimuladora, então, pode ser modificada para diminuir suas propriedades imunoestimuladoras substituindo pelo menos um dos nucleotídeos da fita senso e/ou antissenso por nucleo- tídeos modificados. Por exemplo, menos de cerca de 30% (por exem-plo, menos do que cerca de 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%) dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA dúplex podem ser subs-tituídos por nucleotídeos modificados tais como nucleotídeos 2’OMe. O siRNA modificado, então, pode ser contatado com uma célula respon- siva de mamífero, conforme descrito acima para confirmar que suas propriedades imunoestimuladoras foram reduzidas ou revogadas.
[000150] Ensaios apropriados in vitro para detecção de uma resposta imune incluem, mas não estão limitados a, técnica de imunoensaio de sanduíche de anticorpo monoclonal duplo de David et al. (patente US 4.376.110); ensaios de sanduiche de anticorpo monoclonal-policlonal (Wide et al., em Kirkham e Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. e S. Livingstone, Edinburgh (1970)); método "Western blot" de Gor-don et al. (Patente US 4.452.901); imunoprecipitação de ligante mar-cado (Brown et al., J. Biol Chem., 255:4980-4983 (1980)); ensaios imunossorventes ligados a enzima(ELISA) como descrito, por exemplo, por Raines et al, J. Biol Chem., 257:5154-5160 (1982); técnicas imunocitoquímicas, incluindo o uso de fluorcromos (Brooks et al. Clin. Exp. Immunol., 39:477 (1980)); e neutralização de atividade (Bowen- Pope et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2396-2400 (1984)). Além dos imunoensaios descritos acima, uma série de outros imunoensaios está disponível, incluindo aqueles descritos nas Patentes US 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; e 4.098.876. As divulgações dessas referências neste do-cumento são incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos.
[000151] Um modelo de um exemplo de não limitação de um modelo in vivo para detecção de uma resposta imune inclui um ensaio de indução de citocina em camundongo in vivo conforme descrito em, por exemplo, Judge et al., Mol. Ther., 13:494-505 (2006). Em determinadas modalidades, o ensaio pode ser executado da seguinte forma: (1) siRNA pode ser administrado por injeção intravenosa padrão na veia da cauda lateral; (2) sangue pode ser coletado por punção cardíaca cerca de 6 horas após a administração e processado como plasma para análise de citocina; e (3) citocinas podem ser quantificadas usando kits ELISA de sanduíche de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, IFN-α de camundongo e humano (PBL Biomedical; Pis-cataway, NJ); IL-6 e TNF-α humano (eBioscience; San Diego, CA); e IL-6, TNF-α e IFN-Y de camundongo (BD Biosciences; San Diego, CA)).
[000152] Anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a citocinas e fatores de crescimento são comercialmente disponíveis de várias fontes e podem ser gerados usando os métodos conhecidos na arte (ver, por exemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) e Harlow e Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, Nova Iorque (1999)). Geração de anticorpos monoclonais foi descrita anteriormente e pode ser realizada por qual-quer meio conhecido na arte (Buhring et al., em Hybridoma, Vol. 10, N.° 1, pp. 77-78 (1991)). Em alguns métodos, o anticorpo monoclonal é marcado (por exemplo, com qualquer composição detectável por meio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, elétrico, óptico ou químico) para facilitar a detecção.
b) Geração de Moléculas de siRNA
[000153] siRNA pode ser fornecido em diversas formas incluindo, por exemplo, como um ou mais dúplices de RNA interferente pequeno (siRNA) isolados, como RNA de fita dupla (dsRNA) mais longo, ou como siRNA ou dsRNA transcrito de um cassete transcricional em um plasmídeo de DNA. Em algumas modalidades, siRNA pode ser produ-zido enzimaticamente ou por síntese orgânica parcial/total e ribonucle- otídeos modificados podem ser introduzidos por síntese enzimática ou orgânica in vitro. Em certos casos, cada fita é preparada quimicamente. Métodos de sintetizar moléculas de RNA são conhecidos na arte, por exemplo, os métodos de síntese química conforme descrito em Verma e Eckstein (1998), ou conforme descrito neste documento.
[000154] Uma população de RNA pode ser usada para fornecer RNAs precursores longos, ou RNAs precursores longos que têm identidade substancial ou completa para uma sequência alvo selecionada podem ser usados para fazer o siRNA. Os RNAs podem ser isolados de células ou tecido, sintetizados e/ou clonados de acordo com méto-dos conhecidos daqueles de habilidade na arte. O RNA pode ser uma população mista (obtida de células ou tecido, transcrita de cDNA, sub-traída, selecionada, etc.), ou pode representar uma sequência alvo simples. RNA pode ser de ocorrência natural (por exemplo, isolado de amostras de tecido ou célula), sintetizado in vitro (por exemplo, usando produtos de polimerase T7 ou SP6 e PCR ou um cDNA clonado), ou quimicamente sintetizado.
[000155] Para formar um dsRNA longo, para RNAs sintéticos, o complemento também é transcrito in vitro e hibridizado para formar um dsRNA. Se uma população de RNA ocorrendo naturalmente for usada, os complementos de RNA também são fornecidos (por exemplo, para formar dsRNA para digestão por E. coli RNAse III ou Dicer), por exem-plo, transcrevendo cDNAs correspondentes à população de RNA, ou usando RNA polimerases. Os RNAs precursores são, então, hibridiza- dos para formar RNAs de fita dupla para digestão. Os dsRNAs podem ser administrados diretamente a um indivíduo ou podem ser digeridos in vitro antes da administração.
[000156] Métodos para isolar RNA, sintetizar RNA, hibridizar ácidos nucleicos, fazer e triar bibliotecas de cDNA e realizar PCR são bem conhecidos na arte (veja, por exemplo, Gubler e Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra), como são os métodos PCR (veja, Patentes US 4.683.195 e 4.683.202; PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)). Bibliotecas de expressão também são bem conhecidas para aqueles versados na técnica. Textos básicos adicionais divulgando os métodos gerais de utilização nesta invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994). As divulgações destas referências neste documento são incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000157] De preferência, siRNA são quimicamente sintetizados. Os oligonucleotídeos que compreendem as moléculas de siRNA da inven-ção podem ser sintetizados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas na arte, tal como aquelas descritas em Usman. et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al. Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); e Wincott et al., Methods Mol.Bio., 74:59 (1997). A síntese de oligonucleotídeos faz uso de grupos de proteção e acoplamento de áci-do nucleico comuns, tal como dimetoxitritil na extremidade 5’ e fosfora- midatos na extremidade 3’. Como um exemplo de não limitação, a sín-teses de pequena escala pode ser realizada em um sintetizador Applied Biosystems usando um protocolo de escala de 0,2 μmol. Alternativamente, sínteses na escala de 0,2 μmol podem ser executadas em um sintetizador de placa de 96 poços de Protogene (Palo Alto, CA). No entanto, uma maior ou menor escala de síntese está também dentro do escopo desta invenção. Reagentes apropriados para síntese de oligo- nucleotídeo, métodos para desproteção de RNA e métodos para purificação de RNA são conhecidos por aqueles de habilidade na arte
[000158] Moléculas de siRNA também podem ser sintetizadas via uma técnica de síntese em tandem, em que ambas as fitas são sintetizadas como um fragmento ou fita de oligonucleotídeo contínua simples por um ligante clivável que posteriormente é clivado para fornecer frag-mentos ou fitas separadas que hibridizam para formar o dúplex de siR-NA. O ligante pode ser um ligante de polinucleotídeo ou um ligante não nucleotídeo. A síntese em tandem de siRNA pode ser prontamente adaptada para ambas as plataformas de síntese multipoços/multiplacas, bem como plataformas de síntese em larga escala, empregando reatores em batelada, colunas de síntese e similares. Alternativamente, as moléculas de siRNA podem ser montadas de dois oligonucleotídeos distintos, em que um oligonucleotídeo compreende a fita senso e o ou-tro compreende a fita antissenso do siRNA. Por exemplo, cada fita pode ser sintetizada separadamente e unida junta por hibridização ou ligação em seguida a síntese e/ou desproteção. Em outros casos, as moléculas de siRNA podem ser sintetizadas como um fragmento de oligonucleotí- deo contínuo simples, onde as regiões de senso e antissenso autocom- plementares hibridizam para formar um dúplex de siRNA tendo estrutura secundária de grampo (hairpin).
c) Modificando Sequências de siRNA
[000159] Em certos aspectos, moléculas de siRNA compreendem um dúplex tendo duas fitas e pelo menos um nucleotídeo modificado na região de fita dupla, em que cada fita é de cerca de 15 a 60 nucleotí- deos de comprimento. Vantajosamente, o siRNA modificado é menos imunoestimulador do que uma sequência de siRNA não modificada correspondente, mas retém a capacidade de silenciar a expressão de uma sequência alvo. Em modalidades preferidas, o grau de modifica-ções químicas introduzidas na molécula de siRNA bate um equilíbrio entre redução ou revogação das propriedades imunoestimuladoras do siRNA e retenção de atividade de RNAi. Como um exemplo de não limitação, uma molécula de siRNA que tem como alvo um gene de in-teresse pode ser minimamente modificada (por exemplo, menos de cerca de 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% modificada) em nucleotí- deos de uridina e/ou guanosina seletivos dentro do dúplex de siRNA para eliminar a resposta imune gerada pelo siRNA, embora retendo sua capacidade de silenciar expressão de gene alvo.
[000160] Exemplos de nucleotídeos modificados apropriados para uso na invenção incluem, mas não estão limitados a ribonucleotídeos tendo um grupo 2’-O-metil (2’OMe) 2’-deóxi-2’-fluor (2’F), 2’-deóxi, 5-C- metila, 2’-O-(2-metoxietil) (MOE), 4’-tio, 2’-amino ou 2’-C-alila. Nucleo- tídeos modificados tendo uma conformação Northern tal como aquelas descritas em, por exemplo, Saenger, Principles of Nucleic Acid Struc-ture, Springer-Verlag Ed. (1984), também são adequados para uso em moléculas de siRNA. Esses nucleotídeos modificados incluem, sem limitação, nucleotídeos do ácido nucleico bloqueado (LNA) (por exem-plo, nucleotídeos 2’-O,4’-C-metileno-(D-ribofuranosil)), nucleotídeos 2’- O-(2-metoxietil) (MOE), nucleotídeos 2’-metil-tio-etila, nucleotídeos 2’- deóxi-2’-fluor (2’F), nucleotídeos 2’-deóxi-2’-cloro (2’Cl) e nucleotídeos 2’-azido. Em certos casos, as moléculas de siRNA descritas neste do-cumento incluem um ou mais nucleotídeos G-clamp. Um nucleotídeo G-clamp se refere a um análogo de citosina modificada em que as modificações conferem a capacidade de ligar por hidrogênio ambas as faces Watson-Crick e Hoogsteen de um nucleotídeo guanina comple-mentar dentro de um dúplex (ver, por exemplo, Lin et al, J. Am. Chem. Soc., 120:8531-8532 (1998)). Além disso, nucleotídeos tendo um aná-logo de base de nucleotídeo tal como, por exemplo, C-fenila, C-naftila, outros derivados aromáticos, inosina, azol carboxamidas e derivados de nitroazol, tal como 3-nitropirrol, 4-nitroindol, 5-nitroindol e 6- nitroindol (veja, por exemplo, Loakes, Nucl. Acids Res., 29:2437-2447 (2001)) podem ser incorporados nas moléculas de siRNA.
[000161] Em determinadas modalidades, as moléculas de siRNA ainda podem compreender uma ou mais modificações químicas, tal como frações de capa terminal, modificações de espinha dorsal de fosfato e afins. Exemplos de frações de capa terminal incluem, sem limitação, resíduos abásicos deóxi invertidos, modificações glicerila, nu- cleotídeos 4’,5’-metileno, nucleotídeos l-(β-D-eritrofuranosil), nucleotí- deos 4’-tio, nucleotídeos carbocíclicos, nucleotídeos 1,5-anidrohexitol, L-nucleotídeos, a-nucleotídeos, nucleotídeos de base modificados, nu- cleotídeos treo-pentofuranosila, nucleotídeos 3’,4’-seco acíclicos, nu- cleotídeos 3,4-di-hidroxibutil acíclicos, nucleotídeos 3,5-di-hidroxipentil acíclicos, frações de nucleotídeo 3’-3’-invertidas, frações abásicas 3’- 3’-invertidas, frações de nucleotídeos 3’-2’-invertidas, frações abásicas 3’-2’-invertidas, frações de nucleotídeos 5’-5’-inertidas, frações abási- cas 5’-5’-invertidas, frações abásicas deóxi 3’-5’-invertidas, 5’-amino- alquil fosfato, 1,3-diamino-2-propil fosfato, 3-aminopropil fosfato, 6- aminohexil fosfato, 1,2-aminododecil fosfato, hidroxipropil fosfato, 1,4- butanodiol fosfato, 3’-fosforamidato, 5’-fosforamidato, hexilfosfato, aminohexil fosfato, 3’-fosfato, 5’-amino, 3’-fosforotioato, 5’- fosforotioato, fosforoditioato e metilfosfonato de ponte ou não de ponte ou frações 5’-mercapto (ver, por exemplo, Patente US 5.998.203; Be- aucage et al. Tetrahedron 49:1925 (1993)). Exemplos não limitantes de modificações de espinha dorsal de fosfato (isto é, resultando em ligações internucleotídeo modificadas) incluem fosforotioato, fosforodi- tioato, metilfosfonato, fosfotriester, morfolino, amidato, carbamato, car- boximetila, acetamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal e substituições alquilsilil (ver, por exemplo, Hunziker et al, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, em Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995); Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, em Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)). Tais modifi-cações químicas podem ocorrer na extremidade 5’ e/ou 3’ da fita senso, fita antissenso ou ambas as fitas do siRNA. As divulgações destas referências neste documento são incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos.
[000162] Em algumas modalidades, a fita senso e/ou antissenso da molécula de siRNA ainda pode compreender uma saliência no terminal 3’ tendo cerca de 1 a 4 (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) 2’-deóxi ribonucleo- tídeos, ribonucleotídeos uridina modificados (por exemplo, 2’OMe) e/ou não modificados e/ou qualquer outra combinação de nucleotídeos modificados (por exemplo, 2’OMe) e não modificados.
[000163] Exemplos de adicionais de nucleotídeos modificados e tipos de modificações químicas que podem ser introduzidas em moléculas de siRNA são descritos, por exemplo, na Patente do Reino Unido GB 2.397.818 B e Publicações de Pedido de Patente US 2004/0192626, 2005/0282188 e 2007/0135372, as divulgações das quais são aqui in-corporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000164] Moléculas de siRNA aqui descritas, opcionalmente, podem compreender um ou mais não nucleotídeos em uma ou ambas as fitas do siRNA. Como usado aqui, o termo "não nucleotídeo" se refere a qualquer grupo ou composto que pode ser incorporado em uma cadeia de ácido nucleico no lugar de uma ou mais unidades de nucleotídeos, incluindo substituições de açúcar e/ou fosfato e permite que as bases restantes exibam sua atividade. O grupo ou o composto é abásico em que ele não contém uma base de nucleotídeo comumente reconhecida, tal como adenosina, guanina, citosina, uracila ou timina e, portanto, carece de uma base na posição 1’.
[000165] Em outras modalidades, a modificação química do siRNA compreende fixar um conjugado à molécula de siRNA. O conjugado pode ser fixado na extremidade 5' ou 3' da fita senso e/ou antissenso do siRNA via uma fixação covalente tal como, por exemplo, um ligante biodegradável. O conjugado também pode ser fixado ao siRNA, por exemplo, através de um grupo carbamato ou outro grupo de ligação (ver, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente US 2005/0074771, 2005/0043219 e 2005/0158727). Em certos casos, o conjugado é uma molécula que facilita a distribuição do siRNA para uma célula. Exemplos de moléculas de conjugado apropriadas para fixação a siRNA incluem, sem limitação, esteroides, tal como coleste-rol, glicois, tal como polietileno glicol (PEG), albumina de soro ser hu-mano (HSA), ácidos graxos, carotenoides, terpenos, ácidos biliares, folatos (por exemplo, ácido fólico, análogos de folato e seus deriva- dos), açúcares (por exemplo, galactose, galactosamina, N-acetil galac- tosamina, glicose, manose, frutose, fucose, etc.), fosfolipídeos, peptí- deos, ligantes para receptores celulares capazes de mediar absorção celular e suas combinações (ver, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente 2003/0130186, 2004/0110296 e 2004/0249178; Patente US 6.753.423). Outros exemplos incluem a fração lipofílica, vitamina, polímero, peptídeo, proteína, ácido nucleico, pequena molécula, oli- gossacarídeo, grupo de carboidrato, intercalador, ligante de ranhura menor, agente de clivagem e moléculas conjugadas de agente de reti- culação descritas nas Publicações de Pedido de Patente 2005/0119470 e 2005/0107325. No entanto, outros exemplos incluem a 2’-O-alquil amina, 2’-O-alcoxialquil amina, poliamina, pirimidina modificada C5-catiônica, peptídeo catiônico, grupo guanidínio, grupo amidí- nio, moléculas conjugadas de aminoácido catiônico descritas na Publicação de Pedido de Patente 2005/0153337. Exemplos adicionais incluem o grupo hidrofóbico, composto ativo de membrana, composto de penetração em célula, sinal de alvo de célula, modificador de interação e moléculas conjugadas de estabilizador estérico descritas na Publica-ção de Patente US 2004/0167090. Outros exemplos incluem as molé-culas conjugadas descritas na Publicação de Pedido de Patente US 2005/0239739. O tipo de conjugado usado e a extensão da conjugação para a molécula de siRNA podem ser avaliados para perfis farma- cocinéticos melhorados, biodisponibilidade e/ou estabilidade do siRNA, embora retendo a atividade de RNAi. Como tal, aqueles versados na técnica podem triar moléculas de siRNA tendo vários conjugados fixa-dos às mesmas para identificar aquelas tendo propriedades melhora-das e plena atividade de RNAi usando qualquer uma de uma variedade de culturas de células in vitro ou modelos animais in vivo. As divul-gações dos documentos de patentes acima descritos neste documento são incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
d) Genes Alvo
[000166] O componente de siRNA das partículas de ácido nucleico- lipídeo aqui descrito pode ser usado para infrarregular ou silenciar a tradução (isto é, expressão) de um gene de interesse. Genes de inte-resse incluem, mas não são limitados a genes associados com infec-ção viral e sobrevivência, genes associados com doenças e distúrbios metabólicos (por exemplo, doenças e distúrbios do fígado), genes as-sociados com tumorigênese ou transformação de célula (por exemplo, câncer), genes angiogênicos, genes imunomoduladores, tal como aqueles associados com respostas inflamatórias e autoimunes, genes de ligante de receptor e genes associados com distúrbios neurodege- nerativos.
[000167] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece um coquetel de dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais moléculas de siRNA que silencia a expressão de múltiplos genes de interesse. Em algumas modalidades, o coquetel de moléculas de siRNA é totalmente encapsulado em uma partícula de lipídeo, tal como uma partícula de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP). As molé-culas de siRNA podem ser coencapsuladas na mesma partícula de lipídeo, ou cada espécie de siRNA presente no coquetel pode ser for-mulada em partículas separadas.
[000168] Genes associados com infecção viral e sobrevivência incluem aqueles expressos por um hospedeiro (por exemplo, um fator de hospedeiro tal como fator de tecido (TF)) ou um vírus a fim de ligar, entrar e replicar em uma célula. De interesse particular são sequências virais associadas com doenças virais crônicas. Sequências virais de interesse particular incluem sequências de Filoviruses, tal como vírus Ebola e vírus Marburg (ver, por exemplo, Geisbert et al., J. Infect. Dis., 193:1650-1657 (2006)); Arenavirus, tal como Lassa vírus, Junin vírus, Machupo vírus, Guanarito vírus e Sabia vírus (Buchmeier et al., Are- naviridae: the viruses and their replication, Em: FIELDS VIROLOGY, Kni- pe et al. (eds.), 4a ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (2001)); vírus da Influenza tais como vírus da Influenza A, B e C (ver, por exemplo, Ste- inhauer et al., Annu Rev Genet., 36:305-332 (2002); e Neumann et al., J Gen Virol., 83:2635-2662 (2002)); vírus da Hepatite (ver, por exemplo, Hamasaki et al., FEBS Lett., 543:51 (2003); Yokota et al., EMBO Rep., 4:602 (2003); Schlomai et al., Hepatology, 37:764 (2003); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2783 (2003); Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2014 (2003); e FIELDS VIROLOGY, Kni- pe et al. (eds.), 4a ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (2001)); Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) (Banerjea et al., Mol. Ther., 8:62 (2003); Song et al., J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA, 289:1494 (2003); Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:183 (2003)); vírus da Herpes (Jia et al., J. Virol., 77:3301 (2003)); e Papil-loma Vírus Humano (HPV) (Hall et al., J. Virol., 77:6066 (2003); Jiang et al., Oncogene, 21:6041 (2002)).
[000169] Sequências de ácido nucleico de Filovirus exemplares que podem ser silenciadas incluem, mas não se limitam a sequências de ácido nucleico codificando proteínas estruturais (por exemplo, VP30, VP35, nucleoproteína (NP), polimerase proteína (L-pol)) e proteínas associadas a membrana (por exemplo, VP40, glicoproteína (GP), VP24). Sequências de genoma completas para vírus Ebola são esta-belecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_002549; AY769362; NC_006432; NC_004161; AY729654; AY354458; AY142960; AB050936; AF522874; AF499101; AF272001; e AF086833. Sequências VP24 de vírus Ebola são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank U77385 ed AY058897. Sequências L-pol do vírus Ebola são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank X67110. Sequências VP40 do vírus Ebola são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank AY058896. Sequências NP do vírus Ebola são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank AY058895. Sequências GP do vírus Ebola são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank AY058898; Sanchez et al., Virus Res., 29:215-240 (1993); Will et al., J. Virol., 67:1203-1210 (1993); Volchkov et al., FEBS Lett., 305:181-184 (1992); e Patente US 6.713.069. Sequências do vírus Ebola adicionais são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank L11365 e X61274. Sequências de genoma completas para vírus Marburg são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_001608; AY430365; AY430366; e AY358025. Sequências GP de vírus Marburg são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank AF005734; AF005733; e AF005732. Sequências VP35 de vírus Mar-burg são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank AF005731 e AF005730. Sequências de vírus Marburg adicionais são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank X64406; Z29337; AF005735; e Z12132. Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo sequências de ácido nucleico de vírus Ebo-la e vírus Marburg incluem aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente US 2007/0135370 e Pedido Provisional US 61/286.741, depositado em 15 de dezembro de 2009, as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[000170] Sequências de ácido nucleico de Arenavírus exemplares que podem ser silenciadas incluem, mas não estão limitadas a, sequências de ácido nucleico codificando nucleoproteína (NP), glicopro- teína (GP), L-polimerase (L) e proteína Z (Z). Sequências de genoma completas para vírus Lassa são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_004296 (LASV segmento S) e NC_004297 (LASV segmento L). Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo sequências de ácido nucleico de vírus Lassa incluem aquelas descritas no Pedido Provisório US 61/319.855, depositado em 31 de março de 2010, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os fins.
[000171] Sequências de ácido nucleico hospedeiras exemplares que podem ser silenciadas incluem, mas não estão limitadas a sequências de ácido nucleico que codificam fatores de hospedeiro, tal como fator tecidual (TF), que são conhecidas por desempenharem um papel na patogênese de vírus da febre hemorrágica. A sequência de mRNA de TF é estabelecida no N.° de Acessão Genbank NM_001993. Aqueles versados na técnica apreciarão que TF é também conhecido como F3, fator de coagulação III, tromboplastina e CD142. Exemplos não limi- tantes de moléculas de siRNA tendo como alvo sequências de ácido nucleico de TF incluem aquelas descritas no Pedido Provisório US 61/319.855, depositado em 31 de março de 2010, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os fins.
[000172] Sequências de ácido nucleico de vírus da Influenza exem-plares que podem ser silenciadas incluem, mas não estão limitadas a sequências de ácido nucleico codificando nucleoproteína (NP), proteí-nas de matriz (M1 e M2), proteínas não estruturais (NS1 e NS2), RNA polimerase (PA, PB1, PB2), neuraminidase (NA) e hemaglutinina (HA). Sequências NP de Influenza A estão estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_004522; AY818138; AB166863; AB188817; AB189046; AB189054; AB189062; AY646169; AY646177; AY651486; AY651493; AY651494; AY651495; AY651496; AY651497; AY651498; AY651499; AY651500; AY651501; AY651502; AY651503; AY651504; AY651505; AY651506; AY651507; AY651509; AY651528; AY770996; AY790308; AY818138; e AY818140. Sequências PA de Influenza A estão estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank AY818132; AY790280; AY646171; AY818132;AY818133; AY646179; AY818134; AY551934; AY651613; AY651610; AY651620; AY651617; AY651600; AY651611; AY651606; AY651618; AY651608; AY651607; AY651605; AY651609; AY651615; AY651616; AY651640; AY651614; AY651612; AY651621; AY651619; AY770995; e AY724786. Exemplos não limitantes moléculas de siRNA tendo como alvo sequências de ácido nucleico do vírus da Influenza incluem aque-las descritas na Publicação de Pedido de Patente US 2007/0218122, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os fins.
[000173] Sequências de ácido nucleico de vírus da hepatite exemplares que podem ser silenciadas incluem, mas não se limitam a, sequências de ácido nucleico envolvidas em transcrição e tradução (por exemplo, En1, En2, X, P) e sequências de ácido nucleico codificando proteínas estruturais (por exemplo, proteínas núcleo incluindo proteína C e proteínas relacionadas a C, proteínas capsídeo e envelope incluindo proteínas S, M e/ou L, ou fragmentos da mesma) (ver, por exemplo, FIELDS VIROLOGY, supra). Sequências de ácido nucleico do vírus da Hepatite C (HCV) exemplares que podem ser silenciadas incluem, mas não estão limitadas a, região 5’ não traduzida (5’-UTR), região 3’ não traduzida (3’-UTR), região de códon de iniciação de tradução de poliproteína, suqência de sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) e/ou sequências de ácido nucleico codificando a proteína núcleo, pro-teína E1, proteína E2, proteína p7, proteína NS2, NS3 pro- tease/helicase, proteína NS4A, proteína NS4B, proteína NS5A e/ou RNA polimerase dependente de NS5B RNA. Sequências de genoma de HCV são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_004102 (genótipo HCV 1a), AJ238799 (genótipo HCV 1b), NC_009823 (genótipo HCV 2), NC_009824 (genótipo HCV 3), NC_009825 (genótipo HCV 4), NC_009826 (genótipo HCV 5) e NC_009827 (genótipo HCV 6). Sequências de ácido nucleico de vírus da Hepatite A são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_001489; sequências de ácido nucleico de vírus da Hepa- tite B são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_003977; sequências de ácido nucleico de vírus da Hepatite D são estabelecidas em N.° de Acessão Genbank NC_001653; sequências de ácido nucleico de vírus da Hepatite E são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_001434; e sequências de ácido nucleico de vírus da Hepatite G são estabelecidas em, por exemplo, N.° de Acessão Genbank NC_001710. O silenciamento de sequências que codificam genes associados com infecção viral e sobrevivência pode ser usado convenientemente em combinação com a administração de agentes convencionais usados para tratar a condição viral. Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo sequências de ácido nucleico do vírus da hepatite incluem aquelas descritas na Publicação de Pedido de Patente US 2006/0281175, 2005/0058982 e 2007/0149470; Patente US 7.348.314; e Pedido PCT N.° PCT/CA2010/000444, intitulado "Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression", depositado em 19 de março de 2010, tendo o N.° do Procurador 020801-008910PC, as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência na íntegra para todos os fins.
[000174] Genes associados com doenças e distúrbios metabólicos (por exemplo, distúrbios nos quais o fígado é o alvo e doenças e distúrbios do fígado) incluem, mas não estão limitados a, genes expressos em dislipidemia tal como, por exemplo, apolipoproteína B (APOB) (N.° de Acessão Genbank NM_000384), apolipoproteína CIII (APOC3) (N.° de Acessão Genbank NM_000040 e NG_008949 REGIÃO: 5001..8164), apolipoproteína E (APOE) (N.° de Acessão Genbank NM_000041 e NG_007084 REGIÃO: 5001..8612), proproteína conver- tase subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9) (N.° de Acessão Genbank NM_174936), diacilglicerol O-aciltransferase tipo 1 (DGAT1) (N.° de Acessão Genbank NM_012079), diacilglicerol O-aciltransferase tipo 2 (DGAT2) (N.° de Acessão Genbank NM_032564), receptores X do fí-gado, tal como, LXRα e LXRβ (N.° de Acessão Genbank NM_007121), receptores farnesoide X (FXR) (N.° de Acessão Genbank NM_005123), proteína de ligação de elemento regulador de esterol (SREBP), protease de sítio 1 (S1P), 3-hidróxi-3-metilglutaril coenzima- A redutase (HMG coenzima-A redutase); e genes expressos em diabetes tal como, por exemplo, glicose 6-fosfatase (ver, por exemplo, Forman et al., Cell, 81:687 (1995); Seol et al., Mol. Endocrinol., 9:72 (1995), Zavacki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:7909 (1997); Sakai et al., Cell, 85:1037-1046 (1996); Duncan et al., J. Biol. Chem., 272:12778-12785 (1997); Willy et al., Genes Dev., 9:1033-1045 (1995); Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272:3137-3140 (1997); Janowski et al., Nature, 383:728-731 (1996); e Peet et al., Cell, 93:693-704 (1998)).
[000175] Aqueles versados na técnica apreciarão que genes associ-ados a doenças e distúrbios metabólicos (por exemplo, doenças e dis-túrbios nos quais o fígado é um alvo e doenças e distúrbios do fígado) incluem genes que são expressos no fígado em si, bem como genes expressos em outros órgãos e tecidos. Silenciamento de sequências que codificam genes associados a doenças e distúrbios metabólicos convenientemente pode ser usado em combinação com a administra-ção de agentes convencionais utilizados para tratar a doença ou dis-túrbio. Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo o gene APOB incluem aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente 2006/0134189, 2006/0105976 e 2007/0135372 e Publicação PCT N.° WO 04/091515, as divulgações das quais são aqui incor-poradas por referência na sua totalidade para todos os efeitos. Exem-plos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo o gene APOC3 incluem aquelas descritas no Pedido PCT N.° PCT/CA2010/000120, depositado em 26 de janeiro de 2010, cuja di-vulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os efeitos. Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo o gene PCSK9 incluem aquelas descritas nas Publicações de Pe-dido de Patente US 2007/0173473, 2008/0113930 e 2008/0306015, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência na sua to-talidade para todos os efeitos. Moléculas de siRNA exemplares tendo como alvo o gene DGAT1 podem ser projetadas usando os compostos antissenso descritos na Publicação de Pedido de Patente US 2004/0185559, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os efeitos. Moléculas de siRNA exemplares tendo como alvo o gene DGAT2 podem ser projetadas usando os compostos antissenso descritos na Publicação de Pedido de Patente US 2005/0043524, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os efeitos.
[000176] Genes associados a tumorigênese ou transformação de célula (por exemplo, câncer ou outra neoplasia) incluem, por exemplo, genes envolvidos na ubiquitinação de p53, ubiquitinação de c-Jun, de- acetilação de histona, regulação do ciclo celular, regulação transcricio- nal e suas combinações. Exemplos não limitantes de sequências de genes associadas com tumorigênese e transformação de célula inclu-em serina/treonina cinases, tal como cinase tipo polo 1 (PLK-1) (N.° de Acesssão Genbank NM_005030; Barr et al, Nat. Rev. Mol. Cell Biol, 5:429-440 (2004)) e cinase dependente de ciclina 4 (CDK4) (N.° de Acesssão Genbank NM_000075); ubiquitina ligases, tal como COP1 (RFWD2; N.° de Acesssão Genbank NM_022457 e NM_001001740) e ring-box 1 (RBX1) (ROC1; N.° de Acesssão Genbank NM_014248); tirosina cinase, tal como WEE1 (N.° de Acesssão Genbank NM_003390 e NM_001143976); cinesinas mitóticas, tal como Eg5 (KSP, KIF11; N.° de Acesssão Genbank NM_004523); fatores de transcrição, tal como, forkhead box M1 (FOXM1) (N.° de Acesssão Genbank NM_202002, NM_021953 e NM_202003) e RAM2 (R1 ou CDCA7L; N.° de Acesssão Genbank NM_018719, NM_001127370 e NM_001127371); inibidores de apoptose, tal como XIAP (N.° de Aces- ssão Genbank NM_001167); subunidades de signalossoma COP9, tal como CSN1 CSN2, CSN3, CSN4, CSN5 (JAB1; N.° de Acesssão Genbank NM_006837); CSN6, CSN7A, CSN7B e CSN8; e histona de- acetilases, tal como HDAC1, HDAC2 (N.° de Acesssão Genbank NM_001527), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, etc
[000177] Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo o gene PLK-1 incluem aquelas descritas nas Publicações de Pedido de Patente US 2005/0107316 e 2007/0265438; Publicação PCT WO 09/082817, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos. Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo os genes Eg5 e XIAP incluem aquelas descritas na Publicação de Pedido de Patente US 2009/0149403, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os efeitos. Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo o gene CSN5 incluem aquelas descritas na Publicação PCT WO 09/129319, a divulgação da qual é aqui incor-porada por referência na íntegra para todos os efeitos. Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo os genes COP1, CSN5, RBX1, HDAC2, CDK4, WEE1, FOXM1 e RAM2 incluem aque-las descritas no Pedido Provisional US 61/245.143, depositado em 23 de setembro de 2009, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os efeitos.
[000178] Exemplos adicionais de sequências de genes associadas com tumorigênese ou transformação de célula incluem sequências de translocação, tal como genes de fusão MLL, BCR-ABL (Wilda et al., Oncogene, 21:5716 (2002); Scherr et al., Blood, 101:1566 (2003)), TEL-AML1, EWS-FLI1, TLS-FUS, PAX3-FKHR, BCL-2, AML1-ETO e AML1-MTG8 (Heidenreich et al., Blood, 101:3157 (2003)); sequências superexpressas, tal como genes de resistência a múltiplos fármacos (Nieth et al., FEBS Lett., 545:144 (2003); Wu et al, Cancer Res. 63:1515 (2003)), ciclinas (Li et al., Cancer Res., 63:3593 (2003); Zou et al., Genes Dev., 16:2923 (2002)), beta-catenina (Verma et al., Clin Cancer Res., 9:1291 (2003)), genes da telomerase (Kosciolek et al., Mol Cancer Ther., 2:209 (2003)), c-MYC, N-MYC, BCL-2, receptores de fator de crescimento (por exemplo, EGFR/ErbB1 (N.° de Acesssão Genbank NM_005228, NM_201282, NM_201283 e NM_201284; ver também, Nagy et al. Exp. Cell Res., 285:39-49 (2003)), ErbB2/HER-2 (N.° de Acesssão Genbank NM_004448 e NM_001005862), ErbB3 (N.° de Acesssão Genbank NM_001982 e NM_001005915) e ErbB4 (N.° de Acesssão Genbank NM_005235 e NM_001042599)), e sequências mutadas, tal como RAS (Tuschl e Borkhardt, Mol. Interven tions, 2:158 (2002)). Exemplos não limitantes de moléculas de siRNA tendo como alvo o gene de EGFR incluem aquelas descritas na Publi-cação de Pedido de Patente US 2009/0149403, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os efeitos. Moléculas de siRNA que têm como alvo genes de VEGFR são estabelecidas em, por exemplo, GB 2396864; Publicação de Pedido de Patente US 2004/0142895; e CA 2456444, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os efeitos.
[000179] Silenciamento de sequências que codificam enzimas de reparo de DNA encontra uso em combinação com a administração de agentes quimioterápicos (Collis et al, Cancer Res., 63:1550 (2003)). Genes codificando proteínas associadas com migração de tumor tam-bém são sequências alvo de interesse, por exemplo, integrinas, selec- tinas e metaloproteinases. Os exemplos acima não são exclusivos. Aqueles de habilidade na arte entenderão que qualquer sequência de gene inteira ou parcial que facilita ou promove tumorigênese ou trans formação celular, crescimento de tumor ou migração de tumor pode ser incluída como uma sequência de modelo.
[000180] Genes angiogênicos são capazes de promover a formação de novos vasos. Genes angiogênicos de interesse incluem, mas não estão limitados a fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Reich et al, Mol. Vis., 9:210 (2003)), fator de crescimento placentário (PGF), VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1) e afins. Moléculas de siRNA que têm como alvo genes de VEGFR estão estabelecidas em, por exemplo, GB 2396864; Publicação de Pedido de Patente US 2004/0142895; e CA 2456444, as divulgações das quais são aqui in-corporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000181] Geens imunomoduladores são genes que modulam uma ou mais respostas imunes. Exemplos de genes imunomoduladores inclu-em, sem limitação, fatores de crescimento (por exemplo, TGF-α TGF- β, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, GM-CSF, SCF, etc.), interleuci- nas (por exemplo, IL-2, IL-4, IL-12 (Hill et al., J. Immunol., 171:691 (2003)), IL-15, IL-18, IL-20, etc.), interferons (por exemplo, IFN-α, IFN- β, IFN-Y, etc.) e TNF. Genes de ligante Fas e Fas também são se-quências alvo imunomoduladoras de interesse (Song et al., Nat. Med., 9:347 (2003)). Genes codificando moléculas de sinalização secundárias em células linfóides e hematopoiéticas também estão incluídos na presente invenção, por exemplo, cinases da família Tec, tal como tiro- sina cinase de Bruton (Btk) (Heinonen et al., FEBS Lett., 527:274 (2002)).
[000182] Genes de ligante de receptor celular incluem ligantes que são capazes de ligar a receptores de superfície celular (por exemplo, receptores de citocina, receptores de fator de crescimento, receptores com atividade de tirosina cinase, receptores acoplados a proteína G, receptor de insulina, receptor de EPO, etc.) para modular (por exemplo, inibir) a via fisiológica na qual o receptor está envolvido (por exemplo, proliferação celular, tumorigênese, transformação de célula, mitogênese, etc.). Exemplos não limitantes de genes de ligante de re-ceptor celular incluem citocinas (por exemplo, TNF-α, interferons, tal como IFN-α,IFN-β, e IFN-Y, interleucinas, tal como IL-1 α, IL-1 β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23, IL-27, quimiocinas, etc.), fatores de crescimento (por exemplo, EGF, HB-EGF, VEGF, PEDF, SDGF, bFGF, HGF, TGF-α TGF-β, BMP1- BMP15, PDGF, IGF, NGF, β-NGF, BDNF, NT3, NT4, GDF-9, CGF, G- CSF, GM-CSF, GDF-8, EPO, TPO, etc.), insulina, glucagon, ligantes de receptor acoplado a proteína G, etc.
[000183] Modelos de codificação para uma expansão de repetições do trinucleotídeo (por exemplo, repetições CAG) encontram uso em silenciar sequências patogênicas em distúrbios neurodegenerativos causados pela expansão de repetições de trinucleotídeo, tal como atrofia muscular espinobulbular e Doença de Huntington (Caplen et al. Hum. Mol. Genet., 11:175 (2002)).
[000184] Além de sua utilidade em silenciar a expressão de qualquer um dos genes descritos anteriormente para fins terapêuticos, o siRNA aqui descrito também é útil a em aplicações de pesquisa e desenvol-vimento, bem como aplicações diagnósticas, profiláticas, prognósticas, clínicas e outras aplicações de cuidados com a saúde. Como um exemplo não limitante, o siRNA pode ser usado em estudos de valida-ção de alvo dirigidos a testar se um gene de interesse tem potencial para ser um alvo terapêutico. O siRNA também pode ser utilizado em estudos de identificação de alvo dirigidos a descobrir genes como alvos terapêuticos potenciais. e) Modalidades de siRNA exemplares
[000185] Em algumas modalidades, cada fita da molécula de siRNA compreende cerca de 15 a 60 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cerca de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 ou 19-25 nucleo- tídeos de comprimento, ou 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento). Em uma determinada modalidade, o siRNA é quimicamente sintetizado. As moléculas de siRNA da inven-ção são capazes de silenciar a expressão de uma sequência alvo in vitro e/ou in vivo.
[000186] Em outras modalidades, o siRNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado. Em determinadas modalidades, o siRNA compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais nucleotídeos modificados na região de fita dupla. Em modalidades particulares, menos de cerca de 50% (por exemplo, menos do que cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%) dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos modificados. Em modalidades preferidas, de cerca de 1% a cerca de 50% (por exemplo, de cerca de 5%-50%, 10%-50%, 15%- 50%, 20%-50%, 25%-50%, 30%-50%, 35%-50%, 40%-50%, 45%- 50%, 5%-45%, 10%-45%, 15%-45%, 20%-45%, 25%-45%, 30%-45%, 35%-45%, 40%-45%, 5%-40%, 10%-40%, 15%-40%, 20%-40%, 25%- 40%, 30%-40%, 35%-40%, 5%-35%,10%-35%, 15%-35%, 20%-35%, 25%-35%, 30%-35%, 5%-30%, 10%-30%, 15%-30%, 20%-30%, 25%- 30%, 5%-25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-25%, 5%-20%, 10%-20%, 15%-20%, 5%-15%, 10%-15% ou 5%-10%) dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos modificados.
[000187] Em modalidades adicionais, o siRNA compreende nucleotí- deos modificados incluindo, mas não se limitando a, nucleotídeos 2’-O- metil (2’OMe), nucleotídeos 2’-deóxi-2’-fluor (2’F), nucleotídeos 2’- deóxi, nucleotídeos 2’-O-(2-metoxietil) (MOE), nucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA) e suas misturas. Em modalidades preferidas, o siRNA compreende nucleotídeos 2’OMe (por exemplo, nucleotí- deos 2’OMe purina e/ou pirimidina) como, por exemplo, nucleotídeos 2’OMe-guanosina, nucleotídeos 2’OMe-uridina, nucleotídeos 2’OMe- adenosina, nucleotídeos 2’OMe-citosina ou suas misturas. Em uma determinada modalidade, o siRNA compreende pelo menos um nucle- otídeo 2’OMe-guanosina, nucleotídeo 2’OMe-uridina ou suas misturas. Em certos casos, o siRNA não compreende nucleotídeos 2’-OMe- citosina. Em outras modalidades, o siRNA compreende uma estrutura de grampo (hairpin).
[000188] Em determinadas modalidades, o siRNA compreende nu- cleotídeos modificados em uma fita (isto é, senso ou antissenso) ou ambas as fitas da região de fita dupla da molécula de siRNA. De prefe-rência, nucleotídeos de uridina e/ou guanosina são modificados em posições seletivas na região de fita dupla do siRNA dúplex. No que se refere a modificações de nucleotídeo uridina, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais dos nucleotídeos uridina na fita senso e/ou antissenso podem ser um nucleotídeo uridina modificado, tal como um nucleotídeo 2’OMe-uridina. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo uridina na fita senso e/ou antissenso é um nucleotídeo 2’OMe-uridina. No que se refere a modificações de nucleotídeo gua- nosina, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais dos nu- cleotídeos guanosina na fita senso e/ou antissenso podem ser um nu- cleotídeo guanosina modificado, tal como um nucleotídeo 2’OMe- guanosina. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo guanosina na fita senso e/ou antissenso é um nucleotídeo 2’OMe-guanosina.
[000189] Em determinadas modalidades, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais motivos 5’-GU-3’ em uma sequência de siRNA podem ser modificados, por exemplo, introduzindo incompa-tibilidades para eliminar os motivos 5’-GU-3’ e/ou introduzindo nucleo- tídeos modificados, tal como nucleotídeos 2’OMe. O motivo 5’-GU-3’ pode ser na fita senso, na fita antissenso ou ambas as fitas da se-quência de siRNA. Os motivos 5’-GU-3’ podem ser adjacentes uns aos outros ou, alternativamente, eles podem ser separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais nucleotídeos.
[000190] Em algumas modalidades, uma molécula de siRNA modifi-cado é menos imunoestimuladora do que uma correspondente se-quência de siRNA sem modificações. Em tais modalidades, a molécula de siRNA modificado com propriedades imunoestimuladoras reduzidas vantajosamente retém atividade de RNAi contra a sequência alvo. Em outra modalidade, as propriedades imunoestimuladoras da molécula de siRNA modificado e sua capacidade de silenciar a expressão do gene alvo podem ser equilibradas ou otimizadas pela introdução de modificações 2’OMe mínimas e seletivas dentro da sequência de siR-NA tal como, por exemplo, dentro da região de fita dupla do siRNA dú- plex. Em certos casos, o siRNA modificado é pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% menos imunoestimuladora do que o correspondente siRNA não modificado. Será prontamente aparente para aqueles versados na técnica que as propriedades imunoestimuladoras da mo-lécula de siRNA modificado e da molécula de siRNA não modificado correspondente podem ser determinadas, por exemplo, medindo níveis de INF-α e/ou IL-6 de cerca de duas a cerca de doze horas após a administração sistêmica em um mamífero ou transfecção de uma célula respondente de mamífero usando um adequado sistema de distribuição baseado em lipídeos (tal como o sistema de distribuição LNP divulgado neste documento).
[000191] Em outras modalidades, uma molécula de siRNA modificado tem uma IC50 (isto é, meia concentração inibidora máxima) menor ou igual a dez vezes aquela do correspondente siRNA não modificado (isto é, o siRNA modificado tem uma IC50 que é menor ou igual a dez vezes a IC50 do siRNA correspondente não modificado). Em outras modalidades, o siRNA modificado tem uma IC50 menor ou igual a três vezes aquela da correspondente sequência de siRNA não modificado. Em ainda outras modalidades, o siRNA modificado tem uma IC50 menor ou igual a duas vezes aquela do correspondente siRNA não modi-ficado. Será prontamente perceptível para aqueles de habilidade na arte que uma curva de dose-resposta pode ser gerada e os valores de IC50 para o siRNA modificado e o siRNA não modificado correspon-dente podem ser determinados prontamente usando métodos conhe-cidos por aqueles de habilidade na arte.
[000192] Em outra modalidade, uma molécula de siRNA não modifi-cado ou modificado é capaz de silenciar pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da expressão da sequência alvo relativa a um controle negativo (por exemplo, tampão apenas, uma sequência de siRNA que tem como alvo um gene diferente, uma sequência de siRNA embaralhada, etc.). Em ainda outra modalidade, uma molécula de siRNA modificado é ca-paz de silenciar pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da expressão da sequência alvo relativa à sequência de siRNA não modifi cado correspondente.
[000193] Em algumas modalidades, a molécula de siRNA não com-preende modificações na espinha dorsal de fosfato, por exemplo, na fita senso e/ou antissenso da região de fita dupla. Em outras modalidades, o siRNA compreende uma, duas, três, quatro ou mais modificações na espinha dorsal de fosfato, por exemplo, na fita senso e/ou antissenso da região de fita dupla. Em modalidades preferidas, o siR NA não compreende modificações na espinha dorsal de fosfato.
[000194] Em modalidades adicionais, o siRNA não compreende nu- cleotídeos 2’-deóxi, por exemplo, na fita senso e/ou antissenso da re-gião de fita dupla. Ainda em modalidades adicionais, o siRNA compre-ende um, dois, três, quatro ou mais 2’-deóxi nucleotídeos, por exemplo, na fita senso e/ou antissenso da região de fita dupla. Em modalidades preferidas, o siRNA não compreende nucleotídeos 2’-deóxi.
[000195] Em certos casos, o nucleotídeo na extremidade 3’ da região de fita dupla na fita senso e/ou antissenso não é um nucleotídeo modi-ficado. Em outros casos, os nucleotídeos perto da extremidade 3’ (por exemplo, dentro de um, dois, três ou quatro nucleotídeos da extremi-dade 3’) da região de fita dupla da fita senso e/ou antissenso não são nucleotídeos modificados.
[000196] As moléculas de siRNA aqui descritas podem ter saliências 3’ de um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos em um ou ambos os lados da região de fita dupla, ou podem não ter saliências (isto é, têm extremidades cegas) em um ou ambos os lados da região de fita dupla. Em determinadas modalidades, a saliência 3’ na fita senso e/ou antissenso independentemente compreende um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos modificados, tal como nucleotídeos 2’OMe e/ou qualquer outro nucleotídeo modificado aqui descrito ou conhecido na arte.
[000197] Em modalidades particulares, siRNAs são administrados usando um sistema veículo, tal como uma partícula de ácido nucleico- lipídeo. Em uma modalidade preferida, a partícula de ácido nucleico- lipídeo compreende: (a) uma ou mais moléculas de siRNA; (b) um lipí-deo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo; e (c) um lipídeo não catiônico (por exemplo, DPPC, DSPC, DSPE e/ou colesterol). Em cer-tos casos, a partícula de ácido nucleico-lipídeo ainda pode compreen-der um lipídeo conjugado que impede agregação de partículas (por exemplo, PEG-DAA e/ou POZ-DAA).
2. dsRNA de Substrato Dicer
[000198] Como usado aqui, o termo "dsRNA de substrato Dicer" ou "molécula de RNAi precursora" destina-se a incluir qualquer molécula precursora que é processada in vivo por Dicer para produzir um siRNA ativo o qual é incorporado no complexo RISC para interferência de RNA de um gene alvo.
[000199] Em uma modalidade, o dsRNA de substrato Dicer tem um comprimento suficiente tal que ele seja processado por Dicer para produzir um siRNA. De acordo com esta modalidade, o dsRNA de substrato Dicer compreende (i) uma primeira sequência de oligonucle- otídeo (também denominada fita senso) que é de entre 25 e cerca de 60 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cerca de 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35 ou 25-30 nucleotídeos de comprimento), de preferência entre cerca de 25 e cerca de 30 nucleotídeos de compri-mento (por exemplo, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de compri-mento), e (ii) uma segunda sequência de oligonucleotídeo (também denominada fita antissenso) que anela com a primeira sequência sob condições biológicas, tal como as condições encontradas no citoplas-ma de uma célula. A segunda sequência de oligonucleotídeo pode ser de entre 25 e cerca de 60 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cerca de 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35 ou 25-30 nucleotí- deos de comprimento) e é de preferência de entre cerca de 25 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento). Além disso, uma região de uma das sequências, particularmente da fita antissenso do dsRNA de substrato Dicer, tem um comprimento de sequência de pelo menos 19 nu- cleotídeos, por exemplo, de cerca de 19 a cerca de 60 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 19-60, 19-55, 19-50, 19-45, 19-40, 19-35, 1930 ou 19-25 nucleotídeos), de preferência de cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos (por exemplo, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos) que são suficientemente complementares para uma sequência de nucleo- tídeo do RNA produzido do gene alvo para disparar uma resposta de RNAi.
[000200] Em uma segunda modalidade, o dsRNA de substrato Dicer tem várias propriedades as quais realçam seu processamento por Di-cer. De acordo com esta modalidade, o dsRNA tem um comprimento suficiente de forma que ele é processado por Dicer para produzir um siRNA e tem pelo menos uma das seguintes propriedades: (i) o dsRNA é assimétrico, por exemplo, tem uma saliência 3’ na fita antissenso; e/ou (ii) o dsRNA tem uma extremidade 3’ modificada na fita senso pa-ra dirigir a orientação de ligação e processamento Dicer do dsRNA para um siRNA ativo. De acordo com esta última modalidade, a fita senso compreende de cerca de 22 a cerca de 28 nucleotídeos e a fita an- tissenso compreende de cerca de 24 a cerca de 30 nucleotídeos.
[000201] Em uma modalidade, o dsRNA de substrato Dicer tem uma saliência na extremidade 3’ da fita antissenso. Em outra modalidade, a fita senso é modificada para ligação e processamento Dicer por modi-ficadores apropriados localizados na extremidade 3’ da fita senso. Mo-dificadores apropriados incluem nucleotídeos tais como deosxirribonu- cleotídeos, aciclonucleotídeos e afins e moléculas impedidas esteri- camente, tal como moléculas fluorescentes e afins. Quando são usados modificadores de nucleotídeos, eles substituem ribonucleotídeos no dsRNA, de modo que o comprimento do dsRNA não muda. Em outra modalidade, o dsRNA de substrato Dicer tem uma saliência na ex-tremidade 3’ da fita antissenso e a fita senso é modificada para pro-cessamento Dicer. Em outra modalidade, a extremidade 5' da fita senso tem um fosfato. Em outra modalidade, a extremidade 5' da fita an- tissenso tem um fosfato. Em outra modalidade, a fita antissenso ou a fita senso ou ambas as fitas têm um ou mais nucleotídeos 2’-O-metil (2’OMe) modificados. Em outra modalidade, a fita antissenso contém nucleotídeos 2’OMe modificados. Em outra modalidade, a fita antis- senso contém uma saliência 3’ que é compreendida de nucleotídeos 2’OMe modificados. A fita antissenso também poderia incluir nucleotí- deos 2’OMe modificados adicionais. As fitas senso e antissenso ane-lam sob condições biológicas, tal como as condições encontradas no citoplasma de uma célula. Além disso, uma região de uma das se-quências, particularmente da fita antissenso, do dsRNA de substrato Dicer tem um comprimento de sequência de pelo menos cerca de 19 nucleotídeos, em que estes nucleotídeos estão na região de 21 nucle- otídeos adjacente à extremidade 3’ da fita antissenso e são suficien-temente complementares para uma sequência de nucleotídeos do RNA produzida do gene alvo. Além disso, de acordo com esta modalidade, o dsRNA de substrato Dicer também pode ter uma ou mais das seguintes propriedades adicionais: (a) a fita antissenso tem um deslocamento à direita do 21-mer típico (isto é, a fita antissenso inclui nu- cleotídeos no lado direito da molécula em comparação com o 21-mer típico); (b) as fitas podem não ser completamente complementares, isto é, as fitas podem conter emparelhamentos incompatíveis simples; e (c) modificações de base, tal como ácido(s) nucleico(s) bloquea- do(s), podem ser incluídas na extremidade 5' da fita senso.
[000202] Em uma terceira modalidade, a fita senso compreende cerca de 25 a cerca de 28 nucleotídeos (por exemplo, 25, 26, 27 ou 28 nucleotídeos), em que os 2 nucleotídeos na extremidade 3’ da fita senso são desoxirribonucleotídeos. A fita senso contém um fosfato na extremidade 5’. A fita antissenso compreende de cerca de 26 a cerca de 30 nucleotídeos (por exemplo, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos) e contém uma saliência 3’ de 1-4 nucleotídeos. Os nucleotídeos com-preendendo a saliência 3’ são modificados com ribonucleotídeos modi-ficados 2’OMe. A fita antissenso contém nucleotídeos modificados 2’OMe alternados começando no primeiro monômero da fita antissen- so adjacente à saliência 3’ e se estendendo por 15-19 nucleotídeos do primeiro monômero adjacente à saliência 3’. Por exemplo, para uma fita antissenso de 27 nucleotídeos e contando a primeira base na ex-tremidade 5’ da fita antissenso como o número de posição 1, modifica-ções 2’OMe seriam colocadas nas bases 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26 e 27. Em uma modalidade, o dsRNA de substrato Dicer tem a seguinte estrutura:
Figure img0007
onde "X" = RNA, "p" = um grupo fosfato, "X" = 2’OMe RNA, "Y" é um domínio de saliência composto por 1, 2, 3 ou 4 monômeros de RNA que são opcionalmente monômeros de RNA 2’OMe e "D" = DNA. A fita superior é a fita senso, e a fita inferior é a fita antissenso.
[000203] Em uma quarta modalidade, o dsRNA de substrato Dicer tem várias propriedades que realçam seu processamento por Dicer. De acordo com esta modalidade, o dsRNA tem um comprimento suficiente, tal que ele seja processado por Dicer para produzir um siRNA e pelo menos uma das seguintes propriedades: (i) o dsRNA é assimétrico, por exemplo, tem uma saliência 3’ na fita senso; e (ii) o dsRNA tem uma extremidade 3’ modificada na fita antissenso para dirigir a orientação de ligação e processamento Dicer do dsRNA para um siRNA ativo. De acordo com esta modalidade, a fita senso compreende de cerca de 24 a cerca de 30 nucleotídeos (por exemplo, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos) e a fita antissenso compreende de cerca de 22 a cerca de 28 nucleotídeos (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 nucleotídeos). Em uma modalidade, o dsRNA de substrato Dicer tem uma saliência na extremidade 3’ da fita senso. Em outra modalidade, a fita antissenso é modificada para ligação e processamento Di cer por modificadores apropriados localizados na extremidade 3’ da fita antissenso. Modificadores apropriados incluem nucleotídeos tais como desoxirribonucleotídeos, aciclonucleotídeos e afins e moléculas impedidas estericamente como moléculas fluorescentes e afins. Quando são usados modificadores de nucleotídeo, eles substituem ribonucleotídeos no dsRNA tal que o comprimento do dsRNA não mu-da. Em outra modalidade, o dsRNA tem uma saliência extremidade 3’ da fita senso e a fita antissenso é modificada por processamento Dicer. Em uma modalidade, a fita antissenso tem um 5’-fosfato. As fitas senso e antissenso anelam sob condições biológicas, tal como as condições encontradas no citoplasma de uma célula. Além disso, uma região de uma das sequências, particularmente da fita antissenso, do dsRNA tem um comprimento de sequência de pelo menos 19 nucleo- tídeos, em que estes nucleotídeos são adjacentes à extremidade 3’ da fita antissenso e são suficientemente complementares a uma sequência de nucleotídeos do RNA produzido do gene alvo. Além disso, de acordo com esta modalidade, o dsRNA de substrato Dicer também pode ter uma ou mais das seguintes propriedades adicionais: (a) a fita antissenso tem uma mudança esquerda do 21-mer típico (ou seja, a fita antissenso inclui nucleotídeos no lado esquerdo da molécula em comparação com o 21-mer típico); e (b) as fitas podem não ser total-mente complementares, ou seja, as fitas podem conter emparelha- mentos de incompatibilidade simples.
[000204] Em uma modalidade preferida, o dsRNA de substrato Dicer tem uma estrutura assimétrica, com a fita senso tendo um comprimento de 25 pares base e a fita antissenso tendo um comprimento de 27 pares base com uma saliência 3’ de 2 bases. Em certos casos, este dsRNA tendo uma estrutura assimétrica ainda contém 2 desoxinucleo- tídeos na extremidade 3’ da fita senso no lugar de dois dos ribonucleo- tídeos. Em outros casos, este dsRNA tendo uma estrutura assimétrica ainda contém modificações 2’OMe nas posições 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25 da fita antissenso (em que a primeira base na extremidade 5’ da fita antissenso é posição 1). Em certos casos adicionais, este dsRNA tendo uma estrutura assimétrica ainda contém uma saliência 3’ na fita antissenso compreendendo 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos 2’OMe (por exemplo, uma saliência 3’ de nucleotídeos 2’OMe em posições 26 e 27 na fita antissenso).
[000205] Em outra modalidade, dsRNAs de substrato Dicer podem ser criados selecionando primeiro uma sequências de siRNA de fita antissenso tendo um comprimento de pelo menos 19 nucleotídeos. Em alguns casos, o siRNA antissenso é modificado para incluir cerca de 5 a cerca de 11 ribonucleotídeos na extremidade 5’ para fornecer um comprimento de cerca de 24 a 30 nucleotídeos. Quando a fita antis- senso tem um comprimento de 21 nucleotídeos, 3-9, de preferência, 47, ou de mais preferência 6 nucleotídeos podem ser adicionados na extremidade 5’. Embora os ribonucleotídeos adicionados possam ser complementares à sequência de gene alvo, plena complementaridade entre a sequência alvo e o siRNA antissenso não é necessária. Ou se-ja, o siRNA antissenso resultante é suficientemente complementar à sequência alvo. Uma fita senso, então, é produzida que tem cerca de 22 a cerca de 28 nucleotídeos. A fita senso é substancialmente com-plementar à fita antissenso para anelar à fita antissenso sob condições biológicas. Em uma modalidade, a fita senso é sintetizada para conter uma extremidade 3’ modificada para dirigir processamento Dicer da fita antissenso. Em outra modalidade, a fita antissenso do dsRNA tem uma saliência 3’. Em outra modalidade, a fita senso é sintetizada para conter uma extremidade 3’ modificada para ligação e processamento Dicer e a fita antissenso do dsRNA tem uma saliência 3’.
[000206] Em uma modalidade relacionada, o siRNA antissenso pode ser modificado para incluir cerca de 1 a cerca de 9 ribonucleotídeos na extremidade 5’ para fornecer um comprimento de cerca de 22 a cerca de 28 nucleotídeos. Quando a fita antissenso tem um comprimento de 21 nucleotídeos, 1-7, de preferência, 2-5, ou de mais preferência 4 ri- bonucleotídeos podem ser adicionados na extremidade 3’. Os ribonu- cleotídeos adicionados podem ter qualquer sequência. Embora os ri- bonucleotídeos adicionados possam ser complementares à sequência de gene alvo, plena complementaridade entre a sequência alvo e o siRNA antissenso não é necessária. Ou seja, o siRNA antissenso re-sultante é suficientemente complementar à sequência alvo. Uma fita senso, então, é produzida que tem cerca de 24 a 30 nucleotídeos. A fita senso é substancialmente complementar à fita antissenso para anelar à fita antissenso sob condições biológicas. Em uma modalidade, a fita antissenso é sintetizada para conter uma extremidade 3’ modificada para dirigir processamento Dicer. Em outra modalidade, a fita senso do dsRNA tem uma saliência 3’. Em outra modalidade, a fita an- tissenso é sintetizada para conter uma extremidade 3’ modificada para ligação e processamento Dicer e a fita senso do dsRNA tem uma saliência 3’.
[000207] Sequências de dsRNA de substrato Dicer apropriadas podem ser identificadas, sintetizadas e modificadas usando qualquer meio conhecido na arte de projetar, sintetizar e modificar sequências de siRNA. Em modalidades particulares, dsRNAs de substrato Dicer são administrados usando um sistema veículo, tal como uma partícula de ácido nucleico-lipídeo. Em uma modalidade preferencial, a partícula de ácido nucleico-lipídeo compreende: (a) uma ou mais moléculas de dsRNA de substrato Dicer; (b) um lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo; e (c) um lipídeo não catiônico (por exemplo, DPPC, DSPC, DSPE e/ou colesterol). Em certos casos, a partícula de ácido nucleico-lipídeo ainda pode compreender um lipídeo conjugado que impede agregação de partículas (por exemplo, PEG-DAA e/ou POZ- DAA).
[000208] Modalidades adicionais relacionadas com os dsRNAs de substrato Dicer da invenção, bem como métodos de projetar e sintetizar tais dsRNAs, são descritas nas Publicações de Pedido de Patente US 2005/0244858, 2005/0277610 e 2007/0265220 e Pedido Provisional US 61/184.652, depositado em 5 de junho de 2009, as divulgações dos quais são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.
3. shRNA
[000209] Um "RNA de grampo (hairpin) pequeno" ou "RNA de grampo (hairpin) curto" ou "shRNA" inclui uma curta sequência de RNA que faz uma volta de grampo (hairpin) apertada que pode ser usada para silenciar expressão de gene via interferência de RNA. Os shRNAs da invenção podem ser sintetizados quimicamente ou transcritos de um cassete transcricional em um plasmídeo de DNA. A estrutura de gram-po (hairpin) do shRNA é clivada pela maquinaria celular em siRNA que é, então, ligado ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC).
[000210] Os shRNAs da invenção são tipicamente de cerca de 1560, 15-50, ou 15-40 (dúplex) nucleotídeos de comprimento, mais tipi-camente de cerca de 15-30, 15-25 ou 19-25 (dúplex) nucleotídeos de comprimento e são de preferência de cerca de 20-24, 21-22 ou 21-23 (dúplex) nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cada sequência complementar do shRNA de fita dupla é de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 ou 19-25 nucleotídeos de comprimento, de preferência, cerca de 20-24, 21-22, ou 21-23 nucleotídeos de comprimento e o shRNA de fita dupla é de cerca de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 ou 19-25 pares base de comprimento, de preferência cerca de 18-22, 19-20 1921 pares base de comprimento). Dúplices de shRNA podem compreender saliências 3’ de cerca de 1 a cerca de 4 nucleotídeos ou cerca de 2 a cerca de 3 nucleotídeos na fita antissenso e/ou terminais 5’- fosfato na fita senso. Em algumas modalidades, o shRNA compreende uma sequência de fita senso e/ou fita antissenso de cerca de 15 a 60 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cerca de 15-60, 15-55, 15-50, 15-45, 15-40, 15-35, 15-30 ou 15-25 nucleotídeos de comprimento), de preferência de cerca de 19 a cerca de 40 nucleotídeos de com-primento (por exemplo, cerca de 19-40, 19-35, 19-30 ou 19-25 nucleo- tideos de comprimento), de mais preferência de cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos de comprimento).
[000211] Exemplos não limitantes de shRNA incluem uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla montada a partir de uma molécula de fita simples, onde as regiões de senso e antissenso estão ligadas por um ligante à base de ácido nucleico ou não ácido nucleico; e uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla com uma estrutura secundária de grampo (hairpin) tendo regiões de senso e antissenso autocomple- mentares. Em modalidades preferidas, as fitas senso e antissenso do shRNA são ligadas por uma estrutura de alça compreendendo de cerca de 1 a cerca de 25 nucleotídeos, de cerca de 2 a cerca de 20 nu- cleotídeos, de cerca de 4 a cerca de 15 nucleotídeos, de cerca de 5 a cerca de 12 nucleotídeos, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos.
[000212] Sequências de shRNA apropriadas podem ser identificadas, sintetizadas e modificadas usando qualquer meio conhecido na arte de projetar, sintetizar e modificar sequências de siRNA. Em modalidades particulares, shRNAs são administrados usando um sistema veículo, tal como uma partícula de ácido nucleico-lipídeo. Em uma modalidade preferencial, a partícula de ácido nucleico-lipídeo compreende: (a) uma ou mais moléculas de shRNA; (b) um lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo; e (c) um lipídeo não catiônico (por exemplo, DPPC, DSPC, DSPE e/ou colesterol). Em certos casos, a partícula de ácido nucleico-lipídeo ainda pode compreender um lipídeo conjugado que impede agregação de partículas (por exemplo, PEG- DAA e/ou POZ-DAA).
[000213] Modalidades adicionais relacionadas com os shRNAs da invenção, bem como métodos de projetar e sintetizar tais shRNAs, são descritas no Pedido Provisional US 61/184.652, depositado em 5 de junho de 2009, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na íntegra para todos os efeitos.
4. aiRNA
[000214] Tal como siRNA, RNA interferente assimétrico (aiRNA) pode recrutar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) e levar ao silenciamento eficaz de uma variedade de genes em células de mamíferos através da mediação específica da sequência de clivagem da sequência de nucleotídeos alvo entre 10 e 11 em relação à extremidade 5’ da fita antissenso (Sun et al., Nat. Biotech., 26: 1379-1382 (2008)). Tipicamente, uma molécula de aiRNA compreende um curto dúplex de RNA que tem uma fita senso e uma fita antissenso, em que o dúplex contém saliências nas extremidades 3’ e 5' da cadeia an- tissenso. O aiRNA é geralmente assimétrica, porque a cadeia senso é mais curta em ambas as extremidades quando comparado com a fita antissenso complementar. Em alguns aspectos, moléculas aiRNA po-dem ser concebidas, sintetizadas e emparelhadas em condições se-melhantes às utilizadas para as moléculas de siRNA. Como um exem-plo não limitante, as sequências de aiRNA podem ser selecionadas e geradas usando os métodos descritos acima para selecionar sequên-cias de siRNA.
[000215] Em outra modalidade, dúplices de aiRNA de vários com-primentos (por exemplo, cerca de 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, ou 14-17 pares de bases, mais tipicamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 pares de bases) podem ser concebidos com saliências nas extremidades 3’ e extremidades 5’ da fita antissenso para alvejar um mRNA de interesse. Em certos casos, a fita senso da molécula de aiRNA é cerca de 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, ou 14-17 nucleo- tídeos de comprimento, mais tipicamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos de comprimento. Em certos outros casos, a fita an- tissenso da molécula aiRNA é cerca de 15-60, 15-50, ou 15-40 nucleo- tídeos de comprimento, mais tipicamente cerca de 15-30, 15-25, ou 19-25 nucleotídeos de comprimento, e é preferencialmente cerca de 20-24, 21-22, ou 21-23 nucleotídeos de comprimento.
[000216] Em algumas modalidades, a saliência 5’ antissenso contém um, dois, três, quatro, ou mais nucleotídeos não direcionadores (por exemplo, "AA", "UU", "dTdT", etc.). Em outras modalidades, a saliência 3’ antissenso contém um, dois, três, quatro, ou mais nucleotídeos não direcionadores (por exemplo, "AA", "UU", "dTdT", etc). Em certos as-pectos, as moléculas aiRNA aqui descritas podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados, por exemplo, em uma região de fita dupla (dúplex) e/ou nas saliências antissenso. Como um exemplo não limitante, as sequências aiRNA podem compreender um ou mais dos nucleotídeos modificados descritos acima para sequências de siRNA. Em uma modalidade preferencial, a molécula de aiRNA compreende nucleotídeos 2'OMe, tais como, por exemplo, nucleotídeos 2'OMe- guanosina, nucleotídeos 2'OMe-uridina, ou suas misturas.
[000217] Em certas modalidades, as moléculas de aiRNA podem compreender uma fita antissenso que corresponde à fita antissenso de uma molécula de siRNA, por exemplo, uma das moléculas de siRNA aqui descritas. Em modalidades particulares, aiRNAs são administra-dos usando um sistema de veículo, tal como uma partícula de ácido nucleico-lipídeo. Em uma modalidade preferencial, a partícula de ácido nucleico-lipídeo compreende: (a) uma ou mais moléculas de aiRNA; (B) um lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo; e (c) um lipídeo não catiônico (por exemplo, DPPC, DSPC, DSPE e/ou coleste-rol). Em certos casos, a partícula de ácido nucleico-lipídeo pode ainda compreender um lipídeo conjugado que impede a agregação das par-tículas (por exemplo, PEG-DAA e/ou POZ-DAA).
[000218] As sequências aiRNA adequadas podem ser identificadas, sintetizadas e modificadas usando quaisquer meios conhecidos na técnica para a concepção, síntese e modificação de sequências de siRNA. Modalidades adicionais relacionadas com as moléculas aiRNA da invenção são descritas na Publicação de Pedido de Patente US 2009/0291131 e Publicação PCT WO 09/127060, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
5. miRNA
[000219] Geralmente, os microRNAs (miRNA) são moléculas de RNA de cadeia simples de cerca de 21-23 nucleotídeos de comprimento, que regulam a expressão do gene. miRNAs são codificados por genes de cujo DNA são transcritos, mas miRNAs não são traduzidos em proteína (RNA não codificante); em vez disso, cada transcrito primário (um pri-miRNA) é processado em uma estrutura de haste-alça curta chamado um pré-miRNA e, finalmente, para um miRNA funcional maduro. Moléculas de miRNA maduras são moléculas de RNA (mRNA) parcialmente ou completamente complementares a um ou mais de RNA mensageiro, e a sua função principal é a de regular ne-gativamente a expressão do gene. A identificação de moléculas miR- NA é descrita, por exemplo, em Lagos-Quintana et al., Science, 294: 853-858; Lau et al., Science, 294: 858-862; e Lee et al., Science, 294: 862-864.
[000220] Os genes que codificam miRNA são muito mais longos do que a molécula madura de miRNA processada. miRNA são primeiro transcritos como transcritos primários ou pri-miRNA com uma capa e cauda poli-A e processados para estruturas haste-alça curtas de ~70 nucleotídeos conhecidas como pré-miRNA no núcleo da célula. Este processamento é realizado em animais por um complexo de proteína conhecida como o complexo do microprocessador, que consiste na nuclease Drosha e a proteína Pasha de ligação ao RNA de fita dupla (Denli et al., Nature, 432: 231-235 (2004)). Estes pré-miRNA são então processados para amadurecer miRNA no citoplasma por interação com a endonuclease de Dicer, que também inicia a formação do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) (Bernstein et al., Nature, 409:363-366 (2001). A fita senso ou antissenso de DNA de fita simples podem funcionar como moldes para dar origem ao miRNA. Quando Dicer cliva a haste-alça de pré-miRNA, duas moléculas de RNA complementares curtas são formadas, mas só uma é integrada no complexo RISC. Esta fita é conhecida como fita guia e é selecionada pela proteína Argonauta, uma RNase cataliticamente ativa no complexo RISC, com base na estabilidade da extremidade 5’ (Preall et al., Curr Biol, 16:530-535 (2006)). A fita restante, conhecida como o anti- guia ou fita passageira, é degradada como substrato complexo RISC (Gregory et al., Cell, 123: 631-640 (2005)). Após integração do complexo RISC ativo, miRNAs pareia em base com as suas moléculas de mRNA complementares e induz a degradação do mRNA alvo e/ou si- lenciamento da tradução.
[000221] Moléculas de miRNA de mamíferos são geralmente com-plementares a um local em 3’ UTR da sequência de mRNA alvo. Em certos casos, o anelamento de miRNA ao mRNA alvo inibe a tradução em proteína, bloqueando o mecanismo de tradução de proteína. Em certos outros casos, o anelamento de miRNA para o mRNA alvo facilita a clivagem e degradação do mRNA alvo através de um processo semelhante à interferência de RNA (RNAi). miRNA pode também dir- cieonar a metilação alvo de sítios genômicos que correspondem ao mRNA alvo. Geralmente, a função de miRNA em associação com um complemento de proteínas designadas coletivamente como miRNP.
[000222] Em certos aspectos, as moléculas de miRNA aqui descritas são cerca de 15-100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50, ou 1540 nucleotídeos de comprimento, mais tipicamente de cerca de 15-30, 15-25, ou 19-25 nucleotídeos de comprimento e que têm, preferenci-almente, cerca de 20-24, 21-22, ou 21-23 nucleotídeos de comprimen-to. Em certos aspectos, as moléculas de miRNA podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados. Como um exemplo não limitan- te, as sequências de miRNA podem compreender um ou mais dos nu- cleotídeos modificados descritos acima para sequências de siRNA. Em uma modalidade preferencial, a molécula de miRNA compreende nu- cleotídeos 2'OMe, como, por exemplo, nucleotídeos 2'OMe-guanosina, nucleotídeos 2'OMe-uridina, ou misturas dos mesmos.
[000223] Em modalidades particulares, miRNAs são administrados usando um sistema de veículo, tal como uma partícula de ácido nu- cleico-lipídeo. Em uma modalidade preferencial, a partícula de ácido nucleico-lipídeo compreende: (a) uma ou mais moléculas de miRNA; (b) um lipídeo catiônico de Fórmula I ou um sal do mesmo; e (c) um lipídeo não catiônico (por exemplo, DPPC, DSPC, DSPE e/ou coleste-rol). Em certos casos, a partícula de ácido nucleico-lipídeo pode ainda compreender um lipídeo conjugado que impede a agregação das par-tículas (por exemplo, PEG-DAA e/ou POZ-DAA).
[000224] Em outras modalidades, um ou mais agentes que bloqueiam a atividade de um miRNA alvejando um mRNA de interesse são administrados utilizando uma partícula de lipídeo da invenção (por exemplo, uma partícula de ácido nucleico-lipídeo, tais como LNP). Exemplos de agentes bloqueadores incluem, entre outros, oligonucleo- tídeos de bloqueio estérico, oligonucleotídeos de ácido nucleico blo- queado e oligonucleotídeos Morfolino. Tais agentes bloqueadores po-dem ligar diretamente ao miRNA ou ao sítio de ligação do miRNA ao mRNA alvo.
[000225] Modalidades adicionais relacionadas com as moléculas miRNA da invenção estão descritas na Publicação de Pedido de Pa-tente US 2009/0291131 e Publicação PCT WO 09/127060, as revela-ções das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos fins.
6. Oligonucleotídeos antissenso
[000226] Em uma modalidade, o ácido nucleico é um oligonucleotí- deo antissenso dirigido a um gene alvo ou uma sequência de interesse. Os termos "oligonucleotídeo antissenso" ou "antissenso" incluem oligonucleotídeos que são complementares a uma sequência de poli- nucleotídeo alvo. Oligonucleotídeos antissenso são cadeias simples de DNA ou RNA que são complementares a uma sequência escolhida. Os oligonucleotídeos de RNA antissenso impedem a tradução de fitas de RNA complementares por ligação ao RNA. Oligonucleotídeos de DNA antissenso podem ser utilizados para atingir um RNA específico, complementar (codificante ou não codificante). Se a ligação ocorre, este híbrido de DNA/RNA pode ser degradado pela enzima RNase H. Em uma modalidade particular, oligonucleotídeos antissensos com-preendem de cerca de 10 a cerca de 60 nucleotídeos, mais preferen-cialmente de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos. O termo também engloba os oligonucleotídeos antissenso que podem não ser exata-mente complementares ao gene alvo desejado. Assim, a invenção po-de ser utilizada em casos em que as atividades específicas não alvo são encontradas com antissenso, ou, onde uma sequência antissenso contendo um ou mais erros de emparelhamento com a sequência alvo é o mais preferencial para um uso particular.
[000227] Os oligonucleotídeos antissenso demonstraram ser inibido- res eficazes e alvo de síntese de proteínas, e, consequentemente, po-dem ser utilizados para inibir especificamente a síntese proteica atra-vés de um gene alvo. A eficácia dos oligonucleotídeos antissenso para inibir a síntese de proteína é bem estabelecida. Por exemplo, a síntese de poligalactauronase e o receptor de acetilcolina muscarínico do tipo 2 são inibidos por oligonucleotídeos antissenso dirigidos para as suas sequências de mRNA respectivas (ver, Patentes US 5.739.119 e 5.759.829). Além disso, os exemplos de inibição antissenso foram de-monstrados com a proteína nuclear ciclina, o gene de resistência a múltiplos fármacos (MDR1), ICAM-1, E-selectina, STK-1, receptor GA- BAA no estriado, e EGF humano (ver, Jaskulski et al., Science, 240: 1544-6 (1988); Vasanthakumar et al., Cancer Commun, 1: 225-32 (1989); Peris et al., Brain Res Mol Brain Res., 15, 57: 310-20 (1998); e Patentes US 5.801.154;. 5.789.573; 5.718.709 e 5.610.288). Além dis-so, as construções de antissenso também foram descritas, que inibem e podem ser utilizadas para tratar uma variedade de proliferações ce-lulares anormais, por exemplo, câncer (ver, Patentes US 5.747.470; 5.591.317 e 5.783.683). As revelações destas referências são aqui in-corporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000228] Os métodos para produção de oligonucleotídeos antissenso são conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados para a produção de um oligonucleotídeo antissenso que tem como alvo qual-quer sequência de polinucleotídeo. Seleção de sequências de oligonu- cleotídeos antissenso específicos para uma determinada sequência alvo baseia-se na análise da sequência alvo escolhida e determinação da estrutura secundária, Tm, energia de ligação, e estabilidade relativa. Oligonucleotídeos antissenso podem ser selecionados com base na sua incapacidade relativa para formar dímeros, grampos (hairpins), ou outras estruturas secundárias que reduziriam ou proibiriam a ligação específica ao mRNA alvo em uma célula hospedeira. Regiões alvo al- tamente preferencias do mRNA incluem as regiões em ou próximas ao códon de início de tradução AUG e as sequências de códons que são substancialmente complementares às regiões 5’ do mRNA. Estas aná-lises da estrutura secundária e considerações de seleção do sítio alvo podem ser realizadas, por exemplo, usando v.4 do software de análise de iniciadores OLIGO (Molecular Biology Insights) e/ou o software do algoritmo de BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-402 (1997)).
7. Ribozimas
[000229] De acordo com outra modalidade da invenção, as partículas de ácido nucleico-lipídeo estão associadas com ribozimas. As ribozimas são complexos de RNA-proteína possuindo domínios catalíticos específicos que possuem atividade de endonuclease (ver Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 84: 8788-92 (1987), e Forster et al., Cell, 49: 21120 (1987)). Por exemplo, um grande número de reações de ribozimas acelera as reações de transferência de fosfoéster com um elevado grau de especificidade, frequentemente clivando apenas um de vários fosfo- ésteres em um substrato de oligonucleotídeo (ver, Cech et al., Cell, 27: 487-96 (1981); Michel et. al., J. Mol Biol, 216: 585-610 (1990); Reinhold- Hurek et al., Nature, 357: 173-6 (1992)). Esta especificidade tem sido atribuída ao requisito de que o substrato se liga através de interações de emparelhamento de bases específicas para a sequência de guia interna ("IGS") da ribozima, antes da reação química.
[000230] Pelo menos seis variedades básicas de moléculas de RNA enzimáticas de ocorrência natural são conhecidas atualmente. Cada uma destas pode catalisar a hidrólise de ligações fosfodiéster de RNA em trans (e, portanto, podem clivar outras moléculas de RNA) em con-dições fisiológicas. Em geral, os ácidos nucleicos enzimáticos atuam, em primeiro lugar ligando a um RNA alvo. Tal ligação ocorre através da fração de ligação alvo de um ácido nucleico enzimático que é man- tido em estreita proximidade com uma porção enzimática da molécula que atua para clivar o RNA alvo. Assim, o ácido nucleico enzimático primeiro reconhece e depois se liga a um RNA alvo através de empa- relhamento de bases complementar e, uma vez ligado ao sítio correto, atua enzimaticamente para cortar o RNA alvo. Clivagem estratégica de tal RNA alvo irá destruir a sua capacidade para síntese de uma proteí-na codificada. Depois de um ácido nucleico enzimático ter sido ligado e cortado seu RNA alvo, é liberado a partir desse RNA para procurar outro alvo e pode repetidamente ligar e unir novos alvos.
[000231] A molécula de ácido nucleico enzimática pode ser formada de uma cabeça de martelo, grampo (hairpin), vírus da hepatite δ, ín- tron do grupo I ou RNaseP RNA (em associação com uma sequência guia de RNA) ou o motivo de RNA VS de Neurospora, por exemplo. Os exemplos específicos de motivos de cabeça de martelo estão descritos em, por exemplo, Rossi et al., Nucleic Acids Res., 20: 4559-65 (1992). Os exemplos de motivos em grampo (hairpin) estão descritos em, por exemplo, EP 0360257, Hampel et al., Biochemistry, 28: 492933 (1989); Hampel et al., Nucleic Acids Res, 18: 299-304 (1990); e Patente US 5.631.359. Um exemplo do motivo do vírus da hepatite δ é descrito em, por exemplo, Perrotta et al., Biochemistry 31: 11843-52 (1992). Um exemplo do motivo RNaseP está descrito em, por exemplo, Guerrier-Takada et al., Cell, 35: 849-57 (1983). Exemplos do motivo ribozima de RNA de Neurospora VS está descrito em, por exemplo, Saville et al., Cell, 61: 685-96 (1990); Saville et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8826-30 (1991); Collins et al., Biochemistry, 32: 2795-9 (1993). Um exemplo do íntron do Grupo I está descrito em, por exemplo, Patente US 4.987.071. As características importantes de moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos utilizados de acordo com a invenção é que eles têm um sítio de ligação específico de substrato que é complementar a uma ou mais das regiões de DNA ou de RNA do gene al6vo, e que têm sequências de nucleotídeos no interior ou em torno desse local de ligação do substrato que conferem uma atividade de clivagem de RNA para a molécula. Assim, as construções de ribozima não precisam ser limitadas aos motivos específicos aqui referidos. As revelações destas referências são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000232] Os métodos para a produção de uma ribozima direcionada para qualquer sequência de polinucleotídeo são conhecidos na arte. As ribozimas podem ser concebidas como descrito em, por exemplo, as publicações de PCT WO 93/23569 e WO 94/02595, e sintetizadas para serem testadas in vitro e/ou in vivo, tal como descrito nestas. As revelações destas publicações PCT são aqui incorporadas por refe-rência na sua totalidade para todos os fins.
[000233] A atividade de ribozima pode ser otimizada através da alte-ração do comprimento dos braços de ligação à ribozima ou ribozimas quimicamente sintetizadas com modificações que impedem a sua de-gradação por ribonucleases séricas (ver, por exemplo, a publicações PCT WO 92/07065, WO 93/15187, WO 91/03162, e WO 94/13688; EP 92110298.4, e Patente US 5.334.711, que descrevem várias modifica-ções químicas que podem ser feitas nas frações de açúcar de molécu-las enzimáticas de RNA, as divulgações das quais são cada uma aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins), modi-ficações que aumentam a sua eficácia nas células e remoção das ba-ses estaminais II para encurtar os tempos de síntese do RNA e reduzir os requisitos químicos.
8. Oligonucleotídeos Imunoestimuladores
[000234] Os ácidos nucleicos associados com as partículas de lipídeo da presente invenção podem ser imunoestimuladores, incluindo oligonucleotídeos imunoestimuladores (ISS; fita simples ou dupla), ca-paz de induzir uma resposta imune quando administrados a um indiví- duo, que pode ser um mamífero, tal como um ser humano. ISS incluem, por exemplo, certos palíndromos que levam à estruturas secundárias de grampo (hairpin) (ver, Yamamoto et al., J. Immunol., 148: 40726 (1992)), ou motivos CpG, bem como outras características conhecidas do ISS (tais como domínios multi-G; ver, Publicação PCT WO 96/11266, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins).
[000235] Os ácidos nucleicos imunoestimuladores são considerados como sendo não específicos para sequência, quando não é necessário que se liguem especificamente e reduzam a expressão de uma se-quência alvo, a fim de provocar uma resposta imune. Assim, certos ácidos nucleicos imunoestimuladores podem compreender uma se-quência que corresponde a uma região de um gene que ocorre natu-ralmente, ou mRNA, mas podem ainda ser considerados ácidos nu- cleicos imunoestimuladores não específicos da sequência.
[000236] Em uma modalidade, o ácido nucleico ou oligonucleotídeo imunoestimulante compreende pelo menos um dinucleotídeo CpG. O oligonucleotídeo ou dinucleotídeo CpG pode ser metilado ou não meti- lado. Em outra modalidade, o ácido nucleico imunoestimulante inclui pelo menos um dinucleotídeo CpG com uma citosina metilada. Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende um único dinucleotídeo CpG, em que a citosina, no dinucleotídeo CpG é metilado. Em uma modalidade alternativa, o ácido nucleico compreende pelo menos dois dinucleotídeos CpG, em que pelo menos uma citosina nos dinucleotí- deos CpG é metilada. Em outra modalidade, cada citosina nos dinu- cleotídeos CpG presentes na sequência é metilada. Em outra modali-dade, o ácido nucleico compreende uma pluralidade de dinucleotídeos CpG, em que pelo menos um dos dinucleotídeos CpG compreende uma citosina metilada. Exemplos de oligonucleotídeos imunoestimula- dores adequados para utilização nas composições e métodos da pre sente invenção estão descritos nas Publicações PCT WO 02/069369, WO 01/15726, e WO 09/086558; Patente US 6.406.705; e Raney et al., J. Pharm. Exper. Ther., 298: 1185-1192 (2001), as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos utilizados nas composições e métodos da invenção têm um esqueleto fosfodiés- ter ("PO") ou um esqueleto de fosforotioato ("PS"), e/ou pelo menos um resíduo de citosina metilada em um motivo CpG.
B. Outros Agentes Ativos
[000237] Em certas modalidades, o agente ativo associado com as partículas de lipídeo da invenção pode compreender uma ou mais pro-teínas terapêuticas, polipeptídeos ou pequenas moléculas ou compos-tos orgânicos. Exemplos não limitantes de agentes ou fármacos tera- peuticamente eficazes incluem medicamentos oncológicos (por exem-plo, medicamentos quimioterápicos, agentes terapêuticos hormonais, agentes imunoterápicos, agentes de radioterapia, etc.), agentes hipoli- pemiantes, fármacos antivirais, compostos anti-inflamatórios, antide- pressivos, estimulantes, analgésicos, antibióticos, medicamentos de controle de natalidade, antipiréticos, vasodilatadores, anti- angiogênicos, agentes citovasculares, inibidores de transdução de si-nal, fármacos cardiovasculares, como agentes anti-arrítmicos, hormô-nios, vasoconstritores, e esteroides. Estes agentes ativos podem ser administrados isoladamente nas partículas de lipídeo da invenção, ou em combinação (por exemplo, coadministrados) com as partículas de lipídeo da invenção que compreendem o ácido nucleico, tais como RNA interferente.
[000238] Exemplos não limitantes de fármacos quimioterápicos incluem medicamentos à base de platina (por exemplo, oxaliplatina, cisplatina, carboplatina, espiroplatina, iproplatina, satraplatina, etc.), agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, cloram- bucila, busulfan, melfalan mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitro- soureias, etc.), anti-metabólitos (por exemplo, 5-fluoruracil (5-FU), aza- tioprina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gencitabina, pemetrexed, raltitrexed, etc.), alcaloides de plantas (por exemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel (taxol), docetaxel, etc), inibidores da topoiso-merase (por exemplo, irinotecano (CPT-11; Camptosar), topotecano, amsacrina, etoposido (VP 16), fosfato de etoposido, teniposido, etc.), antibióticos antitumorais (por exemplo, doxorrubicina, adriamicina, daunorubicina, epirubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mito- xantrona, plicamicina, etc.), inibidores de tirosina quinase (por exemplo, gefitinib (Iressa®), sunitinib (Sutent®; SU11248), erlotinib (Tarce- va®; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenibe (BAY 43-9006), imatinib (Glivec®; STI571), dasatinib (BMS-354825), lefiu- nomida (SU101), vandetanib (ZACTIMA™; ZD6474), etc), sais farma- ceuticamente aceitáveis dos mesmos, estereoisômeros dos mesmos, derivados dos mesmos, análogos dos mesmos e combinações dos mesmos.
[000239] Exemplos de agentes hormonais terapêuticos convencionais incluem, entre outros, esteroides (por exemplo, dexametasona), finasterida, inibidores de aromatase, tamoxifeno, e goserelina, assim como outros agonistas de liberação da gonadotropina (GnRH).
[000240] Exemplos de agentes de imunoterapia convencionais incluem, entre outros, imunoestimuladores (por exemplo, Bacilo Calmette- Guerin (BCG), o evamisol, inteleucina-2, alfa-interferon, etc.), anticor-pos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD20, anti-HER2, anti-CD52, anti-HLA-DR, e anti-VEGF), imunotoxinas (por exemplo, conjuhado de anticorpo monoclonal anti-CD33- caliqueamicina, conjugado de anticorpo monoclonal anti-CD22- exotoxina de Pseudomonas, etc.), e radioimunoterapia (por exemplo, conjugado anticorpo monoclonal anti-CD20 com In111, Y90 ou I131, etc.).
[000241] Exemplos de agentes radioterapêuticos convencionais in-cluem, entre outros, radionuclídeos tais como 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At e 212Bi, opcionalmente conjugado com anticorpos dirigidos contra antígenos tumorais.
[000242] Os medicamentos de oncologia que podem ser utilizados de acordo com a invenção incluem, entre outros, Alkeran, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, araC, trióxido de arsênico, bexaro- teno, biCNU, carmustina, CCNU, celecoxib, cladribina, ciclosporina A, citosina arabinosídeo, ciclofosfamida, dexrazoxane, DTIC, estramusti- na, exemestano, FK506, gemtuzumabe-ozogamicina, hidrea, hidroxiu- reia, idarubicina, interferon, letrozol, leustatina, leuprolida, litretinoina, megastrol, L-PAM, mesna, metoxsaleno, mitramicina, mostarda nitro- genada, pamidronato, Pegademase, pentostatina, porfímero de sódio, prednisona, Rituxan, estreptozocina, STI-571, taxotere, temozolomida, VM-26, toremifeno, tretinoína, ATRA, valrubicina e velban. Outros exemplos de fármacos oncológicos que podem ser utilizados de acordo com a invenção são ellipticina e análogos ou derivados de elliptici- na, epotilonas, inibidores de quinases intracelulares e camptotecinas.
[000243] Exemplos não limitantes de agentes de redução de lipídeos para o tratamento de uma doença ou distúrbio de lipídeo associado com níveis elevados de triglicerídeos, colesterol, e/ou glicose incluem estatinas, fibratos, ezetimiba, tiazolidinedionas, niacina, beta- bloqueadores, antagonistas do cálcio, nitroglicerina, óleo de peixe, e suas misturas.
[000244] Exemplos de fármacos antivirais incluem, entre outros, abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, arbidol, atazanavir, atripla, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosi- na, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, enteca- vir, inibidores de entrada, famciclovir, combinações de doses fixas, fomivirsen, fosamprenavir, foscarneto, fosfonet, inibidores de fusão, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, ino-sina, inibidores da integrase, interferon do tipo III (por exemplo, molé-culas de IFN-À, tais como IFN-À1, IFN-À2, e IFN-À3), interferon do tipo II (por exemplo, IFN-Y), interferon do tipo I (por exemplo, IFN-α, tais como o IFN-α PEGuilado, IFN-β, IFN-K, IFN-δ, IFN-ε, IFN-T, IFN-W, e IFN—Z), interferon, lamivudina, lopinavir, lovirida, MK—0518, maraviroc, moroxidina, nelfmavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleosídeo, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconarila, podofilotoxina, inibidores da protease, inibidores da transcriptase reversa, ribavirina, riman- tadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, potenciadores sinérgicos, te- nofovir, tenofovir disoproxila, tipranavir, trifluridina, Trizivir tromantadi- na, Truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidi- na, zalcitabina, zanamivir, zidovudina, sais farmaceuticamente aceitáveis, estereoisômeros dos mesmos, derivados dos mesmos, análogos dos mesmos, e misturas dos mesmos.
V. Partículas lipídeo
[000245] Em determinados aspectos, a presente invenção fornece partículas de lipídeo que compreendem um ou mais lipídeos catiônicos (amino) ou sais dos mesmos aqui descritos. Em algumas modalidades, as partículas de lipídeos da presente invenção compreendem ainda um ou mais lipídeos não catiônicos. Em outras modalidades, as partículas de lipídeo compreendem ainda um ou mais lipídeos conjugadas capa-zes de reduzir ou inibir a agregação das partículas. Em modalidades adicionais, as partículas de lipídeo compreendem ainda um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos, tais como os ácidos nucleicos terapêuticos (por exemplo, RNA interferentes tais como siRNA).
[000246] Partículas de lipídeo incluem, entre outras, vesículas lipídi- cas, tais como lipossomas. Tal como aqui utilizado, uma vesícula lipí- dica inclui uma estrutura que tem membranas contendo lipídeos que encerram um interior aquoso. Em modalidades particulares, as vesícu-las lipídicas compreendendo um ou mais dos lipídeos catiônicos des-critos aqui são usadas para encapsular ácidos nucleicos no interior das vesículas lipídicas. Em outras modalidades, as vesículas lipídicas compreendendo um ou mais dos lipídeos catiônicos descritos são complexados com os ácidos nucleicos para formar lipoplexos.
[000247] As partículas de lipídeo da invenção compreendem, tipica-mente, um agente ativo ou agente terapêutico, um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico, e um conjugado lipídico que inibe a agregação de partículas. Em algumas modalidades, o agente ativo ou o agente terapêutico é totalmente encapsulado no interior da porção lipídica da partícula de lipídeo de modo que o agente ativo ou o agente terapêutico na partícula de lipídeo é resistente em solução aquosa à degradação enzimática, por exemplo, por uma nuclease ou da protease. Em outras modalidades, as partículas de lipídeo aqui descritas são substancialmente não tóxicas para os mamíferos, tais como seres hu-manos. As partículas de lipídeo com a invenção tipicamente têm um diâmetro médio de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm e cerca de 1 a 10 nm, de cerca de 70 a cerca de 90 nm. As partículas de lipídeo da invenção também têm tipicamente uma proporção de lipídeo:agente terapêutico (por exemplo, lipídeo:ácido nucleico) (massa/peso) de cerca de 1: 1 a cerca de 100: 1, de cerca de 1: 1 a cerca de 50: 1, de cerca de 2: 1 a cerca de 25: 1, de cerca de 3: 1 a cerca de 20: 1, de cerca de 5: 1 a cerca de 15: 1, ou de cerca de 5: 1 a cerca de 10: 1.
[000248] Em modalidades preferenciais, as partículas de lipídeo da invenção são partículas de soro-ácido nucleico estável-lipídeo (LNP), que compreendem um RNA interferente (por exemplo, siRNA, Dicer- substrato dsRNA, shRNA, aiRNA, e/ou miRNA), um lipídeo catiônico (por exemplo, um ou mais lipídeos catiônicos de Fórmula I ou sais dos mesmos como aqui definidos), um lipídeo não catiônico (por exemplo, misturas de um ou mais fosfolipídeos e colesterol) e um conjugado li- pídico que inibe a agregação das partículas (por exemplo, um ou mais de PEG-lipídeo e/ou conjugados de POZ-lipídeo). O LNP pode com-preender, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais moléculas de RNA interferência modificadas e/ou não modificadas. Partículas ácido nucleico-lipídeo e o seu método de preparação são descritas em, por exemplo, Patentes US. 5.753.613; 5.785.992; 5.705.385; 5.976.567; 5.981.501; 6.110.745; e 6.320.017; e Publicação PCT WO 96/40964, as revelações das quais são aqui incorporadas por referên-cia na sua totalidade para todos os fins.
[000249] Nas partículas de ácido nucleico-lipídeo da invenção, o ácido nucleico pode ser totalmente encapsulado no interior da porção lipídica da partícula, protegendo deste modo o ácido nucleico de degradação da nuclease. Em modalidades preferenciais, um LNP compreendendo um ácido nucleico, como um RNA interferente é totalmente encapsulado no interior da porção lipídica da partícula, protegendo, assim, o ácido nu- cleico de degradação da nuclease. Em certos casos, o ácido nucleico na LNP não é substancialmente degradado após exposição da partícula para uma nuclease, a 37°C durante, pelo menos, cerca de 20, 30, 45, ou 60 minutos. Em certos outros casos, o ácido nucleico na LNP não é substancialmente degradado após incubação das partículas em soro a 37°C durante, pelo menos, cerca de 30, 45, ou 60 minutos ou pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, ou 36 horas. Em outras modalidades, o ácido nucleico é complexado com a porção lipídica da partícula. Uma das vantagens das formulações da presente invenção é que as composições de partículas de ácido nucleico em lipídeos são substancialmente não tóxicas para os mamíferos, tais como seres humanos.
[000250] O termo "totalmente encapsulado" indica que o ácido nu- cleico na partícula de ácido nucleico-lipídeo não é degradado significa-tivamente após exposição ao soro ou um ensaio de nuclease que de-grada significativamente DNA ou RNA livre. Em um sistema totalmente encapsulado, preferencialmente menos do que cerca de 25% do ácido nucleico na partícula é degradado em um tratamento que normalmente degrada 100% de ácido nucleico livre, mais preferencialmente menos do que cerca de 10%, e mais preferencialmente menos do que cerca 5% do ácido nucleico em que a partícula é degradada. "Totalmente encapsulado" também indica que as partículas de ácido nucleico- lipídeo são estáveis ao soro, isto é, que não se decompõem rapida-mente nos seus componentes mediante a administração in vivo.
[000251] No contexto de ácidos nucleicos, o encapsulamento completo pode ser determinado através da realização de um ensaio de exclusão com corante fluorescente de membrana impermeável, que utiliza um corante que tem fluorescência aumentada quando associado com o ácido nucleico. Corantes específicos, tais como OliGreen® e Ri-boGreen® (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA) estão disponíveis para a determinação quantitativa do DNA de plasmídeo, desoxirribonucleotí- deos de fita simples, e/ou ribonucleotídeos de fita simples ou dupla. A encapsulação é determinada pela adição do corante a uma formulação lipossomal, medindo a fluorescência resultante, e comparando-a com a fluorescência observada após a adição de uma pequena quantidade de detergente não iônico. Perturbação mediada por detergente da bi- camada lipossomal libera o ácido nucleico encapsulado, permitindo-lhe interagir com o corante impermeável à membrana. Encapsulação de ácido nucleico pode ser calculada como E = (I0 - I)/I0, onde I e I0 refe-rem-se às intensidades de fluorescência antes e depois da adição do detergente (ver, Wheeler et al, Gene Ther, 6: 271-281 (1999)).
[000252] Em outras modalidades, a presente invenção fornece uma composição de partícula de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP) compreendendo uma pluralidade de partículas de ácido nucleico- lipídeo.
[000253] Em alguns casos, a composição de LNP compreende ácido nucleico que é totalmente encapsulado dentro da porção lipídica das partículas, de tal modo que de cerca de 30% a cerca de 100%, de cer-ca de 40% a cerca de 100%, de cerca de 50% a cerca de 100%, de cerca de 60% a cerca de 100%, de cerca de 70% a cerca de 100%, de cerca de 80% a cerca de 100%, de cerca de 90% a cerca de 100%, de cerca de 30% a cerca de 95 %, de cerca de 40% a cerca de 95%, de cerca de 50% d cerca de 95%, de cerca de 60% a cerca de 95%, de cerca de 70% a cerca de 95%, de cerca de 80% d cerca de 95%, de cerca de 85% a cerca de 95%, de cerca de 90% a cerca de 95%, de cerca de 30% a cerca de 90%, de cerca de 40% a cerca de 90%, de cerca de 50% a cerca de 90%, de cerca de 60% a cerca de 90%, de cerca de 70% a cerca de 90%, de cerca de 80% a cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% (ou qualquer fração da mesma ou faixa desta) de que as partículas têm o ácido nucleico aí encapsulado
[000254] Em outros casos, a composição de LNP compreende ácido nucleico que é completamente encapsulado dentro da porção lipídica das partículas, de tal modo que de cerca de 30% a cerca de 100%, de cerca de 40% a cerca de 100%, de cerca de 50% a cerca de 100%, de cerca de 60% a cerca de 100%, de cerca de 70% a cerca de 100%, de cerca de 80% a cerca de 100%, de cerca de 90% a cerca de 100%, de cerca de 30% a cerca de 95%, de cerca de 40% a cerca de 95%, de cerca de 50% e cerca de 95%, de cerca de 60% a cerca de 95%, de cerca de 70% a cerca de 95%, de cerca de 80% e cerca de 95%, de cerca de 85% a cerca de 95%, de cerca de 90% a cerca de 95%, de cerca de 30% a cerca de 90%, de cerca de 40% a cerca de 90%, de cerca de 50% a cerca de 90%, de cerca de 60% a cerca 90%, de cer ca de 70% a cerca de 90%, de cerca de 80% a cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% (ou qualquer fração do mesmo ou faixa desta) da entrada de ácido nucleico é encapsulado nas partículas.
[000255] Dependendo da utilização pretendida para as partículas de lipídeo da invenção, as proporções dos componentes podem ser vari-ada e a eficiência de liberação de uma formulação particular, pode ser medida utilizando, por exemplo, um ensaio de parâmetro de liberação endossomal (ERP).
[000256] Em modalidades particulares, a presente invenção propor-ciona uma composição de partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) compreendendo uma pluralidade de partículas de lipídeo aqui descritas e um antioxidante. Em certos casos, o antioxidante na composição de partícula de lipídeo reduz, previne e/ou inibe a degradação de um lipídeo catiônico presente na partícula de lipídeo. Nos casos em que o agente ativo é um ácido nucleico terapêutico como um RNA interferente (por exemplo, siRNA), o antioxidante na composição de partícula de lipídeo reduz, previne e/ou inibe a degradação da carga de ácido nu- cleico, por exemplo, através da redução, prevenção e/ou inibição da formação de produtos de adutos entre o ácido nucleico e o lipídeo ca- tiônico. Exemplos não limitantes de antioxidantes incluem antioxidan- tes hidrofílicos, tais como agentes quelantes (por exemplo, quelantes de metais, tais como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), citrato, e semelhantes), antioxidantes lipofílicos (por exemplo, isômeros de vi-tamina E, polifenóis e semelhantes), sais do mesmo; e misturas dos mesmos. Se necessário, o antioxidante é tipicamente presente em uma quantidade suficiente para prevenir, inibir e/ou reduzir a degradação do lipídeo catiônico e/ou agente ativo presente na partícula, por exemplo, pelo menos cerca de 20 mM de EDTA ou um sal do mesmo, ou pelo menos cerca de 100 mM de citrato ou de um sal do mesmo. Um antioxidante como o EDTA e/ou citrato pode ser incluído em qualquer uma das etapas ou em várias etapas no processo de formação de partículas de lipídeo descrito na Secção VI (por exemplo, antes, durante e/ou após a formação de partículas de lipídeo).
[000257] Modalidades adicionais relacionados com métodos para prevenir a degradação dos lipídeos catiônicos e/ou agentes ativos de (por exemplo, ácidos nucleicos terapêuticos) presentes nas partículas de lipídeo, as composições que compreendem partículas de lipídeo estabilizadas por estes métodos, métodos para a preparação destas partículas de lipídeo e métodos de fornecimento e/ou a administração destas partículas de lipídeo são descritos no Pedido de Patente Inter-nacional PCT/CA2010/001919, intitulado "SNALP Formulations Con-taining Antioxidants", depositado em 1° de Dezembro de 2010, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins. A. Lipídeos catiônicos
[000258] Qualquer um dos novos lipídeos catiônicos de fórmula geral I ou sais dos mesmos como aqui definidos pode ser utilizado nas par-tículas de lipídeo com a presente invenção (por exemplo, LNP), quer isoladamente ou em combinação com uma ou mais outras espécies de lipídeos catiônicos ou espécies de lipídeos não catiônicos.
[000259] Outros lipídeos catiônicos ou de sais dos mesmos que tam-bém podem ser incluídos nas partículas de lipídeo com a presente invenção incluem, entre outros, 1,2-dilinoleilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-di-Y-linolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (Y-DLenDMA), 1,2-dilino- leilóxi-(N,N-dimetil)-butil-4-amina (C2-DLinDMA), 1,2-dilinoleoilóxi- (N,N-dimetil)-butil-4-amina (C2-DLinDAP), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetila- minoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA, também conhecido como "XTC2" ou "C2K"), 2,2-dilinoleil-4-(3-dimetilaminopropil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C3-DMA; "C3K"), 2,2-dilinoleil-4-(4-dimetilaminobutil)-[1,3]- dioxolano (DLin-K-C4-DMA; "C4K"), 2,2-dilinoleil-5-dimetilaminometil- [1,3]-dioxano (DLin-K6-DMA), 2,2-dilinoleil-4-N-metilpepiazino-[1,3]- dioxolano (DLin-K-MPZ), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]- dioxolano (DLin-K-DMA), 2,2-dioleoil-4-dimetilaminometil-[1,3]- dioxolano (DO-K-DMA), 2,2-distearoil-4-dimetilaminometil-[1,3]- dioxolano (DS-K-DMA), 2,2-dilinoleil-4-N-morfolino-[1,3]-dioxolano (DLin-K-MA), 2,2-Dilinoleil-4-trimetilamino-[1,3]-dioxolano cloreto (DLin-K-TMA.Cl), 2,2-dilinoleil-4,5-bis(dimetilaminometil)-[1,3]-dioxo- lano (DLin-K2-DMA), 2,2-dilinoleil-4-metilpiperizina-[1,3]-dioxolano (D- Lin-KN- metilpiperizina), (6Z,9Z,28Z,3LZ)-heptatriaconta-6,9,28,3l- tetraen-19-il-(4)-(dimetilamino) butanoato (DLin-M-C3-DMA; "MC3"), dilinoleilmetil-3-dimetilaminopropionato (DLin-M-C2-DMA; também co-nhecido como DLin-MK-DMA ou DLin-M-DMA), 1,2-dioeilcarbamoilóxi- 3-dimetilaminopropano (DO-C-Dap), 1,2-dimiristoleoil-3-dimetilamino- propano (DMDAP), l,2-dioleoil-3-trimetilaminopropano cloreto (DO- TAP.Cl), 1,2-dilinoleilcarbamoilóxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C- DAP), 1,2,-dilinoleyóxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleióxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dime- tilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLinS-DMA), 1-linoleoil-2-linoleilóxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2- DMAP), l,2-dilinoleilóxi-3-trimetilaminopropano sal cloreto (DLin- TMA.Cl), 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano sal de cloreto (DLin- TAP.Cl), 1,2-dilinoleilóxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), 3- (N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)- 1,2-propanodio (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino) etoxi- propano (DLin-EG-DMA), 3-dimetilamino-2-(colest-5-3-en-beta oxibu- tan-4-oxi)-l-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano (CLinDMA),2-[5’- (colest-5-en-3-beta-oxi)-3’-oxapentoxi)-3-dimeti-1-(cis,cis-9’,1-2'-octa- decadienoxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibenzila- mine (DMOBA), 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DO- carbDAP), 1,2-N,N’-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DLincar- bDAP), N,N-dioleil-N,N-dimetilamônio cloreto (DODAC), 1,2-dioleilóxi- N,N-dimetilaminopropano (DODMA), 1,2-distearilóxi-N,N-dimetilamino- propano (DSDMA), N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamônio clo-reto (DOTMA), N,N-distearil-N,N-dimetilamônio brometo (DDAB), N-(1- (2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamônio (DOTAP), 3-(N-(N',N'- dimetilaminoetano) carbamoil)colesterol (DC-Chol), N-(l,2-dimiris- tiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil brometo de amônio (DMRIE), 2,3-dioleilóxi-N[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propana- miniumtrifluoracetato (DOSPA), dioctadecilamidoglicila espermina (DOGS), análogos dos mesmos, e misturas dos mesmos.
[000260] Os lipídeos catiônicos ou sais dos mesmos que podem estar presentes nas partículas de lipídeo aqui descritas incluem novos lipídeos catiônicos, tais como CP-LenMC3, CP—Y—LenMC3, CP-MC3, CP-DLen-C2K-DMA, CP-YDLen-C2K-DMA, CP-C2K-DMA, CP-DODMA, CP-DPetroDMA, CP-DLinDMA, CP-DLenDMA, CP-YDLenDMA, análogos dos mesmos, e combinações dos mesmos. Lipídeos catiônicos adicionais ou sais dos mesmos que podem estar presentes nas partículas de lipídeo aqui descritas incluem análogos MC3 como LenMC3, Y-LenMC3, MC3MC, MC2C, MC2MC, MC3 de tioéster, MC3 Éter, MC4 Éter, MC3 Alquino, MC3 Amida, Pan-MC3, Pan-MC4, Pan-MC5, e combinações dos mesmos. Lipídeos catiônicos adicionais ou sais dos mesmos que podem estar presentes nas partículas de lipídeo aqui descritas incluem os novos lipídeos catiônicos descritos no Pedido de Patente Internacional No. PCT/CA2010/001029, intitulado "Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids", deposi-tado em 30 de Junho de 2010. Os lipídeos catiônicos adicionais ou sais dos mesmos que podem estar presentes nas partículas de lipídeo aqui descritas incluem os lipídeos catiônicos descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0023673. As descrições de cada um destes documentos de patentes são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000261] Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico adicional forma um sal (preferencialmente um sal cristalino) com um ou mais ânions. Em uma modalidade particular, o lipídeo catiônico adicional é o oxalato (por exemplo, hemioxalato) sal do mesmo, que é preferencialmente um sal cristalino.
[000262] A síntese de lipídeos catiônicos, tais como DLinDMA e DLenDMA, assim como lipídeos catiônicos adicionais, é descrita na Publicação do Pedido de Patente US 2006/0083780, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000263] A síntese de lipídeos catiônicos, tais como Y-DLenDMA, C2- DLinDMA e C2-DLinDAP, assim como lipídeos catiônicos adicionais, é descrita no Pedido de Patente Internacional No. PCT/CA2010/001029, intitulado "Improved Cationic Lipids and Methdos for the Delivery of Nucleic Acids", depositado em 30 de junho de 2010, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000264] A síntese de lipídeos catiônicos, tais como DLin-K-DMA, bem como lipídeos catiônicos adicionais, é descrita na Publicação PCT No. WO 09/086558, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000265] A síntese de lipídeos catiônicos, tais como DLin-K-C2-DMA, DLin-K-C3-DMA, DLin-K-C4-DMA, DLin-K6-DMA, DLin-K-MPZ, DO-K DMA, DS-K-DMA, DLin-K-MA, DLin-K-TMA.Cl, DLin-K2-DMA, D-Lin- KN-metilpiperizina, DLin-M-C2-DMA, DO-C-DAP, DMDAP e DO- TAP.Cl, bem como lipídios catiônicos adicionais, é descrita na publica-ção PCT WO 2010/042877, intitulada "Improved Amino Lipids and Me- thos for the Delivery of Nucleic Acids", depositado em 9 de outubro de 2009, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totali-dade para todos os fins.
[000266] A síntese de DLin-M-C3-DMA, bem como lipídeos catiôni- cos adicionais, é descrita, por exemplo, no Pedido Provisório No. 61/384050, depositado em 17 de setembro de 2010, intitulado "Novel Cationic Lipids and Methods of Use Thereof", a divulgação do qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000267] A síntese de lipídios catiônicos, como DLin-C-DAP, DLin- DAC, DLinMA, DLinDAP, DLin-S-DMA, DLin-2-DMAP, DLinTMA.Cl, DLinTAP.Cl, DLinMPZ, DLinAP, DOAP e DLin EG-DMA, bem como lipídeos catiônicos adicionais, é descrita na Publicação PCT WO 09/086558, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000268] A síntese de lipídeos catiônicos, tais como CLinDMA, assim como lipídeos catiônicos adicionais, é descrita na Publicação do Pedi-do de Patente US 2006/0240554, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000269] A síntese de um número de outros lipídeos catiônicos e análogos relacionados foi descrita nas Patentes US 5.208.036; 5.264.618; 5.279.833; 5.283.185; 5.753.613; e 5.785.992; e Publicação PCT No. WO 96/10390, as revelações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins. Além disso, um certo número de preparações comerciais de lipídeos catiônicos pode ser utilizado, tais como, por exemplo, LIPOFECTIN® (incluindo DOTMA e DOPE, disponível a partir de GIBCO/BRL); LIPOFECTAMI- NE®(incluindo DOSPA e DOPE, disponível a partir de GIBCO/BRL); e TRANSFECTAM® (incluindo DOGS, disponíveis a partir Promega Cor-poration).
[000270] Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico compreende de cerca de 50% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 50% em mol a cerca de 85% em mol, de cerca de 50% em mol a cerca de 80% em mol, de cerca de 50% em mol a cerca de 75% em mol, de cerca de 50% em mol a cerca de 70% em mol, de cerca de 50% em mol a cerca de 65% em mol, de cerca de 50% em mol a cerca de 60% em mol, de cerca de 55% em mol a cerca de 65% em mol, ou de cerca de 55% em mol a cerca de 70% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula. Em modalidades particu-lares, o lipídeo catiônico compreende cerca de 50% em mol, 51% em mol, 52% em mol, 53% em mol, 54% em mol, 55% em mol, 56% em mol, 57% em mol, 58% em mol, 59% em mol, 60% em mol, 61% em mol, 62% em mol, 63% em mol, 64% em mol, ou 65% em mol (ou qualquer fração do mesmo) do lipídeo total presente na partícula.
[000271] Em outras modalidades, o lipídeo catiônico compreende de cerca de 2% em mol a cerca de 60% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 50% em mol, de cerca de 10% em mol a cerca de 50% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 50% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol, ou cerca de 40% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula.
[000272] Percentuais e faixas adicionais de lipídeos catiônicos ade-quados para uso nas partículas de lipídeo com a presente invenção estão descritos, por exemplo, na Publicação PCT WO 09/127060, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000273] Deve-se entender que o percentual de lipídeo catiônico presente nas partículas de lipídeo com a invenção é uma quantidade alvo, e que a quantidade real de lipídeo catiônico presente na formula-ção pode variar, por exemplo, de ± 5% em mol. Por exemplo, em uma formulação de partícula de lipídeo 1: 57 (por exemplo, LNP), a quanti-dade alvo de lipídeo catiônico é 57,1% em mol, mas a quantidade real de lipídeo catiônico pode ser de ± 5% em mol, ± 4% em mol, ± 3% em mol, ± 2% em mol, ± 1% em mol, ± 0,75% em mol, ± 0,5% em mol, ± 0,25% em mol, ou ± 0,1% em mol do que a quantidade alvo, com o equilíbrio da formulação sendo constituída por outros componentes lipídicos (adicionando-se até 100% em mol de lipídeos totais presentes na partícula).
B. Lipídeos não catiônicos
[000274] Os lipídeos não catiônicos utilizados nas partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP) podem ser qualquer um de uma variedade de lipídeos não carregados, zwitteriônicos, aniônicos ou neutros, capazes de produzir um complexo estável.
[000275] Exemplos não limitantes de lipídeos não catiônicos incluem fosfolipídeos, tais como lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, liso- fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina de ovo (ESM), cefalina, cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicetilfosfato, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoil- fosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfa- tidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfati- diletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina-fosfatidil- colina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina-fosfatidiletanola- mina (POPE), palmitoiloleiol-fosfatidilglicerol (POPG), dioleoilfosfatidi- letanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (DOPE- mal), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidileta- nolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monome- til-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-fosfa- tidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), lisofosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina, e misturas dos mesmos. Outros diacilfosfatidilcolina e fosfolipídios diacilfosfatidiletanolamina podem também ser usados. Os grupos acil destes lipídeos são prefe-rencialmente grupos acil derivados a partir de ácidos graxos tendo ca-deias de carbono C10-C24, por exemplo, lauroila, miristoila, palmitoila, estearoila ou oleoila.
[000276] Outros exemplos de lipídeos não catiônicos incluem este- róis tais como o colesterol e derivados dos mesmos. Exemplos de de-rivados de colesterol não limitantes incluem análogos polares, tais co-mo 5α-colestanol, 5β-coprostanol, colesteril-(2'-hidroxi) etil éter, coles- teril-(4'-hidroxi)-butil-éter, e 6-cetocolestanol; análogos não polares, tais como 5α-colestano, colestenona, 5α-colestanone, 5β-colestanono, e decanoato de colesterila; e misturas dos mesmos. Em modalidades preferenciais, o derivado de colesterol é um análogo polar tal como colesteril-(4'-hidroxi)-butil éter. A síntese de colesteril-(2'-hidroxi)-etil éter é descrita na Publicação PCT No. WO 09/127060, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000277] Em algumas modalidades, o lipídeo não catiônico presente nas partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) compreende ou é consti-tuído por uma mistura de um ou mais fosfolipídeos e colesterol ou um derivado do mesmo. Em outras modalidades, o lipídeo não catiônico presente nas partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) compreende ou é constituído por um ou mais fosfolipídeos, por exemplo, uma formula-ção de partículas de lipídeo livre de colesterol. Ainda em outras moda-lidades, o lipídeo não catiônico presente nas partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) compreende ou é constituído por colesterol ou um deri-vado do mesmo, por exemplo, uma formulação de partículas de lipídeo livre de fosfolipídeo.
[000278] Outros exemplos de lipídeos não catiônicos adequados para utilização na presente invenção incluem lipídeos contendo não fos- forosos, tais como, por exemplo, estearilamina, dodecilamina, hexade-cilamina, palmitato de acetila, glicerolricinoleato, estereato de hexade-cila, miristato de isopropila, polímeros acrílicos anfotéricos, trietanola- mina-lauril sulfato, amidas de ácidos graxos de alquil-aril sulfato polieti- loxiladas arila, dioctadecildimetil brometo de amônio, ceramida, esfin- gomielina, e outros semelhantes.
[000279] Em algumas modalidades, o lipídeo não catiônico compre-ende cerca de 10% em mol a cerca de 60% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 55% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 50% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 50% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 35% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 37% em mol a cerca de 42% em mol, ou cerca de 35% em mol, 36% em mol, 37% em mol, 38% em mol, 39% em mol, 40% em mol, 41% em mol, 42% em mol, 43% em mol, 44% em mol, ou 45% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do total de lipídeos presente no a partícula.
[000280] Em modalidades em que as partículas de lipídeo contêm uma mistura de fosfolipídeo e colesterol ou um derivado do colesterol, a mistura pode compreender até cerca de 40% em mol, 45% em mol, 50% em mol, 55% em mol, ou 60% em mol do presente de lipídios to-tais na partícula.
[000281] Em algumas modalidades, o componente fosfolipídeo na mistura pode compreender de cerca de 2% em mol a cerca de 20% em mol, de cerca de 2% em mol a cerca de 15% em mol, de cerca de 2% em mol a cerca de 12% em mol, entre cerca 4% em mol a cerca de 15% em mol, ou de cerca de 4% em mol a cerca de 10% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula. Em certas modalidades preferenciais, o componente fosfoli- pídeo na mistura compreende cerca de 5% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 9% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 8% em mol, de cerca de 6% em mol a cerca de 9% em mol, de cerca de 6% em mol a cerca de 8% em mol, ou cerca de 5% em mol, 6% em mol, 7% em mol, 8% em mol, 9% em mol, ou 10% em mol (ou qualquer fração ou faixa desta) do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma formulação de partí-culas de lipídeo 1: 57 que compreende uma mistura de fosfolipídeo e colesterol pode compreender um fosfolipídeo tal como DPPC ou DSPC a cerca de 7% em mol (ou qualquer fração do mesmo), por exemplo, em mistura com um ou colesterol um derivado do colesterol a cerca de 34% em mol (ou qualquer fração do mesmo) do lipídeo total presente na partícula. Como outro exemplo não limitativo, uma formulação de partículas de lipídeo 7:54 compreendendo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol pode compreender um fosfolipídeo tal como DPPC ou DSPC a cerca de 7% em mol (ou qualquer fração do mesmo), por exemplo, em mistura com um ou colesterol um derivado do colesterol a cerca de 32% em mol (ou qualquer fração do mesmo) do lipídeo total presente na partícula.
[000282] Em outras modalidades, o componente de colesterol na mis-tura pode compreender de cerca de 25% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 45% em mol, entre cerca 30% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 27% em mol a cerca de 37% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 30% em mol, ou de cerca de 35% em mol a cerca de 40% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula. Em certas modalidades preferenciais, o componente de colesterol em que a mistura compreende de cerca de 25% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 27% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 29% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 34% em mol, de cerca de 31% em mol a cerca de 33% em mol, ou cerca de 30% em mol, 31% em mol, 32% em mol, 33% em mol, 34% em mol, ou 35% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula. Tipicamente, uma formulação de partícula de lipídeo 1:57 incluindo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol pode compreender um derivado de colesterol ou colesterol a cerca de 34% em mol (ou qualquer fração do mesmo), por exemplo, numa mistura com um fosfolipídeo tal como DPPC ou DSPC a cerca de 7% em mol (ou qualquer fração do mesmo) do lipídeo total presente na partícula. Tipicamente, uma formulação de partículas de lipídeo 7:54 compreendendo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol pode compreender um derivado de colesterol ou colesterol a cerca de 32% em mol (ou qualquer fração do mesmo), por exemplo, em uma mistura com um fosfolipídeo tal como DPPC ou DSPC a cerca 7% em mol (ou qualquer fração do mesmo) do lipídeo total presente na partícula.
[000283] Em modalidades em que as partículas de lipídeo são livres de fosfolipídeo, o colesterol ou um derivado do mesmo pode compreender até cerca de 25% em mol, 30% em mol, 35% em mol, 40% em mol, 45% em mol, 50% em mol, 55% em mol, ou 60% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[000284] Em algumas modalidades, o colesterol ou um derivado do mesmo na formulação de partículas de lipídeo livre de fosfolipídeo pode compreender de cerca de 25% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 31% em mol a cerca de 39% em mol, de cerca de 32% em mol a cerca de 38% em mol, de cerca de 33% em mol a cerca de 37% em mol, a partir cerca de 35% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 35% em mol a cerca de 40% em mol, ou cerca de 30% em mol, 31% em mol, 32% em mol, 33% em mol, 34% em mol, 35% em mol, 36% em mol, 37% em mol, 38% em mol, 39% em mol, ou 40% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma formulação de partí-culas de lipídeo 1:62 pode compreender colesterol a cerca de 37% em mol (ou qualquer fração do mesmo) do lipídeo total presente na partí-cula. Como outro exemplo não limitativo, uma formulação de partículas de lipídeo 7:58 pode compreender colesterol a cerca de 35% em mol (ou qualquer fração do mesmo) do lipídeo total presente na partícula.
[000285] Em outras modalidades, o lipídeo não catiônico compreende de cerca de 5% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 10% em mol a cerca de 85% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 80% em mol, cerca de 10% em mol (por exemplo, apenas de fosfolipí- deo), ou cerca de 60% em mol (por exemplo, de fosfolipídeos e colesterol ou um derivado do mesmo) (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula.
[000286] Percentuais adicionais e faixas de lipídeos não catiônicos adequados para uso nas partículas de lipídeo com a presente invenção estão descritos, por exemplo, na Publicação PCT WO 09/127060, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000287] Deve entender-se que o percentual de lipídeo não catiônico presente nas partículas de lipídeo com a invenção é uma quantidade alvo, e que a quantidade real de presente lipídeo não catiônico na for-mulação pode variar, por exemplo, ± 5% em mol. Por exemplo, em uma formulação 1:57 de partículas de lipídeo (por exemplo, LNP), a quantidade alvo de fosfolipídeo é de 7,1% em mol e a quantidade alvo de colesterol é de 34,3% em mol, mas a quantidade real de fosfolipí- deo pode ser de ± 2% em mol, ± 1,5% em mol, ± 1% em mol, ± 0,75% em mol, ± 0,5% em mol, ± 0,25% em mol, ou ± 0,1% em mol da quan-tidade alvo, e a quantidade real de colesterol pode ser de ± 3% em mol, de ± 2% em mol, ± 1% em mol, ± 0,75% em mol, ± 0,5% em mol, ± 0,25% em mol, ou ± 0,1% em mol da quantidade alvo, com o equilíbrio da formulação sendo constituído por outros componentes lipídicos (adicionando-se até 100% em mol de lipídeos totais presentes na par-tícula). Do mesmo modo, na formulação de partícula de lipídeo 7:54 (por exemplo, LNP), a quantidade alvo de fosfolipídeo é 6,75% em mol e a quantidade alvo de colesterol é 32,43% em mol, mas a quantidade real de fosfolipídeo pode ser de ± 2% em mol, ± 1,5% em mol, ± 1% em mol, ± 0,75% em mol, ± 0,5% em mol, ± 0,25% em mol, ou ± 0,1% em mol do que a quantidade alvo, e a quantidade real de colesterol pode ser de ± 3% em mol, ± 2% em mol, ± 1% em mol, ± 0,75% em mol, ± 0,5% em mol, ± 0,25% em mol, ou ± 0,1% em mol da quantidade alvo, com o equilíbrio da formulação sendo constituído por outros componentes lipídicos (adicionando-se a 100% em mol de lipídeos to-tais presentes na partícula).
C. Conjugados lipídicos
[000288] Além de lipídeos catiônicos e não catiônicos, as partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP) podem ainda compreender um conjugado lipídico. O conjugado lipídico é útil na medida em que impede a agregação das partículas. Lipídeos conjugados adequados incluem, entre outros, conjugados de PEG-lipídicos, conjugados POZ- lipídicos, conjugados ATTA-lipídico, conjugando-catiônico-polímero- lipídeo (CPLs), e misturas dos mesmos. Em certas modalidades, as partículas compreendem um conjugado PEG-lipídeo ou um conjugado ATTA-lipídeo juntamente com uma CPL.
[000289] Em uma modalidade preferencial, o lipídeo é um conjugado PEG-lipídeo. Exemplos de PEG-lipídeos incluem, entre outros, o PEG acoplado a dialquiloxipropil (PEG-DAA), tal como descrito em, por exemplo, publicação PCT WO 05/026372, PEG acoplado ao diacilglicerol (DAG-PEG) tal como descrito em, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente US 2003/0077829 e 2005/008689, PEG acoplado a fosfolipí- deos, tais como fosfatidiletanolamina (PEG-PE), PEG conjugado a cera- midas, tal como descrito em, por exemplo, a Patente US 5.885.613, PEG conjugado com colesterol ou um derivado do mesmo, e misturas dos mesmos. As revelações destes documentos de patentes são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000290] PEG-lipídeos adicionais adequados para uso na invenção incluem, entre outros, mPEG2000-1,2-di-O-alquil-sn3-carbomoilglicerídeo (PEG-C-DOMG). A síntese de PEG-C-DOMG é descrita na Publicação PCT No. WO 09/086558, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins. No entanto, os conjugados de PEG-lipídeo adicionais adequados incluem, entre outros, 1-[8'-(1,2- dimiristoil-3-propanoxi)-carboxamido-3',6'-dioxaoctanil]carbamoil-w-metil- poli(etileno-glicol) (2KPEG-DMG). A síntese de 2KPEG-DMG é descrita na Patente US 7.404.969, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000291] O PEG é uma cadeia linear, de polímero solúvel em água de unidades de repetição de etileno PEG com dois grupos hidroxil ter-minais. PEGs são classificados por seus pesos moleculares; por exemplo, PEG 2000 tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons, e PEG 5000 tem um peso molecular médio de cerca de 5.000 daltons. Os PEG estão disponíveis comercialmente a partir da Sigma Chemical Co. e outras empresas e incluem, entre outros, o seguinte: monometoxipolietileno glicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenogli- col-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenoglicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietileno glicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenoglicol-tresilato (TRES-MePEG), monometoxipolietilenoglicol-imidazolil-carbonil (MePEG-MI), bem como tais compostos contendo um grupo hidroxil terminal, em vez de um grupo metóxi terminal (por exemplo, HO-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO- PEG-NH2, etc.). Outros PEG, tais como os descritos nas Patentes dos US Nos. 6.774.180 e 7.053.150 (por exemplo, mPEG (20 KDa) amina) também são úteis para a preparação dos conjugados de PEG-lipídicos da presente invenção. As revelações destas patentes são aqui incor-poradas por referência na sua totalidade para todos os fins. Além disso, o ácido monometoxipolietilenoglicol-acético (MePEG-CH2COOH) é particularmente útil para a preparação de conjugados de PEG-lipídicos incluindo, por exemplo, conjugados de PEG-DAA.
[000292] A fração PEG dos conjugados de PEG-lipídicas aqui descritas pode compreender um peso molecular médio variando de cerca de 550 daltons a cerca de 10.000 daltons. Em certos casos, a fração PEG tem um peso molecular médio de cerca de 750 daltons a cerca de 5.000 daltons (por exemplo, de cerca de 1.000 daltons a cerca de 5.000 daltons, de cerca de 1.500 daltons a cerca de 3.000 daltons, cerca de 750 daltons a cerca de 3.000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 2.000 daltons, etc.). Em modalidades preferenciais, a fração PEG tem um peso molecular médio de cerca de 2000 daltons ou cerca de 750 daltons.
[000293] Em certos casos, o PEG pode ser opcionalmente substituído por um grupo alquila, alcóxi, acila, ou grupo arila. O PEG pode ser conjugado diretamente ao lipídeo ou pode ser ligado ao lipídeo através de uma fração ligante. Qualquer grupo ligante adequado para acoplar o PEG a um lipídeo pode ser usado incluindo, por exemplo, frações ligantes não contendo éster e frações ligantes contendo ésteres. Em uma modalidade preferencial, a fração ligante é uma fração ligante não contendo éster. Tal como aqui utilizado, o termo "fração ligante não contendo éster" refere-se a uma fração ligante que não contém uma ligação de éster carboxílico (-OC(O)-). Frações ligantes adequadas não contendo éster incluem, entre outras, amido (-C (O)NH-), amino (NR-), carbonil (-C(O)-), carbamato (-NHC(O)O-), ureia (-NHC(O)NH-), dissulfeto (-S-S-), éter (-O), succinil (-(O)CCH2CH2C(O)-), succinamidil (-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), éter, dissulfeto, bem como combinações dos mesmos (como um ligante contendo tanto uma fração ligante car- bamato e uma fração ligante de amido). Em uma modalidade prefe-rencial, um ligante carbamato é usado para acoplar o PEG ao lipídeo.
[000294] Em outras modalidades, uma fração ligante contendo éster é usada para acoplar o PEG ao lipídeo. Frações ligantes adequadas contendo éster incluem, por exemplo, carbonatos (-OC (O)O-) succi- noila, ésteres de fosfato (-O-(O)POH-O-), ésteres de sulfonatos, e combinações dos mesmos.
[000295] Fosfatidiletanolaminas possuindo uma variedade de grupos de cadeia acil de variados comprimentos de cadeia e graus de saturação podem ser conjugados com PEG para formar o conjugado lipídico. Tais fosfatidiletanolaminas estão disponíveis comercialmente, ou podem ser isoladas ou sintetizadas utilizando técnicas convencionais conhecidas dos especialistas na técnica. Fosfatidiletanolaminas contendo ácidos graxos saturados ou insaturados com comprimentos de cadeia de carbono na faixa de C10 a C20 são preferenciais. Fosfatidiletanolaminas com ácidos graxos mono ou di-insaturados e misturas de ácidos graxos saturados e insaturados podem também ser utilizadas. Fosfatidiletanolaminas adequadas incluem, entre outras, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dioleoilfosfatidiletano- lamina (DOPE), e diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE).
[000296] O termo "ATTA" ou "poliamida" inclui, entre outros, os com-postos descritos nas Patentes US 6.320.017 e 6.586.559, as revela-ções das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins. Estes compostos incluem um composto tendo a fórmula:
Figure img0008
em que R é um membro selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila e acil; R1 é um membro selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio e alquil; ou opcionalmente, R e R1 e o nitrogênio ao qual eles estão ligados, formam uma fração azido; R2 é um membro do grupo selecionado a partir de hidrogênio, alquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída e uma cadeia lateral de um aminoácido; R3 é um membro selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogêneo, hidróxi, alcóxi, mercapto, hidrazino, amino e NR4R5, em que R4 e R5 são independen-temente hidrogênio ou alquil; n é 4 a 80; m é 2 a 6; p é 1 a 4; e q é 0 ou 1. Será evidente para os especialistas na técnica que outras polia- midas podem ser utilizadas nos compostos da presente invenção.
[000297] O termo "diacilglicerol" ou "DAG" inclui um composto com 2 cadeias de acil graxo, R1 e R2, que têm, independentemente, entre 2 e 30 átomos de carbono ligados à posição 1 e posição 2 do glicerol por ligações éster. Os grupos acil podem ser saturados ou têm vários graus de insaturação. Grupos acil adequados incluem, entre outros, lauroil (C 12), miristoil (C14), palmitoil (C16), estearoil (C18), e icosoil (C20). Em modalidades preferenciais, R1 e R2 são os mesmos, isto é, R1 e R2 são ambos mi- ristoil {isto é, dimiristoil), R1 e R2 são ambos estearoil (isto é, diestearoil), etc. Diacilgliceróis têm a seguinte geral fórmula:
Figure img0009
[000298] O termo "dialquilxipropila" ou "DAA" inclui um composto com duas cadeias alquila, R1 e R2, ambos dos quais têm, independen-temente, entre 2 e 30 átomos de carboNo. Os grupos alquil podem ser saturados ou têm vários graus de insaturação. Dialquilxipropil têm a seguinte fórmula geral:
Figure img0010
.
[000299] Em uma modalidade preferencial, o PEG-lipídeo é um con-jugado PEG-DAA tendo a seguinte fórmula:
Figure img0011
em que R1 e R2 são selecionados independentemente e são grupos alquil de cadeia longa tendo de cerca de 10 a cerca de 22 átomos de carbono; PEG é um polietilenoglicol; e L é um fração ligante não contendo éster ou uma fração ligante contendo éster tal como descrito acima. Os grupos alquil de cadeia longa podem ser saturados ou insaturados. Os grupos alquil adequados incluem, entre outros, decil (C10), lauril (C12), miristil (C14), palmitil(C16), esteárico (C18), e icosil (C20). Em modalidades preferenciais, R1 e R2 são os mesmos, isto é, R1 e R2 são ambos miristil (isto é, dimiristil), R1 e R2 são ambos estearil (isto é, distearil), etc.
[000300] Na Fórmula V acima, o PEG tem um peso molecular médio variando de cerca de 550 daltons a cerca de 10.000 daltons. Em cer- tos casos, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 750 dal-tons a cerca de 5.000 daltons (por exemplo, de cerca de 1.000 daltons a cerca de 5.000 daltons, cerca de 1.500 daltons a cerca de 3.000 dal-tons, cerca de 750 daltons a cerca de 3.000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 2.000 daltons, etc.). Em modalidades preferenciais, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 2000 daltons ou aproximadamente 750 daltons. O PEG pode ser opcionalmente substi-tuído com grupos alquila, alcóxi, acila ou arila. Em certas modalidades, o grupo hidroxil terminal é substituído com um grupo metóxi ou metila.
[000301] Em uma modalidade preferencial, "L" é uma fração ligante não contendo éster. Ligantes não contendo éster apropriados incluem, entre outros, uma fração ligante amido, uma fração ligante amino, uma fração de ligação carbonila, uma fração ligante carbamato, uma fração ligante de ureia, uma fração ligante éter, uma fração ligante dissulfeto, fração ligante succinamidila, e combinações dos mesmos. Em modalidade preferencial, a fração ligante não contendo éster é fração ligante carbamato (isto é, um conjugado de PEG-C-DAA). Em outra modalidade preferencial, a fração ligante não contendo éster é uma fração ligante de amido (isto é, um conjugado PEG-ADAA). Em ainda outra modalidade preferencial, a fração ligante não contendo és-ter é uma fração ligante succinamidil (isto é, um conjugado de PEG-S- DAA).
[000302] Em modalidades particulares, o conjugado PEG-lipídeo é selecionado a partir de:
Figure img0012
[000303] Os conjugados de PEG-DAA são sintetizados usando téc-nicas padrão e reagentes conhecidos dos especialistas na técnica. Se- rá reconhecido que os conjugados de PEG-DAA irão conter várias li-gações amida, amina, éter, tio, carbamato e ureia. Os especialistas na técnica reconhecerão que os métodos e reagentes para a formação destas ligações são bem conhecidos e facilmente disponíveis. Ver, por exemplo, March ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley, 1992); Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989); e Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5a ed. (Longman, 1989). Também será apreciado que quaisquer grupos funcionais presentes podem exigir proteção e des-proteção em pontos diferentes na síntese dos conjugados de PEG- DAA. Os especialistas na técnica reconhecerão que tais técnicas são bem conhecidas. Ver, por exemplo, Green e Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley, 1991).
[000304] Preferencialmente, o conjugado de PEG-DAA é um PEG- conjugado dideciloxipropil (C10), um conjugado PEG-dilauriloxipropil (C12), um conjugado PEG-dimiristiloxipropil (C14), um conjugado PEG- dipalmitiloxipropil (C16), ou um conjugado PEG-disteariloxipropil (C18). Nestas modalidades, o PEG tem preferencialmente um peso molecular médio de cerca de 750 ou cerca de 2000 daltons. Em uma modalidade particularmente preferencial, o conjugado PEG-lipídeo compreende PEG2000-C-DMA, em que o "2000" indica o peso molecular médio do PEG, a "C" indica uma fração ligante carbamato, e "DMA" significa di- miristiloxipropila. Em outra modalidade particularmente preferencial, o conjugado PEG-lipídeo compreende PEG750-C-DMA, em que o "750" indica o peso molecular médio do PEG, a "C" indica uma fração ligante carbamato, e "DMA" significa dimiristiloxipropila. Em modalidades par-ticulares, o grupo hidroxil terminal do PEG é substituído com um grupo metila. Os especialistas na técnica apreciarão facilmente que outros dialquilxipropil podem ser utilizados em conjugados de PEG-DAA da presente invenção.
[000305] Além do exposto, será evidente para os especialistas na técnica que outros polímeros hidrofílicos podem ser utilizados no lugar de PEG. Exemplos de polímeros adequados que podem ser utilizados em lugar de PEG incluem, entre outros, polivinilpirrolidona, polimetilxa- zolina, polietilxazolina, polihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida e polidimetilacrilamida, ácido poli láctico, ácido poliglicólico, e celuloses derivatizadas, tais como hidroximetilcelulose ou hidroxietilcelulose.
[000306] Além dos componentes acima, as partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) da presente invenção podem ainda compreender lipí-deos catiônicos poli(etileno glicol) (PEG) ou CPLs (ver, por exemplo, Chen et al., Bioconj. Chem., 11: 433-437 (2000), Patente US 6.852.334; Publicação PCT No. WO 00/62813, as revelações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins). CPLs adequados incluem os compostos de Fórmula VI: A-W-Y (VI), em que A, W e Y são tal como descrito abaixo.
[000307] Com referência à Fórmula VI, "A" é um radical lipídico, tal como um lipídeo anfipático, um lipídeo neutro, ou um lipídeo hidrofóbi- co que atua como uma âncora de lipídeos. Exemplos de lipídeos ade-quados incluem, entre outros, diacilglicerolila, dialquilglicerolila, N-N- dialquilaminos, 1,2-diacilxi-3-aminopropanos, e 1,2-dialquil-3-amino- propanos.
[000308] "W" é um polímero ou um oligômero tal como um polímero hidrofílico ou oligômero. Preferencialmente, o polímero hidrofílico é um polímero que não é imunogênico biocompatível ou possui baixa imu- nogenicidade inerente. Em alternativa, o polímero hidrofílico pode ser fracamente antigênico, se utilizado com adjuvantes adequados. Os polímeros não imunogênicos adequados incluem, entre outros, PEG, poliamidas, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido- poliláctico/ácido poliglicólico, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferencial, o polímero tem um peso molecular de cerca de 250 a cerca de 7.000 daltons.
[000309] "Y" é uma fração policatiônica. O termo fração policatiônica refere-se a um composto, derivado, ou um grupo funcional que tem uma carga positiva, preferencialmente, pelo menos, duas cargas posi-tivas a um pH selecionado, preferencialmente pH fisiológico. Frações policatiônicas adequadas incluem aminoácidos básicos e seus deriva-dos, tais como arginina, asparagina, glutamina, lisina e histidina; es- permina; espermidina; dendrímeros catiônicos; poliaminas; açúcares de poliaminas; e amino polissacarídeos. As frações policatiônicas podem ser lineares, tal como tetralisina linear, ramificada ou dendriméri- ca em estrutura. Frações policatiônicas têm entre cerca de 2 a cerca de 15 cargas positivas, preferencialmente entre cerca de 2 a cerca de 12 cargas positivas, e mais preferencialmente entre cerca de 2 a cerca de 8 cargas positivas em valores de pH selecionados. A seleção de cuja fração policatiônica empregar pode ser determinada pelo tipo de aplicação de partícula que é desejada.
[000310] As cargas nas frações policatiônicas podem ser distribuídas em volta de toda ou a fração de partículas ou, alternativamente, eles podem ser uma concentração discreta de densidade de carga de uma área particular da fração de partículas, por exemplo, um aumento de carga. Se a densidade de carga é distribuída sobre a partícula, a den-sidade de carga pode ser distribuída igualmente ou distribuída de forma homogênea. Todas as variações de distribuição de carga da fração policatiônica são englobadas pela presente invenção.
[000311] O lipídeo "A" e o polímero não imunogênico "W" pode ser ligado através de vários métodos, e preferencialmente por uma ligação covalente. Métodos conhecidos dos especialistas na técnica podem ser utilizados para a ligação covalente de "A" e "W" Ligações adequadas incluem, entre outras, ligações amida, amina, carboxila, carbonato, carbamato, éster e hidrazona. Será evidente para os especialistas na técnica que "A" e "W" devem ter grupos funcionais complementares para efetuar a ligação. A reação destes dois grupos, um de lipídeo e o outro no polímero, proporcionarão a ligação desejada. Por exemplo, quando o lipídeo é um diacilglicerol e o hidroxil terminal é ativado, por exemplo, com NHS e DCC, para formar um éster ativo, e é então rea-gido com um polímero que contém um grupo amino, tal como com uma poliamida (ver, por exemplo, Patentes US 6.320.017 e 6.586.559, as revelações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins), uma ligação de amida que se forma entre os dois grupos.
[000312] Em certos casos, a fração policatiônica pode ter um ligante ligado, tal como um ligante de direcionamento ou uma fração quelante para a complexação de cálcio. Preferencialmente, depois de o ligante ser ligado, a unidade catiônica mantém uma carga positiva. Em certos casos, o ligante que se encontra ligado tem uma carga positiva. Os ligantes adequados incluem, entre outros, um composto ou o dispositi-vo com um grupo funcional reativo e incluem lipídeos, lipídeos anfipáti- cos, compostos carreadores, compostos de bioafinidade, biomateriais, biopolímeros, dispositivos biomédicos, compostos analiticamente de- tectáveis, compostos terapeuticamente ativos, enzimas, peptídeos, proteínas, anticorpos, estimuladores imunológicos, marcadores radioa-tivos, fluorógenos, biotina, fármacos, haptenos, DNA, RNA, polissaca- rídeos, lipossomas, virossomas, micelas, imunoglobulinas, grupos fun-cionais, com frações de direcionamento, ou toxinas.
[000313] Em algumas modalidades, o conjugado lipídico (por exemplo, PEG-lipídeo) compreende de cerca de 0,1% em mol a cerca de 2% em mol, de cerca de 0,5% em mol a cerca de 2% em mol, de cerca de 1% em mol a cerca de 2% em mol, de cerca de 0,6% em mol a cerca de 1,9% em mol, de cerca de 0,7% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 0,8% em mol a cerca de 1,7% em mol, de cerca de 0,9% em mol a cerca de 1,6% em mol, de cerca de 0,9% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 1% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 1% em mol a cerca de 1,7% em mol, de cerca de 1,2% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 1,2% em mol a cerca de 1,7% em mol, de cerca de 1,3% em mol a cerca de 1,6% em mol, ou de cerca de 1,4% em mol a cerca de 1,5% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula.
[000314] Em outras modalidades, o conjugado lipídico (por exemplo, PEG-lipídeo) compreende de cerca de 0% em mol a cerca de 20% em mol, de cerca de 0,5% em mol a cerca de 20% em mol, de cerca de 2% em mol a cerca de 20% em mol, de cerca de 1,5% em mol a cerca de 18% em mol, de cerca de 2% em mol a cerca de 15% em mol, de cerca de 4% em mol a cerca de 15% em mol, de cerca de 2% em mol a cerca de 12% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 12% em mol, ou cerca de 2% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula.
[000315] De acordo com outras modalidades, o conjugado lipídico (por exemplo, PEG-lipídeo) compreende de cerca de 4% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 9% em mol, de cerca de 5% em mol até cerca de 8% em mol, de cerca de 6% em mol a cerca de 9% em mol, de cerca de 6% em mol a cerca de 8% em mol, ou cerca de 5% em mol, 6% em mol, 7% em mol, 8% em mol, 9% em mol, ou 10% em mol (ou qualquer fração do mesmo ou faixa deste) do lipídeo total presente na partícula.
[000316] Os exemplos, percentuais e/ou faixas de conjugados de lipídeos adequados para uso nas partículas de lipídeo com a presente invenção são descritos em, por exemplo, a publicação PCT No. WO 09/127060, e Publicação PCT WO 2010/006282, cujas descrições são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000317] Deve entender-se que o percentual do conjugado lipídeo (por exemplo, PEG-lipídeo) presente nas partículas de lipídeo com a invenção é uma quantidade alvo, e que a quantidade real de conjugado lipídico presente na formulação pode variar, por exemplo, ± 2% em mol. Por exemplo, em uma formulação de partícula de lipídeo 1: 57 (por exemplo, LNP), a quantidade alvo do conjugado lipídico é de 1,4% em mol, mas a quantidade real de conjugado lipídico pode ser ± 0,5% em mol, ± 0,4% em mol, ± 0,3% em mol, ± 0,2% em mol, ± 0,1% em mol, ou ± 0,05% em mol daquela quantidade alvo, com o equilíbrio da formulação sendo constituída por outros componentes lipídicos (adici-onando até 100% em mol de lipídeos totais presentes na partícula). Do mesmo modo, na formulação de partícula de lipídeo 7:54 (por exemplo, LNP), a quantidade alvo de conjugado lipídeo é 6,76% em mol, mas a quantidade real de conjugado lipídico pode ser de ± 2% em mol, ± 1,5% em mol, ± 1% em mol, ± 0,75% em mol, ± 0,5% em mol, ± 0,25% em mol, ou ± 0,1% em mol da quantidade alvo, com o equilíbrio da formulação sendo constituída por outros componentes lipídicos (adicionando até 100% em mol de lipídeos totais presentes na partícula).
[000318] Um especialista na técnica irá apreciar que a concentração do conjugado lipídico pode variar, dependendo do conjugado lipídeo empregue e da velocidade com que a partícula de lipídeo se tornar fu- sogênica.
[000319] Através do controle da composição e concentração do con-jugado lipídico, pode-se controlar a velocidade em que o conjugado lipídico sai da partícula de lipídeo e, por sua vez, a velocidade em a partícula de lipídeo se torna fusogênica. Por exemplo, quando um con-jugado de PEG-DAA é usado como o conjugado lipídico, a velocidade em que a partícula de lipídeo se torna fusogênica pode ser variada, por exemplo, ao variar a concentração do conjugado lipídico, variar o peso molecular do PEG, ou através da variação do comprimento da cadeia e grau de saturação dos grupos alquil no conjugado de PEG- DAA. Além disso, outras variáveis, tais como, por exemplo, pH, tempe-ratura, força iónica, etc, podem ser utilizados para variar e/ou controlar a velocidade em que a partícula de lipídeo se torna fusogênica. Outros métodos que podem ser usados para controlar a velocidade em que a partícula de lipídeo se torna fusogênica se tornará evidente para os especialistas na técnica após leitura desta descrição. Além disso, através do controle da composição e concentração do conjugado lipídico, é possível controlar o tamanho da partícula de lipídeo (por exemplo, LNP).
VI. Preparação de Partículas de Lipídeo
[000320] As partículas de lipídeo da presente invenção, por exemplo, LNP, no qual um agente ativo ou agente terapêutico, tal como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) é retido no interior da parte lipídica da partícula e é protegido da degradação, podem ser formadas por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, entre outros, um mé-todo de mistura contínuo, um processo de diluição direta, e um pro-cesso de diluição em série.
[000321] Em modalidades particulares, os lipídeos catiônicos podem compreender lipídeos de Fórmula I ou sais dos mesmos, isoladamente ou em combinação com outros lipídeos catiônicos. Em outras modalidades, os lipídeos não catiônicos são esfingomielina de ovo (ESM), distea- roilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), l-palmitoil-2- oleoil-fosfatidilcolina (POPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), mono- metil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, 14:0 PE (1,2- dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE)), 16:0 PE (1,2-dipalmitoil- fosfatidiletanolamina (DPPE)), 18:0 PE (1,2-diestearoil- fosfatidiletanolamina (DSPE)), 18:1 PE (1,2-dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE)), 18:1 trans PE (1,2-dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE)), 18:0-18:1 PE (1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE)), 16:0- 18:1 PE (l-palmitoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (POPE)), polímeros à base de polietileno-glicol (por exemplo, PEG 2000, PEG 5000, diacilglice- róis modificados com PEG, ou dialquilxipropil modificado com PEG), colesterol e derivados dos mesmos, ou combinações dos mesmos.
[000322] Em certas modalidades, a presente invenção fornece partí-culas de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP) produzidas por meio de um método contínuo de mistura, por exemplo, um processo que inclui o fornecimento de uma solução aquosa compreendendo um ácido nucleico (por exemplo, RNA interferente) em um primeiro reser-vatório, proporcionando uma solução orgânica de lipídeos em um se-gundo reservatório (em que os lipídeos presentes na solução orgânica de lipídeos são dissolvidos em um solvente orgânico, por exemplo, um alcanol inferior tal como etanol), e a mistura da solução aquosa com a solução de lipídeos orgânicos de modo que a solução de lipídeos or-gânicos se mistura com a solução aquosa de modo a produzir subs-tancialmente de modo instantâneo uma vesícula de lipídeos (por exemplo, lipossomas) encapsulando o ácido nucleico dentro da vesí-cula lipídica. Este processo e o aparelho para a realização deste pro-cesso estão descritos em detalhe na Publicação do Pedido de Patente US 2004/0142025, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000323] A ação de introduzir continuamente soluções lipídicas e tampão para um ambiente de mistura, tal como em uma câmara de mistura, faz com que uma diluição contínua da solução de lipídeo, com a solução tampão, produzindo, assim, uma vesícula lipídica substanci-almente de modo instantâneo durante a mistura. Tal como aqui utiliza-da, a frase "diluindo continuamente uma solução lipídica com uma so-lução tampão" (e variantes) significa, geralmente, que a solução lipídi- ca é diluída de maneira suficientemente rápida em um processo de hidratação, com força suficiente para efetuar a geração de vesícula. Ao misturar a solução aquosa compreendendo um ácido nucleico com a solução orgânica lipídica, a solução orgânica lipídica sofre uma dilui-ção gradual contínua na presença de uma solução tampão (isto é, so-lução aquosa) para produzir uma partícula de ácido nucleico-lipídeo.
[000324] As partículas de ácido nucleico-lipídeo formadas usando o método de mistura contínua tipicamente têm um tamanho de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 90 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 70 a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 80 nm, inferior a cerca de 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm, ou 80 nm, ou cerca de 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm ou 150 nm (ou qualquer fração ou faixa nesta). As partículas assim formadas não são agregadas e, opcionalmente, dimensionadas para obter um tamanho de partícula uniforme.
[000325] Em outra modalidade, a presente invenção fornece partículas de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP) produzidas através de um processo que inclui a formação de uma solução de vesícula li- pídica (por exemplo, lipossomas) e imediatamente e diretamente introduzindo a solução de vesícula lipídica em um recipiente de coleta contendo uma quantidade controlada de tampão de diluição. Em aspectos preferenciais, o recipiente de coleta inclui um ou mais elementos con-figurados para agitar o conteúdo do recipiente de coleta para facilitar a diluição. Em um aspecto, a quantidade de tampão de diluição presente no recipiente de coleta é substancialmente igual ao volume de solução de vesículas lipídicas introduzida ao mesmo. Como um exemplo não limitativo, uma solução de vesículas lipídica em etanol a 45%, quando introduzida no recipiente de coleta, contendo um volume igual de tam-pão de diluição irá vantajosamente obter partículas menores.
[000326] Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece partículas de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, LNP) produzidas através de um processo de diluição em linha em que um terceiro re-servatório contendo tampão de diluição está acoplado fluidamente a uma segunda região de mistura. Nesta modalidade, a solução de vesí-cula lipídica (por exemplo, lipossomas) formada em uma primeira regi-ão de mistura é imediatamente e diretamente misturadas com tampão de diluição para a segunda região de mistura. Em aspectos preferen-ciais, a segunda região de mistura inclui um conector em T disposto de modo que a solução de vesículas lipídicas e os fluxos de tampão de diluição se oponha aos fluxos em 180°; no entanto, os conectores pro-porcionando ângulos rasos podem ser utilizados, por exemplo, de cer-ca de 27° a cerca de 180° (por exemplo, cerca de 90°). Um mecanismo de bomba libera um fluxo controlável do tampão para a segunda região de mistura. Em um aspecto, a taxa de fluxo de tampão de diluição fornecida à segunda região de mistura é controlada para ser subs-tancialmente igual à taxa de fluxo da solução de vesícula lipídica intro-duzida a esta a partir da primeira região de mistura. Esta modalidade permite, vantajosamente, permite maior controle do fluxo de tampão de diluição da mistura com a solução de vesículas lipídicas na segunda região de mistura, e, por conseguinte, também a concentração da solução de vesículas lipídicas em tampão ao longo do segundo pro-cesso de mistura. Este controle da taxa de fluxo de tampão de diluição permite vantajosamente permite formação de partículas de tamanho pequeno em concentrações reduzidas.
[000327] Estes processos e os aparelhos para a realização desta diluição direta em processos de diluição em linha encontram-se des- critos em detalhes na Publicação do Pedido de Patente US 2007/0042031, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000328] As partículas de ácido nucleico-lipídeo formadas utilizando a diluição direta em linha e os processos de diluição normalmente têm um tamanho de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 1 a 10 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 90 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 70 a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 70 nm a cer-ca de 80 nm, inferior a cerca de 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm ou 80 nm, ou cerca de 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm ou 150 nm (ou qualquer fração ou faixa nesta). As partículas assim formadas não são agregadas e, opcionalmente, dimensionadas para obter um tamanho de partícula uniforme.
[000329] Se necessário, as partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP) podem ser dimensionadas por qualquer um dos méto-dos disponíveis para o dimensionamento de lipossomas. O dimensio-namento pode ser conduzido de modo a atingir uma faixa de tamanhos desejada e de distribuição relativamente estreita de tamanhos de par-tículas.
[000330] Várias técnicas estão disponíveis para o dimensionamento de partículas de um tamanho desejado. Um método de dimensionamento utilizado para os lipossomas e igualmente aplicável as presentes partículas é descrito na Patente US 4.737.323, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins. Sonicando uma suspensão de partículas, quer por banho ou sonda de sonicação produz uma redução progressiva de tamanho até partículas de menos de cerca de 50 nm de tamanho. A homogeneização é outro método que se baseia na energia de cisalhamento para fragmentar as partículas maiores em menores. Em um procedimento típico de homo-geneização, as partículas são recirculadas através de um homogenei- zador de emulsão padrão até tamanhos de partículas selecionados, tipicamente entre cerca de 60 e cerca de 80 nm, serem observadas. Em ambos os métodos, a distribuição de tamanho de partícula pode ser monitorada por discriminação de tamanho de partícula por feixe de laser, ou QELS.
[000331] A extrusão das partículas através de uma membrana de policarbonato de poro pequeno, ou de uma membrana de cerâmica assimétrica é também um método eficaz para reduzir os tamanhos de partículas com uma distribuição de tamanho relativamente bem defini-da. Tipicamente, a suspensão é ciclada através da membrana uma ou mais vezes até que a distribuição do tamanho de partícula desejado seja alcançada. As partículas podem ser extrudidas através de, suces-sivamente, membranas de poros menores, para atingir uma redução gradual no tamanho.
[000332] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos presentes nas partículas são pré-condensados como descrito em, por exemplo, Pedido de Patente US 09/744.103, a revelação do qual é aqui incorpo-rada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000333] Em outras modalidades, os métodos podem ainda compre-ender a adição de policátions não lipídicos que são úteis para efetuar a lipofecção de células usando as presentes composições. Exemplos de policátions não lipídicos adequados incluem brometo de hexadimetrina (vendido sob o nome de marca de POLIBRENE®, da Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, EUA) ou outros sais de hexadimetrina. Ou-tros policátions adequados incluem, por exemplo, sais de poli-L- ornitina, poli-L-arginina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, polialilamina e polie- tilenoimina. A adição destes sais é preferencialmente após as partícu-las terem sido formadas.
[000334] Em algumas modalidades, as proporções de ácido nucleico para lipídeo (proporções de massa/massa) em uma partícula de ácido nucleico-lipídeo formada (por exemplo, LNP) irá variar entre cerca de 0,01 a cerca de 0,2, de cerca de 0,05 a cerca de 0,2, de cerca de 0,02 a cerca de 0,1, de cerca de 0,03 a cerca de 0,1, ou de cerca de 0,01 a cerca de 0,08. A proporção dos materiais de partida (entrada) também cai dentro deste intervalo. Em outras modalidades, a preparação de partículas utiliza cerca de 400 μg de ácido nucleico para cada 10 mg de lipídeo total ou uma proporção de massa de ácido nucleico e lipídeo de cerca de 0,01 a cerca de 0,08 e, mais preferencialmente, cerca de 0,04, o que corresponde a 1,25 mg de lipídeo total por 50 μg de ácido nucleico. Em outras modalidades preferenciais, a partícula tem uma proporção em massa de ácido nucleico para lipídeo de cerca de 0,08.
[000335] Em outras modalidades, as proporções de lipídeo para ácido nucleico (proporções de massa/massa) de uma partícula de ácido nucleico-lipídeo formada (por exemplo, LNP) irá variar entre cerca de 1 (1:1) a cerca de 100 (100:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 100 (100:1), de cerca de 1 (1:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 2 (2:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 3 (3:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 4 (4:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 1 (1:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 2 (2:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 3 (3:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 4 (4:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 20 ( 20:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 15 (15:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 10 (10:1), ou cerca de 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (7:1), 8 (8:1), 9 (9:1), 10 (10:1), 11 (11:1), 12 (12:1), 13 (13:1), 14 (14:1), 15 (15:1), 16 (16:1), 17 (17:1), 18 (18:1), 19 (19:1), 20 (20:1), 21 (21:1), 22 (22:1), 23 (23:1), 24 (24:1), ou 25 (25:1), ou qualquer fração da mesma ou faixa nesta. A proporção dos materiais de partida (entrada) também está dentro deste intervalo.
[000336] Tal como discutido anteriormente, o conjugado lipídico pode incluir ainda uma CPL. Uma variedade de métodos gerais para prepa-rar LNP-CPLs (LNP contendo CPL) é aqui discutido. Duas técnicas gerais incluem a técnica de "pós-inserção", isto é, a inserção de uma CPL em, por exemplo, uma LNP pré-formada, e a técnica "padrão", em que o CPL é incluído na mistura lipídica durante, por exemplo, as eta-pas de formação de LNP. A técnica de pós-inserção resulta em LNP tendo CPLs principalmente na face externa da membrana de bicamada LNP, enquanto que as técnicas padrão fornecem LNP tendo CPLs em ambas as faces internas e externas. O método é especialmente útil para vesículas preparadas de fosfolipídeos (que pode conter colesterol) e também para as vesículas contendo PEG-lipídeos (como PEG-DAAS e PEG-DAG). Métodos de preparação de LNP-CPLs são ensinados, por exemplo, nas Patentes US 5.705.385.; 6.586.410; 5.981.501; 6.534.484; e 6.852.334; Pedido de Publicação de Patente 2002/0072121; e Publicação PCT No. WO 00/62813, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins. VII. Kits
[000337] A presente invenção também proporciona partículas de lipí-deo (por exemplo, LNP) na forma de kit. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente, que está compartimentado para manter os vários elementos das partículas de lipídeo (por exemplo, os agentes ativos ou agentes terapêuticos, tais como os ácidos nucleicos e os componentes lipídicos individuais das partículas). Preferencialmente, o kit compreende um recipiente (por exemplo, um frasco ou ampola), que mantém as partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP), em que as partículas são produzidas por um dos processos aqui esta- belecidos. Em certas modalidades, o kit pode ainda compreender um desestabilizador de membrana endossomal (por exemplo, íons de cál-cio). O kit contém normalmente as partículas de composições da in-venção, como uma suspensão em um veículo farmaceuticamente acei-tável ou sob a forma desidratada, com instruções para a sua reidrata- ção (se liofilizadas) e de administração.
[000338] As partículas de lipídeo da presente invenção podem ser adaptadas para os tecidos alvos, preferencialmente, em particular, ór-gãos ou tumores de interesse. Em alguns casos, a formulação de par-tícula de lipídeo 1:57 (por exemplo, LNP) pode ser utilizada, preferen-cialmente, para atingir o fígado (por exemplo, tecido normal do fígado). Em outros casos, a formulação da partícula de lipídeo 7:54 (por exem-plo, LNP) pode ser usada para alvejar preferencialmente tumores sóli-dos, tais como tumores no fígado e tumores fora do fígado. Em moda-lidades preferenciais, os kits da invenção compreendem estas partícu-las de lipídeo dirigidas ao fígado e/ou dirigida ao tumor, em que as par-tículas estão presentes em um recipiente tal como uma suspensão ou na forma desidratada.
[000339] Em certos outros casos, pode ser desejável ter uma fração de direcionamento ligada à superfície da partícula de lipídeo para au-mentar ainda mais o direcionamento da partícula. Métodos para ligar frações de direcionamento (por exemplo, anticorpos, proteínas, etc.) aos lipídeos (tais como as utilizadas nas presentes partículas) são co-nhecidos dos especialistas na técnica.
VIII. A administração de Partículas de Lipídeo
[000340] Uma vez formadas, as partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP) são úteis para a introdução de agentes ativos ou agentes terapêuticos (por exemplo, ácidos nucleicos, tais como RNA de interferência) nas células. Por conseguinte, a presente invenção também fornece métodos para a introdução de um agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico (por exemplo, RNA inter-ferentes) em uma célula. Em alguns casos, a célula é uma célula do fígado, tais como, por exemplo, um dos hepatócitos presentes no teci-do do fígado. Em outros casos, a célula é uma célula tumoral, tais co-mo, por exemplo, uma célula de tumor presente em tumores sólidos. Os métodos são realizados in vitro ou in vivo, formando em primeiro lugar as partículas como descrito acima e, em seguida, as partículas em contato com as células durante um período de tempo suficiente para ocorrer a liberação do agente ativo ou agente terapêutico para as células.
[000341] As partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP) podem ser adsorvidas em quase todo o tipo de células com as quais são misturadas ou contatadas. Uma vez adsorvida, as partículas po-dem ser sujeitas a endocitose por uma fração das células, com troca lipídica com membranas celulares, ou fundir com as células. Transfe-rência ou incorporação do agente ativo ou agente terapêutico (por exemplo, o ácido nucleico) da fração de partículas pode ocorrer através de qualquer uma destas vias. Em particular, quando a fusão ocorre, a membrana de partícula está integrada na membrana celular e o conteúdo da partícula combina com o fluido intracelular.
[000342] As partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP) podem ser administradas isoladamente ou em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, soro fisiológico ou tampão fosfato) selecionado de acordo com a via de administração e prática farmacêutica padrão. Geralmente, a solução salina tamponada normal (por exemplo, NaCl 135-150 mM) será empregue como o veículo far- maceuticamente aceitável. Outros veículos adequados incluem, por exemplo, água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3%, e outros semelhantes, incluindo as glicoproteínas para maior estabilidade, tais como albumina, lipoproteína, globulina, etc. Carrea- dores adequados estão descritos em, por exemplo, REMINGTON'S Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17 ed.(1985). Tal como aqui utilizado, "carreador" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, carreadores, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, tampões, soluções carreadoras, sus-pensões, colóides e afins. A frase "farmaceuticamente aceitável" refe-re-se às entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou semelhante inconveniente, quando administrados a um ser humano.
[000343] O carreador farmaceuticamente aceitável é geralmente adi-cionado após a formação de partículas de lipídeo. Assim, depois das partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) serem formadas, a partícula pode ser diluída em carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada normal.
[000344] A concentração de partículas nas formulações farmacêuticas pode variar amplamente, isto é, de menos de cerca de 0,05%, normalmente a ou, pelo menos, cerca de 2 a 5%, até tanto quanto cer-ca de 10 a 90%, em peso, e será selecionada principalmente por vo-lumes de fluido, viscosidades, etc, de acordo com o modo particular de administração selecionado. Por exemplo, a concentração pode ser aumentada para reduzir a carga de fluido associada com o tratamento. Isto pode ser particularmente desejável em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva associada a aterosclerose ou a hipertensão grave. Alternativamente, as partículas compostas por lipídeos irritantes podem ser diluídas para concentrações baixas para reduzir a inflamação no local de administração.
[000345] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As soluções aquosas podem ser embaladas para utiliza- ção ou filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo a prepa-ração liofilizada combinada com uma solução aquosa estéril antes da administração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar às condições fisiológicas, tais como ajuste do pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de tonicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio e clore-to de cálcio. Além disso, a suspensão de partículas pode incluir agen-tes de proteção de lipídeos que protegem lipídeos contra danos dos radicais livres e de lipídeos-peroxidativa no armazenamento. Supres-sores lipofílicos de radicais livres, tal como alfa-tocoferol, e agentes quelantes de ferro específico solúvel em água, tais como ferrioxamina, são adequados.
[000346] Em algumas modalidades, as partículas de lipídeo da in-venção (por exemplo, LNP) são particularmente úteis em métodos para a administração terapêutica de um ou mais ácidos nucleicos que compreendem uma sequência de RNA interferente (por exemplo, siR-NA). Em particular, é um objeto da presente invenção proporcionar, in vitro e in vivo, métodos para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um mamífero (por exemplo, um roedor tal como um camundongo ou um primata, tal como um ser humano, chimpanzé ou de macaco) por regulação negativa ou silenciamento da transcrição e/ou tradução de sequências de ácido nucleico de uma ou mais alvo ou genes de interesse. Como um exemplo não limitativo, os métodos da invenção são úteis para a liberação in vivo de RNA interferente (por exemplo, siRNA) para o fígado, e/ou um tumor de um indivíduo mamífero. Em certas modalidades, a doença ou distúrbio associado com expressão e/ou a sobre-expressão de um gene e a expressão ou sobre- expressão do gene é reduzida pelo RNA interferente (por exemplo, siRNA). Em certas outras modalidades, uma quantidade terapeutica- mente eficaz de partículas de lipídeo pode ser administrada ao mamí-fero. Em alguns casos, um RNA interferente (por exemplo, siRNA) é formulado em uma LNP, e as partículas são administradas aos pacien-tes que necessitam de tal tratamento. Em outros casos, as células são removidas a partir de um paciente, o RNA interferente é liberado in vitro (por exemplo, usando uma LNP aqui descrita), e as células são reinjetadas no paciente. A. Administração in vivo
[000347] A liberação sistêmica in vivo para terapia, por exemplo, a libe-ração de um ácido nucleico terapêutico a uma célula-alvo distal via sis-temas do corpo, tais como a circulação, foi conseguida usando partículas de ácido nucleico-lipídeo, tais como aquelas descritas nas Publicações PCT WO 05/007196, WO 05/121348, WO 05/120152, e WO 04/002453, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins. A presente invenção também fornece partículas de lipídeo totalmente encapsuladas que protegem o ácido nucleico da degradação nuclease no soro, são não imunogênicas, são de tamanho pequeno, e são adequadas para a repetição da dose.
[000348] Para a administração in vivo, a administração pode ser em qualquer forma conhecida na técnica, por exemplo, por injeção, administração oral, inalação (por exemplo, intralçal ou intratraqueal), aplicação transdérmica, ou administração retal. A administração pode ser realizada através de administração de doses únicas ou divididas. As composições farmacêuticas podem ser administradas por via parenteral, isto é, intraarticular, por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são administradas por via intravenosa ou intraperitoneal, por uma injeção de bolus (ver, por exemplo, Patente US 5.286.634). Liberação de ácido nucleico intracelular também foi discutida em Straubringer et al., Methods Enzymol, 101: 512 (1983); Mannino et al., Biotechniques, 6: 682 (1988); Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 239 (1989); e Behr, Acc. Chem. Res., 26: 274 (1993). Ainda outros métodos de administra-ção de agentes terapêuticos à base lipídica são descritos, por exemplo, Patentes US. 3.993.754.; 4.145.410; 4.235.871; 4.224.179; 4.522.803; e 4.588.578. As partículas de lipídeo podem ser administradas por injeção direta no local da doença ou por injeção em um local distante do local da doença (ver, por exemplo, Culver, HUMAN GENE THERAPY, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71 (1994)). As revelações das referências acima descritas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000349] Em modalidades em que as partículas de lipídeo da presente invenção (por exemplo, LNP) são administradas por via intravenosa, pelo menos, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% da dose total inje-tada de partículas está presente no plasma a cerca de 8, 12, 24, 36, ou 48 horas após a injeção. Em outras modalidades, mais do que cerca de 20%, 30%, 40% e tanto quanto cerca de 60% 70% ou 80% da dose total injetada das partículas de lipídeo está presente no plasma a cerca de 8, 12, 24, 36, ou 48 horas após a injeção. Em certos casos, mais do que cerca de 10% de uma pluralidade de partículas está presente no plasma de um mamífero cerca de 1 hora após a administração. Em certos outros casos, a presença das partículas de lipídeo é detectável pelo menos cerca de 1 hora após a administração da partícula. Em certas modalidades, a presença de um agente terapêutico, tal como um ácido nucleico é detectável nas células do pulmão, do fígado, do tumor, ou a um local de inflamação cerca de 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 ou 96 horas após a administração. Em outras modalidades, a regulação negativa da expressão de uma sequência alvo através de um RNA interferente (por exemplo, siRNA) é detectável cerca de 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 ou 96 horas após a administração. Em ainda outras modalidades, a regulação negativa da expressão de uma sequência alvo através de um RNA interferente (por exemplo, siRNA) ocorre pre-ferencialmente em células do fígado (por exemplo, hepatócitos, células de tumor), ou nas células em um local de inflamação. Em outras mo-dalidades, a presença ou o efeito de uma RNA interferente (por exem-plo, siRNA) em células em um local proximal ou distal ao local de ad-ministração ou em células do pulmão, o fígado, ou o tumor é detectável cerca de 12, 24, 48, 72 ou 96 horas, ou em cerca de 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, ou 28 dias após a administração. Em modalidades adicionais, as partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) da invenção são administradas por via parenteral ou por via intraperitoneal.
[000350] As composições da presente invenção, isoladamente ou em combinação com outros componentes adequados, podem ser prepa-radas em formulações em aerossol (ou seja, podem ser "nebulizadas") a ser administradas por via de inalação (por exemplo, por via intranasal ou intratraquealmente) (ver Brigham et al, Am J. Sci, 298: 278 (1989)). As formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluormetano, propano, nitrogênio e semelhantes.
[000351] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas po-dem ser administradas por aerossóis intranasais, inalação, e/ou outros veículos de liberação de aerossol. Os métodos para a liberação de composições de ácido nucleico diretamente aos pulmões através de sprays nasais de aerossol foram descritos, por exemplo, nas Patentes US. 5.756.353 e 5.804.212. Do mesmo modo, a liberação de fármacos a partir de resinas de micropartículas intranasais e compostos lisofos- fatidil-glicerol (Patente US 5.725.871) é também bem conhecida nas técnicas farmacêuticas. Do mesmo modo, a liberação de fármacos por via transmucosa, na forma de uma matriz de suporte politetrafluoretile- no é descrita na Patente US 5.780.045. As descrições das patentes acima descritas são incorporadas aqui por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000352] As formulações adequadas para administração parenteral, tais como, por exemplo, por intra-articular (nas articulações), por via in-travenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, e subcutânea, incluem soluções injetáveis estéreis isotônicas aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. Na prática da presente invenção, as composições são preferencialmente administradas, por exemplo, por infusão intravenosa, por via oral, tópica, intraperitoneal, intravesical ou intratecal.
[000353] De um modo geral, quando administradas por via intravenosa, as formulações de partículas de lipídeo são formuladas com um veículo farmacêutico adequado. Muitos carreadores farmaceuticamen- te aceitáveis podem ser empregues nas composições e métodos da presente invenção. As formulações adequadas para utilização na pre-sente invenção encontram-se, por exemplo, em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Filadél-fia, PA, 17a ed. (1985). Pode ser usada uma variedade de carreadores aquosos, por exemplo, água, água tamponada, solução salina a 0,4%, 0,3% glicina, e semelhantes, e podem incluir glicoproteínas para uma estabilidade aumentada, tais como albumina, lipoproteína, globulina, etc. Geralmente, salina tamponada normal (NaCl 135-150 mM) será empregue como o carreador farmaceuticamente aceitável, mas outros suportes adequados serão suficientes. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais lipossomal, tais como filtração. As composições podem conter substâncias auxilia-res farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar às condições fisiológicas, tais como ajuste do pH e agentes tamponan- tes, agentes de ajustamento da tonicidade, agentes molhantes e se-melhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. Estas composições podem ser esteriliza-das com as técnicas acima referidas ou, em alternativa, eles podem ser produzidas em condições estéreis. As soluções aquosas resultantes podem ser empacotadas para utilização ou filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com uma solução aquosa estéril antes da administração.
[000354] Em certas aplicações, as partículas de lipídeo aqui descritas podem ser liberadas por meio de administração oral para o indivíduo. As partículas podem ser incorporadas com excipientes e utilizadas na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trocis- cos, cápsulas, pílulas, pastilhas, elixires, elixires, suspensões, sprays orais, xaropes, hóstias, e semelhantes {ver, por exemplo, Patentes US. 5.641.515, 5.580.579, e 5.792.451, as revelações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins). Estas formas de dosagem oral também podem conter o seguinte: ligan- tes, gelatina; agentes excipientes, lubrificantes, e/ou aromatizantes. Quando a forma de unidade de dosagem é uma cápsula, esta pode conter, além dos materiais acima descritos, um veículo líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para, de outra forma, modificar a forma física da unidade de dosagem. É cla-ro que, qualquer material utilizado na preparação de qualquer forma de unidade de dosagem deve ser farmaceuticamente pura e substancial-mente não tóxica nas quantidades empregues.
[000355] Tipicamente, estas formulações orais podem conter, pelo menos, cerca de 0,1% de partículas de lipídeo ou mais, embora o per-centual de partículas pode, é claro, ser variado e pode convenientemente situar-se entre cerca de 1% ou 2% e cerca de 60% ou 70% ou mais do peso ou volume total da formulação. Naturalmente, a quantidade de partículas em cada uma das composições terapeuticamente úteis podem ser preparada de uma tal maneira que uma dosagem adequada será obtida em qualquer unidade de dosagem determinada do composto. Fatores tais como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, vida de prateleira do produto, assim como outras considerações farmacológicas serão contempladas por um especialista na técnica de preparar tais formulações farmacêuticas, e como tal, uma variedade de dosagens e regimes de tratamento pode ser desejável.
[000356] As formulações adequadas para administração oral podem consistir em: (a) soluções líquidas, tais como uma quantidade eficaz de um agente terapêutico embalado tal como ácido nucleico (por exemplo, RNA interferente) suspenso em diluentes, tais como água, soro fisiológico, ou PEG 400; (B) cápsulas, sachês, ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada de um agente te-rapêutico, como o ácido nucleico (por exemplo, RNA interferente), na forma de líquidos, sólidos, granulados, ou gelatina; (c) suspensões em um líquido apropriado; e (d) emulsões adequadas. As formas em com-primidos podem incluir um ou mais de lactose, sacarose, manitol, sor-bitol, fosfato de cálcio, amido de milho, amido de batata, celulose mi- crocristalina, gelatina, dióxido de silício coloidal, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico, e outros excipientes, corantes, agentes de enchimento, ligantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes mo- lhantes, conservantes, agentes aromatizantes, corantes, agentes de desintegração, e carreadores farmaceuticamente compatíveis. Formas de pastilha podem compreender um agente terapêutico, tal como ácido nucleico (por exemplo, RNA interferente) em um sabor, por exemplo, a sacarose, bem como pastilhas que compreendem o agente terapêutico em uma base inerte, tal como gelatina e glicerina ou sacarose e goma arábica, emulsões géis, e outros semelhantes contendo, além do agente terapêutico, carreadores conhecidos na técnica.
[000357] Em outro exemplo da sua utilização, as partículas de lipídeo podem ser incorporadas em uma ampla faixa de formas de dosagem tópicas. Por exemplo, uma suspensão que contém partículas de ácido nucleico-lipídeo, tais como LNP pode ser formulada e administrada como géis, óleos, emulsões, cremes, pastas, unguentos, loções, es-pumas, mousses e semelhantes.
[000358] Quando a preparação de preparações farmacêuticas de partículas de lipídeo da presente invenção é preferencial usar quanti-dades de partículas que tenham sido purificadas para reduzir ou elimi-nar as partículas vazias ou com partículas de agentes terapêuticos, tais como o ácido nucleico associado com a superfície externa.
[000359] Os métodos da presente invenção podem ser praticados em uma variedade de hospedeiros. Os hospedeiros preferenciais incluem as espécies de mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos e chimpanzés, bem como outros primatas não ser humanos), caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, roedores (por exemplo, camundongos e ratos), lagomorfos, e porcos. A quantidade de partículas administrada dependerá da proporção entre o agente terapêutico (por exemplo, ácido nucleico) para o lipídeo, o agente terapêutico particular (por exemplo, ácido nucleico) utilizado, a doença ou distúrbio a ser tratado, a idade, peso, e condição do pacien-te, e do julgamento do médico, mas será geralmente entre cerca de 0,01 e cerca de 50 mg por kg de peso corporal, preferencialmente entre cerca de 0,1 e cerca de 5 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 1081010 partículas por administração (por exemplo, injeção). B. Administração In vitro
[000360] Para aplicações in vitro, a liberação de agentes terapêuticos, tais como os ácidos nucleicos (por exemplo, RNA interferente) pode ser de qualquer célula cultivada em cultura, de origem animal ou vegetal, animal vertebrado ou invertebrado, e de qualquer tecido ou tipo. Em modalidades preferenciais, as células são células de animais, mais preferencialmente células de mamíferos, e mais preferencialmen-te células humanas (por exemplo, células tumorais ou hepatócitos).
[000361] O contato entre as células e as partículas de lipídeo, quando realizado in vitro ocorre em um meio biologicamente compatível. A concentração de partículas varia amplamente, dependendo da aplica-ção em particular, mas é, geralmente, de cerca de 1 μmol e cerca de 10 μmol. O tratamento das células com as partículas de lipídeo é ge-ralmente realizada em temperaturas fisiológicas (cerca de 37°C) du-rante longos períodos de tempo de cerca de 1 a 48 horas, preferenci-almente de cerca de 2 a 4 horas.
[000362] Em um grupo de modalidades preferenciais, uma suspensão de partículas de lipídeo é adicionada a 60-80% de confluentes de células com uma densidade de células de cerca de 103 a cerca de 105 células/ml, mais preferencialmente cerca de 2 x 104 células/ml. A con-centração da suspensão adicionada às células é, preferencialmente de cerca de 0,01 a 0,2 μg/ml, mais preferencialmente cerca de 0,1 μg/ml.
[000363] Na medida em que a cultura de tecidos de células pode não ser necessária, isto é bem conhecido na técnica. Por exemplo, Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Techniques, 3 ed., Wiley-Liss, New York (1994), Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson e Ross, Inc. (1977), e as referências citadas nestes fornecem um guia geral para a cultura de células. Sistemas de células cultivadas serão muitas vezes na forma de monocamadas de células, embora também sejam utilizadas suspensões de células.
[000364] A utilização de um ensaio de Parâmetro de liberação endos- somal (ERP), a eficiência de liberação de LNP ou outra partícula de lipídeo da invenção pode ser otimizada. Um ensaio de ERP é descrito em detalhes na Publicação do Pedido de Patente US 2003/0077829, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins. Mais particularmente, o objetivo de um ensaio de ERP é distinguir os efeitos de diversos lipídeos catiônicos e os componentes lipídicos auxiliares de LNP ou outras partículas de lipídeo com base no seu efeito relativo na ligação/absorção ou fusão com/desestabilização da membrana endossomal. Este ensaio permite determinar quantitati-vamente quanto cada componente do LNP ou outra partícula de lipídeo afeta a eficiência de liberação, otimizando assim a LNP ou outra partícula de lipídeo. Geralmente, um ensaio de ERP mede a expressão de uma proteína repórter (por exemplo, luciferase, β-galactosidase, pro-teína fluorescente verde (GFP), etc.), e, em alguns casos, a uma formu-lação de LNP otimizada para um plasmídeo de expressão será também adequado para encapsular um RNA interferente. Em outros casos, um ensaio ERP pode ser adaptado para medir a regulação negativa da transcrição ou tradução de uma sequência alvo na presença ou ausência de um RNA interferente (por exemplo, siRNA). Ao comparar a ERPs para cada uma das várias partículas de lipídeo LNP ou outros, pode-se determinar facilmente o sistema otimizado, por exemplo, o LNP ou outras partículas de lipídeo que têm a maior absorção na célula. C. Células para liberação de partículas de lipídeo
[000365] As composições e métodos da presente invenção são utili-zadas para tratar uma ampla variedade de tipos de células, in vivo e in vitro. Células adequadas incluem, entre outras, hepatócitos, células reticuloendoteliais (por exemplo, monócitos, macrófagos, etc.), células de fibroblastos, células endoteliais, células de plaquetas, outros tipos de células infectadas e/ou suscetíveis de serem infectadas com o vírus, células precursoras hematopoiéticas (tronco), queratinócitos, células ósseas e do músculo liso, osteoblastos, neurônios, linfócitos quies- centes, células terminalmente diferenciadas, células primárias lentas ou acíclicas, células parenquimatosas, células linfóides, células epiteli- ais, células do osso, e outras semelhantes.
[000366] Em modalidades particulares, um agente ativo ou agente terapêutico, tal como um ácido nucleico (por exemplo, um RNA interfe-rente) é liberado às células de câncer (por exemplo, células de um tu-mor sólido), incluindo, entre outras, células de câncer do fígado, células de câncer de pulmão, células de câncer de cólon, células de câncer de reto, células de câncer anal, células de câncer do ducto biliar, células de câncer de intestino delgado, células de câncer de estômago (gástrico), células de câncer de esôfago, células de câncer de vesícula biliar, células de câncer de pâncreas, células de câncer de apêndice, células de câncer de mama, células de câncer de ovário, células de câncer do colo do útero, células de câncer de próstata, células de câncer renal, células de câncer do sistema nervoso central, as células tumorais glioblastoma, células de câncer de pele, células do linfoma, células tu- morais coriocarcinoma, células de câncer de cabeça e pescoço, células tumorais de sarcoma osteogênico, e células de câncer de sangue.
[000367] Liberação in vivo de partículas de lipídeo como LNP encapsu-lando um ácido nucleico (por exemplo, um RNA interferente) é apropriada para direcionamento de células de qualquer tipo celular. Os métodos e composições podem ser utilizados com as células de uma ampla variedade de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como, por exemplo, caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, roedores (por exemplo, camundongos, ratos e porquinhos da índia), lagomorfos, porcos, e primatas (por exemplo, macacos, chimpanzés e seres humanos). A. D. Detecção de Partículas de Lipídeo
[000368] Em algumas modalidades, as partículas de lipídeo da pre-sente invenção (por exemplo, LNP) são detectáveis no indivíduo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais horas. Em outras modalidades, as par-tículas de lipídeo da presente invenção (por exemplo, LNP) são detec- táveis no indivíduo cerca de 8, 12, 24, 48, 60, 72, ou 96 horas, ou cer- ca de 6, 8, 10, 12, 14 , 16, 18, 19, 22, 24, 25, ou 28 dias após a administração das partículas. A presença das partículas pode ser detectada nas células, tecidos ou outras amostras biológicas do indivíduo. As partículas podem ser detectadas, por exemplo, por detecção direta das partículas, detecção de um ácido nucleico terapêutico como uma sequência de RNA interferente (por exemplo, siRNA), detecção da sequência alvo de interesse (ou seja, através da detecção de expressão ou expressão reduzida da sequência de interesse), ou uma combinação dos mesmos. 1. Detecção de Partículas
[000369] Partículas de lipídeo da invenção, tais como LNP podem ser detectadas utilizando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, um marcador pode ser acoplado direta ou indiretamente a um componente da partícula de lipídeo utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Uma grande variedade de marcadores pode ser utilizada, com a escolha do marcador dependendo da sensibilidade necessária, facilidade de conjugação com o componente de partículas de lipídeos, requisitos de estabilidade e instrumentação disponível e provisões de descarte. Os marcadores adequados incluem, entre outros, marcadores espectrais, tais como corantes fluorescentes (por exemplo, fluoresceína e os derivados da mesma, tais como o isotioci- anato de fluoresceína (FITC) e Oregon Green™; rodamina e derivados como vermelho Texas, tetrarodimina isotiocianato (TRITC), etc., digo- xigenina, biotina, ficoeritrina, AMCA, CyDyes™, e semelhantes; radio- marcadores como 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 33P, etc.; enzimas como peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, etc.; marcadores colori- métricos espectrais como ouro coloidal ou esferas de vidro coloridas ou de plástico como poliestireno, polipropileno, látex, etc. O marcador pode ser detectado usando qualquer meio conhecido na técnica. 2. Detecção de Ácidos Nucleicos
[000370] Os ácidos nucleicos (por exemplo, RNA interferente) são detectados e quantificados aqui por qualquer um de uma série de mei-os bem conhecidos dos especialistas na técnica. A detecção de ácidos nucleicos pode prosseguir através de métodos bem conhecidos, tais como a análise de Southern, a análise de Northern, eletroforese em gel, PCR, radiomarcação, contagem de cintilação, e cromatografia de afinidade. Podem também ser utilizados métodos bioquímicos analíti-cos adicionais, tais como espectrofotometria, radiografia, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia em camada fina (TLC), e cromatografia por hiperdifusão.
[000371] A seleção de um formato de hibridização de ácido nucleico não é crítica. Uma variedade de formatos de hibridização de ácidos nucleicos é conhecida dos especialistas na técnica. Por exemplo, os formatos comuns incluem ensaios sanduíche e ensaios de competição ou de deslocamento. As técnicas de hibridização são geralmente des-critas em, por exemplo, "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Appro-ach", Eds. Hames e Higgins, IRL Press (1985).
[000372] A sensibilidade dos ensaios de hibridização pode ser au-mentada através da utilização de um sistema de amplificação de áci-dos nucleicos que multiplica o ácido nucleico alvo a ser detectado. Em técnicas de amplificação in vitro adequadas para a amplificação de se-quências para a utilização como sondas moleculares ou para a geração de fragmentos de ácido nucleico para subclonagem subsequente são conhecidos. Exemplos de técnicas suficientes para direcionar es-pecialistas através de métodos de amplificação in vitro, incluindo a re-ação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação por replicase Qβ, e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA™) encontram-se em Sambrook et al., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000); e Ausubel et al, SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc. (2002); bem como a Patente US 4.683.202; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis et al eds.); Arnheim & Levinson (01 de outubro de 1990), C&EN 36; The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991); Kwoh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989); Guatelli et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990); Lomell et al., J. Clin. Chem., 35: 1826 (1989); Landegren et al., Science, 241: 1077 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990); Wu e Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringer et al, Gene, 89: 117 (1990); e Sooknanan e Malek, Biotechnology, 13: 563 (1995). Métodos melhorados de clonagem in vitro de ácidos nucleicos amplificados são descritos na Patente US 5.426.039. Outros métodos descritos na téc-nica são a amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (NASBA™, Cangene, Mississauga, Ontario) e sistemas de Qβ- replicase. Estes sistemas podem ser utilizados para identificar direta-mente mutantes onde os iniciadores de PCR ou LCR são concebidos para serem alongados ou ligados apenas quando a sequência selecio-nada está presente. Alternativamente, as sequências de escolha po-dem ser geralmente amplificadas utilizando, por exemplo, os iniciado-res de PCR não específicos e a região alvo amplificada depois sonda-da para uma sequência específica indicativa de uma mutação. As re-velações das referências acima descritas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
[000373] Os ácidos nucleicos para uso como sondas, por exemplo, em métodos de amplificação in vitro, para uso como sondas de genes, ou como inibidor de componentes são tipicamente sintetizados quimi-camente de acordo com o método de fosforamidita triéster em fase sólida descrito por Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22: 1859 1862 (1981), por exemplo, utilizando um sintetizador automático, como des-crito em Needham VanDevanter et al, Nucleic Acids Res, 12: 6159 (1984). A purificação de polinucleotídeos, se necessária, é tipicamente realizada por eletroforese em gel de acrilamida nativo ou por HPLC de troca aniônica como descrito em Pearson et al., J. Chrom, 255: 137 149 (1983). A sequência dos polinucleotídeos sintéticos podem ser verificada utilizando o método da degradação química de Maxam e Gilbert (1980) em Grossman e Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65: 499.
[000374] Um meio alternativo para determinar o nível de transcrição é a hibridização in situ. Em testes de hibridização in situ são bem co-nhecidos e são geralmente descritos em Angerer et al., Methods Enzymol, 152: 649 (1987). Em um teste de hibridização in situ, as célu-las são fixadas a um suporte sólido, tipicamente uma lâmina de vidro. Se o DNA deve ser sondado, as células são desnaturadas pelo calor ou alcalino. As células são, então, postas em contato com uma solução de hibridização a uma temperatura moderada para permitir a hibridização de sondas específicas que são marcadas. As sondas são preferencialmente marcadas com radioisótopos ou repórteres fluorescentes. IX. Exemplos
[000375] A presente invenção será descrita em mais detalhes por meio de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para finalidades ilustrativas, e não pretendem limitar a invenção em qualquer modo. Os especialistas na técnica reconhecerão uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para gerar essencialmente os mesmos resultados.
[000376] Métodos gerais: Todas as reações foram realizadas em temperatura ambiente em uma pressão positiva de nitrogênio de outra forma declarada. Todos os reagentes foram adquiridos de fontes co-merciais e usados sem outra purificação. O progresso da reação foi monitorado por TLC em sílica gel 60 F254 (0,25 mm, E. Merck). Pontos foram detectados em luz UV ou por carbonização com anisaldeído ou manchas de sulfato de cobre. Toda a cromatografia de coluna foi realizada em sílica gel 60 (40-60μM). A razão entre sílica gel e o pro-duto bruto variou de 100 a 50:1. Os espectros de 1H RMN foram regis-trados a 300MHz ou 400MHz e deslocamentos químicos foram inter-namente referenciados ao solvente protonado residual (7,27 ppm CHCl3). As soluções orgânicas foram concentradas sob vácuo a < 40°C.
Exemplo 1
[000377] Este exemplo descreve a síntese de lipídeos catiônicos tri- alquila exemplares da presente invenção. Esquema Sintético para o Composto 9
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Síntese do Composto 2
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[000378] A uma solução resfriada (0oC) de (Z)-dec-4-en-1-ol 9 (20 g, 128,0 mmol) e trietilamina (26,7 mL, 191,9 mmol) em diclorometano anidro (200 mL) foi lentamente adicionado metano sulfonil cloreto (14,9 mL, 191,9 mmol). A solução foi agitada por 30 min em temperatura ambiente então diluída com diclorometano (100 mL). A solução foi la-vada com bicarbonato de sódio saturado (3 x 150 mL) e então as lava-gens aquosas combinadas foram extraídas com diclorometano (150 mL). Os extratos de diclorometano combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados em vácuo até secagem. O resíduo foi filtrado por um pad de sílica (100% diclorometano) para ge- rar (Z)-dec-4-enil metanossulfonato 2 como um óleo amarelo (28,5 g, 95%). Rf 0,5 (100% CH2Cl2). Síntese do Composto 3
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[000379] A uma solução de (Z)-dec-4-enil metanossulfonato 2 (28,5 g, 121,1 mmol) em 2-metiltetrahidrofurano (280 mL) foi adicionado te- trabutilamônio brometo (48,8 g, 151,4 mmol). A solução foi agitada a 80oC por 30 minutos sob nitrogênio, então diluída com éter (150 mL) e lavada com água (75 mL) e salmoura (75 mL). A solução de éter foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada em vácuo até se-cagem. O óleo amarelo pálido foi filtrado por um pad de sílica (100% hexanos) para gerar (Z)-1-bromodec-4-eno 3 como um óleo incolor (23,0 g, 87%). Rf 0,9 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 4
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[000380] A uma suspensão de voltas de magnésio (1,4 g, 55,1 mmol) em THF anidro (6 mL) sob nitrogênio foi lentamente adicionada uma solução de (Z)-1-bromodec-4-eno 3 (11,5 g, 52,5 mmol) em THF (12 mL). A mistura de reação foi agitada a 45oC por 30 minutos sob nitro-gênio. A solução foi resfriada até 0oC e uma solução de formato de etila (4,1 g, 55,1 mmol) em THF (12 mL) foi adicionada sob gotejamen- to por mais de 5 minutos. A solução foi extinta em temperatura ambiente por 2 horas então resfriada até -15oC e extinta lentamente com água (10 mL) seguido por 5M ácido clorídrico (15 mL). Uma vez o magnésio foi totalmente dissolvido, a solução foi diluída com água (50 mL) e extraída com hexanos (3 x 75 mL). Os extratos combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados em vácuo até secagem. O resíduo obtido foi dissolvido em etanol (40 mL) e uma solução de hidróxido de potássio (4,4 g, 78,7 mmol)) em água (10 mL) foi adicionada. A mistura de reação foi extinta vigorosamente por 30 minutos então concentrada em vácuo para remover etanol. A solução foi então preparada ácida com 5M ácido clorídrico (15 mL) e extraída com hexanos (3 x 75 mL). Os extratos de hexanos combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados em vácuo até secagem. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100% hexanos a 2,5% acetato de etila em hexanos) para gerar (6Z,15Z)-henicosa-6,15-dien-11-ol 4 como um óleo amarelo pálido (5,6 g, 35%). Rf 0,4 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 5
Figure img0017
[000381] A uma solução resfriada (0oC) de 6Z,15Z)-henicosa-6,15- dien-11-ol 4 (5,6 g, 18,2 mmol) e trietilamina (3,8 mL, 27,2 mmol) em diclorometano anidro (50 mL) foi lentamente adicionado metanosulfonil cloreto (2,1 mL, 27,2 mmol). A mistura de reação foi extinta por 2 horas em temperatura ambiente então diluída com diclorometano (50mL). A solução foi lavada com bicarbonato de sódio saturado (3 x 25 mL) então as lavagens aquosas combinadas foram extraídas com dicloro- metano (50 mL). Os extratos de diclorometano combinados foram se-cos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados em vácuo até secagem. O óleo amarelo pálido foi filtrado por um pad de sílica (100% DCM) para gerar (6Z,15Z)-henicosa-6,15-dien-11-il metanossulfonato 5 como um óleo incolor bruto (7,6 g). Rf 0,8 (100% CH2Cl2). Síntese do Composto 6
Figure img0018
[000382] Uma solução de (6Z,15Z)-henicosa-6,15-dien-11-il meta- nossulfonato 5 (7,6 g, 19,6 mmol) e cianeto de sódio (4,8 g, 98,1 mmol) em DMF anidro (60 mL) foi aquecida a 60oC durante a noite. Na conclusão, a mistura de reação foi vertida em água (200 mL) e extraída com acetato de etila (3 x 100 mL). Os extratos de acetato de eti- la combinados foram lavados com salmoura (3 x 100 mL), secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados em vácuo até secagem. O produto foi purificado por cromatografia em coluna (100% Hexanos para 1% acetato de etila em hexanos) para gerar (Z)-2-((Z)-dec-4- enil)dodec-6-enonitrila 6 como um óleo incolor (6,6 g, 97%). Rf 0,75 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 7
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[000383] A uma solução resfriada (-78oC) de (Z)-2-((Z)-dec-4- enil)dodec-6-enonitrila 6 (4,0 g, 12,6 mmol) em diclorometano anidro (125 mL) foi adicionada lentamente uma solução 1M de diisobutilalu- mínio hidreto em hexanos (5,6 m1,31,5 mmol). A solução foi aquecida até -15oC e extinta por 1 hora. Na conclusão, a reação foi extinta com 5% ácido clorídrico (30 mL) e agitada a -15oC até a evolução de gás hidrogênio cessar. A solução foi então diluída com diclorometano (75 mL) e a camada orgânica foi lavada com 5M ácido clorídrico (100 mL). Os extratos de diclorometano foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados em vácuo até secagem. O resíduo foi purifica-do por cromatografia em coluna (100% Hexanos para 2% acetato de etila em hexanos) para gerar (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 como um óleo incolor (3,9 g, 97%). Rf 0,65 (5% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 8
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[000384] A uma suspensão de aparas de magnésio (0,6 g, 23,9 mmol) em tetrahidrofurano (5 mL) foi lentamente adicionada uma solução de (Z)-1-bromodec-4-eno 3 (4,5 g, 20,5 mmol) em tetrahidrofurano (5 mL). A mistura de reação foi extinta por 30 minutos em temperatura ambiente então uma solução de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 em tetrahidrofurano (5 mL) foi adicionado. A solução foi agitada por 15 minutos em temperatura ambiente então vertida em 5% ácido clorídrico (50 mL) e gelo (100 mL). A solução foi extraída com éter (2 x 150 mL). Os extratos combinados de éter foram secos em sulfato de magnésio, filtrados, e concentrados em vácuo até secagem. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (1% acetato de etila em hexa- nos) para gerar (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ol 8 como um óleo incolor (4,8 g, 76%). Rf 0,45 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 9
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[000385] A uma solução de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16- dien-11-ol 8 (0,4 g, 0,9 mmol), ácido 4-(dimetilamino)butanoico clori- drato (0,2 g, 1.3 mmol), EDCI cloridrato (0,25 g, 1,3 mmol), diisopropi- letilamina (0,4 mL, 2,6 mmol) em diclorometano anidro (10 mL) foi adi-cionado dimetilaminopiridina (5 mg). A solução foi refluxada por 2 horas então extinta em temperatura ambiente por 2 horas. A mistura é concentrada em vácuo até secagem e purificada por cromatografia em coluna (100% acetato de etila) para gerar 6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4- enil)docosa-6,16-dien-11-il 4-(dimetilamino)butanoato 9 como um óleo amarelo pálido. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,36 (m, 6H), 4,93 (m, 1H), 2,30 (m, 4H), 2,22 (s, 6H), 2,03 (m, 12H), 1,88 (m, 2H), 1,66-1,18 (m, 31H), 0,90 (m, 9H). Rf 0,3 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para Compostos 11 e 13
Figure img0022
Síntese do Composto 10
Figure img0023
[000386] A uma solução de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16- dien-11-ol 8 (2,4 g, 5,2 mmol), ácido 6-bromohexanoico (1,5 g, 7,8 mmol), EDCI cloridrato (1,5 g, 7,8 mmol), diisopropiletilamina (2,0 g, 15,6 mmol) em diclorometano anidro (25 mL) foi adicionado dimetila- minopiridina (15 mg). A solução foi refluxada por 2 horas, resfriada até temperatura ambiente e concentrada em vácuo até secagem. A mistura de reação foi purificada por cromatografia em coluna em sílica gel 60 (2" W x 10" L; eluída com 5% EtOAc/Hex) para gerar (6Z,16Z)-12- ((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-bromohexanoato 10 como um óleo incolor (3,1 g, 94%). Rf 0,5 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 11
Figure img0024
[000387] À (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6- bromohexanoato 10 (3,1 g, 4,9 mmol) em um frasco de pressão vedado com teflon foi adicionado 5,6 M dimetilamina em etanol (20 mL) e a reação foi aquecida a 70°C e extinta durante a noite. Uma vez comple-ta, a reação foi concentrada em vácuo até secagem. O resíduo foi dis-solvido em acetato de etila (100 mL) e lavado com solução de bicarbo-nato de sódio (2 x 50 mL). A camada de acetato de etila foi seca em sulfato de magnésio, filtrada, e concentrada em vácuo até secagem. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (100% EtOAc) para gerar (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-(dimetila- mino)hexanoato 11 como um óleo amarelo pálido (2,0 g, 69%, 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,36 (m, 6H), 4,93 (m, 1H), 2,27 (m, 10H), 2,00 (m, 12H), 1,63 (m, 6H), 1,51 (m, 6H), 1,28 (m, 25H), 0,90 (m, 9H). Rf 0,3 (10% MeOH-CH2Cl2). Síntese do Composto 12
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[000388] Usando um procedimento análogo ao descrito pela síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-bromohexa- noato 10, (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 5-bromo- pentanoato 12 foi obtido como um óleo incolor (3,3 g, 61%) de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ol 8 (4,0 g, 8,7 mmol), ácido 6-bromo-n-valérico (2,4 g, 13,0 mmol), EDCI cloridrato (2,5 g, 13,0 mmol), diisopropiletilamina (3,4 g, 26,0 mmol) e dimetilaminopiri- dina (10 mg). Rf 0,5 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 13
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[000389] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-(dimetila- mino)hexanoato 11, (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 5-(dimetilamino)pentanoato 13 foi obtido como um óleo amarelo pálido (1,9 g, 62%) de 5,6 M dimetilamina em etanol (20 mL). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,45-5,28 (m, 6H), 4,95-4,90 (m, 1H), 2,34-2,23 (m, 4H), 2,23-2,20 (s, 6H), 2,06-1,92 (m, 12H), 1,70-1,58 (m, 5H), 1,581,44 (m, 5H), 1,44-1,15 (m, 25H), 0,92-0,87 (m, 9H). Rf 0,4 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 14
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Síntese do Composto 14
Figure img0028
[000390] Um frasco contendo (6Z,16Z)-12-((Z)-non-4-en-1-il)tricosa- 6,16-dien-11-il 5-(dimetilamino)pentanoato 13 (200mg, 0,34mmol) foi evacuado e preenchido de volta com nitrogênio (duas vezes) então tratado com Pd/C (150mg, 10% p/p) e subsequentemente suspenso em EtOAc (10mL). Um frasco de reação foi então evacuado e preenchido de volta com H2 (3x) e a mistura vigorosamente extinta (18h). O H2 foi então evacuado e o frasco preenchido de volta com N2. A mistura de reação foi filtrada por Celite, enxaguando a torta do filtro com EtOAc, e o filtrado foi concentrado. O material bruto foi submetido à cromatografia (EtOAc) para gerar 12-noniltricosan-11-il 5-(dimetila- mino)pentanoato 14 (100mg, 50%) como um óleo incolor. Rf 0,35 (10% CH3OH-CH2Cl2); 1H RMN (400MHz, CDCl3, δH) 4,95-4,90 (m, 1H), 2,31 (t, 2H), 2,27 (t, 2H), 2,21 (s, 6H), 1,68-1,60 (m, 3H), 1,581,42 (m, 5H), 1,38-1,16 (m, 54H), 0,88 (t, 6H). Esquema sintético para Compostos 19 e 21
Figure img0029
Síntese do Composto 15
Figure img0030
[000391] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (Z)-dec-4-enil metanossulfonato 2, (Z)-non-3-enil metanossulfo- nato 15 foi obtido como um óleo amarelo (28,5 g, 92%) de (Z)-non-3- en-1-ol (20,0 g, 128,0 mmol), trietilamina (26,7 mL, 191,9 mmol) e metano sulfonil cloreto (14,9 mL, 191,9 mmol). Rf 0,15 (30% acetato de etila-hexanos). Síntese do Composto 16
Figure img0031
[000392] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (Z)-1-bromodec-4-eno 3, (Z)-1-bromonon-3-eno 16 foi obtido como um óleo incolor (27,0 g, quantitativo) de (Z)-dec-4-enil metanos- sulfonato 15 (28,5 g, 129 mmol) e tetrabutilamônio brometo (52,0 g, 161,4 mmol). Rf 0,6 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 17
Figure img0032
[000393] Um frasco de fundo redondo de 100 mL foi carregado com arestas de magnésio (0,6 g, 25,7 mmol) e uma barra de agitação. O frasco foi seco com uma pistola de calor por 5 minutos. O frasco foi carregado com THF (5 mL) e um grão único em iodo. Uma solução de (Z)-1-bromonon-3-eno (4,5 g, 22,0 mmol) em THF (5 mL) foi adicionada lentamente à mistura e reação foi refluxada por 30 minutos sob ni-trogênio. A solução foi resfriada até temperatura ambiente e uma solu-ção de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 (4,7 g, 14,7 mmol) em THF (5 mL) foi adicionada. A solução foi extinta durante a noite em tempe-ratura ambiente e na conclusão a mistura foi vertida em 5% HCl (50 mL) e gelo (100 mL). A solução foi extraída com éter (2 x 150 mL) e os extratos de éter combinados foram secos em sulfato de magnésio, fil-trados e concentrados em vácuo até secagem. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (coluna: 2" W x 8" L; eluída com 100% Hexanos para 5% acetato de etila em hexanos) para gerar (6Z,15Z)- 11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien-10-ol 17 como um óleo incolor (5,4 g, 82%). Rf 0,5 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 18
Figure img0033
[000394] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-bromohe- xanoato 10, (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien-10-il 5-bro- mopentanoato 18 foi obtido como um óleo incolor (0,9 g, 66%) de (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien-10-ol 17 (0,35 g, 0,7 mmol), ácido 5-bromo-n-valérico (0,60 g, 3,4 mmol), EDCI (0,60 g, 3,4 mmol), diisopropiletilamina (0,90 g, 6,7 mmol) e DMAP (5 mg, catalisa-dor). Rf 0,5 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 19
Figure img0034
[000395] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-(dimetila- mino)hexanoato 11, (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien- 10-il 5-(dimetilamino)pentanoato 19 foi obtido como um óleo incolor (0,2 g, 24%) de 5,6 M dimetilamina em etanol (10 mL) e (6Z,15Z)-11- ((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien-10-ol 17 (0,35 g, 0,7 mmol). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,40-5,28 (m, 6H), 4,97-4,88 (m, 1H), 2,35-2,24 (m, 4H), 2,24-2,19 (m, 6H), 2,08-1,93 (m, 12H), 1,70-1,55 (m, 3H), 1,55-1,45 (m, 5H), 1,45-1,13 (m, 25H), 0,93-0,82 (m, 9H). Rf 0,4 (10% MeOH-CH2Cl2). Síntese do Composto 20
Figure img0035
[000396] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-bromohexa- noato 10, (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien-10-il 6- bromohexanoato 20 foi obtido como um óleo incolor (1,4 g, 99%) de (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien-10-ol 17 (0,35 g, 0,7 mmol), ácido 6-Bromo-n-caproico (0,70 g, 3,4 mmol), EDCI (0,60 g, 3,4 mmol), diisopropiletilamina (0,90 g, 6,7 mmol) e DMAP (5 mg, catalisa-dor). Rf 0,6 (10% EtOAc-Hexanos). Síntese do Composto 21
Figure img0036
[000397] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-(dimetila- mino)hexanoato 11, (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien- 10-il 6-(dimetilamino)hexanoato 21 foi obtido como um óleo incolor (1,2 g, 92%) de 5,6 M dimetilamina em etanol (15 mL). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,44-5,28 (m, 6H), 4,95-4,88 (m, 1H), 2,33-2,19 (m, 10H), 2,08-1,90 (m, 12H), 1,70-1,23 (m, 9H), 1,23-1,14 (m, 26H), 0,93-0,85 (m, 9H). Rf 0,15 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 22
Figure img0037
Síntese do Composto 22
Figure img0038
[000398] A uma solução de (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa- 6,15-dien-10-ol 17 (0,5 g, 1,1 mmol), ácido 4-(dimetilamino)butanoico cloridrato (0,3 g, 1,7 mmol), EDCI cloridrato (0,3 g, 1,7 mmol), DIPEA (0,4 g, 3,4 mmol) em diclorometano anidro (10 mL) foi adicionado DMAP (5 mg). A solução foi extinta em temperatura ambiente durante a noite em uma atmosfera de nitrogênio. A mistura é concentrada em vácuo até secagem então tomada em DCM (150 mL) e extraída com bicarbonato de sódio saturado. A mistura de reação foi purificada por cromatografia em coluna em sílica gel 60 (1:1 acetato de eti- la/hexanos) para gerar (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien- 10-il 4-(dimetilamino)butanoato 22 como um óleo incolor (0,4 g, 67%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,40-5,28 (m, 6H), 4,97-4,90 (m, 1H), 2,36-2,25 (m, 4H), 2,25-2,19 (m, 6H), 2,07-1,95 (m, 12H), 1,85-1,73 (m, 2H), 1,58-1,45 (m, 3H), 1,45-1,10 (m, 24H), 0,93-0,85 (m, 9H). Rf 0,4 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para Compostos 23, 24 e 14
Figure img0039
Síntese do Composto 23
Figure img0040
[000399] Uma solução de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16- dien-11-ol 8 (0,5 g, 1,1 mmol) em éter dietil anidro (10 mL) foi adicio-nada lentamente uma solução de difosgeno (0,2 mL, 1,8 mmol) em éter dietil anidro resfriado até aproximadamente -15 oC. A solução foi extinta por 1 hora então N,N,N’-trimetil-1,3-propanodiamina (1,3 mL, 8,7 mmol) foi adicionado a -15oC. A solução foi aquecida até temperatura ambiente, extinta por 1 hora, e então filtrada para remover os sais de amônio e ureia. O filtrado de dietil éter foi concentrado em vácuo até secagem. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (100% acetato de etila) para gerar (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa- 6,16-dien-11-il 3-(dimetilamino)propil(metil)carbamato 23 como um óleo incolor (0,15 g, 23%, 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,41-5,29 (m, 6H), 4,85-4,77 (m, 1H), 3,35-3,21 (m, 2H), 2,93-2,81 (m, 3H), 2,31-2,17 (m, 8H), 2,08-1,92 (m, 12H), 1,75-1,64 (m, 2H), 1,64-1,15 (m, 31H), 0,92-0,85 (m, 9H). Rf 0,45 (10% MeOH-CH2Cl2). Síntese do Composto 24
Figure img0041
[000400] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 3- (dimetilamino)propil(metil)carbamato 23, (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4- enil)docosa-6,16-dien-11-il 3-(dimetilamino)propilcarbamato 24 como obtido como um óleo incolor (0,1 g, 17%) de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4- enil)docosa-6,16-dien-11-ol 8 (0,5 g, 1,1 mmol), difosgeno (0,2 mL, 1,8 mmol), piridina, e 3-(Dimetilamino)-1-propilamina (0,9 g, 8,7 mmol). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,44-5,28 (m, 6H), 4,81-4,72 (bs, 1H), 4,55-4,45 (bs, 1H), 3,34-3,15 (m, 3H), 2,45-2,13 (m, 7H), 2,10-1,86 (m, 12H), 1,75-1,57 (m, 3H), 1,57-1,03 (m, 30H), 0,93-0,85 (m, 9H). Rf 0,2 (10% MeOH-CH2Cl2). Síntese do Composto 25
Figure img0042
[000401] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 3- (dimetilamino)propil(metil)carbamato 23, (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4- enil)docosa-6,16-dien-11-il 2-(dimetilamino)etilcarbamato 25 foi obtido como um óleo incolor (0,20 g, 33%) de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4- enil)docosa-6,16-dien-11-ol 8 (0,5 g, 1,1 mmol), difosgeno (0,2 mL, 1,8 mmol) e N,N-dimetiletilenediamina (0,8 g, 8,7 mmol). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,40-5,28 (m, 6H), 5,08-5,01 (bs, 1H), 4,82-4,73 (bs, 1H), 3,30-3,18 (m, 2H), 2,44-2,35 (m, 2H), 2,30-2,20 (m, 6H), 2,07-1,91 (m, 12H), 1,65-1,11 (m, 31H), 0,93-0,85 (m, 9H). Rf 0,4 (10% MeOH- DCM). Esquema sintético para Compostos 26, 27 e 28
Figure img0043
Síntese do Composto 26
Figure img0044
[000402] Uma solução de (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-en-1-il)docosa- 6,15-dien-10-ol 17 (2,25g, 5,036mmol) e piridina (611 μL, 7,6 mmol) em anidro Et2O (15mL) foi adicionada à uma solução resfriada (0°C) de difosgeno (910 μL, 7,6 mmol) em Et2O (15mL). Após agitação (10min) a mistura de reação foi filtrada e concentrada para remover o solvente e restante gás fosgeno. Um terço deste cloroformato (0,879g, 1,679mmol) foi tomado em Et2O (5mL) e adicionado à uma solução resfriada (0°C) de N,N dimetiletilenodiamina (367 μ1,3,4 mmol) em Et2O anidro (5mL). Após agitação (20min), a mistura foi filtrada, con-centrada e submetida à cromatografia (100% EtOAc) para gerar (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-en-1-il)docosa-6,15-dien-10-il (2-(dimetilamino) etil)carbamato 26 (603 mg, 64%) como um óleo incolor claro. Rf 0,28 (10% MeOH/CH2Cl2); 1H RMN (400MHz, CDCl3, δH) 5,45-5,36 (m, 6H), 5,30 (br s, 1H), 4,89-4,78 (m, 1H), 3,32-3,21 (m, 2H), 2,42 (t, 2H), 2,25 (s, 6H), 2,16-1,94 (m, 12H), 1,63-1,19 (m, 29H), 0,92 (t, 9H). Síntese do Composto 27
Figure img0045
[000403] Uma solução resfriada (0oC) de cloroformato (0,88 g, 1,7 mmol) (como preparado na síntese de (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-en-1- il)docosa-6,15-dien-10-il (2-(dimetilamino)etil)carbamato 26) foi dissolvido em Et2O anidro (5mL) e adicionado à uma solução de N,N dimetilpropildi- amina (422 μ1,3,4 mmol) em Et2O anidro (5mL). Na conclusão (20 min), a solução foi filtrada, concentrada e então o material bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100% EtOAc) para gerar (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4- en-1-il)docosa-6,15-dien-10-il (3-(dimetilamino)propil)carbamato 27 (675 mg, 70%) como um óleo incolor claro. Rf 0,32 (10% MeOH/CH2Cl2); 1H RMN (400MHz, CDCl3, δH) 5,44-5,33 (m, 6H), 4,86-4,78 (m, 1H), 3,32-3,21 (m, 2H), 2,36 (t, 2H), 2,24 (s, 6H), 2,14-1,97 (m, 12H), 1,69 (app. p, 2H), 1,61-1,50 (m, 3H), 1,50-1,20 (m, 27H), 0,91 (t, 9H). Síntese do Composto 28
Figure img0046
[000404] Uma solução resfriada (0oC) do cloroformato (0,88 g, 1,7 mmol) (como preparado na síntese de (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-en-1- il)docosa-6,15-dien-10-il (2-(dimetilamino)etil)carbamato 26) foi dissol-vida em Et2O anidro (5mL) e adicionada à uma solução de N,N,N’ tri- metilpropildiamina (492 μ1,3,4 mmol) em Et2O anidro (5mL). Na con-clusão (20 min), a solução foi filtrada, concentrada e então o material bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100% EtOAc) para gerar (6Z,15Z)-11-((Z)-dec-4-en-1-il)henicosa-6,15-dien-10-il (3- (dimetilamino)propil)(metil) carbamato 28 (672 mg, 68%) como um óleo incolor claro. Rf 0,44 (10% MeOH/CH2Cl2); 1H RMN (400MHz, CDCl3, δH) 5,43-5,32 (m, 6H), 4,85 (br. s, 1H), 3,38-3,27 (m, 2H), 2,952,87 (m, 3H), 2,28 (t, 2H), 2,24 (s, 6H), 2,14-1,96 (m, 12H), 1,72 (app. p, 2H), 1,67-1,49 (m, 3H), 1,49-1,20 (m, 26H), 0,91 (t, 9H). Esquema sintético para Compostos 30 e 31
Figure img0047
Síntese do Composto 29
Figure img0048
[000405] Um frasco de fundo redondo de 100 mL foi carregado com arestas de magnésio (263 mg, 10,9 mmol) e uma barra de agitação. O frasco foi seco com uma pistola de calor por 5 minutos, resfriado sob ni-trogênio antes de THF (5 mL) e um pequeno grão de iodo foi adicionado. Uma solução de (Z)-1-bromodec-4-eno 3 (2 g, 9,1 mmol) em THF (5 mL) foi adicionada lentamente. A solução foi extinta em temperatura ambiente por 2 horas então etil glioxalato (0,375 mL, 1,82 mmol, solução 50% em tolueno) foi adicionada. Na conclusão, a solução foi extinta com solução saturada de cloreto de amônio (5 mL) e extinta até o excesso de magnésio ser dissolvido. A solução foi diluída com água e extraída com acetato de etila (3 x 50 mL). Os extratos combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados em vácuo até secagem. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (100% Hexanos to 20% EtOAc em hexanos) para gerar (6Z,16Z)-11-((Z)-dec-4-enil) do- cosa-6,16-diene-11,12-diol 29 como um óleo incolor (700 mg, 48%). Síntese do Composto 30
Figure img0049
[000406] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 4-(dimetila- mino)butanoato 9, (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)-12-hidroxidocosa-6,16- dien-11-il 4-(dimetilamino)butanoato 30 foi obtido como um óleo incolor (0,10 g, 25%) de (6Z,16Z)-11-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dieno-11,12- diol (0,35 g, 0,7 mmol), ácido 4-(dimetilamino)butanoico cloridrato (0,20 g, 1,1 mmol), EDCI (0,20 g, 1,1 mmol), diisopropiletilamina (0,3 g, 2,2 mmol) e DMAP (5 mg, catalisador). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,44-5,28 (m, 6H), 5,03-4,95 (m, 1H), 2,25-2,17 (m, 6H), 2,14-1,65 (m, 14H), 1,65-1,10 (m, 33H), 0,93-0,82 (m, 9H). Rf 0,2 (10% MeOH-CH2Cl2). Síntese do Composto 31
Figure img0050
[000407] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 4-(dimetila- mino)butanoato 9, (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)-12-hidroxidocosa-6,16- dien-11-il 3-(dimetilamino)propanoato 31 foi obtido como um óleo inco-lor (0,4 g, 33%) de (6Z,16Z)-11-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dieno- 11,12-diol (1,0 g, 2,1 mmol), ácido 4-(dimetilamino)butanoico cloridrato (0,50 g, 3,1 mmol), EDCI (0,60 g, 3,1 mmol), diisopropiletilamina (0,80 g, 6,3 mmol) e DMAP (5 mg, catalisador). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,40-5,28 (m, 6H), 5,12-5,07 (m, 1H), 4,75-4,55 (bs, 1H), 2,77-2,65 (m, 1H), 2,65-2,41 (m, 3H), 2,28-2,15 (m, 6H), 2,15-1,92 (m, 12H), 1,671,10 (m, 30H), 0,93-0,82 (m, 9H). Rf 0,5 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 40
Figure img0051
Síntese do Composto 33
Figure img0052
[000408] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 2, (Z)-non-3-enil metanossulfonato 33 foi obtido como um óleo amarelo (33 g, 85%) de (Z)-non-3-en-1-ol 32 (25,0 g, 176 mmol), trieti- lamina (25,0 mL) e metano sulfonil cloreto (27,2 m1,352 mmol). Rf 0,68 (CH2Cl2). Síntese do Composto 34
Figure img0053
[000409] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 3, (Z)-non-3-enil brometo 34 foi obtido como um óleo amarelo (20,2 g, 85%) de (Z)-non-3-enil metanossulfonato (25,7 g, 117 mmol) e tetrabutilamônio brometo (52,6 g, 163mmol). Rf 0,73 (hexanos). Síntese do Composto 35
Figure img0054
[000410] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 4, (6Z,13Z)-nonadeca-6,13-dien-10-ol 35 (9,11 g, 85%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-non-3-enil brometo (15,8 g, 76,8 mmol), arestas de magnésio (2,0 g, 82 mmol), formato de etila (6,36 mL, 79,1 mmol) e hidróxido de potássio (3,88 g, 69,1 mmol). Rf 0,43 (10% EtO- Ac-hexanos). Síntese do Composto 36
Figure img0055
[000411] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 5, (6Z,13Z)-nonadeca-6,13-dien-10-il metanossulfonato 36 (11,6g, 99%) foi obtido como um óleo incolor de (6Z,13Z)-nonadeca- 6,13-dien-10-ol (9,11 g, 32,5 mmol), trietilamina (10 mL) e metano sul- fonil cloreto (5,0 mL, 65 mmol). Rf 0,73 (CH2Cl2). Síntese do Composto 37
Figure img0056
[000412] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 6, (Z)-2-((Z)-non-3-en-1-il)undec-5-enonitrila 37 (7,2 g, 77%) foi obtido como um óleo incolor de (6Z,13Z)-nonadeca-6,13-dien-10-il me- tanossulfonato (11,6 g, 32,3 mmol) e cianeto de sódio (3,96 g, 80,9 mmol). Rf 0,75 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 38
Figure img0057
[000413] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 7, (Z)-2-((Z)-non-3-en-1-il)undec-5-enal 38 (5,0 g, 69%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-2-((Z)-non-3-en-1-il)undec-5-enonitrila (7,2 g, 24,9 mmol) e DIBAL (49,7 mL como uma solução 1M em hexa- nos, 49,7 mmol). Rf 0,69 (10 EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 39
Figure img0058
[000414] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 8, (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-ol 39 (1,64 g, 76%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-2-((Z)-non-3-en-1-il)undec-5- enal (1,5 g, 5,1 mmol), (Z)-non-3-enil brometo (1,58 g, 7,7 mmol) e arestas de magnésio (206 mg, 8,5 mmol). Rf 0,46 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 40
Figure img0059
[000415] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 9, (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1-il)docosa-6,16-dien-11-il 4- (dimetilamino)butanoato 40 (483 mg, 76%) foi obtido como um óleo incolor de (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-ol (500 mg, 1,19 mmol), EDC (686 mg, 3,58 mmol), Hunig’s base (726 μL, 4,17mmol) e ácido N,N dimetilaminobutírico cloridrato (600 mg, 3,58 mmol). Rf 0,43 (10% CH3OH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 42
Figure img0060
Síntese do Composto 41
Figure img0061
[000416] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 10, (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-il 5- bromopentanoato 41 (655 mg, 95%) foi obtido como um óleo incolor de (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3- en-1-il)icosa-6,14-dien-10-ol (500mg, 1,19mmol), EDC (686 mg, 3,58mmol) e ácido 5-bromovalérico (649 mg, 3,58mmol). Rf 0,54 (5% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 42
Figure img0062
[000417] Usando um procedimento análogo ao descrito para a sínte- se de 11, (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-il 5- (dimetilamino)pentanoato 42 (421 mg, 68%) foi obtido como um óleo incolor de (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-il 5- bromopentanoato (655 mg, 1,13mmol) e dimetilamina (25 mL como uma solução 5,6M em EtOH). Rf 0,4 (10% CH3OH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 50
Figure img0063
Síntese do Composto 44
Figure img0064
[000418] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 4, henicosan-11-ol 44 (7,06 g, 99%) foi obtido como um óleo incolor de bromodecano (9,4 mL, 45,2mmol), arestas de magnésio (1,18 g, 48,4mmol), formato de etila (3,74 mL, 46,6mmol) e hidróxido de po-tássio (2,28 g, 40,7mmol). Rf 0,36 (10% EtOAc-hexanos), FW 312,57, C21H44O. Síntese do Composto 45
Figure img0065
[000419] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 5, henicosan-11-il metanossulfonato 45 (6,87 g, 78%) foi obtido como um óleo incolor de henicosan-11-ol (7,06 g, 22,6mmol), trietila- mina (22mL) e metano sulfonil cloreto (3,5 mL, 45mmol). Rf 0,86 (CH2Cl2). Síntese do Composto 46
Figure img0066
[000420] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 6, 2-decildodecanonitrila 46 (2,25 g, 40%) foi obtido como um óleo incolor de henicosan-11-il metanossulfonato (6,87 g, 17,6mmol) e cianeto de sódio (4,31 g, 87,9mmol). Rf 0,84 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 47
Figure img0067
[000421] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 7, 2-decildodecanal 47 (1,91 g, 84%) foi obtido como um óleo incolor de 2-decildodecanonitrila (2,25 g, 7,0mmol) e DIBAL (14 mL, como uma solução 1M em hexanos, 14mmol). Rf 0,51 (5% EtOAc- hexanos). Síntese do Composto 48
Figure img0068
[000422] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 8, (Z)-12-decildocos-6-en-11-ol 48 (1,08 g, 40%) foi obtido como um óleo incolor de 2-decildodecanal (1,91 g, 5,87mmol), (Z)-dec-4-enil brometo (1,45 g, 7,05mmol) e arestas de magnésio (183 mg, 7,54mmol). Rf 0,26 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 49
Figure img0069
[000423] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 10, (Z)-12-decildocos-6-en-11-il 5-bromopentanoato 49 (916 mg, 63%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-12-decildocos-6-en-11-ol (1,08 g, 2,33mmol), EDC (804 mg, 4,19mmol) e ácido 5-bromovalérico (1,27 g, 6,99mmol). Rf 0,29 (5% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 50
Figure img0070
[000424] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 11, (Z)-12-decildocos-6-en-11-il 5-(dimetilamino)pentanoato 50 (662 mg, 80%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-12-decildocos-6- en-11-il 5-bromopentanoato (916 mg, 1,16mmol) e dimetilamina (27 mL como uma solução 5,6M em EtOH). Rf 0,51 (10% CH3OH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 53
Figure img0071
Síntese do Composto 51
Figure img0072
[000425] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 8, (Z)-12-((Z)-dec-4-en-1-il)docos-16-en-11-ol 51 (3,37 g, 65%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 (3,6 g, 11,2mmol), 1-bromodecano (3,5 mL, 16,9mmol) e arestas de magnésio (438 mg, 18,0mmol). Rf 0,31 (5% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 52
Figure img0073
[000426] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 10, (Z)-12-((Z)-dec-4-en-1-il)docos-16-en-11-il 5-bromopenta- noato 52 (4,69 g, 99%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-12-((Z)- dec-4-en-1-il)docos-16-en-11-ol (3,37 g, 7,29mmol), EDC (2,51 g, 13,1mmol) e ácido 5-bromovalérico (3,96 g, 21,8mmol). Rf 0,56 (5% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 53
Figure img0074
[000427] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 11, (Z)-12-decildocos-6-en-11-il 5-(dimetilamino)pentanoato 53 (943 mg, 99%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-12-decildocos-6- en-11-il 5-bromopentanoato (1,0 g, 1,6mmol) e dimetilamina (30 mL como uma solução 5,6M em EtOH). Rf 0,50 (10% CH3OH-CH2Cl2).
Exemplo 2
[000428] Este exemplo compara a efetividade, em um modelo de ati-vidade de ApoB siRNA murina, de lipídeos trialquil de cadeia curta da presente invenção com lipídeos tendo cadeias de alquil maiores mas que são de outra forma estruturalmente idênticas aos lipídeos trialquil de cadeia curta.
[000429] Formulações de partícula de acido nucleico-lipídeo contendo lipídeos catiônicos foram avaliadas para suas capacidades de expressão em ApoB knockdown nos fígados de camundongos fêmeas BALB/c de 7 a 9 semanas de idade. Os camundongos foram dosados por via intravenosa (veia da cauda) em grupos de três 0,02, 0,03 ou 0,05 mg/kg. ApoB knockdown (normalizados para o gene housekeeping GAPDH) foi medido em relação a PBS como um controle negativo. Cada experimento foi terminado 48 horas após a dosagem.
[000430] Por comparação a um controle positivo, o desempenho de lipídeos trialquil de cadeia curta da presente invenção foi comparado a um lipídeo catiônico potente, referenciado como C2K, que é conhecido para facilitar a liberação de ácido nucleico, in vivo, em partículas de ácido nucleico-lipídeo (Nature Biotech., Vol 28(2),172 (2010)). C2K tem a seguinte estrutura:
Figure img0075
[000431] Como mostrado na tabela 1, em uma dose injetada de 0,02 mg/kg, 10 de 11 lipídeos catiônicos da presente invenção (compostos 9, 13, 14, 19, 22, 27, 40, 42, 50 e 53) apresentaram maior atividade do que C2K.
[000432] Tabela 1: silenciamento de ApoB (0,02 mg/kg siRNA) por vários lipídeos catiônicos de trialquil da presente invenção.
Figure img0076
[000433] Como mostrado na tabela 2, em um experimento separado, em uma dose injetada de 0,03 mg/kg, 5 de 7 lipídeos catiônicos da presente invenção (compostos 11, 13, 19, 23, e 25) apresentaram maior atividade do que C2K.
[000434] Tabela 2: silenciamento de ApoB (0,03 mg/kg siRNA) por vários lipídeos catiônicos de cadeia curta da presente invenção.
Figure img0077
[000435] A atividade de lipídeos catiônicos da presente invenção foi também comparada aos correspondentes lipídeos catiônicos de trial- quil que são estruturalmente idênticos aos lipídeos da presente inven-ção, exceto que as cadeias de alquil são maiores. As estruturas destes lipídeos catiônicos de trialquil de cadeia maior (identificadas como compostos 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60) são mostradas na tabela 3.
[000436] Tabela 3: estruturas de lipídeos catiônicos de trialquil de
Figure img0078
[000437] Compostos 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60 foram preparados de acordo com os procedimentos descritos no pedido de patente US 13/235.253, depositado em 16 de setembro, 2011, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[000438] Como mostrado na tabela 4, os lipídeos de cadeia maior 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 foram dosados em 0,05 mg/kg (2,5 vezes a dose descrita na tabela 1), e apresentaram ApoB knockdown variando de +25% a -69% em comparação a 60% por C2K (ou seja, alguns compostos apresentaram uma melhora moderada sobre C2K).
[000439] Tabela 4: silenciamento ApoB (0,05 mg/kg siRNA) por vários lipídeos catiônicos trilinoleil
Figure img0079
a Média de silenciamento de ApoB em quatro estudos
[000440] Em geral, a atividade de lipídeos catiônicos de trialquil cadeia mais curta (C9 a C10) da presente invenção foi substancialmente melhorada quando comparada ao lipídeo contraparte de cadeia maior trilinoleil (C18). Por exemplo, uma comparação direta de composto 13 com sua variante trilinoleil 54 mostrou uma melhora de -6% (0,05 mg/kg) a -80% (0,02 mg/kg) em ApoB knockdown, apesar do fato de que o composto 13 foi dosado 2,5 vezes menor. A mesma tendência foi observada quando comparando os compostos 55 a 11, 56 a 24 e 57 a 25.
Exemplo 3
[000441] Outros experimentos no modelo murinho de ApoB usados em diferente lipídeo catiônico como o controle positivo; DLin-MP-DMA. DLin-MP-DMA é descrito no pedido de patente WO 2011/141705, e tem a estrutura:
Figure img0080
DLin-MP-DMA
[000442] Como mostrado na tabela 5, no mesmo modelo murino ApoB, DLin-MP-DMA demonstrou ser mais eficaz do que C2K em três experimentos separados, e é, portanto, um controle positivo válido:
[000443] Tabela 5. Comparação entre C2K e DLin-MP-DMA como controles positivos
Figure img0081
[000444] Em outro experimento, dois mais lipídeos da presente inven-ção (Compostos 62 e 71) foram formulados em nanopartículas de lipídeo com siRNA para ter como alvo ApoB. Os camundongos foram doseados intravenosamente (veia da cauda) e sacrificados 48 h após doseamento. Os fígados foram coletados e homogeneizados e o nível de silenciamen- to de ApoB (normalizado ao gene GAPDH housekeeping) então medido por ensaio Quantigene. Os resultados são mostrados na tabela 6 e são expressos como um percentual, em relação a um grupo de controle negativo tratado com PBS. A sequência de siRNA usada neste experimento foi diferente, e menos potente do que o usado no exemplo 2. As comparações entre os experimentos não são, portanto, possíveis:
[000445] Tabela 6: silenciamento de ApoB por vários lipídeos catiô- nicos de trialquila da presente invenção.
Figure img0082
[000446] O composto 71 teve atividade semelhante ao controle DLin- MP-DMA. O composto 62 foi significativamente mais ativo. A síntese destes e outros compostos é descrita no Exemplo 4.
Exemplo 4
[000447] Estes exemplos descrevem a síntese de compostos adicionais da presente invenção. Esquema sintético para o Composto 62
Figure img0083
Síntese do Composto 61
Figure img0084
[000448] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 5, (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1-il)docosa-6,16-dien-11-il meta- nossulfonato 61 (1,18 g, 90%) foi obtido como um óleo incolor de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1-il)docosa-6,16-dien-11-ol 8 (1,12 g, 2,43 mmol), trietilamina (8mL) e metano sulfonil cloreto (0,38 mL, 4,9mmol). Rf 0,91 (CH2Cl2). Síntese do Composto 62
Figure img0085
[000449] Uma solução de mesilato 61 (1,09g, 2,01mmol) em tolueno (30mL) foi sucessivamente tratada com N,N-dimetilaminobutanol (1,34mL, 10,1mmol) e NaH (442mg como um 60% dispersão em óleo, 11,1mmol). Uma vez cessada a evolução do gás a mistura de reação foi trazida ao refluxo (115°C temperatura do banho) e extinta (50h). A mistura de reação foi então resfriada (rt) e vertida em água fria e então extraída com EtOAc. Os orgânicos combinados foram lavados com água e salmoura, secos (Na2SO4), filtrados, concentrados e purificados via cromatografia (100% EtOAc) para gerar 4-(((6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4- en-1-il)docosa-6,16-dien-11-il)oxi)-N,N-dimetilbutan-1-amina 62 (143mg, 13%) como um óleo amarelo pálido. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,415,30 (m, 6H), 3,46-3,35 (m, 2H), 3,19-3,14 (m, 1H), 2,34 (t, 2H), 2,24 (s, 6H), 2,10-1,93 (m, 12H), 1,60-1,09 (m, 35H), 0,90 (t, 9H). Rf 0,54 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 71
Figure img0086
Síntese do Composto 63
Figure img0087
[000450] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 5, 3,7-dimetilctil metanossulfonato 63 (7,47 g, >99%) foi obtido como um óleo incolor de 3,7-dimetilctan-1-ol (5,0 g, 31,6mmol), trieti- lamina (8mL) e metano sulfonil cloreto (4,89 mL, 63,2mmol). Rf 0,69 (CH2Cl2). Síntese do Composto 64
Figure img0088
[000451] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 3, 1-bromo-3,7-dimetilctane 64 foi obtido como um óleo incolor (6,0 g, 86%) de 3,7-dimetilctil metanossulfonato 63 (7,47 g, 31,6 mmol) e tetrabutilamônio brometo (13,2 g, 41,1 mmol). Rf 0,92 (hexanos). Síntese do Composto 65
Figure img0089
[000452] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 4, 2,6,12,16-tetrametilheptadecan-9-ol 65 (7,0 g, quantitativo) foi obtido como um óleo incolor de 1-bromo-3,7-dimetilctane 64 (10 g, 45,2 mmol), arestas de magnésio (1,21 g, 49,8 mmol), formato de etila (3,8 mL, 47,5 mmol) e hidróxido de potássio (3,8 g, 67,8 mmol). Rf 0,38 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 66
Figure img0090
[000453] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 5, 2,6,12,16-tetrametilheptadecan-9-il metanossulfonato 66 (1,56 g, 87%) foi obtido como um óleo incolor de 2,6,12,16-tetrametilhepta- decan-9-ol 65 (1,39 g, 5,14mmol), trietilamina (3mL) e metano sulfonil cloreto (0,8 mL, 10,3mmol). Rf 0,8 (CH2Cl2). Síntese do Composto 67
Figure img0091
[000454] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 6, 2-(3,7-dimetilctil)-5,9-dimetildecanonitrila 67 (0,8 g, 56%) foi obtido como um óleo incolor de 2,6,12,16-tetrametilheptadecan-9-il metanossulfonato 66 (1,56 g, 4,48 mmol) e cianeto de sódio (0,55 g, 11,2 mmol). Rf 0,8 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 68
Figure img0092
[000455] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 7, 2-(3,7-dimetilctil)-5,9-dimetildecanal 68 (0,63 g, 78%) foi obtido como um óleo incolor de 2-(3,7-dimetilctil)-5,9-dimetildecanonitrila 67 (0,8 g, 2,49 mmol) e DIBAL (5,74 mL como uma solução 1M em hexanos, 5,74 mmol). Rf 0,6 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 69
Figure img0093
[000456] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 8, 10-(3,7-dimetilctil)-2,6,13,17-tetrametilctadecan-9-ol 69 (0,53 g, 62%) foi obtido como um óleo incolor de 2-(3,7-dimetilctil)-5,9- dimetildecanal 68 (0,6 g, 1,85 mmol), 1-bromo-3,7-dimetilctano 64 (2,0 g, 9,0 mmol) e arestas de magnésio (232 mg, 9,67 mmol). Rf 0,37 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 70
Figure img0094
[000457] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 10, 10-(3,7-dimetilctil)-2,6,13,17-tetrametilctadecan-9-il 5- bromopentanoato 68 (450 mg, bruto) foi obtido como um óleo amarelo de 10-(3,7-dimetilctil)-2,6,13,17-tetrametilctadecan-9-ol 69 (200mg, 0,43 mmol), EDC (246 mg, 1,28mmol) e ácido 5-bromovalérico (246 mg, 1,28mmol). Rf 0,49 (5% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 71
Figure img0095
[000458] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 11, 10-(3,7-dimetilctil)-2,6,13,17-tetrametilctadecan-9-il 5- (dimetilamino)pentanoato 71 (184 mg, 72% 2 etapas) foi obtido como um óleo incolor de 10-(3,7-dimetilctil)-2,6,13,17-tetrametilctadecan-9-il 5-bromopentanoato 68 (450 mg bruto) e dimetilamina (10 mL como uma solução 2,0M em EtOH). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 4,95-4,87 (m, 1H), 2,33 (t, 2H), 2,28 (t, 2H), 2,23 (s, 6H), 1,74-1,60 (m, 4H), 1,58-0,99 (m, 37H), 0,93-0,79 (m, 27H). Rf 0,43 (10% CH3OH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 74
Figure img0096
Síntese do Composto 72
Figure img0097
[000459] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 8, (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1-il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-ol 72 (0,62 g, 72%) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6- enal 7 (0,6 g, 1,87 mmol), 1-bromo-3,7-dimetilctano 64 (3,9 g, 17,5 mmol) e arestas de magnésio (454 mg, 18,7 mmol). Rf 0,61 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 73
Figure img0098
[000460] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 10, (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1-il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-il 5- bromopentanoato 73 (900 mg, bruto) foi obtido como um óleo amarelo de (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1-il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-ol 72 (620mg, 1,34mmol), EDC (500 mg, 2,6mmol) e ácido 5-bromovalérico (500 mg, 2,56mmol). Rf 0,72 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 74
Figure img0099
[000461] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 11, (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1-il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-il 5- (dimetilamino)pentanoato 74 (466 mg, 58% 2 etapas) foi obtido como um óleo incolor de (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1-il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-il 5-bromopentanoato 73 (900 mg, bruto) e dimetilamina (15 mL como uma solução de 2,0M em EtOH). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,435,29 (m, 4H), 4,94-4,88 (m, 1H), 2,32 (t, 2H), 2,26 (t, 2H), 2,15 (s, 6H), 2,08-1,93 (m, 8H), 1,70-1,00 (m, 43H), 0,95-0,83 (m, 15H). Rf 0,42 (10% CH3OH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 76
Figure img0100
Síntese do Composto 75
Figure img0101
[000462] Uma solução de 5-bromopentan-1-ol (1,0g, 5,99mmol) foi preparada com dimetilamina (10mL, como uma solução 2M em EtOH) em um frasco vedado e aquecida (80°C). Após agitação (16h) dimeti- lamina e EtOH foram removidos em pressão reduzida para gerar 5- (dimetilamino)pentan-1-ol hidrobrometo 75 (1,26g, quantitativo) como um sólido amarelo-laranja. Rf 0,25 (10% CH3OH-CH2Cl2). Síntese do Composto 76
Figure img0102
[000463] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 62, 5-(((6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1-il)docosa-6,16-dien-11- il)oxi)-N,N-dimetilpentan-1-amina 76 (864 mg, 37%) foi obtido como um óleo amarelo pálido de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1-il)docosa-6,16- dien-11-il metanossulfonato 61 (1,86 g, 3,45mmol), 5- (dimetilamino)pentan-1-ol bromidrato 75 (1,26g, 5,99mmol) e NaH (288 mg como um 60% dispersão em óleo, 7,2mmol). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,43-5,32 (m, 6H), 3,46-3,33 (m, 2H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,30-2,18 (m, 8H), 2,07-1,93 (m, 12H), 1,61-1,04 (m, 37H), 0,89 (t, 9H). Rf 0,47 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 79
Figure img0103
Síntese do Composto 77
Figure img0104
[000464] A uma solução resfriada (-15°C) de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4- enil)docosa-6,16-dien-11-ol 8 (5 g, 10,9 mmol) em diclorometano anidro (125 mL) sob nitrogênio foi adicionado, sob gotejamento, dietil zinco (1M em hexano, 82 mL, 81,8 mmol) por 20 minutos. A solução foi agitada por 70 minutos a 0°C então diiodometano (6,6 mL, 81,8 mmol) foi cuidadosamente adicionado. A solução foi extinta durante a noite, deixando-a aquecer até temperatura ambiente. Na conclusão, a solu-ção foi vertida em água gelada (350 mL) e diluída com acetato de etila (450 mL). Então 5% HCl (350 mL) foi adicionado para ajudar a aliviar a emulsão que se formou. A camada orgânica foi lavada com NaHCO3 (sat. aq. 500 mL), água (500 mL) e salmoura (500 mL). As camadas aquosas combinadas foram extraída de volta com acetato de etila. Os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados em vácuo até secagem. O resíduo foi purifica-do por cromatografia em coluna em sílica gel (2,5% acetato de etila em hexanos) para gerar um óleo colorido rosa. Para remover a cor (I2), o produto purificado foi dissolvido em diclorometano (150 mL) e lavado com Na2S2O3 (sat. aq. 2 x 40mL) para gerar 1,8-bis(2-pentilciclopropil)- 5-(3-(2-pentilciclopropil)propil)octan-4-ol 77 como um óleo amarelo pá-lido (5,54 g, 96,5%). Síntese do Composto 78
Figure img0105
[000465] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6 bromohe- xanoato 10, 1,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil) pro- pil)octan-4-il 6-bromohexanoato foi obtido como um óleo bruto de 1,8- bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil)propil)octan-4-il 6- (dimetilamino)hexanoato (0,75 g, 1,5 mmol), anidro diclorometano (5,2ml), ácido 6-bromohexanoico (0,88 g, 4,5 mmol), 1-Etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida cloridrato (0,87 g, 4,5 mmol), e 4- dimetilaminopiridina (5 mg). O produto foi usado na etapa seguinte sem outra purificação. Síntese do Composto 79
Figure img0106
[000466] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6- (dimetiamino)hexanoato 11, foi obtido como um óleo (0,56 g, 59%) de 1,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil) propil)octan-4-il 6- bromohexanoato (1,0 g, 1,5 mmol) e 2,0M dimetilamina em etanol (3,5 ml). Rf 0,50 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 83
Figure img0107
Síntese do Composto 80
Figure img0108
[000467] A uma solução de 2-octildodecan-1-ol (20 g, 67,0 mmol) em diclorometano anidro (500 mL) foi adicionado clorocromato de piridínio (43,2 g, 200 mmol). A solução foi agitada por 3 horas em temperatura ambiente então filtrada por um pad de sílica e eluída com diclorometa- no para gerar 2-octildodecanal 80 como um óleo incolor (10,5 g, 50%). Síntese do Composto 81
Figure img0109
[000468] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,15Z)-henicosa-6,15-dien-11-ol 4, (Z)-12-octildocos-6-en-11- ol 81 foi obtido como um óleo incolor (0,67 g, 92%) de 2-octildodecanal 80 (0,5 g, 1,6 mmol), (Z)-1-bromodece-4-eno (0,7 g, 3,1 mmol), magnésio (80 mg, 3,4 mmol), tetrahidrofurano anidro (0,5 mL), água (2 mL), EtOH (2 mL) e KOH (0,2 g, 2,8 mmol). Síntese do Composto 82
Figure img0110
[000469] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6 bromohe- xanoato 10, (Z)-12-octildocos-6-en-11-il 6-bromohexanoato 82 foi obti- do como um óleo incolor (0,78 g, 85%) de (Z)-12-octildocos-6-en-11-ol 81 (0,67 g, 1,5 mmol), diclorometano anidro (5 mL), ácido 6- bromohexanoico (0,80 g, 4,4 mmol), 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato (0,85 g, 4,4 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (5 mg). O produto foi usado na etapa seguinte sem outra purificação. Síntese do Composto 83
Figure img0111
[000470] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6- (dimetiamino)hexanoato 11, (Z)-12-octildocos-6-en-11-il 6- (dimetilamino)hexanoato 83 foi obtido como um óleo (103 mg, 14%) de (Z)-12-octildocos-6-en-11-il 6-bromohexanoato 82 (0,78 g, 1,3 mmol) e 2,0M dimetilamina em etanol (3 mL). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,43-5,26 (m, 2H), 4,96-4,91 (m, 1H), 2,33 (t, 4H), 2,26 (s, 6H), 2,081,93 (m, 4H), 1,70-1,60 (m, 2H), 1,57-1,43 (m, 4H), 1,40-1,15 (m, 43H), 0,94-0,85 (m, 9H). Esquema sintético para o Composto 89
Figure img0112
Síntese do Composto 84
Figure img0113
[000471] A uma solução resfriada (0oC) de (E)-etil dec-4-enoato (20 g, 101 mmol) em éter dietil anidro (350 mL) foi adicionado hidreto de alumínio lítio (8,9 g, 212 mmol) sob nitrogênio. A solução foi extinta por 1 hora em temperatura ambiente então resfriada até 0oC e extinta len-tamente com 5M NaOH (30 mL) e diluída com éter etil (100mL). A so-lução foi agitada por 30 min e seca em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada em vácuo até secagem para gerar (E)-dec-4-en-1-ol 84 como óleo (16,1 g, quantitativo). Síntese do Composto 85
Figure img0114
[000472] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (Z)-dec-4-enil metanossulfonato 2, (E)-dec-4-enil metanossulfo- nato 85 foi obtido como um óleo laranja (32,7 g) de (E)-dec-4-en-1-ol (16,1 g, 94,7 mmol), trietilamina (15,5 mL, 111,7 mmol) e metano sul- fonil cloreto (15,6 mL, 201,7 mmol). Rf 0,65 (100% CH2Cl2). Síntese do Composto 86
Figure img0115
[000473] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (Z)-1-bromodec-4-eno 3, (E)-1-bromodec-4-eno 86 foi obtido como óleo (17,9 g, 81%) de (E)-dec-4-enil metanossulfonato 85 (23,5 g, 94,7 mmol), e tetrabutilamônio brometo (40,0 g, 124,1 mmol). Rf 0,85 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 87
Figure img0116
[000474] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese para gerar (6Z,15Z)-henicosa-6,15-dien-11-ol 4, (6E,16Z)-12-((Z)- dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ol 87 foi obtido como óleo (1,28 g, 71%) de (E)-1-bromodec-4-eno 86 (1,7 g, 7,8 mmol), arestas de magnésio (0,19 g, 7,8 mmol), (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 (1,25 g, 3,9 mmol) e hidróxido de potássio (0,66 g, 11,7 mmol). Rf 0,43 (10% EtOAc-hexanos). Síntese do Composto 88
Figure img0117
[000475] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-bromohexa- noato 10, (6E,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 5- bromopentanoato 88 foi obtido como óleo (1,36 g, 78%) de (6E,16Z)- 12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ol 87 (1,28 g, 2,8 mmol), e ácido 5-bromo-n-valérico (1,00 g, 5,6 mmol), 1-Etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato (1,06 g, 5,6 mmol), diiso- propiletilamina (1,1 g, 83,0 mmol) e dimetilaminopiridina (10 mg). Síntese do Composto 89
Figure img0118
[000476] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 6-(dimetilamino)he xanoato 11, (6E,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 5-(dimetila mino)pentanoato 89 foi obtido como óleo (0,45 g, 35%) de (6E,16Z)-12- ((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-il 5-bromopentanoato 88 (1,36 g, 2,2 mmol), e 2 M dimetilamina em etanol (5 mL). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,45-5,28 (m, 6H), 4,96-4,91 (m, 1H), 2,34-2,25 (m, 2H), 2,06-1,90 (m, 12H), 1,68-1,61 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 5H), 1,45-1,16 (m, 28H), 0,95-0,84 (m, 9H). Rf 0,46 (10% MeOH-CH2Cl2). Esquema sintético para o Composto 90
Figure img0119
Síntese do Composto 89
Figure img0120
[000477] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 5, 1,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil)propil) oc- tan-4-il metanossulfonato 89 foi obtido como um óleo incolor. Síntese do Composto 90
Figure img0121
[000478] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese de 62, 5-((1,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil) pro- pil)octan-4-il)oxi)-N,N-dimetilpentan-1-amina 90 (580 mg) foi obtido como um óleo amarelo pálido. Rf 0,48 (10% MeOH-CH2Cl2).
[000479] Deve ser entendido que a descrição acima se destina a ser ilustrativa e não restritiva. Muitas modalidades serão aparentes aos especialistas na técnica mediante leitura da descrição acima. O escopo da invenção deve, portanto, ser determinado não com referência à descrição acima, mas em vez disso deve ser determinado com refe-rência às seguintes reivindicações anexadas, juntamente com o esco-po total dos equivalentes aos quais as reivindicações têm direito. As revelações dos artigos e referências, incluindo pedidos de patente, pa-tentes, publicações de PCT, e N.° de Acessão Genbank e sequências descritas neste documento são incorporadas aqui por referência em para todos os fins.

Claims (27)

1. Lipídeo, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fór-mula estrutural (I): X-A-Y-Z; (I) ou sais do mesmo, em que: X é C1 a C4 alquilamino; A é C1 a C6 alquila opcionalmente substituída por C1 a C4 alquila ou C1 a C4 cicloalquila, em que a dita C1 a C6 alquila opcional-mente substituída por C1 a C4 alquila ou C1 a C4 cicloalquila pode ser saturada ou insaturada, e em que A pode ou não pode estar presente; Y é selecionado do grupo consistindo em cetal, éster, car- bamato opcionalmente substituído por C1 a C4 alquila ou C1 a C4 ciclo- alquila, éter, e amida opcionalmente substituída por C1 a C4 alquila ou C1 a C4 cicloalquila; e Z apresenta a fórmula:
Figure img0122
em que R1, R2 e R3 são cada qual independentemente se-lecionados a partir do grupo consistindo em C8 a C11 hidrocarboneto alifático, em que cada um de R1, R2 e R3 pode independentemente ser saturado ou insaturado, e em que cada um de R1, R2 e R3 é opcional-mente substituído por C1 a C4 alquila ou C1 a C4 cicloalquila.
2. Lipídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma das cadeias alquila R1, R2 e R3 apresenta um comprimento de C9 a C10.
3. Lipídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zado pelo fato de que pelo menos uma das cadeias alquila R1, R2 e R3 compreende uma fração cicloalquila e/ou uma ligação dupla.
4. Lipídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X é selecionado a partir do grupo consistindo em di- metilamino, dietilamino e etilmetilamino.
5. Lipídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em:
Figure img0123
Figure img0124
Figure img0125
Figure img0126
ou um sal do mesmo.
6. Lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que A, Y, R1, R2, e R3 não são substi-tuídos.
7. Partícula de lipídeo, caracterizada pelo fato de que com-preende um lipídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 7, ca-racterizada pelo fato de que a partícula ainda compreende um lipídeo não catiônico.
9. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 8, ca-racterizada pelo fato de que o lipídeo não catiônico é selecionado do grupo consistindo em um fosfolipídeo, colesterol ou um derivado do mesmo, ou uma mistura de um fosfolipídeo e colesterol ou um derivado do mesmo.
10. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo compreende dipalmitoil- fosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) ou uma mis-tura dos mesmos.
11. Partícula de lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a partícula ainda compreende um lipídeo conjugado que inibe agregação de partículas.
12. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o lipídeo conjugado que inibe agregação de partículas compreende um conjugado polietilenoglicol (PEG)- lipídeo.
13. Partícula de lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizada pelo fato de que a partícula ainda compreende um agente terapêutico.
14. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é um RNA interfe-rente selecionado a partir do grupo consistindo em um RNA interferen-te pequeno (siRNA), um RNA interferente assimétrico (aiRNA), um mi- croRNA (miRNA), um dsRNA de substrato Dicer, um RNA em forma de grampo (hairpin) pequeno (shRNA) e misturas dos mesmos.
15. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é um RNA interfe-rente pequeno (siRNA).
16. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é um RNA mensa-geiro (mRNA).
17. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a partícula tem uma razão em massa de lipídeo:agente terapêutico de cerca de 5:1 a cerca de 15:1.
18. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende mRNA como agente tera-pêutico e compreende um lipídeo apresentando a estrutura do Com-posto 13, ou um sal do mesmo, em que a partícula de lipídeo compre-ende cerca de 55% em mol do lipídeo apresentando a estrutura do Composto 13 ou um sal do mesmo, e de cerca de 1,2% em mol a cerca de 1,6% em mol de PEG200-C-DMA.
19. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende de cerca de 1,3% em mol a cerca de 1,6% em mol de PEG200-C-DMA.
20. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 1,3% em mol de PEG200-C-DMA.
21. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 1,4% em mol de PEG200-C-DMA.
22. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 1,5% em mol de PEG200-C-DMA.
23. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 1,6% em mol de PEG200-C-DMA.
24. Partícula de lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizada pelo fato de que é para uso na distribuição in vivo de um agente terapêutico a um mamífero.
25. Partícula de lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizada pelo fato de que é para o trata-mento de uma doença ou distúrbio em um mamífero em necessidade do mesmo.
26. Partícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado a partir do grupo consistindo em infecção viral, uma doença ou distúrbio no fígado e câncer.
27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma partícula de lipídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 23 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
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