CN116348147A

CN116348147A - 用于将有效载荷分子递送至气道上皮的组合物

Info

Publication number: CN116348147A
Application number: CN202180068470.XA
Authority: CN
Inventors: A·卡德特皮雷斯; J·C·宋; M·科恩比斯; J·赫卡奇
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2023-06-27
Also published as: US20230285310A1; KR20230087443A; EP4192433A2; BR112023001955A2; TW202214215A; CA3189854A1; IL300111A; WO2022032154A3; JP2023538260A; WO2022032154A2; MX2023001461A; AU2021320426A1

Abstract

本公开提供了包含有效载荷分子例如mRNA治疗剂的LNP，其用于治疗将受益于将有效载荷分子递送至气道细胞的疾病或病症。

Description

用于将有效载荷分子递送至气道上皮的组合物

背景技术

呼吸上皮细胞内衬于呼吸道。呼吸上皮细胞的主要功能是湿润呼吸道，保护气道免受潜在的病原体、感染和组织损伤，和/或促进气体交换。气道上皮细胞的功能障碍可导致许多病症，包括例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和囊性纤维化。将有效载荷递送至呼吸上皮细胞可用于诱导针对感兴趣的抗原的免疫并调节气道上皮细胞的功能，例如替代缺失或突变的蛋白质或增加或降低此类细胞的功能性。

例如，囊性纤维化(“CF”)是一种常染色体隐性疾病，其特征在于患者中又粘又稠的粘液的异常累积。CF也被称为胰腺的囊性纤维化、胰腺的纤维囊性疾病或粘液粘稠病(muscoviscidosis)。粘液是润滑和保护肺、生殖系统、消化系统和其他器官的重要体液。然而，CF患者产生又粘又稠的粘液，粘液减小气道的大小，导致慢性咳嗽、喘鸣、炎症、细菌感染、纤维化和肺囊肿。另外，大多数CF患者具有阻塞胰腺导管的粘液，该粘液防止胰岛素和消化酶释放，导致腹泻、营养不良、生长不良和体重减轻。Gershman A.J.等人,Cleve ClinJ Med.73:1065-1074(2006)。CF在高加索人出生时的估计发病率为2,500至3,500人中有1例，但在其他群体中更为罕见。Ratjen F.等人,Lancet 361:681-689(2003)。大多数当前CF治疗仅控制症状而不能治愈疾病。具体地，开具抗生素、抗炎药、支气管扩张剂、解充血药、高蛋白和高脂肪饮食及维生素补充剂的处方以控制症状。在晚期肺病中，还进行了肺移植以向患者提供未受损的肺。然而，这些治疗并未完全或可靠地控制疾病。已经出现专注于CF根本原因的新治疗方法。这些治疗调节具有Phe508del CFTR突变的患者的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)。Middleton P.J.等人,N Engl J Med.381:1809-1819(2019)。然而，每一百名CF患者中约有1个没有Phe508del CFTR突变，将他们从这种治疗中排除。

因此，需要改进的疗法来治疗与气道上皮细胞功能障碍相关的病症(例如CF)，靶向此类气道上皮细胞进行预防性疗法(例如免疫接种)，或治疗将受益于核酸分子或其他有效载荷分子向气道上皮细胞的治疗性递送的其他病症。

发明内容

本公开提供了用于将核酸分子(例如，mRNA治疗剂)递送至气道上皮细胞以治疗与气道上皮功能障碍相关的病症或获得患者的预防益处的LNP分子。在一个实施方案中，主题LNP分子可用于治疗与上皮细胞功能障碍相关的病症，诸如囊性纤维化(CF)、COPD或哮喘，以及用于施用疫苗有效载荷。本公开提供了LNP，其例如在体外和体内施用至细胞时具有改善的特性，例如，如例如通过LNP的细胞积聚、期望蛋白质的表达和/或mRNA表达所测量的，有效载荷至上皮细胞改善的递送。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(b)包封在所述核内用于递送到细胞中的多核苷酸或多肽有效载荷，以及

(c)主要置于所述核的外表面上的阳离子剂，

其中所述纳米颗粒在生理pH下具有大于中性的ζ电位。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，其包含：

(i)可电离脂质，

(ii)磷脂，

(iii)结构脂质，和

(iv)PEG-脂质，和

(c)阳离子剂。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒在上皮细胞中表现出至少约20％的细胞积聚并且在上皮细胞中表现出约5％或更高的表达。

在一个方面，本文提供了一种制备纳米颗粒的方法，所述方法包括使脂质纳米颗粒与阳离子剂接触，其中所述脂质纳米颗粒包含：

(a)脂质纳米颗粒核，其包含：

(i)可电离脂质，

(ii)磷脂，

(iii)结构脂质，和

(iv)PEG-脂质，和

(b)包封在所述核内用于递送到细胞中的多核苷酸或多肽有效载荷。

在一个方面，本文提供了通过本文所述的方法制备的纳米颗粒。

在一个方面，本文提供了将多核苷酸或多肽有效载荷递送到细胞中的方法，其包括使所述细胞与本文所述的纳米颗粒接触。

在一个方面，本文提供了治疗或防止患者的疾病的方法，其包括向所述患者施用包含有效载荷的纳米颗粒以治疗或防止如本文所述的疾病。

本发明的每个限制都可以涵盖本发明的各种实施方案。因此，预期本发明的牵涉任何一个要素或要素组合的每个限制都可以包括在本发明的每个方面中。本发明在其应用方面不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的组分的构造和排列的细节。本发明能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实践或进行。

附图说明

图1是用于制备LNP的示例性第一代事后装载(PHL)方法的图解。

图2是用于制备LNP的示例性第二代PHL方法(通用的)的图解。

图3是用于制备LNP的示例性第二代PHL方法(特定的)的图解。

图4是制备空脂质纳米颗粒原型(“中性组件”)的示例性方法的图解，其中空LNP在pH 8.0下混合且最终配制物为pH 5.0。

图5是用甾醇胺制备LNP的示例性方法的图解。

图6是LNP-1和LNP-1a的小角度x-射线散射(SAXS)分析。

图7是示出LNP-1和LNP-1a的Laurdan广义极性(GLP)的图。

具体实施方式

本公开提供了用于将核酸或有效载荷分子递送至气道上皮细胞的LNP分子。例如，此类LNP分子可用于向气道上皮细胞递送有效载荷分子，例如用于治疗囊性纤维化(CF)的mRNA治疗剂。例如，囊性纤维化(CF)是一种引起持续性肺部感染并随时间推移限制呼吸能力的进行性遗传疾病。该疾病的特征在于在囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的基因的两个拷贝中存在突变。在没有牵涉于汗液、消化液和粘液的产生的CFTR的情况下，通常稀薄的分泌物反而变稠。mRNA治疗剂特别适合于治疗CF，因为该技术提供编码CFTR的mRNA的细胞内递送，接着在靶细胞内从头合成功能性CFTR蛋白。在将mRNA递送至靶细胞后，期望的CFTR蛋白由细胞的自身翻译机制表达，因此全功能性CFTR蛋白替代缺陷蛋白或缺失的蛋白。在另一个实施方案中，此类LNP可用于递送用于基因编辑的核酸分子、小分子或其他有效载荷以改善上皮细胞功能障碍。在另一个实施方案中，此类LNP可用于将抗原递送至气道细胞。在一个实施方案中，抗原呈存在于LNP中的mRNA构建体的形式，该形式引起多肽或肽的表达，使得产生针对抗原的免疫应答。

脂质纳米颗粒(LNP)是用于将有效载荷分子(例如，mRNA)安全且有效地递送至靶细胞的理想平台。LNP具有通过牵涉细胞摄取、细胞内转运和内体释放或内体逃逸的机制递送核酸的独特能力。本文提供的一些实施方案的特征在于具有改善的特性的LNP。在一些实施方案中，本文提供的LNP包含脂质纳米颗粒核、包封在所述核内用于递送到细胞中的多核苷酸或多肽有效载荷，以及主要置于纳米颗粒的外表面上的阳离子剂。在不受特定理论束缚的情况下，具有主要置于所述核的外表面上的阳离子剂的LNP可以改善LNP在细胞诸如人支气管上皮(HBE)中的积聚并且还可以改善有效载荷分子的功能，例如，如通过细胞(例如气道上皮细胞)中的mRNA表达所测量的。

在一些实施方案中，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)主要置于所述核的外表面上的阳离子剂，

其中所述纳米颗粒在生理pH下具有大于中性的ζ电位。

在一些实施方案中，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，其包含：

(i)可电离脂质，

(ii)磷脂，

(iii)结构脂质，和

(iv)PEG-脂质，和

(c)阳离子剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，其包含：

(i)可电离脂质，

(ii)磷脂，

(iii)结构脂质，和

(iv)PEG-脂质，和

(c)主要置于所述核的外表面上的阳离子剂。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出细胞的至少约20％的细胞积聚并且在细胞中表现出约5％或更高的表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出细胞的约1％至约75％、5％至约50％、约10％至约40％或约15％至约25％的细胞积聚。在一些实施方案中，纳米颗粒在细胞中表现出约0.5％至约50％、约1％至约40％、约3％至约20％或约5％至约15％的表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)主要置于所述核的外表面上的阳离子剂，

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)主要置于所述核的外表面上的阳离子剂，

其中所述纳米颗粒在细胞中表现出约0.5％至50％的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒在细胞中表现出约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒在上皮细胞中表现出至少约20％的细胞积聚并且在上皮细胞中表现出约5％或更高的表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出上皮细胞的约1％至约75％、5％至约50％、约10％至约40％或约15％至约25％的细胞积聚。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出在上皮细胞中约0.5％至约50％、约1％至约40％、约3％至约20％或约5％至约15％的表达。在一些实施方案中，上皮细胞是HBE细胞。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出上皮细胞的约0.5％至50％的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出上皮细胞的约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在约0.5％至约50％的肺细胞中的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出肺细胞的约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在约0.5％至约50％的鼻细胞中的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出鼻细胞的约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在约0.5％至约50％的肺泡上皮细胞中的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出肺泡上皮细胞的约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在呼吸上皮细胞中至少约20％的细胞积聚并且表现出在呼吸上皮细胞中约5％或更高的表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出呼吸上皮细胞的约1％至约75％、5％至约50％、约10％至约40％或约15％至约25％的细胞积聚。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出在呼吸上皮细胞中约0.5％至约50％、约1％至约40％、约3％至约20％或约5％至约15％的表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在约0.5％至约50％的呼吸上皮细胞中的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出呼吸上皮细胞的约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在约0.5％至约50％的巨噬细胞中的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出巨噬细胞的约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在约0.5％至约50％的HeLa细胞中的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出HeLa细胞的约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在支气管上皮细胞中至少约20％的细胞积聚并且表现出在支气管上皮细胞中约5％或更高的表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出呼吸上皮细胞的约1％至约75％、5％至约50％、约10％至约40％或约15％至约25％的细胞积聚。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出在支气管上皮细胞中约0.5％至约50％、约1％至约40％、约3％至约20％或约5％至约15％的表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在约0.5％至约50％的支气管上皮细胞中的蛋白质表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出支气管上皮细胞的约0.1％至约60％、约0.5％至约40％、约1％至约30％或约1％至约20％的蛋白质表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在HBE细胞中至少约20％的细胞积聚并且表现出在HBE细胞中约5％或更高的表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出在HBE中约1％至约75％、5％至约50％、约10％至约40％或约15％至约25％的细胞积聚。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出在HBE细胞中约0.5％至约50％、约1％至约40％、约3％至约20％或约5％至约15％的表达。

在一个方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在健康HBE细胞中至少约20％的细胞积聚并且表现出在健康HBE细胞中约5％或更高的表达。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出在体外的健康HBE细胞中约1％至约75％、5％至约50％、约10％至约40％或约15％至约25％的细胞积聚。在一些实施方案中，纳米颗粒表现出在体外的健康HBE细胞中约0.5％至约50％、约1％至约40％、约3％至约20％或约5％至约15％的表达。

在一些实施方案中，上文和本文全篇提及的细胞可以是体外细胞或体内细胞。在一些实施方案中，所述细胞是体外细胞。在一些实施方案中，所述细胞是体内细胞。

在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒相对于基本上相同组成但没有后添加阳离子剂制备(例如，阳离子剂与预先形成的脂质纳米颗粒分层或接触)的纳米颗粒具有增加的细胞积聚(例如，在气道上皮细胞诸如HBE中)。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒相对于基本上相同组成但没有后添加阳离子剂制备(例如，阳离子剂与预先形成的脂质纳米颗粒分层或接触)的纳米颗粒具有增加的细胞表达(例如，在气道上皮细胞诸如HBE中)。

在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约0.1:1至约15:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约0.2:1至约10:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1:1至约10:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1:1至约8:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1:1至约7:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1:1至约6:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1:1至约5:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1:1至约4:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1.25:1至约3.75:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1.25:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约2.5:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约3.75:1。

在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约0.1:1至约20:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约1.5:1至约10:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约1.5:1至约9:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约1.5:1至约8:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约1.5:1至约7:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约1.5:1至约6:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约1.5:1至约5:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约1.5:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约2:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约3:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约4:1。在一些实施方案中，阳离子剂与多核苷酸有效载荷的摩尔比为约5:1。

在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒具有约5mV至约20mV的ζ电位。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约5mV至约15mV的ζ电位。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约5mV至约10mV的ζ电位。

ζ电位度量胶体分散体的表面电荷。ζ电位的大小指示分散体中相邻的类似带电颗粒之间的静电排斥程度。ζ电位可以在Wyatt Technologies Mobiusζ电位仪器上测量。该仪器通过“大规模平行相分析光散射”或MP-PALS的原理表征迁移率和ζ电位。该测量比ISO方法13099-1:2012(仅使用一个检测角度和操作所需的更高电压)更灵敏且更少的应力诱导。在一些实施方案中，使用采用MP-PALS原理的仪器测量本文所述的空脂质纳米颗粒组合物脂质的ζ电位。ζ电位可以在Malvern Zetasizer(Nano ZS)上测量。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒核在中性pH下具有中性电荷。

在一些实施方案中，大于约80％的阳离子剂在纳米颗粒的表面上。在一些实施方案中，大于约90％的阳离子剂在纳米颗粒的表面上。在一些实施方案中，大于约95％的阳离子剂在纳米颗粒的表面上。

在一些实施方案中，至少约50％的多核苷酸或多肽有效载荷包封在核内。在一些实施方案中，至少约75％的多核苷酸或多肽有效载荷包封在核内。在一些实施方案中，至少约90％的多核苷酸或多肽有效载荷包封在核内。在一些实施方案中，至少约95％的多核苷酸或多肽有效载荷包封在核内。

在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于约0.4的多分散性值。在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于约0.3的多分散性值。在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于约0.2的多分散性值。

在一些实施方案中，纳米颗粒具有约40nm至约150nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约50nm至约100nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约60nm至约120nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约60nm至约100nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约60nm至约80nm的平均直径。

在一些实施方式中，纳米颗粒的laurdan广义极化大于或等于约0.6。在一些实施方案中，纳米颗粒具有大于约6nm的d-间距。在一些实施方案中，纳米颗粒具有大于约7nm的d-间距。

在一些实施方案中，至少50％的纳米颗粒具有大于阈值极化水平的表面流动性值。在一些实施方案中，至少75％的纳米颗粒具有大于阈值极化水平的表面流动性值。在一些实施方案中，至少90％的纳米颗粒具有大于阈值极化水平的表面流动性值。在一些实施方案中，至少95％的纳米颗粒具有大于阈值极化水平的表面流动性值。

在一些实施方案中，当纳米颗粒与细胞群接触时，细胞群的约10％或更多已经积聚了纳米颗粒。在一些实施方案中，当纳米颗粒与细胞群接触时，细胞群的约15％或更多已经积聚了纳米颗粒。在一些实施方案中，当纳米颗粒与细胞群接触时，细胞群的约20％或更多已经积聚了纳米颗粒。在一些实施方案中，当纳米颗粒与细胞群接触时，约5％或更多的细胞表达多核苷酸或多肽。在一些实施方案中，当纳米颗粒与细胞群接触时，约10％或更多的细胞表达多核苷酸或多肽。在一些实施方案中，细胞群是上皮细胞群。在一些实施方案中，细胞群是呼吸上皮细胞群。在一些实施方案中，呼吸上皮细胞群是肺细胞群。在一些实施方案中，呼吸上皮细胞群是鼻细胞群。在一些实施方案中，呼吸上皮细胞群是肺泡上皮细胞群。在一些实施方案中，呼吸上皮细胞群是支气管上皮细胞群。在一些实施方案中，呼吸上皮细胞群是HBE群体。在一些实施方案中，细胞群是肺细胞群。在一些实施方案中，细胞群是鼻细胞群。在一些实施方案中，细胞群是肺泡上皮细胞群。在一些实施方案中，细胞群是支气管上皮细胞群。在一些实施方案中，细胞群是HBE群体。在一些实施方案中，细胞群是HeLa群体。

阳离子剂

阳离子剂可包含具有净正电荷并且可粘附于脂质纳米颗粒核的表面的任何水溶性分子或物质。此类试剂也可以是脂溶性的，但也将溶于水溶液。阳离子剂可以在生理pH下带电。生理pH是人体中通常观察到的pH水平。生理pH可以为约7.30-7.45或约7.35-7.45。生理pH可以为约7.40。一般来说，阳离子剂在生理pH下具有净正电荷，因为它含有一个或多个在生理pH下在水性介质中质子化的碱性官能团。例如，阳离子试剂可以含有一个或多个胺基，例如伯胺、仲胺或叔胺，每个胺基具有8.0或更大的pKa。pKa可以大于约9。

在一些实施方案中，阳离子剂可以是阳离子脂质，其为水溶性两亲分子，其中所述分子的一部分是疏水性的，包含例如脂质部分，并且其中所述分子的另一部分是亲水性的，含有一个或多个通常在生理pH下带电的官能团。包含脂质部分的疏水部分可用于将阳离子剂锚定到脂质纳米颗粒核上。亲水部分可用于增加脂质纳米颗粒核的表面上的电荷。例如，阳离子剂可在醇中具有大于约1mg/mL的溶解度。在醇中的溶解度可以大于约5mg/mL。在醇中的溶解度可以大于约10mg/mL。在醇中的溶解度可以在醇中大于约20mg/mL。所述醇可以是C_1-6醇诸如乙醇。

所述分子的脂质部分可以是例如结构脂质、脂肪酸或类似的烃基。

结构脂质可以选自但不限于类固醇、二萜、三萜、胆甾烷、熊果酸或其衍生物。

在一些实施方案中，结构脂质是选自但不限于胆固醇或植物固醇(phystosterol)的类固醇。在一些实施方案中，结构脂质为胆固醇的类似物。在一些实施方案中，结构脂质是谷甾醇(sitosterol)、菜油甾醇(campesterol)或豆甾醇(stigmasterol)。在一些实施方案中，结构脂质是谷甾醇、菜油甾醇或豆甾醇的类似物。在一些实施方案中，结构脂质是β-谷甾醇。

脂肪酸包含1至4条C_6-20烃链。脂肪酸可以是完全饱和的或者可以含有1至7个双键。脂肪酸可以含有1至5个杂原子，所述杂原子沿着主链或悬垂于主链。

在一些实施方案中，脂肪酸包含两条C_10-18烃链。在一些实施方案中，脂肪酸包含两条C_10-18饱和烃链。在一些实施方案中，脂肪酸包含两条C₁₆饱和烃链。在一些实施方案中，脂肪酸包含两条C₁₄饱和烃链。在一些实施方案中，脂肪酸包含两条不饱和的C_10-18烃链。在一些实施方案中，脂肪酸包含两条C_16-18烃链，每条链具有一个双键。在一些实施方案中，脂肪酸包含三条C_8-18饱和烃链。

烃基由1至4条C_6-20烷基、烯基或炔基链或3至10元环烷基、环烯基或环炔基组成。

在一些实施方案中，烃基链为C_8-10烷基。在一些实施方式中，烃基链为C_8-10烯基。

亲水部分可包含1至5个在生理pH 7.3至7.4下带电的官能团。亲水基团可包含在生理pH下将会质子化且带正电的碱性官能团。至少一个碱性官能团具有8或更大的pKa。

在一些实施方案中，亲水部分包含胺基。胺基可包含1至4个伯胺、仲胺或叔胺及其混合物。伯胺、仲胺或叔胺可以是含有选自但不限于-C(＝N-)-N-、-C＝C-N-、-C＝N-或-N-C(＝N-)-N-的官能团的较大胺的一部分。胺可以含在3至8元杂烷基或杂芳基环中。

在一些实施方案中，胺基包含一个或两个末端伯胺。在一些实施方案中，胺基包含一个或两个末端伯胺和一个内部仲胺。在一些实施方案中，胺基包含一个或两个叔胺。在一些实施方案中，叔胺是(CH₃)₂N-。在一些实施方案中，胺基包含一至两个末端(CH₃)₂N-。

亲水部分可包含鏻基。鏻离子的抗衡离子由带有一个电荷的阴离子组成。

在一些实施方案中，鏻上的三个取代基是异丙基。在一些实施方案中，抗衡离子是卤离子、硫酸氢根、亚硝酸根、氯酸根或碳酸氢根。在一些实施方案中，抗衡离子是溴离子。

在一些实施方案中，阳离子剂是阳离子脂质，其是甾醇胺。甾醇胺对于其疏水部分而言具有甾醇，并且对其亲水部分而言具有胺基。甾醇基团选自但不限于胆固醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或其衍生物。胺基可包含1至5个伯胺、仲胺、叔胺或其混合物。至少一个胺具有8或更大的pKa并且在生理pH下带电。伯胺、仲胺或叔胺可以是含有选自但不限于-C(＝N-)-N-、-C＝C-N-、-C＝N-或-N-C(＝N-)-N-的官能团的较大胺的一部分。胺可以含在3至8元杂烷基或杂芳基环中。

在一些实施方案中，甾醇胺的胺基包含一个或两个末端伯胺。在一些实施方案中，胺基包含一个或两个末端伯胺和一个内部仲胺。在一些实施方案中，胺基包含一个或两个叔胺。在一些实施方案中，叔胺是(CH₃)₂N-。在一些实施方案中，胺基包含一至两个末端(CH₃)₂N-。

可用于本发明的纳米颗粒中的甾醇胺包括具有式(A1)的分子：

A-L-B (A1)

或其盐，其中：

A是胺基，L是任选接头，并且B是甾醇。

在一些实施方案中，胺基为烷基(例如，C_1-14烷基、C_1-12烷基、C_1-10烷基等)、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)或C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)，其中所述烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)包含1至5个伯胺、仲胺或叔胺或其组合，其中所述烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)各自任选地被1、2、3或4个选自以下的取代基取代：C_1-6烷基、卤基、OH、O(C_1-6烷基)、C_1-6烷基-OH、NH₂、NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂、3至8元杂环烷基(任选地被包含1至5个伯胺、仲胺或叔胺或其组合的C_1-14烷基取代)、5至6元杂芳基、NH(3至8元杂环烷基)和NH(5至6元杂芳基)。在一些实施方案中，接头不存在，为-O-、-S-S-、-OC(＝O)、-C(＝O)N-、-OC(＝O)N-、CH₂-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH₂-CH₂-C(＝O)N-、-S-S-CH₂或-SS-CH₂-CH₂-C(O)N-。在一些实施方案中，甾醇基团是胆固醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或其衍生物。

在一些实施方案中，甾醇胺具有式A2a：

或其盐，其中：

----是单键或双键

R¹为C_1-14烷基或C_1-14烯基；

L^a不存在，为-O-、-S-S-、-OC(＝O)、-C(＝O)N-、-OC(＝O)N-、CH₂-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH₂-CH₂-C(＝O)N-、-S-S-CH₂、-SS-CH₂-CH₂-C(O)N-或式(a)的基团：

Y¹为C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)或C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)

其中所述烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合

其中所述烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)各自任选地被1、2、3或4个取代基取代，所述取代基选自C_1-6烷基、卤基、OH、O(C_1-6烷基)、C_1-6烷基-OH、NH₂、NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂、3至8元杂环烷基(任选地被包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合的C_1-14烷基取代)、5至6元杂芳基、NH(3至8元杂环烷基)和NH(5至6元杂芳基)；并且

n＝1或2。

在一些实施方案中，甾醇胺具有式A2a：

或其盐，其中：

----是单键或双键

R¹为C_1-14烷基或C_1-14烯基；

n＝1或2；

条件是式A2a的化合物不是：

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在一些实施方案中，----是双键。在一些实施方案中，----是单键。

在一些实施方案中，L^a为-OC(＝O)、-OC(＝O)N-或-OC(＝O)-CH₂-CH₂-C(＝O)N-。

在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。

在一些实施方案中，R¹为C_1-14烷基。在一些实施方案中，R¹为C_1-14烯基。在一些实施方案中，R¹为

在一些实施方案中，Y¹为C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、-C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)或-C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)，

其中所述C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、-C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和-C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合；

并且其中所述C_1-10烷基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)各自任选地被C_1-6烷基、OH、-C_1-6烷基-OH或NH₂取代。

在一些实施方案中，甾醇胺具有式A2：

或其盐，其中：

----是单键或双键

R¹为C_1-14烷基或C_1-14烯基；

L不存在，为-O-、-S-S-、-OC(＝O)、-C(＝O)N-、-OC(＝O)N-、CH₂-NH-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-CH₂-CH₂-C(＝O)N-、-S-S-CH₂或-SS-CH₂-CH₂-C(O)N-；

Y¹为C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)或C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)，

其中所述烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合，

n＝1或2。

在一些实施方案中，甾醇胺具有式A3a：

或其盐，其中：

----是单键或双键；

R²为H或C_1-6烷基；

n＝1或2。

在一些实施方案中，甾醇胺具有式A3a：

或其盐，其中：

----是单键或双键；

R²为H或C_1-6烷基；

n＝1或2；

条件是式A2a的化合物不是：

/>

/>

在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。

在一些实施方案中，R²为H。在一些实施方案中，R²为乙基。

在一些实施方案中，甾醇胺具有式A3：

或其盐，其中：

----是单键或双键；

R²为H或C_1-6烷基；

n＝1或2。

在一些实施方案中，Y¹选自：

(1)

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(3)

(4)/>

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(18)

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(22)

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(28)N(CH₃)₂；(29)/>

(30)/>

(31)/>

和(32)/>

在一些实施方案中，Y¹选自：

(1)

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(3)

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(7)

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(21)

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(24)

(25)/>

(26)

(27)/>

(28)N(CH₃)₂。

在一些实施方案中，甾醇胺具有式A4：

或其盐，其中：

Z¹为OH或C_3-6烷基；

n＝1或2。

在一些实施方案中，Z¹为OH。在一些实施方案中，Z¹为C_3-6烷基。

在一些实施方案中，L为-C(＝O)N-、-CH₂-NH-C(＝O)-或-C(＝O)O-。

在一些实施方案中，Y¹为包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合的C_1-10烷基。在一些实施方案中，Y¹为

在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，甾醇胺具有式A5：

或其盐，其中：

Z²为OH或异丙基；

L³为-CH₂-NH-C(O)-、-C(O)NH-或-C(O)O-。在一些实施方案中，甾醇胺选自：

表1

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或其盐。

在一些实施方案中，甾醇胺选自：

表2

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在一些实施方案中，甾醇胺选自：

表4

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或其盐。

在一些实施方案中，甾醇胺选自：

表5

或其盐。

在一些实施方案中，甾醇胺是SA3：

或其盐，其也称为GL-67。SA3或GL-67可根据本领域已知的方法制备或购自商业供应商诸如/>

PolarLipids,Inc.(SKU 890893)。

在一些实施方案中，阳离子脂质是经修饰的氨基酸，诸如经修饰的精氨酸，其中具有含胺侧链的氨基酸残基悬垂于疏水基团，诸如固醇(例如，胆固醇或其衍生物)、脂肪酸或类似烃基。经修饰的氨基酸部分的至少一个胺具有8.0或更大的pKa。经修饰的氨基酸部分的至少一个胺在生理pH下带正电。氨基酸残基可以包括但不限于精氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、鸟氨酸和5-羟基赖氨酸。氨基酸通过接头键合至疏水基团。

在一些实施方案中，经修饰的氨基酸是经修饰的精氨酸。

在一些实施方案中，阳离子剂是非脂质阳离子剂。非脂质阳离子剂的示例包括例如苯扎氯铵、氯化十六烷基吡啶、L-赖氨酸一水合物或氨丁三醇。

如本文总体定义的，术语“脂质”是指具有疏水性或两亲性的小分子。脂质可以是天然存在的或合成的。脂质类别的示例包括但不限于脂肪、蜡、含甾醇的代谢物、维生素、脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂和多聚酮，以及孕烯醇酮脂类。在一些情况下，一些脂质的两亲性导致它们在水性介质中形成脂质体、囊泡或膜。

可电离脂质

如本文所用，术语“可电离脂质”具有其在本领域中的普通含义并且可以指包含一个或多个带电部分的脂质。在一些实施方案中，可电离脂质可以带正电或带负电。例如，可电离脂质可以在较低pH下带正电，在这种情况下它可以被称为“阳离子脂质”。在某些实施方案中，可电离脂质分子可包含胺基，并且可以被称为可电离氨基脂质。如本文所用，“带电部分”是携带形式电子电荷的化学部分，例如为单价(+1或-1)、二价(+2或-2)、三价(+3或-3)等。带电部分可以是阴离子的(即，带负电)或阳离子的(即，带正电)。带正电的部分的示例包括胺基(例如，伯胺、仲胺和/或叔胺)、铵基、吡啶鎓基、胍基和咪唑鎓基。在一个特定实施方案中，带电部分包含胺基。带负电的基团或其前体的示例包括羧酸根基团、磺酸根基团、硫酸根基团、膦酸根基团、磷酸根基团、羟基基团等。带电部分的电荷在一些情况下可随环境条件而变化，例如，pH的变化可改变所述部分的电荷，和/或使所述部分变得带电或不带电。一般而言，可以根据需要选择分子的电荷密度。

应当理解，术语“带电的”或“带电部分”不是指分子上的“部分负电荷”或“部分正电荷”。术语“部分负电荷”和“部分正电荷”被给予本领域中的普通含义。“部分负电荷”可以在官能团包含某个键时产生，该键变得极化使得电子密度被拉向该键的一个原子，在该原子上产生部分负电荷。本领域的普通技术人员通常将认识到可以这种方式变得极化的键。

在一些实施方案中，可电离脂质是可电离氨基脂质。在一个实施方案中，可电离氨基脂质可以具有经由接头结构连接的带正电的亲水头部和疏水尾部。

在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒包含约30摩尔％至约60摩尔％的可电离脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含约40摩尔％至约50摩尔％的可电离脂质。

本发明的脂质纳米颗粒组合物可以包括一种或多种可电离(例如，可电离氨基)脂质(例如，在生理pH下可以具有正电荷或部分正电荷的脂质)。可电离脂质可选自由以下组成的非限制性组：3-(二-十二烷基氨基)-N1,N1,4-三-十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(二-十二烷基氨基)乙基]N1,N4,N4-三-十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-二-十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)、N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。除了这些之外，可电离脂质还可以是包含环状胺基的脂质。

可电离脂质也可以是在国际公布第WO 2017/075531 A1号中公开的化合物，该国际公布特此通过引用整体并入。例如，可电离氨基脂质包括但不限于：

及其任何组合。

可电离脂质也可以是在国际公布第WO 2015/199952 A1号中公开的化合物，该国际公布特此通过引用整体并入。例如，可电离氨基脂质包括但不限于：

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及其任何组合。

在一个实施方案中，可电离脂质可以选自但不限于国际公布第WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865、WO2008103276、WO2013086373和WO2013086354号，美国专利第7,893,302、7,404,969、8,283,333和8,466,122号以及美国专利公布第US20100036115、US20120202871、US20130064894、US20130129785、US20130150625、US20130178541和S20130225836号中描述的可电离脂质；这些参考文献中的每一个的内容通过引用整体并入本文。

在另一个实施方案中，可电离脂质可以选自但不限于国际公布第WO2013116126或US20130225836号中描述的式A；每个公开的内容通过引用整体并入本文。在又一个实施方案中，可电离脂质可以选自但不限于国际公布第WO2008103276号的式CLI-CLXXIX、美国专利第7,893,302号的式CLI-CLXXIX、美国专利第7,404,969号的式CLI-CLXXXXII以及美国专利公布第US20100036115号的式I-VI、美国专利公布第US20130123338号的式I；这些参考文献中的每一个通过引用整体并入本文。

作为非限制性示例，阳离子脂质可以选自(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五碳-l6,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二烷-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一烷-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三烷-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四烷-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七烷-18,21-二烯-10-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四烷-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三烷-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八烷-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七烷-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一烷-22,25-二烯-10-胺、(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十烷-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十七烷-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六烷-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八烷-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-l0-胺、1-[(11Z,14Z)-l-壬基二十碳-11,14-二烯-l-基]吡咯烷、(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-l0-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-l0-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-l0-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-l0-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-l0-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-l0-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-l0-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1–胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二烷-l3,16-二烯-l–胺、N,N-二甲基-l-[(lS,2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九烷-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九烷-10-胺、N,N-二甲基-21-[(lS,2R)-2-辛基环丙基]二十一烷-l0-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(lR,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九烷-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六烷-8-胺、N,N-二甲基-[(lR,2S)-2-十一烷基环丙基]十四烷-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二烷-1–胺、1-[(1R,2S)-2-庚基l环丙基]-N,N-二甲基十八烷-9–胺、1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五烷-6-胺、N,N-二甲基-l-[(lS,2R)-2-辛基环丙基]十五烷-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯烷、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧基]丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}氮杂环丁烷、(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八烷-6,9,12-三烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十二碳-l3,16-二烯-l-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六碳-9-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]辛基}氧基)丙-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基环丙基)辛基]氧基}-3-(辛氧基)丙-2-胺和(1lE,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-l1,20,2-三烯-10-胺或其药学上可接受的盐或立体异构体。

可电离脂质的其他示例包括以下：

在一个实施方案中，脂质可以是可裂解的脂质，诸如在国际公布第WO2012170889号中描述的那些，该国际公布通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，脂质可以通过本领域已知的方法和/或如国际公布第WO2013086354号中所述的方法合成；每个国际公布的内容通过引用整体并入本文。在另一个实施方案中，脂质可以是三烷基阳离子脂质。三烷基阳离子脂质的非限制性示例以及制备和使用三烷基阳离子脂质的方法描述于国际专利公布第WO2013126803号中，该国际专利公布的内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，可电离脂质可以是式(I)的化合物：

或其盐或异构体，其中：

R₁选自由H、C_5-30烷基、C_5-30烯基、-R*YR”、-YR”、-(CH₂)_n(NR₄)R”M’R’和-R”M’R’组成的组；

R₂和R₃独立地选自由H、C_1-14烷基、C_2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R₂和R₃连同其所连接的原子形成杂环或碳环，其中碳环任选地被C₆环烷基或C₅烷基取代；

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂、-CH(CH₂Q)₂和未取代的C_1-6烷基组成的组，其中C_3-6碳环任选地被-OH或-OMe取代；

每个Q独立地选自碳环、杂环、-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN、-N(R)₂、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)₂C(O)OR；

或Q选自：

每个n独立地选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、

-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)₂-、-S-S-、芳基和杂芳基；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

R₉选自由H、CN、NO₂、C_1-6烷基、-OR、-S(O)₂R、-S(O)₂N(R)₂、C_2-6烯基、C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组，其中C_1-3烷基任选地被-OH、-C(O)OH、-OMe、-O-苄基取代，

每个R’独立地选自由C_1-18烷基、C_2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组，其中C_1-18烷基任选地被-OMe取代；

每个R”独立地选自由H、C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。

在一些实施方案中，可电离脂质可以是式(I)的化合物：

或其盐或异构体，其中：

R₁选自由C_5-30烷基、C_5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；

R₂和R₃独立地选自由H、C_1-14烷基、C_2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R₂和R₃连同其所连接的原子形成杂环或碳环；

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂和未取代的C_1-6烷基组成的组，每个Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN、-N(R)₂、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR和–C(R)N(R)₂C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)₂-、-S-S-、芳基和杂芳基；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R’独立地选自由C_1-18烷基、C_2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；

每个R”独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。

在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括以下那些，其中当R₄为-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、–CHQR或-CQ(R)₂时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不为-N(R)₂，或(ii)当n为1或2时，Q不为5、6或7元杂环烷基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物的另一子集包括以下那些，或其盐或异构体，其中

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂和未取代的C_1-6烷基组成的组，其中Q选自C_3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基，-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-CRN(R)₂C(O)OR、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR以及具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，所述杂环烷基被一个或多个选自氧基(＝O)、OH、氨基、单-或二-烷基氨基和C_1-3烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R”独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂和未取代的C_1-6烷基组成的组，其中Q选自C_3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环，-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-CRN(R)₂C(O)OR、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR₉)N(R)₂，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q为5至14元杂环并且(i)R₄为-(CH₂)_nQ，其中n为1或2，或(ii)R₄为-(CH₂)_nCHQR，其中n为1，或(iii)R₄为-CHQR和-CQ(R)₂时，则Q为5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R”独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂和未取代的C_1-6烷基组成的组，其中Q选自C_3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基，-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-CRN(R)₂C(O)OR、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR₉)N(R)₂，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R”独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。

R₂和R₃独立地选自由H、C_2-14烷基、C_2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R₂和R₃连同其所连接的原子形成杂环或碳环；

R₄为-(CH₂)_nQ或-(CH₂)_nCHQR，其中Q为-N(R)₂，并且n选自3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R”独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_1-12烯基组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。

R₂和R₃独立地选自由C_1-14烷基、C_2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R₂和R₃连同其所连接的原子形成杂环或碳环；

R₄选自由-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR和-CQ(R)₂组成的组，其中Q为-N(R)₂，并且n选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R”独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_1-12烯基组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。

在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括式(IA)的那些：

或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M₁是键或M’；R₄是未取代的C_1-3烷基或-(CH₂)_nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)₂、-NHC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)R₈、-NHC(＝NR₉)N(R)2、-NHC(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R₂和R₃独立地选自由H、C_1-14烷基和C_2-14烯基组成的组。

在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括式(II)的那些：

或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M₁是键或M’；R₄是未取代的C_1-3烷基或-(CH₂)_nQ，其中n为2、3或4，并且Q为OH、-NHC(S)N(R)₂、-NHC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)R₈、-NHC(＝NR₉)N(R)₂、-NHC(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R₂和R₃独立地选自由H、C_1-14烷基和C_2-14烯基组成的组。

在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)的那些：

/>

或其盐或异构体，其中R₄如本文所述。

在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括式(IId)的那些：

或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R’、R”和R₂至R₆如本文所述。例如，R₂和R₃中的每一个独立地选自由C_5-14烷基和C_5-14烯基组成的组。

在一些实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

在其他实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：

在一些实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：

/>

/>

/>

/>

/>

/>

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/>

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及其盐和异构体。

在一些实施方案中，可电离脂质是化合物429：

或其盐。

在一些实施方案中，可电离脂质是化合物18：

或其盐。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包括包含如本文所述的化合物(例如，根据式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的化合物)的脂质组分。

在一些实施方案中，LNP可以由包含中心哌嗪部分的可电离脂质组成。此类LNP有利地可以由可电离脂质、磷脂和PEG脂质组成，并且可以任选地包括结构脂质或者可以缺乏结构脂质。在一些实施方案中，磷脂是DSPC或DOP。

本文所述的包括中心哌嗪部分的可电离脂质可有利地用于脂质纳米颗粒组合物中，以将治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物的细胞或器官。例如，本文所述的脂质几乎没有免疫原性。例如，与参考脂质(例如，MC3、KC2或DLinDMA)相比，本文公开的脂质化合物具有较低的免疫原性。例如，与包含参考脂质(例如，MC3、KC2或DLinDMA)和治疗剂或预防剂的相应配制物相比，包含本文公开的脂质和相同治疗剂或预防剂的配制物具有增加的治疗指数。

脂质可以是式(III)的化合物，

或其盐或异构体，其中

环A为

t为1或2；

A₁和A₂各自独立地选自CH或N；

Z是CH₂或不存在，其中当Z是CH₂时，虚线(1)和(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)都不存在；

R₁、R₂、R₃、R₄和R₅独立地选自由C_5-20烷基、C_5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；

每个M独立地选自由-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)₂-、芳基和杂芳基组成的组；

X¹、X²和X³独立地选自由键、-CH₂-、-(CH₂)₂-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)-、-C(O)O-CH₂-、-OC(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)O-、-CH₂-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基和C_3-6碳环组成的组；

每个R’独立地选自由C_1-12烷基、C_2-12烯基和H组成的组；并且

每个R”独立地选自由C_3-12烷基和C_3-12烯基组成的组，

其中当环A为

时，则

i)X¹、X²和X³中的至少一者不是-CH₂-；和/或

ii)R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少一者为-R”MR'。

在一些实施方案中，所述化合物具有式(IIIa1)-(IIIa6)中的任一个：

式(III)或(IIIa1)-(IIIa6)中任一个的化合物在适用时包括以下的一种或多种特征。

在一些实施方案中，环A为

在一些实施方案中，环A为

在一些实施方案中，环A为

在一些实施方案中，环A为

在一些实施方案中，环A为

在一些实施方案中，环A为

其中在环中，N原子与X²连接。

在一些实施方案中，Z为CH₂。

在一些实施方案中，Z不存在。

在一些实施方案中，A₁和A₂中的至少一者为N。

在一些实施方案中，A₁和A₂中的每一者均为N。

在一些实施方案中，A₁和A₂中的每一个均为CH。

在一些实施方案中，A₁为N且A₂为CH。

在一些实施方案中，A₁为CH且A₂为N。

在一些实施方案中，X¹、X²和X³中的至少一者不是-CH₂-。例如，在某些实施方案中，X¹不是-CH₂-。在一些实施方案中，X¹、X²和X³中的至少一者为-C(O)-。

在一些实施方案中，X²为-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)-、-C(O)O-CH₂-、-OC(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)O-或-CH₂-OC(O)-。

在一些实施方案中，X³为-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)-、-C(O)O-CH₂-、-OC(O)-CH₂-、-CH2-C(O)O-或-CH₂-OC(O)-。在其他实施方案中，X³为-CH₂-。

在一些实施方案中，X³为键或–(CH₂)₂-。

在一些实施方案中，R₁和R₂是相同的。在某些实施方案中，R₁、R₂和R₃是相同的。在一些实施方案中，R₄和R₅是相同的。在某些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅是相同的。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少一者为-R”MR'。在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至多一者为-R”MR'。例如，R₁、R₂和R₃中的至少一者可以是-R”MR’，和/或R₄和R₅中的至少一者为-R”MR’。在某些实施方案中，至少一个M是-C(O)O-。在一些实施方案中，每个M均为-C(O)O-。在一些实施方案中，至少一个M为-OC(O)-。在一些实施方案中，每个M均为-OC(O)-。在一些实施方案中，至少一个M为-OC(O)O-。在一些实施方案中，每个M均为-OC(O)O-。在一些实施方案中，至少一个R”为C₃烷基。在某些实施方案中，每个R”均为C₃烷基。在一些实施方案中，至少一个R”为C₅烷基。在某些实施方案中，每个R”均为C₅烷基。在一些实施方案中，至少一个R”为C₆烷基。在某些实施方案中，每个R”均为C₆烷基。在一些实施方案中，至少一个R”为C₇烷基。在某些实施方案中，每个R”均为C₇烷基。在一些实施方案中，至少一个R’为C₅烷基。在某些实施方案中，每个R’均为C₅烷基。在其他实施方案中，至少一个R’为C₁烷基。在某些实施方案中，每个R’均为C₁烷基。在一些实施方案中，至少一个R’为C₂烷基。在某些实施方案中，每个R’均为C₂烷基。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少一者为C₁₂烷基。在某些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的每一个均为C₁₂烷基。

在某些实施方案中，所述化合物选自由以下项组成的组：

/>

/>

/>

/>

/>

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/>

/>

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/>

在其他实施方案中，脂质具有式(IV)

或其盐或异构体，其中

A₁和A₂各自独立地选自CH或N并且A₁和A₂中至少一者为N；

R₁、R₂、R₃、R₄和R₅独立地选自由C_6-20烷基和C_6-20烯基组成的组；

其中当环A为

时，则

i)R₁、R₂、R₃、R₄和R₅是相同的，其中R₁不是C₁₂烷基、C₁₈烷基或C₁₈烯基；

ii)R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中仅一者选自C_6-20烯基；

iii)R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少一者具有与R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少另一者不同的碳原子数；

iv)R₁、R₂和R₃选自C_6-20烯基，并且R₄和R₅选自C_6-20烷基；或

v)R₁、R₂和R₃选自C_6-20烷基，并且R₄和R₅选自C_6-20烯基。

在一些实施方案中，所述化合物具有式(IVa)：

式(IV)或式(IVa)的化合物在适用时包括以下的一种或多种特征。

在一些实施方案中，Z为CH₂。

在一些实施方案中，Z不存在。

在一些实施方案中，A₁和A₂中的至少一者为N。

在一些实施方案中，A₁和A₂中的每一者均为N。

在一些实施方案中，A₁和A₂中的每一个均为CH。

在一些实施方案中，A₁为N且A₂为CH。

在一些实施方案中，A₁为CH且A₂为N。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅是相同的，并且不是C₁₂烷基、C₁₈烷基或C₁₈烯基。在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅是相同的并且是C₉烷基或C₁₄烷基。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中仅一者选自C_6-20烯基。在某些此类实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅具有相同的碳原子数。在一些实施方案中，R₄选自C_5-20烯基。例如，R₄可以是C₁₂烯基或C₁₈烯基。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少一者具有与R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少另一者不同的碳原子数。

在某些实施方案中，R₁、R₂和R₃选自C_6-20烯基，并且R₄和R₅选自C_6-20烷基。在其他实施方案中，R₁、R₂和R₃选自C_6-20烷基，并且R₄和R₅选自C_6-20烯基。在一些实施方案中，R₁、R₂和R₃具有相同的碳原子数，和/或R₄和R₅具有相同的碳原子数。例如，R₁、R₂和R₃，或R₄和R₅可具有6、8、9、12、14或18个碳原子。在一些实施方案中，R₁、R₂和R₃，或R₄和R₅为C₁₈烯基(例如，亚油基)。在一些实施方案中，R₁、R₂和R₃，或R₄和R₅是包含6、8、9、12或14个碳原子的烷基。

在一些实施方案中，R₁具有与R₂、R₃、R₄和R₅不同的碳原子数。在其他实施方案中，R3具有与R₁、R₂、R₄和R₅不同的碳原子数。在其他实施方案中，R4具有与R₁、R₂、R₃和R₅不同的碳原子数。

在一些实施方案中，所述化合物选自由以下组成的组：

/>

/>

在其他实施方案中，所述化合物具有式(V)

或其盐或异构体，其中

A₃为CH或N；

A₄为CH₂或NH；并且A₃和A₄中的至少一者为N或NH；

R₁、R₂和R₃独立地选自由C_5-20烷基、C_5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；

每个M独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)₂-、芳基和杂芳基；

X¹和X²独立地选自由-CH₂-、-(CH₂)₂-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)-、-C(O)O-CH₂-、-OC(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)O-、-CH₂-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基和C_3-6碳环组成的组；

每个R”独立地选自由C_3-12烷基和C_3-12烯基组成的组。

在一些实施方案中，所述化合物具有式(Va)：

式(V)或式(Va)的化合物在适用时包括以下的一种或多种特征。

在一些实施方案中，Z为CH₂。

在一些实施方案中，Z不存在。

在一些实施方案中，A₃和A₄中的至少一者为N或NH。

在一些实施方案中，A₃为N且A₄为NH。

在一些实施方案中，A₃为N且A₄为CH₂。

在一些实施方案中，A₃为CH且A₄为NH。

在一些实施方案中，X¹和X²中的至少一者不是-CH₂-。例如，在某些实施方案中，X¹不是-CH₂-。在一些实施方案中，X¹和X²中的至少一者为-C(O)-。

在一些实施方案中，R₁、R₂和R₃独立地选自由C_5-20烷基和C_5-20烯基组成的组。在一些实施方案中，R₁、R₂和R₃是相同的。在某些实施方案中，R₁、R₂和R₃为C₆、C₉、C₁₂或C₁₄烷基。在其他实施方案中，R₁、R₂和R₃为C₁₈烯基。例如，R₁、R₂和R₃可以是亚油基。

在一些实施方案中，所述化合物选自由以下组成的组：

在另一方面，本公开提供了根据式(VI)的化合物：

或其盐或异构体，其中

A₆和A₇各自独立地选自CH或N，其中A₆和A₇中至少一者为N；

X⁴和X⁵独立地选自由-CH₂-、-(CH₂)₂-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)-、-C(O)O-CH₂-、-OC(O)-CH₂-、-CH₂-C(O)O-、-CH₂-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-组成的组；

R₁、R₂、R₃、R₄和R₅各自独立地选自由C_5-20烷基、C_5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；

每个M独立地选自由-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)₂-、芳基和杂芳基组成的组；

每个Y独立地为C_3-6碳环；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基和C_3-6碳环组成的组；

每个R”独立地选自由C_3-12烷基和C_3-12烯基组成的组。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅各自独立地选自由C_6-20烷基和C_6-20烯基组成的组。

在一些实施方案中，R₁和R₂是相同的。在某些实施方案中，R₁、R2和R3是相同的。在一些实施方案中，R₄和R₅是相同的。在某些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅是相同的。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少一者为C_9-12烷基。在某些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的每一个独立地为C₉、C₁₂或C₁₄烷基。在某些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的每一个均为C₉烷基。

在一些实施方案中，A₆为N且A₇为N。在一些实施方案中，A₆为CH且A₇为N。

在一些实施方案中，X₄为-CH₂-且X₅为-C(O)-。在一些实施方案中，X₄和X₅为-C(O)-。

在一些实施方案中，当A₆为N且A₇为N时，X₄和X₅中的至少一者不为-CH₂-，例如，X₄和X₅中的至少一者为-C(O)-。在一些实施方案中，当A₆为N且A₇为N时，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少一者为-R”MR’。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的至少一者不为-R”MR'。

在一些实施方案中，所述化合物为

在一个实施方案中，所述化合物具有下式：

PEG和经PEG修饰的脂质

一般来说，本文所述的各式的一些其他脂质组分(例如PEG脂质)可如2016年12月10日提交的标题为“Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents”的国际专利申请第PCT/US2016/000129号中所述合成，所述专利申请通过引用整体并入。

脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可以包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，诸如PEG或经PEG修饰的脂质。此类物质可替代地称为PEG化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自包括经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油、经PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物的非限制性组。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。在一些实施方案中，PEG脂质是DMG-PEG 2k或化合物428。

在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质是PEG DMG的经修饰形式。PEG-DMG具有以下结构：

在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒包含约1摩尔％至约5摩尔％的PEG-脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含约1摩尔％至约2.5摩尔％的PEG-脂质。

在一个实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可为描述于国际公布第WO2012099755号中的PEG化脂质，所述公布的内容通过引用整体并入本文。本文所述的这些示例性PEG脂质中的任一者均可经修饰为在PEG链上包含羟基。在某些实施方案中，PEG脂质是PEG-OH脂质。如本文一般所定义，“PEG-OH脂质”(本文中也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)基团的PEG化脂质。在某些实施方案中，PEG-OH脂质包含在PEG链上的一个或多个羟基。在某些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质包含在PEG链的末端的-OH基团。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(VII)的化合物。本文提供了式(VII)的化合物：

或其盐，其中：

R³为-OR^O；

R^O为氢、任选取代的烷基或氧保护基；

r是1至100的整数，包括端值；

L¹是任选取代的C_1-10亚烷基，其中所述任选取代的C_1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、–O–、–N(R^N)–、–S–、–C(O)–、–C(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–OC(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)O–或–NR^NC(O)N(R^N)–替换；

D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；

m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

A具有下式：

L²的每个示例独立地是键或任选取代的C_1-6亚烷基，其中所述任选取代的C_1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被–O–、–N(R^N)–、–S–、–C(O)–、–C(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–OC(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)O–或–NR^NC(O)N(R^N)–替换；

R²的每个示例独立地为任选取代的C_1-30烷基、任选取代的C_1-30烯基或任选取代的C_1-30炔基；任选地其中R²的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、–N(R^N)–、–O–、–S–、–C(O)–、–C(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)–、–NR^NC(O)N(R^N)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–OC(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)O–、–C(O)S–、–SC(O)–、–C(＝NR^N)–、–C(＝NR^N)N(R^N)–、–NR^NC(＝NR^N)–、–NR^NC(＝NR^N)N(R^N)–、–C(S)–、–C(S)N(R^N)–、–NR^NC(S)–、–NR^NC(S)N(R^N)–、–S(O)–、–OS(O)–、–S(O)O–、–OS(O)O–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–OS(O)₂O–、–N(R^N)S(O)–、–S(O)N(R^N)–、–N(R^N)S(O)N(R^N)–、–OS(O)N(R^N)–、–N(R^N)S(O)O–、–S(O)₂–、–N(R^N)S(O)₂–、–S(O)₂N(R^N)–、–N(R^N)S(O)₂N(R^N)–、–OS(O)₂N(R^N)–或–N(R^N)S(O)₂O–替换；

R^N的每个示例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；

环B为任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；以及

p为1或2。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物是PEG-OH脂质(即，R³为–OR^O，并且R^O为氢)。在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有式(VII-OH)：

或其盐。

在某些实施方案中，D是通过点击化学获得的部分(例如，三唑)。在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有式(VII-a-1)或(VII-a-2)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有下式之一：

或其盐，其中

s为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有下式之一，其中r为1-100：

或其盐。

在某些实施方案中，D是在生理条件下可裂解的部分(例如，酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、脲)。在某些实施方案中，式(VII)的化合物是式(VII-b-1)或式(VII-b-2)的化合物：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有式(VII-b-1-OH)或式(VII-b-2-OH)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VII)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是PEG化的脂肪酸。在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(VIII)的化合物。本文提供了式(VIII)的化合物：

或其盐，其中：

R³为–OR^O；

R^O为氢、任选取代的烷基或氧保护基；

r是1至100的整数，包括端值；

R⁵是任选取代的C_10-40烷基、任选取代的C_10-40烯基或任选取代的C_10-40炔基；并且任选地R⁵的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、–N(R^N)–、–O–、–S–、–C(O)–、–C(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)–、–NR^NC(O)N(R^N)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–OC(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)O–、–C(O)S–、–SC(O)–、–C(＝NR^N)–、–C(＝NR^N)N(R^N)–、–NR^NC(＝NR^N)–、–NR^NC(＝NR^N)N(R^N)–、–C(S)–、–C(S)N(R^N)–、–NR^NC(S)–、–NR^NC(S)N(R^N)–、–S(O)–、–OS(O)–、–S(O)O–、–OS(O)O–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–OS(O)₂O–、–N(R^N)S(O)–、–S(O)N(R^N)–、–N(R^N)S(O)N(R^N)–、–OS(O)N(R^N)–、–N(R^N)S(O)O–、–S(O)₂–、–N(R^N)S(O)₂–、–S(O)₂N(R^N)–、–N(R^N)S(O)₂N(R^N)–、–OS(O)₂N(R^N)–或–N(R^N)S(O)₂O–替换；并且

R^N的每个示例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。

在某些实施方案中，式(VIII)的化合物具有式(VIII-OH)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(VIII)的化合物具有下式之一：

或其盐。在一些实施方案中，r为45。

在某些实施方案中，式(VIII)的化合物具有下式之一：

/>

或其盐。在一些实施方案中，r为45。

在其他实施方案中，式(VIII)的化合物为：

或其盐。

在一些实施方案中，式(VIII)的化合物为

在某些实施方案中，PEG脂质是下式之一：

或其盐。在一些实施方案中，r为45。

磷脂

如本文所定义的磷脂是包含磷酸基团的任何脂质。磷脂是非阳离子脂质的子集。脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可以包括一种或多种磷脂，诸如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可组装成一个或多个脂质双层。一般而言，磷脂可以包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。磷脂部分可以选自由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。脂肪酸部分可以选自由以下项组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二烷酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。还考虑了非天然物质，包括具有修饰和取代的天然物质，所述修饰和取代包括支化、氧化、环化和炔烃。例如，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键替换的烯基)官能化或与一种或多种炔烃交联。在适当的反应条件下，炔基可在暴露于叠氮化物时经历铜催化的环加成。此类反应可用于使纳米颗粒组合物的脂质双层官能化以促进膜渗透或细胞识别，或用于使纳米颗粒组合物缀合至有用组分，诸如靶向部分或成像部分(例如，染料)。

在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒包含约5摩尔％至约15摩尔％的磷脂。在一些实施方案中，纳米颗粒包含约8摩尔％至约13摩尔％的磷脂。在一些实施方案中，纳米颗粒包含约10摩尔％至约12摩尔％的磷脂。

在所述组合物和方法中有用或可能有用的磷脂可选自由以下项组成的非限制性组：

1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、

1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、

1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、

1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、

1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、

1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、

1,2-双十一烷酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、

1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、

1,2-二-O-十八碳烯-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、

1-油酰-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、

1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、

1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、

1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、

1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、

1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、

1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(4ME 16:0PC)、

1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(钠盐)(4ME 16:0PG)、1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(4ME 16:0PS)、

1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、

1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、

1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、

1,2-双二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和

1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)以及鞘磷脂。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含DSPC。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含DOPE。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含DSPC和DOPE两者。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含：

1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(4ME 16:0PE)

1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(4ME 16:0PC)

1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(钠盐)(4ME 16:0PG)或

1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(4ME 16:0PS)

或其混合物。

磷脂的示例包括但不限于以下：

/>

/>

在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂是DSPC的类似物或变体。

在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂是式(IX)的化合物：

或其盐，其中：

每个R¹独立地为H或任选取代的烷基；或者任选地两个R¹与居间原子接合在一起以形成任选取代的单环碳环基或任选取代的单环杂环基；或者任选地三个R¹与居间原子接合在一起以形成任选取代的双环碳环基或任选取代的双环杂环基；

n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

A具有下式：

R^N的每个示例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；

p为1或2；

条件是所述化合物不具有下式：

其中R²的每个示例独立地为未取代的烷基、未取代的烯基或未取代的炔基。

或其盐，其中：

每个R¹独立地为任选取代的烷基；或者任选地两个R¹与居间原子接合在一起以形成任选取代的单环碳环基或任选取代的单环杂环基；或者任选地三个R¹与居间原子接合在一起以形成任选取代的双环碳环基或任选取代的双环杂环基；

n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

A具有下式：

R^N的每个示例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；

p为1或2；

条件是所述化合物不具有下式：

磷脂头部修饰

在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含经修饰的磷脂头部(例如，经修饰的胆碱基团)。在某些实施方案中，具有经修饰的头部的磷脂是具有经修饰的季胺的DSPC或其类似物。例如，在式(IX)的实施方案中，至少一个R¹不是甲基。在某些实施方案中，至少一个R¹不是氢或甲基。在某些实施方案中，式(IX)的化合物具有下式之一：

或其盐，其中：

每个t独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

每个u独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且

每个v独立地为1、2或3。

在某些实施方案中，式(IX)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX)的化合物是以下的一种：

/>

/>

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX)的化合物具有式(IX-a)：

或其盐。

在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含经修饰的核。在某些实施方案中，本文所述的具有经修饰的核的磷脂是具有经修饰的核结构的DSPC或其类似物。例如，在式(IX-a)的某些实施方案中，基团A不具有下式：

在某些实施方案中，式(IX-a)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX)的化合物是以下的一种：

或其盐。

在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含环状部分代替甘油酯部分。在某些实施方案中，在本发明中有用的磷脂是DSPC或其类似物，其具有环状部分代替甘油酯部分。在某些实施方案中，式(IX)的化合物具有式(IX-b)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物具有式(IX-b-1)：

/>

或其盐，其中：

w为0、1、2或3。

在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物具有式(IX-b-2)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物具有式(IX-b-3)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物具有式(IX-b-4)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物是以下的一种：

或其盐。

磷脂尾部修饰

在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含经修饰的尾部。在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂是具有经修饰的尾部的DSPC或其类似物。如本文所述，“经修饰的尾部”可以是具有较短或较长脂族链、引入支链的脂族链、引入取代基的脂族链、其中一个或多个亚甲基由环状或杂原子基团替换的脂族链或它们的任何组合的尾部。例如，在某些实施方案中，(IX)的化合物具有式(IX-a)，或其盐，其中R²的至少一个示例为R²的每个示例为任选取代的C_1-30烷基，其中R²的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、–N(R^N)–、–O–、–S–、–C(O)–、–C(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)–、–NR^NC(O)N(R^N)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–OC(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)O–、–C(O)S–、–SC(O)–、–C(＝NR^N)–、–C(＝NR^N)N(R^N)–、–NR^NC(＝NR^N)–、–NR^NC(＝NR^N)N(R^N)–、–C(S)–、–C(S)N(R^N)–、–NR^NC(S)–、–NR^NC(S)N(R^N)–、–S(O)–、–OS(O)–、–S(O)O–、–OS(O)O–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–OS(O)₂O–、–N(R^N)S(O)–、–S(O)N(R^N)–、–N(R^N)S(O)N(R^N)–、–OS(O)N(R^N)–、–N(R^N)S(O)O–、–S(O)₂–、–N(R^N)S(O)₂–、–S(O)₂N(R^N)–、–N(R^N)S(O)₂N(R^N)–、–OS(O)₂N(R^N)–或–N(R^N)S(O)₂O–替换。

在某些实施方案中，式(IX)的化合物具有式(IX-c)：

或其盐，其中：

每个x独立地为0-30之间的整数，包括0和30；并且

G的每个示例独立地选自由以下组成的组：任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、–N(R^N)–、–O–、–S–、–C(O)–、–C(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)–、–NR^NC(O)N(R^N)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–OC(O)N(R^N)–、–NR^NC(O)O–、–C(O)S–、–SC(O)–、–C(＝NR^N)–、–C(＝NR^N)N(R^N)–、–NR^NC(＝NR^N)–、–NR^NC(＝NR^N)N(R^N)–、–C(S)–、–C(S)N(R^N)–、–NR^NC(S)–、–NR^NC(S)N(R^N)–、–S(O)–、–OS(O)–、–S(O)O–、–OS(O)O–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–OS(O)₂O–、–N(R^N)S(O)–、–S(O)N(R^N)–、–N(R^N)S(O)N(R^N)–、–OS(O)N(R^N)–、–N(R^N)S(O)O–、–S(O)₂–、–N(R^N)S(O)₂–、–S(O)₂N(R^N)–、–N(R^N)S(O)₂N(R^N)–、–OS(O)₂N(R^N)–或–N(R^N)S(O)₂O–。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物具有式(IX-c-1)：

或其盐，其中：

v的每个示例独立地为1、2或3。

在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物具有式(IX-c-2)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物具有下式：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为以下：

或其盐。/>

在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物具有式(IX-c-3)：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物具有下式：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为以下：

或其盐。

在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含经修饰的磷酸胆碱部分，其中将季胺连接至磷酰基的烷基链不是亚乙基(例如，n不是2)。因此，在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂是式(IX)的化合物，其中n为1、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，式(IX)的化合物具有下式之一：

或其盐。

在某些实施方案中，式(IX)的化合物是以下的一种：

/>

或其盐。

替代脂质

在某些实施方案中，使用替代脂质代替本发明的磷脂。此类替代脂质的非限制性示例包括以下：

/>

结构脂质

脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可以包括一种或多种结构脂质。在脂质纳米颗粒中掺入结构脂质可帮助减轻颗粒中其他脂质的聚集。结构脂质可选自包括但不限于以下的组：胆固醇、粪固醇、谷甾醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、番茄碱(tomatidine)、番茄素(tomatine)、熊果酸、α-生育酚、藿烷、植物固醇、类固醇以及它们的混合物。在一些实施方案中，结构脂质为固醇。如本文所定义，“固醇”是由类固醇类醇组成的类固醇子组。在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。在某些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。结构脂质的示例包括但不限于以下：

在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒可包含约20摩尔％至约60摩尔％的结构脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含约30摩尔％至约50摩尔％的结构脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含约35摩尔％的结构脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含约40摩尔％的结构脂质。在一些实施方案中，结构脂质是胆固醇或具有以下结构的化合物：

有效载荷分子

本公开的组合物可用于将多种不同的剂递送至气道细胞。气道细胞可以是衬于呼吸道中，例如衬于口、鼻、喉或肺部中的细胞。治疗剂能够介导(例如，直接介导或经由旁观者效应)此类气道细胞中的治疗效果。通常，由所述组合物递送的治疗剂是核酸，但本公开也涵盖非核酸剂，诸如小分子、化疗药物、肽、多肽和其他生物分子。可以递送的核酸包括基于DNA的分子(即，包括脱氧核糖核苷酸)和基于RNA的分子(即，包括核糖核苷酸)。此外，核酸可以是所述分子的天然存在的形式或所述分子的化学修饰形式(例如，包含一个或多个经修饰的核苷酸)。

用于增强蛋白质表达的剂

在一个实施方案中，治疗剂是增强(即，增加、刺激、上调)蛋白质表达的剂。可用于增强蛋白质表达的治疗剂类型的非限制性示例包括RNA、mRNA、dsRNA、CRISPR/Cas9技术、ssDNA和DNA(例如，表达载体)。

在一个实施方案中，治疗剂是DNA治疗剂。DNA分子可为双链DNA、单链DNA(ssDNA)或作为部分双链DNA的分子(即，具有双链部分和单链部分)。在一些情况下，DNA分子是三链的或是部分三链的(即，具有三链部分和双链部分)。DNA分子可为环状DNA分子或线性DNA分子。

DNA治疗剂可为能够将基因转移至细胞中，例如编码转录物并且可表达转录物的DNA分子。例如，DNA治疗剂可以编码感兴趣的蛋白质，从而在通过LNP递送时增加感兴趣的蛋白质在气道中的表达。在一些实施方案中，DNA分子可以是天然来源的，例如分离自天然来源。在其他实施方案中，DNA分子是合成分子，例如体外产生的合成DNA分子。在一些实施方案中，DNA分子是重组分子。非限制性示例性DNA治疗剂包括质粒表达载体和病毒表达载体。

本文所述的DNA治疗剂(例如DNA载体)可包括多种不同特征。本文所述的DNA治疗剂(例如DNA载体)可包括非编码DNA序列。例如，DNA序列可包括针对基因的至少一种调控元件，例如启动子、增强子、终止元件、多聚腺苷酸化信号元件、剪接信号元件等。在一些实施方案中，非编码DNA序列是内含子。在一些实施方案中，非编码DNA序列是转座子。在一些实施方案中，本文所述的DNA序列可具有可操作性连接至转录活性基因的非编码DNA序列。在其他实施方案中，本文所述的DNA序列可具有未连接至基因的非编码DNA序列，即所述非编码DNA不调控所述DNA序列上的基因。

在一些实施方案中，有效载荷包含遗传调节因子，即系统的至少一种组分，该组分例如通过改变核碱基，例如引入插入、缺失、突变(例如，错义突变、沉默突变或无义突变)、复制或倒置或它们的任何组合来修饰DNA分子中的核酸序列。在一些实施方案中，遗传调节因子包括DNA碱基编辑器、CRISPR/Cas基因编辑系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)系统、大范围核酸酶系统或转座酶系统或它们的任何组合。

在一些实施方案中，遗传调节因子包含模板DNA。在一些实施方案中，遗传调节因子不包含模板DNA。在一些实施方案中，遗传调节因子包含模板RNA。在一些实施方案中，遗传调节因子不包含模板RNA。

在一些实施方案中，遗传调节因子是CRISPR/Cas基因编辑系统。在一些实施方案中，该CRISPR/Cas基因编辑系统包含：指导RNA(gRNA)分子，其包含对靶基因的序列具有特异性的靶向序列；和具有核酸酶活性(例如，核酸内切酶活性)的肽，例如Cas蛋白或其片段(例如，生物活性片段)或其变体，例如Cas9蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；Cas3蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；Cas12a蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；Cas 12e蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；Cas 13蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；或Cas14蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体。

在一些实施方案中，该CRISPR/Cas基因编辑系统包含：gRNA分子，其包含对靶基因的序列具有特异性的靶向序列；和编码具有核酸酶活性(例如，核酸内切酶活性)的肽的核酸，所述肽例如，Cas蛋白或其片段(例如，生物活性片段)或变体，例如Cas9蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；Cas3蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；Cas12a蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；Cas12e蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；Cas13蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；或Cas14蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体。

在一些实施方案中，该CRISPR/Cas基因编辑系统包含：编码gRNA分子的核酸，该gRNA分子包含对靶基因的序列具有特异性的靶向序列；和Cas9蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体。

在一些实施方案中，该CRISPR/Cas基因编辑系统包含：编码gRNA分子的核酸，该gRNA分子包含对靶基因的序列具有特异性的靶向序列；和编码Cas9蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体的核酸。

在一些实施方案中，该CRISPR/Cas基因编辑系统还包含模板DNA。在一些实施方案中，该CRISPR/Cas基因编辑系统还包含模板RNA。在一些实施方案中，该CRISPR/Cas基因编辑系统还包含逆转录酶。

在本文公开的任何方法、组合物或细胞的一些实施方案中，遗传调节因子是锌指核酸酶(ZFN)系统。在一些实施方案中，ZFN系统包含具有以下的肽：锌指DNA结合结构域、其片段(例如，生物活性片段)或变体；和/或核酸酶活性，例如核酸内切酶活性。在一些实施方案中，ZFN系统包含具有锌指DNA结合结构域的肽。在一些实施方案中，锌指结合结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个锌指。在一些实施方案中，ZFN系统包含具有核酸酶活性例如核酸内切酶活性的肽。在一些实施方案中，具有核酸酶活性的肽是II型限制性1样核酸内切酶，例如FokI核酸内切酶。在一些实施方案中，ZFN系统包含编码具有以下的肽的核酸：锌指DNA结合结构域、其片段(例如，生物活性片段)或变体；和/或核酸酶活性，例如核酸内切酶活性。

在一些实施方案中，ZFN系统包含编码具有锌指DNA结合结构域的肽的核酸。在一些实施方案中，锌指结合结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个锌指。在一些实施方案中，ZFN系统包含编码具有核酸酶活性例如核酸内切酶活性的肽的核酸。在一些实施方案中，具有核酸酶活性的肽是II型限制性1样核酸内切酶，例如FokI核酸内切酶。

在一些实施方案中，所述系统还包含模板，例如模板DNA。

在本文公开的任何方法、组合物或细胞的一些实施方案中，遗传调节因子是转录激活物样效应核酸酶(TALEN)系统。在一些实施方案中，所述系统包含具有以下的肽：转录激活物样(TAL)效应DNA结合结构域、其片段(例如，生物活性片段)或变体；和/或核酸酶活性，例如核酸内切酶活性。在一些实施方案中，所述系统包含具有TAL效应DNA结合结构域、其片段(例如，生物活性片段)或变体的肽。在一些实施方案中，所述系统包含具有核酸酶活性例如核酸内切酶活性的肽。在一些实施方案中，具有核酸酶活性的肽是II型限制性1样核酸内切酶，例如FokI核酸内切酶。

在一些实施方案中，所述系统包含编码具有以下的肽的核酸：转录激活物样(TAL)效应DNA结合结构域、其片段(例如，生物活性片段)或变体；和/或核酸酶活性，例如核酸内切酶活性。在一些实施方案中，所述系统包含编码具有以下的肽的核酸：转录激活物样(TAL)效应DNA结合结构域、其片段(例如，生物活性片段)或变体。在一些实施方案中，所述系统包含编码具有核酸酶活性例如核酸内切酶活性的肽的核酸。在一些实施方案中，具有核酸酶活性的肽是II型限制性1样核酸内切酶，例如FokI核酸内切酶。

在一些实施方案中，所述系统还包含模板，例如模板DNA。

在本文公开的任何方法、组合物或细胞的一些实施方案中，遗传调节因子是大范围核酸酶系统。在一些实施方案中，大范围核酸酶系统包含具有DNA结合结构域和核酸酶活性例如归巢核酸内切酶的肽。在一些实施方案中，归巢核酸内切酶包括LAGLIDADG核酸内切酶、GIY-YIG核酸内切酶、HNH核酸内切酶、His-Cys盒核酸内切酶或PD-(D/E)XK核酸内切酶或其片段(例如，生物活性片段)或变体，例如，如Silva G.等人,(2011)Curr Gene Therapy11(1):11-27中所述。

在一些实施方案中，大范围核酸酶系统包含编码具有DNA结合结构域和核酸酶活性例如归巢核酸内切酶的肽的核酸。在一些实施方案中，归巢核酸内切酶包括LAGLIDADG核酸内切酶、GIY-YIG核酸内切酶、HNH核酸内切酶、His-Cys盒核酸内切酶或PD-(D/E)XK核酸内切酶或其片段(例如，生物活性片段)或变体，例如，如Silva G.等人,(2011)Curr GeneTherapy 11(1):11-27中所述。

在一些实施方案中，所述系统还包含模板，例如模板DNA。

在本文公开的任何方法、组合物或细胞的一些实施方案中，遗传调节因子是转座酶系统。在一些实施方案中，转座酶系统包含编码具有逆转录酶和/或核酸酶活性的肽的核酸序列，例如逆转录转座子，例如LTR逆转录转座子或非LTR逆转录转座子。在一些实施方案中，转座酶系统包含模板，例如RNA模板。

在一个实施方案中，治疗剂是RNA治疗剂。RNA分子可为单链RNA、双链RNA(dsRNA)或作为部分双链RNA的分子(即，具有双链部分和单链部分)。RNA分子可为环状RNA分子或线性RNA分子。

RNA治疗剂可以是能够将基因转移到细胞中，例如，编码感兴趣的蛋白质，从而增加气道细胞中感兴趣的蛋白质的表达的RNA治疗剂。在一些实施方案中，RNA分子可以是天然来源的，例如分离自天然来源。在其他实施方案中，RNA分子是合成分子，例如体外产生的合成RNA分子。

RNA治疗剂的非限制性示例包括信使RNA(mRNA)(例如，编码感兴趣的蛋白质)、经修饰的mRNA(mmRNA)、掺入微RNA结合位点(miR结合位点)的mRNA、包含功能性RNA元件的经修饰的RNA、微RNA(miRNA)、miRNA拮抗剂(antagomir)、小(短)干扰RNA(siRNA)(包括短小体(shortmer)和dicer-底物RNA)、RNA干扰(RNAi)分子、反义RNA、核酶、小发夹RNA(shRNA)、锁核酸(LNA)以及编码CRISPR/Cas9技术组分的RNA，这些中的每一种在以下小节中进一步描述。在一些实施方案中，RNA调节因子包含RNA碱基编辑系统。在一些实施方案中，RNA碱基编辑系统包含：脱氨酶，例如RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)；Cas蛋白、其片段(例如，生物活性片段)或变体；和/或指导RNA。在一些实施方案中，RNA碱基编辑系统还包含模板，例如DNA或RNA模板。

mRNA可为天然或非天然存在的mRNA。mRNA可包括一个或多个如下文所述的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸，在所述情况下其可被称为“经修饰的mRNA”或“mmRNA”。如本文所述，“核苷”被定义为含有与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称为“核碱基”)组合的糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。如本文所述，“核苷酸”被定义为包括磷酸酯基的核苷。

mRNA可包括5'非翻译区(5'-UTR)、3'非翻译区(3'-UTR)和/或编码区(例如开放阅读框)。mRNA可包括任何合适数目的碱基对，包括数十个(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个)、数百个(例如，200、300、400、500、600、700、800或900个)或数千个(例如，1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000个)碱基对。任何数目(例如，全部、一些或无)的核碱基、核苷或核苷酸均可为规范物质的类似物，被取代、被修饰或以其他方式非天然存在。在某些实施方案中，特定核碱基类型的全部可被修饰。

在一些实施方案中，如本文所述的mRNA可包括5'帽结构、链终止核苷酸、任选地Kozak序列(也称为Kozak共有序列)、茎环、polyA序列和/或多聚腺苷酸化信号。

5'帽结构或帽物质是包括通过接头接合的两个核苷部分的化合物并且可选自天然存在的帽、非天然存在的帽或帽类似物或抗-反向帽类似物(ARCA)。帽物质可包括一个或多个经修饰的核苷和/或接头部分。例如，天然mRNA帽可包括鸟嘌呤核苷酸和在7位置处甲基化的鸟嘌呤(G)核苷酸，由所述核苷酸的5'位置处的三磷酸酯键接合，例如m7G(5')ppp(5')G，通常书写为m7GpppG。帽物质还可为抗-反向帽类似物。可能的帽物质的非限制性列表包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG、m27,O3'GpppG、m27,O3'GppppG、m27,O2'GppppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG、m27,O3'GpppG、m27,O3'GppppG和m27,O2'GppppG。

mRNA可替代地或另外包括链终止核苷。例如，链终止核苷可包括在其糖基的2'和/或3'位置处脱氧的那些核苷。此类物质可包括3'脱氧腺苷(蛹虫草菌素(cordycepin))、3'脱氧尿苷、3'脱氧胞嘧啶、3'脱氧鸟苷、3'脱氧胸腺嘧啶和2',3'二脱氧核苷(诸如2',3'二脱氧腺苷、2',3'二脱氧尿苷、2',3'二脱氧胞嘧啶、2',3'二脱氧鸟苷和2',3'二脱氧胸腺嘧啶)。在一些实施方案中，将链终止核苷酸例如在3′-末端掺入mRNA中，可导致mRNA稳定化，如例如在国际专利公布第WO 2013/103659号中所述。

mRNA可替代地或另外包括茎环，诸如组蛋白茎环。茎环可包括2、3、4、5、6、7、8个或更多个核苷酸碱基对。例如，茎环可包括4、5、6、7或8个核苷酸碱基对。茎环可位于mRNA的任何区域中。例如，茎环可位于非翻译区(5'非翻译区或3'非翻译区)、编码区或polyA序列或尾部中、之前或之后。在一些实施方案中，茎环可影响mRNA的一种或多种功能，诸如翻译起始、翻译效率和/或转录终止。

mRNA可替代地或另外包括polyA序列和/或多聚腺苷酸化信号。polyA序列可完全地或主要包含腺嘌呤核苷酸或其类似物或衍生物。polyA序列可为与mRNA的3'非翻译区相邻定位的尾部。在一些实施方案中，polyA序列可影响mRNA的核输出、翻译和/或稳定性。

mRNA可替代地或另外包括微小RNA结合位点。

在一些实施方案中，mRNA是包含第一编码区和第二编码区的双顺反子mRNA，所述编码区具有包含允许第一编码区与第二编码区之间的内部翻译起始的内部核糖体进入位点(IRES)序列的居间序列，或具有编码自裂解肽(诸如2A肽)的居间序列。IRES序列和2A肽典型地用于增强来自同一载体的多种蛋白质的表达。多种IRES序列是已知的并且在本领域中可获得并且可加以使用，包括例如脑心肌炎病毒IRES。

在一些实施方案中，本公开的mRNA包含一个或多个经修饰的核碱基、核苷或核苷酸(称为“经修饰的mRNA”或“mmRNA”)。在一些实施方案中，经修饰的mRNA可具有适用特性，包括如与参考未修饰mRNA相比，增强的稳定性、细胞内保留、增强的翻译和/或缺乏其中引入所述mRNA的细胞的先天免疫反应的实质诱导。因此，经修饰mRNA的使用可增强蛋白质产生效率、核酸的细胞内保留，以及具有降低的免疫原性。

在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如，1、2、3或4个)不同的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个)不同的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，相对于相应的未修饰mRNA，经修饰mRNA可在其中引入所述mRNA的细胞中具有降低的降解。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤基-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酰甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酰甲基-假尿苷、5-牛磺酰甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酰甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2'-F-阿拉伯糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、立西啶(lysidine，k2C)、α-硫代-胞苷、2'-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞苷、2'-F-阿拉伯糖-胞苷、2'-F-胞苷和2'-OH-阿拉伯糖-胞苷。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括a-硫代-腺苷、2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤基-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫代-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫代-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2'-F-阿拉伯糖-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-阿拉伯糖-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括a-硫代-鸟苷、肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、修饰不足的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m22G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟苷(m2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2'-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2'-F-阿拉伯糖-鸟苷和2'-F-鸟苷。

在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。在一个实施方案中，经修饰的核碱基是N1-甲基假尿苷(m1ψ)，并且本公开的mRNA经N1-甲基假尿苷(m1ψ)完全修饰。在一些实施方案中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)表示mRNA中的75-100％尿嘧啶。在一些实施方案中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)表示mRNA中的100％尿嘧啶。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括7-脱氮-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基是1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷或α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。

在一些实施方案中，mRNA包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，mRNA包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，mRNA包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，mRNA包含2'-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。

在某些实施方案中，本公开的mRNA是针对特定修饰均一地被修饰(即，完全被修饰、通过整个序列修饰)。例如，mRNA可均一地被N1-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)修饰，意指mRNA序列中的所有尿苷或所有胞嘧啶核苷均被N1-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)代替。类似地，本公开的mRNA可通过用经修饰残基(诸如上文所陈述的那些)代替而针对存在于所述序列中的任何类型的核苷残基均一地被修饰。

在一些实施方案中，本公开的mRNA可在编码区(例如，编码多肽的开发阅读框)中被修饰。在其他实施方案中，mRNA可在除编码区之外的区中被修饰。例如，在一些实施方案中，提供5'-UTR和/或3'-UTR，其中任一者或两者可独立地含有一种或多种不同的核苷修饰。在此类实施方案中，核苷修饰还可存在于编码区中。

可存在于本公开的mmRNA中的核苷修饰及其组合的示例包括但不限于以下PCT专利申请公开中描述的那些：WO2012045075、WO2014081507、WO2014093924、WO2014164253和WO2014159813。

本公开的mmRNA可包括对糖、核碱基和/或核苷间键的修饰的组合。这些组合可包括本文所述的任何一种或多种修饰。

在列出单一修饰的情况下，所列出的核苷或核苷酸表示100％的所述A、U、G或C核苷酸或核苷已被修饰。在列出百分率的情况下，这些表示所存在的A、U、G或C三磷酸酯的总量中所述百分率的所述特定A、U、G或C核碱基三磷酸酯。例如，组合：25％5-氨基烯丙基-CTP+75％ CTP/25％5-甲氧基-UTP+75％ UTP是指多核苷酸，其中25％的胞嘧啶三磷酸酯是5-氨基烯丙基-CTP，而75％的胞嘧啶是CTP；而25％的尿嘧啶是5-甲氧基UTP，而75％的尿嘧啶是UTP。在未列出经修饰UTP的情况下，则天然存在的ATP、UTP、GTP和/或CTP用于所述多核苷酸中发现的那些核苷酸的100％位点中。在此示例中，所有GTP和ATP核苷酸均保持未被修饰。

本公开的mRNA可通过本领域中可获得的方式，包括但不限于体外转录(IVT)和合成方法产生。可使用酶促(IVT)、固相、液相、组合合成方法、小区域合成和连接方法。在一个实施方案中，使用IVT酶促合成方法制备mRNA。通过IVT制备多核苷酸的方法是本领域已知的并且描述于国际申请PCT/US2013/30062中，该申请的内容通过引用整体并入本文。因此，本公开还包括可用于体外转录本文所述的mRNA的多核苷酸，例如DNA、构建体和载体。

非天然修饰的核碱基可在合成期间或合成后引入多核苷酸(例如，mRNA)中。在某些实施方案中，修饰可在核苷间键、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。在特定实施方案中，修饰可引入在多核苷酸链的末端处或所述多核苷酸链中的任何其他位置；使用化学合成或使用聚合酶。经修饰的核酸及其合成的示例公开于PCT申请第PCT/US2012/058519号中。经修饰的多核苷酸的合成也描述于Verma和Eckstein,Annual Review of Biochemistry,第76卷,99-134(1998)中。

酶促或化学连接方法可用于将多核苷酸或它们的区域与不同的功能部分(诸如靶向剂或递送剂、荧光标记、液体、纳米颗粒等)缀合。多核苷酸和经修饰的多核苷酸的缀合物综述于Goodchild,Bioconjugate Chemistry,第1卷(3),165-187(1990)。

用于减少蛋白质表达的治疗剂

在一个实施方案中，治疗剂是减少(即，降低、抑制、下调)蛋白质表达的治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂减少目标气道细胞中的蛋白质表达。可用于减少蛋白质表达的治疗剂类型的非限制性示例包括掺入微RNA结合位点(miR结合位点)的mRNA、微RNA(miRNA)、miRNA拮抗剂、小(短)干扰RNA(siRNA)(包括短小体和dicer-底物RNA)、RNA干扰(RNAi)分子、反义RNA、核酶、小发夹RNA(shRNA)、锁核酸(LNA)和CRISPR/Cas9技术。

肽/多肽治疗剂

在一个实施方案中，治疗剂是肽治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂是多肽治疗剂。

在一些实施方案中，治疗性有效载荷或预防性有效载荷包含编码以下的mRNA：分泌性蛋白；膜结合蛋白；或细胞间蛋白，或肽、多肽或其生物活性片段。

在一些实施方案中，治疗性有效载荷或预防性有效载荷包含编码分泌性蛋白、肽、多肽或其生物活性片段的mRNA。在一些实施方案中，治疗性有效载荷或预防性有效载荷包含编码膜结合蛋白质、肽、多肽或其生物活性片段的mRNA。在一些实施方案中，治疗性有效载荷或预防性有效载荷包含编码细胞内蛋白、肽、多肽或其生物活性片段的mRNA。在一些实施方案中，治疗性有效载荷或预防性有效载荷包括蛋白质、多肽或肽。

在一些实施方案中，所述肽或多肽是天然来源的，例如从天然来源分离。在其他实施方案中，所述肽或多肽是合成分子，例如体外产生的合成肽或多肽。在一些实施方案中，所述肽或多肽是重组分子。在一些实施方案中，所述肽或多肽是嵌合分子。在一些实施方案中，所述肽或多肽是融合分子。在一个实施方案中，所述组合物的肽或多肽治疗剂是天然存在的肽或多肽。在一个实施方案中，所述组合物的肽或多肽治疗剂是天然存在的肽或多肽的经修饰形式(例如，与其野生型、天然存在的肽或多肽对应物相比，含有少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个或少于25个氨基取代、缺失或添加)。

包含阳离子剂的LNP

本发明的LNP包含LNP核和主要置于核的外表面上的阳离子剂。此类LNP在生理pH下具有大于中性的ζ电位。

核脂质纳米颗粒通常包含以下的一种或多种组分：脂质(其可以包括可电离的氨基脂质、磷脂、辅助脂质，这些脂质可以是中性脂质、两性离子脂质、阴离子脂质等)、结构脂质(诸如胆固醇或胆固醇类似物)、脂肪酸、聚合物、稳定剂、盐、缓冲液、溶剂等。

本文提供的某些LNP核包含可电离脂质，诸如可电离脂质，例如可电离氨基脂质、磷脂、结构脂质且任选包含稳定剂(例如，包含聚乙二醇的分子)，稳定剂可以或可以不与另一种脂质缀合提供。

结构脂质可以是但不限于甾醇，诸如胆固醇。结构脂质可以是β-谷甾醇。

辅助脂质是非阳离子脂质。辅助脂质可包含至少一个至少8C的脂肪酸链和至少一个极性头基部分。

当使用包含聚乙二醇(即PEG)的分子时，其可用作稳定剂。在一些实施方案中，包含聚乙二醇的分子可以是与脂质缀合的聚乙二醇，因此可以例如以PEG-c-DOMG或PEG-DMG提供。本文提供的某些LNP不包含PEG化脂质或包含低水平的PEG化脂质，不包括烷基-PEG化脂质或包括低水平的烷基-PEG化脂质，并且在本文中可以被称为不含PEG或PEG化脂质。因此，一些LNP包含小于0.5摩尔％的PEG化脂质。在一些情况下，PEG可以是烷基-PEG，诸如甲氧基-PEG。还有其他LNP包含非烷基-PEG诸如羟基-PEG，和/或非烷基-PEG化脂质诸如羟基-PEG化脂质。本文提供的某些LNP包含高水平的PEG化脂质。一些LNP包含0.5摩尔％的PEG化脂质。一些LNP包含大于0.5摩尔％的PEG化脂质。在一些实施方案中，LNP包含1.5摩尔％的PEG化脂质。在一些实施方案中，LNP包含3.0摩尔％的PEG化脂质。在一些实施方案中，LNP包含0.1摩尔％至3.0摩尔％的PEG化脂质、0.5摩尔％至2.0摩尔％的PEG化脂质或1.0摩尔％至1.5摩尔％的PEG化脂质。

在一些实施方案中，纳米颗粒核组合物可具有化合物18:磷脂:胆固醇:N-月桂酰基-D-赤型-鞘氨醇磷酸胆碱的配制物，摩尔比为50:10:38.5:1.5。在一些实施方案中，纳米颗粒核组合物可具有化合物18:DSPC:胆固醇:化合物428的配制物，摩尔比为50:10:38.5:1.5。

化合物428：

本公开的纳米颗粒包含至少一种根据式(I)的化合物。例如，纳米颗粒组合物可以包括化合物1-147中的一种或多种。纳米颗粒还可以包括多种其他组分。例如，除了根据式(I)或式(II)的脂质之外，纳米颗粒组合物还可以包括一种或多种其他脂质，例如(i)至少一种磷脂，(ii)至少一种结构脂质，(iii)至少一种PEG-脂质，或(iv)它们的任何组合。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)和磷脂(例如，DSPC、DOPE或MSPC)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)和磷脂(例如，DSPC、DPPC、DOPE或MSPC)。

本公开还提供了制备纳米颗粒的方法，所述方法包括使脂质纳米颗粒与阳离子剂接触，其中所述脂质纳米颗粒包含：

(a)脂质纳米颗粒核，其包含：

(i)可电离脂质，

(ii)磷脂，

(iii)结构脂质，和

(iv)PEG-脂质，和

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒与阳离子剂的所述接触包括将所述阳离子剂溶解在非离子赋形剂中。在一些实施方案中，非离子赋型剂选自聚乙二醇15羟基硬脂酸酯(HS 15)、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2K)、化合物428、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯[

80]和d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)。在一些实施方案中，非离子赋形剂是聚乙二醇15羟基硬脂酸酯(HS 15)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒与阳离子剂的接触包括将阳离子剂溶解在缓冲溶液中。在一些实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，缓冲溶液是基于Tris的缓冲液。

提供了通过如本文所述的方法，例如通过使脂质纳米颗粒与阳离子剂接触制备的纳米颗粒。在一些实施方案中，阳离子剂可以是甾醇胺诸如GL-67。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的脂质纳米颗粒核任选地包含PEG-脂质。在一些实施方案中，形成与阳离子剂接触的脂质纳米颗粒的脂质纳米颗粒核基本上不含PEG-脂质。在一些实施方案中，在与阳离子剂接触之前或在与阳离子剂接触之后，将PEG-脂质与阳离子剂一起添加到脂质纳米颗粒中。

在一个实施方案中，本发明的LNP可以使用传统的混合技术制备，其中核酸有效载荷与核LNP组分混合以产生核LNP加上有效载荷。一旦制备了这种有载荷的核LNP，就使阳离子剂与有载荷的核LNP接触。

在另一个实施方案中，本发明的LNP可以使用空LNP作为起始点来制备。例如，如图1所示，在装载到核酸有效载荷中之前制备空LNP。一旦核酸有效载荷与LNP接触，就可以添加阳离子剂以形成本发明的LNP。

例如，在一个实施方案中，在事后装载(PHL)方法中，首先在纳米沉淀步骤中配制空LNP，并将缓冲液交换成低pH缓冲液(即pH 5)。接着，通过混合事件将这些空LNP引入mRNA(也在低pH下酸化)。在混合步骤之后，使用pH调节方法来中和pH。最后，添加PEG脂质，例如DMG-PEG-2k以使颗粒稳定。然后将这些颗粒浓缩至目标浓度并过滤。添加阳离子剂，例如GL67。

图2中说明了空LNP起始点的变型。图2显示使用LNP的脂质(不包括PEG脂质)形成空LNP。然后使核酸溶液与空LNP接触，形成有载荷的LNP。在进一步处理有载荷的LNP期间在一个点或两个点添加PEG脂质，并且可以在进一步处理期间的任何点添加阳离子剂，如图2中的虚线方框所示。图3是图2中的方法的更具体的版本，并且再次地，可以在进一步处理有载荷的LNP期间的任何点添加阳离子剂。

在一些实施方案中，本发明的LNP可以使用纳米沉淀来制备，纳米沉淀是单元操作，其中LNP通过动力学混合和随后的熟化和连续稀释从它们的单独脂质组分自组装。这种单元操作包括三个单独的步骤：水性和有机输入的混合，LNP的熟化，以及在受控停留时间之后的稀释。由于这些步骤的连续性质，将它们认为是一个单元操作。该单元操作包括具有一个在线成熟步骤的三个液体流的连续在线组合：将水性缓冲液与脂质储备溶液混合，通过控制停留时间进行熟化，及稀释纳米颗粒。纳米沉淀本身发生在适当规模的混合器中，该混合器设计成允许水溶液与溶解在乙醇中的脂质储备溶液的连续、高能量组合。在整个操作中，水溶液和脂质储备溶液都同时连续流入混合硬件中。保持脂质溶解的乙醇含量突然降低，并且脂质全部相互沉淀。因此颗粒在混合室中自组装。

单元操作的目的之一是将溶液交换到不含乙醇的全水性缓冲液中，并达到LNP的目标浓度。这可以通过首先达到目标处理浓度，然后渗滤，一旦乙醇被完全去除后，然后(如有必要)进行最终浓缩步骤来实现。

在一些方面，本公开提供了制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：

i)纳米沉淀步骤，其包括：

i-a)混合步骤，包括将包含可电离脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，从而形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；

i-b)将中间空LNP溶液保持停留时间；并且

i-c)将稀释溶液添加到中间空LNP溶液中，从而形成包含空LNP的空LNP溶液。

i)纳米沉淀步骤，其包括：

i-b)将中间空LNP溶液保持停留时间；

i-c)将稀释溶液添加到中间空LNP溶液中，从而形成包含空LNP的空LNP溶液；以及

ii)处理空LNP溶液。

ii)处理包含空LNP的空LNP溶液。

在一些方面，本公开提供了制备脂质纳米颗粒配制物(LNP配制物)的方法，所述方法包括：

i)纳米沉淀步骤，其包括：

i-b)将中间空LNP溶液保持停留时间；

ii)处理空LNP溶液；以及

iii)装载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与空LNP溶液混合，从而形成包含有载荷的脂质纳米颗粒(有载荷的LNP)的有载荷的LNP溶液。

i)纳米沉淀步骤，其包括：

i-b)将中间空LNP溶液保持停留时间；

ii)处理空LNP溶液；

iii)装载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与空LNP溶液混合，从而形成包含有载荷的脂质纳米颗粒(有载荷的LNP)的有载荷的LNP溶液；以及

iv)处理有载荷的LNP溶液，从而形成有载荷的LNP配制物。

i)纳米沉淀步骤，其包括：

i-b)将中间空LNP溶液保持停留时间；

ii)处理空LNP溶液；

iii)装载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与空LNP溶液混合，从而形成包含有载荷的脂质纳米颗粒(有载荷的LNP)的有载荷的LNP溶液；

iv)处理有载荷的LNP溶液，从而形成有载荷的LNP配制物；以及

v)添加阳离子剂。

iii)装载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与包含空LNP的空LNP溶液混合，从而形成包含有载荷的脂质纳米颗粒(有载荷的LNP)的有载荷的纳米颗粒溶液(有载荷的LNP溶液)。

iii)装载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与包含空LNP的空LNP溶液混合，从而形成包含有载荷的脂质纳米颗粒(有载荷的LNP)的有载荷的纳米颗粒溶液(有载荷的LNP溶液)；以及

iv)处理有载荷的LNP溶液，从而形成有载荷的LNP配制物。

iii)装载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与包含空LNP的空LNP溶液混合，从而形成包含有载荷的脂质纳米颗粒(有载荷的LNP)的有载荷的纳米颗粒溶液(有载荷的LNP溶液)

iv)处理有载荷的LNP溶液，从而形成有载荷的LNP配制物；以及

v)添加阳离子剂。

在一些实施方案中，步骤i-a)至i-c)在独立的操作单元(例如，独立的反应装置)中进行。

在一些实施方案中，步骤i-a)至i-c)在单个操作单元中进行。在一些实施方案中，步骤i-a)至i-c)在连续流装置中进行，使得步骤i-c)在步骤i-b)的下游，步骤i-b)在步骤i-a)的下游。

在一些实施方案中，在步骤i-c)中，添加一次稀释溶液。

在一些实施方案中，在步骤i-c)中，连续添加稀释溶液。

在一些方面，本公开提供了产生空脂质纳米颗粒(空LNP)的方法，所述方法包括：i)混合步骤，包括将可电离脂质与第一缓冲剂混合，从而形成空LNP，其中所述空LNP包含约0.1摩尔％至约0.5摩尔％的聚合脂质(例如，PEG脂质)。

i)混合步骤，包括将包含可电离脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，从而形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)。

i)混合步骤，包括将包含可电离脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，从而形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)；并且

ii)处理空LNP溶液。

在一些实施方案中，混合步骤包括将包含可电离脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，从而形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)。

在一些方面，本公开提供了制备与核酸缔合的有载荷的脂质纳米颗粒(有载荷的LNP)的方法，所述方法包括：ii)装载步骤，包括将核酸与空LNP混合，接着添加阳离子剂，从而形成有载荷的LNP。

在一些实施方案中，装载步骤包括将包含核酸的核酸溶液与空LNP溶液混合，接着添加阳离子剂，从而形成包含有载荷的LNP的有载荷的脂质纳米颗粒溶液(有载荷的LNP溶液)。

在一些实施方案中，使空LNP或空LNP溶液经受装载步骤而无需保持或储存。

在一些实施方案中，使空LNP或空LNP溶液在保持一段时间后经受装载步骤。

在一些实施方案中，使空LNP或空LNP溶液在保持约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时或约24小时后经受装载步骤。

在一些实施方案中，使空LNP或空LNP溶液在储存约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年后经受装载步骤。

在一些实施方案中，在形成后，使空LNP或空LNP溶液经受装载步骤而无需储存或保持一段时间。

在一些方面，本公开提供了一种方法，所述方法还包括：ii)处理空LNP溶液。

在一些方面，本公开提供了一种方法，所述方法还包括：iv)处理有载荷的LNP溶液，从而形成脂质纳米颗粒配制物(LNP配制物)。

与其他生产技术(例如，薄膜再水合/挤压)形成对比，乙醇滴沉淀(ethanol-dropprecipitation)已成为用于生成核酸脂质纳米颗粒的工业标准。沉淀反应因其连续性、可扩展性和易用性而受到青睐。这些方法通常使用高能混合器(例如，T形接头、受限冲击射流、微流体混合器、涡旋混合器)以可控方式将脂质(在乙醇中)引入合适的反溶剂(即水)中，驱动液体过饱和并自发沉淀成脂质颗粒。在一些实施方案中，所用的涡旋混合器是描述于美国专利申请第62/799,636号和第62/886,592号中的那些，所述美国专利申请通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，所用的微流体混合器是描述于PCT申请第WO/2014/172045号中的那些，所述PCT申请通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器进行所述混合步骤。

在一些实施方案中，用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器进行所述装载步骤。

在一些实施方案中，混合步骤在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下进行。

在一些实施方案中，装载步骤在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下进行。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，其包括向空LNP或有载荷的LNP中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，其包括向空LNP溶液中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，其包括向空LNP中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，处理有载荷的LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，其包括向有载荷的LNP溶液中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，处理有载荷的LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，其包括向有载荷的LNP中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，第一添加步骤包括向空LNP溶液或有载荷的LNP溶液中添加包含PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，其包括向空LNP或有载荷的LNP中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，其包括向空LNP溶液中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，其包括向空LNP中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，处理有载荷的LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，其包括向有载荷的LNP溶液中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，处理有载荷的LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，其包括向有载荷的LNP中添加聚乙二醇脂质(PEG脂质)。

在一些实施方案中，第二添加步骤包括向空LNP溶液或有载荷的LNP溶液中添加包含PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)。

在一些实施方案中，第一添加步骤包括向空LNP或有载荷的LNP中添加约0.1摩尔％至约3.0摩尔％的PEG、约0.2摩尔％至约2.5摩尔％的PEG、约0.5摩尔％至约2.0摩尔％的PEG、约0.75摩尔％至约1.5摩尔％的PEG、约1.0摩尔％至约1.25摩尔％的PEG。

在一些实施方案中，第一添加步骤包括向空LNP或有载荷的LNP中添加约0.1摩尔％至约3.0摩尔％的PEG、约0.2摩尔％至约2.5摩尔％的PEG、约0.5摩尔％至约2.0摩尔％的PEG、约0.75摩尔％至约1.5摩尔％的PEG、约1.0摩尔％至约1.25摩尔％的PEG。在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加约0.1摩尔％、约0.2摩尔％、约0.3摩尔％、约0.4摩尔％、约0.5摩尔％、约0.6摩尔％、约0.7摩尔％、约0.8摩尔％、约0.9摩尔％、约1.0摩尔％、约1.1摩尔％、约1.2摩尔％、约1.3摩尔％、约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％、约2.0摩尔％、约2.1摩尔％、约2.2摩尔％、约2.3摩尔％、约2.4摩尔％、约2.5摩尔％、约2.6摩尔％、约2.7摩尔％、约2.8摩尔％、约2.9摩尔％或约3.0摩尔％的PEG脂质(例如，PEG_2k-DMG)。

在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加约1.75±0.5摩尔％、约1.75±0.4摩尔％、约1.75±0.3摩尔％、约1.75±0.2摩尔％或约1.75±0.1摩尔％(例如，约1.75摩尔％)的PEG脂质(例如，PEG_2k-DMG)。

在一些实施方案中，在第一添加步骤之后，空LNP溶液(例如，空LNP)包含约1.0摩尔％、约1.1摩尔％、约1.2摩尔％、约1.3摩尔％、约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％、约2.0摩尔％、约2.1摩尔％、约2.2摩尔％、约2.3摩尔％、约2.4摩尔％、约2.5摩尔％、约2.6摩尔％、约2.7摩尔％、约2.8摩尔％、约2.9摩尔％、约3.0摩尔％、约3.1摩尔％、约3.2摩尔％、约3.3摩尔％、约3.4摩尔％、约3.5摩尔％、约3.6摩尔％、约3.7摩尔％、约3.8摩尔％、约3.9摩尔％、约4.0摩尔％、约4.1摩尔％、约4.2摩尔％、约4.3摩尔％、约4.4摩尔％、约4.5摩尔％、约4.6摩尔％、约4.7摩尔％、约4.8摩尔％、约4.9摩尔％或约5.0摩尔％的PEG脂质(例如，PEG_2k-DMG)。

在一些实施方案中，在第一添加步骤之后，有载荷的LNP溶液(例如，有载荷的LNP)包含约1.0摩尔％、约1.1摩尔％、约1.2摩尔％、约1.3摩尔％、约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％、约2.0摩尔％、约2.1摩尔％、约2.2摩尔％、约2.3摩尔％、约2.4摩尔％、约2.5摩尔％、约2.6摩尔％、约2.7摩尔％、约2.8摩尔％、约2.9摩尔％、约3.0摩尔％、约3.1摩尔％、约3.2摩尔％、约3.3摩尔％、约3.4摩尔％、约3.5摩尔％、约3.6摩尔％、约3.7摩尔％、约3.8摩尔％、约3.9摩尔％、约4.0摩尔％、约4.1摩尔％、约4.2摩尔％、约4.3摩尔％、约4.4摩尔％、约4.5摩尔％、约4.6摩尔％、约4.7摩尔％、约4.8摩尔％、约4.9摩尔％或约5.0摩尔％的PEG脂质(例如，PEG_2k-DMG)。

在一些实施方案中，第二添加步骤包括向空LNP或有载荷的LNP中添加约0.1摩尔％至约3.0摩尔％的PEG、约0.2摩尔％至约2.5摩尔％的PEG、约0.5摩尔％至约2.0摩尔％的PEG、约0.75摩尔％至约1.5摩尔％的PEG、约1.0摩尔％至约1.25摩尔％的PEG。

在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加约0.1摩尔％、约0.2摩尔％、约0.3摩尔％、约0.4摩尔％、约0.5摩尔％、约0.6摩尔％、约0.7摩尔％、约0.8摩尔％、约0.9摩尔％、约1.0摩尔％、约1.1摩尔％、约1.2摩尔％、约1.3摩尔％、约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％、约2.0摩尔％、约2.1摩尔％、约2.2摩尔％、约2.3摩尔％、约2.4摩尔％、约2.5摩尔％、约2.6摩尔％、约2.7摩尔％、约2.8摩尔％、约2.9摩尔％或约3.0摩尔％的PEG脂质(例如，PEG_2k-DMG)。

在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加约1.0±0.5摩尔％、约1.0±0.4摩尔％、约1.0±0.3摩尔％、约1.0±0.2摩尔％或约1.0±0.1摩尔％(例如，约1.0摩尔％)的PEG脂质(例如，PEG_2k-DMG)。

在一些实施方案中，第二添加步骤包括将约1.0摩尔％的PEG脂质添加至空LNP或有载荷的LNP中。

在一些实施方案中，在第二添加步骤之后，空LNP溶液(例如，空LNP)包含约1.0摩尔％、约1.1摩尔％、约1.2摩尔％、约1.3摩尔％、约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％、约2.0摩尔％、约2.1摩尔％、约2.2摩尔％、约2.3摩尔％、约2.4摩尔％、约2.5摩尔％、约2.6摩尔％、约2.7摩尔％、约2.8摩尔％、约2.9摩尔％、约3.0摩尔％、约3.1摩尔％、约3.2摩尔％、约3.3摩尔％、约3.4摩尔％、约3.5摩尔％、约3.6摩尔％、约3.7摩尔％、约3.8摩尔％、约3.9摩尔％、约4.0摩尔％、约4.1摩尔％、约4.2摩尔％、约4.3摩尔％、约4.4摩尔％、约4.5摩尔％、约4.6摩尔％、约4.7摩尔％、约4.8摩尔％、约4.9摩尔％或约5.0摩尔％的PEG脂质(例如，PEG_2k-DMG)。

在一些实施方案中，在第二添加步骤之后，有载荷的LNP溶液(例如，有载荷的LNP)包含约1.0摩尔％、约1.1摩尔％、约1.2摩尔％、约1.3摩尔％、约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％、约2.0摩尔％、约2.1摩尔％、约2.2摩尔％、约2.3摩尔％、约2.4摩尔％、约2.5摩尔％、约2.6摩尔％、约2.7摩尔％、约2.8摩尔％、约2.9摩尔％、约3.0摩尔％、约3.1摩尔％、约3.2摩尔％、约3.3摩尔％、约3.4摩尔％、约3.5摩尔％、约3.6摩尔％、约3.7摩尔％、约3.8摩尔％、约3.9摩尔％、约4.0摩尔％、约4.1摩尔％、约4.2摩尔％、约4.3摩尔％、约4.4摩尔％、约4.5摩尔％、约4.6摩尔％、约4.7摩尔％、约4.8摩尔％、约4.9摩尔％或约5.0摩尔％的PEG脂质(例如，PEG_2k-DMG)。

在一些实施方案中，第一添加步骤在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下进行。

在一些实施方案中，第二添加步骤在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下进行。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括选自以下的至少一个步骤：过滤、pH调节、缓冲液交换、稀释、透析、浓缩、冷冻、冻干、储存和包装。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括pH调节。

在一些实施方案中，pH调节包括添加选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组的第二缓冲剂。

在一些实施方案中，第一添加步骤在pH调节之前进行。

在一些实施方案中，第一添加步骤在pH调节之后进行。

在一些实施方案中，第二添加步骤在pH调节之前进行。

在一些实施方案中，第二添加步骤在pH调节之后进行。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括过滤。

在一些实施方案中，所述过滤是切向流过滤(TFF)。

在一些实施方案中，所述过滤从LNP溶液中去除有机溶剂(例如，醇或乙醇)。在一些实施方案中，在去除有机溶剂(例如醇或乙醇)后，将LNP溶液转化成在中性pH、pH 6.5至7.8、pH 6.8至pH 7.5，优选pH 7.0至pH 7.2下缓冲的溶液(例如，磷酸盐或HEPES缓冲液)。在一些实施方案中，将LNP溶液转化成在约7.0至约7.2的pH下缓冲的溶液。在一些实施方案中，所得LNP溶液在储存或使用之前，例如通过过滤(例如，经由0.1-0.5μm过滤器)灭菌。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括缓冲液交换。

在一些实施方案中，缓冲液交换包括添加包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液。

在一些实施方案中，第一添加步骤在缓冲液交换之前进行。

在一些实施方案中，第一添加步骤在缓冲液交换之后进行。

在一些实施方案中，第二添加在缓冲液交换之前进行。

在一些实施方案中，第二添加步骤在缓冲液交换之后进行。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括稀释。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括透析。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括浓缩。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括冷冻。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括冻干。

在一些实施方案中，冻干包括在约-100℃至约0℃、约-80℃至约-10℃、约-60℃至约-20℃、约-50℃至约-25℃或约-40℃至约-30℃的温度下冷冻有载荷的LNP溶液。

在一些实施方案中，冻干还包括干燥冷冻的有载荷的LNP溶液以形成冻干的空LNP或冻干的有载荷的LNP。

在一些实施方案中，干燥在约50毫托至约150毫托的真空下进行。

在一些实施方案中，干燥在约-35℃至约-15℃下进行。

在一些实施方案中，干燥在约室温至约25℃下进行。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括储存。

在一些实施方案中，储存包括在约-80℃、约-78℃、约-76℃、约-74℃、约-72℃、约-70℃、约-65℃、约-60℃、约-55℃、约-50℃、约-45℃、约-40℃、约-35℃或约-30℃的温度下储存空LNP或有载荷的LNP至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。

在一些实施方案中，储存包括在约-40℃、约-35℃、约-30℃、约-25℃、约-20℃、约-15℃、约-10℃、约-5℃、约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃或约25℃的温度下储存空LNP或有载荷的LNP至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。

在一些实施方案中，储存包括在约-40℃至约0℃、约-35℃至约-5℃、约-30℃至约-10℃、约-25℃至约-15℃、约-22℃至约-18℃或约-21℃至约-19℃的温度下储存空LNP或有载荷的LNP至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。

在一些实施方案中，储存包括在约-20℃的温度下储存空LNP或有载荷的LNP至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤还包括包装。

如本文所用，“包装”可以指以其最终状态储存药物产品或在空LNP、有载荷的LNP或LNP配制物置于最终包装中之前的过程中储存。储存和/或包装的模式包括但不限于在无菌袋中冷藏，在小瓶中冷藏或冷冻配制物，在小瓶和注射器中冻干配制物等。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤包括：iia)向空LNP溶液或有载荷的LNP溶液中添加冷冻保护剂。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤包括：iib)过滤空LNP溶液或有载荷的LNP溶液。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤包括：

iia)向空LNP溶液或有载荷的LNP溶液中添加冷冻保护剂；并且

iic)过滤空LNP溶液或有载荷的LNP溶液。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液或有载荷的LNP溶液的步骤包括以下步骤中的一个或多个：

iib)向空LNP溶液或有载荷的LNP溶液中添加冷冻保护剂；

iic)冻干空LNP溶液或有载荷的LNP溶液，从而形成冻干的LNP组合物；

iid)储存冻干的LNP组合物的空LNP溶液或有载荷的LNP溶液；并且

iie)向空LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物中添加缓冲溶液，从而形成LNP配制物。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括：iia)向空LNP溶液中添加冷冻保护剂。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括：iib)过滤空LNP溶液。

在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括：

iia)向空LNP溶液中添加冷冻保护剂；并且

iic)过滤空LNP溶液。

在一些实施方案中，在冻干之前将冷冻保护剂添加到空LNP溶液或有载荷的LNP溶液中。在一些实施方案中，冷冻保护剂包含一种或多种冷冻保护剂，并且所述一种或多种冷冻保护剂中的每一种独立地是多元醇(例如，二醇或三醇，诸如丙二醇(即，1,2-丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇、1,6-己二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、乙二醇或二乙二醇)、非洗涤剂磺基甜菜碱(例如，NDSB-201(3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸酯)、渗透剂(例如，L-脯氨酸或三甲胺N-氧化物二水合物)、聚合物(例如，聚乙二醇200(PEG 200)、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG_2k-DMG、PEG 3350、PEG 4000、PEG 8000、PEG 10000、PEG20000、聚乙二醇单甲醚550(mPEG 550)、mPEG 600、mPEG 2000、mPEG 3350、mPEG 4000、mPEG5000、聚乙烯吡咯烷酮(例如，聚乙烯吡咯烷酮K15)、季戊四醇丙氧基化物或聚丙二醇P400)、有机溶剂(例如，二甲亚砜(DMSO)或乙醇)、糖(例如，D-(+)-蔗糖、D-山梨糖醇、海藻糖、D-(+)-麦芽糖一水合物、内赤藓糖醇、木糖醇、肌醇、D-(+)-海藻糖五水合物、D-(+)-海藻糖二水合物或D-(+)-葡萄糖一水合物)或盐(例如，乙酸锂、氯化锂、甲酸锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、乙酸钠、氯化钠、甲酸钠、丙二酸钠、硝酸钠、硫酸钠或它们的任何水合物)，或它们的任何组合。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含蔗糖。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂和/或赋形剂是蔗糖。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含乙酸钠。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂和/或赋形剂是乙酸钠。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含蔗糖和乙酸钠。

在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以下述浓度存在的冷冻保护剂：10g/L至约1000g/L、约25g/L至约950g/L、约50g/L至约900g/L、约75g/L至约850g/L、约100g/L至约800g/L、约150g/L至约750g/L、约200g/L至约700g/L、约250g/L至约650g/L、约300g/L至约600g/L、约350g/L至约550g/L、约400g/L至约500g/L和约450g/L至约500g/L。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以下述浓度存在的冷冻保护剂：约10g/L至约500g/L、约50g/L至约450g/L、约100g/L至约400g/L、约150g/L至约350g/L、约200g/L至约300g/L和约200g/L至约250g/L。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以下述浓度存在的冷冻保护剂：约10g/L、约25g/L、约50g/L、约75g/L、约100g/L、约150g/L、约200g/L、约250g/L、约300g/L、约300g/L、约350g/L、约400g/L、约450g/L、约500g/L、约550g/L、约600g/L、约650g/L、约700g/L、约750g/L、约800g/L、约850g/L、约900g/L、约950g/L和约1000g/L。

在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以下述浓度存在的冷冻保护剂：约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约25mM、约8mM至约20mM、约9mM至约15mM和约10mM至约15mM。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以下述浓度存在的冷冻保护剂：约0.1mM至约10mM、约0.5mM至约9mM、约1mM至约8mM、约2mM至约7mM、约3mM至约6mM和约4mM至约5mM。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以下述浓度存在的冷冻保护剂：约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM和约100mM。

在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含蔗糖。

在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含含有蔗糖的水溶液。

在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含含有约700±300g/L、700±200g/L、700±100g/L、700±90g/L、700±80g/L、700±70g/L、700±60g/L、700±50g/L、700±40g/L、700±30g/L、700±20g/L、700±10g/L、700±9g/L、700±8g/L、700±7g/L、700±6g/L、700±5g/L、700±4g/L、700±3g/L、700±2g/L或700±1g/L蔗糖的水溶液。

在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含含有乙酸钠和蔗糖的水溶液。

在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含水溶液，所述水溶液包含：

(a)约5±1mM、约5±0.9mM、约5±0.8mM、约5±0.5mM、约5±0.6mM、约5±0.5mM、约5±0.4mM、约5±0.3mM、约5±0.2mM或约5±0.1mM的乙酸钠；和

(b)约700±300g/L、700±200g/L、700±100g/L、700±90g/L、700±80g/L、700±70g/L、700±60g/L、700±50g/L、700±40g/L、700±30g/L、700±20g/L、700±10g/L、700±9g/L、700±8g/L、700±7g/L、700±6g/L、700±5g/L、700±4g/L、700±3g/L、700±2g/L或700±1g/L的蔗糖。

在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含含有乙酸钠和蔗糖的水溶液，其中所述水溶液具有5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1的pH值。

(b)约700±300g/L、700±200g/L、700±100g/L、700±90g/L、700±80g/L、700±70g/L、700±60g/L、700±50g/L、700±40g/L、700±30g/L、700±20g/L、700±10g/L、700±9g/L、700±8g/L、700±7g/L、700±6g/L、700±5g/L、700±4g/L、700±3g/L、700±2g/L或700±1g/L的蔗糖；并且

其中所述水溶液具有5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1的pH值。

在一些实施方案中，冻干在合适的玻璃容器(例如，10mL圆柱形玻璃小瓶)中进行。在一些实施方案中，玻璃容器在短时间段内承受在低于-40℃和高于室温之间的极端温度变化，和/或被切割成均匀的形状。在一些实施方案中，冻干步骤包括在高于约-40℃的温度下冷冻LNP溶液，从而形成冷冻的LNP溶液；并且干燥冷冻的LNP溶液以形成冻干的LNP组合物。在一些实施方案中，冻干步骤包括在高于约-40℃且低于约-30℃的温度下冷冻LNP溶液。所述冷冻步骤导致温度在约6分钟内线性降低至最终温度，优选以每分钟约1℃从20℃降低到-40℃。在一些实施方案中，所述冷冻步骤导致温度在约6分钟内线性降低至最终温度，以每分钟约1℃从20℃降低到-40℃。在一些实施方案中，可以使用12-15％的蔗糖，并且所述干燥步骤在约50毫托至约150毫托的真空下进行。在一些实施方案中，可以使用12-15％的蔗糖，并且所述干燥步骤在约50毫托至约150毫托的真空下，首先在约-35℃至约-15℃的低温下，然后在室温至约25℃的较高温度下进行。在一些实施方案中，可以使用12-15％的蔗糖，并且所述干燥步骤在约50毫托至约150毫托的真空下进行，并且所述干燥步骤在三至七天内完成。在一些实施方案中，可以使用12-15％的蔗糖，并且所述干燥步骤在约50毫托至约150毫托的真空下，首先在约-35℃至约-15℃的低温下，然后在室温至约25℃的较高温度下进行，并且所述干燥步骤在三至七天内完成。在一些实施方案中，所述干燥步骤在约50毫托至约100毫托的真空下进行。在一些实施方案中，所述干燥步骤在约50毫托至约100毫托的真空下，首先在约-15℃至约0℃的低温下，然后在较高温度下进行。

在一些实施方案中，空LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物在约3.5至约8.0、约4.0至约7.5、约4.5至约7.0、约5.0至约6.5和约5.5至约6.0的pH下储存。在一些实施方案中，空LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物在约3.5、约4.0、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约4.5、约5.5、约6.5、约7.0、约7.5和约8.0的pH下储存。

在一些实施方案中，LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在包含蔗糖和乙酸钠的冷冻保护剂中。在一些实施方案中，LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物在约4.5至约7.0的pH下储存在包含约150g/L至约350g/L蔗糖和约3mM至约6mM乙酸钠的冷冻保护剂中。在一些实施方案中，LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物在约pH 5.0下储存在包含约200g/L蔗糖和5mM乙酸钠的冷冻保护剂中。

在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前，空LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在约-80℃、约-78℃、约-76℃、约-74℃、约-72℃、约-70℃、约-65℃、约-60℃、约-55℃、约-50℃、约-45℃、约-40℃、约-35℃或约-30℃的温度下。

在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前，空LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在约-40℃、约-35℃、约-30℃、约-25℃、约-20℃、约-15℃、约-10℃、约-5℃、约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃或约25℃的温度下。

在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前，空LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在约-40℃至约0℃、约-35℃至约-5℃、约-30℃至约-10℃、约-25℃至约-15℃、约-22℃至约-18℃或约-21℃至约-19℃的温度下。

在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前，空LNP溶液、有载荷的LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在约-20℃的温度下。

所述方法的某些方面描述于PCT申请第WO/2020/160397号中，该申请通过引用整体并入本文。

本文还描述了包含纳米颗粒的细胞。所述细胞可以是上皮细胞。例如，所述细胞可以是肺细胞。所述细胞可以是呼吸上皮细胞。例如，所述细胞可以是肺细胞、鼻细胞、肺泡上皮细胞或支气管上皮细胞。所述细胞可以是人支气管上皮(HBE)细胞。所述细胞可以是HeLa细胞。此类细胞可以在体外或在体内与LNP接触。

药物组合物和配制物

本公开提供了包含本文所述的任何纳米颗粒的药物组合物和配制物。

药物组合物或配制物可以任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本公开的药物组合物或配制物可以是无菌的和/或无热原的。在药剂的配制和/或制造中的一般考虑因素可以在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过引用整体并入本文)中找到。在一些实施方案中，将组合物施用于人、人患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指包含如本文所述的待递送的多核苷酸或多肽有效载荷的纳米颗粒。

本文所述的配制物和药物组合物可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。一般而言，此类制备方法包括将纳米颗粒与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后如有必要和/或期望的话，将产物分开、成型和/或包装为所需的单剂量或多剂量单位的步骤。

根据本公开的药物组合物或配制物可以呈散装、呈单一单位剂量和/或呈多个单一单位剂量进行制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用给受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的适宜分数，例如此类剂量的一半或三分之一。

根据本公开的药物组合物中活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量可根据所治受试者的特性、大小和/或状况，并进一步根据施用组合物的途径而变化。

尽管本文提供的药物组合物和配制物的描述主要针对适合施用于人的药物组合物和配制物，但是本领域技术人员将理解，此类组合物通常适合施用于任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。

如本文所用，药学上可接受的赋形剂包括但不限于适合于所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、稀释剂、造粒剂和/或分散剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂或油、着色剂、甜味剂或调味剂、稳定剂、抗氧化剂、抗微生物剂或抗真菌剂、渗透压调节剂、pH调节剂、缓冲剂、螯合剂、细胞保护剂和/或填充剂。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用整体并入本文)。

示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙或碳酸钠、磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇等和/或其组合。

示例性的造粒剂和/或分散剂包括但不限于淀粉、预胶化淀粉或微晶淀粉、海藻酸、瓜尔胶、琼脂、聚(乙烯基吡咯烷酮)、(聚维酮)、交联聚(乙烯基吡咯烷酮)(交聚维酮)、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、硅酸镁铝

十二烷基硫酸钠等和/或其组合。

示例性的表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、软骨胶(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、山梨醇脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯[

80]、山梨醇酐单棕榈酸酯[/>

40]、甘油单油酸酯、聚氧乙烯酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，/>

)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚[/>

30])、

F 68、/>

188等和/或其组合。

示例性的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)、氨基酸(例如，甘氨酸)、天然和合成树胶(例如，阿拉伯胶、海藻酸钠)、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等及其组合。

氧化是mRNA的潜在降解途径，尤其对于液体mRNA配制物而言。为了防止氧化，可以向配制物中添加抗氧化剂。示例性的抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、苄醇、丁基羟基茴香醚、间甲酚、甲硫氨酸、丁羟甲苯、硫代甘油、焦亚硫酸钠或焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠等及其组合。

示例性的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸、依地酸三钠等及其组合。

示例性的抗微生物剂或抗真菌剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾或苯甲酸钠、山梨酸钾或山梨酸钠、丙酸钠、山梨酸等及其组合。

示例性的防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、抗坏血酸、丁基羟基苯甲醚、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)等及其组合。

在一些实施方案中，多核苷酸溶液的pH维持在pH 5和pH 8之间以提高稳定性。用于控制pH的示例性缓冲液可包括但不限于磷酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、组氨酸(或组氨酸-HCl)、苹果酸钠、碳酸钠等和/或其组合。

示例性的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠或月桂基硫酸镁等及其组合。

本文所述的药物组合物可含有冷冻保护剂以使本文所述的多核苷酸在冷冻期间稳定。示例性的冷冻保护剂包括但不限于甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖等及其组合。

本文所述的药物组合物可以含有在冻干的多核苷酸配制物中的填充剂以得到“药学上精致的”饼状物，使冻干的多核苷酸在长期(例如36个月)储存期间稳定。本公开的示例性填充剂可以包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、乳糖、棉子糖及其组合。

所述组合物可以是液体形式或固体形式。在一些实施方案中，所述组合物或配制物是液体形式。在一些实施方案中，所述组合物适于吸入。所述组合物可以施用于肺道。气溶胶化的药物配制物可以优选使用许多市售装置被递送至肺部。

组合物可通过合适的方法诸如鼻内滴注、气管内滴注和气管内注射施用于呼吸道。在一些实施方案中，所述组合物或所述纳米颗粒通过鼻内、支气管内或肺部施用来施用。例如，所述组合物和纳米颗粒通过喷雾器或吸入器施用。

在一些实施方案中，通过吸入气溶胶化的药物配制物将所述组合物递送到肺部。吸入可以通过受试者的鼻和/或口进行。施用可以通过在吸入时自我施用配制物来进行，或者通过经由呼吸器向佩戴呼吸器的受试者施用配制物来进行。用于将配制物递送至肺部的示例性装置包括但不限于干粉吸入器、加压定量吸入器、喷雾器和电流体动力学气溶胶装置。

可以使用加压定量吸入器(pMDI)将液体配制物施用至患者的肺部。pMDI通常包括至少两个部件：其中将液体配制物与一种或多种推进剂组合保持处于压力下的罐，以及用于容纳和致动所述罐的容器。所述罐包含单剂量或多剂量的配制物。所述罐可包括阀，通常为计量阀，罐的内容物可从所述阀排出。通过以下方式从pMDI中分配气溶胶化的药物：在罐上施加力以将气溶胶化的药物推入容器中，从而将阀打开并使药物颗粒从阀通过容器出口输送。在从罐中排出时，将液体配制物雾化，形成气溶胶。pMDI通常采用一种或多种推进剂来对罐的内容物加压并将液体配制物推出容器出口，形成气溶胶。可以利用任何合适的推进剂。所述推进剂可以呈多种形式。例如，所述推进剂可以是压缩气体或液化气体。

所述液体配制物也可以使用喷雾器施用。喷雾器是液体气溶胶发生器，其将液体配制物转化为小液滴的薄雾或云状物，小液滴优选具有小于5微米总气体动力学中位数直径的直径，可以被吸入到下呼吸道中。这个过程称为雾化。当吸入气溶胶云状物时，液滴将所述一种或多种活性剂携带到鼻、上气道或肺深部。可以使用任何类型的喷雾器向患者施用配制物，包括但不限于气动(射流)喷雾器和机电喷雾器。气动(射流)喷雾器使用加压气体供应作为液体配制物雾化的驱动力。压缩气体通过喷嘴或射流递送以产生低压场，所述低压场夹带周围的液体配制物并将其剪切成薄膜或细丝。所述薄膜或细丝是不稳定的并且分裂成小液滴，这些小液滴被压缩气流携带到吸入气息中。插入液滴卷流中的挡板将较大的液滴筛出并将它们返回到散装液体贮存器中。机电喷雾器使用电产生的机械力来雾化液体配制物。可以例如通过以超声频率振动液体配制物，或通过迫使散装液体通过薄膜中的小孔来施加机电驱动力。所述力产生液体薄膜或细丝流，所述液体薄膜或细丝流分裂成小液滴以形成缓慢移动的气溶胶流，所述气溶胶流可以被夹带在吸入流中。液体配制物也可以使用电流体动力学(EHD)气溶胶装置施用。EHD气溶胶装置使用电能使液体药物溶液或悬浮液气溶胶化。

干粉吸入器(DPI)通常使用诸如气体爆炸的机制在容器内部产生干粉云状物，其然后可被受试者吸入。在DPI中，待施用的剂量以非加压干粉的形式储存，并且在吸入器致动时，粉末颗粒被受试者吸入。在一些情况下，压缩气体(即，推进剂)可用于分配粉末，与加压定量吸入器(pMDI)类似。在一些情况下，DPI可以是呼吸致动的，这意味着对吸气精确响应而产生气溶胶。通常，干粉吸入器每次吸入施用小于几十毫克的剂量以免引发咳嗽。DPI的示例包括

吸入器(Astrazeneca,Wilmington,Del.)、/>

吸入器(Innovata,Ruddington,Nottingham,UKL)、/>

吸入器(Glaxo,Greenford,Middlesex,UK)、/>

(Orion,Expoo,FI)、/>

吸入器(Pfizer,New York,N.Y.)、/>

吸入器(Microdose,Monmouth Junction,N.J.)和/>

吸入器(Dura,San Diego,Calif.)。

本发明的药物组合物以有效量施用以引起期望的生物效应，例如治疗或预防效应，这是例如由于正常基因产物表达以补充或替代缺陷蛋白或减少不期望蛋白的表达，如在一些实施方案中通过一种或多种症状的减轻所测量的。所述配制物可以以有效量施用以将LNP递送至例如呼吸和非呼吸上皮细胞的顶端膜以递送有效载荷。在一些实施方案中，所述药物组合物以有效量施用以诱导患有CF的患者中缺乏CFTR活性或增加患有CF的患者中残留CFTR活性的现有水平。

使用本领域已知的方法，包括标准电生理学技术、生物化学技术和/或组织化学技术，可以容易地检测所需生物活性，例如在上皮表面的残留CFTR活性的存在。此类方法使用体内或离体电生理学技术，汗液或唾液CT浓度的测量，或离体生物化学或组织化学技术以监测CFTR细胞表面密度来鉴定和/或定量CFTR活性。

使用方法

本文描述了治疗或防止患者中的疾病的方法，所述疾病与气道细胞功能障碍相关。所述方法包括向患者施用包含如本文所述的核酸有效载荷的纳米颗粒或组合物，以治疗或防止所述疾病。例如，在一个实施方案中，有效载荷是核酸分子，例如mRNA分子，并且通过蛋白质或多肽在气道上皮细胞中的表达来改善所述疾病。在一些实施方案中，所述疾病是囊性纤维化。

在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒用于在有需要的受试者中降低细胞钠水平的方法中。

在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒用于降低与CF相关的代谢物(例如，底物或产物)的水平，所述方法包括向受试者施用有效量的编码CFTR多肽的多核苷酸。

在一些实施方案中，施用有效量的本文所述的纳米颗粒降低CF生物标志物的水平，例如胞内钠水平。在一些实施方案中，施用本文所述的纳米颗粒引起在施用本文所述的纳米颗粒后的短时间段内，CF的一种或多种生物标志物的水平(例如，胞内钠水平)降低。

在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的纳米颗粒引起细胞中的胞内钠水平降低到比施用所述组合物或配制物之前观察到的水平低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的水平。

在一些实施方案中，本文提供了将多核苷酸或多肽有效载荷递送到细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与本文所述的纳米颗粒接触。在一些实施方案中，施用本文所述的纳米颗粒引起受试者细胞中CFTR的表达。在一些实施方案中，施用本文所述的纳米颗粒引起受试者中CFTR酶活性的增加。例如，所述方法可引起受试者的至少一些细胞中CFTR酶活性的增加。

在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的包含编码CFTR多肽的mRNA的纳米颗粒引起受试者细胞中的CFTR酶活性增加到在正常受试者(例如，未患CF的人)中预计的活性水平的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％或更高的水平。

在一些实施方案中，施用本文所述的纳米颗粒引起CFTR蛋白在受试者的至少一些细胞中表达，所述表达持续足以允许显著的氯离子通道活性出现的时间段。

在一些实施方案中，所编码的多肽的表达增加。在一些实施方案中，所述多核苷酸在引入那些细胞中时增加细胞中的CFTR表达水平，例如相对于在将所述多肽引入细胞中之前在细胞中的CFTR表达水平，增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。

如本领域技术人员将理解的，本文公开的甾醇胺具有另外的用途。例如，甾醇胺可用于治疗炎性疾病。甾醇胺也可用作抗微生物剂。

试剂盒和装置

本公开提供了用于方便地和/或有效地使用本公开的要求保护的纳米颗粒的多种试剂盒。通常，试剂盒将包含足够量和/或数目的组分以允许使用者对受试者进行多次治疗和/或进行多次实验。

在一个方面，本公开提供了包含本公开的纳米颗粒的试剂盒。

所述试剂盒还可包含包装和说明书和/或递送剂以形成配制组合物。所述递送剂可以包括盐水、缓冲溶液、类脂或本文公开的任何递送剂。在一个实施方案中，此类试剂盒还包含施用装置，诸如喷雾器或吸入器。

呼吸功能和呼吸症状改善的其他测试

在一些实施方案中，纳米颗粒或药物组合物包含mRNA，所述mRNA包含编码多肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。可以测试此类多肽或蛋白质对呼吸功能或症状的改善。例如，在一个实施方案中，囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)多肽当施用于有需要的受试者时，与在未治疗囊性纤维化的受试者中测量的至少一个参考呼吸量相比，足以在施用后至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时使至少一个呼吸量的测量值提高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或至少30％。呼吸量是在任何给定时间吸入、呼出和储存在肺部内的空气的量。下面提供了可以测量的各种呼吸量的非限制性示例。

肺总容量(TLC)是最大程度充气时肺部的体积，即VC和RV的总和。平均肺总容量为6000ml，但是这会随年龄、身高、性别和健康状况而变化。

潮气量(TV)是在安静呼吸期间移入或移出肺部的空气量(TV指示肺的细分；当精确测量潮气量时，如在气体交换计算中，使用符号TV或VT)。平均潮气量为500ml。

余气量(RV)是最大程度呼气后肺部中剩余的空气量。余气量(RV/TLC％)表示为TLC的百分比。

呼气储备量(ERV)是在用力呼气期间可以呼出的空气的最大量(高于潮气量)。

吸气储备量(IRV)是可以从吸气末位吸入的最大量。

吸气容量(IC)是IRV和TV的总和。

吸气肺活量(IVC)是从最大呼气点吸入的空气的最大量。

肺活量(VC)是最深吸入后呼出的空气量。

功能余气量(FRC)是呼气末位肺部中的量。

用力肺活量(FVC)是由最大限度用力呼气确定的肺活量。

用力呼气量(时间)(FEV_t)是指示在前t秒内在用力条件下呼出的空气量的通用术语。FEV₁是在第一秒用力呼气结束时呼出的量。FEF_x是与FVC曲线的某一部分相关的用力呼气流量；修饰语是指已经呼出的FVC的量。FEF_max是在FVC操作期间达到的最大瞬时流量。

用力吸气流量(FIF)是用力吸气曲线的具体量度，用类似于用力呼气曲线的术语表示。例如，最大吸气流量表示为FIF_max。除非另有说明，否则量的限定词指示在测量时从RV吸入的量。

峰值呼气流量(PEF)是用峰值流量计测量的最高用力呼气流量。

最大自主通气量(MVV)是在重复最大努力期间在指定时间段内呼出的空气量。

合成

如本领域技术人员将理解的，本文提供的化合物，包括其盐和立体异构体，可以使用已知的有机合成技术制备，并且可以根据众多可能的合成途径中的任一种，诸如以下方案中提供的那些途径合成。

用于制备本文所述的化合物的反应可以在合适的溶剂中进行，所述溶剂可由有机合成领域的技术人员容易地选择。合适的溶剂可以在进行反应的温度(例如，可以在溶剂的冻结温度至溶剂的沸腾温度的范围内的温度)下基本上不与原材料(反应物)、中间体或产物反应。给定的反应可以在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。根据特定反应步骤，本领域技术人员可以选择用于特定反应步骤的合适溶剂。

如本文所用的表述“环境温度”或“室温”或“rt”是本领域中理解的，并且通常是指为约进行反应的室的温度(例如反应温度)，例如约20℃至约30℃的温度。

本文所述的化合物的制备可牵涉各种化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员可以容易地确定保护和脱保护的需要以及适当保护基的选择。保护基的化学性质可以例如在T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,Wiley&Sons,Inc.,New York(1999)中找到。

可以根据本领域已知的任何合适的方法监测反应。例如，可以通过光谱手段，诸如核磁共振光谱法(例如，¹H或¹³C)、红外光谱法、分光光度法(例如，UV-可见光)、质谱法或通过色谱法诸如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱法-质谱法(LCMS)或薄层色谱法(TLC)来监测产物形成。化合物可由本领域技术人员通过多种方法纯化，包括高效液相色谱法(HPLC)和正相硅胶色谱法。

式A2a的化合物可以例如使用如下方案中所示的方法制备：

方案1

式A2a的化合物可经由方案1中概述的合成途径制备。胆固醇氯甲酸酯和胺之间的适当反应可以在合适的条件下进行以生成式A2a的化合物。

方案2

式A2a的化合物可经由方案2中概述的合成途径制备。胆固醇或胆固醇衍生物(诸如豆甾醇)与氯甲酸4-硝基苯酯之间的适当反应可以在合适的条件下进行(诸如使用三乙胺和4-二甲基氨基吡啶)。所述反应的产物可以与胺在合适的条件下(诸如使用三乙胺)反应，得到式A2a的化合物。

方案3

式A2a的化合物可经由方案3中概述的合成途径制备。胆固醇或胆固醇衍生物(诸如豆甾醇)与羧酸之间的适当反应可以在活化试剂(诸如，EDC-HCl、DMAP、DCC或新戊酸酐)的存在下在合适条件下进行，得到式A2a的化合物。

方案4

式A2a的化合物可经由方案4中概述的合成途径制备。胆固醇半琥珀酸酯或胆固醇衍生物半琥珀酸酯与活化剂之间的适当反应可以在合适的条件下进行。所述反应的产物可以与胺在合适的条件下反应以得到式A2a的化合物。

方案5

式A2a的化合物可经由方案5中概述的合成途径制备。胆固醇氯甲酸酯和乙烷-1,2-二胺之间的适当反应可以在合适的条件下进行以得到SA22。SA22可以与2-(甲硫基)-4,5-二氢-1H-咪唑氢碘酸盐在合适的条件下反应以得到式A2a的化合物。SA22还可以与方酸二甲酯在合适的条件下反应，并且所述反应的产物可以进一步与仲胺在合适的条件下反应以得到式A2a的化合物。

方案6

式A2a的化合物可经由方案6中概述的合成途径制备。氨基甲酸氨基烷基酯与胍基化剂之间的适当反应可以在合适的条件下进行。所述反应的产物可以与HCl在合适的条件下反应以得到式A2a的化合物。

方案7

式A2a的化合物的前体可经由方案7中概述的合成途径制备。胆固醇或胆固醇衍生物(诸如豆甾醇)之间的适当反应可以在合适的条件下进行(诸如使用三乙胺和4-二甲基氨基吡啶)。所述反应的产物可以与胺在合适的条件下(诸如使用三乙胺)反应，得到式A2a的化合物的前体。

方案8

式A2a的化合物的前体可经由方案8中概述的合成途径制备。胆固醇或胆固醇衍生物(诸如豆甾醇)与boc-半酯之间的适当反应可以在合适的条件下进行。所述反应的产物可以在合适的条件下反应以得到式A2a的化合物的前体。

方案9

用于合成式A2a的化合物的中间体可经由方案9中概述的合成途径制备。亚精胺或精胺与(E)-N-((叔丁氧羰基)氧基)亚胺苄基氰化物(BOC-ON)之间的适当反应可以在适当条件下进行以得到用于合成式A2a的化合物的中间体。

定义

为了更容易地理解本公开，首先对某些术语进行了定义。如在本申请中所用，除非本文另外明确地提供，否则以下术语中的每一个应该具有下面阐述的含义。另外的定义在整个申请中阐述。

本公开包括其中该组中恰好一个成员存在于给定产品或方法中，用于给定产品或方法或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。本公开包括其中多于一个或所有组成员存在于给定产品或方法中，用于给定产品或方法或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。

在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。术语“一”(或“一种(个)”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”在本文可以互换使用。在某些方面，术语“一”或“一种(个)”意指“单个”。在其他方面，术语“一”或“一种(个)”包括“两个或更多个”或“多个”。

此外，“和/或”在本文中使用时应被视为两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如本文在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括：“A和B”；“A或B”；“A”(单独)；和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；Dictionary of Cell andMolecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,修订板,2000,Oxford University Press，给普通技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用字典。

当本文中用语言“包含”描述方面时，还提供了根据“由……组成”和/或“基本上由……组成”所描述的其他类似方面。

单位、前缀和符号以其国际单位制(Système International de Unites,SI)可接受的形式表示。数值范围将限定范围的数量包括在内。在列举值的范围的情况下，应当理解还具体公开了在该范围的列举的上限和下限之间的每个居间整数值及其每个分数，以及介于此类值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或从该范围中排除，并且其中包括任一个限值、不包括两个限值或包括两个限值的每个范围也涵盖在本公开内。在明确列举值的情况下，应理解作为与所列举的值大约相同的数量或量的值也在本公开的范围内。在公开组合的情况下，该组合的要素的每个子组合也被具体公开并且在本公开的范围内。相反，在单独公开不同要素或要素的组的情况下，也公开了它们的组合。在将本公开的任何要素公开为具有多个替代的情况下，由此还公开了本公开的示例，其中单独地或以与其他替代方案的任何组合形式排除每个替代方案；本公开的多于一个要素可以具有此类排除，并且由此公开了具有此类排除的要素的所有组合。

约：在整个说明书和权利要求书中连同数值使用的术语“约”表示本领域技术人员熟悉和可接受的精确度区间。此类精确度区间为±10％。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，除非另有指示或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，除非上下文另外清楚地指示，否则表示为范围的值可以假定在本公开的不同实施方案中规定范围内的任何具体值或子范围，至该范围下限的单位的十分之一。

组合施用：如本文所用，术语“呈组合施用”或“组合的施用”意指两种或更多种剂同时或在一定间隔内施用于受试者，使得每种剂对患者的作用可以重叠。在一些实施方案中，它们彼此在约60、30、15、10、5或1分钟内施用。在一些实施方案中，剂的施用充分紧密地间隔在一起，以便实现组合(例如，协同)效应。

动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼和蠕虫。在一些实施方案中，动物是转基因动物、基因工程动物或克隆物。

大约：如本文所用，术语“大约”，正如适用于一个或多个目标值那样，是指与规定参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另有规定或另外从上下文中显而易见(除非在此类数字超过可能值的100％的情况下)，术语“大约”是指落入规定参考值任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的一系列值。

化合物：如本文所用，术语“化合物”意在包括所描绘的结构的所有立体异构体和同位素。如本文所用，术语“立体异构体”意指化合物的任何几何异构体(例如，顺式异构体和反式异构体)、对映异构体或非对映异构体。本公开涵盖本文所述的化合物的任何和所有立体异构体，包括立体异构纯形式(例如，几何异构纯、对映异构纯或非对映异构纯)及对映异构体和立体异构体混合物，例如外消旋物。化合物的对映异构体和立体异构体混合物以及将其拆分成其组分对映异构体或立体异构体的方式是众所周知的。“同位素”是指具有相同原子序数但由于原子核中不同数目的中子而具有不同质量数的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。此外，本公开的化合物、盐或复合物可通过常规方法与溶剂或水分子组合制备以形成溶剂合物和水合物。

接触：如本文所用，术语“接触”意指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使哺乳动物细胞与纳米颗粒组合物接触意指使哺乳动物细胞和纳米颗粒共有物理连接。体内和离体使细胞与外部实体接触的方法是生物学领域中众所周知的。例如，使纳米颗粒组合物与置于哺乳动物体内的哺乳动物细胞接触可通过不同的施用途径(例如，静脉内、肌内、皮内和皮下)进行，并且可以牵涉不同量的纳米颗粒组合物。而且，可以使一种以上的哺乳动物细胞接触纳米颗粒组合物。接触的另一个示例是纳米颗粒与阳离子剂之间。使纳米颗粒与阳离子剂接触可意指将纳米颗粒的表面置于与阳离子剂的物理连接中，使得阳离子剂可与纳米颗粒形成非键合的相互作用。在一些实施方案中，使纳米颗粒与阳离子剂接触将阳离子剂插入纳米颗粒中，例如，从纳米颗粒的表面开始。在一些实施方案中，术语“成层”、“涂覆”和“后添加”和“添加”可用于意指关于使纳米颗粒与阳离子剂接触的“接触”

递送：如本文所用，术语“递送”意指向目的地提供实体。例如，向受试者递送多核苷酸可以涉及向受试者施用包含多核苷酸的纳米颗粒组合物(例如，通过静脉内、肌内、皮内或皮下途径)。向哺乳动物或哺乳动物细胞施用纳米颗粒组合物可以涉及使一种或多种细胞与纳米颗粒组合物接触。

递送剂：如本文所用，“递送剂”是指至少部分促进多核苷酸向靶细胞的体内、体外或离体递送的任何物质。

非对映异构体：如本文所用，术语“非对映异构体”意指彼此不是镜像并且彼此不可重叠的立体异构体。

布置：如本文所用，术语“布置”意指分子与纳米颗粒彼此接触之后形成非键合相互作用。

给药方案：如本文所用，“给药方案”或“给药的方案”是施用时间表或医师确定的治疗、预防或姑息护理的方案。

有效量：如本文所用，术语剂的“有效量”是足以实现有益结果或所需结果(例如临床结果)的量，并且因此，“有效量”取决于其应用的情境。例如，在施用治疗蛋白质缺乏(例如，CFTR缺乏)的剂的情境下，剂的有效量是，例如，与不施用该剂观察到的症状的严重程度相比，表达足够CFTR以改善、减少、消除或防止与CFTR缺乏相关的体征和症状的mRNA的量。术语“有效量”可与“有效剂量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”互换使用。

对映异构体：如本文所用，术语“对映异构体”意指本公开的化合物的每个单独的光学活性形式，其具有至少80％(即，有至少90％的一种对映异构体和至多10％的另一种对映异构体)、至少90％或至少98％的光学纯度或对映异构体过量(如通过本领域中的标准方法测定的)。

包封：如本文所用，术语“包封”意指封装、包围或包住。

包封效率：如本文所用，“包封效率”是指相对于用于制备纳米颗粒组合物的多核苷酸的初始总量，成为纳米颗粒组合物的一部分的多核苷酸的量。例如，如果在最初提供给组合物的总共100mg的多核苷酸中，97mg的多核苷酸包封在纳米颗粒组合物中，则包封效率可以给出为97％。如本文所用，“包封”可以指完全、大幅或部分的封装、封闭、包围或包住。

上皮细胞：如本文所用，“上皮细胞”包括来源于上皮的细胞。上皮细胞的示例是呼吸上皮细胞、鼻上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺上皮细胞或支气管上皮细胞。在一些实施方案中，上皮细胞是人支气管上皮(HBE)细胞。在一些实施方案中，上皮细胞是体外细胞。在一些实施方案中，上皮细胞是体内细胞。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生mRNA模板(例如，通过转录)；(2)mRNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3′末端加工)；(3)mRNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

离体：如本文所用，术语“离体”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)外部发生的事件。离体事件可以在与天然(例如，体内)环境相比改变最小的环境中发生。

辅助脂质：如本文所用，术语“辅助脂质”是指包括脂质部分(用于插入脂质层，例如脂质双层)和极性部分(用于与脂质层表面的生理溶液相互作用)的化合物或分子。通常辅助脂质是磷脂。辅助脂质的功能是“补充”氨基脂质并增加双层的融合性和/或帮助促进内体逃逸，例如递送至细胞的核酸的逃逸。认为辅助脂质也是LNP表面的关键结构组分。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中，在陪替氏培养皿(Petri dish)等中，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。

可电离氨基脂质：术语“可电离氨基脂质”包括具有一条、两条、三条或更多条脂肪酸链或脂肪烷基链和pH可滴定的氨基头基(例如，烷基氨基或二烷基氨基头基)的那些脂质。可电离氨基脂质通常在低于氨基头基的pKa的pH下质子化(即，带正电荷)，并且在高于pKa的pH下基本上不带电荷。此类可电离氨基脂质包括但不限于DLin-MC3-DMA(MC3)和(13Z,165Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二烷-13-16-二烯-1-胺(L608)。

异构体：如本文所用，术语“异构体”意指本公开的任何化合物的任何互变异构体、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。应认识到，本公开的化合物可具有一个或多个手性中心和/或双键，并且因此作为立体异构体存在，诸如双键异构体(即，几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如，对映异构体(即，(+)或(-))或顺式/反式异构体)。根据本公开，本文所描绘的化学结构以及因此本公开的化合物涵盖所有相应的立体异构体，即立体异构纯形式(例如，几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)以及对映异构和立体异构混合物(例如，外消旋物)。本公开的化合物的对映异构体和立体异构体混合物通常可通过熟知的方法拆分成其组分的对映异构体或立体异构体，所述方法诸如手性相气相色谱法、手性相高效液相色谱法，使化合物结晶为手性盐复合物，或使化合物在手性溶剂中结晶。对映异构体和立体异构体也可通过熟知的不对称合成方法由立体异构或对映异构纯的中间体、试剂和催化剂获得。

脂质纳米颗粒核：如本文所用，脂质纳米颗粒核是可向其中添加附加组分(诸如阳离子剂和/或PEG-脂质或其他脂质)的后添加层的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒核包含：(i)可电离脂质，(ii)磷脂，(iii)结构脂质，和(iv)任选PEG-脂质。在其他实施方案中，脂质纳米颗粒核包含：(i)可电离脂质，(ii)磷脂，(iii)结构脂质，和(iv)PEG-脂质。

接头：如本文所用，“接头”是指一组原子，例如10-1,000个原子，并且可以由诸如但不限于以下的原子或基团组成：碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。接头可以在第一末端附接至核碱基或糖部分上经修饰的核苷或核苷酸，并且在第二末端附接至有效载荷，例如可检测剂或治疗剂。接头可以具有足够的长度以不干扰掺入到核酸序列中。接头可用于任何有用的目的，诸如形成多核苷酸多聚体(例如，通过两个或更多个嵌合多核苷酸分子或IVT多核苷酸的连接)或多核苷酸缀合物，以及施用有效载荷，如本文所述。可掺入接头中的化学基团的示例包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，这些基团中的每一个可任选取代，如本文所述。接头的示例包括但不限于不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单元，例如二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)和葡聚糖聚合物及其衍生物。其他示例包括但不限于接头内的可裂解部分，例如二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)，所述可裂解部分可以使用还原剂或光分解裂解。选择性可裂解键的非限制性示例包括可以例如通过使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其他还原剂和/或光分解裂解的酰胺键，以及可以例如通过酸水解或碱水解裂解的酯键。

肺细胞：如本文所用，“肺细胞”包括来源于肺的细胞。肺细胞可以是例如肺上皮细胞、气道基底细胞、支气管外分泌细胞、肺神经内分泌细胞、肺泡细胞或气道上皮细胞。在一些实施方案中，肺细胞是体外细胞。在一些实施方案中，肺细胞是体内细胞。

施用方法：如本文所用，“施用方法”可包括静脉内、肌内、皮内、皮下方法或将组合物递送至受试者的其他方法。可以选择施用方法以靶向递送(例如，特异性递送)至身体的特定区域或系统。

术语“核酸”以其最广泛的意义包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物常常称为多核苷酸。本公开的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA，具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)或它们的杂合体或组合。

患者：如本文所用，“患者”是指可寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或由受过训练的专业人员针对特定疾病或疾患进行护理的受试者。

CFTR相关疾病：如本文所用，术语“CFTR相关疾病”或“CFTR相关病症”分别是指由异常的CFTR活性(例如，降低的活性或增加的活性)引起的疾病或病症。作为非限制性示例，囊性纤维化是CFTR相关疾病。囊性纤维化的许多临床变型是本领域已知的。参见例如，www.omim.org/entry/219700。

术语“CFTR酶活性”、“CFTR活性”和“囊性纤维化跨膜传导调节因子活性”在本公开中可互换使用，并且是指CFTR转运氯离子通过细胞膜的能力。因此，保留或具有CFTR酶活性或CFTR活性的片段或变体是指具有穿过细胞膜的可测量的氯离子转运的片段或变体。

药学上可接受的：短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适用于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物(例如，能够使活性化合物悬浮或溶解的媒介物)之外并且具有在患者中基本上无毒和非炎性的特性的任何成分。赋形剂可以包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填料(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性的赋形剂包括但不限于：丁羟甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(磷酸氢钙)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。

药学上可接受的盐：本公开还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)进行修饰。药学上可接受的盐的示例包括但不限于诸如胺的碱性残基的无机或有机酸盐；诸如羧酸的酸性残基的碱式盐或有机盐；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等；以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性部分或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，使用非水介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等。合适的盐的列表见于Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑),Wiley-VCH,2008，以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，其各自通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“溶剂合物”意指本公开的化合物，其中合适溶剂的分子掺入晶格中。合适的溶剂在施用的剂量下是生理上可耐受的。例如，溶剂合物可以通过从包含有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备。合适的溶剂的示例是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂合物称为“水合物”。

多核苷酸：如本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，所述核苷酸包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。该术语是指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。该术语还包括例如通过烷基化和/或通过加帽修饰的形式和未修饰形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”包括多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA(不论是剪接的还是未剪接的)，任何其他类型的多核苷酸(其为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷)，以及含有正核苷酸主链的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和多吗啉代聚合物，和其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物含有允许碱基配对和碱基堆积的构型(诸如可见于DNA和RNA中)的核碱基。在特定方面，多核苷酸包括mRNA。在其他方面，mRNA是合成mRNA。在一些方面，合成mRNA包含至少一个非天然核碱基。在一些方面，某一类的所有核碱基已经被非天然核碱基替换(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷可以被非天然核碱基(例如，5-甲氧基尿苷)替换)。在一些方面，多核苷酸(例如，合成RNA或合成DNA)仅包含天然核碱基，即在合成DNA的情况下包含A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞苷)和T(胸苷)，或在合成RNA的情况下包含A、C、G和U(尿苷)。

本领域技术人员将理解，本文公开的密码子图谱中的T碱基存在于DNA中，而在相应的RNA中T碱基将被U碱基替换。例如，本文公开的DNA形式的密码子-核苷酸序列，例如载体或体外翻译(IVT)模板，将其T碱基转录为基于其相应转录mRNA的U。在这方面，将密码子优化的DNA序列(包含T)和它们相应的mRNA序列(包含U)都认为是本公开的密码子优化的核苷酸序列。技术人员还将理解，通过用非天然碱基替换一个或多个碱基，可以生成等效密码子图谱。因此，例如，TTC密码子(DNA图谱)将对应于UUC密码子(RNA图谱)，后者又将对应于ΨΨC密码子(其中U已被假尿苷替换的RNA图谱)。

在允许在胸苷的N3-H和C4-氧基分别与腺苷的N1和C6-NH2之间以及在胞苷的C2-氧基、N3和C4-NH2分别与鸟苷的C2-NH2、N′—H和C6-氧基之间形成氢键的条件下形成标准A-T和G-C碱基对。因此，例如，鸟苷(2-氨基-6-氧基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可以被修饰以形成异鸟苷(2-氧基-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。此类修饰产生不再有效地与胞嘧啶形成标准碱基对的核苷碱基。然而，修饰胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-氨基-嘧啶)以形成异胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧基-嘧啶-)会产生经修饰的核苷酸，其不会与鸟苷有效地进行碱基配对，但会与异鸟苷形成碱基对(Collins等人的美国专利第5,681,702号)。异胞嘧啶可从Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)获得；异胞苷可以通过Switzer等人(1993)Biochemistry32:10489-10496以及其中引用的参考文献描述的方法制备；2′-脱氧-5-甲基-异胞苷可以通过Tor等人,1993,J.Am.Chem.Soc.115:4461-4467以及其中引用的参考文献的方法制备；并且异鸟嘌呤核苷酸可以使用Switzer等人,1993(同上)和Mantsch等人,1993,Biochem.14:5593-5601描述的方法，或者通过Collins等人的美国专利第5,780,610号中描述的方法制备。其他非天然碱基对可以通过Piccirilli等人,1990,Nature 343:33-37中描述的用于合成2,6-二氨基嘧啶及其互补物(1-甲基吡唑并-[4,3]嘧啶-5,7-(4H,6H)-二酮)的方法来合成。形成独特碱基对的其他此类经修饰的核苷酸单元是已知的，诸如Leach等人(1992)J.Am.Chem.Soc.114:3675-3683和Switzer等人(同上)描述的那些。

多肽：术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以包含经修饰的氨基酸。所述术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰(诸如与标记组分缀合)。所述定义还包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对-乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所用，所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括所编码的多核苷酸产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、前述物质的片段和其他等效物、变体和类似物。多肽可以是单体或者可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽。最常见的二硫键见于多链多肽中。术语多肽也可适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。在一些实施方案中，“肽”可以小于或等于50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。

防止：如本文所用，术语“防止”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或疾患的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种体征和症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种体征和症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或疾患的进展；和/或降低发展与感染、疾病、病症和/或疾患相关的病理学的风险。

预防性：如本文所用，“预防性”是指用于防止疾病传播的治疗或作用过程。

预防：如本文所用，“预防”是指保持健康和防止疾病传播所采取的措施。“免疫预防”是指产生......的措施

盐：在一些方面，本文公开的药物组合物包含它们的一些脂质组成部分的盐。术语“盐”包括任何阴离子和阳离子复合物。阴离子的非限制性示例包括无机和有机阴离子，例如，氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、草酸根(例如，半草酸根)、磷酸根、膦酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、氧离子、碳酸根、碳酸氢根、硝酸根、亚硝酸根、氮离子、亚硫酸氢根、硫离子、亚硫酸根、硫酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氢根、硼酸根、甲酸根、乙酸根、苯甲酸根、柠檬酸根、酒石酸根、乳酸根、丙烯酸根、聚丙烯酸根、富马酸根、马来酸根、衣康酸根、乙醇酸根、葡糖酸根、苹果酸根、扁桃酸根、惕各酸根、抗坏血酸根、水杨酸根、聚甲基丙烯酸根、高氯酸根、氯酸根、亚氯酸根、次氯酸根、溴酸根、次溴酸根、碘酸根、烷基磺酸根、芳基磺酸根、砷酸根、亚砷酸根、铬酸根、重铬酸根、氰离子、氰酸根、硫氰酸根、氢氧根、过氧根、高锰酸根及它们的混合物。

样品：如本文所用，术语“样品”或“生物样品”是指其组织、细胞或组成部分(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)的子集。样品还可以包括从完整生物体或其组织、细胞或组成部分的子集或其级分或部分制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液；皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道的外部切片；泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。样品还指培养基，诸如营养肉汤或凝胶，其可含有细胞组分，诸如蛋白质或核酸分子。

单一单位剂量：如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/一次性/单一途径/单一接触点(即，单一施用事件)施用的任何治疗剂的剂量。

分次剂量：如本文所用，“分次剂量”是将单一单位剂量或总日剂量分成两个或更多个剂量。

立体异构体：如本文所用，术语“立体异构体”是指化合物可具有的所有可能的不同异构体形式以及构象形式(例如，本文所述的任何式的化合物)，尤其是基本分子结构的所有可能的立体化学和构象异构形式、所有非对映异构体、对映异构体和/或构象异构体。本公开的一些化合物可以不同的互变异构形式存在，后者全部包括在本公开的范围内。

受试者：“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛；灵长类，诸如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，诸如狗和狼；猫科动物，诸如猫、狮子和老虎；马科动物，诸如马、驴和斑马；熊类、食用动物诸如牛、猪和羊；有蹄类，诸如鹿和长颈鹿；啮齿动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。在某些实施方案中，哺乳动物是人受试者。在其他实施方案中，受试者是人患者。在特定实施方案中，受试者是需要治疗的人患者。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或特性的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学特征很少(如果曾经有)完成和/或继续进行到完成或实现或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学特征中固有的潜在完整性缺失。

患有：“患有”疾病、病症和/或疾患的个体已被诊断出具有或展示出所述疾病、病症和/或疾患的一种或多种体征和症状。

易患：“易患”疾病、病症和/或疾患的个体尚未被诊断出患有和/或不能表现出所述疾病、病症和/或疾患的体征和症状，但具有发展疾病或其体征和症状的倾向。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或疾患(例如，癌症)的个体的特征可在于以下中的一种或多种：(1)与疾病、病症和/或疾患的发展相关的遗传突变；(2)与疾病、病症和/或疾患的发展相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或疾患相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/或减少；(4)与疾病、病症和/或疾患的发展相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或疾患的家族史；和(6)暴露于和/或感染与疾病、病症和/或疾患的发展相关的微生物。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或疾患的个体将会发展所述疾病、病症和/或疾患。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或疾患的个体不会发展所述疾病、病症和/或疾患。

合成的：术语“合成的”意指人工产生、制备和/或制造。本公开的多核苷酸或其他分子的合成可以是化学的或酶促的。

治疗剂：术语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引起期望的生物学和/或药理学作用的剂。例如，在一些实施方案中，编码CFTR多肽的mRNA可以是治疗剂。

治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送的剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，该量当施用于患有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者时，足以治疗、改善所述感染、疾病、病症和/或疾患的体征和症状，诊断、防止和/或延迟所述感染、疾病、病症和/或疾患的发作。

治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者中足以治疗、改善所述感染、疾病、病症和/或疾患的体征和症状，诊断、防止和/或延迟所述感染、疾病、病症和/或疾患的发作的结果。

总日剂量：如本文所用，“总日剂量”是在24小时内给予或开具的量。总日剂量可以作为单一单位剂量或分次剂量施用。

治疗(treating)、治疗(treatment)、疗法(therapy)：如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“疗法(therapy)”是指部分或完全减轻、改进、改善、缓解疾病(例如，囊性纤维化)，延迟疾病的发作，抑制疾病的进展，降低疾病的一种或多种体征和症状或特征的严重程度，和/或降低疾病的一种或多种体征和症状或特征的发病率。例如，“治疗”囊性纤维化可以指减弱与疾病相关的体征和症状，延长患者的寿命(增加存活率)，降低疾病的严重程度，防止或延迟疾病的发作等。为了降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险，可向未表现出疾病、病症和/或疾患的体征的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期体征的受试者施用治疗。

如本文所用，术语“烷基”或“烷基基团”意指包含一个或多个碳原子(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)的直链或支链饱和烃。

标注“C_1-14烷基”意指包含1-14个碳原子的直链或支链饱和烃。烷基基团可以任选地被取代。

如本文所用，术语“烯基”或“烯基基团”意指包含两个或更多个碳原子(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)和至少一个双键的直链或支链烃。

标注“C_2-14烯基”意指包含2-14个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃。烯基基团可包含一个、两个、三个、四个或更多个双键。烯基基团可以任选地被取代。

如本文所用，术语“碳环”或“碳环基团”意指包含一个或多个碳原子环的单环或多环系统。环可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15元环。

标注“C_3-6碳环”意指包含具有3-6个碳原子的单环的碳环。碳环可以包括一个或多个双键并且可以是芳香族的(例如，芳基基团)。碳环的示例包括环丙基、环戊基、环己基、苯基、萘基和1,2-二氢萘基基团。碳环可以任选地被取代。

如本文所用，术语“杂环”或“杂环基团”意指包含一个或多个环的单环或多环系统，其中至少一个环包含至少一个杂原子。杂原子可以是例如氮、氧或硫原子。环可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11或12元环。杂环可以包括一个或多个双键并且可以是芳族的(例如，杂芳基基团)。杂环的示例包括咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、异噻唑烷基、异噻唑基、吗啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、喹啉基和异喹啉基基团。杂环可以任选地被取代。

如本文所用，“芳基基团”是包括一个或多个芳环的碳环基团。芳基基团的示例包括苯基和萘基基团。

如本文所用，“杂芳基基团”是包含一个或多个芳环的杂环基团。杂芳基基团的示例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基和噻唑基。芳基和杂芳基团均可任选被取代。

除非另有说明，否则烷基、烯基和环基(例如，碳环基和杂环基)基团可任选地被取代。任选的取代基可以选自但不限于由以下组成但不限于以下的组：卤素原子(例如，氯、溴、氟或碘基团)、羧酸(例如，C(O)OH)、醇(例如，羟基、OH)、酯(例如，C(O)OR或OC(O)R)、醛(例如，C(O)H)、羰基(例如，C(O)R，可替代地用C＝O表示)、酰卤(例如，C(O)X，其中X是选自溴化物、氟化物、氯化物和碘化物的卤化物)、碳酸酯(例如，OC(O)OR)、烷氧基(例如，OR)、缩醛(例如，C(OR)₂R”“，其中每个OR是可以相同或不同的烷氧基并且R”“是烷基或烯基基团)、磷酸根(例如，P(O)₄ ³)、硫醇(例如，SH)、亚砜(例如，S(O)R)、亚磺酸(例如，S(O)OH)、磺酸(例如，S(O)₂OH)、硫醛(例如，C(S)H)、硫酸根(例如，S(O)₄ ²)、磺酰基(例如，S(O)₂)、酰胺(例如，C(O)NR₂或N(R)C(O)R)、叠氮基(例如，N₃)、硝基(例如，NO₂)、氰基(例如，CN)、异氰基(例如，NC)、酰氧基(例如，OC(O)R)、氨基(例如，NR₂、NRH或NH₂)、氨基甲酰基(例如，OC(O)NR₂、OC(O)NRH或OC(O)NH₂)、磺酰胺(例如，S(O)₂NR₂、S(O)₂NRH、S(O)₂NH₂、N(R)S(O)₂R、N(H)S(O)₂R、N(R)S(O)₂H或N(H)S(O)₂H)、烷基基团、烯基基团和环基(例如，碳环基或杂环基)基团。R是如本文所定义的烷基或烯基基团。

如本文所用，“包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合”是指烷基、杂环烷基、环烷基、芳基或杂芳基基团，所述基团除了其他原子之外还包含至少一个氮原子。氮原子是伯胺、仲胺或叔胺基团的一部分。胺基可以选自但不限于

伯胺、仲胺或叔胺可以是含有选自但不限于-C(＝N-)-N-、-C＝C-N-、-C＝N-和-N-C(＝N-)-N-的官能团的较大胺的一部分。

本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定根据本文描述的本公开的具体实施方案的许多等同形式。本公开的范围不旨在局限于以上具体实施方式，而是如所附权利要求中所陈述。

还应当注意，术语“包含”旨在是开放式的，并且容许但不要求包括附加要素或步骤。当在本文中使用术语“包含”时，因此也涵盖和公开了术语“由......组成”。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解除非另有指示或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，除非上下文另外清楚地指示，否则表示为范围的值可以假定在本公开的不同实施方案中规定范围内的任何具体值或子范围，至该范围下限的单位的十分之一。

另外，应理解落在现有技术之内的本公开的任何特定实施方案可以从任何一项或多项权利要求中明确排除。因为此类实施方案被视为对于本领域的普通技术人员是已知的，因此它们可以被排除，即使该排除在本文没有明确阐述。本公开的组合物的任何特定实施方案(例如，任何核酸或由其编码的蛋白质；任何生产方法；任何使用方法；等等)可以出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。

所有引用的来源，例如本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，通过引用并入本申请，即使在引用中没有明确陈述。在引用的来源与本申请的陈述有冲突的情况下，应以本申请中的陈述为准。

章节和表格标题不旨在是限制性的。

实施例

实施例1

根据式(I)的化合物的合成

A.一般考虑因素

除非另有说明，否则使用的所有溶剂和试剂均可商购获得并原样使用。¹H NMR光谱是在CDCl₃中，在300K下使用Bruker Ultrashield300MHz仪器记录的。化学位移以相对于¹H的TMS(0.00)的百万分率(ppm)报告。在ISCO CombiFlash Rf+管腔仪器上使用ISCORediSep Rf Gold闪速筒(粒度：20-40微米)进行硅胶色谱法。在ISCO CombiFlash Rf+管腔仪器上使用RediSep Rf Gold C18高性能柱进行反相色谱法。使用具有DAD和ELSD的WatersAcquity UPLC仪器及ZORBAX快速分辨率高清(RRHD)SB-C18 LC柱(2.1mm，50mm，1.8μm)，以及65％至100％乙腈在含0.1％ TFA的水中的梯度在5分钟内以1.2mL/分钟通过反相UPLC-MS(保留时间，RT，以分钟计)分析确定所有最终化合物的纯度大于85％。进样体积为5μL并且柱温为80℃。使用Waters SQD质谱仪(Milford,MA,USA)和蒸发光散射检测器以正模式基于电喷雾电离(ESI)进行检测。

下面描述的代表性程序可用于合成化合物1-147。

本文采用以下缩写：

THF：四氢呋喃

DMAP：4-二甲基氨基吡啶

LDA：二异丙基氨基锂

rt：室温

DME：1,2-二甲氧基乙烷

n-BuLi：正丁基锂

B.化合物2：8-((2-羟乙基)(十四烷基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯

代表性程序1：

8-溴辛酸十七烷-9-基酯(方法A)

向8-溴辛酸(1.04g，4.6mmol)和十七烷-9-醇(1.5g，5.8mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液中添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.1g，5.8mmol)、N,N-二异丙基乙胺(3.3mL，18.7mmol)和DMAP(114mg，0.9mmol)。使反应在室温下搅拌18小时。将反应用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢钠洗涤。将有机层分离并用盐水洗涤，并且经MgSO₄干燥。将有机层过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0％-10％乙酸乙酯的己烷溶液)获得8-溴辛酸十七烷-9-基酯(875mg，1.9mmol，41％)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 4.89(m,1H)；3.42(m,2H)；2.31(m,2H)；1.89(m,2H)；1.73-1.18(br.m,36H)；0.88(m,6H)。

8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(方法B)

使8-溴辛酸十七烷-9-基酯(3.8g，8.2mmol)和2-氨基乙-1-醇(15mL，248mmol)在乙醇(3mL)中的溶液在62℃下搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩并将残余物吸收在乙酸乙酯和水中。分离有机层并用水、盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥。将混合物过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0-100％(1％ NH₄OH、20％ MeOH在二氯甲烷中的混合物)的二氯甲烷溶液)，获得8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(3.1g，7mmol，85％)。UPLC/ELSD:RT＝2.67分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)442.68，对于C₂₇H₅₅NO₃而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 4.89(p,1H)；3.67(t,2H)；2.81(t,2H)；2.65(t,2H)；2.30(t,2H)；2.05(br.m,2H)；1.72-1.41(br.m,8H)；1.40-1.20(br.m,30H)；0.88(m,6H)。

8-((2-羟乙基)(十四烷基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(方法C)

化学式：C₄₁H₈₃NO₃

分子量：638.12

将8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(125mg，0.28mmol)、1-溴十四烷(94mg，0.34mmol)和N,N-二异丙基乙胺(44mg，0.34mmol)在乙醇中的溶液在65℃下搅拌18小时。将反应冷却至室温并真空蒸发溶剂。将残余物吸收在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠中。分离有机层，经Na₂SO₄干燥并真空蒸发。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0-100％(1％ NH₄OH、20％ MeOH在二氯甲烷中的混合物)的二氯甲烷溶液)，获得8-((2-羟乙基)(十四烷基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(89mg，0.14mmol，50％)。UPLC/ELSD:RT＝3.61分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)638.91，对于C₄₁H₈₃NO₃而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 4.86(p,1H)；3.72-3.47(br.m,2H)；2.78-2.40(br.m,5H)；2.28(t,2H)；1.70-1.40(m,10H)；1.38-1.17(br.m,54H)；0.88(m,9H)。

中间体的合成：

中间体A：2-辛基癸酸

将二异丙基胺(2.92mL，20.8mmol)在THF(10mL)中的溶液冷却至-78℃并添加n-BuLi溶液(7.5mL，18.9mmol，2.5M的己烷溶液)。使反应升温至0℃。在0℃下向癸酸(2.96g，17.2mmol)和NaH(754mg，18.9mmol，60％w/w)在THF(20mL)中的溶液中添加LDA溶液，并且使混合物在室温下搅拌30分钟。此后，添加1-碘辛烷(5g，20.8mmol)并将反应混合物在45℃下加热6小时。用1N HCl(10mL)淬灭反应。将有机层经MgSO₄干燥，过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0-20％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到2-辛基癸酸(1.9g，6.6mmol，38％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 2.38(br.m,1H)；1.74-1.03(br.m,28H)；0.91(m,6H)。

中间体B：2-辛基癸酸7-溴庚基酯

使用方法A，由2-辛基癸酸和7-溴庚-1-醇合成2-辛基癸酸7-溴庚基酯。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 4.09(br.m,2H)；3.43(br.m,2H)；2.48-2.25(br.m,1H)；1.89(br.m,2H)；1.74-1.16(br.m,36H)；0.90(m,6H)。

中间体C：(2-己基环丙基)甲醇

使二乙基锌(20mL，20mmol，1M的己烷溶液)在二氯甲烷(20mL)中的溶液冷却到-40℃，保持5分钟。然后滴加二碘甲烷(3.22mL，40mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液。使反应在-40℃下搅拌1小时后，添加三氯乙酸(327mg，2mmol)和DME(1mL，9.6mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液。使反应升温至-15℃并在该温度下搅拌1小时。然后将(Z)-壬-2-烯-1-醇(1.42g，10mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液添加到-15℃的溶液中。然后使反应缓慢升温至室温并搅拌18小时。此后，添加饱和NH₄Cl(200mL)并将反应用二氯甲烷(3X)萃取，用盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥。将有机层过滤，真空蒸发并将残余物通过硅胶色谱法纯化(0-50％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到(2-己基环丙基)甲醇(1.43g，9.2mmol，92％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 3.64(m,2H)；1.57-1.02(m,12H)；0.99-0.80(m,4H)；0.72(m,1H),0.00(m,1H)。

C.化合物18：8-((2-羟乙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯

化学式：C₄₄H₈₇NO₅

分子量：710.18

根据上述一般程序和代表性程序1合成化合物18。

UPLC/ELSD:RT＝3.59分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)710.89，对于C₄₄H₈₇NO₅而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 4.86(m,1H)；4.05(t,2H)；3.53(br.m,2H)；2.83-2.36(br.m,5H)；2.29(m,4H)；0.96-1.71(m,64H)；0.88(m,9H)。

D.化合物136：8-((2-羟乙基)((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)氨基)辛酸壬酯

代表性程序2：

8-溴辛酸壬酯(方法A)

向8-溴辛酸(5g，22mmol)和壬-1-醇(6.46g，45mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.3g，22mmol)和DMAP(547mg，4.5mmol)。使反应在室温下搅拌18小时。将反应用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢钠洗涤。将有机层分离并用盐水洗涤，经MgSO₄干燥。将有机层过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0％-10％乙酸乙酯的己烷溶液)获得8-溴辛酸壬酯(6.1g，17mmol，77％)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 4.06(t,2H)；3.40(t,2H)；2.29(t,2H)；1.85(m,2H)；1.72-0.97(m,22H)；0.88(m,3H)。

8-((2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯

使8-溴辛酸壬酯(1.2g，3.4mmol)和2-氨基乙-1-醇(5mL，83mmol)在乙醇(2mL)中的溶液在62℃下搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩并将残余物用乙酸乙酯和水萃取。分离有机层并用水、盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0-100％(1％ NH₄OH、20％ MeOH在二氯甲烷中的混合物)的二氯甲烷溶液)，获得8-((2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯(295mg，0.9mmol，26％)。

UPLC/ELSD:RT＝1.29分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)330.42，对于C₁₉H₃₉NO₃而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 4.07(t,2H)；3.65(t,2H)；2.78(t,2H)；2.63(t,2H)；2.32-2.19(m,4H)；1.73-1.20(m,24H)；0.89(m,3H)

8-((2-羟乙基)((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)氨基)辛酸壬酯

化学式：C₃₇H₇₁NO₃

分子量：577.98

使8-((2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯(150mg，0.46mmol)、(6Z,9Z)-18-溴十八烷-6,9-二烯(165mg，0.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(65mg，0.5mmol)在乙醇(2mL)中的溶液在回流下搅拌48小时。使反应冷却至室温并真空蒸发溶剂。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0-10％MeOH的二氯甲烷溶液)，获得呈HBr盐的8-((2-羟乙基)((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)氨基)辛酸壬酯(81mg，0.14mmol，30％)。

UPLC/ELSD:RT＝3.24分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)578.64，对于C₃₇H₇₁NO₃而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 10.71(br.,1H)；5.36(br.m,4H)；4.04(m,4H)；3.22-2.96(br.m,5H)；2.77(m,2H)；2.29(m,2H)；2.04(br.m,4H)；1.86(br.m,4H)；1.66-1.17(br.m,40H)；0.89(m,6H)

E.化合物138：8,8’-((2-羟乙基)氮烷二基)二辛酸二壬酯

代表性程序3：

8,8’-((2-羟乙基)氮烷二基)二辛酸二壬酯

化学式：C₃₆H₇₁NO₅

分子量：597.97

使8-溴辛酸壬酯(200mg，0.6mmol)和2-氨基乙-1-醇(16mg，0.3mmol)和N,N-二异丙基乙胺(74mg，0.6mmol)在THF/CH₃CN(1:1)(3mL)中的溶液在63℃下搅拌72小时。将反应冷却至室温并真空蒸发溶剂。将残余物用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥并真空蒸发。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0-10％MeOH的二氯甲烷溶液)，获得8,8’-((2-羟乙基)氮烷二基)二辛酸二壬酯(80mg，0.13mmol，43％)。

UPLC/ELSD:RT＝3.09分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)598.85，对于C₃₆H₇₁NO₅而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 4.05(m,4H)；3.57(br.m,2H)；2.71-2.38(br.m,6H)；2.29(m,4H),1.71-1.01(br.m,49H),0.88(m,6H)。

本公开的式(I)的所有其他化合物可通过类似于如上所述的代表性程序1-3的方法获得。

实施例2

纳米颗粒组合物的产生

使用乙醇液滴纳米沉淀，接着使用脱盐色谱柱将溶剂交换为水性缓冲液中来制备脂质纳米颗粒核。示例性的脂质纳米颗粒可通过下述方法制备，其中将脂质以15.4mM的浓度和50:10:38.5:1.5的摩尔比(可电离脂质:DSPC:胆固醇:DMG-PEG2K脂质)溶解在乙醇中，并与稀释在25mM乙酸钠(pH 5.0)中的浓度为0.1515mg/mL的mRNA混合。在每种配制物中将N:P比率设定为5.8。使用微T型混合器(micro-tee mixer)将脂质溶液和mRNA以1:3的脂质:mRNA体积比混合。一旦纳米颗粒形成，它们就在用pH 7.0的1x PBS缓冲液预处理的脱盐色谱柱上进行溶剂交换。通过UV、pH和电导率检测器捕获纳米颗粒的洗脱图。UV图用于收集经过溶剂交换的纳米颗粒。将所得纳米颗粒悬浮液使用Amicon超离心过滤器进行浓缩，并使其通过0.22μm注射器过滤器。将纳米颗粒制备成特定浓度。

通过将GL67溶解在聚乙二醇(15)-羟基硬脂酸酯，

HS15(HS15)中将GL67添加到纳米颗粒核中并以1.25的质量比(GL67:mRNA)后添加到LNP中。具体地，将3HCl-GL67直接溶解在HS15(1mg/mL，约70μM，水)中以生成5mg/mL(6.92mM)的初始储备溶液，该初始储备溶液在溶液中可以是胶束形式。将5mg/mL的GL67用HS15(1mg/mL)进一步稀释(在特定GL67:mRNA重量比下后添加(PA)所需的[GL67])并且在环境温度下经由简单混合添加至LNP中(按体积计1:1)：

[mRNA]0.2mg/mL，[3HCl-GL67]0.25mg/mL，[HS15]0.5mg/mL，[PBS]0.5x。

将LNP用1xPBS进一步稀释(按体积计1:1)：

[mRNA]0.1mg/mL，[3HCl-GL67]0.125mg/mL，[HS15]0.5mg/mL，[PBS]0.75x。

命名为LNP-1a的示例性LNP核如下：

LNP-1a

命名为LNP-1的如所述的示例LNP如下：

LNP-1

HS15的分子量为960-1900，平均分子量为1430。

示例性LNP(不含GL67)可根据图1-3中的示意图制备。图1涉及生成空脂质纳米颗粒的事后装载(PHL)过程，然后将含有核酸的溶液添加到空LNP中。图2涉及后插入/后添加(PHL-PIPA)过程，是指将PEG脂质添加到脂质纳米颗粒中。图3涉及第二代事后装载过程，其包括PEG的后插入/后添加步骤。图4涉及空脂质纳米颗粒原型(“中性组件”)，其中空LNP在pH 8.0下混合且最终配制物为pH 5.0。

实施例3

小角x射线散射(SAXS)

使用来自Anton Paar的内部小角x射线散射仪器(SAXS点2.0)进行x射线散射实验。LNP的mRNA浓度范围通常为0.5至1mg/mL，将LNP装载到直径为1mm的石英毛细管中。从Primux 100微x射线源生成0.154nm波长的x射线。使用来自DECTRIS的二维(2D)EIGER R系列CMOS检测器以575mm的样品与检测器距离测量散射强度。然后对2D数据进行圆平均，得到在0.06nm^-1至4nm^-1范围的一维(1D)图q，其中

是波矢量，λ和θ分别是波长和散射角。针对样品输送和缓冲液背景进一步校正1D数据。根据实施例3制备的LNP-1具有6.42nm的d-间距。LNP-1a具有5.47nm的d-间距。图6示出了LNP-1和LNP-1a的l(q)(au)对比q(nm-1)的图。

实施例4

广义极化(GP)

将Laurdan(6-十二烷酰基-2-二甲基氨基萘烷)以0.075mg/mL的浓度预先溶解在二甲亚砜(DMSO)中。然后将Laurdan/DMSO溶液以0.18mg/mL脂质的浓度添加到LNP溶液中，DMSO与水性缓冲液的体积比为1:500。对于对照实验，按照相同的方案将DMSO而不是Laurdan/DMSO添加到LNP溶液中。使Laurdan染料与LNP溶液温育三小时。使用连接到来自Horiba的内部荧光光谱仪FluoroMax-4的MicroMax 384微孔酶标仪，以340nm的激发波长收集435nm和490nm下的荧光强度。基于以下等式计算广义极化(GP)：

图7示出了根据实施例3制备的LNP-1和LNP-1a的laurdan广义极性(GPL)值。

实施例5

mRNA包封百分比

使用改良的Quant-iT RiboGreen测定测量包封效率(EE％)。为了测定EE％，将纳米颗粒(或PBS，空白)在1X TE中稀释以达到每孔2-4μg/mL mRNA的浓度。将这些样品等分并在1X TE或含有2.5mg/mL肝素缓冲液的1X TE(测量游离mRNA)或含有2％ Triton X-100的TE缓冲液或含有2.5mg/mL肝素的2％ Triton(测量总mRNA)中1:1稀释。添加Quant-iTRiBogreen试剂并使用酶标仪定量荧光信号。包封效率计算如下：

总mRNA：通过用含或不含肝素的洗涤剂Triton(TX)溶解颗粒来定量mRNA的总量。

游离mRNA：通过在含或不含肝素的TE(Tris+EDTA缓冲液)中稀释颗粒来定量未被包封的mRNA的量。

肝素是阴离子糖胺聚糖，其与甾醇胺竞争mRNA，并用于用阳离子剂诸如甾醇胺定量LNP中mRNA的量。

根据实施例2制备的LNP-1具有98％包封的mRNA。

实施例6

健康人支气管上皮细胞模型中的LNP细胞摄取和蛋白质表达

为了评价健康人支气管上皮细胞(HBE)中的LNP细胞摄取和蛋白质表达，使用来自MatTek(Ashland,MA)的EpiAirway模型，即用型3D组织模型。该模型由来自健康供体的人源性气管/支气管上皮细胞组成。

将细胞涂铺在孔径为0.4μm的24mm transwells插入物上，并且在发展融合单层后，从顶室去除培养基，将培养物保持在空气-液体界面(ALI)达4周以实现完全细胞分化和假分层。该模型概括了粘膜纤毛屏障的体内表型并且表现出人相关的组织结构和细胞形态，其3D结构由有组织的角蛋白5+基底细胞、产生粘液的杯状细胞、功能性紧密接头和跳动的纤毛组成。

健康HBE细胞中的积聚和表达测定

将掺入0.1摩尔％罗丹明-DOPE和包封NPI-Luc报告mRNA的LNP在Hyclone磷酸盐缓冲盐水中在健康HBE中顶端给药。将细胞用1mM DTT的PBS溶液洗涤10分钟，之后添加LNP以去除ALI后分化期间积聚的粘液。NPI-Luc报告蛋白包括在N端的核定位序列和多个V5标签，以增强表达的蛋白质分子的检测灵敏度。将LNP转染的细胞温育4-72小时，之后使用胰蛋白酶EDTA将细胞从膜上分离并在含有4％ PFA的PBS的悬浮液中固定。

针对LNP积聚和蛋白质表达单独处理细胞。为了定量LNP积聚，将PFA固定的细胞转移到具有光学透明的环烯烃底部的96孔Cell Carrier Ultra板(PerkinElmer)中用于高含量分析，并使用Opera Phenix旋转圆盘共聚焦显微镜(PerkinElmer)成像。使用DAPI(405nm通道)检测细胞，并且使用罗丹明-DOPE(561nm通道)检测LNP积聚。在Harmony 4.8中，在561nm通道中使用斑点分割进行图像分析来定量内吞细胞器中的LNP积聚，并且得到LNP摄取阳性的细胞％以及每个细胞的LNP积聚。

为了定量蛋白质表达，将PFA固定的细胞转移到96孔v型底板中，并使用抗V5兔单克隆抗体进行免疫荧光(IF)处理。简言之，将细胞用0.5％ TX-100透化5分钟，用1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭30分钟，接着在室温下与抗V5一抗温育1小时，并与Alexa488缀合的二抗温育30分钟。在不同的温育步骤之间，将细胞离心并通过在PBS中重悬来洗涤。在抗V5 IF染色后，将细胞转移到96孔Cell Carrier Ultra板中，用Opera Phenix成像，使用488nm通道检测NPI-Luc表达。在Harmony 4.8中进行图像分析，使用488nm通道中的平均核强度得到蛋白质表达阳性的％细胞和每个细胞的蛋白质表达。

实施例7

人宫颈癌上皮细胞(HeLa)模型中的蛋白质表达

为了评价体外蛋白质表达，使用来自ATCC.org(ATCC CCL-2)的HeLa细胞。在运行实验之前，将细胞在完全最小基本培养基(MEM)中培养并涂铺在具有PDL涂覆表面(PerkinElmer)的96孔Cell Carrier Ultra板中。

HeLa细胞中的表达测定

用不存在血清的MEM培养基对包封NPI-Luc mRNA的LNP给药。将LNP转染的细胞在LNP转染后温育5小时，使用Opera Phoenix旋转圆盘共聚焦显微镜(PerkinElmer)对细胞进行实时成像。使用DAPI(405nm通道)检测细胞，并在Harmony 4.9中进行图像分析以定量细胞数目。成像后，用One-Glo荧光素酶测定(Promega)处理细胞以定量蛋白质表达。结果报告为以细胞计数作归一化的相对发光单位(RLU)。

实施例8

使用事后方法产生纳米颗粒组合物

示例性的空脂质纳米颗粒可通过下述方法制备，其中将脂质以40mM的浓度和50.5:10.1:38.9:0.5的摩尔比(可电离脂质:DSPC:胆固醇:DMG-PEG2K脂质)溶解在乙醇中，并与7.15mM乙酸钠(pH 5.0)混合。使用多入口涡旋混合器将脂质溶液和缓冲液以3:7的脂质:缓冲液体积比混合。在5秒停留时间后，将eLNP与5mM乙酸钠(pH 5.0)以5:7的eLNP:缓冲液体积比混合。然后将稀释的eLNP进行缓冲液交换并使用切向流过滤浓缩到含有5mM乙酸钠(pH 5.0)的最终缓冲液中，随后添加蔗糖溶液以完成储存基质。使用PHL方法将mRNA装载到eLNP中。示例性的装载mRNA的纳米颗粒可以通过将脂质浓度为2.85mg/mL的eLNP与浓度为0.25mg/mL的mRNA在42.5mM乙酸钠(pH 5.0)中混合来制备。在每种配制物中将N:P比率设定为4.93。使用多入口涡旋混合器将eLNP溶液和mRNA以3:2的eLNP:mRNA体积比混合。一旦eLNP装载有mRNA，它们就经历30秒-60秒的停留时间，然后与含有120mM TRIS(pH 8.12)的缓冲液以5:1的纳米颗粒:缓冲液体积比连续混合。在该添加步骤后，将纳米颗粒配制物与含有20mM TRIS、0.352mg/mL DMG-PEG2k、0.625mg/mL GL-67(pH 7.5)的缓冲液以6:1的纳米颗粒:缓冲液体积比连续混合。将所得纳米颗粒悬浮液使用切向流过滤进行浓缩，并用盐溶液稀释至含有70mM NaCl的最终缓冲基质中。将所得纳米颗粒悬浮液通过0.8/0.2μm胶囊过滤器过滤并填充到玻璃小瓶中，mRNA浓度为0.5-2mg/mL。

实施例9

甾醇胺的合成

A.化合物SA1：(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-N,N,10,13-四甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-胺

SA1如Justus Liebigs Annalen der Chemie,663,135-49(1963)中所述那样制备。

B.化合物SA2：2-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺

SA2如Biochem.and Biophys.Res.Communications,6,359(1961)中所述那样制备。

C.化合物SA3：(3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐

SA3购自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,AL)。

D.化合物SA4：(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

SA4购自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,AL)。

E.化合物SA5：4-((((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)二硫烷基)甲基)-1H-咪唑

SA5如美国专利申请20140288160中所述那样制备(“可裂解脂质”)。

F.化合物SA6：(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

在干燥氮气下，在0℃下在5分钟内向2-[(2-氨基乙基)(甲基)氨基]乙醇(53mg，0.44mmol)在1mL无水DCM中的搅拌溶液中滴加胆固醇氯甲酸酯(100mg，0.22mmol)在2mL无水DCM中的溶液。使反应缓慢升温至室温并搅拌过夜，之后通过LCMS检测没有原材料剩余。将白色混合物浓缩，并将残余物通过硅胶色谱法纯化(100％DCM至20％ DCM/80％ DCM/MeOH/NH₄OH(80:20:1))，得到呈白色固体的(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(57mg，0.11mmol，48％)。MS(ES):m/z(MH⁺)531.5，对于C₃₆H₆₄N₂O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.36(d,1H,J＝5.1Hz)；5.02(t,1H,J＝5.3Hz)；4.48(m,1H)；3.61(t,2H,J＝5.3Hz)；3.27(q,2H,J＝5.5Hz,11.2Hz)；2.69(br.s,4H)；2.55(m,4H)；2.42-2.16(m,5H)；2.10-1.71(m,5H)；1.63-1.22(m,11H)；1.21-0.95(m,13H)；0.90(d,3H,J＝6.5Hz)；0.88(dd,6H,J＝1.2Hz,6.6Hz)；0.66(s,3H)。

G.化合物SA7：(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

以与SA6相同的方式制备SA7，但使用2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙胺代替2-[(2-氨基乙基)(甲基)氨基]乙醇，得到呈白色固体的(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(115mg，0.21mmol，93％)。MS(ES):m/z(MH⁺)556.5，对于C₃₅H₆₁N₃O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.37(d,1H,J＝5.0Hz)；5.08(m,1H)；4.48(m,1H)；3.59(t,2H,J＝6.4Hz)；3.27(d,2H,J＝5.3Hz)；2.71(br.s,4H)；2.57-2.45(m,8H)；2.42-2.18(m,3H)；2.05-1.72(m,5H)；1.70-1.23(m,11H)；1.22-0.95(m,13H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.1Hz,6.6Hz)；0.67(s,3H)。

H.化合物SA8：(2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

以与SA6相同的方式制备SA8，但使用2-[4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基]乙醇代替2-[(2-氨基乙基)(甲基)氨基]乙醇，得到呈白色固体的(2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(85mg，0.15mmol，87％)。MS(ES):m/z(MH⁺)589.9，对于C₃₆H₆₃N₃O₃而言。¹H NMR(300MHz,CDC l₃)δ:ppm 5.37(d,1H,J＝5.0Hz)；5.08(m,1H)；4.50(m,1H)；3.61(t,2H,J＝6.4Hz)；3.27(d,2H,J＝5.3Hz)；2.69(br.s,4H)；2.57-2.45(m,11H)；2.42-2.18(m,3H)；2.05-1.72(m,5H)；1.70-1.23(m,11H)；1.22-0.95(m,13H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.1Hz,6.6Hz)；0.67(s,3H)。

I.化合物SA9：(3-((2-羟乙基)(甲基)氨基)丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

以与SA6相同的方式制备SA9，但使用2-[(3-氨基丙基)(乙基)氨基]乙醇代替2-[(2-氨基乙基)(甲基)氨基]乙醇，得到呈无色油状物的(3-((2-羟乙基)(甲基)氨基)丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(97mg，0.18mmol，80％)。MS(ES):m/z(MH⁺)545.5，对于C₃₄H₆₀N₂O₃而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.35(d,1H,J＝5.1Hz)；5.19(m,1H)；4.45(m,1H)；3.60(t,2H,J＝5.3Hz)；3.21(m,2H)；2.51(t,2H,J＝5.2Hz)；2.44(t,2H,J＝6.9Hz)；2.39-1.73(m,10H)；1.71-1.25(m,14H)；1.24-0.95(m,12H)；0.89(d,3H,J＝6.4Hz)；0.84(dd,6H,J＝1.2Hz,6.6Hz)；0.65(s,3H)。

J.化合物SA10：(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

步骤1：4-硝基苯基碳酸β-谷甾醇酯

将β-谷甾醇(8.00g，19.3mmol)、三乙胺(5.4mL，39mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.471g，3.86mmol)在DCM(80mL)中的搅拌溶液在冰浴中冷却至0℃。在2分钟内逐份添加氯甲酸4-硝基苯酯(4.277g，21.22mmol)。使反应混合物缓慢达到室温过夜并通过LCMS监测。在21小时，将反应混合物在冰浴中冷却至0℃，然后添加三乙胺(2.7mL)和氯甲酸4-硝基苯酯(3.00g)。使反应混合物达到室温。在40小时，将反应混合物过滤，并将滤液在1小时内滴加到在冰浴中冷却至0℃的烧瓶的搅拌ACN(250mL)中。通过真空过滤收集固体，用ACN冲洗，得到呈灰白色固体的4-硝基苯基碳酸β-谷甾醇酯(9.15g，15.8mmol，81.8％)。UPLC/ELSD:RT＝3.38分钟。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.28(m,2H),7.39(m,2H),5.37-5.49(m,1H),4.54-4.69(m,1H),2.36-2.57(m,2H),0.86-2.10(br.m,27H),1.05(s,3H),0.93(d,3H,J＝6.4Hz),0.78-0.88(m,9H),0.69(s,3H)。

步骤2a：(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

将(2-氨基乙基)二甲胺(0.11mL，1.0mmol)添加到4-硝基苯基碳酸β-谷甾醇酯(0.487g，0.840mmol)和三乙胺(0.18mL，1.3mmol)在DCM(8.4mL)中的搅拌溶液中。将反应混合物在40℃下搅拌并通过LCMS监测。在2小时，使反应混合物冷却至室温。将反应混合物用DCM稀释并用水洗涤。将水性混合物用DCM萃取。使合并的有机层通过疏水玻璃料，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将粗制材料经由硅胶色谱法纯化(0-20％(5％浓NH₄OH的MeOH水溶液)的DCM溶液)，得到呈灰白色固体的(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(0.296g，0.56mmol，66.6％)。UPLC/ELSD:RT＝2.43分钟。MS(ES):m/z＝529.3[M+H]⁺，对于C₃₄H₆₀N₂O₂而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ5.34-5.41(m,1H),5.01-5.71(m,1H),4.42-4.58(m,1H),3.24(dt,2H,J＝5.6,5.4Hz),2.19-2.44(m,2H),2.39(t,2H,J＝6.0Hz),2.22(s,6H),1.76-2.05(br.m,5H),0.88-1.72(br.m,22H),1.01(s,3H),0.92(d,3H,J＝6.4Hz),0.77-0.88(m,9H),0.68(s,3H)。

步骤2b：(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

向4-硝基苯基碳酸β-谷甾醇酯(2.50g，4.31mmol)和CHCl₃(40mL)的搅拌溶液中添加(2-氨基乙基)二甲胺(0.56mL，5.2mmol)和三乙胺(0.91mL，6.5mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌并通过LC MS监测。在26小时，将反应混合物冷却至室温，用水洗涤(3x)，使其通过疏水玻璃料，然后浓缩。将残余物溶解在iPrOH(15mL)和DCM(10mL)中，得到黄色溶液。向黄色溶液中滴加5-6N HCl的iPrOH溶液(1.0mL)，并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将溶液浓缩以去除DCM，然后添加ACN(10mL)。将混合物在0℃下在冰浴中搅拌15分钟，然后通过真空过滤收集固体，用1:1ACN:iPrOH冲洗，得到呈白色固体的(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐(1.984g，3.344mmol，77.6％)。UPLC/ELSD:RT＝2.43分钟。MS(ES):m/z＝529.3[M+H]⁺，对于C₃₄H₆₀N₂O₂而言；¹H NMR(300MH z,CDCl₃):δ12.49(br.s,1H),6.25-6.37(m,1H),5.33-5.40(m,1H),4.40-4.55(m,1H),3.66(dt,2H,J＝5.4,5.3Hz),3.19(dt,2H,J＝5.4,5.3Hz),2.86(d,6H,J＝4.9Hz),2.24-2.42(m,2H),1.75-2.07(br.m,5H),0.88-1.72(br.m,22H),1.00(s,3H),0.92(d,3H,J＝6.4Hz),0.77-0.88(m,9H),0.67(s,3H)。

K.化合物SA11：3-(1H-咪唑-5-基)丙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

如WO 2011/068810(“Delivery of mRNA for the augmentation of proteinsand enzymes in human genetic diseases”)中所述那样制备SA11，然后用2.5当量的2M氯化氢的乙醚溶液将其转化成盐酸盐。将所得沉淀用另外的乙醚洗涤，风干，然后真空干燥，得到呈白色固体的3-(1H-咪唑-5-基)丙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐(29mg，0.05mmol，77％)。MS(ES):m/z(MH⁺)509.8，对于C₃₃H₅₂N₂O₂而言。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm7.54(s,1H)；6.80(s,1H)；5.36(d,1H,J＝4.0Hz)；4.62(m,1H)；2.91(t,2H,J＝6.8Hz)；2.64(d,2H,J＝6.9Hz)；2.30(d,1H,J＝7.8Hz)；2.07-1.72(m,6H)；1.70-0.94(m,28H)；0.91(d,3H,J＝6.4Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.0Hz,6.5Hz)；0.67(s,3H)。

L.化合物SA12：(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)十六氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

在干燥氮气下，将(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)十六氢-1H-环戊[a]菲-3-醇(280mg，0.72mmol)在5mL无水DCM中的搅拌溶液冷却至0℃，并添加三乙胺(60μL，1.1mmol)，然后在5分钟内滴加氯甲酸对硝基苯酯(220mg，1.1mmol)在2mL无水DCM中的溶液。十分钟后，移去冷却浴，并将混合物在室温下搅拌三小时，之后通过TLC检测没有原材料剩余。向反应中滴加N,N-二甲基乙二胺(纯的；90μL，0.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。然后将反应混合物用DCM稀释并用1N NaOH水溶液洗涤两次。将有机物干燥(MgSO₄)并过滤。将滤液浓缩成浅黄色固体。将该黄色固体经由硅胶色谱法纯化(0-20％(5％浓NH₄OH的MeOH水溶液)的DCM溶液)，得到呈白色固体的(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)十六氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(270mg，0.54mmol，75％)。MS(ES):m/z(MH⁺)503.9，对于C₃₂H₅₈N₂O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.12(m,1H)；4.56(m,1H)；3.25(d,2H,J＝5.4Hz)；2.41(t,2H,J＝5.8Hz)；2.23(s,6H)；2.15-1.90(m,1H)；1.89-1.41(m,11H):1.40-0.94(m,18H)；0.89(d,3H,J＝6.6Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.2Hz,6.6Hz)；0.80(s,3H)；0.64(m,4H)。

M.化合物SA13：(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

以与SA12相同的方式制备SA13，但使用(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-醇代替(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)十六氢-1H-环戊[a]菲-3-醇，得到呈白色固体的(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(210mg，0.40mmol，77％)。MS(ES):m/z(MH⁺)527.9，对于C₃₄H₅₈N₂O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.36(d,1H,J＝5.1Hz)；5.15(dd,2H,J＝8.4Hz,15.1Hz),5.01(dd,1H,J＝8.4Hz,15.1Hz),4.48(m,1H),3.25(q,2H,J＝5.4Hz,11Hz)；2.40(t,2H,J＝6.1Hz)；2.36-2.13(m,8H)；2.12-1.77(m,6H)；1.76-1.39(m,9H)；1.37-1.07(m,6H)；1.06-0.90(m,8H)；0.89-0.74(m,9H),0.69(s,3H)。

N.化合物SA14：(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

以与SA12相同的方式制备化合物SA14，但使用(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-醇代替(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)十六氢-1H-环戊[a]菲-3-醇并且使用2-[(2-氨基乙基)(甲基)氨基]乙醇代替N,N-二甲基乙二胺，得到呈白色固体的(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(92mg，0.16mmol，93％)。MS(ES):m/z(MH⁺)557.46，对于C₃₅H₆₀N₂O₃而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm5.36(d,1H,J＝5.1Hz)；5.19-5.11(m,1H)；5.04-4.97(m,1H)；4.49(m,1H),3.62(t,2H,J＝5.2Hz)；3.28(d,2H,J＝5.6Hz)；2.57(m,4H)；2.45-2.18(m,5H)；2.16-1.62(m,8H)；1.60-1.08(m,15H)；1.07-0.89(m,8H)；0.88-0.74(m,9H),0.69(s,3H)。

O.化合物SA15：(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)十六氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

以与SA12相同的方式制备化合物SA14，但使用2-[(2-氨基乙基)(甲基)氨基]乙醇代替N,N-二甲基乙二胺，得到呈白色固体的(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)十六氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(79mg，0.15mmol，82％)。MS(ES):m/z(MH⁺)532.9，对于C₃₃H₆₀N₂O₃而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.19(m,1H)；4.53(m,1H)；3.59(t,2H,J＝5.2Hz)；3.24(d,2H,J＝5.4Hz)；2.53(m,4H)；2.25(s,3H)；2.02-1.38(m,10H)；1.37-0.91(m,19H)；0.86(d,3H,J＝6.6Hz)；0.83(dd,6H,J＝1.2Hz,6.6Hz)；0.77(s,3H)；0.61(m,4H)。

P.化合物SA16：3-(二甲基氨基)-N-(((1R,4aS,10aR)-7-异丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基)甲基)丙烯酰胺

使3-(二甲基氨基)丙酸(1.067g，9.108mmol)在亚硫酰氯(5.1mL，70.1mmol)中的溶液回流30分钟。真空浓缩反应混合物，并将残余物溶解在DCM中并添加((1R,4aS,10aR)-7-异丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基)甲胺(脱氢枞胺；Combi-Blocks,Inc.,San Diego,CA)(2g，7mmol)，接着添加三乙胺(2.9mL，21.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。然后将反应混合物用水淬灭并且用DCM萃取。将有机层用DCM稀释并用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。分离有机层，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化(0-20％ MeOH的DCM溶液)，得到3-(二甲基氨基)-N-(((1R,4aS,10aR)-7-异丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基)甲基)丙烯酰胺(0.441g，1.147mmol，收率16.4％)。UPLC/ELSD:RT＝1.19分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)385.46，对于C₂₅H₄₀N₂O而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 8.42(bs,1H)；7.18(m,1H)；6.99(m,1H)；6.90(m；1H)；3.17(m,2H)；3.01-2.73(m,3H)；2.71-2.53(m,2H)；2.44(m,2H)；2.37-2.16(m,7H)；1.95-1.61(m,4H)；1.51-1.18(m,13H)；0.96(s,3H)。

Q.化合物SA17：(2-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

在干燥氮气下，将3-甲基组胺二盐酸盐(265mg，1.27mmol)在20mL无水DCM和无水2-丙醇的1:1混合物中的溶液边搅拌边冷却至0℃，得到白色浆料。向其中添加三乙胺(520μL，3.7mmol)，接着在十分钟内滴加胆固醇氯甲酸酯(500mg，1.06mmol)在10mL无水THF中的溶液。将所得混合物在0℃下搅拌两小时，之后通过LCMS检测没有原材料剩余。混合物在真空下减少。将残余物用饱和碳酸氢钠水溶液稀释并用DCM萃取两次。合并有机层，干燥(MgSO₄)并过滤。将滤液浓缩成浅黄色固体。将该黄色固体通过硅胶色谱法纯化(100％ DCM至90％ DCM/10％ MeOH)，得到呈白色固体的(2-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(530mg，0.98mmol，93％)。UPLC/ELSD:RT＝2.85分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)538.79，对于C₃₄H₅₅N₃O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 7.42(s,1H)；6.83(s,1H)；5.36(d,1H,J＝5.1Hz)；4.82(m,1H)；4.48(m,1H)；3.58(s,3H)；3.39(q,2H,J＝6.7Hz,13.2Hz)；2.42-2.18(m,2H)；2.16-1.91(m,3H)；1.90-1.73(m,3H)；1.65-1.44(m,6H)；1.43-1.22(m,4H)；1.21-1.06(m,6H)；1.05-0.94(m,6H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(d,6H,J＝6.5Hz)；0.67(s,3H)。

R.化合物SA18：(1R,4aS,10aR)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酰胺

步骤1：(1R,4aS,10aR)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸

向(1R,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸(罗汉松酸；Sigma-Aldrich,Inc.,St.Louis,MO)(0.5g,1.8mmol)在DMF(9.1mL，0.2M)中的搅拌溶液中添加咪唑(0.496g，7.29mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(0.275g，1.822mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水稀释并用DCM萃取。将有机物用水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并真空蒸发。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化(0-20％ MeOH的DCM溶液)，得到(1R,4aS,10aR)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸(0.471g，1.212mmol，收率67％)。UPLC/ELSD:RT＝3.55分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)389.56，对于C₂₃H₃₆O₃Si而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 6.80(m,1H)；6.63(m,1H)；6.48(m,1H)；2.81-2.51(m,2H)；2.18-2.00(m,3H)；2.00-1.75(m,2H)；1.57-1.21(m,3H)；1.17(s,3H)；1.05-0.77(m,14H)；0.15(m,6H)。

步骤2：(1R,4aS,10aR)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酰胺

向(1R,4aS,10aR)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸(0.213g，0.548mmol)在DCM(2.7mL)中的溶液中添加(1-氯-2-甲基丙-1-烯-1-基)二甲胺(0.16mL，1.206mmol)。将反应在室温下搅拌1小时并真空蒸发。将残余物再溶解在DCM(2.7mL)中并添加(2-氨基乙基)二甲胺(0.081mL，0.822mmol)，接着添加三乙胺(0.2mL，1.6mmol)。将反应在室温下搅拌16小时，用DCM稀释，并用饱和碳酸氢钠洗涤。分离有机层，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化(0-20％ MeOH的DCM溶液)，得到(1R,4aS,10aR)-N-[2-(二甲基氨基)乙基]-6-羟基-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-羧酰胺(0.095g，0.276mmol，收率50％)。UPLC/ELSD:RT＝1.53分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)345.37，对于C₂₁H₃₂N₂O₂而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 6.92(m,1H)；6.77(m,1H)；6.74-6.57(m,2H)；3.44(m,2H)；2.94-2.58(m,4H)；2.42(bs,6H)；2.32-2.16(m,3H)；2.14-1.92(m,2H)；1.74-1.61(m,1H)；1.59-1.07(m,10H)。

S.化合物SA19：(1R,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸2-(二甲基氨基)乙酯

步骤1：(1R,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸甲酯

在5分钟内向(1R,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸(罗汉松酸；Sigma-Aldrich,Inc.,St.Louis,MO)(1.9g，6.925mmol)在MeOH(9mL)和甲苯(18mL)中的搅拌溶液滴加三甲基甲硅烷基重氮甲烷[4.9mL(2M的己烷溶液)，9.695mmol]。使溶液在室温下搅拌1小时。用AcOH淬灭过量的三甲基甲硅烷基重氮甲烷，并真空蒸发反应混合物。将残余物溶解在DMF(35mL)中并添加碳酸铯(9.03g，27.74mmol)和苄基溴(1.3mL，10.4mmol)。使溶液搅拌1小时。将反应用水稀释并用DCM萃取。将有机层用水和盐水洗涤。分离有机层，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化(0-100％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到(1R,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸甲酯(2.12g，5.60mmol，收率81％)。UPLC/ELSD:RT＝3.53分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)379.48，对于C₂₅H₃₀O₃而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 7.38-7.17(m,5H)；6.86(m,1H)；6.78(m,1H)；6.64(m,1H)；4.92(s,2H)；3.56(s,3H)；2.82-2.55(m,2H)；2.23-2.02(m,3H)；1.96-1.74(m,2H)；1.56-1.14(m,6H)；1.05-0.89(m,4H)。

步骤2：(1R,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸2-(二甲基氨基)乙酯

向(1R,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸甲酯(2.1g，5.548mmol)在DMSO(28mL)中的搅拌溶液中添加叔丁醇钾(9.34g，83.22mmol)。使溶液搅拌1小时。然后，将反应混合物倒入冰水中，用2N HCl水溶液酸化，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并减压蒸发溶剂。将残余物溶解在DCM(65mL)中，添加草酰氯(2.2mL，25.8mmol)，接着添加DMF(0.01mL)。使溶液搅拌1小时。蒸发挥发物，并将残余物溶解在DCM(7mL)中。添加二甲基氨基乙醇(0.21mL，2.06mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(0.033g，0.274mmol)，接着添加三乙胺(0.6mL，4.1mmol)。使溶液搅拌1小时。将残余物用DCM稀释并用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。分离有机层，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并真空蒸发。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化(0-20％ MeOH的DCM溶液)，得到(1R,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸2-(二甲基氨基)乙酯(0.323g，0.741mmol，收率54％)。UPLC/ELSD:RT＝3.13分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)436.14，对于C₂₈H₃₇NO₃而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm7.51-7.30(m,5H)；6.99(m,1H)；6.91(m,1H)；6.76(m,1H)；5.04(s,2H)；4.23(m,2H)；2.93-2.60(m,4H)；2.44-2.13(m,9H)；2.10-1.91(m,2H)；1.71-1.51(m,2H)；1.48-1.35(m,1H)；1.31(s,3H)；1.17-1.03(m,4H)。

步骤3：(1R,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸2-(二甲基氨基)乙酯

在N₂下向含有氢氧化钯(0.07g)的烧瓶中添加(1R,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸2-(二甲基氨基)乙酯(0.31g，0.71mmol)在乙醇(4mL)中的溶液。将反应在氢气球下在室温下搅拌过周末。将反应通过硅藻土塞过滤并真空蒸发滤液。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化(0-20％ MeOH的DCM溶液)，得到(1R,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-2,3,4,9,10,10a-六氢菲-1-甲酸2-(二甲基氨基)乙酯(0.14g，0.41mmol，收率57％)。UPLC/ELSD:RT＝2.04分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)346.11，对于C₂₁H₃₁NO₃而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 6.92(m,1H)；6.75(m,1H)；6.60(m,1H)；4.21(m,2H)；2.90-2.60(m,4H)；2.42-2.12(m,9H)；2.08-1.90(m,2H)；1.69-1.51(m,2H)；1.48-1.34(m,1H)；1.30(s,3H)；1.17-1.02(m,4H)。

T.化合物SA20：3-(吡啶-4-基)丙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

在干燥氮气下，向3-(吡啶-4-基)丙酸(196mg，1.27mmol)和胆固醇(415mg，1.06mmol)在10mL无水DCM中的搅拌溶液中添加EDC-HCl(320mg，1.57mmol)和DMAP(65mg，0.53mmol)，接着添加DIEA(560μL，3.2mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过LCMS检测没有原材料剩余，因此将反应用饱和碳酸氢钠水溶液稀释并用DCM萃取两次。合并有机层，干燥(MgSO₄)，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化(0-10％ MeOH的DCM溶液)，得到呈白色固体的3-(吡啶-4-基)丙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(370mg，0.71mmol，67％)。UPLC/ELSD:RT＝3.09分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)520.59，对于C₃₅H₅₃NO₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 8.52(d,2H,J＝6.1Hz)；7.20(d,2H,J＝6.0Hz)；5.37(d,1H,J＝4.5Hz)；4.60(m,1H)；2.97(t,2H,J＝7.4Hz)；2.64(t,2H,J＝7.4Hz)；2.27(d,2H,J＝7.9Hz)；2.08-1.91(m,2H)；1.90-1.74(m,3H)；1.64-1.22(m,11H)；1.21-1.05(m,7H)；1.04-0.95(m,6H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.2Hz,6.5Hz)；0.67(s,3H)。

U.化合物SA21：(3-(6-氨基吡啶-3-基)丙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

在干燥氮气下，向3-(6-氨基吡啶-3-基)丙酸(270mg，1.54mmol)和胆固醇(500mg，1.28mmol)在10mL无水DCM中的搅拌溶液中添加EDC-HCl(390mg，1.9mmol)和DMAP(79mg，0.64mmol)，接着添加DIEA(680μL，3.8mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过LCMS检测没有原材料剩余，因此将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液稀释并用DCM萃取两次。将有机层合并，干燥(MgSO₄)并过滤，并且浓缩滤液，得到浅黄色固体。将该固体通过硅胶色谱法纯化(0-10％ MeOH的DCM溶液)，得到呈白色固体的3-(6-氨基吡啶-3-基)丙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(281mg，0.52mmol，41％)。UPLC/ELSD:RT＝3.10分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)535.68，对于C₃₅H₅₄N₂O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 7.88(d,1H,J＝2.0Hz)；7.36(dd,1H,J＝2.3Hz,8.5Hz)；6.50(d,1H,J＝8.5Hz)；5.36(d,1H,J＝4.4Hz)；4.75-4.54(m,3H)；2.81(t,2H,J＝7.4Hz)；2.54(t,2H,J＝7.6Hz)；2.28(d,2H,J＝7.7Hz)；2.08-1.91(m,3H)；1.90-1.74(m,3H)；1.65-1.23(m,10H)；1.22-0.94(m,13H)；1.04-0.95(m,6H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝0.9Hz,6.6Hz)；0.67(s,3H)。

V.化合物SA22：(2-氨基乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

在干燥氮气下，将乙二胺(4.6mL，64.8mmol)在20mL无水DCM中的搅拌溶液冷却至0℃，并且在二十分钟内滴加胆固醇氯甲酸酯(2.0g，4.3mmol)在20mL无水DCM中的溶液。使所得混合物边搅拌边温热至室温过夜。将反应混合物用DCM稀释，用水洗涤三次，干燥(MgSO₄)并过滤，并将滤液浓缩为白色固体。将该白色固体溶解在热乙醇中并使其通过棉塞。用乙腈稀释滤液直到材料开始沉淀。将混合物在4℃下放置过夜。经由过滤分离所得固体并用乙腈洗涤。将滤液浓缩，用乙腈研磨并过滤。将过滤的固体用乙腈洗涤，风干，然后真空干燥，得到呈白色固体的(2-氨基乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(1.56g，3.3mmol，76％)。UPLC/ELSD:RT＝2.70分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)473.55，对于C₃₀H₅₂N₂O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.36(d,1H,J＝4.6Hz)；4.96(m,1H)；4.50(m,1H)；3.23(q,2H,J＝5.6Hz,11.6Hz)；2.83(t,2H,J＝5.8Hz)；2.42-2.19(m,2H)；2.06-1.75(m,5H)；1.65-1.05(m,19H)；1.04-0.94(m,6H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(d,6H,J＝6.5Hz)；0.67(s,3H)。

W.化合物SA23：(2-胍基乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

步骤1：

向(2-氨基乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯SA22(300mg，0.63mmol)和N¹,N²-双-Boc-胍-N³-三氟甲磺酸酯(250mg，0.63mmol)在5mL无水DCM中的搅拌溶液中添加三乙胺(92μL，0.66mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜，之后通过LCMS检测没有原材料剩余。将混合物用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，干燥(MgSO₄)并过滤。将滤液浓缩成浅黄色浆料。将该浅黄色浆料通过硅胶色谱法纯化(0-30％ EtOAc的己烷溶液)，得到呈白色固体是产物(384mg，0.53mmol，85％)。UPLC/ELSD:RT＝3.35分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)715.66，对于C₄₁H₇₀N₄O₆而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm11.45(s,1H)；8.59(br.s,1H)；5.56(s,1H)；5.36(d,1H,J＝4.9Hz)；4.49(m,1H)；3.60(s,2H)；3.37(d,2H,J＝8.8Hz)；2.42-2.19(m,2H)；2.06-1.75(m,5H)；1.67-1.44(m,23H)；1.43-1.22(m,4H)；1.21-0.94(m,11H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.1Hz,6.6Hz)；0.68(s,3H)。

步骤2：(2-(胍基乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

向步骤1的产物(384mg，0.53mmol)在5mL无水DCM中的搅拌溶液中添加HCl在乙醚中的2M溶液(1.33mL，2.66mmol)。将反应容器紧密密封。将反应混合物加热至40℃并搅拌过夜。再添加2MHCl的醚溶液(5mL，10mmol)。将小瓶密封，并将反应物加热至40℃过夜。通过LCMS检测没有原材料剩余，因此将混合物在氮气流中浓缩。将白色残余物用乙醚研磨并过滤。将过滤的固体用乙醚洗涤并风干，然后真空干燥，得到呈白色固体的N-(2-{[(Z)-[(叔丁氧羰基)氨基][(叔丁氧羰基)亚氨基]甲基]氨基}乙基)氨基甲酸(1R,3aS,3bS,7S,9aR,9bS,11aR)-9a,11a-二甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-2-基]-1H,2H,3H,3aH,3bH,4H,6H,7H,8H,9H,9bH,10H,11H-环戊[a]菲-7-基酯盐酸盐(235mg，0.42mmol，79％)。UPLC/ELSD:RT＝2.71分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)515.73，对于C₃₁H₅₄N₄O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 7.88(br.s,1H)；7.16(br.s,4H)；5.96(br.s,1H)；5.36(s,1H)；4.42(m,1H)；3.55-3.18(m,4H)；2.31(s,2H)；2.08-1.65(m,7H)；1.64-1.22(m,11H)；1.23-0.94(m,14H)；0.92(d,3H,J＝5.9Hz)；0.86(d,6H,J＝6.6Hz)；0.68(s,3H)。

X.化合物SA24：4-(双(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐

步骤1：4-(双(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

将(-)-胆固醇NHS琥珀酸酯(517mg，0.886mmol)和3,3′-亚氨基双(N,N-二甲基丙胺)(0.40mL，1.8mmol)合并在THF(6.0mL)中。将反应混合物在室温下搅拌并通过TLC监测。在20小时，将反应混合物用DCM稀释，然后用水洗涤。用DCM萃取水层(2x)。使合并的有机物通过疏水玻璃料，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将粗制材料经由硅胶色谱法纯化(0-20％(10％浓NH₄OH的MeOH水溶液)的DCM溶液)，得到呈透明、粘稠油状物的4-(双(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(425mg，0.607mmol，68.5％)。UPLC/ELSD:RT＝2.11分钟。MS(ES):m/z＝656.6[M+H]⁺，对于C₄₁H₇₃N₃O₃而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ5.32-5.39(m,1H),4.54-4.68(m,1H),3.29-3.40(m,4H),2.64(s,4H),2.18-2.35(m,5H),2.21(s,12H),0.82-2.05(br.m,31H),1.01(s,3H),0.91(d,3H,J＝6.5Hz),0.86(d,3H,J＝6.6Hz),0.86(d,3H,J＝6.6Hz),0.67(s,3H)。

步骤2：4-(双(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐

向4-(双(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(0.135g，0.206mmol)在DCM(6.8mL)和iPrOH(2.7mL)的混合物中的搅拌溶液中滴加5-6N HCl的iPrOH溶液(0.10mL)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后浓缩。添加ACN(5mL)，并将混合物在0℃冰浴中搅拌。添加ACN(5mL)。浓缩混合物。添加ACN(3mL)，并将混合物超声处理。通过真空过滤收集固体并用冷ACN冲洗。将固体悬浮在1:1AC N/iPrOH中并浓缩，得到呈灰白色固体的4-(双(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐(0.079g，0.10mmol，49.1％)。UPLC/ELSD:RT＝1.94分钟。MS(ES):m/z＝656.3[M+H]⁺，对于C₄₁H₇₃N₃O₃而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ12.33(br.s,1H),12.14(br.s,1H),5.28-5.38(m,1H),4.45-4.61(m,1H),3.51-3.72(m,4H),3.13-3.26(m,2H),2.97-3.09(m,2H),2.90(d,6H,J＝4.8Hz),2.81(d,6H,J＝4.7Hz),2.55-2.72(m,4H),2.25-2.43(m,4H),2.10-2.24(m,2H),1.75-2.06(br.m,5H),0.92-1.71(br.m,21H),1.01(s,3H),0.91(d,3H,6.4Hz),0.86(d,3H,J＝6.6Hz),0.86(d,3H,J＝6.5Hz),0.67(s,3H)。

Y.化合物SA25：(2-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

步骤1：(2-((2-甲氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

将(2-氨基乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(SA22，1g，2.1mmol)和3,4-二甲氧基-3-环丁烯-1,2-二酮(600mg，4.2mmol)在20mL的1:1DCM/MeOH混合物中的搅拌混合物温热至35℃。将混合物澄清，并且将所得无色溶液在室温下搅拌过夜，之后通过LCMS检测没有原材料剩余。将混合物用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，干燥(MgSO₄)并过滤。将滤液浓缩，得到呈白色固体的2-((2-甲氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(1.06g，1.8mmol，86％)。UPLC/ELSD:RT＝3.27分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)583.68，对于C₃₅H₅₄N₂O₅而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 6.30(br.s,0.5H)；5.99(br.s,0.5H)；5.37(d,1H,J＝5.5Hz)；4.95(m,1H)；4.48(m,1H)；4.38(d,3H,J＝3.5Hz)；3.79(m,1H)；3.56(m,1H)；3.40(q,2H,J＝5.6Hz,10.6Hz)；2.40-2.19(m,2H)；2.07-1.75(m,5H)；1.68-1.23(m,11H)；1.22-0.94(m,12H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.1Hz,6.6Hz)；0.68(s,3H)。

步骤2：(2-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

向2-((2-甲氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(200mg，0.34mmol)在5mL甲醇中的搅拌悬浮液中添加N,N-二甲基乙二胺(60μL，0.51mmol)。将混合物加热至45℃并搅拌过夜，之后通过LCMS检测没有原材料剩余。使不透明的白色混合物冷却至室温并过滤。将过滤的固体用甲醇洗涤，然后用乙腈洗涤。将固体风干，得到脆性黄色固体。将该黄色固体粉碎，真空干燥，并悬浮在10mL的DCM/甲醇的1:1混合物中。将混合物加热实现几乎完全溶解并过滤。边搅拌边向滤液中添加2M HCl的乙醚溶液(1.0mL，2mmol)。将所得溶液在氮气流中浓缩，并将所得固体真空干燥，得到呈白色固体的(2-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)氨基)-3,4-二氧环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐(150mg，0.22mmol，65％)。UPLC/ELSD:RT＝2.57分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)639.56，对于C₃₈H₆₂N₄O₄而言。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:ppm 10.00(br.s,1H)；7.94(m,2H)；7.16(t,1H,J＝5.5Hz)；5.32(d,1H,J＝3.6Hz)；4.29(m,1H)；3.83(d,2H,J＝5.7Hz)；3.50(br.s,2H)；3.37(br.s,2H)；3.26(br.s,2H)；3.13(q,2H,J＝5.2Hz,11.1Hz)；2.80(s,6H)；2.33-2.10(m,2H)；2.04-1.68(m,5H)；1.63-1.23(m,10H)；1.22-0.97(m,11H)；0.89(d,3H,J＝6.4Hz)；0.83(dd,6H,J＝1.2Hz,6.5Hz)；0.64(s,3H)。

Z.化合物SA26：(2-((2-((3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

以与SA25相同的方式制备SA26，但在步骤2中使用N,N-二甲基丙二胺代替N,N-二甲基乙二胺。向HCl盐进行类似转化，得到呈白色固体的(2-((2-((3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐(168mg，0.24mmol，71％)。UPLC/ELSD:RT＝2.60分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)653.74，对于C₃₉H₆₄N₄O₄而言。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:ppm 10.00(br.s,1H)；7.95(m,2H)；7.15(m,1H)；5.32(d,1H,J＝2.7Hz)；4.29(m,1H)；3.60-3.43(m,4H)；3.19-3.00(m,4H)；2.80(s,6H)；2.35-2.10(m,2H)；2.04-1.68(m,5H)；1.56-1.23(m,10H)；1.22-0.97(m,11H)；0.88(d,3H,J＝6.4Hz)；0.83(dd,6H,J＝0.9Hz,6.6Hz)；0.64(s,3H)。

AA.化合物SA27：(2-((2-((4-(二甲基氨基)丁基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

以与SA25相同的方式制备SA27，但在步骤2中使用N,N-二甲基丁二胺代替N,N-二甲基乙二胺。向HCl盐进行类似转化，得到呈白色固体的(2-((2-((4-(二甲基氨基)丁基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐(145mg，0.34mmol，60％)。UPLC/ELSD:RT＝2.62分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)667.69，对于C₃₉H₆₄N₄O₄而言。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:ppm 10.01(br.s,1H)；8.04(m,2H)；7.14(t,1H,J＝5.4Hz)；5.32(d,1H,J＝2.9Hz)；4.29(m,1H)；3.95(m,2H)；3.49(br.d,4H,J＝4.8Hz)；3.19-2.96(m,4H)；2.72(d,6H,J＝4.9Hz)；2.34-2.08(m,2H)；2.04-1.60(m,5H)；1.59-1.23(m,10H)；1.22-0.97(m,11H)；0.88(d,3H,J＝6.4Hz)；0.83(dd,6H,J＝1.0Hz,6.6Hz)；0.64(s,3H)。

AB.化合物SA28：4-(双(3-氨基丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐

步骤1：4-(双(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

向(-)-胆固醇NHS琥珀酸酯(0.100g，0.172mmol)在THF(0.86mL)中的溶液中添加N-[3-({3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(0.074g，0.22mmol)在THF(0.40mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌并通过LCMS监测。在5小时，添加N-[3-({3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(40mg)。在21小时，将反应混合物用DCM稀释并用水洗涤。用DCM(2x 10mL)萃取水层。使合并的有机物通过疏水玻璃料，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将粗制材料经由硅胶色谱法纯化(30-75％ EtOAc的己烷溶液)，得到呈透明油状物的4-(双(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(定量)。UPLC/ELSD:RT＝3.98分钟。MS(ES):m/z＝700.7[(M+H)–(CH₃)₂C＝CH₂–CO₂]⁺，对于C₄₇H₈₁N₃O₇而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ5.32-5.40(m,1H),5.29(br.s,1H),4.50-4.73(m,2H),3.40(t,2H,J＝6.2Hz),3.32(t,2H,J＝6.8Hz),3.15(dt,2H,J＝6.0,6.4Hz),3.04(dt,2H,J＝5.6,5.7Hz),2.54-2.70(m,4H),2.28-2.37(m,2H),1.75-2.07(br.m,5H),0.94-1.71(br.m,25H),1.44(s,9H),1.43(s,9H),1.01(s,3H),0.91(d,3H,J＝6.4Hz),0.86(d,6H,J＝6.5Hz),0.67(s,3H)。

步骤2：4-(双(3-氨基丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐

向在冰浴中冷却至0℃的4-(双(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(110mg，0.137mmol)在DCM(2.0mL)中的搅拌溶液中滴加4N HCl的二噁烷溶液(0.17mL)。使反应混合物边搅拌边缓慢升温至室温并通过LCMS监测。在3小时，用Et₂O稀释悬浮液。通过真空过滤收集固体，用Et₂O冲洗，得到呈白色固体的4-(双(3-氨基丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐(55mg，0.081mmol，58.7％)。UPLC/ELSD:RT＝2.13分钟。MS(ES):m/z＝600.5[M+H]⁺，对于C₃₇H₆₅N₃O₃而言；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ8.07(br.s,3H),7.90(br.s,3H),5.30-5.37(m,1H),4.36-4.51(m,1H),3.34-3.46(m,4H),2.64-2.91(m,4H),2.47-2.63(m,2H),2.19-2.32(m,2H),1.69-2.05(br.m,7H),0.91-1.64(br.m,25H),0.98,(s,3H),0.90(d,3H,J＝6.4Hz),0.84(d,3H,J＝6.6Hz),0.84(d,3H,J＝6.6Hz),0.65(s,3H)。

AC.化合物SA29：(4-氨基丁基)(3-氨基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐

将(4-((-叔丁氧羰基)氨基)丁基)(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(如Hum.Gene Ther.,7(14),1701-1717(1996))中所述那样制备)(190mg，0.251mmol)在DCM(3.4mL)中的搅拌溶液在冰浴中冷却至0℃。滴加4N HCl的二噁烷溶液(0.31mL)，并且使反应混合物边搅拌边缓慢升温至室温。通过LCMS监测反应。在4小时，添加4N HCl的二噁烷溶液(0.10mL)。在9小时，将反应混合物用Et₂O稀释至约20mL。过滤悬浮液，用Et₂O冲洗。将固体悬浮在庚烷中，并将悬浮液浓缩，得到呈白色固体的(4-氨基丁基)(3-氨基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐(147mg，0.228mmol，91.0％)。UPLC/ELSD:RT＝2.05分钟。MS(ES):m/z＝558.5[M+H]⁺，对于C₃₅H₆₃N₃O₂而言；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ7.93(br.s,6H),5.29-5.38(m,1H),4.26-4.40(m,1H),3.10-3.30(m,4H),2.68-2.86(m,4H),2.20-2.35(m,2H),1.70-2.03(br.m,7H),0.91-1.64(br.m,25H),0.99(s,3H),0.89(d,3H,J＝6.4Hz),0.85(d,3H,J＝6.6Hz),0.84(d,3H,J＝6.6Hz),0.65(s,3H)。

AD.化合物SA30：(3-((4-氨基丁基)氨基)丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐

将(4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)(3-(((((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)氧基)羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(如Hum.Gene Ther.,7(14),1701-1717(1996)中所述那样制备)(215mg，0.284mmol)在DCM(3.9mL)中的搅拌溶液在冰浴中冷却至0℃。滴加4N HCl的二噁烷溶液(0.35mL)，并且使反应混合物边搅拌边缓慢升温至室温。通过LCMS监测反应。在4小时，再添加4N HCl的二噁烷溶液(0.10mL)。在9小时，将反应混合物用Et₂O稀释至约20mL。通过真空过滤收集固体，用Et₂O冲洗。将固体悬浮在庚烷中，然后浓缩，得到呈半透明固体的(3-((4-氨基丁基)氨基)丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐(142mg，0.216mmol，76.1％)。UPLC/ELSD:RT＝2.16分钟。MS(ES):m/z＝558.5[M+H]⁺，对于C₃₅H₆₃N₃O₂而言；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ8.97(br.s,2H),8.03(br.s,3H),7.20(t,1H,J＝5.7Hz),5.26-5.43(m,1H),4.23-4.39(m,1H),2.97-3.12(dt,2H,J＝6.1,6.3Hz),2.70-2.95(m,6H),2.13-2.36(m,2H),0.91-2.05(br.m,32H),0.97(s,3H),0.89(d,3H,J＝6.1Hz),0.84(d,3H,J＝6.6Hz),0.84(d,3H,J＝6.6Hz),0.65(s,3H)。

AE.化合物SA31：4-((4-氨基丁基)(3-氨基丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐

/>

步骤1：4-((4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

向(-)-胆固醇NHS琥珀酸酯(201mg，0.344mmol)在THF(1.7mL)中的溶液中添加N-[3-({4-[(叔丁氧羰基)氨基]丁基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(0.178g，0.516mmol)在THF(1.0mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌并通过LCMS监测。在19小时，将反应混合物用DCM(30mL)稀释，然后用水洗涤。用DCM(10mL)萃取水层。使合并的有机物通过疏水玻璃料，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将粗制材料通过硅胶色谱法纯化(20-65％ EtOAc的己烷溶液)，得到呈白色泡沫的4-((4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(241mg，0.296mmol，86.1％)。UPLC/ELSD:RT＝3.98分钟。MS(ES):m/z＝814.7[M+H]⁺，对于C₄₈H₈₃N₃O₇而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ5.21-5.43(m,2H),4.49-4.82(m,2H),3.33(t,2H,J＝6.4Hz),3.22-3.38(m,2H),2.97-3.21(m,4H),2.52-2.72(m,4H),2.24-2.38(m,2H),1.73-2.07(br.m,5H),0.75-1.64(br.m,27H),1.44(s,9H),1.42(s,9H),1.01(s,3H),0.91(d,3H,J＝6.4Hz),0.86(d,3H,J＝6.6Hz),0.86(d,3H,J＝6.6Hz),0.67(s,3H)。

步骤2：4-((4-氨基丁基)(3-氨基丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐

将4-((4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(0.230g，0.282mmol)在DCM(4.1mL)中的搅拌溶液在冰浴中冷却至0℃。滴加4N HCl的二噁烷溶液(0.35mL)，并且使反应混合物边搅拌边缓慢升温至室温。通过LCMS监测反应。在4小时，再添加4N HCl的二噁烷溶液(0.10mL)。在9小时，将反应混合物用Et₂O稀释至约20mL。通过真空过滤收集固体并用Et₂O冲洗。将固体悬浮在庚烷中，浓缩并在高真空下进一步干燥，得到呈白色固体的4-((4-氨基丁基)(3-氨基丙基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯二盐酸盐(171mg，0.247mmol，87.4％)。UPLC/ELSD:RT＝2.22分钟。MS(ES):m/z＝614.3[M+H]⁺，对于C₃₈H₆₇N₃O₃而言；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ7.73-8.14(m,6H),5.29-5.37(m,1H),4.36-4.51(m,1H),3.15-3.43(m,4H),2.64-2.88(m,4H),2.47-2.63(m,2H),2.21-2.29(m,2H),1.69-2.03(br.m,7H),0.80-1.64(br.m,27H),0.98,(s,3H),0.90(d,3H,J＝6.4Hz),0.84(d,3H,J＝6.5Hz),0.84(d,3H,J＝6.6Hz),0.65(s,3H)。

AF.化合物SA32：2-(奎宁-3-基)乙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

向3-(羧甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-1-鎓氯化物(AstaTech,Inc.,Bristol,PA)(0.100g，0.486mmol)在DCM(3.2mL)中的溶液中添加胆固醇(470mg，1.22mmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(30mg，0.24mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.103g，0.535mmol)。添加THF(3.5mL)。将反应混合物在室温下搅拌并通过LCMS监测。在16.5小时，将反应混合物在50℃下加热。在21小时，将反应混合物冷却至室温。将粗制材料用3:1CHCl₃/iPrOH(约40mL)稀释，然后用水洗涤。使有机物通过疏水玻璃料，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将粗制材料经由硅胶色谱法纯化(5-20％(10％浓NH₄OH的MeOH水溶液)的DCM溶液)，得到呈透明油状物的2-(奎宁-3-基)乙酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(0.193g，0.357mmol，73.5％)。UPLC/ELSD:RT＝3.02分钟。MS(ES):m/z＝538.5[M+H]⁺，对于C₃₆H₅₉NO₂而言；¹H NMR(300MHz,CD₃OD):δ5.32-5.43(m,1H),4.47-4.61(m,1H),3.06-3.18(m,1H),2.73-2.92(m,4H),2.25-2.50(br.m,5H),0.91-2.23(br.m,32H),1.05(s,3H),0.95(d,3H,J＝6.5Hz),0.88(d,3H,J＝6.5Hz),0.88(d,3H,J＝6.6Hz),0.73(s,3H)。

AG.化合物SA33：奎宁-3-甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

向胆固醇(504mg，1.30mmol)、1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-甲酸盐酸盐(Enamine,Monmouth Junction,NJ)(100mg，0.522mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(0.032g，0.261mmol)在THF(3.5mL)中的悬浮液中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.110g，0.574mmol)。将反应混合物在室温下搅拌并通过LCMS监测。在16小时，将反应混合物在50℃下搅拌。在40小时，将反应混合物冷却至室温并用3:1CHCl₃:iPrOH稀释(约40mL)。将有机物用水洗涤，使其通过疏水玻璃料，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将粗制材料经由硅胶色谱法纯化(0-10％(10％浓NH₄OH的MeOH水溶液)的DCM溶液)，得到呈白色固体的奎宁-3-甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(0.121g，0.226mmol，43.4％)。UPLC/ELSD:RT＝3.06分钟。MS(ES):m/z＝524.5[M+H]⁺，对于C₃₅H₅₇NO₂而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ5.34-5.43(m,1H),4.58-4.72(m,1H),3.29(ddd,1H,J＝13.9,6.0,1.7Hz),2.72-3.05(br.m,5H),2.46-2.56(m,1H),2.22-2.40(m,2H),2.12-2.19(m,1H),1.75-2.09(br.m,5H),0.92-1.70(br.m,25H),1.02(s,3H),0.91(d,3H,J＝6.5Hz),0.86(d,3H,J＝6.5Hz),0.86(d,3H,J＝6.6Hz),0.68(s,3H)。

AH.化合物SA34：(2-((4,5-二氢-1H-咪唑-2-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯碘化氢盐

将(2-氨基乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(SA22，200mg，0.42mmol)和2-(甲硫基)-4,5-二氢-1H-咪唑氢碘酸盐(94mg，0.38mmol)在5mL无水THF中的溶液加热至40℃并搅拌过夜，之后其变为白色悬浮液。通过LCMS检测没有原材料剩余，因此使溶液冷却至室温并浓缩(恶臭！)。将所得固体用乙醚研磨。过滤混合物，并将过滤的固体用醚洗涤，风干，然后真空干燥，得到呈吸湿性白色固体的(2-((4,5-二氢-1H-咪唑-2-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(77mg，0.11mmol，30％)。UPLC/ELSD:RT＝2.76分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)541.63，对于C₃₃H₅₆N₄O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 7.97(br.s,2H)；7.29(br.s,1H)；5.61(br.s,1H)；5.36(d,1H,J＝3.2Hz)；4.43(br.d,1H,J＝8.7Hz)；3.78(s,4H)；3.61-3.21(m,4H)；2.31(s,2H)；2.30(d,2H,J＝6.7Hz)；2.14-1.70(m,5H)；1.69-1.22(m,11H)；1.21-0.94(m,13H)；0.90(d,3H,J＝6.2Hz)；0.85(d,6H,J＝6.4Hz)；0.66(s,3H)。

AI.化合物SA35：(2-((2-(双(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

以与SA25相同的方式制备SA35，但在步骤2中使用3,3'-亚氨基双(N,N-二甲基丙胺)代替N,N-二甲基乙二胺。反应完成后，使不透明的白色混合物冷却至室温并过滤。将过滤的固体用甲醇洗涤并将滤液浓缩成浅黄色膜。将该浅黄色膜通过硅胶色谱法纯化(0-25％ MeOH的DCM溶液)，得到呈白色固体的(2-((2-(双(3-(二甲基氨基)丙基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(45mg，0.06mmol，14％)。UPLC/ELSD:RT＝2.12分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)738.60，对于C₄₄H₇₅N₅O₄而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 8.85(br.s,1H)；5.34(d,1H,J＝4.7Hz)；5.19(t,1H,J＝6.2Hz)；4.44(m,1H)；3.76(q,2H,J＝5.8Hz,11.8Hz)；3.70-3.47(m,3H)；3.39(q,2H,J＝5.8Hz,11.4Hz)；2.85-2.33(m,15H)；2.27(d,2H,J＝7.1Hz)；2.10-1.70(m,9H)；1.66-1.22(m,11H)；1.21-0.95(m,12H)；0.91(d,3H,J＝6.4Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.1Hz,6.6Hz)；0.67(s,3H)。

AJ.化合物SA36：(3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐

步骤1：4-硝基苯基碳酸豆甾醇酯

将豆甾醇(0.600g，1.45mmol)、三乙胺(0.41mL，2.9mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.036g，0.29mmol)在DCM(6.0mL)中的搅拌悬浮液在冰浴中冷却至0℃。然后，添加氯甲酸4-硝基苯酯(0.322g，1.60mmol)。使反应混合物缓慢达到室温过夜并通过LCMS监测。在21小时，过滤反应混合物。将滤液滴加到烧瓶的搅拌ACN(30mL)中。沉淀固体，得到黄色悬浮液。通过真空过滤收集固体，用CAN冲洗，得到4-硝基苯基碳酸豆甾醇酯(0.526g，0.910mmol，62.6％)。从母液中沉淀出另外的固体。将母液部分浓缩以去除大部分DCM。一旦冷却至室温，就通过真空过滤收集固体，用ACN冲洗，得到4-硝基苯基碳酸豆甾醇酯(0.162g，0.280mmol，19.3％)。合并收率＝81.9％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.28(m,2H),7.39(m,2H),5.40-5.47(m,1H),5.15(dd,1H,J＝15.1,8.4Hz),5.02(dd,1H,J＝15.1,8.4Hz),4.55-4.68(m,1H),2.41-2.55(m,2H),1.89-2.13(br.m,5H),0.88-1.84(br.m,18H),1.05(s,3H),1.03(d,3H,J＝6.6Hz),0.76-0.87(m,9H),0.71(s,3H)。

步骤2：((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基双((3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯)

将N-{3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}-N-[4-({3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丁基]氨基甲酸叔丁酯(0.566g，1.12mmol)、4-硝基苯基碳酸豆甾醇酯(0.500g，0.865mmol)和三乙胺(0.36mL，2.6mmol)合并在甲苯(5.0mL)中。将反应混合物在90℃下搅拌并通过LCMS监测。在24小时，将反应混合物冷却至室温。将反应混合物用水(3x 5mL)洗涤，然后浓缩。将粗制材料经由硅胶色谱法纯化(20-60％EtOAc的己烷溶液)，得到呈白色泡沫的((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基双((3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯)(0.703g，0.747mmol，86.3％)。UPLC/ELSD:RT＝3.45分钟。MS(ES):m/z＝841.8[(M+H)–(CH₃)₂C＝CH₂–CO₂]⁺，对于C₅₅H₉₆N₄O₈而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ5.33-5.41(m,1H),5.28(br.s,1H),5.16(dd,1H,J＝15.1,8.4Hz),5.01(dd,1H,J＝15.1,8.4Hz),4.79(br.s,1H),4.42-4.59(m,1H),2.97-3.48(br.m,12H),2.20-2.43(m,2H),1.79-2.12(br.m,5H),0.88-1.77(br.m,26H),1.45(s,9H),1.43(s,18H),1.02(s,3H),1.02(d,3H,J＝6.4Hz),0.75-0.88(m,9H),0.69(s,3H)。

步骤3：(3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐

在30℃下搅拌((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基双((3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯)(0.700g，0.744mmol)在iPrOH(3.2mL)中的溶液。滴加5至6N HCl的iPrOH溶液(1.5mL)。将反应混合物在40℃下搅拌并通过LCMS监测。在18.5小时，添加ACN(3.2mL)，超声处理浆料，然后在室温下搅拌1小时。此后，通过真空过滤收集固体，用3:1ACN:iPrOH冲洗，然后用ACN冲洗，得到呈白色固体的(3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐(0.509g，0.636mmol，85.5％)。UPLC/ELSD:RT＝1.56分钟。MS(ES):m/z＝641.4[M+H]⁺，对于C₄₀H₇₂N₄O₂而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ5.38-5.45(m,1H),5.20(dd,1H,J＝15.1,8.4Hz),5.07(dd,1H,J＝15.1,8.4Hz),4.40-4.54(m,1H),3.29-3.46(m,4H),3.05-3.20(m,6H),2.92-3.02(m,2H),2.34-2.43(m,2H),1.87-2.20(m,9H),0.92-1.83(br.m,22H),1.09(s,3H),1.07(d,3H,6.6Hz),0.80-0.92(m,9H),0.77(s,3H)。

AK.化合物SA37：(3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐

步骤1：4-硝基苯基碳酸β-谷甾醇酯

将β-谷甾醇(8.00g，19.3mmol)、三乙胺(5.4mL，39mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.471g，3.86mmol)在DCM(80mL)中的搅拌溶液在冰浴中冷却至0℃。在2分钟内向溶液中逐份添加氯甲酸4-硝基苯酯(4.277g，21.22mmol)。使反应混合物缓慢达到室温过夜并通过LCMS监测。在21小时，将反应混合物在冰浴中冷却至0℃，然后添加三乙胺(2.7mL)和氯甲酸4-硝基苯酯(3.00g)。使反应混合物达到室温。在40小时，将反应混合物过滤，并将滤液在1小时内滴加到在冰浴中冷却至0℃的烧瓶的搅拌ACN(250mL)中。通过真空过滤收集固体，用CAN冲洗，得到呈灰白色固体的4-硝基苯基碳酸β-谷甾醇酯(9.15g，15.8mmol，81.8％)。UPLC/ELSD:RT＝3.38分钟。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.28(m,2H),7.39(m,2H),5.37-5.49(m,1H),4.54-4.69(m,1H),2.36-2.57(m,2H),0.86-2.10(br.m,27H),1.05(s,3H),0.93(d,3H,J＝6.4Hz),0.78-0.88(m,9H),0.69(s,3H)。

步骤2：((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基双((3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯)

将N-{3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}-N-[4-({3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丁基]氨基甲酸叔丁酯(0.564g，1.12mmol)、4-硝基苯基碳酸β-豆甾醇酯(0.500g，0.862mmol)和三乙胺(0.36mL，2.6mmo l)合并在PhMe(5.0mL)中。将反应混合物在90℃下搅拌并通过TLC监测。在44小时，将反应混合物冷却至室温。将反应混合物用水(3x 5mL)洗涤，然后浓缩。将粗制材料经由硅胶色谱法纯化(20-60％EtOAc的己烷溶液)，得到呈白色泡沫的((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基双((3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基甲酸酯)(0.704g，0.746mmol，86.5％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ5.32-5.44(m,1H),5.28(br.s,1H),4.78(br.s,1H),4.43-4.58(m,1H),2.97-3.45(br.m,12H),2.20-2.43(m,2H),1.76-2.06(br.m,5H),0.87-1.73(br.m,30H),1.45(s,9H),1.43(s,18H),1.02(s,3H),0.92(d,3H,J＝6.4Hz),0.77-0.87(m,9H),0.68(s,3H)。UPLC/ELSD:RT＝3.51分钟。MS(ES):m/z＝843.9[(M+H)–(CH₃)₂C＝CH₂–CO₂]⁺，对于C₅₅H₉₈N₄O₈而言。

步骤3：(3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐

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将((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丁烷-1,4-二基双((3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯)(0.700g，0.742mmol)在iPrOH(3.2mL)中的搅拌溶液在30℃下加热。向该溶液中添加5-6N HCl的iPrOH溶液(1.5mL)。将反应混合物在40℃下搅拌并通过LCMS监测。在18.5小时，添加ACN(3.2mL)。将混合物超声处理，然后在室温下搅拌1小时。此后，通过真空过滤收集固体，用3:1ACN:iPrOH冲洗，然用ACN冲洗，得到呈白色固体的(3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-乙基-6-甲基庚-2-基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐(0.498g，0.639mmol，86.1％)。UPLC/ELSD:RT＝1.63分钟。MS(ES):m/z＝643.4[M+H]⁺，对于C₄₀H₇₄N₄O₂而言；¹H NMR(300MHz,CD₃OD):δ5.39-5.45(m,1H),4.40-4.54(m,1H),3.29-3.48(m,4H),3.05-3.19(m,6H),2.91-3.02(m,2H),2.34-2.43(m,2H),1.83-2.20(br.m,9H),0.92-1.82(br.m,26H),1.08(s,3H),0.97(d,3H,J＝6.4Hz),0.80-0.93(m,9H),0.75(s,3H)。

AL.化合物SA38：4-((3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐

步骤1：9-(叔丁氧羰基)-14-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-2,2-二甲基-4,15-二氧代-3-氧杂-5,9,14-三氮杂十八烷-18-酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

向N-{3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}-N-[4-({3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丁基]氨基甲酸叔丁酯(0.341g，0.678mmol)和半琥珀酸胆固醇酯(0.300g，0.616mmol)在DCM(6.0mL)中的搅拌溶液中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.177g，0.925mmol)。将反应混合物在室温下搅拌并通过TLC监测。在18小时，添加水(10mL)，并将反应混合物在室温下搅拌10分钟。此后，分离各层。用DCM(2x 10mL)萃取水层。使合并的有机物通过疏水玻璃料，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将粗制材料经由硅胶色谱法纯化(30-70％ EtOAc的己烷溶液)，得到呈白色泡沫的9-(叔丁氧羰基)-14-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-2,2-二甲基-4,15-二氧代-3-氧杂-5,9,14-三氮杂十八烷-18-酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(371mg，0.382mmol，62.0％)。UPLC/ELSD:RT＝3.37分钟。MS(ES):m/z＝994.2[M+Na]⁺，对于C₅₆H₉₈N₄O₉而言；¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ5.31-5.49(m,1H),5.25(br.s,1H),4.74(br.s,1H),4.51-4.67(m,1H),2.95-3.53(br.m,12H),2.52-2.71(m,4H),2.23-2.38(m,2H),1.73-2.08(br.m,5H),0.93-1.72(br.m,29H),1.46(s,9H),1.44(s,9H),1.42(s,9H),1.01(s,3H),0.91(d,3H,J＝6.5Hz),0.86(d,6H,J＝6.2Hz),0.67(s,3H)。

步骤2：4-((3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐

向9-(叔丁氧羰基)-14-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-2,2-二甲基-4,15-二氧代-3-氧杂-5,9,14-三氮杂十八烷-18-酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(363mg，0.374mmol)在iPrOH(2.5mL)中的溶液中添加5-6N HCl的iPrOH溶液(0.78mL)。将反应混合物在40℃下搅拌并通过LCMS监测。在16.5小时，再添加5-6N HCl的iPrOH溶液(0.20mL)，并将反应混合物在室温下搅拌。在22.5小时，添加ACN(7.5mL)，并将反应混合物在室温下搅拌10分钟。此后，通过真空过滤收集固体并用ACN冲洗，得到呈白色固体的4-((3-氨基丙基)(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基)-4-氧代丁酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯三盐酸盐(0.240g，0.285mmol，76.3％)。UPLC/ELSD:RT＝1.84分钟。MS(ES):m/z＝671.9[M+H]⁺C₄₁H₇₄N₄O₃；¹H NMR(300MHz,CD₃OD):δ5.35-5.41(m,1H),4.46-4.59(m,1H),3.36-3.58(m,4H),2.99-3.19(m,6H),2.86-2.94(m,2H),2.58-2.75(m,4H),2.25-2.41(m,2H),0.96-2.19(br.m,34H),1.05(s,3H),0.95(d,3H,J＝6.4Hz),0.88(m,6H,J＝6.6Hz),0.73(s,3H)。

AM.化合物SA39：N-(3-氨基丙基)-N-(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)-3-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)二硫烷基)丙酰胺三盐酸盐

向(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)(4-(N-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-3-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)二硫烷基)丙酰氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(如WO 98/50417“Cationic Amphiphiles containing a Disulphide Linker forCell Transfections”中所述那样制备)(0.460g，0.464mmol)在DCM(9.2mL)中的搅拌溶液中添加4N HCl的二噁烷溶液(0.81mL)。将反应混合物在室温下搅拌并通过LCMS监测。在5小时，将反应混合物用MTBE稀释至35mL，然后离心(5000RPM，30分钟)。倾析上清液。将固体悬浮在庚烷中，然后浓缩，得到呈白色固体的N-(3-氨基丙基)-N-(4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)-3-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,3-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)二硫烷基)丙酰胺三盐酸盐(0.288g，0.347mmol，74.9％)。UPLC/ELSD:RT＝1.78分钟。MS(ES):m/z＝691.2[M+H]⁺，对于C₄₀H₇₄N₄OS₂而言；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ9.20(br.s,1H),9.11(br.s,1H),8.10(br.s,4H),7.94(br.s,2H),5.30-5.40(m,1H),3.20-3.51(br.m,6H),2.61-3.03(br.m,13H),2.20-2.35(m,2H),0.91-2.07(br.m,29H),0.96(s,3H),0.89(d,3H,J＝6.4Hz),0.84(d,3H,J＝6.7Hz),0.84(d,3H,J＝6.6Hz),0.65(s,3H)。

AN.化合物SA40：(3-氨基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

步骤1：((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丙烷-1,3-二基二氨基甲酸叔丁酯

在干燥氮气下将胆固醇氯甲酸酯(5g，10.8mmol)在90mL无水DCM中的搅拌溶液冷却至0℃。添加三乙胺(3mL，21.6mmol)。在15分钟内滴加N-Boc-1,3-二氨基丙烷(2.3g，12.9mmol)在10mL无水DCM中的溶液。将所得无色溶液在室温下搅拌过夜，用DCM稀释，用50％饱和盐水洗涤两次，用1N HCl水溶液洗涤两次，干燥(Na₂SO₄)并过滤。将滤液浓缩成无色油状物，无色油状物开始缓慢固化。将其用少量DCM(约10mL)在涡旋下稀释以溶解大部分材料，并将混合物用约100mL己烷稀释，得到白色沉淀。将固体粉碎。将混合物在室温下剧烈搅拌60分钟并过滤。将过滤的固体用己烷洗涤并风干，然后真空干燥，得到呈白色固体的((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丙烷-1,3-二基二氨基甲酸叔丁酯(5.45g，9.3mmol，86％)。材料足够纯，无需进一步纯化即可使用。UPLC/ELSD:RT＝3.37分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)587.26，对于C₃₆H₆₂N₂O₄而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.37(d,1H,J＝5.2Hz)；5.00(br.s,1H)；4.84(br.s,1H)；4.49(m,1H)；3.19(m,4H)；2.43-2.20(m,2H)；2.10-1.74(m,5H)；1.69-1.39(m,18H)；1.38-0.94(m,16H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.2Hz,6.6Hz)；0.67(s,3H)。

步骤2：(3-氨基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

向((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基)丙烷-1,3-二基二氨基甲酸叔丁酯(2g，3.37mmol)在25mL无水DCM中的搅拌溶液中添加2M HCl在乙醚中的溶液(8.4mL，16.8mmol)。将反应容器紧密密封，加热至40℃，并搅拌过夜。通过LCMS检测没有原材料剩余，因此将混合物在氮气流中浓缩。将白色残余物用乙醚研磨并过滤。将过滤的固体用乙醚洗涤，风干，然后真空干燥，得到呈白色固体的(3-氨基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐(1.65g，3.12mmol，93％)。UP LC/ELSD:RT＝2.35分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)487.12，对于C₃₁H₅₄N₂O₂而言。¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ:ppm5.38(d,1H,J＝4.3Hz)；4.40(m,1H)；3.20(t,2H,J＝6.6Hz)；2.96(t,2H,J＝7.4Hz)；2.32(d,2H,J＝7.2Hz)；2.13-1.72(m,7H)；1.71-1.26(m,11H)；1.26-0.98(m,13H)；0.95(d,3H,J＝6.5Hz)；0.88(dd,6H,J＝0.8Hz,6.6Hz)；0.72(s,3H)。

AO.化合物SA41：(3-胍基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

步骤1：

向(3-氨基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐(SA40，600mg，1.13mmol)和N¹,N²-双-Boc-胍-N³-三氟甲磺酸酯(450mg，1.13mmol)在15mL无水DCM中的搅拌溶液中添加三乙胺(330μL，2.32mmol)，并将混合物在室温下搅拌96小时，之后通过LCMS检测没有原材料剩余。将混合物用DCM稀释，用1N HCl水溶液洗涤一次，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次，干燥(Na₂SO₄)并过滤。将滤液浓缩成无色油状物。将无色油状物通过硅胶色谱法纯化(0-30％ EtOAc的己烷溶液)，得到呈白色固体的产物(521mg，0.71mmol，62％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm11.39(s,1H)；8.44(br.s,1H)；5.98(s,1H)；5.36(d,1H,J＝3.2Hz)；4.50(m,1H)；3.53(d,2H,J＝6.9Hz)；3.20(s,2H)；2.43-2.120(m,2H)；2.08-1.63(m,7H)；1.62-1.22(m,29H)；1.20-0.95(m,11H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.2Hz,6.6Hz)；0.67(s,3H)。

步骤2：(3-胍基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐

使用步骤1的产物，以与SA23相同的方式制备SA41，得到呈白色固体的(3-胍基丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯盐酸盐(45mg，0.08mmol，10％)。UPLC/ELSD:RT＝2.38分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)529.30，对于C₃₂H₅₆N₄O₂而言。¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ:ppm 7.88(br.s,1H)；6.90(t,1H,J＝6.2Hz)；5.39(d,1H,J＝4.9Hz)；4.39(m,1H)；3.18(m,4H)；2.31(d,2H,J＝7.1Hz)；2.12-1.68(m,5H)；1.66-1.27(m,9H)；1.26-0.97(m,14H)；0.95(d,3H,J＝6.5Hz)；0.88(dd,6H,J＝0.8Hz,6.6Hz)；0.72(s,3H)。

AP.化合物SA42：(3-(二异丙基氨基)丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

在干燥氮气下，在0℃下在5分钟内向3-(二异丙基氨基)丙胺(175mg，1.09mmol)在5mL无水DCM中的搅拌溶液中滴加胆固醇氯甲酸酯(500mg，1.09mmol)在5mL无水DCM中的溶液。使反应缓慢升温至室温并搅拌两小时，之后通过LCMS检测没有原材料剩余。将溶液用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次，干燥(Na₂SO₄)并过滤。将滤液浓缩成浅黄色油状物。将该浅黄色油状物通过硅胶色谱法纯化(100％ DCM至100％ DCM/MeOH/NH₄OH(80:20:1))，得到呈无色浆料的(3-(二异丙基氨基)丙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(392mg，0.66mmol，60％)，其在静置时固化。UPLC/ELSD:RT＝2.55分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)571.48，对于C₃₇H₆₆N₂O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 6.00(br.s,1H)；5.36(d,1H,J＝5.1Hz)；4.48(m,1H)；3.23(d,2H,J＝5.6Hz)；3.04(t,2H,J＝6.2Hz)；2.52(s,2H)；2.42-2.16(m,2H)；2.07-1.74(m,5H)；1.72-1.06(m,22H)；1.05-0.94(m,16H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.3Hz,6.6Hz)；0.67(s,3H)。

AQ.化合物SA43：(2-(二异丙基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯

在干燥氮气下，在0℃下在5分钟内向3-(二异丙基氨基)乙胺(210μL，1.15mmol)在5mL无水DCM中的搅拌溶液中滴加胆固醇氯甲酸酯(500mg，1.09mmol)在5mL无水DCM中的溶液。使反应缓慢升温至室温并搅拌两小时，之后通过LCMS检测没有原材料剩余。将溶液用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次，干燥(Na₂SO₄)并过滤。将滤液浓缩成浅黄色油状物。将该浅黄色油状物通过硅胶色谱法纯化(100％ DCM至25％ DCM/75％ DCM/MeOH/NH₄OH(80:20:1))，得到呈白色固体的(2-(二异丙基氨基)乙基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基酯(300mg，0.52mmol，47％)。UPLC/ELSD:RT＝2.62分钟。MS(ES):m/z(MH⁺)557.42，对于C₃₆H₆₄N₂O₂而言。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:ppm 5.36(d,1H,J＝5.1Hz)；5.06(br.s,1H)；4.50(m,1H)；3.12(q,2H,J＝5.6Hz,11.3Hz)；2.99(m,2H)；2.54(t,2H,J＝6.3Hz)；2.42-2.17(m,2H)；2.07-1.72(m,5H)；1.64-1.25(m,10H)；1.24-1.04(m,8H)；1.03-0.94(m,18H)；0.91(d,3H,J＝6.5Hz)；0.86(dd,6H,J＝1.2Hz,6.6Hz)；0.67(s,3H)。

实施例10

人宫颈癌上皮细胞(HeLa)模型中的蛋白质表达数据

根据实施例2使用NPI-Luc作为mRNA构建体制备LNP。NPI-Luc是通过在萤火虫荧光素酶的N端添加5xV5标记和C-myc核定位序列以增强信噪比而制成的双读段报告蛋白。可以使用具有发光读数的OneGLo测定或通过使用抗V5抗体的免疫荧光来检测蛋白质表达。根据实施例7中概述的程序评价蛋白质表达。将LNP在4个孔中给药并报告平均应答。对于HeLa测定，将发光读数(RLU)以细胞计数作归一化。结果示于表10a中。

表10a

*在磷酸盐缓冲盐水溶液中取得的数据

实施例11

健康HBE细胞中的LNP细胞摄取和蛋白质表达数据

根据实施例2使用NPI-Luc作为mRNA构建体制备LNP。NPI-Luc是通过在萤火虫荧光素酶的N端添加5xV5标记和C-myc核定位序列以增强信噪比而制成的双读段报告蛋白。可以使用具有发光读数的OneGLo测定或通过使用抗V5抗体的免疫荧光来检测蛋白质表达。根据实施例6中概述的程序评估LNP细胞摄取和蛋白质表达。结果示于表11a中。

表11a

/>

*在磷酸盐缓冲盐水溶液中取得的数据

实施例12

纳米颗粒ζ电位

根据实施例2制备LNP。通过在Malvern Zetasizer(Nano ZS)上将LNP在0.1X PBS中稀释到[mRNA]0.01mg/mL来测量ζ电位。结果示于表12a中。

表12a

实施例13

体内研究

给药程序A：气管内mRNA递送

在异氟烷下麻醉动物。移动舌头并将小直径套管插入气管(口咽途径)。套管尖端沿气管向下穿过声带，使得尖端非常靠近但不触及龙骨瓣。放置后，将50μL(小鼠)或200μL(大鼠)配制物输注到肺部。直立30秒后，将动物释放到回收笼中并且一经回收就返回到它们各自的笼中。

给药程序B：仅鼻部气溶胶暴露

使用振动筛网雾化器和限定的入口空气流速生成气溶胶。气溶胶在流入暴露层之前首先通过混合室而被引入啮齿动物仅鼻部引导的流动暴露室。将动物在每个鼻口暴露于新鲜气溶胶，然后将气溶胶排出系统。

在研究开始之前，训练动物适应仅鼻部给药的锥体三天。在研究当天，将动物置于给药锥体中，然后将给药锥体附接至气溶胶暴露室，对于0.4、0.6和1.1mpk的肺剂量，每组指定暴露时间为60、120或240分钟。在整个暴露过程中连续监测动物，随后监测任何可观察到的不良反应。在每次给药之前和之后在给药口处监测气溶胶浓度(mRNA)和空气动力学粒径分布，以分别评价达到的剂量水平和可呼吸的气溶胶粒径目标(对于大鼠为1-4μm)。

样品收集和测定程序A：用于组织学分析的组织收集

收集气管、肺和用于气溶胶研究的鼻腔、鼻咽和喉用于分析。用10％ NBF固定剂使肺部膨胀，并结扎气管以保持膨胀。随附接的气管、支气管和肺叶整块取出肺部。在室温下将整个肺整块在10％ NBF中固定至少24小时，最多48小时，然后从固定剂中取出并置于PBS中。立即将样品送去进行石蜡5微米切片和H&E染色处理。

对于气溶胶研究，除了气管和肺之外，还收集鼻腔、鼻咽和喉。

样品收集和测定程序B：免疫组织化学(IHC)

使用Leica Bond RX自动染色仪对FFPE切片进行IHC。通过1:100稀释的抗V5标签抗体检测NPI-Luc蛋白质表达。用结合聚合物精制检测试剂盒(Bond Polymer RefineDetection kit)检测V5抗体，接着用苏木精和上蓝试剂复染。用Panoramic 250Flash III全载玻片扫描仪以20X放大倍数对图像进行成像。用Indica Labs HALO图像分析软件完成图像分析。分析气管、肺和/或鼻腔图像以捕获总气管、支气管或鼻上皮细胞，并且在适当时将数据表示为％V5阳性上皮细胞/总上皮细胞/动物。

通过气管内递送单剂量的mRNA-LNP后小鼠中的LNP蛋白质表达数据

根据实施例2使用NPI-Luc作为mRNA构建体制备LNP。通过气管内滴注以约0.7mpk的剂量将LNP递送至小鼠。根据样品收集和测定程序A和B评价呼吸上皮中的LNP蛋白质表达。结果示于表13a中。具有主要置于外表面上的阳离子剂的LNP在气管和支气管中展示出阳性呼吸上皮蛋白质表达。

表13a

/>

*在磷酸盐缓冲盐水溶液中取得的数据

通过气管内递送单剂量的mRNA-LNP后大鼠中的LNP蛋白质表达数据

根据实施例2使用NPI-Luc作为mRNA构建体制备LNP。通过气管内滴注以约1.2mpk的剂量将LNP递送至大鼠。根据样品收集和测定程序A和B评价呼吸上皮中的LNP蛋白质表达。结果示于表13b中。具有主要置于外表面上的阳离子剂的LNP在气管和支气管中展示出阳性呼吸上皮蛋白质表达。

表13b

/>

*在磷酸盐缓冲盐水溶液中取得的数据

通过气溶胶递送单剂量的mRNA-LNP后大鼠中的LNP蛋白质表达数据

根据实施例8使用NPI-Luc作为mRNA构建体制备LNP。使用仅鼻部气溶胶给药系统通过气溶胶递送将LNP递送至大鼠。根据样品收集和测定程序A和B评价呼吸上皮中的LNP蛋白质表达。结果示于表13c中。气溶胶递送LNP后，鼻腔、气管和支气管中的呼吸上皮的蛋白质表达呈阳性。

表13c

/>

*在基于Tris的缓冲溶液中获取的数据

本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

Claims

1.一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)主要置于所述核的外表面上的阳离子剂，

其中所述纳米颗粒在生理pH下具有大于中性的ζ电位。

2.一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，其包含：

(i)可电离脂质，

(ii)磷脂，

(iii)结构脂质，和

(iv)PEG-脂质，和

(c)阳离子剂。

3.一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在上皮细胞中至少约20％的细胞积聚并且表现出在上皮细胞中约5％或更高的表达。

4.一种纳米颗粒，其包含：

(a)脂质纳米颗粒核，

(c)阳离子剂，

其中所述纳米颗粒表现出在细胞中约0.5％至50％的蛋白质表达，其中所述细胞在体内。

5.如权利要求1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子剂与多核苷酸有效载荷的重量比为约1:1至约4:1、约1.25:1至约3.75:1、约1.25:1、约2.5:1或约3.75:1。

6.如权利要求1-5中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有约5mV至约20mV、约5mV至约20mV、约5mV至约15mV或约5mV至约10mV的ζ电位。

7.如权利要求1-6中任一项所述的纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒核在中性pH下具有中性电荷。

8.如权利要求1-7中任一项所述的纳米颗粒，其中大于约80％、大于90％、大于95％或大于95％的所述阳离子剂在所述纳米颗粒的表面上。

9.如权利要求1-8中任一项所述的纳米颗粒，其中至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％的所述多核苷酸或多肽有效载荷包封在所述核内。

10.如权利要求1-9中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有小于约0.4、小于约0.3或小于约0.2的多分散性值。

11.如权利要求1-10中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有约40nm至约150nm、约50nm至约100nm、约60nm至约120nm、约60nm至约100nm或约60nm至约80nm的平均直径。

12.如权利要求1-11中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的laurdan广义极化(GPL)大于或等于约0.6。

13.如权利要求1-12中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有大于约6nm或大于约7nm的d-间距。

14.如权利要求1-13中任一项所述的纳米颗粒，其中至少50％、至少75％、至少90％或至少95％的所述纳米颗粒具有大于阈值极化水平的表面流动性值。

15.如权利要求1-14中任一项所述的纳米颗粒，其中当所述纳米颗粒与细胞群接触时，约10％或更多、约15％或更多或约20％或更多的细胞群已积聚所述纳米颗粒。

16.如权利要求1-15中任一项所述的纳米颗粒，其中当所述纳米颗粒与细胞群接触时，约5％或更多或约10％或更多的细胞表达所述多核苷酸或多肽。

17.如权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其中所述细胞群是上皮细胞群。

18.如权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其中所述细胞群是呼吸上皮细胞群。

19.如权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其中所述细胞群是鼻细胞群。

20.如权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其中所述细胞群是肺泡上皮细胞群。

21.如权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其中所述细胞群是肺细胞群。

22.如权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其中所述细胞群是支气管上皮细胞群。

23.如权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其中所述细胞群是HBE群。

24.如权利要求1-23中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子剂在醇中具有大于约1mg/mL、大于约5mg/mL、大于约10mg/mL或大于约20mg/mL的溶解度。

25.如权利要求24所述的纳米颗粒，其中所述醇是C_1-6醇。

26.如权利要求25所述的纳米颗粒，其中所述醇是乙醇。

27.如权利要求1-26中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子剂是阳离子脂质。

28.如权利要求27所述的纳米颗粒，其中所述阳离子脂质是水溶性两亲分子。

29.如权利要求28所述的纳米颗粒，其中所述两亲分子包含脂质部分和亲水部分。

30.如权利要求29所述的纳米颗粒，其中所述脂质部分包含结构脂质、脂肪酸或烃基。

31.如权利要求27所述的纳米颗粒，其中所述阳离子脂质是包含疏水部分和亲水部分的甾醇胺。

32.如权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述亲水部分包含胺基，所述胺基包含一至四个伯胺、仲胺或叔胺或其混合物。

33.如权利要求32所述的纳米颗粒，其中所述胺基包含一个或两个末端伯胺。

34.如权利要求32所述的纳米颗粒，其中所述胺基包含一个或两个末端伯胺和一个内部仲胺。

35.如权利要求32所述的纳米颗粒，其中所述胺基包含一个或两个叔胺。

36.如权利要求32-35中任一项所述的纳米颗粒，其中所述胺基具有大于约8的pKa值。

37.如权利要求32-35中任一项所述的纳米颗粒，其中所述胺基具有大于约9的pKa值。

38.如权利要求31-37中任一项所述的纳米颗粒，其中所述甾醇胺是式(A1)的化合物：

A-L-B(A1)

或其盐，其中：

A是胺基，L是任选接头，并且B是甾醇。

39.如权利要求31-38所述的纳米颗粒，其中所述甾醇胺具有式A2a：

或其盐，其中：

----是单键或双键

R¹为C_1-14烷基或C_1-14烯基；

L^a不存在，为-O-、-S-S-、-OC(＝O)、-C(＝O)N-、-OC(＝O)N-、CH₂-NH-C(O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-CH₂-CH₂-C(＝O)N-、-S-S-CH₂、-SS-CH₂-CH₂-C(＝O)N-或式(a)的基团：

Y¹为C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、-C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)或-C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)，

其中所述C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、-C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和-C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合；

并且其中所述C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、-C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和-C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)各自任选地被1、2、3或4个取代基取代，所述取代基独立地选自C_1-6烷基、卤基、OH、-O(C_1-6烷基)、-C_1-6烷基-OH、NH₂、-NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂、3至8元杂环烷基(任选地被包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合的C_1-14烷基取代)、5至6元杂芳基、-NH-(3至8元杂环烷基)和-NH(5至6元杂芳基)；并且

n为1或2。

40.如权利要求39所述的纳米颗粒，其中----是双键。

41.如权利要求39所述的纳米颗粒，其中----是单键。

42.如权利要求39或40所述的纳米颗粒，其中L^a为-OC(＝O)、-OC(＝O)N-或-OC(＝O)-CH₂-CH₂-C(＝O)N-。

43.如权利要求39-42中任一项所述的纳米颗粒，其中n为1。

44.如权利要求39-42中任一项所述的纳米颗粒，其中n为2。

45.如权利要求39-44中任一项所述的纳米颗粒，其中R¹为C_1-14烷基。

46.如权利要求39-44中任一项所述的纳米颗粒，其中R¹为C_1-14烯基。

47.如权利要求39-44中任一项所述的纳米颗粒，其中R¹为

48.如权利要求39-47中任一项所述的纳米颗粒，其中Y¹为C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、-C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)或-C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)，

49.如权利要求39-47中任一项所述的纳米颗粒，其中Y¹选自：

50.如权利要求31-38中任一项所述的纳米颗粒，其中所述甾醇胺具有式A4

或其盐，其中：

Z¹为OH或C_3-6烷基；

L不存在，为-O-、-S-S-、-OC(＝O)、-C(＝O)N-、-OC(＝O)N-、-CH₂-NH-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-CH₂-CH₂-C(＝O)N-、-S-S-CH₂或-SS-CH₂-CH₂-C(O)N-；

并且其中所述C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、-C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和-C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)各自任选地被1、2、3或4个取代基取代，所述取代基选自C_1-6烷基、卤基、OH、-O(C_1-6烷基)、-C_1-6烷基-OH、NH₂、-NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂、3至8元杂环烷基(任选地被包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合的C_1-14烷基取代)、5至6元杂芳基、-NH(3至8元杂环烷基)和-NH(5至6元杂芳基)；并且

n为1或2。

51.如权利要求50所述的纳米颗粒，其中Z¹为OH。

52.如权利要求50所述的纳米颗粒，其中Z¹为C_3-6烷基。

53.如权利要求50-52中任一项所述的纳米颗粒，其中L为-C(＝O)N-、-CH₂-NH-C(＝O)-或-C(＝O)O-。

54.如权利要求50-53中任一项所述的纳米颗粒，其中Y¹为包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合的C_1-10烷基。

55.如权利要求50-53中任一项所述的纳米颗粒，其中Y¹为

56.如权利要求50-55中任一项所述的纳米颗粒，其中n为1。

57.如权利要求50-55中任一项所述的纳米颗粒，其中n为2。

58.如权利要求38所述的纳米颗粒，其中所述甾醇胺选自：

/>

或其盐。

59.如权利要求1-38中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子剂是非脂质阳离子剂。

60.如权利要求59中任一项所述的纳米颗粒，其中所述非脂质阳离子剂是苯扎氯铵、氯化十六烷基吡啶、L-赖氨酸一水合物或氨丁三醇。

61.如权利要求1-26中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子剂是经修饰的精氨酸。

62.如权利要求1-61中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含约30摩尔％至约60摩尔％或约40摩尔％至约50摩尔％的可电离脂质。

63.如权利要求1-61中任一项所述的纳米颗粒，其中可电离脂质是化合物18：

或其盐。

64.如权利要求1-63中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含约5摩尔％至约15摩尔％、约8摩尔％至约13摩尔％或约10摩尔％至约12摩尔％的磷脂。

65.如权利要求1-64中任一项所述的纳米颗粒，其中所述磷脂是1,2二硬脂酰sn甘油3磷酸胆碱(DSPC)。

66.如权利要求1-65中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含约20摩尔％至约60摩尔％、约30摩尔％至约50摩尔％、约35摩尔％或约40摩尔％的结构脂质。

67.如权利要求1-66中任一项所述的纳米颗粒，其中所述结构脂质选自类固醇、二萜、三萜、胆甾烷和熊果酸或其衍生物。

68.如权利要求1-66中任一项所述的纳米颗粒，其中所述结构脂质是选自胆固醇和植物固醇的类固醇。

69.如权利要求1-66中任一项所述的纳米颗粒，其中所述结构脂质是胆固醇或具有以下结构的化合物：

70.如权利要求1-69中任一项所述的纳米颗粒，其中所述PEG-脂质选自经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油、经PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。

71.如权利要求1-69中任一项所述的纳米颗粒，其中所述PEG-脂质是PEG-DMG。

72.如权利要求1-69中任一项所述的纳米颗粒，其中所述PEG-脂质是DMG-PEG 2k。

73.如权利要求1-69中任一项所述的纳米颗粒，其中所述PEG-脂质是化合物428。

74.如权利要求1-71中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含约1摩尔％至约5摩尔％的PEG-脂质，或约1摩尔％至约2.5摩尔％的PEG-脂质。

75.一种细胞，其包含权利要求1-74中任一项所述的纳米颗粒。

76.如权利要求75所述的细胞，其中所述细胞是上皮细胞。

77.如权利要求75所述的细胞，其中所述细胞是呼吸上皮细胞。

78.如权利要求75所述的细胞，其中所述细胞是鼻细胞。

79.如权利要求75所述的细胞，其中所述细胞是肺泡上皮细胞。

80.如权利要求75所述的细胞，其中所述细胞是肺细胞。

81.如权利要求75所述的细胞，其中所述细胞是支气管上皮细胞。

82.如权利要求75所述的细胞，其中所述细胞是人支气管上皮(HBE)细胞。

83.一种药物组合物，其包含权利要求1-74中任一项所述的纳米颗粒。

84.如权利要求83所述的药物组合物，其中所述组合物为液体形式。

85.如权利要求83所述的药物组合物，其中所述组合物适于吸入。

86.一种制备纳米颗粒的方法，所述方法包括使脂质纳米颗粒与阳离子剂接触，其中所述脂质纳米颗粒包含：

(a)脂质纳米颗粒核，其包含：

(i)可电离脂质，

(ii)磷脂，

(iii)结构脂质，和

(iv)PEG-脂质，和

87.如权利要求86所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒与阳离子剂的所述接触包括将所述阳离子剂溶解在非离子赋形剂中。

88.如权利要求87所述的方法，其中所述非离子赋形剂是聚乙二醇15羟基硬脂酸酯(HS15)。

89.如权利要求86-88中任一项所述的方法，其中所述阳离子剂是甾醇胺。

90.如权利要求89所述的方法，其中所述甾醇胺是GL-67：

或其盐。

91.一种纳米颗粒，其通过权利要求86-90中任一项所述的方法制备。

92.一种将多核苷酸或多肽有效载荷递送到细胞中的方法，其包括使所述细胞与权利要求1-74和91中任一项所述的纳米颗粒接触。

93.一种治疗或防止患者的疾病的方法，其包括向所述患者施用权利要求1-74和91中任一项所述的纳米颗粒或权利要求83-85中任一项所述的组合物，所述纳米颗粒或组合物包含用于治疗或防止所述疾病的有效载荷。

94.如权利要求93所述的方法，其中所述疾病是囊性纤维化。

95.如权利要求93或94所述的方法，其中所述纳米颗粒或组合物通过鼻内、支气管内或肺部施用来施用。

96.如权利要求95所述的方法，其中所述纳米颗粒或组合物通过喷雾器或吸入器施用。

97.一种式A2a的化合物：

或其盐，其中：

----是单键或双键

R¹为C_1-14烷基或C_1-14烯基；

并且其中所述C_1-10烷基、3至8元杂环烷基、5至6元杂芳基、C_1-6烷基-(3至8元杂环烷基)和C_1-6烷基-(5至6元杂芳基)各自任选地被1、2、3或4个取代基取代，所述取代基独立地选自C_1-6烷基、卤基、OH、-O(C_1-6烷基)、-C_1-6烷基-OH、NH₂、NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂、3至8元杂环烷基(任选地被包含一至五个伯胺、仲胺或叔胺或其组合的C_1-14烷基取代)、5至6元杂芳基、-NH-(3至8元杂环烷基)和-NH(5至6元杂芳基)；并且

n为1或2；

条件是式A2a的化合物不是：