KR20230087443A

KR20230087443A - 페이로드 분자를 기도 상피로 전달하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20230087443A
Application number: KR1020237007762A
Authority: KR
Inventors: 피레스 아나 카뎃; 진 씨 성; 마크 코르네비즈; 제프리 흐르카치
Original assignee: 모더나티엑스, 인크.
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2023-06-16
Also published as: US20230285310A1; EP4192433A2; BR112023001955A2; CN116348147A; TW202214215A; CA3189854A1; IL300111A; WO2022032154A3; JP2023538260A; WO2022032154A2; MX2023001461A; AU2021320426A1

Abstract

본 개시내용은 페이로드 분자의 기도 세포로의 전달로부터 이익을 얻는, 질환 또는 장애의 치료를 위한, 페이로드 분자, 예를 들어, mRNA 치료제를 포함하는 LNP를 제공한다.

Description

페이로드 분자를 기도 상피로 전달하기 위한 조성물

호흡기 상피 세포는 호흡기도를 따라 감싸고 있다. 호흡기 상피 세포의 주요 기능은 호흡기도를 습윤화하고, 잠재적인 병원체, 감염 및 조직 손상으로부터 기도를 보호하고, 및/또는 가스 교환을 촉진하는 것이다. 기도 상피 세포의 기능장애는, 예를 들어, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD; chronic obstructive pulmonary disease) 및 낭포성 섬유증을 포함하는, 수많은 장애로 이어질 수 있다. 호흡기 상피 세포로의 페이로드 전달은 관심 항원에 대한 면역성을 유도하고 기도 상피 세포의 기능을 조절하기 위해, 예를 들어, 누락되거나 돌연변이된 단백질을 대체하거나 이러한 세포의 기능을 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, 낭포성 섬유증("CF; cystic fibrosis")은 환자에서 끈적끈적하고 걸쭉한 점액이 비정상적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 상염색체 열성 질환이다. CF는 또한 췌장의 낭포성 섬유증, 췌장의 섬유낭성 질환, 또는 점액성 점착증(muscoviscidosis)으로도 공지되어 있다. 점액은 폐, 생식계, 소화계, 및 기타 기관을 윤활하고 보호하는 중요한 체액이다. 그러나, CF 환자는 걸쭉하고 끈적끈적한 점액을 생성하며, 이는 기도의 크기를 감소시켜 만성 기침, 천명(wheezing), 염증, 박테리아 감염, 섬유증, 및 폐의 낭종으로 이어진다. 또한, 대부분의 CF 환자는 췌장의 도관을 차단하는 점액을 가지며, 이는 인슐린 및 소화 효소의 방출을 방지하여 설사, 영양실조, 성장 부진, 및 체중 감소로 이어진다. 문헌 [Gershman A.J. 등, Cleve Clin J Med. 73: 1065-1074(2006)]. CF는 백인 출생에서 2,500명 내지 3,500명 중 1명의 발병률을 가지고 있지만, 다른 집단에서는 훨씬 더 드물다. 문헌 [Ratjen F. 등, Lancet 361: 681-689(2003)]. CF에 대한 대부분의 현재 치료는 단지 증상을 제어할 뿐 질환을 치료하지는 않는다. 구체적으로, 항생제, 항-염증제, 기관지 확장제, 충혈 제거제, 단백질 및 지방이 풍부한 식이요법, 및 비타민 보충제를 처방하여 증상을 제어한다. 진행된 폐 질환의 경우, 환자에게 손상되지 않은 폐를 제공하기 위해 폐 이식이 또한 수행되어 왔다. 그러나, 이러한 치료법은 질환을 완전히 또는 확실히 제어하지 못한다. CF의 근본 원인에 초점을 맞춘 신규한 치료법이 출현하였다. 이러한 치료법은 Phe508del CFTR 돌연변이를 갖는 환자의 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR; cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)를 조절한다. 문헌 [Middleton P.J. 등, N Engl J Med. 381: 1809-1819(2019)]. 그러나, CF 환자 100명 중 약 1명은 Phe508del CFTR 돌연변이를 가지고 있지 않으므로, 이 치료법에서 배제된다.

이와 같이, 기도 상피 세포 기능장애, 예를 들어, CF와 연관된 장애를 치료하기 위해, 예방 요법, 예를 들어, 면역화를 위해 이러한 기도 상피 세포를 표적화하기 위해, 또는 기도 상피 세포에 대한 핵산 분자 또는 기타 페이로드 분자의 치료적 전달로부터 이익을 얻을 수 있는 기타 장애를 치료하기 위해 개선된 요법에 대한 필요성이 존재한다.

본 개시내용은 기도 상피 기능장애와 연관된 장애의 치료를 위해 또는 환자의 예방적 이점을 위해 핵산 분자, 예를 들어, mRNA 치료제를 기도 상피 세포로 전달하기 위한 LNP 분자를 제공한다. 일 구현예에 있어서, 대상 LNP 분자는 낭포성 섬유증(CF), COPD, 또는 천식과 같은 상피 세포 기능장애와 연관된 장애를 치료할 뿐만 아니라 백신 페이로드를 투여하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은, 예를 들어, LNP의 세포 축적, 목적하는 단백질의 발현, 및/또는 mRNA 발현에 의해 측정되는 바와 같이, 예를 들어, 시험관내 및 생체내에서 세포에 투여될 때 개선된 특성, 예를 들어, 상피 세포로의 페이로드의 개선된 전달을 갖는 LNP를 제공한다.

일 양태에 있어서, 하기를 포함하는 나노입자가 본원에 제공되며:

(a) 지질 나노입자 코어,

(b) 세포로의 전달을 위해 상기 코어 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드, 및

(c) 주로 상기 코어의 외부 표면 상에 배치된 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 생리학적 pH에서 중성 제타 전위 초과이다.

일 양태에 있어서, 하기를 포함하는 나노입자가 본원에 제공된다:

(a) 하기를 포함하는 지질 나노입자 코어:

(i) 이온화 가능한 지질,

(ii) 인지질,

(iii) 구조적 지질, 및

(iv) PEG-지질, 및

(c) 양이온제.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 상피 세포에서 적어도 약 20%의 세포 축적을 나타내고 상피 세포에서 약 5% 이상의 발현을 나타낸다.

일 양태에 있어서, 지질 나노입자를 양이온제와 접촉시키는 것을 포함하는, 나노입자를 제조하는 과정이 본원에 제공되며, 여기서 상기 지질 나노입자는 하기를 포함한다:

(a) 하기를 포함하는 지질 나노입자 코어:

(i) 이온화 가능한 지질,

(ii) 인지질,

(iii) 구조적 지질, 및

(iv) PEG-지질, 및

(b) 세포로의 전달을 위해 상기 코어 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드.

일 양태에 있어서, 본원에 기재된 과정에 의해 제조되는 나노입자가 본원에 제공된다.

일 양태에 있어서, 세포를 본원에 기재된 나노입자와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드를 전달하는 방법이 본원에 제공된다.

일 양태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 질환의 치료 또는 예방을 위한 페이로드를 포함하는 나노입자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다.

본 발명의 제한의 각각은 본 발명의 다양한 구현예를 포괄할 수 있다. 따라서, 임의의 하나의 요소 또는 요소들의 조합을 수반하는 본 발명의 제한의 각각은 본 발명의 각각의 양태에 포함될 수 있음이 예상된다. 본 발명은 하기의 설명에 기술되거나 도면에 예시된 구성 요소의 구성 및 배열의 세부사항에 대한 적용에 제한되지 않는다. 본 발명은 기타 구현예가 가능하며 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다.

도 1은 LNP를 제조하기 위한 예시적인 1세대 사후 로딩(PHL; post-hoc loading) 과정의 다이어그램이다.
도 2는 LNP를 제조하기 위한 예시적인 2세대 PHL 과정(일반)의 다이어그램이다.
도 3은 LNP를 제조하기 위한 예시적인 2세대 PHL 과정(특정)의 다이어그램이다.
도 4는 공 LNP(empty LNP)가 pH 8.0에서 혼합되어 최종 제형이 pH 5.0인, 공 지질 나노입자 프로토타입("중성 어셈블리")을 제조하는 예시적인 과정의 다이어그램이다.
도 5는 스테롤 아민으로 LNP를 제조하는 예시적인 과정의 다이어그램이다.
도 6은 LNP-1 및 LNP-1a의 소각 x-선 산란(small angle x-ray scatter; SAXS) 분석이다.
도 7은 LNP-1 및 LNP-1a에 대한 일반화 분극 라우르단(GLP; general polarity Laurdan)을 나타내는 그래프이다.

본 개시내용은 핵산 또는 페이로드 분자를 기도 상피 세포로 전달하기 위한 LNP 분자를 제공한다. 예를 들어, 이러한 LNP 분자는 페이로드 분자, 예를 들어, 낭포성 섬유증(CF)의 치료를 위한 mRNA 치료제를 기도 상피 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 낭포성 섬유증(CF)은 지속적인 폐 감염을 유발하고 시간이 지남에 따라 호흡 능력을 제한하는 진행성 유전 질환이다. 이 질환은 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR) 단백질에 대한 유전자의 두 카피 모두에 돌연변이가 존재하는 것을 특징으로 한다. 땀, 소화액 및 점액 생성에 관여하는 CFTR이 존재하지 않으면, 일반적으로 묽은 분비물이 대신 걸쭉해진다. mRNA 치료제는 CFTR을 암호화하는 mRNA의 세포내 전달에 이어서 표적 세포 내에서 기능성 CFTR 단백질의 신생 합성을 제공하는 기술로서 CF의 치료법으로 특히 적합하다. 표적 세포에 mRNA를 전달한 후, 목적하는 CFTR 단백질은 세포 자체의 번역 기구(translational machinery)에 의해 발현되므로, 완전한 기능성의 CFTR 단백질은 결함이 있거나 누락된 단백질을 대체한다. 또 다른 구현예에 있어서, 이러한 LNP는 유전자 편집을 위한 핵산 분자, 소분자, 또는 상피 세포 기능장애를 개선하기 위한 기타 페이로드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 이러한 LNP는 기도 세포에 항원을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 항원은 상기 항원에 대한 면역 반응이 생성되도록 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현을 초래하는 상기 LNP에 존재하는 mRNA 작제물의 형태이다.

지질 나노입자(LNP; lipid nanoparticle)는 페이로드 분자, 예를 들어, mRNA를 표적 세포에 안전하고 효과적으로 전달하기 위한 이상적인 플랫폼이다. LNP는 세포 흡수, 세포내 수송 및 엔도솜 방출 또는 엔도솜 탈출을 수반하는 메커니즘에 의해 핵산을 전달하는 고유한 능력을 갖는다. 본원에 제공된 일부 구현예는 개선된 특성을 갖는 LNP를 특징으로 한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 제공된 LNP는 지질 나노입자 코어, 세포로의 전달을 위해 상기 코어 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드, 및 주로 상기 나노입자의 외부 표면 상에 배치된 양이온제를 포함한다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 주로 상기 코어의 외부 표면 상에 배치된 양이온제를 갖는 LNP는 인간 기관지 상피(HBE; human bronchial epithelial)와 같은 세포에서의 LNP의 축적을 개선할 수 있고, 예를 들어, 세포, 예를 들어, 기도 상피 세포에서의 mRNA 발현에 의해 측정된 바와 같이 페이로드 분자의 기능 또한 개선한다.

일부 구현예에 있어서, 하기를 포함하는 나노입자가 본원에 제공되며:

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 주로 상기 코어의 외부 표면 상에 배치된 양이온제,

일부 구현예에 있어서, 하기를 포함하는 나노입자가 본원에 제공된다:

(a) 하기를 포함하는 지질 나노입자 코어:

(i) 이온화 가능한 지질,

(ii) 인지질,

(iii) 구조적 지질, 및

(iv) PEG-지질, 및

(c) 양이온제.

일부 구현예에서, 하기를 포함하는 나노입자가 본원에 제공된다:

(a) 하기를 포함하는 지질 나노입자 코어:

(i) 이온화 가능한 지질,

(ii) 인지질,

(iii) 구조적 지질, 및

(iv) PEG-지질, 및

(c) 주로 상기 코어의 외부 표면 상에 배치된 양이온제.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 세포의 적어도 약 20%의 세포 축적을 나타내고 세포에서 약 5% 이상의 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 세포의 약 1% 내지 약 75%, 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 15% 내지 약 25%의 세포 축적을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 세포에서 약 0.5% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 3% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 15%의 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 주로 상기 코어의 외부 표면 상에 배치된 양이온제,

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 주로 상기 코어의 외부 표면 상에 배치된 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 세포에서 약 0.5% 내지 50%의 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 세포에서 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 상피 세포에서 적어도 약 20%의 세포 축적을 나타내고 상피 세포에서 약 5% 이상의 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 상피 세포의 약 1% 내지 약 75%, 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 15% 내지 약 25%의 세포 축적을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 상피 세포에서 약 0.5% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 3% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 15%의 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 상피 세포는 HBE 세포이다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 상피 세포의 약 0.5% 내지 50%의 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 상피 세포의 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 폐 세포의 약 0.5% 내지 약 50%에서 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 폐 세포의 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 비 세포(nasal cell)의 약 0.5% 내지 약 50%에서 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 비 세포의 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 폐포 상피 세포의 약 0.5% 내지 약 50%에서 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 폐포 상피 세포의 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 호흡기 상피 세포에서 적어도 약 20%의 세포 축적을 나타내고 호흡기 상피 세포에서 약 5% 이상의 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 호흡기 상피 세포의 약 1% 내지 약 75%, 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 15% 내지 약 25%의 세포 축적을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 호흡기 상피 세포에서 약 0.5% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 3% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 15%의 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 약 0.5% 내지 약 50%의 호흡기 상피 세포에서 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 호흡기 상피 세포의 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 대식 세포의 약 0.5% 내지 약 50%에서 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 대식 세포의 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 HeLa 세포의 약 0.5% 내지 약 50%에서 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 HeLa 세포의 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 기관지 상피 세포에서 적어도 약 20%의 세포 축적을 나타내고 기관지 상피 세포에서 약 5% 이상의 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 호흡기 상피 세포의 약 1% 내지 약 75%, 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 15% 내지 약 25%의 세포 축적을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 기관지 상피 세포에서 약 0.5% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 3% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 15%의 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 약 0.5% 내지 약 50%의 기관지 상피 세포에서 단백질 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 기관지 상피 세포의 약 0.1% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 단백질 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 HBE 세포에서 적어도 약 20%의 세포 축적을 나타내고 HBE 세포에서 약 5% 이상의 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 HBE에서 약 1% 내지 약 75%, 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 15% 내지 약 25%의 세포 축적을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 HBE 세포에서 약 0.5% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 3% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 15%의 발현을 나타낸다.

(a) 지질 나노입자 코어,

(c) 양이온제,

여기서 상기 나노입자는 시험관내 건강한 HBE 세포에서 적어도 약 20%의 세포 축적을 나타내고 시험관내 건강한 HBE 세포에서 약 5% 이상의 발현을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 시험관내 건강한 HBE 세포에서 약 1% 내지 약 75%, 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 15% 내지 약 25%의 세포 축적을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 시험관내 건강한 HBE 세포에서 약 0.5% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 3% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 15%의 발현을 나타낸다.

일부 구현예에 있어서, 상기 및 본원 전반에 걸쳐 지칭된 세포는 시험관내 세포 또는 생체내 세포일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포는 시험관내 세포이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포는 생체내 세포이다.

일부 구현예에 있어서, 본 발명의 나노입자는 실질적으로 동일한 조성이지만 양이온제의 후첨가(예를 들어, 양이온제와 사전-형성된 지질 나노입자와의 적층 또는 접촉) 없이 제조된 나노입자에 비해 (예를 들어, HBE와 같은 기도 상피 세포에서) 세포 축적이 증가한다. 일부 구현예에 있어서, 본 발명의 나노입자는 실질적으로 동일한 조성이지만 양이온제의 후첨가(예를 들어, 양이온제와 사전-형성된 지질 나노입자와의 적층 또는 접촉) 없이 제조된 나노입자에 비해 (예를 들어, HBE와 같은 기도 상피 세포에서) 세포 발현이 증가한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 0.1:1 내지 약 15:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 0.2:1 내지 약 10:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 1:1 내지 약 10:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 1:1 내지 약 8:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 1:1 내지 약 7:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 1:1 내지 약 6:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 1:1 내지 약 5:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 1:1 내지 약 4:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 1.25:1 내지 약 3.75:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 1.25:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 2.5:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비는 약 3.75:1이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 0.1:1 내지 약 20:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 1.5:1 내지 약 10:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 1.5:1 내지 약 9:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 1.5:1 내지 약 8:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 1.5:1 내지 약 7:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 1.5:1 내지 약 6:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 1.5:1 내지 약 5:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 1.5:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 2:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 3:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 4:1이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 몰비는 약 5:1이다.

일부 구현예에 있어서, 본 발명의 나노입자는 약 5 mV 내지 약 20 mV의 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 5 mV 내지 약 15 mV의 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 5 mV 내지 약 10 mV의 제타 전위를 갖는다.

제타 전위는 콜로이드 분산액의 표면 전하를 측정한다. 제타 전위의 크기는 분산액에서 인접하고, 유사하게 하전된 입자들 사이의 정전기적 반발 정도를 나타낸다. 제타 전위는 Wyatt Technologies Mobius Zeta Potential 기기 상에서 측정될 수 있다. 이 기기는 "초병렬 상 분석 광 산란(Massively Parallel Phase Analysis Light Scattering)" 또는 MP-PALS 원리에 의해 이동도 및 제타 전위를 특성화한다. 이 측정은 단지 하나의 검출 각만을 사용하고 작동에 더 높은 전압이 필요한 ISO 방법 13099-1:2012보다 더 민감하고 스트레스를 덜 유도한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 공 지질 나노입자 조성물 지질의 제타 전위는 MP-PALS 원리를 이용하는 기기를 사용하여 측정된다. 제타 전위는 Malvern Zetasizer(Nano ZS) 상에서 측정될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 지질 나노입자 코어는 중성 pH에서 중성 전하를 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제의 약 80% 초과는 상기 나노입자의 표면 상에 존재한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제의 약 90% 초과는 상기 나노입자의 표면 상에 존재한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제의 약 95% 초과는 상기 나노입자의 표면 상에 존재한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드의 적어도 약 50%는 상기 코어 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드의 적어도 약 75%는 상기 코어 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드의 적어도 약 90%는 상기 코어 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드의 적어도 약 95%는 상기 코어 내에 캡슐화된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 0.4 미만의 다분산도 값을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 0.3 미만의 다분산도 값을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 0.2 미만의 다분산도 값을 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 40 nm 내지 약 150 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 50 nm 내지 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 60 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 60 nm 내지 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 60 nm 내지 약 80 nm의 평균 직경을 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자의 라우르단의 일반화 분극은 약 0.6 이상이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 6 nm 초과의 면간 거리(d- spacing)를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 7 nm 초과의 면간 거리를 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자의 적어도 50%는 임계 분극 수준 초과의 표면 유동성 값을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자의 적어도 75%는 임계 분극 수준 초과의 표면 유동성 값을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자의 적어도 90%는 임계 분극 수준 초과의 표면 유동성 값을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자의 적어도 95%는 임계 분극 수준 초과의 표면 유동성 값을 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자가 세포의 집단과 접촉할 때 세포 집단의 약 10% 이상이 상기 나노입자를 축적하였다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자가 세포의 집단과 접촉할 때 세포 집단의 약 15% 이상이 상기 나노입자를 축적하였다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자가 세포의 집단과 접촉할 때 세포 집단의 약 20% 이상이 상기 나노입자를 축적하였다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자가 세포의 집단과 접촉할 때 세포의 약 5% 이상이 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자가 세포의 집단과 접촉할 때 세포의 약 10% 이상이 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 집단은 상피 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 집단은 호흡기 상피 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 호흡기 상피 세포 집단은 폐 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 호흡기 상피 세포 집단은 비 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 호흡기 상피 세포 집단은 폐포 상피 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 호흡기 상피 세포 집단은 기관지 상피 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 호흡기 상피 세포 집단은 HBE 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 집단은 폐 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 집단은 비 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 집단은 폐포 상피 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 집단은 기관지 상피 세포 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 집단은 HBE 집단이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 집단은 HeLa 집단이다.

양이온제

상기 양이온제는 순 양전하를 가지며 지질 나노입자 코어의 표면에 부착할 수 있는 임의의 수용성 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 제제는 또한 지용성일 수 있지만 또한 수용액에서도 가용성일 것이다. 상기 양이온제는 생리학적 pH에서 하전될 수 있다. 생리학적 pH는 인체에서 일반적으로 관찰되는 pH 수준이다. 생리학적 pH는 약 7.30 내지 7.45 또는 약 7.35 내지 7.45일 수 있다. 생리학적 pH는 약 7.40일 수 있다. 일반적으로 말해서, 상기 양이온제는 수성 매질의 생리학적 pH에서 양성자화되는 하나 이상의 염기성 작용기를 함유하기 때문에 생리학적 pH에서 순 양전하를 특징으로 한다. 예를 들어, 상기 양이온제는 하나 이상의 아민기, 예를 들어, 각각 8.0 이상의 pKa를 갖는 1차, 2차, 또는 3차 아민을 함유할 수 있다. 상기 pKa는 약 9 초과일 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제는 분자의 한 부분이, 예를 들어, 지질 모이어티를 포함하는 소수성이고, 분자의 다른 부분이 전형적으로 생리학적 pH에서 하전되는 하나 이상의 작용기를 함유하는 친수성인 수용성의 양친매성 분자인 양이온성 지질일 수 있다. 상기 지질 모이어티를 포함하는, 소수성 부분은 상기 양이온제를 지질 나노입자 코어에 고정시키는 역할을 할 수 있다. 상기 친수성 부분은 지질 나노입자 코어의 표면 상의 전하를 증가시키는 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 상기 양이온제는 알코올에서 약 1 mg/mL 초과의 용해도를 가질 수 있다. 상기 알코올에서의 용해도는 약 5 mg/mL 초과일 수 있다. 상기 알코올에서의 용해도는 약 10 mg/mL 초과일 수 있다. 상기 알코올에서의 용해도는 알코올에서 약 20 mg/mL 초과일 수 있다. 상기 알코올은 에탄올과 같은 C_1-6알코올일 수 있다.

상기 분자의 지질 부분은, 예를 들어, 구조적 지질, 지방산, 또는 유사한 하이드로카르빌기일 수 있다.

상기 구조적 지질은 스테로이드, 디테르페니오드(diterpeniod), 트리테르페노이드(triterpenoid), 콜레스탄, 우르솔산, 또는 이들의 유도체로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 콜레스테롤 또는 피스토스테롤로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는 스테로이드이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 콜레스테롤의 유사체이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 시토스테롤, 캄페스테롤, 또는 스티그마스테롤이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 시토스테롤, 캄페스테롤, 또는 스티그마스테롤의 유사체이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 β-시토스테롤이다.

상기 지방산은 1개 내지 4개의 C_6-20탄화수소 사슬을 포함한다. 상기 지방산은 완전히 포화되거나 1개 내지 7개의 이중 결합을 함유할 수 있다. 상기 지방산은 주사슬을 따라 또는 주사슬에 고정된(pendent) 1개 내지 5개의 헤테로원자를 함유할 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 지방산은 2개의 C_10-18탄화수소 사슬을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 지방산은 2개의 C_10-18포화 탄화수소 사슬을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 지방산은 2개의 C₁₆포화 탄화수소 사슬을 포함한다. 일부 구현예예 있어서, 상기 지방산은 2개의 C₁₄포화 탄화수소 사슬을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 지방산은 2개의 불포화 C_10-18탄화수소 사슬을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 지방산은 각각 하나의 이중 결합을 갖는, 2개의 C_16-18탄화수소 사슬을 포함한다.일부 구현예에 있어서, 상기 지방산은 3개의 C_8-18포화 탄화수소 사슬을 포함한다.

상기 하이드로카르빌기는 1개 내지 4개의 C_6-20알킬, 알케닐, 또는 알키닐 사슬 또는 3원 내지 10원 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 또는 사이클로알키닐기로 이루어진다.

일부 구현예에 있어서, 상기 하이드로카르빌 사슬은 C_8-10알킬이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 하이드로카르빌 사슬은 C_8-10알케닐이다.

상기 친수성 부분은 생리학적 pH 7.3 내지 7.4에서 하전되는 1개 내지 5개의 작용기를 포함할 수 있다. 친수성 기는 생리학적 pH에서 양성자화되고 양으로 하전되는 염기성 작용기를 포함할 수 있다. 염기성 작용기 중 적어도 하나는 8 이상의 pKa를 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 친수성 부분은 아민기를 포함한다. 상기 아민기는 1개 내지 4개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 1차, 2차, 또는 3차 아민은 -C(=N-)-N-, -C=C-N-, -C=N-, 또는 -N-C(=N-)-N-으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는, 더 큰 아민 함유 작용기의 일부일 수 있다. 상기 아민은 3원 내지 8원 헤테로알킬 또는 헤테로아릴 고리에 함유될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 아민기는 1개 또는 2개의 말단 1차 아민을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 아민기는 1개 또는 2개의 말단 1차 아민 및 1개의 내부 2차 아민을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 아민기는 1개 또는 2개의 3차 아민을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 3차 아민은 (CH₃)₂N-이다. 일부 구현예에 있어서, 아민기는 1개 내지 2개의 말단 (CH₃)₂N-을 포함한다.

상기 친수성 부분은 포스포늄기를 포함할 수 있다. 상기 포스포늄 이온의 반대 이온은 전하가 1인 음이온으로 이루어진다.

일부 구현예에 있어서, 상기 포스포늄 상의 치환기 중 3개는 이소프로필기이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 반대 이온은 할로, 하이드로겐 설페이트, 나이트라이트, 클로레이트, 또는 하이드로겐 카르보네이트이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 반대 이온은 브로마이드이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제는 스테롤 아민인 양이온성 지질이다. 스테롤 아민은 그 소수성 부분이 스테롤이고 그 친수성 부분이 아민기이다. 상기 스테롤기는 콜레스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 또는 이들의 유도체로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 아민기는 1개 내지 5개의 1차, 2차, 3차 아민, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 아민 중 적어도 하나는 8 이상의 pKa를 가지며 생리학적 pH에서 하전된다. 상기 1차, 2차, 또는 3차 아민은 -C(=N-)-N-, -C=C-N-, -C=N-, 또는 -N-C(=N-)-N-으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는 더 큰 아민 함유 작용기의 일부일 수 있다. 상기 아민은 3원 내지 8원 헤테로알킬 또는 헤테로아릴 고리에 함유될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민의 아민기는 1개 또는 2개의 말단 1차 아민을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 아민기는 1개 또는 2개의 말단 1차 아민 및 1개의 내부 2차 아민을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 아민기는 1개 또는 2개의 3차 아민을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 3차 아민은 (CH₃)₂N-이다. 일부 구현예에 있어서, 아민기는 1개 내지 2개의 말단 (CH₃)₂N-을 포함한다.

본 발명의 나노입자에 유용한 스테롤 아민은 화학식 (A1)을 갖는 분자:

A-L-B (A1)

또는 이의 염을 포함하며, 여기서:

A는 아민기이고, L은 임의의 링커이고, 및 B는 스테롤이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 아민기는 알킬(예를 들어, C_1-14알킬, C_1-12알킬, C_1-10알킬 등), 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이며, 여기서 상기 알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하며, 여기서 상기 알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, 할로, OH, O(C_1-6알킬), C_1-6알킬-OH, NH₂, NH(C_1-6알킬), N(C_1-6알킬)₂, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬(1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-14알킬로 임의로 치환됨), 5원 내지 6원 헤테로아릴, NH(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 NH(5원 내지 6원 헤테로아릴)로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 치환기로 임의로 치환된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 링커는 부재하거나, -O-, -S-S-, -OC(=O), -C(=O)N-, -OC(=O)N-, CH₂-NH-C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-, -S-S-CH₂, 또는 -SS-CH₂-CH₂-C(O)N-이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤기는 콜레스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 또는 이들의 유도체이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 화학식 A2a:

(A2a)

또는 이의 염을 가지며, 여기서:

----는 단일 또는 이중 결합이고

R¹은 C_1-14알킬 또는 C_1-14알케닐이고;

L^a는 부재하거나, -O-, -S-S-, -OC(=O), -C(=O)N-, -OC(=O)N-, CH₂-NH-C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-, -S-S-CH₂, -SS-CH₂-CH₂-C(O)N-, 또는 화학식 (a)의 기:

(a)이고;

Y¹은 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고

여기서 상기 알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고

여기서 상기 알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, 할로, OH, O(C_1-6알킬), C_1-6알킬-OH, NH₂,NH(C_1-6알킬), N(C_1-6알킬)₂, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬(1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-14알킬로 임의로 치환됨), 5원 내지 6원 헤테로아릴, NH(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 NH(5원 내지 6원 헤테로아릴)로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 그리고 n = 1 또는 2이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 화학식 A2a:

(A2a)

또는 이의 염을 가지며, 여기서:

----는 단일 또는 이중 결합이고

R¹은 C_1-14알킬 또는 C_1-14알케닐이고;

(a)이고;

여기서 상기 알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, 할로, OH, O(C_1-6알킬), C_1-6알킬-OH, NH₂,NH(C_1-6알킬), N(C_1-6알킬)₂, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬(1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-14알킬로 임의로 치환됨), 5원 내지 6원 헤테로아릴, NH(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 NH(5원 내지 6원 헤테로아릴)로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 그리고

n = 1 또는 2이되;

단, 상기 화학식 A2a의 화합물은 하기가 아니다:

(SA1)

(SA2)

(SA3)

(SA4)

(SA5)

(SA9)

(SA10)

(SA11)

(SA22)

(SA23)

(SA29)

(SA30)

(SA39)

및

(SA40).

일부 구현예에 있어서, ----는 이중 결합이다. 일부 구현예에 있어서, ----는 단일 결합이다.

일부 구현예에 있어서, L^a는-OC(=O), -OC(=O)N-, 또는 -OC(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-이다.

일부 구현예에 있어서, n은 1이다. 일부 구현예에 있어서, n은 2이다.

일부 구현예에 있어서, R¹은C_1-14알킬이다. 일부 구현예에 있어서, R¹은C_1-14 알케닐이다. 일부 구현예에 있어서, R¹은

,

, 또는

이다.

일부 구현예에 있어서, Y¹은 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이며,

여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고;

그리고 여기서 상기 C_1-10알킬, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, OH, -C_1-6알킬-OH, 또는 NH₂로 임의로 치환된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 화학식 A2:

(A2)

또는 이의 염을 가지며, 여기서:

----는 단일 또는 이중 결합이고

R¹은 C_1-14알킬 또는 C_1-14알케닐이고;

L은 부재하거나, -O-, -S-S-, -OC(=O), -C(=O)N-, -OC(=O)N-, CH₂-NH-C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-, -S-S-CH₂, 또는 -SS-CH₂-CH₂-C(O)N-이고;

Y¹은 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고,

여기서 상기 알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고,

n = 1 또는 2이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 화학식 A3a:

(A3a)

또는 이의 염을 가지며, 여기서:

----는 단일 또는 이중 결합이고;

R²는 H 또는 C_1-6알킬이고;

(a)이고;

n = 1 또는 2이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 화학식 A3a:

(A3a)

또는 이의 염을 가지며, 여기서:

----는 단일 또는 이중 결합이고;

R²는 H 또는 C_1-6알킬이고;

(a)이고;

n = 1 또는 2이되;

단, 상기 화학식 A2a의 화합물은 하기가 아니다:

(SA1)

(SA2)

(SA3)

(SA4)

(SA5)

(SA9)

(SA10)

(SA11)

(SA22)

(SA23)

(SA29)

(SA30)

(SA39)

및

(SA40).

일부 구현예에 있어서, R²는 H이다. 일부 구현예에 있어서, R²는에틸이다.

일부 구현예에 있어서, Y¹은 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고,

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 화학식 A3:

(A3)

또는 이의 염을 가지며, 여기서:

----는 단일 또는 이중 결합이고;

R²는 H 또는 C_1-6알킬이고;

n = 1 또는 2이다.

일부 구현예에 있어서, Y¹은하기로부터 선택된다:

(1)

; (2)

; (3)

; (4)

; (5)

; (6)

; (7)

; (8)

; (9)

; (10)

; (11)

;

(12)

; (13)

; (14)

; (15)

; (16)

; (17)

; (18)

; (19)

; (20)

; (21)

(22)

; (23)

; (28) N(CH₃)₂; (29)

; (30)

; (31)

; 및 (32)

.

일부 구현예에 있어서 Y¹은하기로부터 선택된다:

(1)

; (2)

; (3)

; (4)

; (5)

; (6)

;

(7)

; (8)

; (9)

; (10)

; (11)

; (12)

;

(13)

; (14)

; (15)

; (16)

; (17)

; (18)

; (19)

; (20)

; (21)

(22)

; (23)

; (24)

; (25)

; (26)

; (27)

; (28)

N(CH₃)₂.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 화학식 A4:

(A4)

또는 이의 염을 가지며, 여기서:

Z¹은 OH 또는 C_3-6알킬이고;

n = 1 또는 2이다.

일부 구현예에 있어서, Z¹은 OH이다.일부 구현예에 있어서, Z¹은 C_3-6알킬이다.

일부 구현예에 있어서, L은 -C(=O)N-, -CH₂-NH-C(=O)-, 또는 -C(=O)O-이다.

일부 구현예에 있어서, Y¹은 1개내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-10알킬이다.일부 구현예에 있어서, Y¹은

이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 화학식 A5:

(A5)

또는 이의 염을 가지며, 여기서:

Z²는 OH 또는 이소프로필이고;

L³은 -CH₂-NH-C(O)-, -C(O)NH-, 또는 -C(O)O-이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 하기:

표 1

또는 이들의 염으로부터 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 하기로부터 선택된다:

표 2

.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 하기:

표 4

또는 이들의 염으로부터 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 하기:

표 5

또는 이들의 염으로부터 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 스테롤 아민은 SA3:

, 또는 이의 염이며, 이는 GL-67으로도 지칭된다. SA3 또는 GL-67은 기술분야의 공지된 과정에 따라 제조되거나 Avanti® Polar Lipids, Inc.(SKU 890893)와 같은 상업적 공급업체로부터 구입할 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질은 아민-함유 측쇄를 갖는 아미노산 잔기가 소수성 기, 예컨대, 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤 또는 이의 유도체), 지방산, 또는 유사한 하이드로카르빌기에 부가된 변형된 아르기닌과 같은 변형된 아미노산이다. 상기 변형된 아미노산 부분의 적어도 하나의 아민은 8.0 이상의 pKa를 갖는다. 상기 변형된 아미노산 부분의 적어도 하나의 아민은 생리학적 pH에서 양으로 하전된다. 상기 아미노산 잔기는 아르기닌, 히스티딘, 리신, 트립토판, 오르니틴, 및 5-하이드록시리신을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 상기 아미노산은 링커를 통해 상기 소수성 기에 결합된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 아미노산은 변형된 아르기닌이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제는 비-지질 양이온제이다. 비-지질 양이온제의 예는, 예를 들어, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리듐 클로라이드, L-리신 모노하이드레이트, 또는 트로메타민을 포함한다.

본원에서 일반적으로 정의된 바와 같이, 용어 "지질"은 소수성 또는 양친매성 특성을 갖는 소분자를 지칭한다. 지질은 천연 발생 또는 합성된 것일 수 있다. 지질 부류의 예는 지방, 왁스, 스테롤-함유 대사산물, 비타민, 지방산, 글리세로지질, 글리세로인지질, 스핑고지질, 사카로지질, 및 폴리케티드, 및 프레놀 지질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에 있어서, 일부 지질의 양친매성 특성으로 인해 이들은 수성 매질에서 리포솜, 소포, 또는 막을 형성하게 된다.

이온화 가능한 지질

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이온화 가능한 지질"은 기술분야에서 통상적인 의미를 가지며, 하나 이상의 하전된 모이어티를 포함하는 지질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 이온화 가능한 지질은 양으로 하전되거나 음으로 하전될 수 있다. 예를 들어, 이온화 가능한 지질은 낮은 pH에서 양으로 하전되며, 이 경우 이는 "양이온성 지질"로 지칭될 수 있다. 특정한 구현예에 있어서, 이온화 가능한 지질 분자는 아민기를 포함할 수 있으며, 이온화 가능한 아미노 지질로 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "하전된 모이어티"는, 예를 들어, 1가(+1, 또는 -1), 2가(+2, 또는 -2), 3가(+3, 또는 -3) 등과 같이 형식 전자 전하를 운반하는 화학적 모이어티이다. 상기 하전된 모이어티는 음이온성(즉, 음으로 하전됨) 또는 양이온성(즉, 양으로 하전됨)일 수 있다. 양으로 하전된 모이어티의 예는 아민기(예를 들어, 1차, 2차, 및/또는 3차 아민), 암모늄기, 피리디늄기, 구아니딘기, 및 이미다졸륨기를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 하전된 모이어티는 아민기를 포함한다. 음으로 하전된 기 또는 이의 전구체의 예는 카르복실레이트기, 설포네이트기, 설페이트기, 포스포네이트기, 포스페이트기, 하이드록실기 등을 포함한다. 상기 하전된 모이어티의 전하는, 일부 경우, 환경 조건에 따라 변화할 수 있으며, 예를 들어, pH의 변화는 상기 모이어티의 전하를 변경하고, 및/또는 상기 모이어티가 하전되거나 하전되지 않도록 할 수 있다. 일반적으로, 분자의 전하 밀도는 목적하는 바에 따라 선택할 수 있다.

용어 "하전된" 또는 "하전된 모이어티"는 분자 상의 "부분 음전하" 또는 "부분 양전하"를 지칭하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 용어 "부분 음전하" 및 "부분 양전하"는 기술분야에서 통상적인 의미로 주어진다. "부분 음전하"는 작용기가 전자 밀도로 하여금 결합의 한 원자 쪽으로 편재되도록 하여 원자 상에 부분 음전하를 생성하도록 분극화되는 결합을 포함할 때 발생할 수 있다. 통상의 기술자는, 일반적으로, 이러한 방식으로 분극화될 수 있는 결합을 인식한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 이온화 가능한 아미노 지질이다. 일 구현예에 있어서, 상기 이온화 가능한 아미노 지질은 링커 구조를 통해 연결된 양으로 하전된 친수성 헤드 및 소수성 테일을 가질 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자는 약 30 mol% 내지 약 60 mol%의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 40 mol% 내지 약 50 mol%의 이온화 가능한 지질을 포함한다.

본 발명의 지질 나노입자 조성물은 하나 이상의 이온화 가능한(예를 들어, 이온화 가능한 아미노) 지질(예를 들어, 생리학적 pH에서 양전하 또는 부분 양전하를 가질 수 있는 지질)을 포함할 수 있다. 이온화 가능한 지질은 3-(디도데실아미노)-N1,N1,4-트리도데실-1-피페라진에탄아민(KL10), N1-[2-(디도데실아미노)에틸] N1,N4,N4-트리도데실-1,4-피페라진디에탄아민(KL22), 14,25-디트리데실-15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄(KL25), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2 디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DODMA), 2-({8 [(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시) N,N 디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(옥틸-CLinDMA), (2R)-2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(Octyl-CLinDMA(2R)), 및 (2S) 2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(옥틸-CLinDMA(2S))으로 이루어진 비-제한적 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 외에, 이온화 가능한 지질은 또한 사이클릭 아민기를 포함하는 지질일 수도 있다.

이온화 가능한 지질은 또한 국제 공개 번호 WO 2017/075531 A1에 개시된 화합물일 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 상기 이온화 가능한 아미노 지질은 하기:

;

;

;

및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이온화 가능한 지질은 또한 국제 공개 번호 WO 2015/199952 A1에 개시된 화합물일 수도 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 상기 이온화 가능한 아미노 지질은 하기:

;

;

;

;

;

;

;

;

;

일 구현예에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 국제 공개 번호 WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2008103276, WO2013086373 및 WO2013086354, US 특허 번호 제7,893,302호, 제7,404,969호, 제8,283,333호, 및 제8,466,122호 및 US 특허 공개 번호 US20100036115, US20120202871, US20130064894, US20130129785, US20130150625, US20130178541 및 S20130225836에 기재된 이온화 가능한 지질로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않으며; 이들의 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 국제 공개 번호 WO2013116126 또는 US20130225836에 기재된 화학식 A로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않으며; 이들의 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 국제 공개 번호 WO2008103276의 화학식 CLI-CLXXIX, 미국 특허 번호 제7,893,302호의 화학식 CLI-CLXXIX, 미국 특허 번호 제7,404,969호의 화학식 CLI-CLXXXXII 및 미국 특허 공개 번호 US20100036115의 화학식 I-VI, 미국 특허 공개 번호 US20130123338의 화학식 I로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않으며; 이들의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

비-제한적 예로서, 양이온성 지질은 (20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-20,23-디엔-10-아민, (17Z,20Z)-N,N-디메밀헥사코사-17,20-디엔-9-아민, (1Z,19Z)-N5N-디메틸펜타코사-16,19-디엔-8-아민, (13Z,16Z)-N,N-디메틸도코사-13,16-디엔-5-아민, (12Z,15Z)-N,N 디메틸헤니코사-12,15-디엔-4-아민, (14Z,17Z)-N,N-디메틸트리코사-14,17-디엔-6-아민, (15Z,18Z)-N,N-디메틸테트라코사-15,18-디엔-7-아민, (18Z,21Z)-N,N-디메틸헵타코사-18,21-디엔-10-아민, (15Z,18Z)-N,N-디메틸테트라코사-15,18-디엔-5-아민, (14Z,17Z)-N,N-디메틸트리코사-14,17-디엔-4-아민, (19Z,22Z)-N,N-디메이힐옥타코사-19,22-디엔-9-아민, (18Z,21Z)-N,N-디메틸헵타코사-18,21-디엔-8-아민, (17Z,20Z)-N,N-디메틸헥사코사-17,20-디엔-7-아민, (16Z,19Z)-N,N-디메틸펜타코사-16,19-디엔-6-아민, (22Z,25Z)-N,N-디메틸헨트리아콘타-22,25-디엔-10-아민, (21Z,24Z)-N,N-디메틸트리아콘타-21,24-디엔-9-아민, (18Z)-N,N-디메틸헵타코스-18-엔-10-아민, (17Z)-N,N-디메틸헥사코스-17-엔-9-아민, (19Z,22Z)-N,N-디메틸옥타코사-19,22-디엔-7-아민, N,N-디메틸헵타코산-10-아민, (20Z,23Z)-N-에틸-N-메틸노나코사-20,23-디엔-10-아민, 1-[(11Z,14Z)-1-노닐리코사-11,14-디엔-1-일] 피롤리딘, (20Z)-N,N-디메틸헵타코스-20-엔-10-아민, (15Z)-N,N-디메틸 엡타코스-15-엔-10-아민, (14Z)-N,N-디메틸노나코스-14-엔-10-아민, (17Z)-N,N-디메틸노나코스-17-엔-10-아민, (24Z)-N,N-디메틸트리트리아콘트-24-엔-10-아민, (20Z)-N,N-디메틸노나코스-20-엔-10-아민, (22Z)-N,N-디메틸헨트리아콘트-22-엔-10-아민, (16Z)-N,N-디메틸펜타코스-16-엔-8-아민, (12Z,15Z)-N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민, (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민, N,N-디메틸-1-[(lS,2R)-2-옥틸사이클로프로필] 엡타데칸-8-아민, 1-[(1S,2R)-2-헥실사이클로프로필]-N,N-디메틸노나데칸-10-아민, N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]노나데칸-10-아민, N,N-디메틸-21-[(lS,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헤니코산-10-아민, N,N-디메틸-1-[(1S,2S)-2-{[(lR,2R)-2-펜틸사이클로프로필]메틸}사이클로프로필]노나데칸-10-아민,N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헥사데칸-8-아민, N,N-디메틸-[(lR,2S)-2 운데실사이클로프로필]테트라데칸-5-아민, N,N-디메틸-3-{7-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헵틸} 도데칸-1-아민, 1-[(1R,2S)-2-헵틸사이클로프로필]-N,N-디메틸옥타데칸-9-아민, 1-[(1S,2R)-2-데실사이클로프로필]-N,N-디메틸펜타데칸-6-아민, N,N-디메틸-1-[(lS,2R)-2-옥틸사이클로프로필]펜타데칸-8-아민, R-N,N-디메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, S-N,N-디메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-{2-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-1-[(옥틸옥시)메틸]에틸}피롤리딘, (2S)-N,N-디메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-3-[(5Z)-옥트-5-엔-1-일옥시]프로판-2-아민, 1-{2-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-1-[(옥틸옥시)메틸]에틸}아제티딘, (2S)-1-(헥실옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, (2S)-1-(헵틸옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-디메틸-1-(노닐옥시)-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-디메틸-1-[(9Z)-옥타덱-9-엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민; (2S)-N,N-디메틸-1-[(6Z,9Z,12Z)-옥타데카-6,9,12-트리엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-[(11Z,14Z)-이코사-11,14-디엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(펜틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-(헥실옥시)-3-[(11Z,14Z)-이코사-11,14-디엔-1-일옥시]-N,N-디메틸프로판-2-아민, 1-[(11Z,14Z)-이코사-11,14-디엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-[(13Z,16Z)-도코사-13,16-디엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-[(13Z,16Z)-도코사-13,16-디엔-1-일옥시]-3-(헥실옥시)-N,N-디메틸프로판-2-아민, (2S)-1-[(13Z)-도코스-13-엔-1-일옥시]-3-(헥실옥시)-N,N-디메틸프로판-2-아민, 1-[(13Z)-도코스-13-엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-[(9Z)-헥사덱-9-엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2R)-N,N-디메틸-H(1-메토일옥틸)옥시]-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, (2R)-1-[(3,7-디메틸옥틸)옥시]-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-디메틸-1-(옥틸옥시)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-펜틸사이클로프로필]메틸}사이클로프로필]옥틸}옥시)프로판-2-아민, N,N-디메틸-1-{[8-(2-옥틸사이클로프로필)옥틸]옥시}-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민 및 (11E,20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-11,20,2-트리엔-10-아민 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체로부터 선택될 수 있다.

이온화 가능한 지질의 추가적인 예는 하기와 같다:

.

일 구현예에 있어서, 상기 지질은 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 국제 공개 번호 WO2012170889에 기재된 것과 같은 절단 가능한 지질일 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 지질은 기술분야에 공지된 방법 및/또는 국제 공개 번호 WO2013086354에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있으며; 이들의 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 지질은 트리알킬 양이온성 지질일 수 있다. 트리알킬 양이온성 지질의 비-제한적 예 및 상기 트리알킬 양이온성 지질의 제조 및 사용 방법은 국제 특허 공개 번호 WO2013126803에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 화학식 (I)의 화합물:

(I),

또는 이의 염 또는 이성질체일 수 있으며, 여기서:

R₁은 H, C_5-30알킬, C_5-30알케닐, -R*YR", -YR", -(CH₂)_n(NR₄)R"M'R', 및 -R"M'R'로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R₂ 및 R₃은 H, C_1-14알킬, C_2-14알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R₂ 및 R₃은, 이들이 부착된 원자와 함께, 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하며, 여기서 상기 카르보사이클은 C₆사이클로알킬 또는 C₅알킬로 임의로 치환되고;

R₄는 C_3-6카르보사이클, -(CH₂)_nQ, -(CH₂)_nCHQR, -CHQR, -CQ(R)₂, -CH(CH₂Q)₂, 및 비치환된 C_1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 C_3-6카르보사이클은 -OH 또는 -OMe로 임의로 치환되고;

각각의 Q는 카르보사이클, 헤테로사이클, -OR, -O(CH₂)_nN(R)₂, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX₃, -CX₂H, -CXH₂, -CN, -N(R)₂, -C(O)N(R)₂, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(R)C(O)N(R)₂, -N(R)C(S)N(R)₂, -N(R)R₈, -O(CH₂)_nOR, -(CH₂)_nOR, -N(R)C(=NR₉)N(R)₂, -N(R)C(=CHR₉)N(R)₂, -OC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)₂R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)₂, -N(OR)C(S)N(R)₂, -N(OR)C(=NR₉)N(R)₂, -N(OR)C(=CHR₉)N(R)₂, -C(=NR₉)N(R)₂, -C(=NR₉)R, -C(O)N(R)OR, 및 -C(R)N(R)₂C(O)OR로부터 독립적으로 선택되거나;

또는 Q는 하기로부터 선택되고:

,

,

,

,

,

,

,

,

, 및

;

각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R₅는 C_1-3알킬, C_2-3알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R₆은 C_1-3알킬, C_2-3알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

M 및 M'는 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)₂-, -S-S-, 아릴기, 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;

R₇은 C_1-3알킬, C_2-3알케닐,및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R₈은 C_3-6카르보사이클 및 헤테로사이클로이루어진 군으로부터 선택되고;

R₉는 H, CN, NO₂, C_1-6알킬, -OR, -S(O)₂R, -S(O)₂N(R)₂, C_2-6알케닐, C_3-6카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진군으로부터 선택되고;

각각의 R은 C_1-3알킬, C_2-3알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 상기 C_1-3알킬은 -OH, -C(O)OH, -OMe, -O-벤질로 임의로 치환되고,

각각의 R'는 C_1-18알킬, C_2-18알케닐, -R*YR", -YR", 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 C_1-18알킬은 -OMe로 임의로 치환되고;

각각의 R"는 H, C_3-14알킬 및 C_3-14알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R*는 C_1-12알킬 및 C_2-12알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

각각의 X는 F, Cl, Br, 및 I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 그리고

m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13으로부터 선택된다.

(I),

또는 이의 염 또는 이성질체일 수 있으며, 여기서:

R₁은 C_5-30알킬, C_5-20알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R"M'R'로이루어진 군으로부터 선택되고;

R₂ 및 R₃은 H, C_1-14알킬, C_2-14알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R₂ 및 R₃은, 이들이 부착된 원자와 함께, 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하고;

R₄는 C_3-6카르보사이클, -(CH₂)_nQ, -(CH₂)_nCHQR, -CHQR, -CQ(R)₂, 및 비치환된 C_1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 Q는 카르보사이클, 헤테로사이클, -OR, -O(CH₂)_nN(R)₂, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX₃, -CX₂H, -CXH₂, -CN, -N(R)₂,

-C(O)N(R)₂, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(R)C(O)N(R)₂, -N(R)C(S)N(R)₂, -N(R)R₈,

-O(CH₂)_nOR, -N(R)C(=NR₉)N(R)₂, -N(R)C(=CHR₉)N(R)₂, -OC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)OR,

-N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)₂R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)₂, -N(OR)C(S)N(R)₂,

-N(OR)C(=NR₉)N(R)₂, -N(OR)C(=CHR₉)N(R)₂, -C(=NR₉)N(R)₂, -C(=NR₉)R, -C(O)N(R)OR, 및 -C(R)N(R)₂C(O)OR로부터 선택되고, 및 각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 독립적으로 선택되며;

R₉는 H, CN, NO₂, C_1-6알킬, -OR, -S(O)₂R, -S(O)₂N(R)₂, C_2-6 알케닐, C_3-6카르보사이클 및 헤테로사이클로이루어진 군으로부터 선택되고;

각각의 R은 C_1-3알킬, C_2-3알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R'는 C_1-18알킬, C_2-18알케닐, -R*YR", -YR", 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R"는 C_3-14알킬 및 C_3-14알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13으로부터 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 화학식 (I)의 화합물의 하위세트는 R₄가-(CH₂)_nQ, -(CH₂)_nCHQR, -CHQR, 또는 -CQ(R)₂일 때, (i) n이 1, 2, 3, 4 또는 5일 때 Q가 -N(R)₂가 아니거나, 또는 (ii) n이 1 또는 2일 때 Q가 5원, 6원, 또는 7원 헤테로사이클로알킬이 아닌 화합물을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 하위세트는

R₄는 C_3-6 카르보사이클, -(CH₂)_nQ, -(CH₂)_nCHQR, -CHQR, -CQ(R)₂, 및 비치환된 C_1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서Q는 C_3-6카르보사이클, N, O, 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 5원 내지 14원 헤테로아릴, -OR, -O(CH₂)_nN(R)₂, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX₃, -CX₂H, -CXH₂, -CN, -C(O)N(R)₂, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(R)C(O)N(R)₂, -N(R)C(S)N(R)₂, -CRN(R)₂C(O)OR, -N(R)R₈, -O(CH₂)_nOR, -N(R)C(=NR₉)N(R)₂, -N(R)C(=CHR₉)N(R)₂, -OC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)₂R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)₂, -N(OR)C(S)N(R)₂, -N(OR)C(=NR₉)N(R)₂, -N(OR)C(=CHR₉)N(R)₂, -C(=NR₉)N(R)₂, -C(=NR₉)R, -C(O)N(R)OR, 및 옥소(=O), OH, 아미노, 모노- 또는 디-알킬아미노, 및 C_1-3 알킬로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된, N, O, 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 5원 내지 14원 헤테로사이클로알킬로부터 선택되고, 및 각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 독립적으로 선택되며;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13으로부터 선택되는 화합물,

또는 이들의 염 또는 이성질체를 포함한다.

R₄는 C_3-6카르보사이클, -(CH₂)_nQ, -(CH₂)_nCHQR, -CHQR, -CQ(R)₂, 및 비치환된 C_1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서Q는 C_3-6카르보사이클, N, O, 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 5원 내지 14원 헤테로사이클, -OR, -O(CH₂)_nN(R)₂, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX₃, -CX₂H, -CXH₂, -CN, -C(O)N(R)₂, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(R)C(O)N(R)₂, -N(R)C(S)N(R)₂, -CRN(R)₂C(O)OR, -N(R)R₈, -O(CH₂)_nOR, -N(R)C(=NR₉)N(R)₂, -N(R)C(=CHR₉)N(R)₂, -OC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)₂R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)₂, -N(OR)C(S)N(R)₂, -N(OR)C(=NR₉)N(R)₂, -N(OR)C(=CHR₉)N(R)₂, -C(=NR₉)R, -C(O)N(R)OR, 및 -C(=NR₉)N(R)₂로부터 선택되고, 및 각각의 n은 1, 2, 3, 4 및 5로부터 독립적으로 선택되며; 및

Q가 5원 내지 14원 헤테로사이클이고 및 (i) R₄가(-CH₂)_nQ이고, 여기서 n이 1 또는 2이거나, 또는 (ii) R₄가_-(CH₂)_nCHQR이고, 여기서 n이 1이거나, 또는 (iii) R₄가 -CHQR 및 -CQ(R)₂일 때, Q는 5원 내지 14원 헤테로아릴 또는 8원 내지 14원 헤테로사이클로알킬이고;

각각의 R₆은C_1-3알킬, C_2-3알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

R₉는 H, CN, NO₂, C_1-6 알킬, -OR, -S(O)₂R, -S(O)₂N(R)₂, C_2-6 알케닐, C_3-6카르보사이클 및 헤테로사이클로이루어진 군으로부터 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13으로부터 선택되는 화합물,

또는 이들의 염 또는 이성질체를 포함한다.

R₄는 C_3-6카르보사이클, -(CH₂)_nQ, -(CH₂)_nCHQR, -CHQR, -CQ(R)₂, 및 비치환된 C_1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서Q는 C_3-6카르보사이클, N, O, 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 5원 내지 14원 헤테로아릴, -OR,

-O(CH₂)_nN(R)₂, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX₃, -CX₂H, -CXH₂, -CN, -C(O)N(R)₂, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(R)C(O)N(R)₂, -N(R)C(S)N(R)₂, -CRN(R)₂C(O)OR, -N(R)R₈, -O(CH₂)_nOR, -N(R)C(=NR₉)N(R)₂, -N(R)C(=CHR₉)N(R)₂, -OC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)₂R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)₂, -N(OR)C(S)N(R)₂, -N(OR)C(=NR₉)N(R)₂, -N(OR)C(=CHR₉)N(R)₂, -C(=NR₉)R, -C(O)N(R)OR, 및 -C(=NR₉)N(R)₂로부터 선택되고, 및 각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 독립적으로 선택되며;

R₉는 H, CN, NO₂, C_1-6알킬, -OR, -S(O)₂R, -S(O)₂N(R)₂, C_2-6알케닐, C_3-6카르보사이클 및 헤테로사이클로이루어진 군으로부터 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13으로부터 선택되는 화합물,

또는 이들의 염 또는 이성질체를 포함한다.

R₂ 및 R₃은 H, C_2-14알킬, C_2-14알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R₂ 및 R₃은, 이들이 부착된 원자와 함께, 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하고;

R₄는 -(CH₂)_nQ 또는 -(CH₂)_nCHQR이며, 여기서 Q는 -N(R)₂이고, 및 n은 3, 4, 및 5로부터 선택되며;

각각의 R*는 C_1-12알킬 및 C_1-12알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13으로부터 선택되는 화합물,

또는 이들의 염 또는 이성질체를 포함한다.

R₂ 및 R₃은C_1-14알킬, C_2-14알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R₂ 및 R₃은, 이들이 부착된 원자와 함께, 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하고;

R₄는 -(CH₂)_nQ, -(CH₂)_nCHQR, -CHQR, 및 -CQ(R)₂로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 Q는 -N(R)₂이고, 및 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되며;

각각의 R"는C_3-14알킬 및 C_3-14알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13으로부터 선택되는 화합물,

또는 이들의 염 또는 이성질체를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 화학식 (I)의 화합물의 하위세트는 화학식 (IA)의 화합물:

(IA),

또는 이의 염 또는 이성질체를 포함하며, 여기서 l은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되고; m은 5, 6, 7, 8, 및 9로부터 선택되고; M₁은 결합또는 M'이고; R₄는 비치환된 C_1-3알킬, 또는 -(CH₂)_nQ이며, 여기서 Q는 OH, -NHC(S)N(R)₂, -NHC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(R)R₈, -NHC(=NR₉)N(R)₂, -NHC(=CHR₉)N(R)₂, -OC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)OR, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬이고; M 및 M'는 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, 아릴기, 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고; 그리고 R₂ 및 R₃은H, C_1-14알킬,및 C_2-14알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 화학식 (I)의 화합물의 하위세트는 화학식 (II)의 화합물:

(II) 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함하며, 여기서 l은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되고; M₁은 결합또는 M'이고; R₄는 비치환된 C_1-3알킬, 또는 -(CH₂)_nQ이며, 여기서 n은 2, 3, 또는 4이고, 및 Q는 OH, -NHC(S)N(R)₂, -NHC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(R)R₈, -NHC(=NR₉)N(R)₂, -NHC(=CHR₉)N(R)₂, -OC(O)N(R)₂, -N(R)C(O)OR, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬이고; M 및 M'는 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, 아릴기, 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고; 그리고 R₂ 및 R₃은 H, C_1-14알킬, 및 C_2-14알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 화학식 (I)의 화합물의 하위세트는 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), 또는 (IIe)의 화합물:

(IIa),

(IIb),

(IIc), 또는

(IIe),

또는 이들의 염 또는 이성질체를 포함하며, 여기서 R₄는본원에 기재된 바와 같다.

일부 구현예에 있어서, 화학식 (I)의 화합물의 하위세트는 화학식 (IId)의 화합물:

(IId),

또는 이의 염 또는 이성질체를 포함하며, 여기서 n은 2, 3, 또는 4이고; m, R', R", 및 R₂ 내지 R₆은본원에 기재된 바와 같다. 예를 들어, R₂ 및 R₃의 각각은 C_5-14알킬및 C_5-14알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(화합물 1),

(화합물 2),

(화합물 3),

(화합물 4),

(화합물 5),

(화합물 6),

(화합물 7),

(화합물 8),

(화합물 9),

(화합물 10),

(화합물 11),

(화합물 12),

(화합물 13),

(화합물 14),

(화합물 15),

(화합물 16),

(화합물 17),

(화합물 230),

(화합물 231),

(화합물 18),

(화합물 19),

(화합물 20),

(화합물 21),

(화합물 22),

(화합물 23),

(화합물 24),

(화합물 25),

(화합물 26),

(화합물 27),

(화합물 28),

(화합물 29),

(화합물 30),

(화합물 31),

(화합물 32),

(화합물 33),

(화합물 34),

(화합물 35),

(화합물 36),

(화합물 37),

(화합물 38),

(화합물 39),

(화합물 40),

(화합물 41),

(화합물 42),

(화합물 43),

(화합물 44),

(화합물 45),

(화합물 46),

(화합물 47),

(화합물 48),

(화합물 49),

(화합물 50),

(화합물 51),

(화합물 52),

(화합물 53),

(화합물 54),

(화합물 55),

(화합물 56),

(화합물 57),

(화합물 58),

(화합물 59),

(화합물 60), 및

(화합물 61).

추가 구현예에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(화합물 62),

(화합물 63), 및

(화합물 64).

일부 구현예에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기:

(화합물 65),

(화합물 66),

(화합물 67),

(화합물 68),

(화합물 69),

(화합물 70),

(화합물 71),

(화합물 72),

(화합물 73),

(화합물 74),

(화합물 75),

(화합물 76),

(화합물 77),

(화합물 78),

(화합물 79),

(화합물 80),

(화합물 81),

(화합물 82),

(화합물 83),

(화합물 84),

(화합물 85),

(화합물 86),

(화합물 87),

(화합물 88),

(화합물 89),

(화합물 90),

(화합물 91),

(화합물 92),

(화합물 93),

(화합물 94),

(화합물 95),

(화합물 96),

(화합물 97),

(화합물 98),

(화합물 99),

(화합물 100),

(화합물 101),

(화합물 102),

(화합물 103),

(화합물 104),

(화합물 105),

(화합물 106),

(화합물 107),

(화합물 108),

(화합물 109),

(화합물 110),

(화합물 111),

(화합물 112),

(화합물 113),

(화합물 114),

(화합물 115),

(화합물 116),

(화합물 117),

(화합물 118),

(화합물 119),

(화합물 120),

(화합물 121),

(화합물 122),

(화합물 123),

(화합물 124),

(화합물 125),

(화합물 126),

(화합물 127),

(화합물 128),

(화합물 129),

(화합물 130),

(화합물 131),

(화합물 132),

(화합물 133),

(화합물 134),

(화합물 135),

(화합물 136),

(화합물 137),

(화합물 138),

(화합물 139),

(화합물 140),

(화합물 141),

(화합물 142),

(화합물 143),

(화합물 144),

(화합물 145),

(화합물 146),

(화합물 147),

(화합물 148),

(화합물 149),

(화합물 150),

(화합물 151),

(화합물 152),

(화합물 153),

(화합물 154),

(화합물 155),

(화합물 156),

(화합물 157),

(화합물 158),

(화합물 159),

(화합물 160),

(화합물 161),

(화합물 162),

(화합물 163),

(화합물 164),

(화합물 165),

(화합물 166),

(화합물 167),

(화합물 168),

(화합물 169),

(화합물 170),

(화합물 171),

(화합물 172),

(화합물 173),

(화합물 174),

(화합물 175),

(화합물 176),

(화합물 177),

(화합물 178),

(화합물 179),

(화합물 180),

(화합물 181),

(화합물 182),

(화합물 183),

(화합물 184),

(화합물 185),

(화합물 186),

(화합물 187),

(화합물 188),

(화합물 189),

(화합물 190),

(화합물 191),

(화합물 192),

(화합물 193),

(화합물 194),

(화합물 195),

(화합물 196),

(화합물 197),

(화합물 198),

(화합물 199),

(화합물 200),

(화합물 201),

(화합물 202),

(화합물 203),

(화합물 204),

(화합물 205),

(화합물 206),

(화합물 207),

(화합물 208),

(화합물 209),

(화합물 210),

(화합물 211),

(화합물 212),

(화합물 213),

(화합물 214),

(화합물 215),

(화합물 216),

(화합물 217),

(화합물 218),

(화합물 219),

(화합물 220),

(화합물 221),

(화합물 222),

(화합물 223),

(화합물 224),

(화합물 225),

(화합물 226),

(화합물 227),

(화합물 228),

(화합물 229),

(화합물 232), 및

이들의 염 및 이성질체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 화합물 429:

(화합물 429) 또는 이의 염이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 화합물 18:

(화합물 18) 또는 이의 염이다.

일부 구현예에 있어서, 지질 나노입자 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 화합물(예를 들어, 화학식 (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) 또는 (IIe)에 따른 화합물)을 포함하는 지질 성분을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, LNP는 중앙 피페라진 모이어티를 포함하는 이온화 가능한 지질로 구성될 수 있다. 이러한 LNP는 유리하게는 이온화 가능한 지질, 인지질 및 PEG 지질로 구성될 수 있으며, 임의로 구조적 지질을 포함할 수 있거나 구조적 지질이 결여될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 인지질은 DSPC 또는 DOP이다.

본원에 기재된 중앙 피페라진 모이어티를 포함하는 이온화 가능한 지질은 포유동물 세포 또는 기관에 치료제 및/또는 예방제를 전달하기 위한 지질 나노입자 조성물에서 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 지질은 면역원성을 거의 또는 전혀 갖지 않는다. 예를 들어, 본원에 개시된 지질 화합물은 참조 지질(예를 들어, MC3, KC2, 또는 DLinDMA)과 비교하여 더 낮은 면역원성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 개시된 지질 및 치료제 또는 예방제를 포함하는 제형은 참조 지질(예를 들어, MC3, KC2, 또는 DLinDMA) 및 동일한 치료제 또는 예방제를 포함하는 상응하는 제형과 비교하여 증가된 치료 지수를 갖는다.

지질은 화학식 (III)의 화합물,

(III),

또는 이의 염 또는 이성질체일 수 있으며, 여기서

고리 A는

또는

이고;

t는 1 또는 2이고;

A₁ 및 A₂는각각 CH 또는 N으로부터 독립적으로 선택되고;

Z는 CH₂이거나 부재하며, 여기서 Z가 CH₂일때, 점선 (1) 및 (2)는 각각 단일 결합을 나타내고; 및 Z가 부재할 때, 점선 (1) 및 (2)는 모두 부재하며;

R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 C_5-20알킬, C_5-20알케닐, -R"MR', -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 M은 -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)₂-, 아릴기, 및 헤테로아릴기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

X¹, X²,및 X³은 결합, -CH₂-, -(CH₂)₂-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)-, -C(O)O-CH₂-, -OC(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)O-, -CH₂-OC(O)-, -CH(OH)-, -C(S)-, 및 -CH(SH)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

각각의 R은 C_1-3알킬 및 C_3-6카르보사이클로이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R'는 C_1-12알킬, C_2-12알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 그리고

각각의 R"는 C_3-12알킬 및 C_3-12알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며,

여기서 고리 A가

일 때,

i) X¹, X²,및 X³중 적어도 하나는 -CH₂-가 아니고; 및/또는

ii) R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중적어도 하나는 -R"MR'이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (IIIa1) 내지 (IIIa6) 중 임의의 것이다:

(IIIa1),

(IIIa2),

(IIIa3),

(IIIa4),

(IIIa5), 또는

(IIIa6).

상기 화학식 (III) 또는 (IIIa1) 내지 (IIIa6) 중 임의의 것의 화합물은 적용 가능한 경우 하기 특징 중 하나 이상을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 고리 A는

이다.

일부 구현예에 있어서, 고리 A는

또는

이다.

일부 구현예에 있어서, 고리 A는

이다.

일부 구현예에 있어서, 고리 A는

이다.

일부 구현예에 있어서, 고리 A는

,

, 또는

이다.

일부 구현예에 있어서, 고리 A는

또는

이며, 여기서 고리에서, N 원자는 X²와 연결된다.

일부 구현예에 있어서, Z는 CH₂이다.

일부 구현예에 있어서, Z는 부재한다.

일부 구현예에 있어서, A₁및 A₂중 적어도 하나는 N이다.

일부 구현예에 있어서, A₁및 A₂의 각각은N이다.

일부 구현예에 있어서, A₁및 A₂의 각각은CH이다.

일부 구현예에 있어서, A₁은 N이고 A₂는CH이다.

일부 구현예에 있어서, A₁은CH이고 A₂는N이다.

일부 구현예에 있어서, X¹, X²,및 X³중 적어도 하나는 -CH₂-가 아니다. 예를 들어, 특정한 구현예에 있어서, X¹은-CH₂-가 아니다. 일부 구현예에 있어서, X¹, X²,및 X³중 적어도 하나는 -C(O)-이다.

일부 구현예에 있어서, X²는 -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)-, -C(O)O-CH₂-, -OC(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)O-, 또는 -CH₂-OC(O)-이다.

일부 구현예에 있어서, X³은 -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)-, -C(O)O-CH₂-, -OC(O)-CH₂-, -CH2-C(O)O-, 또는 -CH₂-OC(O)-이다. 다른 구현예에 있어서, X³은 -CH₂-이다.

일부 구현예에 있어서, X³은 결합 또는 -(CH₂)₂-이다.

일부 구현예에 있어서, R₁ 및R₂는동일하다. 특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃은동일하다. 일부 구현예에 있어서, R₄ 및 R₅는 동일하다. 특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 동일하다.

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄,및 R₅중 적어도 하나는 -R"MR'이다. 일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄,및 R₅중 최대 하나는 -R"MR'이다. 예를 들어, R₁, R₂,및 R₃중 적어도 하나는-R"MR'일 수 있고, 및/또는 R₄및 R₅중 적어도 하나는 -R"MR'일 수 있다. 특정한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 M은 -C(O)O-이다. 일부 구현예에 있어서, 각각의 M은 -C(O)O-이다. 일부 구현예에 있어서, 적어도 하나의 M은 -OC(O)-이다. 일부 구현예에 있어서, 각각의 M은 -OC(O)-이다. 일부 구현예에 있어서, 적어도 하나의 M은 -OC(O)O-이다. 일부 구현예에 있어서, 각각의 M은 -OC(O)O-이다. 일부 구현예에 있어서, 적어도 하나의 R"는 C₃알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, 각각의 R"는 C₃알킬이다. 일부 구현예에 있어서, 적어도 하나의 R"는 C₅ 알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, 각각의 R"는 C₅ 알킬이다. 일부 구현예에 있어서, 적어도 하나의 R"는 C₆ 알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, 각각의 R"는 C₆ 알킬이다. 일부 구현예에 있어서, 적어도 하나의 R"는 C₇ 알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, 각각의 R"는 C₇ 알킬이다. 일부 구현예에 있어서, 적어도 하나의 R'는 C₅알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, 각각의 R'는 C₅ 알킬이다. 다른 구현예에 있어서, 적어도 하나의 R'는 C₁ 알킬이다.특정한 구현예에 있어서, 각각의 R'는 C₁ 알킬이다. 일부 구현예에 있어서, 적어도 하나의 R'는 C₂알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, 각각의 R'는 C₂알킬이다.

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄,및 R₅중 적어도 하나는 C₁₂알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄,및 R₅의 각각은 C₁₂ 알킬이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(화합물 233),

(화합물 234),

(화합물 235),

(화합물 236),

(화합물 237),

(화합물 238),

(화합물 239),

(화합물 240),

(화합물 241),

(화합물 242),

(화합물 243),

(화합물 244),

(화합물 245),

(화합물 246),

(화합물 247),

(화합물 248),

(화합물 274),

(화합물 275),

(화합물 276),

(화합물 277),

(화합물 278),

(화합물 279),

(화합물 280),

(화합물 281),

(화합물 282),

(화합물 283),

(화합물 284),

(화합물 285),

(화합물 286),

(화합물 287),

(화합물 288),

(화합물 289),

(화합물 290),

(화합물 291),

(화합물 292),

(화합물 293),

(화합물 294),

(화합물 295),

(화합물 296),

(화합물 297),

(화합물 298),

(화합물 300),

(화합물 301),

(화합물 302),

(화합물 303),

(화합물 304),

(화합물 305),

(화합물 306),

(화합물 307),

(화합물 308),

(화합물 310),

(화합물 311),

(화합물 312),

(화합물 313),

(화합물 314),

(화합물 315),

(화합물 316),

(화합물 317),

(화합물 318),

(화합물 319),

(화합물 320),

(화합물 321),

(화합물 322),

(화합물 323),

(화합물 324),

(화합물 325),

(화합물 326),

(화합물 327),

(화합물 328),

(화합물 329),

(화합물 330),

(화합물 331),

(화합물 332),

(화합물 333),

(화합물 334),

(화합물 335),

(화합물 336),

(화합물 337),

(화합물 338),

(화합물 339),

(화합물 340), 및

(화합물 341).

다른 구현예에 있어서, 지질은 화학식 (IV)

(IV),

또는 이의 염 또는 이성질체를 가지며, 여기서

A₁ 및 A₂는 각각 CH 또는 N으로부터 독립적으로 선택되고 A₁및 A₂ 중 적어도 하나는 N이며;

Z는 CH₂이거나부재하며, 여기서 Z가 CH₂일 때, 점선 (1) 및 (2)는 각각 단일 결합을 나타내고; 및 Z가 부재할 때, 점선 (1) 및 (2)는 모두 부재하며;

R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 C_6-20알킬및 C_6-20알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

여기서 고리 A가

일 때,

i) R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 동일하며, 여기서 R₁은C₁₂ 알킬, C₁₈알킬, 또는 C₁₈알케닐이 아니며;

ii)R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중 단지 하나만이 C_6-20알케닐로부터 선택되고;

iii) R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중 적어도 하나는 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중 적어도다른 하나와상이한 수의 탄소 원자를 갖고;

iv) R₁, R₂, 및 R₃은C_6-20 알케닐로부터 선택되고, 및 R₄ 및R₅는C_6-20알킬로부터 선택되며; 또는

v) R₁, R₂, 및 R₃은C_6-20 알킬로부터 선택되고, 및 R₄ 및R₅는C_6-20알케닐로부터 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (IVa)의 화합물:

(IVa)이다.

상기 화학식 (IV) 또는 (IVa)의 화합물은 적용 가능한 경우 하기 특징 중 하나 이상을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, Z는 CH₂이다.

일부 구현예에 있어서, Z는 부재한다.

일부 구현예에 있어서, A₁및 A₂중 적어도 하나는 N이다.

일부 구현예에 있어서, A₁및 A₂의 각각은 N이다.

일부 구현예에 있어서, A₁및 A₂의 각각은 CH이다.

일부 구현예에 있어서, A₁은N이고 A₂는CH이다.

일부 구현예에 있어서, A₁은CH이고 A₂는N이다.

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는동일하며, C₁₂알킬, C₁₈알킬, 또는 C₁₈알케닐이 아니다. 일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 동일하며 C₉알킬 또는 C₁₄알킬이다.

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중 단지 하나만이 C_6-20알케닐로부터 선택된다. 이러한 특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 동일한 수의 탄소 원자를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, R₄는 C_5-20알케닐로부터 선택된다. 예를 들어, R₄는 C₁₂알케닐 또는 C₁₈알케닐일 수 있다.

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중 적어도 하나는 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중적어도다른 하나와 상이한 수의 탄소원자를 갖는다.

특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃은C_6-20알케닐로부터 선택되고,및R₄ 및 R₅는C_6-20알킬로부터선택된다. 다른 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃은C_6-20알킬로부터 선택되고, 및R₄ 및 R₅는C_6-20알케닐로부터 선택된다. 일부 구현예에 있어서, R₁, R₂,및 R₃은 동일한 수의 탄소 원자를 갖고, 및/또는 R₄및 R₅는 동일한 수의 탄소 원자를 갖는다. 예를 들어, R₁, R₂, 및 R₃, 또는 R₄ 및 R₅는 6개, 8개, 9개, 12개, 14개, 또는 18개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃, 또는 R₄ 및 R₅는 C₁₈알케닐(예를 들어, 리놀레일)이다. 일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃, 또는 R₄ 및 R₅는 6개, 8개, 9개, 12개, 또는 14개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이다.

일부 구현예에 있어서, R₁은 R₂, R₃,R₄, 및 R₅와 상이한수의 탄소 원자를 갖는다. 다른 구현예에 있어서, R3은 R₁, R₂, R₄, 및 R₅와 상이한 수의 탄소 원자를 갖는다. 추가 구현예에 있어서, R4는R₁, R₂, R₃, 및 R₅와 상이한수의 탄소 원자를 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(화합물 249),

(화합물 250),

(화합물 251),

(화합물 252),

(화합물 253),

(화합물 254),

(화합물 255),

(화합물 256),

(화합물 257),

(화합물 258),

(화합물 259),

(화합물 260),

(화합물 261),

(화합물 262),

(화합물 263),

(화합물 264),

(화합물 265), 및

(화합물 266).

다른 구현예에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (V)

(V),

또는 이의 염 또는 이성질체를 가지며, 여기서

A₃은 CH또는 N이고;

A₄는 CH₂ 또는 NH이고; 및 A₃및 A₄중 적어도 하나는 N 또는 NH이며;

Z는 CH₂이거나부재하며, 여기서 Z가 CH₂일 때,점선 (1) 및 (2)는 각각 단일 결합을 나타내고; 및 Z가 부재할 때, 점선 (1) 및 (2)는 모두 부재하며;

R₁, R₂,및 R₃은 C_5-20알킬, C_5-20알케닐, -R"MR', -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 M은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)₂-, 아릴기, 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;

X¹ 및 X²는 -CH₂-, -(CH₂)₂-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)-, -C(O)O-CH₂-, -OC(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)O-, -CH₂-OC(O)-, -CH(OH)-, -C(S)-, 및 -CH(SH)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

각각의 R"는 C_3-12알킬 및 C_3-12알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (Va)의 화합물:

(Va)이다.

상기 화학식 (V) 또는 (Va)의 화합물은 적용 가능한 경우 하기 특징 중 하나 이상을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, Z는 CH₂이다.

일부 구현예에 있어서, Z는 부재한다.

일부 구현예에 있어서, A₃및 A₄중 적어도 하나는 N 또는 NH이다.

일부 구현예에 있어서, A₃은N이고 A₄는 NH이다.

일부 구현예에 있어서, A₃은N이고 A₄는 CH₂이다.

일부 구현예에 있어서, A₃은CH이고 A₄는 NH이다.

일부 구현예에 있어서, X¹및 X²중 적어도 하나는 -CH₂-가 아니다. 예를 들어, 특정한 구현예에 있어서, X¹은-CH₂-가아니다. 일부 구현예에 있어서, X¹및 X²중 적어도 하나는 -C(O)-이다.

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃은 C_5-20알킬및 C_5-20알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃은동일하다. 특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃은 C₆, C₉, C₁₂,또는 C₁₄알킬이다. 다른 구현예에 있어서, R₁, R₂, 및 R₃은 C₁₈ 알케닐이다.예를 들어, R₁, R₂, 및 R₃은 리놀레일일 수 있다.

(화합물 267),

(화합물 268),

(화합물 269),

(화합물 270),

(화합물 271),

(화합물 272),

(화합물 273), 및

(화합물 309).

또 다른 양태에 있어서, 본 개시내용은 화학식 (VI)에 따른 화합물:

(VI),

또는 이의 염 또는 이성질체를 제공하며, 여기서

A₆ 및 A₇은 각각 CH 또는 N으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 A₆및 A₇중 적어도 하나는N이고;

Z는 CH₂이거나 부재하며, 여기서 Z가 CH₂일 때, 점선 (1) 및 (2)는 각각 단일 결합을 나타내고; 및 Z가 부재할 때, 점선 (1) 및 (2)는 모두 부재하며;

X⁴ 및 X⁵는-CH₂-, -(CH₂)₂-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)-, -C(O)O-CH₂-, -OC(O)-CH₂-, -CH₂-C(O)O-, -CH₂-OC(O)-, -CH(OH)-, -C(S)-, 및 -CH(SH)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

R₁, R_2, R₃, R₄, 및 R₅의 각각은 C_5-20알킬, C_5-20알케닐, -R"MR', -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 M은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)₂-, 아릴기, 및 헤테로아릴기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 Y는 독립적으로 C_3-6카르보사이클이고;

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅의 각각은 C_6-20알킬및 C_6-20알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

일부 구현예에 있어서, R₁ 및 R₂는 동일하다. 특정한 구현예에 있어서, R₁, R2, 및 R3은 동일하다. 일부 구현예에 있어서, R₄ 및 R₅는동일하다. 특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 동일하다.

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅중 적어도 하나는 C_9-12알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅의 각각은 독립적으로 C₉, C₁₂또는 C₁₄알킬이다. 특정한 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅의각각은 C₉알킬이다.

일부 구현예에 있어서, A₆은 N이고 A₇은 N이다. 일부 구현예에 있어서, A₆은CH이고 A₇은 N이다.

일부 구현예에 있어서, X₄는-CH₂-이고 X₅는-C(O)-이다. 일부 구현예에 있어서, X₄ 및X₅는-C(O)-이다.

일부 구현예에 있어서, A₆이 N이고 A₇이 N일 때, X₄및 X₅ 중적어도 하나는 -CH₂-가 아니며, 예를 들어, X₄및 X₅ 중적어도 하나는 -C(O)-이다. 일부 구현예에 있어서, A₆이 N이고 A₇이 N일 때, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중적어도 하나는 -R"MR'이다.

일부 구현예에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅ 중 적어도 하나는 -R"MR'이 아니다.

일부 구현예에 있어서, 상기 화합물은

(화합물 299)이다.

일 구현예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식을 갖는다:

(화합물 342).

PEG 및 PEG-변형된 지질

일반적으로, 본원에 기재된 다양한 화학식의 일부 기타 지질 성분(예를 들어, PEG 지질)은 "Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents"라는 제목으로 2016년 12월 10일자로 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/000129에 기재된 바와 같이 합성될 수 있으며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.

지질 나노입자 조성물의 지질 성분은 PEG 또는 PEG-변형된 지질과 같은, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 종은 대안적으로 PEG화 지질로 지칭될 수 있다. PEG 지질은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 지질이다. PEG 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티딘산, PEG-변형된 세라미드, PEG-변형된 디알킬아민, PEG-변형된 디아실글리세롤, PEG-변형된 디알킬글리세롤, 및 이들의 혼합물을 포함하는 비-제한적 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, 또는 PEG-DSPE 지질일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, PEG 지질은 DMG-PEG 2k 또는 화합물 428이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 PEG-변형된 지질은 PEG DMG의 변형된 형태이다. PEG-DMG는 하기 구조를 갖는다:

.

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자는 약 1 mol% 내지 약 5 mol%의 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 1 mol% 내지 약 2.5 mol%의 PEG-지질을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 국제 공개 번호 WO2012099755에 기재된 PEG화 지질일 수 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 기재된 임의의 이러한 예시적인 PEG 지질은 PEG 사슬 상에 하이드록실기를 포함하도록 변형될 수 있다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 PEG 지질은 PEG-OH 지질이다. 본원에서 일반적으로 정의된 바와 같이, "PEG-OH 지질"(또한 본원에서 "하이드록시-PEG화 지질"로도 지칭됨)은 상기 지질 상에 하나 이상의 하이드록실(-OH)기를 갖는 PEG화 지질이다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 PEG-OH 지질은 PEG 사슬 상에 하나 이상의 하이드록실기를 포함한다. 특정한 구현예에 있어서, PEG-OH 또는 하이드록시-PEG화 지질은 PEG 사슬의 말단에 -OH 기를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 화학식 (VII)의 화합물이다. 본원에서 화학식 (VII)의 화합물:

(Ⅶ),

또는 이의 염이 제공되며, 여기서:

R³은 -OR^O이고;

R^O는 수소, 임의로 치환된 알킬, 또는 산소 보호기이고;

r은 1 이상 내지 100 이하의 정수이고;

L¹은 임의로 치환된 C_1-10알킬렌이며, 여기서 상기 임의로 치환된 C_1-10알킬렌 중 적어도 하나의 메틸렌은 임의로 치환된 카르보사이클릴렌, 임의로 치환된 헤테로사이클릴렌, 임의로 치환된 아릴렌, 임의로 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -N(R^N)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, 또는 -NR^NC(O)N(R^N)-으로 독립적으로 대체되고;

D는 클릭 화학(click chemistry)에 의해 수득되는 모이어티 또는 생리학적 조건 하에서 절단 가능한 모이어티이고;

m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;

A는 화학식:

또는

이고;

L²의 각각의 경우는 독립적으로 결합 또는 임의로 치환된 C_1-6알킬렌이며, 여기서 상기 임의로 치환된 C_1-6알킬렌의 하나의 메틸렌 단위는 -O-, -N(R^N)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, 또는 -NR^NC(O)N(R^N)-으로 임의로 대체되고;

R²의 각각의 경우는 독립적으로 임의로 치환된 C_1-30알킬, 임의로 치환된 C_1-30알케닐, 또는 임의로 치환된 C_1-30알키닐이며; 임의로 여기서 R²의 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 치환된 카르보사이클릴렌, 임의로 치환된 헤테로사이클릴렌, 임의로 치환된 아릴렌, 임의로 치환된 헤테로아릴렌, -N(R^N)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -NR^NC(O)N(R^N)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR^N)-, -C(=NR^N)N(R^N)-, -NR^NC(=NR^N)-, -NR^NC(=NR^N)N(R^N)-, -C(S)-, -C(S)N(R^N)-, -NR^NC(S)-, -NR^NC(S)N(R^N)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)₂-, -S(O)₂O-, -OS(O)₂O-, -N(R^N)S(O)-, -S(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)N(R^N)-, -OS(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)O-, -S(O)₂-, -N(R^N)S(O)₂-, -S(O)₂N(R^N)-, -N(R^N)S(O)₂N(R^N)-, -OS(O)₂N(R^N)-, 또는 -N(R^N)S(O)₂O-로 독립적으로 대체되고;

R^N의 각각의 경우는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 또는 질소 보호기이고;

고리 B는 임의로 치환된 카르보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고; 및

p는 1 또는 2이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (VII)의 화합물은 PEG-OH 지질(즉, R³은-OR^O이고, R^O는 수소임)이다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (VII)의 화합물은 화학식 (VII-OH)의 화합물:

(VII-OH),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, D는 클릭 화학에 의해 수득되는 모이어티(예를 들어, 트리아졸)이다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (VII)의 화합물은 화학식 (VII-a-1) 또는 (VII-a-2)의 화합물:

또는

(VII-a-1) (VII-a-2),

또는 이들의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식(VII)의 화합물은 하기 화학식 중 하나:

,

,

,

,

또는 이들의 염이며, 여기서

s는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (VII)의 화합물은 하기 화학식 중 하나:

,

,

,

,

또는 이들의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 화학식 (VII)의 화합물은 하기 화학식 중 하나:

,

,

,

,

또는 이들의 염이다.

(화합물 415),

(화합물 416),

(화합물 417),

(화합물 418),

또는 이들의 염이며, 여기서 r은 1 내지 100이다.

특정한 구현예에 있어서, D는 생리학적 조건 하에서 절단 가능한 모이어티(예를 들어, 에스테르, 아미드, 카르보네이트, 카르바메이트, 요소)이다. 특정한 구현예에 있어서, 화학식 (VII)의 화합물은 화학식 (VII-b-1) 또는 (VII-b-2)의 화화합물:

(VII-b-1) (VII-b-2),

또는 이들의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 화학식 (VII)의 화합물은 화학식 (VII-b-1-OH) 또는 (VII-b-2-OH)의 화합물:

(VII-b-1-OH) (VII-b-2-OH),

또는 이들의 염이다.

,

,

,

,

또는 이들의 염이다.

,

,

,

,

또는 이들의 염이다.

,

,

,

,

또는 이들의 염이다.

(화합물 430),

(화합물 431),

또는 이들의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 PEG화 지방산이다. 특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 화학식 (VIII)의 화합물이다. 본원에서 화학식 (VIII)의 화합물:

(Ⅷ),

또는 이의 염이 제공되며, 여기서:

R³은 -OR^O이고;

R^O는 수소, 임의로치환된 알킬 또는 산소 보호기이고;

r은 1 이상 내지 100 이하 사이의 정수이고;

R⁵는 임의로 치환된 C_10-40알킬, 임의로 치환된 C_10-40알케닐, 또는 임의로 치환된 C_10-40알키닐이고; 및 임의로 R⁵의 하나 이상의 메틸렌기는 임의로 치환된 카르보사이클릴렌, 임의로 치환된 헤테로사이클릴렌, 임의로 치환된 아릴렌, 임의로 치환된 헤테로아릴렌, -N(R^N)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -NR^NC(O)N(R^N)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR^N)-, -C(=NR^N)N(R^N)-, -NR^NC(=NR^N)-, -NR^NC(=NR^N)N(R^N)-, -C(S)-, -C(S)N(R^N)-, -NR^NC(S)-, -NR^NC(S)N(R^N)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)₂-, -S(O)₂O-, -OS(O)₂O-, -N(R^N)S(O)-, -S(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)N(R^N)-, -OS(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)O-, -S(O)₂-, -N(R^N)S(O)₂-, -S(O)₂N(R^N)-, -N(R^N)S(O)₂N(R^N)-, -OS(O)₂N(R^N)-, 또는 -N(R^N)S(O)₂O-로 대체되고; 그리고

R^N의 각각의 경우는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 또는 질소 보호기이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (VIII)의 화합물은 화학식 (VIII-OH)의 화합물:

(Ⅷ-OH),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 화학식 (VIII)의 화합물은 하기 화학식 중 하나:

(화합물 419),

(화합물 420),

(화합물 421),

(화합물 422),

(화합물 423),

(화합물 424),

(화합물 425),

또는 이들의 염이다. 일부 구현예에 있어서, r은 45이다.

(화합물 419),

(화합물 420),

(화합물 421),

(화합물 422),

(화합물 423),

또는 이들의 염이다. 일부 구현예에 있어서, r은 45이다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 화학식 (VIII)의 화합물은:

(화합물 427),

또는 이의 염이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 화학식 (VIII)의 화합물은

(화합물 428), 또는

(화합물 403)이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 PEG 지질은 하기 화학식 중 하나:

(화합물 424),

(화합물 425),

또는 이들의 염이다. 일부 구현예에 있어서, r은 45이다.

인지질

본원에 정의된 바와 같은, 인지질은 포스페이트기를 포함하는 임의의 지질이다. 인지질은 비-양이온성 지질의 하위세트이다. 지질 나노입자 조성물의 지질 성분은 하나 이상의 (다중)불포화 지질과 같은, 하나 이상의 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 하나 이상의 지질 이중층으로 조립될 수 있다. 일반적으로, 인지질은 인지질 모이어티 및 하나 이상의 지방산 모이어티를 포함할 수 있다. 인지질 모이어티는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딘산, 2-리소포스파티딜 콜린, 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비-제한적인 군으로부터 선택될 수 있다. 지방산 모이어티는 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루크산, 피타노산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사펜타엔산, 및 도코사헥사엔산으로 이루어진 비-제한적 군으로부터 선택될 수 있다. 분지화, 산화, 고리화, 및 알킨을 포함하는 변형 및 치환을 갖는 천연 종을 포함하는 비-천연 종 또한 고려된다. 예를 들어, 인지질은 하나 이상의 알킨(예를 들어, 하나 이상의 이중 결합이 삼중 결합으로 대체된 알케닐기)으로 기능화되거나 가교될 수 있다. 적절한 반응 조건 하에서, 알킨기는 아지드에 노출 시 구리-촉매화 고리첨가를 겪을 수 있다. 이러한 반응은 나노입자 조성물의 지질 이중층을 기능화하여 막 투과 또는 세포 인식을 용이하게 하거나 나노입자 조성물을 표적화 또는 이미징 모이어티(예를 들어, 염료)와 같은 유용한 성분에 접합시키는 데 유용할 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자는 약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 인지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 8 mol% 내지 약 13 mol%의 인지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 10 mol% 내지 약 12 mol%의 인지질을 포함한다.

상기 조성물 및 방법에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은

1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC),

1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE),

1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC),

1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC),

1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC),

1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC),

1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC),

1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC),

1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC),

1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC),

1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C16 Lyso PC),

1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린,

1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린,

1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린,

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE),

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(4ME 16:0 PC),

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(소듐 염)(4ME 16:0 PG),

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(소듐 염)(4ME 16:0 PS),

1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민,

1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민,

1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민,

1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민,

1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 및

1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 소듐 염(DOPG), 및

스핑고미엘린으로 이루어진 비-제한적 군으로부터 선택될 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

일부 구현예에 있어서, 지질 나노입자 조성물은 DSPC를 포함한다. 특정한 구현예에 있어서, 지질 나노입자 조성물은 DOPE를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 지질 나노입자 조성물은 DSPC 및 DOPE를 모두 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 지질 나노입자는 하기를 포함한다:

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(4ME 16:0 PE)

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(4ME 16:0 PC)

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(소듐 염)(4ME 16:0 PG), 또는

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(소듐 염)(4ME 16:0 PS)

, 또는 이들의 혼합물.

인지질의 예는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:

(화합물 432),

(화합물 433),

(화합물 434),

(화합물 435),

(화합물 436),

(화합물 437),

(화합물 438),

(화합물 439),

(화합물 440).

(화합물 441),

(화합물 442),

(화합물 443),

(화합물 444),

(화합물 445),

(화합물 446),

(화합물 447), 및

(화합물 448).

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 DSPC의 유사체 또는 변이체이다.

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 화학식 (IX)의 화합물:

(IX),

또는 이의 염이며, 여기서:

각각의 R¹은독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이거나; 또는 임의로 2개의 R¹은 개재 원자(intervening atom)와 함께 접합되어 임의로 치환된 모노사이클릭 카르보사이클릴 또는 임의로 치환된 모노사이클릭 헤테로사이클릴을 형성하거나; 또는 임의로 3개의 R¹은 개재 원자와 함께 접합되어 임의로 치환된 바이사이클릭 카르보사이클릴 또는 임의로 치환된 바이사이클릭 헤테로사이클릴을 형성하고;

n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;

m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;

A는 화학식:

또는

이고;

L²의 각각의 경우는 독립적으로 결합 또는 임의로 치환된 C_1-6알킬렌이며, 여기서 상기 임의로 치환된 C_1-6알킬렌의 하나의 메틸렌 단위는 임의로 -O-, -N(R^N)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, 또는 -NR^NC(O)N(R^N)-으로 대체되고;

p는 1 또는 2이되;

단, 상기 화합물은 하기 화학식의 화합물이 아니며:

,

여기서 R²의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 알케닐, 또는 비치환된 알키닐이다.

(IX),

또는 이의 염이며, 여기서:

각각의 R¹은독립적으로 임의로 치환된 알킬이거나; 또는 임의로 2개의 R¹은 개재 원자와 함께 접합되어 임의로 치환된 모노사이클릭 카르보사이클릴 또는 임의로 치환된 모노사이클릭 헤테로사이클릴을 형성하거나; 또는 임의로 3개의 R¹은 개재 원자와 함께 접합되어 임의로 치환된 바이사이클릭 카르보사이클릴 또는 임의로 치환된 바이사이클릭 헤테로사이클릴을 형성하고;

n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;

m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;

A는 화학식:

또는

이고;

L²의 각각의 경우는 결합 또는 임의로 치환된 C_1-6알킬렌이며, 여기서 상기 임의로 치환된 C_1-6알킬렌의 하나의 메틸렌 단위는 임의로 -O-, -N(R^N)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, 또는 -NR^NC(O)N(R^N)-으로 독립적으로 대체되고;

p는 1 또는 2이되;

단, 상기 화합물은 하기 화학식의 화합물이 아니며:

,

인지질 헤드 변형

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 변형된 인지질 헤드(예를 들어, 변형된 콜린기)를 포함한다. 특정한 구현예에 있어서, 변형된 헤드를 갖는 인지질은 변형된 4차 아민을 갖는, DSPC 또는 이의 유사체이다. 예를 들어, 화학식 (IX)의 구현예에 있어서, R¹중 적어도 하나는 메틸이 아니다. 특정한 구현예에 있어서, R¹중 적어도 하나는 수소 또는 메틸이 아니다. 특정한 구현예에 있어서, 화학식 (IX)의 화합물은 하기 화학식 중 하나의 화합물:

,

,

,

,

,

또는 이들의 염이며, 여기서:

각각의 t는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;

각각의 u는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; 및

각각의 v는 독립적으로 1, 2, 또는 3이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX)의 화합물은 하기 화학식 중 하나의 화합물:

,

,

,

,

,

,

,

,

또는 이들의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 화학식 (IX)의 화합물은 하기 중 하나의 화합물:

(화합물 400)

(화합물 401)

(화합물 402)

(화합물 403)

(화합물 404)

(화합물 405)

(화합물 406)

(화합물 407)

(화합물 408)

(화합물 409)

또는 이들의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 화학식 (IX)의 화합물은 화학식 (IX-a)의 화합물:

(IX-a),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 변형된 코어를 포함한다. 특정한 구현예에 있어서, 본원에 기재된 변형된 코어를 갖는 인지질은 변형된 코어 구조를 갖는, DSPC 또는 이의 유사체이다. 예를 들어, 화학식 (IX-a)의 특정한 구현예에 있어서, 기 A는 하기 화학식이 아니다:

.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-a)의 화합물은 하기 화학식 중 하나:

,

,

,

,

.

또는 이들의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 화학식 (IX)의 화합물은 하기 중 하나:

(화합물 449),

(화합물 450),

(화합물 451),

(화합물 452),

(화합물 453),

또는 이들의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 글리세리드 모이어티 대신 사이클릭 모이어티를 포함한다. 특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용한 인지질은 글리세리드 모이어티 대신 사이클릭 모이어티를 갖는, DSPC 또는 이의 유사체이다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX)의 화합물은 화학식 (IX-b)의 화합물:

,

(IX-b),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-b)의 화합물은 화학식 (IX-b-1)의 화합물:

(IX-b-1),

또는 이의 염이며, 여기서:

w는 0, 1, 2, 또는 3이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-b)의 화합물은 화학식 (IX-b-2)의 화합물:

(IX-b-2),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-b)의 화합물은 화학식 (IX-b-3)의 화합물:

(IX-b-3),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-b)의 화합물은 화학식 (IX-b-4)의 화합물:

(IX-b-4),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-b)의 화합물은 하기 중 하나:

(화합물 454),

(화합물 455),

(화합물 456),

또는 이들의 염이다.

인지질 테일 변형

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 변형된 테일을 포함한다. 특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 변형된 테일을 갖는, DSPC 또는 이의 유사체이다. 본원에 기재된 바와 같은, "변형된 테일"은 더 짧거나 더 긴 지방족 사슬, 분지가 도입된 지방족 사슬, 치환기가 도입된 지방족 사슬, 하나 이상의 메틸렌이 사이클릭 또는 헤테로원자 기로 대체된 지방족 사슬, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 테일일 수 있다. 예를 들어, 특정한 구현예에 있어서, 상기 (IX)의 화합물은 화학식 (IX-a)의 화합물, 또는 이의 염이며, 여기서 R²의 적어도 하나의 경우는 R²의각각의 경우는 임의로 치환된 C_1-30알킬이고, 여기서 R²의 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 치환된 카르보사이클릴렌, 임의로 치환된 헤테로사이클릴렌, 임의로 치환된 아릴렌, 임의로 치환된 헤테로아릴렌, -N(R^N)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -NR^NC(O)N(R^N)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR^N)-, -C(=NR^N)N(R^N)-, -NR^NC(=NR^N)-, -NR^NC(=NR^N)N(R^N)-, -C(S)-, -C(S)N(R^N)-, -NR^NC(S)-, -NR^NC(S)N(R^N)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)₂-, -S(O)₂O-, -OS(O)₂O-, -N(R^N)S(O)-, -S(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)N(R^N)-, -OS(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)O-, -S(O)₂-, -N(R^N)S(O)₂-, -S(O)₂N(R^N)-, -N(R^N)S(O)₂N(R^N)-, -OS(O)₂N(R^N)-, 또는 -N(R^N)S(O)₂O-로 독립적으로 대체된다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX)의 화합물은 화학식 (IX-c)의 화합물:

(IX-c),

또는 이의 염이며, 여기서:

각각의 x는 독립적으로 0 이상 내지 30 이하 사이의 정수이고; 및

각각의 경우 G는 임의로 치환된 카르보사이클릴렌, 임의로 치환된 헤테로사이클릴렌, 임의로 치환된 아릴렌, 임의로 치환된 헤테로아릴렌, -N(R^N)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -NR^NC(O)N(R^N)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR^N)-, -C(=NR^N)N(R^N)-, -NR^NC(=NR^N)-, -NR^NC(=NR^N)N(R^N)-, -C(S)-, -C(S)N(R^N)-, -NR^NC(S)-, -NR^NC(S)N(R^N)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)₂-, -S(O)₂O-, -OS(O)₂O-, -N(R^N)S(O)-, -S(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)N(R^N)-, -OS(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)O-, -S(O)₂-, -N(R^N)S(O)₂-, -S(O)₂N(R^N)-, -N(R^N)S(O)₂N(R^N)-, -OS(O)₂N(R^N)-, 또는 -N(R^N)S(O)₂O-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-c)의 화합물은 화학식 (IX-c-1)의 화합물:

(IX-c-1),

또는 이의 염이며, 여기서:

v의 각각의 경우는 독립적으로 1, 2, 또는 3이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-c)의 화합물은 화학식 (IX-c-2)의 화합물:

(IX-c-2),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-c)의 화합물은 하기 화학식의 화합물:

,

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-c)의 화합물은 하기:

(화합물 457), 또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-c)의 화합물은 화학식 (IX-c-3)의 화합물:

(IX-c-3),

또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 상기 화학식 (IX-c)의 화합물은 하기 화학식의 화합물:

,

또는 이의 염이다.

(화합물 458), 또는 이의 염이다.

특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 변형된 포스포콜린 모이어티를 포함하며, 여기서 4차 아민을 포스포릴기에 연결하는 알킬 사슬은 에틸렌이 아니다(예를 들어, n은 2가 아님). 따라서, 특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 화학식 (IX)의 화합물이며, 여기서 n은 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 예를 들어, 특정한 구현예에 있어서, 화학식 (IX)의 화합물은 하기 화학식 중 하나:

.

,

또는 이들의 염이다.

(화합물 459),

(화합물 460),

(화합물 461),

(화합물 462),

(화합물 463),

(화합물 464),

(화합물 463a),

(화합물 412),

(화합물 413),

(화합물 414),

또는 이들의 염이다.

대체 지질

특정한 구현예에 있어서, 대체 지질이 본 발명의 인지질 대신에 사용된다. 이러한 대체 지질의 비-제한적 예는 하기를 포함한다:

화합물 457a,

화합물 458a,

화합물 459a,

화합물 460a,

화합물 461a,

화합물 461b,

및

화합물 463b.

구조적 지질

지질 나노입자 조성물의 지질 성분은 하나 이상의 구조적 지질을 포함할 수 있다. 상기 지질 나노입자에 구조적 지질을 혼입하면 상기 입자에서 다른 지질의 응집을 완화하는 데 도움이 될 수 있다. 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔산, 알파-토코페롤, 호파노이드, 피토스테롤, 스테로이드, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 스테롤이다. 본원에 정의된 바와 같은, "스테롤"은 스테로이드 알코올로 이루어진 스테로이드의 하위군이다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 스테로이드이다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 콜레스테롤이다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 콜레스테롤의 유사체이다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 알파-토코페롤이다. 구조적 지질의 예는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:

(화합물 464a),

(화합물 465), 및

(화합물 466).

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자는 약 20 mol% 내지 약 60 mol%의 구조적 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 30 mol% 내지 약 50 mol%의 구조적 지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 35 mol%의 구조적 지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 약 40 mol%의 구조적 지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 구조적 지질은 콜레스테롤 또는 하기 구조를 갖는 화합물이다:

.

페이로드 분자

본 개시내용의 조성물은 기도 세포에 매우 다양한 상이한 제제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 기도 세포는, 예를 들어, 입, 코, 인후, 또는 폐에서 호흡기도를 감싸는 세포일 수 있다. 치료제는 이러한 기도 세포에서 치료 효과를 매개할 수 있다(예를 들어, 직접 매개하거나 방관자 효과를 통해). 전형적으로 상기 조성물에 의해 전달되는 치료제는 핵산이지만, 소분자, 화학요법 약물, 펩티드, 폴리펩티드 및 기타 생물학적 분자와 같은, 비-핵산 제제 또한 본 개시내용에 포괄된다. 전달될 수 있는 핵산은 DNA-기반 분자(즉, 데옥시리보뉴클레오티드를 포함함) 및 RNA-기반 분자(즉, 리보뉴클레오티드를 포함함)를 포함한다. 또한, 상기 핵산은 분자의 천연 발생 형태 또는 분자의 화학적으로 변형된 형태(예를 들어, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함함)일 수 있다.

단백질 발현 향상을 위한 제제

일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 단백질 발현을 향상시키는(즉, 증가시키고, 자극하고, 상향조절하는) 제제이다. 단백질 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 치료제 유형의 비-제한적 예는 RNA, mRNA, dsRNA, CRISPR/Cas9 기술, ssDNA 및 DNA(예를 들어, 발현 벡터)를 포함한다.

일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 DNA 치료제이다. 상기 DNA 분자는 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA(ssDNA; single-stranded DNA), 또는 부분적으로 이중-가닥 DNA, 즉, 이중-가닥인 부분 및 단일-가닥인 부분을 갖는 분자일 수 있다. 일부 경우에서 상기 DNA 분자는 삼중-가닥이거나 부분적으로 삼중-가닥, 즉, 삼중 가닥 인 부분 및 이중 가닥인 부분을 갖는다. 상기 DNA 분자는 원형 DNA 분자 또는 선형 DNA 분자일 수 있다.

DNA 치료제는 세포로 유전자를 이동시킬 수 있는, 예를 들어, 전사체를 암호화하고 발현할 수 있는 DNA 분자일 수 있다. 예를 들어, 상기 DNA 치료제는 관심 단백질을 암호화하여 LNP에 의한 전달 시 기도에서 관심 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 DNA 분자는 천연-유래, 예를 들어, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 상기 DNA 분자는 합성 분자, 예를 들어, 시험관내에서 생성된 합성 DNA 분자이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 DNA 분자는 재조합 분자이다. 비-제한적인 예시적인 DNA 치료제는 플라스미드 발현 벡터 및 바이러스 발현 벡터를 포함한다.

본원에 기재된 DNA 치료제, 예를 들어, DNA 벡터는 다양한 상이한 특징을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 DNA 치료제, 예를 들어, DNA 벡터는 비-코딩 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, DNA 서열은 유전자에 대한 적어도 하나의 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종결 요소, 폴리아데닐화 신호 요소, 스플라이싱 신호 요소 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 비-코딩 DNA 서열은 인트론이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 비-코딩 DNA 서열은 트랜스포존이다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 DNA 서열은 전사적으로 활성인 유전자에 작동가능하게 연결된 비-코딩 DNA 서열을 가질 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 본원에 기재된 DNA 서열은 유전자에 연결되지 않은 비-코딩 DNA 서열을 가질 수 있으며, 즉, 상기 비-코딩 DNA는 상기 DNA 서열 상의 유전자를 조절하지 않는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 페이로드는 유전자 조절자, 즉, 예를 들어, 핵염기를 변경함으로써, 예를 들어, 삽입, 결실, 돌연변이(예를 들어, 미스센스 돌연변이, 침묵 돌연변이(silent mutation) 또는 넌센스 돌연변이), 중복, 또는 역위, 또는 이들의 임의의 조합을 도입함으로써 DNA 분자에서 핵산 서열을 변형시키는 시스템의 적어도 하나의 구성 요소를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 DNA 염기 편집기, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN; zinc finger nuclease) 시스템, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN; Transcription activator-like effector nuclease) 시스템, 메가뉴클레아제 시스템, 또는 트랜스포사제 시스템, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 주형 DNA를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 주형 DNA를 포함하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 주형 RNA를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 주형 RNA를 포함하지 않는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 표적 유전자의 서열에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA) 분자 및 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드, 예를 들어, Cas 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체, 예를 들어, Cas9 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; Cas3 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; Cas12a 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; Cas 12e 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; Cas 13 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; 또는 Cas14 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 표적 유전자의 서열에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자 및 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드, 예를 들어, Cas 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체, 예를 들어, Cas9 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; Cas3 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; Cas12a 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; Cas12e 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; Cas13 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; 또는 Cas14 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체를 암호화하는 핵산을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 표적 유전자의 서열에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 및 Cas9 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 표적 유전자의 서열에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 및 Cas9 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체를 암호화하는 핵산을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 주형 DNA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 주형 RNA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 역전사효소(Reverse transcriptase)를 추가로 포함한다.

본원에 개시된 임의의 방법, 조성물, 또는 세포의 일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 ZFN 시스템은 징크 핑거 DNA 결합 도메인, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; 및/또는 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 ZFN 시스템은 Zn 핑거 DNA 결합 도메인을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 Zn 핑거 결합 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상의 징크 핑거를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 ZFN 시스템은 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드는 II형 제한 1-유사 엔도뉴클레아제(type-II restriction 1-like endonuclease), 예를 들어, FokI 엔도뉴클레아제이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 ZFN 시스템은 징크 핑거 DNA 결합 도메인, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; 및/또는 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 ZFN 시스템은 Zn 핑거 DNA 결합 도메인을 갖는 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 Zn 핑거 결합 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상의 징크 핑거를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 ZFN 시스템은 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드는 II형 제한 1-유사 엔도뉴클레아제, 예를 들어, FokI 엔도뉴클레아제이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 시스템은 주형, 예를 들어, 주형 DNA를 추가로 포함한다.

본원에 개시된 임의의 방법, 조성물, 또는 세포의 일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 시스템이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 시스템은 전사 활성자-유사(TAL) 효과기 DNA 결합 도메인, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; 및/또는 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 시스템은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체를 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 시스템은 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드는 II형 제한 1-유사 엔도뉴클레아제, 예를 들어, FokI 엔도뉴클레아제이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 시스템은 전사 활성자-유사(TAL) 효과기 DNA 결합 도메인, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; 및/또는 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 시스템은 전사 활성자-유사(TAL) 효과기 DNA 결합 도메인, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체를 갖는 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 시스템은 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드는 II형 제한 1-유사 엔도뉴클레아제, 예를 들어, FokI 엔도뉴클레아제이다.

본원에 개시된 임의의 방법, 조성물, 또는 세포의 일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 메가뉴클레아제 시스템이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 메가뉴클레아제 시스템은 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드, 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease)를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 문헌 [Silva G. 등, (2011) Curr Gene Therapy 11(1): 11-27]에 기재된 바와 같은 LAGLIDADG 엔도뉴클레아제, GIY-YIG 엔도뉴클레아제, HNH 엔도뉴클레아제, His-Cys 박스 엔도뉴클레아제(box endonuclease) 또는 PD-(D/E)XK 엔도뉴클레아제, 또는 이들의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 메가뉴클레아제 시스템은 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드, 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 문헌 [Silva G. 등, (2011) Curr Gene Therapy 11(1): 11-27]에 기재된 바와 같은 LAGLIDADG 엔도뉴클레아제, GIY-YIG 엔도뉴클레아제, HNH 엔도뉴클레아제, His-Cys 박스 엔도뉴클레아제 또는 PD-(D/E)XK 엔도뉴클레아제, 또는 이들의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 방법, 조성물, 또는 세포의 일부 구현예에 있어서, 상기 유전자 조절자는 트랜스포사제 시스템이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 트랜스포사제 시스템은, 예를 들어, 레트로트랜스포존, 예를 들어, LTR 레트로트랜스포존 또는 비-LTR 레트로트랜스포존과 같은 역전사효소 및/또는 뉴클레아제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 트랜스포사제 시스템은 주형, 예를 들어, RNA 주형을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 RNA 치료제이다. 상기 RNA 분자는 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA(dsRNA; double-stranded RNA) 또는 부분적으로 이중-가닥 RNA인 분자, 즉, 이중-가닥인 부분 및 단일-가닥인 부분을 갖는 분자일 수 있다. 상기 RNA 분자는 원형 RNA 분자 또는 선형 RNA 분자일 수 있다.

RNA 치료제는 세포로 유전자를 이동시킬 수 있는, 예를 들어, 관심 단백질을 암호화하여 기도 세포에서 관심 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 RNA 치료제일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 RNA 분자는 천연-유래, 예를 들어, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 상기 RNA 분자는 합성 분자, 예를 들어, 시험관내에서 생성된 합성 RNA 분자이다.

RNA 치료제의 비-제한적 예는 메신저 RNA(mRNA; messenger RNA)(예를 들어, 관심 단백질을 암호화함), 변형된 mRNA(mmRNA; modified mRNA), 마이크로-RNA 결합 부위(들)(miR 결합 부위(들))를 포함하는 mRNA, 기능성 RNA 요소를 포함하는 변형된 RNA, 마이크로RNA(miRNA; microRNA), 안타고미르, 소형(짧은) 간섭 RNA(siRNA; small interfering RNA)(쇼트머(shortmer) 및 다이서-기질 RNA를 포함함), RNA 간섭(RNAi; RNA interference) 분자, 안티센스 RNA, 리보자임, 소형 헤어핀 RNA(shRNA; small hairpin RNA), 잠금 핵산(LNA; locked nucleic acid)을 포함하고 CRISPR/Cas9 기술의 구성 요소를 암호화하며, 이의 각각은 하기 하위섹션에서 추가로 기재된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 RNA 조절자는 RNA 염기 편집기 시스템을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 RNA 염기 편집기 시스템은 탈아미노효소, 예를 들어, RNA-특이적 아데노신 탈아미노효소(ADAR); Cas 단백질, 이의 단편(예를 들어, 생물학적 활성 단편) 또는 변이체; 및/또는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 RNA 염기 편집기 시스템은 주형, 예를 들어, DNA 또는 RNA 주형을 추가로 포함한다.

mRNA는 천연 또는 비-천연 발생 mRNA일 수 있다. mRNA는 하기에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 변형된 핵염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이 경우 이는 "변형된 mRNA" 또는 "mmRNA"로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 "뉴클레오시드"는 유기 염기(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘) 또는 이의 유도체(또한 본원에서 "핵염기"로도 지칭됨)와 조합된 당 분자(예를 들어, 펜토스 또는 리보스) 또는 이의 유도체를 함유하는 화합물로 정의된다. 본원에 기재된 바와 같은, "뉴클레오티드"는 포스페이트기를 포함하는 뉴클레오시드로 정의된다.

mRNA는 5' 비번역 영역(5'-UTR), 3' 비번역 영역(3'-UTR), 및/또는 코딩 영역(예를 들어, 오픈 리딩 프레임)을 포함할 수 있다. mRNA는 수십(예를 들어, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개), 수백(예를 들어, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 또는 900개) 또는 수천(예를 들어, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9000개, 10,000개) 개의 염기 쌍을 포함하는, 임의의 적합한 수의 염기 쌍을 포함할 수 있다. 임의의 수(예를 들어, 전부, 일부, 또는 없음)의 핵염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드는 표준 종(canonical species)의 유사체일 수 있으며, 치환되거나, 변형되거나, 또는 다르게는 비-천연 발생일 수 있다. 특정한 구현예에 있어서, 특정 핵염기 유형 전부가 변형될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 mRNA는 5' 캡 구조, 사슬 종결 뉴클레오티드, 임의로 코작(Kozak) 서열(또한 코작 공통 서열로도 공지됨), 스템 루프, 폴리A 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.

5' 캡 구조 또는 캡 종은 링커에 의해 접합된 2개의 뉴클레오시드 모이어티를 포함하는 화합물이며, 천연 발생 캡, 비-천연 발생 캡 또는 캡 유사체, 또는 항-역전 캡 유사체(ARCA; anti-reverse cap analog)로부터 선택될 수 있다. 캡 종은 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 및/또는 링커 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 mRNA 캡은 구아닌 뉴클레오티드 및 그 5' 위치에서 트리포스페이트 연결에 의해 접합된 7 위치에서 메틸화된 구아닌(G) 뉴클레오티드, 예를 들어, 통상적으로 m7GpppG로 표기되는 m7G(5')ppp(5')G를 포함할 수 있다. 캡 종은 또한 항-역전 캡 유사체일 수 있다. 가능한 캡 종의 비-제한적 목록은 m7GpppG, m7Gpppm7G, m73'dGpppG, m27, O3'GpppG, m27,O3'GppppG, m27,O2'GppppG, m7Gpppm7G, m73'dGpppG, m27,O3'GpppG, m27,O3'GppppG, 및 m27,O2'GppppG를 포함한다.

mRNA는 대신에 또는 추가적으로 사슬 종결 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 사슬 종결 뉴클레오시드는 그 당 기(sugar group)의 2' 및/또는 3' 위치에서 탈산소화된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 이러한 종은 3' 데옥시아데노신(코르디세핀(cordycepin)), 3' 데옥시우리딘, 3' 데옥시시토신, 3' 데옥시구아노신, 3' 데옥시티민, 및 2',3' 디데옥시뉴클레오시드, 예컨대, 2',3' 디데옥시아데노신, 2',3' 디데옥시우리딘, 2',3' 디데옥시시토신, 2',3' 디데옥시구아노신, 및 2',3' 디데옥시티민을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 예를 들어, 3'-말단에서 mRNA로의 사슬 종결 뉴클레오티드의 혼입은, 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2013/103659에 기재된 바와 같이, mRNA의 안정화를 초래할 수 있다.

mRNA는 대신에 또는 추가적으로 히스톤(histone) 스템 루프와 같은 스템 루프를 포함할 수 있다. 스템 루프는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 염기 쌍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스템 루프는 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 뉴클레오티드 염기 쌍을 포함할 수 있다. 스템 루프는 mRNA의 임의의 영역에 위치할 수 있다. 예를 들어, 스템 루프는 비번역 영역(5' 비번역 영역 또는 3' 비번역 영역), 코딩 영역, 또는 폴리A 서열 또는 테일 이내, 이전, 또는 이후에 위치할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 스템 루프는 번역의 개시, 번역 효율, 및/또는 전사 종결과 같은, mRNA의 하나 이상의 기능(들)에 영향을 미칠 수 있다.

mRNA는 대신에 또는 추가적으로 폴리A 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리A 서열은 전체 또는 대부분이 아데닌 뉴클레오티드 또는 이의 유사체 또는 유도체로 구성될 수 있다. 폴리A 서열은 mRNA의 3' 비번역 영역에 인접하여 위치하는 테일일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 폴리A 서열은 mRNA의 핵 외수송(nuclear export), 번역, 및/또는 안정성에 영향을 미칠 수 있다.

mRNA는 대신에 또는 추가적으로 마이크로RNA 결합 부위를 포함할 수 있다.

일부 구현예에 있어서, mRNA는 제1 코딩 영역과 제2 코딩 영역 사이의 내부 번역 개시를 허용하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES; internal ribosome entry site) 서열을 포함하는 개재 서열, 또는 2A 펩티드와 같은 자가-절단 펩티드를 암호화하는 개재 서열을 갖는 제1 코딩 영역 및 제2 코딩 영역을 포함하는 바이시스트론 mRNA(bicistronic mRNA)이다. IRES 서열 및 2A 펩티드는 전형적으로 동일한 벡터로부터 여러 단백질의 발현을 향상시키는 데 사용된다. 다양한 IRES 서열은 공지되어 있고 기술분야에서 이용가능하며, 예를 들어, 뇌심근염(encephalomyocarditis) 바이러스 IRES를 포함하여 사용될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 하나 이상의 변형된 핵염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드("변형된 mRNA" 또는 "mmRNA"로 지칭됨)를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 변형된 mRNA는 참조 비변형된 mRNA와 비교하여, 향상된 안정성, 세포내 잔류(intracellular retention), 향상된 번역, 및/또는 mRNA가 도입되는 세포의 선천성 면역 반응(innate immune response)의 실질적인 유도의 결여를 포함하는 유용한 특성을 가질 수 있다. 따라서, 변형된 mRNA의 사용은 단백질 생성의 효율성, 핵산의 세포내 잔류를 향상시킬 뿐만 아니라 감소된 면역원성을 보유할 수 있다.

일부 구현예에 있어서, mRNA는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 상이한 변형된 핵염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, mRNA는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 또는 그 이상)의 상이한 변형된 핵염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 변형된 mRNA는 상응하는 비변형된 mRNA에 비해, mRNA가 도입되는 세포에서 분해가 감소될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 변형된 우라실을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 슈도우리딘(pseudouridine)(ψ), 피리딘-4-원 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘(s2U), 4-티오-우리딘(s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘(ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘(예를 들어, 5-아이오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 3-메틸-우리딘(m3U), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 우리딘 5-옥시아세트산(cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르(mcmo5U), 5-카르복시메틸-우리딘(cm5U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘(chm5U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르(mchm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘(mcm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘(mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘(nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘(mnm5U), 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘(mnm5se2U), 5-카르바모일메틸-우리딘(ncm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘(cmnm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘(τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-우리딘(m5U, 즉, 핵염기 데옥시티민을 가짐), 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸-2-티오-우리딘(m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘(D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘(m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘(acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘(acp3ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘(inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘(inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘(Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘(m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘(ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘(s2Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘(mcm5Um), 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘(ncm5Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘(cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘(m3Um), 및 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘(inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카르보메톡시비닐) 우리딘, 및 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)]우리딘을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 변형된 시토신이다. 변형된 시토신을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 5-아자-시티딘, 6-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘(m3C), N4-아세틸-시티딘(ac4C), 5-포르밀-시티딘(f5C), N4-메틸-시티딘(m4C), 5-메틸-시티딘(m5C), 5-할로-시티딘(예를 들어, 5-아이오도-시티딘), 5-하이드록시메틸-시티딘(hm5C), 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘(s2C), 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린(zebularine), 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 리시딘(k2C), α-티오-시티딘, 2'-O-메틸-시티딘(Cm), 5,2'-O-디메틸-시티딘(m5Cm), N4-아세틸-2'-O-메틸-시티딘(ac4Cm), N4,2'-O-디메틸-시티딘(m4Cm), 5-포르밀-2'-O-메틸-시티딘(f5Cm), N4,N4,2'-O-트리메틸-시티딘(m42Cm), 1-티오-시티딘, 2'-F-아라-시티딘, 2'-F-시티딘, 및 2'-OH-아라-시티딘을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 a-티오-아데노신, 2-아미노-퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-할로-퓨린(예를 들어, 2-아미노-6-클로로-퓨린), 6-할로-퓨린(예를 들어, 6-클로로-퓨린), 2-아미노-6-메틸-퓨린, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데닌(m2A), N6-메틸-아데노신(m6A), 2-메틸티오-N6-메틸-아데노신(ms2m6A), N6-이소펜테닐-아데노신(i6A), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐-아데노신(ms2i6A), N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신(io6A), 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신(ms2io6A), N6-글리시닐카르바모일-아데노신(g6A), N6-트레오닐카르바모일-아데노신(t6A), N6-메틸-N6-트레오닐카르바모일-아데노신(m6t6A), 2-메틸티오-N6-트레오닐카르바모일-아데노신(ms2g6A), N6,N6-디메틸-아데노신(m62A), N6-하이드록시노르발릴카르바모일-아데노신(hn6A), 2-메틸티오N6-하이드록시노르발릴카르바모일-아데노신(ms2hn6A), N6-아세틸-아데노신(ac6A), 7-메틸-아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, α-티오-아데노신, 2'-O-메틸-아데노신(Am), N6,2'-O-디메틸-아데노신(m6Am), N6,N6,2'-O-트리메틸-아데노신(m62Am), 1,2'-O-디메틸-아데노신(m1Am), 2'-O-리보실아데노신(포스페이트)(Ar(p)), 2-아미노-N6-메틸-퓨린, 1-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 2'-F-아라-아데노신, 2'-F-아데노신, 2'-OH-아라-아데노신, 및 N6-(19-아미노-펜타옥사노나데실)-아데노신을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 a-티오-구아노신, 이노신(I), 1-메틸-이노신(m1I), 와이오신(imG), 메틸와이오신 (mimG), 4-데메틸-와이오신(imG-14), 이소와이오신(imG2), 와이부토신(yW), 퍼옥시와이부토신(o2yW), 하이드록시와이부토신(OhyW), 미완성변형된(undermodified) 하이드록시와이부토신(OhyW*), 7-데아자-구아노신, 케오신(queuosine)(Q), 에폭시케오신(oQ), 갈락토실-케오신(galQ), 만노실-케오신(manQ), 7-시아노7-데아자-구아노신(preQ0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(preQ1), 아르케오신(archaeosine)(G+), 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신(m7G), 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸-이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸-구아노신(m1G), N2-메틸-구아노신(m2G), N2,N2-디메틸-구아노신(m22G), N2,7-디메틸-구아노신(m2,7G), N2,N2,7-디메틸-구아노신(m2,2,7G), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, α-티오-구아노신, 2'-O-메틸-구아노신(Gm), N2-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2Gm), N2,N2-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m22Gm), 1-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m1Gm), N2,7-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2,7Gm), 2'-O-메틸-이노신(Im), 1,2'-O-디메틸-이노신(m1Im), 2'-O-리보실구아노신(포스페이트)(Gr(p)), 1-티오-구아노신, O6-메틸-구아노신, 2'-F-아라-구아노신, 및 2'-F-구아노신을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 전술한 변형된 핵염기 중 하나 이상의 조합(예를 들어, 전술한 변형된 핵염기 중 2개, 3개 또는 4개의 조합)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 또는 2'-O-메틸 우리딘이다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 전술한 변형된 핵염기 중 하나 이상의 조합(예를 들어, 전술한 변형된 핵염기 중 2개, 3개 또는 4개의 조합)을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ)이고 본 개시내용의 mRNA는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ)으로 완전히 변형된다. 일부 구현예에 있어서, N1-메틸슈도우리딘(m1ψ)은 mRNA에서 75-100%의 우라실을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, N1-메틸슈도우리딘(m1ψ)은 mRNA에서 100%의 우라실을 나타낸다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 변형된 시토신이다. 변형된 시토신을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 N4-아세틸-시티딘(ac4C), 5-메틸-시티딘(m5C), 5-할로-시티딘(예를 들어, 5-아이오도-시티딘), 5-하이드록시메틸-시티딘(hm5C), 1-메틸-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘(s2C), 2-티오-5-메틸-시티딘을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 전술한 변형된 핵염기 중 하나 이상의 조합(예를 들어, 전술한 변형된 핵염기 중 2개, 3개 또는 4개의 조합)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 7-데아자-아데닌, 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데닌(m2A), N6-메틸-아데노신(m6A)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 전술한 변형된 핵염기 중 하나 이상의 조합(예를 들어, 전술한 변형된 핵염기 중 2개, 3개 또는 4개의 조합)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 이노신(I), 1-메틸-이노신(m1I), 와이오신(imG), 메틸와이오신(mimG), 7-데아자-구아노신, 7-시아노-7-데아자-구아노신(preQ0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(preQ1), 7-메틸-구아노신(m7G), 1-메틸-구아노신(m1G), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 전술한 변형된 핵염기 중 하나 이상의 조합(예를 들어, 전술한 변형된 핵염기 중 2개, 3개 또는 4개의 조합)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 5-메틸-시티딘(m5C), 슈도우리딘(ψ), α-티오-구아노신, 또는 α-티오-아데노신이다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 전술한 변형된 핵염기 중 하나 이상의 조합(예를 들어, 전술한 변형된 핵염기 중 2개, 3개 또는 4개의 조합)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 슈도우리딘(ψ)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 슈도우리딘(ψ) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 2-티오우리딘(s2U)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 2-티오우리딘 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 5-메톡시-우리딘(mo5U)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 5-메톡시-우리딘(mo5U) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 2'-O-메틸 우리딘을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 2'-O-메틸 우리딘 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 N6-메틸-아데노신(m6A)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 N6-메틸-아데노신(m6A) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다.

특정한 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 특정 변형에 대해 균일하게 변형된다(즉, 전체 서열에 걸쳐 완전히 변형, 변형됨). 예를 들어, mRNA는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-시티딘(m5C)으로 균일하게 변형될 수 있으며, 이는 mRNA 서열의 모든 우리딘 또는 모든 시토신 뉴클레오시드가 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-시티딘(m5C)으로 대체됨을 의미한다. 유사하게, 본 개시내용의 mRNA는 상기 기술된 것과 같은 변형된 잔기로 대체함으로써 서열에 존재하는 임의의 유형의 뉴클레오시드 잔기에 대해 균일하게 변형될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 mRNA는 코딩 영역(예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임)에서 변형될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, mRNA는 코딩 영역 이외의 영역에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 5'-UTR 및/또는 3'-UTR이 제공되며, 여기서 어느 하나 또는 둘 모두 독립적으로 하나 이상의 상이한 뉴클레오시드 변형을 함유할 수 있다. 이러한 구현예에 있어서, 뉴클레오시드 변형은 또한 상기 코딩 영역 내에 존재할 수도 있다.

본 개시내용의 mmRNA에 존재할 수 있는 뉴클레오시드 변형 및 이의 조합의 예는 PCT 특허 출원 공보: WO2012045075, WO2014081507, WO2014093924, WO2014164253, 및 WO2014159813에 기재된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 개시내용의 mmRNA는 당류, 핵염기, 및/또는 뉴클레오시드간 연결에 대해 변형의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 조합은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.

단일 변형이 열거된 경우, 열거된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 100%의 변형된 해당 A, U, G 또는 C 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 나타낸다. 백분율이 열거된 경우, 이는 존재하는 A, U, G, 또는 C 트리포스페이트의 총량에 대한 해당 특정 A, U, G 또는 C 핵염기 트리포스페이트의 백분율을 나타낸다. 예를 들어, 조합: 25% 5-아미노알릴-CTP + 75% CTP/25% 5-메톡시-UTP + 75% UTP는 25%의 시토신 트리포스페이트가 5-아미노알릴-CTP이고 75%의 시토신이 CTP인 반면; 25%의 우라실이 5-메톡시 UTP이고 75%의 우라실이 UTP인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 UTP가 열거되지 않은 경우 천연 발생 ATP, UTP, GTP 및/또는 CTP는 폴리뉴클레오티드에서 발견되는 해당 뉴클레오티드의 부위의 100%에서 사용된다. 이 예에서 모든 GTP 및 ATP 뉴클레오티드는 변형되지 않은 상태로 남아 있게 된다.

본 개시내용의 mRNA는 시험관내 전사(IVT; in vitro transcription) 및 합성 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 기술분야에서 이용가능한 수단에 의해 생성될 수 있다. 효소적 (IVT), 고체상, 액체상, 조합된 합성 방법, 소영역 합성, 및 결찰 방법이 활용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, mRNA는 IVT 효소적 합성 방법을 사용하여 제조된다. IVT에 의해 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 기술분야에 공지되어 있고 국제 출원 PCT/US2013/30062에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 mRNA를 시험관내 전사하는 데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA, 작제물 및 벡터를 포함한다.

비-천연 변형된 핵염기는 합성 동안 또는 합성 후, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, mRNA로 도입될 수 있다. 특정한 구현예에 있어서, 변형은 뉴클레오시드간 연결, 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 당류 상에 존재할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 변형은 화학적 합성 또는 폴리머라제 효소에 의해 폴리뉴클레오티드 사슬의 말단 또는 상기 폴리뉴클레오티드 사슬의 임의의 다른 곳에 도입될 수 있다. 변형된 핵산 및 이의 합성의 예는 PCT 출원 번호 PCT/US2012/058519에 개시되어 있다. 변형된 폴리뉴클레오티드의 합성은 또한 문헌 [Verma 및 Eckstein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99-134(1998)]에 기재되어 있다.

효소적 또는 화학적 결찰 방법을 사용하여 표적화제 또는 전달제, 형광 표지, 액체, 나노입자 등과 같은, 상이한 기능성 모이어티를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 영역을 접합할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 변형된 폴리뉴클레오티드의 접합체는 문헌 [Goodchild, Bioconjugate Chemistry, vol. 1(3), 165-187(1990)]에서 검토된다.

단백질 발현 감소를 위한 치료제

일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 단백질 발현을 감소(즉, 저하, 억제, 하향조절)시키는 치료제이다. 일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 표적 기도 세포에서 단백질 발현을 감소시킨다. 단백질 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있는 상기 치료제 유형의 비-제한적 예는 마이크로-RNA 결합 부위(들)(miR 결합 부위)를 포함하는 mRNA, 마이크로RNA(miRNA), 안타고미르, 소형(짧은) 간섭 RNA(siRNA)(쇼트머 및 다이서-기질 RNA를 포함함), RNA 간섭(RNAi) 분자, 안티센스 RNA, 리보자임, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 잠금 핵산(LNA) 및 CRISPR/Cas9 기술을 포함한다.

펩티드/폴리펩티드 치료제

일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 펩티드 치료제이다. 일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 폴리펩티드 치료제이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 치료적 페이로드 또는 예방적 페이로드는 분비된 단백질; 막-결합된 단백질; 또는 세포간 단백질, 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 치료적 페이로드 또는 예방적 페이로드는 분비된 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 치료적 페이로드 또는 예방적 페이로드는 막-결합된 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 치료적 페이로드 또는 예방적 페이로드는 세포내 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 치료적 페이로드 또는 예방적 페이로드는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 천연-유래, 예를 들어, 천연 공급원으로부터 단리된다. 다른 구현예에 있어서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성 분자, 예를 들어, 시험관내에서 생성되는 합성 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 재조합 분자이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 키메라 분자이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 융합 분자이다. 일 구현예에 있어서, 상기 조성물의 펩티드 또는 폴리펩티드 치료제는 천연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일 구현예에 있어서, 상기 조성물의 펩티드 또는 폴리펩티드 치료제는 천연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드의 변형된 버전이다(예를 들어, 그것의 야생형(wild type), 천연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드 대응물과 비교하여 3개 미만, 5개 미만, 10개 미만, 15개 미만, 20개 미만, 또는 25개 미만의 아미노 치환, 결실, 또는 부가를 함유함).

양이온제를 포함하는 LNP

본 발명의 LNP는 LNP 코어 및 주로 상기 코어의 외부 표면 상에 배치된 양이온제를 포함한다. 이러한 LNP는 생리학적 pH에서 중성 제타 전위 초과이다.

코어 지질 나노입자는 전형적으로 하기 구성 요소 중 하나 이상을 포함한다: 지질(이는 이온화 가능한 아미노 지질, 인지질, 중성 지질일 수 있는 헬퍼 지질, 양쪽이온성 지질, 음이온성 지질 등을 포함할 수 있음), 구조적 지질, 예컨대, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유사체, 지방산, 중합체, 안정화제, 염, 완충액, 용매 등.

본원에서 제공되는 특정한 LNP 코어는 이온화 가능한 지질, 예컨대, 이온화 가능한 지질, 예를 들어, 이온화 가능한 아미노 지질, 인지질, 구조적 지질, 및 임의로 안정화제(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 분자)를 포함하며, 이는 또 다른 지질에 접합되거나 접합되지 않은 상태로 제공된다.

상기 구조적 지질은, 예를 들어, 콜레스테롤과 같은 스테롤일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 상기 구조적 지질은 β-시토스테롤일 수 있다.

상기 헬퍼 지질은 비-양이온성 지질이다. 상기 헬퍼 지질은 적어도 8C의 적어도 하나의 지방산 사슬 및 적어도 하나의 극성 헤드기 모이어티를 포함할 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜(즉, PEG)을 포함하는 분자가 사용될 때, 이는 안정화제로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 분자는 지질에 접합된 폴리에틸렌 글리콜일 수 있으며, 이에 따라, 예를 들어, PEG-c-DOMG 또는 PEG-DMG로 제공될 수 있다. 본원에서 제공되는 특정한 LNP는 전혀 또는 낮은 수준의 알킬-PEG화 지질을 포함하는, 전혀 또는 낮은 수준의 PEG화 지질을 포함하며, 본원에서 PEG 또는 PEG화 지질이 존재하지 않는 것으로 지칭될 수 있다. 따라서, 일부 LNP는 0.5 mol% 미만의 PEG화 지질을 포함한다. 일부 경우에 있어서, PEG는 메톡시-PEG와 같은 알킬-PEG일 수 있다. 또 다른 LNP는 하이드록시-PEG와 같은 비-알킬-PEG, 및/또는 하이드록시-PEG화 지질과 같은 비-알킬-PEG화 지질을 포함한다. 본원에서 제공되는 특정한 LNP는 높은 수준의 PEG화 지질을 포함한다. 일부 LNP는 0.5 mol%의 PEG화 지질을 포함한다. 일부 LNP는 0.5 mol% 초과의 PEG화 지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 LNP는 1.5 mol%의 PEG화 지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 LNP는 3.0 mol%의 PEG화 지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 LNP는 0.1 mol% 내지 3.0 mol%의 PEG화 지질, 0.5 mol% 내지 2.0 mol%의 PEG화 지질, 또는 1.0 mol% 내지 1.5 mol%의 PEG화 지질을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 코어 나노입자 조성물은 몰비가 50:10:38.5:1.5인 화합물 18:인지질:Chol:N-라우로일-D-에리스로-스핑가닐포스포릴콜린의 제형을 가질 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 나노입자 코어 조성물은 몰비가 50:10:38.5:1.5인 화합물 18:DSPC:Chol:화합물 428의 제형을 가질 수 있다.

화합물 428:

본 개시내용의 나노입자는 적어도 하나의 화학식 (I)에 따른 화합물을 포함한다. 예를 들어, 상기 나노입자 조성물은 화합물 1 내지 147 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 나노입자는 또한 다양한 기타 구성 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 나노입자 조성물은 화학식 (I) 또는 (II)에 따른 지질 외에 하나 이상의 기타 지질, 예를 들어, (i) 적어도 하나의 인지질, (ii) 적어도 하나의 구조적 지질, (iii) 적어도 하나의 PEG-지질, 또는 (iv) 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 화학식 (I)의 화합물(예를 들어, 화합물 18, 25, 26 또는 48)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 화학식 (I)의 화합물(예를 들어, 화합물 18, 25, 26 또는 48) 및 인지질(예를 들어, DSPC, DOPE, 또는 MSPC)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 화학식 (I)의 화합물(예를 들어, 화합물 18, 25, 26 또는 48) 및 인지질(예를 들어, DSPC, DPPC, DOPE, 또는 MSPC)을 포함한다.

본 개시내용은 또한 지질 나노입자를 양이온제와 접촉시키는 것을 포함하는, 나노입자를 제조하는 과정을 제공하며, 여기서 상기 지질 나노입자는 하기를 포함한다:

(a) 하기를 포함하는 지질 나노입자 코어:

(i) 이온화 가능한 지질,

(ii) 인지질,

(iii) 구조적 지질, 및

(iv) PEG-지질, 및

일부 구현예에 있어서, 상기 지질 나노입자를 양이온제와 접촉시키는 것은 상기 양이온제를 비-이온성 부형제에 용해시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 비-이온성 부형제는 마크로골 15 하이드록시스테아레이트(macrogol 15 hydroxystearate)(HS 15), 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2K), 화합물 428, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트[TWEEN ®80], 및 d-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트(TPGS; d-α-Tocopherol polyethylene glycol succinate)로부터 선택된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 비-이온성 부형제는 마크로골 15 하이드록시스테아레이트(HS 15)이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 지질 나노입자를 양이온제와 접촉시키는 것은 완충 용액에 용해된 상기 양이온제를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수(PBS; phosphate buffered saline)이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 완충 용액은 트리스-염기(Tris-based) 완충액이다.

예를 들어, 상기 지질 나노입자를 양이온제와 접촉시킴으로써, 본원에 기재된 바와 같은 과정에 의해 제조된 나노입자가 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제는 GL-67과 같은 스테롤 아민일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 지질 나노입자의 지질 나노입자 코어는 임의로 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양이온제와 접촉하게 되는 지질 나노입자를 형성하는 지질 나노입자 코어는 실질적으로 PEG-지질이 존재하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 PEG-지질은 상기 양이온제와 접촉하기 전에 또는 상기 양이온제와 접촉한 후에, 상기 양이온제와 함께 상기 지질 나노입자에 첨가된다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 LNP는 핵산 페이로드가 코어 LNP 성분과 혼합되어 코어 LNP + 페이로드를 생성하는 전통적인 혼합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이 로딩된 코어 LNP가 제조되면, 상기 양이온제가 상기 로딩된 코어 LNP와 접촉하게 된다.

또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 LNP는 공 LNP를 출발점으로 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 것처럼, 공 LNP는 상기 핵산 페이로드에 로딩하기 전에 제조된다. 상기 핵산 페이로드가 상기 LNP와 접촉하게 되면, 상기 양이온제를 첨가하여 본 발명의 LNP를 형성할 수 있다.

예를 들어, 일 구현예에 있어서, 사후 로딩(PHL) 방법에서, 공 LNP를 우선 나노침전 단계에서 제형화하고, 완충액을 낮은 pH 완충액(즉, pH 5)으로 교환한다. 다음으로, 이러한 공 LNP를 혼합 이벤트를 통해 mRNA(또한 낮은 pH에서 산성화됨)에 도입한다. 상기 혼합 단계 후, pH 조정 방법을 사용하여 pH를 중화한다. 마지막으로, PEG 지질, 예를 들어, DMG-PEG-2k를 첨가하여 입자를 안정화시킨다. 이어서, 이러한 입자를 목표 농도로 농축시키고 여과시킨다. 양이온제, 예를 들어, GL67을 첨가한다.

공 LNP 출발점의 변형은 도 2에 예시되어 있다. 도 2는 상기 PEG 지질을 배제한, 상기 LNP의 지질이 공 LNP를 형성하는 데 사용됨을 나타낸다. 이어서, 핵산 용액은 공 LNP와 접촉하여 로딩된 LNP를 형성한다. 상기 PEG 지질은 상기 로딩된 LNP의 추가 처리 동안 한두 시점에서 첨가되며, 상기 양이온제는 도 2의 점선 상자로 예시된, 추가 처리 중 임의의 시점에서 첨가될 수 있다. 도 3은 도 2의 과정의 보다 구체적인 버전이며, 다시, 상기 양이온제는 상기 로딩된 LNP의 추가 처리 동안 임의의 시점에서 첨가될 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 본 발명의 LNP는 상기 LNP가 동적 혼합 및 후속 성숙 및 연속 희석을 통해 그 개별 지질 성분으로부터 자가-조립되는 단위 작업인, 나노침전을 사용하여 제조될 수 있다. 이 단위 작업은 수성 및 유기 투입물의 혼합, LNP의 성숙, 및 제어된 체류 시간 후 희석의 세 가지 개별 단계를 포함한다. 이러한 단계의 연속적인 특성으로 인해, 이들은 하나의 단위 작업으로 간주된다. 상기 단위 작업은 3개의 액체 스트림과 1개의 인라인 성숙 단계의 연속적인 인라인 조합: 수성 완충액과 지질 스톡 용액의 혼합, 제어된 체류 시간을 통한 성숙, 및 나노입자의 희석을 포함한다. 상기 나노침전 자체는 에탄올에 용해된 상기 지질 스톡 용액과 수용액의 연속적인 고-에너지 조합이 가능하도록 설계된, 규모에 적절한 혼합기에서 발생한다. 상기 수용액 및 지질 스톡 용액은 모두 이 작업을 통해 연속적으로 혼합 하드웨어로 동시에 유동한다. 상기 용해된 지질을 유지하는 에탄올 함량은 갑자기 감소되어 상기 지질이 모두 서로 침전된다. 따라서, 입자는 혼합 챔버에서 자가-조립된다.

단위 작업의 목적 중 하나는 용액을 에탄올이 존재하지 않는 완전 수성 완충액으로 교환하고, 목표 농도의 LNP에 도달하는 것이다. 이는 우선 표적 처리 농도에 도달한 후, 정용여과(diafiltering), 및 이어서 (필요한 경우) 에탄올이 완전히 제거된 후 최종 농축 단계를 통해 달성될 수 있다.

단위 작업의 목적 중 하나는 용액을 에탄올이 존재하지 않는 완전 수성 완충액으로 교환하고, 목표 농도의 LNP에 도달하는 것이다. 이는 우선 표적 처리 농도에 도달한 후, 정용여과, 및 이어서 (필요한 경우) 에탄올이 완전히 제거된 후 최종 농축 단계를 통해 달성될 수 있다.

일부 양태에 있어서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 공 지질 나노입자(공 LNP)를 포함하는 공-지질 나노입자 용액(공-LNP 용액)을 제조하는 방법을 제공한다:

i) 하기를 포함하는, 나노침전 단계:

i-a) 이온화 가능한 지질, 구조적 지질, 인지질, 및 PEG 지질을 포함하는 지질 용액을 제1 완충제를 포함하는 완충액 수용액과 혼합하여 중간체 공 나노입자(중간체 공 LNP)를 포함하는 중간체 공-지질 나노입자 용액(중간체 공-LNP 용액)을 형성하는 것을 포함하는, 혼합 단계;

i-b) 체류 시간 동안 상기 중간체 공-LNP 용액을 유지하는 단계; 및

i-c) 상기 중간체 공-LNP 용액에 희석 용액을 첨가하여 공 LNP를 포함하는 공-LNP 용액을 형성하는 단계.

i) 하기를 포함하는, 나노침전 단계:

i-a) 이온화 가능한 지질, 구조적 지질, 인지질, 및 PEG 지질을 포함하는 지질 용액을 제1 완충제를 포함하는 완충액 수용액과 혼합하여 중간체 공 나노입자 용액(중간체 공 LNP)를 포함하는 중간체 공-지질 나노입자 용액(중간체 공-LNP 용액)을 형성하는 것을 포함하는, 혼합 단계;

i-b) 체류 시간 동안 상기 중간체 공-LNP 용액을 유지하는 단계;

i-c) 상기 중간체 공-LNP 용액에 희석 용액을 첨가하여 공 LNP를 포함하는 공-LNP 용액을 형성하는 단계; 및

ii) 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계.

ii) 상기 공 LNP를 포함하는 공-LNP 용액을 처리하는 단계.

일부 양태에 있어서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 지질 나노입자 제형(LNP 제형)을 제조하는 방법을 제공한다:

i) 하기를 포함하는, 나노침전 단계:

ii) 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계; 및

iii) 핵산을 포함하는 핵산 용액을 상기 공-LNP 용액과 혼합하여 로딩된 지질 나노입자(로딩된 LNP)를 포함하는 로딩된 LNP 용액을 형성하는 것을 포함하는, 로딩 단계.

i) 하기를 포함하는, 나노침전 단계:

i-c) 상기 중간체 공-LNP 용액에 희석 용액을 첨가하여 공-LNP를 포함하는 공-LNP 용액을 형성하는 단계; 및

ii) 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계;

iii) 핵산을 포함하는 핵산 용액을 상기 공-LNP 용액과 혼합하여 로딩된 지질 나노입자(로딩된 LNP)를 포함하는 로딩된 LNP 용액을 형성하는 것을 포함하는, 로딩 단계; 및

iv) 상기 로딩된 LNP 용액을 처리하여 로딩된 LNP 제형을 형성하는 단계.

i) 하기를 포함하는, 나노침전 단계:

ii) 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계;

iii) 핵산을 포함하는 핵산 용액을 상기 공-LNP 용액과 혼합하여 로딩된 지질 나노입자(로딩된 LNP)를 포함하는 로딩된 LNP 용액을 형성하는 것을 포함하는, 로딩 단계;

iv) 상기 로딩된 LNP 용액을 처리하여 로딩된 LNP 제형을 형성하는 단계; 및

v) 양이온제를 첨가하는 단계.

iii) 핵산을 포함하는 핵산 용액을 공 LNP를 포함하는 공-LNP 용액과 혼합하여 로딩된 지질 나노입자(로딩된 LNP)를 포함하는 로딩된 나노입자 용액(로딩된 LNP 용액)을 형성하는 것을 포함하는, 로딩 단계.

iii) 핵산을 포함하는 핵산 용액을 공 LNP를 포함하는 공-LNP 용액과 혼합하여 로딩된 지질 나노입자(로딩된 LNP)를 포함하는 로딩된 나노입자 용액(로딩된 LNP 용액)을 형성하는 것을 포함하는, 로딩 단계; 및

iii) 핵산을 포함하는 핵산 용액을 공 LNP를 포함하는 공-LNP 용액과 혼합하여 로딩된 지질 나노입자(로딩된 LNP)를 포함하는 로딩된 나노입자 용액(로딩된 LNP 용액)을 형성하는 것을 포함하는, 로딩 단계

v) 양이온제를 첨가하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 단계 i-a) 내지 i-c)는 별도의 작업 단위(예를 들어, 별도의 반응 장치)에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 단계 i-a) 내지 i-c)는 단일 작업 단위에서 수행된다. 일부 구현예에 있어서, 단계 i-a) 내지 i-c)는 단계 i-c)가 단계 i-a)의 다운스트림인 단계 i-b)의 다운스트림이 되도록 연속 유동 장치에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 단계 i-c)에서, 상기 희석 용액은 1회 첨가된다.

일부 구현예에 있어서, 단계 i-c)에서, 상기 희석 용액은 연속적으로 첨가된다.

일부 양태에 있어서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 공 지질 나노입자(공 LNP)를 생성하는 방법을 제공한다: i) 이온화 가능한 지질을 제1 완충제와 혼합하여 공 LNP를 형성하는 것을 포함하는, 혼합 단계, 여기서 상기 공 LNP는 약 0.1 mol% 내지 약 0.5 mol%의 중합체성 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함함.

i) 이온화 가능한 지질, 구조적 지질, 인지질, 및 PEG 지질을 포함하는 지질 용액을 제1 완충제를 포함하는 완충액 수용액과 혼합하여 공 LNP를 포함하는 공-지질 나노입자 용액(공-LNP 용액)을 형성하는 것을 포함하는, 혼합 단계.

i) 이온화 가능한 지질, 구조적 지질, 인지질, 및 PEG 지질을 포함하는 지질 용액을 제1 완충제를 포함하는 완충액 수용액과 혼합하여 공 LNP를 포함하는 공-지질 나노입자 용액(공-LNP 용액)을 형성하는 것을 포함하는, 혼합 단계; 및

ii) 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 혼합 단계는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 용액을 제1 완충제를 포함하는 완충액 수용액과 혼합하여 공 LNP를 포함하는 공-지질 나노입자 용액(공-LNP 용액)을 형성하는 것을 포함한다.

일부 양태에 있어서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 핵산과 회합된 로딩된 지질 나노입자(로딩된 LNP)를 제조하는 방법을 제공한다: ii) 핵산을 공 LNP와 혼합한 후 양이온제를 첨가하여 로딩된 LNP를 형성하는 것을 포함하는, 로딩 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 로딩 단계는 핵산을 포함하는 핵산 용액을 공-LNP 용액과 혼합한 후 양이온제를 첨가하여 로딩된 LNP를 포함하는 로딩된 지질 나노입자 용액(로딩된-LNP 용액)을 형성하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공 LNP 또는 상기 공-LNP 용액은 유지 또는 보관 없이 상기 로딩 단계에 적용된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공 LNP 또는 상기 공-LNP 용액은 일정 시간 동안 유지된 후 상기 로딩 단계에 적용된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공 LNP 또는 상기 공-LNP 용액은 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 18시간, 또는 약 24시간 동안 유지된 후 상기 로딩 단계에 적용된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공 LNP 또는 상기 공-LNP 용액은 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 또는 약 5년 동안 보관된 후 상기 로딩 단계에 적용된다.

일부 구현예에 있어서, 형성 시, 상기 공 LNP 또는 상기 공-LNP 용액은 일정 기간 동안 보관 또는 유지되지 않고 상기 로딩 단계에 적용된다.

일부 양태에 있어서, 본 개시내용은 하기를 추가로 포함하는, 방법을 제공한다: ii) 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계.

일부 양태에 있어서, 본 개시내용은 하기를 추가로 포함하는, 방법을 제공한다: iv) 상기 로딩된-LNP 용액을 처리하여 지질 나노입자 제형(LNP 제형)을 형성하는 단계.

다른 생산 기술(예를 들어, 박막 필름 재수화/압출)과 대조적으로, 에탄올-적하 침전(drop precipitation)은 핵산 지질 나노입자를 생성하기 위한 산업 표준이었다. 침전 반응은 그 연속적 특성, 확장성, 및 채택 용이성으로 인해 선호된다. 이러한 과정은 일반적으로 고에너지 혼합기(예를 들어, T-접합(T-junction), 제한된 충돌 제트(confined impinging jet), 미세유체 혼합기, 볼텍스 혼합기)를 사용하여 제어 가능한 방식으로 적합한 반-용매(anti-solvent)(즉, 물)에 지질(에탄올 내)을 도입하여 액체 과포화 및 자발적 침전을 지질 입자로 유도한다. 일부 구현예에 있어서, 사용된 볼텍스 혼합기는 미국 특허 출원 번호 제62/799,636호 및 제62/886,592호에 기재된 것들이며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 사용된 미세유체 혼합기는 PCT 출원 번호 WO/2014/172045에 기재된 것들이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 혼합 단계는 T-접합, 제한된 충돌 제트, 미세유체 혼합기, 또는 볼텍스 혼합기로 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 로딩 단계는 T-접합, 제한된 충돌 제트, 미세유체 혼합기, 또는 볼텍스 혼합기로 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 혼합 단계는 약 30℃ 미만, 약 28℃ 미만, 약 26℃ 미만, 약 24℃ 미만, 약 22℃ 미만, 약 20℃ 미만, 또는 약 주변 온도 미만의 온도에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 로딩 단계는 약 30℃ 미만, 약 28℃ 미만, 약 26℃ 미만, 약 24℃ 미만, 약 22℃ 미만, 약 20℃ 미만, 또는 약 주변 온도 미만의 온도에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제1 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 공 LNP 용액에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제1 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 공 LNP에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제1 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 로딩된 LNP 용액에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제1 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 로딩된 LNP에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제1 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액에 PEG 지질을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 용액(PEG 용액)을 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제2 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 공 LNP 용액에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제2 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 공 LNP에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제2 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 로딩된 LNP 용액에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제2 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 상기 로딩된 LNP에 폴리에틸렌 글리콜 지질(PEG 지질)을 첨가하는 것을 포함하는, 제2 첨가 단계를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액에 PEG 지질을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 용액(PEG 용액)을 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 제1 첨가 단계는 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP에 약 0.1 mol% 내지 약 3.0 mol%의 PEG, 약 0.2 mol% 내지 약 2.5 mol%의 PEG, 약 0.5 mol% 내지 약 2.0 mol%의 PEG, 약 0.75 mol% 내지 약 1.5 mol%의 PEG, 약 1.0 mol% 내지 약 1.25 mol%의 PEG를 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 상기 공-LNP 또는 상기 로딩된 LNP에 약 0.1 mol% 내지 약 3.0 mol%의 PEG, 약 0.2 mol% 내지 약 2.5 mol%의 PEG, 약 0.5 mol% 내지 약 2.0 mol%의 PEG, 약 0.75 mol% 내지 약 1.5 mol%의 PEG, 약 1.0 mol% 내지 약 1.25 mol%의 PEG를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 약 0.1 mol%, 약 0.2 mol%, 약 0.3 mol%, 약 0.4 mol%, 약 0.5 mol%, 약 0.6 mol%, 약 0.7 mol%, 약 0.8 mol%, 약 0.9 mol%, 약 1.0 mol%, 약 1.1 mol%, 약 1.2 mol%, 약 1.3 mol%, 약 1.4 mol%, 약 1.5 mol%, 약 1.6 mol%, 약 1.7 mol%, 약 1.8 mol%, 약 1.9 mol%, 약 2.0 mol%, 약 2.1 mol%, 약 2.2 mol%, 약 2.3 mol%, 약 2.4 mol%, 약 2.5 mol%, 약 2.6 mol%, 약 2.7 mol%, 약 2.8 mol%, 약 2.9 mol%, 또는 약 3.0 mol%의 PEG 지질(예를 들어, PEG_2k-DMG)을 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 약 1.75±0.5 mol%, 약 1.75±0.4 mol%, 약 1.75±0.3 mol%, 약 1.75±0.2 mol%, 또는 약 1.75±0.1 mol%(예를 들어, 약 1.75 mol%)의 PEG 지질(예를 들어, PEG_2k-DMG)을 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계 후, 상기 공 LNP 용액(예를 들어, 상기 공 LNP)은 약 1.0 mol%, 약 1.1 mol%, 약 1.2 mol%, 약 1.3 mol%, 약 1.4 mol%, 약 1.5 mol%, 약 1.6 mol%, 약 1.7 mol%, 약 1.8 mol%, 약 1.9 mol%, 약 2.0 mol%, 약 2.1 mol%, 약 2.2 mol%, 약 2.3 mol%, 약 2.4 mol%, 약 2.5 mol%, 약 2.6 mol%, 약 2.7 mol%, 약 2.8 mol%, 약 2.9 mol%, 약 3.0 mol%, 약 3.1 mol%, 약 3.2 mol%, 약 3.3 mol%, 약 3.4 mol%, 약 3.5 mol%, 약 3.6 mol%, 약 3.7 mol%, 약 3.8 mol%, 약 3.9 mol%, 약 4.0 mol%, 약 4.1 mol%, 약 4.2 mol%, 약 4.3 mol%, 약 4.4 mol%, 약 4.5 mol%, 약 4.6 mol%, 약 4.7 mol%, 약 4.8 mol%, 약 4.9 mol%, 또는 약 5.0 mol%의 PEG 지질(예를 들어, PEG_2k-DMG)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계 후, 상기 로딩된 LNP 용액(예를 들어, 상기 로딩된 LNP)은 약 1.0 mol%, 약 1.1 mol%, 약 1.2 mol%, 약 1.3 mol%, 약 1.4 mol%, 약 1.5 mol%, 약 1.6 mol%, 약 1.7 mol%, 약 1.8 mol%, 약 1.9 mol%, 약 2.0 mol%, 약 2.1 mol%, 약 2.2 mol%, 약 2.3 mol%, 약 2.4 mol%, 약 2.5 mol%, 약 2.6 mol%, 약 2.7 mol%, 약 2.8 mol%, 약 2.9 mol%, 약 3.0 mol%, 약 3.1 mol%, 약 3.2 mol%, 약 3.3 mol%, 약 3.4 mol%, 약 3.5 mol%, 약 3.6 mol%, 약 3.7 mol%, 약 3.8 mol%, 약 3.9 mol%, 약 4.0 mol%, 약 4.1 mol%, 약 4.2 mol%, 약 4.3 mol%, 약 4.4 mol%, 약 4.5 mol%, 약 4.6 mol%, 약 4.7 mol%, 약 4.8 mol%, 약 4.9 mol%, 또는 약 5.0 mol%의 PEG 지질(예를 들어, PEG_2k-DMG)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP에 약 0.1 mol% 내지 약 3.0 mol%의 PEG, 약 0.2 mol% 내지 약 2.5 mol%의 PEG, 약 0.5 mol% 내지 약 2.0 mol%의 PEG, 약 0.75 mol% 내지 약 1.5 mol%의 PEG, 약 1.0 mol% 내지 약 1.25 mol%의 PEG를 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 약 0.1 mol%, 약 0.2 mol%, 약 0.3 mol%, 약 0.4 mol%, 약 0.5 mol%, 약 0.6 mol%, 약 0.7 mol%, 약 0.8 mol%, 약 0.9 mol%, 약 1.0 mol%, 약 1.1 mol%, 약 1.2 mol%, 약 1.3 mol%, 약 1.4 mol%, 약 1.5 mol%, 약 1.6 mol%, 약 1.7 mol%, 약 1.8 mol%, 약 1.9 mol%, 약 2.0 mol%, 약 2.1 mol%, 약 2.2 mol%, 약 2.3 mol%, 약 2.4 mol%, 약 2.5 mol%, 약 2.6 mol%, 약 2.7 mol%, 약 2.8 mol%, 약 2.9 mol%, 또는 약 3.0 mol%의 PEG 지질(예를 들어, PEG_2k-DMG)을 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 약 1.0±0.5 mol%, 약 1.0±0.4 mol%, 약 1.0±0.3 mol%, 약 1.0±0.2 mol%, 또는 약 1.0±0.1 mol%(예를 들어, 약 1.0 mol%)의 PEG 지질(예를 들어, PEG_2k-DMG)을 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP에 약 1.0 mol%의 PEG 지질을 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계 후, 상기 공 LNP 용액(예를 들어, 상기 공 LNP)은 약 1.0 mol%, 약 1.1 mol%, 약 1.2 mol%, 약 1.3 mol%, 약 1.4 mol%, 약 1.5 mol%, 약 1.6 mol%, 약 1.7 mol%, 약 1.8 mol%, 약 1.9 mol%, 약 2.0 mol%, 약 2.1 mol%, 약 2.2 mol%, 약 2.3 mol%, 약 2.4 mol%, 약 2.5 mol%, 약 2.6 mol%, 약 2.7 mol%, 약 2.8 mol%, 약 2.9 mol%, 약 3.0 mol%, 약 3.1 mol%, 약 3.2 mol%, 약 3.3 mol%, 약 3.4 mol%, 약 3.5 mol%, 약 3.6 mol%, 약 3.7 mol%, 약 3.8 mol%, 약 3.9 mol%, 약 4.0 mol%, 약 4.1 mol%, 약 4.2 mol%, 약 4.3 mol%, 약 4.4 mol%, 약 4.5 mol%, 약 4.6 mol%, 약 4.7 mol%, 약 4.8 mol%, 약 4.9 mol%, 또는 약 5.0 mol%의 PEG 지질(예를 들어, PEG_2k-DMG)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계 후, 상기 로딩된 LNP 용액(예를 들어, 상기 로딩된 LNP)은 약 1.0 mol%, 약 1.1 mol%, 약 1.2 mol%, 약 1.3 mol%, 약 1.4 mol%, 약 1.5 mol%, 약 1.6 mol%, 약 1.7 mol%, 약 1.8 mol%, 약 1.9 mol%, 약 2.0 mol%, 약 2.1 mol%, 약 2.2 mol%, 약 2.3 mol%, 약 2.4 mol%, 약 2.5 mol%, 약 2.6 mol%, 약 2.7 mol%, 약 2.8 mol%, 약 2.9 mol%, 약 3.0 mol%, 약 3.1 mol%, 약 3.2 mol%, 약 3.3 mol%, 약 3.4 mol%, 약 3.5 mol%, 약 3.6 mol%, 약 3.7 mol%, 약 3.8 mol%, 약 3.9 mol%, 약 4.0 mol%, 약 4.1 mol%, 약 4.2 mol%, 약 4.3 mol%, 약 4.4 mol%, 약 4.5 mol%, 약 4.6 mol%, 약 4.7 mol%, 약 4.8 mol%, 약 4.9 mol%, 또는 약 5.0 mol%의 PEG 지질(예를 들어, PEG_2k-DMG)을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 약 30℃ 미만, 약 28℃ 미만, 약 26℃ 미만, 약 24℃ 미만, 약 22℃ 미만, 약 20℃ 미만, 또는 약 주변 온도 미만의 온도에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 약 30℃ 미만, 약 28℃ 미만, 약 26℃ 미만, 약 24℃ 미만, 약 22℃ 미만, 약 20℃미만, 또는 약 주변 온도 미만의 온도에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 여과, pH 조정, 완충액 교환, 희석, 투석, 농축, 동결, 동결건조, 보관, 및 포장으로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 pH 조정을 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 pH 조정은 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 및 트리스 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 완충제를 첨가하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 상기 pH 조정 전에 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 상기 pH 조정 후에 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 상기 pH 조정 전에 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 상기 pH 조정 후에 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 여과를 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 여과는 접선 유동 여과(TFF; tangential flow filtration)이다.

일부 구현예에 있어서, 상기 여과는 상기 LNP 용액으로부터 유기 용매(예를 들어, 알코올 또는 에탄올)를 제거한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 유기 용매(예를 들어, 알코올 또는 에탄올)의 제거 시, 상기 LNP 용액은 중성 pH, pH 6.5 내지 7.8, pH 6.8 내지 pH 7.5, 바람직하게는, pH 7.0 내지 pH 7.2에서 완충된 용액으로 전환된다(예를 들어, 포스페이트 또는 HEPES 완충액). 일부 구현예에 있어서, 상기 LNP 용액은 약 7.0의 pH 내지 약 7.2의 pH에서 완충된 용액으로 전환된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 생성되는 LNP 용액은, 예를 들어, 여과에 의해(예를 들어, 0.1-0.5 μm 필터를 통해) 보관 또는 사용 전에 멸균된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 완충액 교환을 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 완충액 교환은 제3 완충제를 포함하는 완충액 수용액의 첨가를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 상기 완충액 교환 전에 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제1 첨가 단계는 상기 완충액 교환 후에 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가는 상기 완충액 교환 전에 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 제2 첨가 단계는 상기 완충액 교환 후에 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 희석을 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 투석을 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 농축을 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 동결을 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 동결건조를 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결건조는 약 -100℃ 내지 약 0℃, 약 -80℃ 내지 약 -10℃, 약 -60℃ 내지 약 -20℃, 약 -50℃ 내지 약 -25℃, 또는 약 -40℃ 내지 약 -30℃의 온도에서 상기 로딩된-LNP 용액을 동결시키는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결건조는 상기 동결된 로딩된-LNP 용액을 건조시켜 동결건조된 공 LNP 또는 동결건조된 로딩된 LNP를 형성하는 것을 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 건조는 약 50 mTorr 내지 약 150 mTorr 범위의 진공에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 건조는 약 -35℃ 내지 약 -15℃에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 건조는 약 실온 내지 약 25℃에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 보관을 추가로 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 보관은 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP를 약 -80℃, 약 -78℃, 약 -76℃, 약 -74℃, 약 -72℃, 약 -70℃, 약 -65℃, 약 -60℃, 약 -55℃, 약 -50℃, 약 -45℃, 약 -40℃, 약 -35℃, 또는 약 -30℃의 온도에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 8개월, 또는 적어도 1년 동안 보관하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 보관은 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP를 약 -40℃, 약 -35℃, 약 -30℃, 약 -25℃, 약 -20℃, 약 -15℃, 약 -10℃, 약 -5℃, 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 또는 약 25℃의 온도에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 8개월, 또는 적어도 1년 동안 보관하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 보관은 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP를 약 -40℃ 내지 약 0℃, 약 -35℃ 내지 약 -5℃, 약 -30℃ 내지 약 -10℃, 약 -25℃ 내지 약 -15℃, 약 -22℃ 내지 약 -18℃, 또는 약 -21℃ 내지 약 -19℃의 온도에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 8개월, 또는 적어도 1년 동안 보관하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 보관은 상기 공 LNP 또는 상기 로딩된 LNP를 약 -20℃의 온도에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 8개월, 또는 적어도 1년 동안 보관하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 포장을 추가로 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "포장"은 최종 포장재에 넣기 전 공 LNP, 로딩된 LNP, 또는 LNP 제형의 제조 과정 중 보관 또는 약물 제품을 그 최종 상태로 보관하는 것을 지칭할 수 있다. 보관 및/또는 포장 방식은 멸균 백의 냉장, 바이알의 냉장 또는 냉동 제형, 바이알 및 시린지의 동결건조 제형 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 하기를 포함한다: iia) 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액에 동결보호제를 첨가하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 하기를 포함한다: iib) 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 여과하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 하기를 포함한다:

iia) 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액에 동결보호제를 첨가하는 단계; 및

iic) 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 여과하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 처리하는 단계는 하기 단계 중 하나 이상을 포함한다:

iib) 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액에 동결보호제를 첨가하는 단계;

iic) 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 동결건조하여 동결건조된 LNP 조성물을 형성하는 단계;

iid) 상기 동결건조된 LNP 조성물의 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액을 보관하는 단계; 및

iie) 상기 공-LNP 용액, 로딩된-LNP 용액 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물에 완충 용액을 첨가하여 LNP 제형을 형성하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계는 하기를 포함한다: iia) 상기 공-LNP 용액에 동결보호제를 첨가하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계는 하기를 포함한다: iib) 상기 공-LNP 용액을 여과하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액을 처리하는 단계는 하기를 포함한다:

iia) 상기 공-LNP 용액에 동결보호제를 첨가하는 단계; 및

iic) 상기 공-LNP 용액을 여과하는 단계.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 상기 동결건조 전에 상기 공-LNP 용액 또는 로딩된-LNP 용액에 첨가된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제(cryoprotectant)는 하나 이상의 동결보호 제제(cryoprotective agent)를 포함하며, 하나 이상의 동결보호 제제의 각각은 독립적으로 폴리올(예를 들어, 디올 또는 트리올, 예컨대, 프로필렌 글리콜(즉, 1,2-프로판디올), 1,3-프로판디올, 글리세롤, (+/-)-2-메틸-2,4-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 1,2-부탄디올, 2,3-부탄디올, 에틸렌 글리콜, 또는 디에틸렌 글리콜), 무세제 설포베타인(nondetergent sulfobetaine)(예를 들어, NDSB-201(3-(1-피리디노)-1-프로판 설포네이트), 오스모라이트(osmolyte)(예를 들어, L-프롤린 또는 트리메틸아민 N-옥사이드 디하이드레이트), 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 200(PEG 200), PEG 400, PEG 600, PEG 1000, PEG_2k-DMG, PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000, PEG 10000, PEG 20000, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 550(mPEG 550), mPEG 600, mPEG 2000, mPEG 3350, mPEG 4000, mPEG 5000, 폴리비닐피롤리돈(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 K 15), 펜타에리스리톨 프로폭실레이트, 또는 폴리프로필렌 글리콜 P 400), 유기 용매(예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO; dimethyl sulfoxide) 또는 에탄올), 당류(예를 들어, D-(+)-수크로스, D-소르비톨, 트레할로스, D-(+)-말토스 모노하이드레이트, 메조-에리스리톨, 자일리톨, 미오-이노시톨, D-(+)-라피노스 펜타하이드레이트, D-(+)-트레할로스 디하이드레이트, 또는 D-(+)-글루코스 모노하이드레이트), 또는 염(예를 들어, 리튬 아세테이트, 리튬 클로라이드, 리튬 포르메이트, 리튬 나이트레이트, 리튬 설페이트, 마그네슘 아세테이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 소듐 포르메이트, 소듐 말로네이트, 소듐 나이트레이트, 소듐 설페이트, 또는 이들의 임의의 하이드레이트), 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 수크로스를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제 및/또는 부형제는 수크로스이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 소듐 아세테이트를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제 및/또는 부형제는 소듐 아세테이트이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 동결보호제는 수크로스 및 소듐 아세테이트를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 약 10 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 25 g/L 내지 약 950 g/L, 약 50 g/L 내지 약 900 g/L, 약 75 g/L 내지 약 850 g/L, 약 100 g/L 내지 약 800 g/L, 약 150 g/L 내지 약 750 g/L, 약 200 g/L 내지 약 700 g/L, 약 250 g/L 내지 약 650 g/L, 약 300 g/L 내지 약 600 g/L, 약 350 g/L 내지 약 550 g/L, 약 400 g/L 내지 약 500 g/L, 및 약 450 g/L 내지 약 500 g/L의 농도로 존재하는 동결보호 제제를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 약 10 g/L 내지 약 500 g/L, 약 50 g/L 내지 약 450 g/L, 약 100 g/L 내지 약 400 g/L, 약 150 g/L 내지 약 350 g/L, 약 200 g/L 내지 약 300 g/L, 및 약 200 g/L 내지 약 250 g/L의 농도로 존재하는 동결보호 제제를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 약 10 g/L, 약 25 g/L, 약 50 g/L, 약 75 g/L, 약 100 g/L, 약 150 g/L, 약 200 g/L, 약 250 g/L, 약 300 g/L, 약 300 g/L, 약 350 g/L, 약 400 g/L, 약 450 g/L, 약 500 g/L, 약 550 g/L, 약 600 g/L, 약 650 g/L, 약 700 g/L, 약 750 g/L, 약 800 g/L, 약 850 g/L, 약 900 g/L, 약 950 g/L, 및 약 1000 g/L의 농도로 존재하는 동결보호 제제를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM, 약 0.5 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 2 mM 내지 약 70 mM, 약 3 mM 내지 약 60 mM, 약 4 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 6 mM 내지 약 30 mM, 약 7 mM 내지 약 25 mM, 약 8 mM 내지 약 20 mM, 약 9 mM 내지 약 15 mM, 및 약 10 mM 내지 약 15 mM의 농도로 존재하는 동결보호 제제를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.5 mM 내지 약 9 mM, 약 1 mM 내지 약 8 mM, 약 2 mM 내지 약 7 mM, 약 3 mM 내지 약 6 mM, 및 약 4 mM 내지 약 5 mM의 농도로 존재하는 동결보호 제제를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 및 약 100 mM의 농도로 존재하는 동결보호 제제를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 수크로스를 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 수크로스를 포함하는 수용액을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 약 700±300 g/L, 700±200 g/L, 700±100 g/L, 700±90 g/L, 700±80 g/L, 700±70 g/L, 700±60 g/L, 700±50 g/L, 700±40 g/L, 700±30 g/L, 700±20 g/L, 700±10 g/L, 700±9 g/L, 700±8 g/L, 700±7 g/L, 700±6 g/L, 700±5 g/L, 700±4 g/L, 700±3 g/L, 700±2 g/L, 또는 700±1 g/L의 수크로스를 포함하는 수용액을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 소듐 아세테이트 및 수크로스를 포함하는 수용액을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 하기를 포함하는 수용액을 포함한다:

(a) 약 5±1 mM, 약 5±0.9 mM, 약 5±0.8 mM, 약 5±0.5 mM, 약 5±0.6 mM, 약 5±0.5 mM, 약 5±0.4 mM, 약 5±0.3 mM, 약 5±0.2 mM, 또는 약 5±0.1 mM의 소듐 아세테이트; 및

(b) 약 700±300 g/L, 700±200 g/L, 700±100 g/L, 700±90 g/L, 700±80 g/L, 700±70 g/L, 700±60 g/L, 700±50 g/L, 700±40 g/L, 700±30 g/L, 700±20 g/L, 700±10 g/L, 700±9 g/L, 700±8 g/L, 700±7 g/L, 700±6 g/L, 700±5 g/L, 700±4 g/L, 700±3 g/L, 700±2 g/L, 또는 700±1 g/L의 수크로스.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 소듐 아세테이트 및 수크로스를 포함하는 수용액을 포함하며, 여기서 상기 수용액은 5.0±2.0, 5.0±1.5, 5.0±1.0, 5.0±0.9, 5.0±0.8, 5.0±0.7, 5.0±0.6, 5.0±0.5, 5.0±0.4, 5.0±0.3, 5.0±0.2, 또는 5.0±0.1의 pH 값을 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결보호제는 하기를 포함하는 수용액을 포함하며:

(b) 약 700±300 g/L, 700±200 g/L, 700±100 g/L, 700±90 g/L, 700±80 g/L, 700±70 g/L, 700±60 g/L, 700±50 g/L, 700±40 g/L, 700±30 g/L, 700±20 g/L, 700±10 g/L, 700±9 g/L, 700±8 g/L, 700±7 g/L, 700±6 g/L, 700±5 g/L, 700±4 g/L, 700±3 g/L, 700±2 g/L, 또는 700±1 g/L의 수크로스; 및

여기서 상기 수용액은 5.0±2.0, 5.0±1.5, 5.0±1.0, 5.0±0.9, 5.0±0.8, 5.0±0.7, 5.0±0.6, 5.0±0.5, 5.0±0.4, 5.0±0.3, 5.0±0.2, 또는 5.0±0.1의 pH 값을 갖는다.

일부 구현예에 있어서, 상기 동결건조는 적합한 유리 리셉터클(receptacle)(예를 들어, 10 mL의 원통형 유리 바이알)에서 수행된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 유리 리셉터클은 단시간에 -40℃ 미만 실온 초과의 온도의 극단적인 변화를 견디고, 및/또는 균일한 형상으로 절단될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결건조 단계는 약 -40℃ 초과의 온도에서 상기 LNP 용액을 동결시켜 동결된 LNP 용액을 형성하고; 및 상기 동결된 LNP 용액을 건조시켜 동결건조된 LNP 조성물을 형성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결건조 단계는 약 -40℃ 초과 약 -30℃ 미만의 온도에서 상기 LNP 용액을 동결시키는 것을 포함한다. 상기 동결 단계는 약 6분에 걸쳐, 바람직하게는 20℃에서 -40℃까지 분당 약 1℃씩 최종 온도까지 온도의 선형 감소를 초래한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동결 단계는 약 6분에 걸쳐 20℃에서 -40℃까지 분당 약 1℃씩 최종 온도까지 온도의 선형 감소를 초래한다. 일부 구현예에 있어서, 12-15%의 수크로스가 사용될 수 있으며, 상기 건조 단계는 약 50 mTorr 내지 약 150 mTorr 범위의 진공에서 수행된다. 일부 구현예에 있어서, 12-15%의 수크로스가 사용될 수 있으며, 상기 건조 단계는 약 50 mTorr 내지 약 150 mTorr 범위의 진공에서, 우선 약 -35℃ 내지 약 -15℃ 범위의 저온에서 수행된 후, 실온 내지 약 25℃ 범위의 더 높은 온도에서 수행된다. 일부 구현예에 있어서, 12-15%의 수크로스가 사용될 수 있고, 상기 건조 단계는 약 50 mTorr 내지 약 150 mTorr 범위의 진공에서 수행되며, 및 상기 건조 단계는 3일 내지 7일 내에 완료된다. 일부 구현예에 있어서, 12-15%의 수크로스가 사용될 수 있고, 상기 건조 단계는 약 50 mTorr 내지 약 150 mTorr 범위의 진공에서, 우선 약 -35℃ 내지 약 -15℃ 범위의 저온에서 수행된 후, 실온 내지 약 25℃ 범위의 더 높은 온도에서 수행되며, 및 상기 건조 단계는 3일 내지 7일 내에 완료된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 건조 단계는 약 50 mTorr 내지 약 100 mTorr 범위의 진공에서 수행된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 건조 단계는 약 50 mTorr 내지 약 100 mTorr 범위의 진공에서, 우선 약 -15℃ 내지 약 0℃ 범위의 저온에서 수행된 후, 더 높은 온도에서 수행된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 약 3.5 내지 약 8.0, 약 4.0 내지 약 7.5, 약 4.5 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.5, 및 약 5.5 내지 약 6.0의 pH에서 보관된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 4.5, 약 5.5, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 및 약 8.0의 pH에서 보관된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 수크로스 및 소듐 아세테이트를 포함하는 동결보호제에 보관된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH에서 약 150 g/L 내지 약 350 g/L의 수크로스 및 약 3 mM 내지 약 6 mM의 소듐 아세테이트를 포함하는 동결보호제에 보관된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 약 pH 5.0에서 약 200 g/L의 수크로스 및 5 mM의 소듐 아세테이트를 포함하는 동결보호제에 보관된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 상기 완충 용액을 첨가하기 전에 약 -80℃, 약 -78℃, 약 -76℃, 약 -74℃, 약 -72℃, 약 -70℃, 약 -65℃, 약 -60℃, 약 -55℃, 약 -50℃, 약 -45℃, 약 -40℃, 약 -35℃, 또는 약 -30℃의 온도에서 보관된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 상기 완충 용액을 첨가하기 전에 약 -40℃, 약 -35℃, 약 -30℃, 약 -25℃, 약 -20℃, 약 -15℃, 약 -10℃, 약 -5℃, 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 또는 약 25℃의 온도에서 보관된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 상기 완충 용액을 첨가하기 전에 약 -40℃ 내지 약 0℃, 약 -35℃ 내지 약 -5℃, -30℃ 내지 약 -10℃, 약 -25℃ 내지 약 -15℃, 약 -22℃ 내지 약 -18℃, 또는 약 -21℃ 내지 약 -19℃ 범위의 온도에서 보관된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 공-LNP 용액, 로딩된-LNP 용액, 또는 상기 동결건조된 LNP 조성물은 상기 완충 용액을 첨가하기 전에 약 -20℃의 온도에서 보관된다.

상기 방법의 특정한 양태는 PCT 출원 번호 WO/2020/160397에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

나노입자를 포함하는 세포 또한 본원에 기재되어 있다. 상기 세포는 상피 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 폐 세포일 수 있다. 상기 세포는 호흡기 상피 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 폐 세포, 비강 세포, 폐포 상피 세포, 또는 기관지 상피 세포일 수 있다. 상기 세포는 인간 기관지 상피(HBE) 세포일 수 있다. 상기 세포는 HeLa 세포일 수 있다. 이러한 세포는 시험관내 또는 생체내에서 LNP와 접촉될 수 있다.

약제학적 조성물 및 제형

본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 제공한다.

약제학적 조성물 또는 제형은 임의로 하나 이상의 추가적인 활성 물질, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물 또는 제형은 무균 및/또는 무-발열성(pyrogen-free)일 수 있다. 약제학적 제제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21^st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005(그 전문은 본원에 참조로 포함됨)]에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 조성물은 인간, 인간 환자 또는 대상체에 투여된다. 본 개시내용의 목적상, 어구 "활성 성분"은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 전달되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드를 포함하는 나노입자를 지칭한다.

본원에 기재된 제형 및 약제학적 조성물은 약리학 분야에서 공지되거나 이후에 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 상기 나노입자를 부형제 및/또는 하나 이상의 기타 보조 성분과 회합시킨 후, 필요하고 및/또는 바람직한 경우, 생성물을 목적하는 단일-용량 또는 다중-용량 단위로 분할, 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.

본 개시내용에 따른 약제학적 조성물 또는 제형은 단일 단위 용량으로서 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "단위 용량"은 사전결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 분리된 양을 지칭한다. 상기 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에 투여되는 활성 성분의 투여량 및/또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어, 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.

상기 활성 성분, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 및/또는 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물 중 임의의 추가적인 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 정체(identity), 크기, 및/또는 상태에 따라 달라질 수 있으며, 추가로 조성물이 투여되는 경로에 의존한다.

본원에 제공된 약제학적 조성물 및 제형의 설명은 주로 인간에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물 및 제형에 관한 것이지만, 통상의 기술자는 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 기타 동물, 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유동물에 투여하기에 적합하다는 것을 이해할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 목적하는 특정 투여 형태에 적합한, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 또는 기타 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 희석제, 과립화제 및/또는 분산제, 표면 활성화제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 결합제, 윤활제 또는 오일, 착색제, 감미제 또는 향미제, 안정화제, 항산화제, 항균제 또는 항진균제, 삼투압 조정제, pH 조정제, 완충액, 킬레이트제, 동결보호제, 및/또는 증량제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약제학적 조성물을 제형화하기 위한 다양한 부형제 및 상기 조성물을 제조하기 위한 기술은 기술분야에 공지되어 있다(문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)] 참조).

예시적인 희석제는 칼슘 또는 소듐 카르보네이트, 칼륨 포스페이트, 칼슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 포스페이트, 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 과립화제 및/또는 분산제는 전분, 전호화 전분, 또는 미세결정질 전분, 알긴산, 구아 검, 한천, 폴리(비닐-피롤리돈), (프로비돈), 가교 폴리(비닐-피롤리돈)(크로스포비돈), 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 가교 소듐 카르복시메틸 셀룰로스(크로스카멜로스), 마그네슘 알루미늄 실리케이트(VEEGUM®), 소듐 라우릴 설페이트 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 표면 활성화제 및/또는 유화제는 천연 유화제(예를 들어, 아카시아, 한천, 알긴산, 소듐 알기네이트, 트래거캔스(tragacanth), 콘드룩스(chondrux), 콜레스테롤, 잔탄(xanthan), 펙틴(pectin), 젤라틴, 난황(egg yolk), 카제인, 양모지(wool fat), 콜레스테롤, 왁스, 및 레시틴(lecithin)), 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트[TWEEN®80], 소르비탄 모노팔미테이트[SPAN®40], 글리세릴 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르(예를 들어, CREMOPHOR®), 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르[BRIJ®30]), PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 결합 제제는 전분, 젤라틴, 당류(예를 들어, 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 덱스트린, 당밀(molasses), 락토스, 락티톨, 만니톨), 아미노산(예를 들어, 글리신), 천연 및 합성 검(예를 들어, 아카시아, 소듐 알기네이트), 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

산화는 mRNA, 특히 액체 mRNA 제형의 잠재적인 분해 경로이다. 산화를 방지하기 위해, 상기 제형에 항산화제를 첨가할 수 있다. 예시적인 항산화제는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아코르빌 팔미테이트, 벤질 알코올, 부틸화 하이드록시아니솔, m-크레졸, 메티오닌, 부틸화 하이드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 소듐 또는 포타슘 메타바이설파이트, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 소듐 아스코르베이트 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 킬레이트화 제제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA; ethylenediaminetetraacetic acid), 시트르산 모노하이드레이트, 디소듐 에데테이트, 푸마르산, 말산, 인산, 소듐 에데테이트, 타르타르산, 트리소듐 에데테이트 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 항균제 또는 항진균제는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 부틸 파라벤, 벤조산, 하이드록시벤조산, 포타슘 또는 소듐 벤조에이트, 포타슘 또는 소듐 소르베이트, 소듐 프로피오네이트, 소르브산 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 보존제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아스코르브산, 부틸화 하이드록시아니솔, 에틸렌디아민, 소듐 라우릴 설페이트(SLS; sodium lauryl sulfate), 소듐 라우릴 에테르 설페이트(SLES; sodium lauryl ether sulfate) 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오티드 용액의 pH는 안정성을 개선시키기 위해 pH 5 내지 pH 8에서 유지된다. pH를 제어하기 위한 예시적인 완충액은 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트, 소듐 숙시네이트, 히스티딘(또는 히스티딘-HCl), 소듐 말레이트, 소듐 카르보네이트 등 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 활석, 맥아, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 또는 마그네슘 라우릴 설페이트 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 동결 동안 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 안정화시키기 위해 동결보호제를 함유할 수 있다. 예시적인 동결보호제는 만니톨, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 글리세롤, 덱스트로스 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 장기간(예를 들어, 36개월)의 보관 동안 동결건조된 폴리뉴클레오티드를 안정화시키기 위해, 동결건조된 폴리뉴클레오티드 제형에 증량제를 함유하여 "약제학적으로 우수한(pharmaceutically elegant)" 케이크(cake)를 산출할 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 증량제는 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 글리신, 락토스, 라피노스, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 액체 형태 또는 고체 형태일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 조성물 또는 제형은 액체 형태이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 조성물은 흡입에 적합하다. 상기 조성물은 폐관(pulmonary tract)에 투여될 수 있다. 에어로졸화된 약제학적 제형은 바람직하게는 다수의 상업적으로 이용 가능한 장치를 사용하여 폐에 전달될 수 있다.

조성물은 비강내 점적, 기관내 점적, 및 기관내 주입과 같은 적합한 방법에 의해 호흡기도에 투여될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 조성물 또는 나노입자는 비강내, 기관지내, 또는 폐 투여에 의해 투여된다. 예를 들어, 상기 조성물 및 나노입자는 분무기 또는 흡입기에 의해 투여된다.

일부 구현예에 있어서, 상기 조성물은 에어로졸화된 약제학적 제형의 흡입에 의해 폐로 전달된다. 흡입은 대상체의 코 및/또는 입을 통해 발생할 수 있다. 투여는 흡입하는 동안 상기 제형의 자가-투여에 의해, 또는 인공호흡기를 착용한 대상체에 인공호흡기를 통한 상기 제형의 투여에 의해 발생할 수 있다. 제형을 폐에 전달하기 위한 예시적인 장치는 건조 분말 흡입기, 가압 정량 흡입기(pressurized metered dose inhaler), 분무기, 및 전기수력학적 에어로졸 장치를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

액체 제형은 가압 정량 흡입기(pMDI; pressurized metered dose inhaler)를 사용하여 환자의 폐에 투여될 수 있다. pMDI는 일반적으로 적어도 하기의 2개의 구성 요소: 액체 제형이 하나 이상의 추진제(propellant)와 조합되어 압력 하에서 유지되는 캐니스터, 및 상기 캐니스터를 유지하고 작동시키는 데 사용되는 리셉터클을 포함한다. 상기 캐니스터는 상기 제형의 단일 또는 다중 용량을 함유할 수 있다. 상기 캐니스터는 상기 캐니스터의 내용물이 배출될 수 있는, 밸브, 전형적으로 정량 밸브를 포함할 수 있다. 에어로졸화된 약물은 상기 캐니스터에 힘을 가하여 이를 상기 리셉터클에 밀어 넣어 밸브를 개방하고 약물 입자가 상기 리셉터클 배출구를 통해 상기 밸브로부터 운반되도록 함으로써 pMDI로부터 분배된다. 상기 캐니스터로부터 배출되면, 상기 액체 제형이 분무되어 에어로졸을 형성한다. pMDI는 전형적으로 하나 이상의 추진제를 이용하여 상기 캐니스터의 내용물을 가압하여 상기 액체 제형을 상기 리셉터클 배출구 밖으로 밀어내어 에어로졸을 형성한다. 임의의 적합한 추진제가 활용될 수 있다. 상기 추진제는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 상기 추진제는 압축 가스 또는 액화 가스일 수 있다.

상기 액체 제형은 또한 분무기를 사용하여 투여될 수도 있다. 분무기는 상기 액체 제형을 바람직하게는 하부 호흡기도로 흡입될 수 있는, 5 미크론 질량 중앙값의 공기역학적 직경 미만의 직경을 갖는 소적(small droplet)의 박무(mist) 또는 구름(cloud)으로 전환시키는 액체 에어로졸 발생기이다. 이 과정을 무화(atomization)라고 한다. 상기 액적은 에어로졸 구름을 흡입할 때 하나 이상의 활성화제를 코, 상부 기도 또는 깊은 폐로 운반한다. 공압(제트) 분무기 및 전기역학적 분무기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 임의의 유형의 분무기가 환자에 제형을 투여하는 데 사용될 수 있다. 공압(제트) 분무기는 상기 액체 제형의 무화를 위한 원동력으로 가압 가스 공급을 사용한다. 압축 가스는 노즐 또는 제트를 통해 전달되어 주변 액체 제형을 비말동반하고(entrain) 박막 필름 또는 필라멘트로 전단하는 저압장(low pressure field)을 생성한다. 상기 필름 또는 필라멘트는 불안정하여 상기 압축 가스 유동에 의해 흡기 호흡으로 운반되는 소적으로 분해된다. 액적 플룸(droplet plume)으로 삽입된 배플(baffle)은 더 큰 액적을 선별하여 이들을 벌크 액체 보관소로 복귀시킨다. 전기역학적 분무기는 전기적으로 생성된 역학적 힘을 사용하여 액체 제형을 무화시킨다. 예를 들어, 상기 액체 제형을 초음파 주파수에서 진동시키거나, 또는 박막 필름의 작은 구멍을 통해 상기 벌크 액체를 밀어넣음으로써 전기역학적 원동력이 적용될 수 있다. 상기 힘은 소적으로 분해되는 액체 필름 또는 필라멘트 스트림을 생성하여 흡기 유동에 비말동반될 수 있는 느리게 움직이는 에어로졸 스트림을 형성한다. 액체 제형은 또한 전기수력학적(EHD; electrohydrodynamic) 에어로졸 장치를 사용하여 투여될 수도 있다. EHD 에어로졸 장치는 전기 에너지를 사용하여 액체 약물 용액 또는 현탁액을 에어로졸화한다.

건조 분말 흡입기(DPI; dry powder inhaler)는 전형적으로 가스 버스트(burst)와 같은 메커니즘을 사용하여 컨테이너 내부에 건조 분말 구름을 생성한 후, 이를 대상체가 흡입할 수 있다. DPI에서, 투여되는 용량은 가압되지 않은 건조 분말의 형태로 보관되며, 흡입기의 작동시, 대상체가 분말 입자를 흡입한다. 일부 경우에 있어서, 가압 정량 흡입기(pMDI)와 유사하게, 압축 가스(즉, 추진제)를 사용하여 분말을 분배할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 DPI는 호흡 작동식일 수 있으며, 이는 흡입에 대한 정확한 반응으로 에어로졸이 생성됨을 의미한다. 전형적으로, 건조 분말 흡입기는 기침이 유발되는 것을 회피하기 위해 흡입당 수십 밀리그램 미만의 용량을 투여한다. DPI의 예는 Turbohaler® 흡입기(Astrazeneca, Wilmington, Del.), Clickhaler® 흡입기(Innovata, Ruddington, Nottingham, UKL), Diskus® 흡입기(Glaxo, Greenford, Middlesex, UK), EasyHaler®(Orion, Expoo, FI), Exubera® 흡입기(Pfizer, New York, N.Y.), Qdose® 흡입기(Microdose, Monmouth Junction, N.J.), 및 Spiros® 흡입기(Dura, San Diego, Calif.)를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 일부 구현예에 있어서, 하나 이상의 증상의 완화에 의해 측정되는 바와 같이, 예를 들어, 결함 단백질을 보충 또는 대체하거나 목적하지 않는 단백질의 발현을 감소시키기 위한 정상 유전자 산물의 발현으로 인해 목적하는 생물학적 효과, 예를 들어, 치료적 또는 예방적 효과를 유발하기 위한 유효량으로 투여된다. 상기 제형은, 예를 들어, 호흡 및 비-호흡 상피 세포의 정단 막(apical membrane)에 LNP를 전달하기 위한 유효량으로 투여되어 페이로드를 전달할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 CF로 고통받는 환자에서 CFTR 활성 부재를 유도하거나 CF로 고통받는 환자에서 기존 잔류 CFTR 활성 수준을 증가시키기 위한 유효량으로 투여된다.

목적하는 생물학적 활성, 예를 들어, 상피 표면에서의 잔류 CFTR 활성의 존재는 표준 전기생리학적, 생화학적, 및/또는 조직화학적 기술을 포함하는, 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 검출될 수 있다. 이러한 방법은 생체내 또는 생체외 전기생리학적 기술, 땀 또는 타액 CT 농도의 측정, 또는 생체외 생화학적 또는 조직화학적 기술을 사용하여 CFTR 활성을 식별 및/또는 정량화하여 CFTR 세포 표면 밀도를 모니터링한다.

사용 방법

환자에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기재되며, 질환은 기도 세포 기능장애와 연관된다. 상기 방법은 상기 질환의 치료 또는 예방을 위해 본원에 기재된 바와 같은 핵산 페이로드를 포함하는 나노입자 또는 조성물을 상기 환자에 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 상기 페이로드는 핵산 분자, 예를 들어, mRNA 분자이고 상기 질환은 기도 상피 세포에서 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에 의해 완화된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 질환은 낭포성 섬유증이다.

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자는 이를 필요로 하는 대상체에서 세포 소듐 수준을 감소시키기 위한 방법에 사용된다.

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자는 CF와 연관된 대사산물(예를 들어, 기질 또는 생성물)의 수준을 감소시키기 위해 사용되며, 상기 방법은 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자의 유효량의 투여는 CF의 바이오마커의 수준, 예를 들어, 세포내 소듐 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자의 투여는 본원에 기재된 나노입자의 투여 후 단기간 내에 CF의 하나 이상의 바이오마커의 수준, 예를 들어, 세포내 소듐 수준의 감소를 초래한다.

일부 구현예에 있어서, 대상체에 대한 본원에 기재된 나노입자의 투여는 상기 조성물 또는 제형의 투여 전에 관찰된 수준보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 낮은 수준으로의 세포의 세포내 소듐 수준의 감소를 초래한다.

일부 구현예에 있어서, 세포를 본원에 기재된 나노입자와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드를 전달하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자의 투여는 상기 대상체의 세포에서 CFTR의 발현을 초래한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자를 투여하는 것은 상기 대상체에서 CFTR 효소 활성의 증가를 초래한다. 예를 들어, 상기 방법은 대상체의 적어도 일부 세포에서 CFTR 효소 활성의 증가를 초래할 수 있다.

일부 구현예에 있어서, 대상체에 대한 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 포함하는 본원에 기재된 나노입자의 투여는 정상 대상체, 예를 들어, CF로 고통받지 않는 인간에서 예상되는 활성 수준의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 이상의 수준으로의 세포에서 CFTR 효소 활성의 증가를 초래한다.

일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 나노입자의 투여는 상당한 클로라이드 채널 활성이 발생하도록 하기에 충분한 기간 동안 지속되는 대상체의 세포의 적어도 일부에서 CFTR 단백질의 발현을 초래한다.

일부 구현예에 있어서, 암호화된 폴리펩티드의 발현이 증가한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포로 도입될 때, 상기 세포에서의 CFTR 발현 수준을, 예를 들어, 상기 폴리펩티드가 상기 세포에 도입되기 전 상기 세포에서의 CFTR 발현 수준에 대해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 만큼 증가시킨다.

통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 본원에 개시된 스테롤 아민은 추가적인 용도를 갖는다. 예를 들어, 스테롤 아민은 염증성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 스테롤 아민은 또한 항균제로도 사용될 수도 있다.

키트 및 장치

본 개시내용은 청구된 본 개시내용의 나노입자를 편리하게 및/또는 효과적으로 사용하기 위한 다양한 키트를 제공한다. 전형적으로 키트는 사용자가 대상체(들)의 여러 치료를 수행하고 및/또는 여러 실험을 수행할 수 있도록 충분한 양 및/또는 수의 구성 요소를 포함할 것이다.

일 양태에 있어서, 본 개시내용은 본 개시내용의 나노입자를 포함하는 키트를 제공한다.

상기 키트는 제형 조성물을 형성하기 위한 포장 및 설명서 및/또는 전달제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 전달제는 식염수, 완충 용액, 리피도이드 또는 본원에 개시된 임의의 전달제를 포함할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 이러한 키트는 분무기 또는 흡입기와 같은 투여 장치를 추가로 포함한다.

호흡기 증상 개선을 위한 호흡 기능 및 기타 테스트

일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF; open reading frame)을 포함하는 mRNA를 포함하는 나노입자 또는 약제학적 조성물. 이러한 폴리펩티드 또는 단백질은 호흡 기능 또는 증상의 개선에 대해 테스트될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR) 폴리펩티드는, 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 때, 투여 후 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 또는 적어도 120시간 동안, 낭포성 섬유증 치료를 받지 않은 대상체에서 측정되는 적어도 하나의 참조 호흡량(respiratory volume)과 비교하여 적어도 하나의 호흡량 측정을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 또는 적어도 30% 만큼 개선시키기에 충분하다. 호흡량은 임의의 주어진 시간에서 폐 내에 흡기, 호기 및 저장되는 공기의 양이다. 측정될 수 있는 다양한 호흡량의 비-제한적인 예가 하기에 제공된다.

총 폐용량(TLC; total lung capacity)은 VC와 RV의 합인, 최대 팽창 시 폐의 부피이다. 평균 총 폐용량은 6000 ml이지만, 이는 연령, 키, 성별 및 건강 상태에 따라 다르다.

일회 호흡량(TV; tidal volume)은 조용히 호흡하는 동안 폐로 들어오거나 나가는 공기량이다(TV는 폐의 세분화(subdivision)를 나타내며; 가스 교환 계산에서와 같이, 일회 호흡량을 정확하게 측정할 때, 기호 TV 또는 VT가 사용됨). 평균 일회 호흡량은 500 ml이다.

잔기량(RV; residual volume)은 최대 호기 후 폐에 잔류하는 공기량이다. 잔기량(RV/TLC%)은 TLC의 백분율로 표현된다.

예비 호기량(ERV; expiratory reserve volume)은 강제로 숨을 내쉬는 동안 호기될 수 있는 최대 공기량(일회 호흡량 초과)이다.

예비 흡기량(IRV; inspiratory reserve volume)은 흡기말(end-inspiratory) 위치로부터 흡기될 수 있는 최대량이다.

흡기 용량(IC; inspiratory capacity)은 IRV와 TV의 합이다.

흡기 폐활량(IVC; inspiratory vital capacity)은 최대 호기 시점부터 흡기되는 최대 공기량이다.

폐활량(VC; vital capacity)은 가장 깊은 흡기 후 내쉬는 공기량이다.

기능성 잔기 용량(FRC; functional residual capacity)은 호기말(end-expiratory) 위치에서 폐의 부피이다.

강제 폐활량(FVC; forced vital capacity)은 최대 강제 호기 노력으로부터 결정된 폐활량이다.

강제 호기량(시간)(FEV_t; forced expiratory volume)은 처음 t초 동안 강제 조건 하에서 호기되는 공기량을 나타내는 일반적인 용어이다. FEV₁은 1초의 강제 호기 말에서 방출된 양이다. FEF_x는 FVC 곡선의 일부 부분과 관련된 강제 호기 유량(forced expiratory flow)이며; 수식자(modifier)는 이미 호기된 FVC의 양을 지칭한다. FEF_최대는 FVC 동작(maneuver) 동안 달성되는 최대 순간 유량이다.

강제 흡기 유량(FIF; forced inspiratory flow)은 강제 호기 곡선에 대한 것과 유사한 명명법으로 표시되는, 강제 흡기 곡선의 특정한 측정이다. 예를 들어, 최대 흡기 유량은 FIF_최대로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한, 양 한정자(volume qualifier)는 측정 시점에서 RV로부터 흡기된 양을 나타낸다.

최대 호기 유량(PEF; peak expiratory flow)은 최대 유량계로 측정한 최고 강제 호기 유량이다.

최대 자발성 환기량(MVV; Maximal Voluntary Ventilation)은 최대 노력을 반복하는 동안 지정된 기간에 방출된 공기량이다.

합성

통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 그 염 및 입체이성질체를 포함하는, 본원에 제공된 화합물은 공지된 유기 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 임의의 수많은 가능한 합성 경로, 예컨대, 하기 스킴에 제공된 경로에 따라 합성될 수 있다.

본원에 기재된 화합물을 제조하기 위한 반응은 유기 합성 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있는 적합한 용매에서 수행될 수 있다. 적합한 용매는 반응이 수행되는 온도(예를 들어, 용매의 어는점 내지 용매의 끓는점 범위일 수 있는 온도)에서 출발 물질(반응물), 중간체, 또는 생성물과 실질적으로 비-반응성일 수 있다. 주어진 반응은 하나의 용매 또는 하나 초과의 용매의 혼합물에서 수행될 수 있다. 특정 반응 단계에 따라, 특정 반응 단계에 적합한 용매는 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 표현 "주변 온도" 또는 "실온" 또는 "rt"는 기술분야에서 이해되며, 일반적으로 온도, 예를 들어, 반응 온도, 즉, 반응이 수행되는 실온의 대략적인 온도, 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도를 지칭한다.

본원에 기재된 화합물의 제조는 다양한 화학적 기의 보호 및 탈보호를 수반할 수 있다. 보호 및 탈보호의 필요성 및 적절한 보호기의 선택은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 보호기의 화학은, 예를 들어, 문헌 [T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., Wiley & Sons, Inc., New York(1999)]에서 찾을 수 있다.

반응은 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 따라 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 생성물 형성은 핵 자기 공명 분광법(예를 들어, ¹H 또는 ¹³C), 적외선 분광법, 분광광도법(예를 들어, UV-가시광선), 질량 분석법과 같은 분광학적 수단에 의해, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LCMS; liquid chromatography-mass spectroscopy), 또는 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography)와 같은 크로마토그래피 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 화합물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 정상 실리카 크로마토 그래피(normal phase silica chromatography)를 포함하는, 다양한 방법에 의해 통상의 기술자에 의해 정제될 수 있다.

화학식 A2a의 화합물은, 예를 들어, 하기 스킴에 예시된 바와 같은 과정을 사용하여 제조할 수 있다:

스킴 1

화학식 A2a의 화합물은 스킴 1에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 콜레스테릴 클로로포르메이트와 아민 사이의 적절한 반응은 화학식 A2a의 화합물을 생성하기에 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다.

스킴 2

화학식 A2a의 화합물은 스킴 2에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체(예컨대, 스티그마스테롤)와 4-나이트로페닐 클로로포르메이트 사이의 적절한 반응은 적합한 조건(예컨대, 트리에틸아민 및 4-디메틸아미노피리딘 사용) 하에서 수행될 수 있다. 상기 반응의 생성물은 적합한 조건(예컨대, 트리에틸아민 사용) 하에서 아민과 반응하여 화학식 A2a의 화합물을 제공할 수 있다.

스킴 3

화학식 A2a의 화합물은 스킴 3에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체(예컨대, 스티그마스테롤)와 카르복실산 사이의 적절한 반응은 적합한 조건 하에 활성화 시약(예컨대, 예를 들어, EDC-HCl, DMAP, DCC, 또는 피발산 무수물)의 존재 하에 수행되어 화학식 A2a의 화합물을 제공할 수 있다.

스킴 4

화학식 A2a의 화합물은 스킴 4에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 콜레스테롤 헤미숙시네이트 또는 콜레스테롤 유도체 헤미숙시네이트와 활성화제 사이의 적절한 반응은 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다. 상기 반응의 생성물은 적합한 조건 하에서 아민과 반응하여 화학식 A2a의 화합물을 제공할 수 있다.

스킴 5

화학식 A2a의 화합물은 스킴 5에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 콜레스테릴 클로로포르메이트와 에탄-1,2-디아민 사이의 적절한 반응은 적합한 조건 하에서 수행되어 SA22를 제공할 수 있다. SA22는 적합한 조건 하에서 2-(메틸티오)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸 하이드로아이오다이드와 반응하여 화학식 A2a의 화합물을 제공할 수 있다. SA22는 또한 적합한 조건 하에서 디메틸 스쿠아레이트와 반응할 수 있으며, 반응의 생성물은 적합한 조건 하에서 2차 아민과 추가로 반응하여 화학식 A2a의 화합물을 제공할 수 있다.

스킴 6

화학식 A2a의 화합물은 스킴 6에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 아미노알킬 카르바메이트와 구아니디닐화제 사이의 적절한 반응은 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다. 상기 반응의 생성물은 적합한 조건 하에서 HCl과 반응하여 화학식 A2a의 화합물을 제공할 수 있다.

스킴 7

화학식 A2a의 화합물에 대한 전구체는 스킴 7에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체(예컨대, 스티그마스테롤) 사이의 적절한 반응은 적합한 조건(예컨대, 트리에틸아민 및 4-디메틸아미노피리딘 사용) 하에서 수행될 수 있다. 상기 반응의 생성물은 적합한 조건(예컨대, 트리에틸아민 사용) 하에서 아민과 반응하여 화학식 A2a의 화합물에 대한 전구체를 제공할 수 있다.

스킴 8

화학식 A2a의 화합물에 대한 전구체는 스킴 8에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체(예컨대, 스티그마스테롤)와 boc-헤미에스테르 사이의 적절한 반응은 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다. 상기 반응의 생성물은 적합한 조건 하에서 반응하여 화학식 A2a의 화합물에 대한 전구체를 제공할 수 있다.

스킴 9

화학식 A2a의 화합물의 합성을 위한 중간체는 스킴 9에 요약된 합성 경로를 통해 제조할 수 있다. 스페르미딘 또는 스페르민과 (E)-N-((tert-부톡시카르보닐)옥시)벤즈이미도일 시아나이드(BOC-ON) 사이의 적절한 반응은 적합한 조건 하에서 수행되어 화학식 A2a의 화합물의 합성을 위한 중간체를 제공할 수 있다.

정의

본 개시내용을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정한 용어를 우선 정의한다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 본원에 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기 용어의 각각은 하기에 기술된 의미를 가질 것이다. 추가적인 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 기술된다.

본 개시내용은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 이용되거나, 또는 다르게는 이와 관련되는 구현예를 포함한다. 본 개시내용은 하나 초과의 그룹 구성원 또는 모든 그룹 구성원이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 이용되거나, 또는 다르게는 이와 관련되는 구현예를 포함한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 용어 "a"(또는 "an") 뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 특정한 양태에 있어서, 용어 "a" 또는 "an"은 "단일"을 의미한다. 다른 양태에 있어서, 용어 "a" 또는 "an"은 "둘 이상" 또는 "여러"를 포함한다.

또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것이 존재하거나 존재하지 않는 2개의 특정 특징 또는 구성 요소 각각의 특정한 개시내용으로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 양태의 각각: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)을 포괄하도록 의도된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]는 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.

양태가 언어 "포함하는"으로 본원에 기재되는 경우, 다르게는 "~로 이루어지는" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어지는"의 측면으로 기재되는 유사한 양태 또한 제공된다.

단위, 접두사, 및 기호는

허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 값의 범위가 인용되는 경우, 해당 범위의 인용된 상한 및 하한 사이의 각각의 중간 정수 값 및 그 각각의 분획이 또한 이러한 값들 사이의 각각의 하위범위와 함께 구체적으로 개시된다는 것을 이해해야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 상기 범위에 포함되거나 상기 범위로부터 배제될 수 있으며, 어느 하나가 포함되거나, 둘 다 포함되지 않거나, 또는 둘 모두 포함되는 각각의 범위 또한 본 개시내용 내에 포괄된다. 값이 명시적으로 인용된 경우, 인용된 값과 대략 동일한 양(quantity) 또는 양(amount)인 값 또한 본 개시내용의 범위 내에 존재하는 것으로 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 해당 조합 요소의 각각의 하위조합 또한 구체적으로 개시되며, 본 개시내용의 범위 내에 존재한다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소 군이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합 또한 개시된다. 본 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과 임의의 조합으로 배제되는 본 개시내용의 예 또한 본원에 개시되며; 본 개시내용의 하나 초과의 요소가 이러한 배제를 가질 수 있고, 이러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합이 본원에 개시된다.

약: 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 수치와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 통상의 기술자에게 친숙하고 허용 가능한 정확성의 구간을 표시한다. 이러한 정확도의 구간은 ± 10%이다.

범위가 주어지는 경우, 엔드포인트가 포함된다. 또한, 달리 나타나거나 또는 달리 문맥 및 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로 표현되는 값들은 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 본 개시내용의 상이한 구현예에서 언급된 범위 내에서 임의의 특정 값 또는 하위범위를 범위의 하한 단위의 10분의 1까지 가정할 수 있음을 이해해야 한다.

병용 투여: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "병용 투여(administered in combination)" 또는 "병용 투여(combined administration)"는 둘 이상의 제제가 동시에 또는 환자에 대한 각각의 제제의 효과의 중첩이 존재하도록 하는 간격 내에서 대상체에 투여됨을 의미한다. 일부 구현예에 있어서, 이들은 서로 약 60분, 30분, 15분, 10분, 5분, 또는 1분 이내에 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 제제의 투여는 조합적(예를 들어, 상승적) 효과가 달성되도록 함께 충분히 근접한 간격이다.

동물: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비-인간 동물을 지칭한다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 비-인간 동물은 포유동물(예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 또는 돼지)이다. 일부 구현예에 있어서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및 벌레를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 동물은 트랜스이식(transgenic) 동물, 유전자-조작된 동물, 또는 클론이다.

대략: 본원에 사용된 바와 같은, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 바와 같은, 용어 "대략"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정한 구현예에 있어서, 용어 "대략"은 달리 언급되지 않거나 달리 문맥상 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한 방향으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 이내에 속하는 범위의 값(초과 또는 미만)을 지칭한다(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).

화합물: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "화합물"은 도시된 구조의 모든 입체이성질체 및 동위원소를 포함하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "입체이성질체"는 화합물의 임의의 기하 이성질체(예를 들어, 시스- 및 트랜스-이성질체), 거울상이성질체, 또는 부분입체이성질체를 의미한다. 본 개시내용은 입체이성질체적으로 순수한 형태(예를 들어, 기하학적으로 순수, 거울상이성질체적으로 순수, 또는 부분입체이성질체적으로 순수) 및 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물, 예를 들어, 라세미체를 포함하는, 본원에 기재된 화합물의 임의의 모든 입체이성질체를 포괄한다. 화합물의 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물 및 이들을 이들의 성분 거울상이성질체 또는 입체이성질체로 분해하는 수단은 공지되어 있다. "동위원소"는 동일한 원자 번호를 갖지만 핵의 중성자 수가 상이하여 상이한 질량 수를 갖는 원자를 지칭한다. 예를 들어, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소를 포함한다. 또한, 본 개시내용의 화합물, 염, 또는 복합체는 용매 또는 물 분자와 조합하여 제조되어 통상적인 방법에 의해 용매화물 및 수화물을 형성할 수 있다.

접촉시키는: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "접촉시키는"은 둘 이상의 개체 사이에 물리적 연결을 확립하는 것을 의미한다. 예를 들어, 포유동물 세포를 나노입자 조성물과 접촉시키는 것은 상기 포유동물 세포 및 나노입자가 물리적인 연결을 공유하도록 하는 것을 의미한다. 생체내 및 생체외 모두에서 세포를 외부 개체와 접촉시키는 방법은 생물학 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 나노입자 조성물 및 포유동물 내에 배치된 포유동물 세포를 접촉시키는 것은 다양한 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내, 및 피하)에 의해 수행될 수 있으며, 다양한 양의 나노입자 조성물을 수반할 수 있다. 또한, 하나 초과의 포유동물 세포가 나노입자 조성물에 의해 접촉될 수 있다. 접촉의 추가 예는 나노입자와 양이온제 사이이다. 나노입자와 양이온제를 접촉시키는 것은 상기 나노입자의 표면이 상기 양이온제와 물리적으로 연결되어 상기 양이온제가 상기 나노입자와 비-결합 상호작용을 형성할 수 있음을 의미할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 나노입자와 양이온제를 접촉시키는 것은, 예를 들어, 상기 나노입자의 표면에서 시작하여 상기 양이온제를 상기 나노입자에 삽입한다. 일부 구현예에 있어서, 용어 "적층", "코팅", 및 "후첨가" 및 "첨가"는 나노입자를 양이온제와 접촉시키는 것과 관련하여 "접촉시키는"을 의미하는 데 사용될 수 있다.

전달하는: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "전달하는"은 목적지에 개체를 제공하는 것을 의미한다. 예를 들어, 대상체에 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것은 상기 대상체에 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자 조성물을 (예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내, 또는 피하 경로에 의해) 투여하는 것을 수반할 수 있다. 포유동물 또는 포유동물 세포에 대한 나노입자 조성물의 투여는 하나 이상의 세포를 상기 나노입자 조성물과 접촉시키는 것을 수반할 수 있다.

전달제: 본원에 사용된 바와 같은, "전달제"는 표적 세포에 대한 폴리뉴클레오티드의 생체내, 시험관내, 또는 생체외 전달을, 적어도 부분적으로, 용이하게 하는 임의의 물질을 지칭한다.

부분입체이성질체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "부분입체이성질체"는 서로 거울상이 아니고 서로 중첩될 수 없는(non-superimposable) 입체이성질체를 의미한다.

배치된: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "배치된"은 분자와 나노입자가 서로 접촉한 후에 상기 분자가 상기 나노입자와의 비-결합 상호작용을 형성함을 의미한다.

투여 레지멘: 본원에 사용된 바와 같은, "투여 레지멘" 또는 "투여 레지멘"은 투여 일정 또는 의사가 결정한 치료, 예방, 또는 완화 처치 레지멘이다.

유효량: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 제제의 "유효량"은 유익한 또는 목적하는 결과, 예를 들어, 임상 결과를 달성하기에 충분한 양이며, 따라서, "유효량"은 그것이 적용되는 문맥에 따라 달라진다. 예를 들어, 단백질 결핍(예를 들어, CFTR 결핍)을 치료하는 제제를 투여하는 문맥에서, 제제의 유효량은, 예를 들어, 제제의 투여 없이 관찰되는 증상의 중증도와 비교하여, CFTR 결핍과 연관된 징후 및 증상을 개선, 감소, 제거, 또는 예방하기에 충분한 CFTR을 발현하는 mRNA의 양이다. 용어 "유효량"은 "유효 용량", "치료적 유효량", 또는 "치료적 유효 용량"과 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.

거울상이성질체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 " 거울상이성질체"는 광학 순도 또는 거울상이성질체 과량(기술분야의 표준 방법에 의해 결정됨)이 적어도 80%(즉, 적어도 90%의 하나의 거울상이성질체 및 최대 10%의 기타 거울상이성질체), 적어도 90%, 또는 적어도 98%인, 본 개시내용의 화합물의 각각의 개별적인 광학 활성 형태를 의미한다.

캡슐화: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "캡슐화"는 에워싸거나(enclose), 둘러싸거나(surround) 또는 감싸는(encase) 것을 의미한다.

캡슐화 효율: 본원에 사용된 바와 같은, "캡슐화 효율"은 나노입자 조성물의 제조에 사용되는 폴리뉴클레오티드의 초기 총량에 대한, 나노입자 조성물의 일부가 되는 폴리뉴클레오티드의 양을 지칭한다. 예를 들어, 조성물에 초기에 제공되는 총 100 mg의 폴리뉴클레오티드 중 97 mg의 폴리뉴클레오티드가 나노입자 조성물에 캡슐화되는 경우, 캡슐화 효율은 97%로 주어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "캡슐화"는 완전, 실질적, 또는 부분적인 에워쌈, 봉입(confinement), 둘러쌈(surrounding), 또는 감쌈을 지칭할 수 있다.

상피 세포: 본원에 사용된 바와 같은, "상피 세포"는 상피로부터 유래된 세포를 포함한다. 예시적인 상피 세포는 호흡기 상피 세포, 비강 상피 세포, 폐포 상피 세포, 폐 상피 세포, 또는 기관지 상피 세포이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 상피 세포는 인간 기관지 상피(HBE) 세포이다. 일부 구현예에 있어서, 상피 세포는 시험관내 세포이다. 일부 구현예에 있어서, 상피 세포는 생체내 세포이다.

발현: 본원에 사용된 바와 같은, 핵산 서열의 "발현"은 하기 이벤트 중 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터의 mRNA 주형의 생성(예를 들어, 전사에 의해); (2) mRNA 전사체의 처리(예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 단부 처리에 의해); (3) 폴리펩티드 또는 단백질로의 mRNA의 번역; 및 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형.

생체외: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "생체외"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물, 또는 미생물 또는 이들의 세포 또는 조직) 외부에서 발생하는 이벤트를 지칭한다. 생체외 이벤트는 자연(예를 들어, 생체내) 환경으로부터 최소한으로 변경된 환경에서 일어날 수 있다.

헬퍼 지질: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "헬퍼 지질"은 지질 모이어티(지질 층, 예를 들어, 지질 이중층을 삽입하기 위함) 및 극성 모이어티(지질 층의 표면에서 생리학적 용액과의 상호작용을 위함)를 포함하는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 전형적으로 상기 헬퍼 지질은 인지질이다. 상기 헬퍼 지질의 기능은 아미노 지질을 "보완"하고 이중층의 융합원성(fusogenicity)을 증가시키고 및/또는 예를 들어, 세포에 전달되는 핵산의 엔도솜 탈출을 용이하게 하는 것을 돕는 것이다. 헬퍼 지질은 또한 LNP 표면에 대한 핵심 구조적 구성 요소로 여겨진다.

시험관내: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "시험관내"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물, 또는 미생물) 이내 보다는 인공 환경, 예를 들어, 시험관(test tube) 또는 반응 용기 내, 세포 배양물 내, 페트리 접시 내 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.

생체내: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "생체내"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물, 또는 미생물 또는 이들의 세포 또는 조직) 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.

이온화 가능한 아미노 지질: 용어 "이온화 가능한 아미노 지질"은 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH-적정 가능한 아미노 헤드기(예를 들어, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 헤드기)를 갖는 지질을 포함한다. 이온화 가능한 아미노 지질은 전형적으로 아미노 헤드기의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(즉, 양으로 하전됨)되고 pKa 초과의 pH에서는 실질적으로 하전되지 않는다. 이러한 이온화 가능한 아미노 지질은 DLin-MC3-DMA(MC3) 및 (13Z,165Z)-N,N-디메틸-3-노니도코사-13-16-디엔-1-아민(L608)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이성질체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이성질체"는 본 개시내용의 임의의 화합물의 임의의 호변이성질체, 입체이성질체, 거울상이성질체, 또는 부분입체이성질체를 의미한다. 본 개시내용의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 결합을 가질 수 있으며, 따라서, 입체이성질체, 예컨대, 이중-결합 이성질체(즉, 기하 E/Z 이성질체) 또는 부분입체이성질체(예를 들어, 거울상이성질체(즉, (+) 또는 (-)) 또는 시스/트랜스 이성질체)로서 존재할 수 있다. 본 개시내용에 따르면, 본원에 도시된 화학 구조 및 따라서 본 개시내용의 화합물은 상응하는 모든 입체이성질체, 즉, 입체이성질체적으로 순수한 형태(예를 들어, 기하학적으로 순수, 거울상이성질체적으로 순수, 또는 부분입체이성질체적으로 순수함) 및 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물, 예를 들어, 라세미체 모두를 포괄한다. 본 개시내용의 화합물의 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물은 전형적으로 공지된 방법, 예컨대, 키랄-상 가스 크로마토그래피, 키랄-상 고성능 액체 크로마토그래피, 키랄 염 복합체로서의 화합물의 결정화, 또는 키랄 용매에서의 화합물의 결정화에 의해 그 성분 거울상이성질체 또는 입체이성질체로 분해될 수 있다. 거울상이성질체 및 입체이성질체는 또한 공지된 비대칭 합성 방법에 의해 입체이성질체적 또는 거울상이성질체적으로 순수한 중간체, 시약, 및 촉매로부터 수득될 수 있다.

지질 나노입자 코어: 본원에 사용된 바와 같은, 지질 나노입자 코어는 추가적인 성분의 후첨가 층이, 예컨대, 양이온제 및/또는 PEG-지질 또는 기타 지질로서 첨가될 수 있는 지질 나노입자이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 지질 나노입자 코어는 하기를 포함한다: (i) 이온화 가능한 지질, (ii) 인지질, (iii) 구조적 지질, 및 (iv) 임의로 PEG-지질. 추가 구현예에 있어서, 상기 지질 나노입자 코어는 하기를 포함한다: (i) 이온화 가능한 지질, (ii) 인지질, (iii) 구조적 지질, 및 (iv) PEG-지질.

링커: 본원에 사용된 바와 같은, "링커"는 원자단, 예를 들어 10-1,000개의 원자를 지칭하며, 원자 또는 기, 예컨대, 비제한적으로, 탄소, 아미노, 알킬아미노, 산소, 황, 설폭사이드, 설포닐, 카르보닐, 및 이민으로 구성될 수 있다. 상기 링커는 제1 단부에서 핵염기 또는 당 모이어티 상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에, 및 제2 단부에서 페이로드, 예를 들어, 검출제 또는 치료제에 부착될 수 있다. 상기 링커는 핵산 서열로의 혼입을 방해하지 않도록 충분한 길이일 수 있다. 상기 링커는 임의의 유용한 목적을 위해, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 다량체(예를 들어, 2개 이상의 키메라 폴리뉴클레오티드 분자 또는 IVT 폴리뉴클레오티드의 연결을 통해) 또는 폴리뉴클레오티드 접합체를 형성하기 위해서 뿐만 아니라 페이로드를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 상기 링커로 혼입될 수 있는 화학적 기의 예는 본원에 기재된 바와 같이, 각각 임의로 치환될 수 있는, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아미도, 아미노, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 아릴, 또는 헤테로사이클릴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 링커의 예는 불포화 알칸, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜 단량체 단위, 예를 들어, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 또는 테트라에틸렌 글리콜), 및 덱스트란 중합체 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 예는 상기 링커 내 절단 가능한 모이어티, 예컨대, 예를 들어, 환원제 또는 광분해를 사용하여 절단될 수 있는, 디설파이드 결합(-S-S-) 또는 아조 결합(-N=N-)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선택적으로 절단 가능한 결합의 비-제한적 예는, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP; tris(2-carboxyethyl)phosphine), 또는 기타 환원제, 및/또는 광분해의 사용에 의해 절단될 수 있는 아미도 결합뿐만 아니라, 예를 들어, 산성 또는 염기성 가수분해에 의해 절단될 수 있는 에스테르 결합을 포함한다.

폐 세포: 본원에 사용된 바와 같은, "폐 세포"는 폐로부터 유래된 세포를 포함한다. 폐 세포는, 예를 들어, 폐 상피 세포, 기도 기저 세포, 세기관지 외분비 세포(bronchiolar exocrine cell), 폐 신경내분비 세포, 폐포 세포, 또는 기도 상피 세포일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 폐 세포는 시험관내 세포이다. 일부 구현예에 있어서, 폐 세포는 생체내 세포이다.

투여 방법: 본원에 사용된 바와 같은, "투여 방법"은 대상체에 조성물을 전달하는 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 기타 방법을 포함할 수 있다. 투여 방법은 신체의 특정 영역 또는 시스템으로 전달을 표적화(예를 들어, 특이적으로 전달)하도록 선택될 수 있다

용어 "핵산"은, 가장 넓은 의미에서, 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 이러한 중합체는 종종 폴리뉴클레오티드로 지칭된다. 본 개시내용의 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 리보핵산(RNA; ribonucleic acid), 데옥시리보핵산(DNA; deoxyribonucleic acid), 트레오스 핵산(TNA; threose nucleic acid), 글리콜 핵산(GNA; glycol nucleic acid), 펩티드 핵산(PNA; peptide nucleic acid), 잠금 핵산(LNA; locked nucleic acid, β-D-리보 형태를 갖는 LNA, α-L-리보 형태를 갖는 α-LNA(LNA의 부분입체이성질체), 2'-아미노 기능화를 갖는 2'-아미노-LNA, 및 2'-아미노 기능화를 갖는 2'-아미노-α-LNA), 에틸렌 핵산(ENA; ethylene nucleic acid), 사이클로헥세닐 핵산(CeNA; cyclohexenyl nucleic acid) 또는 이들의 하이브리드 또는 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

환자: 본원에 사용된 바와 같은, "환자"는 치료를 추구할 수 있거나 치료를 필요로 하거나, 치료를 요구하거나, 치료를 받고 있거나, 치료를 받을 대상체, 또는 특정 질환 또는 병태에 대해 숙련된 전문가의 보살핌을 받는 대상체를 지칭한다.

CFTR 연관 질환: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CFTR-연관 질환" 또는 "CFTR-연관 장애"는 각각, 비정상적인 CFTR 활성(예를 들어, 활성 감소 또는 활성 증가)으로 인해 발생하는 질환 또는 장애를 지칭한다. 비-제한적 예로서, 낭포성 섬유증은 CFTR 연관 질환이다. 낭포성 섬유증의 수많은 임상적 변이가 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, www.omim.org/entry/219700을 참조한다.

용어 "CFTR 효소 활성", "CFTR 활성", 및 "낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자 활성"은 본 개시내용에서 상호교환 가능하게 사용되며, 세포 막을 통해 클로라이드 이온을 수송하는 CFTR의 능력을 지칭한다. 따라서, CFTR 효소 활성 또는 CFTR 활성을 보유하거나 갖는 단편 또는 변이체는 세포 막을 걸쳐 측정 가능한 클로라이드 수송을 갖는 단편 또는 변이체를 지칭한다.

약제학적으로 허용 가능한: 어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익/위험 비에 상응하는, 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에서 이용된다.

약제학적으로 허용 가능한 부형제: 본원에 사용된 바와 같은, 어구 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 본원에 기재된 화합물 이외의 임의의 성분(예를 들어, 활성 화합물을 현탁 또는 용해시킬 수 있는 비히클)을 지칭하며, 환자에서 실질적으로 무독성 및 비-염증성인 특성을 갖는다. 부형제는, 예를 들어, 하기를 포함할 수 있다: 유착-방지제(antiadherent), 산화방지제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료(색소), 연화제(emollient), 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 향료, 방향제, 활택제(유동 향상제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미료, 및 수화수(waters of hydration). 예시적인 부형제는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT; butylated hydroxytoluene), 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트(이염기성), 칼슘 스테아레이트, 크로스카멜로스, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미세결정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전호화 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 이산화 규소, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소듐 시트레이트, 소듐 전분 글리콜레이트, 소르비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 수크로스, 활석, 이산화 티타늄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 및 자일리톨.

약제학적으로 허용 가능한 염: 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용 가능한 염"은 기존 산 또는 염기 모이어티를 그 염 형태로 전환시킴으로써 (예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기 산과 반응시킴으로써) 모 화합물이 변형된 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 염의 예는 염기성 잔기, 예컨대, 아민의 무기 또는 유기산 염; 산성 잔기, 예컨대, 카르복실산의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 대표적인 산 부가 염은 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠 설폰산, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등뿐만 아니라 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다. 본 개시내용의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 무독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된, 모 화합물의 통상적인 무독성 염을 포함한다. 본 개시내용의 약제학적으로 허용 가능한 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 중 또는 유기 용매 중, 또는 그 둘의 혼합물 중 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토나이트릴과 같은 비수성 매질이 사용된다. 적합한 염의 목록은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl 및 C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, 및 Berge 등, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19(1977)]에서 발견되며, 이들의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "용매화물"은 적합한 용매의 분자가 결정 격자에 혼입된 본 개시내용의 화합물을 의미한다. 적합한 용매는 투여되는 투여량에서 생리학적으로 허용된다. 예를 들어, 용매화물은 유기 용매, 물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액으로부터 결정화, 재결정화, 또는 침전에 의해 제조될 수 있다. 적합한 용매의 예는 에탄올, 물(예를 들어, 모노-, 디-, 및 트리-하이드레이트), N-메틸피롤리디논(NMP; N-methylpyrrolidinone), 디메틸 설폭사이드(DMSO; dimethyl sulfoxide), N,N'-디메틸포름아미드(DMF; N,N'-dimethylformamide), N,N'-디메틸아세트아미드(DMAC; N,N'-dimethylacetamide), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMEU; 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone), 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2-(1H)-피리미디논(DMPU; 1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-(1H)-pyrimidinone), 아세토나이트릴(ACN; acetonitrile), 프로필렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 2-피롤리돈, 벤질 벤조에이트 등이다. 물이 용매일 때, 용매화물은 "하이드레이트"로 지칭된다.

폴리뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 분자의 1차 구조를 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 데옥시리보핵산("DNA")뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 리보핵산("RNA")을 포함한다. 이는 또한, 예를 들어, 알킬화에 의해 및/또는 캡핑에 의해 변형 및 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 보다 특히, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스를 함유함), 스플라이싱 또는 스플라이싱되지 않는지 여부에 관계 없이, tRNA, rRNA, hRNA, siRNA 및 mRNA를 포함하는, 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스를 함유함), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 기타 유형의 폴리뉴클레오티드, 및, 예를 들어, 폴리아미드(예를 들어, 펩티드 핵산 "PNA") 및 폴리모르폴리노 중합체와 같은 비뉴클레오티드 백본(normucleotidic backbone)을 함유하는 기타 중합체, 및 중합체가 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같이, 염기 쌍형성 및 염기 스택킹을 가능하게 하는 형태로 핵염기를 함유하는 경우의 기타 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함한다. 특정 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 mRNA를 포함한다. 다른 양태에 있어서, 상기 mRNA는 합성 mRNA이다. 일부 양태에 있어서, 상기 합성 mRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 양태에 있어서, 특정한 부류의 모든 핵염기는 비천연 핵염기로 대체되었다(예를 들어, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 내 모든 우리딘은 비천연 핵염기, 예를 들어, 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있음). 일부 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 합성 RNA 또는 합성 DNA)는 단지 천연 핵염기, 즉, 합성 DNA의 경우 A(아데노신), G(구아노신), C(시티딘), 및 T(티미딘)를 포함하거나, 또는 합성 RNA의 경우 A, C, G, 및 U(우리딘)만을 포함한다.

통상의 기술자는 본원에 개시된 코돈 맵의 T 염기는 DNA에 존재하는 반면, 상기 T 염기는 상응하는 RNA에서 U 염기에 의해 대체될 것임을 인지할 것이다. 예를 들어, 벡터 또는 시험관내 번역(IVT; in-vitro translation) 주형과 같은, 예를 들어, DNA 형태의 본원에 개시된 코돈-뉴클레오티드 서열은 그 T 염기가 그 상응하는 전사된 mRNA에서 U 염기로서 전사되게 할 것이다. 이러한 점에서, 코돈-최적화된 DNA 서열(T를 포함함) 및 그 상응하는 mRNA 서열(U를 포함함) 둘 모두 본 개시내용의 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열로 간주된다. 통상의 기술자는 또한 동등한 코돈-맵이 하나 이상의 염기를 비-천연 염기로 대체함으로써 생성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, TTC 코돈(DNA 맵)은 UUC 코돈(RNA 맵)에 상응할 것이며, 이는 결국 ΨΨC 코돈(U가 슈도우리딘으로 대체된 RNA 맵)에 상응할 것이다.

표준 A-T 및 G-C 염기 쌍은 각각, 티미딘의 N3-H 및 C4-옥시와 아데노신의 N1 및 C6-NH2 사이, 및 각각, 시티딘의 C2-옥시, N3 및 C4-NH2와 구아노신의 C2-NH2, N'-H 및 C6-옥시 사이의 수소 결합의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 형성된다. 따라서, 예를 들어, 구아노신(2-아미노-6-옥시-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)은 변형되어 이소구아노신(2-옥시-6-아미노-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)을 형성할 수 있다. 이러한 변형은 더 이상 시토신과의 표준 염기 쌍을 효과적으로 형성하지 않는 뉴클레오시드 염기를 생성한다. 그러나, 이소시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-아미노-4-옥시-피리미딘-)을 형성하는 시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-옥시-4-아미노-피리미딘)의 변형은 구아노신과 효과적으로 염기 쌍을 형성하지 않을 것이지만 이소구아노신과의 염기 쌍을 형성할 변형된 뉴클레오티드를 생성한다(Collins 등의 미국 특허 번호 제5,681,702호). 이소시토신은 Sigma Chemical Co.(St. Louise, Mo.)로부터 입수 가능하고; 이소시티딘은 문헌 [Switzer 등 (1993) Biochemistry 32:10489-10496] 및 이에 인용된 참고문헌에 의해 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며; 2'-데옥시-5-메틸-이소시티딘은 문헌 [Tor 등, 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467] 및 이에 인용된 참고문헌의 방법에 의해 제조될 수 있고; 및 이소구아닌 뉴클레오티드는 상기 문헌 [Switzer 등, 1993] 및 문헌 [Mantsch 등, 1993, Biochem. 14:5593-5601]에 기재된 방법을 사용하거나, 또는 Collins 등의 미국 특허 번호 제5,780,610호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 기타 비천연 염기 쌍은 2,6-디아미노피리미딘 및 그 상보체(1-메틸피라졸로-[4,3]피리미딘-5,7-(4H,6H)-디온)의 합성에 대해 문헌 [Piccirilli 등, 1990, Nature 343:33-37]에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다. 고유한 염기 쌍을 형성하는 기타 이러한 변형된 뉴클레오티드 단위는 공지되어 있으며, 예컨대, 문헌 [Leach 등 (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683] 및 상기 문헌 [Switzer 등]에 기재된 것들이다.

폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 상기 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 유사체를 함유하는 폴리펩티드(예를 들어, 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산, 및 크레아틴과 같은 비천연 아미노산을 포함함)뿐만 아니라 기술분야에 공지된 다른 변형 또한 정의 내에 또한 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어는 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 암호화된 폴리뉴클레오티드 생성물, 천연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 상동체(homolog), 이종상동체(ortholog), 동종상동체(paralog), 전술한 것의 단편 및 기타 등가물, 변이체, 및 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단량체일 수 있거나 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다중-분자 복합체일 수 있다. 이들은 또한 단일 사슬 또는 다중사슬 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가장 통상적으로 디설파이드 연결은 다중사슬 폴리펩티드에서 발견된다. 용어 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, "펩티드"는 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다.

예방하는: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "예방하는"은 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고; 특정 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 징후 및 증상, 특징, 또는 임상 소견(clinical manifestation)의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고; 특정 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 징후 및 증상, 특징, 또는 소견의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고; 감염, 특정 질환, 장애 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고; 및/또는 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태와 연관된 병리상태의 발생 위험을 감소시키는 것을 지칭한다.

예방적: 본원에 사용된 바와 같은, "예방적"은 질환의 확산을 예방하는 데 사용되는 치료제 또는 작용 과정을 지칭한다.

예방: 본원에 사용된 바와 같은, "예방"은 건강을 유지하고 질환의 확산을 예방하기 위해 취해진 조치를 지칭한다. "면역 예방"은 생성하기 위한 조치를 지칭한다.

염: 일부 양태에 있어서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 그 지질 구성 성분의 일부의 염을 포함한다. 용어 "염"은 임의의 음이온성 및 양이온성 복합체를 포함한다. 음이온의 비-제한적 예는 무기 및 유기 음이온, 예를 들어, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 옥살레이트(예를 들어, 헤미옥살레이트), 포스페이트, 포스포네이트, 하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 옥사이드, 카르보네이트, 바이카르보네이트, 나이트레이트, 나이트라이트, 나이트라이드, 바이설파이트, 설파이드, 설파이트, 바이설페이트, 설페이트, 티오설페이트, 하이드로겐 설페이트, 보레이트, 포르메이트, 아세테이트, 벤조에이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 아크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 푸마레이트, 말레에이트, 이타코네이트, 글리콜레이트, 글루코네이트, 말레이트, 만델레이트, 티글레이트, 아스코르베이트, 살리실레이트, 폴리메타크릴레이트, 퍼클로레이트, 클로레이트, 클로라이트, 하이포클로라이트, 브로메이트, 하이포브로마이트, 아이오데이트, 알킬설포네이트, 아릴설포네이트, 아르세네이트, 아르세나이트, 크로메이트, 디크로메이트, 시아나이드, 시아네이트, 티오시아네이트, 하이드록사이드, 퍼옥사이드, 퍼망가네이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다.

샘플: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 그 조직, 세포 또는 성분 부분(예를 들어, 혈액, 점액, 림프액, 윤활액, 뇌척수액, 타액, 양수, 양막 제대혈, 소변, 질액 및 정액을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 체액)의 하위세트를 지칭한다. 샘플은, 예를 들어, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 절편, 호흡기도, 장관, 및 비뇨생식관, 눈물, 타액, 모유, 혈액 세포, 종양, 기관을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 전체 유기체 또는 그 조직, 세포 또는 성분 부분의 하위세트, 또는 이들의 단편 또는 부분으로부터의 균질물, 용해물 또는 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 샘플은 추가로, 세포 성분, 예컨대, 단백질 또는 핵산 분자를 함유할 수 있는 배지, 예컨대, 영양 브로쓰(nutrient broth) 또는 겔을 지칭한다.

단일 단위 용량: 본원에 사용된 바와 같은, "단일 단위 용량"은 1회 용량/한번에(at one time)/단일 경로/단일 접촉점, 즉, 단일 투여 이벤트로 투여되는 임의의 치료제의 용량이다.

분할 용량: 본원에 사용된 바와 같은, "분할 용량(split dose)"은 단일 단위 용량 또는 총 1일 용량을 2회 이상의 용량으로 나눈 것이다.

입체이성질체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "입체이성질체"는 화합물이 보유할 수 있는 모든 가능한 상이한 이성질체 형태뿐만 아니라 입체형태적 형태(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 화학식의 화합물), 특히 기본 분자 구조의 모든 가능한 입체화학적 및 입체형태적 이성질체 형태, 모든 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및/또는 이형태체를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 화합물은 상이한 호변이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 후자 모두는 본 개시 내용의 범위 내에 포함된다.

대상체: "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 요법을 목적으로 하는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류, 예컨대, 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 및 침팬지; 갯과 동물(canid), 예컨대, 개 및 늑대; 고양이과 동물(felid), 예컨대, 고양이, 사자, 및 호랑이; 말과 동물(equid), 예컨대, 말, 당나귀, 및 얼룩말; 곰, 식용 동물, 예컨대, 젖소, 돼지, 및 양; 유제류(ungulate), 예컨대, 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 포유동물은 인간 대상체이다. 다른 구현예에 있어서, 대상체는 인간 환자이다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 치료를 필요로 하는 인간 환자이다.

실질적으로: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 지칭한다. 생물학 기술분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 특징이, 설사 그렇다 해도, 드물게 완결되고 및/또는 완결까지 진행되거나 또는 절대적 결과를 달성하거나 회피함을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 특징에 내재하는 잠재적인 완결성의 결여를 포착하기 위해 본원에 사용된다.

~로 고통받는: 질환, 장애, 및/또는 병태"로 고통받는" 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태로 진단되었거나 또는 이들 중 하나 이상의 징후 및 증상을 나타낸다.

걸리기 쉬운: 질환, 장애, 및/또는 병태에 "걸리기 쉬운" 개체는 상기 질환, 장애, 및/또는 병태로 진단되지 않았고 및/또는 이들의 징후 및 증상을 나타내지 않을 수 있지만, 질환 또는 그 징후 및 증상이 발생할 성향을 보유한다. 일부 구현예에 있어서, 질환, 장애, 및/또는 병태(예를 들어, 암)에 걸리기 쉬운 개체는 하기 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: (1) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발생과 연관된 유전자 돌연변이; (2) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발생과 연관된 유전자 다형성; (3) 질환, 장애, 및/또는 병태와 연관된 단백질 및/또는 핵산의 증가 및/또는 감소된 발현 및/또는 활성; (4) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발생과 연관된 습관 및/또는 생활방식; (5) 질환, 장애, 및/또는 병태의 가족력; 및 (6) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발생과 연관된 미생물에 대한 노출 및/또는 이에 의한 감염. 일부 구현예에 있어서, 질환, 장애, 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 상기 질환, 장애 및/또는 병태가 발생할 것이다. 일부 구현예에 있어서, 질환, 장애, 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 상기 질환, 장애, 및/또는 병태가 발생하지 않을 것이다.

합성: 용어 "합성"은 인간의 손에 의해 생성, 제조(prepared), 및/또는 제조(manufactured)됨을 의미한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 또는 기타 분자의 합성은 화학적 또는 효소적일 수 있다.

치료제: 용어 "치료제"는 대상체에 투여될 때, 치료, 진단, 및/또는 예방 효과를 갖고 및/또는 목적하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유발하는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA는 치료제일 수 있다.

치료적 유효량: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료적 유효량"은 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태로 고통받고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에 투여될 때, 상기 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태의 징후 및 증상을 치료하고, 개선하고, 이들을 진단하고, 예방하고, 및/또는 이들의 발병을 지연시키기에 충분한 전달되는 제제(예를 들어, 핵산, 약물, 치료제, 진단제, 예방제 등)의 양을 의미한다.

치료적으로 유효한 결과: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료적으로 유효한 결과"는 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태로 고통받고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에서 상기 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태의 징후 및 증상을 치료하고, 개선하고, 이들을 진단하고, 예방하고, 및/또는 이들의 발병을 지연시키기에 충분한 결과를 의미한다.

총 1일 용량: 본원에 사용된 바와 같은, "총 1일 용량"은 24시간의 기간 동안 주어지거나 처방된 양이다. 총 1일 용량은 단일 단위 용량 또는 분할 용량으로 투여될 수 있다.

치료하는, 치료, 요법: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "요법"은 질환, 예를 들어, 낭포성 섬유증의 하나 이상의 징후 및 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 완화시키고, 호전되도록 하고, 개선하고, 경감시키고, 이들의 발병을 지연시키고, 이들의 진행을 억제하고, 이들의 중증도를 감소시키고, 및/또는 이들의 발생률을 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 낭포성 섬유증을 "치료하는" 것은 상기 질환과 연관된 징후 및 증상을 저감시키거나, 환자의 수명을 연장시키거나(생존율을 증가시킴), 상기 질환의 중증도를 감소시키거나, 상기 질환의 발병을 예방 또는 지연시키는 것 등을 지칭할 수 있다. 치료는 질환, 장애, 및/또는 병태와 연관된 병리상태 발생의 위험을 감소시키기 위한 목적으로 상기 질환, 장애, 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 상기 질환, 장애, 및/또는 병태의 단지 초기 징후만을 나타내는 대상체에 투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알킬" 또는 "알킬기"는 하나 이상의 탄소 원자(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상의 탄소 원자)를 포함하는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소를 의미한다.

표기 "C_1-14알킬"은 1개 내지 14개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소를 의미한다. 알킬기는 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알케닐" 또는 "알케닐기"는 둘 이상의 탄소 원자(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상의 탄소 원자) 및 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는 선형 또는 분지형 탄화수소를 의미한다.

표기 "C_2-14알케닐"은 2개 내지 14개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는 선형 또는 분지형 탄화수소를 의미한다. 알케닐기는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 이중 결합을 포함할 수 있다. 알케닐기는 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "카르보사이클" 또는 "카르보사이클릭기"는 하나 이상의 탄소 원자의 고리를 포함하는 모노- 또는 멀티-사이클릭 시스템을 의미한다. 고리는 3원, 4원, 5원, 6원, 7원, 8원, 9원, 10원, 11원, 12원, 13원, 14원, 또는 15원 고리일 수 있다.

표기 "C_3-6 카르보사이클"은 3개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 단일 고리를 포함하는 카르보사이클을 의미한다. 카르보사이클은 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있으며, 방향족(예를 들어, 아릴기)일 수 있다. 카르보사이클의 예는 사이클로프로필, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 페닐, 나프틸, 및 1,2-디하이드로나프틸기를 포함한다. 카르보사이클은 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릭기"는 하나 이상의 고리를 포함하는 모노- 또는 멀티-사이클릭 시스템을 의미하며, 여기서 적어도 하나의 고리는 적어도 하나의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로원자는, 예를 들어, 질소, 산소, 또는 황 원자일 수 있다. 고리는 3원, 4원, 5원, 6원, 7원, 8원, 9원, 10원, 11원, 또는 12원 고리일 수 있다. 헤테로사이클은 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있으며, 방향족(예를 들어, 헤테로아릴기)일 수 있다. 헤테로사이클의 예는 이미다졸릴, 이미다졸리디닐, 옥사졸릴, 옥사졸리디닐, 티아졸릴, 티아졸리디닐, 피라졸리디닐, 피라졸릴, 이소옥사졸리디닐, 이소옥사졸릴, 이소티아졸리디닐, 이소티아졸릴, 모르폴리닐, 피롤릴, 피롤리디닐, 푸릴, 테트라하이드로푸릴, 티오페닐, 피리디닐, 피페리디닐, 퀴놀릴, 및 이소퀴놀릴기를 포함한다. 헤테로사이클은 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "아릴기"는 하나 이상의 방향족 고리를 포함하는 카르보사이클릭기이다. 아릴기의 예는 페닐 및 나프틸기를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "헤테로아릴기"는 하나 이상의 방향족 고리를 포함하는 헤테로사이클릭기이다. 헤테로아릴기의 예는 피롤릴, 푸릴, 티오페닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 및 티아졸릴을 포함한다. 아릴 및 헤테로아릴기 모두 임의로 치환될 수 있다.

알킬, 알케닐, 및 사이클릴(예를 들어, 카르보사이클릴 및 헤테로사이클릴) 기는 달리 명시되지 않는 한 임의로 치환될 수 있다. 임의의 치환기는 할로겐 원자(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 플루오라이드, 또는 아이오다이드기), 카르복실산(예를 들어, C(O)OH), 알코올(예를 들어, 하이드록실, OH), 에스테르(예를 들어, C(O)OR 또는 OC(O)R), 알데히드(예를 들어, C(O)H), 카르보닐(예를 들어, C(O)R, 대안적으로 C=O로 표시됨), 아실 할라이드(예를 들어, C(O)X, 여기서 X는 브로마이드, 플루오라이드, 클로라이드, 및 아이오다이드로부터 선택되는 할라이드임), 카르보네이트(예를 들어, OC(O)OR), 알콕시(예를 들어, OR), 아세탈(예를 들어, C(OR)₂R"", 여기서 각각의 OR은 동일하거나 상이할 수 있는 알콕시기이고 R""는 알킬 또는 알케닐기임), 포스페이트(예를 들어, P(O)₄ ³), 티올(예를 들어, SH), 설폭사이드(예를 들어, S(O)R), 설핀산(예를 들어, S(O)OH), 설폰산(예를 들어, S(O)₂OH), 티알(예를 들어, C(S)H), 설페이트(예를 들어, S(O)₄ ²), 설포닐(예를 들어, S(O)₂), 아미드(예를 들어, C(O)NR₂ 또는 N(R)C(O)R), 아지도(예를 들어, N₃), 나이트로(예를 들어, NO₂), 시아노(예를 들어, CN), 이소시아노(예를 들어, NC), 아실옥시(예를 들어, OC(O)R), 아미노(예를 들어, NR₂, NRH, 또는 NH₂), 카르바모일(예를 들어, OC(O)NR₂, OC(O)NRH,또는 -OC(O)NH₂), 설폰아미드(예를 들어, S(O)₂NR₂, S(O)₂NRH, S(O)₂NH₂, N(R)S(O)₂R, -N(H)S(O)₂R, N(R)S(O)₂H, 또는 N(H)S(O)₂H), 알킬기, 알케닐기, 및 사이클릴(예를 들어, 카르보사이클릴 또는 헤테로사이클릴)기로 이루어지지만, 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. R은 본원에 정의된 바와 같은, 알킬 또는 알케닐기이다.

본원에 사용된 바와 같은, "1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함한다"는, 다른 원자 이외에, 적어도 하나의 질소 원자를 포함하는 알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴기를 지칭한다. 상기 질소 원자는 1차, 2차, 또는 3차 아민기의 일부이다. 상기 아민기는

,

, 및

으로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 1차, 2차, 또는 3차 아민은 -C(=N-)-N-, -C=C-N-, -C=N-, 및 -N-C(=N-)-N-으로부터 선택되는 더 큰 아민 함유 작용기의 일부일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

통상의 기술자는 본원에 기재된 본 개시내용에 따른 특정한 구현예에 대한 많은 등가물을 단지 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 개시내용의 범위는 상기 설명으로 제한되는 것으로 의도된 것이 아니라, 첨부된 청구범위에 기술된 바와 같다.

또한 용어 "포함하는(comprising)"은 개방형이고 추가적인 요소 또는 단계의 포함을 허용하도록 의도되지만 이를 필요로 하는 것은 아니라는 점에 유의한다. 용어 "포함하는"이 본원에서 사용될 때, 용어 "~로 이루어진" 또한 따라서 포괄되고 개시된다.

범위가 주어지는 경우, 엔드포인트가 포함된다. 또한, 달리 나타나거나 또는 달리 문맥 및 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 본 개시내용의 상이한 구현예에서 언급된 범위 내에서 임의의 특정한 값 또는 하위범위를 상기 범위의 하한 단위의 10분의 1까지 가정할 수 있음을 이해해야 한다.

또한, 선행 기술에 속하는 본 개시내용의 임의의 특정 구현예는 임의의 하나 이상의 청구범위로부터 명시적으로 배제될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 구현예는 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 배제가 본원에서 명시적으로 기술되지 않더라도 배제될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 임의의 특정 구현예(예를 들어, 이에 의해 암호화되는 임의의 핵산 또는 단백질; 임의의 생성 방법; 임의의 사용 방법 등)는, 선행 기술의 존재와 관련이 있는지 여부에 관계없이, 임의의 이유로, 임의의 하나 이상의 청구범위로부터 배제될 수 있다.

모든 인용 출처, 예를 들어, 참고문헌, 간행물, 데이터베이스, 데이터베이스 항목, 및 본원에 인용된 기술은, 인용에 명시적으로 언급되지 않더라도, 본 출원에 참조로 포함된다. 인용 출처와 본 출원의 진술이 상충하는 경우, 본 출원의 진술이 우선한다.

섹션 및 표 제목은 제한하려는 의도가 아니다.

실시예

실시예 1

화학식 (I)에 따른 화합물의 합성

A. 일반적인 고려 사항

사용된 모든 용매 및 시약은 달리 명시되지 않는 한 상업적으로 수득하였고 그대로 사용하였다. ¹H NMR 스펙트럼은 Bruker Ultrashield 300 MHz 기기를 사용하여 300 K에서 CDCl₃에서 기록되었다. 화학적 이동은 ¹H의 경우 TMS(0.00)에 대해 백만분율(ppm)로 보고된다. 실리카 겔 크로마토그래피는 ISCO RediSep Rf Gold Flash Cartridge(입자 크기: 20-40 미크론)를 사용하여 ISCO CombiFlash Rf+ Lumen Instrument 상에서 수행되었다. 역상 크로마토그래피는 RediSep Rf Gold C18 고성능 컬럼을 사용하여 ISCO CombiFlash Rf+ Lumen Instrument 상에서 수행되었다. 모든 최종 화합물은 DAD 및 ELSD가 구비된 Waters Acquity UPLC 기기 및 ZORBAX Rapid Resolution High Definition(RRHD) SB-C18 LC 컬럼, 2.1 ㎜, 50 ㎜, 1.8 μm, 및 1.2 mL/분에서 5분에 걸친 0.1% TFA가 포함된 물 중 65% 내지 100%의 아세토나이트릴의 구배를 사용하여 역상 UPLC-MS(체류시간, RT, 분 단위)에 의한 분석을 통해 85% 초과의 순도인 것으로 결정되었다. 주입 부피는 5 μL였고 상기 컬럼 온도는 80℃였다. 검출은 Waters SQD 질량 분석기(Milford, MA, USA) 및 증발 광 산란 검출기를 사용하여 양성 모드의 전자분무 이온화(ESI; electrospray ionization)를 기반으로 하였다

하기 기재된 대표적인 절차는 화합물 1 내지 147의 합성에 유용하다.

하기 약어가 본원에서 이용된다:

THF: 테트라하이드로푸란

DMAP: 4-디메틸아미노피리딘

LDA: 리튬 디이소프로필아미드

rt: 실온

DME: 1,2-디메톡시에탄

n-BuLi: n-부틸리튬

B. 화합물 2: 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(테트라데실)아미노) 옥타노에이트

대표적인 절차 1:

헵타데칸-9-일 8-브로모옥타노에이트(방법 A)

디클로로메탄(20 mL) 중 8-브로모옥탄산(1.04 g, 4.6 mmol) 및 헵타데칸-9-올(1.5 g, 5.8 mmol)의 용액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(1.1 g, 5.8 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(3.3 mL, 18.7 mmol) 및 DMAP(114 mg, 0.9 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반되도록 하였다. 상기 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기 층을 분리하여 염수로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 상기 유기 층을 여과시키고 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 0-10% 에틸 아세테이트)로 정제하여 헵타데칸-9-일 8-브로모옥타노에이트(875 mg, 1.9 mmol, 41%)를 수득하였다.

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 4.89(m, 1H); 3.42(m, 2H); 2.31(m, 2H); 1.89(m, 2H); 1.73-1.18(br. m, 36H); 0.88(m, 6H).

헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)아미노)옥타노에이트(방법 B)

에탄올(3 mL) 중 헵타데칸-9-일 8-브로모옥타노에이트(3.8 g, 8.2 mmol) 및 2-아미노에탄-1-올(15 mL, 248 mmol)의 용액을 62℃에서 18시간 동안 교반되도록 하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 및 물에 녹였다(taken-up). 유기 층을 분리하여 물, 염수로 세척하고 Na₂SO₄상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과시키고 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-100% (디클로로메탄 중 1% NH₄OH, 20% MeOH의 혼합물))로 정제하여 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)아미노)옥타노에이트(3.1 g, 7 mmol, 85%)를 수득하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.67분. MS(ES): C₂₇H₅₅NO₃의 경우 m/z(MH⁺) 442.68

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 4.89(p, 1H); 3.67(t, 2H); 2.81(t, 2H); 2.65(t, 2H); 2.30(t, 2H); 2.05(br. m, 2H); 1.72-1.41(br. m, 8H); 1.40-1.20(br. m, 30H); 0.88(m, 6H).

헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(테트라데실)아미노)옥타노에이트(방법 C)

화학식: C₄₁H₈₃NO₃

분자량: 638.12

에탄올 중 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)아미노)옥타노에이트(125 mg, 0.28 mmol), 1-브로모테트라데칸(94 mg, 0.34 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(44 mg, 0.34 mmol)의 용액을 65℃에서 18시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 및 포화 소듐 바이카르보네이트에 녹였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고및진공에서 증발시켰다.잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-100% (디클로로메탄 중 1% NH₄OH, 20% MeOH의 혼합물))로 정제하여 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(테트라데실)아미노)옥타노에이트(89 mg, 0.14 mmol, 50%)를 수득하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.61분. MS(ES): C₄₁H₈₃NO₃의 경우 m/z(MH⁺) 638.91. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 4.86(p, 1H); 3.72-3.47(br. m, 2H); 2.78-2.40(br. m, 5H); 2.28(t, 2H); 1.70-1.40(m, 10H); 1.38-1.17(br. m, 54H); 0.88(m, 9H).

중간체의 합성:

중간체 A: 2-옥틸데칸산

THF(10 mL) 중 디이소프로필아민(2.92 mL, 20.8 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시키고 n-BuLi(7.5 mL, 18.9 mmol, 헥산 중 2.5 M)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 0℃로 가온되도록 하였다. THF(20 mL) 중 데칸산(2.96 g, 17.2 mmol) 및 NaH(754 mg, 18.9 mmol, 60%w/w)의 용액에 0℃에서 LDA의 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반되도록 하였다. 그 후 1-아이오도옥탄(5 g, 20.8 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 45℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응물을 1N HCl(10 mL)로 켄칭하였다. 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과시키고 및진공에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 0-20% 에틸 아세테이트)로 정제하여 2-옥틸데칸산(1.9 g, 6.6 mmol, 38%)을 산출하였다. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 2.38(br. m, 1H); 1.74-1.03(br. m, 28H); 0.91(m, 6H).

중간체 B: 7-브로모헵틸 2-옥틸데카노에이트

2-옥틸데칸산 및 7-브로모헵탄-1-올로부터 방법 A를 사용하여 7-브로모헵틸 2-옥틸데카노에이트를 합성하였다. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 4.09(br. m, 2H); 3.43(br. m, 2H); 2.48-2.25(br. m, 1H); 1.89(br. m, 2H); 1.74-1.16(br. m, 36H); 0.90(m, 6H).

중간체 C: (2-헥실사이클로프로필)메탄올

디클로로메탄(20 mL) 중 디에틸 아연(20 mL, 20 mmol, 헥산 중 1 M)의 용액을 -40℃로 5분 동안 냉각되도록 하였다. 이어서, 디클로로메탄(10 mL) 중 디아이오도메탄(3.22 mL, 40 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응물을 -40℃에서 1시간 동안 교반되도록 한 후, 디클로로메탄(10 mL) 중 트리클로로-아세트산(327 mg, 2 mmol) 및 DME(1 mL, 9.6 mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응물을 -15℃로 가온되도록 하고 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 디클로로메탄(10 mL) 중 (Z)-논-2-엔-1-올(1.42 g, 10 mmol)의 용액을 -15℃ 용액에 첨가하였다. 이어서, 상기 반응물을 서서히 실온으로 가온되도록 하고 18시간 동안 교반하였다. 그 후 포화 NH₄Cl(200 mL)을 첨가하고 상기 반응물을 디클로로메탄(3X)으로 추출하고, 염수로 세척하고, 및 Na₂SO₄상에서 건조시켰다. 유기 층을 여과시키고, 진공에서 증발시키고 및 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 0-50% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (2-헥실사이클로프로필)메탄올(1.43 g, 9.2 mmol, 92%)을 산출하였다. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 3.64(m, 2H); 1.57-1.02(m, 12H); 0.99-0.80(m, 4H); 0.72(m, 1H), 0.00(m, 1H).

C. 화합물 18: 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노) 옥타노에이트

화학식: C₄₄H₈₇NO₅

분자량: 710.18

상기 기재된 일반적인 절차 및 대표적인 절차 1에 따라 화합물 18을 합성하였다.

UPLC/ELSD: RT = 3.59분. MS(ES): C₄₄H₈₇NO₅의 경우 m/z(MH⁺) 710.89. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 4.86(m, 1H); 4.05(t, 2H); 3.53(br. m, 2H); 2.83-2.36(br. m, 5H); 2.29(m, 4H); 0.96-1.71(m, 64H); 0.88(m, 9H).

D. 화합물 136: 노닐 8-((2-하이드록시에틸)((9 Z ,12 Z )-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아미노)옥타노에이트

대표적인 절차 2:

노닐 8-브로모옥타노에이트(방법 A)

디클로로메탄(100 mL) 중 8-브로모옥탄산(5 g, 22 mmol) 및 노난-1-올(6.46 g, 45 mmol)의 용액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(4.3 g, 22 mmol) 및 DMAP(547 mg, 4.5 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반되도록 하였다. 상기 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기 층을 분리하여 염수로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 상기 유기 층을 여과시키고 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 0-10% 에틸 아세테이트)로 정제하여 노닐 8-브로모옥타노에이트(6.1 g, 17 mmol, 77%)를 수득하였다.

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 4.06(t, 2H); 3.40(t, 2H); 2.29(t, 2H); 1.85(m, 2H); 1.72-0.97(m, 22H); 0.88(m, 3H).

노닐 8-((2-하이드록시에틸)아미노)옥타노에이트

에탄올(2 mL) 중 노닐 8-브로모옥타노에이트(1.2 g, 3.4 mmol) 및 2-아미노에탄-1-올(5 mL, 83 mmol)의 용액을 62℃에서 18시간 동안 교반되도록 하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 및 물로 추출하였다. 유기 층을 분리하여 물, 염수로 세척하고 Na₂SO₄상에서 건조시켰다. 상기 유기 층을 여과시키고 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-100% (디클로로메탄 중 1% NH₄OH, 20% MeOH의 혼합물))로 정제하여 노닐 8-((2-하이드록시에틸)아미노)옥타노에이트(295 mg, 0.9 mmol, 26%)를 수득하였다.

UPLC/ELSD: RT = 1.29분. MS(ES): C₁₉H₃₉NO₃의 경우 m/z(MH⁺) 330.42

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 4.07(t, 2H); 3.65(t, 2H); 2.78(t, 2H); 2.63(t, 2H); 2.32-2.19(m, 4H); 1.73-1.20(m, 24H); 0.89(m, 3H)

노닐 8-((2-하이드록시에틸)((9 Z ,12 Z )-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아미노)옥타노에이트

화학식: C₃₇H₇₁NO₃

분자량: 577.98

에탄올(2 mL) 중 노닐 8-((2-하이드록시에틸)아미노)옥타노에이트(150 mg, 0.46 mmol), (6Z,9Z)-18-브로모옥타데카-6,9-디엔(165 mg, 0.5 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(65 mg, 0.5 mmol)의 용액을 48시간 동안 환류 교반되도록 하였다. 반응물을 실온으로 냉각되도록 하고 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-10% MeOH)로 정제하여 노닐 8-((2-하이드록시에틸)((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아미노)옥타노에이트(81 mg, 0.14 mmol, 30%)를 HBr 염으로서 수득하였다.

UPLC/ELSD: RT = 3.24분. MS(ES): C₃₇H₇₁NO₃의 경우 m/z(MH⁺) 578.64

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 10.71(br., 1H); 5.36(br. m, 4H); 4.04(m, 4H); 3.22-2.96(br. m, 5H); 2.77(m, 2H); 2.29(m, 2H); 2.04(br. m, 4H); 1.86(br. m, 4H); 1.66-1.17(br. m, 40H); 0.89(m, 6H)

E. 화합물 138: 디노닐 8,8'-((2-하이드록시에틸)아잔디일)디옥타노에이트

대표적인 절차 3:

디노닐 8,8'-((2-하이드록시에틸)아잔디일)디옥타노에이트

화학식: C₃₆H₇₁NO₅

분자량: 597.97

THF/CH₃CN(1:1)(3 mL) 중 노닐 8-브로모옥타노에이트(200 mg, 0.6 mmol) 및 2-아미노에탄-1-올(16 mg, 0.3 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(74 mg, 0.6 mmol)의 용액을 63℃에서 72시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 및 포화 소듐 바이카르보네이트로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고및진공 하에서 증발시켰다.잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-10% MeOH)로 정제하여 디노닐 8,8'-((2-하이드록시에틸)아잔디일)디옥타노에이트(80 mg, 0.13 mmol, 43%)를 수득하였다.

UPLC/ELSD: RT = 3.09분. MS(ES): C₃₆H₇₁NO₅의 경우 m/z(MH⁺) 598.85

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 4.05(m, 4H); 3.57(br. m, 2H); 2.71-2.38(br. m, 6H); 2.29(m, 4H), 1.71-1.01(br. m, 49H), 0.88(m, 6H).

본 개시내용의 모든 다른 화학식 (I)의 화합물은 상기 기재된 바와 같은 대표적인 절차 1 내지 3과 유사한 방법에 의해 수득될 수 있다.

실시예 2

나노입자 조성물의 생성

탈염 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 에탄올 적하 나노침전에 이어서 수성 완충액으로의 용매 교환을 사용하여 지질 나노입자 코어를 제조하였다. 예시적인 지질 나노입자는 지질을 15.4 mM의 농도 및 50:10:38.5:1.5(이온화 가능한 지질: DSPC: 콜레스테롤: DMG-PEG2K 지질)의 몰비로 에탄올에 용해시키고, pH 5.0의 25 mM 소듐 아세테이트에 희석된 0.1515 mg/mL의 농도로 mRNA와 혼합하는 과정에 의해 제조할 수 있다. N:P 비는 각각의 제형에서 5.8로 설정되었다. 1:3의 지질:mRNA 체적비로 마이크로-티 혼합기(micro-tee mixer)를 사용하여 지질 용액 및 mRNA를 혼합하였다. 나노입자가 형성되면, pH 7.0에서 1x PBS 완충액으로 전처리된 탈염 크로마토그래피 컬럼 상에서 이들을 용매 교환시켰다. 상기 나노입자의 용출 프로파일은 UV, pH, 및 전도도 검출기로 포착되었다. UV 프로파일은 용매-교환된 나노입자를 수집하는 데 사용되었다. 생성되는 나노입자 현탁액을 Amicon 초-원심 필터(ultra-centrifugal filter)를 사용하여 농축시키고 이를 0.22 μm 시린지 필터에 통과시켰다. 상기 나노입자는 특정 농도로 제조되었다.

GL67을 마크로골(15)-하이드록시 스테아레이트, Kolliphor^® HS15(HS15)에 용해시켜 상기 나노입자 코어에 GL67을 첨가하고 1.25(mRNA에 대한 GL67)의 질량비로 LNP에 후첨가하였다. 구체적으로, 3HCl-GL67을 HS15(1 mg/mL, ~70 μM, 물)에 직접 용해시켜 5 mg/mL(6.92 mM)의 초기 스톡 용액을 생성하였으며, 이는 용액에서 미셀(micellar) 형태일 수 있다. 5 mg/mL의 GL67을 HS15(1 mg/mL)로 추가로 희석하고([GL67]은 특정한 GL67:mRNA 중량비에서 후첨가(PA; post-addition)에 필요함) 간단한 혼합을 통해 주변 온도에서 LNP(부피 기준 1:1)에 첨가하였다:

[mRNA] 0.2 mg/mL, [3HCl-GL67] 0.25 mg/mL, [HS15] 0.5 mg/mL, [PBS] 0.5x.

1xPBS로 추가 희석된 LNP(부피 기준 1:1):

[mRNA] 0.1 mg/mL, [3HCl-GL67] 0.125 mg/mL, [HS15] 0.5 mg/mL, [PBS] 0.75x.

LNP-1a로 지정된, LNP 코어의 예는 하기와 같다:

LNP-1a

LNP-1로 지정된, 기재된 바와 같은 LNP의 예는 하기와 같다:

LNP-1

예시적인 LNP(GL67 불포함)는 도 1-3의 개략도에 따라 제조할 수 있다. 도 1은 공 지질 나노입자를 생성한 후 공-LNP에 핵산을 함유하는 용액을 첨가하는 사후 로딩(PHL) 과정을 나타낸다. 도 2는 후-삽입/후-첨가(PHL-PIPA; post-insertion/post-addition) 과정에서 지질 나노입자에 PEG 지질을 첨가하는 것을 나타낸다. 도 3은 PEG 단계의 후-삽입/후-첨가를 포함하는, 2세대 사후 로딩 과정을 나타낸다. 도 4는 공 지질 나노입자 프로토타입("중성 어셈블리")을 나타내며, 여기서 상기 공 LNP는 pH 8.0에서 혼합되고 최종 제형은 pH 5.0이다.

실시예 3

소각 x-선 산란(SAXS; small-angle x-ray scattering)

x-선 산란 실험은 Anton Paar의 실내(in-house) 소각 x-선 산란 기기 SAXS point 2.0을 사용하여 수행되었다. LNP는 전형적으로 직경 1 mm의 석영 모세관에 로딩된 0.5 내지 1 mg/mL 범위의 mRNA 농도 범위에 존재하였다. 0.154 nm 파장의 x-선은 Primux 100 마이크로 x-선 소스로부터 생성되었다. DECTRIS의 2차원(2D) EIGER R 시리즈 CMOS 검출기를 사용하여 575 mm의 샘플에서 검출기까지의 거리에서 산란 강도를 측정하였다. 이어서, 2D 데이터를 원형 평균화하여 0.06 nm^-1내지4 nm^-1범위의 1차원(1D) 프로파일 q를 산출하였으며, 여기서 q[

]는 파동 벡터이고, λ 및 θ는 각각, 파장 및 산란각이다. 샘플 전송 및 완충액 배경에 대해 1D 데이터를 추가로 교정하였다. 실시예 3에 따라 제조된 LNP-1은 6.42 nm의 면간 거리를 갖는다. LNP-1a는 5.47 nm의 면간 거리를 갖는다. 도 6은 LNP-1 및 LNP-1a의 l(q)(au) 대 q(nm-1)의 그래프를 나타낸다.

실시예 4

일반화된 분극화(GP; generalized polarization)

라우르단(6-도데카노일-2-디메틸아미노나프탄)을 0.075 mg/mL의 농도로 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 사전-용해시켰다. 이어서, 라우르단/DMSO 용액을 1:500의 DMSO 대 수성 완충액 부피비에서 0.18 mg/mL의 지질 농도로 LNP 용액에 첨가하였다. 제어 실험을 위해, 라우르단/DMSO 대신 DMSO를 동일한 프로토콜에 따라 상기 LNP 용액에 첨가하였다. 라우르단 염료를 상기 LNP 용액과 함께 3시간 동안 인큐베이션되도록 하였다. 435 nm 및 490 nm에서의 형광 강도는 Horiba의 실내 형광 분광계 FluoroMax-4에 연결된 MicroMax 384 Microwell-플레이트 리더를 사용하여 340 nm에서 여기 파장으로 수집하였다. 일반화된 분극화(GP)는 하기 방정식을 기반으로 계산하였다:

도 7은 실시예 3에 따라 제조된 LNP-1 및 LNP-1a에 대한 일반화 분극 라우르단(GPL) 값을 나타낸다.

실시예 5

mRNA 캡슐화 백분율

캡슐화 효율(EE%; encapsulation efficiency)은 변형된 Quant-iT RiboGreen 검정을 사용하여 측정하였다. EE%를 결정하기 위해, 나노입자(또는 PBS, 블랭크)를 1X TE에 희석하여 웰당 2-4 μg/mL의 mRNA의 농도를 달성하였다. 이들 샘플을 분주하여 1X TE 또는 2.5 mg/mL의 헤파린 완충액이 포함된 1X TE(유리 mRNA를 측정함) 또는 2% Triton X-100이 포함된 TE 완충액 또는 2.5 mg/mL의 헤파린이 포함된 2% Triton(총 mRNA를 측정함)에 1:1로 희석하였다. Quant-iT RiBogreen 시약을 첨가하고 플레이트 리더를 사용하여 형광 신호를 정량화하였다. 캡슐화 효율은 하기와 같이 계산하였다:

총 mRNA: 헤파린이 포함되거나 포함되지 않은 세제 트리톤(TX)을 이용하여 입자를 용해시켜 mRNA의 총량 정량화.

유리 mRNA: 헤파린이 포함되거나 포함되지 않은 TE(Tris + EDTA 완충액)에 입자를 희석하여 캡슐화되지 않은 mRNA의 양 정량화.

헤파린은 mRNA에 대해 스테롤 아민과 경쟁하는 음이온성 글리코사미노글리칸이며, 스테롤 아민과 같은 양이온제를 이용하여 LNP에서 mRNA의 양을 정량화하는 데 사용된다.

실시예 2에 따라 제조된 LNP-1은 mRNA가 98% 캡슐화되어 있다.

실시예 6

건강한 인간 기관지 상피 세포 모델에서의 LNP 세포 흡수 및 단백질 발현

건강한 인간 기관지 상피 세포(HBE)에서의 LNP 세포 흡수 및 단백질 발현을 평가하기 위해, 즉시 사용 가능한 3D 조직 모델인 MatTek(Ashland, MA)의 EpiAirway 모델을 사용하였다. 상기 모델은 건강한 기증자로부터의 인간-유래 기관/기관지 상피 세포로 이루어진다.

상기 세포는 구멍 크기가 0.4 μm인 24 mm 트랜스웰 인서트 상에 플레이팅되고, 합류 단층(confluent monolayer)이 발달하면, 정단 챔버로부터 배지를 제거하며, 배양물은 완전한 세포 분화 및 슈도-층화(pseudo-stratification)를 달성하기 위해 공기-액체 계면(ALI; air-liquid interface)에서 최대 4주 동안 유지된다. 상기 모델은 점액섬모 장벽의 생체내 표현형을 요약하고 인간 관련 조직 구조 및 세포 형태를 나타내며, 3D 구조는 조직화된 케라틴 5+ 기저 세포, 점액 생성 배상 세포(goblet cell), 기능적으로 긴밀한 접합부 및 박동 섬모(beating cilia)로 이루어진다.

건강한 HBE 세포에서의 축적 및 발현 검정

0.1 mole%의 로다민-DOPE를 포함하고 NPI-Luc 리포터 mRNA를 캡슐화하는 LNP를 Hyclone 포스페이트 완충 식염수 중 건강한 HBE에 치근방향으로(apically) 투여하였다. ALI 분화 후 동안 축적된 점액을 제거하기 위해 LNP 첨가 전에 10분 동안 PBS 중 1 mM DTT로 세포를 세척하였다. 상기 NPI-Luc 리포터는 발현된 단백질 분자의 향상된 검출 감도를 위해 N-말단에 핵 국소화 서열 및 여러 V5 태그를 포함한다. LNP 형질감염된 세포를 4-72시간 인큐베이션한 후, 트립신 EDTA를 사용하여 상기 세포를 막으로부터 분리하여 PBS 중 4% PFA로 현탁액에 고정시켰다.

LNP 축적 및 단백질 발현을 위해 세포를 별도로 처리하였다. LNP 축적을 정량화하기 위해, PFA 고정된 세포를 고함량 분석을 위한 광학적으로 투명한 사이클릭 올레핀 바닥이 포함된 96 웰 Cell Carrier Ultra 플레이트(PerkinElmer)로 이동시키고, Opera Phenix 회전 디스크 공초점 현미경(PerkinElmer)을 사용하여 이미징하였다. DAPI(405 nm 채널)를 사용하여 세포를 검출하고, 로다민-DOPE(561 nm 채널)를 사용하여 LNP 축적을 검출하였다. 561 nm 채널에서 스팟 세분화(spot segmentation)를 사용하여, Harmony 4.8에서 이미지 분석을 수행하여 세포내이입 소기관(endocytic organelle)에서의 LNP 축적을 정량화하고, LNP 흡수에 대해 양성인 % 세포뿐만 아니라 세포당 LNP 축적을 도출하였다.

단백질 발현을 정량화하기 위해, PFA 고정된 세포를 96 웰 v-바닥 플레이트에 이동시키고 항-V5 토끼 단일클론 항체를 사용하여 면역형광(IF; immunofluorescence)을 위해 처리하였다. 간략하게, 상기 세포를 0.5%의 TX-100으로 5분 동안 투과시키고, PBS 중 1% 소 혈청 알부민(BSA; bovine serum albumin)으로 30분 동안 차단한 후, 실온에서 1시간 동안 항-V5 1차 항체 및 30분 동안 Alexa 488 접합된 2차 항체로 인큐베이션하였다. 상이한 인큐베이션 단계들 사이에서 상기 세포를 원심 분리(spun down)시키고 PBS에 재현탁시켜 세척하였다. 항-V5 IF 염색 후, 상기 세포를 Opera Phenix로 이미징하기 위해 96 웰 Cell Carrier Ultra 플레이트에 이동시키고, 488 nm 채널을 사용하여 NPI-Luc 발현을 검출하였다. 이미지 분석은 Harmony 4.8에서 수행하였으며, 488 nm 채널의 평균 핵 강도를 사용하여 단백질 발현에 대해 양성인 % 세포 및 세포당 단백질 발현을 도출하였다.

실시예 7

인간 자궁경부암 상피 세포(HeLa) 모델에서의 단백질 발현

시험관내에서 단백질 발현을 평가하기 위해, ATCC.org의 HeLa 세포(ATCC CCL-2)를 사용하였다. 상기 세포를 완전한 최소 필수 배지(MEM; Minimum Essential Medium)에서 배양하고 실험을 실행하기 전에 PDL 코팅된 표면(PerkinElmer)이 포함된 96 웰 Cell Carrier Ultra 플레이트에 플레이팅하였다.

HeLa 세포의 발현 검정

혈청의 부재 하에 NPI-Luc mRNA를 캡슐화하는 LNP에 MEM 배지를 투여하였다. LNP 형질감염된 세포를 LNP 형질감염 후 5시간 동안 인큐베이션하고, 상기 세포를 Opera Phoenix 회전 디스크 공초점 현미경(PerkinElmer)을 사용하여 실시간 이미지징하였다. DAPI(405 nm 채널)를 사용하여 세포를 검출하고, Harmony 4.9에서 이미지 분석을 수행하여 세포의 수를 정량화하였다. 이미징 후 상기 세포를 One-Glo 루시퍼라제 검정(Promega)으로 처리하여 단백질 발현을 정량화하였다. 결과는 세포 수로 정규화된 상대 발광 단위(RLU; relative luminescence unit)로 보고되었다.

실시예 8

사후 접근법을 사용하는 나노입자 조성물의 생성

지질을 40 mM의 농도 및 50.5:10.1:38.9:0.5(이온화 가능한 지질: DSPC: 콜레스테롤: DMG-PEG2K 지질)의 몰비로 에탄올에 용해시키고 pH 5.0의 7.15 mM 소듐 아세테이트와 혼합하는 과정에 의해 예시적인 공 지질 나노입자를 제조할 수 있다. 3:7의 지질:완충액 체적비로 다중-입구 볼텍스 혼합기를 사용하여 지질 용액 및 완충액을 혼합하였다. 5초의 체류 시간 후, 상기 eLNP를 5:7의 eLNP:완충액 체적비로 pH 5.0의 5 mM 소듐 아세테이트와 혼합하였다. 이어서, 희석된 eLNP를 완충액 교환하고 접선 유동 여과를 사용하여 pH 5.0의 5 mM 소듐 아세테이트를 함유하는 최종 완충액으로 농축시키고 및 수크로스 용액을 후속적으로 첨가하여 저장 매트릭스를 완성하였다. eLNP로의 mRNA 로딩은 PHL 과정을 사용하여 일어났다. 예시적인 mRNA-로딩된 나노입자는 pH 5.0의 42.5 mM 소듐 아세테이트에서 2.85 mg/mL의 지질 농도의 eLNP와 0.25 mg/mL의 농도의 mRNA를 혼합하여 제조할 수 있다. N:P 비는 각각의 제형에서 4.93으로 설정되었다. 상기 eLNP 용액과 mRNA는 3:2의 eLNP:mRNA 체적비로 다중-입구 볼텍스 혼합기를 사용하여 혼합하였다. 상기 eLNP에 mRNA가 로딩되면, 5:1의 나노입자:완충액 체적비로 pH 8.12의 120 mM TRIS를 함유하는 완충액과 인-라인 혼합하기 전에 이들을 30초-60초의 체류 시간을 거치도록 하였다. 이 첨가 단계 후, 상기 나노입자 제형을 pH 7.5의 20 mM TRIS, 0.352 mg/mL DMG-PEG2k, 0.625 mg/mL GL-67을 함유하는 완충액과 6:1의 나노입자:완충액 체적비로 인-라인 혼합하였다. 접선 유동 여과를 사용하여 생성되는 나노입자 현탁액을 농축시키고 염 용액을 이용하여 70 mM의 NaCl을 함유하는 최종 완충액 매트릭스로 희석하였다. 생성되는 나노입자 현탁액을 0.8/0.2 μm의 캡슐 필터를 통해 여과시키고 0.5-2 mg/mL의 mRNA 강도로 유리 바이알에 충전하였다.

실시예 9

스테롤 아민의 합성

A. 화합물 SA1: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-N,N,10,13-테트라메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-아민

SA1은 문헌 [Justus Liebigs Annalen der Chemie, 663, 135-49(1963)]에 기재된 바와 같이 제조하였다.

B. 화합물 SA2: 2-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)옥시)-N,N-디메틸에탄-1-아민

SA2는 문헌 [Biochem. and Biophys. Res. Communications, 6, 359(1961)]에 기재된 바와 같이 제조하였다.

C. 화합물 SA3: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)카르바메이트, 트리하이드로클로라이드 염

SA3은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Alabaster, AL)에서 구입하였다.

D. 화합물 SA4: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드

SA4는 Avanti Polar Lipids, Inc.(Alabaster, AL)에서 구입하였다.

E. 화합물 SA5: 4-((((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)디설파닐)메틸)-1H-이미다졸

SA5는 미국 특허 출원 제20140288160호("Cleavable Lipids")에 기재된 바와 같이 제조하였다.

F. 화합물 SA6: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-하이드록시에틸)(메틸)아미노)에틸)카르바메이트

0℃의 무수 질소 하에서 1 mL의 무수 DCM 중 2-[(2-아미노에틸)(메틸)아미노]에탄올(53 mg, 0.44 mmol)의 교반된 용액에 2 mL의 무수 DCM 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(100 mg, 0.22 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 서서히 실온으로 가온되도록 하고 밤새 교반한 후 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았다. 백색 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(100% DCM에서 20% DCM / 80% DCM/MeOH/NH₄OH(80:20:1)로)로 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-하이드록시에틸)(메틸)아미노)에틸)카르바메이트(57 mg, 0.11 mmol, 48%)를 백색 고체로서 제공하였다. MS(ES): C₃₆H₆₄N₂O₂의 경우 m/z(MH⁺) 531.5. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.36(d, 1H, J = 5.1 Hz); 5.02(t, 1H, J = 5.3 Hz); 4.48(m, 1H); 3.61(t, 2H, J = 5.3 Hz); 3.27(q, 2H, J = 5.5 Hz, 11.2 Hz); 2.69(br. s, 4H); 2.55(m, 4H); 2.42-2.16(m, 5H); 2.10-1.71(m, 5H); 1.63-1.22(m, 11H); 1.21-0.95(m, 13H); 0.90(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.88(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.66(s, 3H).

G. 화합물 SA7: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)카르바메이트

SA7을 2-[(2-아미노에틸)(메틸)아미노]에탄올 대신 2-(4-메틸피페라진-1-일)에탄아민을 사용하는 것을 제외하고는 SA6과 동일한 방식으로 제조하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)카르바메이트(115 mg, 0.21 mmol, 93%)를 백색 고체로서 제공하였다. MS(ES): C₃₅H₆₁N₃O₂의 경우 m/z(MH⁺) 556.5. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.37(d, 1H, J = 5.0 Hz); 5.08(m, 1H); 4.48(m, 1H); 3.59(t, 2H, J = 6.4 Hz); 3.27(d, 2H, J = 5.3 Hz); 2.71(br. s, 4H); 2.57-2.45(m, 8H); 2.42-2.18(m, 3H); 2.05-1.72(m, 5H); 1.70-1.23(m, 11H); 1.22-0.95(m, 13H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.67(s, 3H).

H. 화합물 SA8: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)에틸)카르바메이트

SA8을 2-[(2-아미노에틸)(메틸)아미노]에탄올 대신 2-[4-(2-아미노에틸)피페라진-1-일]에탄올을 사용하는 것을 제외하고는 SA6과 동일한 방식으로 제조하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)에틸)카르바메이트(85 mg, 0.15 mmol, 87%)를 백색 고체로서 제공하였다. MS(ES): C₃₆H₆₃N₃O₃의 경우 m/z(MH⁺) 589.9. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.37(d, 1H, J = 5.0 Hz); 5.08(m, 1H); 4.50(m, 1H); 3.61(t, 2H, J = 6.4 Hz); 3.27(d, 2H, J = 5.3 Hz); 2.69(br. s, 4H); 2.57-2.45(m, 11H); 2.42-2.18(m, 3H); 2.05-1.72(m, 5H); 1.70-1.23(m, 11H); 1.22-0.95(m, 13H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.67(s, 3H).

I. 화합물 SA9: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-((2-하이드록시에틸)(메틸)아미노)프로필)카르바메이트

SA9를 2-[(2-아미노에틸)(메틸)아미노]에탄올 대신 2-[(3-아미노프로필)(에틸)아미노]에탄올을 사용하는 것을 제외하고는 SA6과 동일한 방식으로 제조하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-((2-하이드록시에틸)(메틸)아미노)프로필)카르바메이트(97 mg, 0.18 mmol, 80%)를 무색 오일로서 제공하였다. MS(ES): C₃₄H₆₀N₂O₃의 경우 m/z(MH⁺) 545.5. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.35(d, 1H, J = 5.1 Hz); 5.19(m, 1H); 4.45(m, 1H); 3.60(t, 2H, J = 5.3 Hz); 3.21(m, 2H); 2.51(t, 2H, J = 5.2Hz); 2.44(t, 2H, J = 6.9 Hz); 2.39-1.73(m, 10H); 1.71-1.25(m, 14H); 1.24-0.95(m, 12H); 0.89(d, 3H, J = 6.4 Hz); 0.84(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.65(s, 3H).

J. 화합물 SA10: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트

단계 1: β-시토스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트

DCM(80 mL) 중 β-시토스테롤(8.00 g, 19.3 mmol), 트리에틸아민(5.4 mL, 39 mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘(0.471 g, 3.86 mmol)의 교반된 용액을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시켰다. 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(4.277 g, 21.22 mmol)를 2분에 걸쳐 조금씩 나누어(portion wise) 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 서서히 실온이 되도록 하고 LCMS로 모니터링하였다. 21시간 후, 상기 반응 혼합물을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시킨 후, 트리에틸아민(2.7 mL) 및 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(3.00 g)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온이 되도록 하였다. 40시간 후, 상기 반응 혼합물을 여과시키고, 여액을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시킨 교반된 ACN(250 mL) 플라스크에 1시간에 걸쳐 적가하였다. 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, ACN으로 헹구어 β-시토스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트(9.15 g, 15.8 mmol, 81.8%)를 회백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.38분. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 8.28(m, 2H), 7.39(m, 2H), 5.37-5.49(m, 1H), 4.54-4.69(m, 1H), 2.36-2.57(m, 2H), 0.86-2.10(br. m, 27H), 1.05(s, 3H), 0.93(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.78-0.88(m, 9H), 0.69(s, 3H).

단계 2a: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트

(2-아미노에틸)디메틸아민(0.11 mL, 1.0 mmol)을 DCM(8.4 mL) 중 β-시토스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트(0.487 g, 0.840 mmol) 및 트리에틸아민(0.18 mL, 1.3 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 2시간 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각되도록 하였다. 상기 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고 물로 세척하였다. 수성 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 조합된 유기 층을 소수성 프릿(frit)에 통과시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 및 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(DCM 중 0-20% (MeOH 중 5% 농축 수성 NH₄OH))를 통해 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트(0.296 g, 0.56 mmol, 66.6%)를 회백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.43분. MS(ES): C₃₄H₆₀N₂O₂의 경우 m/z = 529.3[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.34-5.41(m, 1H), 5.01-5.71(m, 1H), 4.42-4.58(m, 1H), 3.24(dt, 2H, J = 5.6, 5.4 Hz), 2.19-2.44(m, 2H), 2.39(t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.22(s, 6H), 1.76-2.05(br. m, 5H), 0.88-1.72(br. m, 22H), 1.01(s, 3H), 0.92(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.77-0.88(m, 9H), 0.68(s, 3H).

단계 2b: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트 하이드로클로라이드

β-시토스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트(2.50 g, 4.31 mmol) 및 CHCl₃(40 mL)의 교반된 용액에 (2-아미노에틸)디메틸아민(0.56 mL, 5.2 mmol) 및 트리에틸아민(0.91 mL, 6.5 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 26시간 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물(3x)로 세척하고, 소수성 프릿을 통과시킨 후, 농축시켰다. 잔류물을 iPrOH(15 mL) 및 DCM(10 mL)에 용해시켜 황색 용액을 제공하였다. 상기 황색 용액에 iPrOH(1.0 mL) 중 5-6 N HCl을 적가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 상기 용액을 농축시켜 DCM을 제거한 후, ACN(10 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 15분 동안 얼음 배스에서 교반한 후, 고체를 진공 여과에 의해 수집하고 1:1의 ACN:iPrOH로 헹구어 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트 하이드로클로라이드(1.984 g, 3.344 mmol, 77.6%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.43분. MS(ES): C₃₄H₆₀N₂O₂의 경우 m/z = 529.3[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 12.49(br. s, 1H), 6.25-6.37(m, 1H), 5.33-5.40(m, 1H), 4.40-4.55(m, 1H), 3.66(dt, 2H, J = 5.4, 5.3 Hz), 3.19(dt, 2H, J = 5.4, 5.3 Hz), 2.86(d, 6H, J = 4.9 Hz), 2.24-2.42(m, 2H), 1.75-2.07(br. m, 5H), 0.88-1.72(br. m, 22H), 1.00(s, 3H), 0.92(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.77-0.88(m, 9H), 0.67(s, 3H).

K. 화합물 SA11: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-5-일)프로파노에이트, 하이드로클로라이드 염

SA11을 WO 2011/068810("Delivery of mRNA for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases")에 기재된 바와 같이 제조한 후 디에틸 에테르 중 2.5 당량의 2M 하이드로겐 클로라이드를 사용하여 하이드로클로라이드 염으로 전환하였다. 생성되는 침전물을 추가적인 에테르로 세척하고, 공기-건조시킨 후, 진공 하에서 건조시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-5-일)프로파노에이트, 하이드로클로라이드 염(29 mg, 0.05 mmol, 77%)을 백색 고체로서 제공하였다. MS(ES): C₃₃H₅₂N₂O₂의 경우 m/z(MH⁺) 509.8. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 7.54(s, 1H); 6.80(s, 1H); 5.36(d, 1H, J = 4.0 Hz); 4.62(m, 1H); 2.91(t, 2H, J = 6.8 Hz); 2.64(d, 2H, J = 6.9 Hz); 2.30(d, 1H, J = 7.8 Hz); 2.07-1.72(m, 6H); 1.70-0.94(m, 28H); 0.91(d, 3H, J = 6.4 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.0 Hz, 6.5 Hz); 0.67(s, 3H).

L. 화합물 SA12: (3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트

무수 질소 하에서 5 mL의 무수 DCM 중 (3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-올(280 mg, 0.72 mmol)의 교반된 용액을 0℃로 냉각시키고 트리에틸아민(60 μL 1.1 mmol)을 첨가한 후, 2 mL의 무수 DCM 중 파라-나이트로페닐 클로로포르메이트(220 mg, 1.1 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 적가하였다. 10분 후, 냉각 배스를 제거하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후 출발 물질이 TLC에 의해 남아 있지 않았다. 반응물에 N,N-디메틸에틸렌디아민(순수(neat); 90 μL, 0.8 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고 1N NaOH 수용액으로 2회 세척하였다. 유기물을 건조시키고(MgSO₄) 여과시켰다. 여액을 옅은 황색 고체로 농축시켰다. 이를 실리카 겔 크로마토그래피(DCM 중 0-20% (MeOH 중 5% 농축 수성 NH₄OH))를 통해 정제하여(3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트(270 mg, 0.54 mmol, 75%)를 백색 고체로서 제공하였다. MS(ES): C₃₂H₅₈N₂O₂의 경우 m/z(MH⁺) 503.9. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.12(m, 1H); 4.56(m, 1H); 3.25(d, 2H, J = 5.4 Hz); 2.41(t, 2H, J = 5.8 Hz); 2.23(s, 6H); 2.15-1.90(m, 1H); 1.89-1.41(m, 11H): 1.40-0.94(m, 18H); 0.89(d, 3H, J = 6.6 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.80(s, 3H); 0.64(m, 4H).

M. 화합물 SA13: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트

SA13은 (3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-올 대신 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-올을 사용하는 것을 제외하고는 SA12와 동일한 방식으로 제조하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트(210 mg, 0.40 mmol, 77%)를 백색 고체로서 제공하였다. MS(ES): C₃₄H₅₈N₂O₂의 경우 m/z(MH⁺) 527.9. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.36(d, 1H, J = 5.1 Hz); 5.15(dd, 2H, J = 8.4 Hz, 15.1 Hz), 5.01(dd, 1H, J = 8.4 Hz, 15.1 Hz), 4.48(m, 1H), 3.25(q, 2H, J = 5.4 Hz, 11 Hz); 2.40(t, 2H, J = 6.1 Hz); 2.36-2.13(m, 8H); 2.12-1.77(m, 6H); 1.76-1.39(m, 9H); 1.37-1.07(m, 6H); 1.06-0.90(m, 8H); 0.89-0.74(m, 9H), 0.69(s, 3H).

N. 화합물 SA14: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-하이드록시에틸)(메틸)아미노)에틸)카르바메이트

화합물 SA14는 (3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-올 대신 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-올 및 N,N-디메틸에틸렌디아민 대신 2-[(2-아미노에틸)(메틸)아미노]에탄올을 사용하는 것을 제외하고는 SA12와 동일한 방식으로 제조하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-하이드록시에틸)(메틸)아미노)에틸)카르바메이트(92 mg, 0.16 mmol, 93%)를 백색 고체로서 제공하였다. MS(ES): C₃₅H₆₀N₂O₃의 경우 m/z(MH⁺) 557.46. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.36(d, 1H, J = 5.1 Hz); 5.19-5.11(m, 1H); 5.04-4.97(m, 1H); 4.49(m, 1H), 3.62(t, 2H, J = 5.2 Hz); 3.28(d, 2H, J = 5.6 Hz); 2.57(m, 4H); 2.45-2.18(m, 5H); 2.16-1.62(m, 8H); 1.60-1.08(m, 15H); 1.07-0.89(m, 8H); 0.88-0.74(m, 9H), 0.69(s, 3H).

O. 화합물 SA15: (3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-하이드록시에틸)(메틸)아미노)에틸)카르바메이트

화합물 SA14는 N,N-디메틸에틸렌디아민 대신 2-[(2-아미노에틸)(메틸)아미노]에탄올을 사용하는 것을 제외하고는 SA12와 동일한 방식으로 제조하여 (3S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-하이드록시에틸)(메틸)아미노)에틸)카르바메이트(79 mg, 0.15 mmol, 82%)를 백색 고체로서 제공하였다. MS(ES): C₃₃H₆₀N₂O₃의 경우 m/z(MH⁺) 532.9. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.19(m, 1H); 4.53(m, 1H); 3.59(t, 2H, J = 5.2 Hz); 3.24(d, 2H, J = 5.4 Hz); 2.53(m, 4H); 2.25(s, 3H); 2.02-1.38(m, 10H); 1.37-0.91(m, 19H); 0.86(d, 3H, J = 6.6 Hz); 0.83(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.77(s, 3H); 0.61(m, 4H).

P. 화합물 SA16: 3-(디메틸아미노)-N-(((1R,4aS,10aR)-7-이소프로필-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-일)메틸)프로펜아미드

티오닐 클로라이드(5.1 mL, 70.1 mmol) 중 3-(디메틸아미노)프로판산(1.067 g, 9.108 mmol)의 용액을 30분 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시키고, 잔류물을 DCM에 용해시키고 및 ((1R,4aS,10aR)-7-이소프로필-1,4a-디메틸- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-일)메탄아민(데하이드로아비에틸아민; Combi-Blocks, Inc., San Diego, CA)(2 g, 7 mmol)을 첨가한 후 트리에틸아민(2.9 mL, 21.0 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 DCM으로 추출하였다. 유기 층을 DCM으로 희석하고 포화 수성 NaHCO₃로 세척하였다. 상기 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과시키고, 및 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(DCM 중 0-20% MeOH)로 정제하여 3-(디메틸아미노)-N-(((1R,4aS,10aR)-7-이소프로필-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-일)메틸)프로펜아미드(0.441 g, 1.147 mmol, 수율 16.4%)를 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 1.19분. MS(ES): C₂₅H₄₀N₂O의 경우 m/z(MH⁺) 385.46; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 8.42(bs, 1H); 7.18(m, 1H); 6.99(m, 1H); 6.90(m; 1H); 3.17(m, 2H); 3.01-2.73(m, 3H); 2.71-2.53(m, 2H); 2.44(m, 2H); 2.37-2.16(m, 7H); 1.95-1.61(m, 4H); 1.51-1.18(m, 13H); 0.96(s, 3H).

Q. 화합물 SA17: (3 S ,8 S ,9 S ,10 R ,13 R ,14 S ,17 R )-10,13-디메틸-17-(( R )-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1 H -사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)에틸)카르바메이트

무수 질소 하에서 20 mL의 무수 DCM과 무수 2-프로판올의 1:1 혼합물 중 3-메틸히스타민 디하이드로클로라이드(265 mg, 1.27 mmol)의 용액을 교반하면서 0℃로 냉각시켜 백색 슬러리를 제공하였다. 여기에 트리에틸아민(520 μL, 3.7 mmol)을 첨가한 후 10 mL의 무수 THF 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(500 mg, 1.06 mmol)의 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 생성되는 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았다. 상기 혼합물을 진공 하에서 환원시켰다. 잔류물을 포화 소듐 바이카르보네이트 수용액으로 희석하고 DCM으로 2회 추출하였다. 유기 층을 조합하고, 건조시키고(MgSO₄), 및 여과시켰다.여액을 옅은 황색 고체로 농축시켰다. 이를 실리카 겔 크로마토그래피(100% DCM에서 90% DCM / 10% MeOH로)로 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)에틸)카르바메이트(530 mg, 0.98 mmol, 93%)를 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.85분. MS(ES): C₃₄H₅₅N₃O₂의 경우 m/z(MH⁺) 538.79. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 7.42(s, 1H); 6.83(s, 1H); 5.36(d, 1H, J = 5.1 Hz); 4.82(m, 1H); 4.48(m, 1H); 3.58(s, 3H); 3.39(q, 2H, J = 6.7 Hz, 13.2 Hz); 2.42-2.18(m, 2H); 2.16-1.91(m, 3H); 1.90-1.73(m, 3H); 1.65-1.44(m, 6H); 1.43-1.22(m, 4H); 1.21-1.06(m, 6H); 1.05-0.94(m, 6H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(d, 6H, J = 6.5 Hz); 0.67(s, 3H).

R. 화합물 SA18: (1R,4aS,10aR)-N-(2-(디메틸아미노)에틸)-6-하이드록시-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-카르복스아미드

단계 1: (1R,4aS,10aR)-6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-카르복실산

DMF(9.1 mL, 0.2 M) 중 (1R,4aS,10aR)-6-하이드록시-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실산(포도카르프산; Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)(0.5 g, 1.8 mmol))의 교반된 용액에 이미다졸(0.496 g, 7.29 mmol) 및 t-부틸디메틸클로로실란(0.275 g, 1.822 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고 DCM으로 추출하였다. 유기물을 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조시키고, 여과시키고, 및 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(DCM 중 0-20% MeOH)로 정제하여 (1R,4aS,10aR)-6-[(tert-부틸디메틸실릴)옥시]-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실산(0.471 g, 1.212 mmol, 수율 67%)을 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.55분. MS(ES): C₂₃H₃₆O₃Si의 경우 m/z(MH⁺) 389.56; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 6.80(m, 1H); 6.63(m, 1H); 6.48(m, 1H); 2.81-2.51(m, 2H); 2.18-2.00(m, 3H); 2.00-1.75(m, 2H); 1.57-1.21(m, 3H); 1.17(s, 3H); 1.05-0.77(m, 14H); 0.15(m, 6H).

단계 2: (1R,4aS,10aR)-N-(2-(디메틸아미노)에틸)-6-하이드록시-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-카르복스아미드

DCM(2.7 mL) 중 (1R,4aS,10aR)-6-[(tert-부틸디메틸실릴)옥시]-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실산(0.213 g, 0.548 mmol)의 용액에 (1-클로로-2-메틸프로프-1-엔-1-일)디메틸아민(0.16 mL, 1.206 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 DCM(2.7 mL)에 재용해시키고 (2-아미노에틸)디메틸아민(0.081 mL, 0.822 mmol)을 첨가한 후 트리에틸아민(0.2 mL, 1.6 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, DCM으로 희석하고, 및 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과시키고, 및 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(DCM 중 0-20% MeOH)로 정제하여 (1R,4aS,10aR)-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-6-하이드록시-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복스아미드(0.095 g, 0.276 mmol, 수율 50%)를 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 1.53분. MS(ES): C₂₁H₃₂N₂O₂의 경우 m/z(MH⁺) 345.37; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 6.92(m, 1H); 6.77(m, 1H); 6.74-6.57(m, 2H); 3.44(m, 2H); 2.94-2.58(m, 4H); 2.42(bs, 6H); 2.32-2.16(m, 3H); 2.14-1.92(m, 2H); 1.74-1.61(m, 1H); 1.59-1.07(m, 10H).

S. 화합물 SA19: 2-(디메틸아미노)에틸 (1R,4aS,10aR)-6-하이드록시-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-카르복실레이트

단계 1: 메틸 (1R,4aS,10aR)-6-(벤질옥시)-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-카르복실레이트

MeOH(9 mL) 및 톨루엔(18 mL) 중 (1R,4aS,10aR)-6-하이드록시-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실산(포도카르프산; Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)(1.9 g, 6.925 mmol)의 교반된 용액에 트리메틸실릴디아조메탄[4.9 mL(헥산 중 2 M 용액), 9.695 mmol]을 5분에 걸쳐 적가하였다. 상기 용액을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 과량의 트리메틸실릴디아조메탄을 AcOH로 켄칭하고, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 DMF(35 mL)에 용해시키고 세슘 카르보네이트(9.03 g, 27.74 mmol) 및 벤질 브로마이드(1.3 mL, 10.4 mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 물로 희석하고 DCM으로 추출하였다. 유기 층을 물 및 염수로 세척하였다. 상기 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과시키고, 및 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(헥산 중 0-100% 에틸 아세테이트)로 정제하여 메틸 (1R,4aS,10aR)-6-(벤질옥시)-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실레이트(2.12 g, 5.60 mmol, 수율 81%)를 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.53분. MS(ES): C₂₅H₃₀O₃의 경우 m/z(MH⁺) 379.48; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 7.38-7.17 (m, 5H); 6.86(m, 1H); 6.78(m, 1H); 6.64(m, 1H); 4.92(s, 2H); 3.56(s, 3H); 2.82-2.55(m, 2H); 2.23-2.02(m, 3H); 1.96-1.74(m, 2H); 1.56-1.14(m, 6H); 1.05-0.89(m, 4H).

단계 2: 2-(디메틸아미노)에틸 (1R,4aS,10aR)-6-(벤질옥시)-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-카르복실레이트

DMSO(28 mL) 중 메틸 (1R,4aS,10aR)-6-(벤질옥시)-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실레이트(2.1 g, 5.548 mmol)의 교반된 용액에 포타슘 tert 부톡사이드(9.34 g, 83.22 mmol)를 첨가하였다. 용액을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응 혼합물을 얼음 물에 붓고, 2N HCl 수용액으로 산성화하고, 및 에틸아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과시키고, 및 용매를 감압 하에서 증발 제거하였다. 잔류물을 DCM(65 mL)에 용해시키고, 옥살릴 클로라이드(2.2 mL, 25.8 mmol)를 첨가한 후 DMF(0.01 mL)를 첨가하였다. 상기 용액을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 DCM(7 mL)에 용해시켰다. 디메틸아미노에탄올(0.21 mL, 2.06 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(0.033 g, 0.274 mmol)을 첨가한 후 트리에틸아민(0.6 mL, 4.1 mmol)을 첨가하였다. 상기 용액을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 잔류물을 DCM으로 희석하고 포화 수성 NaHCO₃로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과시키고, 및 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔류물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(DCM 중 0-20% MeOH)로 정제하여 2-(디메틸아미노)에틸 (1R,4aS,10aR)-6-(벤질옥시)-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실레이트(0.323 g, 0.741 mmol, 수율 54%)를 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.13분. MS(ES): C₂₈H₃₇NO₃의 경우 m/z(MH⁺) 436.14; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 7.51-7.30(m, 5H); 6.99(m, 1H); 6.91(m, 1H); 6.76(m,1H); 5.04(s, 2H); 4.23(m, 2H); 2.93-2.60(m, 4H); 2.44-2.13(m, 9H); 2.10-1.91(m, 2H); 1.71-1.51(m, 2H); 1.48-1.35(m, 1H); 1.31(s, 3H); 1.17-1.03(m, 4H).

단계 3: 2-(디메틸아미노)에틸 (1R,4aS,10aR)-6-하이드록시-1,4a-디메틸-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로페난트렌-1-카르복실레이트

팔라듐 하이드록사이드(0.07 g)를 함유하는 플라스크에 에탄올(4 mL) 중 2-(디메틸아미노)에틸 (1R,4aS,10aR)-6-(벤질옥시)-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실레이트(0.31　g, 0.71　mmol)의 용액을 N₂하에서 첨가하였다. 반응물을 수소 벌룬 하에서 주말 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응물을 셀라이트 플러그를 통해 여과시키고, 여액을 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(DCM 중 0-20% MeOH)로 정제하여 2-(디메틸아미노)에틸 (1R,4aS,10aR)-6-하이드록시-1,4a-디메틸-2,3,4,9,10,10a-헥사하이드로페난트렌-1-카르복실레이트(0.14 g, 0.41 mmol, 수율 57%)를 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.04분. MS(ES): C₂₁H₃₁NO₃의 경우 m/z(MH⁺) 346.11; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 6.92(m, 1H); 6.75(m, 1H); 6.60(m, 1H); 4.21(m, 2H); 2.90-2.60(m, 4H); 2.42-2.12(m, 9H); 2.08-1.90(m, 2H); 1.69-1.51(m, 2H); 1.48-1.34(m, 1H); 1.30(s, 3H); 1.17-1.02(m, 4H).

T. 화합물 SA20: (3 S ,8 S ,9 S ,10 R ,13 R ,14 S ,17 R )-10,13-디메틸-17-(( R )-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1 H -사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(피리딘-4-일)프로파노에이트

무수 질소 하에서 10 mL의 무수 DCM 중 3-(피리딘-4-일)프로판산(196 mg, 1.27 mmol) 및 콜레스테롤(415 mg, 1.06 mmol)의 교반된 용액에 EDC-HCl(320 mg, 1.57 mmol) 및 DMAP(65 mg, 0.53 mmol)에 이어서 DIEA(560 μL, 3.2 mmol)를 첨가하고, 생성되는 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았으므로, 반응물을 포화 소듐 바이카르보네이트 수용액으로 희석하고 DCM으로 2회 추출하였다. 유기 층을 조합하고, 건조시키고(MgSO₄), 여과시키고, 및 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(피리딘-4-일)프로파노에이트(370 mg, 0.71 mmol, 67%)를 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.09분. MS(ES): C₃₅H₅₃NO₂의 경우 m/z(MH⁺) 520.59. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 8.52(d , 2H, J = 6.1 Hz); 7.20(d, 2H, J = 6.0 Hz); 5.37(d, 1H, J = 4.5 Hz); 4.60(m, 1H); 2.97(t, 2H, J = 7.4 Hz); 2.64(t, 2H, J = 7.4 Hz); 2.27(d, 2H, J = 7.9 Hz); 2.08-1.91(m, 2H); 1.90-1.74(m, 3H); 1.64-1.22(m, 11H); 1.21-1.05(m, 7H); 1.04-0.95(m, 6H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.5 Hz); 0.67(s, 3H).

U. 화합물 SA21: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(6-아미노피리딘-3-일)프로파노에이트

무수 질소 하에서 10 mL의 무수 DCM 중 3-(6-아미노피리딘-3-일)프로판산(270 mg, 1.54 mmol) 및 콜레스테롤(500 mg, 1.28 mmol)의 교반된 용액에 EDC-HCl(390 mg, 1.9 mmol) 및 DMAP(79 mg, 0.64 mmol)에 이어서 DIEA(680 μL, 3.8 mmol)를 첨가하고, 생성되는 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았으므로, 반응 혼합물을 포화 소듐 바이카르보네이트 수용액으로 희석하고 DCM으로 2회 추출하였다. 유기 층을 조합하고, 건조시키고(MgSO₄), 및 여과시키고, 및 여액을 옅은 황색 고체로 농축시켰다_.이를 실리카 겔 크로마토그래피(DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(6-아미노피리딘-3-일)프로파노에이트(281 mg, 0.52 mmol, 41%)를 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.10분. MS(ES): C₃₅H₅₄N₂O₂의 경우 m/z(MH⁺) 535.68. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 7.88(d , 1H, J = 2.0 Hz); 7.36(dd, 1H, J = 2.3 Hz, 8.5 Hz); 6.50(d, 1H, J = 8.5 Hz); 5.36(d, 1H, J = 4.4 Hz); 4.75-4.54(m, 3H); 2.81(t, 2H, J = 7.4 Hz); 2.54(t, 2H, J = 7.6 Hz); 2.28(d, 2H, J = 7.7 Hz); 2.08-1.91(m, 3H); 1.90-1.74(m, 3H); 1.65-1.23(m, 10H); 1.22-0.94(m, 13H); 1.04-0.95(m, 6H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 0.9 Hz, 6.6 Hz); 0.67(s, 3H).

V. 화합물 SA22: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-아미노에틸)카르바메이트

무수 질소 하에서 20 mL의 무수 DCM 중 에틸렌디아민(4.6 mL, 64.8 mmol)의 교반된 용액을 0℃로 냉각시키고, 20 mL의 무수 DCM 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(2.0 g, 4.3 mmol)의 용액을 20분에 걸쳐 적가하였다. 생성되는 혼합물을 밤새 교반하면서 실온으로 가온되도록 하였다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 물로 3회 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 및 여과시키고, 및 여액을 백색 고체로 농축시켰다. 이를 고온의 에탄올에 용해시키고 솜 플러그(cotton plug)를 통과시켰다. 여액을 물질이 침전되기 시작할 때까지 아세토나이트릴로 희석하였다. 상기 혼합물을 4℃에 밤새 두었다. 생성되는 고체를 여과를 통해 단리하고 아세토나이트릴로 세척하였다. 여액을 농축시키고, 아세토나이트릴로 연마하고(triturated), 및 여과시켰다. 여과된 고체를 아세토나이트릴로 세척하고, 공기-건조시킨 후, 진공 하에서 건조시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-아미노에틸)카르바메이트(1.56 g, 3.3 mmol, 76%)를 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.70분. MS(ES): C₃₀H₅₂N₂O₂의 경우 m/z(MH⁺) 473.55. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.36(d, 1H, J = 4.6 Hz); 4.96(m, 1H); 4.50(m, 1H); 3.23(q, 2H, J = 5.6 Hz, 11.6 Hz); 2.83(t, 2H, J = 5.8 Hz); 2.42-2.19(m, 2H); 2.06-1.75(m, 5H); 1.65-1.05(m, 19H); 1.04-0.94(m, 6H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(d, 6H, J = 6.5 Hz); 0.67(s, 3H).

W. 화합물 SA23: (3 S ,8 S ,9 S ,10 R ,13 R ,14 S ,17 R )-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[ a ]페난트렌-3-일 (2-구아니디노에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

단계 1:

5 mL의 무수 DCM 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-아미노에틸)카르바메이트 SA22(300 mg, 0.63 mmol) 및 N¹,N²-비스-Boc-구아니딘-N³-트리플레이트(250 mg, 0.63 mmol)의 교반된 용액에 트리에틸아민(92 μL, 0.66 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았다. 상기 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 소듐 바이카르보네이트 수용액으로 2회 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 및 여과시켰다. 여액을 옅은 황색 시럽으로 농축시켰다. 이를 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 0-30% EtOAc)로 정제하여 생성물(384 mg, 0.53 mmol, 85%)을 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.35분. MS(ES): C₄₁H₇₀N₄O₆의 경우 m/z(MH⁺) 715.66. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 11.45(s, 1H); 8.59(br. s, 1H); 5.56(s, 1H); 5.36(d, 1H, J = 4.9 Hz); 4.49(m, 1H); 3.60(s, 2H); 3.37(d, 2H, J = 8.8 Hz); 2.42-2.19(m, 2H); 2.06-1.75(m, 5H); 1.67-1.44(m, 23H); 1.43-1.22(m, 4H); 1.21-0.94(m, 11H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.68(s, 3H).

단계 2: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-구아니디노에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

5 mL의 무수 DCM 중 단계 1의 생성물(384 mg, 0.53 mmol)의 교반된 용액에 디에틸 에테르 중 2M HCl 용액(1.33 mL, 2.66 mmol)을 첨가하였다. 반응 용기를 단단히 밀봉하였다. 반응 혼합물을 40℃로 가열하고 밤새 교반하였다. 추가적인 에테르 중 2M HCl(5 mL, 10 mmol)을 첨가하였다. 바이알을 밀봉하고, 반응물을 밤새 40℃로 가열하였다. 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았으므로, 상기 혼합물을 질소 스트림에서 농축시켰다. 백색 잔류물을 디에틸 에테르로 연마하고 여과시켰다. 필터 고체를 디에틸 에테르로 세척하고 공기-건조시킨 후, 진공 하에서 건조시켜 (1R,3aS,3bS,7S,9aR,9bS,11aR)-9a,11a-디메틸-1-[(2R)-6-메틸헵탄-2-일]-1H,2H,3H,3aH,3bH,4H,6H,7H,8H,9H,9bH,10H,11H-사이클로펜타[a]페난트렌-7-일 N-(2-{[(Z)-[(tert-부톡시카르보닐)아미노][(tert-부톡시카르보닐)이미노]메틸]아미노}에틸)카르바메이트 하이드로클로라이드 염(235 mg, 0.42 mmol, 79%)을 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.71분. MS(ES): C₃₁H₅₄N₄O₂의 경우 m/z(MH⁺) 515.73. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 7.88(br. s, 1H); 7.16(br. s, 4H); 5.96(br. s, 1H); 5.36(s, 1H); 4.42(m, 1H); 3.55-3.18(m, 4H); 2.31(s, 2H); 2.08-1.65(m, 7H); 1.64-1.22(m, 11H); 1.23-0.94(m, 14H); 0.92(d, 3H, J = 5.9 Hz); 0.86(d, 6H, J = 6.6 Hz); 0.68(s, 3H).

X. 화합물 SA24: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드

단계 1: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트

(-)-콜레스테롤 NHS 숙시네이트(517 mg, 0.886 mmol) 및 3,3'-이미노비스(N,N-디메틸프로필아민)(0.40 mL, 1.8 mmol)을 THF(6.0 mL)에서 조합하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 TLC로 모니터링하였다. 20시간 후, 상기 반응 혼합물을 DCM으로 희석한 후, 물로 세척하였다. 수성 층을 DCM(2x)으로 추출하였다. 조합된 유기물을 소수성 프릿에 통과시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 및 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(DCM 중 0-20% (MeOH 중 10% 농축 수성 NH₄OH))를 통해 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트(425 mg, 0.607 mmol, 68.5%)를 투명한 점성 오일로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.11분. MS(ES): C₄₁H₇₃N₃O₃의 경우 m/z = 656.6[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.32-5.39(m, 1H), 4.54-4.68(m, 1H), 3.29-3.40(m, 4H), 2.64(s, 4H), 2.18-2.35(m, 5H), 2.21(s, 12H), 0.82-2.05(br. m, 31H), 1.01(s, 3H), 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.86(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.86(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.67(s, 3H).

단계 2: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드

DCM(6.8 mL) 및 iPrOH(2.7 mL)의 혼합물 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트(0.135 g, 0.206 mmol)의 교반된 용액에 iPrOH(0.10 mL) 중 5-6 N HCl을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 후 농축시켰다. ACN(5 mL)을 첨가하고, 상기 혼합물을 0℃의 얼음 배스에서 교반하였다. ACN(5 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 농축시켰다. ACN(3 mL)을 첨가하고, 상기 혼합물을 초음파 처리하였다. 고체를 진공 여과에 의해 수집하여 저온의 ACN으로 헹구었다. 고체를 1:1의 ACN/iPrOH에 현탁시키고 농축시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드(0.079 g, 0.10 mmol, 49.1%)를 회백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 1.94분. MS(ES): C₄₁H₇₃N₃O₃의 경우 m/z = 656.3[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 12.33(br. s, 1H), 12.14(br. s, 1H), 5.28-5.38(m, 1H), 4.45-4.61(m, 1H), 3.51-3.72(m, 4H), 3.13-3.26(m, 2H), 2.97-3.09(m, 2H), 2.90(d, 6H, J = 4.8 Hz), 2.81(d, 6H, J = 4.7 Hz), 2.55-2.72(m, 4H), 2.25-2.43(m, 4H), 2.10-2.24(m, 2H), 1.75-2.06(br. m, 5H), 0.92-1.71(br. m, 21H), 1.01(s, 3H), 0.91(d, 3H, 6.4 Hz), 0.86(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.86(d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.67(s, 3H).

Y. 화합물 SA25: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-((2-(디메틸아미노)에틸)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

단계 1: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-메톡시-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트

20 mL의 1:1 DCM/MeOH 혼합물 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-아미노에틸)카르바메이트(SA22, 1 g, 2.1 mmol) 및 3,4-디메톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(600 mg, 4.2 mmol)의 교반된 혼합물을 35℃로 가온하였다. 상기 혼합물이 투명해졌고, 생성되는 무색 용액을 실온에서 밤새 교반한 후 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았다. 상기 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 소듐 바이카르보네이트 수용액으로 2회 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 및 여과시켰다. 여액을 농축시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-메톡시-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트(1.06 g, 1.8 mmol, 86%)를 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.27분. MS(ES): C₃₅H₅₄N₂O₅의 경우 m/z(MH⁺) 583.68. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 6.30(br. s, 0.5H); 5.99(br. s, 0.5H); 5.37(d, 1H, J = 5.5 Hz); 4.95(m, 1H); 4.48(m, 1H); 4.38(d, 3H, J = 3.5 Hz); 3.79(m, 1H); 3.56(m, 1H); 3.40(q, 2H, J = 5.6 Hz, 10.6 Hz); 2.40-2.19(m, 2H); 2.07-1.75(m, 5H); 1.68-1.23(m, 11H); 1.22-0.94(m, 12H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.68(s, 3H).

단계 2: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-((2-(디메틸아미노)에틸)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

5 mL의 메탄올 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-메톡시-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트(200 mg, 0.34 mmol)의 교반된 현탁액에 N,N-디메틸에틸렌디아민(60 μL, 0.51 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 45℃로 가열하고 밤새 교반한 후 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았다. 불투명한 백색 혼합물을 실온으로 냉각되도록 하고 여과시켰다. 필터 고체를 메탄올로 세척한 후, 아세토나이트릴로 세척하였다. 상기 고체를 공기-건조시켜 부서지기 쉬운 황색 고체를 제공하였다. 이를 분쇄하고, 진공 하에서 건조시키고, 및 10 mL의 DCM/메탄올의 1:1 혼합물에 현탁시켰다. 상기 혼합물을 가열하여 거의 완전히 용해시키고 여과시켰다. 여액에 디에틸 에테르 중 2M HCl 용액(1.0 mL, 2 mmol)을 교반하면서 첨가하였다. 생성되는 용액을 질소 스트림에서 농축시키고, 생성되는 고체를 진공 하에서 건조시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-((2-(디메틸아미노)에틸)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트 하이드로클로라이드(150 mg, 0.22 mmol, 65%)를 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.57분. MS(ES): C₃₈H₆₂N₄O₄의 경우 m/z(MH⁺) 639.56. ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ: ppm 10.00(br. s, 1H); 7.94(m, 2H); 7.16(t, 1H, J = 5.5 Hz); 5.32(d, 1H, J = 3.6 Hz); 4.29(m, 1H); 3.83(d, 2H, J = 5.7 Hz); 3.50(br. s, 2H); 3.37(br. s, 2H); 3.26(br. s, 2H); 3.13(q, 2H, J = 5.2 Hz, 11.1 Hz); 2.80(s, 6H); 2.33-2.10(m, 2H); 2.04-1.68(m, 5H); 1.63-1.23(m, 10H); 1.22-0.97(m, 11H); 0.89(d, 3H, J = 6.4 Hz); 0.83(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.5 Hz); 0.64(s, 3H).

Z. 화합물 SA26: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-((3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

SA26은 단계 2에서 N,N-디메틸에틸렌디아민 대신 N,N-디메틸프로필렌디아민을 사용하는 것을 제외하고는 SA25와 동일한 방식으로 제조하였다. HCl 염으로의 유사한 전환을 수행하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-((3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염(168 mg, 0.24 mmol, 71%)을 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.60분. MS(ES): C₃₉H₆₄N₄O₄의 경우 m/z(MH⁺) 653.74. ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ: ppm 10.00(br. s, 1H); 7.95(m, 2H); 7.15(m, 1H); 5.32(d, 1H, J = 2.7 Hz); 4.29(m, 1H); 3.60-3.43(m, 4H); 3.19-3.00(m, 4H); 2.80(s, 6H); 2.35-2.10(m, 2H); 2.04-1.68(m, 5H); 1.56-1.23(m, 10H); 1.22-0.97(m, 11H); 0.88(d, 3H, J = 6.4 Hz); 0.83(dd, 6H, J = 0.9 Hz, 6.6 Hz); 0.64(s, 3H).

AA. 화합물 SA27: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-((4-(디메틸아미노)부틸)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

SA27은 단계 2에서 N,N-디메틸에틸렌디아민 대신 N,N-디메틸부탄디아민을 사용하는 것을 제외하고는 SA25와 동일한 방식으로 제조하였다. HCl 염으로의 유사한 전환을 수행하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-((4-(디메틸아미노)부틸)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염(145 mg, 0.34 mmol, 60%)을 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.62분. MS(ES): C₃₉H₆₄N₄O₄의 경우 m/z(MH⁺) 667.69. ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ: ppm 10.01(br. s, 1H); 8.04(m, 2H); 7.14(t, 1H, J = 5.4 Hz); 5.32(d, 1H, J = 2.9 Hz); 4.29(m, 1H); 3.95(m, 2H); 3.49(br. d, 4H, J = 4.8 Hz); 3.19-2.96(m, 4H); 2.72(d, 6H, J = 4.9 Hz); 2.34-2.08(m, 2H); 2.04-1.60(m, 5H); 1.59-1.23(m, 10H); 1.22-0.97(m, 11H); 0.88(d, 3H, J = 6.4 Hz); 0.83(dd, 6H, J = 1.0 Hz, 6.6 Hz); 0.64(s, 3H).

AB. 화합물 SA28: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-아미노프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드

단계 1: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트

THF(0.86 mL) 중 (-)-콜레스테롤 NHS 숙시네이트(0.100 g, 0.172 mmol)의 용액에 THF(0.40 mL) 중 tert-부틸 N-[3-({3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]프로필}아미노)프로필]카르바메이트(0.074 g, 0.22 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 5시간 후, tert-부틸 N-[3-({3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]프로필}아미노)프로필]카르바메이트(40 mg)를 첨가하였다. 21시간 후, 상기 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고 물로 세척하였다. 수성 층을 DCM(2 x 10 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기물을 소수성 프릿에 통과시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 및 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 30-75% EtOAc)를 통해 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트(정량적(quant.))를 투명한 오일로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.98분. MS(ES): C₄₇H₈₁N₃O₇의 경우 m/z = 700.7[(M + H) - (CH₃)₂C=CH₂ - CO₂]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.32-5.40(m, 1H), 5.29(br. s, 1H), 4.50-4.73(m, 2H), 3.40(t, 2H, J = 6.2 Hz), 3.32(t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.15(dt, 2H, J = 6.0, 6.4 Hz), 3.04(dt, 2H, J = 5.6, 5.7 Hz), 2.54-2.70(m, 4H), 2.28-2.37(m, 2H), 1.75-2.07(br. m, 5H), 0.94-1.71(br. m, 25H), 1.44(s, 9H), 1.43(s, 9H), 1.01(s, 3H), 0.91(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.86(d, 6H, J = 6.5 Hz), 0.67(s, 3H).

단계 2: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-아미노프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드

얼음 배스에서 0℃로 냉각된 DCM(2.0 mL) 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트(110 mg, 0.137 mmol)의 교반된 용액에 디옥산(0.17 mL) 중 4 N HCl을 적가하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 서서히 실온으로 가온되도록 하고 LCMS로 모니터링하였다. 3시간 후, 현탁액을 Et₂O로 희석하였다. 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, Et₂O로 헹구어 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-(비스(3-아미노프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드(55 mg, 0.081 mmol, 58.7%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.13분. MS(ES): C₃₇H₆₅N₃O₃의 경우 m/z = 600.5[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d ₆): δ 8.07(br. s, 3H), 7.90(br. s, 3H), 5.30-5.37(m, 1H), 4.36-4.51(m, 1H), 3.34-3.46(m, 4H), 2.64-2.91(m, 4H), 2.47-2.63(m, 2H), 2.19-2.32(m, 2H), 1.69-2.05(br. m, 7H), 0.91-1.64(br. m, 25 H), 0.98,(s, 3H), 0.90(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.65(s, 3H).

AC. 화합물 SA29: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (4-아미노부틸)(3-아미노프로필)카르바메이트 디하이드로클로라이드

DCM(3.4 mL) 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부틸)(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)카르바메이트(문헌 [Hum. Gene Ther.,　7(14),　1701-1717 (1996)]에 기재된 바와 같이 제조됨)(190 mg, 0.251 mmol)의 교반된 용액을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시켰다. 디옥산(0.31 mL) 중 4 N HCl을 적가하고, 반응 혼합물을 교반하면서 서서히 실온으로 가온되도록 하였다. 반응을 LCMS로 모니터링하였다. 4시간 후, 디옥산(0.10 mL) 중 4 N HCl을 첨가하였다. 9시간 후, 상기 반응 혼합물을 약 Et₂O20 mL로 희석하였다. 현탁액을 여과시키고, Et₂O로 헹구었다. 고체를 헵탄에 현탁시키고, 현탁액을 농축시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (4-아미노부틸)(3-아미노프로필)카르바메이트 디하이드로클로라이드(147 mg, 0.228 mmol, 91.0%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.05분. MS(ES): C₃₅H_63-N₃O₂의 경우 m/z = 558.5[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d ₆): δ 7.93(br. s, 6H), 5.29-5.38(m, 1H), 4.26-4.40(m, 1H), 3.10-3.30(m, 4H), 2.68-2.86(m, 4H), 2.20-2.35(m, 2H), 1.70-2.03(br. m, 7H), 0.91-1.64(br. m, 25H), 0.99(s, 3H), 0.89(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.85(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.65(s, 3H).

AD. 화합물 SA30: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-((4-아미노부틸)아미노)프로필)카르바메이트 디하이드로클로라이드

DCM(3.9 mL) 중 tert-부틸 (4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부틸)(3-(((((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)옥시)카르보닐)아미노)프로필)카르바메이트(문헌 [Hum. Gene Ther.,　7(14),　1701-1717(1996)]에 기재된 바와 같이 제조됨)(215 mg, 0.284 mmol)의 교반된 용액을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시켰다. 디옥산(0.35 mL) 중 4 N HCl을 적가하고, 반응 혼합물을 교반하면서 서서히 실온으로 가온되도록 하였다. 반응을 LCMS로 모니터링하였다. 4시간 후, 추가적인 디옥산(0.10 mL) 중 4 N HCl을 첨가하였다. 9시간 후, 상기 반응 혼합물을 약 Et₂O20 mL로 희석하였다. 고체를 진공 여과로 수집하고, Et₂O로 헹구었다. 상기 고체를 헵탄에 현탁시킨 후 농축시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-((4-아미노부틸)아미노)프로필)카르바메이트 디하이드로클로라이드(142 mg, 0.216 mmol, 76.1%)를 반-투명 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.16분. MS(ES): C₃₅H_63-N₃O₂의 경우 m/z = 558.5[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d ₆): δ 8.97(br. s, 2H), 8.03(br. s, 3H), 7.20(t, 1H, J = 5.7 Hz), 5.26-5.43(m, 1H), 4.23-4.39(m, 1H), 2.97-3.12(dt, 2H, J = 6.1, 6.3 Hz), 2.70-2.95(m, 6H), 2.13-2.36(m, 2H), 0.91-2.05(br. m, 32H), 0.97(s, 3H), 0.89(d, 3H, J = 6.1 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.65(s, 3H).

AE. 화합물 SA31: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((4-아미노부틸)(3-아미노프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드

단계 1: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부틸)(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트

THF(1.7 mL) 중 (-)-콜레스테롤 NHS 숙시네이트(201 mg, 0.344 mmol)의 용액에 THF(1.0 mL) 중 tert-부틸 N-[3-({4-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]부틸}아미노)프로필]카르바메이트(0.178 g 0.516 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 19시간 후, 상기 반응 혼합물을 DCM(30 mL)으로 희석한 후, 물로 세척하였다. 수성 층을 DCM(10 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기물을 소수성 프릿에 통과시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 및 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 20-65% EtOAc)로 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부틸)(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트(241 mg, 0.296 mmol, 86.1%)를 백색 폼(foam)으로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.98분. MS(ES): C₄₈H₈₃N₃O₇의 경우 m/z = 814.7[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.21-5.43(m, 2H), 4.49-4.82(m, 2H), 3.33(t, 2H, J = 6.4 Hz), 3.22-3.38(m, 2H), 2.97-3.21(m, 4H), 2.52-2.72(m, 4H), 2.24-2.38(m, 2H), 1.73-2.07(br. m, 5H), 0.75-1.64(br. m, 27H), 1.44(s, 9H), 1.42(s, 9H), 1.01(s, 3H), 0.91(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.86(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.86(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.67(s, 3H).

단계 2: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((4-아미노부틸)(3-아미노프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드

DCM(4.1 mL) 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부틸)(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트(0.230 g, 0.282 mmol)의 용액을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시켰다. 디옥산(0.35 mL) 중 4 N HCl을 적가하고, 반응 혼합물을 교반하면서 서서히 실온으로 가온되도록 하였다. 반응을 LCMS로 모니터링하였다. 4시간 후, 추가적인 디옥산(0.10 mL) 중 4 N HCl을 첨가하였다. 9시간 후, 상기 반응 혼합물을 약 Et₂O 20 mL로 희석하였다. 고체를 진공 여과에 의해 수집하고 Et₂O로 헹구었다. 상기 고체를 헵탄에 현탁시키고, 농축시키고, 및 고진공 하에서 추가로 건조시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((4-아미노부틸)(3-아미노프로필)아미노)-4-옥소부타노에이트 디하이드로클로라이드(171 mg, 0.247 mmol, 87.4%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.22분. MS(ES): C₃₈H₆₇N₃O₃의 경우 m/z = 614.3[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d ₆): δ 7.73-8.14(m, 6H), 5.29-5.37(m, 1H), 4.36-4.51(m, 1H), 3.15-3.43(m, 4H), 2.64-2.88(m, 4H), 2.47-2.63(m, 2H), 2.21-2.29(m, 2H), 1.69-2.03(br. m, 7H), 0.80-1.64(br. m, 27 H), 0.98,(s, 3H), 0.90(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.65(s, 3H).

AF. 화합물 SA32: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 2-(퀴누클리딘-3-일)아세테이트

DCM(3.2 mL) 중 3-(카르복시메틸)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-이움 클로라이드(AstaTech, Inc., Bristol, PA)(0.100 g, 0.486 mmol)의 용액에 콜레스테롤(470 mg, 1.22 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘(30 mg, 0.24 mmol), 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(0.103 g, 0.535 mmol)를 첨가하였다. THF(3.5 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 16.5시간 후, 상기 반응 혼합물을 50℃에서 가열하였다. 21시간 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 미정제 물질을 3:1의 CHCl₃/iPrOH(약 40 mL)로 희석하고 물로 세척하였다. 유기물을 소수성 프릿에 통과시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 및농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(DCM 중 5-20% (MeOH 중 10% 농축 수성 NH₄OH))를 통해 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 2-(퀴누클리딘-3-일)아세테이트(0.193 g, 0.357 mmol, 73.5%)를 투명한 오일로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.02분. MS(ES): C₃₆H₅₉NO₂의 경우 m/z = 538.5[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CD₃OD): δ 5.32-5.43(m, 1H), 4.47-4.61(m, 1H), 3.06-3.18(m, 1H), 2.73-2.92(m, 4H), 2.25-2.50(br. m, 5H), 0.91-2.23(br. m, 32H), 1.05(s, 3H), 0.95(d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.88(d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.88(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.73(s, 3H).

AG. 화합물 SA33: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 퀴누클리딘-3-카르복실레이트

THF(3.5 mL) 중 콜레스테롤(504 mg, 1.30 mmol), 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥탄-3-카르복실산 하이드로클로라이드(Enamine, Monmouth Junction, NJ)(100 mg, 0.522 mmol), 및 4-(디메틸아미노)피리딘(0.032 g, 0.261 mmol)의 현탁액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(0.110 g, 0.574 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 16시간 후, 상기 반응 혼합물을 50℃에서 교반하였다. 40시간 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 3:1의 CHCl₃:iPrOH(약 40mL)로 희석하였다. 유기물을 물로 세척하고, 소수성 프릿에 통과시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 및 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(DCM 중 0-10% (MeOH 중 10% 농축 수성 NH₄OH))를 통해 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 퀴누클리딘-3-카르복실레이트(0.121 g, 0.226 mmol, 43.4%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.06분. MS(ES): C₃₅H₅₇NO₂의 경우 m/z = 524.5[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.34-5.43(m, 1H), 4.58-4.72(m, 1H), 3.29(ddd, 1H, J = 13.9, 6.0, 1.7 Hz), 2.72-3.05(br. m, 5H), 2.46-2.56(m, 1H), 2.22-2.40(m, 2H), 2.12-2.19(m, 1H), 1.75-2.09(br. m, 5H), 0.92-1.70(br. m, 25H), 1.02(s, 3H), 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.86(d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.86(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.68(s, 3H).

AH. 화합물 SA34: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((4,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-일)아미노)에틸)카르바메이트, 하이드로겐 아이오다이드 염

5 mL의 무수 THF 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-아미노에틸)카르바메이트(SA22, 200 mg, 0.42 mmol) 및 2-(메틸티오)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸 하이드로아이오다이드(94 mg, 0.38 mmol)의 용액을 40℃로 가열하고 밤새 교반한 후 이는 백색 현탁액이 되었다. 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았으므로, 상기 용액을 실온으로 냉각되도록 하고 농축시켰다(악취!). 생성되는 고체를 디에틸 에테르로 연마하였다. 혼합물을 여과시키고, 필터 고체를 에테르로 세척하고, 공기-건조시킨 후, 진공 하에서 건조시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((4,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-일)아미노)에틸)카르바메이트 하이드로아이오다이드(77 mg, 0.11 mmol, 30%)를 흡습성 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.76분. MS(ES): C₃₃H₅₆N₄O₂의 경우 m/z(MH⁺) 541.63. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 7.97(br. s, 2H); 7.29(br. s, 1H); 5.61(br. s, 1H); 5.36(d, 1H, J = 3.2 Hz); 4.43(br. d, 1H, J = 8.7 Hz); 3.78(s, 4H); 3.61-3.21(m, 4H); 2.31(s, 2H); 2.30(d, 2H, J = 6.7 Hz); 2.14-1.70(m, 5H); 1.69-1.22(m, 11H); 1.21-0.94(m, 13H); 0.90(d, 3H, J = 6.2 Hz); 0.85(d, 6H, J = 6.4 Hz); 0.66(s, 3H).

AI. 화합물 SA35: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-(비스(3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트

SA35는 단계 2에서 N,N-디메틸에틸렌디아민 대신 3,3'-이미노비스(N,N-디메틸프로필아민)을 사용한 것을 제외하고는 SA25와 동일한 방식으로 제조하였다. 반응이 완료되면, 불투명한 백색 혼합물을 실온으로 냉각되도록 하고 여과시켰다. 필터 고체를 메탄올로 세척하고 여액을 옅은 황색 필름으로 농축시켰다. 이를 실리카 겔 크로마토그래피(DCM 중 0-25% MeOH)로 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-((2-(비스(3-(디메틸아미노)프로필)아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)에틸)카르바메이트(45 mg, 0.06 mmol, 14%)를 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.12분. MS(ES): C₄₄H₇₅N₅O₄의 경우 m/z(MH⁺) 738.60. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 8.85(br. s, 1H); 5.34(d, 1H, J = 4.7 Hz); 5.19(t, 1H, J = 6.2 Hz); 4.44(m, 1H); 3.76(q, 2H, J = 5.8 Hz, 11.8 Hz); 3.70-3.47(m, 3H); 3.39(q, 2H, J = 5.8 Hz, 11.4 Hz); 2.85-2.33(m, 15H); 2.27(d, 2H, J = 7.1 Hz); 2.10-1.70(m, 9H); 1.66-1.22(m, 11H); 1.21-0.95(m, 12H); 0.91(d, 3H, J = 6.4 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.1 Hz, 6.6 Hz); 0.67(s, 3H).

AJ. 화합물 SA36: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)카르바메이트 트리하이드로클로라이드

단계 1: 스티그마스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트

DCM(6.0 mL) 중 스티그마스테롤(0.600 g, 1.45 mmol), 트리에틸아민(0.41mL, 2.9 mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘(0.036 g, 0.29 mmol)의 교반된 현탁액을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(0.322 g, 1.60 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 서서히 실온이 되도록 하고 LCMS로 모니터링하였다. 21시간 후, 상기 반응 혼합물을 여과시켰다. 여액을 교반된 ACN(30 mL)의 플라스크에 적가하였다. 고체가 침전되어 황색 현탁액을 제공하였다. 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, CAN으로 헹구어 스티그마스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트(0.526 g, 0.910 mmol, 62.6%)를 생성하였다. 모액으로부터 추가적인 고체를 침전시켰다. 상기 모액을 부분적으로 농축시켜 대부분의 DCM을 제거하였다. 실온으로 냉각되면, 고체를 ACN으로 헹구는 진공 여과에 의해 수집하여 스티그마스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트(0.162 g, 0.280 mmol, 19.3%)를 생성하였다. 조합된 수율 = 81.9%. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 8.28(m, 2H), 7.39(m, 2H), 5.40-5.47(m, 1H), 5.15(dd, 1H, J = 15.1, 8.4 Hz), 5.02(dd, 1H, J = 15.1, 8.4 Hz), 4.55-4.68(m, 1H), 2.41-2.55(m, 2H), 1.89-2.13(br. m, 5H), 0.88-1.84(br. m, 18H), 1.05(s, 3H), 1.03(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.76-0.87(m, 9H), 0.71(s, 3H).

단계 2: tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 부탄-1,4-디일비스((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)카르바메이트)

tert-부틸 N-{3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]프로필}-N-[4-({3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]프로필}아미노)부틸]카르바메이트(0.566 g, 1.12 mmol), 스티그마스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트(0.500 g, 0.865 mmol), 및 트리에틸아민(0.36 mL, 2.6 mmol)을 톨루엔(5.0 mL)에서 조합하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 24시간 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 상기 반응 혼합물을 물(3 x 5mL)로 세척한 후 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 20-60% EtOAc)를 통해 정제하여 tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 부탄-1,4-디일비스((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)카르바메이트)(0.703 g, 0.747 mmol, 86.3%)를 백색 폼으로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.45분. MS(ES): C₅₅H₉₆N₄O₈의 경우 m/z = 841.8[(M + H) - (CH₃)₂C=CH₂ - CO₂]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.33-5.41(m, 1H), 5.28(br. s, 1H), 5.16(dd, 1H, J = 15.1, 8.4 Hz), 5.01(dd, 1H, J = 15.1, 8.4 Hz), 4.79(br. s, 1H), 4.42-4.59(m, 1H), 2.97-3.48(br. m, 12H), 2.20-2.43(m, 2H), 1.79-2.12(br. m, 5H), 0.88-1.77(br. m, 26H), 1.45(s, 9H), 1.43(s, 18H), 1.02(s, 3H), 1.02(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.75-0.88(m, 9H), 0.69(s, 3H).

단계 3: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)카르바메이트 트리하이드로클로라이드

iPrOH(3.2 mL) 중 tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 부탄-1,4-디일비스((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)카르바메이트)(0.700 g, 0.744 mmol)의 용액을 30℃에서 교반하였다. iPrOH(1.5 mL) 중 5 내지 6 N HCl을 적가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 18.5시간 후, ACN(3.2 mL)을 첨가하고, 슬러리를 초음파 처리한 후, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이 시간 후, 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, 3:1의 ACN:iPrOH에 이어서 ACN으로 헹구어 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5S,E)-5-에틸-6-메틸헵트-3-엔-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)카르바메이트 트리하이드로클로라이드(0.509 g, 0.636 mmol, 85.5%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 1.56분. MS(ES): C₄₀H₇₂N₄O₂의 경우 m/z = 641.4[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.38-5.45(m, 1H), 5.20(dd, 1H, J = 15.1, 8.4 Hz), 5.07(dd, 1H, J = 15.1, 8.4 Hz), 4.40-4.54(m, 1H), 3.29-3.46(m, 4H), 3.05-3.20(m, 6H), 2.92-3.02(m, 2H), 2.34-2.43(m, 2H), 1.87-2.20(m, 9H), 0.92-1.83(br. m, 22H), 1.09(s, 3H), 1.07(d, 3H, 6.6 Hz), 0.80-0.92(m, 9H), 0.77(s, 3H).

AK. 화합물 SA37: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)카르바메이트 트리하이드로클로라이드

단계 1: β-시토스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트

DCM(80　mL) 중 β-시토스테롤(8.00 g, 19.3 mmol), 트리에틸아민(5.4 mL, 39 mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘(0.471 g, 3.86 mmol)의 교반된 용액을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시켰다. 상기 용액에 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(4.277 g, 21.22 mmol)를 2분에 걸쳐 조금씩 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 서서히 실온이 되도록 하고 LCMS로 모니터링하였다. 21시간 후, 상기 반응 혼합물을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시킨 후 트리에틸아민(2.7 mL) 및 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(3.00 g)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온이 되도록 하였다. 40시간 후, 상기 반응 혼합물을 여과시키고, 여액을 얼음 배스에서 0℃로 냉각시킨 교반된 ACN(250 mL) 플라스크에 1시간에 걸쳐 적가하였다. 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, CAN으로 헹구어 β-시토스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트(9.15 g, 15.8 mmol, 81.8%)를 회백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.38분. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 8.28(m, 2H), 7.39(m, 2H), 5.37-5.49(m, 1H), 4.54-4.69(m, 1H), 2.36-2.57(m, 2H), 0.86-2.10(br. m, 27H), 1.05(s, 3H), 0.93(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.78-0.88(m, 9H), 0.69(s, 3H).

단계 2: tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 부탄-1,4-디일비스((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)카르바메이트)

tert-부틸 N-{3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]프로필}-N-[4-({3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]프로필}아미노)부틸]카르바메이트(0.564 g, 1.12 mmol), β-시토스테롤 4-나이트로페닐 카르보네이트(0.500 g, 0.862 mmol), 및 트리에틸아민(0.36 mL, 2.6 mmol)을 PhMe(5.0 mL)에서 조합하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 교반하고 TLC로 모니터링하였다. 44시간 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 상기 반응 혼합물을 물(3 x 5 mL)로 세척한 후 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 20-60% EtOAc)를 통해 정제하여 tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 부탄-1,4-디일비스((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)카르바메이트)(0.704 g, 0.746 mmol, 86.5%)를 백색 폼으로서 생성하였다. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.32-5.44(m, 1H), 5.28(br. s, 1H), 4.78(br. s, 1H), 4.43-4.58(m, 1H), 2.97-3.45(br. m, 12H), 2.20-2.43(m, 2H), 1.76-2.06(br. m, 5H), 0.87-1.73(br. m, 30H), 1.45(s, 9H), 1.43(s, 18H),1.02(s, 3H), 0.92(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.77-0.87(m, 9H), 0.68(s, 3H). UPLC/ELSD: RT = 3.51분. MS(ES): C₅₅H₉₈N₄O₈의 경우 m/z = 843.9[(M + H) - (CH₃)₂C=CH₂ - CO₂]⁺.

단계 3: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)카르바메이트 트리하이드로클로라이드

iPrOH(3.2 mL) 중 tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 부탄-1,4-디일비스((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)카르바메이트)(0.700 g, 0.742 mmol)의 교반된 용액을 30℃에서 가열하였다. 상기 용액에 iPrOH(1.5 mL) 중 5-6 N HCl을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 18.5시간 후, ACN(3.2 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 초음파 처리한 후 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이 시간 후, 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, 3:1의 ACN:iPrOH에 이어서 ACN으로 헹구어 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)카르바메이트 트리하이드로클로라이드(0.498 g, 0.639 mmol, 86.1%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 1.63분. MS(ES): C₄₀H₇₄N₄O₂의 경우 m/z = 643.4[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CD₃OD): δ 5.39-5.45(m, 1H), 4.40-4.54(m, 1H), 3.29-3.48(m, 4H), 3.05-3.19(m, 6H), 2.91-3.02(m, 2H), 2.34-2.43(m, 2H), 1.83-2.20(br. m, 9H), 0.92-1.82(br. m, 26H), 1.08(s, 3H), 0.97(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.80-0.93(m, 9H), 0.75(s, 3H).

AL. 화합물 SA38: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)아미노)-4-옥소부타노에이트 트리하이드로클로라이드

단계 1: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 9-(tert-부톡시카르보닐)-14-(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)-2,2-디메틸-4,15-디옥소-3-옥사-5,9,14-트리아자옥타데칸-18-오에이트

DCM(6.0 mL) 중 tert-부틸 N-{3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]프로필}-N-[4-({3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]프로필}아미노)부틸]카르바메이트(0.341 g, 0.678 mmol) 및 콜레스테릴 헤미숙시네이트(0.300 g, 0.616 mmol)의 교반된 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(0.177 g, 0.925 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 TLC로 모니터링하였다. 18시간 후, 물(10 mL)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이 시간 후, 층을 분리하였다. 수성 물질을 DCM으로 추출하였다(2 x 10mL). 조합된 유기물을 소수성 프릿에 통과시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 및 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 30-70% EtOAc)를 통해 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 9-(tert-부톡시카르보닐)-14-(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)-2,2-디메틸-4,15-디옥소-3-옥사-5,9,14-트리아자옥타데칸-18-오에이트(371 mg, 0.382 mmol, 62.0%)를 백색 폼으로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.37분. MS(ES): C₅₆H₉₈N₄O₉의 경우 m/z = 994.2[M + Na]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 5.31-5.49(m, 1H), 5.25(br. s, 1H), 4.74(br. s, 1H), 4.51-4.67(m, 1H), 2.95-3.53(br. m, 12H), 2.52-2.71(m, 4H), 2.23-2.38(m, 2H), 1.73-2.08(br. m, 5H), 0.93-1.72(br. m, 29H), 1.46(s, 9H), 1.44(s, 9H), 1.42(s, 9H), 1.01(s, 3H), 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.86(d, 6H, J = 6.2 Hz), 0.67(s, 3H).

단계 2: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)아미노)-4-옥소부타노에이트 트리하이드로클로라이드

iPrOH(2.5 mL) 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 9-(tert-부톡시카르보닐)-14-(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)-2,2-디메틸-4,15-디옥소-3-옥사-5,9,14-트리아자옥타데칸-18-오에이트(363 mg, 0.374 mmol)의 용액에 iPrOH(0.78 mL) 중 5-6 N HCl을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 16.5시간 후, 추가적인 iPrOH(0.20 mL) 중 5-6 N HCl을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 22.5시간 후, ACN(7.5 mL)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이 시간 후, 고체를 진공 여과에 의해 수집하고 ACN으로 헹구어 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 4-((3-아미노프로필)(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)아미노)-4-옥소부타노에이트 트리하이드로클로라이드(0.240 g, 0.285 mmol, 76.3%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 1.84분. MS(ES): C₄₁H₇₄N₄O₃의 경우 m/z = 671.9[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, CD₃OD): δ 5.35-5.41(m, 1H), 4.46-4.59(m, 1H), 3.36-3.58(m, 4H), 2.99-3.19(m, 6H), 2.86-2.94(m, 2H), 2.58-2.75(m, 4H), 2.25-2.41(m, 2H), 0.96-2.19(br. m, 34H), 1.05(s, 3H), 0.95(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.88(m, 6H, J = 6.6 Hz), 0.73(s, 3H).

AM. 화합물 SA39: N -(3-아미노프로필)-N-(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)-3 -(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)디설파닐)프로판아미드 트리하이드로클로라이드

DCM(9.2 mL) 중 tert-부틸 (3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(4-(N-(3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)-3-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)디설파닐)프로판아미도)부틸)카르바메이트(WO 98/50417 "Cationic Amphiphiles containing a Disulphide Linker for Cell Transfections"에 기재된 바와 같이 제조됨)(0.460 g, 0.464 mmol)의 교반된 용액에 디옥산(0.81 mL) 중 4 N HCl을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 LCMS로 모니터링하였다. 5시간 후 상기 반응 혼합물을 MTBE로 35 mL로 희석한 후 원심분리하였다(5000 RPM, 30분). 상청액을 따라내었다. 고체를 헵탄에 현탁시킨 후 농축시켜 N-(3-아미노프로필)-N-(4-((3-아미노프로필)아미노)부틸)-3-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,3-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)디설파닐)프로판아미드 트리하이드로클로라이드(0.288 g, 0.347 mmol, 74.9%)를 백색 고체로서 생성하였다. UPLC/ELSD: RT = 1.78분. MS(ES): C₄₀H₇₄N₄OS₂의 경우 m/z = 691.2[M + H]⁺; ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d ₆): δ 9.20(br. s, 1H), 9.11(br. s, 1H), 8.10(br. s, 4H), 7.94(br. s, 2H), 5.30-5.40(m, 1H), 3.20-3.51(br. m, 6H), 2.61-3.03(br. m, 13H), 2.20-2.35(m, 2H), 0.91-2.07(br. m, 29H), 0.96(s, 3H), 0.89(d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.7 Hz), 0.84(d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.65(s, 3H).

AN. 화합물 SA40: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

단계 1: tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 프로판-1,3-디일디카르바메이트

무수 질소 하에서 90 mL의 무수 DCM 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(5g, 10.8 mmol)의 교반된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 트리에틸아민(3 mL, 21.6 mmol)을 첨가하였다. 10 mL의 무수 DCM중 N-Boc-1,3-디아미노프로판(2.3 g, 12.9 mmol)의 용액을 15분에 걸쳐 적가하였다. 생성되는 무색 용액을 실온에서 밤새 교반하고, DCM으로 희석하고, 50% 포화 염수로 2회 세척하고, 1 N HCl 수용액으로 2회 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄), 및 여과시켰다. 여액을 무색 오일로 농축시켰으며, 이는 서서히 고형화되기 시작하였다. 이를 소량의 DCM(~10 mL)을 와류시켜(swirling) 희석하여 대부분의 물질을 용해시키고, 혼합물을 약 100 mL의 헥산으로 희석하여 백색 침전물을 제공하였다. 고체를 분쇄하였다. 상기 혼합물을 실온에서 60분 동안 격렬하게 교반하고 여과시켰다. 필터 고체를 헥산으로 세척하고 공기-건조시킨 후 진공 하에서 건조시켜 tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 프로판-1,3-디일디카르바메이트(5.45 g, 9.3 mmol, 86%)를 백색 고체로서 제공하였다. 물질은 추가 정제 없이 사용할 수 있을 만큼 충분히 순수하였다. UPLC/ELSD: RT = 3.37분. MS(ES): C₃₆H₆₂N₂O₄의 경우 m/z (MH⁺) 587.26. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.37(d, 1H, J = 5.2 Hz); 5.00(br. s, 1H); 4.84(br. s, 1H); 4.49(m, 1H); 3.19(m, 4H); 2.43-2.20(m, 2H); 2.10-1.74(m, 5H); 1.69-1.39(m, 18H); 1.38-0.94(m, 16H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.67(s, 3H).

단계 2: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

25 mL의 무수 DCM 중 tert-부틸 ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 프로판-1,3-디일디카르바메이트(2 g, 3.37 mmol)의 교반된 용액에 디에틸 에테르(8.4 mL, 16.8 mmol) 중 2 M HCl 용액을 첨가하였다. 반응 용기를 단단히 밀봉하고, 40℃로 가열하고, 및 밤새 교반하였다. 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았으므로, 혼합물을 질소 스트림에서 농축시켰다. 백색 잔류물을 디에틸 에테르로 연마하고 여과시켰다. 필터 고체를 디에틸 에테르로 세척하고, 공기-건조시킨 후, 진공 하에서 건조시켜 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염(1.65 g, 3.12 mmol, 93%)을 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.35분. MS(ES): C₃₁H₅₄N₂O₂의 경우 m/z (MH⁺) 487.12. ¹H NMR(300 MHz, CD₃OD) δ: ppm 5.38(d, 1H, J = 4.3 Hz); 4.40(m, 1H); 3.20(t, 2H, J = 6.6 Hz); 2.96(t, 2H, J = 7.4 Hz); 2.32(d, 2H, J = 7.2 Hz); 2.13-1.72(m, 7H); 1.71-1.26(m, 11H); 1.26-0.98(m, 13H); 0.95(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.88(dd, 6H, J = 0.8 Hz, 6.6 Hz); 0.72(s, 3H).

AO. 화합물 SA41: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-구아니디노프로필)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

단계 1:

15 mL의 무수 DCM 중 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-아미노프로필)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염(SA40, 600 mg, 1.13 mmol) 및 N¹,N²-비스-Boc-구아니딘-N³-트리플레이트(450 mg, 1.13 mmol)의 교반된 용액에 트리에틸아민(330 μL, 2.32 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 96시간 동안 교반한 후 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았다. 상기 혼합물을 DCM으로 희석하고, 1 N HCl 수용액으로 1회 세척하고, 포화 소듐 바이카르보네이트 수용액으로 1회 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄), 및 여과시켰다. 여액을 무색 오일로 농축시켰다. 이를 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중 0-30% EtOAc)로 정제하여 생성물(521 mg, 0.71 mmol, 62%)을 백색 고체로서 제공하였다. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 11.39(s, 1H); 8.44(br. s, 1H); 5.98(s, 1H); 5.36(d, 1H, J = 3.2 Hz); 4.50(m, 1H); 3.53(d, 2H, J = 6.9 Hz); 3.20(s, 2H); 2.43-2.120(m, 2H); 2.08-1.63(m, 7H); 1.62-1.22(m, 29H); 1.20-0.95(m, 11H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.67(s, 3H).

단계 2: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-구아니디노프로필)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염

SA41은 단계 1의 생성물을 사용하여 SA23과 동일한 방식으로 제조하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-구아니디노프로필)카르바메이트, 하이드로클로라이드 염(45 mg, 0.08 mmol, 10%)을 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.38분. MS(ES): C₃₂H₅₆N₄O₂의 경우 m/z (MH⁺) 529.30. ¹H NMR(300 MHz, CD₃OD) δ: ppm 7.88(br. s, 1H); 6.90(t, 1H, J = 6.2 Hz); 5.39(d, 1H, J = 4.9 Hz); 4.39(m, 1H); 3.18(m, 4H); 2.31(d, 2H, J = 7.1 Hz); 2.12-1.68(m, 5H); 1.66-1.27(m, 9H); 1.26-0.97(m, 14H); 0.95(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.88(dd, 6H, J = 0.8 Hz, 6.6 Hz); 0.72(s, 3H).

AP. 화합물 SA42: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-(디이소프로필아미노)프로필)카르바메이트

0℃의 무수 질소 하에서 5 mL의 무수 DCM 중 3-(디이소프로필아미노)프로필아민(175 mg, 1.09 mmol)의 교반된 용액에 5 mL의 무수 DCM 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(500 mg, 1.09 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 서서히 실온으로 가온되도록 하고 2시간 동안 교반한 후 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았다. 상기 용액을 DCM으로 희석하고, 포화 소듐 바이카르보네이트 수용액으로 1회 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄), 및 여과시켰다. 여액을 옅은 황색 오일로 농축시켰다. 이를 실리카 겔 크로마토그래피(100% DCM에서 100% DCM/MeOH/NH₄OH(80:20:1)로)로 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (3-(디이소프로필아미노)프로필)카르바메이트(392 mg, 0.66 mmol, 60%)를 무색 시럽으로 제공하였으며, 이를 정치 상태(on standing)로 고형화시켰다. UPLC/ELSD: RT = 2.55분. MS(ES): C₃₇H₆₆N₂O₂의 경우 m/z (MH⁺) 571.48. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 6.00(br. s, 1H); 5.36(d, 1H, J = 5.1 Hz); 4.48(m, 1H); 3.23(d, 2H, J = 5.6 Hz); 3.04(t, 2H, J = 6.2 Hz); 2.52(s, 2H); 2.42-2.16(m, 2H); 2.07-1.74(m, 5H); 1.72-1.06(m, 22H); 1.05-0.94(m, 16H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.3 Hz, 6.6 Hz); 0.67(s, 3H).

AQ. 화합물 SA43: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디이소프로필아미노)에틸)카르바메이트

0℃의 무수 질소 하에서 5 mL의 무수 DCM 중 3-(디이소프로필아미노)에틸아민(210 μL, 1.15 mmol)의 교반된 용액에 5 mL의 무수 DCM 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(500 mg, 1.09 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 서서히 실온으로 가온되도록 하고 2시간 동안 교반한 후 출발 물질이 LCMS에 의해 남아 있지 않았다. 상기 용액을 DCM으로 희석하고, 포화 소듐 바이카르보네이트 수용액으로 1회 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄), 및 여과시켰다. 여액을 옅은 황색 오일로 농축시켰다. 이를 실리카 겔 크로마토그래피(100% DCM에서 25% DCM / 75% DCM/MeOH/NH₄OH(80:20:1)로)로 정제하여 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 (2-(디이소프로필아미노)에틸)카르바메이트(300 mg, 0.52 mmol, 47%)를 백색 고체로서 제공하였다. UPLC/ELSD: RT = 2.62분. MS(ES): C₃₆H₆₄N₂O₂의 경우 m/z(MH⁺) 557.42. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ: ppm 5.36(d, 1H, J = 5.1 Hz); 5.06(br. s, 1H); 4.50(m, 1H); 3.12(q, 2H, J = 5.6 Hz, 11.3 Hz); 2.99(m, 2H); 2.54(t, 2H, J = 6.3 Hz); 2.42-2.17(m, 2H); 2.07-1.72(m, 5H); 1.64-1.25(m, 10H); 1.24-1.04(m, 8H); 1.03-0.94(m, 18H); 0.91(d, 3H, J = 6.5 Hz); 0.86(dd, 6H, J = 1.2 Hz, 6.6 Hz); 0.67(s, 3H).

실시예 10

인간 자궁경부암 상피 세포(HeLa) 모델의 단백질 발현 데이터

mRNA 작제물로서 NPI-Luc를 사용하여 실시예 2에 따라 LNP를 제조하였다. NPI-Luc는 신호 대 노이즈 비를 향상시키기 위해 반딧불이 루시퍼라제(Firefly Luciferase)의 N-말단에 5xV5 태그 및 C-myc 핵 국소화 서열을 첨가하여 제조한 이중 판독 리포터이다. 단백질 발현은 발광 판독값이 포함된 OneGLo 검정을 사용하거나 항-V5 항체를 이용한 면역형광으로 검출될 수 있다. 실시예 7에 기술된 절차에 따라 단백질 발현을 평가하였다. 상기 LNP를 4개의 웰에 투여하고 평균 반응을 기록하였다. HeLa 검정의 경우 발관 판독(luminescence read)(RLU)을 세포 수로 정규화하였다. 결과를 표 10a에 나타냈다.

표 10a

실시예 11

건강한 HBE 세포에서의 LNP 세포 흡수 및 단백질 발현 데이터

mRNA 작제물로서 NPI-Luc를 사용하여 실시예 2에 따라 LNP를 제조하였다. NPI-Luc는 신호 대 노이즈 비를 향상시키기 위해 반딧불이 루시퍼라제의 N-말단에 5xV5 태그 및 C-myc 핵 국소화 서열을 첨가하여 제조한 이중 판독 리포터이다. 단백질 발현은 발광 판독값이 포함된 OneGLo 검정을 사용하거나 항-V5 항체를 이용한 면역형광으로 검출할 수 있다. 실시예 6에 기술된 절차에 따라 LNP 세포 흡수 및 단백질 발현을 평가하였다. 결과를 표 11a에 나타냈다.

표 11a

실시예 12

나노입자 제타 전위

실시예 2에 따라 LNP를 제조하였다. Malvern Zetasizer(Nano ZS) 상에서 LNP를 0.1X PBS에서 [mRNA] 0.01 mg/mL로 희석하여 제타 전위를 측정하였다. 그 결과를 표 12a에 나타냈다.

표 12a

실시예 13

생체내 연구

투여 절차 A: 기관내 mRNA 전달

동물을 이소플루란 하에서 마취시킨다. 혀를 이동시키고 직경이 작은 캐뉼라를 기관(구인두 경로)으로 삽입한다. 상기 캐뉼라 팁은 성대를 통해 기관 아래로 통과시켜 상기 팁이 분기부(carina)에 매우 근접하지만, 닿지는 않도록 한다. 배치 시, 50 μL(마우스) 또는 200 μL(래트)의 제형을 폐로 주입한다. 30초 동안 직립시킨 후, 동물을 회복 케이지로 풀어주고 회복되면 이들의 각자의 케이지로 되돌려 보낸다.

투여 절차 B: 코-전용 에어로졸 노출

진동 메쉬 분무기 및 지정된 유입 공기 유량을 사용하여 에어로졸을 생성한다. 에어로졸은 노출 층(exposure tier)으로 유동하기 전에 우선 혼합 챔버를 통과하여 설치류 코-전용 유도 유동 노출 챔버로 도입된다. 동물은 각각의 코 포트에서 신선한 에어로졸에 노출되며, 이어서 이는 시스템 외부로 배출된다.

연구 개시 전 3일 동안 코-전용 투여 콘(dosing cone)에 대해 동물을 훈련시켰다. 연구일에, 동물을 투여 콘에 배치시킨 후 0.4, 0.6 및 1.1 mpk의 폐 투여량에 대해 그룹당 60, 120 또는 240분의 지정된 노출 시간 동안 동물을 에어로졸 노출 챔버에 부착시켰다. 전체 노출 기간 동안 동물을 지속적으로 모니터링하고 후속적으로 임의의 관찰 가능한 부작용에 대해 모니터링하였다. 에어로졸 농도(mRNA) 및 공기역학적 입자 크기 분포를 각각의 투여 시점 전후에 투여 포트에서 모니터링하여 달성된 투여량 수준 및 호흡 가능한 에어로졸 입자 크기 목표(래트의 경우 1-4 μm)를 각각 평가하였다.

샘플 수집 및 검정 절차 A: 조직학을 위한 조직 수집

에어로졸 연구를 위한 기관, 폐 및 비강, 비인두 및 후두를 분석을 위해 수집한다. 폐는 10% NBF 고정제로 팽창시키고 기관은 팽창을 유지하기 위해 묶어 두었다. 폐를 부착된 기관, 기관지 및 엽(lobe)과 함께 일괄 제거한다. 전체 폐를 일괄적으로 실온에서 10% NBF에 적어도 24시간 최대 48시간 동안 고정한 후 고정제로부터 제거하여 PBS에 넣는다. 샘플을 즉시 보내어 파라핀 5-미크론 절편 및 H&E 염색을 위해 처리되도록 한다.

에어로졸 연구를 위해, 기관 및 폐 외에도 비강, 비인두 및 후두 또한 수집하였다.

샘플 수집 및 검정 절차 B: 면역조직화학(IHC; Immunohistochemistry)

IHC는 Leica Bond RX 자동염색기(autostainer)를 사용하여 FFPE 절편 상에서 수행되었다. NPI-Luc 단백질 발현은 1:100 희석에서 항-V5 태그 항체에 의해 검출되었다. V5 항체는 Bond Polymer Refine Detection 키트에 이어서 헤마톡실린 및 청색화 시약 대조염색으로 검출되었다. 이미지는 Panoramic 250 Flash III 전체 슬라이드 스캐너를 이용하여 20X 배율로 이미징되었다. 이미지 분석은 Indica Labs HALO 이미지 분석 소프트웨어로 완료하였다. 기관, 폐 및/또는 비강 이미지를 분석하여 총 기관, 기관지 또는 비강 상피 세포를 포착하고 데이터는 적절한 경우 동물당 총 상피 세포당 % V5 양성 상피 세포로 표현하였다.

기관내 전달에 의한 mRNA-LNP의 단일 투여 후 마우스에서의 LNP 단백질 발현 데이터

mRNA 작제물로서 NPI-Luc를 사용하여 실시예 2에 따라 LNP를 제조하였다. LNP는 ~0.7 mpk의 용량으로 기관내 주입에 의해 마우스에 전달되었다. 호흡기 상피에서의 LNP 단백질 발현을 샘플 수집 및 검정 절차 A 및 B에 따라 평가하였다. 결과를 표 13a에 나타냈다. 주로 외부 표면 상에 배치된 양이온제가 포함된 LNP는 기관 및 기관지에서 양성 호흡기 상피 단백질 발현을 나타냈다.

표 13a

기관내 전달에 의한 mRNA-LNP의 단일 투여 후 래트에서의 LNP 단백질 발현 데이터

mRNA 작제물로서 NPI-Luc를 사용하여 실시예 2에 따라 LNP를 제조하였다. LNP는 ~1.2 mpk의 용량으로 기관내 점적주입에 의해 래트에 전달되었다. 호흡기 상피에서의 LNP 단백질 발현을 샘플 수집 및 검정 절차 A 및 B에 따라 평가하였다. 결과를 표 13b에 나타냈다. 주로 외부 표면 상에 배치된 양이온제가 포함된 LNP는 기관 및 기관지에서 양성 호흡기 상피 단백질 발현을 나타냈다.

표 13b

에어로졸 전달에 의한 mRNA-LNP의 단일 투여 후 래트에서의 LNP 단백질 발현 데이터

mRNA 작제물로서 NPI-Luc를 사용하여 실시예 8에 따라 LNP를 제조하였다. LNP는 코-전용 에어로졸 투여 시스템을 사용하여 에어로졸 전달에 의해 래트에게 전달되었다. 호흡기 상피에서의 LNP 단백질 발현을 샘플 수집 및 검정 절차 A 및 B에 따라 평가하였다. 결과를 표 13c에 나타냈다. 비강, 기관 및 기관지의 호흡 상피는 LNP의 에어로졸 전달 후 단백질 발현에 대해 양성이었다.

표 13c

본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.

Claims

나노입자로서,
(a) 지질 나노입자 코어,
(b) 세포로의 전달을 위해 상기 코어 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드, 및
(c) 주로 상기 코어의 외부 표면 상에 배치된 양이온제를 포함하며,
여기서 상기 나노입자는 생리학적 pH에서 중성 제타 전위 초과인, 나노입자.
나노입자로서,
(a) 하기를 포함하는 지질 나노입자 코어:
(i) 이온화 가능한 지질,
(ii) 인지질,
(iii) 구조적 지질, 및
(iv) PEG-지질, 및
(b) 세포로의 전달을 위해 상기 코어 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드, 및
(c) 양이온제를 포함하는 것인, 나노입자.
나노입자로서,
(a) 지질 나노입자 코어,
(b) 세포로의 전달을 위해 상기 코어 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드, 및
(c) 양이온제를 포함하며,
여기서 상기 나노입자는 상피 세포에서 적어도 약 20%의 세포 축적을 나타내고 상피 세포에서 약 5% 이상의 발현을 나타내는 것인, 나노입자.
나노입자로서,
(a) 지질 나노입자 코어,
(b) 세포로의 전달을 위해 상기 코어 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드, 및
(c) 양이온제를 포함하며,
여기서 상기 나노입자는 세포에서 약 0.5% 내지 50%의 단백질 발현을 나타내고, 여기서 상기 세포는 생체내에 존재하는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제 대 폴리뉴클레오티드 페이로드의 중량비가 약 1:1 내지 약 4:1, 약 1.25:1 내지 약 3.75:1, 약 1.25:1, 약 2.5:1, 또는 약 3.75:1인, 나노입자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 약 5 mV 내지 약 20 mV, 약 5 mV 내지 약 20 mV, 약 5 mV 내지 약 15 mV, 또는 약 5 mV 내지 약 10 mV의 제타 전위를 갖는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 나노입자 코어가 중성 pH에서 중성 전하를 갖는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제의 약 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 95% 초과가 상기 나노입자 상의 표면 상에 존재하는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드의 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%가 상기 코어 내에 캡슐화되는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 약 0.4 미만, 약 0.3 미만, 또는 약 0.2 미만의 다분산도 값을 갖는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 120 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 80 nm의 평균 직경을 갖는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 라우르단의 일반화 분극(GPL)이 약 0.6 이상인, 나노입자.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 약 6 nm 초과 또는 약 7 nm 초과의 면간 거리(d-spacing)를 갖는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 임계 분극화 수준 초과의 표면 유동성 값을 갖는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 세포의 집단과 접촉할 때 세포 집단의 약 10% 이상, 약 15% 이상, 또는 약 20% 이상이 상기 나노입자를 축적한 것인, 나노입자.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 세포의 집단과 접촉할 때 세포의 약 5% 이상, 또는 약 10% 이상이 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 상피 세포 집단인, 나노입자.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 호흡기 상피 세포 집단인, 나노입자.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 비 세포(nasal cell) 집단인, 나노입자.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 폐포 상피 세포 집단인, 나노입자.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 폐 세포 집단인, 나노입자.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 기관지 상피 세포 집단인, 나노입자.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 HBE 집단인, 나노입자.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 알코올에서 약 1 mg/mL 초과, 약 5 mg/mL 초과, 약 10 mg/mL 초과, 또는 약 20 mg/mL 초과의 용해도를 갖는 것인, 나노입자.
제24항에 있어서, 상기 알코올이 C_1-6알코올인, 나노입자.
제25항에 있어서, 상기 알코올이 에탄올인, 나노입자.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 양이온성 지질인, 나노입자.
제27항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 수용성 양친매성 분자인, 나노입자.
제28항에 있어서, 상기 양친매성 분자가 지질 모이어티 및 친수성 모이어티를 포함하는 것인, 나노입자.
제29항에 있어서, 상기 지질 모이어티가 구조적 지질, 지방산, 또는 하이드로카르빌기를 포함하는 것인, 나노입자.
제27항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 소수성 모이어티 및 친수성 모이어티를 포함하는 스테롤 아민인, 나노입자.
제31항에 있어서, 상기 친수성 모이어티가 1개 내지 4개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 혼합물을 포함하는 아민기를 포함하는 것인, 나노입자.
제32항에 있어서, 상기 아민기가 1개 또는 2개의 말단 1차 아민을 포함하는 것인, 나노입자.
제32항에 있어서, 상기 아민기가 1개 또는 2개의 말단 1차 아민 및 1개의 내부 2차 아민을 포함하는 것인, 나노입자.
제32항에 있어서, 상기 아민기가 1개 또는 2개의 3차 아민을 포함하는 것인, 나노입자.
제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아민기가 약 8 초과의 pKa 값을 갖는 것인, 나노입자.
제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아민기가 약 9 초과의 pKa 값을 갖는 것인, 나노입자.
제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테롤 아민이 화학식 (A1)의 화합물:
A-L-B (A1)
또는 이의 염이며, 여기서:
A는 아민기이고, L은 임의의 링커이고, 및 B는 스테롤인, 나노입자.
제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테롤 아민이 화학식 A2a:

(A2a)
또는 이의 염을 가지며, 여기서:
----는 단일 또는 이중 결합이고
R¹은 C_1-14알킬 또는 C_1-14알케닐이고;
L^a는 부재하거나, -O-, -S-S-, -OC(=O), -C(=O)N-, -OC(=O)N-, CH₂-NH-C(O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-, -S-S-CH₂, -SS-CH₂-CH₂-C(=O)N-, 또는 화학식 (a)의 기:

(a)이고;
Y¹은 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고,
여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고;
그리고 여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, 할로, OH, -O(C_1-6알킬), -C_1-6알킬-OH, NH₂, -NH(C_1-6알킬), N(C_1-6알킬)₂, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬(1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-14알킬로 임의로 치환됨), 5원 내지 6원 헤테로아릴, -NH-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -NH(5원 내지 6원 헤테로아릴)로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 그리고
n은 1 또는 2인, 나노입자.
제39항에 있어서, ----이 이중 결합인, 나노입자.
제39항에 있어서, ----이 단일 결합인, 나노입자.
제39항 또는 제40항에 있어서, L^a가 -OC(=O), -OC(=O)N-, 또는 -OC(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-인, 나노입자.
제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1인, 나노입자.
제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, n이 2인, 나노입자.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 C_1-14알킬인, 나노입자.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 C_1-14알케닐인, 나노입자.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이

,
, 또는
인, 나노입자.
제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, Y¹이 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, -C_1-6 알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고,
여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고;
그리고 여기서 상기 C_1-10알킬, C_1-6 알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, OH, -C_1-6알킬-OH, 또는 NH₂로 임의로 치환되는 것인, 나노입자.
제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, Y¹이 하기로부터 선택되는 것인, 나노입자:
(1)
; (2)
; (3)

; (4)
; (5)
; (6)
;
(7)
; (8)
; (9)
; (10)
; (11)
; (12)
;
(13)
; (14)
; (15)
; (16)

; (17)
; (18)
; (19)

; (20)
; (21)
(22)

; (23)
; (28) N(CH₃)₂; (29)

; (30)
; (31)
; 및 (32)

.
제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테롤 아민이 화학식 A4

(A4)
또는 이의 염을 가지며, 여기서:
Z¹은 OH 또는 C_3-6 알킬이고;
L은 부재하거나, -O-, -S-S-, -OC(=O), -C(=O)N-, -OC(=O)N-, -CH₂-NH-C(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-, -S-S-CH₂, 또는 -SS-CH₂-CH₂-C(O)N-이고;
Y¹은 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6 알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고,
여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고;
그리고 여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, 할로, OH, -O(C_1-6알킬), -C_1-6 알킬-OH, NH₂, -NH(C_1-6알킬), -N(C_1-6알킬)₂, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬(1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-14알킬로 임의로 치환됨), 5원 내지 6원 헤테로아릴, -NH(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -NH(5원 내지 6원 헤테로아릴)로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 그리고
n은 1 또는 2인, 나노입자.
제50항에 있어서, Z¹이 OH인, 나노입자.
제50항에 있어서, Z¹이 C_3-6알킬인, 나노입자.
제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, L이 -C(=O)N-, -CH₂-NH-C(=O)-, 또는 -C(=O)O-인, 나노입자.
제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, Y¹이 1개내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-10알킬인, 나노입자.
제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, Y¹이
인, 나노입자.
제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1인, 나노입자.
제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, n이 2인, 나노입자.
제38항에 있어서, 상기 스테롤 아민이 하기:

또는 이들의 염으로부터 선택되는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 비-지질 양이온제인, 나노입자.
제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-지질 양이온제가 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리듐 클로라이드, L-리신 모노하이드레이트, 또는 트로메타민인, 나노입자.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 변형된 아르기닌인, 나노입자.
제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 약 30 mol% 내지 약 60 mol% 또는 약 40 mol% 내지 약 50 mol%의 이온화 가능한 지질을 포함하는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 화합물 18:

(화합물 18), 또는 이의 염인, 나노입자.
제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 약 5 mol% 내지 약 15 mol%, 약 8 mol% 내지 약 13 mol%, 또는 약 10 mol% 내지 약 12 mol%의 인지질을 포함하는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질이 1,2 디스테아로일 sn 글리세로 3 포스포콜린(DSPC)인, 나노입자.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 약 20 mol% 내지 약 60 mol%, 약 30 mol% 내지 약 50 mol%, 약 35 mol%, 또는 약 40 mol%의 구조적 지질을 포함하는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조적 지질이 스테로이드, 디테르페니오드, 트리테르페노이드, 콜레스탄, 및 우르솔산, 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조적 지질이 콜레스테롤 및 피스토스테롤로부터 선택되는 스테로이드인, 나노입자.
제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조적 지질이 콜레스테롤 또는 하기 구조를 갖는 화합물인, 나노입자:

.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티딘산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 디알킬아민, PEG-변형된 디아실글리세롤, PEG-변형된 디알킬글리세롤, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 PEG-DMG인, 나노입자.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 DMG-PEG 2k인, 나노입자.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 화합물 428인, 나노입자.
제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 약 1 mol% 내지 약 5 mol%의 PEG-지질, 또는 약 1 mol% 내지 약 2.5 mol%의 PEG-지질을 포함하는 것인, 나노입자.
제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는 세포.
제75항에 있어서, 상기 세포가 상피 세포인, 세포.
제75항에 있어서, 상기 세포가 호흡기 상피 세포인, 세포.
제75항에 있어서, 상기 세포가 비 세포인, 세포.
제75항에 있어서, 상기 세포가 폐포 상피 세포인, 세포.
제75항에 있어서, 상기 세포가 폐 세포인, 세포.
제75항에 있어서, 상기 세포가 기관지 상피 세포인, 세포.
제75항에 있어서, 상기 세포가 인간 기관지 상피(HBE) 세포인, 세포.
제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물.
제83항에 있어서, 상기 조성물이 액체 형태인, 약제학적 조성물.
제83항에 있어서, 상기 조성물이 흡입에 적합한 것인, 약제학적 조성물.
지질 나노입자를 양이온제와 접촉시키는 것을 포함하는 나노입자를 제조하는 공정으로서, 상기 지질 나노입자가:
(a) 하기를 포함하는 지질 나노입자 코어:
(i) 이온화 가능한 지질,
(ii) 인지질,
(iii) 구조적 지질, 및
(iv) PEG-지질, 및
(b) 세포로의 전달을 위해 상기 코어 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드를 포함하는 것인, 공정.
제86항에 있어서, 상기 지질 나노입자를 양이온제와 접촉시키는 것이 상기 양이온제를 비-이온성 부형제에 용해시키는 것을 포함하는 것인, 공정.
제87항에 있어서, 상기 비-이온성 부형제가 마크로골 15 하이드록시스테아레이트(HS 15)인, 공정.
제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 스테롤 아민인, 공정.
제89항에 있어서, 상기 스테롤 아민이 GL-67:

(GL-67) 또는 이의 염인, 공정.
제86항 내지 제90항 중 어느 한 항의 공정에 의해 제조되는 나노입자.
세포를 제1항 내지 제74항 및 제91항 중 어느 한 항의 나노입자와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 페이로드를 전달하는 방법.
질환의 치료 또는 예방을 위한 페이로드를 포함하는 제1항 내지 제74항 및 제91항 중 어느 한 항의 나노입자 또는 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
제93항에 있어서, 상기 질환이 낭포성 섬유증인, 방법.
제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 나노입자 또는 조성물이 비내, 기관지내, 또는 폐 투여에 의해 투여되는 것인, 방법.
제95항에 있어서, 상기 나노입자 또는 조성물이 분무기 또는 흡입기에 의해 투여되는 것인, 방법.
화학식 A2a의 화합물:

(A2a)
또는 이의 염으로서, 여기서:
----는 단일 또는 이중 결합이고
R¹은 C_1-14 알킬 또는 C_1-14 알케닐이고;
L^a는 부재하거나, -O-, -S-S-, -OC(=O), -C(=O)N-, -OC(=O)N-, CH₂-NH-C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-, -S-S-CH₂, -SS-CH₂-CH₂-C(O)N-, 또는 화학식 (a)의 기:

(a)이고;
Y¹은 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고,
여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고;
그리고 여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, 할로, OH, -O(C_1-6알킬), -C_1-6알킬-OH, NH₂, NH(C_1-6알킬), N(C_1-6알킬)₂, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬(1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-14알킬로 임의로 치환됨), 5원 내지 6원 헤테로아릴, -NH-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -NH(5원 내지 6원 헤테로아릴)로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 그리고
n은 1 또는 2이되;
단, 상기 화학식 A2a의 화합물은 하기가 아닌 것인, 화합물 또는 이의 염:

(SA1)

(SA2)

(SA3)

(SA4)

(SA5)

(SA9)

(SA10)

(SA11)

(SA22)

(SA23)

(SA29)

(SA30)

(SA39)
및

(SA40).
제97항에 있어서, ----이 이중 결합인, 화합물 또는 이의 염.
제97항에 있어서, ----이 단일 결합인, 화합물 또는 이의 염.
제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, L^a가 -OC(=O), -OC(=O)N-, 또는 -OC(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-인, 화합물 또는 이의 염.
제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1인, 화합물 또는 이의 염.
제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, n이 2인, 화합물 또는 이의 염.
제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 C_1-14 알킬인, 화합물또는 이의 염.
제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 C_1-14알케닐인, 화합물 또는 이의 염.
제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이

,
, 또는
인, 화합물 또는 이의 염.
제97항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, Y¹이 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, -C_1-6 알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고,
여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고;
그리고 여기서 상기 C_1-10알킬, C_1-6 알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, OH, -C_1-6알킬-OH, 또는 NH₂로 임의로 치환되는 것인, 화합물 또는 이의 염.
제97항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, Y¹이
(1)
; (2)
; (3)

; (4)
; (5)
; (6)
;
(7)
; (8)
; (9)
; (10)
; (11)
; (12)
;
(13)
; (14)
; (15)
; (16)

; (17)
; (18)
; (19)

; (20)
; (21)
(22)

; (23)
; (28) N(CH₃)₂; (30)

; (31)
; (32)
; 및 (33)

인, 화합물 또는 이의 염.
화학식 A4의 화합물:

(A4)
또는 이의 염으로서, 여기서:
Z¹은 OH 또는 C_3-6 알킬이고;
L은 부재하거나, -O-, -S-S-, -OC(=O), -C(=O)N-, -OC(=O)N-, -CH₂-NH-C(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)N-, -S-S-CH₂, 또는 -SS-CH₂-CH₂-C(O)N-이고;
Y¹은 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6 알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 또는 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)이고,
여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하고;
그리고 여기서 상기 C_1-10알킬, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬, 5원 내지 6원 헤테로아릴, -C_1-6알킬-(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -C_1-6알킬-(5원 내지 6원 헤테로아릴)은 각각 C_1-6알킬, 할로, OH, -O(C_1-6알킬), -C_1-6 알킬-OH, NH₂, -NH(C_1-6알킬), -N(C_1-6알킬)₂, 3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬(1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-14알킬로 임의로 치환됨), 5원 내지 6원 헤테로아릴, -NH(3원 내지 8원 헤테로사이클로알킬), 및 -NH(5원 내지 6원 헤테로아릴)로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 그리고
n은 1 또는 2인, 화합물 또는 이의 염.
제108항에 있어서, Z¹이 OH인, 화합물 또는 이의 염.
제108항에 있어서, Z¹이 C_3-6알킬인, 화합물 또는 이의 염.
제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, L이 -C(=O)N-, -CH₂-NH-C(=O)-, 또는 -C(=O)O-인, 화합물 또는 이의 염.
제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, Y¹이 1개 내지 5개의 1차, 2차, 또는 3차 아민 또는 이들의 조합을 포함하는 C_1-10알킬인, 화합물 또는 이의 염.
제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, Y¹이

인, 화합물 또는 이의 염.
제108항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1인, 화합물 또는 이의 염.
제108항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, n이 2인, 화합물 또는 이의 염.
하기로부터 선택되는, 화합물, 또는 이의 염:

.
제97항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 이의 염, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
제117항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체가 비-이온성 부형제인, 조성물.
제118항에 있어서, 상기 비-이온성 부형제가 HS15인, 조성물.