CN106188223B - 一种含有二肽类脂质阳离子的化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有二肽类脂质阳离子的化合物及其制备方法与应用，属于小干扰RNA(siRNA)载体制备领域。所述含有二肽类脂质阳离子的化合物，其化学结构如通式(I)所示，

Description

一种含有二肽类脂质阳离子的化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因载体领域，具体涉及一种含有二肽类脂质阳离子的化合物及其制备方法以及在制备siRNA载体中的应用。

背景技术

基因沉默(gene silencing)是指生物体内特定基因由于某些因素而无法表达，而转录后水平的基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)是较为普遍的、且备受研究者所关注的一种基因沉默。PTGS是在RNA分子水平的基因调控结果,因而又称作RNA干扰(RNA interference，RNAi)。RNAi可以理解为由双链RNA(dsRNA)靶向序列特异性调控基因表达而导致的基因沉默现象，是保守的基因调节机能，在细胞的发育、分裂、分化以及疾病等各种生理过程中扮演重要的转录后(post-transcriptional)基因调控角色。通过遗传学与生物化学的探索研究，在2000年提出了RNAi的作用机制模型，RNA干涉机制可以概括为：外源的或体内产生的双链RNA(dsRNA)，在细胞内首先被核酸内切酶(Drosha和Dicer等)特异性识别并降解为小的双链RNA(siRNA，21～23bp)；在细胞质内，siRNA结合到argonaute蛋白进而负载到RISC(RNA-Induced Silencing Complex)复合物中；结合到RISC上的siRNA经过解旋与解链，正义链被排除，反义链留在RISC里指导结合与其碱基序列互补的同源于siRNA的mRNA[5]并使之降解，导致特定的转录后基因沉默。

siRNA与其它类型的药物的相比有显著的优越性：(1)传统的小分子药物一般都针对特定的蛋白质，设计小分子库并从中筛选出有效抑制剂(inhibitor)。当某一蛋白由于缺少结构信息，无法设计小分子抑制剂或无法制备抗体时，可以抑制或降解特定基因产物(即mRNA)从而降低或抑制相关蛋白的生物合成。如利用反义链技术(antisense technology)制备的单链寡聚DNA能够降解ApoB的mRNA，从而治疗家族性高血脂病。而ApoB很难用小分子药物来抑制。到目前为止，美国的Isis Pharmaceutials公司已经推出两个基于反义链技术的临床药物，即Fomivirsen(1998年获得FDA批准,治疗cytomegalovirus retinitis)和Mipomersen(2013年获批，治疗familial hypercholesterolemia)。于本世纪初发现的RNA干扰技术在mRNA的抑制效率、专一性、持续性等方面均具有优越性；然而，由于缺乏安全有效的载体等原因，RNA干扰技术还没有达到临床应用阶段。(2)RNA干扰效率高，持续时间长。小鼠实验证明，一次给药后靶基因的表达被抑制90％以上，RNA干扰效果能够持续6-10天；(3)特异性高，不存在耐药性问题。小分子RNA只有与特定的靶mRNA通过碱基互补进行结合并引起其降解，副作用以及脱靶效应(off-target)极小。长期给药后没有观察到任何的耐药性；(4)RNA干扰技术适合使用在肿瘤，病毒感染(埃博拉病毒、乙肝病毒感染)引起的疾病等。

国际上对RNA干扰的临床应用的研究竞争激烈。最近，总部在加拿大的TekmiraPharmaceuticals研发的针对埃博拉病毒的RNA干扰类药TKM-Ebola已经被FDA特批作为“同情使用”(compassionate use)来缓解目前在非洲等国蔓延的埃博拉病危机。美国AlnylamPharmaceuticals公司推出ALN系列项目，其中与其合作伙伴Tekmira公司的LipidNanoparticle(LNP)技术结合的项目ALN-TTR(靶基因：转甲状腺素蛋白transthyretin)已经进入临床II期实验阶段；Arrowhead Research Corporation采用DynamicPolyconjugate技术来输送siRNA，用于肝脏疾病包括肝癌等。就在2014年年初，位于马萨诸塞州Cambridge的Sanofi/Genzyme公司对其邻居Alnylam Pharmaceuticals公司注入7亿美元的股权投资，而Dicerna Pharmaceuticals公司(研发DCR-M1711，抑制MYC RNA)的首次公开募股(IPO)筹资到9千多万美元。

开发安全高效的siRNA输送载体是关键任何RNAi疗法在临床应用之前，必须进行如下几步关键性的研究：①筛选稳定高效的前导siRNA；②制备安全高效的siRNA靶向递送体系；③全面严格的安全性(包括潜在的脱靶副作用)筛查。siRNA是带负电荷、对核酸降解酶敏感、亲水性强的一类较小核酸分子，这些特有的物理化学性质，使得siRNA很难作为药物活性成分，同时对siRNA安全有效的载体递送也极具挑战性。由于siRNAs是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此高效地将siRNAs转入细胞、组织和器官，是成功抑制基因表达的关键步骤之一。

对于siRNA递送，按载体不同可以分为三个探究方向。(1)以病毒(viral vector)为载体递送siRNA的研究，与之相关的最初报道是将siRNA序列克隆到逆转录病毒，使病毒在其所侵染的宿主细胞内表达此siRNA序列，从而显著下调宿主NDR和p75等基因的表达。此后，腺病毒和慢病毒等用于siRNA的载体传送的报道也相继出现。病毒载体递送siRNA的优势在于能够保持siRNA序列的稳定性和传递的高效性，但是病毒载体内容易引起机体的免疫原性，还存在着引起插入型基因突变和癌变等潜在隐患。所以，病毒在siRNA传送领域的进一步应用研究极大地受到了限制，这使得以非病毒作为siRNA传送载体的研究成为必然。(2)非病毒(non-viral vector)载体传送法，2003年报道了小鼠体内非病毒载体传送siRNA。时至今日，已经先后尝试了以脂质体，多肽及蛋白质，合成的或天然的阳离子型高分子等非病毒作为载体，对siRNA的传送进行研究。研究结果表明，与病毒传递方法相比较，使用非病毒传送siRNA可以避免免疫刺激和癌变等副作用。非病毒siRNA载体以纳米材料(Nanoparticle)为主。纳米微球之所以被应用于传递siRNA，是因为已有的研究表明纳米尺寸的载体，具有独特的生物功能：①纳米微球组织靶向性和穿透力强，能够提高传送效率，降低免疫刺激和毒副作用；②纳米微球能够有效避开肾脏的过滤，延长其在血液中循环的时间；③纳米微球具有较强的保护性，能够有效保护siRNA避开RNase等的攻击，延长其半衰期，提高生物活性及生物利用率。因此，纳米材料在siRNA传送上的应用研究日益受到关注。这些纳米微球技术的开发，为siRNA的高效传送及进一步在临床上的应用提供了有价值的研究基础和理论指导，其中有的研究成果已进入临床前评价。

发明内容

针对本领域技术的不足之处，本发明的目的是提供一种细胞毒性低、细胞转染效率高、siRNA传递效率高的非病毒脂质类纳米材料载体，其为一种含有二肽类脂质阳离子的化合物。

本发明的另一目的是提供所述载体的制备方法与应用。

实现本发明上述目的的具体技术方案为：

一种含有二肽类脂质阳离子的化合物，其化学结构如通式(I)所示：

式中n为1或2，m为3或4；X为NH、O或S；R₁选自以下基团：

-CH₂CH₂CH₂CH₂(CH₂CH＝CH)₃(CH₂)₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₅CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₂CH₃、-CH₂(CH₂)₁₂CH₃。

优选地，所述二肽为L型或D型碱性氨基酸和酸性氨基酸。

更优选地，本发明的含有二肽类脂质阳离子的化合物为：

更优选地，本发明的含有二肽类脂质阳离子的化合物为：

更优选地，本发明的含有二肽类脂质阳离子的化合物为：

更优选地，本发明的含有二肽类脂质阳离子的化合物为：

本发明提供了上述含有二肽类脂质阳离子化合物的制备方法，包括以下步骤：

上述R1选自：

-CH₂CH₂CH₂CH₂(CH₂CH＝CH)₃(CH₂)₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₅CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₂CH₃、-CH₂(CH₂)₁₂CH₃；

n为1或2；m为3或4；X为NH、O、S。

具体地，本发明化合物的制备方法为：

(1)Boc-D-酸性氨基酸-OH或Boc-L-酸性氨基酸-OH与饱和/不饱和脂肪烃胺或醇溶于溶剂，在氮气保护下冷却至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌8h-24h后，将反应混合物溶解在溶剂中，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤，干燥后纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中于0度-室温搅拌30min-60min；

(2)将步骤(1)中的终产物、Boc-L-碱性氨基酸-OSu或Boc-D-碱性氨基酸-Osu、三乙胺溶于溶剂中，在氮气保护下室温反应8h-24h后加入二氯甲烷，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤，干燥后纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中在0度-室温搅拌30min-60min即得。

上述R1选自以下任一基团：

-CH₂CH₂CH₂CH₂(CH₂CH＝CH)₃(CH₂)₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₅CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₂CH₃、-CH₂(CH₂)₁₂CH₃；

n为1或2；m为3或4；X为NH、O、S。

本发明的制备方法中，步骤(1)Boc-D(或L)-酸性氨基酸-OH可以选自Boc-D-谷氨酸-OH、Boc-D-天冬氨酸-OH、Boc-L-谷氨酸-OH或Boc-L-天冬氨酸-OH；步骤(2)中Boc-L(或D)-碱性氨基酸-OSu中的碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。并且，步骤(1)Boc-D(或L)-酸性氨基酸-OH和步骤(2)中Boc-L(或D)-碱性氨基酸-Osu的镜像相同，即同为D型或同为L型。

本发明的制备方法中，步骤(1)和步骤(2)所述的溶剂为本领域已知的能够溶解所选化合物的溶剂，如二氯甲烷。

本发明化合物的制备方法中，步骤(1)中Boc-D(或L)-酸性氨基酸-OH与油胺的摩尔比为1:2；步骤(2)中步骤(1)的终产物与Boc-L(或D)-碱性氨基酸-OSu和三乙胺的摩尔比为1:1:1。

本发明化合物的制备方法中，步骤(1)和步骤(2)中所述的干燥均采用无水硫酸钠干燥，并采用硅胶柱层析方法纯化目的物，步骤(1)中硅胶柱层析方法的洗脱液为二氯甲烷和甲醇，二者的体积比为20:1；步骤(2)中硅胶柱层析方法的洗脱液为乙酸乙酯和正己烷，二者的体积比为4:1。步骤(1)和步骤(2)中所述的三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为1:1。

本发明提供了上述含有二肽类脂质阳离子的化合物在制备基因载体中的应用。

具体地，是将本发明的化合物与胆固醇、DSPE-PEG按60％、39％、1％的摩尔比溶解于氯仿中，旋转蒸发移去溶剂后真空干燥过夜。加入278mM的蔗糖溶液，超声波处理5分钟-30分钟后，用Avanti Mini-Extruder脂质体挤出器(膜孔径为50纳米-100纳米)制备得到载体，采用激光粒度分析，得到直径约100-150nm的脂质体，在4℃冰箱内保存。

将本发明的化合物制备脂质体载体，该载体粒径均匀，分散性良好，与siRNA结合能力强，具有高效的体外、体内siRNA传送效率。

本发明提供了上述含有二肽类脂质阳离子的化合物在制备基因治疗药物中的应用。

含有本发明所述的化合物的核酸载体也属于本发明的保护内容。

本发明提供了含有上述含有二肽类脂质阳离子的化合物的核酸载体在递送siRNA中的应用。

本发明提供了含有上述含有二肽类脂质阳离子的化合物的核酸载体制备基因治疗药物中的应用。

进一步地，所述核酸载体优选为siRNA载体。

本发明的有益效果在于：本发明所述含有二肽类脂质阳离子的组合物具有(1)能够在体内有效传送未做任何化学修饰或保护的siRNA序列，效率高达90％，解决了野生型siRNA序列难以在体内有效传送的难题；(2)此二肽类脂质阳离子的化合物完全由天然氨基酸组成，细胞和体内毒性低，生物相容性高，适合多次给药；(3)器官靶向性高，所传送的siRNA主要分布在小鼠的肝脏、肺和胰脏内等优点。

附图说明

图1为脂质分子与siRNA结合后的凝胶电泳图。脂质分子I、脂质分子II、脂质分子III和脂质分子IV制得的脂质体分别与siRNA以不同的氨基：磷酸基团(N/P)的比例混合，在室温培育30分钟后用1％的琼脂凝胶电泳分析。图中0、1、2、3分别代表脂质体上的氨基数(N)与siRNA分子上的磷酸基数(P)的摩尔比例。

图2为激光粒度分析由脂质分子I形成的脂质体的粒度分布结果。

图3为细胞存活率分析结果。HeLa细胞用脂质分子I、脂质分子II、脂质分子III、脂质分子IV制得的脂质体处理24小时，采用MTT方法分析结果显示，脂质分子I、II、III、IV制得的脂质体为明显低的细胞毒性。

图4为体外siRNA转染效果。用脂质分子I、脂质分子II、脂质分子III、脂质分子IV形成的脂质体分别与磷酸甘油醛脱氢酶siRNA结合并将其带入HeLa细胞，引起90％的信使RNA的降解。

图5为体内siRNA输送效果图。由脂质分子I、脂质分子II、脂质分子III、脂质分子IV形成的脂质体与载脂蛋白B siRNA结合，经尾静脉注射给小鼠，24小时后提取肝脏细胞总RNA，采用荧光定量PCR方法测定肝内载脂蛋白B mRNA的含量的结果显示，80％到90％的载脂蛋白B mRNA被降解。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

除非另有说明，上下文中百分比为重量百分比，所有的温度以摄氏度给出。

实施例1脂质分子I的合成

第一步：将试剂Boc-L-谷氨酸-OH(1.0g,4.1mmol),油胺(2.6mL,8.1mmol)溶解在10ml二氯甲烷，在氮气保护下用冰浴冷却至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.7g,8.9mmol)，在25℃搅拌24小时。反应结束后，将反应混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析方法(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝15/1，v/v)纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室温搅拌30分钟，得到目的物2.13g产物，产率82％。

第二步：将第一步中得到的产物(0.500g，0.774mmol)、Boc-L-鸟氨酸(Boc)-OSu(0.332g，0.774mmol)、三乙胺(0.108ml，0.774mmol)溶解在二氯甲烷中，在氮气保护下室温反应24h后加入200ml二氯甲烷，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析方法(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1，v/v)纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室温搅拌30分钟，得到目的物0.488g产物，产率83％。

产物的表征数据：¹H NMR(DMSO-d6,ppm):0.838-0.852(t,6H,-CH₃),1.232-1.371(m,48H,-CH₂-),1.581-1.594(m,2H,NH₂-CH₂-CH₂-),1.692-1.719(m,2H,NH₂-C(CO)H-CH₂-),1.786-2.062(m,4H,-NHCOCH₂-,-NHCOCH₂CH₂-),2.076-2.183(m,8H,-CH₂CH＝CHCH₂-),2.797(t,2H,NH₂-CH₂-),2.994-3.133(m,4H,NHCOCH₂-),3.849(m,1H,-NHCOC(NH₂)H-),4.202-4.257(m,1H,OCCH(NH-)CH₂-),5.319-5.350(m,4H,-CH＝CH-),7.795-8.596(m,7H,-CONH-,-NH₂).MS(ESI)m/z 760.23(M)⁺。表征数据显示结构正确。

实施例2脂质分子II的合成

第一步：将试剂Boc-D-谷氨酸-OH(1.0g,4.05mmol),油胺(2.16mL,8.09mmol)溶解在10ml二氯甲烷，在氮气保护下用冰浴冷却至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.71g，8.91mmol)，在25℃搅拌24小时。反应结束后，将反应混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析方法(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝20/1，v/v)纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室温搅拌30分钟，得到目的物1.92g产物，产率74％。第二步：将第一步中达到的产物(1.22g，1.890mmol)、Boc-D-鸟氨酸(Boc)-OSu(0.812g，1.890mmol)、三乙胺(0.26ml，1.890mmol)溶解在二氯甲烷中，在氮气保护下室温反应24h后加入200ml二氯甲烷，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析方法(洗脱液：乙酸乙酯/正己烷＝4/1v/v)纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室温搅拌30分钟，得到目的物0.82g产物，产率57％。

产物的表征数据：¹H NMR(DMSO-d6,ppm):0.838-0.852(t,6H,-CH₃),1.232-1.371(m,48H,-CH₂-),1.581-1.594(m,2H,NH₂-CH₂-CH₂-),1.692-1.719(m,2H,NH₂-C(CO)H-CH₂-),1.786-2.062(m,4H,-NHCOCH₂-,-NHCOCH₂CH₂-),2.076-2.183(m,8H,-CH₂CH＝CHCH₂-),2.797(t,2H,NH₂-CH₂-),2.994-3.133(m,4H,NHCOCH₂-),3.849(m,1H,-NHCOC(NH₂)H-),4.202-4.257(m,1H,OCCH(NH-)CH₂-),5.319-5.350(m,4H,-CH＝CH-),7.795-8.596(m,7H,-CONH-,-NH₂).MS(ESI)m/z 760.23(M)⁺。表征数据显示结构正确。

实施例3脂质分子III

第一步：将试剂Boc-L-天冬氨酸-OH(1.0g,4.1mmol),油胺(2.6mL,8.1mmol)溶解在10ml二氯甲烷，在氮气保护下用冰浴冷却至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.7g,8.9mmol)，在25℃搅拌24小时。反应结束后，将反应混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析方法(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝15/1v/v)纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室温搅拌30分钟，得到目的物2.13g产物，产率82％。

第二步：将第一步中达到的产物(1.9g，2.986mmol)、Boc-L-鸟氨酸(Boc)-OSu(1.283g，2.968mmol)、三乙胺(0.416ml，2.986mmol)溶解在二氯甲烷中，在氮气保护下室温反应24h后加入200ml二氯甲烷，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析方法(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1v/v)纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室温搅拌30分钟，得到目的物2.37g产物，产率84％。

产物的表征数据：¹HNMR(DMSO-d6,ppm):0.876-0.890(t,6H,-CH₃),1.355(m,44H,-CH₂-),1.597-1.627(m,6H,NH₂CH₂CH₂-,-CONHCH₂CH₂-),1.693-1.740(m,2H,NH₂-C(CO)H-CH₂-),1.938-1.994(m,8H,-CH₂CH＝CHCH₂-),2.425-2.474(m,4H,NH₂-CH₂,-NHCOCH₂-),2.790-2.802(m,2H,-CH₂CONHCH₂-),2.899-2.956(m,2H,-CH(NH)CONHCH₂-),3.068(m,1H,-NHCOCH(NH₂)-),4.572-4.586(m,1H,-NHCOCH(NH)-),5.311-5.359(m,4H,-CH＝CH-),7.861-8.622(m,7H,-CONH-,-NH₂).MS(ESI)m/z 746.83(M)⁺。表征数据显示结构正确。

实施例4脂质分子IV

第一步：将试剂Boc-D-天冬氨酸-OH(1.0g,4.3mmol),油胺(2.3mL,8.58mmol)溶解在10ml二氯甲烷，在氮气保护下用冰浴冷却至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.8g,9.44mmol)，在25℃搅拌24小时。反应结束后，将反应混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析方法(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝20/1，v/v)纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室温搅拌30分钟，得到目的物1.91g产物，产率71％。

第二步：将第一步中达到的产物(1.91g，3.02mmol)、Boc-D-鸟氨酸(Boc)-OSu(1.298g，3.02mmol)、三乙胺(0.421ml，3.02mmol)溶解在二氯甲烷中，在氮气保护下室温反应24h后加入200ml二氯甲烷，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析方法(洗脱液：乙酸乙酯/正己烷＝4/1，v/v)纯化目的物，将收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室温搅拌30分钟，得到目的物1.89g产物，产率84％。

产物的表征数据：¹HNMR(DMSO-d6,ppm):0.876-0.890(t,6H,-CH₃),1.355(m,44H,-CH₂-),1.597-1.627(m,6H,NH₂CH₂CH₂-,-CONHCH₂CH₂-),1.693-1.740(m,2H,NH₂-C(CO)H-CH₂-),1.938-1.994(m,8H,-CH₂CH＝CHCH₂-),2.425-2.474(m,4H,NH₂-CH₂,-NHCOCH₂-),2.790-2.802(m,2H,-CH₂CONHCH₂-),2.899-2.956(m,2H,-CH(NH)CONHCH₂-),3.068(m,1H,-NHCOCH(NH₂)-),4.572-4.586(m,1H,-NHCOCH(NH)-),5.311-5.359(m,4H,-CH＝CH-),7.861-8.622(m,7H,-CONH-,-NH₂).MS(ESI)m/z 746.83(M)⁺。表征数据显示结构正确。

实施例5脂质体的制备

将上述实施例制得的脂质分子I，或II，或III，或IV与胆固醇、DSPE-PEG按60％、39％、1％的摩尔比例溶解在氯仿中混合，旋转蒸发移去溶剂后真空干燥过夜。加入278mM的蔗糖溶液，超声波处理5分钟后，用Avanti Mini-Extruder脂质体挤出器制备得到载体，采用激光粒度分析，得到直径约100nm-150nm的脂质体(见图2)，在4℃冰箱内保存。脂质分子II，III，IV制得的脂质体激光粒度分析结果显示，直径均为100nm-150nm的脂质体。

实施例6脂质体的载体siRNA输送效果验证

实验动物：C57/BL6小鼠，雄性，6周龄，体重约20g；

所采用的阳性载脂蛋白siRNA(pm siRNA)的碱基序列为：反义链序列:5’-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC-3’，有义链序列为：5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-3’；阴性对照siRNA(mm siRNA)序列为：反义链：5’-AUUCGUAUUGAGUCUGAUCACAC-3’；有义链：5’-GUGAUCAGACUCAAUACGAAU-3’

分组及处理方法(mm，mismatch，即序列不匹配的阴性对照siRNA；pm,perfectmatch，序列完全匹配的阳性siRNA)：

阴性对照组1：6只小鼠，尾静脉注射5％的蔗糖溶液；

阴性对照组2：6只小鼠，尾静脉注射由脂质分子I制备的脂质体+阴性对照siRNA(mm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾静脉注射由脂质分子II制备的脂质体+阴性对照siRNA(mm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾静脉注射由脂质分子III制备的脂质体+阴性对照siRNA(mm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾静脉注射由脂质分子IV制备的脂质体+阴性对照siRNA(mm siRNA)

实验组：6只小鼠，尾静脉注射由脂质分子I制备的脂质体+阳性siRNA(pm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾静脉注射由脂质分子II制备的脂质体+阳性siRNA(pm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾静脉注射由脂质分子III制备的脂质体+阳性siRNA(pm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾静脉注射由脂质分子IV制备的脂质体+阳性siRNA(pm siRNA，在5％的蔗糖溶液)；根据动物体重，以2.0-5.0mg siRNA/kg体重的剂量，尾静脉注射，24小时后，取肝脏，提取总RNA，采用荧光定量PCR方法，检测RNA干扰的效率。所使用的引物序列如下：小鼠载脂蛋白apoB引物对:5’-ttccagccatgggcaactttacct-3’；5’-tactgcagggcgtcagtgacaaat-3’.内参引物对(小鼠肌动蛋白b)：5’-ctaaggccaaccgtgaaaag-3’；5’-accagaggcatacagggaca-3’。

对实施例5制备得到的、基于脂质分子I、脂质分子II、脂质分子III、脂质分子IV的脂质体siRNA传送载体，对其进行下述几个方面的检测：

(1)利用激光粒度仪检测载体的大小、粒径分布情况，图2显示结果，由实施例5所得脂质体载体粒径在100nm到150nm之间，大小均一，分散性良好。

(2)采用凝胶电泳阻滞实验检测脂质体siRNA载体与siRNA的结合能力，结果显示，当N/P比例大于或等于1时，载体能够有效的阻滞质粒的电泳，包裹能力强。

(3)细胞存活率检测：

转染前一天，按每孔1.0×10⁴细胞密度接种于96孔培养板，在5％CO₂、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70％左右；更换含有10％小牛血清的新鲜培养液(100μl/孔)；分别取脂质体(由实施例5所得)0.2～5.0μl，加入到细胞上面，继续培养48小时后，采用MTT方法，测定细胞存活率，其计算公式为：[细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100，其中，Asample是被处理细胞孔的吸收，Acontrol是没有经过处理的细胞孔的吸收，每组实验重复6次，结果如图3所示。图3显示，由实施例5制备所得脂质体处理的细胞，其细胞存活率达到95％以上，说明本发明制备的脂质体的细胞毒性极低，适合作为核酸载体使用。

结果说明，本发明的、基于脂质分子I～IV制备得到的脂质体siRNA载体具有很低的细胞毒性。

(4)体外(细胞)siRNA输送效率的测定：

HepG2细胞的培养：在含有10％的胎牛血清的培养液中，在37℃，5％CO₂条件下培养24小时。转染前一天，按每孔2.5×10⁵细胞密度接种于12孔培养板，在5％CO₂、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70％左右；更换含有10％小牛血清的新鲜培养液(1.0ml/孔)；将磷酸甘油醛脱氢酶siRNA(siGAPDH，美国Dharmacon公司的siGenome HumanGAPDH siRNA，在500μl Opti-MEM培养液中加siRNA溶液，最终浓度为100nM)和由实施例5所得脂质体(在500μl Opti-MEM培养液中加5～7μl脂质体)，以1：1体积比混合两种溶液，得到1000ul混合液，在室温放置30分钟后，加入到细胞上面，继续培养24小时；

效果测定：提取细胞内总RNA，采用荧光定量PCR方法测定GAPDH mRNA的含量，结果见图4。图4显示，由实施例5制备的脂质体，高效的将siRNA传送到细胞内，引起细胞内的RNA干扰活动，并干扰了细胞内源性基因的表达，效率达到95％以上。

(5)动物体内siRNA输送：

将由实施例5制备的脂质体与siRNA(靶标为肝脏内apoB基因)混合，方法是：

取7.14ul载脂蛋白siRNA(siApoB，剂量为5mg/kg)母液(14mg/ml)，加入到0.2ml经过灭菌的蔗糖溶液(278mM)，混匀；取0.2ml脂质体母液(4.6mg/ml)，加入到0.2ml siRNA溶液里，混匀，室温放置30分钟后，经尾静脉注射C57/BL6小鼠，24小时候提取肝脏内总RNA，采用荧光定量PCR法测定apoB mRNA的表达量。

所采用的阳性载脂蛋白siRNA(pm siRNA)的碱基序列为：反义链序列:5’-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC-3’，有义链序列为：5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-3’；阴性对照siRNA(mm siRNA)序列为：反义链：5’-AUUCGUAUUGAGUCUGAUCACAC-3’；有义链：5’-GUGAUCAGACUCAAUACGAAU-3’。所使用的引物序列如下：小鼠载脂蛋白apoB引物对:5’-ttccagccatgggcaactttacct-3’；5’-tactgcagggcgtcagtgacaaat-3’.内参引物对：小鼠肌动蛋白b引物对,5’-ctaaggccaaccgtgaaaag-3’,；5’-accagaggcatacagggaca-3’。

结果单次注射后apoB mRNA下降了70-90％。单次尾静脉注射剂量4mg/kg体重，由D-型氨基酸组成的脂质分子，其基因干扰效率最高达到90％，可见本发明的基因载体具有高效载体siRNA传送效率(见图5)。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种含有二肽类脂质阳离子的化合物，其特征在于，其为：

2.一种含有二肽类脂质阳离子的化合物，其特征在于，其为：

3.一种含有二肽类脂质阳离子的化合物，其特征在于，其为：

4.一种含有二肽类脂质阳离子的化合物，其特征在于，其为：

5.权利要求1-4任一所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)

(2)

上述R1为：-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃；

n为1或2；m为3；X为NH。

6.权利要求1-4任一所述的化合物在制备核酸载体中的应用。

7.权利要求1-4任一所述的化合物在制备RNA干扰治疗药物中的应用。

8.含有权利要求1-4任一所述化合物的核酸载体。