PL211710B1 - Zastosowanie lipozomów zawierających związek o wzorze (II) ,jako nośnika do transportu leków lub substancji posiadających aktywność kosmetyczną - Google Patents

Zastosowanie lipozomów zawierających związek o wzorze (II) ,jako nośnika do transportu leków lub substancji posiadających aktywność kosmetyczną

Info

Publication number
PL211710B1
PL211710B1 PL386640A PL38664000A PL211710B1 PL 211710 B1 PL211710 B1 PL 211710B1 PL 386640 A PL386640 A PL 386640A PL 38664000 A PL38664000 A PL 38664000A PL 211710 B1 PL211710 B1 PL 211710B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
liposomes
liposome
cpt
carnitine
palmitoyl
Prior art date
Application number
PL386640A
Other languages
English (en)
Inventor
Claudio Pisano
Maria Ornella Tinti
Mose Santaniello
Luciana Critelli
Giovanni Salvatori
Original Assignee
Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sigma Tau Ind Farmaceuti filed Critical Sigma Tau Ind Farmaceuti
Publication of PL211710B1 publication Critical patent/PL211710B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/22—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated the carbon skeleton being further substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/225—Polycarboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/14—Liposomes; Vesicles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie lipozomów zawierających związek o wzorze (II), jako nośnika do transportu leków lub substancji posiadających aktywność kosmetyczną.
Związki o wzorze (II) są estrami L-karnityny i według wynalazku znajdują zastosowanie jako kationowe lipidy odpowiednie do korzystnego dokomórkowego dostarczania farmakologicznie aktywnych związków, ułatwiających transport przezbłonowy lub wzmacniających ich oddziaływanie ze specyficznymi miejscami błony komórkowej (receptorami).
Stosowany tu termin „dostarczanie wewnątrzkomórkowe odnosi się do transfekcji komórki polinukleotydami lub plazmidami naturalnego pochodzenia lub zmodyfikowanymi, obdarzonymi aktywnością terapeutyczną (dostarczanie genu), lub do wprowadzenia leków bądź immunogennych peptydów do komórki.
Wiele farmakologicznie aktywnych substancji, takich jak np. polipeptydy, białka lub leki musi na ogół przeniknąć do komórki by wywrzeć efekt na funkcje komórkowe, na poziomie komórkowym lub cząsteczkowym. Dla cząsteczek tych błona komórki tworzy selektywnie nieprzepuszczalną barierę. Błona komórki tworzy selektywnie nieprzepuszczalną barierę. Błona komórki pełni właściwie funkcję ochronną, zapobiegając wejściu potencjalnie toksycznych substancji, ale także przechodzeniu związków o aktywności terapeutycznej. Złożony skład błony komórkowej obejmuje fosfolipidy, glikolipidy i białka; ich funkcja podlega wpływowi składników cytoplazmatycznych takich jak Ca++ i inne jony, ATP, mikrofilamentów, mikrotubul, enzymów i białek, które wiążą Ca++. Oddziaływanie pomiędzy strukturalnymi i cytoplazmatycznymi składnikami komórek i odpowiedź na zewnętrzne sygnały są mechanizmami odpowiedzialnymi za selektywność wśród różnych typów komórek. Efekt barierowy błony można przezwyciężyć przez połączenie substancji w kompleksy z preparatami lipidowymi, które powielają budowę naturalnie występujących lipidów błonowych. Lipidy te są zdolne do stapiania się z błoną i uwalniania połączonych z nimi substancji do komórki. Kompleksy lipidowe są zdolne nie tylko do ułatwiania transportu dokomórkowego za pomocą fuzji z błoną, ale mogą także zmniejszać siłę odpychania pomiędzy błoną i cząsteczką która ma przenikać do komórki. Amfipatyczne lipidy, takie jak fosfolipidy błonowe, tworzą pęcherzyki lipidowe lub liposomy w układach wodnych.
Liposomy są pęcherzykami, w których określona objętość wody jest całkowicie zamknięta przez jedną lub więcej błonę składającą się z cząsteczek lipidów, zazwyczaj fosfolipidów. Fosfolipidy, które składają się z hydrofilowej główki i pary łańcuchów węglowych (ogonków hydrofobowych), są głównymi składnikami błon biologicznych. W roztworze wodnym hydrofobowe ogonki łączą się ze sobą aby pozbyć się cząsteczek wody, podczas gdy hydrofilowe główki oddziaływują z ośrodkiem, samorzutnie tworząc populacje pęcherzyków o zmiennych średnicach. Lipidy są na ogół dwubiegunowe, obojętne lub anionowe. Pęcherzyki te można stosować jako nośniki leków, małych cząsteczek, białek, nukleotydów i plazmidów.
Przez ostatnie lata, liposomy kationowe, klasa dodatnio naładowanych pęcherzyków wytworzonych z syntetycznych lipidów, znalazły szerokie zastosowanie do przenoszenia materiału genetycznego do komórki. Ujemny ładunek DNA może oddziaływać z dodatnim ładunkiem kationowym lipidów, tworząc trwały kompleks DNA-liposom. Prostota i uniwersalność tej technologii uczyniła z liposomów ważne nośniki w transporcie genów w terapii genowej człowieka. Obecnie, większość wektorów używanych w terapii genowej i zatwierdzonych przez NIH Recombinant Advisory Committee obejmują układy wirusowe i syntetyczne.
Infekcja wirusowa angażuje serie mechanizmów w celu zaatakowania specyficznej komórki i przeniesienia do jądra. Racjonalne uzasadnienie zastosowania wektorów wirusowych w terapii genowej opiera się na możliwości zastąpienia genów wirusowych genami, które kodują funkcje terapeutyczne, bez eliminowania zdolności cząstki wirusowej do infekowania komórki. Ograniczenia terapii wirusowej wiążą się ze składnikami wirusowymi, które mogą być immunogenne, cytopatogenne i rekombinogenne.
Wielkie nadzieje pokłada się w zastosowaniu kationowych lipidów w terapii genowej. Wektory te posiadają duży potencjał w porównaniu z wektorami pochodzenia biologicznego, a to z uwagi na to, że są znacznie bezpieczniejsze, mniej toksyczne i są także zdolne do włączania genów o dużym wymiarze. Jednakże w porównaniu z wektorami typu biologicznego, wektory te posiadają niską wydajność wewnątrzkomórkowej transkrypcji genów. Należy jednakże pamiętać, że zastosowanie takich układów transfekcyjnych jest w początkowej fazie badań. Lipidy kationowe ogrywają bardzo ważną
PL 211 710 B1 rolę w powstawaniu kompleksu DNA-lipid, oddziaływaniu komórka-kompleks, fuzji z błoną, uwalnianiu DNA wewnątrz komórki i w transkrypcji.
Istnieją ważne przykłady zastosowania kationowych liposomów in vivo. Pierwszą kliniczną próbę terapii genowej do leczenia czerniaka przeprowadzono wprowadzając wektor ekspresji zawierający ludzki liposom połączony z genem HLA-B7. Innym ważnym zastosowaniem dotyczącym leczenia torbielowatego zwłóknienia płuc, za pomocą podawania drogą płucną lub poprzez spray donosowy, liposomu związanego z wektorem ekspresji SV-40C-FTR. W trakcie są inne próby kliniczne polegające na zastosowaniu liposomów w terapii genowej raka.
Na ogół, w budowie lipidów kationowych identyfikuje się cztery elementy składowe: dodatnio naładowana kationowa główka, grupa dystansująca, lipid kotwiczący i wiążące połączenie.
Główka kationowa odpowiada za oddziaływania pomiędzy kationowymi liposomami i DNA, pomiędzy kompleksem DNA-liposom i błoną komórki oraz innymi składnikami komórki. Składa się ona z mono- lub polikationowych grup, które (zależnie od liczby ładunków) mogą być rozmaicie podstawione.
Grupa dystansująca jest częścią cząsteczki, która oddziela główkę kationową od hydrofobowego ogonka i jest zaangażowana w zapewnienie optymalnego kontaktu pomiędzy kationową główką oraz ujemnymi ładunkami fosforanów DNA.
Lipid kotwiczący jest niepolarną węglowodorową częścią cząsteczki i określa fizyczne właściwości podwójnej warstwy lipidowej, takie jak jej sztywność i wielkość wymiany z lipidami błonowymi.
Pod pojęciem „wiązanie łączące rozumie się wiązanie pomiędzy węglowodorowymi łańcuchami i resztą cząsteczki. Wiązanie to określa chemiczną trwałość i podatność na rozkład biologiczny lipidów kationowych.
W ostatnich latach zastosowanie liposomów niezmiennie zwiększało się w sektorze kosmetyków. Powodzenie liposomów na tym polu wywołane jest faktem, że związki te są bardzo dobrze tolerowane przez skórę. Stosuje się je zarówno jako nośniki dla aktywnych składników jako związki polepszające ich wchłanianie.
Naukowa i patentowa literatura zawiera wiele odsyłaczy dotyczących przygotowania i zastosowania liposomów; jednakże, bardzo niewiele jest literatury opisującej zastosowanie pochodnych karnityny przydatnych do transportu genowego, podczas gdy nie ma dostępnej literatury dotyczącej transportu leków, zajmującej się technikami wytwarzania związków odlegle przypominających te, których dotyczy ten wynalazek.
Zgłoszenie patentowe EP 0279887 opisuje zastosowanie pochodnej karnityny tj. fosfatydylokarnityny, ewentualnie w mieszaninie z innymi fosfolipidami i lipidami (cholesterolu, fosfatydylocholiny, fosfatydyloseryny), do otrzymywania liposomów.
W podanym przykładzie dotyczącym wytwarzania liposomów, otrzymuje się liposomy fosfatydylokarnitynowe, które obejmują propranolol, lek o którym wiadomo, że aktywność przeciwnadciśnieniową, przeciwdusznicową i jest środkiem przeciw arytmii.
Pochodną karnityny stosuje się tutaj bazując na stwierdzonym tropiźmie karnityny w kierunku mięśnia sercowego. Tropizm ten umożliwia uniknięcie raczej metabolizowania liposomów w wątrobie, przed osiągnięciem przez nie pożądanego celu.
Obecność fosfatydylokarnityny umożliwia także stosowanie liposomów doustnie, ponieważ są one odporne na lipazy jelitowe.
W J. Med. Chem., 18 czerwca 1998; 41(13):2207-15, opisano liczne estry L-karnityny przydatne do dostarczania genów, ale ani nie opisano ich ani nie proponowano jako środki przydatne dla transportu leków.
EP 559625 B1 opisuje liczne estry L-karnityny i acylo-L-karnityn obdarzone selektywną rozkurczającą aktywnością mięśni przewodu żołądkowo-jelitowego.
W ostatnich latach biologowie molekularni zidentyfikowali liczne defekty na poziomie chromosomalnym, które są przyczyną chorób dziedzicznych u człowieka.
Ważny dział nowoczesnej medycyny dotyczy leczenia chorób o podłożu genetycznym za pomocą stosowania metod terapii genowej.
Jak już wspomniano, liposomy kationowe stosuje się szeroko w celu dokomórkowego dostarczania farmakologicznie aktywnych związków, ułatwiania transportu przezbłonowego lub wzmacniania ich oddziaływania ze specyficznymi miejscami błony komórkowej (receptorami).
Wektory te mają wielki potencjał w porównaniu z wektorami pochodzenia biologicznego, a to dlatego, że są bardziej bezpieczne, mniej toksyczne jak również są zdolne do włączania genów
PL 211 710 B1 o dużych wymiarach. W porównaniu jednakże z wektorami typu biologicznego, posiadają niską wydajność wewnątrzkomórkowej transkrypcji genu.
Ponadto, transport genu za pośrednictwem typowych lipidów kationowych wymaga by plazmid DNA i lipidy kationowe były trzymane oddzielnie, a ich zmieszanie było przeprowadzane bezpośrednio przed transferem genu.
Próby stabilizacji kompleksów polinukleotydowych do tej pory zakończone były niepowodzeniem; w rzeczywistości kompleksy pozostają stabilne tylko przez krótki okres.
W dziedzinie terapii genowej lub transferu genowego i dostarczania leków występuje zatem silnie dostrzegana potrzeba uzyskania trwałych, powtarzalnych, specyficznych dla miejsca układów, które są także aktywne po odpowiednim okresie czasu.
Obecnie stwierdzono, że klasa lipidów kationowych silnie aktywnych we wzmacnianiu dokomórkowego dostarczania farmakologicznie aktywnych związków obejmuje nowe estry L-karnityny i acylo-L-karnityn.
Te nowe związki są trwałe i silnie selektywne ponieważ są miejscowo specyficzne w osiąganiu organu docelowego.
Te charakterystyczne cechy powodują, że są one szczególnie przydatne w transporcie aktywnych związków bezpośrednio do miejsca gdzie mogą wykazać swą farmakologiczną aktywność.
Wynalazek dotyczy lipidów kationowych o ogólnym wzorze (II), znanych już z różnych zastosowań (wymienione powyżej zgłoszenie EP 559625).
Według niniejszego wynalazku, związki o wzorze (II) są estrami L-karnityny, przydatnymi do otrzymywania liposomów posiadających silną aktywność pod względem dostarczania leku i charakteryzują się trwałością i selektywnością w osiąganiu docelowego organu. Te same korzystne właściwości znajdują zastosowanie w przypadku kosmetyki.
Te związki mają ogólny wzór (II):
w którym:
3
R3 oznacza mirystoil, palmitoil lub stearoil;
R4 oznacza undecyl, tetradecyl lub heksadecyl;
X- oznacza anion farmakologicznie dopuszczalnego kwasu; i związek jest wybrany z grupy obejmującej;
- ester undecylowy chlorku palmitoilo-L-karnityny;
- ester undecylowy chlorku stearoilo-L-karnityny;
- ester tetradecylowy chlorku stearoilo-L-karnityny;
- ester tetradecylowy chlorku palmitoilo-L-karnityny;
- ester tetradecylowy chlorku mirystoilo-L-karnityny;
- ester heksadecylowy bromku palmitoilo-L-karnityny, jako nośnika do transportu leków lub substancji posiadających aktywność kosmetyczną.
Pod pojęciem anionu farmakologicznie dopuszczalnego kwasu rozumiemy dowolny anion kwasu, który nie zwiększa niepożądanych toksycznych efektów lub innych efektów ubocznych.
Kwasy te są dobrze znane farmakologom i specjalistom w technologii farmaceutycznej. Przykłady anionów farmakologicznie dopuszczalnego kwasu obejmują: chlorek; bromek; jodek;
asparaginian; wodoroasparaginian; cytrynian; wodorocytrynian; winian; wodorowinian; fosforan; wodorofosforan; fumaran; wodorofumaran; glicerofosforan; glukozofosforan; mleczan; maleinian; wodoromaleinian; śluzan; orotonian; szczawian; wodoroszczawian; siarczan; wodorosiarczan; trichlorooctan; trifluorooctan; metanosulfonian; palmitynian i wodoropalmitynian.
W dalszej części opisu stosowane są skróty nazw związków o wzorze (II), które są następujące: - ester undecylowy chlorku palmitoilo-L-karnityny (ST 983);
- ester undecylowy chlorku stearoilo-L-karnityny (ST 1055);
- ester tetradecylowy chlorku stearoilo-L-karnityny (ST 1351);
- ester tetradecylowy chlorku palmitoilo-L-karnityny (ST 1379);
PL 211 710 B1
- ester tetradecylowy chlorku mirystoilo-L-karnityny (ST 1380);
- ester heksadecylowy bromku palmitoilo-L-karnityny (ST 1390);
- ester oleilowy chlorku oleilo-L-karnityny (ST 1392).
Liczne związki o wzorze (II), a mianowicie ST 1380, ST 1390 i ST 1392, są znane i opisane w powyżej cytowanym J. Med. Chem. 1998 18 czerwca; 41(13):2207-15, jako przydatne środki do otrzymywania liposomów dla komórkowej transfekcji, posiadających terapeutyczną aktywność, lecz nigdy ich nie opisano jak środki przydatne do otrzymywania liposomów do dostarczania leków.
Fachowiec ze średnim doświadczeniem w dziedzinie farmaceutycznych preparatów jest dobrze świadomy trudności napotykanych przy przygotowywaniu kompleksów liposom-lek; a właściwie, niemożliwe jest ustalenie a priori czy liposom, który jest przydatny dla dostarczania genu można stosować do dostarczania leku, a to z powodu licznych problemów, które trzeba przezwyciężyć w celu wytworzenia liposomu zdolnego do kompleksowania leku, i który dostarczy go preferencyjnie do organu gdzie ma wykazać swą leczniczą aktywność.
Związki o wzorze (II), w postaci liposomów, są przydatnymi środkami dla dostarczania leków, takich jak np. przeciwrakowe, antyangiogenne, przeciwwirusowe, przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwpierwotniakom lub leki przydatne w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, lub immunogennych peptydów i innych leków przydatnych w leczeniu.
Związki o wzorze (II), w postaci liposomów, są także przydatne do wytwarzania kosmetycznych kompozycji jak środki kosmetyczne per se lub w celu dostarczenia substancji posiadających kosmetyczną aktywność, takich jak, np. środki hydratujące, składniki odżywcze, środki do oczyszczania twarzy i środki przeciwzmarszczkowe, przeciwcellulitowe oraz środki i przeciw rozstępom.
Dlatego przedmiotem wynalazku jest zastosowanie liposomu zawierającego związek o wzorze (II) do wytwarzania do transportowania leków lub substancji posiadających aktywność kosmetyczną.
Liposomy zawierające związek o wzorze (II), mogą ewentualnie zawierać pomocniczy lipid, który jest wybrany z grupy obejmującej cholesterol, 1-palmitoilo-2-oleoilofosfatydylo-cholinę lub dioleilofosfatydylocholinę.
Liposomy zawierającą związki o wzorze (II) można podawać doustnie lub pozajelitowo, dożylnie, domięśniowo, podskórnie, przezskórnie lub w postaci rozpylaczy donosowych lub do jamy ustnej.
Przykład 1 i 2 przedstawiają wytwarzanie substratów do liposomu
P r z y k ł a d 1
7-benzylooksyiminometylokamptotecyna (CPT 172)
500 mg (1,33 mmola) 7-formylokamptotecyny rozpuszcza się w 100 ml etanolu. Dodaje się 15 ml pirydyny i 638 mg (4 mmole) chlorowodorku O-benzylohydroksyloaminy. Roztwór ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 5 godzin. Rozpuszczalnik odparowuje się pod próżnią i tak otrzymaną pozostałość oczyszcza się metodą szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym stosując jako eluant mieszaninę heksan/octan etylu 4:6. Wydajność: 65%. Temperatura topnienia: 200-205°C z rozkładem.
Otrzymany produkt stanowi w przybliżeniu mieszaninę w stosunku 8:2 dwóch izomerów syn i anti (izomer A - Rf 0,32; izomer B - Rf 0,19, na żelu krzemionkowym Merck 60 F254; eluant: heksan:octan etylu 3:7).
HPLC: analizy prowadzono na urządzeniu zaopatrzonym w pompę do czterech faz ruchomych (HP 1050) z iniektorem Rheodyne (pętla 20 μΐ), a detektor diodowy (HP 1050) obsługiwany był przez program HPLC-ChemStation. Widma odczytywano w zakresie od 200 do 600 nm i chromatogramy rejestrowano przy 360 i 400 nm.
Chromatografię kolumnową w układzie faz odwróconych (kolumna C18, Rainin CIS; 25x0,4 Varian) przeprowadzano z kolumną wstępną RP18. Analizę prowadzono stosując liniowy gradient wymywania, wychodząc od stosunku acetonitryl:woda 30:70 do 100% acetonitrylu w czasie 20 minut, z szybkością przepływu 1 ml/minutę. Czas retencji wynosił: 12,51 minuty dla izomeru B i 14,48 minuty dla izomeru A.
1H-NMR (300 MHz; DMSO-da): δ 0,88 (t, H3-I8A+ H3-I8B), 1,87 8m, (H2-19A+ H2-19B), 5,18 (s, H2-5B), 5,21 (8s, H2-Ph B), 5,30 (H2-t Ph A), 5,40 (s, H2-5A), 5,45 (s, H2-17A+H2-17B), 6,53 (s, -OH A+-OH B), 7,3-7,6 (m, Ar A+ Ar B+H-14A+H-14B), 7,75 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,95 (m, H-10A+H-10B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18-8,27 (m, H-12A+H9-B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (dd, H9A), 9,38 (s, CH=N A).
Widmo masowe m/z 481 (M+ 100) 374 (30) 330 (70) 300 (30) 273 (20) 243 (20) 91 (34).
PL 211 710 B1
P r z y k ł a d 2
7-butoksyiminometylokamptotecyna (CPT 184)
400 mg (1,06 mmola) 7-formylokamptotecyny rozpuszcza się w 80 ml etanolu. Dodaje się 12 ml pirydyny i 400 mg (3,18 mmola) chlorowodorku O-t-butylohydroksyloaminy. Roztwór ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny. Rozpuszczalnik odparowuje się pod silnie zmniejszonym ciśnieniem i otrzymaną pozostałość oczyszcza się metodą szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym stosując jako eluant mieszaninę heksan/octan etylu 4:6.
Otrzymuje się 322 mg (0,72 mmola) żółtego ciała stałego. Wydajność: 68%. Temperatura topnienia: 250°C z rozkładem.
Otrzymany produkt stanowi w przybliżeniu mieszaninę w stosunku 8:2 dwóch izomerów syn i anti (izomer A - Rf 0,31; izomer B - Rf 0,24, na żelu krzemionkowym Merck 60 F254; eluant: heksan:octan etylu 3:7).
HPLC: analizy prowadzono na urządzeniu zaopatrzonym w (HP 1050) z iniektorem Rheodyne (pętla 20 μΐ), a detektor diodowy (HP 1050) obsługiwany był przez program HPLC-ChemStation. Widma odczytywano w zakresie od 200 do 600 nm i chromatogramy rejestrowano przy 360 i 400 nm.
Kolumnę C18 (Rainin C18; 25 x 0,4 cm, Varian) stosowano z kolumną wstępną RP18. Analizę prowadzono stosując liniowy gradient wymywania, wychodząc od stosunku acetonitryl:woda 30:70 do 100% acetonitrylu w czasie 20 minut, z szybkością przepływu 1 ml/min. Czas retencji wynosił: 12,92 minuty dla izomeru B i 14,61 minuty dla izomeru A.
1H-NMR (300 MHz; DMSO-da): δ 0,88 (t, H3-I8A+H3-I8B), 1,30 (s, t-but.B), 1,47 (s, t-but.A), 1,87 (m, H2-19A+ H2-19B), 5,18 (s, H2-5 B), 5,37 (H2-5 A), 5,42 (s, H2-17A+ H2-17B), 6,54 (s, OH A+-OH B), 7,35 (s, H-14A), 7,36 (s, H-14B) 7,69-7,83 (m, H11A+H-11B), 7,85-7,98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16-8,27 (m, H-9A+H-12B) 8,40 (s, CH B), 8,62 (dd, H-12A), 9,31 (s, CH A).
Widmo masowe m/z 448 (M+ 28) 391 (40) 374 (100) 362 (40) 330 (34) 57 (17).
Wytwarzanie liposomów
Związki według wynalazku można stosować w celu przygotowania liposomów wielowarstwowych (MLV) i liposomów jednowarstwowych (SUV), zarówno w postaci suchych proszków jak i zawiesin w roztworach.
Związki według wynalazku, przygotowane tak jak opisano w przykładach 1-7, stosuje się w celu otrzymania liposomów według następującej procedury. Odpowiednią ilość związku rozpuszcza się w chloroformie; roztwór ten zatęża się pod silnie zmniejszonym ciśnieniem do suchej masy za pomocą wyparki obrotowej aż do otrzymania błony lipidowej. Błonę lipidową osusza się pod silnie zmniejszonym ciśnieniem aż do usunięcia pozostających śladowych ilości rozpuszczalnika i następnie rozpuszcza się w alkoholu tert-butylowym lub w wodzie. Tak otrzymany roztwór liofilizuje się uzyskując miękki, suchy proszek.
Proszki uwadnia się odpowiednią ilością roztworu wodnego, otrzymując liposom stosowanego związku, który następnie kompleksowany jest z polinukleotydem lub z wymaganym lekiem.
Inna metoda wytwarzania liposomów polega na zaadsorbowaniu błony lipidowej, składającej się ze związku według wynalazku w rozpuszczalniku, na odpowiednim obojętnym nośniku takim jak sorbitol, mannitol lub na innych farmakologicznie dopuszczalnych węglowodanach. Mieszaninę osusza się pod silnie zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując ciało stałe, które łatwo i bardzo szybko może być uwodnione przed użyciem.
Preparaty w postaci suchego proszku mają tę korzystną właściwość, że są przez długi czas trwałe i łatwe w zastosowaniu.
Ponadto, związki według wynalazku można stosować w celu przygotowania liposomów połączonych z DNA lub z wymaganym lekiem, w postaci suchego proszku, według następującej procedury. Związek według wynalazku rozpuszcza się w alkoholu tert-butylowym lub w wodzie; tak otrzymany roztwór miesza się z DNA lub wymaganym lekiem i mieszaninę liofilizuje się otrzymując kompleks, który można określić jako kompleks proliposom-DNA lub proliposom-lek, mający postać miękkiego, suchego proszku.
Tak otrzymane proszki (proliposomy) można stosować do otrzymywania kompozycji farmaceutycznych, które można aplikować w postaci aerozolu, lub alternatywnie drogą pozajelitową lub doustnie, wtedy gdy są one odtwarzane wodą lub odpowiednim roztworem buforu.
Liposomy skompleksowane z DNA lub z lekami w postaci stałej, również można otrzymać metodą adsorpcji błony lipidowej na obojętnym nośniku takim jak sorbitol, mannitol lub inne węglowodany otrzymane metodą opisaną powyżej.
PL 211 710 B1
Badanie powstawania liposomu
Powstawanie liposomu badano metodą kolorymetryczną, stosując rozpuszczalny w wodzie barwnik, według następującej procedury. Otrzymano roztwór wodny rozpuszczalnego w wodzie barwnika Arsenazo III (masa cząsteczkowa = 776,37; 2,3 mg/ml).
Roztwór ten użyto zamiast wody do uwodnienia błon lipidowych otrzymanych w wyżej opisany sposób.
Próbkę zawiesiny zawierającą liposom opłaszczający barwnik rozcieńczono 100-krotnie wodą.
Do otrzymania pierwszego odczytu gęstości optycznej przy 660 nm użyto 2 ml zawiesiny liposomu; odczyt otrzymano w odniesieniu do takiej samej próbki określonej jako próba ślepa. 200 μΐ roztworu CaCb (15 mg/ml; 100 mM) dodano do próbki pierwszej i zmierzono gęstość optyczną przy 660 nm względem próby ślepej, do której dodano 200 μΐ wody. Wartość absorbancji jaką otrzymano określono jako odczyt 2. Do próbki dodano 100 μΐ roztworu Triton Χ-100 (5% objętościowo; stężenie końcowe 0,26%) i do próby ślepej dodano 200 μΐ wody; odczyt gęstości optycznej przy 660 nm dostarczył informacji o wartości gęstości optycznej określonej jako odczyt 3. Do obliczenia zawartości procentowej barwnika zawartego w liposomach, zastosowano następujący wzór:
% zawartego w liposomach barwnika = odczyt 3 - odczyt 2 odczyt 3 • 100
Zawartość procentowa opłaszczonego barwnika jest miarą powstawania liposomów i średnio wynosi około 40%: określenie wymiarów liposomu przeprowadzono stosując z wynikiem pozytywnym metodę rozproszenia światła laserowego.
Przykłady tworzenia liposomów
Tworzenie liposomów z estru undecylowego chlorku palmitoilo-L-karnityny (ST 983) w postaci:
a) proszki liofilizowane
W kolbie 100 ml rozpuszczono 65 mg, 0,11 mmola estru undecylowego chlorku palmitoilo-L-karnityny w 20 ml chloroformu. Roztwór odparowano aż do otrzymania błony lipidowej, którą osuszano pod silnie zmniejszonym ciśnieniem przez 3 godziny Otrzymany produkt rozpuszczono w alkoholu tertbutylowym, roztwór ten szybko ochłodzono do temperatury -70°C stosując ciekły azot i liofilizowano przez 24 godziny. Otrzymano gąbczaste, miękkie, białe ciało stałe.
b) Proszki zaadsorbowane
143 mg, 0,231 mmola estru undecylowego chlorku palmitoilo-L-karnityny rozpuszczono w 10 ml chloroformu. Tak otrzymany roztwór wlano małymi porcjami do kolby 100 ml zawierającej 750 mg sorbitolu. Po zakończeniu dodawania różnych porcji roztworu, chloroform szybko odparowano.
Tak otrzymane ciało stałe osuszano pod silnie zmniejszonym ciśnieniem przez 3 godziny.
Otrzymano 893 mg białego produktu w postaci ciała stałego.
Przed zastosowaniem, produkt szybko uwadniano stosując objętości wody odpowiednią do otrzymania roztworu izotonicznego.
c) Zawiesiny MLV
W kolbie 100 ml rozpuszczono 65 mg, 0,11 mmola estru undecylowego chlorku palmitoilo-L-karnityny w 20 ml chloroformie.
Tak otrzymany roztwór odparowano aż do otrzymania błony lipidowej, którą następnie osuszano pod silnie zmniejszonym ciśnieniem przez 3 godziny.
Błonę lipidową uwadniano stosując 10 ml wody w temperaturze 30°C przez 3 godziny otrzymując zawiesinę MLV.
Zawiesinę MLV, odpowiednio rozcieńczoną, skompleksowano z polinukleotydem lub lekiem i użyto do testów biologicznych.
e) Zawiesiny SUV
W kolbie o objętości 100 ml rozpuszczono 65 mg, 0,11 mmola estru undecylowego chlorku palmitoilo-L-karnityny w 20 ml chloroformu.
Tak otrzymany roztwór odparowano aż do otrzymania błony lipidowej, którą następnie osuszano pod silnie zmniejszonym ciśnieniem przez 3 godziny.
Błonę lipidową uwadniano stosując 10 ml wody, w temperaturze 30°C przez 3 godziny otrzymując zawiesinę MLV.
Zawiesinę MLV przetłaczano 10 razy przez filtr poliwęglanowy o wymiarach porów 200 nm. Tak otrzymaną zawiesinę jednowarstwowych liposomów skompleksowano z polinukleotydem lub lekiem i użyto do testów biologicznych.
PL 211 710 B1
f) Badanie trwałości fizycznej liposomów
Trwałość fizyczną zawiesiny liposomów badano turbidymetrycznie przez 30 dni.
Pomiar absorbancji przy długości fali 600 nm prowadzono przez pewien czas dla każdej badanej zawiesiny. Średnia wartość absorbancji zmierzonej w czasie 0 pozostawała stała dla wszystkich badanych preparatów.
Badane cząsteczki wykazywały oczekiwane wartości w badanych okresach czasu.
Zawiesiny liposomów MLV i SUV można wytworzyć przez połączenie związków według wynalazku z lipidami pomocniczymi takimi jak cholesterol, 1-palmitoilo-2-oleoilofosfatydylocholina (POPC) lub dioleilofosfatydylocholina (DOPE).
Związki wiąże się z lipidami pomocniczymi w celu otrzymywania liposomów ze stabilniejszymi błonami. W poniższym ustępie opisującym wytwarzanie liposomów podano przykład preparatu, w którym związek według wynalazku łączy się z lipidem pomocniczym takim jak cholesterol lub POPC.
Przykłady wytwarzania liposomów służących do dostarczania leków.
P r z y k ł a d 3
Przygotowanie liposomów taksol-ST 983 MLV (1:40) mg, 0, 0234 mmola taksolu i 556 mg, 0,9417 mmola ST 983 rozpuszczono w 20 ml chloroformu.
Roztwór zatężono aż do otrzymania błony lipidowej na powierzchni szkła kolby.
Po usunięciu ostatnich śladowych ilości chloroformu przy zastosowaniu pompy próżniowej, do błony lipidowej dodano 20 ml alkoholu tert-butylowego i tak otrzymany roztwór podzielono na 19 frakcji, które zamrożono bezpośrednio w temperaturze -70°C stosując ciekły azot i liofilizowano przez 24 godziny. Każda frakcja porcja ciała stałego zawierała taksol (1,05 mg) i ST 983 (29,2 mg).
W celu otrzymania ostatecznej zawiesiny liposomów, zliofilizowany produkt uwadniano w czasie stosowania przy użyciu wody (450 l) lub innego roztworu solanki, mieszano przez 10 minut i pozostawiono na 30 minut w celu umożliwienia zakończenia procesu pęcznienia (hydratacja).
Otrzymano liposomy MLV.
Badanie trwałości fizycznej preparatu
Trwałość fizyczną preparatu badano turbidymetrycznie rejestrując krzywą czasową TDC przy 800 nm, w temperaturze 20°C przez 20 godzin.
Stwierdzono stały trend do mętnienia, wskazujący na trwałość preparatu, bez wytrącania się osadu.
Badanie trwałości chemicznej taksolu w preparacie
Chemiczną trwałość taksolu badano stosując metodę HPLC.
Warunki chromatograficzne były następujące:
Kolumna: ąBondapack C-18
Eluant: acetonitryl:woda 70:30
Detektor UV-VIS: 227 nm
Szybkość przepływu: 1 ml/minutę
Czas retencji: 4,5 minutę
Stężenie taksolu określone względem wzorca wyniosło 2,13 mg/ml. Zawartość procentowa zawartego w liposomach taksolu 98%.
P r z y k ł a d 4
Wytwarzanie liposomów taksol-ST 983 SUV mg, tj. 0,0234 nmola taksolu i 556 mg tj. 0,9417 mmola ST 983 rozpuszczono 20 ml chloroformu.
Roztwór zatężono aż do otrzymania błony lipidowej na powierzchni szkła kolby.
Po usunięciu ostatnich śladów chloroformu przy zastosowaniu pompy wysokopróżniowej, do błony lipidowej dodano 20 ml alkoholu tert-butylowego i tak otrzymany roztwór podzielono na 19 frakcji, które natychmiast zamrożono w temperaturze -70°C stosując ciekły azot i liofilizowano przez 24 godziny. Każda frakcja ciała stałego zawierała taksol (1,05 mg) i ST 983 (29,2 mg).
W celu uzyskania końcowej zawiesiny liposomów SUV liofilizowanego produktu, uwadnianego roztworem PBS (1 ml), sonikowano go przez 20 minut w temperaturze 0°C. Następnie przeprowadzono filtrację stosując filtr 400 nm w celu eliminacji śladów tytanu uwalnianych przez sondę ultradźwiękową.
Badanie fizycznej trwałości taksolu w preparacie.
Fizyczną trwałość preparatu badano turbidymetrycznie rejestrując krzywą czasową TDC przy 800 nm, w temperaturze 20°C przez 20 godzin.
PL 211 710 B1
Stały trend mętnienia świadczył o trwałości preparatu, nie zarejestrowano wytrącania się osadu.
Badanie chemicznej trwałości taksolu w preparacie
Chemiczną trwałość taksolu badano metodą HPLC.
Warunki chromatograficzne były następujące:
Kolumna: ąBondapack C-18
Eluent: acetonitryl:woda 70:30
Detektor UV-VIS: 227 nm
Szybkość przepływu: 1 mL/minutę
Czas retencji: 4,5 minutę
Analiza HPLC zawiesiny liposomów SUV dała takie same wyniki jak odpowiadającej zawiesiny liposomów MLV i, także w tym przypadku, zawartość procentowa opłaszczonego taksolu wynosiła 98%.
Analiza HPLC powtórzona po upływie 24 godzin nie ujawniła istnienia nowych pików, innych niż pik taksolu, wskazując na trwałość aktywnego składnika.
P r z y k ł a d 5
Wytwarzanie liposomów taksol-ST 983-cholesterol (1:15)
Te rodzaje liposomów wytworzono w celu uzyskania kompleksów ze stabilniejszymi błonami.
mp, 0,0101 mmola taksolu, 62,2 mg, 0,105 mmola ST 983 i 40 mg cholesterolu rozpuszczono w 10 ml chloroformu.
Tak otrzymany roztwór zatężono aż do otrzymania błony lipidowej na powierzchni szkła kolby.
Po usunięciu ostatnich śladów chloroformu przy zastosowaniu wysokopróżniowej pompy, 6,3 ml alkoholu tert-butylowego dodano do błony lipidowej i tak otrzymany roztwór podzielono na 5 frakcji, które natychmiast zamrożono w temperaturze -70°C stosując ciekły azot i liofilizowano przez 24 godziny. Każda frakcja ciała stałego zawierała taksol (1,2 mg), ST 983 (12,44 mg) i cholesterol (8 mg).
W celu otrzymania końcowej zawiesiny liposomów, liofilizowany produkt uwadniano stosując wodę (1000 liL) lub inne roztwory solanki, mieszano przez 10 minut i pozostawiono przez 30 minut umożliwiając zakończenie procesu pęcznienia (hydratacja). Otrzymano MLV liposomy.
Badanie fizycznej trwałości preparatu
Fizyczną trwałość preparatu badano turbidymetrycznie z odczytami TDC (Time Drive Curve) przy 800 nm w temperaturze 20°C przez 6 godzin.
Stały trend mętnienia wskazywał na trwałość preparatu, nie zaobserwowano wytrącania się osadu.
P r z y k ł a d 6
Przygotowanie liposomów CPT 83-ST 983 MLV (1:40)
6,3 mg 0,0168 mmola CPT 83 (7-karbonitrylokamtotecyna opisana w zgłoszeniu WO 97/31003) i 400 mg, 0, 667 mmola ST 983 rozpuszczono w 20 ml chloroform.
Roztwór zatężono aż do otrzymania błony lipidowej na powierzchni szkła kolby.
Po usunięciu ostatnich śladów chloroformu przy zastosowaniu pompy próżniowej, do błony lipidowej dodano 26 ml alkoholu tert-butylowego i tak otrzymany roztwór podzielono na 12 frakcji, które natychmiast zamrożono w temperaturze -70°C stosując ciekły azot i liofilizowano przez 24 godziny. Każda frakcja ciała stałego zawierała CPT 83 (0,525 mg) i ST 983 (33,33 mg).
W celu otrzymania końcowej zawiesiny liposomów, liofilizowany produkt uwadniano w czasie stosowania wodą (1000 ąL) lub innymi roztworami solanki i mieszano przez 10 minut.
Otrzymano liposomy MLV.
Badanie fizycznej trwałości preparatu
Fizyczną trwałość preparatu badano turbidymetrycznie rejestrując krzywą czasową TDC przy 800 nm, w temperaturze 20°C przez 20 godzin.
Stały trend mętnienia wskazywał na trwałość preparatu, nie zaobserwowano wytrącania się osadu.
Badanie chemicznej trwałości CPT 83 w preparacie.
Chemiczną trwałość CPT 83 badano metodą HPLC.
Warunki chromatograficzne były następujące:
Kolumna: Supelcosil LC-ABZ
Eluent: bufor fosforanowy 20 mM:metanol 40:60, pH = 7,3
Detektor UV-VIS : 360 nm
Szybkość przepływu: 1 ml/min
PL 211 710 B1
Czas retencji: 4,033 min
Stężenie CPT 83 określone względem wzorca wynosiło 0,502 mg/ml
Zawartość procentowa opłaszczonego CPT 83 wynosiła 99%.
P r z y k ł a d 7
Wytwarzanie liposomów CPT 83-ST 983 SUV (1:40)
6,3 mg, 0,0168 mmola CPT 83 i 400 mg, 0,667 mmola ST 983 rozpuszczono w 20 ml chloroformu.
Roztwór zatężono aż do otrzymania błony lipidowej na powierzchni szkła kolby.
Po usunięciu ostatnich śladów chloroformu przy zastosowaniu pompy wysokopróżniowej, do błony lipidowej dodano 26 ml alkoholu tert-butylowego i tak otrzymany roztwór podzielono na 12 frakcji, które natychmiast zamrożono w temperaturze -70°C stosując ciekły azot i liofilizowano przez 24 godziny. Każda frakcja ciała stałego zawierała CPT 83 (0,525 mg) i ST 983 (33,33 mg).
W celu uzyskania końcowej zawiesiny liposomu SUV liofilizowany produkt, po uwodnieniu (1000 ąL), sonikowano przez 40 minut w temperaturze 0°C.
Następnie przeprowadzono filtrację na filtrze 400 nm w celu usunięcia śladów tytanu uwalnianego przez sondę ultradźwiękową.
Badanie chemicznej trwałości CPT 83 podczas wytwarzania.
Chemiczną trwałość CPT 83 badano metodą HPLC.
Warunki chromatograficzne były następujące:
Kolumna: Supelcosil LC-ABZ
Eluent: bufor fosforanowy 20 mM:metanol 40:60, pH = 7,3 Detektor UV-VIS: 360 nm Szybkość przepływu: 1 ml/min Czas retencji: 4,033 min
Stężenie CPT 83 określone względem wzorca wynosiło 0,3 mg/ml Zawartość procentowa opłaszczonego CPT 83 wynosiła 59%.
Analiza HPLC powtórzona po upływie 24 godzin nie ujawniła istnienia nowych pików innych niż pik CPT 83, wskazując na trwałość związku.
Badanie fizycznej trwałości preparatu
Fizyczną trwałość preparatu badano turbidymetrycznie rejestrując krzywą czasową TDC przy 600 nm, w temperaturze 20°C przez 20 godzin.
Stały trend mętnienia wskazywał na trwałość preparatu, nie zaobserwowano wytrącania się osadu.
P r z y k ł a d 8
Wytwarzanie liposomów CPT 184-ST 983 MLV (1:40)
7,29 mg, tj. 0,0168 mmola CPT 184 i 400 mg, tj. 0,677 mmola ST 983 rozpuszczono w 20 ml chloroformu.
Roztwór zatężono aż do otrzymania błony lipidowej na powierzchni szkła kolby.
Po usunięciu ostatnich śladów chloroformu przy zastosowaniu pompy próżniowej, do błony lipidowej dodano 26 ml alkoholu tert-butylowego i tak otrzymany roztwór podzielono na 12 frakcji, które natychmiast zamrożono w temperaturze -70°C stosując ciekły azot i liofilizowano przez 24 godziny. Każda frakcja ciała stałego zawierała CPT 184 (0,607 mg) i ST 983 (33,33 mg).
W celu otrzymania końcowej zawiesiny liposomu, liofilizowany produkt uwadniano w czasie stosowania wodą (1000 ąL) lub innymi roztworami solanki i mieszano przez 10 minut.
Otrzymano liposomy MLV.
Badanie fizycznej trwałości preparatu
Fizyczną trwałość preparatu badano turbidymetrycznie rejestrując krzywą czasową TDC przy 600 nm, przy 20°C przez 20 godzin.
Stały trend mętnienia wskazywał na trwałość preparatu, nie zaobserwowano wytrącania się osadu.
Badanie chemicznej trwałości CPT 184 w preparacie.
Chemiczną trwałość CPT 184 badano metodą HPLC.
Warunki chromatograficzne były następujące:
Kolumna: Supelcosil LC-ABZ
Eluent: bufor fosforanowy 20 mM:metanol 40:60, pH = 7,3 Detektor UV-VIS: 360 nm
PL 211 710 B1
Szybkość przepływu: 1 ml/min Czas retencji: 25,5 min
Stężenie CPT 184 określone względem wzorca wynosiło 0,600 mg/ml.
Zawartość procentowa opłaszczonego CPT 184 wynosiła 99%.
P r z y k ł a d 9
Wytwarzanie liposomów CPT 184-ST 983 SUV (1:40)
7,29 mg, tj. 0,0168 mmola CPT 184 i 400 mg, tj. 0,667 mmola ST 983 rozpuszczono w 20 ml chloroformu.
Roztwór zatężono aż do otrzymania błony lipidowej na powierzchni szkła kolby.
Po usunięciu ostatnich śladów chloroformu przy zastosowaniu wysokopróżniowej pompy, do błony lipidowej dodano 26 ml alkoholu tert-butylowego i tak otrzymany roztwór podzielono na 12 frakcji, które natychmiast zamrożono w temperaturze -70°C stosując ciekły azot i liofilizowano przez 24 godziny. Każda frakcja ciała stałego zawierała CPT 184 (0,607 mg) i ST 983 (33,33 mg).
W celu uzyskania końcowej zawiesiny liposomu SUV liofilizowany produkt, po uwodnieniu (1000 ąL), sonikowano przez 40 minut w temperaturze 0°C.
Następnie przeprowadzono filtrację na filtrze 400 nm w celu usunięcia śladów tytanu uwalnianego przez sondę ultradźwiękową.
Badanie chemicznej trwałości CPT 184 w preparacie Chemiczną trwałość CPT 184 badano metodą HPLC.
Warunki chromatograficzne były następujące:
Kolumna: Supelcosil LC-ABZ
Eluent: bufor fosforanowy 20 mM:metanol 40:60, pH = 7,3 Detektor UV-VIS: 360 nm Szybkość przepływu: 1 ml/min Czas retencji: 25,5 min
Stężenie CPT 184 określone względem wzorca wynosiło 0,36 mg/ml.
Procentowa zawartość opłaszczonego CPT 184 wynosiła 70%.
Analiza HPLC powtórzona po upływie 24 godzin nie ujawniła istnienia nowych pików innych niż pik CPT 184, wskazując na trwałość aktywnego składnika.
Badanie fizycznej trwałości preparatu
Fizyczną trwałość preparatu badano turbidymetrycznie rejestrując krzywą czasową TDC przy 600 nm, w temperaturze 20°C przez 20 godzin.
Stały trend mętnienia wskazywał na trwałość preparatu, nie zaobserwowano wytrącania się osadu.
W następujących przykładach, liposomy wytworzono przy zastosowaniu lipidów pomocniczych i/lub środków krioprotekcyjnych.
P r z y k ł a d 10
Wytwarzanie liposomów CPT 184-ST 983
W kolbie 2 L do 100 ml metylochloroformu dodano do 20 mg CPT 184 i 600 mg ST 983 i mieszaninę słabo ogrzano aż do zakończenia rozpuszczenia. Uzyskany roztwór zatężono w wyparce obrotowej aż do otrzymania błony lipidowej, a następnie osuszano przez dwie godziny z zastosowaniem pompy wysokopróżniowej. Błonę lipidową uwadniano roztworem laktozy (6 g/300 ml wody) w temperaturze 45°C i pozostawiono mieszając w wyparce obrotowej przez około 2 godziny. Następnie zawiesinę sonikowano przez 2 godziny, każdy cykl trwał pół godziny. Potem, produkt odsączono na filtrze 200 nm i liofilizowano.
Badanie chemicznej trwałości CPT 184 w preparacie
Chemiczną trwałość CPT 184 potwierdzono metodą HPLC. Produkt ten był trwały przez 24 godziny testu.
Badanie fizycznej trwałości preparatu
Fizyczną trwałość preparatu badano turbidymetrycznie. Produkt był trwały przez 24 godziny. Wielkość cząstki była także trwała (średnia wartość 100 nm).
P r z y k ł a d 11
Wytwarzanie liposomów CPT 184-ST 983
Następującej procedury użyto dla 1 ml preparatu liposomowego (POPC - 1-palmitoilo-2-oleoilofosfatydylocholina 5 mM; ST 983 1,25 mM; CPT 184 0,25 i trehalozal 50 mM):
PL 211 710 B1
0,11 mg, 0,25 μmoli CPT 184 rozpuszczono w 250 μl octanu etylu, 3,79 mg, 4,89 μmoli POPC rozpuszczono w 100 μl etanolu i 0,74 mg, 1,25 μmoli ST 983 rozpuszczono w 100 μL etanolu. Trzy roztwory zmieszano razem i wirowano na worteksie. Rozpuszczalniki odparowano w wyparce obrotowej w temperaturze pokojowej, 80 mbar. Błonę lipidową osuszano przez dwie godziny w ciemności. Błonę lipidową zawieszono w 1 ml 150 mM roztworze dihydratu D(+)-trehalozy (Fluka, HPLC 99%), sterylizowano stosując filtr 0,22 nm i wirowano na worteksie przez dwie minuty. Zawiesinę przetłaczano 21 razy przez poliwęglanowe filtry 200 nm. Przetłoczoną zawiesinę liposomową zamrożono w ciekłym azocie i liofilizowano przez 2 noce. Otrzymano białe ciało stałe.
P r z y k ł a d 12
Wytwarzanie liposomów CPT 184-ST 983
Użyto tej samej procedury jak w przykładzie 11, z wyjątkiem zastosowania 500 mM trehalozy
Przeciwrakowa aktywność ST 983 kompleksu liposom-środek przeciwrakowy
Jak przedstawi się poniżej, liposom ST 983 wykazywał przeważające gromadzenie na poziomie płucnym. Ta charakterystyczna miejscowa specyficzność spowodowała preferowanie jego użycia w mysim modelu powstawanie raka płuc.
Środkiem przeciwrakowym użytym w tym doświadczeniu był taksol.
5
Do indukowania guza in vivo, myszy Balb/c otrzymały bez znieczulenia iniekcje 3x105 komórek mysiego raka płuc M109 w 0,1 ml RPMI-1640 (Sigma) w mięsień czterogłowy uda prawej tylnej łapy.
Dziesięć dni po zaimplantowaniu guza kompleks liposom-taksol rozcieńczono buforowanym fosforanem roztworem solanki (PBS, SIGMA, P-4417) i wstrzyknięto dożylnie w stężeniu 2,5 mg/mL liposomu ST 983 i 75 μg/mL taksolu.
Taksol (paclitaxel INDENA) użyty jako próba kontrolna rozpuszczono w rozpuszczalniku cremophor EL (BASF) w stężeniu 20 mg/mL i przechowywano w temperaturze +4°C przez następne 24 godziny, w zabezpieczeniu przed światłem. W czasie stosowania, rozcieńczono go buforowanym fosforanem roztworem solanki (PBS, SIGMA) i wstrzyknięto dożylnie w tej samej objętości i stężeniu jak opisano dla taksolu transportowanego przez liposom ST 983.
Cremophor przygotowano przez rozcieńczenie 1:1 z alkoholanem etylowym.
Iniekcje podawano przez siedem kolejnych dni rozpoczynając od 10 dnia po wszczepieniu guza. Zwierzęta trzymano pod obserwacją do 17 dnia po wszczepieniu guza i uśmiercano przez przerwanie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, płuca wyizolowano w celu określania liczby przerzutów. Barwienie płuc w celu wykrycia przerzutów przeprowadzono poprzez inkubację płuc przez 10 dni w 5 ml roztworu Bouin'a składającego się z 71% nasyconego roztwór kwasu pikrynowego, 4,8% lodowatego kwasu octowego (Merck) i 24% 10%-owego formaldehydu (Fluka). Pod koniec inkubacji w roztworze Bouin'a, zliczano liczbę przerzutów.
W porównaniu z kontrolnymi, niczym nie traktowanymi myszami, transportowany przez cremophor taksol nie wykazał zmniejszającego efektu na liczbę przerzutów płucnych, chociaż u tych ostatnich były one mniejsze niż u niczym nie traktowanych myszy kontrolnych, podczas gdy taksol połączony z liposomem ST 983 wykazały znaczące obniżenie zarówno w liczbie jak i wymiarach przerzutów płucnych.
Analizę statystyczną danych liczby przerzutów płucnych przeprowadzono stosując nieparametryczne testy Mann-Whitney'a dla niesparowanych danych.
Otrzymane wyniki przedstawiono w Tablicy 1 poniżej.
T a b l i c a 1
Przerzuty płucne w 17-tym dniu po wszczepieniu guza M109 myszom BALB/c po potraktowaniu ich taksolem i taksolem z liposomem ST983.
Grupa średnia przerzutów ± s.d wielkość przerzutów
kontrolne 21 ± 12 M
Taksol 22 ± 9 S
Taksol - ST983 10 ± 2 S
s.d = odchylenie standardowe M = średnia (średnica 1-2 mm) S = mała (średnica < 1 mm) Testy cytotoksyczności in vitro
PL 211 710 B1
Testy toksyczności przeprowadzono na komórkach HeLa i komórkach M109 w płytkach 96-dołkowych. W dniu następnym po posiewie, komórki traktowano badanymi substancjami przez następne 48 godziny. Komórki przemyto następnie PBS i pozostawiono w warunkach do normalnego wzrostu przez 48 godzin. Po usunięciu pożywki, komórki inkubowano na lodzie z 16% TCA, przemyto 3 razy H2O, potraktowano 30 minut sulforodaminą B(SRB) w 1% kwasie octowym, przemyto 3 razy samym 1% kwasem octowym, inkubowano przez 20 minut w TRJEST 10 mH 10,5 i, ostatecznie, przeprowadzono odczyty przy 540 nm.
Testy cytotoksyczności z CPT 83
Testy cytotoksyczności in vitro z CPT 83 przeprowadzono w celu oceny cytotoksyczności środka przeciwnowotworowego połączonego z liposomem, jako wstępne określenie efektywnej aktywności.
Aby ocenić zdolność liposomu do transportu CPT 83 in vitro w komórkach M109 użyto powyżej opisanego testu sulforodaminy B.
Ponadto, cytotoksyczność CPT 83 rozpuszczonego w sulfotlenku dimetylu (DMSO) oszacowano także w porównaniu z cytotoksycznością samej cząsteczki połączonej z liposomem ST 983.
Kompleks liposom-CPT 83 użyto w testach cytotoksyczności w stężeniach wskazanych w tablicach 2,1, 2,2 i 3,3 zamieszczonych poniżej zarówno w konfiguracji SUV jak i MLV. Stosunek molowy liposomu: CPT 83 wynosił 40:1.
Średnie wartości cytotoksyczności kompleksów
ST 983-CPT 83 zarówno w konfiguracji SUV jak i MLV, podane w poniższych tablicach 2,1, 2,2 i 2,3, wskazują że liposom ST 983 jest zdolny do transportowania CPT 83 w ten sam sposób jak DMSO, wykazując poziom cytotoksyczności tego wielkości samego rzędu.
T a b l i c a 2,1
Cytotoksyczność (SRB) ST 983 SUV-CPT 83
Stężenia w μΜ
kontrola 1,3 0,13 0,013 00013
0,911 0,294 0,705 0,908 0,911
0,745 0,198 0,525 0,821 0,83
0,884 0,204 0,801 0,906 0,91
0,833 0,25 0,748 0,856 0,853
0,854 0,254 0,778 0,867 0,873
0,793 0,231 0,739 0,802 0,803
0,792 0,193 0,602 0,827 0,829
0,901 0,248 0,69 0,904 0,89
średnia 0,839125 0,352444 0,635333 0,767111 0,7667
s.d. 0,060645 0,034513 0,092925 0,042054 0,040149
Wartości dane w tablicy odnoszą się do gęstości optycznej, odczyty przy 540 nm. T a b l i c a 2,2
Cytotoksyczność (SRB) ST 983 MLV-CPT 83 stężenia w μΜ
Kontrola 1,3 0,13 0,013 0,0013
1 2 3 4 5
0,895 0,038 0,04 0,095 0,088
0,82 0,038 0,046 0,109 0,124
0,896 0,041 0,049 0,128 0,127
PL 211 710 B1 cd. tablicy 2,2
1 2 3 4 5
0,847 0,041 0,042 0,105 0,115
0,863 0,041 0,053 0,111 0,107
0,794 0,043 0,041 0,073 0,095
0,829 0,039 0,044 0,08 0,085
0,893 0,041 0,044 0,064 0,065
średnia 0,854625 0,04025 0,044875 0,095625 0,10075
s.d. 0,038682 0,001753 0,004357 0,021738 0,021359
Wartości podane w tablicy odnoszą się do gęstości optycznej, odczyty przy 540 nm.
T a b l i c a 2,3
Cytotoksyczność (SRB) DMSO-CPT 83;
Stężenia w μM
kontrola 13 1,3 0,13 0,013 0,0013
0,898 0,281 0,33 0,406 0,8 0,809
0,774 0,267 0,302 0,407 0,804 0,816
0,857 0,3 0,285 0,57 0,863 0,886
0,787 0,286 0,287 0,383 0,836 0,841
0,808 0,285 0,318 0,474 0,851 0,863
0,745 0,288 0,317 0,467 0,79 0,795
0,775 0,312 0,328 0,429 0,806 0,831
0,864 0,318 0,305 0,421 0,81 0,878
średnia 0,8135 0,292125 0,309 0,444625 0,82 0,839875
s.d. 0,053519 0,016848 0,017205 0,059269 0,026506 0,033237
Wartości podane w tablicy odnosi się do gęstości optycznej, odczyty przy 540 nm.
Aktywność biologiczna kompleksu ST 983 liposom-CPT 184
Badano aktywność biologiczną liposomów według przykładu 10 (niżej zwanym liposomem A) i przykładu 12 (niżej zwanym liposomem B).
Toksyczność w przypadku zdrowej myszy
Liposomy A i B podawano doustnie, dożylnie, w porównaniu z wolnym CPT 184, w dawce 1,2 mg/kg według schematu q4dx4. Oba liposomy nie miały istotnego wpływu na masę ciała, masę płuc, śledziony i nerek. Liposom B, podany dożylnie, i liposom A, podany doustnie wpłynęły na masę grasicy podobnie jak wolny CPT 184. Dożylne podanie liposomu A miało tylko minimalny wpływ. Parametry hematologiczne nie wykazują dla każdego z liposomów znaczących zmian po upływie 24 godzin. Podanie dożylnie liposomu A, zgodnie ze schematem qd5 wykazało toksyczność porównywalną z wolnym CPT 184.
Tropizm płucny liposomów
Liposomy A i B wykazały dominujące gromadzenie się na poziomie płucnym. Liposomy do podawania dożylnego zaaplikowano w dawce 1,2 mg/kg. Wolny CPT 184 podano doustnie w dawce 1,2 mg/kg w DMSO. Zwierzęta, zdrowe myszy, uśmiercono 24 godziny po ostatnim podawaniu. Płuca wyizolowano i zamrożono w ciekłym azocie. Po rozmrożeniu, narządy pulowano i homogenizowano
PL 211 710 B1 w roztworze 0,1% kwas octowy/acetonitryl 1:5. Homogenaty podzielono na trzy próbki, do dwóch z nich dodano CPT 184 w celu obliczenia ilości odzyskanej. Trzy próbki odwirowano przy 16000 g przez 5 minut. Pozyskano supernatanty i ekstrahowano je dichlorometanem. Fazę organiczną wysuszono za pomocą urządzenia speedvac i pozostałość ponownie rozpuszczono w acetonitrylu w celu uzyskania ilości odpowiedniej na jedno zwierzę w 50 μL w celu przeprowadzenia HPLC. HPLC prowadzono na Waters Symmetry CJEST 3,5 μm (4,6x7,5 nm). Stosowano detektor fluorymeter Merck, wzbudzenie 370 nm przy emisji 510 nmn. Roztworem wymywającym był izokratyczny roztwór woda/acetonitryl 60:40. Objętość próbki wynosiła 50 μL. Odzysk CPT 184 wyniósł około 70%. Oba liposomy A i B dały poziom akumulacji dla CPT 184 większy niż dla wolnego CPT 184 w DMSO, jak pokazano na Fig. 3.
Dostarczanie genu
Wytwarzanie kompleksu liposom-DNA
Liposom i plazmid DNA oddzielnie rozcieńczono w PBS w odpowiednim stopniu. Następnie do liposomu dodano DNA i kompleks liposom-DNA pozostawiono przez około 30 minut w temperaturze 4°C w celu ułatwienia powstawania trwałego układu liposom-DNA.
W doświadczeniach in vitro stosowano sól 1,2-dioleoiloksy-propano-3-trimetyloamoniową (DO5
TAP) jako odnośny lipid kationowy; na 2x10 komórek HeLa stosowano 2,5 μg plazmidu DNA, stężenie liposomu wynosiło 9 μM.
W doświadczeniach in vivo, zarówno DOTAP jak i sól [2,3-'(dioleoilo)propylo]trimetyloamoniową (DOTMA) stosowano jako odnośne lipidy kationowe.
Stosunki molowe określone w wynikach odnoszą się do nanomolowego stężenia odpowiednich lipidów kationowych na mg DNA.
W doświadczeniach transfekcji in vivo, użyto 25 μg plazmidu DNA na zwierzę.
Plazmid pCMVluc użyty w tych doświadczeniach zawierał cDNA genu lucyferazy pod kontrolą transkrypcyjną promotora cytomegalowirusa (CMV).
Ilościowe określanie aktywności lucyferazy
Aktywność białka lucyferazy w komórkach i tkankach oznaczono stosując zestaw Boehringera Mannheima (nr. kat. 1669 893).
Komórki przemyto 3 razy PBS i następnie usunięto je z płytki przy pomocy skrobaka w buforze lizującym (100 mM fosforan potasu pH 7,8, 1 mM ditiotreitol - DTT) i poddano trzem kolejnym cyklom zamarzania i rozmrażania. Po odwirowaniu w 1,5 mL w probówkach Eppendorfa, sklarowaną ciecz poddano testowi luminescencji nie później niż 5 godzin po ekstrakcji białka. Pomiary luminescencji wykonano stosując luminometr przy 562 nm. Po pierwszym zamrożeniu w ciekłym N2, po którym delikatnie pokruszono próbkę w celu uzyskania proszku, tkanki ponownie zawieszono w buforze lizującym i inkubowano przez 10-15 minut w lodzie.
Próbki następnie odwirowano w 2 ml w probówkach Eppendorfa i sklarowaną ciecz badano na aktywność lucyferazy.
Analiza dot-blot
Komórkowe DNA ekstrahowano według procedury lizy alkalicznej opisanej przez Sanbrooka, Fritscha i Maniata w Molecular Cloning, 1989.
μg DNA wyekstrahowanego z komórkek absorbowano wstępnie na nylonowych filtrach (Boehringer) przy zastosowaniu urządzenia Biorad (dot-blot). Następnie filtry poddawano prehybrydyzacji przez 4 godziny w temperaturze 65°C w roztworze zawierającym 0,5 M pirofosforanu sodu (NaPi), 1 EDTA, 7% SDS. Sondę znakowaną 32p(aifa) wytworzono stosując plazmid pCMVluc DRA jako matrycę i losowy zestaw liczb pierwszych Amershama. Filtr hybrydyzowano w tym samym buforze prehybrydyzacyjnym przez 12 godzin w 42°C przy zastosowaniu 1x106 CPM/ml. Filtr następnie poddano 3-10-minutowym płukaniem w temperaturze 65°C w buforze zawierającym 40 mM NaPi, 1% SDS. Analizę radiograficzną prowadzono z zastosowaniem znacznika fosforowego z zastosowaniem ekranów fosforowych aktywowanych przez promieniowanie beta, które jest sczytywane i zliczane za pomocą układu fotopowielającego w połączeniu z programem do analizy obrazu. Densytometrię (dot-blot) przeprowadzono z zastosowaniem programu do analizy obrazu IP-LabGel.
Testy transfekcji plazmidu DNA
Pewną liczbę testów transfekcji plazmidu DNA przeprowadzono zarówno in vitro jak i in vivo.
Zarówno DOTAP jak i DOTMA stosowano jako odnośne lipidy kationowe. Ich wydajność transfekcyjna została w pełni scharakteryzowana i opisana przez Abkeneta i in. w Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 1993, 90, 6518. In doświadczeniach in vivo, różne stosunki molowe lipidów kationowych do pla16
PL 211 710 B1 zmidowego DNA analizowano w celach określenia aktywności lipidów kationowych i odpowiednich najbardziej efektywnych stężeń dla transferu genowego. Zdolność transfekcyjna różnych liposomów szacowano zarówno in vitro jak i in vivo przy użyciu transportera genu lucyferazy zawartego w plazmidzie pCMVluc, aktywność którego wyrażono w jednostkach luminescencji względnej (RLU) (opisane uprzednio) w celu ułatwienia oceny ilościowej.
Alternatywnie, skuteczność transfekcji pewnej liczby kationowych liposomów oszacowano stosując analizę densytometryczną (znacznika fosforowego) próbek DNA wyekstrahowanego z transfekowanych komórek absorbowanych wstępnie na nitrocelulozowych filtrach (dot-blot) i hybrydy32 zowanych z markerami plazmidowego znakowanego 32P jak opisano uprzednio.
Testy transfekcji in vivo
Zależność skuteczności transfekcji in vivo od stosunku molowego liposom ST 983: DNA
W doświadczeniu oszacowano zależność skuteczności transfekcji komórek wątroby, płuc i serca od stosunku molowego liposom ST 983:plazmidowe DNA. Badano następujące proporcje liposom (nmol) względem DNA (ąg) DNA: 12:1, 24:1, 36:1 i 48:1.
Grupy 6 myszy Balb/c o masie w przybliżeniu 20 g potraktowano dożylnie wyżej wymienionymi ilościami kompleksu liposom- DNA w objętości 200 ąl PBS i uśmiercano po 24 godzinach po podawaniu kompleksu.
Aktywność lucyferazy wyekstrahowanej z tkanki płuc, serca i wątroby ujawnia w przeważającej mierze rozkład lucyferazy w płucach we wszystkich badanych stosunkach molowych. Właściwie, około 99% całkowitej wyekstrahowanej ze wszystkich trzech tkanek lucyferazy ulokowane było w płucach. Stosunek molowy liposom:DNA 12:1 był najlepszy. Otrzymane wyniki przedstawiono poniżej w tablicy 3.
T a b l i c a 3
Skuteczność transfekcji in vivo ST 983 jako funkcji stosunku molowego ST 983:DNA (ng DNA)
Liposom Średnia RLU/mg białko ± s.d. ST 983:DNA
wątroba płuca serce stosunek molowy
ST 983 2589+/-140 8818442+/-449529 28875+/-2593 12:1
1310+/-385 2257856+/-280480 7091+/-249 24:1
1035+/-347 301107+/-21503 8351+/-477 36:1
1571+/-156 112747+/-5655 5251+/-489 48:1
kontrola 396+/-55 458+/-45 755+/-55
DOTMA 1352+/-226 3828742+/-161332 3363+/-123 12:1
Zależność skuteczności transfekcji in vivo od różnic pomiędzy preparatami liposomowymi SRT 983
Wartości aktywności lucyferazy, w jednostkach luminescencji względnej (RLU), ekstrahowanej z płuc myszy Balb/c potraktowanych dożylnie różnymi preparatami liposomalnymi ST 983 liposom:DNA w stosunku molowym 12:1, podano w tablicy 4.
Otrzymane dane demonstrują, że liposom ST 983 jest zdolny do transportowania plazmidu DNAI in vivo, ze skutecznością większego rzędu lub porównywalną do skuteczności DOTMA, a ponadto także pokazują stopień zmienności wśród różnych preparatów ST 983. Może być to spowodowane licznymi fizykochemicznymi właściwościami takimi jak wielkość pęcherzyków liposomalnych, lub względne w proporcjach pęcherzyków w stosunku do jednowarstwowej (SUV) lub wielowarstwowej budowy różnych preparatów ST 983. W rzeczywistości, właściwości fizykochemiczne wyszczególnione powyżej w pełni opisano jako wyznaczniki w optymalnej skuteczności transfekcji in vivo i in vitro, R.I. Mahato i in., Human Gene Therapy 9. 1998: 2083.
PL 211 710 B1
T a b l i c a 4
Skuteczność transfekcji in vivo ST 983 (różne preparaty)
Liposom Średnia RLU/mg białko ± s.d. ST 983:DNA
Płuca Stosunek molowy
ST 983/#72 3418235+/-184726 12:1
ST 983/#73 7285835+/-827067 12:1
ST 983/#4 1022117+/-60402 12:1
Kontrola 1523+/-98
DOTMA 3110125+/-189520 12:1
Zależność skuteczności transfekcji in vivo od czasu preinkubacji kompleksu ST 983-DNA liposom
Tablica 5 prezentuje w jednostkach luminescencji względnej aktywność lucyferazy wyekstrahowanej z tkanek wątroby, płuc i serca myszy potraktowanych dożylnie liposomem ST 983 preinkubowanym z plazmidowym DNA przez 30 minut lub przez 3 godziny przed podaniem. Zwierzęta potraktowane ST 983 preinkubowanym przez 3 godziny z DNA wykazują w przybliżeniu 5-krotny wzrost w aktywności lucyferazy w płucach i w sercu w porównaniu z tymi, które potraktowano tym samym liposomem preinkubowanym przez 30 minut.
Wynik ten sugeruje, że powstawanie trwałego kompleksu liposom-DNA jest zjawiskiem zależnym od czasu i odgrywa znamienną rolę jako czynnik decydujący skuteczności transfekcji in vivo.
T a b l i c a 5
Skuteczność transfekcji ST 983 in vivo jako funkcja czasu preinkubacji liposomu z DNA
Liposom Czas Średnia RLU/mg białka ± s.d T 983:DNA
wątroba płuca serce stosunek molowy
ST 983 30 min 3526+/-260 874882+/-65917 8118+/-263 12:1
ST 983 3 godz. 2497+/-682 4225656+/-211731 37100+/-1853 12:1
Zastrzeżenia patentowe

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zastosowanie liposomu zawierającego związek o wzorze (II) w którym:
    R3 oznacza mirystoil, palmitoil lub stearoil;
    R4 oznacza undecyl, tetradecyl lub heksadecyl;
    X- oznacza anion farmakologicznie dopuszczalnego kwasu; i związek jest wybrany z grupy obejmującej;
    - ester undecylowy chlorku palmitoilo-L-karnityny;
    - ester undecylowy chlorku stearoilo-L-karnityny;
    - ester tetradecylowy chlorku stearoilo-L-karnityny;
    - ester tetradecylowy chlorku palmitoilo-L-karnityny;
    - ester tetradecylowy chlorku mirystoilo-L-karnityny;
    - ester heksadecylowy bromku palmitoilo-L-karnityny, jako nośnika do transportu leków lub substancji posiadających aktywność kosmetyczną.
    PL 211 710 B1
  2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym X- jest wybrany z grupy obejmującej chlorek; bromek; jodek; asparaginian; wodoroasparaginian; cytrynian; wodorocytrynian; winian; wodorowinian; fosforan; wodorofosforan; fumaran; wodorofumaran; glicerofosforan; glukozofosforan; mleczan; maleinian; wodoromaleinian; śluzan; orotonian; szczawian; wodoroszczawian; siarczan; wodorosiarczan; trichlorooctan; trifluorooctan; metanosulfonian; palmitynian i wodoropalmitynian.
  3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym liposom ponadto zawiera lipidy pomocnicze.
  4. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym lipid pomocniczy jest wybrany z grupy obejmującej cholesterol, 1-palmitoilo-2-oleoilofosfatydylocholinę lub dioleilofosfatydylocholinę.
PL386640A 1999-04-13 2000-04-11 Zastosowanie lipozomów zawierających związek o wzorze (II) ,jako nośnika do transportu leków lub substancji posiadających aktywność kosmetyczną PL211710B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT1999RM000220A IT1306129B1 (it) 1999-04-13 1999-04-13 Esteri della l-carnitina o di alcanoil l-carnitine utilizzabili comelipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL211710B1 true PL211710B1 (pl) 2012-06-29

Family

ID=11406659

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL351112A PL204418B1 (pl) 1999-04-13 2000-04-11 Estry L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityn, ich zastosowanie, lipozom zawierający przedmiotowy związek, zastosowanie lipozomu, oraz kompozycja zawierająca lipozom
PL386640A PL211710B1 (pl) 1999-04-13 2000-04-11 Zastosowanie lipozomów zawierających związek o wzorze (II) ,jako nośnika do transportu leków lub substancji posiadających aktywność kosmetyczną

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL351112A PL204418B1 (pl) 1999-04-13 2000-04-11 Estry L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityn, ich zastosowanie, lipozom zawierający przedmiotowy związek, zastosowanie lipozomu, oraz kompozycja zawierająca lipozom

Country Status (34)

Country Link
US (4) US6797281B1 (pl)
EP (3) EP1435232A1 (pl)
JP (2) JP4703855B2 (pl)
KR (2) KR100684378B1 (pl)
CN (2) CN100402017C (pl)
AT (2) ATE317257T1 (pl)
AU (2) AU776301B2 (pl)
BG (3) BG65501B1 (pl)
BR (2) BR0009765B1 (pl)
CA (2) CA2370143C (pl)
CZ (1) CZ302628B6 (pl)
DE (2) DE60017388T2 (pl)
DK (2) DK1426044T3 (pl)
EA (2) EA006021B1 (pl)
EE (2) EE05719B1 (pl)
ES (2) ES2234591T3 (pl)
HK (2) HK1045145B (pl)
HR (1) HRP20010740B1 (pl)
HU (1) HU229366B1 (pl)
IL (4) IL145765A0 (pl)
IS (2) IS2476B (pl)
IT (1) IT1306129B1 (pl)
ME (2) ME00113B (pl)
MX (1) MXPA01010359A (pl)
NO (2) NO327742B1 (pl)
NZ (2) NZ528874A (pl)
PL (2) PL204418B1 (pl)
PT (2) PT1426044E (pl)
RS (3) RS20090448A (pl)
SI (2) SI1183228T1 (pl)
SK (2) SK287253B6 (pl)
TR (2) TR200102941T2 (pl)
WO (1) WO2000061543A2 (pl)
ZA (1) ZA200109291B (pl)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1246792B1 (en) * 2000-01-13 2014-08-13 Emisphere Technologies, Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
DE10113446A1 (de) † 2001-03-19 2002-09-26 Schwarzkopf Gmbh Hans Haarbehandlungsmittel mit Betainen
PT2108362E (pt) * 2002-06-26 2013-07-11 Medigene Ag Preparação lipossomal catiónica que compreende um taxano
WO2004002468A1 (en) 2002-06-26 2004-01-08 Medigene Oncology Gmbh Method of producing a cationic liposomal preparation comprising a lipophilic compound
ITRM20040288A1 (it) * 2004-06-11 2004-09-11 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso della 7-t-butossiimminometilcamptotecina per la preparazione di un medicamento per il trattamento delle neoplasie dell'utero.
GT200500310A (es) * 2004-11-19 2006-06-19 Compuestos organicos
US20080095834A1 (en) * 2005-03-02 2008-04-24 Volkmar Weissig Mitochondriotropic Phospholipid Vesicles
SA06270147B1 (ar) 2005-06-09 2009-12-22 نوفارتيس ايه جي عملية لتخليق 5-(مثيل–1h–إيميدازول–1-يل )–3-(ثلاثي فلـورو مثيل)–بنزامـين
TW200800195A (en) * 2005-08-10 2008-01-01 Novartis Ag Organic compounds
MX2008001970A (es) * 2005-08-10 2008-03-24 Novartis Ag Formulaciones para 7-(t-butoxi)iminometil camptotecin.
WO2008024389A2 (en) * 2006-08-23 2008-02-28 Biodelivery Sciences International, Inc. Amphiphilic nucleotide cochleate compositions and methods of using the same
WO2008094959A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Pharmaceutical composition comprising a campothecin derivative
WO2008101173A2 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Cornell University Biodegradable compositions and materials
US20100204432A1 (en) 2007-05-28 2010-08-12 Husam Younes Biodegradable elastomers prepared by the condensation of an organic di-, tri- or tetra-carboxylic acid and an organic diol
WO2008154484A1 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Mannkind Corporation Ire-1a inhibitors
AU2009223222A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Enzymatic substrates for multiple detection systems
EP2532649B1 (en) * 2011-06-07 2015-04-08 Incella GmbH Amino lipids, their synthesis and uses thereof
WO2013032643A2 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Lipids capable of conformational change and their use in formulations to deliver therapeutic agents to cells
US20140274798A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Compounds and methods relating to lysosomal storage disorders
US11376324B2 (en) 2016-03-02 2022-07-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Sting activating nanovaccine for immunotherapy
CN110997624B (zh) 2017-06-06 2024-05-24 韦恩州立大学 与肉毒碱衍生的材料相关的方法和组合物
CN115177608B (zh) * 2022-07-26 2023-12-05 南方医科大学南方医院 长链酰基肉碱类化合物在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4866040A (en) * 1986-01-06 1989-09-12 Alfred Stracher Aminocarnitine directed pharmaceutical agents
US5008288A (en) * 1986-01-06 1991-04-16 Alfred Stracher Carnitine directed pharmaceutical agents
IT1230142B (it) * 1989-05-03 1991-10-14 Fidia Spa Derivati della carnitina, processo per la loro preparazione e impiego in terapia umana
DE69119074T2 (de) * 1990-06-15 1996-12-12 University Of North Carolina At Chapel Hill, Chapel Hill, N.C. Kovalente-ther lipidnukleosid-konjugate
IT1248321B (it) * 1991-05-15 1995-01-05 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso di esteri di acil l-carnitine con l'acido gamma-idrossibutirrico per produrre composizioni farmaceutiche per il trattamento di epatopatie
IT1258370B (it) * 1992-03-02 1996-02-26 Sigma Tau Ind Farmaceuti Esteri della l-carnitina e di acil l-carnitine dotati di attivita' miorilassante selettiva sull'apparato gastro-intestinale e composizioni farmaceutiche che li contengono.
US5972600A (en) * 1992-04-03 1999-10-26 The Regents Of The University Of California Separation of active complexes
IT1263013B (it) * 1992-10-20 1996-07-23 Avantgarde Spa Esteri della l-carnitina e di alcanoil l-carnitine con l'acido glicolico o suoi esteri e composizioni farmaceutiche contenenti tali per il trattamento di affezioni cutanee.
US5552156A (en) * 1992-10-23 1996-09-03 Ohio State University Liposomal and micellular stabilization of camptothecin drugs
US5512671A (en) * 1993-02-16 1996-04-30 Wake Forest University Ether lipid-nucleoside covalent conjugates
IT1261984B (it) * 1993-06-22 1996-06-11 Avantgarde Spa Uso di esteri della l-carnitina o di acil l- carnitine con idrossiacidi per produrre composizioni farmaceutiche per il trattamento di affezioni cutanee.
DE69407292T2 (de) * 1993-06-30 1998-06-25 Genentech Inc Verfahren zur herstellung von liposomen
IT1273987B (it) * 1994-09-29 1997-07-14 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso di esteri ftalidilidenici della carnitina e di alcanoil carnitine per il trattamento dello shock endotossico
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6316652B1 (en) * 1995-06-06 2001-11-13 Kosta Steliou Drug mitochondrial targeting agents
JP2001516329A (ja) * 1995-06-07 2001-09-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ポリヌクレオチド複合体の安定化
US5811406A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Regents Of The University Of California Dry powder formulations of polynucleotide complexes
IT1283955B1 (it) * 1996-03-20 1998-05-07 Sigma Tau Ind Farmaceuti Bis alcanoil esteri della carnitina ad attivita' antibatterica, antimicotica ed antiprotozoaria.
WO1998004720A1 (en) * 1996-07-26 1998-02-05 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and reagents for genetic immunization
US6056973A (en) * 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
US6071532A (en) * 1996-10-15 2000-06-06 Emory University Synthesis of glycophospholipid and peptide-phospholipid conjugates and uses thereof
IT1299172B1 (it) * 1998-05-06 2000-02-29 Sigma Tau Ind Farmaceuti Esteri perfluorurati di alcanoil l-carnitine utilizzabili quali lipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti

Also Published As

Publication number Publication date
YU70201A (sh) 2004-07-15
BR0009765A (pt) 2002-01-02
IL175366A (en) 2010-12-30
ES2258688T3 (es) 2006-09-01
KR100684378B1 (ko) 2007-02-20
EA200300745A1 (ru) 2003-12-25
EA006021B1 (ru) 2005-08-25
DK1183228T3 (da) 2005-05-17
ATE317257T1 (de) 2006-02-15
TR200102941T2 (tr) 2002-05-21
KR100798499B1 (ko) 2008-01-28
EP1426044B1 (en) 2006-02-08
HK1045145B (zh) 2006-01-27
EP1183228B1 (en) 2005-01-12
RS50911B (sr) 2010-08-31
EE05719B1 (et) 2014-08-15
SI1183228T1 (en) 2005-04-30
IS2539B (is) 2009-09-15
AU776301B2 (en) 2004-09-02
JP2002541238A (ja) 2002-12-03
BR0009765B1 (pt) 2013-11-05
AU2004224958B2 (en) 2007-11-22
BG109876A (en) 2008-02-29
US20070190128A1 (en) 2007-08-16
IS2476B (is) 2008-12-15
DK1426044T3 (da) 2006-06-12
BG105971A (en) 2002-08-30
US6797281B1 (en) 2004-09-28
EE201100028A (et) 2011-08-15
PT1183228E (pt) 2005-04-29
CN1359370A (zh) 2002-07-17
MXPA01010359A (es) 2002-05-06
US20040186175A1 (en) 2004-09-23
SK287253B6 (sk) 2010-04-07
IL175366A0 (en) 2006-09-05
JP2011042657A (ja) 2011-03-03
EE200100518A (et) 2002-12-16
EP1426044A1 (en) 2004-06-09
ITRM990220A1 (it) 2000-10-13
HK1045145A1 (en) 2002-11-15
WO2000061543A3 (en) 2001-01-11
CA2370143A1 (en) 2000-10-19
EA200101076A1 (ru) 2002-04-25
NO327742B1 (no) 2009-09-14
PL204418B1 (pl) 2010-01-29
DE60025961T2 (de) 2006-08-17
NO336949B1 (no) 2015-11-30
TR200202358T2 (tr) 2002-12-23
DE60017388D1 (de) 2005-02-17
MEP24008A (en) 2010-06-10
DE60017388T2 (de) 2006-03-30
IL145765A0 (en) 2002-07-25
EP1435232A1 (en) 2004-07-07
KR20060113799A (ko) 2006-11-02
DE60025961D1 (de) 2006-04-20
NO20014985D0 (no) 2001-10-12
BRPI0017460B1 (pt) 2016-04-19
EA004459B1 (ru) 2004-04-29
HRP20010740B1 (en) 2005-08-31
AU4312300A (en) 2000-11-14
CN100402017C (zh) 2008-07-16
EE05514B1 (et) 2012-02-15
CN1823731A (zh) 2006-08-30
PT1426044E (pt) 2006-06-30
NZ528874A (en) 2005-09-30
KR20010113794A (ko) 2001-12-28
CA2650202C (en) 2012-12-11
CZ302628B6 (cs) 2011-08-10
IT1306129B1 (it) 2001-05-30
HK1092732A1 (en) 2007-02-16
ZA200109291B (en) 2002-08-16
IS8719A (is) 2008-03-07
ATE286873T1 (de) 2005-01-15
JP5420507B2 (ja) 2014-02-19
NZ515270A (en) 2004-02-27
PL351112A1 (en) 2003-03-24
AU2004224958A1 (en) 2004-11-25
BG65312B1 (bg) 2008-01-31
HUP0201446A2 (en) 2002-08-28
IL185486A0 (en) 2008-01-06
HU229366B1 (en) 2013-11-28
HUP0201446A3 (en) 2002-11-28
EP1183228A2 (en) 2002-03-06
SI1426044T1 (sl) 2006-04-30
CA2650202A1 (en) 2000-10-19
US20050079209A1 (en) 2005-04-14
HRP20010740A2 (en) 2002-10-31
JP4703855B2 (ja) 2011-06-15
SK14312001A3 (sk) 2002-02-05
IL145765A (en) 2007-07-04
RS52682B (en) 2013-08-30
WO2000061543A2 (en) 2000-10-19
IS6095A (is) 2001-09-28
RS20090448A (en) 2010-06-30
CN1263730C (zh) 2006-07-12
US7585519B2 (en) 2009-09-08
CA2370143C (en) 2011-06-21
CZ20013617A3 (cs) 2002-02-13
BG65501B1 (bg) 2008-10-31
NO20085413L (no) 2001-10-12
NO20014985L (no) 2001-10-12
ME00113B (me) 2010-10-10
US7629003B2 (en) 2009-12-08
SK288246B6 (sk) 2015-03-03
ES2234591T3 (es) 2005-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5420507B2 (ja) 薬理活性のある化合物の細胞内送達のためのカチオン脂質として有用な、ｌ−カルニチンまたはアルカノイルｌ−カルニチンのエステル
JP2002538096A (ja) 生理活性複合体のリポソームへのカプセル化
WO2010095964A1 (en) A method for amphiphilic drug loading in liposomes by ion gradient
AU2007214359B2 (en) Esters of L-carnitine or alkanoyl L-carnitines useful as cationic lipids for the intracellular delivery of pharmacologically active compounds
KR20070023826A (ko) 미용 활성 화합물의 세포 내 전달을 위한 양이온성지질로서 유용한 ｌ-카르니틴 또는 알카노일 ｌ-카르니틴의에스테르함유 리포솜이

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification