KR20220044816A - 하전 물질 전달을 위한 지질, 이의 제형 및 그 제조 방법 - Google Patents

하전 물질 전달을 위한 지질, 이의 제형 및 그 제조 방법 Download PDF

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KR20220044816A
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조슈아 자이프만
샘 천
위엔 이 탐
마르코 에이. 시우폴리니
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인티그레이티드 나노테라퓨틱스 아이엔씨.
더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아
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Abstract

생리학적 pH에서 네트 전하를 갖고 지질 모이어티에 공유적으로 부착된 지질이 본원에 개시되어 있다. 상기 지질 모이어티는 선택적으로 시스 또는 트랜스 C=C를 갖는 둘 이상의 연결된 탄화수소 사슬을 갖는 탄화수소 구조를 포함하고, 상기 사슬 중 적어도 하나는 선택적으로 링커 영역을 통해 헤드기에 공유 부착된다. 상기 탄화수소 사슬은 링커 영역에 부착된 사슬의 내부 탄소의 분기점에서 서로 결합되며, 이 분기점은 전기음성 원자를 갖는 작용기를 포함한다. 상기 탄화수소 사슬은 각각 1 내지 40개의 탄소 원자를 가지며, 여기서 탄화수소 구조는 총 10 내지 150개의 탄소 원자를 포함한다. 유리하게는, 상기 탄화수소 구조는 카고 분자의 향상된 전달을 위해 일반적으로 나팔 모양을 취할 수 있다. 지질을 포함하는 전달 비히클이 추가로 제공된다.

Description

하전 물질 전달을 위한 지질, 이의 제형 및 그 제조 방법
본 발명은 지질, 이러한 지질의 제제 및 그의 제조 방법을 제공한다. 상기 지질 및 이의 제형은 핵산 및 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 하전 물질의 전달에 유용하다.
핵산 또는 펩티드와 같은 다른 하전된 분자의 세포내 전달은 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP)와 같은 전달 시스템으로의 통합에 의해 촉진된다. 예를 들어, 이온화 가능한 지질은 LNP 제조 과정에서 핵산의 효율적인 캡슐화를 담당하는 주요 지질 성분이다. 게다가, 상기 이온성 또는 양이온성 지질은 표적 세포에서 엔도시토시스(endocytosis)에 의한 흡수 후 엔도솜으로부터 핵산의 후속 제어 방출을 촉진한다.
형질전환 또는 유전자-전달 활성은 양이온성 지질과 같은 이온화 가능한 지질의 화학 구조에 의존한다고 제안되어 왔다(Semple, S.C., et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol, 2010, 28(2): p. 172-6). 특히, 상기 친유성 부분(lipophilic portion)은 비-원통 형상이어야 한다. 실시예는 작은 이온화 가능한 헤드 그룹을 가지며, 상기 헤드 그룹에서 바깥쪽으로 넓어지거나 플레어링되는 탄화수소 모이어티를 갖는 지질이다.
현재, 간단하거나 편리한 방법을 사용하여 제조될 수 있는 원하는 모양의 이온화 가능하거나 하전된 지질 구조가 필요하다. 이러한 지질을 제공하는 능력은 표적 세포로의 핵산 또는 다른 하전된 분자의 전달에 의존하는 치료법의 임상 개발을 상당히 발전시킬 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 전술한 문제를 해결하고/하거나 당업계에서 이전에 기재된 것에 대한 유용한 대안을 제공하고자 한다.
하전된 물질의 전달을 용이하게 하는 탄화수소 구조를 갖는 이온화 가능한 또는 양이온성 지질이 본원에서 제공된다. 상기 하전된 물질은 핵산과 같은 음으로 하전된 물질 또는 양으로 하전된 물질일 수 있다. 본원에 기재된 지질은 다양한 음전하 또는 양전하 물질의 전달을 용이하게 하기 위해 다양한 비-실린더 형상의 맞춤형 탄화수소 구조를 제공하기 위해 모듈식 방식으로 제조될 수 있다.
생리학적 pH에서 네트 전하를 갖고 선택적 링커 영역을 통해 지질 모이어티에 공유적으로 부착된 헤드 그룹을 포함하는 지질이 본원에 개시되어 있다. 상기 지질 모이어티는 선택적으로 시스 또는 트랜스 C=C를 갖고, 사슬 중 적어도 하나 이상은 선택적으로 링커 영역을 통해 이온화 가능한 헤드 그룹에 공유 부착된 2개 이상의 연결된 탄화수소 사슬을 갖는 탄화수소 구조를 포함한다. 상기 탄화수소 사슬은 선택적인 링커 영역을 통해 헤드 그룹에 부착된 사슬의 내부 탄소의 분기점에서 서로 결합되며, 이 분기점은 전기음성 원자를 갖는 본원에 추가로 기재된 X1 작용기를 포함한다. 상기 탄화수소 사슬은 각각 1 내지 40개 또는 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖고, 여기서 탄화수소 구조는 총 10 내지 150개의 탄소 원자를 포함한다.
하나의 실시양태에 따르면, 다음을 포함하는 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 하전된 지질이 제공된다: 생리학적 pH에서 네트 전하를 갖고 선택적인 링커 영역을 통해 지질 모이어티에 공유적으로 부착되는 헤드 그룹; 2개 이상의 연결된 탄화수소 사슬을 갖고, 선택적으로 시스 또는 트랜스 C=C를 갖고, 상기 사슬 중 적어도 하나 이상이 링커 영역을 통해 이온화 가능한 헤드 그룹에 공유 부착된 탄화수소 구조를 포함하는 지질 모이어티, 및 상기 탄화수소 사슬은 링커 영역에 부착된 탄화수소 사슬의 내부 탄소에서 분기점에서 서로 결합되고, 상기 분기점은 X1 작용기를 포함하고, 상기 X1 작용기는 -OC(O)-, -C(O)O-, -O-, -NR1-, -C(O)N(R1)-, N(R1)C(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R1)-, -N(R1)C(O)O-, -S-, -S-S-, -C(R1)=N-N-C(O)-, -C(O)-N-N=C(R1), -ON=C(R1)-, 또는 -C(R1)=NO-로부터 선택되며, 상기 탄화수소 사슬은 각각 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖고, 상기 탄화수소 구조는 총 10 내지 150개의 탄소 원자를 포함하고, 상기 R1은 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클로부터 독립적으로 선택된다.
하나의 실시양태에서, 2개 이상의 연결된 탄화수소 사슬은 하기 화학식 III의 구조를 갖는다:
<화학식 III>
Figure pct00001
상기 식에서, L1', L1", L1''' 및 L1''''은 1 내지 30개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고, 선택적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 포함하고 L1'은 링커 영역에 공유적으로 부착된 탄화수소 사슬이다.
추가 실시양태에 따르면, 상기 탄화수소 구조는 링커 영역을 통해 헤드 그룹에 결합된 소수성 사슬 L2를 추가로 포함하고, 여기서 L2는 선택적으로 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 갖는 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 사슬이거나, L2는 하기 화학식 IIIa의 구조를 갖는다:
Figure pct00002
상기 식에서, L2', L2", L2''' 및 L2''''는 1개 내지 30개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고, 선택적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 포함하고, 여기서 L2'는 링커 영역에 공유적으로 부착된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 탄화수소는 링커 영역을 통해 헤드 그룹에 결합된 탄화수소 사슬, L3을 추가로 포함하고, 여기서, L3은 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖고, 선택적으로 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 가지거나, 또는 하기 화학식 IIIa의 구조를 갖는다:
Figure pct00003
상기 식에서, L3', L3", L3''' 및 L3''''는 1개 내지 30개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고, 임의로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 포함하고, 여기서 L3'는 링커 영역에 공유적으로 부착된다.
추가 실시양태에서, 상기 지질은 X1 연결을 통해 L1에 결합된 1 내지 10개의 측쇄 S를 추가로 포함할 수 있고, 각각의 측쇄는 임의로 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 갖는 1 내지 30개의 원자를 갖거나, 또는 하기 화학식 IIIb의 구조를 갖는다:
Figure pct00004
상기 식에서, S1', S1", S1''' 및 S1''''은 1개 내지 30개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고, 임의로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 포함하고, 여기서 S1'은 L1의 탄소에 결합된다.
추가 실시양태에 따르면, 상기 지질은 X1 연결을 통해 L2에 결합된 1 내지 10개의 측쇄 S를 추가로 포함할 수 있고, 각각의 측쇄는 1 내지 30개의 원자를 가지며, 선택적으로 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 갖거나, 또는 화학식 IIIb의 구조를 갖는다:
Figure pct00005
상기 식에서, S2', S2", S2''' 및 S2''''는 1개 내지 30개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고, 선택적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 포함하고, 여기서 S2'는 L2의 탄소에 결합된다.
추가 실시양태에서, 상기 지질은 X1 연결을 통해 L3에 결합된 1 내지 10개의 측쇄 S를 추가로 포함하고, 각각의 측쇄는 1 내지 30개의 원자를 갖고, 선택적으로 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 갖거나, 또는 화학식 IIIb의 구조를 갖는다:
Figure pct00006
상기 식에서, S3', S3", S3''' 및 S3''''는 1개 내지 30개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고, 선택적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C 결합을 포함하고, 여기서 S3'는 L3의 탄소에 결합된다.
대안적인 실시양태에서, X1의 1회 이상의 발생은 생분해성이다.
추가 실시양태에서, 상기 링커 영역을 통해 헤드 그룹에 결합된 탄화수소 사슬은 내부 탄소 원자에 결합된 하이드록실, 아미노, 및/또는 아미드로부터 선택되는 하나 이상의 반응성 그룹을 갖는 지질로부터 유래되고, 탄화수소 구조에서 스캐폴드 탄소 사슬로 작용하고 탄화수소 구조에서 적어도 하나 이상의 다른 탄화수소 사슬은 아실 지질에서 유래하며, 상기 X1 연결은 스캐폴드 탄소 사슬 상의 반응기와 아실 사슬의 카르복실산의 반응에 의해 형성된다.
추가 실시양태에서, 상기 지질은 디-히드록시 지질(di-hydroxy lipid)이다.
상기 헤드 그룹은 5.0 내지 9.0 사이의 pKa 또는 5.5 내지 8.0 사이의 pKa를 지질에 부여할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 상기 헤드 그룹은 화학식 I의 구조를 갖는다.
추가 실시양태에서, 상기 탄화수소 구조에 결합된 링커 영역은 화학식 IIa 또는 IIb의 구조를 갖는다.
추가 실시양태에서, 상기 탄화수소 구조는 형상이 비-실린더형(non-cylindrical)이다.
추가 실시양태에서, 상기 지질은 수용액에서 다른 지질과 조합하여 지질 나노입자로 조립될 수 있다.
추가 실시양태에서, 지질을 형성하는 다른 소포체는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딘산(phosphatidic acid), 세라마이드(ceramides), 스핑고미엘린(sphingomyelin) 또는 친수성 폴리머-지질 접합체(hydrophilic polymer-lipid conjugate)를 포함한다.
추가로 제공되는 것은 지질 이중층 또는 이의 단층에 통합된 전술한 실시양태 중 어느 하나의 지질을 포함하고 핵산 또는 펩티드를 포함하는 약물 전달 비히클(vehicle) 제형이다.
하나의 실시양태에서, 상기 핵산은 소간섭 RNA(small interfering RNA), 소활성 RNA(small activating RNA), 메신저 RNA(messenger RNA), 마이크로 RNA(micro RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 리보자임(ribozyme), 앱타머(aptamer), 플라스미드(plasmid), 원형 DNA(circular DNA), 선형 DNA(linear DNA), 안타고미르(antagomir), 항-miRNA 올리고뉴클레오티드(anti-miRNA oligonucleotide) 또는 miRNA 모방체(miRNA mimic)이다.
추가 실시양태에서, 상기 약물 전달 비히클 제제는 지질 나노입자(LNP)를 포함한다.
이러한 지질을 제조하기 위한 편리한 방법이 추가로 제공된다.
이러한 실시양태는 관심 분자를 전달하는데 사용하기 위해 하전된 지질의 탄화수소 구조를 제조하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(i) O, P, N 및/또는 S로부터 선택된 원자를 포함하는 반응성 그룹을 내부 탄소 상에 갖는 탄화수소 사슬을 제공하는 단계; 및
(ii) 탄화수소 구조를 생성하기 위해 반응성 그룹 또는 그룹을 통해 탄와수소 사슬을 하나 이상의 아실 사슬에 접합시키고, 여기서 탄화수소 구조는 형상이 비-실린더형인 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 반응성 그룹 또는 그룹은 각각의 아실 사슬의 접합시 각각의 X1 연결을 형성한다.
또한, 상기 방법에 의해 생성된 지질이 제공된다.
화학식 I의 구조를 갖는 분지형 지질 모이어티 L을 포함하는 하전된 지질을 추가로 제공한다:
<화학식 I>
A-(V)m-Z-L
상기 식에서, A는 생리학적 pH에서 전하를 띠는 헤드 그룹이며;
(V)m은 선택적 -(CR1R2)-이고 m은 1~10 또는 2~6이며, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 hydrogen, 선택적으로 치환된 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 사이클로알킬(cycloalkyl), 사이클로알킬알킬(cycloalkylalkyl), 또는 헤테로사이클(heterocycle)이거나 선택적으로 치환된 모노-(mono-), 바이-(bi-), 또는 트리-사이클릭 탄소고리(tri-cyclic carbon ring) 또는 4 내지 12개 고리 원자를 갖는 헤테로원자고리(heteroatom ring)로부터 독립적으로 선택되며;
Z-L은 하기 화학식 II, 화학식 IIa 또는 화학식 IIb의 구조를 갖는다:
화학식 II 선형 링커 구조:
X1-Lb
상기 식에서, X1은 선택적이고 X1은 에테르, 에스테르 및 카바메이트 그룹(group)으로부터 선택되며;
Lb는 화학식 IIIc의 분지형 지질이다;
화학식 IIa 분지형 링커 구조:
Figure pct00007
상기 식에서, W는 선택적이며,
W는 존재하는 경우 X1 연결, N-C(O), N-C(O)O 또는 N-OC(O)이고;
상기 W는 D로 선택적으로 치환되고, 이는 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클이며;
(X)n의 각 발생은 독립적으로 선택된 -(CR1R2)-이고; (X)n의 n은 0 내지 10이고; T는 선택적이고, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클이고, 여기서 T는 선택적으로 치환되며;
B는 각각의 G1 및 G2를 통해 L1 및 L2에 연결된 탄소 원자이며;
상기 G1 및 G2는 X1으로부터 독립적으로 선택되고, G1 및 G2 각각은 독립적으로 선택적으로 선행되고 (G)u에 공유 결합되며, 상기 G는 독립적으로 선택된 -(CR1R2)- 이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 또는 헤테로사이클이고, u는 0 내지 16이며;
상기 G3은 선택적이고 X1에서 선택되고, 선택적으로 선행되고 (G)u에 공유 결합되며;
L1은 화학식 IIIc의 분지형 탄화수소이며;
L2는 1 내지 20개의 탄소 원자 및 0 내지 2개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 탄화수소 사슬이거나 화학식 IIIc의 구조를 가지며;
존재하는 경우 L3는 수소, 1 내지 20개 탄소 원자 및 0 내지 2개 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬, 또는 화학식 IIIc의 구조를 갖는다;
화학식 IIb 고리 구조:
Figure pct00008
상기 식에서, 곡선은 고리를 나타내고, E 및 K는 고리의 구조를 부분적으로 형성하는 원자를 나타내며, 고리는 3 내지 8개의 고리 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 고리이고;
상기 L1, L2 및 L3 중 적어도 하나 이상은 선택적으로 각각의 G1, G2 및 G3을 통해 고리의 단일 원자에 결합되고, 상기 G1, G2 및 G3 각각은 독립적으로 선택적으로 선행되고 (G)u에 공유 결합되며;
상기 화학식 IIb의 L1 및 선택적으로 L2 및/또는 L3는 하기 화학식 IIIc의 구조를 갖는다:
<화학식 IIIc>
Figure pct00009
상기 식에서, L 백본(backbone)은 L1' - L1''- G1- CH-[CH2]q-CH3로 표시되고, 상기 백본에서 탄소 원자의 총 개수는 10 내지 30개 이며;
L1'은 선형 탄화수소 사슬이고 5-20, 6-20, 7-20, 8-20, 5-12, 5-10, 5-9, 6-12, 6-10, 6-9, 7 -12, 7-10, 또는 7-9개의 탄소 원자 및 0-3개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 가지며;
L1''은 탄소 원자이며;
L1'''은 G1-CH-CH2-CH3로 표시되며, 상기 G1은 선택적으로 하나의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 0-4개의 탄소 원자의 탄화수소 사슬이며;
상기 n은 0 내지 4이고;
상기 p는 1 내지 4이고;
상기 n + p는 1 내지 4이고;
q는 0 내지 20이고;
각각의 X1은 에테르, 에스테르 및 카바메이트 그룹으로부터 독립적으로 선택되며;
상기 각 S 및 L1'''' 탄화수소 측쇄는 독립적으로:
(a) 0 내지 5개의 시스 또는 트랜스 C=C 및 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖고 탄화수소 사슬의 임의의 탄소 원자에서 각각의 X1 중 하나에 접합된 선형 또는 분지형 말단 탄화수소 사슬 또는
(b) 화학식 IIIc의 분지형 탄화수소 구조이며,
상기 화학식 IIIc에서 L1'''' 및 S 탄화수소 사슬의 총 수는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4 또는 1 내지 3개이며;
상기 지질 모이어티의 L1'''' 및 S 탄화수소 사슬 각각은 헤테로원자로 임의로 치환되지만, 단 2개 이하의 헤테로원자가 탄화수소 사슬에서 치환된다.
다른 실시양태에서, 화학식 I의 Z-L은 화학식 II의 구조(선형 링커 구조)를 갖는다:
X1-Lb;
상기 식에서, 화학식 IIIc의 L1'은 5 내지 9개의 탄소 원자 및 0 내지 2개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 가지며;
상기 화학식 IIIc의 G1은 존재하지 않고, CH2 또는 CH2CH=CH이고, 상기 이중 결합은 시스 또는 트랜스이며;
상기 화학식 IIIc의 L1'''' 및 S는 0 내지 5개의 시스 또는 트랜스 CH=CH 및 2 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소로부터 독립적으로 선택되며;
상기 화학식 IIIc의 스캐폴드 백본은 CH2-L1''-G1-CH-CH2-CH3(L1'''는 8 내지 30개의 탄소 원자임)로 표시되며;
상기 q는 1 내지 9이다.
다른 실시양태에서, 화학식 I의 (V)m은 (CH2)m이고, 상기 m은 1 내지 20이며;
Z-L은 화학식 IIa의 구조(분지형 링커 구조)를 갖는 것을 특징으로 하는 하전 지질:
<화학식 IIa>
Figure pct00010
상기 식에서, W는 에테르(ether), 에스테르(ester) 또는 카바메이트(carbamate) 그룹이고 D는 존재하지 않고, (X)n은 (CH2)n이고, 여기서 n은 1 내지 10이며;
상기 G1 및 G2는 존재하고 각각의 (G)u에 선행하고 공유 결합되며, 여기서 (G)u는 CH2이고;
상기 G3-L3은 존재하고, CH3 및 CH2CH3로부터 선택된 탄화수소이며; 또는 상기 G3-L3은 CH2X1L3이고 L3은 1 내지 20개의 탄소 원자 및 0 내지 2개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬이거나 화학식 IIIc의 구조를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 Z-L은 화학식 IIb의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 하전 지질:
화학식 IIb 고리 구조:
Figure pct00011
상기 식에서 곡선은 고리를 나타내고 E 및 K는 고리의 구조를 부분적으로 형성하는 원자를 나타내며, 상기 고리는 3 내지 6개의 고리 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 탄소 고리이다.
하나의 실시양태에서, 상기 고리는 3 또는 5개의 탄소 원자를 포함한다. 추가 실시양태에서, 적어도 L1 및 L2가 존재하고 각각의 G1 및 G2 그룹을 통해 고리에 부착되며, 상기 각 G1 및 G2는 선택적으로 Gu가 선행되며, 상기 u는 0 내지 10 또는 0 내지 6이다.
화학식 I의 헤드 그룹 A는 하기로부터 선택될 수 있다:
(i) 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이온화 가능한 양이온성 모이어티:
Figure pct00012
(ii) 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 영구적으로 하전된 모이어티:
Figure pct00013
(iii) 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이온화 가능한 음이온성 모이어티:
Figure pct00014
; 또는
(iv) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 쌍이온성(zwitterionic) 모이어티:
Figure pct00015
하나의 실시양태에서, 화학식 I의 탄화수소 구조 L은 형태가 비-실린더형이다.
추가 실시양태에서, 상기 지질은 수용액에서 다른 지질과 혼합되어 지질 나노입자로 조립될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 지질을 형성하는 다른 소포체(vesicle)는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파디딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파디딜세린(phosphatidylserine), 포스파디딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파디딘산(phosphatidic acid), 세라마이드(ceramides), 스핑고미엘린(sphingomyelin) 또는 친수성 중합체-지질 접합체(hydrophilic polymer-lipid conjugate)를 포함한다.
추가로 지질 이중층 또는 이의 단층에 통합된 전술한 실시양태의 지질을 포함하며, 핵산, 단백질 또는 펩타이드인 카고 분자 또는 화합물을 포함하는 악물 전달 비히클 제형을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 상기 핵산은 소간섭 RNA(small interfering RNA), 소활성 RNA(small activating RNA), 메신저 RNA(messenger RNA), 마이크로 RNA(micro RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 리보자임(ribozyme), 앱타머(aptamer), 플라스미드(plasmid), 원형 DNA(circular DNA), 선형 DNA(linear DNA), 안타고미르(antagomir), 항-miRNA 올리고뉴클레오티드(anti-miRNA oligonucleotide) 또는 miRNA 모방체(miRNA mimic)이다.
하나의 실시양태에서, 상기 약물 전달 비히클은 하전된 펩티드를 포함한다.
추가 실시양태에서, 상기 약물 전달 비히클은 지질 나노입자(LNP)이다.
다양한 비-제한적인 실시예가 본원에 설명되어 있다.
하전된 물질(charged material) 전달에 사용되는 지질의 구조
본원에 기재된 지질은 하기에 기재된 탄화수소 구조를 갖는 헤드 그룹 A 및 지질 모이어티 L을 갖는다. 상기 헤드 그룹 A는 생리학적 pH에서 하전되고 일부 실시양태에서 이온화 가능하지만, 영구적으로 하전된 그룹도 본 개시내용에 포함된다. 상기 헤드 그룹 H는 생리학적 pH에서 다른 하전된 그룹을 포함할 수 있지만 생리학적 pH에서 네트 전체 양전하 또는 음전하를 갖는다. 상기 하전된 지질은 1가(mono-valent) 또는 다가(multi-valent)일 수 있다.
상기 지질 모이어티 L은 일반적으로 탄화수소 구조 내에서 추가적인 탄화수소 사슬 또는 그룹을 접합하기 위한 스캐폴드로서 기능하는 탄소 사슬 또는 사슬을 갖는 탄화수소 구조로 구성된다. 또 다른 유리한 실시양태에서, 상기 지질 모이어티 L은 히드록시 또는 작용기를 갖는 다른 지질로부터 유래된 탄화수소 사슬로 적어도 부분적으로 구성되고 탄화수소 구조의 스캐폴드 성분으로서 작용한다. 상기 하이드록스-지질(들)(hydrox-lipid(s))은 차례로 아실 지질로부터 유래된 하나 이상의 탄화수소 사슬에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 "스캐폴드 탄소 사슬(scaffold carbon chain)"은 본원에 기재된 작용기를 통해 상기 지질 모이어티 L의 또 다른 탄화수소 사슬에 대한 공유 접합에 의해 이러한 스캐폴드 기능을 제공하는 탄소 사슬이다 (예를 들어, "X1 작용기(X1 functional group)", "X1 연결(X1 linkage)" 또는 본원에 사용된 기타 유사한 관례). 하나의 실시예에서, 상기 X1 작용기는 그룹 내의 원자로서, 또는 선택적으로 그룹 내의 단독 원자로서 N, O, S 또는 P와 같은 음전기 원자를 갖는 그룹을 포함하고, 다른 스캐폴드 탄소 사슬을 포함하여 하나 이상의 탄화수소 사슬에 스캐폴드 탄소 사슬의 공유 결합을 제공한다. 적절한 X1 작용기의 실시예는 에스테르이지만, 에테르 및 카바메이트그룹을 포함하는 다른 그룹이 당업자에 의해 용이하게 구상될 수 있다.
상기 스캐폴드 탄소 사슬은 본원에 기재된 바와 같이 히드록실 그룹을 갖는 전구체 지질로부터 유래될 수 있다. 이러한 지질은 일반적으로 하이드록시 지질이라고 하며 자연적으로 발생하거나 실험실에서 합성될 수 있다. 에스테르 그룹을 생성하기 위해, 예를 들어 탄화수소 사슬의 히드록실기는 축합 반응을 통해 다른 탄화수소 사슬의 카르복실산과 반응할 수 있다. 그러나, 탄화수소 구조의 제조 방법은 다양한 상이한 합성 경로가 본원에서 고려되기 때문에 임의의 특정 제조 방법으로 제한되지 않는다.
스캐폴드로 하이드록실화 지질에서 유래된 하전된 지질의 구조의 실시예는 도 1A 및 1B에 설명되어 있다. 상기 지질 모이어티(L)는 지질 모이어티(L) 내의 1, 2 또는 3개의 탄화수소 그룹을 통해 헤드 그룹 A에 연결될 수 있다.
도 1A는 선택적으로 링커 그룹을 통해 지질 모이어티 L 내의 하나의 탄화수소에 접합된 단순 헤드 그룹(A)을 갖는 본 개시내용에 포함되는 하전된 지질을 도시한다. 이 실시양태에서 제1 지질 사슬은 히드록시-지질로부터 유래된다. 상기 히드록시-지질은 차례로 히드록시-지질로부터 유래된 하나 이상의 추가 지질 사슬에 접합될 수 있다. 이러한 지질 사슬은 아실 지질에서 유래된 하나 이상의 탄화수소 사슬에 추가로 접합된다.
도 1B는 선택적으로 링커 그룹을 통해 지질 모이어티 L 내의 2개의 탄화수소에 접합된 헤드 그룹(A)으로 제조된 본 개시내용에 포함되는 하전된 지질을 도시한다. 이 실시예에서 상기 헤드 그룹에 접합된 두 개의 탄화수소는 하이드록시 지질에서 파생된다. 2개의 지질 각각은 차례로 히드록시-지질로부터 유래된 또 다른 각각의 지질에 접합되고 이러한 지질에 아실 지질로부터 유래된 하나 이상의 탄화수소 사슬이 추가로 접합된다.
그러나, 도 1은 단지 선택된 실시예의 예시일 뿐이며 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 스캐폴드 탄소 사슬은 대안적으로 지방산 아민, 지방산 아미드 및/또는 분지형 지방산 에스테르로부터 생성될 수 있다.
본 개시내용의 하나의 실시예에서, 상기 지질은 생리학적 pH에서 네트 양전하 또는 음전하를 갖고 링커 영역(본원에서 "링커(linker)"로도 지칭됨)을 통해 지질 모이어티에 공유적으로 부착된 헤드 그룹을 포함하고, 2개 이상의 연결된 탄화수소 사슬을 갖고, 선택적으로 시스 또는 트랜스 C=C를 갖고, 사슬 중 적어도 하나 이상이 링커 영역을 통해 이온화 가능한 헤드 그룹에 공유 부착된 탄화수소 구조를 포함하는 지질 모이어티를 포함하며, 상기 탄화수소 사슬은 링커 영역에 부착된 사슬의 내부 탄소의 분지점에서 서로 결합되고, 이 분지점은 X1 작용기를 포함하고, 상기 X1 작용기는 -OC(O)-, -C(O)O-, -O-, -NR1-, -C(O)N(R1)-, N(R1)C(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R1)-, -N(R1)C(O)O-, -S-, -S-S-, -C(R1)=N-N-C(O)-, -C(O)-N-N=C(R1), -ON=C(R1)-, 또는 -C(R1)=NO-로부터 선택되고, 여기서 상기 탄화수소 사슬은 각각 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖고, 상기 탄화수소 구조는 총 10 내지 150개의 탄소 원자를 포함하고, 여기서 R1은 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클로부터 독립적으로 선택된다.
추가 실시양태에서, 상기 하전된 지질의 탄화수소 구조는 비-실린더형인 형태를 갖는다. 많은 인지질은 모양이 일반적으로 실린더형인 친유성 성분을 형성하는 글리세롤 골격에 연결된 탄화수소 사슬(2개의 지방산 사슬로 형성됨)을 가지고 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 탄화수소 구조는 "플레어형(flared)" 구조(형상이 "절두원추형(frusto-conical)"이라고도 함)를 형성하는데, 이는 상기 탄화수소 구조가 길이를 따라 임의의 지점에서 직경이 1.2 이상임을 의미하며, 상기 헤드 그룹의 가장 큰 직경보다 1.5배 이상 또는 2배 이상 크다. 이러한 형태는 핵산 또는 다른 하전 분자를 세포로 형질감염시키는 것을 용이하게 할 수 있다는 점에서 유리하다.
다른 실시양태에서, 상기 하전된 지질의 탄화수소 구조는 3개 이상의 탄화수소 사슬을 갖고, 3개 이상의 탄화수소 사슬 각각은 전술한 X1 연결을 통해 그의 내부 탄소에서 또 다른 사슬에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 지질 모이어티는 2 내지 20 또는 3 내지 18개의 공액 탄화수소 사슬을 갖는 탄화수소 구조를 갖는다. 하나의 실시양태에서 탄화수소 구조는 나팔 모양의 비-실린더 구조를 형성하는 연결된 탄화수소 사슬의 격자 또는 매트릭스로 설명될 수 있다. 상기 연결 지점은 선택적으로 각각의 생분해성 기능이거나, 환자에게 투여한 후 생체내에서 측정할 때 연결 지점 중 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상이 생분해성이다.
다양한 헤드 그룹이 고려되지만, 한 실시예에서 상기 헤드 그룹은 말단 아민 그룹과 같은 이온화 가능한 아미노 그룹을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 헤드 그룹은 포스페이트 그룹을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 아민은 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민이다. 4차 아민이 헤드 그룹에 사용되는 경우, 상기 지질은 헤드 그룹에 다른 이온화 가능한 그룹의 존재 여부에 따라 이온화되지 않을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 헤드 그룹은 비-쌍이온성이다.
L의 탄화수소 구조에서 탄화수소 사슬을 연결하는 X1 연결 각각은 동일하거나 상이할 수 있음을 이해해야 한다. 즉, 각 X1은 상기에 나열된 X1 연결 그룹에서 독립적으로 선택될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 X1 연결은 -OC(O)-, -C(O)O-, 및 -O-로부터 선택된다. 추가의 대안적인 실시양태에서, 상기 X1 연결은 생분해성인 임의의 공유 결합이다. 상기 X1 연결은 또한 pH에 민감할 수 있으며, 분열은 주변 용액의 pH에 따라 달라지는 것을 의미한다.
추가 실시양태에서, 상기 탄화수소 구조는 하나 이상의 히드록시 지질 및 하나 이상의 아실 지질로부터 생성되고, 여기서 하나 이상의 히드록시 지질은 스캐폴드 탄소 사슬로서 기능하여 상기 하나 이상의 아실 지질에 접합시킨다.
추가 실시양태에서, 상기 지질은 5.0 내지 9.0 또는 5.5 내지 8.5 또는 5.0 내지 8.0의 겉보기 pKa를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 하전 지질(예를 들어, 양이온성 또는 이온화 가능한 지질)은 리포솜을 포함하나 이에 제한되지 않는 지질 나노입자로 제형화될 수 있다.
추가 실시양태에서, 상기 하전된 지질은 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:
<화학식 I>
A-(V)m-Z-L
상기 식에서, A는 생리학적 pH에서 전하를 띠는 헤드 그룹이며;
(V)m은 선택적 -(CR1R2)-이고 m은 1~10 또는 2~6이며, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 hydrogen, 선택적으로 치환된 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 사이클로알킬(cycloalkyl), 사이클로알킬알킬(cycloalkylalkyl), 또는 헤테로사이클(heterocycle)이거나 선택적으로 치환된 모노-(mono-), 바이-(bi-), 또는 트리-사이클릭 탄소고리(tri-cyclic carbon ring) 또는 4 내지 12개 고리 원자를 갖는 헤테로원자고리(heteroatom ring)로부터 독립적으로 선택되며;
Z-L은 하기 화학식 II, 화학식 IIa 또는 화학식 IIb의 구조를 갖는다.
화학식 II는 선형 링커 구조이다:
X1-Lb
상기 식에서, X1은 선택적이고 X1은 에테르, 에스테르 및 카바메이트 그룹(group)으로부터 선택되며;
Lb는 화학식 IIIc의 분지형 지질이다.
본 개시내용의 다른 실시예에서, 상기 하전된 지질은 아미노산 지질이며 하기 화학식 Ia를 갖는다:
<화학식 Ia>
Figure pct00016
상기 식에서, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 또는 헤테로사이클이며;
상기, 선택적으로 R1, R2 및 R3는 부존재(또는 고립전자쌍(lone pair))하거나 수소이고;
V의 각 발생은 독립적으로 선택된 -(CR1R2)-이고, m은 1에서 10 또는 2에서 6이다.
화학식 I의 Z-L 또는 화학식 Ia의 아미노 지질의 Z-L1은 하기 나타낸 화학식 II, 화학식 IIa 또는 화학식 IIb로 표시될 수 있다:
<화학식 II>
X1-Lb,
상기 식에서, X1은 선택적이고, 하나의 실시양태에서 X1은 에테르, 에스테르 및 카바메이트 그룹으로부터 선택되며;
Lb는 화학식 III, IIIa 또는 IIIc의 분지형 지질이다.
<화학식 IIa>
Figure pct00017
W는 선택적이며,
W는 존재하는 경우 -OC(O)-, -C(O)O-, -O-, -NR1-, -C(O)N(R1)-, N(R1)C(O)-, -NC(O)R1-,-OC(O)O-, -OC(O)N(R1)-, -N(R1)C(O)O-, -S-, -S-S-, C(R1)=N-N-C(O)-, C(O)-N-N=C(R1), -ON=C(R1), 또는 C(R1)=NO-이고;
상기 W는 D로 선택적으로 치환되고, 이는 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클이며;
(X)n의 각 발생은 독립적으로 선택된 -(CR1R2)-, 또는 독립적으로 선택된 선택적으로 치환된 모노-, 바이-, 트리-사이클릭 탄소 고리 또는 4 내지 12개의 고리 원자를 갖는 헤테로원자 고리이고; (X)n의 n은 0 내지 10이고; T는 선택적이고, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클이고,
B는 선택적으로 G1을 통해 L1에 공유 부착된 탄소, 산소, 질소 원자이고; 선택적으로 각각의 G2 및 G3 그룹을 통해 독립적으로 선택된 L2 및/또는 L3을 선택적으로 추가로 부착하고;
상기 G1, G2 및 G3은 -OC(O)-, -C(O)O-, -O-, -NR1-, -C(O)N(R1)-, N(R1)C(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R1)-, -N(R1)C(O)O-, -S-, -S-S-, C(R1)=N-N-C(O)-, C(O)-N-N=C(R1), -ON=C(R1), 또는 C(R1)=NO-로부터 선택되며, 여기서 G1, G2 및 G3 각각은 독립적으로 선택적으로 선행되고, (G)u에 공유 결합되며, 여기서 G는 독립적으로 선택된 -(CR1R2)-이고 u는 0 내지 10이며;
<화학식 IIb>
Figure pct00018
W는 선택적이며,
W는 존재하는 경우, -OC(O)-, -C(O)O-, -O-, -NR1-, -C(O)N(R1)-, N(R1)C(O)-, -NC(O)R1-,-OC(O)O-, -OC(O)N(R1)-, -N(R1)C(O)O-, -S-, -S-S-, C(R1)=N-N-C(O)-, C(O)-N-N=C(R1), -ON=C(R1), 또는 C(R1)=NO-이며;
상기 W는 D로 선택적으로 치환되고, 이는 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클이며;
여기서, 상기 곡선은 고리를 나타내고 E 및 K는 고리의 구조를 부분적으로 형성하는 임의의 원자를 나타내며, 고리는 치환되거나 비-치환된, 모노-, 바이- 또는 트리-사이클릭 탄소 고리 또는 4 내지 12개의 고리 원자를 갖는 모노-, 바이- 또는 트리-사이클릭 탄소 고리이며;
화학식 Ia 및 Ib에서 L2 및 L3는 선택적 수소 원자 또는 1 내지 40개의 탄소 원자를 갖고 임의적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C 이중 결합을 가지거나 화학식 IIIa의 구조(이하 기재됨)를 갖는 탄화수소 사슬이고;
여기서 L1, L2 및 L3 중 2개는 곡선으로 표시되는 고리의 단일 원자에 선택적으로 결합되고;
상기 화학식의 L, Lb, L1 및 선택적으로 L2 및/또는 L3은 바로 하기 기재된 화학식 III의 구조를 갖는 지질 모이어티이다. 대안적으로, 상기 지질 모이어티는 하기 기재된 화학식 IIIa 또는 화학식 IIIc를 포함하는 구조를 포함한다.
<화학식 III>
Figure pct00019
상기 식에서, L1', L1", L1''' 및 L1''''은 1 내지 30개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고, 선택적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C를 포함하고;
상기 X1은 -OC(O)-, -C(O)O-, -O-, -NR1-, -C(O)N(R1)-, N(R1)C(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R1)-, -N(R1)C(O)O-, -S-, -S-S-, C(R1)=N-N-C(O)-, C(O)-N-N=C(R1), -ON=C(R1), 또는 C(R1)=NO-이며;
여기서, 화학식 III은 각각 독립적으로 1 내지 30개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 선택되는 1 내지 10개의 측쇄 S를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C 또는 스테롤을 포함하고, 여기서 적어도 하나 이상의 S는 연결을 통해 L1', L1'', L1''' 및/또는 L''''의 탄소 원자에 공유적으로 부착된 X1이다.
상기 하전된 지질(예를 들어, 이온화 가능한 지질)은 거울상 이성질체의 혼합물이거나 단일 광학 이성질체를 함유할 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 상기 X1 그룹은 생분해성일 수 있으며, 이는 개체에 투여한 후 절단될 수 있음을 의미한다. 제한 없이, 에스테르 결합은 환자에게 투여된 후 에스테라제에 의해 가수분해되어 지질로부터 탄화수소 사슬을 방출할 수 있다. 효소에 의해 또는 pH 변화에 반응하여 가수분해될 수 있는 다른 그룹도 본 개시내용에 포함된다. 그러나, 상기 X1 그룹도 생분해되지 않는 그룹일 수 있음을 이해해야 한다.
하나의 실시양태에서, 상기 지질은 생체적합성 알코올에 가용성이고, 전달 비히클 내로의 혼입 및 소간섭 RNA, 소활성 RNA, 메신저 RNA, 마이크로RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 앱타머, 플라스미드, 원형 DNA, 선형 DNA, 안타고미르, 안티-miRNA 올리고뉴클레오티드, miRNA 모방체 또는 유전자 편집 물질과 같은 핵산의 공동-캡슐화를 용이하게 한다.
헤드 그룹 (Head group) (A)
지질은 종종 하나 이상의 탄화수소 사슬에 공유 부착된 헤드 그룹(본원에서 "A"로 표시됨)을 갖는 것으로 편리하게 표시된다. 선택적으로, 상기 헤드 그룹 A는 링커 영역에 의해 탄화수소 사슬 또는 사슬에 부착된다. 적절한 헤드 그룹 및 링커 영역은 하기에 설명되어 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 헤드 그룹은 이온화 가능한, 영구적으로 하전된 또는 쌍이온성인 모이어티로부터 선택된다. 상기 헤드 그룹은 pH 7.4(생리학적 pH)를 포함하여 주어진 pH 값 또는 범위에서 지질에 양전하 또는 음전하를 부여할 수 있다.
이러한 각 범주에 속하는 화학 그룹의 실시예는 다음과 같다:
(i) 이온화 가능한 양이온성 모이어티:
Figure pct00020
(ii) 영구적으로 하전된 모이어티:
Figure pct00021
(iii) 이온화 가능한 음이온성 모이어티:
Figure pct00022
; 또는
(iv) 쌍이온성(zwitterionic) 모이어티:
Figure pct00023
일반적으로, 상기 지질의 헤드 그룹 A는 상대적으로 작고 생리학적 pH에서 하전된다. 하나의 비-제한적인 실시양태에서, 이러한 헤드 그룹은 말단 이온화 가능한 아민 그룹 포함하지만, 포스페이트 및 설페이트 그룹과 같은 그룹이 본원에서도 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 헤드 그룹은 5 내지 8의 겉보기 pKa를 이온화 지질에 부여하거나 5.5 내지 7.5의 pKa를 이온화 지질에 부여하는 말단 이온화 아민 그룹을 갖는다. 상기 아미노 그룹의 pKa는 헤드 그룹의 이웃 원자에 의해 영향을 받을 수 있음을 이해할 것이다. 설페이트 또는 포스페이트를 함유하는 헤드 그룹은 지질에 전반적인 음전하를 부여할 수 있다.
상기 아민 그룹은 1차, 2차 또는 3차 아민 그룹일 수 있다. 상기 헤드 그룹은 동일하거나 상이한 2개 또는 3개의 아민 그룹과 같은 추가 아민 그룹을 함유할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 헤드 그룹의 아민 부분은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00024
상기 식에서, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 또는 헤테로사이클이고; 여기서 R1, R2 및 R3 중 하나는 부존재(고립전자쌍)하거나 수소이다.
상기 헤드 그룹이 양전하를 띠는 실시양태에서, 이러한 그룹은 포스페이트 그룹을 보유하지 않는데, 이는 이 그룹이 음전하를 부여하여 전하 중성인 지질을 생성할 수 있기 때문이다. 그러나, 상기 지질의 전체 전하가 생리학적 pH에서 양수인 경우 이러한 그룹은 헤드 그룹에 포함될 수 있다.
선택적으로, 상기 헤드 그룹은 환자에게 지질 또는 이의 제형을 투여한 후 순환 수명을 개선하는 중합체를 포함하는 친수성 중합체에 접합된다. 이러한 친수성 중합체의 비-제한적인 실시예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 헤드 그룹이 하전될 때, 상기 지질은 염으로서 존재할 수 있다. 임의의 약학적으로 허용되는 염이 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
선택적 링커 영역(Optional linker region)
이온화 가능한 아민 그룹에 더하여, 상기 지질은 1, 2 또는 3개의 지질 사슬에 공유 부착을 허용하는 하나 이상의 전기음성 원자를 갖는 영역을 포함할 수 있으며, 그 중 적어도 하나 이상은 스캐폴드 탄소 사슬이다. 상기 지질 내의 그러한 영역은 링커 영역, 또는 간단히 "링커(linker)"로 지칭될 수 있고 탄화수소 사슬 또는 사슬들이 헤드 그룹에 직접 연결될 수 있기 때문에 선택적이다.
상기 링커의 화학 구조는 헤드 그룹에 부착된 지질 사슬의 수에 따라 달라질 수 있으나, 그 구조 내에 에스테르, 에테르, 글리세라이드 링커, 글리세라이드 링커의 유도체 또는 탄소 또는 헤테로원자로 이루어진 다원 고리(multi-membered rings)를 포함하는 고리형 링커를 포함할 수 있다.
상기 헤드 그룹에 부착된 링커 영역은 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00025
상기 식에서, (V)m-Z는 헤드 그룹 A에 하나의 말단 및 탄화수소 영역인 L1에 다른 말단이 부착된 링커 영역을 나타낸다.
상기 화학식의 Z-L1 부분은 함께 전술한 화학식 II, 화학식 IIa 또는 화학식 IIb로 표시될 수 있다.
선택적으로, 상기 링커 영역은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 순환 수명을 개선하는 중합체를 포함하는 친수성 중합체에 접합된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 헤드-링커 그룹(head-linker groups)의 다양한 상이한 조합이 본 개시내용에 포함된다. 상기 링커 영역은 그에 부착된 탄화수소 사슬의 수에 의해 특징지어질 수 있다. 대안적으로, 상기 링커는 선형, 분지형 또는 고리형으로 기재될 수 있다. 각 카테고리의 실시예는 하기에 나타내었다.
단일 탄화수소 사슬을 부착하는 링커 영역을 갖는 헤드 그룹의 비-제한적 실시예는 하기에 제공된다:
Figure pct00026
2개의 탄화수소 사슬을 부착하는 링커 영역을 갖는 헤드 그룹의 비-제한적 실시예는 하기에 제공된다:
Figure pct00027
3개의 탄화수소 사슬을 부착하는 링커 영역을 갖는 헤드 그룹의 비-제한적 실시예는 하기에 제공된다:
Figure pct00028
링커 영역은 또한 선형, 분지형 또는 고리형으로 설명될 수 있다. 선형, 분지형 및 고리형 링커 영역의 실시예는 각각 상기 기재된 화학식 II, IIa 및 IIb에 기재되어 있다.
지질 모이어티 L (Lipid Moiety L)
지질 모이어티 L은 헤드 그룹에 직접 또는 링커 영역을 통해 부착된 탄화수소 구조 내에 1, 2 또는 3개의 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 하나의 탄화수소 사슬만이 헤드 그룹 또는 링커 영역에 부착된 실시양태에서, 추가적인 탄화수소 측쇄 S가 L1의 내부 탄소에 연결될 수 있다.
따라서, 최소한, 하나의 실시양태에서, 상기 헤드 그룹은 이에 부착되거나 링커를 통해, 화학식 III의 구조를 갖는 지질 모이어티인 L1을 갖는다:
<화학식 III>
Figure pct00029
상기 식에서, L1', L1", L1''' 및 L1''''는 선택적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C를 포함하는, 1 내지 30개의 원자, 또는 1 내지 20개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고;
상기 X1은 -OC(O)-, -C(O)O-, -O-, -NR1-, -C(O)N(R1)-, -N(R1)C(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R1)-, -N(R1)C(O)O-, -S-, -S-S-, C(R1)=N-N-C(O)-, -C(O)-N-N=C(R1), -ON=C(R1), 또는 -C(R1)=NO-이다.
선택적으로, 상기 헤드 그룹은 선택적으로 링커, 지질 모이어티인 L2, 또는 추가의 L3 지질 모이어티에 부착되어 있다. 상기 선택적 L2 및 L3 지질 모이어티는 각각 독립적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C를 포함하는 1 내지 30개의 원자, 또는 1 내지 20개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬, 또는 스테롤로부터 선택될 수 있다. L2 및/또는 L3는 선택적으로 하기 화학식 IIIa의 지질일 수 있다.
<화학식 IIIa>
Figure pct00030
상기 식에서, Ln'은 링커에 공유적으로 부착된다.
화학식 IIIa의 명명법에 따르면, L이 L2인 경우 n은 2이고, L이 L3인 경우 n은 3이다. 예를 들어, L2 탄화수소의 경우, 화학식 IIIa는 다음 명명법을 적용한다.
Figure pct00031
화학식 III 또는 IIIa는 (S)n으로 도시된 1 내지 20개의 측쇄 S를 임의로 포함하고, 상기 n은 0 내지 20이고, 각각은 선택적으로 하나 이상의 시스 또는 트랜스 C=C, 또는 스테롤을 포함하는 1 내지 30개의 원자, 또는 1 내지 20개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고, 상기 (S)n은 X1인 연결을 통해 L1, L2 및/또는 L3의 탄소 원자에 공유적으로 부착되거나 이러한 연결을 통해 탄화수소 구조의 또 다른 측쇄 S에 공유 결합된다. 하나의 실시양태에서, 상기 X1 연결은 에스테르 연결과 같은 생분해성이다. 그러나, 생분해성 이외의 다른 연결이 본 발명의 수행에 사용될 수 있다.
예를 들어, L1은 X1 연결을 통해 L1', L1''' 또는 L1'''' 중 어느 하나에 접합된 측쇄 S1'을 가질 수 있다. 추가 측쇄 S1'', S1''' 또는 S1''''은 L1의 탄소 또는 S1 측쇄에 부착될 수 있다. 추가 실시예에서, L2가 상기 화학식 IIIa의 구조를 갖는다면, L2는 L2', L2''' 또는 L2'''' 중 어느 하나에 부착된 측쇄 S2'를 가질 수 있다. 추가 측쇄 S2'', S2''' 및 S2''''는 L2의 탄소 또는 S2 측쇄에 부착될 수 있다. 마찬가지로, L3가 존재하고 상기 화학식 IIIa를 갖는다면, L3', L3''' 또는 L3'''' 중 어느 하나에 부착된 측쇄 S3'를 가질 수 있다. 추가 측쇄 S3'', S3''' 및 S3''''는 L3의 탄소 또는 S3 측쇄에 부착될 수 있다.
아래에 주석이 달린 구조 A는 L1의 X1 연결 및 소수성 영역을 묘사하기 위해 본원의 화학식 III에서 사용된 관례를 예시한다. X1의 각 발생은 상기 구조에서 다른 X1으로부터 독립적으로 선택되는 것으로 이해될 것이다. 논의된 바와 같이, 상기 X1 그룹은 전기음성 원자를 갖는 임의의 적합한 작용기를 포함한다.
나타낸 실시예는 L1의 탄소에 연결된 측쇄 S와 함께 상기의 화학식 III에 따른 단일 L1 지질 탄화수소 사슬(L1', L1'' 및 L1''')을 갖는 아미노 지질이다:
구조 A (INT-A001):
Figure pct00032
상기에 묘사된 구조 A(INT-A001)에서 볼 수 있는 바와 같이, L1', L1'' 및 L1'''은 함께 디하이드록시 지질에서 파생된 선형 탄화수소 백본(본원에서 "스캐폴드 탄소 사슬(scaffold carbon chain)"로 지칭됨)을 형성한다. 이 탄화수소 사슬, L1'-L1''-L1'''은 X1 연결을 통해 L1''''을 L1'-L1''-L1'''의 L1'' 탄소에 연결하고 두 번째 S "측쇄(side chain)" 탄화수소 사슬은 두 번째 X1 연결을 통해 L1'''에 접합된다. 이 구조에서, X1 연결은 모두 에스테르 그룹이다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, 상기 X1 작용기는 O, N, P 및/또는 S 원자를 함유하는 다양한 작용기로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
1, 2 또는 3개의 탄화수소 사슬에 부착된 헤드 그룹 내에 링커 영역을 갖는 지질의 예는 하기 표 1에 제공된다. 도시된 각 지질에 대해, 화학식 III의 L1의 치환기 L1'/L''/L'''/L'''', 뿐만 아니라 선택적 L2 및 L3 탄화수소 사슬이 제공된다. 또한, 화학식 IIa 또는 IIb에 의해 정의된 바와 같은 헤드 그룹 및 링커 영역의 구조가 제공된다. 각 경우에, 상기 X1 그룹은 탄화수소 사슬을 서로 연결하여 상호 연결된 탄화수소 격자 구조를 형성하는 에스테르이다. 하기 구조에서 볼 수 있듯이, L의 상호 연결된 탄화수소 구조는 일반적으로 나팔 모양 또는 원뿔대 모양을 형성한다.
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
상기 지질 모이어티를 설명하기 위한 대체 명명법은 화학식 IIIc이다:
<화학식 IIIc>
Figure pct00044
상기 식에서, L 백본(backbone)은 L1’ - L1''- G1- CH-[CH2]q-CH3로 표시되고, 상기 백본에서 탄소 원자의 총 개수는 10 내지 30개 이며;
L1'은 선형 탄화수소 사슬이고 5-20, 6-20, 7-20, 8-20, 5-12, 5-10, 5-9, 6-12, 6-10, 6-9, 7 -12, 7-10, 또는 7-9개의 탄소 원자 및 0-3개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 가지며;
L1''은 탄소 원자이며;
L1'''은 G1-CH-CH2-CH3로 표시되며;
G1은 선택적으로 하나의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 0-4개의 탄소 원자의 탄화수소 사슬이며;
상기 n은 0 내지 4이고;
상기 p는 1 내지 4이고;
상기 n + p는 1 내지 4이고;
q는 0 내지 20 또는 0 내지 10 또는 1 내지 5이고;
각각의 X1은 상기 기재된 임의의 적합한 X1 그룹이거나, 에테르, 에스테르 및 카바메이트 그룹으로부터 독립적으로 선택되며;
상기 각 S 및 L1'''' 탄화수소 측쇄는 독립적으로:
(c) 0 내지 5개의 시스 또는 트랜스 C=C 및 1 내지 30개 또는 2 내지 18개의 탄소 원자를 갖고 탄화수소 사슬의 임의의 탄소 원자에서 각각의 X1 중 하나에 접합된 선형 또는 분지형 말단 탄화수소 사슬; 또는
(d) 화학식 IIIc의 분지형 구조,
화학식 IIIc에서 L1'''' 및 S 탄화수소 사슬의 총 수는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4 또는 1 내지 3개이며;
상기 지질 모이어티의 L1'''' 및 S 탄화수소 사슬 각각은 헤테로원자로 임의로 치환되지만, 단 4, 3 또는 2개 이하의 헤테로원자가 탄화수소 사슬에서 치환된다.
상기 X1 에스테르 그룹은 하기에 예시된 바와 같이 카르보닐기의 위치에 대해 임의의 배향일 수 있다:
Figure pct00045
하나의 실시양태에서, 화학식 IIIc의 총 탄소 원자 수는 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50개를 초과하지 않는다.
다른 실시양태에서, 화학식 IIIc의 구조는 상기 헤드 그룹 또는 링커 영역에 인접한 영역으로부터 탄화수소 구조 상의 원위 탄소 원자까지 결정될 때 비원추형 또는 나팔 모양의 형태이다. 언급된 바와 같이, 이러한 구조는 지질이 전달 비히클에서 제형화될 때 카고 분자의 전달을 촉진한다.
스캐폴드 탄소 사슬(Scaffold carbon chain)
하나의 실시양태에서, 스캐폴드 기능을 제공하는 L1, L2 및/또는 L3 지질 모이어티의 백본 탄화수소 사슬은 측쇄 S에 대한 연결을 위한 작용기를 갖는 지방산으로부터 유래된다. 이는 O, N, P 및/또는 S로부터 선택된 원자를 갖는 그룹으로 치환된 지방산을 포함한다. 이러한 그룹은 스캐폴드를 구성하는 L1, L2 및/또는 L3의 백본 탄소에 대한 측쇄 또는 사슬의 접합을 촉진한다.
예를 들어, L1, L2 및/또는 L3은 탄소 사슬의 임의의 위치에 결합된 OH 기를 갖는 지방산인 히드록시 지방산(hydroxy fatty acid, HFA)으로부터 유도될 수 있다. 제한 없이, 상기 HFA는 β-히드록시 지방, ω-히드록시 지방산 또는 임의의 (ω-1)-히드록시 지방산, 또는 탄소 백본의 내부 탄소에서 반응성 작용기를 갖는 임의의 다른 HFA일 수 있다. 상기 HFA는 포화되거나 불포화될 수 있다. 2개 이상의 하이드록시 작용기가 탄소 사슬에도 존재할 수 있다.
L1, L2 및/또는 L3은 대안적으로 히드록실 지방산의 지방산 에스테르(FAHFA)로서 당업계에 공지된 HFA의 분지형 지방산 에스테르로부터 유도된다. 이러한 지방산 에스테르는 지방산과 HFA 사이의 분지형 에스테르 결합을 포함한다. 예를 들어, 9-[(9Z)-옥타데세노일옥시]옥타데칸산(9-[(9Z)-octadecenoyloxy]octadecanoic acid)은 올레산(oleic acid)의 카르복실기와 9-히드록시옥타데칸산(9-hydroxyoctadecanoic acid)의 히드록시기를 축합하여 얻은 지방산 에스테르이다.
대안적인 실시양태에서, L1, L2 및/또는 L3은 아민 성분으로서 에탄올아민을 포함할 수 있는 지방산 아미드로부터 유도된다. 더 나아가, L1, L2 및/또는 L3은 지방산 아민으로부터 유도될 수 있다.
화학식 III의 스캐폴드 탄소 사슬은 상기 기재된 것 이외의 다른 지방산으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 지방산은 차례로 이들의 상응하는 트리글리세리드(tri-glycerides)로부터 유도될 수 있음이 이해될 것이다.
화학식 III, IIIa 및 IIIb에서, L1', L1'' 및 L1'''은 함께 선형 탄화수소 백본(본원에서 "스캐폴드 탄소 사슬(scaffold carbon chain)"로 지칭됨)을 형성한다. 상기 화학식 IIIc에 따르면, 상기 스캐폴드 탄소 사슬은 L1' - L1''- G1-CH-[CH2]q-CH3로 표시되며, 여기서 스캐폴드의 총 탄소 원자 수는 10 내지 30이다.
제형(Formulations)
상기 양이온성 또는 이온화 가능한 지질은 소간섭 RNA(small interfering RNA), 소활성 RNA(small activating RNA), 메신저 RNA(messenger RNA), 마이크로 RNA(micro RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 리보자임(ribozyme), 앱타머(aptamer), 플라스미드(plasmid), 원형 DNA(circular DNA), 선형 DNA(linear DNA), 안타고미르(antagomir), 항-miRNA 올리고뉴클레오티드(anti-miRNA oligonucleotide) 및 miRNA 모방체(miRNA mimic) 및/또는 유전자-편집 물질(gene-editing material)을 포함하나 이에 제한되지 않는 핵산의 캡슐화를 용이하게 한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 음으로 하전된 단백질 및 아미노산은 전달 비히클에 포함될 수 있다.
본원에 기재된 하전된 지질은 핵산 외에 다른 하전된 분자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 이는 생물활성제와 전구약물을 모두 포함하는 다양한 양전하 또는 음전하를 띤 펩타이드, 단백질, 다당류 또는 탄수화물이 포함되며, 이들의 실시예는 하기에 설명되어 있다.
본원에 기술된 양이온성 또는 이온화 가능한 지질은 핵산 또는 다른 음으로 또는 양으로 하전된 카고 분자와 함께 유리 형태로 투여될 수 있거나, 이러한 성분은 전달 비히클에 포함될 수 있다. 다양한 전달 시스템을 사용하여 약학적 제형을 제조할 수 있다. 상기 하전된 지질 및 관련된 하전된 분자가 유리 형태인 경우, 약학적으로 허용되는 염 또는 부형제가 약학적 제제에 포함될 수 있다.
본 개시내용의 지질은 특히 본원에서 "지질 나노입자(lipid nanoparticle)" 또는 "LNP"로 지칭되는 지질 또는 기타 소수성 성분을 포함하는 리포솜 또는 중합체-기반 시스템과 같은 나노입자에 혼입될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 주어진 지질 나노입자로의 로딩 효율은 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 가장 유리하게는 80% 내지 100%이다.
하나의 실시양태에서, 상기 지질은, 예컨대 베시클(vesicle) 형성 지질 및 선택적으로 스테롤을 포함하는 지질 제형 성분과 혼합함으로써 리포좀과 같은 지질 나노입자 내로 로딩된다. 그 결과, 이온화 가능하거나 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자는 압출, 에탄올 주입 및 인-라인 혼합을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 광범위하게 잘 설명된 제형 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 방법은 Maclachlan, I. and P. Cullis, "Diffusible-PEG-lipid Stabilized Plasmid Lipid Particles", Adv. Genet., 2005. 53PA:157-188; Jeffs, L.B., et al., “A Scalable, Extrusion-free Method for Efficient Liposomal Encapsulation of Plasmid DNA”, Pharm Res, 2005, 22(3):362-72; and Leung, A.K., et al., “Lipid Nanoparticles Containing siRNA Synthesized by Microfluidic Mixing Exhibit an Electron-Dense Nanostructured Core”, The Journal of Physical Chemistry. C, Nanomaterials and Interfaces, 2012, 116(34): 18440-18450에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
하전된 지질 외에 지질 나노입자에 포함될 수 있는 다른 지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 세라마이드 또는 기타 지질과 같은 소포 형성 지질을 포함한다. 콜레스테롤은 상전이 온도를 넓히기 위해 LNP에 포함될 수도 있다. LNP는 또한 예를 들어 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-PEG(distearoylphosphatidylethanolamine-PEG)와 같은 친수성 중합체와 접합된 지질을 포함할 수 있다. 친수성 폴리머와 같은 표면 안정화 기능은 투여 후 나노입자의 클리어런스를 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 LNP 제형은 또한 세포내이입(endocytosis)을 통해 전달 비히클과 표적 세포의 융합을 촉진하는 융합성 지질을 포함할 수 있다.
적합한 LNP는 공지된 방법에 의해 압출에 의해 제조된 리포솜 또는 다중-라멜라 소포(multi-lamellar vesicles, MLV)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 리포솜의 내부 공간은 약물과 같은 포획된 제제를 포함할 수 있거나, 이중층 또는 이중층은 내부에 분할된 이러한 제제를 포함할 수 있다.
적합한 LNP 전달 시스템의 또 다른 예는 SNALP라고 하는 안정한 핵산-지질 입자이다. 상기 SNALP는 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 선택적인 친수성 중합체-지질 접합체, 예컨대 PEG화 지질(PEGylated lipid) 및 융합성 지질과 관련된 핵산을 포함할 수 있다.
지질 나노입자는 친유성 코어(lipophilic core)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 전달 비히클은 또한 계면활성제에 의해 안정화된 지질 코어를 포함하는 나노입자일 수 있다. 소포체-형성 지질은 안정화제로 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서 지질 나노입자는 안정화 지질에 의해 둘러싸인 중합체 나노입자 코어를 포함하는 중합체-지질 하이브리드 시스템(polymer-lipid hybrid system)이다.
나노입자는 대안적으로 지질이 없는 중합체로부터 제조될 수 있다. 이러한 나노입자는 중합체 쉘로 둘러싸인 약물의 농축된 코어를 포함할 수 있거나 중합체 매트릭스 전체에 분산된 고체 또는 액체를 가질 수 있다.
본원에 기재된 지질은 또한 오일 액적(oil droplets) 또는 오일 코어를 함유하는 약물 전달 비히클인 에멀젼에 혼입될 수 있다. 에멀젼은 지질 안정화될 수 있다. 예를 들어, 에멀젼은 지질의 단층 또는 이중층과 같은 유화 성분에 의해 안정화된 오일 충전 코어를 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 지질은 또한 미셀(micelles)로 제형화될 수 있다. 미셀은 소수성 코어에 존재하는 제제의 전달에 사용되는 양친매성 지질 또는 중합체 성분으로 구성된 자가-조립 입자(self-assembling particles)이다.
상기 하전된 지질이 제형화될 수 있는 당업자에게 공지된 약물 전달 비히클의 추가 부류는 탄소 나노튜브이다.
전술한 전달 비히클의 제조 및 그 내부에 하전된 지질의 혼입을 위한 다양한 방법이 공지되어 있고 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
본 개시내용에 포함되는 특정 지질은 담체-프리 시스템(carrier-free system)의 일부를 형성할 수 있다. 그러한 실시양태에서, 음으로 하전된 분자와 관련된 지질은 입자로 자가-조립될 수 있다. 실시예는 DNA와 양이온성 지질 사이의 결합인 리포플렉스(lipoplex)의 형성이다. 이러한 제형은 선택적으로 약학적으로 허용되는 염 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.
양이온성 또는 이온화 가능한 지질을 포함하는 전달 비히클은 또한 비히클에 포함된 활성제, 예를 들어 항암제 또는 전구약물을 포함하는 다른 치료제를 포함할 수 있다.
상기 전달 비히클은 선택적으로 아포지질단백질(apolipoprotein)과 같은 지질단백질을 포함할 수 있다.
핵산, 유전 물질, 단백질, 펩티드 또는 기타 하전 물질의 전달
논의된 바와 같이, 본원에 개시된 하전된 지질은 순 음전하 또는 양전하를 지닌 분자(본원에서 "카고(cargo)" 또는 "카고 분자(cargo molecule)"라고도 함)의 전달 비히클 내로의 혼입 및 시험관내 또는 생체내 표적 세포로의 후속 전달을 촉진한다.
하나의 실시양태에서, 상기 분자는 핵산과 같은 유전 물질이다. 상기 핵산은 제한 없이 소간섭 RNA(siRNA), 소핵 RNA(small nuclear RNA, snRNA), 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하는 RNA, 또는 플라스미드 DNA 또는 선형 DNA와 같은 DNA를 포함한다. 상기 핵산 길이는 다양할 수 있고 5-50,000개 뉴클레오티드 길이의 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 하이브리드를 포함하는 임의의 형태일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides)를 포함한다.
하나의 특히 유리한 실시양태에서, 상기 카고는 siRNA이다. siRNA는 내인성 세포 기계에 통합되어 mRNA 분해를 일으켜 전사를 방지한다. RNA는 쉽게 분해되기 때문에, 전달 비히클에 결합하면 이러한 분해를 줄이거나 방지할 수 있어 표적 사이트로의 전달이 용이해진다.
유전자 편집 시스템(Gene editing systems)은 또한 하전된 지질을 포함하는 전달 비히클에 포함될 수 있다. 이는 Cas9-CRISPR, TALEN 및 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease) 유전자 편집 시스템을 포함한다. Cas9-CRISPR의 경우, Cas9 단백질을 인코딩하는 플라스미드 또는 mRNA와 함께 가이드 RNA(gRNA)가 본원에 기술된 양이온성 지질을 포함하는 전달 비히클에 통합될 수 있다. 선택적으로, 리보핵단백질 복합체(ribonucleoprotein complex)는 본원에 기술된 양이온성 지질을 포함하는 전달 비히클에 혼입될 수 있다. 유사하게, 본 개시내용은 징크 핑거 뉴클레아제 또는 TALEN 시스템의 DNA 결합 및 절단 도메인을 인코딩하는 유전 물질이 이온화 가능하거나 양이온성 지질과 함께 전달 비히클에 혼입되는 실시양태를 포함한다.
상기 하전된 지질은 또한 전체 전하를 갖는 단백질 및 펩티드를 전달 비히클에 혼입시키는 것을 촉진할 수 있다. 이는 선형 또는 비-선형 펩티드가 모두 포함된다. 펩티드의 실시예는 세균/항생제 펩티드(bacterial/antibiotic peptides), 진균 펩티드(fungal peptides), 무척추동물 펩티드(invertebrate peptides), 양서류/피부 펩티드(amphibian/skin peptides), 독 펩티드(venom peptides), 암/항암 펩티드(cancer/anticancer peptides), 백신 펩티드(vaccine peptides), 면역/항-염증 펩티드(immune/anti-inflammatory peptides), 뇌 펩티드(brain peptides), 내분비 펩티드(endocrine peptides), 섭취 펩티드(ingestive peptides), 위장 펩티드(gastrointestinal peptides), 심혈관 펩티드(cardiovascular peptides), 신장 펩티드(renal peptides), 호흡기 펩티드(respiratory peptides), 아편 펩티드(opiate peptides), 신경 영양 펩티드(neurotrophic peptides), 및 혈액-뇌 펩티드(blood-brain peptides)를 포함한다. 펩티드의 구체적인 실시예는 상기에 제공되어 있다.
본원에 기재된 하전 지질과 연관될 수 있는 펩티드의 특정 실시예는 인터페론 및 기타 대식세포 활성화 인자이다. 이는 림포카인(lymphokines), 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide, MDP), γ-인터페론, α-인터페론 및 β-인터페론, 관련된 항바이러스제 및 종양 제거제; 아편 펩티드 및 신경 펩티드를 포함하며, 이는 엔카팔린(enkaphalins), 엔도르핀(endorphins), 다이노르핀(dynorphins), 기타 진통제(analgesics); 예를 들어 항고혈압제를 포함하는 레닌 억제제(renin inhibitors); CCK, 세룰레타이드(ceruletide) 및 엘레도이신(eledoisin)과 같은 콜레시스토키닌(cholecystokinins) (CCK 유사체), 및 관련된 심혈관-표적화제 및 CNS-표적화제; 옥시토신(oxytocin), 및 기타 항염증, 옥시토시드(oxytocid) 및 낙태 화합물을 포함하는 류코트리엔(leukotrienes) 및 프로스타글란딘(prostaglandins); 에리트로포이에틴(erythropoietin) 및 이의 유도체(deratives), 뿐만 아니라 관련된 헤마틴(haematinics); 류프롤리드(leuprolide,), 부세렐린(buserelin) 및 나파렐린(nafarelin)과 같은 LHRH 유사체, 및 뇌하수체 수용체의 관련 하향 조절제; 부갑상선 호르몬 및 기타 성장 호르몬 유사체; Dnase, 카탈라아제 및 알파-I 항트립신(alpha-I antitrypsin)과 같은 효소; 사이클로스포린(cyclosporin)과 같은 면역억제제; GM-CSF 및 기타 면역조절제; 및 인슐린(insulin)을 포함한다.
투여(Administration)
특정 실시양태에서, 유리 또는 약물 전달 비히클에서 제형화된 핵산 또는 다른 하전 분자와 관련된 하전 지질은 환자의 상태를 치료, 예방 및/또는 개선하기 위해 투여된다. 특히, 핵산 또는 다른 하전 물질과 함께 전달 비히클에서 제형화된 또는 유리 형태의 하전된 지질은 예방의(prophylactic)(예방적(preventive)), 개선 또는 치료적 이점을 제공할 수 있다. 상기 하전된 지질을 포함하는 약학적 조성물은 임의의 적합한 투여량으로 투여될 것이다. 하나의 실시양태에서, 약물 전달 비히클에 존재하지 않거나 제형화된 지질은 비경구, 즉, 동맥내, 정맥내, 피하 또는 근육내로 투여된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 전달 비히클에 제형화된 또는 유리 형태의 지질은 국소 투여될 수 있다. 또 다른 대안적 실시양태에서, 본원에 기재된 전달 비히클에 제형화된 또는 유리 형태의 지질은 경구 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 유리 형태 또는 전달 비히클에서 제형화된 지질은 에어로졸 또는 분말 분산에 의한 폐 투여를 위한 것이다.
본원에 기재된 조성물은 "환자(patient)"를 포함하는 임의의 개체에 투여될 수 있으며, 여기에는 본원에 사용된 바와 같이 인간 또는 비-인간 개체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 지질은 환자 및 배양된 세포로부터 수득된 줄기 세포를 비롯한 세포의 시험관내 형질감염에 사용된다. 하나의 실시양태에서, 상기 형질감염된 세포는 줄기 세포이고 이전에 얻은 환자에게 다시 투여된다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라 단지 예시의 목적으로 제공된다.
도 1A는 선택적으로 링커 그룹을 통해, 지질 모이어티 L 내의 하나의 탄화수소 사슬에 접합된 단순 헤드 그룹(simple head group)(H)을 갖는 본 개시내용에 포함되는 아미노 지질을 도시한다. 상기 헤드 그룹에 접합된 지질 사슬은 히드록시-지질(hydroxy-lipid)로부터 유래되고, 이는 차례로 히드록시-지질로부터 유래된 하나 이상의 추가 지질 사슬에 접합된다. 이러한 지질 사슬은 아실 지질(acyl lipid)에서 유래된 하나 이상의 탄화수소 사슬에 추가로 접합된다.
도 1B는 선택적으로 링커 그룹을 통해, 지질 모이어티 L 내의 2개의 탄화수소에 접합된 헤드 그룹으로 제조된 본 개시내용에 포함되는 아미노 지질을 도시한다. 상기 헤드 그룹에 결합된 두 개의 탄화수소는 하이드록시 지질에서 유래된다. 상기 히드록시 지질로부터 유래된 2개의 지질 사슬 각각은, 차례로 히드록시-지질로부터 유래된 또 다른 각각의 지질 사슬에 접합되고, 이러한 지질은 아실 지질로부터 유래된 하나 이상의 탄화수소 사슬에 추가로 접합된다.
도 2A는 22Rv1 세포를 발현하는 배양된 루시퍼라제에서 평가된 시험관내(in vitro) 아미노 지질의 활성을 나타낸다. 세포를 1.0㎍/mL(왼쪽 막대), 0.3㎍/mL(중간 막대) 및 0.1㎍/mL(오른쪽 막대) 농도의 본 개시내용의 이온화 가능한 지질 및 루시페라제 siRNA를 함유하는 지질 나노입자(LNP) 제형으로 처리하였다. 발광 수준을 처리 후 측정하였다. 상기 LNP에 통합된 이온화 가능한 지질은 2-(디메틸아미노)에틸(±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아레이트 (2-(dimethylamino)ethyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearate) (INT-A001), 3-(디에틸아미노)프로필 (±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아레이트 (3-(diethylamino)propyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearate) (INT-A002), 3-(디메틸아미노)프로필 (±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아레이트 (3-(dimethylamino)propyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearat)e (INT-A003), 2-(디에틸아미노)에틸 (±) 신-9,10-디리놀레스테아레이트 (2-(diethylamino)ethyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearate) (INT-A004) , 3-(디메틸아미노)프로필 (12R)-리놀레옥시올레이트 (3-(dimethylamino)propyl (12R)-linoleoxyoleate) (INT-A005), 3-(디에틸아미노)프로필 (신-9,10,12R)-트리리놀레옥시스테아레이트 (3-(diethylamino)propyl (syn-9,10,12R)-trilinoleoxystearate) (INT-A006), 및 3-(디에틸아미노)프로필 (±)-신-9,19-비스-(2-헥실데카노일옥시)스테아레이트 (3-(diethylamino)propyl (±)-syn-9,10-bis(2-hexyldecanoyloxy)stearate) (INT-A007)이다.
도 2B는 배양된 22Rv1 세포에서 1μg/mL siRNA 농도에서 시험관 내 아미노 지질의 활성을 나타낸다. 발광 수준은 처리 후 16-24시간에 측정되었으며, 상대적 발광은 최고(왼쪽)에서 최저(오른쪽)로 순위가 매겨졌다.
도 3은 마우스 FVII 모델에서 평가된 생체 내(in vivo) 아미노 지질의 활성을 나타낸다. 본 개시내용의 양이온성 지질 및 FVII siRNA를 함유하는 지질 나노입자(LNP) 제형을 C57BI/6 야생형 마우스에서 꼬리 정맥을 통해 주사하고 혈장 중 FVII의 수준을 주사 후 측정하였다. 상기 마우스에 0.03mg/kg(왼쪽 막대), 0.1mg/kg(중간 막대) 및 0.3mg/kg(오른쪽 막대)의 용량으로 LNP-siRNA를 주사하였다. 상기 LNP에 포함된 양이온성 지질은 INT-A001, INT-A002, INT-A003 및 INT-A007이었다.
도 4A는 배양된 HepG2 간세포에서 평가된 시험관 내 이온화 지질의 활성을 나타낸다. 세포를 0.125-1㎍/mL 농도에서 본 개시내용의 이온화 가능한 지질 및 루시페라제 mRNA를 함유하는 LNP 제형으로 처리하였다. 발광 수준을 처리 후 측정하였다. 왼쪽에서 오른쪽으로, LNP에 통합된 이온화 가능한 지질은 INT-A001(흰색 막대), INT-A002(점선 막대), INT-A003(검은색 막대) 및 INT-A004(회색 막대)였다.
도 4B는 마우스의 간에서 생체내 mRNA 발현을 나타낸다. 본 개시내용의 양이온성 지질 및 루시페라제 mRNA를 함유하는 지질 나노입자(LNP) 제형을 1 mg/kg의 mRNA 용량으로 C57BI/6 야생형 마우스에 꼬리 정맥을 통해 주사하고, 주사 후 간에서의 발광성을 측정하였다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 상기 LNP-mRNA에 포함된 양이온성 지질은 INT-A001, INT-A002, INT-A003 및 INT-A004였다. 처리되지 않은 동물에 인산완충식염수(PBS)를 주사하였다.
재료 및 방법
실시예 1에 기술된 유기 합성 반응의 경우, THF(질소 하에서 Na/benzophenone에서 새로 증류됨) 및 Et3N, DMF 및 CH2Cl2(질소 하에서 CaH2에서 새로 증류됨)를 제외하고, 모든 시약 및 용매는 상업적 공급업체로부터 구입하였고, 달리 명시되지 않는 한 추가 정제 없이 사용하였다. USP 등급 피마자유는 지역 약국(Life Brand)에서 구입하여 받은 그대로 사용하였다. NMR 화학적 이동은 δ 스케일에서 ppm(parts per million)으로 보고되고 커플링 상수 J는 헤르츠(Hz)로 표시된다. 스펙트럼은 잔류 용매의 신호를 참조한다. 다중도는 "s"(단일선), "d"(이중선), "t"(삼중선), "q"(4중선), "quint"(5중선), "sept"(7중선), "m"(다중선)으로 보고되며, "app"(명백한) 및 "br"(광범위한)으로 추가로 한정된다.
지질 나노 입자(LNP)는 중성 지질, 1, 2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) (DSPC) 및 1,20디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]) (PEG-DMPE) 뿐만 아니라, 스테롤(sterol), 콜레스테롤(cholesterol)로 제조된다. DSPC 및 PEG-DMPE는 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL)에서 구입했으며 콜레스테롤은 Sigma(St Louis, MO)에서 구입하였다.
상기 LNP는 입자 크기 및 다분산도(PdI)를 측정하여 특성화되었다. 상기 입자 크기 및 다분산도는 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK)를 사용하여 동적 광산란에 의해 결정되었다. LNP는 PBS에서 적절한 농도로 희석되었다. 수-가중 크기(Number-weighted size) 및 분포 데이터(distribution data)가 결정에 사용되었으며 PdI > 0.15인 제형은 추가 연구에 사용되지 않았다.
지질 농도는 Wako Chemicals USA(Richmond, VA)의 콜레스테롤 E 효소 분석 키트를 사용하여 총 콜레스테롤을 측정하여 결정하였다.
RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 캡슐화 효율은 각각 Quant-iT Ribogreen RNA 또는 Oligreen ssDNA Assays(Life Technologies, Burlington, ON)를 사용하여 결정되었다. 간단히 말해서, LNP를 1% Triton X-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 존재 또는 부존재하에 37℃에서 10분 동안 배양한 다음 Ribogreen 또는 Oligreen 시약을 첨가하였다. 상기 형광 강도(Ex/Em: 480/520 nm)가 결정되었고 Triton X-100으로 처리된 샘플은 전체 핵산을 나타내고 처리되지 않은 샘플은 캡슐화되지 않은 핵산을 나타낸다.
단백질/펩티드의 정량은 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석(Pierce) 또는 CBQCA 단백질 정량 키트(Invitrogen)를 사용하여 수행되었다.
LNP 시스템의 겉보기 산 해리 상수(pKa)는 문헌에 설명된 절차에 따라 결정되었다(Jayaraman, M., et al., Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo. Angewandte Chemie, 2012. 51(34): p. 8529-33). 간단히 말해서, 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 술폰산(2-(p-toluidino)-6-napthalene sulfonic acid) (TNS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 LNP를 pH 범위가 2.5 내지 11인 완충액(10mM HEPES, 10mM MES 및 10mM 암모늄 아세테이트)에서 희석하였다. TNS 또는 총 지질의 최종 농도는 6μM이었다. 그런 다음 샘플을 혼합하고 Perkin Elmer LS55를 사용하여 형광 강도를 측정하였다(Ex/Em: 321/445 nm). S자형 최적 적합 분석이 적용되었고, pKa는 최대 형광 강도의 절반에서 pH로 측정되었다.
실시예 1: 이온화 가능한 지질의 합성
Figure pct00046
일반 절차 A - 하이드록시 지방산의 에스테르화(Esterification of Hydroxy Fatty Acids)
하이드록실화 지방산(1.00 당량)을 콘덴서가 장착된 둥근 바닥 플라스크에서 MeOH(0.4-0.5 M)에 현탁시켰다. 농축된 황산(0.05 당량)을 상기 혼합물에 첨가하였고, 결과물을 환류하에 가열하였으며, 이는 5-15분 내에 균질하게 되었다. 16시간 후, 잔류 MeOH를 회전 증발기(rotary evaporator)에서 제거하고 잔류 잔류물을 에틸 아세테이트(EtOAc)와 포화 수성 NaHCO3 사이에 분배하였다. 수성 층을 EtOAc로 2회 추출하고, 조합한 유기 층을 물, 염수로 1회 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 중력 여과하고, 회전 증발기에서 농축하여 백색 분말을 얻었고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
일반 절차 B - 하이드록시 지방산 에스테르의 아실화(Acylation of Hydroxy Fatty Acid Esters)
N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 히드록실당 1.00 당량 + 추가 0.10 당량)를 아르곤 하에 둥근 바닥 플라스크에서 원하는 카르복실 산(히드록실당 1.00 당량 + 추가 0.10 당량)의 얼음처럼 차가운 CH2Cl2(0.3 M) 용액에 첨가하였다. 이어서, 얼음 수조(ice bath)를 제거하고 생성된 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 다시 얼음 수조에서 냉각하고 고체 하이드록시 지방산(1.00 당량)을 첨가한 후, 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine) (DMAP; 하이드록실 1.00 당량 + 추가 0.50 당량)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 16시간에 걸쳐 실온으로 가온시킨 다음, 헥산으로 희석하고, 10분 동안 교반한 다음, Celite® 패드를 통해 여과하였다. 상기 여과액을 회전 증발기에서 농축하여 조 혼합물을 수득하고 이로부터 원하는 아실화 물질을 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
일반 절차 C - 과아실화 지방산 메틸 에스테르의 비누화(Saponification of Peracylated Fatty Acid Methyl Esters)
수성 NaOH(2.0M, 1.00당량)를 아르곤 하에 둥근 바닥 플라스크에서 아실화 지방산 메틸 에스테르(1.10 당량)의 실온 t-BuOH(0.3M) 용액에 첨가하였다. 16시간 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 수성 HCl(2.0 M)을 첨가하여 pH≤2로 산성화하고 헥산으로 3회 추출하였다. 상기 조합한 유기 추출물을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 회전 증발기에서 농축하여 조 물질을 무색 오일로 수득하였다. 상기 조 물질을 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 지방산을 얻었다.
일반 절차 D - 아미노알코올을 사용한 과아실화 지방산의 에스테르화
DCC(1.10 당량)를 아르곤 하에 둥근 바닥 플라스크에 있는 지방산(1.00 당량)의 얼음처럼 차가운 CH2Cl2(0.2M) 용액에 첨가하였다. 얼음 수조를 제거하고 15분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 얼음 수조에서 다시 냉각시키고, 순수한 아미노알코올(1.20-2.00 당량)을 첨가한 다음, DMAP(1.20 당량)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 16시간에 걸쳐 실온으로 가온시켰다. 상기 반응 혼합물을 Et2O로 희석하고, 10분 동안 교반한 다음, Celite® 패드를 통해 여과하였다. 상기 여과액을 회전 증발기에서 농축하여 조 오일을 얻었고, 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 과아실화 아미노지질(peracylated aminolipids)을 얻었다.
Figure pct00047
메틸(12R)-리놀레옥시올레이트(Methyl (12R)-linoleoxyoleate)
일반 절차 B에 따라, CH2Cl2(5 mL) 중 메틸 리시놀레에이트(methyl ricinoleate) (500mg, 1.60mmol), 리놀레산(linoleic acid) (538mg, 1.92mmol, 1.20 당량), DCC(396mg, 1.20mmol, 2.20당량) 및 DMAP(293mg, 2.40mmol, 1.50 당량), 표제 화합물(875 mg, 93% 수율)을 투명한 무색 오일로서 수득하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.55-5.28 (m, 6H), 4.90 (quint, J = 6.2 Hz, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.79 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.40-2.21 (m, 6H), 2.16-1.93 (m, 6H), 1.72-1.46 (m, 8H), 1.46-1.18 (m, 32H), 1.00-0.80 (m, 6H).
Figure pct00048
메틸(±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아레이트(Methyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearate)
일반 절차 B에 따라, CH2Cl2(10 mL) 중 디히드록시 스테아레이트(dihydroxy stearate) (1.32g, 4.00mmol), 리놀레산(2.47g, 8.80mmol, 2.20 당량), DCC(1.82g, 8.80mmol, 2.20 당량) 및 DMAP(1.22g, 10 mmol, 2.50 당량) 표제 화합물(2.64 g, 77% 수율)을 투명한 무색 오일로 제공하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.47-5.28 (m, 8H), 5.04-4.94 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 2.79 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 2.35-2.25 (m, 6H), 2.11-2.00 (m, 8H), 1.69-1.47 (m, 10H), 1.44-1.16 (m, 48 H), 0.97-0.84 (m, 9H).
Figure pct00049
메틸 (±)-신-9,10-비스(2-헥실데카노일옥시)스테아레이트(Methyl (±)-syn-9,10-bis(2-hexyldecanoyloxy)stearate)
일반 절차 B에 따라, CH2Cl2(18mL) 중 디히드록시 스테아레이트(2.31g, 7.00mmol), (±)-2-헥실데칸산((±)-2-hexyldecanoic acid) (3.77g, 14.7mmol, 2.10 당량), DCC(3.03g, 14.7mmol, 2.10 당량) 및 DMAP(2.14g, 17.5mmol, 2.50 당량)로 표제 화합물(4.20g, 74% 수율)을 투명한 무색 오일로 제공하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.06-4.96 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.69-1.50 (m, 10H), 1.50-1.16 (m, 64H), 0.94-0.84 (m, 15H).
Figure pct00050
메틸-(신-9,10,12R)-트리리놀레옥시스테아레이트(Methyl (syn-9,10,12R)-trilinoleoxystearate)
일반 절차 B에 따라, CH2Cl2(10 mL) 중 트리하이드록시 스테아레이트(trihydroxy stearate) (1.04g, 3.00mmol), 리놀레산(2.61g, 9.30mmol, 3.10 당량), DCC(1.92g, 9.30mmol, 3.10 당량) 및 DMAP(1.28g, 10) mmol, 3.50 당량) 표제 화합물(2.33 g, 68% 수율)을 투명한 무색 오일로 제공하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.49-5.26(m, 12H), 5.14-4.84(m, 3H), 3.68(s, 3H), 2.79(brt, J = 6.0 Hz, 6H), 2.37-2.21 (m, 8H), 2.14-1.99 (m, 12H), 1.92-1.47 (m, 16H), 1.47-1.16 (m, 56 H), 0.96-0.84 (m, 12H).
Figure pct00051
(12R)-리놀레옥시올레산((12R)-Linoleoxyoleic acid)
일반 절차 C에 따라, 아실 메틸 에스테르(acyl methyl ester) (5.97g, 10.4mmol, 1.10 당량), 수성 NaOH(2.0M, 4.70mL, 1.00 당량) 및 t-BuOH(26mL)를 사용하여, 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 95:5:0→90:10:0→85:12:3 헥산/EtOAc/MeOH) 후, 투명한 무색 오일의 표제 화합물(4.48g, 85% 수율)을 수득하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.55-5.28 (m, 6H), 4.90 (quint, J = 6.2 Hz, 1H), 2.79 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.43-2.21 (m, 6H), 2.14-1.96 (m, 6H), 1.73-1.47 (m, 6H), 1.46-1.18 (m, 30H), 0.99-0.81 (m, 6H).
Figure pct00052
(±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아르 산((±)-syn-9,10-Dilinoleoxystearic acid) (INT-A008)
일반 절차 C에 따라, 디아실 메틸 에스테르(1.88g, 2.20mmol, 1.10 당량), 수성 NaOH(2.0M, 1.00mL) 및 t-BuOH(7mL)를 사용하여, 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 95:5:0→90:10:0→85:12:3 헥산/EtOAc/MeOH) 후, 투명한 무색 오일로서 INT-A008(1.50 g, 89% 수율)을 제공하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.47-5.28(m, 8H), 5.04-4.94(m, 2H), 2.79(brt, J = 6.0 Hz, 4H), 2.36 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.12-1.98 (m, 8H), 1.72-1.46 (m, 10H), 1.44-1.16 (m, 48 H), 0.97-0.84 (m, 9H).
Figure pct00053
(신-9,10,12R)-트리리놀레옥시스테아르산 ((syn-9,10,12R)-Trilinoleoxystearic acid)
일반 절차 C에 따라, 트리아실 메틸 에스테르(2.41g, 2.12mmol, 1.05당량), 수성 NaOH(2.0M, 1.01mL) 및 t-BuOH(7mL)를 사용하여, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 90:10:0→80:17:3 헥산/EtOAc/MeOH) 후, 투명한 무색 오일로서 트리아실화 지방산(1.37 g, 60% 수율)을 제공하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.47-5.26(m, 12H), 5.14-4.84(m, 3H), 2.79(brt, J = 6.0 Hz, 6H), 2.41-2.20 (m, 8H), 2.14-1.99 (m, 12H), 1.92-1.47 (m, 16H), 1.47-1.16 (m, 56 H), 0.96-0.84 (m, 12H).
Figure pct00054
(±)-신-9,10-비스(2-헥실데카노일옥시)스테아르산 ((±)-syn-9,10-Bis(2-hexyldecanoyloxy)stearic acid) (INT-A009)
일반 절차 C에 따라, 디아실 메틸 에스테르(4.20g, 5.21mmol, 1.05당량), 수성 NaOH(2.0M, 2.48mL) 및 t-BuOH(7mL)를 사용하여, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 95:5:0→90:10:0→85:12:3 헥산/EtOAc/MeOH) 후, 투명한 무색 오일로서 INT-A009(3.12 g, 79% 수율)를 제공하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.09-4.93(m, 2H), 2.41-2.23(m, 4H), 1.71-1.51(m, 10H), 1.51-1.15(m, 64H), 0.95-0.82(m, 15H).
Figure pct00055
3-(디메틸아미노)프로필(12R)-리놀레옥시올레이트(3-(Dimethylamino)propyl (12R)-linoleoxyoleate) (INT-A005)
일반 절차 D에 따라, CH2Cl2(3.5 mL) 중 카르복실산(carboxylic acid)(561mg, 1.00mmol), 아미노알코올(0.18mL, 1.20mmol, 1.20당량), DCC(227mg, 1.10mmol, 1.10당량) 및 DMAP(147mg, 1.20mmol, 1.20 당량)에 이어, 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 88:10:2→68:30:2 헥산/EtOAc/Et3N)로, 투명한 무색 오일로 INT-A005(639 mg, 95% 수율)를 얻었다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.54-5.23(m, 6H), 4.89(quint, J = 6.0 Hz, 1H), 4.12 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.78 (br t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.58-2.45 (m, 6 H), 2.29 (br q, J = 6.0 Hz, 6 H), 2.12-1.96 (m, 6H), 1.83-1.72 (m, 2H), 1.69-1.47 (m, 6H), 1.44-1.18 (m, 30 H), 1.02 (t, J = 7.1 Hz, 6 H), 0.94-0.84 (m, 6H).
Figure pct00056
2-(디메틸아미노)에틸(±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아레이트(2-(Dimethylamino)ethyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearate) (INT-A001)
일반 절차 D에 따라, CH2Cl2(2 mL) 중 카르복실산(336mg, 0.40mmol), 아미노알코올(0.12mL, 1.20mmol, 3.00 당량), DCC(91mg, 0.44mmol, 1.10당량) 및 DMAP(59mg, 0.48mmol, 1.20 당량)에 이어, 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 88:20:2→68:30:2→48:50:2 헥산/EtOAc/Et3N)로, 투명한 무색 오일로서 INT-A001(255 mg, 70% 수율)을 얻었다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.47-5.27(m, 8H), 5.04-4.94(m, 2H), 4.18(t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.79 (br t, J = 5.90 Hz, 4H), 2.57 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.39-2.24 (m, 9H), 2.30 (s, 3H), 2.13-1.99 (m, 8H), 1.70-1.46 (m, 10H), 1.44-1.16 (m, 48 H), 0.97-0.84 (m, 9H).
Figure pct00057
3-(디에틸아미노)프로필(±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아레이트(3-(Diethylamino)propyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearate) (INT-A002)
일반 절차 D에 따라, CH2Cl2(2 mL) 중 카르복실산(336mg, 0.40mmol), 아미노알코올(0.12mL, 0.80mmol, 2.00 당량), DCC(91mg, 0.44mmol, 1.10당량) 및 DMAP(59mg, 0.48mmol, 1.20 당량)에 이어서 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 78:20:2→68:30:2 헥산/EtOAc/Et3N)를 수행하여 투명한 무색 오일로 INT-A002(272 mg, 71% 수율)를 얻었다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.47-5.27(m, 8H), 5.04-4.94(m, 2H), 4.12(t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.79 (br t, J = 5.9 Hz, 4H), 2.59-2.46 (m, 6H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 6H), 2.12-1.99 (m, 8H), 1.78 (quint, J = 6.9 Hz, 2H), 1.70-1.46 (m, 10H), 1.44-1.16 (m, 48 H), 1.03 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.97-0.84 (m, 9H).
Figure pct00058
3-(디메틸아미노)프로필(±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아레이트 (3-(Dimethylamino)propyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearate) (INT-A003)
일반 절차 D에 따라, CH2Cl2(3 mL) 중 카르복실산(421mg, 0.50mmol), 아미노알코올(88L, 0.75mmol, 1.50 당량), DCC(113mg, 0.55mmol, 1.10 당량) 및 DMAP(73mg, 0.60mmol, 1.20 당량)에 이어서, 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 78:20:2→68:30:2 헥산/EtOAc/Et3N)로, 투명한 무색 오일로 INT-A003(323 mg, 70% 수율)을 얻었다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.47-5.27(m, 8H), 5.04-4.94(m, 2H), 4.13(t, J = 6.60 Hz, 2H), 2.79 (br t, J = 5.90 Hz, 4H), 2.39-2.25 (m, 8H), 2.24 (s, 3H), 2.13-1.99 (m, 8H), 1.81 (quint, J = 6.8 Hz, 2H), 1.70-1.46 (m, 10H), 1.44-1.16 (m, 48 H), 0.97-0.84 (m, 9H).
Figure pct00059
2-(디에틸아미노)에틸(±)-신-9,10-디리놀레옥시스테아레이트(2-(Diethylamino)ethyl (±)-syn-9,10-dilinoleoxystearate) (INT-A004)
일반 절차 D에 따라, CH2Cl2(3 mL) 중 카르복실산(421mg, 0.50mmol), 아미노알코올(80L, 0.60mmol, 1.20당량), DCC(113mg, 0.55mmol, 1.10당량) 및 DMAP(73mg, 0.60mmol, 1.20 당량)에 이어서, 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 78:20:2→68:30:2 헥산/EtOAc/Et3N)로 투명한 무색 오일로 INT-A004(406 mg, 86% 수율)를 얻었다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.47-5.27(m, 8H), 5.05-4.93(m, 2H), 4.15(t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.78 (br t, J = 5.9 Hz, 4H), 2.70 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.59 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 2.36-2.23 (m, 6H), 2.12-1.99 (m, 8H), 1.69-1.45 (m, 10H), 1.44-1.16 (m, 48 H), 1.05 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.97-0.84 (m, 9H).
Figure pct00060
3-(디에틸아미노)프로필(±)-신-9,10-비스(2-헥실데카노일옥시)스테아레이트(3-(Diethylamino)propyl (±)-syn-9,10-bis(2-hexyldecanoyloxy)stearate) (INT-A007)
일반 절차 D에 따라, CH2Cl2(4 mL) 중 카르복실산(595mg, 0.75mmol), 아미노알코올(0.13mL, 0.90mmol, 1.20당량), DCC(170mg, 0.82mmol, 1.10당량) 및 DMAP(110mg, 0.90mmol, 1.20 당량)에 이어서 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 85:15:0→80:15:5→75:20:5 헥산/EtOAc/MeOH)로 투명한 무색 오일로 INT-A007(577 mg, 85% 수율)를 얻었다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.06-4.96(m, 2H), 4.12(t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.60-2.46 (m, 6H), 2.37-2.23 (m, 5H), 1.79 (quint, J = 7.2 Hz, 2H), 1.70-1.50 (m, 10H), 1.50-1.16 (m, 64H), 1.04 (t, J = 7.1 Hz, 6H) 0.94-0.84 (m, 15H).
Figure pct00061
3-(디에틸아미노)프로필(신-9,10,12R)-트리리놀레옥시스테아레이트(3-(Diethylamino)propyl (syn-9,10,12R)-trilinoleoxystearate) (INT-A006)
일반 절차 D에 따라, CH2Cl2(3mL) 중 카르복실산(560mg, 0.50mmol), 아미노알코올(89L, 0.0.60mmol, 1.20당량), DCC(113mg, 0.55mmol, 1.10당량) 및 DMAP(73mg, 0.60mmol, 1.20당량)에 이어서 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 85:15:0→80:15:5→75:20:5 헥산/EtOAc/MeOH)로 투명한 무색 오일로 INT-A006(417 mg, 68% 수율)을 얻었다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.49-5.26(m, 12H), 5.12-4.84(m, 3H), 4.12(t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.59-2.45 (m, 6H), 2.36-2.21 (m, 8H), 2.14-1.99 (m, 12H), 1.92-1.47 (m, 18H), 1.47-1.16 (m, 56 H), 1.03 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.96-0.84 (m, 12H).
Figure pct00062
이소부틸(10Z)-노나데센술포네이트(Isobutyl (10Z)-nonadecenesulfonate)
절차에 따라(M. Xie, TS Widlanski, Tetrahedron Lett. 1996, 37, 4443), n-BuLi 용액(헥산 중 1.15M 6.52mL, 7.50mmol, 1.50당량)을 아르곤 하에 둥근 바닥 플라스크에 이소부틸 메탄술포네이트(1.22g, 8.00mmol, 1.60당량)의 -78℃ 9:1 THF/DMPU(15mL) 용액에 첨가하고 30분 동안 교반되도록 하였다. 여전히 -78℃에 있는 동안, 올레일 요오다이드(oleyl iodide) (1.89g, 5.00mmol, 1.00당량)의 THF(2mL) 용액을 상기 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 16시간에 걸쳐 가온되도록 하였다. 상기 반응 혼합물을 수성 10% 시트르산으로 켄칭하고, Et2O(2×10 mL)로 추출하고, 상기 조합한 유기물을 물(1×10 mL), 염수(1×10 mL)로 세척한 다음, Na2SO4로 건조하고 회전 증발기에서 농축하였다. 상기 조 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(98:2 → 95:5 헥산/EtOAc)로 정제하여 투명한 무색 오일로 알킬화된 설포네이트(1.19 g, 46% 수율)를 수득하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.46-5.27(m, 2H), 4.00(d, J = 6.6 Hz, 2H), 3.14-3.05 (m, 2H), 2.11-1.94 (m, 5H), 1.94-1.80 (m, 2H), 1.51-1.18 (m, 26 H), 1.00 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 0.90 (br t, J = 6.6 Hz, 3H).
Figure pct00063
이소부틸(±)-신-10,11-디히드록시노나데칸술포네이트 (Isobutyl (±)-syn-10,11-dihydroxynonadecanesulfonate)
OsO4 용액(물 중 4%의 0.11mL, 0.02mmol, 0.01당량)을 아르곤 하에 둥근 바닥 플라스크에 이소부틸(10Z)-노나데센술포네이트(709mg, 1.76mmol) 및 NMO(물 중 50%의 0.54mL, 2.64mmol, 1.50당량)의 실온 4:1 Me2CO/H2O(5.5mL) 용액에 첨가하였다. 16시간 동안 교반한 후, 포화된 수성 NaHSO3를 첨가하고 반응 혼합물을 1시간 동안 교반되도록 하고, 이 시점에서 이를 EtOAc(3 x 10mL)로 추출하고 상기 조합한 유기물을 물(1 x 10mL), 염수(1×10mL)로 세척하였고, Na2SO4로 건조하고 회전 증발기에서 농축하여 디올(768 mg, 정량적 수율)을 백색 고체로 얻었고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):4.00(d, J = 6.6 Hz, 2H), 3.67-3.65 (m, 2H), 3.14-3.05 (m, 2H), 2.05 (sept, J = 6.7 Hz, 1H), 1.95-1.78 (m, 4H), 1.58-1.19 (m, 28 H), 1.00 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 0.90 (br t, J = 6.6 Hz, 3H).
Figure pct00064
이소부틸 (±)-신-10,11-비스(2-헥실데카노일옥시)노나데칸술포네이트 (Isobutyl (±)-syn-10,11-bis(2-hexyldecanoyloxy)nonadecanesulfonate)
고체 DCC(388mg, 1.88mmol, 2.10당량)를 아르곤 하에 둥근 바닥 플라스크에 (±)-2-헥실데칸산(482mg, 1.88mmol, 2.10당량)의 냉각된 CH2Cl2(4.5mL) 용액에 첨가하였다. 이어서, 얼음 수조를 제거하고 생성된 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 다시 얼음 수조에서 식힌 후 고체 디하이드록시 설포네이트(391 mg, 0.90 mmol, 1.00 당량)를 가한 후, DMAP(273 mg, 2.23 mmol, 2.50 당량)를 가하였다. 상기 반응 혼합물을 16시간에 걸쳐 실온으로 가온시킨 다음, Et2O로 희석하고, 10분 동안 교반한 다음, Celite® 패드를 통해 여과하였다. 상기 여과액을 회전 증발기에서 농축시킨 다음, 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 95:5→90:10 헥산/EtOAc)로 정제하여 투명한 무색 오일로 디아실화된 설포네이트(574 mg, 70% 수율)를 수득하였다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.08-4.93(m, 2H), 4.00(d, J = 6.6 Hz, 2H), 3.67-3.65 (m, 2H), 3.14-3.05 (m, 2H), 2.38-2.24 (m, 2H), 2.05 (sept, J = 6.7 Hz, 1H), 1.95-1.80 (m, 2H), 1.70-1.15 (m, 74H), 1.00 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 0.96-0.83 (m, 15H).
Figure pct00065
소듐 (±)-신-10,11-비스(2-헥실데카노일옥시)노나데칸술포네이트 (Sodium (±)-syn-10,11-bis(2-hexyldecanoyloxy)nonadecanesulfonate) (INT-A012)
NaI(82 mg, 0.55 mmol, 2.00 당량)를 아르곤 하에 Teflon® 스크류 캡이 있는 밀봉된 유리 튜브 내의 디아실화 이소부틸 설포네이트(250 mg, 0.27 mmol)의 실온 Me2CO(0.9 mL) 용액에 첨가하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 24시간 동안 환류 가열하고, 이 시점에서 이를 Me2CO(3mL)로 희석하고, 얼음 상에서 2-3시간 동안 냉각시키고, 백색 침전물을 수집하고, 얼음처럼 차가운 Me2CO로 세척하여 백색 분말로서 INT- A012(200 mg, 84% 수율)를 얻었다.
1H (300 MHz, CDCl3):5.10-4.93(m, 2H), 2.90(appbrs, 2H), 2.46-2.22(m, 4H), 1.70-1.15(m, 76H), 0.96-0.83(m, 15H).
실시예 2: 핵산을 함유하는 지질 나노입자를 지질 나노입자(LNP)로 제형화
실시예 1에 기재된 바와 같이, 합성된 지질 INT-A001, INT-A002, INT-A003, INT-A004, INT-A005, INT-A006 및 INT-A007을 핵산과 함께 지질 나노입자로 제형화하였다. 실시예 카고(cargo)로서 LNP를 포함하기 위한 핵산은 혈액 응고에 관여하는 단백질인 인자 VII에 대한 siRNA였다. 인자 VII 수준은 발색 분석(chromogenic assay)에 의해 혈장에서 쉽게 측정될 수 있으므로, 이 인자의 siRNA-매개 하향 조절을 결정하기 위한 편리한 모델을 나타낸다.
양이온성 지질 및 인자 VII에 대한 siRNA와 결합된 나노입자의 겉보기 pKa, 입자 직경, 다분산도(PDI) 및 캡슐화 효율을 포함한 물리화학적 파라미터를 측정하고 다음에 보고하였다. 다음 결과는 LNP가 핵산의 캡슐화 및 전달에 적합했음을 나타낸다.
LNP를 제조하기 위해, 이온화 가능한 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-DMPE를 에탄올에 용해시켰다. 상기 siRNA를 10-50mM 아세테이트, 숙시네이트 또는 시트레이트로 구성된 pH 4.0-6.2 완충액에 용해시켰다. 일부 경우에는. 10-50mM 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산 (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid) (HEPES) 또는 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) (MES) 완충액을 사용하였다. LNP는 실온에서 1:3(에탄올 대 수성, 결합된 유속 > 12mL/분)의 체적 유량비로 수성 완충액에서 핵산과 에탄올(DSPC/chol/PEG-DMPE의 몰비 50/10/38.5/1.5)의 지질 성분을 빠르게 혼합하여 제조하였다. 일반적으로 siRNA/지질 비율은 0.056wt/μmol을 표적으로 하였다. 그 다음, 상기 생성물을 pH 7.4에서 1X 인산완충식염수(PBS)에 대해 24시간 동안 투석하여 잔류 에탄올을 제거하고 pH를 상승시켰다. PBS를 4시간 후에 새로 교체하였다.
하기 표 2에 나타난 바와 같이, INT-A001, INT-A002, INT-A003, INT-A004, INT-A005, INT-A006 및 INT-A007 이온화 지질은 높은 캡슐화 효율과 낮은 다분산성에서 FVII siRNA의 통합을 촉진하였으며, 둘 다 약물 전달 시스템에 바람직한 물리화학적 특성이다. 이러한 이온화 가능한 지질에 대한 겉보기 pKa 값은 또한 6 내지 7 사이의 겉보기 pKa 값을 갖는 특정 이온화 가능한 지질이 유전자 침묵을 매개하는데 활성인 것으로 이전에 보고된 바와 같이 측정되었다(Semple, S.C., et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol, 2010, 28(2): p. 172-6 and Jayaraman, M., et al., Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo. Angewandte Chemie, 2012, 51(34): p. 8529-33).
INT-A001, INT-A002, INT-A003, INT-A004, INT-A005, INT-A006 및 INT-A007은 6~7의 적절한 범위 내에서 pKa 값을 나타내는 것으로 결정되었다(표 2).
이온화 지질 및 siRNA를 포함하는 LNP의 물리화학적 파라미터
이온화 가능한 지질(Ionizable Lipid) ID 겉보기(Apparent) pKa 입자 직경(Particle Diameter) (nm) 다분산 지수(Polydispersity index) (PDI) 캡슐화 효율(Encapsulation Efficiency) (%)
INT-A001 6.3 50 0.059 89
INT-A002 6.8 52 0.063 97
INT-A003 7.0 55 0.043 92
INT-A004 5.8 58 0.024 61
INT-A005 7.0 49 0.035 87
INT-A006 6.7 64 0.020 83
INT-A007 6.9 59 0.021 84
누적적으로, 이 데이터는 LNP에서 핵산의 캡슐화에 대한 이러한 신규 이온화 가능한 지질의 적합성을 입증한다.
실시예 3: 배양된 22Rv1 세포에서 LNP 활성 측정
시험관 내 이온화 가능한 지질의 활성은 인간 전립선 세포(22Rv1)를 발현하는 루시퍼라제에서 평가되었다. 반딧불이 루시퍼라제에 대한 siRNA를 함유하는 LNP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 세포를 siRNA를 함유하는 0.1-1 μg/mL의 LNP로 16-24시간 동안 처리한 다음 Glo-Lysis Buffer(Promega)로 용해시켰다. 동일한 양의 Steady-Glo 시약(Promega)을 각 샘플에 첨가하고 발광 수준을 Synergy LX 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 결정하였다. 도 2A는 다양한 처리의 발광 수준을 나타낸다. 일반적으로, 반딧불이 루시퍼라제 유전자의 침묵에 있어서 용량 의존적 효과가 관찰되었다. 도 2B는 이온화 가능한 지질 A001-A007을 함유하는 제형의 상대적 활성을 나타낸다. 상기 결과는 본 개시내용의 이온화 가능한 지질이 siRNA를 효과적으로 전달할 수 있고 시험관내에서 유전자-침묵을 유도할 수 있음을 나타낸다. A007은 유전자 침묵의 이 시험관 내 모델에서 1 ug/mL에서 가장 활성이었다.
실시예 4: 마우스 인자 VII 모델에서 LNP 활성 측정
다음으로 생체내 이온화 가능한 지질의 활성을 마우스 FVII 모델에서 평가하였다. 상기 결과는 본 개시내용의 이온화 가능한 지질이 생체내에서 핵산을 효과적으로 전달할 수 있음을 나타낸다.
인자 VII(FVII)에 대한 siRNA를 함유하는 실시예 2에 기재된 바와 같이, 제조된 LNP를 PBS로 희석하여 주사 부피가 10mL/kg 체중으로 유지되고 6 내지 8주령 암컷 C57Bl/6 마우스(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)의 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여(siRNA 농도 기준)하였다. 주사 후 24시간에, 동물을 안락사시키고 심장 내 샘플링을 통해 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 4℃에서 밤새 응고되도록 하고 혈청을 분리한 다음 12,000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈청 FVII 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 Biophen VII 발색 분석(Aniara, Mason, OH)을 사용하여 결정되었다.
도 3은 INT-A001, INT-A002, INT-A003, INT-A005 또는 INT-A007 제제를 주사한 마우스의 잔류 FVII 수준을 나타낸다. 이러한 이온화 가능한 지질이 유전자 침묵을 매개하는 데 활성인 것으로 결정되었다. INT-A002는 테스트된 제형화된 지질 중 가장 활성이었다. INT-002에 대한 ED 50은 0.1mg/kg 미만으로 추정되었다(ED 50은 50% 유전자 침묵을 달성하기 위한 유효 용량임).
실시예 5: mRNA를 포함하는 지질 나노입자의 LNP로의 제형화
시험관내 및 생체내에서 운반자 mRNA(delever mRNA)에 대한 INT-A001, INT-A002, INT-A003 및 INT-A004를 함유하는 제형의 능력을 평가하였다. 상기 결과는 이러한 이온화 가능한 지질이 mRNA를 효과적으로 전달할 수 있음을 나타낸다.
LNP는 반딧불이 루시퍼라제 mRNA를 함유하는 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조되었다. 하기 표 3에 나타난 바와 같이, INT-A001, INT-A002, INT-A003, INT-A004 이온화 가능한 지질은 높은 캡슐화 효율과 낮은 다분산성으로 루시퍼라제 mRNA의 혼입을 촉진하였으며, 둘 다 약물 전달 시스템에 대한 바람직한 물리화학적 특성이다.
이온화 가능한 지질과 mRNA를 포함하는 LNP의 물리화학적 파라미터
이온화 가능한 지질(Ionizable Lipid) ID 입자 직경(Particle Diameter) (nm) 다분산 지수(Polydispersity index) (PDI) 캡슐화 효율(Encapsulation Efficiency) (%)
INT-A001 43 0.064 96
INT-A002 47 0.053 99
INT-A003 49 0.050 99
INT-A004 42 0.090 96
시험관 내 이온화 가능한 지질의 활성은 배양된 HepG2 세포에서 평가되었다. 반딧불이 루시퍼라제 mRNA를 함유하는 LNP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. LNP를 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지로 0.125-1μg/mL로 희석하고 16-24시간 동안 HepG2 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 Glo-Lysis Buffer(Promega)로 용해하였다. 동일한 양의 Steady-Glo 시약(Promega)을 각 샘플에 첨가하고 발광 수준을 Synergy LX 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 결정하였다. 도 4A는 다양한 처리의 발광 수준을 나타낸다. INT-A003 제형은 시험관 내에서 mRNA 전달 및 발현 유도에서 가장 활성이었다.
생체내 활성을 평가하기 위해, 반딧불이 루시퍼라제 mRNA를 함유하는 LNP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. LNP를 PBS로 희석하였고 6-8주령 암컷 C57Bl/6 마우스(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)에서 꼬리 정맥을 통해 정맥내 1 mg/kg으로 투여하였다. 주사 후 4시간에 동물을 안락사시키고 간을 수집하였다. 대략적으로 100mg의 간을 0.5mL Glo Lysis Buffer(Promega)에서 균질화하였다. 상기 균질액을 용해 완충액으로 1:4 추가 희석한 다음 희석된 균질액 50μL를 50μL Steady-Glo 시약(Promega)에 첨가하였다. 발광 수준은 Synergy LX 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 결정되었다. 도 4B는 생체 내에서 mRNA의 성공적인 전달의 결과로서 발광의 상대적 수준을 나타낸다. INT-A002 제형은 생체 내에서 mRNA 전달 및 mRNA 발현 유도에 가장 활성이었다.
실시예 6: 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 지질 나노입자를 LNP로 제형화
안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 실시예 2에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. 하기 표 4에 나타난 바와 같이 INT-A001, INT-A002, INT-A003, INT-A004, INT-A005, INT-A006, INT-A007 이온화 가능한 지질은 높은 캡슐화 효율과 낮은 다분산성으로 안티센스 올리고뉴클레오티드의 혼입을 촉진하였고, 둘 다 약물 전달 시스템에 바람직한 물리화학적 특성이다.
이온화 가능한 지질 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 LNP의 물리화학적 파라미터
이온화 가능한 지질(Ionizable Lipid) ID 입자 직경(Particle Diameter) (nm) 다분산 지수(Polydispersity index) (PDI) 캡슐화 효율(Encapsulation Efficiency) (%)
INT-A001 44 0.103 84
INT-A002 49 0.096 92
INT-A003 54 0.036 89
INT-A004 45 0.065 88
INT-A005 47 0.090 74
INT-A006 55 0.062 88
INT-A007 55 0.070 84
실시예 7: 히알루론산(HA)을 함유하는 지질 나노입자를 LNP로 제형화
음이온 카고의 실시예로 히알루론산이 사용되었다. 8-15 kDa의 분자량을 갖는 HA를 함유하는 실시예 2에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, INT-A002, INT-A003, INT-A005, INT-A006 및 INT-A007 이온화 지질은 HA의 혼입을 촉진하였다.
이온화 가능한 지질 및 HA를 함유하는 LNP의 물리화학적 파라미터
이온화 가능한 지질(Ionizable Lipid) ID 입자 직경(Particle Diameter) (nm) 다분산 지수(Polydispersity index) (PDI) HA:지질(Lipid) (wt/wt)
INT-A002 83 0.027 0.093
INT-A003 64 0.035 0.094
INT-A005 71 0.096 0.114
INT-A006 74 0.037 0.078
INT-A007 58 0.065 0.096
실시예 8: 산성 펩타이드를 함유하는 지질 나노입자를 LNP로 제형화
핵산과 유사하게, 네트 음전하(net negative charge)를 갖는 단백질 또는 펩티드는 양이온성 이온화 가능한 지질을 사용하여 LNP에 통합될 수 있다. 4.2 kDa의 분자량 및 -3의 예상 네트 전하를 갖는 산성 펩티드를 함유하는 실시예 2에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. 하기 표 6에 나타난 바와 같이, INT-A001, INT-A002, INT-A003, INT-A004, INT-A005, INT-A006, INT-A007 이온화 지질은 이 산성 펩타이드의 결합을 촉진시켰다.
이온화 가능한 지질과 4.2kDa 산성 펩타이드를 포함하는 LNP의 물리화학적 파라미터
이온화 가능한 지질(Ionizable Lipid) ID 입자 직경(Particle Diameter) (nm) 다분산 지수(Polydispersity index) (PDI) 펩티드(Peptide):지질(Lipid) (wt/wt)
INT-A001 48 0.021 0.161
INT-A002 62 0.015 0.157
INT-A003 76 0.031 0.160
INT-A004 40 0.034 0.158
INT-A005 87 0.021 0.193
INT-A006 58 0.070 0.132
INT-A007 52 0.049 0.162
실시예 9: 작은 산성 펩타이드를 포함하는 지질 나노입자를 LNP로 제형화
2.0 kDa의 분자량 및 -3의 예상된 네트 전하를 갖는 산성 펩티드를 함유하는 실시예 2에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. 하기 표 7에 나타난 바와 같이, INT-A003, INT-A004, INT-A006 및 INT-A007 이온화 지질은 이러한 산성 펩타이드의 결합을 촉진하였다.
이온화 가능한 지질 및 2.0 kDa 산성 펩티드를 함유하는 LNP의 물리화학적 파라미터
이온화 가능한 지질(Ionizable Lipid) ID 입자 직경(Particle Diameter) (nm) 다분산 지수(Polydispersity index) (PDI) 펩티드(Peptide):지질(Lipid) (wt/wt)
INT-A003 142 0.025 0.074
INT-A004 59 0.051 0.073
INT-A006 94 0.054 0.061
INT-A007 79 0.019 0.075
실시예 10: LNP에 양이온성 카고를 함유하는 지질 나노입자를 LNP로 제형화
양이온 카고의 실시예로 염기성 펩타이드를 사용하였다. 2.0 kDa의 분자량 및 +4의 예상된 네트 전하를 갖는 염기성 펩티드를 함유하는 실시예 2에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, INT-A008 및 INT-A009 이온화 지질은 이 염기성 펩타이드의 혼입을 촉진하였다.
이온화 가능한 지질과 2.0 kDa 염기성 펩타이드를 포함하는 LNP의 물리화학적 파라미터
이온화 가능한 지질(Ionizable Lipid) ID 입자 직경(Particle Diameter) (nm) 다분산 지수(Polydispersity index) (PDI) 펩티드(Peptide):지질(Lipid) (wt/wt)
INT-A008 39 0.058 0.104
INT-A009 39 0.057 0.121
본원에 첨부된 청구범위는 상기에 설명된 특정 실시예에 의해 제한되어서는 안 되며 모든 가능한 실시예 및 이러한 청구범위에 대한 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. 화학식 I의 구조를 갖는 분지형 지질 모이어티 L을 포함하는 하전된 지질:
    <화학식 I>
    A-(V)m-Z-L
    상기 식에서, A는 생리학적 pH에서 전하를 띠는 헤드 그룹이며;
    (V)m은 선택적 -(CR1R2)-이고 m은 1~10 또는 2~6이며, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 hydrogen, 선택적으로 치환된 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 사이클로알킬(cycloalkyl), 사이클로알킬알킬(cycloalkylalkyl), 또는 헤테로사이클(heterocycle)이거나 선택적으로 치환된 모노-(mono-), 바이-(bi-), 또는 트리-사이클릭 탄소고리(tri-cyclic carbon ring) 또는 4 내지 12개 고리 원자를 갖는 헤테로원자고리(heteroatom ring)로부터 독립적으로 선택되며;
    Z-L은 하기 화학식 II, 화학식 IIa 또는 화학식 IIb의 구조를 갖는다:
    화학식 II 선형 링커 구조:
    X1-Lb
    상기 식에서, X1은 선택적이고 X1은 에테르, 에스테르 및 카바메이트 그룹(group)으로부터 선택되며;
    Lb는 화학식 IIIc의 분지형 지질이다;
    화학식 IIa 분지형 링커 구조:
    Figure pct00066

    상기 식에서, W는 선택적이며,
    W는 존재하는 경우 X1 연결, N-C(O), N-C(O)O 또는 N-OC(O)이고;
    상기 W는 D로 선택적으로 치환되고, 이는 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클이며;
    (X)n의 각 발생은 독립적으로 선택된 -(CR1R2)-이고; (X)n의 n은 0 내지 10이고; T는 선택적이고, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클이고, 여기서 T는 선택적으로 치환되며;
    B는 각각의 G1 및 G2를 통해 L1 및 L2에 연결된 탄소 원자이며;
    상기 G1 및 G2는 X1으로부터 독립적으로 선택되고, G1 및 G2 각각은 독립적으로 선택적으로 선행되고 (G)u에 공유 결합되며, 상기 G는 독립적으로 선택된 -(CR1R2)- 이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 또는 헤테로사이클이고, u는 0 내지 16이며;
    상기 G3은 선택적이고 X1에서 선택되고, 선택적으로 선행되고 (G)u에 공유 결합되며;
    L1은 화학식 IIIc의 분지형 탄화수소이며;
    L2는 1 내지 20개의 탄소 원자 및 0 내지 2개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 탄화수소 사슬이거나 화학식 IIIc의 구조를 가지며;
    존재하는 경우 L3는 수소, 1 내지 20개 탄소 원자 및 0 내지 2개 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬, 또는 화학식 IIIc의 구조를 갖는다;
    화학식 IIb 고리 구조:
    Figure pct00067

    상기 식에서, 곡선은 고리를 나타내고, E 및 K는 고리의 구조를 부분적으로 형성하는 원자를 나타내며, 고리는 3 내지 8개의 고리 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 고리이고;
    상기 L1, L2 및 L3 중 적어도 하나 이상은 선택적으로 각각의 G1, G2 및 G3을 통해 고리의 단일 원자에 결합되고, 상기 G1, G2 및 G3 각각은 독립적으로 선택적으로 선행되고 (G)u에 공유 결합되며;
    상기 화학식 IIb의 L1 및 선택적으로 L2 및/또는 L3는 하기 화학식 IIIc의 구조를 갖는다:
    <화학식 IIIc>
    Figure pct00068

    상기 식에서, L 백본(backbone)은 L1' - L1''- G1- CH-[CH2]q-CH3로 표시되고, 상기 백본에서 탄소 원자의 총 개수는 10 내지 30개 이며;
    L1'은 선형 탄화수소 사슬이고 5-20, 6-20, 7-20, 8-20, 5-12, 5-10, 5-9, 6-12, 6-10, 6-9, 7 -12, 7-10, 또는 7-9개의 탄소 원자 및 0-3개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 가지며;
    L1''은 탄소 원자이며;
    L1'''은 G1-CH-CH2-CH3로 표시되며, 상기 G1은 선택적으로 하나의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 0-4개의 탄소 원자의 탄화수소 사슬이며;
    상기 n은 0 내지 4이고;
    상기 p는 1 내지 4이고;
    상기 n + p는 1 내지 4이고;
    q는 0 내지 20이고;
    각각의 X1은 에테르, 에스테르 및 카바메이트 그룹으로부터 독립적으로 선택되며;
    상기 각 S 및 L1'''' 탄화수소 측쇄는 독립적으로:
    (e) 0 내지 5개의 시스 또는 트랜스 C=C 및 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖고 탄화수소 사슬의 임의의 탄소 원자에서 각각의 X1 중 하나에 접합된 선형 또는 분지형 말단 탄화수소 사슬 또는
    (f) 화학식 IIIc의 분지형 탄화수소 구조이며,
    상기 화학식 IIIc에서 L1'''' 및 S 탄화수소 사슬의 총 수는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4 또는 1 내지 3개이며;
    상기 지질 모이어티의 L1'''' 및 S 탄화수소 사슬 각각은 헤테로원자로 임의로 치환되지만, 단 2개 이하의 헤테로원자가 탄화수소 사슬에서 치환된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Z-L은 화학식 II의 구조(선형 링커 구조)를 갖는 것을 특징으로 하는 하전 지질:
    <화학식 II>
    X1-Lb;
    상기 화학식 IIIc의 L1'은 5 내지 9개의 탄소 원자 및 0 내지 2개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 가지며;
    상기 화학식 IIIc의 G1은 존재하지 않고, CH2 또는 CH2CH=CH이고, 상기 이중 결합은 시스 또는 트랜스이며;
    상기 화학식 IIIc의 L1'''' 및 S는 0 내지 5개의 시스 또는 트랜스 CH=CH 및 2 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소로부터 독립적으로 선택되며;
    상기 화학식 IIIc의 스캐폴드 백본은 CH2-L1''-G1-CH-CH2-CH3(L1'''는 8 내지 30개의 탄소 원자임)로 표시되며;
    상기 q는 1 내지 9이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (V)m은 (CH2)m이고, 상기 m은 1 내지 20이며;
    Z-L은 화학식 IIa의 구조(분지형 링커 구조)를 갖는 것을 특징으로 하는 하전 지질:
    <화학식 IIa>
    Figure pct00069

    상기 식에서, W는 에테르(ether), 에스테르(ester) 또는 카바메이트(carbamate) 그룹이고 D는 존재하지 않고, (X)n은 (CH2)n이고, 여기서 n은 1 내지 10이며;
    상기 G1 및 G2는 존재하고 각각의 (G)u에 선행하고 공유 결합되며, 여기서 (G)u는 CH2이고;
    상기 G3-L3은 존재하고, CH3 및 CH2CH3로부터 선택된 탄화수소이며; 또는 상기 G3-L3은 CH2X1L3이고 L3은 1 내지 20개의 탄소 원자 및 0 내지 2개의 시스 또는 트랜스 이중 결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬이거나 화학식 IIIc의 구조를 갖는다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 Z-L은 화학식 IIb의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 하전 지질:
    화학식 IIb 고리 구조:
    Figure pct00070

    상기 식에서 곡선은 고리를 나타내고 E 및 K는 고리의 구조를 부분적으로 형성하는 원자를 나타내며, 상기 고리는 3 내지 6개의 고리 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 탄소 고리이다.
  5. 제4항에 있어서, 고리가 3 또는 5개의 탄소 원자를 포함하는 것을 특징으로 하는 하전 지질.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 적어도 L1 및 L2가 존재하고 각각의 G1 및 G2 그룹을 통해 고리에 부착되며, 상기 각 G1 및 G2는 선택적으로 Gu가 선행되며, 상기 u는 0 내지 10 또는 0 내지 6인 것을 특징으로 하는 하전 지질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A는
    (i) 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이온화 가능한 양이온성 모이어티:
    Figure pct00071

    (ii) 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 영구적으로 하전된 모이어티:
    Figure pct00072

    (iii) 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이온화 가능한 음이온성 모이어티:
    Figure pct00073
    ; 또는
    (iv) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 쌍이온성(zwitterionic) 모이어티:
    Figure pct00074

    로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하전 지질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 탄화수소 구조 L은 형태가 비-실린더형인 것을 특징으로 하는 지질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질이 수용액에서 다른 지질과 혼합되어 지질 나노입자로 조립될 수 있는 것을 특징으로 하는 지질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 지질을 형성하는 다른 비히클은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파디딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파디딜세린(phosphatidylserine), 포스파디딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파디딘산(phosphatidic acid), 세라마이드(ceramides), 스핑고미엘린(sphingomyelin) 또는 친수성 중합체-지질 접합체(hydrophilic polymer-lipid conjugate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질.
  11. 지질 이중층 또는 이의 단층에 통합된 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 지질을 포함하며, 핵산, 단백질 또는 펩타이드인 카고 분자 또는 화합물을 포함하는 악물 전달 비히클 제형.
  12. 제11항에 있어서, 상기 핵산은 소간섭 RNA(small interfering RNA), 소활성 RNA(small activating RNA), 메신저 RNA(messenger RNA), 마이크로 RNA(micro RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 리보자임(ribozyme), 앱타머(aptamer), 플라스미드(plasmid), 원형 DNA(circular DNA), 선형 DNA(linear DNA), 안타고미르(antagomir), 항-miRNA 올리고뉴클레오티드(anti-miRNA oligonucleotide) 또는 miRNA 모방체(miRNA mimic)인 것을 특징으로 하는 약물 전달 제형.
  13. 제11항에 있어서, 상기 카고 분자 또는 화합물은 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약물 전달 제형.
  14. 제11항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 지질 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달 비히클 제형.
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