CN116199666A - 两亲性化合物及其药物组合物 - Google Patents

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CN116199666A CN202310209720.8A CN202310209720A CN116199666A CN 116199666 A CN116199666 A CN 116199666A CN 202310209720 A CN202310209720 A CN 202310209720A CN 116199666 A CN116199666 A CN 116199666A
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Abstract

本发明公开了一种两亲性化合物及其药物组合物，该化合物具有式I的结构，其中的环状二硫化物可以与细胞外表面硫醇之间发生动态共价二硫键交换介导其进入细胞质；甜菜碱具有阳离子和阴离子电荷群，通过静电相互作用形成较强的水合层，带有甜菜碱结构的两亲性化合物使得环状二硫化物易于暴露于纳米载体表面并达到抗蛋白吸附的作用，延长血液循环时间。修饰有该功能化两亲性化合物的纳米载体可以通过非胞吞途径高效稳定的将药物直接递送到胞质。
Figure DDA0004112182140000011

Description

两亲性化合物及其药物组合物
技术领域
本发明涉及一种两亲性化合物及其药物组合物，尤其涉及一种能够高效、稳定递送药物的两亲性化合物及其药物组合物。
背景技术
近年来，纳米制剂飞速发展，纳米载体可以改变其荷载的物理化学性质，减少脱靶效应，增加细胞内化和提高靶向性。纳米载体递送生物活性药物是一种具有前景的策略，可以提高小分子药物及生物活性药物的生物利用度，最大程度地保留其生物活性、降低其免疫原性。
理想的纳米载体必须具有良好的血液循环稳定性和较高的内体逃逸能力。然而传统的纳米载体大多基于内吞途径被细胞内化，通过内体逃逸完成药物胞质传递。尽管基于内体逃逸传递途径来释放药物分子使之被捕获的策略进行药物设计，但是这些常规策略往往受到低细胞质释放率(＜2％)以及所传递药物分子生物活性丧失的限制。此外，纳米载体在体内容易被单核吞噬细胞系统(MPS)摄取而快速清除，为解决这一问题，通过在载体中引入聚乙二醇(PEGylation)以增加血清稳定性和血液循环时间。然而，注射聚乙二醇化的NPs会刺激抗PEG抗体的产生，反而导致补体激活和免疫系统的识别。因此，反复注射聚乙二醇化NPs会诱发加速血液清除(ABC)现象，从而减少聚乙二醇化NPs的血液循环时间及其治疗效果。
发明内容
发明目的：针对现有药物递送载体在体内循环稳定性及内体逃逸能力等方面的不足，本发明旨在提供一种通过动态共价键交换介导的非内吞途径递送药物并能够延长血液循环时间的两亲性化合物及其药物组合物。
技术方案：作为本发明涉及的第一发明，本发明的两亲性化合物具有式I的结构，
Figure BDA0004112182110000011
其中：
P为
Figure BDA0004112182110000021
Q为-S(O)2O-或-C(O)O-；
R1为至少一个氢、双键或C14-C18直链烷基取代的C14-C19直链烷氧基、C14-C19直链烷氨基或C14-C20直链酰基；
R2为
Figure BDA0004112182110000022
优选上述两亲性化合物具有式II或式III的结构，
Figure BDA0004112182110000023
其中，Q、R1、R2、n的定义同上。
本发明的两亲性化合物以赖氨酸、甘油为连接片段，通过酯键或酰胺键将磺基甜菜碱、羧基甜菜碱类甜菜碱头部片段与硫辛酸、芦笋酸类环状二硫化物头部片段连接起来，同时在连接片段上连接单链烷基、烯基或双链烷基疏水链尾部。
上述两亲性化合中的环状二硫化物可以与细胞外表面硫醇之间发生动态共价二硫键交换介导其进入细胞质；同时甜菜碱具有阳离子和阴离子电荷群，通过静电相互作用形成较强的水合层，因此带有甜菜碱结构的两亲性化合物使得环状二硫化物易于暴露于纳米载体表面并达到抗蛋白吸附的作用，从而延长血液循环时间。修饰有该功能化两亲性化合物的纳米载体可以通过非胞吞途径高效稳定的将药物直接递送至胞质。
优选，上述结构中R1选自以下任一取代基：
Figure BDA0004112182110000031
优选，上述结构中n为1或3。
优选，上述两亲性化合物选自以下任一化合物：
Figure BDA0004112182110000041
/>
Figure BDA0004112182110000051
/>
Figure BDA0004112182110000061
针对现有生物药物纳米递药系统存在的问题，本发明提供了一种含有环状二硫化物和甜菜碱结构的两亲性化合物。细胞表面含有硫醇，以保护细胞免受氧化环境的影响，含二硫化物的“货物”与细胞外表面硫醇之间的共价二硫键交换能显著促进细胞摄取并介导其以非胞吞途径直接进入胞质。但是单独修饰环状二硫化物难以在纳米载体表面暴露，鉴于甜菜碱具有高偶极矩和高电荷基的特点，同时具有等摩尔数的阳离子和阴离子基团，保持整体电中性和高亲水性，与PEG通过氢键相互作用结合水分子不同，甜菜碱可以通过离子偶极相互作用与密度更大、吸附更紧密的水形成更强的水化壳。因此，利用带有甜菜碱结构的两亲性化合物能够确保环状二硫化物暴露于纳米载体表面并达到抗蛋白吸附的作用且无ABC效应。将含有环状二硫化物和甜菜碱结构的两亲性化合物修饰到纳米载体上，有望同时解除药物递送系统(ABC)现象和内体捕获的问题，著提高生物药物递送系统的生理稳定性及胞质递送效率。
上述两亲性化合物的制备方法，包括以下步骤：
在催化剂(EDC/HOBT、EDC/NHS或DCC/DMAP)和/或缚酸剂(三乙胺(TEA)、N-乙基二异丙胺(DIPEA)或吡啶)存在下，经连接分子通过酰胺反应或酯化反应与含有胺基或羟基的疏水尾部联偶联，随后分步在酸性条件或碱性条件下脱保护，进而通过酰胺/酯化反应与环状二硫化物及甜菜碱偶联，即得功能化两亲性化合物。其中，酸性脱保护所用试剂有盐酸乙酸乙酯、盐酸甲醇、三氟乙酸；碱性脱保护试剂有哌啶、浓氨水、乙醇胺。
具体制备方法如下：
(1)赖氨酸为连接分子
取一定量的N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)溶于反应溶剂中，随后加入适量催化剂和缚酸剂，活化一段时间后将含有-OH或-NH2疏水链加入到反应混合物中，在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，分离纯化得到中间产物；上步所得中间产物在碱性条件下反应脱掉Fmoc基团，所得脱Fomc产物与适量的4-(二甲氨基)丁酸在催化剂和缚酸剂存在下反应过夜，待反应完成后，分离纯化得到中间产物；所得中间产物溶解再在酸性条件下反应脱掉Boc基团，所得脱Boc产物与一定量的环状二硫化物在催化剂和缚酸剂存在下反应过夜，待反应完成后，分离纯化得到中间产物，所得中间产物再与过量的1,3-丙磺酸内酯或氯乙酸反应，分离纯化后即可得到功能化两亲性化合物。
(2)甘油为连接分子
取一定量含有羧基的疏水尾链溶于反应溶剂，随后加入适量1-苄基甘油，在催化剂存在下低温条件下反应6～8h，反应完成后分离纯化得到中间产物；所得中间产物与适量的4-(二甲氨基)丁酸在催化剂存在下室温反应过夜，待反应完成后，分离纯化得到中间产物；所得中间产物在低温下暴露于含有三氯化硼干燥二氯甲烷中可以脱掉羟基保护基团苄基(Bn)，所得脱Bn产物与一定量的环状二硫化物在催化剂存在下室温反应过夜，待反应完成后，分离纯化得到中间产物，所得中间产物再与过量的1,3-丙磺酸内酯或氯乙酸反应，分离纯化后即可得到功能化两亲性化合物。
作为本发明涉及的第二方面，上述两亲性化合物与生物活性药物脂质纳米粒形成本发明的药物组合物。
优选，上述生物活性药物为多肽药物、蛋白药物、DNA药物、RNA药物、CRISPR基因编辑系统、小分子药物等。其中，所述多肽药物为鲑鱼降钙素、水蛭素；蛋白药物为胰岛素、白介素、淋巴毒素、干扰素或肿瘤坏死因子；DNA药物为质粒DNA；RNA药物为mRNA、小干扰RNA、microRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、核酶或引导RNA；CRISPR基因编辑系统为CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a或CRISPR/dCas9。
优选，上述脂质纳米粒中的脂质含有磷脂、甾族脂质，其中磷脂为大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、中的一种或多种，优选为豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂中的一种或多种；甾族脂质为胆固醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、海藻甾醇、胆酸、甘氨胆酸、脱氧胆酸和石胆酸中的一种或多种，优选为胆固醇。
优选，上述两亲性化合物、磷脂、甾族脂质的摩尔比为(0～30):(30～90):(5～50)，优选为(2～15):(40～80):(10～35)。
上述脂质纳米颗粒可以采用常规的脂质纳米颗粒制备方法，如薄膜分散法、复乳法、逆向蒸发法等制得。脂质纳米颗粒平均粒径为10-1000nm，多分散指数(PDI)＜0.3。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
1、该两亲性化合物及其药物组合物通过动态共价二硫键交换，显著促进细胞摄取并介导非胞吞途径直接入胞，有效避免内体捕获；同时通过静电相互作用高度抵抗非特异性蛋白质吸附，延长递送系统的血液循环时间；此外还可以有效荷载药物，实现高效递送，并且无明显细胞毒性。
2、以天然氨基酸、甘油作为连接分子，通过简单的酰化、酯化反应制备得到具有甜菜碱和环状二硫化物的新型功能化两亲性化合物，方法简便、原料易得、易于实现大规模制备。
附图说明
图1为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNA LNP、Ⅱa-TA/siRNA LNP、Ⅲa-TA/siRNA LNP、Ⅳa-TA/siRNA LNP抗蛋白吸附结果图；
图2为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNA LNP、Ⅱa-TA/siRNA LNP、Ⅲa-TA/siRNA LNP、Ⅳa-TA/siRNA LNP血清稳定性结果图；
图3为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNALNP、Ⅱa-TA/siRNA LNP、Ⅲa-TA/siRNALNP、Ⅳa-TA/siRNALNP培养基稳定性结果图；
图4为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNALNP、Ⅱa-TA/siRNALNP、Ⅲa-TA/siRNALNP、Ⅳa-TA/siRNALNP包封率检测结果图；
图5为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNALNP、Ⅱa-TA/siRNALNP、Ⅲa-TA/siRNALNP、Ⅳa-TA/siRNALNP细胞毒性结果图；
图6为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNALNP、Ⅱa-TA/siRNALNP、Ⅲa-TA/siRNALNP、Ⅳa-TA/siRNA LNP细胞摄取结果图；
图7为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNALNP、Ⅱa-TA/siRNALNP、Ⅲa-TA/siRNALNP、Ⅳa-TA/siRNA LNP细胞内溶酶体共定位结果图；
图8为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNALNP、Ⅱa-TA/siRNALNP、Ⅲa-TA/siRNA LNP、Ⅳa-TA/siRNA LNP细胞摄取机制研究结果图；
图9为实施例7制备的Ⅰa-TA/siRNA LNP、Ⅱa-TA/siRNA LNP、Ⅲa-TA/siRNA LNP、Ⅳa-TA/siRNA LNP在4T1-luc细胞中转染效率结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：化合物1a-1c的合成
Figure BDA0004112182110000091
1、精密称取化合物1(N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸，Fmoc-Lys(Boc)-OH)(1.0mol)于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃搅拌使其溶解，随后加EDC(1.3mol)、HOBT(1.3mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化2h，随后将Ra-c(1.2mol)加入到反应混合物中，在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，旋蒸除去反应溶剂，抽滤洗涤沉淀，真空干燥后所得固体即为目标产物，收率约80％。
2、取上述所得中间产物2(1mol)溶解在40mL 20％(v/v)哌啶的DCM溶液中，搅拌反应以脱掉Fmoc基团。反应完成后，减压旋蒸除去反应溶剂，所得反应产物通过柱层析分离纯化，产物收率约86％。
3、取4-(二甲氨基)丁酸(1.2mol)于圆底烧瓶中，加入氯仿搅拌溶解，随后加入EDC(1.5mol)、HOBT(1.5mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化2h，随后加入脱Fomc产物3(1mol)。反应混合物在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，萃取水洗。有机相无水硫酸镁干燥，过滤后并减压蒸发除去有机溶剂，所得固体即为目标产物，收率约75％。
4、取上述所得中间产物4(1mol)溶解在40mL盐酸乙酸乙酯溶液中，在室温下搅拌反应4h以脱掉Boc基团。反应完成后，减压蒸发除去有机溶剂，产物收率约90％。
5、取芦笋酸(1.2mol)于圆底烧瓶中，加入氯仿超声使其溶解，随后加入EDC(1.5mol)、HOBT(1.5mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化，随后加入脱BOC产物5(1.0mol)。反应混合物在室温下搅拌反过夜，反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，萃取水洗。有机相无水硫酸镁干燥，过滤后并减压蒸发除去有机溶剂，所得固体即为目标产物，收率约70％。
6、取上述所得中间产物6(1mol)与1,3-丙磺酸内酯(3mol)在氯仿中混合并在室温下搅拌反应3天，反应完成后，减压旋蒸除去有机溶剂，所得固体用石油醚洗涤，最终得到最终产物1a-1c，该步收率约88％。
1a：MS m/z(ESI):764.46[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ4.24(m,1H),3.42(s,6H),3.19(m,6H),3.24(m,3H),3.02(s,2H),2.62(s,2H),2.55(s,2H),2.16(s,2H),2.04(d,J＝5.5Hz,2H)1.63(d,J＝1.8Hz,2H),1.57(m,6H),1.33(m,30H),0.92(s,3H).
1b：MS m/z(ESI):762.45[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ5.42(s,2H),4.10(s,1H),3.42(s,6H),3.19(m,6H),3.24(m,3H),3.02(s,2H),2.62(s,2H),2.45(s,2H),2.20(s,6H),2.09(d,J＝5.5Hz,2H)1.69(d,J＝1.8Hz,2H),1.53(m,6H),1.33(m,26H),0.88(s,3H).
1c：MS m/z(ESI):1030.76[M-1]；1HNMR(300MHz,D2O):δ4.34(s,1H),3.61(m,1H),3.36(s,6H),3.18(m,4H),3.07(m,5H),2.58(m,4H),2.32(m,2H),2.07(d,J＝0.9Hz,2H),1.96(d,J＝5.5Hz,2H),1.69(m,2H),1.54–1.42(m,6H),1.22(d,J＝1.4Hz,66H),0.83(s,6H).
实施例2：化合物2a-2c的合成
Figure BDA0004112182110000111
1、精密称取化合物1(N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸，Fmoc-Lys(Boc)-OH)(1.0mol)于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃搅拌使其溶解，随后加EDC(1.3mol)、HOBT(1.3mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化2h，随后将Ra-c(1.2mol)加入到反应混合物中，在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，旋蒸除去反应溶剂，抽滤洗涤沉淀，真空干燥后所得固体即为目标产物，收率约80％。
2、取上述所得中间产物2(1mol)溶解在40mL 20％(v/v)哌啶的DCM溶液中，搅拌反应以脱掉Fmoc基团。反应完成后，减压旋蒸除去反应溶剂，所得反应产物通过柱层析分离纯化，产物收率约86％。
3、取4-(二甲氨基)丁酸(1.2mol)于圆底烧瓶中，加入氯仿搅拌溶解，随后加入EDC(1.5mol)、HOBT(1.5mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化2h，随后加入脱Fomc产物3(1mol)。反应混合物在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，萃取水洗。有机相无水硫酸镁干燥，过滤后并减压蒸发除去有机溶剂，所得固体即为目标产物，收率约75％。
4、取上述所得中间产物4(1mol)溶解在40mL盐酸乙酸乙酯溶液中，在室温下搅拌反应4h以脱掉Boc基团。反应完成后，减压蒸发除去有机溶剂，产物收率约90％。
5、取芦笋酸(1.2mol)于圆底烧瓶中，加入氯仿超声使其溶解，随后加入EDC(1.5mol)、HOBT(1.5mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化，随后加入脱BOC产物5(1.0mol)。反应混合物在室温下搅拌反过夜，反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，萃取水洗。有机相无水硫酸镁干燥，过滤后并减压蒸发除去有机溶剂，所得固体即为目标产物，收率约70％。
6、取上述所得中间产物6(1.0mol)与氯乙酸(3.0mol)加入到乙醇/水混合溶液中，将pH调至11-13，用冷凝器将反应混合物保持在60℃，反应完成后，蒸发浓缩样品。用乙酸乙酯沉淀最终产物，抽滤，固体用用乙酸乙酯洗涤，然后真空干燥，最终得到最终产物2a-2c，该步收率约80％。
2a：MS m/z(ESI):700.46[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ4.30(s,1H),3.79(d,J＝12.3Hz,2H),3.42(m,2H),3.23(d,J＝17.0Hz,8H),3.10(s,4H),2.98(s,1H),2.65(s,2H),2.24(d,J＝4.9Hz,2H),2.04(d,J＝12.3Hz,2H),1.77(m,2H),1.48(d,2H),1.35–1.25(m,34H),0.89(s,3H).
2b：MS m/z(ESI):698.45[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ5.35(s,2H),3.80(m,2H),3.40(m,2H),3.23(d,J＝17.0Hz,8H),3.11(s,2H),3.07(s,3H),2.69(s,2H),2.24(m,2H),2.03(s,4H),1.95(m,2H),1.78(m,2H),1.56(m,2H),1.35–1.20(m,26H),0.87(s,3H).
2c：MS m/z(ESI):966.75[M-1]；1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.53(m,1H),4.28(s,2H),3.41(m,3H),3.30(s,2H),3.21(s,6H),3.07(s,3H),2.78(s,2H),2.29(m,2H),1.92(m,2H),1.74(m,2H),1.58(m,6H),1.33–1.25(m,66H),0.78(s,6H).
实施例3：化合物3a-3c的合成
Figure BDA0004112182110000131
1、精密称取化合物1(N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸，Fmoc-Lys(Boc)-OH)(1.0mol)于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃搅拌使其溶解，随后加EDC(1.3mol)、HOBT(1.3mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化2h，随后将Ra-c(1.2mol)加入到反应混合物中，在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，旋蒸除去反应溶剂，抽滤洗涤沉淀，真空干燥后所得固体即为目标产物，收率约80％。
2、取上述所得中间产物2(1mol)溶解在40mL 20％(v/v)哌啶的DCM溶液中，搅拌反应以脱掉Fmoc基团。反应完成后，减压旋蒸除去反应溶剂，所得反应产物通过柱层析分离纯化，产物收率约86％。
3、取4-(二甲氨基)丁酸(1.2mol)于圆底烧瓶中，加入氯仿搅拌溶解，随后加入EDC(1.5mol)、HOBT(1.5mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化2h，随后加入脱Fomc产物3(1mol)。反应混合物在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，萃取水洗。有机相无水硫酸镁干燥，过滤后并减压蒸发除去有机溶剂，所得固体即为目标产物，收率约75％。
4、取上述所得中间产物4(1mol)溶解在40mL盐酸乙酸乙酯溶液中，在室温下搅拌反应4h以脱掉Boc基团。反应完成后，减压蒸发除去有机溶剂，产物收率约90％。
5、取硫辛酸(1.2mol)于圆底烧瓶中，加入氯仿超声使其溶解，随后加入EDC(1.5mol)、HOBT(1.5mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化，随后加入脱BOC产物5(1.0mol)。反应混合物在室温下搅拌反过夜，反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，萃取水洗。有机相无水硫酸镁干燥，过滤后并减压蒸发除去有机溶剂，所得固体即为目标产物，收率约70％。
6、取上述所得中间产物6(1mol)与1,3-丙磺酸内酯(3mol)在氯仿中混合并在室温下搅拌反应3天，反应完成后，减压旋蒸除去有机溶剂，所得固体用石油醚洗涤，最终得到最终产物1a-1c，该步收率约88％。
3a：MS m/z(ESI):820.51[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ4.11(s,1H),3.45–3.38(m,3H),3.20(s,8H),3.10(s,2H),3.06(s,2H),2.95(d,J＝17.4Hz,2H),2.65(d,J＝12.4Hz,2H),2.26(d,J＝0.7Hz,2H),2.02–1.95(m,3H),1.74(m,3H),1.53(m,6H),1.32–1.25(m,36H),0.87(s,3H).
3b：MS m/z(ESI):818.49[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ5.35(s,2H),4.11(s,1H),3.45–3.38(m,3H),3.30–3.22(m,3H),3.16(s,8H),2.98(d,4H),2.65(d,2H)2.26(d,J＝0.7Hz,2H),2.01–1.95(m,7H),1.78(m,3H),1.50-1.56(m,6H),1.40–1.20(m,28H),0.79(s,3H).
3c：MS m/z(ESI):1086.83[M-1]；1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.1–3.8(m,2H),3.41–3.30(m,2H),3.30–3.22(m,2H),3.20(s,7H),2.97(s,2H),2.58(d,2H),2.27(d,J＝0.9Hz,2H),2.19(s,2H),2.01–1.95(m,4H),1.66–1.54(m,8H),1.48–1.41(m,4H),1.36–1.23(m,68H),0.92(s,6H).
实施例4：化合物4a-4c的合成
Figure BDA0004112182110000151
1、精密称取化合物1(N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸，Fmoc-Lys(Boc)-OH)(1.0mol)于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃搅拌使其溶解，随后加EDC(1.3mol)、HOBT(1.3mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化2h，随后将Ra-c(1.2mol)加入到反应混合物中，在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，旋蒸除去反应溶剂，抽滤洗涤沉淀，真空干燥后所得固体即为目标产物，收率约80％。
2、取上述所得中间产物2(1mol)溶解在40mL 20％(v/v)哌啶的DCM溶液中，搅拌反应以脱掉Fmoc基团。反应完成后，减压旋蒸除去反应溶剂，所得反应产物通过柱层析分离纯化，产物收率约86％。
3、取4-(二甲氨基)丁酸(1.2mol)于圆底烧瓶中，加入氯仿搅拌溶解，随后加入EDC(1.5mol)、HOBT(1.5mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化2h，随后加入脱Fomc产物3(1mol)。反应混合物在室温下搅拌反应过夜。反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，萃取水洗。有机相无水硫酸镁干燥，过滤后并减压蒸发除去有机溶剂，所得固体即为目标产物，收率约75％。
4、取上述所得中间产物4(1mol)溶解在40mL盐酸乙酸乙酯溶液中，在室温下搅拌反应4h以脱掉Boc基团。反应完成后，减压蒸发除去有机溶剂，产物收率约90％。
5、取硫辛酸(1.2mol)于圆底烧瓶中，加入氯仿超声使其溶解，随后加入EDC(1.5mol)、HOBT(1.5mol)和缚酸剂三乙胺(3mol)。上述混合物搅拌活化，随后加入脱BOC产物5(1.0mol)。反应混合物在室温下搅拌反过夜，反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，萃取水洗。有机相无水硫酸镁干燥，过滤后并减压蒸发除去有机溶剂，所得固体即为目标产物，收率约70％。
6、取上述所得中间产物6(1.0mol)与氯乙酸(3.0mol)加入到乙醇/水混合溶液中，将pH调至11-13，用冷凝器将反应混合物保持在60℃，反应完成后，蒸发浓缩样品。用乙酸乙酯沉淀最终产物，抽滤，固体用用乙酸乙酯洗涤，然后真空干燥，最终得到最终产物2a-2c，该步收率约80％。
4a：MS m/z(ESI):756.49[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ4.23(s,1H),3.76–3.33(m,5H),3.21(s,6H),3.08(s,4H),2.98(d,J＝17.4Hz,2H),2.24(d,J＝4.9Hz,2H),2.19(s,2H),2.07–1.98(m,4H),1.63(m,2H),1.57(m,6H),1.39–1.22(m,36H),0.83(s,3H).
4b：MS m/z(ESI):754.53[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ5.35(s,2H),4.34(s,1H),3.73–3.39(m,5H),3.21(s,6H),3.06(s,4H),2.98(d,J＝17.4Hz,2H),2.29–2.22(m,2H),2.19(s,2H),2.03(s,6H),1.98(t,J＝6.2Hz,2H),1.67(d,J＝1.8Hz,2H),1.59–1.49(m,6H),1.45–1.20(m,28H),0.85(s,3H).
4c：MS m/z(ESI):1022.80[M-1]；1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.15(m,1H),3.89(m,1H),3.50–3.39(m,5H),3.25(s,6H),2.19(m,4H),2.02–1.92(m,4H),1.66–1.54(m,8H),1.46–1.39(m,4H),1.37–1.24(m,68H),0.87(s,6H).
实施例5：化合物9a-9c的合成
Figure BDA0004112182110000161
1、将1-苄基甘油(1.0mol)、含羧基的疏水链(Ra-Rc)(1.5mol)和DMAP(0.1mol)溶于干燥二氯甲烷中的溶液中，随后加入DCC(1.5mol)，并在0℃下搅拌6-8小时。滤出固体，减压浓缩滤液。然后将残余物通过硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯洗脱)，得到中间产物1-苄基-3-酰基甘油，该步收率约75％。
2、将1-苄基-3-酰基甘油(1.0mol)、4-(二甲氨基)丁酸(0.5mol)和DMAP(0.15mol)溶解在干燥二氯甲烷中，随后在上述溶液中加入DCC(0.5mol)，并在室温下搅拌反应24小时。过滤出固体并在真空下蒸发溶剂。残余物分离纯化得到中间产物3，该步收率约62％。
3、取上步所得中间产物3(1.0mol)溶于干燥的二氯甲烷中，在低温条件下将三氯硼烷(2.0mol)的二氯甲烷溶液缓慢滴加到上述溶液中，在氮气保护下，将反应混合物在相同温度下再搅拌30-40分钟。然后将混合物倒入冰水中。分离二氯甲烷并用冰水洗涤，用无水硫酸镁干燥并在室温下浓缩。残余物通过硅胶柱纯化得到中间产物4，该步收率约60％。
4、上步所得中间产物4(1.0mol)、芦笋酸(1.5mol)和DMAP(0.1mol)溶解在干燥二氯甲烷中，随后在上述溶液中加入DCC(1.5mol)，并在室温下搅拌反应24小时。过滤出固体并在真空下蒸发溶剂。残余物纯化后得到中间产物5。
5、上述所得中间产物5(1.0mol)与1,3-丙磺酸内酯(3mol)无水在氯仿中混合并在室温下搅拌反应3天，反应完成后，减压旋蒸除去有机溶剂，所得固体用石油醚洗涤，最终得到最终产物9a-9c。
9a：MS m/z(ESI):725.37[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ:4.7(m,2H),4.19(s,3H),3.45–3.24(m,5H),3.18(s,7H),2.90(m,5H),2.62(m,2H),2.46(s,2H),2.25(s,2H),1.87(d,J＝5.1Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(m,28H),0.85(s,3H).
9b：MS m/z(ESI):723.35[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ5.35(s,2H),4.68(m,2H),4.19(s,3H),3.44–3.24(m,5H),3.18(s,7H),2.98(s,2H),2.89(d,J＝4.4Hz,3H),2.61(m,2H),2.41(s,2H),2.28(s,2H),2.03(s,4H),1.95(m,2H),1.50(s,2H),1.26(m,20H),0.92(s,3H).
9c：MS m/z(ESI):1005.68[M-1]；1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.70(m,2H),4.19(d,J＝1.1Hz,3H),3.48–3.34(m,3H),3.27(dd,J＝12.5,1.1Hz,2H),3.18(s,7H),3.00(s,2H),2.95 -2.84(m,4H),2.58(m,2H),2.41(s,2H),1.96(d,J＝1.5Hz,2H),1.63(m,4H),1.5–1.20(m,64H),0.78(s,6H).
实施例6：化合物10a-10c的合成
Figure BDA0004112182110000181
1、将1-苄基甘油(1.0mol)、含羧基的疏水链(Ra-Rc)(1.5mol)和DMAP(0.1mol)溶于干燥二氯甲烷(100ml)中的溶液中，随后加入DCC(1.5mol)，并在0℃下搅拌6-8小时。滤出固体，减压浓缩滤液。然后将残余物通过硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯洗脱)，得到中间产物1-苄基-3-酰基甘油，该步收率约75％。
2、将1-苄基-3-酰基甘油(1.0mol)、4-(二甲氨基)丁酸(0.5mol)和DMAP(0.15mol)溶解在干燥二氯甲烷中，随后在上述溶液中加入DCC(0.5mol)，并在室温下搅拌反应24小时。过滤出固体并在真空下蒸发溶剂。残余物分离纯化得到中间产物3，该步收率约62％。
3、取上步所得中间产物3(1.0mol)溶于干燥的二氯甲烷中，在低温条件下将三氯硼烷(2.0mol)的二氯甲烷溶液缓慢滴加到上述溶液中，在氮气保护下，将反应混合物在相同温度下再搅拌30-40分钟。然后将混合物倒入冰水中。分离二氯甲烷并用冰水洗涤，用无水硫酸镁干燥并在室温下浓缩。残余物通过硅胶柱纯化得到中间产物4，该步收率约60％。
4、上步所得中间产物4(1.0mol)、芦笋酸(1.5mol)和DMAP(0.1mol)溶解在干燥二氯甲烷中，随后在上述溶液中加入DCC(1.5mol)，并在室温下搅拌反应24小时。过滤出固体并在真空下蒸发溶剂。残余物纯化后得到中间产物5,该步收率约70％。
5、上述所得中间产物5(1.0mol)与氯乙酸(3mol)加入到乙醇/水混合溶液中，将pH调至11-13，用冷凝器将反应混合物保持在60℃，反应完成后，蒸发浓缩样品。用乙酸乙酯沉淀最终产物，抽滤，固体用用乙酸乙酯洗涤，然后真空干燥，最终得到最终产物10a-10c，该步收率约65％。
10a：MS m/z(ESI):661.37[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ4.29(s,3H),3.78(m,2H),3.45–3.35(m,3H),3.21(s,6H),2.95(s,5H),2.42(m,2H),2.26(m,2H),2.00(s,2H),1.51(s,2H),1.26(m,28H),0.87(s,3H).
10b：MS m/z(ESI):659.35[M-1]；1H NMR(300MHz,D2O):δ5.35(s,2H),4.76(m,2H),4.19(s,3H),3.45–3.35(m,4H),3.21(s,6H),2.93(s,5H),2.42-2.26(m,4H),2.05(m,6H),1.55(s,2H),1.23(m,20H),0.89(s,3H).
10c：MS m/z(ESI):941.49[M-1]；1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.70(m,2H),4.21(d,J＝1.1Hz 3H),3.50–3.39(m,4H),3.21(s,6H),3.00(s,2H),2.90(s,3H),2.42(s,2H),1.99(s,2H),1.63(d,J＝12.4Hz,2H),1.54(d,J＝12.4Hz,2H),1.38–1.20(m,64H),0.80(s,6H).
参照上述制备方法，通过采用不同的反应原料可以制备得到起其它结构的功能化两亲性化合物，此处未重复赘述。
实施例7：两亲性化合物修饰的脂质纳米粒的制备
1、两亲性化合物修饰的TA/siRNA LNP的制备
首先将单宁酸(TA)和siRNA溶于RNase Free水配制成母液，siRNA溶液与等体积TA稀释溶液按质量比1:10混合，轻轻涡旋20s后室温静置30min。将TA/siRNA溶液作为内水相W1。将大豆磷脂、胆固醇按处方量溶于氯仿中为油相，将内水相加入油相中，探头超声形成W/O型乳剂。将W/O型乳剂滴加入含处方量的大豆磷脂与功能化两亲性化合物(1a、2a、3a、4a)的外水相中，水浴超声形成复乳，减压蒸发除去有机溶剂，即得功能化两亲性化合物修饰的脂质纳米颗粒Ⅰa-TA/siRNA LNP、Ⅱa-TA/siRNA LNP、Ⅲa-TA/siRNA LNP、Ⅳa-TA/siRNA LNP。使用Zetasizer 3000HS instrument粒度分析仪(Malvern Instruments，Malvern，UK)测定内核粒径和多分散指数(PDI)。
在本实施例中，具体结果如下：所得脂质纳米颗粒的平均粒径均在145.0nm左右，PDI小于0.3。
2、两亲性化合物修饰的阳离子脂质体的制备
处方量的的蛋黄卵磷脂、DOTAP、胆固醇和功能化两亲性化合物(1a、2a、3a、4a)于茄形瓶中，用氯仿/甲醇使其完全溶解，37℃下，以120rpm的转速旋转蒸发20min除去有机溶剂，使之形成均匀的薄膜，然后真空干燥以去除残余的有机溶剂。加入含siRNA的无酶溶液分散薄膜，水浴超声5-10min后即制得载有siRNA的两亲性化合物修饰的脂质体。使用Zetasizer 3000HS instrument粒度分析仪(Malvern Instruments，Malvern，UK)测定内核粒径和多分散指数(PDI)。
在本实施例中，具体结果如下：所得脂质纳米颗粒的平均粒径均135.0nm左右，PDI小于0.3。
3、两亲性化合物修饰的TA/mRNA LNP的制备
首先将TA和mRNA溶于RNase Free水配制成母液，mRNA溶液与等体积TA稀释溶液按质量比1:10混合，轻轻涡旋20s后室温静置30min。将TA/mRNA溶液作为内水相W1。将大豆磷脂、胆固醇按处方量溶于氯仿或中为油相，将内水相加入油相中，探头超声形成W/O型乳剂。将W/O型乳剂滴加入含处方量的大豆磷脂与功能化两亲性化合物(1a、2a、3a、4a)的外水相中，水浴超声形成复乳，减压蒸发除去有机溶剂，即得功能化两亲性化合物修饰的脂质纳米颗粒Ⅰa-TA/mRNA LNP、Ⅱa-TA/mRNA LNP、Ⅲa-TA/mRNA LNP、Ⅳa-TA/mRNA LNP。使用Zetasizer 3000HS instrument粒度分析仪(Malvern Instruments，Malvern，UK)测定内核粒径和多分散指数(PDI)。
在本实施例中，具体结果如下：所得脂质纳米颗粒的平均粒径均在145.0nm左右，PDI小于0.3。
4、两亲性化合物修饰的TA/GFP LNP的制备
首先将绿色荧光蛋白(GFP)溶液和TA溶液按质量比1:10等体积混合混合，轻轻涡旋20s后室温静置30min。将TA/GFP溶液作为内水相W1。将大豆磷脂、胆固醇按处方量溶于氯仿中为油相，将内水相加入油相中，探头超声形成W/O型乳剂。将W/O型乳剂滴加入含处方量的大豆磷脂与功能化两亲性化合物(1a、2a、3a、4a)的外水相中，水浴超声形成复乳，减压蒸发除去有机溶剂，即得功能化两亲性化合物修饰的脂质纳米颗粒Ⅰa-TA/GFP LNP、Ⅱa-TA/GFP LNP、Ⅲa-TA/GFP LNP、Ⅳa-TA/GFP LNP。使用Zetasizer 3000HS instrument粒度分析仪(Malvern Instruments，Malvern，UK)测定内核粒径和多分散指数(PDI)。
在本实施例中，具体结果如下：所得脂质纳米颗粒的平均粒径均在150.0nm左右，PDI小于0.3。
5、两亲性化合物修饰的PTX LNP的制备
将处方量的大豆磷脂、胆固醇、PTX和功能化两亲性化合物(1a、2a、3a、4a)于茄形瓶中，用氯仿/甲醇使其完全溶解，37℃下，以120rpm的转速旋转蒸发20min除去有机溶剂，使之形成均匀的薄膜，然后真空干燥以去除残余的有机溶剂。加入PBS分散薄膜，水浴超声5-10min后即制得载有PTX的两亲性化合物修饰的脂质体。使用Zetasizer 3000HSinstrument粒度分析仪(Malvern Instruments，Malvern，UK)测定内核粒径和多分散指数(PDI)。
在本实施例中，具体结果如下：所得脂质纳米颗粒的平均粒径均150nm左右，PDI小于0.3。
实施例8：两亲性化合物修饰的TA/siRNA LNP抗蛋白吸附能力考察
各组脂质纳米颗粒用PBS稀释后，各取1mL，分别与等体积的的牛血清白蛋白(BSA)溶液(3mg/mL)混合，置于气浴恒温振荡器中孵育2h后，离心取上清液，利用紫外-可见分光光度计测280nm处紫外吸光度值A。通过BSA标准曲线计算上述各上清液的BSA浓度，计算各样品的BSA的吸附值。
结果如图1所示，功能化两亲性化合物修饰的脂质纳米颗粒均有良好的抗蛋白吸附的能力。
实施例9：两亲性化合物修饰的TA/siRNA LNP稳定性考察
以粒径变化为指标考察按实施例7制备的脂质纳米颗粒Ⅰa-LNP/siRNA、Ⅱa-LNP/siRNA、Ⅲa-LNP/siRNA、Ⅳa-LNP/siRNA分别在含有10％血清的磷酸盐缓冲液和基础培养基介质中37℃稳定性，结果如图2和3所示，Ⅰa-LNP/siRNA、Ⅱa-LNP/siRNA、Ⅲa-LNP/siRNA、Ⅳa-LNP/siRNA四组制剂在两种介质中48h内粒径无明显变化，稳定性良好，这与功能化两亲性化合物抗蛋白吸附能力有关。
实施例10：两亲性化合物修饰的脂质纳米粒包封率考察
按实施例7中方法制备的载有Cy3-siRNA的脂质纳米颗粒Ⅰa-TA/Cy3-siRNA LNP、Ⅱa-TA/Cy3-siRNA LNP、Ⅲa-TACy3-siRNA LNP、Ⅳa-TA/Cy3-siRNA LNP。将各组脂质纳米颗粒溶解在裂解缓冲液(2mM EDTA和0.05％ Triton X-100in pH 7.8Tris缓冲液)中，65℃孵育10min后，通过测量荧光强度来确定溶解的脂质纳米颗粒释放的Cy3-siRNA的浓度，然后计算装载到LNP NPs中的Cy3-siRNA的包封率。
结果如图4所示，功能化两亲性化合物修饰与未修饰组脂质纳米粒种siRNA的包封率均在60％左右，分别为59.8％、60.2％、63.2％、62.6％、61.8％。
实施例11：两亲性化合物修饰的脂质纳米粒细胞毒性评价
采用MTT法考察实施例7制备的脂质纳米颗粒Ⅰa-LNP/siRNA、Ⅱa-LNP/siRNA、Ⅲa-LNP/siRNA、Ⅳa-LNP/siRNA的细胞毒性。将4T1细胞以5×103个/孔的细胞密度接种于96孔板中，将板置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h。24h后吸出孔中培养液，用PBS洗涤细胞3次。分别加入siRNA剂量为200nM的Ⅰa-LNP/siRNA、Ⅱa-LNP/siRNA、Ⅲa-LNP/siRNA、Ⅳa-LNP/siRNA，无血清条件下孵育48小时。以空白培养基为阴性对照(Control)按相同方式孵育。孵育完成后，向每个细胞孔内加入20μL 5mg/mL的MTT溶液并在37℃下孵育4h。随后弃去孔内液体，向各孔中加入150μL DMSO溶解甲瓒结晶，采用酶标仪测定各细胞孔于570nm处的吸光度值并计算细胞存活率。
具体结果如图5所示，Ⅰa-LNP/siRNA、Ⅱa-LNP/siRNA、Ⅲa-LNP/siRNA、Ⅳa-LNP/siRNA脂质纳米颗粒在细胞系中给药浓度下均未表现出明显的细胞毒性，因此可说明各组制剂均有较高的安全性
实施例12：两亲性化合物修饰的脂质纳米粒在4T1模型细胞中的细胞摄取的考察
通过流式细胞术分析，定量评估在4T1细胞系中各组脂质纳米颗粒的细胞摄取。将4T1细胞按照1×105cells/孔接种于6孔板中，于37℃、5％ CO2培养箱中培养24h。弃去原培养基，分别加入用无血清RPMI-1640培养基稀释至相同Cy3-siRNA浓度(100nM)LNP/Cy3-siRNA、Ⅰa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅱa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅲa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅳa-LNP/Cy3-siRNA溶液继续孵育2h。以空白培养基为阴性对照(Control)，以PEI 25K/Cy3-siRNA(w/w＝1)为阳性对照。弃去原培养基，用PBS洗涤细胞3次，胰酶消化并收集细胞，并将细胞重新悬浮在PBS中。随后用流式细胞仪分析细胞。用平均荧光强度(MFI)表示脂质纳米颗粒的细胞摄取效率。
结果如图6所示，在4T1细胞中，与对照组相比，两亲性化合物修饰的脂质纳米粒的细胞摄取量较高，与阳离子转染试剂PEI 25K相当。其中Ⅰa-LNP/Cy3-siRNA和Ⅱa-LNP/Cy3-siRNA组的细胞摄取略高于Ⅲa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅳa-LNP/Cy3-siRNA组，可能是Ⅰa-LNP/Cy3-siRNA和Ⅱa-LNP/Cy3-siRNA脂质纳米颗粒上所修饰的两亲性化合物中，环状二硫化物的张力高，高的环张力进一步促进其与细胞表面二硫化物的交换，增强了细胞的摄取。
实施例13：两亲性化合物修饰的脂质纳米粒在4T1模型细胞中亚细胞分布的研究
将4T1细胞按照1×105cells/孔接种于共聚焦培养皿中，放置于37℃、5％ CO2培养箱箱中培养24h。弃去原培养基，分别加入用无血清RPMI-1640培养基稀释至相同Cy3-siRNA浓度(100nM)的Ⅰa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅱa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅲa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅳa-LNP/Cy3-siRNA溶液继续孵育1h。弃去培养基，用PBS洗涤3次，加入Lyso-Tracker Green(100nM)染溶酶体30min，PBS洗涤后加入Hoechst 33342(10μg/mL)染核10min，PBS洗涤，再用4％的多聚甲醛固定细胞10min，PBS洗涤后于CLSM下观察分析。用Image J软件进行共定位分析，计算PearsonQs相关系数(PCCs)，以分析脂质纳米粒与溶酶体之间的关系。
结果如图7所示，两亲性化合物修饰的脂质纳米粒的PCCs范围为0.1～0.40，远低于相关性所需的阈值＞0.5，相比之下，未经修饰的脂质纳米颗粒的PCC约为0.86，表明被溶酶体捕获。这些结果表明，两亲性化合物修饰的脂质纳米颗粒可以通过非胞吞途径直接进入细胞质。
实施例14：两亲性化合物修饰的脂质纳米粒细胞摄取机制的研究
将4T1细胞按照1×105cells/孔接种于6孔板中，于37℃、5％ CO2培养箱中培养24h。给药前用不同的抑制剂(4.8mM DTNB、10μg/mL氯丙嗪、50nM渥曼青霉素或50μM甲基-β-环糊精)在37℃下预处理细胞30min，随后加入用无血清RPMI-1640培养基稀释至相同Cy3-siRNA浓度(100nM)Ⅰa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅱa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅲa-LNP/Cy3-siRNA、Ⅳa-LNP/Cy3-siRNA溶液继续孵育2h。弃去原培养基，用PBS洗涤细胞3次，胰酶消化并收集细胞，并将细胞重新悬浮在PBS中。随后用流式细胞仪分析细胞。用相对荧光强度(MFI)表示各处理剂对脂质纳米颗粒的细胞摄取的影响。
结果如图8所示，网格蛋白介导的内吞抑制剂氯丙嗪、小窝蛋白介导的内吞抑制剂甲基-β-环糊精和巨胞饮抑制剂渥曼青霉素对两亲性化合物修饰的脂质纳米粒的细胞摄取效率都没有显著影响，用5,5'-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)阻断细胞表面的外表面硫醇显著抑制了两亲性化合物修饰的脂质纳米粒的内化，而对未经修饰的脂质纳米粒LNP的细胞摄取无显著影响。总的来说，上述结果表明两亲性化合物修饰的脂质体通过细胞表面硫醇介导以非胞吞途径入胞。
实施例15：两亲性化合物修饰的脂质纳米粒在4T1-luc模型细胞中的转染效率
将4T1-luc细胞以5×104个/孔的细胞密度接种于24孔板中，将板置于37℃、5％CO2的培养箱中中培养24h。24h后吸出孔中培养液，用PBS洗涤细胞3次。分别加入Ⅰa-LNP/siLuc、Ⅱa-LNP/siLuc、Ⅲa-LNP/siLuc、Ⅳa-LNP/siLuc，在含血清培养基中孵育12h。随后更换为完全培养基继续孵育36h。以空白培养基为阴性对照，以
Figure BDA0004112182110000231
3000/siLuc为阳性对照。孵育结束后吸出孔内液体，使用荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性
结果如图9所示，在给药浓度为200nM时，Ⅰa-LNP/siLuc、Ⅱa-LNP/siLuc、Ⅲa-LNP/siLuc、Ⅳa-LNP/siLuc四组制剂沉默效率大约为65％，与
Figure BDA0004112182110000232
3000/siLuc转染效率相当。其中，Ⅰa-LNP/siLuc、Ⅱa-LNP/siLuc组基因沉默效率略高于Ⅲa-LNP/siLuc、Ⅳa-LNP/siLuc组。/>

Claims (10)

1.一种两亲性化合物，其特征在于，具有式I的结构，
Figure FDA0004112182090000011
其中：
P为
Figure FDA0004112182090000012
Q为-S(O)2O-或-C(O)O-；
R1为至少一个氢、双键或C14-C18直链烷基取代的C14-C19直链烷氧基、C14-C19直链烷氨基或C14-C20直链酰基；
R2为
Figure FDA0004112182090000013
2.根据权利要求1所述的两亲性化合物，其特征在于，具有式II或式III的结构，
Figure FDA0004112182090000014
其中，Q、R1、R2、n的定义同权利要求1。
3.根据权利要求1所述的两亲性化合物，其特征在于，所述结构中，R1选自以下任一取代基：
Figure FDA0004112182090000021
4.根据权利要求1所述的两亲性化合物，其特征在于，所述结构中，n为1或3。
5.根据权利要求1所述的两亲性化合物，其特征在于，选自以下任一化合物：
Figure FDA0004112182090000031
/>
Figure FDA0004112182090000041
/>
Figure FDA0004112182090000051
6.一种药物组合物，其特征在于，由权利要求1所述的两亲性化合物与生物活性药物脂质纳米粒构成。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述生物活性药物为多肽药物、蛋白药物、DNA药物、RNA药物、CRISPR基因编辑系统或小分子药物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述多肽药物为鲑鱼降钙素、水蛭素；蛋白药物为胰岛素、白介素、淋巴毒素、干扰素或肿瘤坏死因子；DNA药物为质粒DNA；RNA药物为mRNA、小干扰RNA、microRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、核酶或引导RNA；CRISPR基因编辑系统为CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a或CRISPR/dCas9。
9.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述脂质纳米粒中的脂质含有磷脂、甾族脂质，其中磷脂为大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵中的一种或多种；甾族脂质为胆固醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、海藻甾醇、胆酸、甘氨胆酸、脱氧胆酸和石胆酸中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述两亲性化合物、磷脂、甾族脂质的摩尔比为(0～30):(30～90):(5～50)。
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