TW202214215A - 用於將有效負載分子遞送至氣道上皮之組成物 - Google Patents

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馬克 況必斯
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Abstract

本揭示案提供包含有效負載分子例如MRNA治療劑之LNP，以用於治療疾病或病症，該等疾病或病症將受益於將有效負載分子遞送至氣道細胞。

Description

用於將有效負載分子遞送至氣道上皮之組成物
呼吸道上皮細胞排列在呼吸道中。呼吸道上皮細胞之主要功能為潤濕呼吸道，保護氣道免受潛在病原體影響，免於感染及組織損傷，及/或促進氣體交換。氣道上皮細胞功能障礙可引起多種病症，包括例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)及囊腫性纖維化。向呼吸道上皮細胞遞送有效負載可用於誘導對關注抗原之免疫，且調節氣道上皮細胞之功能，例如置換缺失或突變蛋白或者增加或減少該等細胞之功能。
舉例而言，囊腫性纖維化(「CF」)為一種體染色體隱性疾病，該疾病之特徵為患者之異常黏稠黏液積聚。CF亦稱為胰腺囊腫性纖維化、胰腺纖維囊腫性疾病或黏液黏稠病。黏液為一種重要體液，其潤滑且保護肺、生殖系統、消化系統及其他器官。然而，CF患者會產生黏稠黏液，此會減小氣道尺寸，從而引起慢性咳嗽、喘息、炎症、細菌感染、纖維化及肺囊腫。此外，大多數CF患者具有黏液阻斷胰腺導管，此會阻止胰島素及消化酶之釋放，從而引起腹瀉、營養不良、生長不良及體重減輕。Gershman A.J.等人, Cleve Clin J Med. 73: 1065-1074 (2006)。CF在高加索人出生中之估計發病率為2,500分之一至3,500分之一，但在其他人群中較為罕見。Ratjen F.等人, Lancet 361: 681-689 (2003)。目前對CF之大多數治療僅控制症狀，且不能治癒該疾病。特定言之，抗生素、消炎藥、支氣管擴張劑、去充血劑、富含蛋白質及脂肪之飲食以及維生素補充劑用於控制症狀。在晚期肺病中，亦進行肺移植以向患者提供未受損之肺。然而，此等治療不能完全或可靠地控制疾病。集中於CF之潛在原因的新治療已出現。此等治療調節具有Phe508del CFTR突變之患者的囊腫性纖維化跨膜傳導調節因數(CFTR)。Middleton P.J.等人, N Engl J Med. 381: 1809-1819 (2019)。然而，每100名CF患者中約有一名無Phe508del CFTR突變，因此將其自此治療排除。
因此，需要改良療法來治療與氣道上皮細胞功能障礙相關之病症，例如CF，靶向該等氣道上皮細胞以進行防治性療法，例如免疫，或治療受益於核酸分子或其他有效負載分子治療性遞送至氣道上皮細胞之其他病症。
本揭示案提供如下LNP分子，其用於將核酸分子，例如mRNA治療劑遞送至氣道上皮細胞以用於治療與氣道上皮功能障礙相關之病症或用於患者之防治益處。在一個實施例中，標的LNP分子可用於治療與上皮細胞功能障礙相關之病症，諸如囊腫性纖維化(CF)、COPD或哮喘，以及投與疫苗有效負載。本揭示案提供如下LNP，當例如 活體外及 活體內投與細胞時，該等LNP具有改良特性，例如改良之有效負載向上皮細胞之遞送，如例如藉由LNP之細胞積累、所要蛋白之表現及/或mRNA表現量測。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      主要分佈在核心之外表面上的陽離子劑， 其中奈米粒子在生理pH下具有大於中性之ζ電位。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心，其包含： (i)      可離子化脂質， (ii)     磷脂， (iii)    結構脂質，及 (iv)    PEG-脂質，以及 (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在上皮細胞中展現至少約20%之細胞積累且在上皮細胞中展現約5%或更高之表現。
在一個態樣中，本文提供一種製備奈米粒子之方法，該方法包括使脂質奈米粒子與陽離子劑接觸，其中該脂質奈米粒子包含： (a)      脂質奈米粒子核心，其包含： (i)      可離子化脂質， (ii)     磷脂， (iii)    結構脂質，及 (iv)    PEG-脂質，以及 (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其藉由本文所述之方法製備。
在一個態樣中，本文提供一種將多核苷酸或多肽有效負載遞送至細胞中之方法，該方法包括使細胞與本文所述之奈米粒子接觸。
在一個態樣中，本文提供一種治療或預防患者之疾病的方法，該方法包括向患者投與包含有效負載之奈米粒子以用於治療或預防本文所述之疾病。
本發明之各限制可涵蓋本發明之各種實施例。因此，預期涉及任一要素或要素組合之本發明之各限制均可包括在本發明之各態樣中。本發明之應用不限於在以下描述中闡述或在圖式中說明之結構細節及元件排列。本發明能夠具有其他實施例且能夠以各種方式實踐或進行。
本揭示案提供用於將核酸或有效負載分子遞送至氣道上皮細胞之LNP分子。舉例而言，該等LNP分子可用於向氣道上皮細胞遞送有效負載分子，例如用於治療囊腫性纖維化(CF)之mRNA治療劑。舉例而言，囊腫性纖維化(CF)為一種進行性遺傳疾病，該疾病會引起持續肺感染且隨時間推移限制呼吸能力。此疾病之特徵在於囊腫性纖維化跨膜傳導調節因數(CFTR)蛋白之基因的兩個拷貝均存在突變。在無參與汗液、消化液及黏液之產生的CFTR之情況下，通常稀薄之分泌物會變得濃稠。mRNA治療劑尤其適用於治療CF，因為該技術可提供編碼CFTR之mRNA的細胞內遞送，然後在標靶細胞內 從頭合成功能性CFTR蛋白。將mRNA遞送至標靶細胞後，所要CFTR蛋白由細胞自身轉譯機構表現，因此，功能完整之CFTR蛋白置換有缺陷或缺失之蛋白。在另一實施例中，該等LNP可用於遞送用於基因編輯之核酸分子、小分子或其他有效負載以改善上皮細胞功能障礙。在另一實施例中，該等LNP可用於將抗原遞送至氣道細胞。在一個實施例中，抗原為存在於LNP中之mRNA構築體之形式以引起多肽或肽之表現，因此產生針對該抗原之免疫反應。
脂質奈米粒子(LNP)為將有效負載分子例如mRNA安全且有效地遞送至標靶細胞的理想平臺。LNP具有藉由涉及細胞攝取、細胞內轉運及內體釋放或內體逃逸之機制遞送核酸的獨特能力。本文提供之一些實施例的特徵為具有改良特性之LNP。在一些實施例中，本文提供之LNP包含脂質奈米粒子核心、封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，以及主要分佈在奈米粒子之外表面上的陽離子劑。在不受特定理論限制之情形下，具有主要分佈在核心外表面上之陽離子劑的LNP可改良LNP在細胞諸如人類支氣管上皮(HBE)中之積累以及改良有效負載分子之功能，例如如藉由細胞，例如氣道上皮細胞中之mRNA表現所量測。
在一些實施例中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      主要分佈在核心之外表面上的陽離子劑， 其中奈米粒子在生理pH下具有大於中性之ζ電位。
在一些實施例中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心，其包含： (i)      可離子化脂質， (ii)     磷脂， (iii)    結構脂質，及 (iv)    PEG-脂質，以及 (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑。
在一些實施例中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心，其包含： (i)      可離子化脂質， (ii)     磷脂， (iii)    結構脂質，及 (iv)    PEG-脂質，以及 (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      主要分佈在核心之外表面上的陽離子劑。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在細胞中展現至少約20%之細胞積累且在細胞中展現約5%或更高之表現。在一些實施例中，奈米粒子在細胞中展現約1%至約75%、5%至約50%、約10%至約40%或約15%至約25%之細胞積累。在一些實施例中，奈米粒子在細胞中展現約0.5%至約50%、約1%至約40%、約3%至約20%或約5%至約15%之表現
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      主要分佈在核心之外表面上的陽離子劑， 其中奈米粒子在細胞中展現至少約20%之細胞積累且在細胞中展現約5%或更高之表現。在一些實施例中，奈米粒子在細胞中展現約1%至約75%、5%至約50%、約10%至約40%或約15%至約25%之細胞積累。在一些實施例中，奈米粒子在細胞中展現約0.5%至約50%、約1%至約40%、約3%至約20%或約5%至約15%之表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      主要分佈在核心之外表面上的陽離子劑， 其中奈米粒子在細胞中展現約0.5%至50%之蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在細胞中展現約0.5%至50%之蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在上皮細胞中展現至少約20%之細胞積累且在上皮細胞中展現約5%或更高之表現。在一些實施例中，奈米粒子在上皮細胞中展現約1%至約75%、5%至約50%、約10%至約40%或約15%至約25%之細胞積累。在一些實施例中，奈米粒子在上皮細胞中展現約0.5%至約50%、約1%至約40%、約3%至約20%或約5%至約15%之表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在上皮細胞中展現約0.5%至50%之蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在上皮細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在約0.5%至約50%肺細胞中展現蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在肺細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在約0.5%至約50%鼻細胞中展現蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在鼻細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在約0.5%至約50%肺泡上皮細胞中展現蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在肺泡上皮細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在呼吸道上皮細胞中展現至少約20%之細胞積累且在呼吸道上皮細胞中展現約5%或更高之表現。在一些實施例中，奈米粒子在呼吸道上皮細胞中展現約1%至約75%、5%至約50%、約10%至約40%或約15%至約25%之細胞積累。在一些實施例中，奈米粒子在呼吸道上皮細胞中展現約0.5%至約50%、約1%至約40%、約3%至約20%或約5%至約15%之表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在約0.5%至約50%呼吸道上皮細胞中展現蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在呼吸道上皮細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在約0.5%至約50%巨噬細胞中展現蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在巨噬細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在約0.5%至約50% HeLa細胞中展現蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在HeLa細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在支氣管上皮細胞中展現至少約20%之細胞積累且在支氣管上皮細胞中展現約5%或更高之表現。在一些實施例中，奈米粒子在呼吸道上皮細胞中展現約1%至約75%、5%至約50%、約10%至約40%或約15%至約25%之細胞積累。在一些實施例中，奈米粒子在支氣管上皮細胞中展現約0.5%至約50%、約1%至約40%、約3%至約20%或約5%至約15%之表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在約0.5%至約50%支氣管上皮細胞中展現蛋白質表現。在一些實施例中，奈米粒子在支氣管上皮細胞中展現約0.1%至約60%、約0.5%至約40%、約1%至約30%或約1%至約20%之蛋白質表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在HBE細胞中展現至少約20%之細胞積累且在HBE細胞中展現約5%或更高之表現。在一些實施例中，奈米粒子在HBE中展現約1%至約75%、5%至約50%、約10%至約40%或約15%至約25%之細胞積累。在一些實施例中，奈米粒子在HBE細胞中展現約0.5%至約50%、約1%至約40%、約3%至約20%或約5%至約15%之表現。
在一個態樣中，本文提供一種奈米粒子，其包含： (a)      脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)      陽離子劑， 其中奈米粒子在活體外在健康HBE細胞中展現至少約20%之細胞積累且在活體外在健康HBE細胞中展現約5%或更高之表現。在一些實施例中，奈米粒子在活體外在健康HBE細胞中展現約1%至約75%、5%至約50%、約10%至約40%或約15%至約25%之細胞積累。在一些實施例中，奈米粒子在活體外在健康HBE細胞中展現約0.5%至約50%、約1%至約40%、約3%至約20%或約5%至約15%之表現。
在一些實施例中，相對於具有實質上相同組成但以不後添加陽離子劑(例如，使陽離子劑與預形成之脂質奈米粒子分層或接觸)之方式製備之奈米粒子，本發明之奈米粒子具有增加之細胞積累(例如在氣道上皮細胞諸如HBE中)。在一些實施例中，相對於具有實質上相同組成但以不後添加陽離子劑(例如使陽離子劑與預形成之脂質奈米粒子分層或接觸)之方式製備之奈米粒子，本發明之奈米粒子具有增加之細胞表現(例如，在氣道上皮細胞諸如HBE中)。
在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約0.1:1至約15:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約0.2:1至約10:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1:1至約10:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1:1至約8:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1:1至約7:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1:1至約6:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1:1至約5:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1:1至約4:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1.25:1至約3.75:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1.25:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約2.5:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約3.75:1。
在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約0.1:1至約20:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約1.5:1至約10:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約1.5:1至約9:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約1.5:1至約8:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約1.5:1至約7:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約1.5:1至約6:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約1.5:1至約5:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約1.5:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約2:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約3:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約4:1。在一些實施例中，陽離子劑與多核苷酸有效負載之莫耳比為約5:1。
在一些實施例中，本發明之奈米粒子具有約5 mV至約20 mV之ζ電位。在一些實施例中，奈米粒子具有約5 mV至約15 mV之ζ電位。在一些實施例中，奈米粒子具有約5 mV至約10 mV之ζ電位。
ζ電位量度膠體分散體之表面電荷。ζ電位之大小指示分散體中相鄰類似帶電粒子之間的靜電排斥程度。ζ電位可在Wyatt Technologies Mobius ζ電位儀器上量測。該儀器藉由「大規模平行相位分析光散射(Massively Parallel Phase Analysis Light Scattering)」或MP-PALS之原理表徵遷移率及ζ電位。與僅使用一個偵測角且需要較高操作電壓之ISO方法13099-1:2012相比，該量測較靈敏且引起較小應力。在一些實施例中，使用採用MP-PALS原理之儀器量測本文所述空脂質奈米粒子組成物脂質之ζ電位。ζ電位可在Malvern Zetasizer (Nano ZS)上量測。
在一些實施例中，脂質奈米粒子核心在中性pH下具有中性電荷。
在一些實施例中，陽離子劑中超過約80%在奈米粒子之表面上。在一些實施例中，陽離子劑中超過約90%在奈米粒子之表面上。在一些實施例中，陽離子劑中超過約95%在奈米粒子之表面上。
在一些實施例中，多核苷酸或多肽有效負載中至少約50%封裝在核心內。在一些實施例中，多核苷酸或多肽有效負載中至少約75%封裝在核心內。在一些實施例中，多核苷酸或多肽有效負載中至少約90%封裝在核心內。在一些實施例中，多核苷酸或多肽有效負載中至少約95%封裝在核心內。
在一些實施例中，奈米粒子之多分散性值小於約0.4。在一些實施例中，奈米粒子之多分散性值小於約0.3。在一些實施例中，奈米粒子之多分散性值小於約0.2。
在一些實施例中，奈米粒子之平均直徑為約40 nm至約150 nm。在一些實施例中，奈米粒子之平均直徑為約50 nm至約100 nm。在一些實施例中，奈米粒子之平均直徑為約60 nm至約120 nm。在一些實施例中，奈米粒子之平均直徑為約60 nm至約100 nm。在一些實施例中，奈米粒子之平均直徑為約60 nm至約80 nm。
在一些實施例中，奈米粒子之laurdan的一般極化大於或等於約0.6。在一些實施例中，奈米粒子之晶面間距大於約6 nm。在一些實施例中，奈米粒子之晶面間距大於約7 nm。
在一些實施例中，奈米粒子中至少50%之表面流動性值大於臨限極化水準。在一些實施例中，奈米粒子中至少75%之表面流動性值大於臨限極化水準。在一些實施例中，奈米粒子中至少90%之表面流動性值大於臨限極化水準。在一些實施例中，奈米粒子中至少95%之表面流動性值大於臨限極化水準。
在一些實施例中，當奈米粒子與細胞群接觸時，約10%或更多細胞群積累奈米粒子。在一些實施例中，當奈米粒子與細胞群接觸時，約15%或更多細胞群積累奈米粒子。在一些實施例中，當奈米粒子與細胞群接觸時，約20%或更多細胞群積累奈米粒子。在一些實施例中，當奈米粒子與細胞群接觸時，約5%或更多細胞表現多核苷酸或多肽。在一些實施例中，當奈米粒子與細胞群接觸時，約10%或更多細胞表現多核苷酸或多肽。在一些實施例中，細胞群為上皮細胞群。在一些實施例中，細胞群為呼吸道上皮細胞群。在一些實施例中，呼吸道上皮細胞群為肺細胞群。在一些實施例中，呼吸道上皮細胞群為鼻細胞群。在一些實施例中，呼吸道上皮細胞群為肺泡上皮細胞群。在一些實施例中，呼吸道上皮細胞群為支氣管上皮細胞群。在一些實施例中，呼吸道上皮細胞群為HBE群。在一些實施例中，細胞群為肺細胞群。在一些實施例中，細胞群為鼻細胞群。在一些實施例中，細胞群為肺泡上皮細胞群。在一些實施例中，細胞群為支氣管上皮細胞群。在一些實施例中，細胞群為HBE群。在一些實施例中，細胞群為HeLa群。 陽離子劑
陽離子劑可包含具有淨正電荷且可黏附於脂質奈米粒子核心之表面的任何水溶性分子或物質。該試劑亦可為脂溶性的，但亦可溶於水溶液。陽離子劑可在生理pH下帶電。生理pH為通常在人體中觀察到之pH水準。生理pH可為約7.30-7.45或約7.35-7.45。生理pH可為約7.40。一般而言，陽離子劑在生理pH下具有淨正電荷，因為其含有在水性介質中在生理pH下質子化之一或多個鹼性官能基。舉例而言，陽離子劑可含有一或多個胺基，例如各自之pKa為8.0或更大之一級胺、二級胺或三級胺。pKa可大於約9。
在一些實施例中，陽離子劑可為陽離子脂質，其為水溶性兩親分子，其中分子之一部分為疏水的，其包含例如脂質部分，且其中分子之另一部分為親水的，其含有典型地在生理pH值下帶電之一或多個官能基。包含脂質部分之疏水部分可用於將陽離子劑錨定於脂質奈米粒子核心。親水部分可用於增加脂質奈米粒子核心表面上之電荷。舉例而言，陽離子劑在醇中之溶解度可大於約1 mg/mL。在醇中之溶解度可大於約5 mg/mL。在醇中之溶解度可大於約10 mg/mL。在醇中之溶解度可大於在醇中約20 mg/mL。醇可為C 1-6醇，諸如乙醇。
分子之脂質部分可為例如結構脂質、脂肪酸或類似烴基。
結構脂質可選自但不限於類固醇、二萜、三萜、膽甾烷、熊果酸或其衍生物。
在一些實施例中，結構脂質為選自但不限於膽固醇或植物固醇之類固醇。在一些實施例中，結構脂質為膽固醇之類似物。在一些實施例中，結構脂質為麥固醇、菜油固醇或豆固醇。在一些實施例中，結構脂質為麥固醇、菜油固醇或豆固醇之類似物。在一些實施例中，結構脂質為β-麥固醇。
脂肪酸包含1至4個C 6-20烴鏈。脂肪酸可完全飽和或可含有1至7個雙鍵。脂肪酸可含有1至5個沿主鏈或懸垂於主鏈之雜原子。
在一些實施例中，脂肪酸包含兩個C 10-18烴鏈。在一些實施例中，脂肪酸包含兩個C 10-18飽和烴鏈。在一些實施例中，脂肪酸包含兩個C 16飽和烴鏈。在一些實施例中，脂肪酸包含兩個C 14飽和烴鏈。在一些實施例中，脂肪酸包含兩個不飽和C 10-18烴鏈。在一些實施例中，脂肪酸包含兩個C 16-18烴鏈，該等烴鏈各自具有一個雙鍵。在一些實施例中，脂肪酸包含三個C 8-18飽和烴鏈。
烴基由1至4個C 6-20烷基、烯基或炔基鏈或3至10員環烷基、環烯基或環炔基組成。
在一些實施例中，烴基鏈為C 8-10烷基。在一些實施例中，烴基鏈為C 8-10烯基。
親水部分可包含在生理pH 7.3至7.4下帶電之1至5個官能基。親水基團可包含在生理pH下質子化且帶正電之鹼性官能基。該等鹼性官能基中至少一者之pKa為8或更大。
在一些實施例中，親水部分包含胺基。胺基可包含一至四個一級胺、二級胺或三級胺及其混合物。一級胺、二級胺或三級胺可為含有選自但不限於-C(=N-)-N-、-C=C-N-、-C=N-或-N-C(=N-)-N-之官能基之較大胺的一部分。胺可包含在三至八員雜烷基或雜芳基環中。
在一些實施例中，胺基包含一或兩個末端一級胺。在一些實施例中，胺基包含一或兩個末端一級胺及一個內部二級胺。在一些實施例中，胺基包含一或兩個三級胺。在一些實施例中，三級胺為(CH 3) 2N-。在一些實施例中，胺基包含一至兩個末端(CH 3) 2N-。
親水部分可包含鏻基。鏻離子之相對離子由具有1個電荷之陰離子組成。
在一些實施例中，鏻上三個取代基為異丙基。在一些實施例中，相對離子為鹵離子、硫酸氫根離子、亞硝酸根離子、氯酸根離子或碳酸氫根離子。在一些實施例中，相對離子為溴離子。
在一些實施例中，陽離子劑為作為固醇胺之陽離子脂質。固醇胺之疏水部分具有固醇，且親水部分具有胺基。固醇基係選自但不限於膽固醇、麥固醇、菜油固醇、豆固醇或其衍生物。胺基可包含一至五個一級胺、二級胺、三級胺或其混合物。該等胺中至少一者之pKa為8或更大，且在生理pH下帶電。一級胺、二級胺或三級胺可為含有選自但不限於-C(=N-)-N-、-C=C-N-、-C=N-或-N-C(=N-)-N-之官能基之較大胺的一部分。胺可包含在三至八員雜烷基或雜芳基環中。
在一些實施例中，固醇胺之胺基包含一或兩個末端一級胺。在一些實施例中，胺基包含一或兩個末端一級胺及一個內部二級胺。在一些實施例中，胺基包含一或兩個三級胺。在一些實施例中，三級胺為(CH 3) 2N-。在一些實施例中，胺基包含一至兩個末端(CH 3) 2N-。
可用於本發明之奈米粒子中的固醇胺包括具有式(A1)之分子： A-L-B (A1) 或其鹽，其中： A為胺基，L為視情況存在之連接基團，且B為固醇。
在一些實施例中，胺基為烷基(例如C 1-14烷基、C 1-12烷基、C 1-10烷基等)、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)，其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合，其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、O(C 1-6烷基)、C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、NH(3至8員雜環烷基)及NH(5至6員雜芳基)。在一些實施例中，連接基團為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2或-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-。在一些實施例中，固醇基為膽固醇、麥固醇、菜油固醇、豆固醇或其衍生物。
在一些實施例中，固醇胺具有式A2a：
Figure 02_image001
(A2a) 或其鹽，其中： ----為單鍵或雙鍵； R 1為C 1-14烷基或C 1-14烯基； L a為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2、-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-或式(a)之基團：
Figure 02_image003
(a)； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或C 1-6烷基-(5至6員雜芳基) 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、O(C 1-6烷基)、C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、NH(3至8員雜環烷基)及NH(5至6員雜芳基)；且 n = 1或2。
在一些實施例中，固醇胺具有式A2a：
Figure 02_image001
(A2a) 或其鹽，其中： ----為單鍵或雙鍵； R 1為C 1-14烷基或C 1-14烯基； L a為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2、-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-或式(a)之基團：
Figure 02_image003
(a)； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或C 1-6烷基-(5至6員雜芳基) 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、O(C 1-6烷基)、C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、NH(3至8員雜環烷基)及NH(5至6員雜芳基)；且 n = 1或2； 其條件為式A2a化合物不為：
Figure 02_image005
(SA1)
Figure 02_image007
(SA2)
Figure 02_image009
(SA3)
Figure 02_image011
(SA4)
Figure 02_image013
(SA5)
Figure 02_image015
(SA9)
Figure 02_image017
(SA10)
Figure 02_image019
(SA11)
Figure 02_image021
(SA22)
Figure 02_image023
(SA23)
Figure 02_image025
(SA29)
Figure 02_image027
(SA30)
Figure 02_image029
(SA39) 及
Figure 02_image031
(SA40)。
在一些實施例中，----為雙鍵。在一些實施例中，----為單鍵。
在一些實施例中，L a為-OC(=O)、-OC(=O)N-或-OC(=O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-。
在一些實施例中，n為1。在一些實施例中，n為2。
在一些實施例中，R 1為C 1-14烷基。在一些實施例中，R 1為C 1-14烯基。在一些實施例中，R 1為
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
或
Figure 02_image037
，
在一些實施例中，Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合； 且其中C 1-10烷基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經C 1-6烷基、OH、-C 1-6烷基-OH或NH 2取代。
在一些實施例中，固醇胺具有式A2：
Figure 02_image039
(A2) 或其鹽，其中： ----為單鍵或雙鍵； R 1為C 1-14烷基或C 1-14烯基； L為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2或-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、O(C 1-6烷基)、C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、NH(3至8員雜環烷基)及NH(5至6員雜芳基)；且 n = 1或2。
在一些實施例中，固醇胺具有式A3a：
Figure 02_image041
(A3a) 或其鹽，其中： ----為單鍵或雙鍵； R 2為H或C 1-6烷基； L a為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2、-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-或式(a)之基團：
Figure 02_image003
(a)； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、O(C 1-6烷基)、C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、NH(3至8員雜環烷基)及NH(5至6員雜芳基)；且 n = 1或2。
在一些實施例中，固醇胺具有式A3a：
Figure 02_image041
(A3a) 或其鹽，其中： ----為單鍵或雙鍵； R 2為H或C 1-6烷基； L a為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2、-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-或式(a)之基團：
Figure 02_image003
(a)； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、O(C 1-6烷基)、C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、NH(3至8員雜環烷基)及NH(5至6員雜芳基)；且 n = 1或2； 其條件為式A2a化合物不為：
Figure 02_image005
(SA1)
Figure 02_image007
(SA2)
Figure 02_image009
(SA3)
Figure 02_image011
(SA4)
Figure 02_image013
(SA5)
Figure 02_image015
(SA9)
Figure 02_image017
(SA10)
Figure 02_image019
(SA11)
Figure 02_image021
(SA22)
Figure 02_image023
(SA23)
Figure 02_image025
(SA29)
Figure 02_image027
(SA30)
Figure 02_image029
(SA39) 及
Figure 02_image031
(SA40)。
在一些實施例中，----為雙鍵。在一些實施例中，----為單鍵。
在一些實施例中，L a為-OC(=O)、-OC(=O)N-或-OC(=O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-。
在一些實施例中，n為1。在一些實施例中，n為2。
在一些實施例中，R 2為H。在一些實施例中，R 2為乙基。
在一些實施例中，Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合； 且其中C 1-10烷基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經C 1-6烷基、OH、-C 1-6烷基-OH或NH 2取代。
在一些實施例中，固醇胺具有式A3：
Figure 02_image055
(A3) 或其鹽，其中： ----為單鍵或雙鍵； R 2為H或C 1-6烷基； L為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2或-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、O(C 1-6烷基)、C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、NH(3至8員雜環烷基)及NH(5至6員雜芳基)；且 n = 1或2。
在一些實施例中，Y 1係選自： (1)
Figure 02_image057
；(2)
Figure 02_image059
；(3)
Figure 02_image061
；(4)
Figure 02_image063
；(5)
Figure 02_image065
；(6)
Figure 02_image067
；(7)
Figure 02_image069
；(8)
Figure 02_image071
；(9)
Figure 02_image073
；(10)
Figure 02_image075
；(11)
Figure 02_image077
；(12)
Figure 02_image079
；(13)
Figure 02_image081
；(14)
Figure 02_image083
；(15)
Figure 02_image085
；(16)
Figure 02_image087
；(17)
Figure 02_image089
；(18)
Figure 02_image091
；(19)
Figure 02_image093
；(20)
Figure 02_image095
(21)
Figure 02_image097
；(22)
Figure 02_image099
；(23)
Figure 02_image101
；(28) N(CH 3) 2；(29)
Figure 02_image103
；(30)
Figure 02_image105
；(31)
Figure 02_image107
；及(32)
Figure 02_image109
。
在一些實施例中，Y 1係選自： (1)
Figure 02_image057
；(2)
Figure 02_image059
；(3)
Figure 02_image061
； (4)
Figure 02_image063
；(5)
Figure 02_image065
；(6)
Figure 02_image067
；(7)
Figure 02_image069
；(8)
Figure 02_image071
；(9)
Figure 02_image073
；(10)
Figure 02_image075
；(11)
Figure 02_image077
；(12)
Figure 02_image079
；(13)
Figure 02_image081
；(14)
Figure 02_image083
；(15)
Figure 02_image085
；(16)
Figure 02_image087
；(17)
Figure 02_image089
；(18)
Figure 02_image091
；(19)
Figure 02_image093
；(20)
Figure 02_image095
(21)
Figure 02_image097
；(22)
Figure 02_image099
；(23)
Figure 02_image101
；(24)
Figure 02_image128
；(25)
Figure 02_image130
；(26)
Figure 02_image132
；(27)
Figure 02_image134
；(28) N(CH 3) 2。
在一些實施例中，固醇胺具有式A4：
Figure 02_image136
(A4) 或其鹽，其中： Z 1為OH或C 3-6烷基； L為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2或-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合， 其中該烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、O(C 1-6烷基)、C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、NH(3至8員雜環烷基)及NH(5至6員雜芳基)；且 n = 1或2。
在一些實施例中，Z 1為OH。在一些實施例中，Z 1為C 3-6烷基。
在一些實施例中，L為-C(=O)N-、-CH 2-NH-C(=O)-或-C(=O)O-。
在一些實施例中，Y 1為C 1-10烷基，其包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合。在一些實施例中，Y 1為
Figure 02_image069
。
在一些實施例中，n為1。在一些實施例中，n為2。
在一些實施例中，固醇胺具有式A5：
Figure 02_image138
(A5) 或其鹽，其中： Z 2為OH或異丙基； L 3為-CH 2-NH-C(O)-、-C(O)NH-或-C(O)O-。
在一些實施例中，固醇胺係選自： 表1
固醇胺編號 結構
SA1
Figure 02_image005
SA2
Figure 02_image007
SA3
Figure 02_image009
SA4
Figure 02_image011
SA5
Figure 02_image013
SA6
Figure 02_image145
SA7
Figure 02_image147
SA8
Figure 02_image149
SA9
Figure 02_image015
SA10
Figure 02_image017
SA11
Figure 02_image019
SA12
Figure 02_image154
SA13
Figure 02_image156
SA14
Figure 02_image158
SA15
Figure 02_image160
SA16
Figure 02_image162
SA17
Figure 02_image164
SA18
Figure 02_image166
SA19
Figure 02_image168
SA20
Figure 02_image170
SA21
Figure 02_image172
SA22
Figure 02_image021
SA23
Figure 02_image023
SA24
Figure 02_image176
SA25
Figure 02_image178
SA26
Figure 02_image180
SA27
Figure 02_image182
SA28
Figure 02_image184
SA29
Figure 02_image025
SA30
Figure 02_image027
SA31
Figure 02_image188
SA32
Figure 02_image190
SA33
Figure 02_image192
SA34
Figure 02_image194
SA35
Figure 02_image196
SA36
Figure 02_image198
SA37
Figure 02_image200
SA38
Figure 02_image202
SA39
Figure 02_image029
SA40
Figure 02_image031
及
SA41
Figure 02_image206
或其鹽。
在一些實施例中，固醇胺係選自： 表2
固醇胺編號 結構
SA1
Figure 02_image005
SA2
Figure 02_image007
SA3
Figure 02_image009
SA4
Figure 02_image011
SA5
Figure 02_image013
SA6
Figure 02_image145
SA7
Figure 02_image147
SA8
Figure 02_image149
SA9
Figure 02_image015
SA10
Figure 02_image017
SA11
Figure 02_image019
SA12
Figure 02_image154
SA13
Figure 02_image156
SA14
Figure 02_image158
SA15
Figure 02_image160
SA16
Figure 02_image162
SA17
Figure 02_image164
SA18
Figure 02_image166
SA19
Figure 02_image168
SA20
Figure 02_image170
SA21
Figure 02_image172
SA22
Figure 02_image021
SA23
Figure 02_image023
SA24
Figure 02_image176
SA25
Figure 02_image178
SA26
Figure 02_image180
SA27
Figure 02_image182
SA28
Figure 02_image184
SA29
Figure 02_image025
SA30
Figure 02_image027
SA31
Figure 02_image188
SA32
Figure 02_image190
SA33
Figure 02_image192
SA34
Figure 02_image194
SA35
Figure 02_image196
SA36
Figure 02_image198
SA37
Figure 02_image200
SA38
Figure 02_image202
SA39
Figure 02_image029
SA40
Figure 02_image031
SA41
Figure 02_image206
SA42
Figure 02_image226
及
SA43
Figure 02_image228
在一些實施例中，固醇胺係選自： 表4
固醇胺編號 結構
SA6
Figure 02_image145
SA7
Figure 02_image147
SA8
Figure 02_image149
SA12
Figure 02_image154
SA13
Figure 02_image156
SA14
Figure 02_image158
SA15
Figure 02_image160
SA16
Figure 02_image162
SA17
Figure 02_image164
SA18
Figure 02_image166
SA19
Figure 02_image168
SA20
Figure 02_image170
SA21
Figure 02_image172
SA24
Figure 02_image176
SA25
Figure 02_image178
SA26
Figure 02_image180
SA27
Figure 02_image182
SA28
Figure 02_image184
SA31
Figure 02_image188
SA32
Figure 02_image190
SA33
Figure 02_image192
SA34
Figure 02_image194
SA35
Figure 02_image196
SA36
Figure 02_image198
SA37
Figure 02_image200
SA38
Figure 02_image202
SA41
Figure 02_image206
及
SA42
Figure 02_image226
或其鹽。
在一些實施例中，固醇胺係選自： 表5
固醇胺編號 結構
SA16
Figure 02_image162
SA18
Figure 02_image166
及
SA19
Figure 02_image168
或其鹽。
在一些實施例中，固醇胺為SA3：
Figure 02_image009
，或其鹽，其亦稱為GL-67。SA3或GL-67可根據此項技術中已知之方法製備或購自商業供應商，諸如Avanti® Polar Lipids公司(SKU 890893)。
在一些實施例中，陽離子脂質為經修飾胺基酸，諸如經修飾精胺酸，其中具有含胺側鏈之胺基酸殘基附加到疏水基團，諸如固醇(例如膽固醇或其衍生物)、脂肪酸或類似烴基。經修飾胺基酸部分中至少一種胺的pKa為8.0或更大。經修飾胺基酸部分中至少一種胺在生理pH下帶正電。該胺基酸殘基可包括但不限於精胺酸、組胺酸、離胺酸、色胺酸、鳥胺酸及5-羥基離胺酸。胺基酸經由連接基團鍵結於疏水基團。
在一些實施例中，經修飾胺基酸為經修飾精胺酸。
在一些實施例中，陽離子劑為非脂質陽離子劑。非脂質陽離子劑之實例包括例如氯化苄烷銨、氯化鯨蠟基吡啶鎓、L-離胺酸單水合物或胺丁三醇。
如本文一般定義，術語「脂質」指具有疏水或兩親特性之小分子。脂質可為天然存在或合成的。脂質類別之實例包括但不限於脂肪、蠟、含固醇之代謝物、維生素、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、醣脂及聚乙醯類以及異戊烯醇脂質。在一些情況下，一些脂質之兩親特性使其在水性介質中形成脂質體、囊泡或膜。 可離子化脂質
如本文所用，術語「可離子化脂質」在此項技術中具有其普通含義且可指包含一或多個帶電部分之脂質。在一些實施例中，可離子化脂質可帶正電或帶負電。舉例而言，可離子化脂質可在較低pH下帶正電，在此情況下，其可稱為「陽離子脂質」。在某些實施例中，可離子化脂質分子可包含胺基，且可稱為可離子化胺基脂質。如本文所用，「帶電部分」為帶有形式電子電荷之化學部分，例如單價(+1或-1)、二價(+2或-2)、三價(+3或-3)等。帶電部分可為陰離子(亦即，帶負電)或陽離子(亦即，帶正電)的。帶正電部分之實例包括胺基(例如一級胺、二級胺及/或三級胺)、銨基、吡啶鎓基、胍基及咪唑鎓基。在一特定實施例中，帶電部分包含胺基。帶負電基團或其前驅物之實例包括羧酸根基、磺酸根基、硫酸根基、膦酸根基、磷酸根基、羥基及其類似基團。在一些情況下，帶電部分之電荷可隨環境條件而變化，例如，pH變化可改變部分之電荷，及/或使部分帶電或不帶電。一般而言，可視需要選擇分子之電荷密度。
應理解，術語「帶電」或「帶電部分」不指分子上之「部分負電荷」或「部分正電荷」。術語「部分負電荷」及「部分正電荷」在此項技術中具有普通含義。當官能基包含如下鍵(該鍵變得極化，使得電子密度拉向鍵之一個原子，從而在原子上產生部分負電荷)時，可產生「部分負電荷」。一般而言，一般技術者能識別可以此方式極化之鍵。
在一些實施例中，可離子化脂質為可離子化胺基脂質。在一個實施例中，可離子化胺基脂質可具有經由連接結構連接之帶正電親水頭部及疏水尾部。
在一些實施例中，本文所述之奈米粒子包含約30 mol%至約60 mol%可離子化脂質。在一些實施例中，奈米粒子包含約40 mol%至約50 mol%可離子化脂質。
本發明之脂質奈米粒子組成物可包括一或多種可離子化(例如可離子化胺基)脂質(例如在生理pH下可具有正電荷或部分正電荷之脂質)。可離子化脂質可選自由以下組成之非限制性群：3-(二(十二烷基)胺基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-呱嗪乙基胺(KL10)、N1-[2-(二(十二烷基)胺基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-呱嗪二乙基胺(KL22)、14,25-二(十三烷基)-15,18,21,24-四氮雜-三十八烷(KL25)、1,2-二亞油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亞油烯基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)、4-(二甲基胺基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亞油烯基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-膽固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-膽固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA (2R))及(2S)-2-({8-[(3β)-膽固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA (2S))。除此等物質之外，可離子化脂質亦可為包括環胺基之脂質。
可離子化脂質亦可為國際公開案第WO 2017/075531 A1號中所揭示之化合物，該案在此以全文引用之方式併入。舉例而言，可離子化胺基脂質包括但不限於：
Figure 02_image245
；
Figure 02_image247
；
Figure 02_image249
； 及其任何組合。
可離子化脂質亦可為國際公開案第WO 2015/199952 A1號中所揭示之化合物，該案在此以全文引用之方式併入。舉例而言，可離子化胺基脂質包括但不限於：
Figure 02_image251
Figure 02_image253
；
Figure 02_image255
Figure 02_image257
Figure 02_image259
Figure 02_image261
Figure 02_image263
Figure 02_image265
Figure 02_image267
Figure 02_image269
及其任何組合。
在一個實施例中，可離子化脂質可選自但不限於以下中所述之可離子化脂質：國際公開案第WO2012040184號、第WO2011153120號、第WO2011149733號、第WO2011090965號、第WO2011043913號、第WO2011022460號、第WO2012061259號、第WO2012054365號、第WO2012044638號、第WO2010080724號、第WO201021865號、第WO2008103276號、第WO2013086373號及第WO2013086354號、美國專利第7,893,302號、第7,404,969號、第8,283,333號及第8,466,122號及美國專利公開案第US20100036115號、第US20120202871號、第US20130064894號、第US20130129785號、第US20130150625號、第US20130178541號及第S20130225836號；該等案每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
在另一實施例中，可離子化脂質可選自但不限於國際公開案第WO2013116126號或第US20130225836號中所述之式A；該等案每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。在另一實施例中，可離子化脂質可選自但不限於國際公開案第WO2008103276號之式CLI-CLXXIX、美國專利第7,893,302號之式CLI-CLXXIX、美國專利第7,404,969號之式CLI-CLXXXXII及美國專利公開案第US20100036115號之式I-VI、美國專利公開案第US20130123338號之式I；該等案之每一者以全文引用之方式併入本文中。
作為非限制性實例，陽離子脂質可選自(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21 Z)-N,N-二甲基二十七碳-18 ,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一碳-22,25-二烯-10-胺、(21 Z ,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、1-[(11Z,14Z)-1-亞二十九碳-11,14-二烯-1-基]吡咯啶、(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十八碳-15-烯-10-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-10-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基環丙基]-N,N-二甲基十九烷-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S ,2R)-2-辛基環丙基]十九烷-10-胺、N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]二十一烷-10-胺,N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基環丙基]甲基}環丙基]十九烷-10-胺,N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十六烷-8-胺、N,N-二甲基-[(1R,2S)-2-十一基環丙基]十四烷-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]庚基}十二烷-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基環丙基]-N,N-二甲基十八烷-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基環丙基]-N,N-二甲基十五烷-6-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十五烷-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙烷-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙烷-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯啶、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}氮雜環丁烷、(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、N,N-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、N,N-二甲基-1-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙烷-2-胺；(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八碳-6,9,12-三烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙烷-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙烷-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙烷-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙烷-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙烷-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙烷-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙烷-2-胺、1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙烷-2-胺、1-[(9Z)-十六碳-9-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙烷-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基環丙基]甲基}環丙基]辛基}氧基)丙烷-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基環丙基)辛基]氧基}-3-(辛氧基)丙烷-2-胺及(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,2-三烯-10-胺或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構物。
可離子化脂質之其他實例包括以下：
Figure 02_image271
在一個實施例中，脂質可為可裂解脂質，諸如國際公開案第WO2012170889號中所述之可裂解脂質，該公開案以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，脂質可藉由此項技術中已知及/或如國際公開案第WO2013086354號中所述之方法合成；其每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。在另一實施例中，脂質可為三烷基陽離子脂質。三烷基陽離子脂質之非限制性實例以及製備及使用三烷基陽離子脂質之方法描述於國際專利公開案第WO2013126803號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可離子化脂質可為式(I)化合物：
Figure 02_image273
(I)， 或其鹽或異構物，其中： R 1係選自由以下組成之群：H、C 5-30烷基、C 5-30烯基、-R*YR''、-YR''、-(CH 2) n(NR 4)R''M’R’及-R''M’R’； R 2及R 3係獨立地選自由以下組成之群：H、C 1-14烷基、C 2-14烯基、-R*YR''、-YR''及-R*OR''，或R 2及R 3連同其所附接之原子一起形成雜環或碳環，其中該碳環視情況經C 6環烷基或C 5烷基取代； R 4係選自由以下組成之群：C 3-6碳環、-(CH 2) nQ、-(CH 2) nCHQR、-CHQR、-CQ(R) 2、-CH(CH 2Q) 2及未經取代之C 1-6烷基，其中該C 3-6碳環視情況經-OH或-OMe取代； 各Q係獨立地選自碳環、雜環、-OR、-O(CH 2) nN(R) 2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX 3、-CX 2H、-CXH 2、-CN、-N(R) 2、-C(O)N(R) 2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) 2R、-N(R)C(O)N(R) 2、-N(R)C(S)N(R) 2、-N(R)R 8、-O(CH 2) nOR、-(CH 2) nOR、-N(R)C(=NR 9)N(R) 2、-N(R)C(=CHR 9)N(R) 2、-OC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) 2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) 2、-N(OR)C(S)N(R) 2、-N(OR)C(=NR 9)N(R) 2、-N(OR)C(=CHR 9)N(R) 2、-C(=NR 9)N(R) 2、-C(=NR 9)R、-C(O)N(R)OR及-C(R)N(R) 2C(O)OR； 或Q係選自：
Figure 02_image275
、
Figure 02_image277
、
Figure 02_image279
、
Figure 02_image281
、
Figure 02_image283
、
Figure 02_image285
、
Figure 02_image287
、
Figure 02_image289
、
Figure 02_image291
、
Figure 02_image293
、
Figure 02_image295
、
Figure 02_image297
及
Figure 02_image299
； 各n係獨立地選自1、2、3、4及5； 各R 5係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R 6係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、-S-S-、芳基及雜芳基； R 7係選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； R 8係選自由C 3-6碳環及雜環組成之群； R 9係選自由以下組成之群：H、CN、NO 2、C 1-6烷基、-OR、-S(O) 2R、-S(O) 2N(R) 2、C 2-6烯基、C 3-6碳環及雜環； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群，其中C 1-3烷基視情況經-OH、-C(O)OH、-OMe、-O-苯甲基取代， 各R’係獨立地選自由C 1-18烷基、C 2-18烯基、-R*YR''、-YR''及H組成之群，其中C 1-18烷基視情況經-OMe取代； 各R''係獨立地選自由H、C 3-14烷基及 C 3-14烯基組成之群； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及 C 2-12烯基組成之群； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各X係獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m選自5、6、7、8、9、10、11、12及13。
在一些實施例中，可離子化脂質可為式(I)化合物：
Figure 02_image273
(I)， 或其鹽或異構物，其中： R 1係選自由C 5-30烷基、C 5-20烯基、-R*YR''、-YR''及-R''M’R’組成之群； R 2及R 3係獨立地選自由H、C 1-14烷基、C 2-14烯基、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群，或R 2及R 3連同其所附接之原子形成雜環或碳環； R 4係選自由以下組成之群：C 3-6碳環、-(CH 2) nQ、-(CH 2) nCHQR、-CHQR、-CQ(R) 2及未經取代C 1-6烷基組成之群，其中Q係選自碳環、雜環、-OR、-O(CH 2) nN(R) 2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX 3、-CX 2H、-CXH 2、-CN、-N(R) 2、-C(O)N(R) 2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) 2R、-N(R)C(O)N(R) 2、-N(R)C(S)N(R) 2、-N(R)R 8、-O(CH 2) nOR、-N(R)C(=NR 9)N(R) 2、-N(R)C(=CHR 9)N(R) 2、-OC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) 2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) 2、-N(OR)C(S)N(R) 2、-N(OR)C(=NR 9)N(R) 2、-N(OR)C(=CHR 9)N(R) 2、-C(=NR 9)N(R) 2、-C(=NR 9)R、-C(O)N(R)OR及-C(R)N(R) 2C(O)OR，且各n係獨立地選自1、2、3、4及5； 各R 5係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R 6係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、-S-S-、芳基及雜芳基； R 7係選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； R 8係選自由C 3-6碳環及雜環組成之群； R 9係選自由以下組成之群：H、CN、NO 2、C 1-6烷基、-OR、-S(O) 2R、-S(O) 2N(R) 2、C 2-6烯基、C 3-6碳環及雜環； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-18烷基、C 2-18烯基、-R*YR''、-YR''及H組成之群； 各R''係獨立地選自由C 3-14烷基及 C 3-14烯基組成之群； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及 C 2-12烯基組成之群； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各X係獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m選自5、6、7、8、9、10、11、12及13。
在一些實施例中，式(I)化合物之子集包括如下化合物，其中當R 4為-(CH 2) nQ、-(CH 2) nCHQR、-CHQR或-CQ(R) 2時，則(i)當n為1、2、3、4或5時，Q不為-N(R) 2，或(ii)當n為1或2時，Q不為5員、6員或7員雜環烷基。
在一些實施例中，式(I)化合物之另一子集包括如下彼等化合物： R 1係選自由C 5-30烷基、C 5-20烯基、-R*YR''、-YR''及-R''M’R’組成之群； R 2及R 3係獨立地選自由H、C 1-14烷基、C 2-14烯基、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群，或R 2及R 3連同其所附接之原子形成雜環或碳環； R 4係選自由以下組成之群：C 3-6碳環、-(CH 2) nQ、-(CH 2) nCHQR、-CHQR、-CQ(R) 2及未經取代之C 1-6烷基，其中Q係選自C 3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子的5至14員雜芳基、-OR、-O(CH 2) nN(R) 2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX 3、-CX 2H、-CXH 2、-CN、-C(O)N(R) 2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) 2R、-N(R)C(O)N(R) 2、-N(R)C(S)N(R) 2、-CRN(R) 2C(O)OR、-N(R)R 8、-O(CH 2) nOR、-N(R)C(=NR 9)N(R) 2、-N(R)C(=CHR 9)N(R) 2、-OC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) 2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) 2、-N(OR)C(S)N(R) 2、-N(OR)C(=NR 9)N(R) 2、-N(OR)C(=CHR 9)N(R) 2、-C(=NR 9)N(R) 2、-C(=NR 9)R、-C(O)N(R)OR及具有一或多個選自N、O及S之雜原子的5至14員雜環烷基，該基團經一或多個選自側氧基(=O)、OH、胺基、單烷基胺基或二烷基胺基及C 1-3烷基之取代基取代，且各n係獨立地選自1、2、3、4及5； 各R 5係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R 6係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、-S-S-、芳基及雜芳基； R 7係選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； R 8係選自由C 3-6碳環及雜環組成之群； R 9係選自由以下組成之群：H、CN、NO 2、C 1-6烷基、-OR、-S(O) 2R、-S(O) 2N(R) 2、C 2-6烯基、C 3-6碳環及雜環； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-18烷基、C 2-18烯基、-R*YR''、-YR''及H組成之群； 各R’’係獨立地選自由C 3-14烷基及C 3-14烯基組成之群； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及C 2-12烯基組成之群； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各X係獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13， 或其鹽或異構物。
在一些實施例中，式(I)化合物之另一子集包括如下彼等化合物： R 1係選自由C 5-30烷基、C 5-20烯基、-R*YR''、-YR''及-R''M’R’組成之群； R 2及R 3係獨立地選自由H、C 1-14烷基、C 2-14烯基、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群，或R 2及R 3連同其所附接之原子形成雜環或碳環； R 4係選自由以下組成之群：C 3-6碳環、-(CH 2) nQ、-(CH 2) nCHQR、-CHQR、-CQ(R) 2及未經取代之C 1-6烷基，其中Q係選自C 3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子的5至14員雜環、-OR、-O(CH 2) nN(R) 2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX 3、-CX 2H、-CXH 2、-CN、-C(O)N(R) 2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) 2R、-N(R)C(O)N(R) 2、-N(R)C(S)N(R) 2、-CRN(R) 2C(O)OR、-N(R)R 8、-O(CH 2) nOR、-N(R)C(=NR 9)N(R) 2、-N(R)C(=CHR 9)N(R) 2、-OC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) 2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) 2、-N(OR)C(S)N(R) 2、-N(OR)C(=NR 9)N(R) 2、-N(OR)C(=CHR 9)N(R) 2、-C(=NR 9)R、-C(O)N(R)OR及-C(=NR 9)N(R) 2，且各n係獨立地選自1、2、3、4及5；且當Q為5至14員雜環，且(i)R 4為-(CH 2) nQ，其中n為1或2，或(ii)R 4為-(CH 2) nCHQR，其中n為1，或(iii)R 4為-CHQR及-CQ(R) 2時，則Q為5至14員雜芳基或8至14員雜環烷基； 各R 5係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R 6係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、-S-S-、芳基及雜芳基； R 7係選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； R 8係選自由C 3-6碳環及雜環組成之群； R 9係選自由以下組成之群：H、CN、NO 2、C 1-6烷基、-OR、-S(O) 2R、-S(O) 2N(R) 2、C 2-6烯基、C 3-6碳環及雜環； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-18烷基、C 2-18烯基、-R*YR''、-YR''及H組成之群； 各R’’係獨立地選自由C 3-14烷基及C 3-14烯基組成之群； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及C 2-12烯基組成之群； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各X係獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13， 或其鹽或異構物。
在一些實施例中，式(I)化合物之另一子集包括如下彼等化合物： R 1係選自由C 5-30烷基、C 5-20烯基、-R*YR''、-YR''及-R''M’R’組成之群； R 2及R 3係獨立地選自由H、C 1-14烷基、C 2-14烯基、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群，或R 2及R 3連同其所附接之原子形成雜環或碳環； R 4係選自由以下組成之群：C 3-6碳環、-(CH 2) nQ、-(CH 2) nCHQR、-CHQR、-CQ(R) 2及未經取代之C 1-6烷基，其中Q係選自C 3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子的5至14員雜芳基、-OR、-O(CH 2) nN(R) 2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX 3、-CX 2H、-CXH 2、-CN、-C(O)N(R) 2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) 2R、-N(R)C(O)N(R) 2、-N(R)C(S)N(R) 2、-CRN(R) 2C(O)OR、-N(R)R 8、-O(CH 2) nOR、-N(R)C(=NR 9)N(R) 2、-N(R)C(=CHR 9)N(R) 2、-OC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) 2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) 2、-N(OR)C(S)N(R) 2、-N(OR)C(=NR 9)N(R) 2、-N(OR)C(=CHR 9)N(R) 2、-C(=NR 9)R、-C(O)N(R)OR及-C(=NR 9)N(R) 2，且各n係獨立地選自1、2、3、4及5； 各R 5係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R 6係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、-S-S-、芳基及雜芳基； R 7係選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； R 8係選自由C 3-6碳環及雜環組成之群； R 9係選自由以下組成之群：H、CN、NO 2、C 1-6烷基、-OR、-S(O) 2R、-S(O) 2N(R) 2、C 2-6烯基、C 3-6碳環及雜環； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-18烷基、C 2-18烯基、-R*YR''、-YR''及H組成之群； 各R’’係獨立地選自由C 3-14烷基及C 3-14烯基組成之群； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及C 2-12烯基組成之群； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各X係獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13， 或其鹽或異構物。
在一些實施例中，式(I)化合物之另一子集包括如下彼等化合物： R 1係選自由C 5-30烷基、C 5-20烯基、-R*YR''、-YR''及-R''M’R’組成之群； R 2及R 3係獨立地選自由H、C 2-14烷基、C 2-14烯基、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群，或R 2及R 3連同其所附接之原子形成雜環或碳環； R 4為-(CH 2) nQ或-(CH 2) nCHQR，其中Q為-N(R) 2，且n係選自3、4及5； 各R 5係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R 6係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、-S-S-、芳基及雜芳基； R 7係選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-18烷基、C 2-18烯基、-R*YR''、-YR''及H組成之群； 各R’’係獨立地選自由C 3-14烷基及C 3-14烯基組成之群； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及C 1-12烯基組成之群； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各X係獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13， 或其鹽或異構物。
在一些實施例中，式(I)化合物之另一子集包括如下彼等化合物： R 1係選自由C 5-30烷基、C 5-20烯基、-R*YR''、-YR''及-R''M’R’組成之群； R 2及R 3係獨立地選自由C 1-14烷基、C 2-14烯基、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群，或R 2及R 3連同其所附接之原子形成雜環或碳環； R 4係選自由-(CH 2) nQ、-(CH 2) nCHQR、-CHQR及-CQ(R) 2組成之群，其中Q為-N(R) 2，且n係選自1、2、3、4及5； 各R 5係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R 6係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、-S-S-、芳基及雜芳基； R 7係選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基、C 2-3烯基及H組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-18烷基、C 2-18烯基、-R*YR''、-YR''及H組成之群； 各R’’係獨立地選自由C 3-14烷基及C 3-14烯基組成之群； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及C 1-12烯基組成之群； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各X係獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13， 或其鹽或異構物。
在一些實施例中，式(I)化合物之子集包括式(IA)之彼等化合物：
Figure 02_image302
(IA)， 或其鹽或異構物，其中l係選自1、2、3、4及5；m係選自5、6、7、8及9；M 1為鍵或M’；R 4為未經取代之C 1-3烷基或-(CH 2) nQ，其中Q為OH、-NHC(S)N(R) 2、-NHC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) 2R、-N(R)R 8、-NHC(=NR 9)N(R) 2、-NHC(=CHR 9)N(R) 2、-OC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)OR、雜芳基或雜環烷基；M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基及雜芳基；且R 2及R 3係獨立地選自由H、C 1-14烷基及C 2-14烯基組成之群。
在一些實施例中，式(I)化合物之子集包括式(II)之彼等化合物：
Figure 02_image304
(II)或其鹽或異構物，其中l係選自1、2、3、4及5；M 1為鍵或M’；R 4為未經取代之C 1-3烷基或-(CH 2) nQ，其中n為2、3或4，且Q為OH、-NHC(S)N(R) 2、-NHC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) 2R、-N(R)R 8、-NHC(=NR 9)N(R) 2、-NHC(=CHR 9)N(R) 2、-OC(O)N(R) 2、-N(R)C(O)OR、雜芳基或雜環烷基；M及M’係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基及雜芳基；且R 2及R 3係獨立地選自由H、C 1-14烷基及C 2-14烯基組成之群。
在一些實施例中，式(I)化合物之子集包括式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)之彼等化合物：
Figure 02_image306
(IIa)、
Figure 02_image308
(IIb)、
Figure 02_image310
(IIc)或
Figure 02_image312
(IIe)， 或其鹽或異構物，其中R 4如本文所述。
在一些實施例中，式(I)化合物之子集包括式(IId)之彼等化合物：
Figure 02_image314
(IId)， 或其鹽或異構物，其中n為2、3或4；且m、R’、R''及R 2至R 6如本文所述。舉例而言，R 2及R 3中之每一者可獨立地選自由C 5-14烷基及C 5-14烯基組成之群。
在一些實施例中，式(I)化合物係選自由以下組成之群：
Figure 02_image316
(化合物1)、
Figure 02_image318
(化合物2)、
Figure 02_image320
(化合物3)、
Figure 02_image322
(化合物4)、
Figure 02_image324
(化合物5)、
Figure 02_image326
(化合物6)、
Figure 02_image328
(化合物7)、
Figure 02_image330
(化合物8)、
Figure 02_image332
(化合物9)、
Figure 02_image334
(化合物10)、
Figure 02_image336
(化合物11)、
Figure 02_image338
(化合物12)、
Figure 02_image340
(化合物13)、
Figure 02_image342
(化合物14)、
Figure 02_image344
(化合物15)、
Figure 02_image346
(化合物16)、
Figure 02_image348
(化合物17)、
Figure 02_image350
(化合物230)、
Figure 02_image352
(化合物231)、
Figure 02_image354
(化合物18)、
Figure 02_image356
(化合物19)、
Figure 02_image358
(化合物20)、
Figure 02_image360
(化合物21)、
Figure 02_image362
(化合物22)、
Figure 02_image364
(化合物23)、
Figure 02_image366
(化合物24)、
Figure 02_image368
(化合物25)、
Figure 02_image370
(化合物26)、
Figure 02_image372
(化合物27)、
Figure 02_image374
(化合物28)、
Figure 02_image376
(化合物29)、
Figure 02_image378
(化合物30)、
Figure 02_image380
(化合物31)、
Figure 02_image382
(化合物32)、
Figure 02_image384
(化合物33)、
Figure 02_image386
(化合物34)、
Figure 02_image388
(化合物35)、
Figure 02_image390
(化合物36)、
Figure 02_image392
(化合物37)、
Figure 02_image394
(化合物38)、
Figure 02_image396
(化合物39)、
Figure 02_image398
(化合物40)、
Figure 02_image400
(化合物41)、
Figure 02_image402
(化合物42)、
Figure 02_image404
(化合物43)、
Figure 02_image406
(化合物44)、
Figure 02_image408
(化合物45)、
Figure 02_image410
(化合物46)、
Figure 02_image412
(化合物47)、
Figure 02_image414
(化合物48)、
Figure 02_image416
(化合物49)、
Figure 02_image418
(化合物50)、
Figure 02_image420
(化合物51)、
Figure 02_image422
(化合物52)、
Figure 02_image424
(化合物53)、
Figure 02_image426
(化合物54)、
Figure 02_image428
(化合物55)、
Figure 02_image430
(化合物56)、
Figure 02_image432
(化合物57)、
Figure 02_image434
(化合物58)、
Figure 02_image436
(化合物59)、
Figure 02_image438
(化合物60)及
Figure 02_image440
(化合物61)。
在另一實施例中，式(I)化合物係選自由以下組成之群：
Figure 02_image442
(化合物62)、
Figure 02_image444
(化合物63)及
Figure 02_image446
(化合物64)。
在一些實施例中，式(I)化合物係選自由以下組成之群：
Figure 02_image448
(化合物65)、
Figure 02_image450
(化合物66)、
Figure 02_image452
(化合物67)、
Figure 02_image454
(化合物68)、
Figure 02_image456
(化合物69)、
Figure 02_image458
(化合物70)、
Figure 02_image460
(化合物71)、
Figure 02_image462
(化合物72)、
Figure 02_image464
(化合物73)、
Figure 02_image466
(化合物74)、
Figure 02_image468
(化合物75)、
Figure 02_image470
(化合物76)、
Figure 02_image472
(化合物77)、
Figure 02_image474
(化合物78)、
Figure 02_image476
(化合物79)、
Figure 02_image478
(化合物80)、
Figure 02_image480
(化合物81)、
Figure 02_image482
(化合物82)、
Figure 02_image484
(化合物83)、
Figure 02_image486
(化合物84)、
Figure 02_image488
(化合物85)、
Figure 02_image490
(化合物86)、
Figure 02_image492
(化合物87)、
Figure 02_image494
(化合物88)、
Figure 02_image496
(化合物89)、
Figure 02_image498
(化合物90)、
Figure 02_image500
(化合物91)、
Figure 02_image502
(化合物92)、
Figure 02_image504
(化合物93)、
Figure 02_image506
(化合物94)、
Figure 02_image508
(化合物95)、
Figure 02_image510
(化合物96)、
Figure 02_image512
(化合物97)、
Figure 02_image514
(化合物98)、
Figure 02_image516
(化合物99)、
Figure 02_image518
(化合物100)、
Figure 02_image520
(化合物101)、
Figure 02_image522
(化合物102)、
Figure 02_image524
(化合物103)、
Figure 02_image526
(化合物104)、
Figure 02_image528
(化合物105)、
Figure 02_image530
(化合物106)、
Figure 02_image532
(化合物107)、
Figure 02_image534
(化合物108)、
Figure 02_image536
(化合物109)、
Figure 02_image538
(化合物110)、
Figure 02_image540
(化合物111)、
Figure 02_image542
(化合物112)、
Figure 02_image544
(化合物113)、
Figure 02_image546
(化合物114)、
Figure 02_image548
(化合物115)、
Figure 02_image550
(化合物116)、
Figure 02_image552
(化合物117)、
Figure 02_image554
(化合物118)、
Figure 02_image556
(化合物119)、
Figure 02_image558
(化合物120)、
Figure 02_image560
(化合物121)、
Figure 02_image562
(化合物122)、
Figure 02_image564
(化合物123)、
Figure 02_image566
(化合物124)、
Figure 02_image568
(化合物125)、
Figure 02_image570
(化合物126)、
Figure 02_image572
(化合物127)、
Figure 02_image574
(化合物128)、
Figure 02_image576
(化合物129)、
Figure 02_image578
(化合物130)、
Figure 02_image580
(化合物131)、
Figure 02_image582
(化合物132)、
Figure 02_image584
(化合物133)、
Figure 02_image586
(化合物134)、
Figure 02_image588
(化合物135)、
Figure 02_image590
(化合物136)、
Figure 02_image592
(化合物137)、
Figure 02_image594
(化合物138)、
Figure 02_image596
(化合物139)、
Figure 02_image598
(化合物140)、
Figure 02_image600
(化合物141)、
Figure 02_image602
(化合物142)、
Figure 02_image604
(化合物143)、
Figure 02_image606
(化合物144)、
Figure 02_image608
(化合物145)、
Figure 02_image610
(化合物146)、
Figure 02_image612
(化合物147)、
Figure 02_image614
(化合物148)、
Figure 02_image616
(化合物149)、
Figure 02_image618
(化合物150)、
Figure 02_image620
(化合物151)、
Figure 02_image622
(化合物152)、
Figure 02_image624
(化合物153)、
Figure 02_image626
(化合物154)、
Figure 02_image628
(化合物155)、
Figure 02_image630
(化合物156)、
Figure 02_image632
(化合物157)、
Figure 02_image634
(化合物158)、
Figure 02_image636
(化合物159)、
Figure 02_image638
(化合物160)、
Figure 02_image640
(化合物161)、
Figure 02_image642
(化合物162)、
Figure 02_image644
(化合物163)、
Figure 02_image646
(化合物164)、
Figure 02_image648
(化合物165)、
Figure 02_image650
(化合物166)、
Figure 02_image652
(化合物167)、
Figure 02_image654
(化合物168)、
Figure 02_image656
(化合物169)、
Figure 02_image658
(化合物170)、
Figure 02_image660
(化合物171)、
Figure 02_image662
(化合物172)、
Figure 02_image664
(化合物173)、
Figure 02_image666
(化合物174)、
Figure 02_image668
(化合物175)、
Figure 02_image670
(化合物176)、
Figure 02_image672
(化合物177)、
Figure 02_image674
(化合物178)、
Figure 02_image676
(化合物179)、
Figure 02_image678
(化合物180)、
Figure 02_image680
(化合物181)、
Figure 02_image682
(化合物182)、
Figure 02_image684
(化合物183)、
Figure 02_image686
(化合物184)、
Figure 02_image688
(化合物185)、
Figure 02_image690
(化合物186)、
Figure 02_image692
(化合物187)、
Figure 02_image694
(化合物188)、
Figure 02_image696
(化合物189)、
Figure 02_image698
(化合物190)、
Figure 02_image700
(化合物191)、
Figure 02_image702
(化合物192)、
Figure 02_image704
(化合物193)、
Figure 02_image706
(化合物194)、
Figure 02_image708
(化合物195)、
Figure 02_image710
(化合物196)、
Figure 02_image712
(化合物197)、
Figure 02_image714
(化合物198)、
Figure 02_image716
(化合物199)、
Figure 02_image718
(化合物200)、
Figure 02_image720
(化合物201)、
Figure 02_image722
(化合物202)、
Figure 02_image724
(化合物203)、
Figure 02_image726
(化合物204)、
Figure 02_image728
(化合物205)、
Figure 02_image730
(化合物206)、
Figure 02_image732
(化合物207)、
Figure 02_image734
(化合物208)、
Figure 02_image736
(化合物209)、
Figure 02_image738
(化合物210)、
Figure 02_image740
(化合物211)、
Figure 02_image742
(化合物212)、
Figure 02_image744
(化合物213)、
Figure 02_image746
(化合物214)、
Figure 02_image748
(化合物215)、
Figure 02_image750
(化合物216)、
Figure 02_image752
(化合物217)、
Figure 02_image754
(化合物218)、
Figure 02_image756
(化合物219)、
Figure 02_image758
(化合物220)、
Figure 02_image760
(化合物221)、
Figure 02_image762
(化合物222)、
Figure 02_image764
(化合物223)、
Figure 02_image766
(化合物224)、
Figure 02_image768
(化合物225)、
Figure 02_image770
(化合物226)、
Figure 02_image772
(化合物227)、
Figure 02_image774
(化合物228)、
Figure 02_image776
(化合物229)、
Figure 02_image778
(化合物232)，及其鹽及異構物。
在一些實施例中，可離子化脂質為化合物429：
Figure 02_image780
(化合物429)或其鹽。
在一些實施例中，可離子化脂質為化合物18：
Figure 02_image354
(化合物18)或其鹽。
在一些實施例中，脂質奈米粒子組成物包括脂質組分，該脂質組分包含如本文所述之化合物(例如根據式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物)。
在一些實施例中，LNP可由包括中心呱嗪部分之可離子化脂質構成。該等LNP有利地可由可離子化脂質、磷脂及PEG脂質組成，且可視情況包括結構脂質或可無結構脂質。在一些實施例中，磷脂為DSPC或DOP。
本文所述之包括中心呱嗪部分之可離子化脂質可有利地用於脂質奈米粒子組成物中以向哺乳動物細胞或器官遞送治療劑及/或防治劑。舉例而言，本文所述之脂質幾乎無免疫原性。舉例而言，與參考脂質(例如MC3、KC2或DLinDMA)相比，本文揭示之脂質化合物具有較低免疫原性。舉例而言，與包含參考脂質(例如MC3，KC2或DLinDMA)及相同之治療或防治劑之相應調配物相比，包含本文揭示之脂質及治療或防治劑之調配物具有增加之治療指數。
脂質可為式(III)化合物，
Figure 02_image783
(III)， 或其鹽或異構物，其中 環A為
Figure 02_image785
或
Figure 02_image787
； t為1或2； A 1及A 2各自獨立地選自CH或N； Z為CH 2或不存在，其中當Z為CH 2時，虛線(1)及(2)各自表示單鍵；且當Z不存在時，虛線(1)及(2)均不存在； R 1、R 2、R 3、R 4及R 5係獨立地選自由C 5-20烷基、C 5-20烯基、-R''MR’、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群； 各M係獨立地選自由-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、芳基及雜芳基組成之群； X 1、X 2及X 3係獨立地選自由以下組成之群：鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)-、-C(O)O-CH 2-、-OC(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)O-、-CH 2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-及-CH(SH)-； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及C 2-12烯基組成之群； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基及C 3-6碳環組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-12烷基、C 2-12烯基及H組成之群；且 各R’’係獨立地選自由C 3-12烷基及C 3-12烯基組成之群， 其中當環A為
Figure 02_image789
時，則 i)        X 1、X 2及X 3中之至少一者不為-CH 2-；及/或 ii)       R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至少一者為-R''MR’。
在一些實施例中，該化合物具有式(IIIa1)-(IIIa6)中之任一者：
Figure 02_image791
(IIIa1)、
Figure 02_image793
(IIIa2)、
Figure 02_image795
(IIIa3)、
Figure 02_image797
(IIIa4)、
Figure 02_image799
(IIIa5)或
Figure 02_image801
(IIIa6)。
式(III)或(IIIa1)-(IIIa6)中之任一者的化合物在適用時包括以下特徵中之一或多者。
在一些實施例中，環A為
Figure 02_image785
。
在一些實施例中，環A為
Figure 02_image804
或
Figure 02_image806
。
在一些實施例中，環A為
Figure 02_image789
。
在一些實施例中，環A為
Figure 02_image787
。
在一些實施例中，環A為
Figure 02_image810
、
Figure 02_image812
或
Figure 02_image814
。
在一些實施例中，環A為
Figure 02_image810
或
Figure 02_image812
，其中環，在此情況下N原子與X 2連接。
在一些實施例中，Z為CH 2。
在一些實施例中，Z不存在。
在一些實施例中，A 1及A 2中之至少一者為N。
在一些實施例中，A 1及A 2中之每一者為N。
在一些實施例中，A 1及A 2中之每一者為CH。
在一些實施例中，A 1為N，且A 2為CH。
在一些實施例中，A 1為CH，且A 2為N。
在一些實施例中，X 1、X 2及X 3中之至少一者不為-CH 2-。舉例而言，在某些實施例中，X 1不為-CH 2-。在一些實施例中，X 1、X 2及X 3中之至少一者為-C(O)-。
在一些實施例中，X 2為-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)-、-C(O)O-CH 2-、-OC(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)O-或-CH 2-OC(O)-。
在一些實施例中，X 3為-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)-、-C(O)O-CH 2-、-OC(O)-CH 2-、-CH2-C(O)O-或-CH 2-OC(O)-。在其他實施例中，X 3為-CH 2-。
在一些實施例中，X 3為鍵或-(CH 2) 2-。
在一些實施例中，R 1及R 2相同。在某些實施例中，R 1、R 2及R 3相同。在一些實施例中，R 4及R 5相同。在某些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5相同。
在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至少一者為-R''MR’。在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至多一者為-R''MR’。舉例而言，例如，R 1、R 2及R 3中之至少一者可為-R''MR’，及/或R 4及R 5中之至少一者為-R''MR'。在某些實施例中，至少一個M為-C(O)O-。在一些實施例中，各M為-C(O)O-。在一些實施例中，至少一個M為-OC(O)-。在一些實施例中，各M為-OC(O)-。在一些實施例中，至少一個M為-OC(O)O-。在一些實施例中，各M為-OC(O)O-。在一些實施例中，至少一個R''為C 3烷基。在某些實施例中，各R’’為C 3烷基。在一些實施例中，至少一個R’’為C 5烷基。在某些實施例中，各R’’為C 5烷基。在一些實施例中，至少一個R’’為C 6烷基。在某些實施例中，各R’’為C 6烷基。在一些實施例中，至少一個R’’為C 7烷基。在某些實施例中，各R’’為C 7烷基。在一些實施例中，至少一個R’為C 5烷基。在某些實施例中，各R’為C 5烷基。在其他實施例中，至少一個R’為C 1烷基。在某些實施例中，各R’為C 1烷基。在一些實施例中，至少一個R’為C 2烷基。在某些實施例中，各R’為C 2烷基。
在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至少一者為C 12烷基。在某些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之每一者為C 12烷基。
在某些實施例中，該化合物係選自由以下組成之群：
Figure 02_image818
(化合物233)、
Figure 02_image820
(化合物234)、
Figure 02_image822
(化合物235)、
Figure 02_image824
(化合物236)、
Figure 02_image826
(化合物237)、
Figure 02_image828
(化合物238)、
Figure 02_image830
(化合物239)、
Figure 02_image832
(化合物240)、
Figure 02_image834
(化合物241)、
Figure 02_image836
(化合物242)、
Figure 02_image838
(化合物243)、
Figure 02_image840
(化合物244)、
Figure 02_image842
(化合物245)、
Figure 02_image844
(化合物246)、
Figure 02_image846
(化合物247)、
Figure 02_image848
(化合物248)、
Figure 02_image850
(化合物274)、
Figure 02_image852
(化合物275)、
Figure 02_image854
(化合物276)、
Figure 02_image856
(化合物277)、
Figure 02_image858
(化合物278)、
Figure 02_image860
(化合物279)、
Figure 02_image862
(化合物280)、
Figure 02_image864
(化合物281)、
Figure 02_image866
(化合物282)、
Figure 02_image868
(化合物283)、
Figure 02_image870
(化合物284)、
Figure 02_image872
(化合物285)、
Figure 02_image874
(化合物286)、
Figure 02_image876
(化合物287)、
Figure 02_image878
(化合物288)、
Figure 02_image880
(化合物289)、
Figure 02_image882
(化合物290)、
Figure 02_image884
(化合物291)、
Figure 02_image886
(化合物292)、
Figure 02_image888
(化合物293)、
Figure 02_image890
(化合物294)、
Figure 02_image892
(化合物295)、
Figure 02_image894
(化合物296)、
Figure 02_image896
(化合物297)、
Figure 02_image898
(化合物298)、
Figure 02_image900
(化合物300)、
Figure 02_image902
(化合物301)、
Figure 02_image904
(化合物302)、
Figure 02_image906
(化合物303)、
Figure 02_image908
(化合物304)、
Figure 02_image910
(化合物305)、
Figure 02_image912
(化合物306)、
Figure 02_image914
(化合物307)、
Figure 02_image916
(化合物308)、
Figure 02_image918
(化合物310)、
Figure 02_image920
(化合物311)、
Figure 02_image922
(化合物312)、
Figure 02_image924
(化合物313)、
Figure 02_image926
(化合物314)、
Figure 02_image928
(化合物315)、
Figure 02_image930
(化合物316)、
Figure 02_image932
(化合物317)、
Figure 02_image934
(化合物318)、
Figure 02_image936
(化合物319)、
Figure 02_image938
(化合物320)、
Figure 02_image940
(化合物321)、
Figure 02_image942
(化合物322)、
Figure 02_image944
(化合物323)、
Figure 02_image946
(化合物324)、
Figure 02_image948
(化合物325)、
Figure 02_image950
(化合物326)、
Figure 02_image952
(化合物327)、
Figure 02_image954
(化合物328)、
Figure 02_image956
(化合物329)、
Figure 02_image958
(化合物330)、
Figure 02_image960
(化合物331)、
Figure 02_image962
(化合物332)、
Figure 02_image964
(化合物333)、
Figure 02_image966
(化合物334)、
Figure 02_image968
(化合物335)、
Figure 02_image970
(化合物336)、
Figure 02_image972
(化合物337)、
Figure 02_image974
(化合物338)、
Figure 02_image976
(化合物339)、
Figure 02_image978
(化合物340)及
Figure 02_image980
(化合物341)。
在其他實施例中，脂質具有式(IV)
Figure 02_image982
(IV)， 或其鹽或異構物，其中 A 1及A 2各自獨立地選自CH或N，且A 1及A 2中之至少一者為N； Z為CH 2或不存在，其中當Z為CH 2時，虛線(1)及(2)各自表示單鍵；且當Z不存在時，虛線(1)及(2)均不存在； R 1、R 2、R 3、R 4及R 5係獨立地選自由C 6-20烷基及C 6-20烯基組成之群； 其中當環A為
Figure 02_image789
時，則 i)        R 1、R 2、R 3、R 4及R 5相同，其中R 1不為C 12烷基、C 18烷基或C 18烯基； ii)       R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中僅一者係選自C 6-20烯基； ⅲ)      R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至少一者具有與R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中至少另一者不同數量之碳原子； iv)      R 1、R 2及R 3係選自C 6-20烯基，且R 4及R 5係選自C 6-20烷基；或 v)       R 1、R 2及R 3係選自C 6-20烷基，且R 4及R 5係選自C 6-20烯基。
在一些實施例中，該化合物具有式(IVa)：
Figure 02_image985
(IVa)。
式(IV)或(IVa)之化合物在適用時包括以下特徵中之一或多者。
在一些實施例中，Z為CH 2。
在一些實施例中，Z不存在。
在一些實施例中，A 1及A 2中之至少一者為N。
在一些實施例中，A 1及A 2中之每一者為N。
在一些實施例中，A 1及A 2中之每一者為CH。
在一些實施例中，A 1為N，且A 2為CH。
在一些實施例中，A 1為CH，且A 2為N。
在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5相同，且不為C 12烷基、C 18烷基或C 18烯基。在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5相同且為C 9烷基或C 14烷基。
在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中僅一者係選自C 6-20烯基。在某些該等實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5具有相同數量之碳原子。在一些實施例中，R 4係選自C 5-20烯基。舉例而言，R 4可為C 12烯基或C 18烯基。
在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至少一者具有與R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中至少另一者不同數量之碳原子。
在某些實施例中，R 1、R 2及R 3係選自C 6-20烯基，且R 4及R 5係選自C 6-20烷基。在其他實施例中，R 1、R 2及R 3係選自C 6-20烷基，且R 4及R 5係選自C 6-20烯基。在一些實施例中，R 1、R 2及R 3具有相同數量之碳原子，及/或R 4及R 5具有相同數量之碳原子。舉例而言，R 1、R 2及R 3，或R 4及R 5可具有6、8、9、12、14或18個碳原子。在一些實施例中，R 1、R 2及R 3，或R 4及R 5為C 18烯基(例如亞麻基)。在一些實施例中，R 1、R 2及R 3，或R 4及R 5為包括6、8、9、12或14個碳原子之烷基。
在一些實施例中，R 1具有與R 2、R 3、R 4及R 5不同數量之碳原子。在其他實施例中，R3具有與R 1、R 2、R 4及R 5不同數量之碳原子。在其他實施例中，R4具有與R 1、R 2、R 3及R 5不同數量之碳原子。
在一些實施例中，該化合物係選自由以下組成之群：
Figure 02_image987
(化合物249)、
Figure 02_image989
(化合物250)、
Figure 02_image991
(化合物251)、
Figure 02_image993
(化合物252)、
Figure 02_image995
(化合物253)、
Figure 02_image997
(化合物254)、
Figure 02_image999
(化合物255)、
Figure 02_image1001
(化合物256)、
Figure 02_image1003
(化合物257)、
Figure 02_image1005
(化合物258)、
Figure 02_image1007
(化合物259)、
Figure 02_image1009
(化合物260)、
Figure 02_image1011
(化合物261)、
Figure 02_image1013
(化合物262)、
Figure 02_image1015
(化合物263)、
Figure 02_image1017
(化合物264)、
Figure 02_image1019
(化合物265)及
Figure 02_image1021
(化合物266)。
在其他實施例中，化合物具有式(V)
Figure 02_image1023
(V)， 或其鹽或異構物，其中 A 3為CH或N； A 4為CH 2或NH；且A 3及A 4中之至少一者為N或NH； Z為CH 2或不存在，其中當Z為CH 2時，虛線(1)及(2)各自表示單鍵；且當Z不存在時，虛線(1)及(2)均不存在； R 1、R 2及R 3係獨立地選自由C 5-20烷基、C 5-20烯基、-R''MR’、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群； 各M係獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、芳基及雜芳基； X 1及X 2係獨立地選自由以下組成之群：-CH 2-、-(CH 2) 2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)-、-C(O)O-CH 2-、-OC(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)O-、-CH 2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-及-CH(SH)-； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及C 2-12烯基組成之群； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基及C 3-6碳環組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-12烷基、C 2-12烯基及H組成之群；且 各R’’係獨立地選自由C 3-12烷基及C 3-12烯基組成之群。
在一些實施例中，該化合物具有式(Va)：
Figure 02_image1025
(Va)。
式(V)或(Va)之化合物在適用時包括以下特徵中之一或多者。
在一些實施例中，Z為CH 2。
在一些實施例中，Z不存在。
在一些實施例中，A 3及A 4中之至少一者為N或NH。
在一些實施例中，A 3為N，且A 4為NH。
在一些實施例中，A 3為N，且A 4為CH 2。
在一些實施例中，A 3為CH，且A 4為NH。
在一些實施例中，X 1及X 2中之至少一者不為-CH 2-。舉例而言，在某些實施例中，X 1不為-CH 2-。在一些實施例中，X 1及X 2中之至少一者為-C(O)-。
在一些實施例中，X 2為-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)-、-C(O)O-CH 2-、-OC(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)O-或-CH 2-OC(O)-。
在一些實施例中，R 1、R 2及R 3係獨立地選自由C 5-20烷基及C 5-20烯基組成之群。在一些實施例中，R 1、R 2及R 3相同。在某些實施例中，R 1、R 2及R 3為C 6、C 9、C 12或C 14烷基。在其他實施例中，R 1、R 2及R 3為C 18烯基。舉例而言，R 1、R 2及R 3可為亞麻基。
在一些實施例中，該化合物係選自由以下組成之群：
Figure 02_image1027
(化合物267)、
Figure 02_image1029
(化合物268)、
Figure 02_image1031
(化合物269)、
Figure 02_image1033
(化合物270)、
Figure 02_image1035
(化合物271)、
Figure 02_image1037
(化合物272)、
Figure 02_image1039
(化合物273)及
Figure 02_image1041
(化合物309)。
在另一態樣中，本揭示案提供一種根據式(VI)之化合物：
Figure 02_image1043
(VI)， 或其鹽或異構物，其中 A 6及A 7各自獨立地選自CH或N，其中A 6及A 7中之至少一者為N； Z為CH 2或不存在，其中當Z為CH 2時，虛線(1)及(2)各自表示單鍵；且當Z不存在時，虛線(1)及(2)均不存在； X 4及X 5係獨立地選自由以下組成之群：-CH 2-、-(CH 2) 2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)-、-C(O)O-CH 2-、-OC(O)-CH 2-、-CH 2-C(O)O-、-CH 2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-及-CH(SH)-； R 1、R 2、R 3、R 4及R 5係獨立地選自由C 5-20烷基、C 5-20烯基、-R''MR’、-R*YR''、-YR''及-R*OR''組成之群； 各M係獨立地選自由-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) 2-、芳基及雜芳基組成之群； 各Y獨立地為C 3-6碳環； 各R*係獨立地選自由C 1-12烷基及C 2-12烯基組成之群； 各R係獨立地選自由C 1-3烷基及C 3-6碳環組成之群； 各R’係獨立地選自由C 1-12烷基、C 2-12烯基及H組成之群；且 各R’’係獨立地選自由C 3-12烷基及C 3-12烯基組成之群。
在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5各自獨立地選自由C 6-20烷基及C 6-20烯基組成之群。
在一些實施例中，R 1及R 2相同。在某些實施例中，R 1、R2及R3相同。在一些實施例中，R 4及R 5相同。在某些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5相同。
在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至少一者為C 9-12烷基。在某些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5 中之每一者獨立地為C 9、C 12或C 14烷基。在某些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之每一者為C 9烷基。
在一些實施例中，A 6為N，且A 7為N。在一些實施例中，A 6為CH，且A 7為N。
在一些實施例中，X 4為-CH 2-，且X 5為-C(O)-。在一些實施例中，X 4及X 5為-C(O)-。
在一些實施例中，當A 6為N且A 7為N時，X 4及X 5中之至少一者不為-CH 2-，例如X 4及X 5中之至少一者為-C(O)-。在一些實施例中，當A 6為N且A 7為N時，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至少一者為-R''MR’。
在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 4及R 5中之至少一者不為-R''MR’。
在一些實施例中，化合物為
Figure 02_image1045
(化合物299)。
在一實施例中，該化合物具有下式：
Figure 02_image1047
(化合物342)。 PEG 及經 PEG 修飾之脂質
一般而言，本文所述之各式之一些其他脂質組分(例如PEG脂質)可如2016年12月10日提出申請之標題為「Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents」的國際專利申請案第PCT/US2016/000129號中所述般合成，該案以全文引用之方式併入。
脂質奈米粒子組成物之脂質組分可包括一或多種包含聚乙二醇之分子，諸如PEG或經PEG修飾之脂質。該等物質可替代地稱為PEG化脂質。 PEG脂質係經聚乙二醇修飾之脂質。PEG脂質可選自包括經PEG修飾之磷脂醯乙醇胺、經PEG修飾之磷脂酸、經PEG修飾之神經醯胺、經PEG修飾之二烷基胺、經PEG修飾之二醯基甘油、經PEG修飾之二烷基甘油及其混合物的非限制性群。舉例而言，PEG脂質可為PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂質。在一些實施例中，PEG脂質為DMG-PEG 2k或化合物428。
在一些實施例中，經PEG修飾之脂質係PEG DMG之經修飾形式。PEG-DMG具有以下結構：
Figure 02_image1049
。
在一些實施例中，本文所述之奈米粒子包含約1 mol%至約5 mol% PEG-脂質。在一些實施例中，奈米粒子包含約1 mol%至約2.5 mol% PEG-脂質。
在一個實施例中，可用於本發明之PEG脂質可為描述於國際公開案第WO2012099755號中的PEG化脂質，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。本文所述之此等例示性PEG脂質中的任一者均可經修飾以在PEG鏈上包含羥基。在某些實施例中，PEG脂質為PEG-OH脂質。如本文一般所定義，「PEG-OH脂質」(本文中亦稱作「羥基-PEG化脂質」)係在脂質上具有一或多個羥基(-OH)之PEG化脂質。在某些實施例中，PEG-OH脂質在PEG鏈上包括一或多個羥基。在某些實施例中，PEG-OH或羥基-PEG化脂質在PEG鏈之末端包含-OH基團。各可能性代表本發明之一各別實施例。
在某些實施例中，可用於本發明之PEG脂質為式( VII)化合物。本文提供式( VII)化合物：
Figure 02_image1051
( VII)， 或其鹽，其中： R 3為-OR O； R O為氫、視情況經取代之烷基或氧保護基； r為1至100之整數，包括1及100； L 1為視情況經取代之C 1-10伸烷基，其中該視情況經取代之C 1-10伸烷基中之至少一個亞甲基獨立地經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-O-、-N(R N)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-或-NR NC(O)N(R N)-； D為藉由點擊化學獲得之部分或在生理條件下可裂解之部分； m為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； A具有下式：
Figure 02_image1053
或
Figure 02_image1055
； L 2之各情況獨立地為鍵或視情況經取代之C 1-6伸烷基，其中該視情況經取代之C 1-6伸烷基的一個亞甲基單元視情況經以下置換：-O-、-N(R N)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-或-NR NC(O)N(R N)-； R 2之各情況獨立地為視情況經取代之C 1-30烷基、視情況經取代之C 1-30烯基或視情況經取代之C 1-30炔基；視情況，其中R 2之一或多個亞甲基單元獨立地經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-NR NC(O)N(R N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR N)-、-C(=NR N)N(R N)-、-NR NC(=NR N)-、-NR NC(=NR N)N(R N)-、-C(S)-、-C(S)N(R N)-、-NR NC(S)-、-NR NC(S)N(R N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) 2-、-S(O) 2O-、-OS(O) 2O-、-N(R N)S(O)-、-S(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)N(R N)-、-OS(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)O-、-S(O) 2-、-N(R N)S(O) 2-、-S(O) 2N(R N)-、-N(R N)S(O) 2N(R N)-、-OS(O) 2N(R N)-或-N(R N)S(O) 2O-； R N之各情況獨立地為氫、視情況經取代之烷基或氮保護基； 環B為視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；且 p為1或2。
在某些實施例中，式( VII)化合物為PEG-OH脂質( 亦即，R 3為-OR O，且R O為氫)。在某些實施例中，式( VII)化合物具有式( VII-OH)：
Figure 02_image1057
( VII-OH)， 或其鹽。
在某些實施例中，D為藉由點擊化學獲得之部分( 例如三唑)。在某些實施例中，式( VII)化合物具有式( VII-a-1)或( VII-a-2)：
Figure 02_image1059
或
Figure 02_image1061
( VII-a-1)                    ( VII-a-2)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1063
、
Figure 02_image1065
、
Figure 02_image1067
、
Figure 02_image1069
， 或其鹽，其中 s為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1071
、
Figure 02_image1073
、
Figure 02_image1075
、
Figure 02_image1077
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1079
、
Figure 02_image1081
、
Figure 02_image1083
、
Figure 02_image1085
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有下式中之一者，其中r為1-100：
Figure 02_image1087
(化合物415)、
Figure 02_image1089
(化合物416)、
Figure 02_image1091
(化合物417)、
Figure 02_image1093
(化合物418)， 或其鹽。
在某些實施例中，D為在生理條件下可裂解之部分( 例如酯、醯胺、碳酸酯、胺基甲酸酯、脲)。在某些實施例中，式( VII)化合物具有式( VII-b-1)或( VII-b-2)：
Figure 02_image1095
Figure 02_image1097
( VII-b-1)           ( VII-b-2)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有式( VII-b-1-OH)或( VII-b-2-OH)：
Figure 02_image1099
Figure 02_image1101
( VII-b-1-OH)  ( VII-b-2-OH)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1103
、
Figure 02_image1105
、
Figure 02_image1107
、
Figure 02_image1109
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1111
、
Figure 02_image1113
、
Figure 02_image1115
、
Figure 02_image1117
、 或其鹽。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1119
、
Figure 02_image1121
、
Figure 02_image1123
、
Figure 02_image1125
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( VII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1127
(化合物430)、
Figure 02_image1129
(化合物431)， 或其鹽。
在某些實施例中，可用於本發明之PEG脂質為PEG化脂肪酸。在某些實施例中，可用於本發明之PEG脂質為式( VIII)化合物。本文提供式( VIII)化合物：
Figure 02_image1131
( VIII)， 或其鹽，其中： R 3為-OR O； R O為氫、視情況經取代之烷基或氧保護基； r為1至100之整數，包括1及100； R 5為視情況經取代之C 10-40烷基、視情況經取代之C 10-40烯基或視情況經取代之C 10-40炔基；且視情況，R 5之一或多個亞甲基經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-NR NC(O)N(R N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR N)-、-C(=NR N)N(R N)-、-NR NC(=NR N)-、-NR NC(=NR N)N(R N)-、-C(S)-、-C(S)N(R N)-、-NR NC(S)-、-NR NC(S)N(R N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) 2-、-S(O) 2O-、-OS(O) 2O-、-N(R N)S(O)-、-S(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)N(R N)-、-OS(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)O-、-S(O) 2-、-N(R N)S(O) 2-、-S(O) 2N(R N)-、-N(R N)S(O) 2N(R N)-、-OS(O) 2N(R N)-或-N(R N)S(O) 2O-；且 R N之各情況獨立地為氫、視情況經取代之烷基或氮保護基。
在某些實施例中，式( VIII)化合物具有式( VIII-OH)：
Figure 02_image1133
( VIII-OH)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( VIII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1135
(化合物419)、
Figure 02_image1137
(化合物420)、
Figure 02_image1139
(化合物421)、
Figure 02_image1141
(化合物422)、
Figure 02_image1143
(化合物423)、
Figure 02_image1145
(化合物424)、
Figure 02_image1147
(化合物425)， 或其鹽。在一些實施例中，r為45。
在某些實施例中，式( VIII)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1135
(化合物419)、
Figure 02_image1137
(化合物420)、
Figure 02_image1139
(化合物421)、
Figure 02_image1141
(化合物422)、
Figure 02_image1143
(化合物423)， 或其鹽。在一些實施例中，r為45。
在其他實施例中，式( VIII)化合物為：
Figure 02_image1154
(化合物427)， 或其鹽。
在一些實施例中，式(III)化合物為
Figure 02_image1156
(化合物428)或
Figure 02_image1158
(化合物403)。
在某些實施例中，PEG脂質為下式之化合物：
Figure 02_image1145
(化合物424)、
Figure 02_image1147
(化合物425)， 或其鹽。在一些實施例中，r為45。 磷脂
如本文所定義，磷脂為包含磷酸基之任何脂質。磷脂為非陽離子脂質之子集。脂質奈米粒子組成物之脂質組分可包括一或多種磷脂，諸如一或多種(多)不飽和脂質。磷脂可組裝成一或多個脂質雙層。一般而言，磷脂可包括磷脂部分及一或多個脂肪酸部分。磷脂部分可選自由以下組成之非限制性群：磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、2-溶血磷脂醯膽鹼集鞘磷脂。脂肪酸部分可選自由以下組成之非限制性群：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、花生油酸、二十碳五烯酸、二十二酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸。亦涵蓋非天然物質，包括具有修飾及取代(包括支鏈、氧化、環化及炔烴)之天然物質。舉例而言，磷脂可經一或多個炔烴(例如一或多個雙鍵經三鍵置換之烯基)官能化或與之交聯。在適當反應條件下，炔基在暴露於疊氮化物時可進行銅催化之環加成反應。該等反應可用於官能化奈米粒子組成物之脂質雙層以促進膜滲透或細胞識別，或可用於使奈米粒子組成物結合於可用組分，諸如靶向或成像部分(例如染料)。
在一些實施例中，本文所述之奈米粒子包含約5 mol%至約15 mol%磷脂。在一些實施例中，奈米粒子包含約8 mol%至約13 mol%磷脂。在一些實施例中，奈米粒子包含約10 mol%至約12 mol%磷脂。
可用於或潛在用於該等組成物及方法中之磷脂可選自由以下組成之非限制性群：1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二(十一烷醯基)-sn-甘油-磷酸膽鹼(DUPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:0 Diether PC)、1-油醯基-2-膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二(二十二碳六烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(4ME 16:0 PC)、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油) (鈉鹽) (4ME 16:0 PG)、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲胺酸(鈉鹽)(4ME 16:0 PS)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺及1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)及鞘磷脂。各可能性代表本發明之一各別實施例。
在一些實施例中，脂質奈米粒子組成物包括DSPC。在某些實施例中，脂質奈米粒子組成物包括DOPE。在一些實施例中，脂質奈米粒子組成物包括DSPC及DOPE兩者。在一些實施例中，脂質奈米粒子包括： 1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(4ME 16:0 PE)、
Figure 02_image1162
1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(4ME 16:0 PC)
Figure 02_image1164
1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油) (鈉鹽) (4ME 16:0 PG)或
Figure 02_image1166
1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲胺酸(鈉鹽)(4ME 16:0 PS)
Figure 02_image1168
，或其混合物。
磷脂之實例包括但不限於以下：
Figure 02_image1170
(化合物432)、
Figure 02_image1172
(化合物433)、
Figure 02_image1174
(化合物434)、
Figure 02_image1176
(化合物435)、
Figure 02_image1176
(化合物436)、
Figure 02_image1179
(化合物437)、
Figure 02_image1181
(化合物438)、
Figure 02_image1183
(化合物439)、
Figure 02_image1185
(化合物440)、
Figure 02_image1187
(化合物441)、
Figure 02_image1189
(化合物442)、
Figure 02_image1191
(化合物443)
Figure 02_image1193
(化合物444)、
Figure 02_image1195
(化合物445)、
Figure 02_image1197
(化合物446)、
Figure 02_image1199
(化合物447)及
Figure 02_image1201
(化合物448)。
在某些實施例中，可用於或潛在用於本發明之磷脂為DSPC之類似物或變體。
在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂為式( IX)化合物：
Figure 02_image1203
( IX)， 或其鹽，其中： 各R 1獨立地為H或視情況經取代之烷基；或視情況，兩個R 1與介入原子接合在一起以形成視情況經取代之單環碳環基或視情況經取代之單環雜環基；或視情況，三個R 1與介入原子接合在一起以形成視情況經取代之雙環碳環基或視情況經取代之雙環雜環基； n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； A具有下式：
Figure 02_image1053
或
Figure 02_image1055
； L 2之各情況獨立地為鍵或視情況經取代之C 1-6伸烷基，其中該視情況經取代之C 1-6伸烷基的一個亞甲基單元視情況經以下置換：-O-、-N(R N)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-或-NR NC(O)N(R N)-； R 2之各情況獨立地為視情況經取代之C 1-30烷基、視情況經取代之C 1-30烯基或視情況經取代之C 1-30炔基；視情況，其中R 2之一或多個亞甲基單元獨立地經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-NR NC(O)N(R N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR N)-、-C(=NR N)N(R N)-、-NR NC(=NR N)-、-NR NC(=NR N)N(R N)-、-C(S)-、-C(S)N(R N)-、-NR NC(S)-、-NR NC(S)N(R N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) 2-、-S(O) 2O-、-OS(O) 2O-、-N(R N)S(O)-、-S(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)N(R N)-、-OS(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)O-、-S(O) 2-、-N(R N)S(O) 2-、-S(O) 2N(R N)-、-N(R N)S(O) 2N(R N)-、-OS(O) 2N(R N)-或-N(R N)S(O) 2O-； R N之各情況獨立地為氫、視情況經取代之烷基或氮保護基； 環B為視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；且 p為1或2； 其限制條件在於該化合物不具有下式：
Figure 02_image1207
， 其中R 2之各情況獨立地為未經取代之烷基、未經取代之烯基或未經取代之炔基。
在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂為式( IX)化合物：
Figure 02_image1203
( IX)， 或其鹽，其中： 各R 1獨立地為視情況經取代之烷基；或視情況，兩個R 1與介入原子接合在一起以形成視情況經取代之單環碳環基或視情況經取代之單環雜環基；或視情況，三個R 1與介入原子接合在一起以形成視情況經取代之雙環碳環基或視情況經取代之雙環雜環基； n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； A具有下式：
Figure 02_image1053
或
Figure 02_image1055
； L 2之各情況獨立地為鍵或視情況經取代之C 1-6伸烷基，其中該視情況經取代之C 1-6伸烷基的一個亞甲基單元視情況經以下置換：-O-、-N(R N)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-或-NR NC(O)N(R N)-； R 2之各情況獨立地為視情況經取代之C 1-30烷基、視情況經取代之C 1-30烯基或視情況經取代之C 1-30炔基；視情況，其中R 2之一或多個亞甲基單元獨立地經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-NR NC(O)N(R N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR N)-、-C(=NR N)N(R N)-、-NR NC(=NR N)-、-NR NC(=NR N)N(R N)-、-C(S)-、-C(S)N(R N)-、-NR NC(S)-、-NR NC(S)N(R N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) 2-、-S(O) 2O-、-OS(O) 2O-、-N(R N)S(O)-、-S(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)N(R N)-、-OS(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)O-、-S(O) 2-、-N(R N)S(O) 2-、-S(O) 2N(R N)-、-N(R N)S(O) 2N(R N)-、-OS(O) 2N(R N)-或-N(R N)S(O) 2O-； R N之各情況獨立地為氫、視情況經取代之烷基或氮保護基； 環B為視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；且 p為1或2； 其限制條件在於該化合物不具有下式：
Figure 02_image1207
， 其中R 2之各情況獨立地為未經取代之烷基、未經取代之烯基或未經取代之炔基。 磷脂頭修飾
在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂包含經修飾之磷脂頭( 例如經修飾之膽鹼基團)。在某些實施例中，具有經修飾頭之磷脂為DSPC或其具有經修飾四級胺之類似物。舉例而言，在式( IX)之實施例中，至少一個R 1不為甲基。在某些實施例中，至少一個R 1不為氫或甲基。在某些實施例中，式( IX)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1213
、
Figure 02_image1215
、
Figure 02_image1217
、
Figure 02_image1219
、
Figure 02_image1221
， 或其鹽，其中： 各t獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； 各u獨立地為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且 各v獨立地為1、2或3。
在某些實施例中，式( IX)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1223
、
Figure 02_image1225
、
Figure 02_image1227
、
Figure 02_image1229
、
Figure 02_image1231
、
Figure 02_image1233
、
Figure 02_image1235
、
Figure 02_image1237
、
Figure 02_image1239
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX)化合物為以下中之一者：
Figure 02_image1241
(化合物400)
Figure 02_image1243
(化合物401)
Figure 02_image1245
(化合物402)
Figure 02_image1247
(化合物403)
Figure 02_image1249
(化合物404)
Figure 02_image1251
(化合物405)
Figure 02_image1253
(化合物406)
Figure 02_image1255
(化合物407)
Figure 02_image1257
(化合物408)
Figure 02_image1259
(化合物409)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX)化合物具有式( IX-a)：
Figure 02_image1261
( IX-a)， 或其鹽。
在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂包含經修飾核心。在某些實施例中，本文所述之具有經修飾核心之磷脂為DSPC或其具有經修飾核心結構之類似物。舉例而言，在式( IX-a)之某些實施例中，基團A不具有下式：
Figure 02_image1263
。
在某些實施例中，式( IX-a)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1265
、
Figure 02_image1267
、
Figure 02_image1269
、
Figure 02_image1271
、
Figure 02_image1273
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX)化合物為以下中之一者：
Figure 02_image1275
(化合物449)、
Figure 02_image1277
(化合物450)、
Figure 02_image1279
(化合物451)、
Figure 02_image1281
(化合物452)、
Figure 02_image1283
(化合物453)， 或其鹽。
在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂包含替代甘油酯部分之環狀部分。在某些實施例中，可用於本發明之磷脂為DSPC或其具有替代甘油酯部分之環狀部分的類似物。在某些實施例中，式( IX)化合物具有式( IX-b)：
Figure 02_image1285
， ( IX-b)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX-b)化合物具有式( IX-b-1)：
Figure 02_image1287
( IX-b-1)， 或其鹽，其中： w為0、1、2或3。
在某些實施例中，式( IX-b)化合物具有式( IX-b-2)：
Figure 02_image1289
( IX-b-2)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX-b)化合物具有式( IX-b-3)：
Figure 02_image1291
( IX-b-3)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX-b)化合物具有式( IX-b-4)：
Figure 02_image1293
( IX-b-4)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX-b)化合物為以下中之一者：
Figure 02_image1295
(化合物454)、
Figure 02_image1297
(化合物455)、
Figure 02_image1299
(化合物456)、 或其鹽。 磷脂尾修飾
在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂包含經修飾尾。在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂為DSPC或其具有經修飾尾之類似物。如本文所述，「經修飾尾」可為具有以下之尾：較短或較長脂族鏈、引入支鏈之脂族鏈、引入取代基之脂族鏈、一或多個亞甲基經環狀或雜原子基團置換之脂族鏈或其任何組合。舉例而言，在某些實施例中，( IX)化合物具有式( IX-a)或其鹽，其中R 2之至少一種情況為R 2之各情況為視情況經取代之C 1-30烷基，其中R 2之一或多個亞甲基單元獨立地經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-NR NC(O)N(R N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR N)-、-C(=NR N)N(R N)-、-NR NC(=NR N)-、-NR NC(=NR N)N(R N)-、-C(S)-、-C(S)N(R N)-、-NR NC(S)-、-NR NC(S)N(R N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) 2-、-S(O) 2O-、-OS(O) 2O-、-N(R N)S(O)-、-S(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)N(R N)-、-OS(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)O-、-S(O) 2-、-N(R N)S(O) 2-、-S(O) 2N(R N)-、-N(R N)S(O) 2N(R N)-、-OS(O) 2N(R N)-或-N(R N)S(O) 2O-。
在某些實施例中，式( IX)化合物具有式( IX-c)：
Figure 02_image1301
( IX-c)， 或其鹽，其中： 各x獨立地為0-30之整數，包括0及30；且 各情況為G係獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R N)-、-NR NC(O)-、-NR NC(O)N(R N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R N)-、-NR NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR N)-、-C(=NR N)N(R N)-、-NR NC(=NR N)-、-NR NC(=NR N)N(R N)-、-C(S)-、-C(S)N(R N)-、-NR NC(S)-、-NR NC(S)N(R N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) 2-、-S(O) 2O-、-OS(O) 2O-、-N(R N)S(O)-、-S(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)N(R N)-、-OS(O)N(R N)-、-N(R N)S(O)O-、-S(O) 2-、-N(R N)S(O) 2-、-S(O) 2N(R N)-、-N(R N)S(O) 2N(R N)-、-OS(O) 2N(R N)-或-N(R N)S(O) 2O-。各可能性代表本發明之一各別實施例。
在某些實施例中，式( IX-c)化合物具有式( IX-c-1)：
Figure 02_image1303
( IX-c-1)， 或其鹽，其中： v之各情況獨立地為1、2或3。
在某些實施例中，式( IX-c)化合物具有式( IX-c-2)：
Figure 02_image1305
( IX-c-2)， 或其鹽。
在某些實施例中，式(IX-c)化合物具有下式：
Figure 02_image1307
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX-c)化合物為以下：
Figure 02_image1309
(化合物457)或其鹽。
在某些實施例中，式( IX-c)化合物具有式( IX-c-3)：
Figure 02_image1311
( IX-c-3)， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX-c)化合物具有下式：
Figure 02_image1313
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX-c)化合物為以下：
Figure 02_image1315
(化合物458)、 或其鹽。
在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂包含經修飾磷酸膽鹼部分，其中連接四級胺與磷醯基之烷基鏈不為伸乙基( 例如n不為2)。因此，在某些實施例中，可用於或潛在可用於本發明之磷脂為式( IX)化合物，其中n為1、3、4、5、6、7、8、9或10。舉例而言，在某些實施例中，式( IX)化合物具有下式中之一者：
Figure 02_image1317
、
Figure 02_image1319
， 或其鹽。
在某些實施例中，式( IX)化合物為以下中之一者：
Figure 02_image1321
(化合物459)、
Figure 02_image1323
(化合物460)
Figure 02_image1325
(化合物461)、
Figure 02_image1327
(化合物462)、
Figure 02_image1329
(化合物463)、
Figure 02_image1331
(化合物464)、
Figure 02_image1333
(化合物463a)，
Figure 02_image1335
(化合物412)、
Figure 02_image1337
化合物413)、
Figure 02_image1339
(化合物414)、 或其鹽。 替代脂質
在某些實施例中，替代脂質替代本發明之磷脂使用。該等替代脂質之非限制性實例包括以下：
Figure 02_image1341
化合物457a、
Figure 02_image1343
化合物458a、
Figure 02_image1345
化合物459a、
Figure 02_image1347
化合物460a、
Figure 02_image1349
化合物461a、
Figure 02_image1351
化合物461b 及
Figure 02_image1353
化合物463b。 結構脂質
脂質奈米粒子組成物之脂質組分可包括一或多種結構脂質。在脂質奈米粒子中併入結構脂質可幫助減輕粒子中其他脂質之聚集。結構脂質可選自包括但不限於以下之群：膽固醇、糞固醇、麥固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、蕓苔固醇、番茄鹼、番茄苷、熊果酸、α-生育酚、類藿烷、植物固醇、類固醇及其混合物。在一些實施例中，結構脂質為固醇。如本文所定義，「固醇」為由類固醇組成之類固醇子群。在某些實施例中，結構脂質為類固醇。在某些實施例中，結構脂質為膽固醇。在某些實施例中，結構脂質為膽固醇之類似物。在某些實施例中，結構脂質為α-生育酚。結構脂質之實例包括但不限於以下：
Figure 02_image1355
(化合物464a)、
Figure 02_image1357
(化合物465)及
Figure 02_image1359
(化合物466)。
在一些實施例中，本文所述之奈米粒子可包含約20 mol%至約60 mol%結構脂質。在一些實施例中，奈米粒子包含約30 mol%至約50 mol%結構脂質。在一些實施例中，奈米粒子包含約35 mol%結構脂質。在一些實施例中，奈米粒子包含約40 mol%結構脂質。在一些實施例中，結構脂質為膽固醇或具有以下結構之化合物：
Figure 02_image1361
。 有效負載分子
本揭示案之組成物可用於將多種不同藥劑遞送至氣道細胞。氣道細胞可為襯填於呼吸道，例如口腔、鼻、咽喉或肺中之細胞。治療劑能夠在該氣道細胞仲介導(例如，直接介導或經由旁觀者效應)治療效果。典型地，由該組成物遞送之治療劑為核酸，但本揭示案亦涵蓋非核酸藥劑，諸如小分子、化療藥、肽、多肽及其他生物分子。可遞送之核酸包括基於DNA之分子(亦即，包含去氧核糖核苷酸)及基於RNA之分子(亦即，包含核糖核苷酸)。此外，核酸可為分子之天然存在形式或分子之經化學修飾形式(例如包含一或多個經修飾核苷酸)。 用於增強蛋白質表現之試劑
在一個實施例中，治療劑為增強(亦即，增加、刺激、上調)蛋白質表現之藥劑。可用於增強蛋白質表現之治療劑類型的非限制性實例包括RNA、mRNA、dsRNA、CRISPR/Cas9技術、ssDNA及DNA (例如表現載體)。
在一個實施例中，治療劑為DNA治療劑。該DNA分子可為雙股DNA、單股DNA (ssDNA)或為部分雙股DNA之分子，亦即，具有雙股部分及單股部分。在一些情況下，該DNA分子為三鏈的或為部分三鏈的(亦即，具有三鏈部分及雙鏈部分)。該DNA分子可為環狀DNA分子或直鏈DNA分子。
DNA治療劑可為能夠將基因轉移至細胞中，例如編碼且可表現轉錄物之DNA分子。舉例而言，DNA治療劑可編碼關注蛋白質，從而在由LNP遞送後增加氣道中關注蛋白質之表現。在一些實施例中，DNA分子可為天然來源的，例如自天然來源分離。在其他實施例中，該DNA分子為合成分子，例如活體外產生之合成DNA分子。在一些實施例中，該DNA分子為重組分子。非限制性例示性DNA治療劑包括質體表現載體及病毒表現載體。
本文所述之DNA治療劑(例如DNA載體)可包括多種不同特徵。本文所述之DNA治療劑(例如DNA載體)可包括非編碼DNA序列。例如，DNA序列可包括針對基因之至少一種調控元件，例如啟動子、增強子、終止元件、聚腺苷酸化訊號元件、剪接訊號元件及其類似元件。在一些實施例中，該非編碼DNA序列為內含子。在一些實施例中，該非編碼DNA序列為轉座子。在一些實施例中，本文所述之DNA序列可具有可操作性連接至轉錄活性基因之非編碼DNA序列。在其他實施例中，本文所述之DNA序列可具有不與基因連接之非編碼DNA序列，亦即該非編碼DNA不調節DNA序列上之基因。
在一些實施例中，有效負載包含遺傳調節子，亦即系統之至少一種組分，其修飾DNA分子中之核酸序列， 例如藉由改變核鹼基， 例如引入插入、缺失、突變( 例如錯義突變、沉默突變或無義突變)、重複或倒位或者其任何組合。在一些實施例中，遺傳調節子包含DNA鹼基編輯子、CRISPR/Cas基因編輯系統、鋅指核酸酶(ZFN)系統、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)系統、大範圍核酸酶系統或轉座酶系統或其任何組合。
在一些實施例中，遺傳調節子包含範本DNA。在一些實施例中，遺傳調節子不包含範本DNA。在一些實施例中，遺傳調節子包含範本RNA。在一些實施例中，遺傳調節子不包含範本RNA。
在一些實施例中，遺傳調節子為CRISPR/Cas基因編輯系統。在一些實施例中，CRISPR/Cas基因編輯系統包含：包含特異於標靶基因之序列的靶向序列的嚮導RNA (gRNA)分子，及具有核酸酶活性， 例如核酸內切酶活性之肽， 例如Cas蛋白或其片段( 例如生物活性片段)或變體， 例如Cas9蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體；Cas3蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體；Cas12a蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體；Cas 12e蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體；Cas 13蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體；或Cas14蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體。
在一些實施例中，CRISPR/Cas基因編輯系統包含：包含特異於標靶基因之序列的靶向序列的gRNA分子，及編碼具有核酸酶活性， 例如核酸內切酶活性之肽的核酸，該肽 例如Cas蛋白或其片段( 例如生物活性片段)或變體，例 如Cas9蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或其變體；Cas3蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或其變體；Cas12a蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或其變體；Cas12e蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體；Cas13蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或其變體；或Cas14蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體。
在一些實施例中，CRISPR/Cas基因編輯系統包含：編碼gRNA分子之核酸，該gRNA分子包含特異於標靶基因之序列的靶向序列，及Cas9蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體。
在一些實施例中，CRISPR/Cas基因編輯系統包含：編碼gRNA分子之核酸，該gRNA分子包含特異於標靶基因之序列的靶向序列，及編碼Cas9蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體之核酸。
在一些實施例中，CRISPR/Cas基因編輯系統進一步包含範本DNA。在一些實施例中，CRISPR/Cas基因編輯系統進一步包含範本RNA。在一些實施例中，CRISPR/Cas基因編輯系統進一步包含逆轉錄酶。
在本文所揭示方法、組成物或細胞中任一者之一些實施例中，遺傳調節子為鋅指核酸酶(ZFN)系統。在一些實施例中，ZFN系統包含如下肽，其具有：鋅指DNA結合域、其片段( 例如生物活性片段)或變體；及/或核酸酶活性， 例如核酸內切酶活性。在一些實施例中，ZFN系統包含具有Zn指DNA結合域之肽。在一些實施例中，Zn指結合域包含1、2、3、4、5、6、7、8個或更多個鋅指。在一些實施例中，ZFN系統包含具有核酸酶活性 例如核酸內切酶活性之肽。在一些實施例中，具有核酸酶活性之肽為II型限制性1樣核酸內切酶， 例如FokI核酸內切酶。在一些實施例中，ZFN系統包含編碼如下肽之核酸，該肽具有：鋅指DNA結合域、其片段( 例如生物活性片段)或變體；及/或核酸酶活性， 例如核酸內切酶活性。
在一些實施例中，ZFN系統包含編碼具有Zn指DNA結合域之肽的核酸。在一些實施例中，Zn指結合域包含1、2、3、4、5、6、7、8個或更多個鋅指。在一些實施例中，ZFN系統包含編碼具有核酸酶活性 例如核酸內切酶活性之肽的核酸。在一些實施例中，具有核酸酶活性之肽為II型限制性1樣核酸內切酶， 例如FokI核酸內切酶。
在一些實施例中，該系統進一步包含範本， 例如範本DNA。
在本文所揭示方法、組成物或細胞中任一者之一些實施例中，遺傳調節子為轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)系統。在一些實施例中，系統包含以下肽，其具有：轉錄活化子樣(TAL)效應DNA結合域、其片段( 例如生物活性片段)或變體；及/或核酸酶活性， 例如核酸內切酶活性。在一些實施例中，系統包含以下肽，其具有：TAL效應DNA結合域、其片段( 例如生物活性片段)或變體。在一些實施例中，系統包含具有核酸酶活性 例如核酸內切酶活性之肽。在一些實施例中，具有核酸酶活性之肽為II型限制性1樣核酸內切酶， 例如FokI核酸內切酶。
在一些實施例中，系統包含編碼以下肽之核酸，該肽具有：轉錄活化子樣(TAL)效應DNA結合域、其片段( 例如生物活性片段)或變體；及/或核酸酶活性， 例如核酸內切酶活性。在一些實施例中，系統包含編碼以下肽之核酸，該肽具有：轉錄活化子樣(TAL)效應DNA結合域、其片段( 例如生物活性片段)或變體。在一些實施例中，系統包含編碼具有核酸酶活性 例如核酸內切酶活性之肽的核酸。在一些實施例中，具有核酸酶活性之肽為II型限制性1樣核酸內切酶， 例如FokI核酸內切酶。
在一些實施例中，該系統進一步包含範本， 例如範本DNA。
在本文所揭示方法、組成物或細胞中任一者之一些實施例中，遺傳調節子為大範圍核酸酶系統。在一些實施例中，大範圍核酸酶系統包含具有DNA結合域及核酸酶活性， 例如歸巢核酸內切酶之肽。在一些實施例中，歸巢核酸內切酶包含LAGLIDADG核酸內切酶、GIY-YIG核酸內切酶、HNH核酸內切酶、His-Cys盒狀核酸內切酶或PD-(D/E)XK核酸內切酶或其片段( 例如生物活性片段)或變體， 例如如Silva G.等人, (2011) Curr Gene Therapy 11(1): 11-27中所述。
在一些實施例中，大範圍核酸酶系統包含編碼具有DNA結合域及核酸酶活性， 例如歸巢核酸內切酶之肽的核酸。在一些實施例中，歸巢核酸內切酶包含LAGLIDADG核酸內切酶、GIY-YIG核酸內切酶、HNH核酸內切酶、His-Cys盒狀核酸內切酶或PD-(D/E)XK核酸內切酶或其片段( 例如生物活性片段)或變體， 例如如Silva G.等人, (2011) Curr Gene Therapy 11(1): 11-27中所述。
在一些實施例中，該系統進一步包含範本， 例如範本DNA。
在本文所揭示方法、組成物或細胞中任一者之一些實施例中，遺傳調節子為轉座酶系統。在一些實施例中，轉座酶系統包含編碼以下肽之核酸序列，該肽具有逆轉錄酶及/或核酸酶活性， 例如逆轉錄轉座子， 例如LTR逆轉錄轉座子或非LTR逆轉錄轉座子。在一些實施例中，轉座酶系統包含範本， 例如RNA範本。
在一個實施例中，治療劑為RNA治療劑。該RNA分子可為單股RNA、雙股RNA (dsRNA)或為部分雙股RNA之分子，亦即，具有雙股部分及單股部分。該RNA分子可為環狀RNA分子或直鏈RNA分子。
RNA治療劑可為能夠將基因轉移至細胞中之RNA治療劑，例如編碼關注蛋白質，從而增加氣道細胞中關注蛋白質之表現。在一些實施例中，RNA分子可為天然來源的，例如自天然來源分離。在其他實施例中，RNA分子為合成分子，例如活體外產生之合成RNA分子。
RNA治療劑之非限制性實例包括信使RNA (mRNA)(例如編碼關注蛋白質)、經修飾mRNA (mmRNA)、倂有微小RNA結合位點(miR結合位點)之mRNA、包含功能性RNA元件之經修飾RNA、微小RNA (miRNA)、拮抗劑(antagomir)、小(短)干擾RNA (siRNA)(包括短鏈物及切塊酶受質RNA)、RNA干擾(RNAi)分子、反義RNA、核酶、小髮夾RNA (shRNA)、鎖核酸(LNA) )及編碼CRISPR/Cas9技術之組分者，其中每一者均在如下小節中進一步描述。在一些實施例中，RNA調節子包含RNA堿基編輯系統。在一些實施例中，RNA鹼基編輯系統包含：去胺酶， 例如RNA特異性腺苷去胺酶(ADAR)；Cas蛋白、其片段( 例如生物活性片段)或變體；及/或嚮導RNA。在一些實施例中，RNA鹼基編輯系統進一步包含範本， 例如DNA或RNA範本。
mRNA可為天然或非天然存在之mRNA。mRNA可如下文所述包括一或多個經修飾核鹼基、核苷或核苷酸，在該情況下其可稱作「經修飾mRNA」或「mmRNA」。如本文所述，「核苷」係定義為含有與有機鹼(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中亦稱作「核鹼基」)組合之糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。如本文所述，「核苷酸」係定義為包括磷酸酯基之核苷。
mRNA可包括5′未轉譯區(5′-UTR)、3′未轉譯區(3′-UTR)及/或編碼區(例如開放閱讀框)。mRNA可包括任何合適數目之鹼基對，包括數十個(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個)、數百個(例如，200、300、400、500、600、700、800或900個)或數千個(例如，1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000個)鹼基對。任何數目(例如，全部、一些或無)之核鹼基、核苷或核苷酸均可為規範物質之類似物，經取代、經修飾或以其他方式非天然存在。在某些實施例中，特定核鹼基類型之全部均可經修飾。
在一些實施例中，如本文所述之mRNA可包括5’帽結構、鏈終止核苷酸、視情況存在之Kozak序列(亦稱作Kozak共有序列)、莖環、polyA序列及/或聚腺苷酸化訊號。
5'帽結構或帽物質係包括藉由連接體接合之兩個核苷部分的化合物且可選自天然存在之帽、非天然存在之帽或帽類似物或抗-反向帽類似物(ARCA)。帽物質可包括一或多個經修飾核苷及/或連接體部分。例如，天然mRNA帽可包括鳥嘌呤核苷酸及在7位置處甲基化之鳥嘌呤(G)核苷酸，由該等核苷酸之5′位置處的三磷酸酯鍵接合，例如m7G(5′)ppp(5′)G，通常書寫為m7GpppG。帽物質亦可為抗-反向帽類似物。可能的帽物質之非限制性清單包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73′dGpppG、m27,O3′GpppG、m27,O3′GppppG、m27,O2′GppppG、m7Gpppm7G、m73′dGpppG、m27,O3′GpppG、m27,O3′GppppG及m27,O2′GppppG。
mRNA可替代地或另外包括鏈終止核苷。例如，鏈終止核苷可包括在其糖基之2’及/或3′位置處去氧之彼等核苷。該等物質可包括3′去氧腺苷(蛹蟲草菌素)、3′去氧尿苷、3′去氧胞嘧啶、3′去氧鳥苷、3′去氧胸腺嘧啶及2',3′二去氧核苷，諸如2',3′二去氧腺苷、2',3′二去氧尿苷、2',3′二去氧胞嘧啶、2',3′二去氧鳥苷及2',3′二去氧胸腺嘧啶。在一些實施例中，將鏈終止核苷酸併入mRNA中例如3’-末端處可使該mRNA穩定，如例如國際專利公開案第WO 2013/103659號中所述。
mRNA可替代地或另外包括莖環，諸如組織蛋白莖環。莖環可包括2、3、4、5、6、7、8個或8個以上核苷酸鹼基對。例如，莖環可包括4、5、6、7或8個核苷酸鹼基對。莖環可位於mRNA之任何區中。例如，莖環可位於未轉譯區(5′未轉譯區或3′未轉譯區)、編碼區或polyA序列或尾中、之前或之後。在一些實施例中，莖環可影響mRNA之一或多種功能，諸如轉譯起始、轉譯效率及/或轉錄終止。
mRNA可替代地或另外包括polyA序列及/或聚腺苷酸化訊號。 polyA序列可完全或主要包含腺嘌呤核苷酸或者其類似物或衍生物。polyA序列可為與mRNA之3′未轉譯區相鄰定位之尾。在一些實施例中，polyA序列可影響mRNA之核輸出、轉譯及/或穩定性。
mRNA可替代地或另外包括微小RNA結合位點。
在一些實施例中，mRNA為包含第一編碼區及第二編碼區之雙順反子mRNA，該等編碼區具有包含允許在第一與第二編碼區之間進行內部轉譯起始之內部核糖體進入位點(IRES)序列的介入序列，或具有編碼自裂解肽，諸如2A肽之介入序列。IRES序列及2A肽典型地用於增強來自同一載體之多種蛋白質之表現。多種IRES序列為此項技術中已知且可獲得的且可加以使用，包括例如腦心肌炎病毒IRES。
在一些實施例中，本揭示案之mRNA包含一或多個經修飾核鹼基、核苷或核苷酸(稱作「經修飾mRNA」或「mmRNA」)。在一些實施例中，經修飾mRNA可具有可用特性，包括如與參考未經修飾mRNA相比，增強之穩定性、細胞內保留、增強之轉譯及/或缺乏其中引入該mRNA之細胞的先天免疫反應之實質誘導。因此，經修飾mRNA之使用可增強蛋白質產生效率、核酸之細胞內保留，以及具有降低的免疫原性。
在一些實施例中，mRNA包括一或多個(例如，1、2、3或4個)不同的經修飾核鹼基、核苷或核苷酸。在一些實施例中，mRNA包括一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或更多)不同的經修飾核鹼基、核苷或核苷酸。在一些實施例中，相對於相應的未經修飾mRNA，經修飾mRNA可在其中引入該mRNA之細胞中具有降低之降解。
在一些實施例中，經修飾核鹼基係經修飾尿嘧啶。具有經修飾尿嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵基-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羥基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羥基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-胺基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基胺基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基胺基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基胺基甲基-2-硒並-尿苷(mnm5se2U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基胺基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，亦即具有核鹼基去氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m5D)、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3 ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷(inm5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-胺甲醯基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基胺基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)及5-(異戊烯基胺基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、去氧胸腺嘧啶、2’‐F‐阿拉伯糖‐尿苷、2’‐F‐尿苷、2’‐OH‐阿拉伯糖‐尿苷、5‐(2‐甲氧羰基乙烯基)尿苷及5‐[3‐(1‐E‐丙烯基胺基)]尿苷。
在一些實施例中，經修飾核鹼基係經修飾胞嘧啶。具有經修飾胞嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括5-氮雜-胞苷、6-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙醯基-胞苷(ac4C)、5-甲醯基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-鹵基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羥基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假異胞苷、吡咯並-胞苷、吡咯並-假異胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫代-澤布拉林、2-硫代-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、立西啶(k2C)、α-硫代-胞苷、2′-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2′-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙醯基-2′-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2′-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲醯基-2′-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2′-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞苷、2’‐F‐阿拉伯糖‐胞苷、2’‐F‐胞苷及2’‐OH‐阿拉伯糖‐胞苷。
在一些實施例中，經修飾核鹼基係經修飾腺嘌呤。具有經修飾腺嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括a-硫代-腺苷、2-胺基-嘌呤、2, 6-二胺基嘌呤、2-胺基-6-鹵基-嘌呤(例如2-胺基-6-氯-嘌呤)、6-鹵基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-胺基-6-甲基-嘌呤、8-疊氮基-腺苷、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫代-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-異戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫代-N6-異戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫代-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘胺醯基胺甲醯基-腺苷(g6A)、N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫代-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m62A)、N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺苷(hn6A)、2-甲基硫代-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙醯基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2′-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2′-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯) (Ar(p))、2-胺基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-疊氮基-腺苷、2’‐F‐阿拉伯糖‐腺苷、2’‐F‐腺苷、2’‐OH‐阿拉伯糖‐腺苷及N6‐(19‐胺基‐五氧雜十九烷基)-腺苷。
在一些實施例中，經修飾核鹼基係經修飾鳥嘌呤。具有經修飾鳥嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括a-硫代-鳥苷、肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、4-去甲基-懷俄苷(imG-14)、異懷俄苷(imG2)、懷丁苷(yW)、過氧懷丁苷(o2yW)、羥基懷丁苷(OhyW)、修飾不足之羥基懷丁苷(OhyW*)、7-去氮雜-鳥苷、辮苷(Q)、環氧辮苷(oQ)、半乳糖基-辮苷(galQ)、甘露糖基-辮苷(manQ)、7-氰基-7-去氮雜-鳥苷(preQ0)、7-胺基甲基-7-去氮雜-鳥苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫代-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基-鳥苷(m1G)、N2-甲基-鳥苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鳥苷(m22G)、N2,7-二甲基-鳥苷(m2,7G)、N2, N2,7-二甲基-鳥苷(m2,2,7G)、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鳥苷、α-硫代-鳥苷、2′-O-甲基-鳥苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鳥苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2′-O-甲基-鳥苷(m22Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鳥苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2′-O-甲基-鳥苷(m2,7Gm)、2′-O-甲基-肌苷(Im)、1,2′-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2′-O-核糖基鳥苷(磷酸酯) (Gr(p))、1-硫代-鳥苷、O6-甲基-鳥苷、2’‐F‐阿拉伯糖‐鳥苷及2’‐F‐鳥苷。
在一些實施例中，本揭示案之mRNA包括一或多種前述經修飾核鹼基之組合(例如，2、3或4種前述經修飾核鹼基之組合。)
在一些實施例中，經修飾核鹼基為假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷或2’-O-甲基尿苷。在一些實施例中，本揭示案之mRNA包括一或多種前述經修飾核鹼基之組合(例如2、3或4種前述經修飾核鹼基之組合。)在一些實施例中，經修飾核鹼基為N1-甲基假尿苷(m1ψ)且本揭示案之mRNA經N1-甲基假尿苷(m1ψ)完全修飾。在一些實施例中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)代表mRNA中尿嘧啶之75-100%。在一些實施例中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)代表mRNA中尿嘧啶之100%。
在一些實施例中，經修飾核鹼基係經修飾胞嘧啶。具有經修飾胞嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括N4-乙醯基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-鹵基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羥基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假異胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷。在一些實施例中，本揭示案之mRNA包括一或多種前述經修飾核鹼基之組合(例如，2、3或4種前述經修飾核鹼基之組合。)
在一些實施例中，經修飾核鹼基係經修飾腺嘌呤。具有經修飾腺嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括7-去氮雜-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些實施例中，本揭示案之mRNA包括一或多種前述經修飾核鹼基之組合(例如，2、3或4種前述經修飾核鹼基之組合。)
在一些實施例中，經修飾核鹼基係經修飾鳥嘌呤。具有經修飾鳥嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、7-去氮雜-鳥苷、7-氰基-7-去氮雜-鳥苷(preQ0)、7-胺基甲基-7-去氮雜-鳥苷(preQ1)、7-甲基-鳥苷(m7G)、1-甲基-鳥苷(m1G)、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷。在一些實施例中，本揭示案之mRNA包括一或多種前述經修飾核鹼基之組合(例如，2、3或4種前述經修飾核鹼基之組合。)
在一些實施例中，經修飾核鹼基係1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鳥苷或α-硫代-腺苷。在一些實施例中，本揭示案之mRNA包括一或多種前述經修飾核鹼基之組合(例如，2、3或4種前述經修飾核鹼基之組合。)
在一些實施例中，mRNA包含假尿苷(ψ)。在一些實施例中，mRNA包含假尿苷(ψ)及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些實施例中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，mRNA包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些實施例中，mRNA包含2-硫代尿苷及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些實施例中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，mRNA包含2’-O-甲基尿苷。在一些實施例中，mRNA包含2’-O-甲基尿苷及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些實施例中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)及5-甲基-胞苷(m5C)。
在某些實施例中，本揭示案之mRNA係針對特定修飾均一地經修飾(亦即，完全地經修飾、通過整個序列經修飾)。例如，mRNA可均一地經N1-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)修飾，意謂mRNA序列中之所有尿苷或所有胞嘧啶核苷均經N1-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)置換。同樣，本揭示案之mRNA可藉由用經修飾殘基(諸如上文所陳述之彼等)置換而針對存在於該序列中的任何類型之核苷殘基均一地經修飾。
在一些實施例中，本揭示案之mRNA可在編碼區(例如，編碼多肽之開放閱讀框)中經修飾。在其他實施例中，mRNA可在除編碼區之外的區中經修飾。例如，在一些實施例中，提供5′-UTR及/或3′-UTR，其中任一者或兩者可獨立地含有一或多種不同的核苷修飾。在該等實施例中，核苷修飾亦可存在於編碼區中。
可存在於本揭示案之mmRNA中的核苷修飾及其組合之實例包括但不限於以下中所述之彼等：PCT專利申請公開案：WO2012045075、WO2014081507、WO2014093924、WO2014164253及WO2014159813。
本揭示案之mmRNA可包括對糖、核鹼基及/或核苷間鍵聯之修飾的組合。此等組合可包括本文所述之任何一或多種修飾。
在列出單一修飾之情況下，所列出之核苷或核苷酸表示100%之彼A、U、G或C核苷酸或核苷已經修飾。在列出百分率之情況下，此等表示所存在之A、U、G或C三磷酸酯的總量中該百分率之彼特定A、U、G或C核鹼基三磷酸酯。舉例而言，組合：25% 5-胺基烯丙基-CTP + 75% CTP/25% 5-甲氧基-UTP + 75% UTP指多核苷酸，其中胞嘧啶三磷酸之25%為5-胺基烯丙基-CTP，而胞嘧啶之75%為CTP；而尿嘧啶之25%為5-甲氧基UTP，而尿嘧啶之75%為UTP。在未列出經修飾UTP之情況下，則天然存在之ATP、UTP、GTP及/或CTP用於該多核苷酸中發現的彼等核苷酸之100%位點中。在此實例中，GTP及ATP核苷酸中之全部均保持未修飾。
本揭示案之mRNA可藉由此項技術中可獲得之方式，包括但不限於活體外轉錄(IVT)及合成方法產生。可使用酶(IVT)、固相、液相、組合合成方法、小區合成及接合方法。在一個實施例中，mRNA使用IVT酶學合成方法製備。藉由IVT製備多核苷酸之方法為此項技術中所已知且描述於國際申請案PCT/US2013/30062中，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。因此，本揭示案亦包括可用於活體外轉錄本文所述之mRNA的多核苷酸，例如DNA、構築體及載體。
非天然經修飾核鹼基可在合成期間或合成後引入至多核苷酸(例如，mRNA)中。在某些實施例中，修飾可在核苷間鍵、嘌呤或嘧啶鹼基或糖上。在特定實施例中，可使用化學合成或使用聚合酶將修飾引入多核苷酸鏈之末端處或該多核苷酸鏈中之別處。經修飾核酸及其合成之實例如PCT申請案第PCT/US2012/058519號中所揭示。經修飾多核苷酸之合成亦描述於Verma及Eckstein, Annual Review of Biochemistry,第76卷, 99-134 (1998)中。
酶學或化學接合方法可用於使多核苷酸或其區域與不同功能部分(諸如靶向或遞送劑、螢光標記、液體、奈米粒子等)結合。多核苷酸與經修飾多核苷酸之結合如Goodchild, Bioconjugate Chemistry,第1(3)卷, 165-187 (1990)中所綜述。 用於降低蛋白質表現之治療劑
在一些實施例中，治療劑為降低(亦即，減少、抑制、下調)蛋白質表現之治療劑。在一個實施例中，該治療劑降低標靶氣道細胞中之蛋白質表現。可用於降低蛋白質表現之治療劑類型之非限制性實例包括併有微小RNA結合位點(miR結合位點)之mRNA、微小RNA (miRNA)、拮抗劑、小(短)干擾RNA (siRNA) (包括短鏈物及切塊酶受質RNA)、RNA干擾(RNAi)分子、反義RNA、核酶、小髮夾RNA (shRNA)、鎖核酸(LNA)及CRISPR/Cas9技術。 肽/多肽治療劑
在一個實施例中，治療劑為肽治療劑。在一個實施例中，治療劑為多肽治療劑。
在一些實施例中，治療有效負載或防治有效負載包含編碼以下之mRNA：分泌蛋白；膜結合蛋白；或細胞間蛋白，或者肽、多肽或其生物活性片段。
在一些實施例中，治療有效負載或防治有效負載包含編碼分泌蛋白、肽、多肽或其生物活性片段之mRNA。在一些實施例中，治療有效負載或防治有效負載包含編碼膜結合蛋白、肽、多肽或其生物活性片段之mRNA。在一些實施例中，治療有效負載或防治有效負載包含編碼細胞內蛋白、肽、多肽或其生物活性片段之mRNA。在一些實施例中，治療有效負載或防治有效負載包含蛋白質、多肽或肽。
在一些實施例中，肽或多肽為天然來源的，例如自天然來源分離。在其他實施例中，該肽或多肽為合成分子，例如活體外產生之合成肽或多肽。在一些實施例中，該肽或多肽為重組分子。在一些實施例中，該肽或多肽為嵌合分子。在一些實施例中，肽或多肽為融合分子。在一個實施例中，組成物之肽或多肽治療劑為天然存在之肽或多肽。在一個實施例中，組成物之肽或多肽治療劑為天然存在之肽或多肽的經修飾形式(例如與其野生型、天然存在之肽或多肽配對物相比，含有少於3個、少於5個、少於10個、少於15個、少於20個或少於25個胺基酸取代、缺失或添加)。 包含陽離子劑之 LNP
本發明之LNP包含LNP核心及主要分佈在核心之外表面上的陽離子劑。該等LNP在生理pH下具有大於中性之ζ電位。
核心脂質奈米粒子典型地包含以下組分中之一或多者：脂質(其可包括可離子化胺基脂質、磷脂、輔助脂質，其可為中性脂質、兩性離子脂質、陰離子脂質及其類似物)、結構脂質諸如膽固醇或膽固醇類似物、脂肪酸、聚合物、穩定劑、鹽、緩沖劑、溶劑及其類似物。
本文提供之某些LNP核心包含可離子化脂質，諸如可離子化脂質，例如可離子化胺基脂質、磷脂、結構脂質及視情況存在之可以或可不以與另一脂質結合之方式提供的穩定劑(例如包含聚乙二醇之分子)。
結構脂質可為但不限於固醇，諸如膽固醇。結構脂質可為β-麥固醇。
輔助脂質為非陽離子脂質。輔助脂質可包含至少一個具有至少8C之脂肪酸鏈及至少一個極性頭基部分。
當使用包含聚乙二醇(亦即，PEG)之分子時，其可用作穩定劑。在一些實施例中，包含聚乙二醇之分子可為與脂質結合之聚乙二醇，因此可以例如PEG-c-DOMG或PEG-DMG形式提供。本文提供之某些LNP不包含或包含低水準之PEG化脂質，其不包括或包括低水準之烷基-PEG化脂質，且在本文中可稱為不含PEG或PEG化脂質。因此，一些LNP包含少於0.5 mol% PEG化脂質。在一些情況下，PEG可為烷基-PEG，諸如甲氧基-PEG。其他LNP包含非烷基-PEG，諸如羥基-PEG，及/或非烷基-PEG化脂質，諸如羥基-PEG化脂質。本文提供之某些LNP包含高水準之PEG化脂質。一些LNP包含0.5 mol% PEG化脂質。一些LNP包含超過0.5 mol% PEG化脂質。在一些實施例中，LNP包含1.5 mol% PEG化脂質。在一些實施例中，LNP包含3.0 mol% PEG化脂質。在一些實施例中，LNP包含0.1 mol%至3.0 mol% PEG化脂質、0.5 mol%至2.0 mol% PEG化脂質或1.0 mol%至1.5 mol% PEG化脂質。
在一些實施例中，核心奈米粒子組成物可具有莫耳比為50:10:38.5:1.5之化合物18:磷脂:Chol:N-月桂醯基-D-赤型-二氫鞘胺醇基磷醯膽鹼的調配物。在一些實施例中，奈米粒子核心組成物可具有莫耳比為50:10:38.5:1.5之化合物18:DSPC:Chol:化合物428的調配物。
化合物428：
Figure 02_image1363
本揭示案之核心奈米粒子組成物包含至少一種根據式(I)之化合物。舉例而言，奈米粒子組成物可包括化合物1-147中之一或多者。奈米粒子組成物亦可包括多種其他組分。舉例而言，除了根據式(I)或(II)之脂質外，奈米粒子組成物亦可包括一或多種其他脂質，例如(i)至少一種磷脂、(ii)至少一種結構脂質、(iii)至少一種PEG-脂質或(iv)其任何組合。
在一些實施例中，奈米粒子組成物包含式(I)化合物(例如化合物18、25、26或48)。在一些實施例中，奈米粒子組成物包含式(I)化合物(例如化合物18、25、26或48)及磷脂(例如DSPC、DOPE或MSPC)。在一些實施例中，奈米粒子組成物包含式(I)化合物(例如化合物18、25、26或48)及磷脂(例如DSPC、DPPC、DOPE或MSPC)。
本揭示案亦提供一種製備奈米粒子之方法，該方法包括使脂質奈米粒子與陽離子劑接觸，其中該脂質奈米粒子包含： (a)      脂質奈米粒子核心，其包含： (i)      可離子化脂質， (ii)     磷脂， (iii)    結構脂質，及 (iv)    PEG-脂質，以及 (b)     封裝在核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載。
在一些實施例中，脂質奈米粒子與陽離子劑之接觸包含將陽離子劑溶解於非離子賦形劑中。在一些實施例中，非離子賦形劑選自聚乙烯二醇15羥基硬脂酸酯(HS 15)、1,2-二肉荳蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (DMG-PEG2K)、化合物428、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[TWEEN®80]及d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)。在一些實施例中，非離子賦形劑為聚乙烯二醇15羥基硬脂酸酯(HS 15)。在一些實施例中，脂質奈米粒子與陽離子劑之接觸包含將陽離子劑溶解於緩衝溶液中。在一些實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些實施例中，緩衝溶液為基於Tris之緩衝液。
提供藉由如本文所述之方法，例如藉由使脂質奈米粒子與陽離子劑接觸而製備之奈米粒子。在一些實施例中，陽離子劑可為固醇胺，諸如GL-67。在一些實施例中，脂質奈米粒子之脂質奈米粒子核心視情況包含PEG-脂質。在一些實施例中，形成與陽離子劑接觸之脂質奈米粒子的脂質奈米粒子核心實質上不含PEG-脂質。在一些實施例中，在與陽離子劑接觸之前或在與陽離子劑接觸之後，將PEG-脂質與陽離子劑一起添加至脂質奈米粒子中。
在一個實施例中，本發明之LNP可使用傳統混合技術製備，其中將核酸有效負載與核心LNP組分混合以產生核心LNP加有效負載。製得此負載核心LNP之後，使陽離子劑與負載核心LNP接觸。
在另一實施例中，本發明之LNP可使用空LNP作為起點來製備。舉例而言，如圖1所示，製備空LNP，隨後載入核酸有效負載。使核酸有效負載與LNP接觸之後，可添加陽離子劑以形成本發明之LNP。
舉例而言，在一個實施例中，在事後裝載(PHL)方法中，首先在奈米沉澱步驟中調配空LNP，且將緩衝液交換為低pH緩衝液(亦即pH 5)。隨後，經由混合事件將此等空LNP引入mRNA (亦在低pH下酸化)中。在混合步驟之後，使用pH調節方法來中和pH。最後，添加PEG脂質，例如DMG-PEG-2k以穩定粒子。隨後將此等粒子濃縮至標靶濃度且過濾。添加陽離子劑，例如GL67。
空LNP起點之變化如圖2所說明。圖2展示使用LNP之脂質(不包括PEG脂質)形成空LNP。隨後使核酸溶液與空LNP接觸，形成負載LNP。在負載LNP之進一步處理期間的一或兩個點添加PEG脂質，且可在進一步處理期間之任何點添加陽離子劑，如圖2中的虛線框所說明。圖3為圖2中方法之更特定形式，且同樣，陽離子劑可在負載LNP之進一步處理期間之任何點添加。
在一些實施例中，本發明之LNP可使用奈米沉澱製備，奈米沉澱為如下單元操作，其中LNP藉由動力學混合，隨後進行成熟及連續稀釋來自其個別脂質組分自組裝。該單元操作包括三個個別步驟，其為：混合水性與有機輸入、使LNP成熟以及在受控滯留時間後稀釋。由於此等步驟之連續性，故將其視為一個單元操作。單元操作包括三個液體流之連續線上組合以及一個線上成熟步驟：將水性緩衝液與脂質儲備溶液混合，經由受控滯留時間進行成熟，及稀釋奈米粒子。奈米沉澱本身發生在適合規模之混合器中，該混合器經設計以允許水溶液與溶解在乙醇中之脂質儲備溶液的連續、高能量組合。在整個此操作中，水溶液及脂質儲備溶液均同時連續流入混合硬體中。保持脂質溶解之乙醇含量突然減少，且脂質均彼此沉澱。由此粒子在混合室中自組裝。
單元操作之目標之一為將溶液交換為不含乙醇之全水性緩衝液，且達到LNP之標靶濃度。此可藉由如下步驟實現：首先達到標靶處理濃度，隨後滲濾，接著(若需要)在乙醇完全去除後進行最終濃縮步驟。
在一些實施例中，本發明之LNP可使用奈米沉澱製備，奈米沉澱為如下單元操作，其中LNP藉由動力學混合，隨後進行成熟及連續稀釋來自其個別脂質組分自組裝。該單元操作包括三個個別步驟，其為：混合水性與有機輸入、使LNP成熟以及在受控滯留時間後稀釋。由於此等步驟之連續性，故將其視為一個單元操作。單元操作包括三個液體流之連續線上組合以及一個線上成熟步驟：將水性緩衝液與脂質儲備溶液混合，經由受控滯留時間進行成熟，及稀釋奈米粒子。奈米沉澱本身發生在適合規模之混合器中，該混合器經設計以允許水溶液與溶解在乙醇中之脂質儲備溶液的連續、高能量組合。在整個此操作中，水溶液及脂質儲備溶液均同時連續流入混合硬體中。保持脂質溶解之乙醇含量突然減少，且脂質均彼此沉澱。由此粒子在混合室中自組裝。
單元操作之目標之一為將溶液交換為不含乙醇之全水性緩衝液，且達到LNP之標靶濃度。此可藉由如下步驟實現：首先達到標靶處理濃度，隨後滲濾，接著(若需要)在乙醇完全去除後進行最終濃縮步驟。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備包含空脂質奈米粒子(空LNP)之空脂質奈米粒子溶液(空LNP溶液)之方法，該方法包括： i)        奈米沉澱步驟，其包含： i-a)     混合步驟，其包含使包含可離子化脂質、結構脂質、磷脂及PEG脂質之脂質溶液與包含第一緩衝劑之水性緩衝溶液混合，從而形成包含中間空奈米粒子(中間空LNP)之中間空脂質奈米粒子溶液(中間空LNP溶液)； i-b)    將中間空LNP溶液保存一段滯留時間；及 i-c)     向中間空LNP溶液中添加稀釋溶液，從而形成包含空LNP之空LNP溶液。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備包含空脂質奈米粒子(空LNP)之空脂質奈米粒子溶液(空LNP溶液)之方法，該方法包括： i)        奈米沉澱步驟，其包含： i-a)     混合步驟，其包含使包含可離子化脂質、結構脂質、磷脂及PEG脂質之脂質溶液與包含第一緩衝劑之水性緩衝溶液混合，從而形成包含中間空奈米粒子(中間空LNP)之中間空脂質奈米粒子溶液(中間空LNP溶液)； i-b)    將中間空LNP溶液保存一段滯留時間； i-c)     向中間空LNP溶液中添加稀釋溶液，從而形成包含空LNP之空LNP溶液；及 ii)       處理空LNP溶液。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備包含空脂質奈米粒子(空LNP)之空脂質奈米粒子溶液(空LNP溶液)之方法，該方法包括： ii)       處理包含空LNP之空LNP溶液。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備脂質奈米粒子調配物(LNP調配物)之方法，該方法包括： i)        奈米沉澱步驟，其包含： i-a)     混合步驟，其包含使包含可離子化脂質、結構脂質、磷脂及PEG脂質之脂質溶液與包含第一緩衝劑之水性緩衝溶液混合，從而形成包含中間空奈米粒子(中間空LNP)之中間空脂質奈米粒子溶液(中間空LNP溶液)； i-b)    將中間空LNP溶液保存一段滯留時間； i-c)     向中間空LNP溶液中添加稀釋溶液，從而形成包含空LNP之空LNP溶液；及 ii)       處理空LNP溶液；及 iii)      裝載步驟，其包含使包含核酸之核酸溶液與空LNP溶液混合，從而形成包含負載脂質奈米粒子(負載LNP)之負載LNP溶液。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備脂質奈米粒子調配物(LNP調配物)之方法，該方法包括： i)        奈米沉澱步驟，其包含： i-a)     混合步驟，其包含使包含可離子化脂質、結構脂質、磷脂及PEG脂質之脂質溶液與包含第一緩衝劑之水性緩衝溶液混合，從而形成包含中間空奈米粒子(中間空LNP)之中間空脂質奈米粒子溶液(中間空LNP溶液)； i-b)    將中間空LNP溶液保存一段滯留時間； i-c)     向中間空LNP溶液中添加稀釋溶液，從而形成包含空LNP之空LNP溶液；及 ii)       處理空LNP溶液； iii)      裝載步驟，其包含使包含核酸之核酸溶液與空LNP溶液混合，從而形成包含負載脂質奈米粒子(負載LNP)之負載LNP溶液；及 iv)      處理負載LNP溶液，從而形成負載LNP調配物。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備脂質奈米粒子調配物(LNP調配物)之方法，該方法包括： i)        奈米沉澱步驟，其包含： i-a)     混合步驟，其包含使包含可離子化脂質、結構脂質、磷脂及PEG脂質之脂質溶液與包含第一緩衝劑之水性緩衝溶液混合，從而形成包含中間空奈米粒子(中間空LNP)之中間空脂質奈米粒子溶液(中間空LNP溶液)； i-b)    將中間空LNP溶液保存一段滯留時間； i-c)     向中間空LNP溶液中添加稀釋溶液，從而形成包含空LNP之空LNP溶液；及 ii)       處理空LNP溶液； iii)      裝載步驟，其包含使包含核酸之核酸溶液與空LNP溶液混合，從而形成包含負載脂質奈米粒子(負載LNP)之負載LNP溶液； iv)      處理負載LNP溶液，從而形成負載LNP調配物；及 v)       添加陽離子劑。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備脂質奈米粒子調配物(LNP調配物)之方法，該方法包括： iii)      裝載步驟，其包含使包含核酸之核酸溶液與包含空LNP之空LNP溶液混合，從而形成包含負載脂質奈米粒子(負載LNP)之負載奈米粒子溶液(負載LNP溶液)。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備脂質奈米粒子調配物(LNP調配物)之方法，該方法包括： iii)      裝載步驟，其包含使包含核酸之核酸溶液與包含空LNP之空LNP溶液混合，從而形成包含負載脂質奈米粒子(負載LNP)之負載奈米粒子溶液(負載LNP溶液)；及 iv)      處理負載LNP溶液，從而形成負載LNP調配物。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備脂質奈米粒子調配物(LNP調配物)之方法，該方法包括： iii)      裝載步驟，其包含使包含核酸之核酸溶液與包含空LNP之空LNP溶液混合，從而形成包含負載脂質奈米粒子(負載LNP)之負載奈米粒子溶液(負載LNP溶液) iv)      處理負載LNP溶液，從而形成負載LNP調配物；及 v)       添加陽離子劑。
在一些實施例中，步驟i-a)至i-c)在各別操作單元(例如各別反應裝置)中進行。
在一些實施例中，步驟i-a)至i-c)在單個操作單元中進行。在一些實施例中，步驟i-a)至i-c)在連續流動裝置中進行，使得步驟i-c)在步驟i-b)之下游，該步驟i-b)在步驟i-a)之下游。
在一些實施例中，在步驟i-c)中，添加一次稀釋溶液。
在一些實施例中，在步驟i-c)中，連續添加稀釋溶液。
在一些態樣中，本揭示案提供一種產生空脂質奈米粒子(空LNP)之方法，該方法包括：i)混合步驟，其包含使可離子化脂質與第一緩衝劑混合，從而形成空LNP，其中空LNP包含約0.1 mol%至約0.5 mol%聚合脂質(例如PEG脂質)。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備包含空脂質奈米粒子(空LNP)之空脂質奈米粒子溶液(空LNP溶液)之方法，該方法包括： i)        混合步驟，其包含使包含可離子化脂質、結構脂質、磷脂及PEG脂質之脂質溶液與包含第一緩衝劑之水性緩衝溶液混合，從而形成包含空LNP之空脂質奈米粒子溶液(空LNP溶液)。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備包含空脂質奈米粒子(空LNP)之空脂質奈米粒子溶液(空LNP溶液)之方法，該方法包括： i)        混合步驟，其包含使包含可離子化脂質、結構脂質、磷脂及PEG脂質之脂質溶液與包含第一緩衝劑之水性緩衝溶液混合，從而形成包含空LNP之空脂質奈米粒子溶液(空LNP溶液)；及 ii)       處理空LNP溶液。
在一些實施例中，混合步驟包含使包含可離子化脂質之脂質溶液與包含第一緩衝劑之水性緩衝溶液混合，從而形成包含空LNP之空脂質奈米粒子溶液(空LNP溶液)。
在一些態樣中，本揭示案提供一種製備與核酸結合之負載脂質奈米粒子(負載LNP)之方法，該方法包括：ii)裝載步驟，其包含使核酸與空LNP混合，繼而添加陽離子劑，從而形成負載LNP。
在一些實施例中，裝載步驟包含使包含核酸之核酸溶液與空LNP溶液混合，繼而添加陽離子劑，從而形成包含負載LNP之負載脂質奈米粒子溶液(負載LNP溶液)。
在一些實施例中，空LNP或空LNP溶液在不進行保存或儲存之情況下進行裝載步驟。
在一些實施例中，空LNP或空LNP溶液在保存一段時期後進行裝載步驟。
在一些實施例中，空LNP或空LNP溶液在保存約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約18小時或約24小時後進行裝載步驟。
在一些實施例中，空LNP或空LNP溶液在儲存約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約18小時、約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約1年、約2年、約3年、約4年或約5年後進行裝載步驟。
在一些實施例中，在形成之後，空LNP或空LNP溶液在未儲存或保存一段時期之情況下進行裝載步驟。
在一些態樣中，本揭示案提供一種方法，該方法進一步包含：ii)處理空LNP溶液。
在一些態樣中，本揭示案提供一種方法，該方法進一步包含：iv)處理負載LNP溶液，從而形成脂質奈米粒子調配物(LNP調配物)。
與其他產生技術( 例如薄膜再水合/擠壓)形成對比，乙醇滴加沉澱(ethanol-drop precipitation)已成為用於產生核酸脂質奈米粒子之工業標準。沉澱反應因其連續性、可放大性及易用性而受到青睞。彼等方法通常使用高能混合器( 例如T型接頭、受限衝擊射流、微流體混合器、渦旋混合器)以可控制方式將脂質(在乙醇中)引入合適反溶劑(亦即，水)中，從而驅動液體過飽和及自發沉澱成脂質粒子。在一些實施例中，所用之渦旋混合器係描述於美國專利申請案第62/799,636號及第62/886,592號中之彼等，該等美國專利申請案以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，所用之微流體混合器為PCT申請案第WO/2014/172045號中所述之彼等混合器，該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，混合物步驟用T形接頭、受限衝擊射流、微流體混合器或渦旋混合器進行。
在一些實施例中，裝載步驟用T形接頭、受限衝擊射流、微流體混合器或渦旋混合器進行。
在一些實施例中，混合步驟在小於約30℃、小於約28℃、小於約26℃、小於約24℃、小於約22℃、小於約20℃或小於約環境溫度之溫度下進行。
在一些實施例中，裝載步驟在小於約30℃、小於約28℃、小於約26℃、小於約24℃、小於約22℃、小於約20℃或小於約環境溫度之溫度下進行。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟包含第一添加步驟，該第一添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至空LNP或負載LNP中。
在一些實施例中，處理空LNP溶液之步驟包含第一添加步驟，該第一添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至空LNP溶液中。
在一些實施例中，處理空LNP溶液之步驟包含第一添加步驟，該第一添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至空LNP中。
在一些實施例中，處理負載LNP溶液之步驟包含第一添加步驟，該第一添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至負載LNP溶液中。
在一些實施例中，處理負載LNP溶液之步驟包含第一添加步驟，該第一添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至負載LNP中。
在一些實施例中，第一添加步驟包含將包含PEG脂質之聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至空LNP溶液或負載LNP溶液中。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟包含第二添加步驟，該第二添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至空LNP或負載LNP中。
在一些實施例中，處理空LNP溶液之步驟包含第二添加步驟，該第二添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至空LNP溶液中。
在一些實施例中，處理空LNP溶液之步驟包含第二添加步驟，該第二添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至空LNP中。
在一些實施例中，處理負載LNP溶液之步驟包含第二添加步驟，該第二添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至負載LNP溶液中。
在一些實施例中，處理負載LNP溶液之步驟包含第二添加步驟，該第二添加步驟包含將聚乙二醇脂質(PEG脂質)添加至負載LNP中。
在一些實施例中，第二添加步驟包含將包含PEG脂質之聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至空LNP溶液或負載LNP溶液中。
在一些實施例中，第一添加步驟包含將約0.1 mol%至約3.0 mol% PEG、約0.2 mol%至約2.5 mol% PEG、約0.5 mol%至約2.0 mol% PEG、約0.75 mol%至約1.5 mol% PEG、約1.0 mol%至約1.25 mol% PEG添加至空LNP或負載LNP中。
在一些實施例中，第一添加步驟包含將約0.1 mol%至約3.0 mol% PEG、約0.2 mol%至約2.5 mol% PEG、約0.5 mol%至約2.0 mol% PEG、約0.75 mol%至約1.5 mol% PEG、約1.0 mol%至約1.25 mol% PEG添加至空LNP或負載LNP中。在一些實施例中，第一添加步驟包含添加約0.1 mol%、約0.2 mol%、約0.3 mol%、約0.4 mol%、約0.5 mol%、約0.6 mol%、約0.7 mol%、約0.8 mol%、約0.9 mol%、約1.0 mol%、約1.1 mol%、約1.2 mol%、約1.3 mol%、約1.4 mol%、約1.5 mol%、約1.6 mol%、約1.7 mol%、約1.8 mol%、約1.9 mol%、約2.0 mol%、約2.1 mol%、約2.2 mol%、約2.3 mol%、約2.4 mol%、約2.5 mol%、約2.6 mol%、約2.7 mol%、約2.8 mol%、約2.9 mol%或約3.0 mol% PEG脂質(例如PEG 2k-DMG)。
在一些實施例中，第一添加步驟包含添加約1.75±0.5 mol%、約1.75±0.4 mol%、約1.75±0.3 mol%、約1.75±0.2 mol%或約1.75±0.1 mol% (例如約1.75 mol%) PEG脂質(例如PEG 2k-DMG)。
在一些實施例中，在第一添加步驟之後，空LNP溶液(例如空LNP)包含約1.0 mol%、約1.1 mol%、約1.2 mol%、約1.3 mol%、約1.4 mol%、約1.5 mol%、約1.6 mol%、約1.7 mol%、約1.8 mol%、約1.9 mol%、約2.0 mol%、約2.1 mol%、約2.2 mol%、約2.3 mol%、約2.4 mol%、約2.5 mol%、約2.6 mol%、約2.7 mol%、約2.8 mol%、約2.9 mol%、約3.0 mol%、約3.1 mol%、約3.2 mol%、約3.3 mol%、約3.4 mol%、約3.5 mol%、約3.6 mol%、約3.7 mol%、約3.8 mol%、約3.9 mol%、約4.0 mol%、約4.1 mol%、約4.2 mol%、約4.3 mol%、約4.4 mol%、約4.5 mol%、約4.6 mol%、約4.7 mol%、約4.8 mol%、約4.9 mol%或約5.0 mol% PEG脂質(例如PEG 2k-DMG)。
在一些實施例中，在第一添加步驟之後，負載LNP溶液(例如負載LNP)包含約1.0 mol%、約1.1 mol%、約1.2 mol%、約1.3 mol%、約1.4 mol%、約1.5 mol%、約1.6 mol%、約1.7 mol%、約1.8 mol%、約1.9 mol%、約2.0 mol%、約2.1 mol%、約2.2 mol%、約2.3 mol%、約2.4 mol%、約2.5 mol%、約2.6 mol%、約2.7 mol%、約2.8 mol%、約2.9 mol%、約3.0 mol%、約3.1 mol%、約3.2 mol%、約3.3 mol%、約3.4 mol%、約3.5 mol%、約3.6 mol%、約3.7 mol%、約3.8 mol%、約3.9 mol%、約4.0 mol%、約4.1 mol%、約4.2 mol%、約4.3 mol%、約4.4 mol%、約4.5 mol%、約4.6 mol%、約4.7 mol%、約4.8 mol%、約4.9 mol%或約5.0 mol% PEG脂質(例如PEG 2k-DMG)。
在一些實施例中，第二添加步驟包含將約0.1 mol%至約3.0 mol% PEG、約0.2 mol%至約2.5 mol% PEG、約0.5 mol%至約2.0 mol% PEG、約0.75 mol%至約1.5 mol% PEG、約1.0 mol%至約1.25 mol% PEG添加至空LNP或負載LNP中。
在一些實施例中，第二添加步驟包含將約0.1 mol%至約3.0 mol% PEG、約0.2 mol%至約2.5 mol% PEG、約0.5 mol%至約2.0 mol% PEG、約0.75 mol%至約1.5 mol% PEG、約1.0 mol%至約1.25 mol% PEG添加至空LNP或負載LNP中。
在一些實施例中，第二添加步驟包含添加約0.1 mol%、約0.2 mol%、約0.3 mol%、約0.4 mol%、約0.5 mol%、約0.6 mol%、約0.7 mol%、約0.8 mol%、約0.9 mol%、約1.0 mol%、約1.1 mol%、約1.2 mol%、約1.3 mol%、約1.4 mol%、約1.5 mol%、約1.6 mol%、約1.7 mol%、約1.8 mol%、約1.9 mol%、約2.0 mol%、約2.1 mol%、約2.2 mol%、約2.3 mol%、約2.4 mol%、約2.5 mol%、約2.6 mol%、約2.7 mol%、約2.8 mol%、約2.9 mol%或約3.0 mol% PEG脂質(例如PEG 2k-DMG)。
在一些實施例中，第二添加步驟包含添加約1.0±0.5 mol%、約1.0±0.4 mol%、約1.0±0.3 mol%、約1.0±0.2 mol%或約1.0±0.1 mol% (例如約1.0 mol%) PEG脂質(例如PEG 2k-DMG)。
在一些實施例中，第二添加步驟包含將約1.0 mol% PEG脂質添加至空LNP或負載LNP中。
在一些實施例中，在第二添加步驟之後，空LNP溶液(例如空LNP)包含約1.0 mol%、約1.1 mol%、約1.2 mol%、約1.3 mol%、約1.4 mol%、約1.5 mol%、約1.6 mol%、約1.7 mol%、約1.8 mol%、約1.9 mol%、約2.0 mol%、約2.1 mol%、約2.2 mol%、約2.3 mol%、約2.4 mol%、約2.5 mol%、約2.6 mol%、約2.7 mol%、約2.8 mol%、約2.9 mol%、約3.0 mol%、約3.1 mol%、約3.2 mol%、約3.3 mol%、約3.4 mol%、約3.5 mol%、約3.6 mol%、約3.7 mol%、約3.8 mol%、約3.9 mol%、約4.0 mol%、約4.1 mol%、約4.2 mol%、約4.3 mol%、約4.4 mol%、約4.5 mol%、約4.6 mol%、約4.7 mol%、約4.8 mol%、約4.9 mol%或約5.0 mol% PEG脂質(例如PEG 2k-DMG)。
在一些實施例中，在第二添加步驟之後，負載LNP溶液(例如負載LNP)包含約1.0 mol%、約1.1 mol%、約1.2 mol%、約1.3 mol%、約1.4 mol%、約1.5 mol%、約1.6 mol%、約1.7 mol%、約1.8 mol%、約1.9 mol%、約2.0 mol%、約2.1 mol%、約2.2 mol%、約2.3 mol%、約2.4 mol%、約2.5 mol%、約2.6 mol%、約2.7 mol%、約2.8 mol%、約2.9 mol%、約3.0 mol%、約3.1 mol%、約3.2 mol%、約3.3 mol%、約3.4 mol%、約3.5 mol%、約3.6 mol%、約3.7 mol%、約3.8 mol%、約3.9 mol%、約4.0 mol%、約4.1 mol%、約4.2 mol%、約4.3 mol%、約4.4 mol%、約4.5 mol%、約4.6 mol%、約4.7 mol%、約4.8 mol%、約4.9 mol%或約5.0 mol% PEG脂質(例如PEG 2k-DMG)。
在一些實施例中，第一添加步驟在小於約30℃、小於約28℃、小於約26℃、小於約24℃、小於約22℃、小於約20℃或小於約環境溫度之溫度下進行。
在一些實施例中，第二添加步驟在小於約30℃、小於約28℃、小於約26℃、小於約24℃、小於約22℃、小於約20℃或小於約環境溫度之溫度下進行。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含選自過濾、pH調節、緩衝液交換、稀釋、透析、濃縮、冷凍、凍乾、儲存及包裝之至少一個步驟。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含pH調節。
在一些實施例中，pH調節包含添加第二緩衝劑，該第二緩衝劑選自由乙酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液及tris緩衝液組成之群。
在一些實施例中，第一添加步驟在pH調節之前進行。
在一些實施例中，第一添加步驟在pH調節之後進行。
在一些實施例中，第二添加步驟在pH調節之前進行。
在一些實施例中，第二添加步驟在pH調節之後進行。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含過濾。
在一些實施例中，過濾為切向流過濾(TFF)。
在一些實施例中，過濾自LNP溶液移除有機溶劑(例如乙醇(alcohol/ethanol))。在一些實施例中，在移除有機溶劑(例如乙醇)後，LNP溶液轉化為在中性pH、pH 6.5至7.8、pH 6.8至pH 7.5，較佳地pH 7.0至pH 7.2下緩衝(例如磷酸鹽或HEPES緩衝液)之溶液。在一些實施例中，LNP溶液轉化為在約7.0之pH至約7.2之pH下緩衝之溶液。在一些實施例中，所得LNP溶液在儲存或使用之前，例如藉由過濾(例如經由0.1-0.5 µm過濾器)滅菌。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含緩衝液交換。
在一些實施例中，緩衝液交換包含添加包含第三緩衝劑之水性緩衝溶液。
在一些實施例中，第一添加步驟在緩衝液交換之前進行。
在一些實施例中，第一添加步驟在緩衝液交換之後進行。
在一些實施例中，第二添加在緩衝液交換之前進行。
在一些實施例中，第二添加步驟在緩衝液交換之後進行。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含稀釋。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含透析。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含濃縮。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含冷凍。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含凍干。
在一些實施例中，凍乾包含在約-100℃至約0℃、約-80℃至約-10℃、約-60℃至約-20℃、約-50℃至約-25℃或約-40℃至約-30℃之溫度下冷凍負載LNP溶液。
在一些實施例中，凍乾進一步包含乾燥經冷凍之負載LNP溶液，形成經凍乾之空LNP或經凍乾之負載LNP。
在一些實施例中，乾燥在約50毫托(mTorr)至約150毫托範圍內之真空下進行。
在一些實施例中，乾燥在約-35℃至約-15℃下進行。
在一些實施例中，乾燥在約室溫至約25℃下進行。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含儲存。
在一些實施例中，儲存包含在約-80℃、約-78℃、約-76℃、約-74℃、約-72℃、約-70℃、約-65℃、約-60℃、約-55℃、約-50℃、約-45℃、約-40℃、約-35℃或約-30℃之溫度下儲存空LNP或負載LNP至少1天、至少2天、至少1週、至少2週、至少4週、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少6個月、至少8個月或至少1年。
在一些實施例中，儲存包含在約-40℃、約-35℃、約-30℃、約-25℃、約-20℃、約-15℃、約-10℃、約-5℃、約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃或約25℃之溫度下儲存空LNP或負載LNP至少1天、至少2天、至少1週、至少2週、至少4週、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少6個月、至少8個月或至少1年。
在一些實施例中，儲存包含在約-40℃至約0℃、約-35℃至約-5℃、約-30℃至約-10℃、約-25℃至約-15℃、約-22℃至約-18℃或約-21℃至約-19℃之溫度下儲存空LNP或負載LNP至少1天、至少2天、至少1週、至少2週、至少4週、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少6個月、至少8個月或至少1年。
在一些實施例中，儲存包含在約-20℃之溫度下儲存空LNP或負載LNP至少1天、至少2天、至少1週、至少2週、至少4週、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少6個月、至少8個月或至少1年。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟進一步包含包裝。
如本文所用，「包裝」可指藥物產品以其最終狀態儲存，或空LNP、負載LNP或LNP調配物在置於最終封裝中之前的過程中儲存。儲存及/或包裝模式包括但不限於在無菌袋中冷藏、小瓶中之經冷藏或經冷凍調配物、小瓶及注射器中之經凍乾調配物等。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟包含：iia)將冷凍保護劑添加至空LNP或負載LNP溶液中。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟包含：iib)過濾空LNP溶液或負載LNP溶液。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟包含： iia)     將冷凍保護劑添加至空LNP或負載LNP溶液中；及 iic)     過濾空LNP溶液或負載LNP溶液。
在一些實施例中，處理空LNP溶液或負載LNP溶液之步驟包含以下步驟中之一或多者： iib)     將冷凍保護劑添加至空LNP溶液或負載LNP溶液中； iic)     凍乾空LNP溶液或負載LNP溶液，由此形成經凍乾LNP組合物； iid)     儲存經凍乾LNP組合物之空LNP溶液或負載LNP溶液；及 iie)     將緩衝溶液添加至空LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物中，從而形成LNP調配物。
在一些實施例中，處理空LNP溶液之步驟包含：iia)將冷凍保護劑添加至空LNP溶液中。
在一些實施例中，處理空LNP溶液之步驟包含：iib)過濾空LNP溶液。
在一些實施例中，處理空LNP溶液之步驟包含： iia)     將冷凍保護劑添加至空LNP溶液中；及 iic)     過濾空LNP溶液。
在一些實施例中，冷凍保護劑在凍乾之前添加至空LNP溶液或負載LNP溶液中。在一些實施例中，冷凍保護劑包含一或多種冷凍保護劑，且一或多種冷凍保護劑中之每一者獨立地為多元醇(例如二醇或三醇，諸如丙二醇(亦即，1,2-丙二醇))、1,3-丙二醇、甘油、(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇、1,6-己二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、乙二醇或二乙二醇)、非去汙劑磺基甜菜鹼(例如，NDSB-201 (3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸鹽)、滲透劑(例如，L-脯胺酸或三甲基胺N-氧化物二水合物)、聚合物(例如，聚乙二醇200 (PEG 200)、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG 2k-DMG、 PEG 3350、PEG 4000、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000、聚乙二醇單甲醚550 (mPEG 550)、mPEG 600、mPEG 2000、mPEG 3350、mPEG 4000、mPEG 5000、聚乙烯吡咯啶酮(例如，聚乙烯吡咯啶酮K 15)、新戊四醇丙氧基化物或聚丙二醇P 400 )、有機溶劑(例如二甲亞碸(DMSO)或乙醇)、糖(例如D-(+)-蔗糖、D-山梨糖醇、海藻糖、D-(+)-麥芽糖單水合物、內消旋-赤蘚糖醇、木糖醇、肌醇、D-(+)-棉子糖五水合物、D-(+)-海藻糖二水合物或D-(+)-葡萄糖單水合物)或鹽(例如乙酸鋰、氯化鋰、甲酸鋰、硝酸鋰、硫酸鋰、乙酸鎂、乙酸鈉、氯化鈉、甲酸鈉、丙二酸鈉、硝酸鈉、硫酸鈉或其任何水合物)或其任何組合。在一些實施例中，冷凍保護劑包含蔗糖。在一些實施例中，冷凍保護劑及/或賦形劑為蔗糖。在一些實施例中，冷凍保護劑包含乙酸鈉。在一些實施例中，冷凍保護劑及/或賦形劑為乙酸鈉。在一些實施例中，冷凍保護劑包含蔗糖及乙酸鈉。
在一些實施例中，冷凍保護劑包含以如下濃度存在之冷凍保護劑：約10 g/L至約1000 g/L、約25 g/L至約950 g/L、約50 g/L至約900 g/L、約75 g/L至約850 g/L、約100 g/L至約800 g/L、約150 g/L至約750 g/L、約200 g/L至約700 g/L、約250 g/L至約650 g/L、約300 g/L至約600 g/L、約350 g/L至約550 g/L、約400 g/L至約500 g/L及約450 g/L至約500 g/L。在一些實施例中，冷凍保護劑包含以如下濃度存在之冷凍保護劑：約10 g/L至約500 g/L、約50 g/L至約450 g/L、約100 g/L至約400 g/L、約150 g/L至約350 g/L、約200 g/L至約300 g/L及約200 g/L至約250 g/L。在一些實施例中，冷凍保護劑包含以如下濃度存在之冷凍保護劑：約10 g/L、約25 g/L、約50 g/L、約75 g/L、約100 g/L、約150 g/L、約200 g/L、約250 g/L、約300 g/L、約300 g/L、約350 g/L、約400 g/L、約450 g/L、約500 g/L、約550 g/L、約600 g/L、約650 g/L、約700 g/L、約750 g/L、約800 g/L、約850 g/L、約900 g/L、約950 g/L及約1000 g/L。
在一些實施例中，冷凍保護劑包含以如下濃度存在之冷凍保護劑：約0.1 mM至約100 mM、約0.5 mM至約90 mM、約1 mM至約80 mM、約2 mM至約70 mM、約3 mM至約60 mM、約4 mM至約50 mM、約5 mM至約40 mM、約6 mM至約30 mM、約7 mM至約25 mM、約8 mM至約20 mM、約9 mM至約15 mM及約10 mM至約15 mM。在一些實施例中，冷凍保護劑包含以如下濃度存在之冷凍保護劑：約0.1 mM至約10 mM、約0.5 mM至約9 mM、約1 mM至約8 mM、約2 mM至約7 mM、約3 mM至約6 mM及約4 mM至約5 mM。在一些實施例中，冷凍保護劑包含以如下濃度存在之冷凍保護劑：約0.1 mM、約0.5 mM、約1 mM、約2 mM、約3 mM、約4 mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM、約90 mM、約95 mM及約100 mM。
在一些實施例中，冷凍保護劑包含蔗糖。
在一些實施例中，冷凍保護劑包括包含蔗糖之水溶液。
在一些實施例中，冷凍保護劑包括包含約700±300 g/L、700±200 g/L、700±100 g/L、700±90 g/L、700±80 g/L、700±70 g/L、700±60 g/L、700±50 g/L、700±40 g/L、700±30 g/L、700±20 g/L、700±10 g/L、700±9 g/L、700±8 g/L、700±7 g/L、700±6 g/L、700±5 g/L、700±4 g/L、700±3 g/L、700±2 g/L或700±1 g/L蔗糖之水溶液。
在一些實施例中，冷凍保護劑包括包含乙酸鈉及蔗糖之水溶液。
在一些實施例中，冷凍保護劑包括包含以下之水溶液： (a)      約5±1 mM、約5±0.9 mM、約5±0.8 mM、約5±0.5 mM、約5±0.6 mM、約5±0.5 mM、約5±0.4 mM、約5±0.3 mM、約5±0.2 mM或約5±0.1 mM乙酸鈉；及 (b)     約700±300 g/L、700±200 g/L、700±100 g/L、700±90 g/L、700±80 g/L、700±70 g/L、700±60 g/L、700±50 g/L、700±40 g/L、700±30 g/L、700±20 g/L、700±10 g/L、700±9 g/L、700±8 g/L、700±7 g/L、700±6 g/L、700±5 g/L、700±4 g/L、700±3 g/L、700±2 g/L或700±1 g/L蔗糖。
在一些實施例中，冷凍保護劑包括包含乙酸鈉及蔗糖之水溶液，其中水溶液之pH值為5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些實施例中，冷凍保護劑包括包含以下之水溶液： (a)      約5±1 mM、約5±0.9 mM、約5±0.8 mM、約5±0.5 mM、約5±0.6 mM、約5±0.5 mM、約5±0.4 mM、約5±0.3 mM、約5±0.2 mM或約5±0.1 mM乙酸鈉；及 (b)     約700±300 g/L、700±200 g/L、700±100 g/L、700±90 g/L、700±80 g/L、700±70 g/L、700±60 g/L、700±50 g/L、700±40 g/L、700±30 g/L、700±20 g/L、700±10 g/L、700±9 g/L、700±8 g/L、700±7 g/L、700±6 g/L、700±5 g/L、700±4 g/L、700±3 g/L、700±2 g/L或700±1 g/L蔗糖；及 其中水溶液之pH值為5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些實施例中，凍乾在合適玻璃容器(例如10 mL圓柱形玻璃小瓶)中進行。在一些實施例中，該玻璃容器能在短時間段內承受低於-40℃至高於室溫之極端溫度變化，及/或切割成均勻形狀。在一些實施例中，凍乾步驟包含在高於約-40℃之溫度下冷凍LNP溶液，從而形成經冷凍LNP溶液；及乾燥經冷凍LNP溶液，形成經凍乾LNP組成物。在一些實施例中，凍乾步驟包含在高於約-40℃且低於約-30℃之溫度下冷凍LNP溶液。冷凍步驟使溫度經約6分鐘線性降至最終溫度，較佳以每分鐘約1℃自20℃降至-40℃。在一些實施例中，冷凍步驟使溫度以每分鐘約1℃自20℃經約6分鐘線性降至最終溫度-40℃。在一些實施例中，可使用12-15%蔗糖，且乾燥步驟在約50毫托至約150毫托範圍內之真空下進行。在一些實施例中，可使用12-15%蔗糖，且乾燥步驟在約50毫托至約150毫托範圍內之真空下，首先在約-35℃至約-15℃範圍內之低溫下，隨後在室溫至約25℃範圍內之較高溫度下進行。在一些實施例中，可使用12-15%蔗糖，且乾燥步驟在約50毫托至約150毫托範圍內之真空下進行，且乾燥步驟在三至七天中完成。在一些實施例中，可使用12-15%蔗糖，且乾燥步驟在約50毫托至約150毫托範圍內之真空下，首先在約-35℃至約-15℃範圍內之低溫下，隨後在室溫至約25℃範圍內之較高溫度下進行，且乾燥步驟在三至七天中完成。在一些實施例中，乾燥步驟在約50毫托至約100毫托範圍內之真空下進行。在一些實施例中，乾燥步驟在約50毫托至約100毫托範圍內之真空下，首先在約-15℃至約0℃範圍內之低溫下，隨後在較高溫度下進行。
在一些實施例中，將空LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在約3.5至約8.0、約4.0至約7.5、約4.5至約7.0、約5.0至約6.5及約5.5至約6.0之pH下。在一些實施例中，將空LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在約3.5、約4.0、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約4.5、約5.5、約6.5、約7.0、約7.5及約8.0之pH下。
在一些實施例中，將LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在包含蔗糖及乙酸鈉之冷凍保護劑中。在一些實施例中，將LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在包含約150 g/L至約350 g/L蔗糖及約3 mM至約6 mM乙酸鈉(pH為約4.5至約7.0)之冷凍保護劑中。在一些實施例中，將LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在包含約200 g/L蔗糖及5 mM乙酸鈉(pH為約5.0)之冷凍保護劑中。
在一些實施例中，在添加緩衝溶液之前，將空LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在約-80℃、約-78℃、約-76℃、約-74℃、約-72℃、約-70℃、約-65℃、約-60℃、約-55℃、約-50℃、約-45℃、約-40℃、約-35℃或約-30℃之溫度下。
在一些實施例中，在添加緩衝溶液之前，將空LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在約-40℃、約-35℃、約-30℃、約-25℃、約-20℃、約-15℃、約-10℃、約-5℃、約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃或約25℃之溫度下。
在一些實施例中，在添加緩衝溶液之前，將空LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在約-40℃至約0℃、約-35℃至約-5℃、約-30℃至約-10℃、約-25℃至約-15℃、約-22℃至約-18℃或約-21℃至約-19℃範圍內之溫度下。
在一些實施例中，在添加緩衝溶液之前，將空LNP溶液、負載LNP溶液或經凍乾LNP組成物儲存在約-20℃之溫度下。
該等方法之某些態樣描述於PCT申請案第WO/2020/160397號中，該案以全文引用之方式併入本文中。
本文亦描述包含奈米粒子之細胞。細胞可為上皮細胞。舉例而言，細胞可為肺細胞。細胞可為呼吸道上皮細胞。舉例而言，細胞可為肺細胞、鼻細胞、肺泡上皮細胞或支氣管上皮細胞。細胞可為人類支氣管上皮(HBE)細胞。細胞可為HeLa細胞。該等細胞可在活體外或活體內與LNP接觸。 醫藥組成物及調配物
本揭示案提供包含本文所述奈米粒子中之任一者的醫藥組成物及調配物。
醫藥組成物或調配物可視情況包含一或多種其他活性物質， 例如治療及/或防治活性物質。本揭示案之醫藥組成物或調配物可為無菌及/或無熱原的。藥劑之調配及/或製備中之一般考慮因素可見於例如 Remington: The Science and Practice of Pharmacy第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (以全文引用之方式併入本文中)中。在一些實施例中，將組成物投與人類、人類患者或個體。出於本揭示案之目的，片語「活性成分」通常指包含如本文所述待遞送之多核苷酸或多肽有效負載的奈米粒子。
本文所述之調配物及醫藥組成物可藉由藥理學技術中已知或以後開發之任何方法來製備。一般而言，該等製備方法包括如下步驟：使奈米粒子與賦形劑及/或一或多種其他輔助成分結合，隨後需要及/或必要時，將產物分成、成形及/或包裝成所要單次劑量或多次劑量單位。
根據本揭示案之醫藥組成物或調配物可大批、以單次單位劑量及/或以複數個單次單位劑量製備、包裝及/或銷售。如本文所用，「單位劑量」係指包含預定量之活性成分(例如脂質奈米粒子)的醫藥組成物之分立量。活性成分之量通常等於投與個體之活性成分之劑量及/或該劑量之便利分數，諸如該劑量之一半或三分之一。
根據本揭示案之醫藥組成物中的活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何其他成分之相對量可視所治療個體之身份、體型及/或狀況且另外視欲投與該組成物之途徑而變化。
儘管本文提供之醫藥組成物及調配物之描述主要針對適用於投與人類之醫藥組成物及調配物，但熟練技術者應瞭解該等組成物通常適用於投與任何其他動物， 例如非人類動物， 例如非人類哺乳動物。
如本文所用之醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於適合於所要特定劑型之任何及所有溶劑、分散介質或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、稀釋劑、造粒劑及/或分散劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、黏合劑、潤滑劑或油、著色劑、甜味劑或調味劑、穩定劑、抗氧化劑、抗微生物劑或抗真菌劑、滲透壓調節劑、pH調節劑、緩沖劑、螯合劑、冷凍保護劑及/或增積劑。用於調配醫藥組成物之各種賦形劑及用於製備該組成物之技術為此項技術中所已知(參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第21版, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；該文獻以全文引用之方式倂入本文中)。
稀釋劑之實例包括但不限於碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉、乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇等及/或其組合。
例示性造粒劑及/或分散劑包括但不限於澱粉、預膠化澱粉或微晶澱粉、海藻酸、瓜爾膠、瓊脂、聚(乙烯-吡咯啶酮)、(聚維酮)、交聯聚(乙烯-吡咯啶酮)(交聯聚維酮)、纖維素、甲基纖維素、羧基甲基纖維素、交聯羧基甲基纖維素鈉(交聯羧甲基纖維素)、矽酸鎂鋁(VEEGUM®)、月桂基硫酸鈉等及/或其組合。
例示性表面活性劑及/或乳化劑包括但不限於天然乳化劑(例如阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、海藻酸鈉、黃蓍膠、角叉菜膠、膽固醇、黃原膠、果膠、明膠、蛋黃、酪蛋白、羊毛脂、膽固醇、蠟及卵磷脂)、脫水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[TWEEN®80]、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯[SPAN®40]、單油酸甘油酯、聚氧乙烯酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如CREMOPHOR®)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚[BRIJ®30])、PLUORINC®F 68、POLOXAMER®188等及/或其組合。
例示性黏合劑包括但不限於澱粉、明膠、糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)、胺基酸(例如甘胺酸)、天然及合成樹膠(例如阿拉伯膠、海藻酸鈉)、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等及其組合。
氧化為mRNA，尤其液體mRNA調配物之潛在降解路徑。為防止氧化，可向調配物中添加抗氧化劑。例示性抗氧化劑包括但不限於α-生育酚、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、苯甲醇、丁基化羥基茴香醚、間甲酚、甲硫胺酸、丁基化羥基甲苯、單硫代甘油、偏亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸氫鉀、丙酸、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉等及其組合。
例示性螯合劑包括但不限於乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸單水合物、依地酸二鈉、反丁烯二酸、蘋果酸、磷酸、依地酸鈉、酒石酸、依地酸三鈉等及其組合。
例示性抗微生物劑或抗真菌劑包括但不限於氯化苄烷銨、氯化苄乙氧銨、對羥苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯甲酸鉀或苯甲酸鈉、山梨酸鉀或山梨酸鈉、丙酸鈉、山梨酸等及其組合。
例示性防腐劑包括但不限於維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素、檸檬酸、抗壞血酸、丁基化羥基茴香醚、乙二胺、月桂基硫酸鈉(SLS)、月桂基醚硫酸鈉(SLES)等及其組合。
在一些實施例中，多核苷酸溶液之pH維持在pH 5與pH 8之間以改良穩定性。控制pH之例示性緩沖劑可包括但不限於磷酸鈉、檸檬酸鈉、丁二酸鈉、組胺酸(或組胺酸-HCl)、蘋果酸鈉、碳酸鈉等及/或其組合。
例示性潤滑劑包括但不限於硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸、矽石、滑石、麥芽、氫化植物油、聚乙二醇、苯甲酸鈉、月桂基硫酸鈉或月桂基硫酸鎂等及其組合。
本文所述之醫藥組成物可含有冷凍保護劑以在冷凍期間穩定本文所述之多核苷酸。例示性冷凍保護劑包括但不限於甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖等及其組合。
本文所述之醫藥組成物可在經凍乾多核苷酸調配物中含有增積劑以產生「醫藥學上精緻(pharmaceutically elegant)」之塊，在長期(例如36個月)儲存期間穩定經凍乾多核苷酸。本揭示案之例示性增積劑可包括但不限於蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、甘胺酸、乳糖、棉子糖及其組合。
組成物可為液體形式或固體形式。在一些實施例中，組成物或調配物為液體形式。在一些實施例中，組成物適用於吸入。可向肺道投與組成物。可將經霧化醫藥調配物遞送至肺，較佳使用多種市售裝置。
可藉由合適方法諸如鼻內滴注、氣管內滴注及氣管內註射向呼吸道投與組成物。在一些實施例中，藉由鼻內、支氣管內或肺投與來給與組合物或奈米粒子。舉例而言，藉由霧化器或吸入器投與組成物及奈米粒子。
在一些實施例中，藉由吸入經霧化醫藥調配物將組成物遞送至肺中。吸入可經由個體之鼻及/或口進行。投藥可藉由在吸入時自投與調配物或藉由呼吸器向呼吸器上之個體投與調配物來進行。用於將調配物遞送至肺之例示性裝置包括但不限於乾粉吸入器、加壓計量吸入器、霧化器及電流體動力氣霧劑裝置。
可使用加壓計量吸入器(pMDI)向患者之肺投與液體調配物。pMDI通常包括至少兩個組件：在壓力下固持液體調配物與一或多種推進劑之組合的罐，及用於固持及制動罐之容器。罐可含有單次劑量或多次劑量之調配物。罐可包括閥，典型地為計量閥，罐之內含物可自該閥排出。經氣霧化藥物藉由如下方法自pMDI分配：在罐上施加力將其推入容器中，從而打開閥且使藥物粒子自閥穿過容器出口輸送。自罐排出後，液體調配物經霧化，從而形成氣霧劑。pMDI典型地採用一或多種推進劑來加壓罐之內含物，且將液體調配物推出容器出口，形成氣霧劑。可使用任何合適推進劑。推進劑可採用多種形式。舉例而言，推進劑可為壓縮氣體或液化氣體。
液體調配物亦可使用霧化器投與。霧化器為液體氣霧劑產生器，其將液體調配物轉化為小液滴之霧或雲，較佳直徑小於5微米質量中值空氣動力學直徑之霧或雲，該等霧或雲可吸入下呼吸道中。此過程稱為霧化。當吸入氣霧劑雲時，液滴攜帶一或多種活性劑進入鼻、上呼吸道或深肺中。可使用任何類型之霧化器向患者投與調配物，包括但不限於氣動(噴射)霧化器及機電霧化器。氣動(噴射)霧化器使用加壓氣體供應作為液體調配物霧化之驅動力。壓縮氣體經由噴嘴(nozzle/jet)遞送以產生低壓場，該低壓場夾帶周圍液體調配物且其剪切成薄膜或細絲。膜或細絲不穩定，且會分解成小液滴，該等小液滴由壓縮氣流攜帶進入吸入之氣息中。插入液滴羽流中之擋板將較大液滴篩選出，且使其返回總液體儲罐中。機電霧化器使用電致機械力霧化液體調配物。可例如藉由以超音波頻率振動液體調配物，或藉由迫使大量液體穿過薄膜中之小孔來施加機電驅動力。該等力產生薄液膜或細絲流，其分解成小液滴以形成緩慢移動之氣霧劑流，該氣霧劑流可夾帶於吸入流中。液體調配物亦可使用電流體動力學(EHD)氣霧劑裝置投與。EHD氣霧劑裝置使用電能來霧化液體藥物溶液或懸浮液。
乾粉吸入器(DPI)典型地使用如下機制，諸如一陣氣體，在容器內產生乾粉雲，隨後可由個體吸入。在DPI中，待投與之劑量以非加壓乾粉之形式儲存，且在制動吸入器時，個體吸入粉末之粒子。在一些情況下，類似於加壓計量吸入器(pMDI)，可使用壓縮氣體(亦即推進劑)來分配粉末。在一些情況下，DPI可呼吸制動，此意謂氣霧劑在精確響應於吸氣時產生。典型地，乾粉吸入器每次投與之劑量小於數十毫克，以避免引起咳嗽。DPI之實例包括Turbohaler®吸入器(Astrazeneca, Wilmington, Del.)、Clickhaler®吸入器(Innovata, Ruddington, Nottingham, UKL)、Diskus®吸入器(Glaxo, Greenford, Middlesex, UK)、EasyHaler® (Orion, Expoo, FI)、Exubera®吸入器(Pfizer, New York, N.Y.)、Qdose®吸入器(Microdose, Monmouth Junction, N.J.)及Spiros®吸入器(Dura, San Diego, Calif.)。
本發明之醫藥組成物以有效量投與以例如由於正常基因產物之表現補充或置換缺陷蛋白或減少非所要蛋白之表現而引起所要生物作用，例如治療或防治作用，如在一些實施例中，藉由一或多種症狀之緩解來量測。調配物可以有效量投與以將LNP遞送至例如呼吸道及非呼吸道上皮細胞之頂膜來遞送有效負載。在一些實施例中，醫藥組成物以有效量投與以在罹患CF之患者中誘導不存在之CFTR活性或在罹患CF之患者中增加殘餘CFTR活性之現有水準。
可使用此項技術中已知之方法，包括標準電生理學、生物化學及/或組織化學技術容易地偵測所要生物活性，例如上皮表面處殘餘CFTR活性之存在。該等方法使用活體內或離體電生理學技術、汗液或唾液CT濃度之量測或離體生化或組織化學技術來鑒別及/或定量CFTR活性，從而監測CFTR細胞表面密度。 使用方法
本文描述治療或預防患者之疾病的方法，該疾病與氣道細胞功能障礙相關。方法包括向患者投與包含如本文所述之核酸有效負載的奈米粒子或組成物以用於治療或預防疾病。舉例而言，在一個實施例中，有效負載為核酸分子，例如mRNA分子，且疾病藉由在氣道上皮細胞中表現蛋白質或多肽而改善。在一些實施例中，疾病為囊腫性纖維化。
在一些實施例中，本文所述之奈米粒子用於降低有需要之個體的細胞鈉水準的方法中。
在一些實施例中，本文所述之奈米粒子用於降低與CF相關之代謝物(例如受質或產物)的水準，該方法包括向個體投與有效量之編碼CFTR多肽之多核苷酸。
在一些實施例中，投與有效量之本文所述之奈米粒子降低CF之生物標誌物的水準，例如細胞內鈉水準。在一些實施例中，投與本文所述之奈米粒子使CF之一或多種生物標誌物的水準，例如細胞內鈉水準在投與本文所述之奈米粒子後短時間段內降低。
在一些實施例中，向個體投與本文所述之奈米粒子使細胞中細胞內鈉水準降至比投與組成物或調配物之前觀察到之水準低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%之水準。
在一些實施例中，本文提供一種將多核苷酸或多肽有效負載遞送至細胞中之方法，該方法包括使細胞與本文所述之奈米粒子接觸。在一些實施例中，本文所述奈米粒子之投與引起個體細胞中CFTR之表現。在一些實施例中，投與本文所述之奈米粒子使個體之CFTR酶活性增加。舉例而言，該方法可使個體之至少一些細胞中的CFTR酶活性增加。
在一些實施例中，向個體投與本文所述之包含編碼CFTR多肽之mRNA的奈米粒子使個體細胞中之CFTR酶活性增加至正常個體， 例如未罹患CF之人類的預期活性水準之至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%或更多之水準。
在一些實施例中，投與本文所述之奈米粒子引起CFTR蛋白在個體之至少一些細胞中表現，該表現持續足夠時間段以允許顯著氯通道活性發生。
在一些實施例中，所編碼多肽之表現增加。在一些實施例中，當引入細胞中時，多核苷酸使彼等細胞中之CFTR表現水準相對於將多肽引入細胞中之前細胞中之CFTR表現水準增加 例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。
如熟習此項技術者所瞭解，本文所揭示之固醇胺具有其他用途。舉例而言，固醇胺可用於治療炎性疾病。固醇胺亦可用作抗微生物劑。 套組及裝置
本揭示案提供多種用於方便及/或有效地使用本揭示案所主張之奈米粒子的套組。典型地，套組包含足夠量及/或數量之組分以允許使用者對個體進行多次治療及/或進行多次實驗。
在一個態樣中，本揭示案提供包含本揭示案之奈米粒子之套組。
該套組可另外包含包裝及說明書及/或遞送劑以形成調配物組成物。遞送劑可包含鹽水、緩衝溶液、類脂質或本文揭示之任何遞送劑。在一個實施例中，該套組另外包含投藥裝置，諸如霧化器或吸入器。 呼吸功能測試及呼吸症狀改良之其他測試
在一些實施例中，奈米粒子或醫藥組成物包含如下mRNA，該mRNA包含編碼多肽或蛋白質之開放閱讀框(ORF)。可測試該多肽或蛋白質對呼吸功能或症狀之改良。舉例而言，在一個實施例中，囊腫性纖維化跨膜傳導調節因數(CFTR)多肽，當投與有需要之個體時，與在未經囊腫性纖維化治療之個體中量測的至少一種參考呼吸量相比，在投與後至少24小時、至少48小時、至少72小時、至少96小時至少120小時內足以將至少一種呼吸量之量測值改良至少10%、至少15%、至少20%、至少25%或至少30%。呼吸量為在任何給定時間吸入、呼出及儲存在肺內之空氣量。下文提供可量測之各種呼吸量之非限制性實例。
總肺容量(TLC)為最大充氣時肺中之量，即VC與RV之總和。平均總肺容量為6000 ml，但此會隨年齡、身高、性別及健康狀況而變化。
潮氣量(TV)為安靜呼吸期間進入或離開肺之空氣量(TV指示肺之子部分；當精確量測潮氣量時，如在氣體交換計算中，使用符號TV或VT)。平均潮氣量為500 ml。
殘氣量(RV)為最大呼氣後留在肺中之空氣量。殘氣量(RV/TLC%)表示為TLC之百分比。
呼氣儲備量(ERV)為在用力呼氣期間可呼出之最大空氣量(高於潮氣量)。
吸氣儲備量(IRV)為自吸氣末位置可吸入之最大量。
吸氣容量(IC)為IRV與TV之總和。
吸氣肺活量(IVC)為自最大呼氣點吸入之最大空氣量。
肺活量(VC)為最深吸氣後呼出之空氣量。
功能殘氣容量(FRC)為呼氣末位置肺中之量。
用力肺活量(FVC)為藉由最大用力呼氣努力確定肺活量。
用力呼氣量(時間)(FEV t)為一種通用術語，其指示在第一個t秒內在用力條件下呼出之空氣量。FEV 1為在用力呼氣之第一秒結束時呼出之量。FEF x為與FVC曲線之某個部分相關的用力呼氣流量；變數指已呼出之FVC量。FEF max為FVC操作期間達到之最大瞬時流量。
用力吸氣流量(FIF)為用力吸氣曲線之特定量測值，由類似於用力呼氣曲線之命名法表示。舉例而言，最大吸氣流量表示為FIF max。除非另外說明，否則量限定詞指示在量測點自RV之吸氣量。
峰值呼氣流量(PEF)為用峰值流量計量測之最高用力呼氣流量。
最大自主通氣(MVV)為在指定時間內重複最大努力期間呼出之空氣量。 合成
如熟習此項技術者所瞭解，本文提供之化合物，包括其鹽及立體異構物，可使用已知有機合成技術製備，且可根據多種可能合成途徑中之任一者，諸如以下方案中提供之彼等合成途徑合成。
用於製備本文所述化合物之反應可在合適溶劑中進行，所述溶劑可由熟習有機合成技術者容易地選擇。合適溶劑在反應進行之溫度(例如可為溶劑之冷凍溫度至溶劑之沸騰溫度範圍內之溫度)下可實質上不與起始材料(反應物)、中間物或產物反應。給定反應可在一種溶劑或超過一種溶劑之混合物中進行。視特定反應步驟而定，熟練技術者可選擇用於特定反應步驟之合適溶劑。
如本文所用，表述「環境溫度」或「室溫」或「rt」為此項技術中所瞭解，且通常指約為反應進行之室溫的溫度，例如反應溫度，例如約20℃至約30℃之溫度。
本文所述化合物之製備可涉及各種化學基團之保護及去保護。熟習此項技術者可容易地確定保護及去保護之需要以及適當保護基之選擇。保護基之化學性質可見於例如T. W. Greene及P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis,第3版, Wiley & Sons, Inc., New York (1999)中。
可根據此項技術中已知之任何合適方法監測反應。舉例而言，產物形成可藉由光譜方法監測，諸如核磁共振光譜(例如 1H或 13C)、紅外光譜、分光光度法(例如UV-可見光)、質譜，或藉由層析方法，諸如高效液相層析(HPLC)、液相層析-質譜(LCMS)或薄層層析(TLC)。熟習此項技術者可藉由多種方法純化化合物，包括高效液相層析(HPLC)及正相矽膠層析。
式A2a化合物可例如使用如下流程中所說明之方法製備： 流程 1
Figure 02_image1365
式A2a化合物可 經由流程1中概述之合成途徑製備。氯甲酸膽固醇酯與胺之間的適當反應可在合適條件下進行以產生式A2a化合物。 流程 2
Figure 02_image1367
式A2a化合物可 經由流程2中概述之合成途徑製備。膽固醇或膽固醇衍生物(諸如豆固醇)與氯甲酸4-硝基苯酯之間的適當反應可在合適條件下進行(諸如使用三乙基胺及4-二甲基胺基吡啶)。該反應之產物可與胺在合適條件下(諸如使用三乙基胺)反應，得到式A2a化合物。 流程 3
Figure 02_image1369
式A2a化合物可 經由流程3中概述之合成途徑製備。膽固醇或膽固醇衍生物(諸如豆固醇)與羧酸之間的適當反應可在活化劑(諸如，EDC-HCl、DMAP、DCC或三甲基乙酸酐)存在下在合適條件下進行，得到式A2a化合物。 流程 4
Figure 02_image1371
式A2a化合物可 經由流程4中概述之合成途徑製備。膽固醇半丁二酸酯或膽固醇衍生物半丁二酸酯與活化劑之間的適當反應可在合適條件下進行。該反應之產物可與胺在合適條件下反應，得到式A2a化合物。 流程 5
Figure 02_image1373
式A2a化合物可 經由流程5中概述之合成途徑製備。氯甲酸膽固醇酯與乙-1,2-二胺之間的適當反應可在合適條件下進行以產生SA22。SA22可與2-(甲基硫基)-4,5-二氫-1H-咪唑氫碘化物在合適條件下反應，得到式A2a化合物。SA22亦可與方酸二甲酯在合適條件下反應，且反應產物可進一步與二級胺在合適條件下反應，得到式A2a化合物。 流程 6
Figure 02_image1375
式A2a化合物可 經由流程6中概述之合成途徑製備。胺基甲酸胺基烷酯與胍基化劑之間的適當反應可在合適條件下進行。該反應之產物可與HCl在合適條件下反應，得到式A2a化合物。 流程 7
Figure 02_image1377
式A2A化合物之前驅物可 經由流程7中概述之合成途徑製備。膽固醇或膽固醇衍生物(諸如豆固醇)之間的適當反應可在合適條件下(諸如使用三乙基胺及4-二甲基胺基吡啶)進行。該反應之產物可與胺在合適條件下(諸如使用三乙基胺)反應，得到式A2a化合物之前驅物。 流程 8
Figure 02_image1379
式A2a化合物之前驅物可 經由流程8中概述之合成途徑製備。膽固醇或膽固醇衍生物(諸如豆固醇)與boc-半酯之間的適當反應可在合適條件下進行。該反應之產物可在合適條件下反應，得到式A2a化合物之前驅物。 流程 9
Figure 02_image1381
用於合成式A2a化合物之中間物可 經由流程9中概述之合成途徑製備。亞精胺或精胺與(E)-N-((第三丁氧基羰基)氧基)亞胺基苯乙腈(BOC-ON)之間的適當反應可在合適條件下進行，得到用於合成式A2a化合物之中間物。 定義
為能更容易地理解本揭示案，首先定義某些術語。如在本申請案中所使用，除非本文中另外明確規定，否則以下術語中之每一者均應具有下文所闡述之含義。其他定義如整個申請案中所闡述。
本揭示案包括如下實施例，其中確切地該組中之一個成員存在於、用於給定產物或過程中或以其他方式與給定產物或過程相關。本揭示案包括如下實施例，其中組成員中超過一個或全部存在於、用於給定產物或過程中或以其他方式與給定產物或過程相關。
在本說明書及隨附申請專利範圍中，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一」及「該」包括複數個提及物。術語「一」以及術語「一或多」及「至少一」在本文中可互換使用。在某些態樣中，術語「一」意謂「單一」。在其他態樣中，術語「一」包括「兩個或多個」或「多個」。
此外，「及/或」在本文中使用時應視為特別揭示兩種規定特徵或組分中之每一者，其中包含或不包含另一者。因此，在本文中之片語諸如「A及/或B」中使用之術語「及/或」旨在包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣地，片語諸如「A、B及/或C」中所用之術語「及/或」旨在涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本揭示案所關於技術之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show,第2版, 2002, CRC Press；Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版, 1999, Academic Press；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修訂版, 2000, Oxford University Press為熟練技術者提供本揭示案中所用多個術語之通用詞典。
本文中無論何處用語言「包含」描述態樣，均亦提供以「由……組成」及/或「基本上由……組成」描述之其他類似態樣。
單位、前綴及符號以其Système International de Unites (SI)接受之形式表示。數字範圍包括定義範圍之數字。在敘述值之範圍的情況下，應瞭解，亦特別揭示該範圍之所述上限與下限之間的各中間整數值及其各分數，以及該等值之間的各子範圍。任何範圍之上限及下限可獨立地包括在該範圍內或被排除在該範圍之外，且包括兩個極限值中之任一者、兩個極限值均不包括或包括兩個極限值之各範圍亦涵蓋在本揭示案中。在明確敘述數值之情況下，應瞭解與所述數值大致相同數量或量的數值亦屬於本揭示案之範疇。在揭示組合之情況下，亦特別揭示該組合之要素的各子組合，且該各子組合屬於本揭示案之範疇。相反地，在個別揭示不同要素或要素組之情況下，亦揭示其組合。在本揭示案之任何要素揭示為具有複數個替代方案之情況下，藉此亦揭示本揭示案之如下實例，其中單獨排除各替代方案或排除各替代方案與其他替代方案之任何組合；本揭示案之超過一種要素可具有該等排除，且藉此揭示具有該等排除之要素的所有組合。
約：在整個說明書及申請專利範圍中與數值結合使用之術語「約」表示熟習此項技術者熟悉且可接受之準確度區間。該準確度區間為±10%。
在給出範圍之情況下，包括終點。此外，除非另外指示或自上下文及一般技術者之理解中顯而易見，否則在本揭示案之不同實施例中，表示為範圍之值可假定為所述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確指出，否則直至該範圍之下限單位之十分之一。
組合投與：如本文所用，術語「組合投與」意謂同時或在一定時間間隔內向個體投與兩種或更多種藥劑，使得各藥劑對患者之作用可存在重疊。在一些實施例中，其在彼此之約60、30、15、10、5或1分鐘內投與。在一些實施例中，藥劑之投與間隔足夠緊密，從而達成組合( 例如協同)作用。
動物：如本文所用，術語「動物」指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」指處於任何發育階段之人類。在一些實施例中，「動物」指處於任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物( 例如囓齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。在一些實施例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚及蟲。在一些實施例中，動物為轉殖基因動物、經遺傳工程改造之動物或純系。
大約：如本文所用，在用於一或多個關注值時，術語「大約」指類似於所述參考值之值。在某些實施例中，除非另外說明或自上下文顯而易見，否則術語「大約」指在所述參考值之任一方向上(大於或小於所述參考值)落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少內之值的範圍(除非該數字超過可能值之100%)。
化合物：如本文所用，術語「化合物」意欲包括所描繪結構之所有立體異構物及同位素。如本文所用，術語「立體異構物」意謂化合物之任何幾何異構物(例如順式及反式異構物)、鏡像異構物或非鏡像異構物。本揭示案涵蓋本文所述化合物之任何及所有立體異構物，包括立體異構純形式(例如幾何異構純、鏡像異構純或非鏡像異構純)以及鏡像異構及立體異構混合物(例如外消旋物)。化合物之鏡像異構物及立體異構物混合物以及將其解析成其組分鏡像異構物或立體異構物之方式為熟知的。「同位素」指具有相同原子數但由於原子核中之中子數不同而質量數不同的原子。舉例而言，氫之同位素包括氚及氘。此外，本揭示案之化合物、鹽或錯合物可與溶劑或水分子組合製備以藉由常規方法形成溶劑合物及水合物。
接觸：如本文所用，術語「接觸」意謂在兩個或更多個實體之間建立物理連接。舉例而言，使哺乳動物細胞與奈米粒子組成物接觸意謂使哺乳動物細胞與奈米粒子共用物理連接。活體內及離體使細胞與外部實體接觸之方法為生物學技術中所熟知。舉例而言，使奈米粒子組成物與分佈於哺乳動物內之哺乳動物細胞接觸可藉由不同投與途徑( 例如靜脈內、肌內、皮內及皮下)進行，且可涉及不同量之奈米粒子組成物。此外，奈米粒子組成物可接觸超過一種哺乳動物細胞。接觸之另一實例為奈米粒子與陽離子劑之間。奈米粒子與陽離子劑接觸可意謂使奈米粒子之表面與陽離子劑物理連接，使得陽離子劑可與奈米粒子形成非鍵結相互作用。在一些實施例中，奈米粒子與陽離子劑接觸將陽離子劑插入奈米粒子中，例如在奈米粒子之表面處開始。在一些實施例中，術語「分層」、「塗布」以及「後添加」及「添加」可用於意謂所提及之奈米粒子與陽離子劑接觸中之「接觸」。
遞送：如本文所用，術語「遞送」意謂將實體提供至目的地。舉例而言，將多核苷酸遞送至個體可涉及向個體投與包括多核苷酸之奈米粒子組成物( 例如藉由靜脈內、肌內、皮內或皮下途徑)。向哺乳動物或哺乳動物細胞投與奈米粒子組成物可涉及使一或多個細胞與奈米粒子組成物接觸。
遞送劑：如本文所用，「遞送劑」指至少部分促進多核苷酸向靶向細胞之 活體內、活體外或離體遞送的任何物質。
非鏡像異構物：如本文所用，術語「非鏡像異構物」意謂不為彼此之鏡像且彼此不可重疊之立體異構物。
分佈：如本文所用，術語「分佈」意謂分子與奈米粒子在兩者彼此接觸後與奈米粒子形成非鍵結相互作用。
給藥方案：如本文所用，「給藥方案」為投藥方案或醫師確定之治療、防治或緩和療護之方案。
有效量：如本文所用，術語藥劑之「有效量」為足以實現有益或期望結果，例如臨床結果之量，因此，「有效量」取決於該藥劑所施加之情況。舉例而言，在投與治療蛋白質缺乏(例如CFTR缺乏)之藥劑的情況下，藥劑之有效量為例如表現足夠CFTR以與未投與藥劑之情況下觀察到的症狀之嚴重性相比改善、減少、消除或預防與CFTR缺乏相關之病徵及症狀的mRNA的量。術語「有效量」可與「有效劑量」、「治療有效量」或「治療有效劑量」互換使用。
鏡像異構物：如本文所用，術語「鏡像異構物」意謂本揭示案化合物之各個別光學活性形式，該形式具有至少80% ( 亦即，至少90%之一種鏡像異構物及至多10%之另一鏡像異構物)、至少90%或至少98%之光學純度或鏡像異構過量(如藉由此項技術中之標準方法所確定)。
封裝：如本文所用，術語「封裝」意謂包封、包圍或圍繞。
封裝效率：如本文所用，「封裝效率」指相對於製備奈米粒子組成物中所用之多核苷酸之初始總量，成為奈米粒子組成物之一部分的多核苷酸之量。舉例而言，若在最初向奈米粒子組成物提供之總共100 mg多核苷酸中有97 mg多核苷酸封裝在該組成物中，則封裝效率可表示為97%。如本文所使用之，「封裝」可指完全、實質上或部分包封、限制、包圍或圍繞。
表現：如本文所用，核酸序列之「表現」指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生mRNA範本( 例如藉由轉錄)；(2)加工mRNA轉錄物( 例如藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3’末端加工)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)對多肽或蛋白質進行轉譯後修飾。
離體：如本文所用，術語「離體」指事件發生於生物體( 例如動物、植物或微生物或其細胞或組織)外部。離體事件可發生於自天然( 例如活體內)環境最低程度地改變之環境中。
輔助脂質：如本文所用，術語「輔助脂質」指包括脂質部分(用於插入脂質層，例如脂質雙層中)及極性部分(用於與脂質層表面之生理溶液相互作用)之化合物或分子。典型地，輔助脂質為磷脂。輔助脂質之功能為「補充」胺基脂質且增加雙層之融合性，及/或幫助促進例如遞送至細胞之核酸的內體逃逸。亦認為輔助脂質為LNP表面之關鍵結構組分。
活體外：如本文所用，術語「活體外」指事件發生於人工環境中，例如試管或反應容器中、細胞培養物中、皮氏培養皿(Petri dish)中等中，而非發生於生物體(例如動物、植物或微生物)內。
活體內：如本文所用，術語「活體內」指事件發生於生物體(例如動物、植物或微生物或其細胞或組織)內。
可離子化胺基脂質：術語「可離子化胺基脂質」包括具有一個、兩個、三個或更多個脂肪酸或脂肪烷基鏈及可pH滴定胺基頭基(例如烷基胺基或二烷基胺基頭基)之彼等脂質。可離子化胺基脂質典型地在低於胺基頭基之pKa的pH下質子化(亦即，帶正電)，且在高於pKa之pH下基本上不帶電。該等可離子化胺基脂質包括但不限於DLin-MC3-DMA (MC3)及(13Z,165Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13-16-二烯-1-胺(L608)。
異構物：如本文所用，術語「異構物」意謂本揭示案之任何化合物的任何互變異構物、立體異構物、鏡像異構物或非鏡像異構物。認為本揭示案之化合物可具有一或多個對掌性中心及/或雙鍵，因此以立體異構物，諸如雙鍵異構物( 亦即幾何E/Z異構物)或非鏡像異構物( 例如鏡像異構物( 亦即，(+)或(-))或順式/反式異構物)之形式存在。根據本揭示案，本文所述之化學結構及因此本揭示案之化合物涵蓋所有相應立體異構物，該等立體異構物為立體異構純形式( 例如幾何異構純、鏡像異構純或非鏡像異構純)及鏡像異構物與立體異構物混合物， 例如外消旋物。本揭示案化合物之鏡像異構物與立體異構物混合物典型地可藉由如下熟知方法解析為其組分鏡像異構物或立體異構物，諸如對掌性相氣相層析、對掌性相高效液相層析、將化合物結晶為對掌性鹽複合物，或在對掌性溶劑中使化合物結晶。鏡像異構物及立體異構物亦可藉由熟知不對稱合成方法自立體異構或鏡像異構純中間物、試劑及催化劑獲得。
脂質奈米粒子核心：如本文所用，脂質奈米粒子核心為如下脂質奈米粒子，可向其添加其他組分之後添加層，諸如陽離子劑及/或PEG-脂質或其他脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子核心包含：(i)可離子化脂質、(ii)磷脂、(iii)結構脂質及(iv)視情況存在之PEG-脂質。在其他實施例中，脂質奈米粒子核心包含：(i)可離子化脂質、(ii)磷脂、(iii)結構脂質及(iv)PEG-脂質。
連接基團：如本文所用，「連接基團」指一組原子，例如10-1,000個原子，且可由如下原子或基團構成，諸如但不限於：碳、胺基、烷基胺基、氧、硫、亞碸、磺醯基、羰基及亞胺。連接基團可在第一端連接於核鹼基或糖部分上之經修飾核苷或核苷酸，且在第二端連接於有效負載，例如可偵測劑或治療劑。連接基團可具有足夠長度以不干擾在核酸序列中之倂入。連接基團可用於任何有用目的，諸如形成多核苷酸多聚體(例如經由兩個或更多個嵌合多核苷酸分子或IVT多核苷酸之鍵聯)或多核苷酸結合物，以及投與有效負載，如本文所述。可併入連接基團中之化學基團之實例包括但不限於烷基、烯基、炔基、醯胺基、胺基、醚、硫醚、酯、伸烷基、伸雜烷基、芳基或雜環基，其中每一者可視情況經取代，如本文所述。連接基團之實例包括但不限於不飽和烷烴、聚乙二醇(例如乙二醇或丙二醇單體單元，例如二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)以及葡聚醣聚合物及其衍生物。其他實例包括但不限於連接基團內之可裂解部分，諸如二硫鍵(-S-S-)或偶氮鍵(-N=N-)，該等部分可使用還原劑或光解裂解。選擇性可裂解鍵之非限制性實例包括可例如藉由使用參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或其他還原劑及/或光解作用裂解之醯胺鍵，以及可例如藉由酸性或鹼性水解裂解之酯鍵。
投與方法：如本文所用，「投與方法」可包括靜脈內、肌肉內、皮內、皮下或向個體遞送組成物之其他方法。可以選擇投與方法以靶向遞送( 例如特異性遞送)至身體之特定區域或系統。
術語「核酸」在其最廣泛意義上包括包含核苷酸聚合物之任何化合物及/或物質。此等聚合物通常稱為多核苷酸。本揭示案之例示性核酸或多核苷酸包括但不限於核糖核酸(RNA)、去氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA，其包括具有β-D-核糖構型之LNA、具有α-L-核糖構型之α-LNA (LNA之非鏡像異構物)、具有2'-胺基官能化之2'-胺基-LNA及具有2'-胺基官能化之2'-胺基-α-LNA)、伸乙基核酸(ENA)、環己烯基核酸(CeNA)或其混合物或組合。
患者：如本文所用，「患者」指可尋求或需要治療、要求治療、正接受治療、將接受治療之個體，或處於特定疾病或疾患之受訓專業人員之護理下的個體。
CFTR 相關疾病：如本文所用，術語「CFTR相關疾病」或「CFTR相關病症」分別指由異常CFTR活性(例如活性降低或活性增加)引起之疾病或病症。作為非限制性實例，囊腫性纖維化為CFTR相關疾病。囊腫性纖維化之許多臨床變型為此項技術中所已知。參見例如www.omim.org/entry/219700。
術語「CFTR酶活性」、「CFTR活性」及「囊腫性纖維化跨膜傳導調節因數活性」在本揭示案中可互換使用且指CFTR穿過細胞膜轉運氯離子之能力。因此，保留或具有CFTR酶活性或CFTR活性之片段或變體指具有可量測之跨細胞膜氯離子轉運的片段或變體。
醫藥學上可接受：本文所用之片語「醫藥學上可接受」指在合理之醫學判斷範疇內適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症，與合理效益/風險比相稱的彼等化合物、材料、組成物及/或劑型。
醫藥學上可接受之賦形劑：如本文所用之片語「醫藥學上可接受之賦形劑」指除本文所述化合物以外(例如能夠懸浮或溶解活性化合物之媒劑)且具有在患者中實質上無毒且非炎性之特性的任何成分。賦形劑可包括例如：抗黏劑、抗氧化劑、黏合劑、塗料、壓縮助劑、崩解劑、染料(染色劑)、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或塗層、調味劑、芳香劑、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸附劑、懸浮或分散劑、甜味劑及水合水。例示性賦形劑包括但不限於：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(磷酸氫鈣)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯聚維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、預膠化澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃酯、蟲膠、二氧化矽、羧基甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、乙醇酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C及木糖醇。
醫藥學上可接受之鹽：本揭示案亦包括本文所述化合物之醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」指所揭示化合物之如下衍生物，其中母化合物因現有酸或鹼部分轉化為其鹽形式( 例如藉由使遊離鹼基與合適有機酸反應)而經修飾。醫藥學上可接受之鹽之實例包括但不限於鹼性殘基(諸如胺)之無機酸或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼鹽或有機鹽；及其類似物。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似物。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類似物；以及無毒銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、乙基胺及其類似物。本揭示案之醫藥學上可接受之鹽包括由例如無毒無機酸或有機酸形成之母化合物之習知無毒鹽。本揭示案之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法由含有鹼性或酸性部分之母化合物合成。一般而言，該等鹽可藉由使此等化合物之遊離酸或鹼形式與化學計量量之適當鹼或酸在水中或在有機溶劑中或在兩者之混合物中反應來製備；一般而言，使用非水性介質，如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。合適鹽之清單可見於 Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985,第1418頁, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use，P.H. Stahl及C.G. Wermuth (編), Wiley-VCH, 2008及Berge等人, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)中，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用之術語「溶劑合物」意謂如下本揭示案化合物，其中合適溶劑之分子併入晶格中。合適溶劑在投與劑量下為生理學上可耐受的。舉例而言，溶劑合物可藉由自包括有機溶劑、水或其混合物之溶液結晶、再結晶或沉澱來製備。合適溶劑之實例為乙醇、水(例如單水合物、二水合物及三水合物)、 N-甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、 N, N’二甲基甲醯胺(DMF)、 N, N’-二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苯甲酯及其類似物。當水為溶劑時，溶劑合物稱為「水合物」。
多核苷酸：如本文所用，術語「多核苷酸」指任何長度之核苷酸的聚合物，包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物。此術語指分子之一級結構。因此，該術語包括參股、雙股及單股去氧核糖核酸(「DNA」)，以及參股、雙股及單股核糖核酸(「RNA」)。其亦包括多核苷酸之經修飾形式，例如藉由烷基化及/或藉由加帽，以及未修飾形式。更特定言之，術語「多核苷酸」包括聚去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)；聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，其包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA及mRNA，無論是剪接的還是未剪接的；任何其他類型多核苷酸，其為嘌呤或嘧啶鹼基之N-或C-糖苷；以及含有非核苷酸骨架之其他聚合物，例如聚醯胺( 例如肽核酸「PNA」)及多嗎啉聚合物；以及其他合成序列特異性核酸聚合物，其限制條件為該等聚合物含有允許鹼基配對及鹼基堆積之構型(諸如DNA及RNA中所發現)的核鹼基。在特定態樣中，多核苷酸包含mRNA。在另一態樣中，mRNA為合成mRNA。在一些態樣中，合成mRNA包含至少一種非天然核鹼基。在一些態樣中，某種類別之所有核鹼基經非天然核鹼基置換( 例如本文所揭示之多核苷酸中的所有尿苷可經非天然核鹼基置換， 例如5-甲氧基尿苷)。在一些態樣中，多核苷酸( 例如合成RNA或合成DNA)僅包含天然核鹼基， 亦即在合成DNA之情況下，為A (腺苷)、G (鳥苷)、C (胞苷)及T (胸苷)，或在合成RNA之情況下，為A、C、G及U (尿苷)。
熟練技術者應瞭解，本文揭示之密碼子圖中的T鹼基存在於DNA中，而該等T鹼基將經相應RNA中之U鹼基置換。舉例而言，本文揭示之DNA形式的密碼子-核苷酸序列， 例如載體或活體外轉譯(IVT)範本，其T鹼基將在其相應轉錄mRNA中轉錄為U堿基。在此方面，認為經密碼子最佳化之DNA序列(包含T)及其相應mRNA序列(包含U)兩者均為本揭示案之經密碼子最佳化之核苷酸序列。熟練技術者亦應瞭解等效密碼子圖可藉由用非天然鹼基置換一或多個鹼基來產生。因此， 例如TTC密碼子(DNA圖)將對應於UUC密碼子(RNA圖)，該UUC密碼子又將對應於ΨΨC密碼子(U經假尿苷置換之RNA圖)。
標準A-T及G-C鹼基對在允許胸苷之N3-H及C4-氧基分別與腺苷之N1及C6-NH2之間以及在胞苷之C2-氧基、N3及C4-NH2分別與鳥苷之C2-NH2、N'-H及C6-氧基之間形成氫鍵的條件下形成。因此，例如，鳥苷(2-胺基-6-氧基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可經修飾以形成異鳥苷(2-氧基-6-胺基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。該修飾得到不再有效地與胞嘧啶形成標準鹼基對之核苷鹼基。然而，胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-胺基-嘧啶)修飾形成異胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-胺基-4-氧基-嘧啶-)得到不會與鳥苷有效地鹼基配對，而會與異鳥苷形成鹼基對的經修飾核苷酸(Collins等人之美國專利第5,681,702號)。異胞嘧啶可購自Sigma Chemical公司(St. Louis, Mo.)；異胞苷可藉由Switzer等人(1993) Biochemistry 32:10489-10496及其中引用之參考文獻描述的方法製備；2'-去氧-5-甲基-異胞苷可藉由Tor等人, 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467及其中引用之參考文獻的方法製備；且異鳥嘌呤核苷酸可使用Switzer等人, 1993,見上文，及Mantsch等人, 1993, Biochem. 14:5593-5601描述之方法或藉由Collins等人之美國專利第5,780,610號中所述之方法製備。其他非天然鹼基對可藉由Piccirilli等人, 1990, Nature 343:33-37中所述之用於合成2,6-二胺基嘧啶及其互補物(1-甲基吡唑並[4,3]嘧啶-5,7-(4H,6H)-二酮之方法合成。形成獨特鹼基對之其他該等經修飾核苷酸單位為已知的，諸如Leach等人, (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683及Switzer等人,見上文中所述之彼等單位。
多肽：術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，指任何長度之胺基酸之聚合物。該聚合物可包含經修飾胺基酸。該術語亦涵蓋如下胺基酸聚合物，其經天然修飾，或藉由插入，例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分結合修飾。該定義中亦包括例如含有胺基酸(包括例如非天然胺基酸，諸如高半胱胺酸、鳥胺酸、對乙醯基苯丙基胺酸、D-胺基酸及肌酸)之一或多種類似物的多肽以及此項技術中已知之其他變化形式。
如本文所用，該術語指任何大小、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。多肽包括經編碼多核苷酸產物、天然存在之多肽、合成多肽、前述之同源物、異種同源物、同種同源物、片段及其他等效物、變體及類似物。多肽可為單體或可為多分子復合物，諸如二聚物、三聚物或四聚物。其亦可包含單鏈或多鏈多肽。最常見二硫鍵見於多鏈多肽中。術語多肽亦可應用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之人工化學類似物。在一些實施例中，「肽」可小於或等於50個胺基酸長， 例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
預防：如本文所用，術語「預防」指部分或完全延遲感染、疾病、病症及/或疾患之發作；部分或完全延遲特定感染、疾病、病症及/或疾患之一或多種病徵及症狀、特徵或臨床表現的發作；部分或完全延遲特定感染、疾病、病症及/或疾患之一或多種病徵及症狀、特徵或表現的發作；部分或完全延遲感染、特定疾病、病症及/或疾患的進展；及/或降低產生與感染、疾病、病症及/或疾患相關的病理的風險。
防治：如本文所用，「防治」指用於預防疾病傳播之治療或行動過程。
防治：如本文所用，「防治」指為保持健康及預防疾病傳播而採取之措施。「免疫防治」指產生之措施
鹽：在一些態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含一些其脂質成分之鹽。術語「鹽」包括任何陰離子及陽離子復合物。陰離子之非限制性實例包括無機及有機陰離子，例如氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、草酸根(例如半草酸根)、磷酸根、膦酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、氧離子、碳酸根、碳酸氫根、硝酸根、亞硝酸根、氮離子、亞硫酸氫根、硫離子、亞硫酸根、硫酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氫根、硼酸根、甲酸根、乙酸根、苯甲酸根、檸檬酸根、酒石酸根、乳酸根、丙烯酸根、聚丙烯酸根、反丁烯二酸根、馬來酸根、衣康酸根、乙醇酸根、葡糖酸根、蘋果酸根、扁桃酸根、惕各酸根、抗壞血酸根、水楊酸根、聚甲基丙烯酸根、高氯酸根、氯酸根、亞氯酸根、次氯酸根、溴酸根、次溴酸根、碘酸根、烷基磺酸根、芳基磺酸根、砷酸根、亞砷酸根、鉻酸根、二鉻酸根、氰離子、氰酸根、硫氰酸根、氫氧根、過氧根、高錳酸根及其混合物。
樣品：如本文所用，術語「樣品」或「生物樣品」指其組織、細胞或組分部分之子集( 例如體液，包括但不限於血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜臍血、尿液、陰道液及精液)。樣品可另外包括自整個生物體或其組織、細胞或組分部分之子集或其溶離分或部分製備的勻漿、裂解物或提取物，包括但不限於例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚外部切片、呼吸道、腸道及泌尿生殖道、眼淚、唾液、乳汁、血細胞、腫瘤、器官。樣品還指培養基，諸如營養肉湯或凝膠，其可含有細胞組分，諸如蛋白質或核酸分子。
單次單位劑量：如本文所用，「單次單位劑量」為以一次劑量/同時/以單一途徑/以單一接觸點( 亦即，單一投與事件)投與之任何治療劑之劑量。
分次劑量：如本文所用，「分次劑量」為將單次單位劑量或總日劑量分成兩次或更多次劑量。
立體異構物：如本文所用，術語「立體異構物」指化合物可具有之所有可能不同異構物以及構形形式( 例如本文所述之任何式之化合物)，尤其基本分子結構之所有可能立體化學及構形異構形式、所有非鏡像異構物、鏡像異構物及/或構形異構物。本揭示案之一些化合物可以不同互變異構形式存在，所有該等形式均包括在本揭示案之範疇內。
個體：「個體(subject/individual)」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意謂任何個體，尤其是哺乳動物個體，其需要診斷、預後或療法。哺乳動物個體包括但不限於人類、家畜、農場動物、動物園動物、運動動物、寵物動物，諸如狗、貓、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、馬、牛、牛；靈長類動物，諸如猿、猴、猩猩及黑猩猩；犬科動物，諸如狗及狼；貓科動物，諸如貓、獅子及虎；馬科動物，諸如馬、驢及斑馬；熊，食用動物，諸如牛、豬及羊；有蹄動物，諸如鹿及長頸鹿；囓齒動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠及豚鼠；及其類似動物。在某些實施例中，哺乳動物為人類個體。在其他實施例中，個體為人類患者。在特定實施例中，個體為需要治療之人類患者。
實質上：如本文所用，術語"實質上"指展現關注特徵或特性之全部或幾乎全部程度之定性條件。生物技術之一般技術者應瞭解，生物及化學特徵極少(若有)進行至完成及/或進行至完全或達成或避免絕對結果。因此，術語"實質上"在本文中用於捕獲諸多生物及化學特徵中固有之潛在完全性喪失。
罹患：「罹患」疾病、病症及/或疾患之個體已診斷出或表現出該疾病、病症及/或疾患之一或多種病徵及症狀。
易患：「易患」某種疾病、病症及/或疾患之個體尚未診斷出及/或不能展現該疾病、病症及/或疾患之病徵及症狀，但具有產生疾病或其病徵及症狀之傾向。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或疾患(例如癌症)之個體可藉由以下中之一或多者表徵：(1)與疾病、病症及/或疾患之產生相關的遺傳突變；(2)與疾病、病症及/或疾患之產生相關的遺傳多態性；(3)與疾病、病症及/或疾患相關之蛋白質及/或核酸的表現及/或活性增加及/或降低；(4)與疾病、病症及/或疾患之產生相關的習慣及/或生活方式；(5)疾病、病症及/或疾患之家族史；及(6)暴露於及/或感染與疾病、病症及/或疾患之產生相關的微生物。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或疾患之個體將產生該疾病、病症及/或疾患。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或疾患之個體不會產生該疾病、病症及/或疾患。
合成：術語「合成」意謂藉由人工生產、製備及/或製造。本揭示案之多核苷酸或其他分子之合成可為化學合成或酶法合成。
治療劑：術語「治療劑」指當投與個體時具有治療、診斷及/或防治作用及/或引發所要生物及/或藥理學作用之藥劑。舉例而言，在一些實施例中，編碼CFTR多肽之mRNA可為治療劑。
治療有效量：如本文所用，術語「治療有效量」意謂欲遞送之藥劑( 例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、防治劑等)的量，該量當投與罹患或易患感染、疾病、病症及/或疾患之個體時足以治療該感染、疾病、病症及/或疾患，改良其病徵及症狀，診斷、預防該感染、疾病、病症及/或疾患及/或延遲其發作。
治療有效結果：如本文所用，術語「治療有效結果」意謂在罹患或易患感染、疾病、病症及/或疾患之個體中足以治療該感染、疾病、病症及/或疾患，改良其病徵及症狀，診斷、預防該感染、疾病、病症及/或疾患及/或延遲其發作的結果。
總日劑量：如本文所用，「總日劑量」為24 hr時間段內給定或開具之量。總日劑量可作為單次單位劑量或分次劑量投與。
治療、療法：如本文所用，術語「治療」或「療法」指部分或完全緩解、改善、改良、減輕疾病 例如囊腫性纖維化，延遲其發作，抑制其進展，降低其嚴重性及/或減少其一或多種病徵及症狀或特徵之發生。舉例而言，「治療」囊腫性纖維化可指減輕與疾病相關之病徵及症狀，延長患者之壽命(提高存活率)，降低疾病之嚴重性、預防或延遲疾病之發作等。治療可投與未展現疾病、病症及/或疾患之病徵的個體，及/或僅展現疾病、病症及/或疾患之早期病徵的個體以降低產生與該疾病、病症及/或疾患相關之病理學的風險。
如本文所用，術語「烷基(alkyl/alkyl group)」意謂包括一或多個碳原子(例如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個或更多碳原子)之直鏈或支鏈飽和烴。
注記「C 1-14烷基」意謂包括1-14個碳原子之直鏈或支鏈飽和烴。烷基可視情況經取代。
如本文所用，術語「烯基(alkenyl/alkenyl group)」意謂包括兩個或更多個碳原子(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個或更多碳原子)及至少一個雙鍵之直鏈或支鏈烴。
注記「C 2-14烯基」意謂包括2-14個碳原子及至少一個碳-碳雙鍵之直鏈或支鏈烴。烯基可包括一個、兩個、三個、四個或更多雙鍵。烯基可視情況經取代。
如本文所用，術語「碳環」或「碳環基」意謂包括一或多個碳原子環之單環或多環系統。環可為三員、四員、五員、六員、七員、八員、九員、十員、十一員、十二員、十三員、十四員或十五員環。
注記「C 3-6碳環」意謂包括具有3-6個碳原子之單環的碳環。碳環可包括一或多個雙鍵且可為芳族基(例如芳基)。碳環之實例包括環丙基、環戊基、環己基、苯基、萘基及1,2-二氫萘基。碳環可視情況經取代。
如本文所用，術語「雜環」或「雜環基」意謂包括一或多個環之單環或多環系統，其中至少一個環包括至少一個雜原子。雜原子可為例如氮、氧或硫原子。環可為三員、四員、五員、六員、七員、八員、九員、十員、十一員或十二員環。雜環可包括一或多個雙鍵且可為芳族基(例如雜芳基)。雜環之實例包括咪唑基、咪唑啶基、噁唑基、噁唑啶基、噻唑基、噻唑啶基、吡唑啶基、吡唑基、異噁唑啶基、異噁唑基、異噻唑啶基、異噻唑基、嗎啉基、吡咯基、吡咯啶基、呋喃基、四氫呋喃基、噻吩基、吡啶基、呱啶基、喹啉基及異喹啉基。雜環可視情況經取代。
如本文所用，「芳基」為包括一或多個芳族環之碳環基。芳基之實例包括苯基及萘基。
如本文所用，「雜芳基」為包括一或多個芳族環之雜環基。雜芳基之實例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基及噻唑基。芳基及雜芳基均可視情況經取代。
除非另外規定，否則烷基、烯基及環基(例如碳環基及雜環基)可視情況經取代。視情況存在之取代基可選自由但不限於以下組成之群：鹵素原子(例如氯、溴、氟或碘基)、羧酸(例如C(O)OH)、醇(例如羥基、OH)、酯(例如-C(O)OR或OC(O)R)、醛(例如C(O)H)、羰基(例如C(O)R，替代地由C=O表示)、醯基鹵(例如C(O)X，其中X為選自溴、氟、氯及碘之鹵基)、碳酸酯(例如OC(O)OR)、烷氧基(例如OR)、縮醛(例如C(OR) 2R”“，其中各OR為可相同或不同之烷氧基且R”“為烷基或烯基)、磷酸酯(例如P(O) 4 3)、硫醇(例如SH)、亞碸(例如S(O)R)、亞磺酸(例如S(O)OH)、磺酸(例如S(O) 2OH)、硫醛(例如C(S)H)、硫酸酯(例如S(O) 4 2)、磺醯基(例如S(O) 2)、醯胺(例如C(O)NR 2或N(R)C(O)R)、疊氮基(例如N 3)、硝基(例如NO 2)、氰基(例如CN)、異氰基(例如NC)、醯氧基(例如OC(O)R)、胺基(例如NR 2、NRH或NH 2)、胺甲醯基(例如OC(O)NR 2、OC(O)NRH或OC(O)NH 2)、磺醯胺(例如S(O) 2NR 2、S(O) 2NRH、S(O) 2NH 2、N(R)S(O) 2R、N(H)S(O) 2R、N(R)S(O) 2H或N(H)S(O) 2H)、烷基、烯基及環基(例如碳環基或雜環基)。R為如本文所定義之烷基或烯基。
如本文所用，「包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合」指除其他原子外亦包含至少一個氮原子之烷基、雜環烷基、環烷基、芳基或雜芳基。氮原子為一級胺基、二級胺基或三級胺基之一部分。胺基可選自但不限於
Figure 02_image1383
、
Figure 02_image1385
及
Figure 02_image1387
。一級胺、二級胺或三級胺可為含有選自但不限於-C(=N-)-N-、-C=C-N-、-C=N-及-N-C(=N-)-N-之官能基之較大胺的一部分。
熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用常規實驗即能夠確定根據本文所述之本揭示案的特定實施例之諸多等效物。本揭示案之範疇不欲限於以上實施方式，而是如隨附申請專利範圍中所述。
亦應注意，術語「包含」欲為開放性的且允許但不需要包括其他要素或步驟。因此當術語「包含」在本文中使用時，亦涵蓋且揭示術語「由......組成」。
在給出範圍之情況下，包括終點。此外，應瞭解，除非另外指示或自上下文及一般技術者之理解中顯而易見，否則在本揭示案之不容實施例中，表示為範圍之值可假定為所述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確指出，否則直至該範圍之下限單位之十分之一。
另外，應瞭解，屬於先前技術內之本揭示案之任何特定實施例可明確地自申請專利範圍之任一或多項中排除。由於認為該等實施例為一般技術者所已知，故可將其排除，即使本文中未明確陳述該排除。本揭示案之組成物的任何特定實施例( 例如任何核酸或由其編碼之蛋白質；任何生產方法；任何使用方法；等)可出於任何原因自任一或多項請求項中排除，無論是否與先前技術之存在有關。
所有引用之來源，例如本文引用之參考文獻、出版物、資料庫、資料庫條目及技術，即使未在引用中明確陳述，亦以引用之方式併入本申請案中。如果引用之來源與本申請案之陳述存在衝突，則以本申請案中之陳述為準。
章節及表格標題不欲為限制性的。 實例 實例 1 根據式 (I) 之化合物的合成 A. 一般注意事項
除非另外說明，否則所用所有溶劑及試劑可購得且原樣使用。使用Bruker Ultrashield 300 MHz儀器，在300 K下，於CDCl 3中記錄 1H NMR光譜。對於 1H而言，化學位移以相對於TMS (0.00)之百萬分率(ppm)之形式報告。使用ISCO RediSep Rf Gold急驟層析柱(粒徑：20-40微米)在ISCO CombiFlash Rf+ Lumen Instruments上進行矽膠層析。使用RediSep Rf Gold C18高效管柱在ISCO CombiFlash Rf+ Lumen儀器上進行逆相層析。 經由藉由使用具有DAD及ELSD之Waters Acquity UPLC儀器及ZORBAX快速解析高精度(RRHD) SB-C18 LC管柱(2.1 mm，50 mm，1.8 µm)及以1.2 mL/min在5分鐘內含0.1% TFA之65%至100%乙腈水溶液之梯度進行逆相UPLC-MS (滯留時間，RT，分鐘)分析確定所有最終化合物之純度均大於85%。注射體積為5 　L，且管柱溫度為80℃。使用Waters SQD質譜儀(Milford, MA, USA)及蒸發光散射偵測器，以正模式基於電噴霧離子化(ESI)進行偵測。
下述代表性程式可用於合成化合物1-147。
本文採用以下縮寫： THF：四氫呋喃 DMAP：4-二甲基胺基吡啶 LDA：二異丙基胺基鋰 rt：室溫 DME：1,2-二甲氧基乙烷 n-BuLi：正丁基鋰 B. 化合物 2 ： 8-((2- 羥乙基 )( 十四烷基 ) 胺基 ) 辛酸十七烷 -9- 基酯 代表程式 1 ：
Figure 02_image1389
8- 溴辛酸十七烷 -9- 基酯 ( 方法 A)
Figure 02_image1391
向8-溴辛酸(1.04 g，4.6 mmol)及十七烷-9-醇(1.5 g，5.8 mmol)於二氯甲烷(20 mL)中之溶液中添加 N-(3-二甲基胺基丙基)- N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1.1 g，5.8 mmol)、 N,N-二異丙基乙基胺(3.3 mL，18.7 mmol)及DMAP (114 mg，0.9 mmol)。將反應物在室溫下攪拌18 h。用二氯甲烷稀釋反應物，且用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層，用鹽水洗滌且經MgSO 4乾燥。過濾有機層且 在真空下蒸發。藉由矽膠層析(0-10%乙酸乙酯之己烷溶液)純化殘餘物，得到8-溴辛酸十七烷-9-基酯(875 mg，1.9 mmol，41%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 4.89 (m, 1H); 3.42 (m, 2H); 2.31 (m, 2H); 1.89 (m, 2H); 1.73-1.18 (br. m, 36H); 0.88 (m, 6H)。 8-((2- 羥基乙基 ) 胺基 ) 辛酸十七烷 -9- 基酯 ( 方法 B)
Figure 02_image1393
將8-溴辛酸十七烷-9-基酯(3.8 g，8.2 mmol)及2-胺基乙-1-醇(15 mL，248 mmol)於乙醇(3 mL)中之溶液在62℃下攪拌18 h。 在真空下濃縮反應混合物，且將殘餘物溶於乙酸乙酯及水中。分離有機層，用水、鹽水洗滌，且經Na 2SO 4乾燥。過濾混合物且 在真空下蒸發。藉由矽膠層析(0-100% (1% NH 4OH、20% MeOH於二氯甲烷中之混合物)之二氯甲烷溶液)純化殘餘物，得到8-((2-羥基乙基)胺基)辛酸十七烷-9-基酯(3.1 g，7 mmol，85%)。UPLC/ELSD: RT = 2.67 min。MS (ES):對於C 27H 55NO 3， m/z(MH +) 442.68
1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 4.89 (p, 1H); 3.67 (t, 2H); 2.81 (t, 2H); 2.65 (t, 2H); 2.30 (t, 2H); 2.05 (br. m, 2H); 1.72-1.41 (br. m, 8H); 1.40-1.20 (br. m, 30H); 0.88 (m, 6H)。 8-((2- 羥基乙基 )( 十四烷基 ) 胺基 ) 辛酸十七烷 -9- 基酯 ( 方法 C)
Figure 02_image318
化學式：C 41H 83NO 3分子量：638.12
將8-((2-羥基乙基)胺基)辛酸十七烷-9-基酯(125 mg，0.28 mmol)、1-溴十四烷(94 mg，0.34 mmol)及 N,N-二異丙基乙基胺(44 mg，0.34 mmol)之乙醇溶液在65℃下攪拌18 h。將反應物冷卻至室溫且 在真空下蒸發溶劑。將殘餘物溶解於乙酸乙酯及飽和碳酸氫鈉中。分離有機層，經Na 2SO 4乾燥，且 在真空下蒸發。藉由矽膠層析(0-100% (1% NH 4OH、20% MeOH於二氯甲烷中之混合物)之二氯甲烷溶液)純化殘餘物，得到8-((2-羥基乙基)(十四烷基)胺基)辛酸十七烷-9-基酯(89 mg，0.14 mmol，50%)。UPLC/ELSD: RT = 3.61 min。MS (ES):對於C 41H 83NO 3， m/z(MH +) 638.91。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 4.86 (p, 1H); 3.72-3.47 (br. m, 2H); 2.78-2.40 (br. m, 5H); 2.28 (t, 2H); 1.70-1.40 (m, 10H); 1.38-1.17 (br. m, 54H); 0.88 (m, 9H)。 中間物之合成： 中間物 A ： 2- 辛基癸酸
Figure 02_image1396
將二異丙基胺(2.92 mL，20.8 mmol)於THF (10 mL)中之溶液冷卻至-78℃，且添加 n-BuLi溶液(7.5 mL，18.9 mmol，2.5 M己烷溶液)。使反應物升溫至0℃。在0℃下，向癸酸(2.96 g，17.2 mmol)及NaH (754 mg，18.9 mmol，60%w/w)於THF (20 mL)中之溶液中添加LDA溶液，且將混合物在室溫下攪拌30 min。此時間之後，添加1­碘辛烷(5 g，20.8 mmol)，且在45℃下加熱反應混合物6 h。用1N HCl (10 mL)淬滅反應物。經MgSO 4乾燥有機層，過濾且 在真空下蒸發。藉由矽膠層析(0-20%乙酸乙酯之己烷溶液)純化殘餘物，得到2-辛基癸酸(1.9 g，6.6 mmol，38%)。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 2.38 (br. m, 1H); 1.74-1.03 (br. m, 28H); 0.91 (m, 6H)。 中間物 B ： 2- 辛基癸酸 7- 溴庚酯
Figure 02_image1398
使用方法A自2-辛基癸酸及7-溴庚-1-醇合成2-辛基癸酸7-溴庚酯。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 4.09 (br. m, 2H); 3.43 (br. m, 2H); 2.48-2.25 (br. m, 1H); 1.89 (br. m, 2H); 1.74-1.16 (br. m, 36H); 0.90 (m, 6H)。 中間物 C ： (2- 己基環丙基 ) 甲醇
Figure 02_image1400
將二乙基鋅(20 mL，20 mmol，1 M己烷溶液)於二氯甲烷(20 mL)中之溶液歷時5 min冷卻至-40℃。隨後逐滴添加二碘甲烷(3.22 mL，40 mmol)於二氯甲烷(10 mL)中之溶液。將反應物在-40℃下攪拌1 h後，添加三氯乙酸(327 mg，2 mmol)及DME (1 mL，9.6 mmol)於二氯甲烷(10 mL)中之溶液。使反應物升溫至-15℃且在此溫度下攪拌1 h。隨後將( Z)-壬-2-烯-1-醇(1.42 g，10 mmol)於二氯甲烷(10 mL)中之溶液添加至-15℃溶液中。然後使反應物緩慢溫至室溫且攪拌18 h。此後，添加飽和NH 4Cl (200 mL)，且用二氯甲烷(3X)萃取反應物，用鹽水洗滌，且經Na 2SO 4乾燥。過濾有機層， 在真空下蒸發，且藉由矽膠層析(0-50%乙酸乙酯之己烷溶液)純化殘餘物，得到(2-己基環丙基)甲醇(1.43 g，9.2 mmol，92%)。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 3.64 (m, 2H); 1.57-1.02 (m, 12H); 0.99-0.80 (m, 4H); 0.72 (m, 1H), 0.00 (m, 1H)。 C. 化合物 18 ： 8-((2- 羥基乙基 )(8-( 壬氧基 )-8- 側氧基辛基 ) 胺基 ) 辛酸十七烷 -9- 基酯
Figure 02_image354
化學式：C 44H 87NO 5分子量：710.18
根據上述通用程式及代表性程式1合成化合物18。
UPLC/ELSD: RT = 3.59 min。MS (ES):對於C 44H 87NO 5， m/z(MH +) 710.89。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 4.86 (m, 1H); 4.05 (t, 2H); 3.53 (br. m, 2H); 2.83-2.36 (br. m, 5H); 2.29 (m, 4H); 0.96-1.71 (m, 64H); 0.88 (m, 9H)。 D. 化合物 136 ： 8-((2- 羥基乙基 )((9 Z,12 Z)- 十八 -9,12- 二烯 -1- 基 ) 胺基 ) 辛酸壬酯 代表程式 2 ： 8- 溴辛酸壬酯 ( 方法 A)
Figure 02_image1403
向8-溴辛酸(5 g，22 mmol)及壬-1-醇(6.46 g，45 mmol)於二氯甲烷(100 mL)中之溶液中添加 N-(3-二甲基胺基丙基)- N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.3 g，22 mmol)及DMAP (547 mg，4.5 mmol)。將反應物在室溫下攪拌18 h。用二氯甲烷稀釋反應物，用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層，且用鹽水洗滌，經MgSO 4乾燥。過濾有機層且在真空下蒸發。藉由矽膠層析(0-10%乙酸乙酯之己烷溶液)純化殘餘物，得到8-溴辛酸壬酯(6.1 g，17 mmol，77%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 4.06 (t, 2H); 3.40 (t, 2H); 2.29 (t, 2H); 1.85 (m, 2H); 1.72-0.97 (m, 22H); 0.88 (m, 3H)。 8-((2- 羥基乙基 ) 胺基 ) 辛酸壬酯
Figure 02_image1405
將8-溴辛酸壬酯(1.2 g，3.4 mmol)及2-胺基乙-1-醇(5 mL，83 mmol)於乙醇(2 mL)中之溶液在62℃下攪拌18 h。在真空下濃縮反應混合物，且用乙酸乙酯及水萃取殘餘物。分離有機層，用水、鹽水洗滌，且經Na 2SO 4乾燥。過濾有機層且 在真空下蒸發。藉由矽膠層析(0-100% (1% NH 4OH、20% MeOH於二氯甲烷中之混合物)之二氯甲烷溶液)純化殘餘物，得到8-((2-羥基乙基)胺基)辛酸壬酯(295 mg，0.9 mmol，26%)。
UPLC/ELSD: RT = 1.29 min。MS (ES):對於C 19H 39NO 3， m/z(MH +) 330.42
1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 4.07 (t, 2H); 3.65 (t, 2H); 2.78 (t, 2H); 2.63 (t, 2H); 2.32-2.19 (m, 4H); 1.73-1.20 (m, 24H); 0.89 (m, 3H) 8-((2- 羥基乙基 )((9 Z,12 Z)- 十八碳 -9,12- 二烯 -1- 基 ) 胺基 ) 辛酸壬酯
Figure 02_image590
化學式：C 37H 71NO 3分子量：577.98
將8-((2-羥基乙基)胺基)辛酸壬酯(150 mg，0.46 mmol)、(6 Z,9 Z)-18-溴十八碳-6,9-二烯(165 mg，0.5 mmol)及 N,N-二異丙基乙基胺(65 mg，0.5 mmol)於乙醇(2 mL)中之溶液在回流下攪拌48 h。將反應物冷卻至室溫且在真空下蒸發溶劑。藉由矽膠層析(0-10% MeOH之二氯甲烷溶液)純化殘餘物，得到HBr鹽形式之8-((2-羥基乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)胺基)辛酸壬酯(81 mg，0.14 mmol，30%)。
UPLC/ELSD: RT = 3.24 min。MS (ES):對於C 37H 71NO 3， m/z(MH +) 578.64
1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 10.71 (br., 1H); 5.36 (br. m, 4H); 4.04 (m, 4H); 3.22-2.96 (br. m, 5H); 2.77 (m, 2H); 2.29 (m, 2H); 2.04 (br. m, 4H); 1.86 (br. m, 4H); 1.66-1.17 (br. m, 40H); 0.89 (m, 6H) E. 化合物 138 ： 8,8’-((2- 羥基乙基 ) 氮烷二基 ) 二辛酸二壬酯 代表程式 3 ：8,8’-((2-羥基乙基)氮烷二基)二辛酸二壬酯
Figure 02_image594
化學式：C 36H 71NO 5分子量：597.97
將8-溴辛酸壬酯(200 mg，0.6 mmol)及2-胺基乙-1-醇(16 mg，0.3 mmol)及 N, N-二異丙基乙基胺(74 mg，0.6 mmol)於THF/CH 3CN (1:1) (3 mL)中之溶液在63℃下攪拌72 h。將反應物冷卻至室溫，且在真空下蒸發溶劑。用乙酸乙酯及飽和碳酸氫鈉萃取殘餘物。分離有機層，經Na 2SO 4乾燥，且在真空下蒸發。藉由矽膠層析(0-10% MeOH之二氯甲烷溶液)純化殘餘物，得到8,8’-((2-羥基乙基)氮烷二基)二辛酸二壬酯(80 mg，0.13 mmol，43%)。
UPLC/ELSD: RT = 3.09 min。MS (ES):對於C 36H 71NO 5， m/z(MH +) 598.85
1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 4.05 (m, 4H); 3.57 (br. m, 2H); 2.71-2.38 (br. m, 6H); 2.29 (m, 4H), 1.71-1.01 (br. m, 49H), 0.88 (m, 6H)。
本揭示案之所有其他式(I)化合物可藉由類似於上述代表性程式1-3之方法獲得。 實例 2 奈米粒子組成物之製備
使用乙醇滴加奈米沉澱，繼而使用去鹽層析管柱將溶劑交換為水性緩衝液來製備脂質奈米粒子核心。例示性脂質奈米粒子可藉由以下方法製備，其中將脂質以15.4 mM之濃度及50:10:38.5:1.5之莫耳比(可離子化脂質:DSPC:膽固醇:DMG-PEG2K脂質)溶解於乙醇中，且與在25 mM乙酸鈉(pH 5.0)中稀釋之0.1515 mg/mL濃度之mRNA混合。將各調配物中之N:P比率設定為5.8。使用微型三通混合器以脂質:mRNA1:3之體積比混合脂質溶液與mRNA。形成奈米粒子後，使其在用pH 7.0之1x PBS緩衝液預處理的去鹽層析管柱上進行溶劑交換。奈米粒子之溶離圖像由UV、pH及電導率偵測器捕獲。使用UV圖像收集經溶劑交換之奈米粒子。使用Amicon超離心過濾器對所得奈米粒子懸浮液進行濃縮，且使其通過0.22 µm注射器過濾器。將奈米粒子製成特定濃度。
藉由將GL67溶解於聚乙烯二醇(15)-羥基硬脂酸酯，即Kolliphor ®HS15 (HS15)中將GL67添加至奈米粒子核心，且以1.25 (GL67:mRNA)之質量比後添加至LNP。特定言之，將3HCl-GL67直接溶解於HS15 (1 mg/mL，約70 µM，水)中以產生5 mg/mL (6.92 mM)初始儲備溶液，其可在溶液中呈微胞形式。將5 mg/mL GL67用HS15 (1 mg/mL)進一步稀釋(以特定GL67:mRNA重量比進行後添加(PA)所要之[GL67])，且在環境溫度下經由簡單混合添加至LNP (1:1，以體積計)： [mRNA] 0.2 mg/mL，[3HCl-GL67] 0.25 mg/mL，[HS15] 0.5 mg/mL，[PBS] 0.5x。 用1xPBS進一步稀釋LNP (1:1，以體積計)： [mRNA] 0.1 mg/mL，[3HCl-GL67] 0.125 mg/mL，[HS15] 0.5 mg/mL，[PBS] 0.75x。
稱為LNP-1a之例示性LNP核心如下： LNP-1a
組分 質量(mg) MW (g/mol) 核心LNP mol%
實例1之化合物18 11.99 710.18 50.0%
DSPC 2.67 790.15 10.0%
膽固醇 5.02 386.65 38.5%
DMG-PEG 2k 1.27 2500 1.5%
mRNA 1 -- --
稱為LNP-1之例示性LNP如下： LNP-1
組分 質量(mg) MW (g/mol) 核心LNP mol% LNP-1 mol % LNP-1質量%
實例1之化合物18 11.99 710.18 50.0% 47.6% 51.7%
DSPC 2.67 790.15 10.0% 9.5% 11.5%
膽固醇 5.02 386.65 38.5% 36.6% 21.6%
DMG-PEG 2k 1.27 2500 1.5% 1.4% 5.5%
GL67 • 3HCl 1.25 724 -- 4.9% 5.4%
HS 15 0.25 -- -- -- --
mRNA 1 -- -- -- 4.3%
HS15之MW為960-1900，其中平均MW為1430。
例示性LNP (無GL67)可根據圖1-3中之示意圖製備。圖1指產生空脂質奈米粒子，隨後將含有核酸之溶液添加至空LNP中之事後裝載(PHL)過程。圖2指後插入/後添加(PHL-PIPA)過程，其指將PEG脂質添加至脂質奈米粒子中。圖3指第二代事後裝載過程，其包括後插入/後添加PEG步驟。圖4指空脂質奈米粒子原型(「中性組合件」)，其中將空LNP在pH 8.0下混合且最終調配物為pH 5.0。 實例 3 小角度 x 射線散射 (SAXS)
x射線散射實驗使用來自Anton Paar之室內小角度x射線散射儀器SAXS point 2.0進行。LNP之mRNA濃度典型地在0.5至1 mg/mL範圍內，將該等LNP裝載至直徑為1 mm之石英毛細管中。由Primux 100 micro x射線源產生波長為0.154 nm之X射線。使用來自DECTRIS之二維(2D) EIGER R系列CMOS偵測器在樣品與偵測器距離為575 mm處量測散射強度。隨後對2D數據進行循環平均，得到範圍為0.06 nm -1至4 nm -1之一維(1D)圖像q，其中q
Figure 02_image1409
為波向量，λ及θ分別為波長及散射角。將1D數據針對樣品傳輸及緩衝液本底值進行進一步校正。根據實例3製備之LNP-1的晶面間距為6.42 nm。LNP-1a之晶面間距為5.47 nm。圖6展示LNP-1及LNP-1a之l(q)(au)與q (nm-1)之圖。 實例 4 廣義極化 (GP)
以0.075 mg/mL之濃度將Laurdan (6-十二烷醯基-2-二甲基胺基萘)預溶解於二甲亞碸(DMSO)中。隨後以0.18 mg/mL脂質濃度，以1:500之DMSO與水性緩衝液體積比將Laurdan/DMSO溶液添加至LNP溶液中。對於對照實驗，按照相同方案將DMSO替代Laurdan/DMSO添加至LNP溶液中。將Laurdan染料與LNP溶液一起培育三小時。使用MicroMax 384微孔板讀取器在340 nm之激發波長下收集435及490 nm下之螢光強度，該讀取器連接於來自Horiba之室內螢光光譜儀FluoroMax-4。廣義極化(GP)基於如下等式計算：
Figure 02_image1411
圖7展示根據實例3製備之LNP-1及LNP-1a的一般極性laurdan (GPL)值。 實例 5 mRNA 封裝百分比
使用改良Quant-iT RiboGreen檢定量測封裝效率(EE%)。為確定EE%，在1X TE中稀釋奈米粒子(或PBS，空白)，以達到每孔2-4 μg/mL mRNA之濃度。將此等樣品等分且在1X TE或者具有2.5 mg/mL肝素緩衝液之1X TE(量測遊離mRNA)或者具有2% Triton X-100或含2.5 mg/mL肝素之2% Triton的TE緩衝液(量測總mRNA)中1:1稀釋。添加Quant-iT RiBogreen試劑，且使用板讀取器對螢光訊號進行定量。封裝效率如下計算：
Figure 02_image1413
總mRNA：藉由用具有或不具有肝素之洗滌劑Triton (TX)溶解粒子來定量mRNA之總量。 遊離mRNA：藉由在具有或不具有肝素之TE (Tris + EDTA緩衝液)中稀釋粒子來定量未封裝之mRNA之量。
肝素為一種陰離子糖胺聚糖，其與固醇胺競爭mRNA，且用於定量具有陽離子劑諸如固醇胺之LNP中mRNA之量。
根據實例2製備之LNP-1具有98%經封裝mRNA。 實例 6 健康人類支氣管上皮細胞模型中之 LNP 細胞攝取及蛋白質表現
為評價健康人類支氣管上皮細胞(HBE)中之LNP細胞攝取及蛋白質表現，使用來自MatTek (Ashland, Ma)的之EpiAirway模型，其為一種即用型3D組織模型。該模型由來自健康供體之人類來源氣管/支氣管上皮細胞組成。
將細胞塗於孔徑為0.4 µm之24 mm transwells外掛程式上，且在產生匯合單層後，自頂端腔室取出培養基，其中將培養物在氣液介面(ALI)處保存長達4週以達成完全細胞分化及假分層。該模型概括黏膜纖毛障壁之活體內表型，且展現人類相關組織結構及細胞形態，其中3D結構由組織角蛋白5+基底細胞、產生黏液之杯狀細胞、功能性緊密接合物及動纖毛組成。 健康 HBE 細胞中之積累及表現檢定
在含健康HBE之Hyclone磷酸鹽緩衝鹽水之頂部給與倂有0.1 mol%玫瑰紅(Rhodamine)-DOPE且封裝NPI-Luc報告基因mRNA之LNP。在添加LNP之前，用含1 mM DTT之PBS洗滌細胞10 min，以移除ALI分化後期間積累之黏液。NPI-Luc報告基因包括核定位序列及N端之多個V5標籤，以提高對所表現蛋白分子之偵測靈敏性。將LNP轉染細胞培育4-72 h，之後使用胰蛋白酶EDTA將細胞自膜分離，且固定在含4% PFA之PBS溶液的懸浮液中。
分別處理細胞以獲得LNP積累及蛋白質表現。為定量LNP積累，將PFA固定細胞轉移於具有光學透明環烯烴底部之96孔Cell Carrier Ultra板(PerkinElmer)中，以進行高含量分析，且使用Opera Phenix轉盤式共聚焦顯微鏡(PerkinElmer)成像。使用DAPI (405 nm通道)偵測細胞，且使用玫瑰紅-DOPE (561 nm通道)偵測LNP積累。在Harmony 4.8中進行影像分析，使用561 nm通道中之點分割來定量胞吞細胞器中之LNP積累且獲得LNP攝取陽性之細胞%以及每個細胞之LNP積累。
為定量蛋白質表現，將PFA固定細胞轉移於96孔v型底板中，且使用抗V5兔單株抗體處理以獲得免疫螢光(IF)。簡言之，將細胞用0.5% TX-100透化5 min，用含1%牛血清白蛋白(BSA)之PBS阻斷30 min，隨後在室溫下與抗V5一級抗體一起培育1 h，且與Alexa 488結合之二級抗體一起培育30 min。在不同培育步驟之間，將細胞離心且藉由再懸浮於PBS中洗滌。抗V5 IF染色後，將細胞轉移於96孔Cell Carrier Ultra板中，以用Opera Phenix成像，使用488 nm通道偵測NPI-Luc表現。在Harmony 4.8中進行影像分析，其中使用488 nm通道中之平均核強度獲得蛋白質表現陽性之細胞%及每個細胞之蛋白質表現。 實例 7 人類子宮頸癌上皮細胞 (HeLa) 模型中之蛋白質表現
為評價 活體外蛋白質表現，使用來自ATCC.org (ATCC CCL-2)之HeLa細胞。將細胞在完全最低必需培養基(MEM)中培養，且在實驗進行之前塗於具有PDL塗布表面之96孔Cell Carrier Ultra板(PerkinElmer)中。 HeLa 細胞中之表現檢定
在無血清存在下向封裝NPI-Luc mRNA之LNP給與MEM培養基。將LNP轉染細胞在LNP轉染後培育5 h，使用Opera Phoenix轉盤式共聚焦顯微鏡(PerkinElmer)對細胞進行實時成像。使用DAPI (405 nm通道)偵測細胞，且在Harmony 4.9中進行影像分析，以定量細胞數量。成像後，用One-Glo螢光素酶檢定(Promega)處理細胞以定量蛋白質表現。結果以針對細胞計數標準化之相對發光單位(RLU)報告。 實例 8 使用事後方法製備奈米粒子組成物
例示性空脂質奈米粒子可藉由以下方法製備，其中將脂質以40 mM之濃度及50.5:10.1:38.9:0.5之莫耳比(可離子化脂質:DSPC:膽固醇:DMG-PEG2K脂質)溶解於乙醇中，且與7.15 mM乙酸鈉(pH 5.0)混合。使用多入口渦旋混合器以脂質:緩衝液3:7之體積比混合脂質溶液與緩衝液。5秒滯留時間後，將eLNP與5 mM乙酸鈉(pH 5.0)以5:7之eLNP:緩衝液體積比混合。隨後將經稀釋eLNP進行緩衝液交換，且使用切向流過濾濃縮至含有5 mM乙酸鈉(pH 5.0)之最終緩衝液中，隨後添加蔗糖溶液以完成儲存基質。使用PHL法將mRNA裝載至eLNP中。可藉由將脂質濃度為2.85 mg/mL之eLNP與濃度為0.25 mg/mL之mRNA在42.5 mM乙酸鈉(pH 5.0)中混合來製備例示性裝載mRNA之奈米粒子。將各調配物中之N:P比率設定為4.93。使用多入口渦旋混合器以eLNP:mRNA 3:2之體積比混合eLNP溶液與mRNA。eLNP裝載mRNA後，其經歷30 s-60 s之滯留時間，隨後與含有120 mM TRIS (pH 8.12)之緩衝液以5:1之奈米粒子:緩衝液體積比在線混合。在此添加步驟之後，將奈米粒子調配物與含有20 mM TRIS、0.352 mg/mL DMG-PEG2k、0.625 mg/mL GL-67 (pH 7.5)之緩衝液以6:1之奈米粒子:緩衝液體積比在線混合。使用切向流過濾對所得奈米粒子懸浮液進行濃縮，且用鹽溶液稀釋至含有70 mM NaCl之最終緩衝液基質。使所得奈米粒子懸浮液經由0.8/0.2 µm膠囊過濾器過濾，且填充於mRNA強度為0.5-2 mg/mL之玻璃小瓶中。 實例 9 固醇胺之合成 A. 化合物 SA1 ： (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-N,N,10,13- 四甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 胺
Figure 02_image1415
SA1如 Justus Liebigs Annalen der Chemie, 663,135-49 ( 1963)中所述製備 B. 化合物 SA2 ： 2-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-di 甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基 ) 氧基 )-N,N- 二甲基乙 -1- 胺
Figure 02_image1417
SA2如 Biochem. and Biophys Res. Communications, 6, 359 ( 1961)中所述製備。 C. 化合物 SA3 ： (3- 胺基丙基 )(4-((3- 胺基丙基 ) 胺基 ) 丁基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯三鹽酸鹽
Figure 02_image1419
SA3購自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster, AL)。 D. 化合物 SA4 ： (2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1421
SA4購自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster, AL)。 E. 化合物 SA5 ： 4-((((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基 ) 二硫烷基 ) 甲基 )-1H- 咪唑
Figure 02_image1423
SA5如美國專利申請案20140288160(「Cleavable Lipids」)中所述製備。 F. 化合物 SA6 ： (2-((2- 羥基乙基 )( 甲基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1425
在乾燥氮氣下，在0℃下，經五分鐘向2-[(2-胺基乙基)(甲基)胺基]乙醇(53 mg，0.44 mmol)於1 mL無水DCM中之攪拌溶液中逐滴添加氯甲酸膽固醇酯於2 mL無水DCM中之溶液(100 mg，0.22 mmol)。使反應物緩慢溫至室溫且攪拌隔夜，之後藉由LCMS得知無起始材料剩餘。濃縮白色混合物，且藉由矽膠層析(100% DCM至20% DCM/80% DCM/MeOH/NH 4OH (80:20:1))純化殘餘物，得到呈白色固體狀之(2-((2-羥基乙基)(甲基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(57 mg，0.11 mmol，48%)。MS (ES):對於C 36H 64N 2O 2， m/z(MH +) 531.5。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.36 (d, 1H, J= 5.1 Hz); 5.02 (t, 1H, J = 5.3 Hz); 4.48 (m, 1H); 3.61 (t, 2H, J= 5.3 Hz); 3.27 (q, 2H, J= 5.5 Hz, 11.2 Hz); 2.69 (br. s, 4H); 2.55 (m, 4H); 2.42-2.16 (m, 5H); 2.10-1.71 (m, 5H); 1.63-1.22 (m, 11H); 1.21-0.95 (m, 13H); 0.90 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.88 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.66 (s, 3H)。 G. 化合物 SA7 ： (2-(4- 甲基呱嗪 -1- 基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1427
以與SA6相同之方式製備SA7，但使用2-(4-甲基呱嗪-1-基)乙基胺替代2-[(2-胺基乙基)(甲基)胺基]乙醇，得到呈白色固體狀之(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基(2-(4-甲基呱嗪-1-基)乙基)胺基甲酸酯(115 mg，0.21 mmol，93%)。MS (ES):對於C 35H 61N 3O 2， m/z(MH +) 556.5。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.37 (d, 1H, J= 5.0 Hz); 5.08 (m, 1H); 4.48 (m, 1H); 3.59 (t, 2H, J= 6.4 Hz); 3.27 (d, 2H, J= 5.3 Hz); 2.71 (br. s, 4H); 2.57-2.45 (m, 8H); 2.42-2.18 (m, 3H); 2.05-1.72 (m, 5H); 1.70-1.23 (m, 11H); 1.22-0.95 (m, 13H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.67 (s, 3H)。 H. 化合物 SA8 ： (2-(4-(2- 羥基乙基 ) 呱嗪 -1- 基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1429
以與SA6相同之方式製備SA8，但使用2-[4-(2-胺基乙基)呱嗪-1-基]乙醇替代2-[(2-胺基乙基)(甲基)胺基]乙醇，得到呈白色固體狀之(2-(4-(2-羥基乙基)呱嗪-1-基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(85 mg，0.15 mmol，87%)。MS (ES):對於C 36H 63N 3O 3， m/z(MH +) 589.9。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.37 (d, 1H, J= 5.0 Hz); 5.08 (m, 1H); 4.50 (m, 1H); 3.61 (t, 2H, J= 6.4 Hz); 3.27 (d, 2H, J= 5.3 Hz); 2.69 (br. s, 4H); 2.57-2.45 (m, 11H); 2.42-2.18 (m, 3H); 2.05-1.72 (m, 5H); 1.70-1.23 (m, 11H); 1.22-0.95 (m, 13H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.67 (s, 3H)。 I. 化合物 SA9 ： (3-((2- 羥基乙基 )( 甲基 ) 胺基 ) 丙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1431
以與SA6相同之方式製備SA9，但使用2-[(3-胺基丙基)(乙基)胺基]乙醇替代2-[(2-胺基乙基)(甲基)胺基]乙醇，得到呈無色油狀之(3-((2-羥基乙基)(甲基)胺基)丙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(97 mg，0.18 mmol，80%)。MS (ES):對於C 34H 60N 2O 3， m/z(MH +) 545.5。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.35 (d, 1H, J= 5.1 Hz); 5.19 (m, 1H); 4.45 (m, 1H); 3.60 (t, 2H, J= 5.3 Hz); 3.21 (m, 2H); 2.51 (t, 2H, J = 5.2Hz); 2.44 (t, 2H, J= 6.9 Hz); 2.39-1.73 (m, 10H); 1.71-1.25 (m, 14H); 1.24-0.95 (m, 12H); 0.89 (d, 3H, J= 6.4 Hz); 0.84 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.65 (s, 3H)。 J. 化合物 SA10 ： (2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5- 乙基 -6- 甲基庚烷 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image017
步驟 1 ：碳酸 β- 麥固醇酯 4- 硝基苯酯
Figure 02_image1434
將β-麥固醇(8.00 g，19.3 mmol)、三乙基胺(5.4 mL，39 mmol)及4-二甲基胺基吡啶(0.471 g，3.86 mmol)於DCM (80 mL)中之攪拌溶液在冰浴中冷卻至0℃。經2 min分批添加氯甲酸4-硝基苯酯(4.277 g，21.22 mmol)。使反應混合物緩慢達至室溫隔夜，且藉由LCMS監測。在21 h時，將反應混合物在冰浴中冷卻至0℃，隨後添加三乙基胺(2.7 mL)及氯甲酸4-硝基苯酯(3.00 g)。使反應混合物達至室溫。在40 h時，過濾反應混合物，且將濾液經1 h逐滴添加至於冰浴中冷卻至0℃之經攪拌ACN (250 mL)之燒瓶中。藉由真空過濾用ACN沖洗收集固體，得到呈灰白色固體狀之碳酸β-麥固醇酯4-硝基苯酯(9.15 g，15.8 mmol，81.8%)。UPLC/ELSD: RT = 3.38 min。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 8.28 (m, 2H), 7.39 (m, 2H), 5.37-5.49 (m, 1H), 4.54-4.69 (m, 1H), 2.36-2.57 (m, 2H), 0.86-2.10 (br. m, 27H), 1.05 (s, 3H), 0.93 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.78-0.88 (m, 9H), 0.69 (s, 3H)。 步驟 2a ： (2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5- 乙基 -6- 甲基庚烷 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1436
將(2-胺基乙基)二甲基胺(0.11 mL，1.0 mmol)添加至碳酸β-麥固醇酯4-硝基苯酯(0.487 g，0.840 mmol)及三乙基胺(0.18 mL，1.3 mmol)於DCM (8.4 mL)中之攪拌溶液中。在40℃下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在2 h時，使反應混合物冷卻至室溫。用DCM稀釋反應混合物且用水洗滌。用DCM萃取水性混合物。使經合併有機層通過疏水玻璃料，經Na 2SO 4乾燥且濃縮。經由矽膠層析(含0-20% (5%濃氨水(conc. aq. NH 4OH)之MeOH溶液)之DCM溶液)純化粗物質，得到呈灰白色固體狀之(2-(二甲基胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚烷-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(0.296 g，0.56 mmol，66.6%)。UPLC/ELSD: RT = 2.43 min。 MS (ES):對於C 34H 60N 2O 2， m/z= 529.3 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.34-5.41 (m, 1H), 5.01-5.71 (m, 1H), 4.42-4.58 (m, 1H), 3.24 (dt, 2H, J= 5.6, 5.4 Hz), 2.19-2.44 (m, 2H), 2.39 (t, 2H, J= 6.0 Hz), 2.22 (s, 6H), 1.76-2.05 (br. m, 5H), 0.88-1.72 (br. m, 22H), 1.01 (s, 3H), 0.92 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.77-0.88 (m, 9H), 0.68 (s, 3H)。 步驟 2b ： (2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5- 乙基 -6- 甲基庚烷 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1438
向碳酸β-麥固醇酯4-硝基苯酯(2.50 g，4.31 mmol)及CHCl 3(40 mL)之攪拌溶液中添加(2-胺基乙基)二甲基胺(0.56 mL，5.2 mmol)及三乙基胺(0.91 mL，6.5 mmol)。將反應混合物在40℃下攪拌，且藉由LCMS監測。在26 h時，將反應混合物冷卻至室溫，用水(3x)洗滌，通過疏水玻璃料，隨後濃縮。將殘餘物溶解於iPrOH (15 mL)及DCM (10 mL)中，得到黃色溶液。向黃色溶液中逐滴添加5-6 N HCl之iPrOH溶液(1.0 mL) ，且將反應混合物在室溫下攪拌15 min。濃縮溶液以移除DCM，隨後添加ACN (10 mL)。將混合物在0℃下在冰浴中攪拌15 min，隨後藉由真空過濾用1:1 ACN:iPrOH沖洗收集固體，得到呈白色固體狀之(2-(二甲基胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚烷-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯鹽酸鹽(1.984 g，3.344 mmol，77.6%)。UPLC/ELSD: RT = 2.43 min. MS (ES):對於C 34H 60N 2O 2， m/z= 529.3 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 12.49 (br. s, 1H), 6.25-6.37 (m, 1H), 5.33-5.40 (m, 1H), 4.40-4.55 (m, 1H), 3.66 (dt, 2H, J= 5.4, 5.3 Hz), 3.19 (dt, 2H, J= 5.4, 5.3 Hz ), 2.86 (d, 6H, J= 4.9 Hz), 2.24-2.42 (m, 2H), 1.75-2.07 (br. m, 5H), 0.88-1.72 (br. m, 22H), 1.00 (s, 3H), 0.92 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.77-0.88 (m, 9H), 0.67 (s, 3H)。 K. 化合物 SA11 ： 3-(1H- 咪唑 -5- 基 ) 丙 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酸酯鹽酸鹽
Figure 02_image1440
SA11如WO 2011/068810 (「Delivery of mRNA for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases」)中所述製備，隨後用2.5當量2 M鹽酸之乙醚溶液轉化為鹽酸鹽。用額外乙醚洗滌所得沉澱，風乾，隨後在真空下乾燥，得到呈白色固體狀之3-(1H-咪唑-5-基)丙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯鹽酸鹽(29 mg，0.05 mmol，77%)。MS (ES):對於C 33H 52N 2O 2， m/z(MH +) 509.8。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 7.54 (s, 1H); 6.80 (s, 1H); 5.36 (d, 1H, J= 4.0 Hz); 4.62 (m, 1H); 2.91 (t, 2H, J= 6.8 Hz); 2.64 (d, 2H, J= 6.9 Hz); 2.30 (d, 1H, J= 7.8 Hz); 2.07-1.72 (m, 6H); 1.70-0.94 (m, 28H); 0.91 (d, 3H, J= 6.4 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.0 Hz, 6.5 Hz); 0.67 (s, 3H)。 L. 化合物 SA12 ： (2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 ) 十六氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1442
在乾燥氮氣下將(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-醇(280 mg，0.72 mmol)於5 mL無水DCM中之攪拌溶液冷卻至0℃，且添加三乙基胺(60 µL 1.1 mmol)，隨後經五分鐘逐滴添加氯甲酸 對硝基苯酯(220 mg，1.1 mmol)於2 mL無水DCM中之溶液。十分鐘後，移除冷卻浴，且在室溫下攪拌混合物三小時，之後藉由TLC得知無起始材料剩餘。向反應物中逐滴添加 N,N-二甲基乙二胺(純的；90 μL，0.8 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物30 min。隨後用DCM稀釋反應混合物，且用1 N NaOH水溶液洗滌兩次。將有機相乾燥(MgSO 4)且過濾。將濾液濃縮成淺黃色固體。將其經由矽膠層析(含0-20% (5%濃氨水之MeOH溶液)之DCM溶液)純化，得到呈白色固體狀之得到呈白色固體狀之(2-(二甲基胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(270 mg，0.54 mmol，75%)。MS (ES):對於C 32H 58N 2O 2， m/z(MH +) 503.9。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.12 (m, 1H); 4.56 (m, 1H); 3.25 (d, 2H, J= 5.4 Hz); 2.41 (t, 2H, J= 5.8 Hz); 2.23 (s, 6H); 2.15-1.90 (m, 1H); 1.89-1.41 (m, 11H): 1.40-0.94 (m, 18H); 0.89 (d, 3H, J= 6.6 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.80 (s, 3H); 0.64 (m, 4H)。 M. 化合物 SA13 ： (2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5- 乙基 -6- 甲基庚 -3- 烯 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1444
以與SA12相同之方式製備SA13，但使用(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-醇替代(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-醇，得到呈白色固體狀之(2-(二甲基胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(210 mg，0.40 mmol，77%)。MS (ES):對於C 34H 58N 2O 2， m/z(MH +) 527.9。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.36 (d, 1H, J= 5.1 Hz); 5.15 (dd, 2H, J= 8.4 Hz, 15.1 Hz), 5.01 (dd, 1H, J= 8.4 Hz, 15.1 Hz), 4.48 (m, 1H), 3.25 (q, 2H, J= 5.4 Hz, 11 Hz); 2.40 (t, 2H, J = 6.1 Hz); 2.36-2.13 (m, 8H); 2.12-1.77 (m, 6H); 1.76-1.39 (m, 9H); 1.37-1.07 (m, 6H); 1.06-0.90 (m, 8H); 0.89-0.74 (m, 9H), 0.69 (s, 3H)。 N. 化合物 SA14 ： (2-((2- 羥基乙基 )( 甲基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5- 乙基 -6- 甲基庚 -3- 烯 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1446
以與SA12相同之方式製備化合物SA14，但使用(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-醇替代(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-醇且使用2-[(2-胺基乙基)(甲基)胺基]乙醇替代 N,N-二甲基乙二胺，得到呈白色固體狀之(2-((2-羥基乙基)(甲基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(92 mg，0.16 mmol，93%)。MS (ES):對於C 35H 60N 2O 3， m/z(MH +) 557.46。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.36 (d, 1H, J= 5.1 Hz); 5.19-5.11 (m, 1H); 5.04-4.97 (m, 1H); 4.49 (m, 1H), 3.62 (t, 2H, J= 5.2 Hz); 3.28 (d, 2H, J = 5.6 Hz); 2.57 (m, 4H); 2.45-2.18 (m, 5H); 2.16-1.62 (m, 8H); 1.60-1.08 (m, 15H); 1.07-0.89 (m, 8H); 0.88-0.74 (m, 9H), 0.69 (s, 3H)。 O. 化合物 SA15 ： (2-((2- 羥基乙基 )( 甲基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 ) 十六氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1448
以與SA12相同之方式製備化合物SA14，但使用2-[(2-胺基乙基)(甲基)胺基]乙醇替代 N,N-二甲基乙二胺，得到呈白色固體狀之(2-((2-羥基乙基)(甲基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(79 mg，0.15 mmol，82%)。MS (ES):對於C 33H 60N 2O 3， m/z(MH +) 532.9。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.19 (m, 1H); 4.53 (m, 1H); 3.59 (t, 2H, J= 5.2 Hz); 3.24 (d, 2H, J= 5.4 Hz); 2.53 (m, 4H); 2.25 (s, 3H); 2.02-1.38 (m, 10H); 1.37-0.91 (m, 19H); 0.86 (d, 3H, J= 6.6 Hz); 0.83 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.77 (s, 3H); 0.61 (m, 4H)。 P. 化合物 SA16 ： 3-( 二甲基胺基 )-N-(((1R,4aS,10aR)-7- 異丙基 -1,4a- 二甲基 -1,2,3,4,4a,9,10,10a- 八氫菲 -1- 基 ) 甲基 ) 丙烯醯胺
Figure 02_image1450
將3-(二甲基胺基)丙酸(1.067 g，9.108 mmol)於亞硫醯氯(5.1 mL，70.1 mmol)中之溶液回流30 min。在真空下濃縮反應混合物，且將殘餘物溶解於DCM，且添加((1R,4aS,10aR)-7-異丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氫菲-1-基)甲基胺(去氫樅胺；Combi-Blocks公司, San Diego, CA) (2 g，7 mmol)，隨後添加三乙基胺(2.9 mL，21.0 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物2 h。隨後用水淬滅反應混合物，且用DCM萃取。用DCM稀釋有機層，且用飽和NaHCO 3水溶液洗滌。分離有機層，用鹽水洗滌，用Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空下蒸發。藉由矽膠急驟層析(0-20% MeOH之DCM溶液)純化殘餘物，得到3-(二甲基胺基)-N-(((1R,4aS,10aR)-7-異丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氫菲-1-基)甲基)丙烯醯胺(0.441 g，1.147 mmol，產率16.4%)。UPLC/ELSD: RT = 1.19 min。MS (ES):對於C 25H 40N 2O， m/z(MH +) 385.46； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 8.42 (bs, 1H); 7.18 (m, 1H); 6.99 (m, 1H); 6.90 (m; 1H); 3.17 (m, 2H); 3.01-2.73 (m, 3H); 2.71-2.53 (m, 2H); 2.44 (m, 2H); 2.37-2.16 (m, 7H); 1.95-1.61 (m, 4H); 1.51-1.18 (m, 13H); 0.96 (s, 3H)。 Q. 化合物 SA17 ： (2-(1- 甲基 -1H- 咪唑 -5- 基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13- 二甲基 -17-(( R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1 H- 環戊二烯並 [ a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1452
在乾燥氮氣下將3-甲基組胺二鹽酸鹽(265 mg，1.27 mmol)於20 mL無水DCM與無水2-丙醇之1:1混合物中之溶液在攪拌下冷卻至0℃，得到白色漿液。向其中添加三乙基胺(520 µL，3.7 mmol)，隨後經10分鐘逐滴添加氯甲酸膽固醇酯(500 mg，1.06 mmol)於10 mL無水THF中之溶液。在0℃下攪拌所得混合物兩小時，之後藉由LCMS得知無起始材料剩餘。在真空下將混合物還原。用飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋殘餘物，且用DCM萃取兩次。合倂有機層，乾燥(MgSO 4)且過濾。濃縮濾液，得到淺黃色固體。將其藉由矽膠層析(100% DCM至90% DCM/10% MeOH)純化，得到呈白色固體狀之(2-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)乙基)胺基甲酸(3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13-二甲基-17-(( R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(530 mg，0.98 mmol，93%)。UPLC/ELSD: RT = 2.85 min。MS (ES):對於C 34H 55N 3O 2， m/z(MH +) 538.79。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 7.42 (s, 1H); 6.83 (s, 1H); 5.36 (d, 1H, J= 5.1 Hz); 4.82 (m, 1H); 4.48 (m, 1H); 3.58 (s, 3H); 3.39 (q, 2H, J= 6.7 Hz, 13.2 Hz); 2.42-2.18 (m, 2H); 2.16-1.91 (m, 3H); 1.90-1.73 (m, 3H); 1.65-1.44 (m, 6H); 1.43-1.22 (m, 4H); 1.21-1.06 (m, 6H); 1.05-0.94 (m, 6H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (d, 6H, J= 6.5 Hz); 0.67 (s, 3H)。 R. 化合物 SA18 ： (1R,4aS,10aR)-N-(2-( 二甲基胺基 ) 乙基 )-6- 羥基 -1,4a- 二甲基 -1,2,3,4,4a,9,10,10a- 八氫菲 -1- 甲醯胺
Figure 02_image166
步驟 1 ： (1R,4aS,10aR)-6-(( 第三丁基二甲基矽基 ) 氧基 )-1,4a- 二甲基 -1,2,3,4,4a,9,10,10a- 八氫菲 -1- 甲酸
Figure 02_image1455
向(1R,4aS,10aR)-6-羥基-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸(羅漢松酸；Sigma-Aldrich公司, St. Louis, MO) (0.5 g，1.8 mmol)於DMF (9.1 mL，0.2 M)中之攪拌溶液中添加咪唑(0.496 g，7.29 mmol)及 第三丁基二甲基氯矽烷(0.275 g，1.822 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。用水稀釋反應混合物，且用DCM萃取。用水洗滌有機相，用硫酸鈉乾燥，過濾且在真空下蒸發。藉由矽膠急驟層析(0-20% MeOH之DCM溶液)純化殘餘物，得到(1R,4aS,10aR)-6-[(第三丁基二甲基矽基)氧基]-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸(0.471 g，1.212 mmol，產率67%)。 UPLC/ELSD: RT = 3.55 min。MS (ES):對於C 23H 36O 3Si， m/z(MH +) 389.56； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 6.80 (m, 1H); 6.63 (m, 1H); 6.48 (m, 1H); 2.81-2.51 (m, 2H); 2.18-2.00 (m, 3H); 2.00-1.75 (m, 2H); 1.57-1.21 (m, 3H); 1.17 (s, 3H); 1.05-0.77 (m, 14H); 0.15 (m, 6H)。 步驟 2 ： (1R,4aS,10aR)-N-(2-( 二甲基胺基 ) 乙基 )-6- 羥基 -1,4a- 二甲基 -1,2,3,4,4a,9,10,10a- 八氫菲 -1- 甲醯胺
Figure 02_image1457
向(1R,4aS,10aR)-6-[(第三丁基二甲基矽基)氧基]-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸(0.213 g，0.548 mmol)於DCM (2.7 mL)中之溶液中添加(1-氯-2-甲基丙-1-烯-1-基)二甲基胺(0.16 mL，1.206 mmol)。在室溫下攪拌反應物1 h，且在真空下蒸發。將殘餘物再溶解於DCM (2.7mL)中，且添加(2-胺基乙基)二甲基胺(0.081 mL，0.822 mmol)，隨後添加三乙基胺(0.2 mL，1.6 mmol)。在室溫下攪拌反應物16 h，用DCM稀釋，且用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層，用鹽水洗滌，用Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空下蒸發。藉由矽膠急驟層析(0-20% MeOH之DCM溶液)純化殘餘物，得到(1R,4aS,10aR)-N-[2-(二甲基胺基)乙基]-6-羥基-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲醯胺(0.095 g，0.276 mmol，產率50%)。UPLC/ELSD: RT = 1.53 min。MS (ES):對於C 21H 32N 2O 2， m/z(MH +) 345.37； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 6.92 (m, 1H); 6.77 (m, 1H); 6.74-6.57 (m, 2H); 3.44 (m, 2H); 2.94-2.58 (m, 4H); 2.42 (bs, 6H); 2.32-2.16 (m, 3H); 2.14-1.92 (m, 2H); 1.74-1.61 (m, 1H); 1.59-1.07 (m, 10H)。 S. 化合物 SA19 ： (1R,4aS,10aR)-6- 羥基 -1,4a- 二甲基 -1,2,3,4,4a,9,10,10a- 八氫菲 -1- 甲酸 2-( 二甲基胺基 ) 乙酯
Figure 02_image1459
步驟 1 ： (1R,4aS,10aR)-6-( 苯甲氧基 )-1,4a- 二甲基 -1,2,3,4,4a,9,10,10a- 八氫菲 -1- 甲酸甲酯
Figure 02_image1461
經5 min向(1R,4aS,10aR)-6-羥基-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸(羅漢松酸；Sigma-Aldrich公司, St. Louis, MO) (1.9 g，6.925 mmol)於MeOH (9 mL)及甲苯(18 mL)中之攪拌溶液中逐滴添加三甲基矽基重氮甲烷[4.9 mL (2 M己烷溶液)，9.695 mmol]。將溶液在室溫下攪拌1 h。用AcOH淬滅過量三甲基矽基重氮甲烷，且在真空下蒸發反應混合物。將殘餘物溶解於DMF (35 mL)中，且添加碳酸銫(9.03 g，27.74mmol)及苯甲基溴(1.3 mL，10.4 mmol)。將溶液攪拌1 h。用水稀釋反應物，且用DCM萃取。用水及鹽水洗滌有機層。分離有機層，用鹽水洗滌，用Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空下蒸發。藉由矽膠急驟層析(0-100%乙酸乙酯之己烷溶液)純化殘餘物，得到(1R,4aS,10aR)-6-(苯甲氧基)-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸甲酯(2.12 g，5.60 mmol，產率81%)。UPLC/ELSD: RT = 3.53 min。MS (ES):對於C 25H 30O 3， m/z(MH +) 379.48； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 7.38-7.17 (m, 5H); 6.86 (m, 1H); 6.78 (m, 1H); 6.64 (m, 1H); 4.92 (s, 2H); 3.56 (s, 3H); 2.82-2.55 (m, 2H); 2.23-2.02 (m, 3H); 1.96-1.74 (m, 2H); 1.56-1.14 (m, 6H); 1.05-0.89 (m, 4H)。 步驟 2 ： (1R,4aS,10aR)-6-( 苯甲氧基 )-1,4a- 二甲基 -1,2,3,4,4a,9,10,10a- 八氫菲 -1- 甲酸 2-( 二甲基胺基 ) 乙酯
Figure 02_image1463
向(1R,4aS,10aR)-6-(苯甲氧基)-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸甲酯(2.1 g，5.548 mmol)於DMSO (28 mL)中之攪拌溶液中添加第三丁醇鉀(9.34 g，83.22 mmol)。將溶液攪拌1 h。隨後，將反應混合物倒入冰水中，用2 N HCl水溶液酸化，且用乙酸乙酯萃取。用水及鹽水洗滌經合併有機層，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下蒸發掉溶劑。將殘餘物溶解於DCM (65 mL)中，且添加草醯氯(2.2 mL，25.8 mmol)，隨後添加DMF (0.01 mL)。將溶液攪拌1 h。蒸發揮發物，且將殘餘物溶解於DCM (7 mL)中。添加二甲基胺基乙醇(0.21 mL，2.06 mmol)及4-(二甲基胺基)吡啶(0.033 g，0.274 mmol)，隨後添加三乙基胺(0.6 mL，4.1 mmol)。將溶液攪拌1 h。用DCM稀釋殘餘物，且用飽和NaHCO 3水溶液洗滌。分離有機層，用鹽水洗滌，用Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空下蒸發。藉由矽膠急驟層析(0-20% MeOH之DCM溶液)純化殘餘物，得到(1R,4aS,10aR)-6-(苯甲氧基)-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸2-(二甲基胺基)乙酯(0.323 g，0.741 mmol，產率54%)。UPLC/ELSD: RT = 3.13 min。MS (ES):對於C 28H 37NO 3， m/z(MH +) 436.14； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 7.51-7.30 (m, 5H); 6.99 (m, 1H); 6.91 (m, 1H); 6.76 (m,1H); 5.04 (s, 2H); 4.23 (m, 2H); 2.93-2.60 (m, 4H); 2.44-2.13 (m, 9H); 2.10-1.91 (m, 2H); 1.71-1.51 (m, 2H); 1.48-1.35 (m, 1H); 1.31 (s, 3H); 1.17-1.03 (m, 4H)。 步驟 3 ： (1R,4aS,10aR)-6- 羥基 -1,4a- 二甲基 -1,2,3,4,4a,9,10,10a- 八氫菲 -1- 甲酸 2-( 二甲基胺基 ) 乙酯
Figure 02_image1459
在N 2下向含有氫氧化鈀(0.07 g)之燒瓶中添加(1R,4aS,10aR)-6-(苯甲氧基)-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸2-(二甲基胺基)乙酯(0.31 g，0.71 mmol)於乙醇(4 mL)中之溶液。在室溫下在氫氣球下攪拌反應物度過週末。經由矽藻土塞過濾反應物，且在真空下蒸發濾液。 藉由矽膠急驟層析(0-20% MeOH之DCM溶液)純化殘餘物，得到(1R,4aS,10aR)-6-羥基-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氫菲-1-甲酸2-(二甲基胺基)乙酯(0.14 g，0.41 mmol，產率57%)。UPLC/ELSD: RT = 2.04 min。MS (ES):對於C 21H 31NO 3， m/z(MH +) 346.11； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 6.92 (m, 1H); 6.75 (m, 1H); 6.60 (m, 1H); 4.21 (m, 2H); 2.90-2.60 (m, 4H); 2.42-2.12 (m, 9H); 2.08-1.90 (m, 2H); 1.69-1.51 (m, 2H); 1.48-1.34 (m, 1H); 1.30 (s, 3H); 1.17-1.02 (m, 4H)。 T. 化合物 SA20 ： 3-( 吡啶 -4- 基 ) 丙酸 (3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13- 二甲基 -17-(( R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1 H- 環戊二烯並 [ a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1466
在乾燥氮氣下向3-(吡啶-4-基)丙酸(196 mg，1.27 mmol)及膽固醇(415 mg，1.06 mmol)於10 mL無水DCM中之攪拌溶液中添加EDC-HCl (320 mg，1.57 mmol)及DMAP (65 mg，0.53 mmol)，隨後添加DIEA (560 µL，3.2 mmol)，且在室溫下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS得知無起始材料剩餘，因此用飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋反應物，且用DCM萃取兩次。合倂有機層，乾燥(MgSO 4)，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(0-10% MeOH之DCM溶液)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之3-(吡啶-4-基)丙酸(3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13-二甲基-17-(( R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1 H-環戊二烯並[ a]菲-3-基酯(370 mg，0.71 mmol，67%)。UPLC/ELSD: RT = 3.09 min。MS (ES):對於C 35H 53NO 2， m/z(MH +) 520.59。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 8.52 (d , 2H, J= 6.1 Hz); 7.20 (d, 2H, J= 6.0 Hz); 5.37 (d, 1H, J= 4.5 Hz); 4.60 (m, 1H); 2.97 (t, 2H, J= 7.4 Hz); 2.64 (t, 2H, J= 7.4 Hz); 2.27 (d, 2H, J= 7.9 Hz); 2.08-1.91 (m, 2H); 1.90-1.74 (m, 3H); 1.64-1.22 (m, 11H); 1.21-1.05 (m, 7H); 1.04-0.95 (m, 6H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.5 Hz); 0.67 (s, 3H)。 U. 化合物 SA21 ： 3-(6- 胺基吡啶 -3- 基 ) 丙酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1468
在乾燥氮氣下向3-(6-胺基吡啶-3-基)丙酸(270 mg，1.54 mmol)及膽固醇(500 mg，1.28 mmol)於10 mL無水DCM中之攪拌溶液中添加EDC-HCl (390 mg，1.9 mmol)及DMAP (79 mg，0.64 mmol)，隨後添加DIEA (680 µL，3.8 mmol)，且在室溫下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS得知無起始材料剩餘，因此用飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋反應混合物，且用DCM萃取兩次。合併有機層，乾燥(MgSO 4)，過濾，且濃縮濾液，得到淺黃色固體。將其藉由矽膠層析(0-10% MeOH之DCM溶液)純化，得到呈白色固體狀之3-(6-胺基吡啶-3-基)丙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(281 mg，0.52 mmol，41%)。UPLC/ELSD: RT = 3.10 min。MS (ES):對於C 35H 54N 2O 2， m/z(MH +) 535.68。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 7.88 (d , 1H, J= 2.0 Hz); 7.36 (dd, 1H, J= 2.3 Hz, 8.5 Hz); 6.50 (d, 1H, J= 8.5 Hz); 5.36 (d, 1H, J= 4.4 Hz); 4.75-4.54 (m, 3H); 2.81 (t, 2H, J= 7.4 Hz); 2.54 (t, 2H, J= 7.6 Hz); 2.28 (d, 2H, J= 7.7 Hz); 2.08-1.91 (m, 3H); 1.90-1.74 (m, 3H); 1.65-1.23 (m, 10H); 1.22-0.94 (m, 13H); 1.04-0.95 (m, 6H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 0.9 Hz, 6.6 Hz); 0.67 (s, 3H)。 V. 化合物 SA22 ： (2- 胺基乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1470
在乾燥氮氣下，將乙二胺(4.6 mL，64.8 mmol)於20 mL無水DCM中之攪拌溶液冷卻至0℃，且經二十分鐘逐滴添加氯甲酸膽固醇酯(2.0 g，4.3 mmol)於20 mL無水DCM中之溶液。使所得混合物在攪拌下溫至室溫隔夜。用DCM稀釋反應混合物，用水洗滌三次，乾燥(MgSO 4)，過濾，且濃縮濾液，得到白色固體。將其溶解於熱乙醇中，且通過棉塞。用乙腈稀釋濾液直至物質開始沉澱。將混合物置於4℃下隔夜。經由過濾分離所得固體且用乙腈洗滌。濃縮濾液，用乙腈研製且過濾。用乙腈洗滌過濾之固體，風乾，隨後在真空下乾燥，得到呈白色固體狀之(2-胺基乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(1.56 g，3.3 mmol，76%)。UPLC/ELSD: RT = 2.70 min。MS (ES):對於C 30H 52N 2O 2， m/z(MH +) 473.55。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.36 (d, 1H, J= 4.6 Hz); 4.96 (m, 1H); 4.50 (m, 1H); 3.23 (q, 2H, J= 5.6 Hz, 11.6 Hz); 2.83 (t, 2H, J= 5.8 Hz); 2.42-2.19 (m, 2H); 2.06-1.75 (m, 5H); 1.65-1.05 (m, 19H); 1.04-0.94 (m, 6H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (d, 6H, J= 6.5 Hz); 0.67 (s, 3H)。 W. 化合物 SA23 ： (2- 胍基乙基 ) 胺基甲酸 (3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [ a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1472
步驟 1 ：
Figure 02_image1474
向(2-胺基乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯SA22 (300 mg，0.63 mmol)及N 1, N 2-雙-Boc-胍-N 3-三氟甲磺酸酯(250 mg，0.63 mmol)於5 mL無水DCM中之攪拌溶液中添加三乙基胺(92 µL，0.66 mmol)，且在室溫下攪拌混合物隔夜，之後藉由LCMS得知無起始材料剩餘。用DCM稀釋混合物，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次，乾燥(MgSO 4)且過濾。濃縮濾液，得到淺黃色糖漿。將其藉由矽膠層析(0-30% EtOAc之己烷溶液)純化，得到呈白色固體狀之產物(384 mg，0.53 mmol，85%)。UPLC/ELSD: RT = 3.35 min。MS (ES):對於C 41H 70N 4O 6， m/z(MH +) 715.66。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 11.45 (s, 1H); 8.59 (br. s, 1H); 5.56 (s, 1H); 5.36 (d, 1H, J= 4.9 Hz); 4.49 (m, 1H); 3.60 (s, 2H); 3.37 (d, 2H, J= 8.8 Hz); 2.42-2.19 (m, 2H); 2.06-1.75 (m, 5H); 1.67-1.44 (m, 23H); 1.43-1.22 (m, 4H); 1.21-0.94 (m, 11H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.68 (s, 3H)。 步驟 2 ： (2- 胍基乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1472
向步驟1之產物(384 mg，0.53 mmol)於5 mL無水DCM中之攪拌溶液中添加2 M HCl之乙醚溶液(1.33 mL，2.66 mmol)。將反應容器緊密密封。將反應混合物加熱至40℃，且攪拌隔夜。再添加2 M HCl之乙醚溶液(5 mL，10 mmol)。將小瓶密封，且將反應物加熱至40℃隔夜。藉由LCMS得知無起始材料剩餘，因此將混合物在氮氣流中濃縮。將白色殘餘物用乙醚研製且過濾。用乙醚洗滌過濾固體且風乾，隨後在真空下乾燥，得到呈白色固體狀之 N-(2-{[( Z)-[( 第三丁氧基羰基)胺基][( 第三丁氧基羰基)亞胺基]甲基]胺基}乙基)胺基甲酸(1 R,3aS,3b S,7 S,9a R,9b S,11a R)-9a,11a-二甲基-1-[(2 R)-6-甲基庚烷-2-基]-1H,2H,3H,3aH,3bH,4H,6H,7H,8H,9H,9bH,10H,11H-環戊二烯並[ a]菲-7-基酯鹽酸鹽(235 mg，0.42 mmol，79%)。UPLC/ELSD: RT = 2.71 min。MS (ES):對於C 31H 54N 4O 2， m/z(MH +) 515.73。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 7.88 (br. s, 1H); 7.16 (br. s, 4H); 5.96 (br. s, 1H); 5.36 (s, 1H); 4.42 (m, 1H); 3.55-3.18 (m, 4H); 2.31 (s, 2H); 2.08-1.65 (m, 7H); 1.64-1.22 (m, 11H); 1.23-0.94 (m, 14H); 0.92 (d, 3H, J= 5.9 Hz); 0.86 (d, 6H, J= 6.6 Hz); 0.68 (s, 3H)。 X. 化合物 SA24 ： 4-( 雙 (3-( 二甲基胺基 ) 丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯二鹽酸鹽
Figure 02_image1476
步驟 1 ： 4-( 雙 (3-( 二甲基胺基 ) 丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1478
將(-)-膽固醇NHS丁二酸酯(517 mg，0.886 mmol)與3,3'-亞胺基雙( N, N-二甲基丙基胺) (0.40 mL，1.8 mmol)在THF (6.0 mL)中組合。在室溫下攪拌反應混合物，且藉由TLC監測。在20 h時，用DCM稀釋反應混合物，隨後用水洗滌。用DCM (2x)萃取水層。使經合併有機相通過疏水玻璃料，經Na 2SO 4乾燥且濃縮。經由矽膠層析(含0-20% (10%濃氨水之MeOH溶液)之DCM溶液)純化粗物質，得到呈透明黏稠油狀之4-(雙(3-(二甲基胺基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(425 mg，0.607 mmol，68.5%)。UPLC/ELSD: RT = 2.11 min。 MS (ES):對於C 41H 73N 3O 3， m/z= 656.6 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.32-5.39 (m, 1H), 4.54-4.68 (m, 1H), 3.29-3.40 (m, 4H), 2.64 (s, 4H), 2.18-2.35 (m, 5H), 2.21 (s, 12H), 0.82-2.05 (br. m, 31H), 1.01 (s, 3H), 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz), 0.86 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.86 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.67 (s, 3H)。 步驟 2 ： 4-( 雙 (3-( 二甲基胺基 ) 丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯二鹽酸鹽
Figure 02_image1476
向4-(雙(3-(二甲基胺基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(0.135 g，0.206 mmol)於DCM (6.8 mL)及iPrOH (2.7 mL)之混合物中之攪拌溶液中逐滴添加5-6 N HCl之iPrOH溶液(0.10 mL)。將反應混合物在室溫下攪拌15 min，隨後濃縮。添加ACN (5 mL)，且在0℃下在冰浴中攪拌混合物。添加ACN (5 mL)。濃縮混合物。添加ACN (3 mL)，且將混合物進行音波處理。藉由真空過濾收集固體，且用冷ACN沖洗。將固體懸浮於1:1 ACN/iPrOH中且濃縮，得到呈灰白色固體狀之4-(雙(3-(二甲基胺基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯二鹽酸鹽(0.079 g，0.10 mmol，49.1%)。 UPLC/ELSD: RT = 1.94 min。 MS (ES):對於C 41H 73N 3O 3， m/z= 656.3 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 12.33 (br. s, 1H), 12.14 (br. s, 1H), 5.28-5.38 (m, 1H), 4.45-4.61 (m, 1H), 3.51-3.72 (m, 4H), 3.13-3.26 (m, 2H), 2.97-3.09 (m, 2H), 2.90 (d, 6H, J= 4.8 Hz), 2.81 (d, 6H, J= 4.7 Hz), 2.55-2.72 (m, 4H), 2.25-2.43 (m, 4H), 2.10-2.24 (m, 2H), 1.75-2.06 (br. m, 5H), 0.92-1.71 (br. m, 21H), 1.01 (s, 3H), 0.91 (d, 3H, 6.4 Hz), 0.86 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.86 (d, 3H, J= 6.5 Hz), 0.67 (s, 3H)。 Y. 化合物 SA25 ： (2-((2-((2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ) 胺基 )-3,4- 二側氧基環丁 -1- 烯 -1- 基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1481
步驟 1 ： (2-((2- 甲氧基 -3,4- 二側氧基環丁 -1- 烯 -1- 基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1483
將(2-胺基乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(SA22，1 g，2.1 mmol)及3,4-二甲氧基-3-環丁烯-1,2-二酮(600 mg，4.2 mmol)於20 mL 1:1 DCM/MeOH混合物中之攪拌混合物溫至35℃。使混合物澄清，且在室溫下攪拌所得無色溶液隔夜，之後藉由LCMS得知無起始材料剩餘。用DCM稀釋混合物，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次，乾燥(MgSO 4)且過濾。濃縮濾液，得到呈白色固體狀之(2-((2-甲氧基-3,4-二側氧基環丁-1-烯-1-基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(1.06 g，1.8 mmol，86%)。UPLC/ELSD: RT = 3.27 min。MS (ES):對於C 35H 54N 2O 5， m/z(MH +) 583.68。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 6.30 (br. s, 0.5H); 5.99 (br. s, 0.5H); 5.37 (d, 1H, J= 5.5 Hz); 4.95 (m, 1H); 4.48 (m, 1H); 4.38 (d, 3H, J= 3.5 Hz); 3.79 (m, 1H); 3.56 (m, 1H); 3.40 (q, 2H, J= 5.6 Hz, 10.6 Hz); 2.40-2.19 (m, 2H); 2.07-1.75 (m, 5H); 1.68-1.23 (m, 11H); 1.22-0.94 (m, 12H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.68 (s, 3H)。 步驟 2 ： (2-((2-((2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ) 胺基 )-3,4- 二側氧基環丁 -1- 烯 -1- 基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1481
向(2-((2-甲氧基-3,4-二側氧基環丁-1-烯-1-基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(200 mg，0.34 mmol)於5 mL甲醇中之攪拌懸浮液中添加 N,N-二甲基乙二胺(60 µL，0.51 mmol)。將混合物加熱至45℃，且攪拌隔夜，之後藉由LCMS得知無起始材料剩餘。使不透明白色混合物冷卻至室溫，且過濾。用甲醇洗滌過濾固體，隨後用乙腈洗滌。將固體風乾，得到脆性黃色固體。將其粉碎，在真空下乾燥，且懸浮於10 mL 1:1 DCM/甲醇混合物中。加熱混合物以幾乎完全溶解，且過濾。在攪拌下向濾液中添加2 M HCl之乙醚溶液(1.0 mL，2 mmol)。將所得溶液在氮氣流中濃縮，且在真空下乾燥所得固體，得到呈白色固體狀之(2-((2-((2-(二甲基胺基)乙基)胺基)-3,4-二側氧基環丁-1-烯-1-基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯鹽酸鹽(150 mg，0.22 mmol，65%)。UPLC/ELSD: RT = 2.57 min。MS (ES):對於C 38H 62N 4O 4， m/z(MH +) 639.56。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ: ppm 10.00 (br. s, 1H); 7.94 (m, 2H); 7.16 (t, 1H, J= 5.5 Hz); 5.32 (d, 1H, J= 3.6 Hz); 4.29 (m, 1H); 3.83 (d, 2H, J= 5.7 Hz); 3.50 (br. s, 2H); 3.37 (br. s, 2H); 3.26 (br. s, 2H); 3.13 (q, 2H, J = 5.2 Hz, 11.1 Hz); 2.80 (s, 6H); 2.33-2.10 (m, 2H); 2.04-1.68 (m, 5H); 1.63-1.23 (m, 10H); 1.22-0.97 (m, 11H); 0.89 (d, 3H, J= 6.4 Hz); 0.83 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.5 Hz); 0.64 (s, 3H)。 Z. 化合物 SA26 ： (2-((2-((3-( 二甲基胺基 ) 丙基 ) 胺基 )-3,4- 二側氧基環丁 -1- 烯 -1- 基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1486
以與SA25相同之方式製備SA26，但在步驟2中使用 N,N-二甲基丙二胺替代 N,N-二甲基乙二胺。進行向HCl鹽之類似轉化，得到呈白色固體狀之(2-((2-((3-(二甲基胺基)丙基)胺基)-3,4-二側氧基環丁-1-烯-1-基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯鹽酸鹽(168 mg，0.24 mmol，71%)。UPLC/ELSD: RT = 2.60 min。MS (ES):對於C 39H 64N 4O 4， m/z(MH +) 653.74。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ: ppm 10.00 (br. s, 1H); 7.95 (m, 2H); 7.15 (m, 1H); 5.32 (d, 1H, J= 2.7 Hz); 4.29 (m, 1H); 3.60-3.43 (m, 4H); 3.19-3.00 (m, 4H); 2.80 (s, 6H); 2.35-2.10 (m, 2H); 2.04-1.68 (m, 5H); 1.56-1.23 (m, 10H); 1.22-0.97 (m, 11H); 0.88 (d, 3H, J= 6.4 Hz); 0.83 (dd, 6H, J= 0.9 Hz, 6.6 Hz); 0.64 (s, 3H)。 AA. 化合物 SA27 ： (2-((2-((4-( 二甲基胺基 ) 丁基 ) 胺基 )-3,4- 二側氧基環丁 -1- 烯 -1- 基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1488
以與SA25相同之方式製備SA27，但在步驟2中使用 N,N-二甲基丁二胺替代 N,N-二甲基乙二胺。進行向HCl鹽之類似轉化，得到呈白色固體狀之(2-((2-((4-(二甲基胺基)丁基)胺基)-3,4-二側氧基環丁-1-烯-1-基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯鹽酸鹽(145 mg，0.34 mmol，60%)。UPLC/ELSD: RT = 2.62 min。MS (ES):對於C 39H 64N 4O 4， m/z(MH +) 667.69。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ: ppm 10.01 (br. s, 1H); 8.04 (m, 2H); 7.14 (t, 1H, J= 5.4 Hz); 5.32 (d, 1H, J= 2.9 Hz); 4.29 (m, 1H); 3.95 (m, 2H); 3.49 (br. d, 4H, J= 4.8 Hz); 3.19-2.96 (m, 4H); 2.72 (d, 6H, J= 4.9 Hz); 2.34-2.08 (m, 2H); 2.04-1.60 (m, 5H); 1.59-1.23 (m, 10H); 1.22-0.97 (m, 11H); 0.88 (d, 3H, J= 6.4 Hz); 0.83 (dd, 6H, J= 1.0 Hz, 6.6 Hz); 0.64 (s, 3H)。 AB. 化合物 SA28 ： 4-( 雙 (3- 胺基丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯二鹽酸鹽
Figure 02_image1490
步驟 1 ： 4-( 雙 (3-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1492
向(-)-膽固醇NHS丁二酸酯(0.100 g，0.172 mmol)於THF (0.86 mL)中之溶液中添加 N-[3-({3-[( 第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)丙基]胺基甲酸 第三丁酯(0.074 g，0.22 mmol)於THF (0.40 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在5 h時，添加N-[3-({3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)丙基]胺基甲酸第三丁酯(40 mg)。在21 h時，用DCM稀釋反應混合物，且用水洗滌。用DCM (2×10 mL)萃取水層。使經合併有機相通過疏水玻璃料，經Na 2SO 4乾燥且濃縮。經由矽膠層析(30-75% EtOAc之己烷溶液)純化粗物質，得到呈透明油狀之4-(雙(3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(定量)。UPLC/ELSD: RT = 3.98 min。 MS (ES):對於C 47H 81N 3O 7， m/z= 700.7 [(M + H) - (CH 3) 2C=CH 2- CO 2] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.32-5.40 (m, 1H), 5.29 (br. s, 1H), 4.50-4.73 (m, 2H), 3.40 (t, 2H, J= 6.2 Hz), 3.32 (t, 2H, J= 6.8 Hz), 3.15 (dt, 2H, J= 6.0, 6.4 Hz), 3.04 (dt, 2H, J= 5.6, 5.7 Hz), 2.54-2.70 (m, 4H), 2.28-2.37 (m, 2H), 1.75-2.07 (br. m, 5H), 0.94-1.71 (br. m, 25H), 1.44 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.01 (s, 3H), 0.91 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.86 (d, 6H, J= 6.5 Hz), 0.67 (s, 3H)。 步驟 2 ： 4-( 雙 (3- 胺基丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯二鹽酸鹽
Figure 02_image1490
向在冰浴中冷卻至0℃之4-(雙(3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(110 mg，0.137 mmol)於DCM (2.0 mL)中之攪拌溶液中逐滴添加4 N HCl之二噁烷溶液(0.17 mL)。在攪拌下使反應混合物緩慢溫至室溫，且藉由LCMS監測。在3 h時，用Et 2O稀釋懸浮液。藉由真空過濾用Et 2O沖洗來收集固體，得到呈白色固體狀之4-(雙(3-胺基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯二鹽酸鹽(55 mg，0.081 mmol，58.7%)。UPLC/ELSD: RT = 2.13 min。 MS (ES):對於C 37H 65N 3O 3， m/z= 600.5 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 8.07 (br. s, 3H), 7.90 (br. s, 3H), 5.30-5.37 (m, 1H), 4.36-4.51 (m, 1H), 3.34-3.46 (m, 4H), 2.64-2.91 (m, 4H), 2.47-2.63 (m, 2H), 2.19-2.32 (m, 2H), 1.69-2.05 (br. m, 7H), 0.91-1.64 (br. m, 25 H), 0.98, (s, 3H), 0.90 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.65 (s, 3H)。 AC. 化合物 SA29 ： (4- 胺基丁基 )(3- 胺基丙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯二鹽酸鹽
Figure 02_image1494
將(4-(( 第三丁氧基羰基)胺基)丁基)(3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(如 Hum. Gene Ther., 7(14), 1701-1717 ( 1996)中所述製備) (190 mg，0.251 mmol)於DCM (3.4 mL)中之攪拌溶液在冰浴中冷卻至0℃。逐滴添加4 N HCl之二噁烷溶液(0.31 mL)，且在攪拌下使反應混合物緩慢溫至室溫。藉由LCMS監測反應。在4 h時，添加4 N HCl之二噁烷溶液(0.10 mL)。在9 h時，用Et 2O將反應混合物稀釋至約20 mL。將懸浮液過濾，用Et 2O沖洗。將固體懸浮於庚烷中，且濃縮懸浮液，得到呈白色固體狀之(4-胺基丁基)(3-胺基丙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯二鹽酸鹽(147 mg，0.228 mmol，91.0%)。UPLC/ELSD: RT = 2.05 min。 MS (ES):對於C 35H 63N 3O 2， m/z= 558.5 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 7.93 (br. s, 6H), 5.29-5.38 (m, 1H), 4.26-4.40 (m, 1H), 3.10-3.30 (m, 4H), 2.68-2.86 (m, 4H), 2.20-2.35 (m, 2H), 1.70-2.03 (br. m, 7H), 0.91-1.64 (br. m, 25H), 0.99 (s, 3H), 0.89 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.85 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.65 (s, 3H)。 AD. 化合物 SA30 ： (3-((4- 胺基丁基 ) 胺基 ) 丙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯二鹽酸鹽
Figure 02_image1496
將(4-((第三丁氧基羰基)胺基)丁基)(3-(((((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)氧基)羰基)胺基)丙基)胺基甲酸第三丁酯(如 Hum. Gene Ther., 7(14), 1701-1717 ( 1996)中所述製備)(215 mg，0.284 mmol)於DCM (3.9 mL)中之攪拌溶液在冰浴中冷卻至0℃。逐滴添加4 N HCl之二噁烷溶液(0.35 mL)，且在攪拌下使反應混合物緩慢溫至室溫。藉由LCMS監測反應。在4 h時，再添加4 N HCl之二噁烷溶液(0.10 mL)。在9 h時，用Et 2O將反應混合物稀釋至約20 mL。藉由真空過濾，用Et 2O沖洗收集固體。將固體懸浮於庚烷中，隨後濃縮，得到呈半透明固體狀之(3-((4-胺基丁基)胺基)丙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯二鹽酸鹽(142 mg，0.216 mmol，76.1%)。UPLC/ELSD: RT = 2.16 min。MS (ES):對於C 35H 63N 3O 2， m/z= 558.5 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 8.97 (br. s, 2H), 8.03 (br. s, 3H), 7.20 (t, 1H, J= 5.7 Hz), 5.26-5.43 (m, 1H), 4.23-4.39 (m, 1H), 2.97-3.12 (dt, 2H, J= 6.1, 6.3 Hz), 2.70-2.95 (m, 6H), 2.13-2.36 (m, 2H), 0.91-2.05 (br. m, 32H), 0.97 (s, 3H), 0.89 (d, 3H, J= 6.1 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.65 (s, 3H)。 AE. 化合物 SA31 ： 4-((4- 胺基丁基 )(3- 胺基丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯二鹽酸鹽
Figure 02_image1498
步驟 1 ： 4-((4-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丁基 )(3-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1500
向(-)-膽固醇NHS丁二酸酯(201 mg，0.344 mmol)於THF (1.7 mL)中之溶液中添加N-[3-({4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁基}胺基)丙基]胺基甲酸第三丁酯(0.178 g，0.516 mmol)於THF (1.0 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在19 h時，用DCM (30 mL)稀釋反應混合物，隨後用水洗滌。用DCM (10 mL)萃取水層。使經合併有機相通過疏水玻璃料，經Na 2SO 4乾燥且濃縮。藉由矽膠層析(20-65% EtOAc之己烷溶液)純化粗物質，得到呈白色泡沫狀之4-((4-((第三丁氧基羰基)胺基)丁基)(3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(241 mg，0.296 mmol，86.1%)。UPLC/ELSD: RT = 3.98 min。MS (ES):對於C 48H 83N 3O 7， m/z= 814.7 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.21-5.43 (m, 2H), 4.49-4.82 (m, 2H), 3.33 (t, 2H, J= 6.4 Hz), 3.22-3.38 (m, 2H), 2.97-3.21 (m, 4H), 2.52-2.72 (m, 4H), 2.24-2.38 (m, 2H), 1.73-2.07 (br. m, 5H), 0.75-1.64 (br. m, 27H), 1.44 (s, 9H), 1.42 (s, 9H), 1.01 (s, 3H), 0.91 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.86 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.86 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.67 (s, 3H)。 步驟 2 ： 4-((4- 胺基丁基 )(3- 胺基丙基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯二鹽酸鹽
Figure 02_image1498
將4-((4-((第三丁氧基羰基)胺基)丁基)(3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(0.230 g，0.282 mmol)於DCM (4.1mL)中之溶液在冰浴中冷卻至0℃。逐滴添加4 N HCl之二噁烷溶液(0.35 mL)，且在攪拌下使反應混合物緩慢溫至室溫。藉由LCMS監測反應。在4 h時，再添加4 N HCl之二噁烷溶液(0.10 mL)。在9 h時，用Et 2O將反應混合物稀釋至約20 mL。藉由真空過濾收集固體，且用Et 2O沖洗。將固體懸浮於庚烷中，濃縮且在高真空下進一步乾燥，得到呈白色固體狀之4-((4-胺基丁基)(3-胺基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯二鹽酸鹽(171 mg，0.247 mmol，87.4%)。UPLC/ELSD: RT = 2.22 min。 MS (ES):對於C 38H 67N 3O 3， m/z= 614.3 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 7.73-8.14 (m, 6H), 5.29-5.37 (m, 1H), 4.36-4.51 (m, 1H), 3.15-3.43 (m, 4H), 2.64-2.88 (m, 4H), 2.47-2.63 (m, 2H), 2.21-2.29 (m, 2H), 1.69-2.03 (br. m, 7H), 0.80-1.64 (br. m, 27 H), 0.98, (s, 3H), 0.90 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.5 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.65 (s, 3H)。 AF. 化合物 SA32 ： 2-( 口昆啶 -3- 基 ) 乙酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1503
向氯化3-(羧甲基)-1-氮雜雙環[2.2.2]辛烷-1-鎓(AstaTech公司, Bristol, PA) (0.100 g，0.486 mmol)於DCM (3.2 mL)中之溶液添加膽固醇(470 mg，1.22 mmol)、4-(二甲基胺基)吡啶(30 mg，0.24 mmol)及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(0.103 g，0.535 mmol)。添加THF (3.5 mL)。在室溫下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在16.5 h時，在50℃下加熱反應混合物。在21 h時，將反應混合物冷卻至室溫。將粗物質用3:1 CHCl 3/iPrOH (約40 mL)稀釋且用水洗滌。使有機相通過疏水玻璃料，經Na 2SO 4乾燥且濃縮。經由矽膠層析(含5-20% (10%濃氨水之MeOH溶液)之DCM溶液)純化粗物質，得到呈透明油狀之2-(口昆啶-3-基)乙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(0.193 g，0.357 mmol，73.5%)。UPLC/ELSD: RT = 3.02 min。 MS (ES):對於C 36H 59NO 2， m/z= 538.5 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CD 3OD): δ 5.32-5.43 (m, 1H), 4.47-4.61 (m, 1H), 3.06-3.18 (m, 1H), 2.73-2.92 (m, 4H), 2.25-2.50 (br. m, 5H), 0.91-2.23 (br. m, 32H), 1.05 (s, 3H), 0.95 (d, 3H, J= 6.5 Hz), 0.88 (d, 3H, J= 6.5 Hz), 0.88 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.73 (s, 3H)。 AG. 化合物 SA33 ：口昆啶 -3- 甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1505
向膽固醇(504 mg，1.30 mmol)、1-氮雜雙環[2.2.2]辛烷-3-甲酸鹽酸鹽(烯胺，Monmouth Junction, NJ) (100 mg，0.522 mmol)及4-(二甲基胺基)吡啶(0.032 g，0.261 mmol)於THF (3.5 mL)中之懸浮液中添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(0.110 g，0.574 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在16 h時，在50℃下攪拌反應混合物。在40 h時，將反應混合物冷卻至室溫，且用3:1 CHCl 3:iPrOH (約40 mL)稀釋。用水洗滌有機相，使其通過疏水玻璃料，經Na 2SO 4乾燥且濃縮。經由矽膠層析(含0-10% (10%濃氨水之MeOH溶液)之DCM溶液)純化粗物質，得到呈白色固體狀之口昆啶-3-甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(0.121 g，0.226 mmol，43.4%)。UPLC/ELSD: RT = 3.06 min。 MS (ES):對於C 35H 57NO 2， m/z= 524.5 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.34-5.43 (m, 1H), 4.58-4.72 (m, 1H), 3.29 (ddd, 1H, J= 13.9, 6.0, 1.7 Hz), 2.72-3.05 (br. m, 5H), 2.46-2.56 (m, 1H), 2.22-2.40 (m, 2H), 2.12-2.19 (m, 1H), 1.75-2.09 (br. m, 5H), 0.92-1.70 (br. m, 25H), 1.02 (s, 3H), 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz), 0.86 (d, 3H, J= 6.5 Hz), 0.86 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.68 (s, 3H)。 AH. 化合物 SA34 ： (2-((4,5- 二氫 -1H- 咪唑 -2- 基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯碘化氫鹽
Figure 02_image1507
將(2-胺基乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(SA22，200 mg，0.42 mmol)及2-(甲基硫基)-4,5-二氫-1 H-咪唑碘化氫鹽(94 mg，0.38 mmol)於5 mL無水THF中之溶液加熱至40℃，且攪拌隔夜，之後其變成白色懸浮液。藉由LCMS得知無起始材料剩餘，因此使溶液冷卻至室溫且濃縮(惡臭！)。將所得固體用乙醚研製。過濾混合物，且用乙醚洗滌過濾固體，風乾，隨後在真空下乾燥，得到呈吸濕性白色固體狀之(2-((4,5-二氫-1H-咪唑-2-基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯碘化氫鹽(77 mg，0.11 mmol，30%)。UPLC/ELSD: RT = 2.76 min。MS (ES):對於C 33H 56N 4O 2， m/z(MH +) 541.63。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 7.97 (br. s, 2H); 7.29 (br. s, 1H); 5.61 (br. s, 1H); 5.36 (d, 1H, J= 3.2 Hz); 4.43 (br. d, 1H, J= 8.7 Hz); 3.78 (s, 4H); 3.61-3.21 (m, 4H); 2.31 (s, 2H); 2.30 (d, 2H, J= 6.7 Hz); 2.14-1.70 (m, 5H); 1.69-1.22 (m, 11H); 1.21-0.94 (m, 13H); 0.90 (d, 3H, J= 6.2 Hz); 0.85 (d, 6H, J= 6.4 Hz); 0.66 (s, 3H)。 AI. 化合物 SA35 ： (2-((2-( 雙 (3-( 二甲基胺基 ) 丙基 ) 胺基 )-3,4- 二側氧基環丁 -1- 烯 -1- 基 ) 胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1509
以與SA25相同之方式製備SA35，但在步驟2中使用3,3'-亞胺基雙( N,N-二甲基丙基胺)替代 N,N-二甲基乙二胺。完成反應後，使不透明白色混合物冷卻至室溫，且過濾。用甲醇洗滌過濾固體且濃縮濾液，得到淺黃色膜。將其藉由矽膠層析(0-25% MeOH之DCM溶液)純化，得到呈白色固體狀之(2-((2-(雙(3-(二甲基胺基)丙基)胺基)-3,4-二側氧基環丁-1-烯-1-基)胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(45 mg，0.06 mmol，14%)。UPLC/ELSD: RT = 2.12 min。MS (ES):對於C 44H 75N 5O 4， m/z(MH +) 738.60。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 8.85 (br. s, 1H); 5.34 (d, 1H, J= 4.7 Hz); 5.19 (t, 1H, J= 6.2 Hz); 4.44 (m, 1H); 3.76 (q, 2H, J= 5.8 Hz, 11.8 Hz); 3.70-3.47 (m, 3H); 3.39 (q, 2H, J= 5.8 Hz, 11.4 Hz); 2.85-2.33 (m, 15H); 2.27 (d, 2H, J= 7.1 Hz); 2.10-1.70 (m, 9H); 1.66-1.22 (m, 11H); 1.21-0.95 (m, 12H); 0.91 (d, 3H, J= 6.4 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.67 (s, 3H)。 AJ. 化合物 SA36 ： (3- 胺基丙基 )(4-((3- 胺基丙基 ) 胺基 ) 丁基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5- 乙基 -6- 甲基庚 -3- 烯 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯三鹽酸鹽
Figure 02_image1511
步驟 1 ：碳酸豆固醇酯 4- 硝基苯酯
Figure 02_image1513
將豆固醇(0.600 g，1.45 mmol)、三乙基胺(0.41 mL，2.9 mmol)及4-二甲基胺基吡啶(0.036 g，0.29 mmol)於DCM (6.0 mL)中之攪拌懸浮液在冰浴中冷卻至0℃。隨後，添加氯甲酸4-硝基苯酯(0.322 g，1.60 mmol)。使反應混合物緩慢達至室溫隔夜，且藉由LCMS監測。在21 h時，過濾反應混合物。將濾液逐滴添加至經攪拌ACN (30 mL)之燒瓶中。使固體沉澱，得到黃色懸浮液。藉由真空過濾用CAN沖洗收集固體，得到碳酸豆固醇酯4-硝基苯酯(0.526 g，0.910 mmol，62.6%)。使其他固體自母液沉澱。將母液部分濃縮以移除大部分DCM。冷卻至室溫後，藉由真空過濾用ACN沖洗收集固體，得到碳酸豆固醇酯4-硝基苯酯(0.162 g，0.280 mmol，19.3%)。組合產率= 81.9%。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 8.28 (m, 2H), 7.39 (m, 2H), 5.40-5.47 (m, 1H), 5.15 (dd, 1H, J= 15.1, 8.4 Hz), 5.02 (dd, 1H, J= 15.1, 8.4 Hz), 4.55-4.68 (m, 1H), 2.41-2.55 (m, 2H), 1.89-2.13 (br. m, 5H), 0.88-1.84 (br. m, 18H), 1.05 (s, 3H), 1.03 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.76-0.87 (m, 9H), 0.71 (s, 3H)。 步驟 2 ： ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5- 乙基 -6- 甲基庚 -3- 烯 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基 ) 丁烷 -1,4- 二基雙 ((3-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙基 ) 胺基甲酸 ) 第三丁酯
Figure 02_image1515
將N-{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}-N-[4-({3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)丁基]胺基甲酸 第三丁酯(0.566 g，1.12 mmol)、碳酸豆固醇酯4-硝基苯酯(0.500 g，0.865 mmol)及三乙基胺(0.36 mL，2.6 mmol)在甲苯(5.0 mL)中組合。在90℃下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在24 h時，將反應混合物冷卻至室溫。用水(3×5 mL)洗滌反應混合物，隨後濃縮。經由矽膠層析(20-60% EtOAc之己烷溶液)純化粗物質，得到呈白色泡沫狀之((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基雙((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基甲酸) 第三丁酯(0.703 g，0.747 mmol，86.3%)。UPLC/ELSD: RT = 3.45 min。 MS (ES):對於C 55H 96N 4O 8， m/z= 841.8 [(M + H) - (CH 3) 2C=CH 2- CO 2] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.33-5.41 (m, 1H), 5.28 (br. s, 1H), 5.16 (dd, 1H, J= 15.1, 8.4 Hz), 5.01 (dd, 1H, J= 15.1, 8.4 Hz), 4.79 (br. s, 1H), 4.42-4.59 (m, 1H), 2.97-3.48 (br. m, 12H), 2.20-2.43 (m, 2H), 1.79-2.12 (br. m, 5H), 0.88-1.77 (br. m, 26H), 1.45 (s, 9H), 1.43 (s, 18H), 1.02 (s, 3H), 1.02 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.75-0.88 (m, 9H), 0.69 (s, 3H)。 步驟 3 ： (3- 胺基丙基 )(4-((3- 胺基丙基 ) 胺基 ) 丁基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5- 乙基 -6- 甲基庚 -3- 烯 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯三鹽酸鹽
Figure 02_image1511
在30℃下攪拌((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基雙((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基甲酸)第三丁酯(0.700 g，0.744 mmol)於iPrOH (3.2 mL)中之溶液。逐滴添加5至6 N HCl之iPrOH溶液(1.5 mL)。在40 °C下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在18.5 h時，添加ACN (3.2 mL)，將漿液音波處理，隨後在室溫下攪拌1 h。此後，藉由真空過濾，用3:1 ACN:iPrOH，隨後用ACN沖洗收集固體，得到呈白色固體狀之(3-胺基丙基)(4-((3-胺基丙基)胺基)丁基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯三鹽酸鹽(0.509 g，0.636 mmol，85.5%)。UPLC/ELSD: RT = 1.56 min。 MS (ES):對於C 40H 72N 4O 2， m/z= 641.4 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.38-5.45 (m, 1H), 5.20 (dd, 1H, J= 15.1, 8.4 Hz), 5.07 (dd, 1H, J= 15.1, 8.4 Hz), 4.40-4.54 (m, 1H), 3.29-3.46 (m, 4H), 3.05-3.20 (m, 6H), 2.92-3.02 (m, 2H), 2.34-2.43 (m, 2H), 1.87-2.20 (m, 9H), 0.92-1.83 (br. m, 22H), 1.09 (s, 3H), 1.07 (d, 3H, 6.6 Hz), 0.80-0.92 (m, 9H), 0.77 (s, 3H)。 AK. 化合物 SA37 ： (3- 胺基丙基 )(4-((3- 胺基丙基 ) 胺基 ) 丁基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5- 乙基 -6- 甲基庚烷 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯三鹽酸鹽
Figure 02_image1518
步驟 1 ：碳酸 β- 麥固醇酯 4- 硝基苯酯
Figure 02_image1520
將β-麥固醇(8.00 g，19.3 mmol)、三乙基胺(5.4 mL，39 mmol)及4-二甲基胺基吡啶(0.471 g，3.86 mmol)於DCM (80 mL)中之攪拌溶液在冰浴中冷卻至0℃。經2 min向溶液中分批添加氯甲酸4-硝基苯酯(4.277 g，21.22 mmol)。使反應混合物緩慢達至室溫隔夜，且藉由LCMS監測。在21 h時，將反應混合物在冰浴中冷卻至0℃，隨後添加三乙基胺(2.7 mL)及氯甲酸4-硝基苯酯(3.00 g)。使反應混合物達至室溫。在40 h時，過濾反應混合物，且將濾液經1 h逐滴添加至於冰浴中冷卻至0℃之經攪拌ACN (250 mL)之燒瓶中。藉由真空過濾用CAN沖洗收集固體，得到呈灰白色固體狀之碳酸β-麥固醇酯4-硝基苯酯(9.15 g，15.8 mmol，81.8%)。UPLC/ELSD: RT = 3.38 min。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 8.28 (m, 2H), 7.39 (m, 2H), 5.37-5.49 (m, 1H), 4.54-4.69 (m, 1H), 2.36-2.57 (m, 2H), 0.86-2.10 (br. m, 27H), 1.05 (s, 3H), 0.93 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.78-0.88 (m, 9H), 0.69 (s, 3H)。 步驟 2 ： ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5- 乙基 -6- 甲基庚烷 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基 ) 丁烷 -1,4- 二基雙 ((3-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙基 ) 胺基甲酸 ) 第三丁酯
Figure 02_image1522
將N-{3-[ ( 第三丁氧基羰基)胺基]丙基}-N-[4-({3-[( 第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)丁基]胺基甲酸第三丁酯(0.564 g，1.12 mmol)、碳酸β-麥固醇酯4-硝基苯酯(0.500 g，0.862 mmol)及三乙基胺(0.36 mL，2.6 mmol)在PhMe (5.0 mL)中組合。在90℃下攪拌反應混合物，且藉由TLC監測。在44 h時，將反應混合物冷卻至室溫。用水(3×5 mL)洗滌反應混合物，隨後濃縮。經由矽膠層析(20-60% EtOAc之己烷溶液)純化粗物質，得到呈白色泡沫狀之((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚烷-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基雙((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基甲酸)第三丁酯(0.704 g，0.746 mmol，86.5%)。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.32-5.44 (m, 1H), 5.28 (br. s, 1H), 4.78 (br. s, 1H), 4.43-4.58 (m, 1H), 2.97-3.45 (br. m, 12H), 2.20-2.43 (m, 2H), 1.76-2.06 (br. m, 5H), 0.87-1.73 (br. m, 30H), 1.45 (s, 9H), 1.43 (s, 18H),1.02 (s, 3H), 0.92 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.77-0.87 (m, 9H), 0.68 (s, 3H)。 UPLC/ELSD: RT = 3.51 min。 MS (ES):對於C 55H 98N 4O 8， m/z= 843.9 [(M + H) - (CH 3) 2C=CH 2- CO 2] +。 步驟 3 ： (3- 胺基丙基 )(4-((3- 胺基丙基 ) 胺基 ) 丁基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5- 乙基 -6- 甲基庚烷 -2- 基 )-10,13- 二甲基 -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯三鹽酸鹽
Figure 02_image1518
在30℃下加熱((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚烷-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基雙((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基甲酸)第三丁酯(0.700 g，0.742 mmol)於iPrOH (3.2 mL)中之攪拌溶液。向溶液中添加5-6 N HCl之iPrOH溶液(1.5 mL)。在40 °C下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在18.5 h時，添加ACN (3.2 mL)。將混合物音波處理，隨後在室溫下攪拌1 h。此後，藉由真空過濾，用3:1 ACN:iPrOH，隨後用ACN沖洗收集固體，得到呈白色固體狀之(3-胺基丙基)(4-((3-胺基丙基)胺基)丁基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚烷-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯三鹽酸鹽(0.498 g，0.639 mmol，86.1%)。UPLC/ELSD: RT = 1.63 min。MS (ES):對於C 40H 74N 4O 2， m/z= 643.4 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, CD 3OD): δ 5.39-5.45 (m, 1H), 4.40-4.54 (m, 1H), 3.29-3.48 (m, 4H), 3.05-3.19 (m, 6H), 2.91-3.02 (m, 2H), 2.34-2.43 (m, 2H), 1.83-2.20 (br. m, 9H), 0.92-1.82 (br. m, 26H), 1.08 (s, 3H), 0.97 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.80-0.93 (m, 9H), 0.75 (s, 3H)。 AL. 化合物 SA38 ： 4-((3- 胺基丙基 )(4-((3- 胺基丙基 ) 胺基 ) 丁基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯三鹽酸鹽
Figure 02_image1525
步驟 1 ： 9-( 第三丁氧基羰基 )-14-(3-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙基 )-2,2- 二甲基 -4,15- 二側氧基 -3- 氧雜 -5,9,14- 三氮雜十八烷 -18- 酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1527
向 N-{3-[( 第三丁氧基羰基)胺基]丙基}-N-[4-({3-[( 第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)丁基]胺基甲酸 第三丁酯(0.341 g，0.678 mmol)及半丁二酸膽固醇酯(0.300 g，0.616 mmol)於DCM (6.0 mL)中之攪拌溶液中添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(0.177 g，0.925 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物，且藉由TLC監測。在18 h時，添加水(10 mL)，且在室溫下攪拌反應混合物10 min。此後，分離各層。用DCM (2×10 mL)萃取水相。使經合併有機相通過疏水玻璃料，經Na 2SO 4乾燥且濃縮。經由矽膠層析(30-70% EtOAc之己烷溶液)純化粗物質，得到呈白色泡沫狀之9-( 第三丁氧基羰基)-14-(3-(( 第三丁氧基羰基)胺基)丙基)-2,2-二甲基-4,15-二側氧基-3-氧雜-5,9,14-三氮雜十八烷-18-酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(371 mg，0.382 mmol，62.0%)。UPLC/ELSD: RT = 3.37 min。 MS (ES):對於C 56H 98N 4O 9， m/z= 994.2 [M + Na] +； 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 5.31-5.49 (m, 1H), 5.25 (br. s, 1H), 4.74 (br. s, 1H), 4.51-4.67 (m, 1H), 2.95-3.53 (br. m, 12H), 2.52-2.71 (m, 4H), 2.23-2.38 (m, 2H), 1.73-2.08 (br. m, 5H), 0.93-1.72 (br. m, 29H), 1.46 (s, 9H), 1.44 (s, 9H), 1.42 (s, 9H), 1.01 (s, 3H), 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz), 0.86 (d, 6H, J= 6.2 Hz), 0.67 (s, 3H)。 步驟 2 ： 4-((3- 胺基丙基 )(4-((3- 胺基丙基 ) 胺基 ) 丁基 ) 胺基 )-4- 側氧基丁酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯三鹽酸鹽
Figure 02_image1525
向9-(第三丁氧基羰基)-14-(3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)-2,2-二甲基-4,15-二側氧基-3-氧雜-5,9,14-三氮雜十八烷-18-酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(363 mg，0.374 mmol)於iPrOH (2.5 mL)中之溶液中添加5-6 N HCl之iPrOH溶液(0.78 mL)。在40 °C下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在16.5 h時，再添加5-6 N HCl之iPrOH溶液(0.20 mL)，且在室溫下攪拌反應混合物。在22.5 h時，添加ACN (7.5 mL)，且在室溫下攪拌反應混合物10 min。此後，藉由真空過濾收集固體，且用ACN沖洗，得到呈白色固體狀之4-((3-胺基丙基)(4-((3-胺基丙基)胺基)丁基)胺基)-4-側氧基丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯三鹽酸鹽(0.240 g，0.285 mmol，76.3%)。UPLC/ELSD: RT = 1.84 min。MS (ES): m/z= 671.9 [M + H] +C 41H 74N 4O 3； 1H NMR (300 MHz, CD 3OD): δ 5.35-5.41 (m, 1H), 4.46-4.59 (m, 1H), 3.36-3.58 (m, 4H), 2.99-3.19 (m, 6H), 2.86-2.94 (m, 2H), 2.58-2.75 (m, 4H), 2.25-2.41 (m, 2H), 0.96-2.19 (br. m, 34H), 1.05 (s, 3H), 0.95 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.88 (m, 6H, J= 6.6 Hz), 0.73 (s, 3H)。 AM. 化合物 SA39 ： N -(3- 胺基丙基 )-N-(4-((3- 胺基丙基 ) 胺基 ) 丁基 )-3-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基 ) 二硫烷基 ) 丙醯胺三鹽酸鹽
Figure 02_image1530
向(3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)(4-(N-(3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)-3-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)二硫烷基)丙醯胺基)丁基)胺基甲酸第三丁酯(如WO 98/50417 “Cationic Amphiphiles containing a Disulphide Linker for Cell Transfections”中所述製備) (0.460 g，0.464 mmol)於DCM (9.2 mL)中之攪拌溶液中添加4 N HCl之二噁烷溶液(0.81 mL)。在室溫下攪拌反應混合物，且藉由LCMS監測。在5 h時，將反應混合物用MTBE稀釋至35 mL，隨後離心(5000 RPM，30 min)。倒出上清液。將固體懸浮於庚烷中，隨後濃縮，得到呈白色固體狀之N-(3-胺基丙基)-N-(4-((3-胺基丙基)胺基)丁基)-3-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,3-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)二硫烷基)丙醯胺三鹽酸鹽(0.288 g，0.347 mmol，74.9%)。UPLC/ELSD: RT = 1.78 min。MS (ES):對於C 40H 74N 4OS 2， m/z= 691.2 [M + H] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 9.20 (br. s, 1H), 9.11 (br. s, 1H), 8.10 (br. s, 4H), 7.94 (br. s, 2H), 5.30-5.40 (m, 1H), 3.20-3.51 (br. m, 6H), 2.61-3.03 (br. m, 13H), 2.20-2.35 (m, 2H), 0.91-2.07 (br. m, 29H), 0.96 (s, 3H), 0.89 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.7 Hz), 0.84 (d, 3H, J= 6.6 Hz), 0.65 (s, 3H)。 AN. 化合物 SA40 ： (3- 胺基丙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1532
步驟 1 ： ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基 ) 丙烷 -1,3- 二基二胺基甲酸第三丁酯
Figure 02_image1534
在乾燥氮氣下將氯甲酸膽固醇酯(5 g，10.8 mmol)於90 mL無水DCM中之攪拌溶液冷卻至0℃。添加三乙基胺(3 mL，21.6 mmol)。經15分鐘逐滴添加 N-Boc-1,3-二胺基丙烷(2.3 g, 12.9 mmol)於10 mL無水DCM中之溶液。將所得無色溶液在室溫下攪拌隔夜，用DCM稀釋，用50%飽和鹽水洗滌兩次，用1 N HCl水溶液洗滌兩次，乾燥(Na 2SO 4)，且過濾。濃縮濾液，得到無色油狀物，其開始緩慢固化。將其在渦旋下用少量DCM (約10 mL)稀釋以溶解大部分材料，且用約100 mL己烷稀釋混合物，得到白色沉澱。將固體粉碎。在室溫下劇烈攪拌混合物60分鐘且過濾。用己烷洗滌過濾固體且風乾，隨後在真空下乾燥，得到呈白色固體狀之((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)丙烷-1,3-二基二胺基甲酸 第三丁酯(5.45 g，9.3 mmol，86%)。物質足夠純，無需進一步純化即可使用。UPLC/ELSD: RT = 3.37 min。MS (ES):對於C 36H 62N 2O 4， m/z(MH +) 587.26。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.37 (d, 1H, J= 5.2 Hz); 5.00 (br. s, 1H); 4.84 (br. s, 1H); 4.49 (m, 1H); 3.19 (m, 4H); 2.43-2.20 (m, 2H); 2.10-1.74 (m, 5H); 1.69-1.39 (m, 18H); 1.38-0.94 (m, 16H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.67 (s, 3H)。 步驟 2 ： (3- 胺基丙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1532
向((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基)丙烷-1,3-二基二胺基甲酸第三丁酯(2 g，3.37 mmol)於25 mL無水DCM中之攪拌溶液中添加2 M HCl之乙醚溶液(8.4 mL，16.8 mmol)。將反應容器緊密密封，加熱至40℃，且攪拌隔夜。藉由LCMS得知無起始材料剩餘，因此將混合物在氮氣流中濃縮。將白色殘餘物用乙醚研製且過濾。用乙醚洗滌過濾固體，風乾，隨後在真空下乾燥，得到呈白色固體狀之(3-胺基丙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯鹽酸鹽(1.65 g，3.12 mmol，93%)。UPLC/ELSD: RT = 2.35 min。MS (ES):對於C 31H 54N 2O 2， m/z(MH +) 487.12。 1H NMR (300 MHz, CD 3OD) δ: ppm 5.38 (d, 1H, J= 4.3 Hz); 4.40 (m, 1H); 3.20 (t, 2H, J= 6.6 Hz); 2.96 (t, 2H, J= 7.4 Hz); 2.32 (d, 2H, J= 7.2 Hz); 2.13-1.72 (m, 7H); 1.71-1.26 (m, 11H); 1.26-0.98 (m, 13H); 0.95 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.88 (dd, 6H, J= 0.8 Hz, 6.6 Hz); 0.72 (s, 3H)。 AO. 化合物 SA41 ： (3- 胍基丙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1536
步驟 1 ：
Figure 02_image1538
向(3-胺基丙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯鹽酸鹽(SA40，600 mg，1.13 mmol)及N 1, N 2-雙-Boc-胍-N 3-三氟甲磺酸酯(450 mg，1.13 mmol)於15 mL無水DCM中之攪拌溶液中添加三乙基胺(330 µL，2.32 mmol)，且在室溫下攪拌混合物96小時，之後藉由LCMS得知無起始材料剩餘。用DCM稀釋混合物，用1 N HCl水溶液洗滌一次，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌一次，乾燥(Na 2SO 4)且過濾。濃縮濾液，得到無色油狀物。將其藉由矽膠層析(0-30% EtOAc之己烷溶液)純化，得到呈白色固體狀之產物(521 mg，0.71 mmol，62%)。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 11.39 (s, 1H); 8.44 (br. s, 1H); 5.98 (s, 1H); 5.36 (d, 1H, J= 3.2 Hz); 4.50 (m, 1H); 3.53 (d, 2H, J= 6.9 Hz); 3.20 (s, 2H); 2.43-2.120 (m, 2H); 2.08-1.63 (m, 7H); 1.62-1.22 (m, 29H); 1.20-0.95 (m, 11H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.67 (s, 3H)。 步驟 2 ： (3- 胍基丙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯鹽酸鹽
Figure 02_image1536
以與SA23相同之方式，使用來自步驟1之產物製備SA41，得到呈白色固體狀之(3-胍基丙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯鹽酸鹽(45 mg，0.08 mmol，10%)。UPLC/ELSD: RT = 2.38 min。MS (ES):對於C 32H 56N 4O 2， m/z(MH +) 529.30。 1H NMR (300 MHz, CD 3OD) δ: ppm 7.88 (br. s, 1H); 6.90 (t, 1H, J= 6.2 Hz); 5.39 (d, 1H, J= 4.9 Hz); 4.39 (m, 1H); 3.18 (m, 4H); 2.31 (d, 2H, J= 7.1 Hz); 2.12-1.68 (m, 5H); 1.66-1.27 (m, 9H); 1.26-0.97 (m, 14H); 0.95 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.88 (dd, 6H, J= 0.8 Hz, 6.6 Hz); 0.72 (s, 3H)。 AP. 化合物 SA42 ： (3-( 二異丙基胺基 ) 丙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1540
在乾燥氮氣下，在0℃下，經五分鐘向3-(二異丙基胺基)丙基胺(175 mg，1.09 mmol)於5 mL無水DCM中之攪拌溶液中逐滴添加氯甲酸膽固醇酯(500 mg，1.09 mmol)於5 mL無水DCM中之溶液。使反應物緩慢溫至室溫且攪拌兩小時，之後藉由LCMS得知無起始材料剩餘。用DCM稀釋溶液，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌一次，乾燥(Na 2SO 4)且過濾。濃縮濾液，得到淺黃色油狀物。將其藉由矽膠層析(100% DCM至100% DCM/MeOH/NH 4OH (80:20:1))純化，得到呈無色糖漿狀之(3-(二異丙基胺基)丙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(392 mg，0.66 mmol，60%)，其在靜置時固化。UPLC/ELSD: RT = 2.55 min。MS (ES):對於C 37H 66N 2O 2， m/z(MH +) 571.48。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 6.00 (br. s, 1H); 5.36 (d, 1H, J= 5.1 Hz); 4.48 (m, 1H); 3.23 (d, 2H, J= 5.6 Hz); 3.04 (t, 2H, J= 6.2 Hz); 2.52 (s, 2H); 2.42-2.16 (m, 2H); 2.07-1.74 (m, 5H); 1.72-1.06 (m, 22H); 1.05-0.94 (m, 16H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.3 Hz, 6.6 Hz); 0.67 (s, 3H)。 AQ. 化合物 SA43 ： (2-( 二異丙基胺基 ) 乙基 ) 胺基甲酸 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- 二甲基 -17-((R)-6- 甲基庚烷 -2- 基 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 十四氫 -1H- 環戊二烯並 [a] 菲 -3- 基酯
Figure 02_image1542
在乾燥氮氣下，在0℃下，經五分鐘向3-(二異丙基胺基)乙基胺(210 µL，1.15 mmol)於5 mL無水DCM中之攪拌溶液中逐滴添加氯甲酸膽固醇酯(500 mg，1.09 mmol)於5 mL無水DCM中之溶液。使反應物緩慢溫至室溫且攪拌兩小時，之後藉由LCMS得知無起始材料剩餘。用DCM稀釋溶液，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌一次，乾燥(Na 2SO 4)且過濾。濃縮濾液，得到淺黃色油狀物。將其藉由矽膠層析(100% DCM至25% DCM / 75% DCM/MeOH/NH 4OH (80:20:1))純化，得到呈白色固體狀之(2-(二異丙基胺基)乙基)胺基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基酯(300 mg，0.52 mmol，47%)。UPLC/ELSD: RT = 2.62 min。MS (ES):對於C 36H 64N 2O 2， m/z(MH +) 557.42。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: ppm 5.36 (d, 1H, J= 5.1 Hz); 5.06 (br. s, 1H); 4.50 (m, 1H); 3.12 (q, 2H, J= 5.6 Hz, 11.3 Hz); 2.99 (m, 2H); 2.54 (t, 2H, J= 6.3 Hz); 2.42-2.17 (m, 2H); 2.07-1.72 (m, 5H); 1.64-1.25 (m, 10H); 1.24-1.04 (m, 8H); 1.03-0.94 (m, 18H); 0.91 (d, 3H, J= 6.5 Hz); 0.86 (dd, 6H, J= 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.67 (s, 3H)。 實例 10 人類子宮頸癌上皮細胞 (HeLa) 模型中之蛋白質表現資料
根據實例2使用NPI-Luc作為mRNA構築體製備LNP。NPI-Luc為一種雙讀報告基因，其藉由在螢火蟲螢光素酶之N末端添加5xV5標籤及C-myc核定位序列提高訊號雜訊比來製備。可使用獲得發光讀數之OneGLo檢定或藉由用抗V5抗體獲得免疫螢光來偵測蛋白質表現。根據實例7中概述之程式評價蛋白質表現。在4個孔中給與LNP且報告平均反應。對於HeLa檢定，將發光讀數(RLU)根據細胞計數標準化。結果如表10a中所示。 表10a
固醇胺 LNP 核心 每個細胞之平均蛋白質表現 ( 每個細胞之 RLU) 每個細胞之蛋白質表現標準偏差
   0.4* 0.0*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 111.0 11.1
SA4 化合物18、DSPC、膽固醇及化合物428 248.5 80.5
SA6 化合物18、DSPC、膽固醇及化合物428 196.2 30.3
SA10 化合物18、DSPC、膽固醇及化合物428 236.6 81.3
SA11 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 5.3 2.9
SA16 化合物18、DSPC、膽固醇及化合物428 14.5 0.8
SA23 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 868.8 72.8
SA24 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 457.2 45.2
SA26 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 84.3 35.3
SA29 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 550.3 91.6
SA30 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 648.3 157.5
SA31 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 643.6 69.5
SA39 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 201.9 6.0
SA32 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 301.8 44.5
*在磷酸鹽緩衝鹽水溶液中採集資料 實例 11 健康 HBE 細胞中之 LNP 細胞攝取及蛋白質表現數據
根據實例2使用NPI-Luc作為mRNA構築體製備LNP。NPI-Luc為一種雙讀報告基因，其藉由在螢火蟲螢光素酶之N末端添加5xV5標籤及C-myc核定位序列提高訊號雜訊比來製備。可使用獲得發光讀數之OneGLo檢定或藉由用抗V5抗體獲得免疫螢光來偵測蛋白質表現。根據實例6中概述之程式評價LNP細胞攝取及蛋白質表現。結果如表11a中所示。 表11a
固醇胺 LNP 核心 健康 HBE 中 LNP 之平均積累 ( 陽性細胞 %) 健康 HBE 中 LNP 之積累標準偏差 ( 陽性細胞 %) 健康 HBE 中之平均蛋白質表現 (V5 陽性細胞 %) 健康 HBE 中之蛋白質表現標準偏差 (V5 陽性細胞 %)
   1.6* 0.2* 0.1* 0.0*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 43.7 1.9 9.4 1.2
SA23 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 34.3 2.2 9.1 1.4
SA29 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 56.2 3.7 12.1 3.5
SA30 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 49.9 2.0 11.9 3.8
SA31 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 43.2 3.8 11.1 2.5
*在磷酸鹽緩衝鹽水溶液中採集資料 實例 12 奈米粒子 ζ 電位
根據實例2製備LNP。藉由在Malvern Zetasizer (Nano ZS)上在0.1X PBS中將LNP稀釋至[mRNA] 0.01 mg/mL來量測Zeta電位。結果如表12a中所示。 表12a
固醇胺 核心 LNP ζ 電位 (mV)
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 10.6
SA23 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 12.7
SA29 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 8.3
SA30 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 8.7
SA31 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 8.6
實例 13 活體內研究 給藥程式 A ：氣管內 mRNA 遞送
將動物在異氟烷下麻醉。安置舌頭且將小直徑套管插入氣管中(口咽途徑)。使套管尖端穿過聲帶，沿氣管向下，因此尖端極其靠近但不接觸隆突。置放後，將50 µL(小鼠)或200 µL (大鼠)調配物輸注入肺中。直立30秒後，將動物釋放至恢復籠中，且在恢復後返回其各別籠。 給藥程式 B ：僅鼻氣霧劑暴露
使用振動網霧化器及指定入口空氣流速產生氣霧劑。藉由首先通過混合室，隨後流入暴露層，將氣霧劑引入囓齒動物僅鼻定向流暴露室。使動物在各鼻孔處暴露於新鮮氣霧劑，隨後使該氣霧劑排出系統。
在研究開始前三天訓練動物以適應僅鼻給藥錐體。在研究當天，將動物置於給藥錐體中，隨後將給藥錐體連接於氣霧劑暴露室持續指定暴露時間：對於0.4、0.6及1.1 mpk之肺劑量，每組為60、120或240分鐘。在整個暴露期間連續監測動物，隨後監測任何可觀察到之不良反應。在每次給藥之前及之後，在給藥孔監測氣霧劑濃度(mRNA)及空氣動力學粒徑分佈，以分別評價達成之劑量水準及可呼吸氣霧劑粒徑目標(對於大鼠，為1-4 µm)。 樣品收集及檢定程式 A ：組織收集以供組織學研究
收集氣管、肺及用於氣霧劑研究之鼻腔、鼻咽及喉以進行分析。將肺用10% NBF固定劑充氣，且將氣管系緊以維持充氣。將肺全部移除，且移除附著之氣管、支氣管及肺葉。將全肺在室溫下全部固定在10% NBF中至少24小時，最多48小時，隨後自固定劑取出且置於PBS中。將樣品立即送去處理以進行石蠟5微米切片及H&E染色。
為進行氣霧劑研究，除氣管及肺外，亦收集鼻腔、鼻咽及喉。 樣品收集及檢定程式 B ：免疫組織化學 (IHC)
使用Leica Bond RX自動染色機對FFPE切片進行IHC。藉由抗V5標籤抗體以1:100稀釋度偵測NPI-Luc蛋白質表現。藉由Bond Polymer Refine Detection套組，隨後使用蘇木精及藍化試劑複染來偵測V5抗體。使用Panoramic 250 Flash III全玻片掃描儀以20X放大率使影像成像。使用Indica Labs HALO影像分析軟體完成影像分析。分析氣管、肺及/或鼻腔影像以捕獲總氣管、支氣管或鼻上皮細胞，且在適當時將數據表示為每隻動物之V5陽性上皮細胞/總上皮細胞%。 藉由氣管內遞送單次給與 mRNA-LNP 後小鼠中之 LNP 蛋白質表現數據
根據實例2使用NPI-Luc作為mRNA構築體製備LNP。藉由氣管內滴注將LNP遞送至小鼠以獲得約0.7 mpk之劑量。根據樣品收集及檢定程式A及B評價呼吸道上皮中之LNP蛋白質表現。結果如表13a中所示。具有陽離子劑主要分佈在外表面上之LNP在氣管及支氣管中展現陽性呼吸道上皮蛋白質表現。 表13a
固醇胺 LNP 核心 組織 平均 V5 陽性細胞數 / 總細胞 % V5 陽性細胞 / 總細胞 % 標準偏差
   小鼠氣管 0.09* 0.04*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 40.7 0.39
SA23 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 0.8 0.66
SA31 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 27.07 8.96
   小鼠支氣管(左肺) 0.08* 0.05*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 9.33 4.93
SA23 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 0.98 0.42
SA31 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 10.52 6.59
*在磷酸鹽緩衝鹽水溶液中採集資料 藉由氣管內遞送單次給與 mRNA-LNP 後大鼠中之 LNP 蛋白質表現數據
根據實例2使用NPI-Luc作為mRNA構築體製備LNP。藉由氣管內滴注將LNP遞送至大鼠以獲得約1.2 mpk之劑量。根據樣品收集及檢定程式A及B評價呼吸道上皮中之LNP蛋白質表現。結果如表13b中所示。具有陽離子劑主要分佈在外表面上之LNP在氣管及支氣管中展現陽性呼吸道上皮蛋白質表現。 表13b
固醇胺 LNP 核心 組織 平均 V5 陽性細胞數 / 總細胞 % V5 陽性細胞 / 總細胞 % 標準偏差
   大鼠氣管 0.03* 0.03*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 2.97 2.14
SA23 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 0.83 0.58
   大鼠支氣管(左肺及右肺) 0.11* 0.11*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 4.95 4.38
SA23 化合物18、DSPC、β-麥固醇、膽固醇及DMG-PEG 2K 1.38 0.95
*在磷酸鹽緩衝鹽水溶液中採集資料 藉由氣霧劑遞送單次給與 mRNA-LNP 後大鼠中之 LNP 蛋白質表現數據
根據實例8使用NPI-Luc作為mRNA構築體製備LNP。藉由氣霧劑使用僅鼻氣霧劑給藥系統將LNP遞送至大鼠。根據樣品收集及檢定程式A及B評價呼吸道上皮中之LNP蛋白質表現。結果如表13c中所示。氣霧劑遞送LNP後，鼻腔、氣管及支氣管中之呼吸道上皮的蛋白質表現呈陽性。 表13c
固醇胺 LNP 核心 組織 劑量 (mpk) 平均 V5 陽性細胞數 / 總細胞 % V5 陽性細胞 / 總細胞 % 標準偏差
   大鼠氣管 0.20* 0.19*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 0.4 0.29 0.16
0.6 0.16 0.15
1.1 0.65 0.39
   大鼠支氣管(左肺及右肺) 0.03* 0.02*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 0.4 0.13 0.07
0.6 0.13 0.03
1.1 0.46 0.17
   大鼠鼻腔 0.18* 0.16*
SA3 化合物18、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2K 0.4 0.64 0.76
0.6 1.20 1.08
1.1 2.84 3.05
*在基於Tris之緩衝溶液中採集資料
本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用之方式併入。在矛盾之情況下，以本說明書(包括定義)為準。
圖1為用於製備LNP之例示性第一代事後裝載(PHL)方法的圖表。 圖2為用於製備LNP之例示性第二代PHL方法(通用)的圖表。 圖3為用於製備LNP之例示性第二代PHL方法(特定)的圖表。 圖4為製備空脂質奈米粒子原型(「中性組合件」)之例示性方法的圖表，其中將空LNP在pH 8.0下混合且最終調配物為pH 5.0。 圖5為用固醇胺製備LNP之例示性方法的圖表。 圖6為LNP-1及LNP-1a之小角度x射線散射(SAXS)分析。 圖7為展示LNP-1及LNP-1a之一般極性Laurdan (GLP)的圖。

Claims (118)

  1. 一種奈米粒子，其包含： (a)     脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在該核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)     主要分佈在該核心之外表面上的陽離子劑， 其中該奈米粒子在生理pH下具有大於中性之ζ電位。
  2. 一種奈米粒子，其包含： (a)     脂質奈米粒子核心，其包含： (i)      可離子化脂質， (ii)     磷脂， (iii)    結構脂質，及 (iv)    PEG-脂質，以及 (b)     封裝在該核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)     陽離子劑。
  3. 一種奈米粒子，其包含： (a)     脂質奈米粒子核心， (b)     封裝在該核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載，及 (c)     陽離子劑， 其中該奈米粒子在上皮細胞中展現至少約20%之細胞積累且在上皮細胞中展現約5%或更高之表現。
  4. 如請求項1-3中任一項之奈米粒子，其中該陽離子劑與多核苷酸有效負載之重量比為約1:1至約4:1、約1.25:1至約3.75:1、約1.25:1、約2.5:1或約3.75:1。
  5. 如請求項1-4中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子之ζ電位為約5 mV至約20 mV、約5 mV至約20 mV、約5 mV至約15 mV或約5 mV至約10 mV。
  6. 如請求項1-5中任一項之奈米粒子，其中該脂質奈米粒子核心在中性pH下具有中性電荷。
  7. 如請求項1-6中任一項之奈米粒子，其中該陽離子劑中大於約80%、大於90%、大於95%或大於95%在該奈米粒子之表面上。
  8. 如請求項1-7中任一項之奈米粒子，其中該多核苷酸或多肽有效負載中之至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%封裝在該核心內。
  9. 如請求項1-8中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子之多分散性值小於約0.4、小於約0.3或小於約0.2。
  10. 如請求項1-9中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子之平均直徑為約40 nm至約150 nm、約50 nm至約100 nm、約60 nm至約120 nm、約60 nm至約100 nm或約60 nm至約80 nm。
  11. 如請求項1-10中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子之laurdan的一般極化(GPL)大於或等於約0.6。
  12. 如請求項1-11中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子之晶面間距大於約6 nm或大於約7 nm。
  13. 如請求項1-12中任一項之奈米粒子，其中該等奈米粒子中之至少50%、至少75%、至少90%或至少95%的表面流動性值大於臨限極化水準。
  14. 如請求項1-13中任一項之奈米粒子，其中當該奈米粒子與細胞群接觸時，細胞群中之約10%或更多、約15%或更多或約20%或更多積累該奈米粒子。
  15. 如請求項1-14中任一項之奈米粒子，其中當該奈米粒子與細胞群接觸時，細胞中之約5%或更多或約10%或更多表現該多核苷酸或多肽。
  16. 如請求項1-15中任一項之奈米粒子，其中該細胞群為上皮細胞群。
  17. 如請求項1-15中任一項之奈米粒子，其中該細胞群為呼吸道上皮細胞群。
  18. 如請求項1-15中任一項之奈米粒子，其中該細胞群為鼻細胞群。
  19. 如請求項1-15中任一項之奈米粒子，其中該細胞群為肺泡上皮細胞群。
  20. 如請求項1-15中任一項之奈米粒子，其中該細胞群為肺細胞群。
  21. 如請求項1-15中任一項之奈米粒子，其中該細胞群為支氣管上皮細胞群。
  22. 如請求項1-15中任一項之奈米粒子，其中該細胞群為HBE群。
  23. 如請求項1-22中任一項之奈米粒子，其中該陽離子劑在醇中之溶解度大於約1 mg/mL、大於約5 mg/mL、大於約10 mg/mL或大於約20 mg/mL。
  24. 如請求項23之奈米粒子，其中該醇為C 1-6醇。
  25. 如請求項24之奈米粒子，其中該醇為乙醇。
  26. 如請求項1-25中任一項之奈米粒子，其中該陽離子劑為陽離子脂質。
  27. 如請求項26之奈米粒子，其中該陽離子脂質為水溶性兩親分子。
  28. 如請求項27之奈米粒子，其中該兩親分子包含脂質部分及親水部分。
  29. 如請求項28之奈米粒子，其中該脂質部分包含結構脂質、脂肪酸或烴基。
  30. 如請求項26之奈米粒子，其中該陽離子脂質為包含疏水部分及親水部分之固醇胺。
  31. 如請求項30之奈米粒子，其中該親水部分包含胺基，該胺基包含一至四個一級胺、二級胺或三級胺或其混合物。
  32. 如請求項31之奈米粒子，其中該胺基包含一或兩個末端一級胺。
  33. 如請求項31之奈米粒子，其中該胺基包含一或兩個末端一級胺及一個內部二級胺。
  34. 如請求項31之奈米粒子，其中該胺基包含一或兩個三級胺。
  35. 如請求項31-34中任一項之奈米粒子，其中該胺基之pKa值大於約8。
  36. 如請求項31-34中任一項之奈米粒子，其中該胺基之pKa值大於約9。
  37. 如請求項30-36中任一項之奈米粒子，其中該固醇胺為式(A1)化合物： A-L-B (A1) 或其鹽，其中： A為胺基，L為視情況存在之連接基團，且B為固醇。
  38. 如請求項30-37之奈米粒子，其中該固醇胺具有式A2a：
    Figure 03_image001
    (A2a) 或其鹽，其中： ----為單鍵或雙鍵； R 1為C 1-14烷基或C 1-14烯基； L a為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2、-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-或式(a)之基團：
    Figure 03_image003
    (a)； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合； 且其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個獨立地選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、-O(C 1-6烷基)、-C 1-6烷基-OH、NH 2、-NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、-NH-(3至8員雜環烷基)及-NH(5至6員雜芳基)；且 n為1或2。
  39. 如請求項38之奈米粒子，其中----為雙鍵。
  40. 如請求項38之奈米粒子，其中----為單鍵。
  41. 如請求項38或39之奈米粒子，其中L a為-OC(=O)、-OC(=O)N-或-OC(=O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-。
  42. 如請求項38-41中任一項之奈米粒子，其中n為1。
  43. 如請求項38-41中任一項之奈米粒子，其中n為2。
  44. 如請求項38-43中任一項之奈米粒子，其中R 1為C 1-14烷基。
  45. 如請求項38-43中任一項之奈米粒子，其中R 1為C 1-14烯基。
  46. 如請求項38-43中任一項之奈米粒子，其中R 1為
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    或
    Figure 03_image037
    。
  47. 如請求項38-46中任一項之奈米粒子，其中Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合； 且其中該C 1-10烷基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經C 1-6烷基、OH、-C 1-6烷基-OH或NH 2取代。
  48. 如請求項38-46中任一項之奈米粒子，其中Y 1選自： (1)
    Figure 03_image057
    ；(2)
    Figure 03_image059
    ；(3)
    Figure 03_image061
    ； (4)
    Figure 03_image063
    ；(5)
    Figure 03_image065
    ；(6)
    Figure 03_image067
    ；(7)
    Figure 03_image069
    ；(8)
    Figure 03_image071
    ；(9)
    Figure 03_image073
    ；(10)
    Figure 03_image075
    ；(11)
    Figure 03_image077
    ；(12)
    Figure 03_image079
    ；(13)
    Figure 03_image081
    ；(14)
    Figure 03_image083
    ；(15)
    Figure 03_image085
    ；(16)
    Figure 03_image087
    ；(17)
    Figure 03_image089
    ；(18)
    Figure 03_image091
    ；(19)
    Figure 03_image093
    ；(20)
    Figure 03_image095
    (21)
    Figure 03_image097
    ；(22)
    Figure 03_image099
    ；(23)
    Figure 03_image101
    ；(28) N(CH 3) 2；(29)
    Figure 03_image103
    ；(30)
    Figure 03_image105
    ；(31)
    Figure 03_image107
    ；及(32)
    Figure 03_image109
    。
  49. 如請求項30-37中任一項之奈米粒子，其中該固醇胺具有式A4
    Figure 03_image136
    (A4) 或其鹽，其中： Z 1為OH或C 3-6烷基； L為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、-CH 2-NH-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2或-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合； 且其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、-O(C 1-6烷基)、-C 1-6烷基-OH、NH 2、-NH(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、-NH(3至8員雜環烷基)及-NH(5至6員雜芳基)；且 n為1或2。
  50. 如請求項49之奈米粒子，其中Z 1為OH。
  51. 如請求項49之奈米粒子，其中Z 1為C 3-6烷基。
  52. 如請求項49-51中任一項之奈米粒子，其中L為-C(=O)N-、-CH 2-NH-C(=O)-或-C(=O)O-。
  53. 如請求項49-52中任一項之奈米粒子，其中Y 1為C 1-10烷基，其包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合。
  54. 如請求項49-52中任一項之奈米粒子，其中Y 1為
    Figure 03_image069
    。
  55. 如請求項49-54中任一項之奈米粒子，其中n為1。
  56. 如請求項49-54中任一項之奈米粒子，其中n為2。
  57. 如請求項37之奈米粒子，其中該固醇胺選自： 固醇胺編號 結構 SA1
    Figure 03_image005
         SA2
    Figure 03_image007
         SA3
    Figure 03_image009
         SA4
    Figure 03_image011
         SA5
    Figure 03_image013
         SA6
    Figure 03_image145
         SA7
    Figure 03_image147
         SA8
    Figure 03_image149
         SA9
    Figure 03_image015
         SA10
    Figure 03_image017
         SA11
    Figure 03_image019
         SA12
    Figure 03_image154
         SA13
    Figure 03_image156
         SA14
    Figure 03_image158
         SA15
    Figure 03_image160
         SA16
    Figure 03_image162
         SA17
    Figure 03_image164
         SA18
    Figure 03_image166
         SA19
    Figure 03_image168
         SA20
    Figure 03_image170
         SA21
    Figure 03_image172
         SA22
    Figure 03_image021
         SA23
    Figure 03_image023
         SA24
    Figure 03_image176
         SA25
    Figure 03_image178
         SA26
    Figure 03_image180
         SA27
    Figure 03_image182
         SA28
    Figure 03_image184
         SA29
    Figure 03_image025
         SA30
    Figure 03_image027
         SA31
    Figure 03_image188
         SA32
    Figure 03_image190
         SA33
    Figure 03_image192
         SA34
    Figure 03_image194
         SA35
    Figure 03_image196
         SA36
    Figure 03_image198
         SA37
    Figure 03_image200
         SA38
    Figure 03_image202
         SA39
    Figure 03_image029
         SA40
    Figure 03_image031
         SA41
    Figure 03_image206
         SA42
    Figure 03_image226
    及     SA43
    Figure 03_image228
    或其鹽。
  58. 如請求項1-37中任一項之奈米粒子，其中陽離子劑為非脂質陽離子劑。
  59. 如請求項58中任一項之奈米粒子，其中該非脂質陽離子劑為氯化苄烷銨、氯化鯨蠟基吡啶鎓、L-離胺酸單水合物或胺丁三醇。
  60. 如請求項1-25中任一項之奈米粒子，其中該陽離子劑為經修飾精胺酸。
  61. 如請求項1-60中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子包含約30 mol%至約60 mol%或約40 mol%至約50 mol%可離子化脂質。
  62. 如請求項1-60中任一項之奈米粒子，其中可離子化脂質為化合物18：
    Figure 03_image354
    (化合物18)，或其鹽。
  63. 如請求項1-62中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子包含約5 mol%至約15 mol%、約8 mol%至約13 mol%或約10 mol%至約12 mol%磷脂。
  64. 如請求項1-63中任一項之奈米粒子，其中該磷脂為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。
  65. 如請求項1-64中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子包含約20 mol%至約60 mol%、約30 mol%至約50 mol%、約35 mol%或約40 mol%結構脂質。
  66. 如請求項1-65中任一項之奈米粒子，其中該結構脂質選自類固醇、二萜、三萜、膽甾烷及熊果酸或其衍生物。
  67. 如請求項1-65中任一項之奈米粒子，其中該結構脂質為選自膽固醇及植物固醇之類固醇。
  68. 如請求項1-65中任一項之奈米粒子，其中該結構脂質為膽固醇或具有以下結構之化合物：
    Figure 03_image1622
  69. 如請求項1-68中任一項之奈米粒子，其中該PEG-脂質選自經PEG修飾之磷脂醯乙醇胺、經PEG修飾之磷脂酸、經PEG修飾之神經醯胺、經PEG修飾之二烷基胺、經PEG修飾之二醯基甘油、經PEG修飾之二烷基甘油及其混合物。
  70. 如請求項1-68中任一項之奈米粒子，其中該PEG-脂質為PEG-DMG。
  71. 如請求項1-68中任一項之奈米粒子，其中該PEG-脂質為DMG-PEG 2k。
  72. 如請求項1-68中任一項之奈米粒子，其中該PEG-脂質為化合物428。
  73. 如請求項1-70中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子包含約1 mol%至約5 mol% PEG-脂質或約1 mol%至約2.5 mol% PEG-脂質。
  74. 一種細胞，其包含如請求項1-73中任一項之奈米粒子。
  75. 如請求項74之細胞，其中該細胞為上皮細胞。
  76. 如請求項74之細胞，其中該細胞為肺細胞。
  77. 如請求項74之細胞，其中該細胞為鼻細胞。
  78. 如請求項74之細胞，其中該細胞為肺泡上皮細胞。
  79. 如請求項74之細胞，其中該細胞為呼吸道上皮細胞。
  80. 如請求項74之細胞，其中該細胞為支氣管上皮細胞。
  81. 如請求項74之細胞，其中該細胞為人類支氣管上皮(HBE)細胞。
  82. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1-73中任一項之奈米粒子。
  83. 如請求項82之醫藥組成物，其中該組成物呈液體形式。
  84. 如請求項82之醫藥組成物，其中該組成物適用於吸入。
  85. 一種製備奈米粒子之方法，該方法包括使脂質奈米粒子與陽離子劑接觸，其中該脂質奈米粒子包含： (a)     脂質奈米粒子核心，其包含： (i)      可離子化脂質， (ii)     磷脂， (iii)    結構脂質，及 (iv)    PEG-脂質，以及 (b)     封裝在該核心內以遞送至細胞中之多核苷酸或多肽有效負載。
  86. 如請求項85之方法，其中該脂質奈米粒子與陽離子劑之接觸包含將該陽離子劑溶解於非離子賦形劑中。
  87. 如請求項86之方法，其中該非離子賦形劑為聚乙烯二醇15羥基硬脂酸酯(HS 15)。
  88. 如請求項85-87中任一項之方法，其中該陽離子劑為固醇胺。
  89. 如請求項88之方法，其中該固醇胺為GL-67：
    Figure 03_image009
    (GL-67)或其鹽。
  90. 一種奈米粒子，其藉由如請求項85-89中任一項之方法製備。
  91. 一種將多核苷酸或多肽有效負載遞送至細胞中之方法，該方法包括使該細胞與如請求項1-73及90中任一項之奈米粒子接觸。
  92. 一種治療或預防患者之疾病的方法，該方法包括向該患者投與如請求項1-73及90中任一項之奈米粒子或如請求項82-84中任一項之組成物，該奈米粒子或組成物包含用於治療或預防該疾病之有效負載。
  93. 如請求項92之方法，其中該疾病為囊腫性纖維化。
  94. 如請求項92或93之方法，其中該奈米粒子或組成物藉由鼻內、支氣管內或經肺投與來投藥。
  95. 如請求項94之方法，其中該奈米粒子或組成物藉由霧化器或吸入器投與。
  96. 一種式A2a化合物，
    Figure 03_image001
    (A2a) 或其鹽，其中： ----為單鍵或雙鍵； R 1為C 1-14烷基或C 1-14烯基； L a為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、CH 2-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2、-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-或式(a)之基團：
    Figure 03_image003
    (a)； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合； 且其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個獨立地選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、-O(C 1-6烷基)、-C 1-6烷基-OH、NH 2、NH(C 1-6烷基)、N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、-NH-(3至8員雜環烷基)及-NH(5至6員雜芳基)；且 n為1或2； 其條件為該式A2a化合物不為：
    Figure 03_image005
    (SA1)
    Figure 03_image007
    (SA2)
    Figure 03_image009
    (SA3)
    Figure 03_image011
    (SA4)
    Figure 03_image013
    (SA5)
    Figure 03_image015
    (SA9)
    Figure 03_image017
    (SA10)
    Figure 03_image019
    (SA11)
    Figure 03_image021
    (SA22)
    Figure 03_image023
    (SA23)
    Figure 03_image025
    (SA29)
    Figure 03_image027
    (SA30)
    Figure 03_image029
    (SA39) 及
    Figure 03_image031
    (SA40)。
  97. 如請求項96之化合物，其中----為雙鍵，或其鹽。
  98. 如請求項96之化合物，其中----為單鍵，或其鹽。
  99. 如請求項96-98中任一項之化合物，其中L a為-OC(=O)、-OC(=O)N-或-OC(=O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-，或其鹽。
  100. 如請求項96-99中任一項之化合物，其中n為1，或其鹽。
  101. 如請求項96-99中任一項之化合物，其中n為2，或其鹽。
  102. 如請求項96-101中任一項之化合物，其中R 1為C 1-14烷基，或其鹽。
  103. 如請求項96-101中任一項之化合物，其中R 1為C 1-14烯基，或其鹽。
  104. 如請求項96-101中任一項之化合物，其中R 1為
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    或
    Figure 03_image037
    ，或其鹽。
  105. 如請求項96-104中任一項之化合物，其中Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合； 且其中該C 1-10烷基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經C 1-6烷基、OH、-C 1-6烷基-OH或NH 2取代， 或其鹽。
  106. 如請求項96-104中任一項之化合物，其中Y 1為 (1)
    Figure 03_image057
    ；(2)
    Figure 03_image059
    ；(3)
    Figure 03_image061
    ；(4)
    Figure 03_image063
    ；(5)
    Figure 03_image065
    ；(6)
    Figure 03_image067
    ；(7)
    Figure 03_image069
    ；(8)
    Figure 03_image071
    ；(9)
    Figure 03_image073
    ；(10)
    Figure 03_image075
    ；(11)
    Figure 03_image077
    ；(12)
    Figure 03_image079
    ；(13)
    Figure 03_image081
    ；(14)
    Figure 03_image083
    ；(15)
    Figure 03_image085
    ；(16)
    Figure 03_image087
    ；(17)
    Figure 03_image089
    ；(18)
    Figure 03_image091
    ；(19)
    Figure 03_image093
    ；(20)
    Figure 03_image095
    (21)
    Figure 03_image097
    ；(22)
    Figure 03_image099
    ；(23)
    Figure 03_image101
    ；(28) N(CH 3) 2；(30)
    Figure 03_image103
    ；(31)
    Figure 03_image105
    ；(32)
    Figure 03_image107
    ；或(33)
    Figure 03_image109
    ， 或其鹽。
  107. 一種式A4化合物，
    Figure 03_image136
    (A4) 或其鹽，其中： Z 1為OH或C 3-6烷基； L為不存在、-O-、-S-S-、-OC(=O)、-C(=O)N-、-OC(=O)N-、-CH 2-NH-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-CH 2-CH 2-C(=O)N-、-S-S-CH 2或-SS-CH 2-CH 2-C(O)N-； Y 1為C 1-10烷基、3至8員雜環烷基、5至6員雜芳基、-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)或-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)， 其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合； 且其中該C 1-10烷基、該3至8員雜環烷基、該5至6員雜芳基、該-C 1-6烷基-(3至8員雜環烷基)及該-C 1-6烷基-(5至6員雜芳基)各自視情況經1、2、3或4個選自以下之取代基取代：C 1-6烷基、鹵基、OH、-O(C 1-6烷基)、-C 1-6烷基-OH、NH 2、-NH(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基) 2、3至8員雜環烷基(視情況經包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合之C 1-14烷基取代)、5至6員雜芳基、-NH(3至8員雜環烷基)及-NH(5至6員雜芳基)；且 n為1或2。
  108. 如請求項97之化合物，其中Z 1為OH，或其鹽。
  109. 如請求項97之化合物，其中Z 1為C 3-6烷基，或其鹽。
  110. 如請求項97-99中任一項之化合物，其中L為-C(=O)N-、-CH 2-NH-C(=O)-或-C(=O)O-，或其鹽。
  111. 如請求項97-100中任一項之化合物，其中Y 1為C 1-10烷基，其包含一至五個一級胺、二級胺或三級胺或其組合，或其鹽。
  112. 如請求項97-100中任一項之化合物，其中Y 1為
    Figure 03_image069
    ，或其鹽。
  113. 如請求項107-112中任一項之化合物，其中n為1，或其鹽。
  114. 如請求項107-112中任一項之化合物，其中n為2，或其鹽。
  115. 一種化合物或其鹽，該化合物選自： 固醇胺編號 結構 SA6
    Figure 03_image145
         SA7
    Figure 03_image147
         SA8
    Figure 03_image149
         SA12
    Figure 03_image154
         SA13
    Figure 03_image156
         SA14
    Figure 03_image158
         SA15
    Figure 03_image160
         SA16
    Figure 03_image162
         SA17
    Figure 03_image164
         SA18
    Figure 03_image166
         SA19
    Figure 03_image168
         SA20
    Figure 03_image170
         SA21
    Figure 03_image172
         SA24
    Figure 03_image176
         SA25
    Figure 03_image178
         SA26
    Figure 03_image180
         SA27
    Figure 03_image182
         SA28
    Figure 03_image184
         SA31
    Figure 03_image188
         SA32
    Figure 03_image190
         SA33
    Figure 03_image192
         SA34
    Figure 03_image194
         SA35
    Figure 03_image196
         SA36
    Figure 03_image198
         SA37
    Figure 03_image200
         SA38
    Figure 03_image202
         SA41
    Figure 03_image206
    及     SA42
    Figure 03_image226
    。
  116. 一種組成物，該組成物包含如請求項96-115中任一項之化合物或其鹽及醫藥學上可接受之載劑。
  117. 如請求項116之組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑為非離子賦形劑。
  118. 如請求項117之組成物，其中該非離子賦形劑為HS15。
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