CN114945555A - 用于荷电材料递送的脂质、其制剂及其制备方法 - Google Patents

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S·陈
Y·Y·塔姆
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Abstract

本文公开了在生理学pH具有净电荷并且共价连接至脂质部分的脂质。脂质部分包含具有两种或更多种连接的烃链的烃结构，烃链任选地具有顺式或反式C＝C，所述链中的至少一个任选地经由接头区共价连接至所述头部基团。烃链在连接至接头区的链的内部碳的分支点彼此键合，分支点包含具有电负性原子的官能团。烃链分别具有1至40个碳原子，其中烃结构总计包含10至150个碳原子。有利地，烃结构可以采取一般张开的形状以用于提高货物分子的递送。还提供了包含脂质的递送媒介物。

Description

用于荷电材料递送的脂质、其制剂及其制备方法
技术领域
本文提供了脂质、这类脂质的制剂以及制备它们的方法。脂质及其制剂对于荷电材料，包括(但不限于)核酸和肽的递送是有用的。
背景技术
通过它们向递送系统，如脂质纳米颗粒(LNP)的掺入有助于核酸或其他荷电分子，如肽的胞内递送。例如，可电离脂质是LNP生产过程期间负责核酸有效封装的主要脂质组分。此外，在靶细胞中通过胞吞吸收后，可电离或阳离子脂质有助于核酸从内涵体中的后续控制释放。
已提议转染或基因递送活性取决于可电离脂质，如阳离子脂质的化学结构(Semple,S.C.等人,Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.NatBiotechnol,2010,28(2):p.172-6)。具体地，亲脂性部分应具有非圆柱形形状。实例是具有小型可电离头部基团和从头部基团向外增宽或张开的烃部分的脂质。
目前，仍需要可以使用简单或方便的方法制备的具有所期望的形状的可电离或荷电脂质结构。提供这些脂质的能力可以显著发展依赖于核酸或其他荷电分子向靶细胞的递送的治疗的临床开发。
本发明公开所述的组合物和方法设法解决上述问题和/或为本领域先前描述的那些提供有用的替代。
发明内容
本文提供了具有有助于荷电材料递送的烃结构的可电离或阳离子脂质。所述荷电材料可以是带负电荷的材料，如核酸，或者带正电荷的材料。可以以模块化方式制备本文所描述的脂质，从而提供具有多种非圆柱形形状的调节的烃结构以辅助多种带负电荷或正电荷的材料的递送。
本文公开了包含头部基团的脂质，所述头部基团在生理学pH具有净电荷并且经由任选的接头区共价连接至脂质部分。所述脂质部分包含具有两种或更多种连接的烃链的烃结构，所述烃链任选地具有顺式或反式C＝C，所述链中的至少一个任选地经由所述接头区共价连接至可电离头部基团。所述烃链在经由任选的接头区连接至头部基团的链的内部碳的分支点彼此键合，所述分支点包含本文中进一步描述的具有电负性原子的X1官能团。所述烃链分别具有1至40或者1至30个碳原子，其中所述烃结构总计包含10至150个碳原子。
根据一个实施方式，提供了荷电脂质，其包括阳离子或阴离子脂质，其包含：头部基团，其在生理学pH具有净电荷并且经由任选的接头区共价连接至脂质部分；脂质部分，其包含具有两种或更多种连接的烃链的烃结构，所述烃链任选地具有顺式或反式C＝C，所述链中的至少一个经由所述接头区共价连接至可电离头部基团，并且其中所述烃链在连接至所述接头区的烃链的内部碳的分支点处彼此键合，所述分支点包含X1官能团，所述X1官能团选自：-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-NR1-、-C(O)N(R1)-、N(R1)C(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)O-、-S-、-S-S-、-C(R1)＝N-N-C(O)-、-C(O)-N-N＝C(R1)、-ON＝C(R1)-或-C(R1)＝NO-，其中所述烃链分别具有1至30个碳原子，其中所述烃结构总计包含10至150个碳原子，并且其中R1独立地选自氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环。
在一个实施方式中，所述两种或更多种连接的烃链具有化学式III的结构：
化学式III
Figure BDA0003583427700000021
其中L1'、L1”、L1”'和L1””独立地选自具有1至30个原子的烃链，其任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C键，并且L1'是共价连接至所述接头区的烃链。
根据其他实施方式，所述烃结构还包括疏水链，L2，其经由接头区键合至头部基团，并且其中L2是具有1至30个碳原子的烃链，其任选地具有顺式或反式C＝C键，或者其中L2具有化学式IIIa的结构：
Figure BDA0003583427700000031
其中L2'、L2”、L2”'和L2””独立地选自具有1至30个原子的烃链，其任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C键，并且其中L2'共价连接至接头区。
在其他实施方式中，所述烃还包括疏水链，L3，其经由接头区键合至头部基团，并且其中L3具有1至30个碳原子，其任选地具有顺式或反式C＝C键，或者具有化学式IIIa的结构：
Figure BDA0003583427700000032
其中L3'、L3”、L3”'和L3””独立地选自具有1至30个原子的烃链，其任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C键，并且其中L3'共价连接至接头区。
在其他实施方式中，所述脂质还可以包含经由X1键，键合至L1的1至10个侧链S，每个侧链具有1至30个原子，其任选地具有顺式或反式C＝C键或者具有化学式IIIb的结构：
Figure BDA0003583427700000033
其中S1'、S1”、S1”'和S1””独立地选自具有1至30个原子的烃链，其任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C键，并且其中S1'键合至L1的碳。
根据其他实施方式，所述脂质还可以包含经由X1键，键合至L2的1至10个侧链S，每个侧链具有1至30个原子，其任选地具有顺式或反式C＝C键或者具有化学式IIIb的结构：
Figure BDA0003583427700000034
其中S2'、S2”、S2”'和S2””独立地选自具有1至30个原子的烃链，其任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C键，并且其中S2'键合至L2的碳。
在其他实施方式中，所述脂质还包括经由X1键，键合至L3的1至10个侧链S，每个侧链具有1至30个原子，其任选地具有顺式或反式C＝C键或者具有化学式IIIb的结构：
Figure BDA0003583427700000041
其中S3'、S3”、S3”'和S3””独立地选自具有1至30个原子的烃链，其任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C键，并且其中S3'键合至L3的碳。
在替代实施方式中，一次或多次出现的X1是生物可降解的。
在其他实施方式中，至少经由接头区键合至头部基团的烃链来源于脂质，所述脂质具有选自羟基、氨基和/或酰胺的一个或多个反应基团，所述羟基、氨基和/或酰胺键合至其内部碳原子以用作所述烃结构中的骨架碳链，并且所述烃结构中的至少一个其他烃链来源于酰基脂质，并且其中X1键是通过骨架碳链上的反应基团与酰基链的羧酸的反应所形成的。
在其他实施方式中，所述脂质是二羟基脂质。
所述头部基团可以赋予所述脂质5.0至9.0之间的pKa或者5.5至8.0之间的pKa。在替代实施方式中，所述头部基团具有化学式I的结构。
在其他实施方式中，键合至所述烃结构的接头区具有化学式IIa或IIb的结构。
在其他实施方式中，所述烃结构的形状是非圆柱形。
在其他实施方式中，所述脂质能够与其他脂质组合在水溶液中组装成脂质纳米颗粒。
在其他实施方式中，其他囊泡形成脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、神经酰胺、鞘磷脂或亲水聚合物脂质缀合物。
还提供了药物递送媒介物制剂，其包含掺入脂质双分子层或其单层的上述实施方式中任一个所述的脂质并且包含核酸或肽。
在一个实施方式中，所述核酸是小干扰RNA、小激活RNA、信使RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、核糖酶、适体、质粒、环状DNA、直链DNA、安塔够妙(antagomir)、抗miRNA寡核苷酸或者miRNA模拟物。
在其他实施方式中，所述药物递送媒介物制剂包含脂质纳米颗粒(LNP)。
还提供了制备这些脂质的简便方法。
这种实施方式涵盖了制备用于在递送所关心的分子中使用的荷电脂质的烃结构的方法，所述方法包括：
(i)提供在其内部碳上具有一个或多个反应基团的烃链，所述反应基团包含选自O、P、N和/或S的原子；和
(ii)将所述烃链经由一个或多个所述反应基团缀合至一个或多个酰基链以产生所述烃结构，并且其中所述烃结构的形状是非圆柱形的。
在一个实施方式中，一旦与各自酰基链之一缀合，则一个或多个所述反应基团形成各自的X1键。
还提供了通过上述方法生产的脂质。
还提供了荷电脂质，其包含具有化学式I的结构的支链脂质部分L：
化学式I：
A-(V)m-Z-L，其中
A是在生理学pH荷电的头部基团；
(V)m是任选的-(CR1R2)-，并且m是1至10或者2至6，其中R1和R2分别独立地为：氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环或者独立选择的任选地取代的具有4至12个环原子的单环、双环或三环碳环或者杂原子环；和
Z-L具有以下化学式II、IIa或IIb的结构：
化学式II直链接头结构：
X1-Lb，
其中X1是任选的并且X1选自醚、酯和氨基甲酸酯基团；和
Lb是化学式IIIc的支链脂质；
化学式IIa支链接头结构：
Figure BDA0003583427700000051
W是任选的；
如果存在W，W是X1键、N-C(O)、N-C(O)O或者N-OC(O)；
其中W任选地被D取代，其是任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环；
每次出现的(X)n是独立选择的-(CR1R2)-；(X)n的n为0至10；并且T是任选的且是烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环，并且其中T是任选地取代的；
B是经由各自的G1和G2与L1和L2连接的碳原子；
其中G1和G2独立地选自X1并且其中每一个G1和G2独立地任选地在前面有(G)u并且共价键合至(G)u，其中G是独立选择的-(CR1R2)-，其中R1和R2分别独立地为：氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环，并且u是0至16；
其中G3是任选的并且选自X1，并且任选地在前面有(G)u并且共价键合至(G)u；
L1是化学式IIIc的支链烃；
L2是具有1至20个碳原子和0至2个顺式或反式双键或者具有化学式IIIc的结构的烃链；
如果存在L3，L3是氢、具有1至20个碳原子和0至2个顺式或反式双键或者具有化学式IIIc的结构的直链或支链烃链；
化学式IIb环状结构：
Figure BDA0003583427700000061
其中曲线代表环并且E和K显示了部分形成所述环的结构的原子，所述环是具有3至8个环原子的取代的或未取代的环；
其中L1、L2和L3中的至少一个任选地经由各自的G1、G2和G3键合至所述环中的单个原子，其中G1、G2和G3中的每一个独立地任选地在前面有(G)u并且共价键合至(G)u；
其中化学式IIb的L1和任选地L2和/或L3具有化学式IIIc的结构：
化学式IIIc：
Figure BDA0003583427700000071
其中L主链由L1'-L1”-G1-CH-[CH2]q-CH3表示，并且其中所述L主链中的碳原子的总数为10至30；
L1'是直链烃链并且具有5-20、6-20、7-20、8-20、5-12、5-10、5-9、6-12、6-10、6-9、7-12、7-10或者7-9个碳原子和0-3个顺式或反式双键；
L1”是碳原子；
L1”'由G1-CH-CH2-CH3表示并且其中G1是具有0-4个碳原子的烃链，任选地其具有一个顺式或反式双键；
其中n为0至4；
其中p为1至4；
其中n+p为1至4；
q为0至20；
每个X1独立地选自醚、酯和氨基甲酸酯基团；
其中每个S和L1””烃侧链独立地为：
(a)直链或支链封端的烃链，其具有0至5个顺式或反式C＝C和1至30个碳原子并且在其烃链中的任何碳原子处缀合至各自X1中的一个；或者
(b)化学式IIIc的支链烃结构，
其中化学式IIIc中的L1””和S烃链的总数为1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4或者1至3；
其中所述脂质部分中的L1””和S烃链中的每一个任选地被杂原子取代，其条件是在所述烃链中取代不超过2个杂原子。
在另一个实施方式中，化学式I的Z-L具有化学式II的结构(直链接头结构)：
X1-Lb；
其中化学式IIIc的L1'具有5至9个碳原子并且具有0至2个顺式或反式双键；
其中化学式IIIc的G1是不存在的、CH2或CH2CH＝CH，并且其中所述双键是顺式或反式；
其中化学式IIIc的L1””和S独立地选自具有0-5个顺式或反式CH＝CH和2至18个碳原子的烃；
其中化学式IIIc的骨架主链由CH2-L1”-G1-CH-CH2-CH3表示(L1”'是8至30个碳原子；且
其中q为1至9。
在另一个实施方式中，化学式I的(V)m是(CH2)m，其中m是1至20；
Z-L具有化学式IIa的结构(支链接头结构)：
Figure BDA0003583427700000081
其中W为醚、酯或氨基甲酸酯基团(以任何取向)并且D是不存在的，且(X)n是(CH2)n，其中n是1至10；
其中G1和G2存在并且在前面有各自的(G)u并且共价键合至各自(G)u，其中(G)u是CH2；
其中G3-L3存在且是选自CH3和CH2CH3的烃；或者其中G3-L3是CH2X1L3且L3是具有1至20个碳原子和0至2个顺式或反式双键或者具有化学式IIIc的结构的直链或支链烃链。
在其他实施方式中，化学式I的Z-L具有化学式IIb的结构：
化学式IIb环状结构：
Figure BDA0003583427700000091
其中曲线代表环并且E和K显示了部分形成所述环的结构的原子，所述环是具有3至6个环原子的取代的或未取代的碳环。
在一个实施方式中，所述环包含3或5个碳原子。在其他实施方式中，至少L1和L2存在且经由各自的G1和G2基团连接至所述环，并且其中每个G1和G2基团任选地在前面有Gu，其中u是0至10或者0至6。
化学式I中的头部基团A可以选自：
(i)可电离阳离子部分，其选自：
Figure BDA0003583427700000092
(ii)永久荷电部分，其选自：
Figure BDA0003583427700000093
(iii)可电离阴离子部分，其选自：
Figure BDA0003583427700000094
(iv)两性离子部分，其选自：
Figure BDA0003583427700000101
在一个实施方式中，化学式I的烃结构L的形状是非圆柱形的。
在其他实施方式中，所述脂质能够与其他脂质组合在水溶液中组装成脂质纳米颗粒。在一个实施方式中，其他囊泡形成脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、神经酰胺、鞘磷脂或亲水聚合物脂质缀合物。
还提供了药物递送媒介物制剂，其包含掺入脂质双分子层或其单层的上述实施方式中任一个所描述的脂质并且包含核酸、蛋白或肽。
在一个实施方式中，所述核酸是小干扰RNA、小激活RNA、信使RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、核糖酶、适体、质粒、环状DNA、直链DNA、antagomir、抗miRNA寡核苷酸或者miRNA模拟物。
在一个实施方式中，所述药物递送媒介物包含荷电的肽。
在其他实施方式中，所述药物递送媒介物是脂质纳米颗粒(LNP)。
本文描述了多种非限制性实施方式。
附图说明
图1A显示了本发明公开所涵盖的氨基脂质，其具有任选地经由接头基团，缀合至脂质部分L内的一个烃链的简单的头部基团(H)。缀合至所述头部基团的脂质链来源于羟基脂质，其反过来缀合至来源于羟基脂质的一个或多个另外的脂质链。这些脂质链进一步缀合至来源于酰基脂质的一条或多条烃链。
图1B显示了本发明公开所涵盖的氨基脂质，其通过任选地经由接头基团，缀合至脂质部分L内的两个烃的头部基团制备。缀合至所述头部基团的两个烃来源于羟基脂质。反过来，来源于羟基脂质的两个脂质链中的每一个缀合至来源于羟基脂质的另一个各自的脂质链，并且来源于酰基脂质的一条或多条烃链进一步缀合至这些脂质。
图2A显示了如在培养的表达荧光素酶的22Rv1细胞中所评价的氨基脂质的体外活性。用含有本发明公开的可电离脂质和1.0(左侧柱)、0.3(中间柱)和0.1μg/mL(右侧柱)的浓度的荧光素酶siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)制剂处理细胞。处理后，测量发光水平。掺入LNP的可电离脂质为2-(二甲基氨基)乙基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A001)、3-(二乙基氨基)丙基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A002)、3-(二甲基氨基)丙基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A003)、2-(二乙基氨基)乙基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A004)、3-(二甲基氨基)丙基(12R)-亚油酸氧基油酸酯(INT-A005)、3-(二乙基氨基)丙基(syn-9,10,12R)-三亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A006)和3-(二乙基氨基)丙基(±)-syn-9,10-双(2-己基癸酰氧基)硬脂酸酯(INT-A007)。
图2B显示了在培养的22Rv1细胞中以1μg/mL siRNA浓度，氨基脂质的体外活性。在处理后16-24hr测量发光水平，并且从高(左图)至低(右图)对相对发光排序。
图3显示了如小鼠FVII模型中所评价的氨基脂质的体内活性。在C57BI/6野生型小鼠中经由尾静脉注射含有本发明公开的阳离子脂质和FVII siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)制剂并且在注射后测量血浆中FVII的水平。以0.03(左侧柱)、0.1(中间柱)和0.3mg/kg(右侧柱)的剂量，用LNP-siRNA注射小鼠。掺入LNP的阳离子脂质为INT-A001、INT-A002、INT-A003和INT-A007。
图4A显示了如培养的HepG2肝细胞中所评价的可电离脂质的体外活性。用0.125-1μg/mL的浓度的含有本发明公开的可电离脂质和荧光素酶mRNA的LNP制剂处理细胞。处理后，测量发光水平。从左至右，掺入LNP的可电离脂质为INT-A001(空白柱)、INT-A002(点状柱)、INT-A003(黑色柱)和INT-A004(灰色柱)。
图4B显示了小鼠肝脏中mRNA的体内表达。以1mg/kg的mRNA剂量，在C57BI/6野生型小鼠中经由尾静脉注射含有本发明公开的阳离子脂质和荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)制剂并且在注射后测量肝脏中的发光。从左至右，掺入LNP-mRNA的阳离子脂质为INT-A001、INT-A002、INT-A003和INT-A004。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)注射未处理的动物。
具体实施方式
用于荷电材料递送的脂质的结构
本文所描述的脂质具有头部基团A和脂质部分L，所述脂质部分L具有以下所描述的烃结构。头部基团A在生理学pH荷电并且在一些实施方式中是可电离的，尽管本发明公开也涵盖了永久荷电基团。头部基团H可以含有其他在生理学pH荷电的基团，但是在生理学pH具有净整体正电荷或负电荷。所述荷电脂质可以是单价或多价的。
脂质部分L通常由具有起骨架作用以缀合所述烃结构内的其他烃链或基团的一条或多条碳链的烃结构组成。在另一个有利的实施方式中，脂质部分L至少部分由来源于羟基的烃链或具有官能团的其他脂质组成并且用作所述烃结构的骨架组分。反过来，羟基脂质可以缀合至来源于酰基脂质的一条或多条烃链。
如本文所使用的，“骨架碳链”是通过经由如本文所描述的官能团(例如，“X1官能团”、“X1键”或本文所使用的其他类似的惯例)与脂质部分L中的另一条烃链共价缀合提供这种骨架功能的碳链。在一个实例中，X1官能团包括具有电负性原子，如N、O、S或P作为所述基团中的原子，或者任选地作为所述基团中的唯一原子并且提供骨架碳链与一条或多条烃链，包括另一条骨架碳链的共价键合的基团。适合的X1官能团的实例是酯，尽管本领域技术人员可以容易地设想其他基团，包括醚和氨基甲酸酯基团。
骨架碳链可以来源于具有如本文所描述的羟基的前体脂质。这些脂质通常被称为羟基脂质并且是天然存在的或者可以在实验室中合成。为了产生酯基，例如，可以将烃链的羟基与另一条烃链上的羧酸经由缩合反应进行反应。然而，制备烃结构的方法不局限于任何具体制备方法，因为在本文中考虑了多种不同的合成路线。
在图1A和1B中描述了作为骨架的来源于羟基化脂质的荷电脂质的结构的实例。脂质部分(L)可以经由脂质部分(L)内的1、2或3个烃基团连接至头部基团A。
图1A显示了本发明公开所涵盖的荷电脂质，其具有任选地经由接头基团，缀合至脂质部分L内的一个烃的简单的头部基团(A)。在该实施方式中，所述第一脂质来源于羟基脂质。反过来，所述羟基脂质可以缀合至来源于羟基脂质的一个或多个其他脂质链。这些脂质链进一步缀合至来源于酰基脂质的一条或多条烃链。
图1B显示了本发明公开所涵盖的荷电脂质，其通过任选地经由接头基团，缀合至脂质部分L内的两个烃的头部基团(A)制备。在该实例中，缀合至所述头部基团的两个烃来源于羟基脂质。反过来，所述两个脂质中的每一个缀合至来源于羟基脂质的另一个各自的脂质并且来源于酰基脂质的一条或多条烃链进一步缀合至这些脂质。
然而，将理解图1仅是所选实施方式的说明并且不应以任何方式视为限制。例如，作为另外一种选择，可以从脂肪酸胺、脂肪酸酰胺和/或支链脂肪酸酯产生所述骨架碳链。
在本发明公开的一个实例中，所述脂质包含头部基团，所述头部基团在生理学pH具有净正电荷或负电荷，并且经由接头区(在本文中也称为“接头”)共价连接至脂质部分，所述脂质部分包含具有两种或更多种连接的烃链的烃结构，所述烃链任选地具有顺式或反式C＝C，所述链中的至少一个经由所述接头区共价连接至可电离头部基团，并且其中所述烃链在连接至所述接头区的链的内部碳的分支点处彼此键合，所述分支点包含X1官能团，所述X1官能团选自：-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-NR1-、-C(O)N(R1)-、N(R1)C(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)O-、-S-、-S-S-、-C(R1)＝N-N-C(O)-、-C(O)-N-N＝C(R1)、-ON＝C(R1)-或-C(R1)＝NO-，其中所述烃链分别具有1至30个碳原子，其中所述烃结构总计包含10至150个碳原子，并且其中R1独立地选自氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环。
在其他实施方式中，所述荷电脂质的烃结构具有非圆柱形的形状。多种磷脂具有连接至形成通常处于圆柱形形状的亲脂性组分的甘油主链的烃链(由两个脂肪酸链形成)。然而，在某些实施方式中，本文所描述的烃结构形成“张开”结构(也称为“截头圆锥形”形状)，这表示所述烃结构在沿其长度的任一点具有比所述头部基团的最大直径大至少1.2或至少1.5或至少2倍的直径。这些形状的有利之处在于它们可以有助于核酸或其他荷电分子向细胞的转染。
在另一个实施方式中，所述荷电脂质的烃结构具有3条或以上的烃链，所述3条或以上的烃链中的每一条经由上述X1键在其内部碳连接至另一条链。在另一个实施方式中，所述脂质部分具有烃结构，所述烃结构具有2至20或3至18条缀合烃链。在一个实施方式中，可以将所述烃结构描述为形成张开、非圆柱形结构的连接的烃链的晶格或基质。所述连接点任选地分别是生物可降解的官能性或者至少1、2、3、4或5个所述连接点是生物可降解的，如向患者施用后体内所测量的。
尽管考虑了多种头部基团，但是在一个实例中，所述头部基团包含可电离的氨基，如末端胺基。在一个实施方式中，所述头部基团不包含磷酸基。在另一个实施方式中，所述胺是伯、仲、叔或季胺。如果在所述头部基团中使用季胺，则基于所述头部基团中其他可电离基团的存在或不存在，所述脂质可以是非可电离的。在另一个实施方式中，所述头部基团是非两性离子的。
应理解连接L的烃结构中的烃链的X1键中的每一个可以是相同或不同的。也就是说，每个X1可以独立地选自以上所列的X1键基团。
在一个实施方式中，X1键选自OC(O)-、-C(O)O-和-O-。在其他替代实施方式中，所述X1键是任何生物可降解的共价键。所述X1键还可以是pH敏感的，这表示切割取决于周围溶液的pH。
在其他实施方式中，从一个或多个羟基脂质和一个或多个酰基脂质产生所述烃结构，其中所述一个或多个羟基脂质起到骨架碳链的作用以缀合所述一个或多个酰基脂质。
在其他实施方式中，所述脂质具有5.0至9.0之间或者5.5至8.5之间或者5.0至8.0之间的表观pKa。
在其他实施方式中，可以在脂质纳米颗粒，包括(但不限于)脂质体中配制以上所描述的荷电脂质(例如，阳离子或可电离脂质)。
在其他实施方式中，所述荷电脂质具有化学式I的结构：
化学式I：
A-(V)m-Z-L，其中
A是在生理学pH荷电的头部基团；
(V)m是任选的-(CR1R2)-，并且m是1至10或者2至6，其中R1和R2分别独立地为：氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环或者独立选择的任选地取代的具有4至12个环原子的单环、双环或三环碳环或者杂原子环；和
Z-L具有以下化学式II、IIa或IIb的结构。
化学式II是直链接头结构：
X1-Lb，
其中X1是任选的并且X1选自醚、酯和氨基甲酸酯基团；和
Lb是以下化学式IIIc的支链脂质。
在本发明公开的另一个实例中，所述荷电脂质是氨基脂质并且具有以下化学式Ia：
化学式Ia：
Figure BDA0003583427700000151
其中R1、R2和R3分别独立地为：氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环；
其中，任选地，R1、R2和R3之一是不存在的(孤电子对)或氢；
每次出现的V是独立选择的-(CR1R2)-，并且m是1至10或2至6。
化学式I的Z-L或者化学式Ia的氨基脂质的Z-L1可以由以下的化学式II、化学式IIa或化学式IIb所表示：
化学式II：
X1-Lb,
其中X1是任选的并且在一个实施方式中，X1选自醚、酯和氨基甲酸酯基团；和
Lb是以下化学式III、IIIa或IIIc的支链脂质。
化学式IIa：
Figure BDA0003583427700000161
W是任选的；
如果存在W，W是-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-NR1-、-C(O)N(R1)-、N(R1)C(O)-、-NC(O)R1-,-OC(O)O-、-OC(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)O-、-S-、-S-S-、C(R1)＝N-N-C(O)-、C(O)-N-N＝C(R1)、-ON＝C(R1)或C(R1)＝NO-；
其中W任选地被D取代，其是任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环；
每次出现的(X)n是独立选择的-(CR1R2)-，或者独立地选自具有4至12个环原子的任选地取代的单环、双环或三环碳环或杂原子环；(X)n的n是0至10；并且T是任选的且是任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环；
B是任选地经由G1共价连接至L1的碳、氧、氮原子；并且任选地另外，任选地经由各自的G2和G3基团连接独立选择的L2和/或L3；
其中G1、G2和G3独立地选自-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-NR1-、-C(O)N(R1)-、N(R1)C(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)O-、-S-、-S-S-、C(R1)＝N-N-C(O)-、C(O)-N-N＝C(R1)、-ON＝C(R1)或C(R1)＝NO-并且其中G1、G2和G3中的每一个独立地任选地在前面有(G)u并且共价键合至(G)u，其中G是独立选择的-(CR1R2)-且u是0至10；
化学式IIb：
Figure BDA0003583427700000171
W是任选的；
如果存在W，W是-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-NR1-、-C(O)N(R1)-、N(R1)C(O)-、-NC(O)R1-,-OC(O)O-、-OC(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)O-、-S-、-S-S-、C(R1)＝N-N-C(O)-、C(O)-N-N＝C(R1)、-ON＝C(R1)或C(R1)＝NO-；
其中W任选地被D取代，其是任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环；
其中曲线代表环并且E和K显示了部分形成所述环的结构的任何原子，所述环是具有4至12个环原子的取代的或未取代的单环、双环或三环碳环或者单环、双环或三环杂原子环；
化学式Ia和Ib中的L2和L3是任选的氢原子或者具有1至40个碳原子且任选地具有一个或多个顺式或反式C＝C双键的烃链或者具有化学式IIIa的结构(在下文中所描述的)；
其中L1、L2和L3中的两个任选地键合至曲线所表示的环中的单个原子；
以上化学式的L、Lb、L1和任选地L2和/或L3是具有以下马上将描述的化学式III的结构的脂质部分。作为另外一种选择，所述脂质部分包含包括下文中所描述的化学式IIIa或化学式IIIc的结构。
化学式III：
Figure BDA0003583427700000172
其中L1'、L1”、L1”'和L1””独立地选自具有1至30个原子的烃链，其任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C；
其中X1是-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-NR1-、-C(O)N(R1)-、N(R1)C(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)O-、-S-、-S-S-、C(R1)＝N-N-C(O)-、C(O)-N-N＝C(R1)、-ON＝C(R1)或C(R1)＝NO-；且
其中，化学式III任选地包含1至10个侧链S，每个侧链S独立地选自具有1至30个原子的烃链，所述烃链任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C，或者甾醇，并且其中至少一个S经由X1键共价连接至L1'、L1”、L1”'和/或L1””的碳原子。
所述荷电脂质(例如，可电离脂质)可以是对映异构体的混合物或者含有单一光学异构体。如以上所讨论的，X1基团可以是生物可降解的，这表示它可以在施用于受试者后被切割。不受限制地，酯键能够在向患者施用后通过酯酶水解，借此从所述脂质释放烃链。本发明公开还涵盖了能够被酶水解或者对pH变化起反应的其他基团。然而，将理解X1基团也可以是生物不可降解的。
在一个实施方式中，所述脂质在生物相容的醇中可溶，借此有助于其向递送媒介物中的掺入和核酸的共封装，所述核酸如小干扰RNA、小激活RNA、信使RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、核糖酶、适体、质粒、环状DNA、直链DNA、antagomir、抗miRNA寡核苷酸、miRNA模拟物或基因编辑材料。
头部基团(A)
通常，将脂质方便地表示为具有共价连接至一条或多条烃链的头部基团(在本文中表示为“A”)。任选地，头部基团A通过接头区连接至一条或多条烃链。以下描述了适合的头部基团和接头区。
在一个实施方式中，头部基团选自可电离、永久荷电或两性离子部分。头部基团可以在给定pH值或范围，包括pH 7.4(生理学pH)赋予脂质正电荷或负电荷。属于这些类别中的每一个的化学基团的实例如下所示：
(i)可电离阳离子部分：
Figure BDA0003583427700000191
(ii)永久荷电部分：
Figure BDA0003583427700000192
(iii)可电离阴离子部分：
Figure BDA0003583427700000193
(iv)两性离子部分：
Figure BDA0003583427700000194
通常，所述脂质的头部基团A是相对小的并且在生理学pH荷电。在一个非限制性实施方式中，这种头部基团包含末端可电离胺基，尽管在本文中也考虑了如磷酸酯和硫酸酯基的基团。在另一个实施方式中，所述头部基团具有赋予所述可电离脂质5至8之间的表观pKa或者赋予所述可电离脂质5.5至7.5的pKa的末端可电离胺基。将理解所述氨基的pKa可以受所述头部基团中相邻原子的影响。含有硫酸酯或磷酸酯的头部基团可以赋予所述脂质整体负电荷。
所述胺基可以是伯、仲或叔胺基。所述头部基团可以含有其他胺基，如两个或三个相同或不同的胺基。
在一个实施方式中，所述头部基团的胺部分具有以下化学式：
Figure BDA0003583427700000201
其中R1、R2和R3分别独立地为：氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环；其中R1、R2和R3之一是不存在的(孤电子对)或氢。
在其中所述头部基团带正电荷的那些实施方式中，该基团不具有磷酸酯基，因为该基团赋予负电荷并因此可以导致产生电中性的脂质。然而，这种基团可以包含在头部基团中，只要所述脂质的整体电荷在生理学pH为正。
任选地，将所述头部基团缀合至亲水聚合物，包括在所述脂质或其制剂施用于患者后改善循环寿命的聚合物。这种亲水聚合物的非限制性实例是聚乙二醇(PEG)。
如本领域技术人员将理解的，当所述头部基团荷电时，所述脂质可以作为盐存在。任何药物可用的盐包括在本发明公开的范围内。
任选的接头区
除可电离胺基外，所述脂质可以包含具有一个或多个电负性原子的区域，所述电负性原子允许共价连接至1、2或3条脂链，所述脂链中的至少一条是骨架碳链。所述脂质中的该区域可以被称为接头区或者简单地“接头”并且是任选的，因为可以将一条或多条烃链直接连接至所述头部基团。
所述接头的化学结构可以取决于连接至所述头部基团的脂链的数目，但是可以在其结构内包括酯、醚、甘油酯接头、甘油酯接头的衍生物或者环接头，包括由碳或杂原子组成的多元环。
连接至头部基团的接头区可以具有以下化学式：
Figure BDA0003583427700000211
其中(V)m-Z显示了在一端连接至头部基团A并且在另一端连接至L1的接头区，所述L1是烃区。
可以通过以上所描述的化学式II、化学式IIa或化学式IIb共同表示化学式的部分Z-L1。
任选地，将所述接头区缀合至亲水聚合物，包括改善循环寿命的聚合物，如聚乙二醇(PEG)。
如本领域技术人员将理解的，本发明公开涵盖了头部基团-接头基团的多种不同组合。所述接头区的特征可以在于与其连接的烃链的数目。作为另外一种选择，可以将所述接头描述为直链、支链或环状。以下提供了每个类别的实例。
以下提供了具有连接单一烃链的接头区的头部基团的非限制性实例：
Figure BDA0003583427700000212
以下提供了具有连接两条烃链的接头区的头部基团的非限制性实例：
Figure BDA0003583427700000221
以下提供了具有连接3条烃链的接头区的头部基团的非限制性实例：
Figure BDA0003583427700000222
还可以将接头区描述为直链、支链或环状。分别在以上所描述的化学式II、IIa和IIb中描述了直链、支链和环状接头区的实例。
脂质部分L
脂质部分L可以在直接或经由接头区连接至头部基团的烃结构内包括1、2或3条烃链。在其中仅一条烃链连接至头部基团或接头区的那些实施方式中，其他烃侧链S可以连接至L1的内部碳。
因此，至少，在一个实施方式中，头部基团已与之或经由接头连接至作为具有化学式III的结构的脂质部分的L1：
化学式III：
Figure BDA0003583427700000231
其中L1'、L1”、L1”'和L1””独立地选自具有1至30个原子或者1至20个原子的烃链，其任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C；且
其中X1是-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-NR1-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)O-、-S-、-S-S-、C(R1)＝N-N-C(O)-、-C(O)-N-N＝C(R1)、-ON＝C(R1)或-C(R1)＝NO-。
任选地，头部基团已与之，任选地经由接头连接至作为脂质部分的L2或者其他L3脂质部分。任选的L2和L3脂质部分可以分别独立地选自具有1至30个原子或1至20个原子的烃链(所述烃链任选地包含一个或多个顺式或者反式C＝C)，或者甾醇。L2和/或L3任选地可以是以下化学式IIIa的脂质。
化学式IIIa：
Figure BDA0003583427700000232
其中Ln'共价连接至所述接头。
根据化学式IIIa的命名，如果L是L2，则n为2，并且如果L是L3，则n为3。例如，对于L2烃，化学式IIIa采用以下命名：
Figure BDA0003583427700000233
化学式III或IIIa任选地包含1至20个侧链S，其描述为(S)n，其中n为0至20，其分别独立地选自具有1至30个原子或1至20个原子的烃链，所述烃链任选地包含一个或多个顺式或反式C＝C，或者甾醇，并且其中(S)n经由X1键共价连接至L1、L2和/或L3的碳原子或者经由这种键共价键合至所述烃结构中的另一条侧链S。在一个实施方式中，所述X1键是生物可降解的，如酯键。然而，除了生物可降解的那些之外，可以在本发明的实践中使用其他键。
例如，L1可以具有经由X1键缀合至L1'、L1”'或L1””中的任一个的侧链S1'。其他侧链S1”、S1”'或S1””可以连接至L1或任何S1侧链的碳。在另一个实例中，如果L2具有以上化学式IIIa的结构，则L2可以具有附接至L2'、L2”'或L2””中的任一个的侧链S2'。其他侧链S2”、S2”'或S2””可以连接至L2或任何S2侧链的碳。同样地，如果L3存在并且具有以上化学式IIIa，则它可以具有连接至L3'、L3”'或L3””中的任一个的侧链S3'。其他侧链S3”、S3”'或S3””可以连接至L3或任何S3侧链的碳。
(下)表1显示了具有本发明公开所涵盖的结构的脂质的实例。表1中的结构A-F包括具有连接至单一烃的接头的头部基团，所述烃具有为其他S烃链提供骨架连接点的X1分支点。表1中的结构G-J包括具有连接两个烃L1和L2的接头的头部基团。描述为结构K-M的脂质具有接头，所述接头具有与3个烃L1、L2和L3的连接点。
以下注释的结构A举例说明了本文中用于显示X1键和L1的疏水性区域的化学式III中所使用的惯例。将理解每次出现的X1独立地选自所述结构中的另一个X1。如所讨论的，X1基团包括任何适合的具有电负性原子的官能团。
所示实例是具有根据以上化学式III的单一L1脂质烃链(L1'、L1”和L1”')的氨基脂质，其具有连接至L1的碳的侧链S：
结构A(INT-A001)：
Figure BDA0003583427700000241
如以上的结构A(INT-A001)中可见，L1'、L1”和L1”'共同形成了来源于二-羟基脂质的直链烃主链(在本文中称为“骨架碳链”)。该烃链L1'-L1”-L1”'将L1””经由X1键连接至L1'-L1”-L1”'的L1”碳，并且将第二S“侧链”烃链经由第二X1键缀合至L1”'。在该结构中，两个X1键均为酯基。然而，如上所述，X1官能团可以独立地选自多种含有O、N、P和/或S原子的官能团。
下表1提供了在头部基团内具有连接至1、2或3条烃链的接头区的脂质的实例。对于的每个脂质，提供了化学式III的L1的取代基L1'/L1”/L1”'/L1””以及任选的L2和L3烃链。还提供了如化学式IIa或IIb所定义的头部基团和接头区的结构。在每种情况下，X1基团是将所述烃链彼此连接以形成相互连接的烃晶格结构的酯。如从以下结构可见，L的相互连接的烃结构形成了一般张开或截头圆锥形的形状。
表1：具有连接至1、2或3条烃链L1、L2和L3，从而形成张开的烃结构的所选的氨基脂质
Figure BDA0003583427700000251
Figure BDA0003583427700000261
Figure BDA0003583427700000271
Figure BDA0003583427700000281
Figure BDA0003583427700000291
Figure BDA0003583427700000301
Figure BDA0003583427700000311
用于描述脂类部分的替代命名为化学式IIIc：
化学式IIIc：
Figure BDA0003583427700000312
其中L主链由L1'-L1”-G1-CH-[CH2]q-CH3表示，并且其中所述L主链中的碳原子的总数为10至30；
L1'是直链烃链并且具有2-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、5-12、5-10、5-9、6-12、6-10、6-9、7-12、7-10或7-9个碳原子和0-3个顺式或反式双键；
L1”是碳原子；
L1”'由G1-CH-CH2-CH3所示；
G1是具有0-4个碳原子的烃链，其任选地具有一个顺式或反式双键；
其中n为0至4；
其中p为1至4；
其中n+p为1至6或者1至4；
q为0至20或者0至10或者1至5；
每个X1是以上所描述的任何适合的X1基团，或者独立地选自醚、酯和氨基甲酸酯基团；
其中每个S和L1””烃侧链独立地为：
直链或支链封端的烃链，其具有0至5个顺式或反式C＝C和1至30个或2至18个碳原子并且在其烃链中的任何碳原子处缀合至各自X1中的一个；或者
化学式IIIc的支链结构，
其中化学式IIIc中的L1””和S烃链的总数为1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4或者1至3；
其中所述脂质部分中的L1””和S烃链中的每一个任选地被杂原子取代，其条件是在所述烃链中取代不超过4、3或2个杂原子。
所述X1酯基可以相对于羰基的位置处于任何取向，如下所示：
Figure BDA0003583427700000321
*为了阐明用于描述
"G2"中酯的取向的标记
在一个实施方式中，化学式IIIc中的碳原子总数不超过150、125、100、90、80、70、60或50。
在另一个实施方式中，化学式IIIc的结构处于非锥形或张开的形状，如从邻近于头部基团或接头区的区域向所述烃结构上的远端碳原子所确定的。如所提及的，当在递送媒介物中配制脂质时，这些结构有助于货物分子的递送。
骨架碳链
在一个实施方式中，提供骨架功能的L1、L2和/或L3脂质部分的主链烃链来源于具有用于键合至侧链S的官能团的脂肪酸。这包括被具有选自O、N、P和/或S的原子的基团取代的脂肪酸。这些基团有助于一条或多条侧链与构成骨架的L1、L2和/或L3的主链碳的缀合。
例如，L1、L2和/或L3可以来源于羟基脂肪酸(HFA)，它是具有在其碳链上的任何位置键合的OH基团的脂肪酸。不受限制地，所述HFA可以是β-羟基脂肪酸、ω-羟基脂肪酸或者任何(ω-1)-羟基脂肪酸，或者在碳主链的内部碳处具有反应性官能性的任何其他HFA。所述HFA可以是饱和或不饱和的。也可以在所述碳链上存在两个或更多个羟基官能团。
作为另外一种选择，L1、L2和/或L3来源于本领域中已知的HFA的支链脂肪酸酯，如羟基脂肪酸的脂肪酸酯(FAHFA)。这些脂肪酸酯在脂肪酸和HFA之间包含支链酯键。例如，9-[(9Z)-油酰基氧基]十八酸是通过油酸的羧基与9-羟基硬脂酸的羟基的缩合反应所获得的脂肪酸酯。
在替代实施方式中，L1、L2和/或L3来源于脂肪酸酰胺，其可以包含乙醇胺作为胺组分。另外，L1、L2和/或L3可以来源于脂肪酸胺。
化学式III的骨架碳链可以来源于除以上所描述的那些之外的其他脂肪酸。另外，将理解所述脂肪酸反过来可以来源于它们相应的三甘油酯。
在化学式III、IIIa和IIIb中，L1'、L1”和L1”'共同形成直链烃主链(在本文中称为“骨架碳链”)。根据以上化学式IIIc，通过L1'-L1”-G1-CH-[CH2]q-CH3表示骨架碳链，其中骨架中碳原子的总数为10至30。
制剂
阳离子或可电离脂质有助于核酸的封装，所述核酸包括(但不限于)小干扰RNA、小激活RNA、信使RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、核糖酶、适体、质粒、环状DNA、直链DNA、antagomir、抗miRNA寡核苷酸和miRNA模拟物和/或基因编辑材料。作为另外一种选择或者另外，可以将带负电荷的蛋白和氨基酸引入递送媒介物。
本文所描述的荷电脂质可以用于递送除核酸之外的其他荷电分子。这包括多种带正电荷或带负电荷的肽、蛋白、多糖或碳水化合物，包括生物活性剂和前体药物两者，以下描述了它们的实例。
可以以游离形式与核酸或其他带负电荷或正电荷的货物分子一起施用本文所描述的阳离子或可电离脂质，或者可以将这些组分引入递送媒介物。多种递送系统可以用于制备药物制剂。如果荷电脂质和相关荷电分子处于游离形式，则药物可用的盐或赋形剂可以包括在药物制剂中。
本发明公开所述的脂质特别适用于向纳米颗粒，如脂质体或者包含脂质或其他疏水性组分的聚合物基系统(在本文中称为“脂质纳米颗粒”或“LNP”)中掺入。
例如，在一些实施方式中，向给定脂质纳米颗粒中的加载效力为60％至100％、70％至100％或者最有利地80％至100％。
在一个实施方式中，通过将它们与脂质制剂组分，包括囊泡形成脂质和任选地甾醇一起混合，将脂质加载到脂质纳米颗粒，如脂质体中。因此，可以使用多种本领域技术人员已知的良好描述的制剂方法，包括(但不限于)挤出、乙醇注入和在线混合来制备掺入可电离或阳离子脂质的脂质纳米颗粒。这些方法描述于Maclachlan,I.and P.Cullis,"Diffusible-PEG-lipid Stabilized Plasmid Lipid Particles",Adv.Genet.,2005.53PA:157-188；Jeffs,L.B.等人,“A Scalable,Extrusion-free Method forEfficient Liposomal Encapsulation of Plasmid DNA”,Pharm Res,2005,22(3):362-72；和Leung,A.K.等人,“Lipid Nanoparticles Containing siRNA synthesized byMicrofluidic Mixing Exhibit an Electron-Dense Nanostructured Core”,TheJournal of Physical Chemistry.C,Nanomaterials and Interfaces,2012,116(34):18440-18450，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
除荷电脂质之外，可以包括在所述脂质纳米颗粒中的其他脂质组分包括囊泡形成脂质，如磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、神经酰胺或其他脂质。胆固醇也可以包括在LNP中以拓宽相变温度。LNP还可以包括与亲水聚合物，如(例如)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG缀合的脂质。表面稳定官能性，如亲水聚合物可以是所期望的以减少施用后纳米颗粒的清除。LNP制剂还可以包括促融脂质(fusogenic lipid)，其有助于递送媒介物经由胞吞与靶细胞融合。
适合的LNP包括(但不限于)通过已知方法，通过挤出制备的脂质体或者多层囊泡(MLV)。脂质体的内部空间可以包括捕获剂，如药物，或者一个或多个双分子层可以包含在其中分配的这种试剂。
适合的LNP递送系统的另一个实例是稳定的核酸脂质颗粒，其称为SNALP。SNALP可以包含与阳离子脂质、非阳离子脂质和任选的亲水聚合物脂质缀合物，如PEG化的脂质和促融脂质结合的核酸。
脂质纳米颗粒可以包含亲脂性核心。例如，递送媒介物还可以是包含通过表面活性剂稳定的脂质核心的纳米颗粒。可以作为稳定剂使用囊泡形成脂质。在另一个实施方式中，所述脂质纳米颗粒是包含通过稳定脂质围绕的聚合物纳米颗粒核心的聚合物脂质杂交系统。
作为另外一种选择，可以在没有脂质的情况下从聚合物制备纳米颗粒。这些纳米颗粒可以包含由聚合物壳体围绕的浓缩的药物核心，或者可以具有在整个聚合物基质中分散的固体或液体。
还可以将本文所描述的脂质引入乳液，所述乳液是含有油滴或油核心的药物递送媒介物。乳液可以是脂质稳定的。例如，乳液可以包含通过乳化组分，如脂质的单分子层或双分子层稳定的油填充的核心。
还可以在胶束中配制本文所提供的脂质。胶束是由两亲性脂质或聚合物组分组成的自组装颗粒，其用于疏水性核心中存在的试剂的递送。
其中可以配制荷电脂质的技术人员已知的药物递送媒介物的其他种类是碳纳米管。
用于制备上述递送媒介物和其中掺入荷电脂质的各种方法是已知的并且可以通过本领域技术人员容易地进行。
本发明公开所涵盖的某些脂质可以构成无载体系统的一部分。在这些实施方式中，与带负电荷的分子有关的脂质可以自组装成颗粒。实例是脂质体复合物的形成，脂质体复合物是DNA和阳离子脂质之间的结合。这些制剂可以任选地包括药物可用的盐和/或赋形剂。
引入阳离子或可电离脂质的递送媒介物还可以包括引入媒介物中的活性剂，如抗癌药或其他治疗剂，包括前体药物。
所述递送媒介物可以任选地包括脂蛋白，如脱脂蛋白。
核酸、基因材料、蛋白、肽或其他荷电试剂的递送
如所讨论的，本文所公开的荷电脂质有助于具有净负电荷或正电荷的分子(在本文中也称为“货物”或“货物分子”)向递送媒介物的引入以及向靶细胞的后续体外或体内递送。
在一个实施方式中，所述分子是基因材料，如核酸。所述核酸无限制地包括RNA，包括小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)，或者DNA，如质粒DNA或直链DNA。所述核酸的长度可以是不同的并且可以包括长度为5-50,000个核苷酸的核酸。所述核酸可以处于任何形式，包括单链DNA或RNA、双链DNA或RNA，或其杂交体。单链核酸包括反义寡核苷酸。
在一个特别有利的实施方式中，所述货物为siRNA。siRNA掺入到内源细胞机器中以导致mRNA破环，借此防止转录。由于RNA容易降解，因此它向递送媒介物的掺入可以降低或防止这种降解，借此有助于向靶标位点的递送。
还可以将基因编辑系统引入包含荷电脂质的递送媒介物。这包括Cas9-CRISPR、TALEN和锌指核酸酶基因编辑系统。就Cas9-CRISPR而言，可以将向导RNA(gRNA)与编码Cas9蛋白的质粒或mRNA一起引入包含本文所描述的阳离子脂质的递送媒介物。任选地，可以将核糖核蛋白复合物引入包含本文所描述的阳离子脂质的递送媒介物。同样地，本发明公开包括其中将编码锌指核酸酶的DNA结合和切割域的基因材料或者TALEN系统与可电离或阳离子脂质一起引入递送媒介物的实施方式。
所述荷电脂质还可以有助于具有整体电荷的蛋白和肽向递送媒介物的掺入。这包括直链或非直链肽两者。肽的实例包括细菌/抗生素肽、真菌肽、无脊椎动物肽、两栖动物/皮肤肽、蛇毒肽、癌症/抗癌肽、疫苗肽、免疫/抗炎肽、脑肽、内分泌肽、消化肽(ingestivepeptides)、胃肠肽、心血管肽、肾肽、呼吸肽、鸦片肽、神经营养性肽和血脑肽。以上提供了肽的具体实例。
可以与本文所描述的荷电脂质结合的肽的具体实例是干扰素及其他巨噬细胞活化因子。这包括淋巴激活素、胞壁酰二肽(MDP)、γ-干扰素、α-干扰素和β-干扰素，和相关抗病毒和杀肿瘤剂；阿片样肽和神经肽，其包括脑啡肽、内啡肽和强啡肽，及其他止痛剂；肾素抑制剂，包括(例如)抗高血压剂；缩胆囊肽(CCK类似物)，如CCK、蓝肽和章鱼毒素，及相关心血管靶向剂和CNS靶向剂；白细胞三烯和前列腺素，包括缩宫素，和其他抗炎、催产和堕胎化合物；促红细胞生成素及其衍生物，以及相关补血药；LHRH类似物，如亮脯利特、布舍瑞林和那法瑞林，及相关垂体受体的下调剂；甲状旁腺激素及其他生长激素类似物；酶，如DNA酶、催化酶和α-I抗胰蛋白酶；免疫抑制剂，如环孢菌素；GM-CSF及其他免疫调节剂；和胰岛素。
施用
在某些实施方式中，施用与核酸或其他荷电分子结合的荷电脂质(其是游离的或在药物递送媒介物中配制)以治疗、预防和/或改善患者中的病况。具体地，将处于游离形式或者在递送媒介物中配制的荷电脂质与核酸或其他荷电材料一起可以提供预防、改善或治疗益处。将以任何适合的剂量施用包含所述荷电脂质的药物组合物。在一个实施方式中，胃肠外施用游离或在药物递送媒介物中配制的脂质，即动脉内、静脉内、皮下或肌内施用。在其他实施方式中，可以表面施用本文所描述的处于游离形式或在递送媒介物中配制的脂质。在其他替代实施方式中，可以口服施用本文所描述的处于游离形式或在递送媒介物中配制的脂质。在其他实施方式中，通过气溶胶或粉末分散体系将处于游离形式或在递送媒介物中配制的脂质用于肺部施用。
本文所述的组合物可以施用于任何受试者，包括“患者”，如本文所使用的，它包括人或非人受试者。
在一些实施方式中，将本文所描述的脂质用于细胞，包括得自患者的干细胞和培养细胞的体外转染。在一个实施方式中，转染的细胞是干细胞并且将所述细胞施用回到先前获得它们的患者。
仅出于说明的目的而非通过对本发明范围的限制，提供了以下实施例。
实施例
材料和方法
对于实施例1中所描述的有机合成反应，除非另作说明，否则除THF(在氮气下，从Na/苯甲酮中新鲜蒸馏)以及Et3N、DMF和CH2Cl2(在氮气下，从CaH2中新鲜蒸馏)外，所有试剂和溶剂均购自商品化供应商并且使用时未进一步纯化。USP级蓖麻油在当地药店(LifeBrand)购买并且直接使用。在δ尺度上以百万分之一(ppm)报告NMR化学位移，并且以赫兹(Hz)报告耦合常数J。光谱以残余溶剂信号作为参照。将多重峰报告为“s”(单峰)、“d”(双峰)、“t”(三重峰)、“q”(四重峰)、“quint”(五重峰)、“sept”(七重峰)、“m”(多重峰)，并且进一步以“app”(表观)和“br”(宽峰)限定。
用中性脂，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DSPC)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DMPE)以及甾醇类，胆固醇制备脂质纳米颗粒(LNP)。DSPC和PEG-DMPE购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL)，并且胆固醇得自Sigma(St Louis,MO)。
通过测量粒径和多分散性(PdI)表征LNP。使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern,UK)，通过动态光散射确定粒径和多分散性。在PBS中以适当浓度稀释LNP。在测定中使用了数量加权的尺寸和分布数据，并且PdI>0.15的制剂未用于进一步研究。
使用来自Wako Chemicals USA(Richmond,VA)的胆固醇E酶促测定试剂盒，通过测量总胆固醇确定了脂质浓度。
分别使用Quant-iT Ribogreen RNA或者Oligreen ssDNA测定(LifeTechnologies,Burlington,ON)确定RNA或反义寡核苷酸封装效率。简要地，在存在或不存在1％Triton X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的情况下将LNP在37℃培育10min，然后添加Ribogreen或Oligreen试剂。确定荧光强度(Ex/Em：480/520nm)，并且用Triton X-100处理的样品表示总核酸，而未处理的样品表示未封装的核酸。
根据生产商的说明，通过使用BCA蛋白测定(Pierce)或者CBQCA蛋白定量试剂盒(Invitrogen)实施蛋白/肽的定量。
根据文献(Jayaraman,M.等人,Maximizing the potency of siRNA lipidnanoparticles for hepatic gene silencing in vivo.Angewandte Chemie,2012.51(34):p.8529-33)中所述的程序确定LNP系统的表观酸解离常数(pKa)。简要地，将2-(p-甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和LNP在pH范围在2.5至11的缓冲液(10mM HEPES、10mM MES和10mM乙酸铵)中稀释。TNS或总脂质的最终浓度为6μM。然后，将样品混合并使用Perkin Elmer LS55测量荧光强度(Ex/Em：321/445nm)。应用S形最佳拟合分析并且将pKa测量为半最大荧光强度处的pH。
实施例1：可电离脂质的合成
Figure BDA0003583427700000391
常规程序A-羟脂肪酸的酯化
将羟基化脂肪酸(1.00当量)在配备有冷凝器的圆底烧瓶中的MeOH(0.4-0.5M)中混悬。将浓硫酸(0.05当量)加入至上述混合物并将所得物回流加热，其在5-15min内变得均一。16h后，在旋转蒸发器上除去残余MeOH并将剩余的残余物在乙酸乙酯(EtOAc)和饱和NaHCO3水溶液之间分配。用EtOAc萃取水层两次并用水、盐水清洗合并的有机层一次，用Na2SO4干燥，重力滤器并在旋转蒸发器上浓缩以提供白色粉末，所述白色粉末使用时未进一步纯化。
常规程序B-羟基脂肪酸酯的酰基化
在氩气下，将N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC；1.00当量每羟基+另外的0.10当量)加入至圆底烧瓶中所期望的羧酸(1.00当量每羟基+另外的0.10当量)的冰冷的CH2Cl2(0.3M)溶液中。随后，除去冰浴并将所得混合物搅拌15min。将反应混合物在冰浴中再次冷却，并向其中加入固体羟基脂肪酸(1.00当量)，随后添加4-二甲基氨吡啶(DMAP；1.00当量每羟基+另外0.50当量)。使反应混合物在16h内加热至室温，然后用己烷稀释，搅拌10min并随后通过
Figure BDA0003583427700000402
垫过滤。在旋转蒸发器上浓缩滤液以获得粗混合物，通过快速柱色谱从所述粗混合物纯化所期望的酰化材料。
常规程序C-过酰化脂肪酸甲酯的皂化
在氩气下，将NaOH水溶液(2.0M，1.00当量)加入至圆底烧瓶中酰化脂肪酸甲酯(1.10当量)的室温t-BuOH(0.3M)溶液中。在搅拌16h后，通过添加HCl水溶液(2.0M)将反应混合物酸化至pH≤2，并用己烷萃取三次。用盐水清洗合并的有机萃取物，用Na2SO4干燥并在旋转蒸发器上浓缩以提供无色油状的粗产物。通过快速柱色谱纯化粗产物以提供所期望的脂肪酸。
常规程序D-用氨基醇对过酰化脂肪酸的酯化
在氩气下，将DCC(1.10当量)加入至圆底烧瓶中脂肪酸(1.00当量)的冰冷CH2Cl2(0.2M)溶液中。除去冰浴并将所得物搅拌15min。将反应混合物在冰浴中再次冷却，添加纯氨基醇(1.20-2.00当量)，随后添加DMAP(1.20当量)，并使反应混合物在16h内加热至室温。用Et2O稀释反应混合物，搅拌10min并随后通过
Figure BDA0003583427700000403
垫过滤。在旋转蒸发器上浓缩滤液以获得粗油，通过快速柱色谱纯化所述粗油以提供所期望的过酰化氨基脂。
Figure BDA0003583427700000401
甲基(12R)-亚油酸氧基油酸酯(linoleoxyoleate)
根据常规程序B，蓖麻醇酸甲酯(500mg，1.60mmol)、亚油酸(538mg，1.92mmol，1.20当量)、DCC(396mg，1.20mmol，2.20当量)和DMAP(293mg，2.40mmol，1.50当量)在CH2Cl2(5mL)中提供了透明、无色油状的标题化合物(875mg，93％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.55-5.28(m,6H),4.90(quint,J＝6.2Hz,1H),3.69(s,3H),2.79(t,J＝5.8Hz,2H),2.40-2.21(m,6H),2.16-1.93(m,6H),1.72-1.46(m,8H),1.46-1.18(m,32H),1.00-0.80(m,6H).
Figure BDA0003583427700000411
甲基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂
根据常规程序B，二羟基硬脂酸酯(1.32g，4.00mmol)、亚油酸(2.47g，8.80mmol，2.20当量)、DCC(1.82g，8.80mmol，2.20当量)和DMAP(1.22g，10.0mmol，2.50当量)在CH2Cl2(10mL)中提供了透明、无色油状的标题化合物(2.64g，77％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.47-5.28(m,8H),5.04-4.94(m,2H),3.68(s,3H),2.79(t,J＝5.8Hz,4H),2.35-2.25(m,6H),2.11-2.00(m,8H),1.69-1.47(m,10H),1.44-1.16(m,48H),0.97-0.84(m,9H).
Figure BDA0003583427700000412
甲基(±)-syn-9,10-双(2-己基癸酰氧基)硬脂酸酯
根据常规程序B，二羟基硬脂酸酯(2.31g，7.00mmol)、(±)-2-己基癸酸(3.77g，14.7mmol，2.10当量)、DCC(3.03g，14.7mmol，2.10当量)和DMAP(2.14g，17.5mmol，2.50当量)在CH2Cl2(18mL)中提供了透明、无色油状的标题化合物(4.20g，74％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.06-4.96(m,2H),3.68(s,3H),2.31(t,J＝7.6Hz,2H),1.69-1.50(m,10H),1.50-1.16(m,64H),0.94-0.84(m,15H).
Figure BDA0003583427700000413
甲基(syn-9,10,12R)-三亚油酸氧基硬脂酸脂
根据常规程序B，三羟基硬脂酸酯(1.04g，3.00mmol)、亚油酸(2.61g，9.30mmol，3.10当量)、DCC(1.92g，9.30mmol，3.10当量)和DMAP(1.28g，10.5mmol，3.50当量)在CH2Cl2(10mL)中提供了透明、无色油状的标题化合物(2.33g，68％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.49-5.26(m,12H),5.14-4.84(m,3H),3.68(s,3H),2.79(brt,J＝6.0Hz,6H),2.37-2.21(m,8H),2.14-1.99(m,12H),1.92-1.47(m,16H),1.47-1.16(m,56H),0.96-0.84(m,12H).
Figure BDA0003583427700000421
(12R)-亚油酸氧基油酸
根据常规程序C，在快速柱色谱(SiO2，95:5:0→90:10:0→85:12:3己烷/EtOAc/MeOH)后，酰基甲酯(5.97g，10.4mmol，1.10当量)、NaOH水溶液(2.0M，4.70mL，1.00当量)和t-BuOH(26mL)提供了透明、无色油状的标题化合物(4.48g，85％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.55-5.28(m,6H),4.90(quint,J＝6.2Hz,1H),2.79(t,J＝6.0Hz,2H),2.43-2.21(m,6H),2.14-1.96(m,6H),1.73-1.47(m,6H),1.46-1.18(m,30H),0.99-0.81(m,6H).
Figure BDA0003583427700000422
(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸(INT-A008)
根据常规程序C，在快速柱色谱(SiO2，95:5:0→90:10:0→85:12:3己烷/EtOAc/MeOH)后，二酰基甲酯(1.88g，2.20mmol，1.10当量)、NaOH水溶液(2.0M，1.00mL)和t-BuOH(7mL)提供了透明、无色油状的INT-A008(1.50g，89％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.47-5.28(m,8H),5.04-4.94(m,2H),2.79(br t,J＝6.0Hz,4H),2.36(t,J＝7.0Hz,2H),2.30(t,J＝7.5Hz,4H),2.12-1.98(m,8H),1.72-1.46(m,10H),1.44-1.16(m,48H),0.97-0.84(m,9H).
Figure BDA0003583427700000423
(syn-9,10,12R)-三亚油酸氧基硬脂酸
根据常规程序C，在快速柱色谱(SiO2，90:10:0→80:17:3己烷/EtOAc/MeOH)后，三酰基甲酯(2.41g，2.12mmol，1.05当量)、NaOH水溶液(2.0M，1.01mL)和t-BuOH(7mL)提供了透明、无色油状的三酰化脂肪酸(1.37g，60％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.47-5.26(m,12H),5.14-4.84(m,3H),2.79(br t,J＝6.0Hz,6H),2.41-2.20(m,8H),2.14-1.99(m,12H),1.92-1.47(m,16H),1.47-1.16(m,56H),0.96-0.84(m,12H).
Figure BDA0003583427700000431
(±)-syn-9,10-双(2-己基癸酰氧基)硬脂酸(INT-A009)
根据常规程序C，在快速柱色谱(SiO2，95:5:0→90:10:0→85:12:3己烷/EtOAc/MeOH)后，二酰基甲酯(4.20g，5.21mmol，1.05当量)、NaOH水溶液(2.0M，2.48mL)和t-BuOH(7mL)提供了透明、无色油状的INT-A009(3.12g，79％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.09-4.93(m,2H),2.41-2.23(m,4H),1.71-1.51(m,10H),1.51-1.15(m,64H),0.95-0.82(m,15H).
Figure BDA0003583427700000432
3-(二甲基氨基)丙基(12R)-亚油酸氧基油酸酯(INT-A005)
根据常规程序D，在快速柱色谱(SiO2，88:10:2→68:30:2己烷/EtOAc/Et3N)后，羧酸(561mg，1.00mmol)、氨基醇(0.18mL，1.20mmol，1.20当量)、DCC(227mg，1.10mmol，1.10当量)和DMAP(147mg，1.20mmol，1.20当量)在CH2Cl2(3.5mL)中提供了透明、无色油状的INT-A005(639mg，95％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.54-5.23(m,6H),4.89(quint,J＝6.0Hz,1H),4.12(t,J＝6.0Hz,2H),2.78(br t,J＝6.0Hz,2H),2.58-2.45(m,6H),2.29(br q,J＝6.0Hz,6H),2.12-1.96(m,6H),1.83-1.72(m,2H),1.69-1.47(m,6H),1.44-1.18(m,30H),1.02(t,J＝7.1Hz,6H),0.94-0.84(m,6H).
Figure BDA0003583427700000441
2-(二甲基氨基)乙基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A001)
根据常规程序D，在快速柱色谱(SiO2，88:20:2→68:30:2→48:50:2己烷/EtOAc/Et3N)后，羧酸(336mg，0.40mmol)、氨基醇(0.12mL，1.20mmol，3.00当量)、DCC(91mg，0.44mmol，1.10当量)和DMAP(59mg，0.48mmol，1.20当量)在CH2Cl2(2mL)中提供了透明、无色油状的INT-A001(255mg，70％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.47-5.27(m,8H),5.04-4.94(m,2H),4.18(t,J＝5.9Hz,2H),2.79(br t,J＝5.90Hz,4H),2.57(t,J＝5.8Hz,2H),2.39-2.24(m,9H),2.30(s,3H),2.13-1.99(m,8H),1.70-1.46(m,10H),1.44-1.16(m,48H),0.97-0.84(m,9H).
Figure BDA0003583427700000442
3-(二乙基氨基)丙基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A002)
根据常规程序D，在快速柱色谱(SiO2，78:20:2→68:30:2己烷/EtOAc/Et3N)后，羧酸(336mg，0.40mmol)、氨基醇(0.12mL，0.80mmol，2.00当量)、DCC(91mg，0.44mmol，1.10当量)和DMAP(59mg，0.48mmol，1.20当量)在CH2Cl2(2mL)中提供了透明、无色油状的INT-A002(272mg，71％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.47-5.27(m,8H),5.04-4.94(m,2H),4.12(t,J＝6.5Hz,2H),2.79(br t,J＝5.9Hz,4H),2.59-2.46(m,6H),2.30(t,J＝7.5Hz,6H),2.12-1.99(m,8H),1.78(quint,J＝6.9Hz,2H),1.70-1.46(m,10H),1.44-1.16(m,48H),1.03(t,J＝7.1Hz,6H),0.97-0.84(m,9H).
Figure BDA0003583427700000443
3-(二甲基氨基)丙基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A003)
根据常规程序D，在快速柱色谱(SiO2，78:20:2→68:30:2己烷/EtOAc/Et3N)后，羧酸(421mg，0.50mmol)、氨基醇(88μL，0.75mmol，1.50当量)、DCC(113mg，0.55mmol，1.10当量)和DMAP(73mg，0.60mmol，1.20当量)在CH2Cl2(3mL)中提供了透明、无色油状的INT-A003(323mg，70％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.47-5.27(m,8H),5.04-4.94(m,2H),4.13(t,J＝6.60Hz,2H),2.79(br t,J＝5.90Hz,4H),2.39-2.25(m,8H),2.24(s,3H),2.13-1.99(m,8H),1.81(quint,J＝6.8Hz,2H),1.70-1.46(m,10H),1.44-1.16(m,48H),0.97-0.84(m,9H).
Figure BDA0003583427700000451
2-(二乙基氨基)乙基(±)-syn-9,10-二亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A004)
根据常规程序D，在快速柱色谱(SiO2，78:20:2→68:30:2己烷/EtOAc/Et3N)后，羧酸(421mg，0.50mmol)、氨基醇(80μL，0.60mmol，1.20当量)、DCC(113mg，0.55mmol，1.10当量)和DMAP(73mg，0.60mmol，1.20当量)在CH2Cl2(3mL)中提供了透明、无色油状的INT-A004(406mg，86％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.47-5.27(m,8H),5.05-4.93(m,2H),4.15(t,J＝6.3Hz,2H),2.78(br t,J＝5.9Hz,4H),2.70(t,J＝6.1Hz,2H),2.59(q,J＝7.2Hz,4H),2.36-2.23(m,6H),2.12-1.99(m,8H),1.69-1.45(m,10H),1.44-1.16(m,48H),1.05(t,J＝7.1Hz,6H),0.97-0.84(m,9H).
Figure BDA0003583427700000452
3-(二乙基氨基)丙基(±)-syn-9,10-双(2-己基癸酰氧基)硬脂酸酯(INT-A007)
根据常规程序D，在快速柱色谱(SiO2，85:15:0→80:15:5→75:20:5己烷/EtOAc/MeOH)后，羧酸(595mg，0.75mmol)、氨基醇(0.13mL，0.90mmol，1.20当量)、DCC(170mg，0.82mmol，1.10当量)和DMAP(110mg，0.90mmol，1.20当量)在CH2Cl2(4mL)中提供了透明、无色油状的INT-A007(577mg，85％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.06-4.96(m,2H),4.12(t,J＝6.5Hz,2H),2.60-2.46(m,6H),2.37-2.23(m,5H),1.79(quint,J＝7.2Hz,2H),1.70-1.50(m,10H),1.50-1.16(m,64H),1.04(t,J＝7.1Hz,6H)0.94-0.84(m,15H).
Figure BDA0003583427700000461
3-(二乙基氨基)丙基(syn-9,10,12R)-三亚油酸氧基硬脂酸脂(INT-A006)
根据常规程序D，在快速柱色谱(SiO2，85:15:0→80:15:5→75:20:5己烷/EtOAc/MeOH)后，羧酸(560mg，0.50mmol)、氨基醇(89μL，0.60mmol，1.20当量)、DCC(113mg，0.55mmol，1.10当量)和DMAP(73mg，0.60mmol，1.20当量)在CH2Cl2(3mL)中提供了透明、无色油状的INT-A006(417mg，68％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.49-5.26(m,12H),5.12-4.84(m,3H),4.12(t,J＝6.5Hz,2H),2.59-2.45(m,6H),2.36-2.21(m,8H),2.14-1.99(m,12H),1.92-1.47(m,18H),1.47-1.16(m,56H),1.03(t,J＝7.1Hz,6H),0.96-0.84(m,12H).
Figure BDA0003583427700000462
异丁基(10Z)-十九烷磺酸酯
对程序(M.Xie,T.S.Widlanski,Tetrahedron Lett.1996,37,4443)进行改进，在氩气下，将n-BuLi溶液(6.52mL 1.15M在己烷中的溶液，7.50mmol，1.50当量)加入至圆底烧瓶中-78℃的异丁基甲烷磺酸酯(1.22g，8.00mmol，1.60当量)的9:1 THF/DMPU(15mL)的溶液并使所得物搅拌30min。同时仍在-78℃，将油烯基碘化物(1.89g，5.00mmol，1.00当量)的THF(2mL)溶液加入至上述溶液并使反应混合物在16h内加热。用10％柠檬酸水溶液使反应混合物淬灭，用Et2O(2×10mL)萃取并用水(1×10mL)、盐水(1×10mL)清洗合并的有机物，然后用Na2SO4干燥并在旋转蒸发器上浓缩。通过快速柱色谱(98:2→95:5己烷/EtOAc)纯化粗残余物以提供透明、无色油状的烷基化磺酸酯(1.19g，46％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.46-5.27(m,2H),4.00(d,J＝6.6Hz,2H),3.14-3.05(m,2H),2.11-1.94(m,5H),1.94-1.80(m,2H),1.51-1.18(m,26H),1.00(t,J＝6.8Hz,6H),0.90(brt,J＝6.6Hz,3H).
Figure BDA0003583427700000471
异丁基(±)-syn-10,11-二羟基十九烷磺酸酯
在氩气下，将OsO4溶液(0.11mL的4％的水溶液，0.02mmol，0.01当量)加入至圆底烧瓶中的异丁基(10Z)-十九烷磺酸酯(709mg，1.76mmol)和NMO(0.54mL的50％的水溶液，2.64mmol，1.50当量)的室温4:1Me2CO/H2O(5.5mL)溶液。在搅拌16h后，添加饱和NaHSO3水溶液并使反应混合物搅拌1h，此时用EtOAc萃取(3×10mL)并用水(1×10mL)、盐水(1×10mL)清洗合并的有机物，用Na2SO4干燥并在旋转蒸发器上浓缩以提供白色固体状的二醇(768mg，定量得率)，所述二醇使用时未进一步纯化。
1H(300MHz,CDCl3):4.00(d,J＝6.6Hz,2H),3.67-3.65(m,2H),3.14-3.05(m,2H),2.05(sept,J＝6.7Hz,1H),1.95-1.78(m,4H),1.58-1.19(m,28H),1.00(t,J＝6.8Hz,6H),0.90(br t,J＝6.6Hz,3H).
Figure BDA0003583427700000472
异丁基(±)-syn-10,11-双(2-己基癸酰氧基)十九烷磺酸酯
在氩气下，将固体DCC(388mg，1.88mmol，2.10当量)加入至圆底烧瓶中(±)-2-己基癸酸(482mg，1.88mmol，2.10当量)的冰冷CH2Cl2(4.5mL)溶液。随后，除去冰浴并将所得混合物搅拌15min。将反应混合物在冰浴中再次冷却，并向其中加入固体二羟基磺酸酯(391mg，0.90mmol，1.00当量)，随后添加DMAP(273mg，2.23mmol，2.50当量)。使反应混合物在16h内加热至室温，然后用Et2O稀释，搅拌10min并随后通过
Figure BDA0003583427700000482
垫过滤。在旋转蒸发器上浓缩滤液，然后通过快速柱色谱(SiO2，95:5→90:10己烷/EtOAc)纯化以提供二酰化磺酸酯(574mg，70％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.08-4.93(m,2H),4.00(d,J＝6.6Hz,2H),3.67-3.65(m,2H),3.14-3.05(m,2H),2.38-2.24(m,2H),2.05(sept,J＝6.7Hz,1H),1.95-1.80(m,2H),1.70-1.15(m,74H),1.00(t,J＝6.8Hz,6H),0.96-0.83(m,15H).
Figure BDA0003583427700000481
(±)-syn-10,11-双(2-己基癸酰氧基)十九烷磺酸钠(INT-A012)
将NaI(82mg，0.55mmol，2.00当量)加入至具有
Figure BDA0003583427700000483
螺旋封盖的密封玻璃管中并在氩气下的二酰化异丁基磺酸酯(250mg，0.27mmol)的室温Me2CO(0.9mL)溶液。然后，将反应混合物回流加热24h，在此将其用Me2CO(3mL)稀释，在冰上冷却2-3h并收集白色沉淀物，并用冰冷Me2CO清洗以提供白色粉末状的INT-A012(200mg，84％得率)。
1H(300MHz,CDCl3):5.10-4.93(m,2H),2.90(app br s,2H),2.46-2.22(m,4H),1.70-1.15(m,76H),0.96-0.83(m,15H).
实施例2：将含有核酸的脂质纳米颗粒配制成脂质纳米颗粒(LNP)
将如实施例1中所述的合成的脂质INT-A001、INT-A002、INT-A003、INT-A004、INT-A005、INT-A006和INT-A007在脂质纳米颗粒中与核酸一起配制。作为货物的实例，用于LNP掺入的核酸是针对因子VII的siRNA，它是参与血液凝固的蛋白。可以通过发色测定容易地测量血液血浆中的因子VII的水平，并且因子VII水平代表了用于确定siRNA介导的该因子的下调的适当模型。
测量并如下报告了具有掺入的阳离子脂质和针对因子VII的siRNA的纳米颗粒的生理化学参数，包括表观pKa、粒径、多分散性(PDI)和封装效率。以下结果显示LNP适合于核酸的封装和递送。
为了制备LNP，将可电离脂质、DSPC、胆固醇和PEG-DMPE溶于乙醇。将siRNA溶于由10-50mM乙酸盐、琥珀酸盐或柠檬酸盐组成的pH 4.0-6.2的缓冲液。在所选的实例中，使用了10-50mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸(HEPES)或者2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)缓冲液。通过将乙醇中的脂质组分(以50/10/38.5/1.5的DSPC/chol/PEG-DMPE的摩尔比)与水缓冲液中的核酸以1:3(乙醇比水，合并流速>12mL/min)的体积流速比在室温下快速混合来制备LNP。通常，将siRNA/脂质的比定为0.056wt/μmol。然后，将产物对pH 7.4的1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析24小时以除去残余的乙醇并提高pH。4小时后，更新PBS。
如下表2所示，INT-A001、INT-A002、INT-A003、INT-A004、INT-A005、INT-A006和INT-A007可电离脂质有助于FVII siRNA以高封装效率和低多分散性掺入，这两者都是药物递送系统所期望的生理化学性质。还测量了这些可电离脂质的表观pKa值，因为先前报道表观pKa值在6至7之间的某些可电离脂质在介导基因沉默中具有活性(Semple,S.C.等人,Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.Nat Biotechnol,2010,28(2):p.172-6和Jayaraman,M.等人,Maximizing the potency of siRNA lipidnanoparticles for hepatic gene silencing in vivo.Angewandte Chemie,2012,51(34):p.8529-33)。
确定INT-A001、INT-A002、INT-A003、INT-A004、INT-A005、INT-A006和INT-A007显示出在6至7的适当范围内的pKa值(表2)。
表2：含有可电离脂质和siRNA的LNP的生理化学参数
Figure BDA0003583427700000491
Figure BDA0003583427700000501
累积地，该数据表明这些新型可电离脂质对于核酸在LNP中的封装的适合性。
实施例3：LNP活性在培养的22Rv1细胞中的确定
在表达荧光素酶的人前列腺细胞(22Rv1)中评价了可电离脂质的体外活性。如实施例2中所述，制备了含有针对荧火虫荧光素酶的siRNA的LNP。用0.1-1μg/mL的含有siRNA的LNP处理细胞16-24hr，然后用Glo裂解缓冲液(Promega)裂解。将等量的Steady-Glo试剂(Promega)加入至每个样品并且使用synergy LX酶标仪(BioTek)确定发光水平。图2A显示了多种处理的发光水平。通常，观察到了荧火虫荧光素酶基因沉默的剂量依赖性影响。图2B显示了含有可电离脂质A001-A007的制剂的相对活性。结果显示本发明公开的可电离脂质可以有效递送siRNA并体外引起基因沉默。在这体外基因沉默模型中，1ug/mL时的A007活性最强。
实施例4：小鼠因子VII模型中LNP活性的确定
接着，在小鼠FVII模型中评价了可电离脂质的体内活性。结果显示本发明公开的可电离脂质可以体内有效递送核酸。
用PBS稀释如实施例2中所描述的所制备的含有针对因子VII(FVII)的siRNA的LNP，从而将注射体积维持在10mL/kg体重并且在6至8周大的雌性C57BL/6小鼠(CharlesRiver Laboratories,Wilmington,MA)中经由尾静脉静脉内施用(基于siRNA浓度)。在注射后24小时，将动物安乐死并经由心内采样来收集血液。使血液样品在4℃凝固过夜，并通过以12,000rpm离心15min分离血清。根据生产商的规程，使用Biophen VII发色测定(Aniara,Mason,OH)确定血清FVII水平。
图3显示了用INT-A001、INT-A002、INT-A003、INT-A005或INT-A007制剂注射的小鼠中的残余FVII水平。确定这些可电离脂质在介导基因沉默中具有活性。INT-A002是所测试的配制的脂质中活性最强的。将INT-002的ED 50估计为小于0.1mg/kg(ED 50是实现50％基因沉默的有效剂量)。
实施例5：将含有mRNA的脂质纳米颗粒配制成LNP
评价了含有INT-A001、INT-A002、INT-A003和INT-A004的制剂体外递送mRNA的能力。结果显示这些可电离脂质可以有效递送mRNA。
如实施例2所描述，制备了含有荧火虫荧光素酶mRNA的LNP。如下表3所示，INT-A001、INT-A002、INT-A003和INT-A004可电离脂质有助于荧光素酶mRNA以高封装效率和低多分散性掺入，这两者都是药物递送系统所期望的生理化学性质。
表3：含有可电离脂质和mRNA的LNP的生理化学参数
可电离脂质ID 粒径(nm) 多分散指数(PDI) 封装效率(％)
INT-A001 43 0.064 96
INT-A002 47 0.053 99
INT-A003 49 0.050 99
INT-A004 42 0.090 96
在培养的HepG2细胞中评价了可电离脂质的体外活性。如实施例2中所述，制备了含有LNP的荧火虫荧光素酶mRNA。用含有10％FBS的DMEM培养基将LNP稀释至0.125-1μg/mL，并与HepG2细胞培育16-24hr。然后，用Glo裂解缓冲液(Promega)裂解细胞。将等量的Steady-Glo试剂(Promega)加入至每个样品并且使用synergy LX酶标仪(BioTek)确定发光水平。图4A显示了多种处理的发光水平。INT-A003制剂在递送mRNA和诱导其体外表达中活性最强。
为了评价体内活性，如实施例2所述，制备了含有荧火虫荧光素酶mRNA的LNP。用PBS稀释LNP并在6至8周大的雌性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)中经由尾静脉以1mg/kg静脉内施用。在注射后4小时，将动物安乐死并收集肝脏。将约100mg的肝脏在0.5mL Glo裂解缓冲液(Promega)中匀浆化。将匀浆用裂解缓冲液进一步1:4稀释，然后将50μL稀释的匀浆加入至50μL Steady-Glo试剂(Promega)中。使用synergy LX酶标仪(BioTek)确定发光水平。图4B显示了由于mRNA的体内成功递送所造成的相对发光水平。INT-A002制剂在递送mRNA和诱导mRNA体内表达中活性最强。
实施例6：将含有反义寡核苷酸的脂质纳米颗粒配制成LNP
如实施例2所描述，制备了含有反义寡核苷酸的LNP。如下表4所示，INT-A001、INT-A002、INT-A003、INT-A004、INT-A005、INT-A006和INT-A007可电离脂质有助于反义寡核苷酸以高封装效率和低多分散性掺入，这两者都是药物递送系统所期望的生理化学性质。
表4：含有可电离脂质和反义寡核苷酸的LNP的生理化学参数
可电离脂质ID 粒径(nm) 多分散指数(PDI) 封装效率(％)
INT-A001 44 0.103 84
INT-A002 49 0.096 92
INT-A003 54 0.036 89
INT-A004 45 0.065 88
INT-A005 47 0.090 74
INT-A006 55 0.062 88
INT-A007 55 0.070 84
实施例7：将含有透明质酸(HA)的脂质纳米颗粒配制成LNP
将透明质酸用作阴离子货物的实例。如实施例2所述，制备了含有分子量为8-15kDa的HA的LNP。如下表5所示，INT-A002、INT-A003、INT-A005、INT-A006和INT-A007可电离脂质有助于HA的掺入。
表5：含有可电离脂质和HA的LNP的生理化学参数
可电离脂质ID 粒径(nm) 多分散指数(PDI) HA:脂质(wt/wt)
INT-A002 83 0.027 0.093
INT-A003 64 0.035 0.094
INT-A005 71 0.096 0.114
INT-A006 74 0.037 0.078
INT-A007 58 0.065 0.096
实施例8：将含有酸性肽的脂质纳米颗粒配制成LNP
与核酸类似，可以使用阳离子可电离脂质将具有净负电荷的蛋白或肽掺入LNP。如实施例2所述，制备了含有分子量为4.2kDa且预测净电荷为-3的酸性肽的LNP。如下表6所示，INT-A001、INT-A002、INT-A003、INT-A004、INT-A005、INT-A006和INT-A007可电离脂质有助于该酸性肽的掺入。
表6：含有可电离脂质和4.2kDa酸性肽的LNP的生理化学参数
可电离脂质ID 粒径(nm) 多分散指数(PDI) 肽:脂质(wt/wt)
INT-A001 48 0.021 0.161
INT-A002 62 0.015 0.157
INT-A003 76 0.031 0.160
INT-A004 40 0.034 0.158
INT-A005 87 0.021 0.193
INT-A006 58 0.070 0.132
INT-A007 52 0.049 0.162
实施例9：将含有小酸性肽的脂质纳米颗粒配制成LNP
如实施例2所述，制备了含有分子量为2.0kDa且预测净电荷为-3的酸性肽的LNP。如下表7所示，INT-A003、INT-A004、INT-A006和INT-A007可电离脂质有助于该酸性肽的掺入。
表7：含有可电离脂质和2.0kDa酸性肽的LNP的生理化学参数
可电离脂质ID 粒径(nm) 多分散指数(PDI) 肽:脂质(wt/wt)
INT-A003 142 0.025 0.074
INT-A004 59 0.051 0.073
INT-A006 94 0.054 0.061
INT-A007 79 0.019 0.075
实施例10：将含有阳离子货物的脂质纳米颗粒配制成LNP
将碱性肽用作阳离子货物的实例。如实施例2所述，制备了含有分子量为2.0kDa且预测净电荷为+4的碱性肽的LNP。如下表8所示，INT-A008和INT-A009可电离脂质有助于该碱性肽的掺入。
表8：含有可电离脂质和2.0kDa碱性肽的LNP的生理化学参数
可电离脂质ID 粒径(nm) 多分散指数(PDI) 肽:脂质(wt/wt)
INT-A008 39 0.058 0.104
INT-A009 39 0.057 0.121
本说明书所附权利要求不应受以上所描述的任何具体实施方式的限制，并且应视为包括这些权利要求所赋予的所有可能的实施方式和等价形式。

Claims (14)

1.一种荷电脂质，包含具有化学式I的结构的支链脂质部分L：
化学式I：
A-(V)m-Z-L，其中
A是在生理学pH荷电的头部基团；
(V)m是任选的-(CR1R2)-，并且m是1至10或2至6，其中R1和R2分别独立地为：氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环或独立选择的任选地取代的具有4至12个环原子的单环、双环或三环碳环或杂原子环；以及
Z-L具有以下化学式II、IIa或IIb的结构：
化学式II直链接头结构：
X1-Lb，
其中X1是任选的并且X1选自醚、酯和氨基甲酸酯基团；以及
Lb是化学式IIIc的支链脂质；
化学式IIa支链接头结构：
Figure FDA0003583427690000011
W是任选的；
如果存在W，W是X1键、N-C(O)、N-C(O)O或N-OC(O)；
其中W任选地被D取代，所述D是任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环；
每次出现的(X)n是独立选择的-(CR1R2)-；(X)n的n为0至10；并且T是任选的且是烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环，并且其中T是任选地取代的；
B是经由各自的G1和G2与L1和L2连接的碳原子；
其中G1和G2独立地选自X1，并且其中每一个G1和G2独立地任选地在前面有(G)u并且共价键合至(G)u，其中G是独立选择的-(CR1R2)-，其中R1和R2分别独立地为：氢、任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烷基烷基或杂环，并且u是0至16；
其中G3是任选的并且选自X1，并且任选地在前面有(G)u并且共价键合至(G)u；
L1是化学式IIIc的支链烃；
L2是具有1至20个碳原子和0至2个顺式或反式双键的烃链，或具有化学式IIIc的结构；
如果存在L3，L3是氢、具有1至20个碳原子和0至2个顺式或反式双键的直链或支链烃链，或具有化学式IIIc的结构；
化学式IIb环状结构：
Figure FDA0003583427690000021
其中曲线代表环，并且E和K显示了部分形成所述环的结构的原子，所述环是具有3至8个环原子的取代的或未取代的环；
其中L1、L2和L3中的至少一个任选地经由各自的G1、G2和G3键合至所述环中的单个原子，其中G1、G2和G3中的每一个独立地任选地在前面有(G)u并且共价键合至(G)u；
其中化学式IIb的L1和任选地L2和/或L3具有化学式IIIc的结构：
化学式IIIc：
Figure FDA0003583427690000022
其中L主链由L1'-L1”-G1-CH-[CH2]q-CH3表示，并且其中所述L主链中的碳原子的总数为10至30；
L1'是直链烃链并且具有5-20、6-20、7-20、8-20、5-12、5-10、5-9、6-12、6-10、6-9、7-12、7-10或7-9个碳原子和0-3个顺式或反式双键；
L1”是碳原子；
L1”'由G1-CH-CH2-CH3表示，并且其中G1是具有0-4个碳原子的烃链，任选地具有一个顺式或反式双键；
其中n为0至4；
其中p为1至4；
其中n+p为1至4；
q为0至20；
每个X1独立地选自醚、酯和氨基甲酸酯基团；
其中每个S和L1””烃侧链独立地为：
(e)直链或支链封端的烃链，所述直链或支链封端的烃链具有0至5个顺式或反式C＝C和1至30个碳原子并且在其烃链中的任何碳原子处缀合至各自X1中的一个；或
(f)化学式IIIc的支链烃结构，
其中化学式IIIc中的L1””和S烃链的总数为1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4或1至3；
其中所述脂质部分中的L1””和S烃链中的每一者任选地被杂原子取代，条件是在所述烃链中取代不超过2个杂原子。
2.根据权利要求1所述的荷电脂质，其中Z-L具有化学式II的结构(直链接头结构)：
X1-Lb；
其中化学式IIIc的L1'具有5至9个碳原子并且具有0至2个顺式或反式双键；
其中化学式IIIc的G1是不存在的、CH2或CH2CH＝CH，并且其中双键是顺式或反式；
其中化学式IIIc的L1””和S独立地选自具有0-5个顺式或反式CH＝CH和2至18个碳原子的烃；
其中化学式IIIc的骨架主链由CH2-L1”-G1-CH-CH2-CH3表示(L1”'是8至30个碳原子；并且
其中q为1至9。
3.根据权利要求1所述的荷电脂质，其中(V)m为(CH2)m，其中m是1至20；
Z-L具有化学式IIa的结构(支链接头结构)：
Figure FDA0003583427690000041
其中W为醚、酯或氨基甲酸酯基团并且D是不存在的，且(X)n是(CH2)n，其中n是1至10；
其中G1和G2存在并且在前面有各自的(G)u并且共价键合至各自(G)u，其中(G)u是CH2；
其中G3-L3存在且是选自CH3和CH2CH3的烃；或其中G3-L3是CH2X1L3且L3是具有1至20个碳原子和0至2个顺式或反式双键的直链或支链烃链或具有化学式IIIc的结构。
4.根据权利要求1所述的荷电脂质，其中Z-L具有化学式IIb的结构：
化学式IIb环状结构：
Figure FDA0003583427690000042
其中曲线代表环，并且E和K显示了部分形成所述环的结构的原子，所述环是具有3至6个环原子的取代的或未取代的碳环。
5.根据权利要求4所述的荷电脂质，其中所述环包含3或5个碳原子。
6.根据权利要求4或5所述的荷电脂质，其中至少L1和L2存在且经由各自的G1和G2基团连接至所述环，并且其中每个G1和G2基团任选地在前面有Gu，其中u是0至10或0至6。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的荷电脂质，其中A选自：
(i)可电离阳离子部分，选自由以下组成的群组：
Figure FDA0003583427690000051
(ii)永久荷电部分，选自由以下组成的群组：
Figure FDA0003583427690000052
(iii)可电离阴离子部分，选自由以下组成的群组：
Figure FDA0003583427690000053
或
(iv)两性离子部分，选自由以下组成的群组：
Figure FDA0003583427690000061
8.根据权利要求1至7中任一项所述的脂质，其中化学式I的烃结构L的形状是非圆柱形的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的脂质，其中所述脂质能够在水溶液中与其他脂质组合组装成脂质纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的脂质，其中其他囊泡形成脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、神经酰胺、鞘磷脂或亲水聚合物-脂质缀合物。
11.一种药物递送媒介物制剂，包含掺入其脂质双分子层或单分子层中的根据权利要求1-10中任一项所述的脂质并且包含货物分子或化合物，所述货物分子或化合物是核酸、蛋白或肽。
12.根据权利要求11所述的药物递送制剂，其中所述核酸是小干扰RNA、小激活RNA、信使RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、核糖酶、适体、质粒、环状DNA、直链DNA、antagomir、抗-miRNA寡核苷酸或miRNA模拟物。
13.根据权利要求11所述的药物递送制剂，其中所述货物分子或化合物是肽。
14.根据权利要求11、12或13所述的药物递送媒介物制剂，包含脂质纳米颗粒(LNP)。
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