CN117263818A - 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及药物载体的领域，具体公开了阳离子脂质化合物及其制备方法和应用，所述阳离子脂质化合物包括式I所示的化合物；式I中，n=1、2、3或4；R1和R2各自独立地选自式II所示的二级长链烷基酯；式II中，n1=2、4或6；n2=5、7、9或11；n3=5、7、9或11。将上述阳离子脂质化合物与磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质组合，可以制成LNP载体，进而包裹核酸药物制成相应的药物。本申请所述的阳离子脂质化合物的生产原料易得，合成步骤简单，且具有良好的药物递送效果，相应的药物可高效进入受体细胞，并激活机体的免疫应答，具有实际应用的价值。

Description

阳离子脂质化合物及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及药物载体的技术领域，更具体地说，涉及阳离子脂质化合物及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是将目的基因导入患者体内，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，从而使疾病得到治疗，是现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术。基因治疗作为疾病治疗的新手段，已有一些成功的应用，取得的科学性突破将继续推动基因治疗向主流医疗发展。常见的基因药物有质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)、反义寡核苷酸(antisense ODN)、小干扰RNA(siRNA)、小发卡RNA(shRNA)和信使RNA(mRNA)。mRNA是一类包含特定遗传信息的单链核糖核酸，它能够将所携带的遗传信息传递到细胞内的核糖体，并在那里作为模板指导机体合成特定的目标蛋白。相比于难以跨过细胞膜的传统蛋白药物，mRNA的作用机制使其能够向机体递送跨膜或胞内蛋白，因此使得治疗或预防更多的疾病成为可能。mRNA的上述优势也使其成为未来药物开发的趋势。
基因治疗的关键在于将基因药物在体内输送到靶细胞，使其发挥作用。然而，直接将外源基因引入体内，会被体内的核酸酶降解，在未进入靶细胞之前，便被降解成小分子核苷酸，从而失去治疗作用。因此，实现基因治疗的关键在于构建高效、安全的基因递送系统。
基因载体在运送基因时要经历多个复杂的过程：通过血液循环到达靶细胞、细胞摄取、内涵体逃逸、胞内运动以及载体释放基因物质等，其主要障碍是复杂血液环境的细胞外障碍和溶酶体酶降解的细胞内障碍。因此如何寻找良好的基因载体，使得靶基因到达靶点发挥效用，是基因载体研究者亟待解决的问题。
目前，基因输送载体系统主要分为两大类：一是病毒载体系统，二是非病毒载体系统。病毒载体是一种天然的载体资源，病毒基因组结构简单、转染效率高、靶细胞特异性强，但其导向性差、携带能力低，且具有免疫原性和潜在致瘤性，使其难以达到临床应用的要求。因此，多样性、无免疫原性及易于控制生产的非病毒载体系统近年来备受关注，并在很多治疗领域有所应用。
常用的非病毒载体系统主要是脂质载体。脂质载体通常含有阳离子脂质的正电荷，通过静电作用与带负电的基因药物结合，从而将基因物质浓缩包装成较小粒径的粒子，形成脂质纳米粒(LNP)。LNP在基因输送载体的制备和细胞转染方面显示出了其他类型脂质体无法比拟的优势。复合物较小的粒径降低了被体内巨嗜细胞识别、吞噬、清除的机会，提高了药物的体内生物利用度。同时，针对于肿瘤组织，复合物较小的粒径更容易通过渗透和滞留效应从血管内皮细胞间隙透过进入肿瘤实质，增加在肿瘤组织的药物聚集。在转染方面，由于细胞表面略微带有负电，带正电的脂质体更容易吸附到细胞表面，通过内吞等机制进入细胞，大大增加了脂质体的转染能力。
目前，LNP因其结构简单、操作简便、生物安全性高等特点成为了应用最为广泛的非病毒载体，但大部分LNP的制备过程复杂，不易进行放大生产。因此，如何提供一种制备方法简单、治疗效果好的非病毒载体系统，已成为亟待解决的问题。
发明内容
为了提高基因载体的药物递送效果并简化其合成步骤，本申请提供阳离子脂质化合物及其制备方法和应用。此类阳离子脂质化合物带有正电，更易进入细胞内，从而更好地递送药物，产生更好的治疗效果，且合成简单，容易制备，具有实际应用的价值。
第一方面，本申请提供阳离子脂质化合物，采用如下技术方案：
阳离子脂质化合物，所述阳离子脂质化合物包括式I所示的化合物；
式I中，n＝1、2、3或4；
R1和R2各自独立地选自式II所示的二级长链烷基酯；
式II中，n1＝2、4或6；n2＝5、7、9或11；n3＝5、7、9或11。
本申请中，将3-((2-(二甲氨基)乙烷基)(甲基)氨基)丙酸和二级长链烷基酯相结合获得的两亲性衍生物作为基因药物的载体系统中的阳离子脂质组分，其带有正电荷，因此能更好地递送基因药物，达到了更好的基因治疗效果。此类阳离子脂质化合物合成步骤简单，原材料简单易得，可以实现大规模生产。
本申请中，所述阳离子脂质化合物中共含有3个酯基，这3个酯基的空间位置直接影响阳离子脂质化合物功能的发挥，而烷基链上的碳原子数会影响酯基的空间结构，经试验验证，当n＝1、2、3或4，n1＝2、4或6，n2＝5、7、9或11，n3＝5、7、9或11时，阳离子化合物对基因药物的装载及递送效果最好，从而达到最佳的治疗效果。
作为优选技术方案，本申请所述阳离子脂质化合物包括式III、式IV、式V、式VI或式VII所示的化合物。
第二方面，本申请提供一种阳离子脂质化合物的制备方法，采用如下技术方案：一种阳离子脂质化合物的制备方法，所述阳离子脂质化合物的制备方法包括以下步骤：
以溴代酯类化合物为原料，依次进行烷基化反应、还原反应，
再与酰氯类化合物发生缩合反应，依次进行两步取代反应和一次水解反应，最后与一元仲醇类化合物进行酯化反应，制得所述阳离子脂质化合物。
作为优选技术方案，所述阳离子脂质化合物的制备方法包括以下步骤：
(1)溴代酯类化合物与TosMIC(对甲苯磺酰基异腈)和NaH发生烷基化反应，生成中间产物2；
(2)中间产物2在酸性条件下发生反应，生成中间产物3；
(3)中间产物3与NaBH4发生还原反应，生成中间产物4；
(4)中间产物4与酰氯类化合物发生缩合反应，生成中间产物5；
(5)中间产物5与NaI发生取代反应，生成中间产物6；
(6)中间产物6与N,N,N'-三甲基乙二胺发生取代反应，生成中间产物7；
(7)中间产物7与LiOH发生水解反应，生成中间产物8；
(8)中间产物8与一元仲醇类化合物发生酯化反应，得到所述阳离子脂质化合物。
本申请中，步骤(1)中的原材料为溴代酯类化合物，在实际的生产过程中，可根据合成的具体的阳离子脂质化合物的结构进行具体地选择。
优选地，所述溴代酯类化合物包括8-溴辛酸乙酯、6-溴己酸乙酯或4-溴丁酸乙酯。
优选地，步骤(1)中，TBAI(四丁基碘化铵)作为反应的催化剂。
优选地，步骤(1)中，反应的溶剂包括DMSO(二甲基亚砜)溶液。
优选地，步骤(1)中，反应条件为在室温下进行。
优选地，步骤(2)中，反应的溶剂包括DCM(二氯甲烷)和浓硫酸的混合溶液，二者的体积比为DCM:浓硫酸＝(3.5～8):1。
本申请中，浓硫酸为步骤(2)中反应的进行提供酸性环境。
优选地，步骤(2)中，反应条件为在室温下进行。
在本申请中，中间产物3为对称的酮类化合物。
优选地，步骤(3)中，反应的溶剂包括THF(四氢呋喃)和乙醇的混合溶液，二者的体积比为THF:乙醇＝(2～4):1。
优选地，步骤(3)中，反应条件为在室温下进行。
在本申请中，中间产物4为醇类化合物。
在本申请中，步骤(4)中的酰氯类化合物为含有不同碳原子数的、末端未被卤素取代的一类化合物的统称，在实际的生产过程中，可根据合成的具体的阳离子脂质化合物的结构进行具体地选择。
优选地，所述酰氯类化合物包括3-氯丙酰氯、2-氯乙酰氯、4-氯丁酰氯或5-氯戊酰氯。
优选地，步骤(4)中，反应的溶剂包括含有吡啶的DCM溶液，其中，吡啶的浓度为73～134mM。
优选地，步骤(4)中，反应条件为在室温下进行。
优选地，步骤(5)中，反应的溶剂包括丙酮溶液。
优选地，步骤(5)中，反应条件为在68～72℃下进行，反应的温度例如可以使68℃、70℃、72℃、68～70℃、68～72℃或70～72℃等。
优选地，步骤(6)中，反应的溶剂包括DCM溶液。
优选地，步骤(6)中，反应条件为在室温下进行。
优选地，步骤(7)中，反应的溶剂包括乙醇和水的混合溶液，二者的体积比为乙醇:水＝1:(1.5～3)。
优选地，步骤(7)中，反应条件为在室温下进行。
优选地，步骤(8)中，DMAP(4-二甲氨基吡啶)和DCC(二环己基碳二亚胺)作为反应的催化剂。
优选地，步骤(8)中，反应的溶剂包括DCM溶液。
优选地，步骤(8)中，反应条件为在室温下进行。
在本申请中，在步骤(8)中，所述一元仲醇类化合物为含有不同碳原子数的一元醇，且羟基不在1号位上，在实际的生产过程中，可根据合成的具体的阳离子脂质化合物的结构进行具体地选择。
优选地，所述一元仲醇类化合物包括13-二十五醇、11-二十一醇、9-十七醇、7-十五醇或9-二十一醇。
第三方面，本申请提供一种LNP载体，采用如下技术方案：
一种LNP载体，所述LNP载体含有第一方面所述的阳离子脂质化合物中的任意一种或至少两种的组合。
本申请中，所述的LNP载体中的阳离子脂质化合物可以为单一的阳离子脂质化合物，也可以为多种阳离子脂质化合物的组合。
优选地，以摩尔分数计，所述阳离子脂质化合物在所述LNP载体中的摩尔分数为15％～70％，例如可以是15％、30％、45％、60％、70％、15％～30％、15％～45％、15％～60％、15％～70％、30％～45％、30％～60％、30％～70％、45％～60％、45％～70％或60％～70％等。
本申请中，当所述LNP载体中的阳离子脂质化合物为一种时，则其在LNP载体中的摩尔分数为15％～70％；当所述LNP载体中的阳离子脂质化合物为多种的组合时，则多种阳离子脂质化合物的组合的总量在LNP载体中的摩尔分数为15％～70％。
优选的，以摩尔分数计，所述LNP载体还包括磷脂8％～30％、胆固醇15％～65％和聚乙二醇脂质1.5％～3％。
优选地，所述磷脂在所述LNP载体中的摩尔分数为8％～30％，例如可以是8％、10％、15％、20％、25％、30％、8％～10％、8％～15％、8％～20％、8％～25％、8％～30％、10％～15％、10％～20％、10％～25％、10％～30％、15％～20％、15％～25％、15％～30％、20％～25％、20％～30％或25％～30％等。
优选地，所述胆固醇在所述LNP载体中的摩尔分数为15％～65％，例如可以是15％、30％、45％、65％、15％～30％、15％～45％、15％～65％、30％～45％、30％～65％或45％～65％等。
优选地，所述聚乙二醇脂质在所述LNP载体中的摩尔分数为1.5％～3％，例如可以是1.5％、2％、2.5％、3％、1.5％～2％、1.5％～2.5％、1.5％～3％、2％～2.5％、2％～3％或2.5％～3％等。
作为优选技术方案，以摩尔分数计，所述LNP载体包括阳离子脂质化合物15％～70％、磷脂8％～30％、胆固醇15％～65％和聚乙二醇脂质1.5％～3％。
本申请中，通过对LNP载体的组分及其各自的添加量进行优化，产生了协同增益的技术效果，装载的药物总量更多，对细胞的吸附效果更好，从而发挥更好的载药效果，提升药物的利用率，治疗效果更好。
第四方面，本申请提供了一种药物，采用如下技术方案：
一种药物，所述药物包括第三方面所述的LNP载体。
优选地，所述药物还包括核酸药物。
优选地，所述药物中，LNP载体中的阳离子脂质化合物的氮含量与核酸药物中的磷含量的摩尔比(即N/P摩尔比)为(2～6):1，例如可以是2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、(2～3):1、(2～4):1、(2～5):1、(2～6):1、(3～4):1、(3～5):1、(3～6):1、(4～5):1、(4～6):1或(5～6):1等。
本申请中，阳离子脂质化合物与核酸药物的比例直接影响药物的包封率以及后续的释药效果，经试验验证，当LNP载体中的阳离子脂质化合物的氮含量与核酸药物中的磷含量的摩尔比为(2～6):1时，药物的包封率最高，治疗效果最好，并且可以提高原料的利用率，节约生产成本。
第五方面，本申请提供上述药物的制备方法，采用如下技术方案：
一种药物的制备方法，所述药物的制备方法包括以下步骤：
称取除阳离子脂质化合物外的其它组分，溶解，制成储备液；
向所述储备液中加入阳离子脂质化合物，混合，得到脂质醇相；
稀释核酸药物，制成核酸水相；
将所述脂质醇相和核酸水相混合，制成药物中间品，透析，得到所述药物。
优选地，磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质溶解时，使用的溶剂包括无水乙醇。
优选地，稀释核酸药物时，使用酸性缓冲盐溶液进行稀释。
本申请中，使用透析装置进行透析，以除去溶剂。
第六方面，本申请提供一种疫苗，采用如下技术方案：
一种疫苗，所述疫苗包括第三方面所述的LNP载体。
第七方面，本申请提供第一方面所述的阳离子脂质化合物在制备LNP载体、药物或疫苗中的应用，或第三方面所述的LNP载体在制备药物和/或疫苗中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请将3-((2-(二甲氨基)乙烷基)(甲基)氨基)丙酸和二级长链烷基酯相结合获得的两亲性衍生物作为基因药物的载体系统中的阳离子脂质组分，其带有正电荷，从而更容易吸附到细胞表面并进入细胞中，传递药物的效率更高，治疗效果更好；生产原材料易得，制备方法简单，合成效率高，为大规模生产创造了条件；
2.使用上述阳离子脂质化合物制备得到的LNP载体具有良好的载药及传递效率，包封率可达88％以上，与核酸分子制成药物后，可以准确高效地进入受体细胞中并表达相关的蛋白，并引发机体的免疫应答，从而作为治疗药物发挥治疗疾病的作用，或作为疫苗产生激活免疫的效果，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本申请中阳离子脂质化合物TM3的合成路线示意图。
图2是本申请制备例1中中间产物2的氢谱检测结果图片。
图3是本申请制备例1中中间产物3的氢谱检测结果图片。
图4是本申请制备例1中中间产物4的氢谱检测结果图片。
图5是本申请制备例1中中间产物5的氢谱检测结果图片。
图6是本申请制备例1中中间产物7的氢谱检测结果图片。
图7是本申请制备例1中阳离子脂质化合物TM3的氢谱检测结果图片。
图8是本申请实施例1中药物TP1在293T细胞内蛋白表达量的检测结果图片。
图9是本申请实施例2中小鼠血清中抗S蛋白抗体滴度的检测结果图片。
具体实施方式
本申请提供了阳离子脂质化合物，所述阳离子脂质化合物包括式I所示的化合物；
式I中，n＝1、2、3或4；
R1和R2各自独立地选自式II所示的二级长链烷基酯；
式II中，n1＝2、4或6；n2＝5、7、9或11；n3＝5、7、9或11。
具体地，所述阳离子脂质化合物包括式III所示的TM1、式IV所示的TM2、式V所示的TM3、式VI所示的TM4或式VII所示的TM5。
具体地，本申请以TM3为例，说明所述阳离子脂质化合物的制备方法，其合成路线示意图如图1所示，具体流程如下：
(1)8-溴辛酸乙酯在DMSO溶液中，以TBAI作为催化剂，与TosMIC和NaH在室温条件下发生烷基化反应，生成中间产物2：18～22mmol 8-溴辛酸乙酯溶解于55～65mL无水DMSO中，8～15℃下搅拌5～10min，加入8～12mmol TosMIC，搅拌5～10min，分多次加入23～28mmol NaH，最后再加入1.8～2.2mmol TBAI，缓慢升高至室温，搅拌1～3h。
通过TLC监测反应进度，待反应完全时，将体系在冰水浴中冷却并加入145～155mL冰水淬灭，再用DCM分3次萃取，每次90～110mL。收集所有有机相，使用90～110mL水清洗，再用饱和碳酸氢钠分2次清洗，每次145～155mL，干燥浓缩后过硅胶柱纯化得到中间产物2。
(2)中间产物2在DCM和浓硫酸的酸性混合溶液(体积比为(3.5～8):1)中，在室温条件反应，生成中间产物3：
称取3.9～4.2g中间产物2，溶解于45～55mL的DCM溶液中，搅拌3～7min。加入7～12mL浓硫酸，室温条件下搅拌2～5h。
通过TLC监测反应进度，待反应完全后，向体系中加入45～55mL水，混匀后静置分层，使用45～55mL DCM萃取水层，合并所有有机相，用45～55mL饱和碳酸氢钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物3。
(3)中间产物3在THF和乙醇的混合溶液(体积比为(2～4):1)中，与NaBH4在室温条件下发生还原反应，生成中间产物4：
称取3～5mmol中间产物3溶解于45～55mL THF和乙醇的混合溶液(体积比为(2～4):1)中，0～4℃搅拌3～7min。分多次缓慢加入3～5mmol NaBH4，室温下反应3～5h。
TLC检测反应进度，待反应完全后，向体系中加入90～110mL冰水淬灭，使用DCM分3次萃取，每次90～110mL。合并所有有机相，使用45～55mL饱和碳酸氢钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物4。
(4)中间产物4在含有吡啶的DCM溶液(吡啶的浓度为73～134mM)中，与3-氯丙酰氯在室温条件下发生缩合反应，生成中间产物5：
称取4～6mmol中间产物4溶解于45～55mL DCM溶液中，再加入4～6mmol吡啶，在0～4℃下搅拌3～7min，缓慢加入7～9mmol 3-氯丙酰氯，室温下反应0.5～2h。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，向体系中加入90～110mL冰水淬灭，使用90～110mL水清洗，再用饱和碳酸氢钠溶液分2次清洗，每次140～160mL，干燥浓缩后过硅胶柱纯化得到中间产物5。
(5)中间产物5在丙酮溶液中，与NaI在68～72℃条件下发生取代反应，生成中间产物6：
称取3～5mmol中间产物5溶解于45～55mL丙酮溶液中，缓慢加入3～6mmol NaI，升高温度至68～72℃，反应12～18h。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，用45～55mL饱和硫代硫酸钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物6。
(6)中间产物6在DCM溶液中，与N,N,N'-三甲基乙二胺在室温条件下发生取代反应，生成中间产物7：
称取3～5mmol中间产物6溶解于45～55mL DCM溶液中，加入5～7mmol N,N,N'-三甲基乙二胺，室温下搅拌反应1～3h。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，用45～55mL饱和碳酸氢钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物7。
(7)中间产物7在乙醇和水的混合溶液(体积比为1:(1.5～3))中，与LiOH在室温条件下发生水解反应，生成中间产物8：
称取4～6mmol中间产物7和18～22mmoL LiOH溶解于90～110mL的乙醇和水的混合溶液(体积比为1:(1.5～3))中，室温条件下搅拌4～7h。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，旋干乙醇后用1.5～2.5M盐酸酸化至pH约为2，使用DCM分3次萃取，每次90～110mL。合并所有有机相，用45～55mL饱和碳酸氢钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物8。
(8)中间产物8在DCM溶液中，在DMAP及DCC的作用下，与9-十七醇在室温条件下发生酯化反应，生成所述阳离子脂质化合物TM3：
称取4～6mmol中间产物8、14～16mmol DMAP和16～20mmol 9-十七醇溶解于55～65mL的DCM中，搅拌3～7min，加入13～17mmol DCC，室温条件下搅拌过夜。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，分3次水洗，每次55～65mL。再用饱和碳酸氢钠分2次清洗，每次45～55mL。干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到阳离子脂质化合物TM3。
本申请还提供了一种LNP载体，以摩尔分数计，所述LNP载体包括阳离子脂质化合物15％～70％、磷脂8％～30％、胆固醇15％～65％和聚乙二醇脂质1.5％～3％。
本申请还提供了一种药物，所述药物包括LNP载体和核酸药物，其中，所述药物中，LNP载体中的阳离子脂质化合物的氮含量与核酸药物中的磷含量的摩尔比为(2～6):1。
所述药物通过如下方法进行制备：
称取1.5～1.8mg磷脂、1.7～1.9mg胆固醇和0.8～1mg聚乙二醇脂质，在55～65℃条件下溶解于0.8～1.5mL无水乙醇中，制成储备液；
在室温条件下向所述储备液中加入13～15mg阳离子脂质化合物，混合，得到脂质醇相；
使用酸性缓冲盐溶液稀释核酸药物至终浓度为0.5～0.7mg/mL，混合均匀，制成核酸水相；将所述脂质醇相和核酸水相按体积比为1:(2～5)在室温下通过混合器混合，制成药物中间品，通过透析装置进行透析，去除溶剂，并置换为含0.2％～0.5％氯化钠、4％～6％蔗糖的浓度为18～22mM的Tris溶液，得到所述药物。
以下结合附图1～9、制备例1～2和实施例1～2对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1
本制备例提供一种阳离子脂质化合物TM3，所述阳离子脂质化合物TM3的结构式如式V所示。
所述阳离子脂质化合物TM3通过如下方法进行制备，合成路线图如图1所示：
(1)8-溴辛酸乙酯在DMSO溶液中，以TBAI为催化剂，与TosMIC和NaH在室温条件下发生烷基化反应，生成中间产物2：
在500mL的单口瓶中，称取5g 8-溴辛酸乙酯(20mmol)溶解于60mL无水DMSO中，10℃下搅拌7min，加入1.9g TosMIC(10mmol)，搅拌7min，分多次加入1g NaH(25mmol)，最后再加入0.7g TBAI(2mmol)，由10℃缓慢升高至室温，搅拌2h。
通过TLC监测反应进度，待反应完全时，将体系在冰水浴中冷却并加入150mL冰水淬灭，再用DCM分3次萃取，每次100mL。收集所有有机相，使用100mL水清洗，再用饱和碳酸氢钠分2次清洗，每次150mL，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物2。中间产物2的氢谱检测结果如图2所示。
(2)中间产物2在DCM和浓硫酸的酸性混合溶液(体积比为5:1)中，在室温条件反应，生成中间产物3：
在250mL的单口瓶中，称取4.1g中间产物2，溶解于50mL的DCM溶液中，搅拌5min。加入10mL浓硫酸，室温条件下搅拌3h。
通过TLC监测反应进度，待反应完全后，向体系中加入50mL水，混匀后静置分层，使用50mL DCM萃取水层，合并所有有机相，用50mL饱和碳酸氢钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物3。中间产物3的氢谱检测结果如图3所示。
(3)中间产物3在THF和乙醇的混合溶液(体积比为3:1)中，与NaBH4在室温条件下发生还原反应，生成中间产物4：
在250mL的单口瓶中，称取1.5g中间产物3(4mmol)溶解于50mL THF和乙醇的混合溶液(体积比为3:1)中，0℃搅拌5min。分多次缓慢加入0.15g NaBH4(4mmol)，室温下反应4h。
TLC检测反应进度，待反应完全后，向体系中加入100mL冰水淬灭，使用DCM分3次萃取，每次100mL。合并所有有机相，使用50mL饱和碳酸氢钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物4。中间产物4的氢谱检测结果如图4所示。
(4)中间产物4在含有吡啶的DCM溶液中(吡啶的浓度为100mM)，与3-氯丙酰氯在室温条件下发生缩合反应，生成中间产物5：
在250mL的单口瓶中，称取1.8g中间产物4(5mmol)溶解于50mL DCM溶液中，再加入0.4g吡啶(5mmol)，在0℃下搅拌5min，缓慢加入1g 3-氯丙酰氯(8mmol)，室温下反应1h。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，向体系中加入100mL冰水淬灭，使用100mL水清洗，再用饱和碳酸氢钠溶液分2次清洗，每次150mL，干燥浓缩后过硅胶柱纯化得到中间产物5。中间产物5的氢谱检测结果如图5所示。
(5)中间产物5在丙酮溶液中，与NaI在70℃条件下发生取代反应，生成中间产物6：
在250mL的单口瓶中，称取1.8g中间产物5(4mmol)溶解于50mL丙酮溶液中，缓慢加入0.8g NaI(5mmol)，升高温度至70℃，反应16h。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，用50mL饱和硫代硫酸钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物6。
(6)中间产物6在DCM溶液中，与N,N,N'-三甲基乙二胺在室温条件下发生取代反应，生成中间产物7：
在250mL的单口瓶中，称取2.2g中间产物6(4mmol)溶解于50mL DCM溶液中，加入0.6g N,N,N'-三甲基乙二胺(6mmol)，室温下搅拌反应2h。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，用50mL饱和碳酸氢钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物7。中间产物7的氢谱检测结果如图6所示。
(7)中间产物7在乙醇和水的混合溶液(体积比为1:2)中，与LiOH在室温条件下发生水解反应，生成中间产物8：
在250mL的单口瓶中，称取3.8g中间产物7(5mmol)和0.5g LiOH(20mmoL)溶解于100mL的乙醇和水的混合溶液(体积比为1:2)中，室温条件下搅拌5h。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，旋干乙醇后用2M盐酸酸化至pH约为2，使用DCM分3次萃取，每次100mL。合并所有有机相，用50mL饱和碳酸氢钠洗脱有机相，干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到中间产物8。
(8)中间产物8在DCM溶液中，在DMAP及DCC的作用下，与9-十七醇在室温条件下发生酯化反应，生成所述阳离子脂质化合物TM3：
在250mL的单口瓶中，称取3.6g中间产物8(5mmol)、1.8g DMAP(15mmol)和4.6g9-十七醇(18mmol)溶解于60mL的DCM中，搅拌5min，加入3.1g DCC(15mmol)，室温条件下搅拌过夜。
通过TLC检测反应进度，待反应完全后，分3次水洗，每次60mL。再用饱和碳酸氢钠分2次清洗，每次50mL。干燥浓缩后过硅胶柱纯化，得到所述阳离子脂质化合物TM3。TM3的氢谱检测结果如图7所示。
上述反应中，各个步骤获得的产物的质量及得率的统计结果如表1所示。
表1各个步骤获得的产物的质量及得率的统计结果
产物 质量(g) 得率(％)
中间产物2 4.7 94
中间产物3 3.7 62
中间产物4 1.0 67
中间产物5 1.9 82
中间产物6 1.8 81
中间产物7 1.8 60
中间产物8 3 83
TM3 3.3 70
制备例2
本制备例提供一种药物TP1，其中为核酸药物为编码SARS-CoV-2病毒刺突糖蛋白(S蛋白)mRNA，通过如下方法进行制备：
称取1.64mg HSPC、1.83mg胆固醇和0.89mg DSPE-PEG2000，在60℃条件下溶解于1mL无水乙醇中，制备为储备液。
在室温条件下向储备液中加入13.41mg TM3，混合，得到脂质醇相。
将1.6mL 1mg/mL的mRNA溶解于1.4mL pH 4.0的D-柠檬酸溶液中，混合均匀，制备为核酸水相。
将1mL脂质醇相与3mL核酸水相在室温下通过混合器混合，制备为药物中间品。
将该中间品通过透析装置去除乙醇和柠檬酸，并置换为含0.4％氯化钠、5％蔗糖的浓度为20mM的Tris溶液，制备为药物TP1。
性能测试
对制备例2制备的药物TP1进行性能测试，具体包括粒径检测、分散程度检测和包封率检测。
粒径及分散程度检测
使用激光散射粒度分析仪(PCS，丹东百特BeNano 180Zeta pro激光粒度仪)测定纳米粒子粒径大小及分散程度(PDI)，使用671nm固体激光器为入射光，动力学光散射试验在25℃进行，散射光路采用173°背散射检测。连续检测3次的平均值作为检测数据。
包封率检测
包封率检测采用荧光定量的检测方法，使用Quant-itTMRiboGreen RNA AssayKit作为检测试剂盒。加入Triton破乳后释放制剂中核酸，加入特异性核酸染料ribogreen，通过ALLSHENG Feyond-A300酶标仪，设置激发光波长为470nm，发射光波长为525nm，检测样品吸光度值，通过标准曲线计算总核酸含量；进一步，通过不加Triton处理的LNP样品，加入特异性核酸染料ribogreen，通过ALLSHENG Feyond-A300酶标仪，设置激发光波长为470nm，发射光波长为525nm，检测样品吸光度值，通过标准曲线计算游离核酸含量，公式如下：
包封率＝(总核酸含量-游离核酸含量)/总核酸含量×100％。
粒径、分散以及包封率的检测结果如表2所示。
表2TP1的粒径、分散以及包封率的检测结果
由表2可以看出，按照制备例2的配方和方法制备得到的药物TP1具有适宜的粒径大小和均一的粒径分布，同时也具有较高的包封率，表明其具有良好的载药能力，为后续的实际应用创造了条件。
实施例1
本实施例对制备例2制备的药物TP1在体外培养细胞内的表达量进行检测，步骤如下：
(1)细胞的培养和收集：
人胚肾细胞株293衍生株293T细胞系由实验室传代获得，采用含10％FBS的RPMI-1640培养基培养，每周传代2～3次。取细胞密度约为80％的细胞进行铺板，细胞计数后使用培养基调整细胞浓度为2×105/mL，在48孔板中，每孔加入0.5mL上述细胞液，即每孔细胞数量约为1×105。每组设置3个复孔，空白对照组也设置3个复孔。
(2)细胞与药物共孵育：
根据mRNA的荧光检测总mRNA浓度，每孔加入含1μg mRNA的药物，分别孵育18、24、48和72h，观察不同孵育时间内蛋白的表达量。
(3)蛋白表达检测：
将细胞培养板在800g下离心5min，取上清，分别用ddH2O稀释10倍、50倍和100倍，制备为待测样品。根据表达的蛋白，以SARS-CoV-2病毒刺突糖蛋白(S蛋白)为标准品绘制标准曲线，采用ELISA方法进行检测。
(4)结果分析：
用待测样品的OD值减去空白对照的OD值，以校准标准曲线的吸光度值。以标准浓度为x轴绘制标准曲线，根据标准曲线计算样本OD值所对应的S蛋白的浓度。
药物TP1在293T细胞内蛋白表达量的检测结果如图8所示。由图8可以看出，药物TP1能够有效地转入293T细胞中并表达S蛋白，并且随着孵育时间的增加，表达量也持续增加，且蛋白的表达量也与剂量呈正相关。上述结果表明LNP载体可以将药物转入细胞中并释放，从而用于相关疾病的治疗中，具有实际应用的价值。
实施例2
本实施例对制备例2制备的药物TP1在体内的免疫原性进行检测，步骤如下：
取6只6～8周的雌性BALB/c小鼠，分别在第1天和第14天通过肌肉(i.m.)注射药物TP1。在首次给药后第10、21、28和35天用ELISA方法检测小鼠血清中的抗S蛋白抗体滴度。
小鼠血清中抗S蛋白抗体滴度的检测结果如图9所示。由图9可以看出，在首次给药后第10天已有抗体产生，在第14天给予加强针后，第21天抗体表达量有显著增加，并且随着时间的推移持续表达，第35天时仍有表达。上述结果表明，所述药物可以有效激活动物的免疫应答，给药后动物体内的抗体滴度有显著提升，因而可作为疫苗，刺激机体产生相应的免疫应答，效果显著。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物包括式I所示的化合物；
式I中，n＝1、2、3或4；
R1和R2各自独立地选自式II所示的二级长链烷基酯；
式II中，n1＝2、4或6；n2＝5、7、9或11；n3＝5、7、9或11。
2.根据权利要求1所示的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物包括式III、式IV、式V、式VI或式VII所示的化合物；
3.如权利要求1或2所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质化合物的制备方法包括以下步骤：
以溴代酯类化合物为原料，依次进行烷基化反应、还原反应，
再与酰氯类化合物发生缩合反应，依次进行两步取代反应和一次水解反应，最后与一元仲醇类化合物进行酯化反应，制得所述阳离子脂质化合物。
4.一种LNP载体，其特征在于，所述LNP载体含有权利要求1或2所述的阳离子脂质化合物中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求4所述的LNP载体，其特征在于，以摩尔分数计，所述LNP载体包括阳离子脂质化合物15％～70％；
优选的，以摩尔分数计，所述LNP载体还包括磷脂8％～30％、胆固醇15％～65％和聚乙二醇脂质1.5％～3％。
6.一种药物，其特征在于，所述药物包括权利要求4或5所述的LNP载体。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括核酸药物；
优选地，所述药物中，LNP载体中的阳离子脂质化合物的氮含量与核酸药物中的磷含量的摩尔比为(2～6):1。
8.如权利要求6或7所述的药物的制备方法，其特征在于，所述药物的制备方法包括以下步骤：
称取除阳离子脂质化合物外的其它组分，溶解，制成储备液；
向所述储备液中加入阳离子脂质化合物，混合，得到脂质醇相；
稀释核酸药物，制成核酸水相；
将所述脂质醇相和核酸水相混合，制成药物中间品，透析，得到所述药物。
9.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求4或5所述的LNP载体。
10.如权利要求1或2所述的阳离子脂质化合物在制备LNP载体、药物或疫苗中的应用，或权利要求4或5所述的LNP载体在制备药物和/或疫苗中的应用。
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