ITRM990220A1 - Esteri della l-carnitina o di alcanoil l-carnitine utilizzabili come lipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti farmacolog - Google Patents

Esteri della l-carnitina o di alcanoil l-carnitine utilizzabili come lipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti farmacolog Download PDF

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ITRM990220A1
ITRM990220A1 IT1999RM000220A ITRM990220A ITRM990220A1 IT RM990220 A1 ITRM990220 A1 IT RM990220A1 IT 1999RM000220 A IT1999RM000220 A IT 1999RM000220A IT RM990220 A ITRM990220 A IT RM990220A IT RM990220 A1 ITRM990220 A1 IT RM990220A1
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Maria Ornella Tinti
Mose Santaniello
Luciana Critelli
Giovanni Salvatori
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Description

La presente invenzione riguarda una classe di nuovi esteri della L-carnitina e di acil L-camitine ed il loro uso quali lipidi cationici atti a favorire rimmissione (“delivery”) intracellulare di composti farmacologicamente attivi facilitandone il trasporto transmembrana o a promuoverne l’interazione con specifici siti (recettori) delle membrane cellulari.
La presente invenzione riguarda inoltre ulteriori esteri della L-carnitina e di acil L-camitine già noti, utili per gli stessi scopi dei composti nuovi sopra citati.
Con il termine immissione intracellulare o delivery si intende qui comprendere la transfezione cellulare con polinucleotidi o plasmidi di origine naturale o modificati, dotati di attività terapeutica (gene delivery) oppure l’introduzione nelle cellule di farmaci o di peptidi immunogenici (drug delivery).
Molte delle sostanze farmacologicamente attive, come ad esempio polipeptidi e proteine o farmaci in genere, per esercitare il loro effetto influenzando le funzioni cellulari a livello subcellulare o molecolare devono penetrare nell’interno delle cellule. Per queste molecole la membrana cellulare rappresenta una barriera selettivamente impermeabile. La membrana cellulare svolge infatti una funzione protettiva prevenendo l’ingresso di sostanze potenzialmente tossiche ma anche il passaggio di composti ad attività terapeutica. La complessa composizione delle membrane cellulari comprende fosfolipidi, glicolipidi e proteine; la sua funzione è influenzata da componenti citoplasmatici quali Ca++ ed altri ioni, anioni, ATP, microfilamenti, microtubuli, enzimi e proteine che legano il Ca++. L’interazione tra i componenti strutturali e citoplasmatici delle cellule e la risposta ai segnali esterni sono responsabili della selettività mostrata dai e tra i diversi tipi cellulari. L’effetto barriera delle membrane può essere superato dall’associazione di sostanze in complessi con formulazioni lipidiche che riproducono la composizione dei lipidi naturali delle membrane. Questi lipidi sono capaci di fondersi con le membrane e di rilasciare le sostanze ad essi associate aH'intemo delle cellule. I complessi lipidici possono non solo facilitare il trasferimento intracellulare mediante la fusione con le membrane, ma anche diminuire la repulsione di carica tra la membrana e la molecola che deve penetrare nella cellula. I lipidi anfipatici, come i fosfolipidi di membrana, formano vescicole lipidiche o liposomi nei sistemi acquosi.
I liposomi sono vescicole in cui un volume acquoso è interamente racchiuso da una o più membrane composte da molecole lipidiche, usualmente fosfolipidi. I fosfolipidi, che consistono di una testa idrofila e di una coppia di catene carboniose (coda idrofobica), rappresentano i maggiori componenti delle membrane biologiche. In soluzione acquosa le code idrofobiche si autoassociano ad escludere l’acqua, mentre le teste idrofiliche interagiscono con il mezzo formando spontaneamente popolazioni di vescicole con diametri che possono variare. I lipidi sono generalmente zwitterionici, neutri o anionici. Tali vescicole possono essere utilizzate come carrier di farmaci, di piccole molecole, proteine, nucleotidi e plasmidi.
Negli ultimi anni i liposomi cationici, una classe di vescicole cariche positivamente preparate da lipidi sintetici, sono ampiamente utilizzati per il trasferimento di materiale genetico airinterno delle cellule. La carica negativa del DNA può interagire con le cariche positive dei lipidi cationici formando un complesso stabile DNA-liposoma. La semplicità e la versatilità di questa tecnologia ha fatto dei liposomi un importante veicolo per il trasporto di geni per la terapia genica nell’uomo . Attualmente la maggior parte dei vettori utilizzati per la terapia genica ed approvati dalla NIH Recombinant Advisory Commitee includono sistemi virali e sintetici.
L’infezione virale comporta una serie di meccanismi complessi per poter colpire una specifica cellula e portare il DNA nel nucleo. Il principio dellùtilizzo di vettori virali per la terapia genica è basato sulla possibilità di sostituire i geni virali con geni che codificano per una funzione terapeutica, senza eliminare la capacità della particella virale di infettare le cellule. I limiti della terapia virale riguardano quegli elementi virali che possono essere immunogenici, citopatici e ricombinogenici.
Grandi speranze vengono poste nell’uso dei lipidi cationici per la terapia genica. Quésti vettori hanno una grande potenzialità rispetto a quelli di origine biologica essendo molto più sicuri, meno tossici ed avendo inoltre la possibilità di incorporare geni di grandi dimensioni.
Rispetto ai vettori di tipo biologico hanno però un basso rendimento di trascrizione genica intracellulare; tuttavia è da tener presente che l’utilizzo di tali sistemi di transfezione è in uno stadio iniziale di ricerca. I lipidi cationici giocano un ruolo molto importante nella formazione del complesso DNA-lipide, nell’interazione complessocellula, nella fusione con la membrana, nel rilascio del DNA all'interno della cellula e nella trascrizione.
Ci sono importanti esempi di applicazioni in vivo dei liposomi cationici. Il primo trial clinico di terapia genica umana fu condotto mediante l'introduzione di un vettore di espressione contenente il gene umano HLA-B7 complessato a liposomi per la cura del melanoma. Un’altra importante applicazione riguarda la cura della fibrosi cistica polmonare mediante somministrazione per via polmonare o come spray nasale del vettore di espressione SV-40C-FTR complessato a liposomi. Altri trial clinici che prevedono l’utilizzo dei liposomi nella terapia genica del cancro sono attualmente in corso.
Nella struttura dei lipidi cationici si individuano generalmente quattro elementi costitutivi: la testa cationica carica positivamente, lo spaziatore, il lipide ancora e il legame linker.
La testa cationica è responsabile delle interazioni tra i liposomi cationici ed il DNA, tra il complesso DNA-liposomi e la membrana cellulare e gli altri componenti della cellula. Essa è costituita da gruppi mono o policationici (in funzione del numero delle cariche) che possono essere variamente sostituiti.
Lo spaziatore rappresenta la parte della molecola che separa la testa cationica dalla coda idrofobica ed è coinvolto nelTassicurare un contatto ottimale tra la testa cationica e le cariche negative dei fosfati del DNA.
Il lipide ancora costituisce la parte non polare, idrocarburica della molecola e determina le proprietà fisiche del doppio strato lipidico come la rigidità e la velocità di scambio con i lipidi di membrana.
Per legame “linker" si intende il legame tra le catene idrocarburiche e la parte restante della molecola. Tale legame determina la stabilità chimica e la biodegradabilità dei lipidi cationici.
Negli ultimi anni nel settore della cosmesi i liposomi hanno trovato sempre maggiore applicazione. Il successo dei liposomi in questo campo è dovuto al fatto che questi composti sono molto ben tollerati dalla pelle. Essi vengono utilizzati sia come veicolo di principi attivi, che come composti favorenti l’assorbimento degli stessi.
La letteratura scientifica e brevettuale è ricca di riferimenti alla preparazione ed utilizzazione dei liposomi; tuttavia pochi sono i riferimenti che descrivono l’uso di derivati della carnitina utili per il gene delivery. Mentre, per il drug delivery non è stato reperito nessun documento di tecnica nota vicino ai composti della presente invenzione.
La domanda di brevetto EP 0 279 887 descrive l’uso di un derivato della carnitina e cioè della fosfatidilcarnitina eventualmente in miscele con altri fosfolipidi, e lipidi (colesterolo, fosfatidilcolina, fosfatidilserina), per la preparazione di liposomi.
Nell’esempio fornito riguardante la preparazione di liposomi, vengono prodotti liposomi di fosfatidilcarnitina che inglobano propranololo, farmaco, come noto, attivo quale antiipertensivo, antianginoso e antiaritmico. Il derivato della carni tina viene qui utilizzato per lo spiccato tropismo della camitina nei riguardi del miocardio. Tale tropismo consente di evitare che i liposomi vengano metabolizzati dal fegato anziché raggiungere il sito-bersaglio desiderato.
La presenza della fosfatidilcarnitina rende inoltre possibile la somministrazione di liposomi per via orale in quanto resistenti alle lipasi intestinali.
In J. Med. Chem. 1998 Jun 18;41(13):2207-15 vengono descritti alcuni esteri della L-camitina utili per il gene delivery, ma non vengono descritti o proposti come agenti utili per il drug delivery.
EP 559 625 B descrive alcuni esteri della L-camitina e di acil L-carnitine, rivendicati nella presente domanda, dotati di attività' miorilassante selettiva sull'apparato gastro-intestinale.
I biologi molecolari negli ultimi anni hanno identificato numerosi difetti a livello dei cromosomi che causano malattie ereditarie nell'uomo .
Un importante settore della medicina moderna è interessato alla cura di queste patologie su base genetica ereditaria, tramite l’uso di protocolli di terapia genica.
Come già detto, i liposomi cationici sono ampiamente utilizzati per Timmissione intracellulare di composti farmacologicamente attivi facilitandone il trasporto transmembrana o promuovendone l’interazione con specifici siti (recettori) delle membrane cellulari.
Questi vettori hanno una grande potenzialità rispetto a quelli di origine biologica essendo molto più sicuri, meno tossici ed avendo inoltre la possibilità di incorporare geni di grandi dimensioni. Rispetto ai vettori di tipo biologico hanno però un basso rendimento di trascrizione genica intracellulare.
Inoltre, il trasferimento di geni mediato da lipidi cationici convenzionali richiede che il DNA-plasmidico e i lipidi cationici vengano mantenuti separati, e la loro miscelazione venga effettuata immediatamente prima del trasferimento genetico.
Tentativi di stabilizzare questi complessi polinucleotidici fino ad ora non hanno dato risultati incoraggianti, infatti, essi rimangono stabili solo per un breve periodo.
Nel campo della terapia genica o gene delivery e del drug delivery è quindi molto sentita la necessità di avere a disposizione sistemi stabili, riproducibili, altamente sito-specifici ed attivi anche dopo un opportuno periodo di tempo.
E’ statò ora trovato che una classe di lipidi cationici potentemente attivi nel favorire l’immissione (delivery) intracellulare di composti farmacologicamente attivi è costituita da nuovi esteri della L-camitina e di acil L-camitine.
Questi nuovi composti sono stabili ed altamente selettivi perché sito-specifici nel raggiungere l’organo bersaglio.
Questa caratteristica li rende particolarmente utili per il trasporto di composti attivi direttamente al sito dove essi devono esplicare la loro attività farmacologica,
I composti della presente invenzione hanno formula generale (I):
(I)
in cui:
n è un numero intero compreso tra 1 e 3;
R è idrogeno o alcanoile, lineare o ramificato, avente 2-6 atomi di carbonio;
RI e R2 uguali o diversi rappresentano una catena acilica lineare, satura o insatura, avente 3-20 atomi di carbonio; e
X<" >è l’anione di un acido farmacologicamente accettabile.
Esempi di R sono acetile, propionile, butirrile, valerile, isovalerile. Esempi di RI e R2 sono esanoile, undecanoile, miristoile, palmitoile o oleoile. .
Esempi preferiti di composti in accordo con la presente invenzione sono:
- estere della L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil-l,3- dipalmitoil glicerolo (ST 770);
- estere della acetil L-camitina bromuro con 2-idrossiacetil- 1,3-dipalmitoil glicerolo (ST 771);
- estere della propionil L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil- 1,3-dipalmitoil glicerolo (ST 772);
- estere della isobutirril L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil 1,3 dipalmitoil glicerolo (ST 773);
- estere della isovaleril L-camitina bromuro con 2-idrossiacetil- 1,3-dipalmitoil glicerolo (ST 774);
- estere della L-camitina bromuro con 1,3 diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo (ST 810);
- estere della acetil L-carnitina bromuro con l,3-diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo (ST 809).
- estere della propionil L-carnitina bromuro con l,3-diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo (ST 808).
Per anione di acido farmacologicamente accettabile si intende Tardone di un acido che non dia origine ad indesiderati effetti tossici o collaterali.
Tali acidi sono ben noti ai farmacologi ed agli esperti di tecnologia farmaceutica.
Esempi non limitativi di tali anioni sono ad esempio cloruro; bromuro; ioduro; aspartato; aspartato acido; citrato; citrato acido; tartrato; tartrato acido; fosfato; fosfato acido; fumarato; fumarato acido; glicerofo sfato; glucosiofosfato; lattato; maleato; maleato acido; mucato; orotato; ossalato; ossalato acido; solfato; solfato acido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metansolfonato; pamoato e pamoato acido.
I composti di formula (I) sono agenti utili sia per il delivery di nucleotidi o plasmidi naturali o modificati utili in terapia genica, o che codificamo per un peptide o proteina utile come vaccino, che per il generale delivery di farmaci, quali ad esempio farmaci antitumorali, antivirali, antibatterici, antimicotici, antiprotozoarici, farmaci utili per la terapia di patologie del sistema cardiovascolare, o di peptidi immunogenici, ed altri farmaci utili in terapia.
I composti di formula (I) trovano inoltre una utile applicazione nella preparazione di composizioni cosmetiche, per il delivery di sostanze ad attività cosmetica, quali, ad esempio, idratanti, nutrienti, per la pulizia del viso, antirughe, anticellulite ed antismagliature.
I composti di formula (I) possono essere somministrati per via orale o parenterale, per via endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, transdermica o sotto forma di spray nasale od orale.
La presente invenzione riguarda inoltre ulteriori lipidi cationici di formula generale (II), già noti per un differente uso (EP 559 625 sopra citato). I composti di formula (II) sono esteri della L-carnitina, potentemente attivi nel drug delivery ed hanno caratteristiche di stabilità e selettività nel raggiungere Porgano bersaglio paragonabile ai composti di formula (I) precedentemente descritti.
Tali composti hanno formula generale:
(Il)
in cui:
R3 è una catena acilica lineare o ramificata, satura o insatura avente 4-26 atomi di carbonio;
R4 è una catena alchilica lineare o ramificata, satura o insatura, avente 4-26 atomi di carbonio; e
X<- >è l’anione di un acido farmacologicamente accettabile;
Esempi preferiti di R3 sono nonanoile, dodecanoile, miristoile, palmitoile, stearoile o oleoile.
Esempi preferiti di R4 sono nonile, undecile, tetradecile, esadecile o oleile.
Un esempio di composti specifici di formula (II), in accordo con la presente invenzione sono:
- palmitoil L-carnitina cloruro undecil estere (ST 983);
- stearoil L-camitina cloruro undecil estere (ST 1055);
- stearoil L-camitina cloruro tetradecil estere (ST 1351);
«
- palmitoil L-camitina cloruro tetradecil estere (ST 1379);
- miristoil L-camitina cloruro tetradecil estere (ST 1380);
- palmitoil L-camitina bromuro esadecil estere (ST 1390);
- oleil L-camitina cloruro oleil estere (ST 1392).
Alcuni composti di formula (II) e precisamente ST 1380, ST 1390 e ST 1392, sono noti e descritti nel citato J. Med. Chem. 1998 Jun 18;41(13):2207-15, come agenti utili per la preparazione di liposomi per la transfezione cellulare con polinucleotidi dotati di attività terapeutica, ma non sono mai stati descritti come agenti utili per la preparazione di liposomi per il drug delivery.
Il tecnico medio esperto del settore tecnica conosce bene le difficoltà che si incontrano nel preparare i complessi liposomafarmaco, infatti non è possibile a priori stabilire se un liposoma utile per il gene delivery è utilizzabile per il drug delivery a causa dei numerosi problemi che si devono superare per ottenere un liposoma capace di complessare un farmaco, e che lo veicoli preferenzialmente nell’organo dove esso deve esplicare la sua attività curativa.
I composti di formula (II) sono agenti utili sia per il delivery di nucleotidi o plasmidi naturali o modificati utili in terapia genica, o che codificano per un peptide o proteina utile come vaccino, che per il delivery di farmaci, quali, ad esempio, farmaci antitumorali, farmaci antiangiogenici, antivirali, antibatterici, antimicotici, antiprotozoarici, farmaci utili per la terapia di patologie del sistema cardiovascolare, o di peptidi immunogenici, ed altri farmaci utili in terapia.
I composti di formula (II) trovano inoltre una utile applicazione nella preparazione di composizioni cosmetiche, per il delivery di sostanze ad attività cosmetica, quali, ad esempio, idratanti, nutrienti, per la pulizia del viso, antirughe, anticellulite ed antismagliature.
I composti di formula (II) possono essere somministrati per via orale o parenterale, per via endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, transdermica o sotto forma di spray nasale od orale.
La presente invenzione riguarda altresì ulteriori lipidi cationici di formula generale (III), già noti per un differente uso (EP 559 625 sopra citato). I composti di formula (III) sono esteri della L-carnitina, potentemente attivi nel favorire il delivery intracellulare di polinucleotidi o plasmidi (gene delivery) ed hanno caratteristiche di stabilità e selettività nel raggiungere l’organo bersaglio paragonabile ai composti di formula (I) precedentemente descritti.
Tali composti hanno formula generale:
m cui:
R5 è una catena acilica lineare o ramificata, satura o insatura avente «
4-26 atomi di carbonio;
R6 è una catena alchilica lineare o ramificata, satura o insatura, avente 4-26 atomi di carbonio; e
X<~ >è Tanione di un acido farmacologicamente accettabile;
con la condizione che:
quando R5 è stearoile R6 non è stearile,
quando R5 è oleoile R6 non è stearile,
quando R5 è palmitoile R6 non è palmitoile,
quando R5 è miristoile R6 non è miristoile,
quando R5 è lauroile R6 non è laurile,
quando R5 è oleile R6 non è oleile.
Esempi preferiti di R5 sono nonanoile, dodecanoile, miristoile, palmitoile, stearoile o oleoile.
Esempi preferiti di R6 sono nonile, undecile, tetradecile, esadecile o oleile.
Esempi preferiti di composti di formula (III), in accordo con la presente invenzione sono:
- palmitoil L-carnitina cloruro undecil estere (ST 983);
- stearoil L-carnitina cloruro undecil estere (ST 1055);
stearoil L-carnitina cloruro tetradecil estere (ST 1351);
- palmitoil L-camitina cloruro tetradecil estere (ST 1379).
I composti di formula (III) sono agenti utili per il delivery di nucleotidi o plasmidi naturali o modificati utili in terapia genica o che «
codificano per un peptide o proteina utile come vaccino.
I composti di formula (III) possono essere somministrati per via orale o parenterale, per via endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, transdermica o sotto forma di spray nasale od orale.
Il procedimento per la preparazione dei composti di formula (I) secondo l’invenzione è rappresentato nel seguente schema di reazione:
SCHEMA DIREAZIONE
Con riferimento al precedente schema di reazione 1, viene di seguito illustrata la preparazione deicompostidiformula (I)secondo l’invenzione.
ESEMPIO 1
Preparazione dell'estere della propionil L-carnitina bromuro con 2-idrossi acetil 1,3 dipalmitoil glicerolo (ST 772)
a) Preparazione dell<,>1.3-diidrossipropan-2-one 1,3-dipalmitato (1) Diidrossiacetone (7g ; 0,078 moli) venne sciolto in 300 ml di cloroformio anidro a 0°C (temperatura esterna) sotto flusso di azoto anidro.
Alla soluzione così ottenuta vennero aggiunti goccia a goccia cloruro di palmitoile (44 g; 0, 16 moli) e piridina anidra (15 mL).
La risultante miscela, la cui temperatura venne fatta salire a temperatura ambiente, venne mantenuta sotto agitazione per 24 ore.
Successivamente la miscela venne estratta nell’ordine: con 300 mL di una soluzione acquosa di acido cloridrico allo 0,5%, 300 mL di una soluzione acquosa di sodio bicarbonato al 5% ed infine con 300 mL di acqua.
La fase organica separata venne anidrificata su sodio solfato anidro, filtrata su filtro di cellulosa e concentrata a secco ottenendo il prodotto (1) grezzo.
Il prodotto (1) puro venne ottenuto per cristallizzazione da 500 mL di alcol etilico.
Si ottennero 30,4 g del prodotto (1).
Resa 73%
P.F =80-81°C
HiNMR(CDCl3): 0,9(6H} t, CH3CH2-); 1,3(48H, m, (CH2)n=24); 1,55(4H, m, -OCOCH2CH2-); 2,4(4H, t, -OCOCH2-); 4,7(4H, s, -OCCH2-). b) Preparazione dell’l, 2, 3-triidrossipropano-l,3-dipalmitato (2) Al prodotto (1) (5 gr, 9 mmoli), sciolto in tetraidrofurano (125 mL) e toluene (25 mL) sotto agitazione venne aggiunta lentamente acqua (7,5 mL).
La temperatura della sospensione bianco latte ottenuta venne portata a 5°C (temperatura esterna) e venne aggiunto a piccole porzioni sodio boroiclruro (500 mg; 13 mmoli). La sospensione venne tenuta sotto agitazione per 30 minuti a 5°C.
Successivamente venne aggiunto lentamente acido acetico glaciale fino a cessazione dell’effervescenza che venne prodotta dalla decomposizione dell'eccesso di sodio boroidruro ottenendo infine una soluzione.
Alla soluzione venne aggiunto cloroformio (100 mL) ottenendo la formazione di un sistema bifasico.
Venne separata la fase organica inferiore costituita da CHCh che venne estratta nell’ordine: con acqua (25 mL), sodio bicarbonato (25 mL di soluzione acquosa al 10%) e acqua (25 mL).
La soluzione organica che contiene il prodotto (2) venne anidrificata su sodio solfato, filtrata e concentrata a secco ottenendo un prodotto ceroso.
Il prodotto (2) venne ottenuto per cristallizzazione da acetone del grezzo ceroso.
Si ottennero 4,8 gr di prodotto (2).
Resa 94%.
P.F= 71-72°C
H<i>NMR(CDCl3): 0,9(6H, t, CH3CH2-); 1,3(48H, m, (CH2)n-24); 1,55(4H, m, -OCOCH2 CH2 -) ; 2,4(4H, t, -OCOCH2-); 4,2(5H, m, -CHCH20-Ì. c) Preparazione dell<,>l,3-dipalmitoil-2-brom.oacetilglicerolo f31
Il prodotto (2) (2,5 gr; 4,4 mmoli) venne solubilizzato in cloroformio anidro (50 mL) sotto agitazione e a 0°C (temperatura esterna).
Alla soluzione così ottenuta , vennero aggiunti lentamente *
piridina (0,42 ml) e goccia a goccia 3 ml d i una soluzione cloroformica contenente bromo-acetilcloruro (0,43 mL; 5,2 mmoli).
La miscela di reazione venne tenuta per 30 minuti a 0°C (temperatura esterna) e 30 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente la miscela di reazione venne trattata nell’ordine con: una soluzione acquosa di acido cloridrico all’1% (circa 50 mL), soluzione acquosa di sodio bicarbonato al 5% (circa 50 mL) e acqua.
Il prodotto (3) venne purificato per cristallizzazione da acetone, dopo aver anidrificato (con sodio solfato) e concentrato a secchezza la miscela di reazione.
Vennero ottenuti 2,5 gr di prodotto (3).
Resa 89%.
P.F.= 46-47°C
H<1>NMR(CDCl3): 0,9(6H, t, CH3CH2-); 1,3(48H, m, (CH2)n=24); 1,55(4H, m, -OCOCH2CH2-); 2,4(4H, t, -OCOCH2-); 3,9(2H, s, -OCH2COO-) 4,2-4,4(5H, m, -CHCH2O-); 5,25(1H, m, CHCH20-)
d) Preparazione dell'estere L-propionilcarnitina bromuro con 2-idrossiacetil- 1,3-dipalmitoilglicerolo (4)
L-propionil carnitina sale interno (0,95 gr, 4,4 mmoli) precedentemente essiccata sotto vuoto a 40°C venne sospesa in dimetilformammide anidra (circa 20 mL).
Alla sospensione venne aggiunto a piccole porzioni il prodotto (3) (3 gr, 4,7 mmoli). La sospensione venne lentamente riscaldata fino a 38°C e tenuta in queste condizioni fino ad ottenere una soluzione.
Dopo 10 minuti la soluzione venne portata per 30 minuti a 0°C. Si ottennne un precipitato che filtrato e lavato con etere etilico, venne sciolto in cloroformio (100 mL). La soluzione opalescente ottenuta (30 mL) venne filtrata su celite e concentrata. A quest’ultima soluzione venne aggiunto esano (100 mL) ed il precipitato del prodotto (4) ottenuto venne filtrato ed essiccato sottovuoto a 35°C.
Si ottennero 3, 19 gr del composto del titolo.
Resa 80%.
P.F.=127-128°C
[a] <25 >D =-3,9 (O1 % Cloroformio)
Analisi elementare per C47H88BrNOio
C% H% N% Br% Calcolato 62,23 9,78 1,54 8,81 Trovato 62,73 10, 15 0,79 8,77 H<i >NMRfCDCla) :0,9-0,95(6H, t, CH3CH2CH2-); l,1 -l,2(3H,t, CH3CH2CO); 1,2-1,4(24H, m, CH2n=24); 1,5-1, 6(4H, m, -OCCH2CH2-); 2,3-2,4(4H, t, -OCCH2CH2-); 2,4-2,45(4H, d.d., -CHCH20-); 2,95(2H, d, -CH2COOCH2COO-); 3,5(9H„ s, N(CH3)3); 4,2(4H, m, -CH20COCH2-); 4,35(2H, m, -CH2N-); 4,65(2H, d,d, -OCH2CO-); 5,25(1H, m, -O CH2CHCH20-); 5,75(1H, m, -CHCH2N-).
ESEMPI 2-7
Analogamente all'esempio precedente furono preparati i seguenti composti:
«
- estere della L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil-l,3- dipalmitoil glicerolo (ST 770);
- estere della acetil L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil- 1,3-dipalmitoil glicerolo (ST 771);
- estere della isobutirril L-camitina bromuro con 2-idrossiacetil 1,3 dipalmitoil glicerolo (ST 773);
estere della isovaleril L-camitina bromuro con 2-idrossiacetil- 1,3-dipalmitoil glicerolo (ST 774);
- estere della L-carnitina bromuro con 1,3 diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo (ST 810);
- estere della acetil L-carnitina bromuro con l,3-diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo (ST 809).
- estere della propionil L-carnitina bromuro con l,3-diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo (ST 808),
Una realizzazione pratica preferita della presente invenzione è rappresentata dalla preparazione di liposomi con farmaci antitumorali, in particolare di liposomi che veicolano delle camptotecine di formula generale (IV):
dove: R7 è un gruppo -C(Ru)=N-O(n)R10, nel quale R10 è idrogeno oppure un gruppo C1-C5 alchile 0 C1-C5 alchenile, lineare o ramificato, o C3-C10 cicloalchile, 0 (C3-C10) cicloalchile - (C1-C5) alchile lineare o ramificato, o C6-C14 arile, 0 (C6-C14) arile - (C1-C5) alchile lineare 0 ramificato, o un gruppo eterociclico o eterociclo - (C1-C5) alchile lineare o ramificato, detto gruppo eterociclico contenente almeno un eteroatomo scelto fra atomo di azoto, eventualmente sostituito con un gruppo ( C1-C5) alchile, e/o ossigeno e/o zolfo; detti gruppi alchile, alchenile, cicloalchile, arile, arile-alchile, eterociclico o eterocicloalchile, potendo essere eventualmente sostituiti con uno o più gruppi scelti fra: alogeno, idrossi, C1-C5 alchile, C1-C5 alcossi, fenile, ciano, nitro, -N R12 R13, dove R12 e R13, uguali 0 diversi fra loro sono idrogeno, (C1-C5) alchile lineare o ramificato, il gruppo -COOH 0 un suo estere farmaceuticamente accettabile; oppure il gruppo -CONR14R15, dove R1 e R15, uguali o diversi fra loro sono idrogeno, (C1-C5) alchile lineare o ramificato; oppure
R10 è un residuo C6-C1 aroile, eventualmente sostituito con uno o più gruppi scelti fra: alogeno, idrossi, C1-C5 alchile lineare 0 ramificato, C1-C5 alcossi lineare o ramificato, fenile, ciano, nitro, -NR16R17, dove R16 e R17, uguali 0 diversi fra loro sono idrogeno, C1-C5 alchile lineare 0 ramificato;
R10 è un residuo poliamminoalchile; oppure
R10 è un residuo glicosilico;
n è il numero 0 oppure 1 ;
R11 è idrogeno, C1-C5 alchile, lineare o ramificato, C1-C5 alchenile, lineare o ramificato, C3-C10 cicloalchile, ( C3-C10) cicloalchile - (C1-C5) alchile lineare o ramificato, C6-C1 arile, ( C6-C1) arile - (C1-C5) alchile lineare o ramificato;
R8 e R9, uguali 0 diversi fra loro sono idrogeno, ossidrile, C1-C5 alcossi, lineare o ramificato;
i loro N1-ossidi, i singoli isomeri, in particolare gli isomeri syn e anti del gruppo -C(Rn)=N-O (n) R10, i loro possibili enantiomeri, diastereoisomeri e relative miscele, i loro sali farmaceuticamente accettabili e i loro metaboliti attivi.
I composti di formula (IV) sono descritti nella domanda di brevetto europeo n. 99830124.9, depositata il 9 marzo 1999.
Per quanto riguarda i composti di formula (IV) nei quali n è 1 e R10 è come definito sopra, con l’eccezione di aroile, possono essere preparati a partire dalla camptotecina 7-aldeide (formula la, RI I idrogeno) o 7-cheto camptotecina (formula IVa, RI I diverso da idrogeno).
dove R7 è il gruppo -C(Rn)=0, e Ru è come definito per la formula (IV), Re e Rg sono come definiti in formula (IV). Il composto di formula (IVa) viene fatto reagire con il composto di formula (Va) R10O-NH2, dove R10 è come sopra, per dare composti di formula (I), nei quali R7 è il gruppo -C(Ru)=N-O-R10, R10 è definito come in formula (IV), tranne aroile.
La reazione può essere condotta con metodi convenzionali noti all’esperto dell’arte, trattandosi di una normale formazione di ossime. Preferibilmente, il rapporto molare tra camptotecina 7-aldeide o 7-cheto e idrossilammina è compreso fra 1:3 e 3: 1. Possono essere anche usati i sali delle idrossilammine di interesse. La reazione è condotta in presenza di una base, ad esempio una base inorganica, quale carbonato di potassio, od organica, quale trietilammina o diazabiciclononene, utilizzando solventi polari, preferibilmente metanolo o etanolo e conducendo la reazione a una temperatura compresa tra la temperatura ambiente e quella di ebollizione del solvente, eventualmente in presenza di agenti disidratanti, ad esempio solfato di sodio o di magnesio, setacci molecolari. Se desiderato è anche possibile condurre la reazione in presenza di un catalizzatore, ad esempio un acido di Lewis.
In via alternativa, i composti suddetti possono essere preparati dall’ossima della camptotecina 7-aldeide (ottenuta come descritto in Sawada et al Chem. Pharm. Bull. 39, 5272 (1991)), o 7-chetone oppure dalla corrispondente 7-acilcamptotecina per reazione con un alogenuro R10-X, dove X è preferibilmente iodio, in un solvente polare, ad esempio tetraidrofurano o alcoli, e in presenza di una base, ad esempio sodio idruro o potassio carbonato.
Per quanto riguarda i composti di formula (IV) nei quali n è 1 e R10 è aroile, come definito per la formula (IV), questi possono essere preparati a partire dalla camptotecina 7-ossima, la cui preparazione è stata descritta nel paragrafo precedente, con cloruri acilici RLO-COCl , in solventi polari, e in presenza di una base, preferibilmente piridina, o direttamente in piridina, come descritto da Cho et al. J. Org. Chem.
62, 2230 (1997).
Per quanto riguarda i composti di formula (IV) nei quali n è 0 e R10 è come definito sopra, con Teccezione di aroile, possono essere preparati a partire dalla camptotecina 7-aldeide (formula IVa, R11 idrogeno) o 7-cheto camptotecina (formula IVa, Rn diverso da idrogeno) .
dove R7 è il gruppo -C(Rn)=0, e Rn è come definito per la formula (IV), Rs e R9 sono come definiti in formula (IV). Il composto di formula (IVa) viene fatto reagire con il composto di formula (Vb) R10-NH2, dove R10 è come sopra, per dare composti di formula (IV), nei quali R7 è il gruppo -C(Rn)=N-R10, R10 è definito come in formula (IV), tranne aroile. La reazione può essere condotta con metodi convenzionali noti all'esperto delfarte, trattandosi di una normale formazione di immine. Preferibilmente, il rapporto molare tra camptotecina 7-aldeide 0 7-cheto e immina è compreso fra 1:3 e 3:1: Possono essere anche usati i sali delle animine di interesse. La reazione è condotta in presenza di una base, ad esempio una base inorganica, quale carbonato di potassio, od organica, quale trietilammina o diazabiciclononene, utilizzando solventi polari, preferibilmente metanolo o etanolo e conducendo la reazione a una temperatura compresa tra la temperatura ambiente e quella di ebollizione del solvente, eventualmente in presenza di agenti disidratanti, ad esempio solfato di sodio o di magnesio, setacci molecolari. Se desiderato è anche possibile condurre la reazione in presenza di un catalizzatore, ad esempio un acido di Lewis (come ad esempio descritto da Moretti e Torre, Synthesis, 1970, 141; o da Kobayashi et al, Synlett, 1977, 115).
La camptotecina 7-aldeide e la camptotecina 7-ossima sono descritte nella domanda di brevetto EP 0056692 e nel citato Sawada et al Chem. Pharm. Bull. 39, 5272 (1991),
Gli Ni-ossidi dei composti di formula (IV) sono preparati secondo metodi noti di ossidazione di azoto eteroaromatico, preferibilmente per ossidazione con acido acetico o trifluoroacetico e perossido di idrogeno, o per reazione con perossiacidi organici (A.Albini e S. Pietra, Heterocyclic N-oxides, CRC, 1991).
Per quanto riguarda i vari significati di R10, presente nei diversi reattivi di formula V, questi reattivi sono disponibili in commercio, oppure possono essere preparati secondo metodi noti in letteratura, ai quali l'esperto del settore può ricorrere, integrando con la propria conoscenza della materia.
Sali farmaceuticamente accettabili sono ottenuti con metodi convenzionali di letteratura, e non necessitano di ulteriore descrizione.
Esempio 8
7-benzilossiimminometilcamptotecina (CPT 172)
Si sciolgono 500 mg (1,33 mmoli) di 7-formilcamptotecina in 100 ml d i etanolo. Si aggiungono 15 ml d i piridina è 638 mg (4mmoli) di O-benzilidrossilammina cloridrato. Si lascia 5 ore a ricadere. Il solvente viene evaporato soto vuoto e il residuo così ottenuto viene purificato tramite cromatografia flash su gel di silice utilizzando come eluente una misclea di esano /acetato di etile 4/6.
Resa 65%
p.f.: 200-205°C dee.
Il prodotto ottenuto è costituito da una miscela circa 8:2 dei due isomeri sin e anti (isomero A: Rf 0,32; isomero B, Rf: 0, 19 su gel di silice Merck 60 F254, eluente esano/acetato di etile 3/7).
HPLC: le analisi sono state condotte su un apparecchio dotato di una pompa quaternaria (HP 1050) con iniettore Rheodyne (loop da 20 μl) e di un rivelatore a schiera di diodi (Hp 1050) gestito dal programma HPLC-ChemStation. L’acquisizione degli spettri è stata fatta da 200 a 600 nm e i cromatogrammi sono stati registrati a 360 e 400 nm.
È stata utilizzata una colonna C18 a fase inversa (Rainin CI 8; 25x0,4 cm, Varian) con una precolonna RP18. L’analisi è stata condotta con un gradiente di eluizione lineare, partendo da acetonitrile: acqua 30:70 a acetonitrile 100% in 20 min, con flusso 1 mi/ min. I tempi di ritenzione sono stati: 12,51 min per l’isomero B e 14,48 per l’isomero A.
iH-NMR (300 MHz; DMSO-de).: δ: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,87 8m, H2-19A+H2-19B), 5,18 (s, H2-5B), 5,21 8s, H2-Ph B), 5,30 (H2-Ph A), 5,40 (s, H2-5A), 5,45 (s, H2-17A+H2-17B), 6,53 (s, -OH A+-OH B), 7,3-7,6 (m, Ar A+ Ar B+H-14A+ H-14B), 7,75 (m, H- 11A+H- 1 1B), 7,85-7-95 (m, H10A+H-10B), 7.98 (dd, H-12B), 8, 18-8,27 (m, H-12A+H9-B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (dd, H-9A), 9,38 (s, CH=N A).
Massa m/z 481 (M<+ >100) 374 (30)330(70)300(30)273(20)243(20)91(34).
ESEMPIO 9
7-butossiimminometilcamptotecina (CPT 184)
Si sciolgono 400 mg (1,06 mmoli) di 7-formilcamptotecina in 80
«
ml d i etanolo. Si aggiungono 12 ml d i piridina e 400 mg (3,18 mmoli) di O-t-butilidrossilammina cloridrato. Si lascia 4 ore a ricadere. Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo così ottenuto viene purificato tramite cromatografia flash su gel di silice utilizzando come eluente una miscela di esano/ acetato di etile 4/6. Si ottengono 322 mg (0,72 mmoli) di un solido giallo.
Resa 68%
p.f.: 250°C dee.
Il prodotto ottenuto è costituito da una miscela circa 8:2 dei due isomeri sin e anti (isomero A: Rf 0,31; isomero B,
Rf: 0,24 su gel di silice Merck 60 F254, eluente esano/ acetato di etile 3/7).
HPLC-. le analisi sono state condotte su un apparecchio dotato di una pompa quaternaria (HP 1050) con iniettore Rheodyne (loop da 20 μl) e di un rivelatore a schiera di diodi (HP 1050) gestito dal programma HPLC-ChemStation. L’acquisizione degli spettri è stata fatta da 200 a 600 nm e i cromatogrammi sono stati registrati a 360 e 400 nm.
È stata utilizzata una colonna C18 a fase inversa (Rainin C18; 25x0,4 cm, Varian) con unaprecolonna RP18. L’analisi è stata condotta con un gradiente di eluizione lineare, partendo da acetonitrile: acqua 30:70 a acetonitrile 100% in 20 min, con flusso 1 ml/min. I tempi di ritenzione sono stati: 12,92 min per l’isomero B e 14,61 per l’isomero A.
<i>H-NMR (300 MHz; DMSO-de): 5: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,30 (s, tbut.B), 1,47 (s, t-but.A) 1,87 (m, H2-19A+H2-19B) 5, 18 (s, H2-5 B), 5,37 (H2-5 A), 5,42 (s, H2-17A+H2-17B), 6,54 (s, -OH A+-OH B), 7,35 (s H-14A), 7,36 (s, H-14B) 7,69-7,83 (m, H-11A+H-1 1B), 7,85-7-98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16-8,27 (m, H-9A+H-12B) 8,40 (s, CH B), 8,62 {dd, H-12A), 9,31 (s, CH A).
Massa m/z 448 (M<+ >28) 391 (40)374(100)362(40)330(34)57(17).
Preparazione di liposomi
Con i composti secondo l’invenzione possono essere preparati liposomi multilamellari (MLV) e liposomi unilamellari (SUV), sia sotto forma di polveri secche che come sospensioni in soluzioni acquose.
I composti secondo l’invenzione preparati come descritto negli esempi 1-7, vengono utilizzati per preparare i liposomi seguendo il seguente procedimento. Un opportuno quantitativo del composto viene sciolto in cloroformio, la soluzione venne concentrata sotto vuoto a secchezza in un evaporatore rotante fino ad ottenere un film lipidico. Il film lipidico venne essiccato sotto alto vuoto fino ad eliminare le ultime tracce di solvente, venne quindi sciolto in alcol tert- butilico o con acqua, la soluzione così ottenuta viene liofilizzata con ottenimento di una soffice polvere secca.
Le polveri vengono idratate con un’opportuna quantità di soluzione acquosa ottenendo il liposoma del composto utilizzato, che successivamente viene complessato con il polinucleotide o con il farmaco desiderato.
Un altro metodo di preparazione dei liposomi consiste nel fare adsorbire un film lipidico, costituito da un composto dell’invenzione disciolto in un solvente, su di un opportuno supporto inerte quale sorbitolo, mannitolo od altri carboidrati farmacologicamente accettabili. Si porta a secco sotto vuoto con ottenimento di un solido, il quale può essere idratate facilmente e molto rapidamente prima dell’uso.
Le preparazioni sotto forma di polveri secche hanno il vantaggio di essere stabili per lunghi periodi, e sono facilmente utilizzabili.
Inoltre, con i composti secondo l’invenzione è possibile preparare liposomi complessati con DNA o con il farmaco desiderato, sotto forma di polvere secca, con il seguente procedimento. Il composto secondo l’invenzione venne sciolto in alcol tert-butilico o con acqua, nella soluzione così ottenuta venne miscelato il DNA o il farmaco desiderato, questa miscela venne liofilizzata con ottenimento del complesso che possiamo definire proliposoma-DNA o proliposoma- farmaco, sotto forma di soffice polvere secca.
Le polveri così ottenute (proliposomi)po ssono essere utilizzate per la preparazione di composizioni farmaceutiche somministrabili per via aere sotto forma di aerosol, oppure una volta ricostituite con acqua, o con un opportuno tampone, si ottiene il liposoma complessato che può essere somministrato per via parenterale o orale.
Liposomi complessati a DNA o a farmaci, in forma solida, si possono ottenere anche con il metodo di adsorbimento del film lipidico, su di un supporto inerte quale sorbitolo, mannitolo od altri carboidrati, con il metodo precedentemente descritto.
Il controllo della formazione dei liposomi
Il controllo della formazione dei liposomi venne effettuato tramite un metodo colorimetrico, con colorante idrosolubile, con il seguente procedimento. Venne preparata una soluzione acquosa del colorante idrosolubile ArsenazoIII (p.m.=776,37; 2,3 mg/mL).
Questa soluzione venne utilizzata al posto dell’acqua, per idratare i films lipidici provenienti dalle suddette preparazione.
Un’aliquota della sospensione contenente il liposoma che incapsula il colorante venne diluita 100 volte con acqua.
Con 2 mL della sospensione liposomica venne effettuata la prima lettura di densità ottica a 660 nm; la lettura venne effettuata contro un campione uguale definito bianco. Quindi al primo campione si aggiunsero 200 μl di una soluzione di CaCl2 (15 mg/mL; 100 mM) effettuando una misura di densità’ ottica sempre a 660 nm contro il bianco al quale venne addizionato di 200 μl di acqua. Il valore di assorbanza ottenuto venne indicato come lettura 2. Si prosegui’ aggiungendo al campione 100 μl di una soluzione di Triton X-100 ( 5% v/v; 0,26 % concentrazione finale) ed al bianco 200 μl di acqua; la lettura di densità’ ottica a 660 nm forni’ il valore di densità’ ottica definito come lettura 3. Per calcolare la percentuale di colorante incapsulato si applico’ la seguente formula:
% di colorante incapsulato= Lettura 3- Lettura 2 x100
Lettura3
La percentuale di colorante incapsulato dà una misura della formazione del liposoma ed è in media circa il 40%.
Il controllo della dimensione dei liposomi è stato effettuato con il Laser Light Scattering con esito positivo.
ESEMPI DI PREPARAZIONE DI LIPOSOMI
Preparazione dei liposomi di palmitoil L-carnitina cloruro undecil estere (ST 983) sotto forma di:
a) Polveri liofilizzate
65 mg; 0, 11 mmoli di palmitoil-L-carnitina cloruro undecil estere vennero sciolti in 20 mL cloroformio, in un pallone da 100 mL.
La soluzione venne evaporata fino ad ottenere un film lipidico che venne essiccato sotto vuoto per 3 ore. Il prodotto così ottenuto venne sciolto in 10 mL di alcol tert- butilico e questa soluzione venne raffreddata rapidamente a -70° C con azoto liquido e liofilizzata per 24 ore.
Si ottenne un solido soffice bianco spugnoso.
b) Polveri adsorbite
143 mg, 0,231 mmoli di palmitoil L-carnitina cloruro undecil estere vennero sciolti in 10 mL di cloroformio. La soluzione così ottenuta venne versata a piccole porzioni in un pallone da 100 mL contenente 750 mg di sorbitolo. Alla fine dell’aggiunta delle varie porzioni della soluzione cloroformica, il cloroformio venne rapidamente evaporato.
Il solido così ottenuto venne essiccato per 3 ore sotto vuoto.
Si ottennero 893 mg di un prodotto solido bianco.
Prima dell’uso si idrata rapidamente con un opportuno volume di acqua, per ottenere una soluzione isotonica.
c) Sospensioni MLV
65 mg, 0, 11 mmoli di palmitoil-L-carnitina cloruro undecil estere vennero sciolti in 20 mL di cloroformio, in un pallone da 100 mL.
La soluzione così ottenuta venne evaporata fino ad ottenere un film lipidico che venne essiccato sotto vuoto per 3 ore.
Il film lipidico venne idratato con lOmL di acqua, a 30° C, per 3 ore con ottenimento di una sospensione MLV.
La sospensione di MLV, opportunamente diluita venne complessata con un polinucleotide o con un farmaco ed utilizzata per i saggi biologici.
e) Sospensioni SUV
65 mg, 0,11 mmoli di palmitoil L-carnitina cloruro undecil estere vennero sciolti in 20 mL di cloroformio, in un pallone da 100 mL.
La soluzione così ottenuta venne evaporata fino ad ottenere un film lipidico che venne successivamente essiccato sottovuoto per 3 ore.
Il film lipidico venne idratato con 10 mL di acqua, a 30°C, per 3 ore con ottenimento di una sospensione MLV.
La sospensione di MLV venne estrusa per 10 volte attraverso un filtro di policarbonato avente pori di dimensioni di 200 nm. La sospensione di liposomi unilamellari così ottenuta venne complessata con un polinucleotide o un farmaco ed utilizzata per i saggi biologici, f) Controllo della stabilita* fìsica dei liposomi
Il controllo della stabilita’ fisica della sospensione liposomica venne effettuato tramite misure di turbidimetria per un periodo di tempo di 30 giorni.
Per ogni sospensione da controllare venne effettuata una misura di assorbenza, a 600 nm, per un certo intervallo di tempo. La misura media di assorbanza registrata al tempo zero si mantenne costante per tutte le formulazioni controllate.
Le molecole considerate hanno avuto un comportamento conforme nei tempi considerati.
Sospensioni di liposomi MLV e SUV possono essere preparate associando i composti secondo l’invenzione con lipidi helper quali il colesterolo o la dioleil fosfatidii colina (DOPE).
L’associazione con lipidi helper viene effettuata con lo scopo di ottenere liposomi con membrane più stabili. Di seguito, nella parte in cui viene descritta la preparazione dei liposomi, viene riportato un esempio di preparazione in cui si associa un composto secondo l’invenzione con un lipide helper quale il colesterolo,
ESEMPI DI PREPARAZIONE DI LIPOSOMI PER IL DRUG DELIVERY ESEMPIO 10
Preparazione di liposomi MLV Taxolo-ST 983 (1:40)
20 mg, 0,0234 mmoli di taxolo e 556 mg, 0,9417 mmoli di ST 983 vennero sciolti in 20 mL cloroformio.
La soluzione venne concentrata fino ad ottenere un film lipidico sulla superficie del pallone di vetro.
Dopo aver eliminato le ultime tracce di cloroformio con una pompa ad alto vuoto, al film lipidico vennero aggiunti 20 mL di alcol tert-butilico e la soluzione così ottenuta venne suddivisa in 19 frazioni che vennero immediatamente congelate a -70° C con azoto liquido e liofilizzate per 24 ore. Ogni frazione di solido conteneva taxolo (1,05 mg) e ST 983 (29,2 mg).
Per ottenere la sospensione finale di liposomi, il liofilizzato venne idratato, al momento dell’uso, con acqua ( 450 pL) o altre soluzioni saline, agitata per 10’ e lasciata riposare per 30’ per permettere il completamento del processo di swelling (idratazione).
Si ottennero liposomi MLV.
Controllo della stabilità fisica della preparazione
La stabilità fisica della preparazione fu controllata per via turbidimetrica tramite registrazione di una TDC (Time Drive Curve) a 800 nm, a 20 °C, per 20 h.
Si registrò un andamento costante della torbidità’, indice di stabilità della preparazione, con assenza di fenomeni di precipitazione.
Controllo della stabilita* chimica del taxolo nella preparazione.
La stabilita’ chimica del taxolo venne controllata via HPLC.
Le condizioni cromatografiche sono le seguenti.
Colonna: μBondapack C-18
Eluente: Acetonitrile / Acqua 70/30
Detector UV-VIS : 227 nm
Flusso: lmL/min
Tempo di ritenzione: 4,5 min
La concentrazione del taxolo, determinata contro standard, risulto’ essere di 2,13 mg/mL.
La percentuale di taxolo incapsulato è stata del 98%.
ESEMPIO 11
Preparazione di liposomi SUV Taxolo-ST 983.
20 mg, 0,0234 mmoli di taxolo e 556 mg, 0,9417 mmoli di ST 983 vennero sciolti in 20 mL di cloroformio.
La soluzione venne concentrata fino ad ottenere un film lipidico sulla superficie del pallone di vetro.
Dopo aver eliminato le ultime tracce di cloroformio con una pompa ad alto vuoto, al film lipidico vennero aggiunti 20 mL di alcol tert-butilico e la soluzione così ottenuta venne suddivisa in 19 frazioni che vennero immediatamente congelate a -70°C con azoto liquido e liofilizzate per 24 ore. Ogni frazione di solido conteneva taxolo (1,05 mg) e ST 983 (29,2 mg).
Per ottenere la sospensione finale di liposomi SUV il liofilizzato, idratato con una soluzione di PBS (1 mL), venne sottoposto a sonicazione per 20’ a 0° C.
Quindi venne effettuata una filtrazione su filtro da 400 nm per eliminare le tracce di titanio rilasciate dalla sonda del sonicatore.
Controllo della stabilità fisica della preparazione
La stabilità fisica della preparazione venne controllata per via turbidimetrica tramite registrazione di una TDC (Time Drive Curve) a 800 nm, a 20 °C, per 20 h.
Si registrò un andamento costante della torbidità’, indice di stabilità della preparazione, con assenza di fenomeni di precipitazione.
Controllo della stabilita’ chimica del taxolo nella preparazione.
La stabilita’ chimica del taxolo venne controllata via HPLC.
Le condizioni cromatografiche sono le seguenti.
Colonna: pBondapack C-18
Eluente: Acetonitrile / Acqua 70/30
Detector UV-VIS: 227 nm
Flusso: 1mL/min
Tempo di ritenzione: 4,5 min
L’analisi HPLC della sospensione di liposomi SUV risulto’ essere uguale a quella corrispondente dei liposomi MLV, e anche in questo caso la percentuale di incapsulamento fu del 98%.
L’analisi HPLC ripetuta dopo 24h, non evidenziò picchi nuovi oltre a quello del taxolo, indice di stabilità del principio attivo.
ESEMPIO 12
Preparazione di liposomi taxolo-ST 983-Colesterolo (1:15)
Questo tipo di liposomi sono stati preparati con lo scopo di ottenere complessi con membrane più stabili.
6 mg, 0,0101 mmoli di taxolo, 62,2 mg, 0,105 mmoli di ST 983 e 40 mg di colesterolo vennero sciolti in 10 mL di cloroformio.
La soluzione così ottenuta venne concentrata fino ad ottenere un film lipidico sulla superficie del pallone di vetro.
Dopo aver eliminato le ultime tracce di cloroformio con una pompa ad alto vuoto, al film lipidico vennero aggiunti 6,3 mL di alcol tert-butilico e la soluzione ottenuta venne suddivisa in 5 frazioni che vennero immediatamente congelate a -70° C con azoto liquido e liofilizzate per 24 ore. Ogni frazione di solido conteneva taxolo (1,2 mg), ST 983 (12,44 mg) e colesterolo (8 mg).
Per ottenere la sospensione finale di liposomi, il liofilizzato venne idratato, al momento dell’uso, con acqua (1000 μL) o altre soluzioni saline, agitata per 10’ e lasciata riposare per 30’ per permettere il completamento del processo di swelling (idratazione) .
Si ottennero liposomi MLV.
Controllo della stabilità fisica della preparazione
La stabilità fisica della preparazione venne controllata per via turbidimetrica tramite registrazione di una TDC (Time Drive Curve) a 800 nm, a 20 °C, per 6 h.
Si registrò un andamento costante della torbidità’, indice di stabilità della preparazione, con assenza di fenomeni di precipitazione.
ESEMPIO 13
Preparazione di liposomi SUV Taxolo-ST 772 (1:70)
20 mg, 0,0234 mmoli di taxolo e 1485 mg, 1,638 mmoli di ST 772 vennero sciolti in 20 mL di cloroformio.
La soluzione verme concentrata fino ad ottenere un film lipidico sulla superficie del pallone di vetro.
Dopo aver eliminato le ultime tracce di cloroformio con una pompa ad alto vuoto, al film lipidico vennero aggiunti 20 mL di alcol tert-butilico. Per ottenere una soluzione limpida fu necessario riscaldare fino a 60°C. La soluzione venne immediatamente congelata a -70 °C e liofilizzata per 24 ore.
Per ottenere la sospensione finale di liposomi SUV il liofilizzato, idratato con una soluzione di PBS (20 mL), venne sottoposto a sonicazione per 20’ a 0° C.
Quindi si effettuo’ una filtrazione su filtro da 400 nm per eliminare le tracce di titanio rilasciate dalla sonda del sonicatore.
Controllo della stabilità fisica della preparazione
La stabilità fisica della preparazione venne controllata per via turbidimetrica tramite registrazione di una TDC (Time Drive Curve) a 800 nm, a 20 °C, per 6 h.
Si registrò un andamento costante della torbidità’, indice di stabilità della preparazione, in assenza di fenomeni di precipitazione. ESEMPIO 14
Preparazione di liposomi MLV CPT 83-ST 983 (1:40)
6,3 mg, 0,0168 mmoli di CPT 83 (7-carbonitrilecamptotecina, descritta in WO 97/31003) e 400 mg, 0,667 mmoli di ST 983 vennero sciolti in 20 mL di cloroformio.
La soluzione venne concentrata fino ad ottenere un film lipidico sulla superficie del pallone di vetro.
Dopo aver eliminato le ultime tracce di cloroformio con una pompa ad alto vuoto, al film lipidico venne aggiunto alcol tert-butilico (26 mL) e la soluzione così ottenuta venne suddivisa in 12 frazioni che vennero immediatamente congelate a -70°C con azoto liquido e liofilizzate per 24 ore. Ogni frazione di solido conteneva CPT 83 (0,525 mg) e ST 983 (33,33 mg).
Per ottenere la sospensione finale di liposomi, il liofilizzato venne idratato, al momento dell’uso, con acqua (1000 pL) o altre soluzioni saline e agitata per 10’
Si ottennero liposomi MLV.
Controllo della stabilità fisica della preparazione
La stabilità fisica della preparazione venne controllata per via turbidimetrica tramite registrazione di una TDC (Time Drive Curve) a 600 nm, a 20 °C, per 20 h.
Si registrò un andamento costante della torbidità, indice di stabilità della preparazione, con assenza di fenomeni di precipitazione.
Controllo della stabilita’ chimica del CPT 83 nella preparazione La stabilita' chimica del CPT 83 venne controllata via HPLC.
Le condizioni cromatografiche furono le seguenti.
Colonna: Supelcosil LC-ABZ
Eluente: Tampone fosfato 20 mM/Metanolo 40/60 pH=7,3
Detector UV-VIS: 360nm
Flusso: lmL/min
Tempo di ritenzione: 4,033 min
La concentrazione del CPT 83, determinata contro standard, risulto’ essere di 0,502 mg/mL.
La percentuale di CPT 83 incapsulata è stata del 99%.
ESEMPIO 15
Preparazione di liposomi SUV CPT 83-ST 983 (1:40)
6,3 mg, 0,0168 mmoli di CPT 83 e 400 mg, 0,667 mmoli di ST 983 vennero sciolti in 20 mL di cloroformio.
La soluzione venne concentrata fino ad ottenere un film lipidico sulla superficie del pallone di vetro.
Dopo aver eliminato le ultime tracce di cloroformio con una pompa ad alto vuoto, al film lipidico venne aggiunto alcol tert-butilico (26 mL) e la soluzione ottenuta venne suddivisa in 12 frazioni che vennero immediatamente congelate a -70°C con azoto liquido e liofilizzate per 24 ore. Ogni frazione di solido conteneva CPT 83 (0,525 mg) e ST 983 (33,33 mg).
Per ottenere la sospensione finale di liposomi SUV, il liofilizzato venne idratato, al momento dell’uso, con acqua (1000 pL) o altre soluzioni saline e sottoposta a sonicazione per 40’, a 0°C.
Quindi venne effettuata una filtrazione su Filtro da 400 nm per eliminare le tracce di titanio rilasciate dalla sonda del sonicatore.
Controllo della stabilita’ chimica del CPT 83 nella preparazione.
La stabilita’ chimica del CPT 83 venne controllata via HPLC.
Le condizioni cromatografiche furono le seguenti.
Colonna: Supelcosil LC-ABZ
Eluente: Tampone fosfato 20 mM/ Metanolo 40/60 pH=7,3 Detector UV-VIS: 360nm
Flusso: 1 mL/min
Tempo di ritenzione: 4,033 min
La concentrazione del CPT 83, determinata contro standard, fu di 0,3 mg/mL.
La percentuale di CPT 83 incapsulata è stata del 59 %.
L’analisi HPLC ripetuta dopo 24 h, non evidenziò picchi nuovi oltre a quello del CPT 83, indice di stabilità del composto.
Controllo stabilità fisica della preparazione
La stabilità fisica della preparazione venne controllata per via turbidimetrica tramite registrazione di una TDC (Time Drive Curve), a 600 nm, a 20 °C, per 20 h.
Venne registrato un andamento costante della torbidità, indice stabilità della preparazione, con assenza di fenomeni di precipitazione.
ESEMPIO 16
Preparazione di liposomi MLV CPT 184-ST 983 (1:40)
7,29 mg, 0,0168 mmoli di CPT 184 e 400 mg, 0,677 mmoli di ST 983 vennero sciolti in 20 mL di cloroformio.
«
La soluzione venne concentrata fino ad ottenere un film lipidico sulla superfìcie del pallone di vetro.
Dopo aver eliminato le ultime tracce di cloroformio con una pompa ad alto vuoto, al film lipidico vennero aggiunto 26 mL di alcol tert-butilico e la soluzione così ottenuta venne suddivisa in 12 frazioni che vennero immediatamente congelate a -70°C con azoto liquido e liofilizzate per 24 orp. Ogni frazione di solido conteneva CPT 184 (0,607 mg) ed ST 983 (33,33 mg).
Per ottenere la sospensione finale di liposomi, il liofilizzato venne idratato, al momento dell’uso, con acqua (1000pL) o altre soluzioni saline e agitata per 10’
Si ottennero liposomi MLV.
Controllo stabilità fisica della preparazione
La stabilità fisica della preparazione venne controllata per via turbidimetrica tramite registrazione di una TDC (Time Drive Curve) a 600 nm, a 20 °C, per 20 h.
Si registrò un andamento costante della torbidità’, indice di stabilità della preparazione, con assenza di fenomeni di precipitazione.
Controllo della stabilita’ chimica del CPT 184 nella preparazione.
La stabilita’ chimica del CPT 184 venne controllata via HPLC. Le condizioni cromatografiche furono le seguenti.
Colonna: Supelcosil LC-ABZ
Eluente: Tampone fosfato 20 mM/Metanolo 40/60 pH=7.3
«
Detector UV-VIS: 360nm-Flusso : lmL/min
Tempo di ritenzione: 25,5 min
La concentrazione del CPT 184, determinata contro standard, risulto’ essere di 0,600 mg/mL.
La percentuale di CPT 184 incapsulata è stata del 99%.
ESEMPIO 17
Preparazione di liposomi SUV CPT 184-ST 983 (1:40)
7,29 mg, 0,0168 mmoli di CPT 184 e 400 mg, 0,667 mmoli di ST 983 vennero sciolti in 20 mL di cloroformio.
La soluzione venne concentrata fino ad ottenere un film lipidico sulla superficie del pallone di vetro.
Dopo aver eliminato le ultime tracce di cloroformio con una pompa ad alto vuoto, al film lipidico venne aggiunto alcol tert-butilico (26 mL) e la soluzione ottenuta venne suddivisa in 12 frazioni che vennero immediatamente congelate a -70°C con azoto liquido e liofilizzate per 24 ore. Ogni frazione di solido conteneva CPT 184 (0,607 mg) e ST 983 (33,33 mg).
Per ottenere la sospensione finale di liposomi SUV, il liofilizzato venne idratato, al momento dell’uso, con acqua (ΙΟΟΟμί) o altre soluzioni saline, e sottoposto a sonicazione per 40’, a 0°C.
Quindi si effettuo’ una filtrazione su filtro da 400 nm per eliminare le tracce di titanio rilasciate dalla sonda del sonicatore.
Controllo stabilita’ chimica del CPT 184 nella preparazione.
La stabilita’ chimica del CPT 184 venne controllata via HPLC. Le condizioni cromatografiche furono le seguenti.
Colonna: Supelcosil LC-ABZ
Eluente: Tampone fosfato 20 mM/Metanolo 40/60 pH=7,3 Detector UV-VIS: 360nm
Flusso: lmL/min
Tempo di ritenzione: 25,5 min
La concentrazione del CPT 184, determinata contro standard, fu di 036 mg/mL.
La percentuale di CPT 184 incapsulato è stata del 70%.
L’analisi HPLC ripetuta dopo 24h, non evidenzio picchi nuovi oltre a quello del CPT 184, indice di stabilità del principio attivo.
Controllo della stabilità fìsica della preparazione
La stabilità fisica della preparazione venne controllata per via turbidimetrica tramite registrazione di una TDC (Time Drive Curve), a 600 nm, a 20 °C, per 20 h.
Si registrò un andamento costante della torbidità’, indice di stabilità della preparazione, in assenza di fenomeni di precipitazione. ATTIVITÀ ANTITUMORALE DEL COMPLESSO LIPOSOMA DI ST 983- ANTITUMORALE
Come si potrà leggere di seguito, il liposoma di ST983 ha mostrato un accumulo preferenziale a livello polmonare. Questa caratteristica di sito-specificità ha favorito il suo utilizzo in un modello murino di tumorogenesi polmonare.
L’antitumorale utilizzato in questo esperimento è stato il taxolo. Per indurre il tumore in vivo, topi Balb/c non anestetizzati, vennero iniettate nel quadricipide femorale della zampa posteriore destra con 3x10<5 >cellule di carcinoma polmonare murino MI 09 in 0,1 mi RPMI-1640 (Sigma).
Dieci giorni dopo limpianto del tumore il complesso liposomataxolo venne diluito con una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, SIGMA, P-4417) ed iniettato per via endovenosa ad una concentrazione di 2,5 rag/mL di ST 983 e di 75 μg/mL di taxolo.
Il taxolo (paclitaxel INDENA) lotto n° 25508/N 1 A utilizzato come controllo venne sciolto nel veicolo cremophor EL (BASF), lotto n°392045, ad una concentrazione di 20 mg/mL e conservato a 4°C per le successive 24 ore, al riparo dalla luce. Al momento dell'uso venne diluito con una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, SIGMA, P-4417) ed iniettato per via endovenosa nelle stesse condizioni di volume e concentrazione descritte per il taxolo veicolato con il liposoma dell’ST 983.
Il cremophor venne preparato diluendolo 1: 1 con alcol etilico.
Le somministrazioni vennero effettuate per sette giorni consecutivi, a partire dal 10° giorno dalla data di inoculo del tumore. Gli animali vennero tenuti in osservazione fino al 17° giorno dall'inoculo <' >delle cellule tumorali M109, sacrificati mediante dislocazione cervicale ed i polmoni prelevati per la determinazione del numero delle metastasi. La colorazione dei polmoni per evidenziare le metastasi venne effettuata mantenendo i polmoni per 10 giorni in 5 mL della soluzione di Bouin’s, costituita dal 71% di soluzione satura di acido picrico (Merck), 4,8% di acido acetico glaciale (Merck), 24% di aldeide formica al 10% (Fulka). Al termine del periodo di incubazione nella soluzione di Bouin’s si procede alla conta numerica delle metastasi evidenziate.
Rispetto ai topi di controllo non trattati il taxolo veicolato con cremophor non mostra nessuna attività nella riduzione del numero delle metastasi polmonari, anche se queste erano più piccole se paragonate a quelle del controllo non trattato, mentre, il taxolo complessato con il liposoma dell’ST 983 mostrò una riduzione significativa sia del numero delle metastasi polmonari che della dimensione delle stesse.
L’analisi statistica dei dati relativi al n umero delle metastasi polmonari venne valutata utilizzando il test non parametrico di Mann-Whitney per dati non appaiati.
Nella seguente Tab. 1 vengono riportati i risultati ottenuti.
Determinazione del numero di metastasi polmonari al 17° giorno dall’inoculo del carcinoma p BALB/c dopo trattamento con taxol e taxol+ST 983
Ai topi BALB/c femmine di circa 20 gr è stato iniettato i.m. il tumore polmonare M-109 (3xl0<5 >cellule/to taxolo o con taxol in combinazione con ST983 secondo lo schema di trattamento; al 17° giorno dall’inocu stati sacrificati, prelevati i polmoni e conservati nella soluzione di Bouin's. Il n° delle metastasi è stato va dei polmoni.
♦ La significatività è stata valutata confrontando I diversi gruppi di trattamento verso il gruppo non tra Il taxolo vs taxolo ST 983 è P=0.066
La statistica è stata effettuata mediante il test di Mann-Whitney per dati non appaiati.
M = Medio (1-2 mm diam); S = (> 1 mm diam).
TEST DI CITOTOSSICITÀ’ IN VITRO
I saggi di tossicità sono stati eseguiti su cellule HeLa e/o su cellule MI 09 in piastre da 96 pozzetti. Il giorno dopo la piastratura le cellule sono stata trattate con le molecole d’interesse per le 24 ore successive. Le cellule sono state quindi lavate con PBS e lasciate in normali condizioni di crescita per 48 ore. Dopo rimozione del terreno di crescita le cellule sono state incubate su ghiaccio con TCA 16%, lavate 3 volte in H2O, trattate per 30 minuti con sulforodamina B (SRB) in 1% acido acetico, lavate per 3 volte in solo acido acetico 1%, incubate per 20 minuti in TRIS 10 mM pH10,5 ed infine lette a 540 nm.
Test di citotossicità con CPT 83
I test di citotossicità "in vitro" con CPT 83 sono stati eseguiti con Io scopo di valutare la citotossicità dell' antitumorale complessato con il liposoma, come indicazione preliminare di una buona efficienza d’attività.
Per valutare la capacità del liposoma di veicolare la CPT83 in vitro su
cellule MI 09 è stato utilizzato il test della sulforodamina B precedentemente descritto.
Inoltre, è stata valutata la citotossicità della CPT83 sciolta in dimetil
sulfossido (DMSO) rispetto a quella della stessa molecola complessata
con il liposoma di ST 983.
Il complesso liposoma-CPT83 è stato utilizzato nei saggi di citotosscità nelle concentrazioni indicate nella seguente Tab. 2,1, 2,2 e 3,3 sia nella configurazione SUV che MLV. Il rapporto molare liposoma/CPT83 utilizzato è stato di 40: 1.
Le medie di citotossicità dei complessi ST 983/CPT83 sia nella configurazione SUV che MLV riportati nelle seguenti Tab. 2,1; 2,2 e 2,3, indicamo che il liposoma di ST 983 è capace di veicolare il CPT 83 in modo analogo al DMSO mostrando livelli di citotossicità dello stesso ordine di grandezza.
Tab. 2.1
Media
s.d.
valori riportati in tabella si riferiscono alla densità ottica, lettura a 40 nm.
Tab. 2.2
Citotossicita [SRBI ST983MLV/ CPT83:
Concentrazioni in uM
Ctr 1.3 0.13 0.013 0.0013 0,895 0,038 0,04 0,095 0,088 0,82 0,038 0,046 0, 109 0,124 0,896 0,041 0,049 0, 128 0,127 0,847 0,041 0,042 0,105 0,115 0,863 0,041 0,053 0,111 0,107 0,794 0,043 0,041 0,073 0,095 0,829 0,039 0,044 0,08 0,085 0,893 0,041 0,044 0,064 0,065 media 0,854625 ,0,04025 0,044875 0,095625 0,10075 s.d. 0,038682 0,001753 0,004357 0,021738 0,021359
valori riportati in tabella si riferiscono alla densità ottica, lettura a 40 nm,
/ Tab. 2.3
I valori riportati in tabella si riferiscono alla densità ottica, lettura a 540 nm.
GENE DELIVERY
Preparazione del complesso Liposoma-DNA
Liposoma e DNA plasmidico sono stati opportunamente dilutiti, separatamente, in PBS. Il DNA é stato, quindi aggiunto al liposoma ed il complesso Liposoma DNA è stato lasciato per circa 30 minuti a 4°C per favorire la formazione di una interazione stabile liposoma/ DNA.
Per gli esperimenti in vitro come lipide cationico di riferimento è stato utilizzato l'l,2-dioleoilossi-3-trimetilammoniopropano (DOTAP); sono stati utilizzati 2,5 μg di DNA plasmidico per 2x1 0<5 >cellule HeLa, e la concentrazione dei liposomi è stata di 9 μΜ.
Per gli esperimenti "in vivo" sono stati utilizzati come lipidi cationici di riferimento sia il DOTAP che il [2,3-bis(oleoil)propil]trimetilammonio (DOTMA).
I rapporti molari definiti nei risultati si riferiscono a concentrazioni nmolali dei relativi lipidi cationici per pg di DNA.
Negli esperimenti di transfezione "in vivo" sono stati utilizzati 25 μg di DNA plasmidico per singolo animale.
Il plasmide pCMVluc utilizzato in questi esperimenti conteneva il cDNA del gene della luciferasi sotto il controllo trascrizionale del promotore del citomegalovirus (CMV).
Determinazione quantitativa dell'attività luciferasica.
L'attività della proteina luciferasi in cellule e tessuti è stata determinata utilizzando il Kit della Bohringer Mannheim (cat N° 1669 893).
Le cellule sono state lavate per 3 volte in PBS quindi rimosse dalla piastra con uno “scraper” in “Lysis buffer” (100 mM potassio fosfato pH 7,8, 1 mM di ditiotritolo (DTT) e sottoposte a 3 cicli consecutivi di congelamento e scongelamento. Dopo centrifugazione in tubi eppendorf da 1,5 mL, il sopranatante veniva utilizzato per il test di luminescenza non oltre 5 ore dal momento di estrazione delle proteine. Misure di emissione di luminescenza venivano eseguite al luminometro a 562 nm. I tessuti, dopo un primo congelamento rapido in N2 liquido seguito da sminuzzamento fino ad ottenere una polvere, venivano risospesi in “lysis buffer” ed incubati per 10-15 minuti in ghiaccio.
I campioni venivano quindi centrifugati in eppendorf da 2 mL ed il sopranatante testato per l’attività luciferasica.
Analisi “dot-blot”
Il DNA cellulare è stato estratto seguendo il procedimento di lisi alcalina descritto da Sanbrook, Fritsch and Maniatis in Molecular cloning, 1989.
5 μg Del DNA estratto dalle cellule sono stati preassorbiti su filtri di Nylon (Boehringer) utilizzando l’apparato per il dot blot della Biorad. I filtri sono stati quindi preibridati per 4 ore a 65°C con una soluzione contenete 0,5 M di sodio pirofosfato (NaPi), 1 mM EDTA, 7% SDS. La sonda marcata con 32P(alfa) è stata preparata utilizzando come templato il DNA plasmidico pCMVluc ed il Kit Amersharm “ramdom primed”. Il filtro è stato ibridato nello stesso tampone di preibridazione per 12 ore a 42°C utilizzando 1x10<6 >CPM/ml. Il filtro è stato sottoposto successivamente a 3 lavaggi successivi di 10 minuti a 65°C in una tampone contenente 40mM NaPi, 1% SDS. L’analisi autoradiografica è stata realizzata con apparecchio “phosphor imager” il quale utilizza gli schermi di fosforo attivati da radiazioni beta che vengono lette e quantificate da un sistema di fotomoltiplicatori associato ad un programma di analisi di immagine. La densiometria fatta su dot-blot è effettuata mediante il programma di analisi di immagine IP-LabGel.
TEST DI TRANSFEZIONE DEL DNA PLASMIDICO
Sono stati effettuati alcuni esperimenti di transfezione di DNA plasmidico sia in vitro che in vivo.
Come lipidi cationici di riferimento sono stati utilizzati sia il DOTAP che il DOTMA le cui capacità transfettanti sono state ampiamente caratterizzate e descritte da Abkenet et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6518. Negli esperimenti "in vivo" sono stati analizzati diversi rapporti molali tra i lipidi cationici e il DNA plasmidico, allo scopo di determinare l’attività dei lipidi cationici e le concentrazioni relative più efficienti per il trasferimento genico. La capacità transfettante dei diversi liposomi sia "in vitro" che "in vivo" è stata valutata utilizzando il gene "reporter” della luciferasi contenuto all’interno del plasmide pCMVTuc, la cui attività in termini di unità di luminescenza relativa (RLU) (descritta precedentemente) consentiva una facile quantificazione.
Alternativamente l'efficienza di transfezione di alcuni liposomi cationici è stata valuta mediante l'analisi densi tometrica (Phosphoroimager) di campioni di DNA estratti da cellule transfettate preassorbiti su filtri di nitro cellulosa (dot-blot) ed ibridati a sonde marcate (32P) di DNA plamidico come precedentemente descritto.
TEST DI TRANSFEZIONE IN VIVO
Dipendenza dell' efficienza di transfezione "in vivo" dal rapporto molare liposoma di ST 983-DNA
In questo esperimento è stata valutata la dipendenza dell'efficienza di transfezione di fegato, polmone e cuore dal rapporto relativo tra il liposoma dell'ST 983 e il DNA palsmidico. Sono stati testati i seguenti rapporti nmolali di liposoma per μg di DNA: 12: 1, 24: 1, 36: 1 e 48:1.
Gruppi di 6 topi Balb/c del peso di circa 20 g vennero trattati per via endovenosa con volumi di 200 μί in PBS, con i quantitativi di liposoma-DNA sopra riportati, e sono stati sacrificati 24 ore dopo la somministrazione del complesso.
L'attività luciferasica estratta dal tessuto polmonare, cardiaco ed epatico ha rivelato una distribuzione preferenzialmente polmonare della luciferasi in tutti i rapporti molali analizzati. Infatti, circa il 99% dell'attività luciferasica totale estratta dai tre tessuti si localizza nel polmone. Il rapporto molale 12: 1 si é rivelato essere il migliore tra liposoma e DNA, i risultati ottenuti sono riportati nella seguente Tab 3.
Tab 3
Efficienza transfezione in vivo ST983 funzione del
rapporto molale/ μg DNA
Liposoma Media RLU/mg proteine /■ s.d. rapporto mol.
fegato polmone cuore 5T983/DNA
ST983 2589 /- 140 8818442+/- 449529 28875+/- 2593 12: 1
1310+/- 385 2257856+/- 280480 7091+/- 249 24: 1
1035+/-347 301107+/- 21503 8351+/- 477 36: 1
1571+/- 156 112747+/- 5655 5251+/-489 48: 1
Controllo 396+/- 55 458+/- 45 755+/-55
Dotma 1352+/- 226 3828742+/- 161332 3363+/- 123 12:1
Dipendenza dell'efficienza di transfezione "in vivo” tra diverse preparazioni di liposomi di ST 983
L'attività luciferasica, come unità di luminescienza relativa (RLU), estratta dal polmone di topi Balb/c trattatati per via endovenosa con preparazioni diverse del liposoma dell’ST 983 ad un rapporto molale liposoma/ DNA di 12: 1 è riportata in Tab 4.
I dati ottenuti, oltre ad evidenziare che il liposoma dell'ST 983 é capace di veicolare il DNA palsmidico "in vivo" con efficienze superiori e/o paragonabili a quelle del DOTMA mostrano anche una variabilità tra preparazioni diverse dell'ST 983. Ciò potrebbe essere dovuto alla variabilità di alcuni caratteri chimico fisici quali dimensione delle vescicole liposomiali, proporzioni relative di vescicole a singola lamella (SUV) o a lamella multipla (MLV) delle diverse preparazioni di ST 983. Infatti, i parametri chimico fisici sopra elencati sono stati ampiamente descritti come determinanti per l' ottimizzazione dell'efficienza di transfezione "in vivo" ed "in vitro" da R. I. Mahato et al. Human Gene Therapy 9, 1998: 2083.
TAB 4
Efficienza transfezione in vivo ST983
(preparazioni diverse)
Liposoma Media RLU/mg proteine /- s.d. rapporto mol.
polmone ST983/DNA
ST983/ #72 3118235+/- 184726 12: 1
ST983/#73 7285835+/- 827067 12: 1
ST983/#4 1022117+/- 60402 12: 1
Controllo 1523+/- 98
Dotma 3410125+/- 189520 12: 1 Dipendenza dell'efficienza di transfezione "in vivo" dal tempo di preincubazione del complesso liposoma di ST 983-DNA
In Tab 5 vengono riportate le unità di luminescenza relative estratte da fegato, polmone e cuore di topi trattati per via endovenosa con il liposoma dell'ST 983 incubato con il DNA plasmidico per 30 minuti o per 3 ore prima della somministrazione. Gli animali trattati con l'ST 983 preincubato per 3 ore con il DNA, mostrano rispetto a quelli trattati con lo stesso liposoma preincubato per 30 minuti un aumento dell'attività luciferasica di circa 5 volte nel polmone e nel cuore. Tale risultato suggerisce che la formazione di un complesso stabile liposoma DNA, sia un fenomeno dipendente dal tempo e giochi un ruolo critico nel determinare l'efficienza di transfezione in vivo.
Tab 5
Efficienza transfezione in vivo ST983 in funzione
dei tempi di incubazione liposoma/DNA
Liposoma Tempi Media RLU/mg proteine /- s.d. rapporto mol. fegato Polmone cuore ST983/DNA
ST983 30min. 3526+/-260 874882+/- 659 17 8118+/- 263 12: 1
ST983 3h 2497+/- 682 4225656+/- 211731 37100+/- 1853 12: 1 Transfezione di DNA plasmidico su cellule HeLa con liposoma di ST 772
In Fig. 1 e Fig. 2 viene mostrata l'efficienza di transfezione di DNA plasmidico su cellule HeLa del liposoma del ST 772. A questo scopo è stata eseguita un'analisi densitometrica del DNA estratto da cellule transfettate con l'ST 772 e con il DOTAP come liposoma cationico di riferimento. I risultati dell'analisi dot blot rivelano quantità di DNA plasmidico dello stesso ordine di grandezza di quello ottenuto con il DOTAP.

Claims (54)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composto di formula (I)
    (I) m cui: n è un numero intero compreso tra 1 e 3; R è idrogeno o alcanoile, lineare o ramificato, avente 2-6 atomi di carbonio; R1 e R2 uguali o diversi rappresentano una catena acilica lineare, satura o insatura, avente 3-20 atomi di carbonio; e X<- >è l'anione di un acido farmacologicamente accettabile.
  2. 2. Composto secondo la rivendicazione 1 in cui R è scelto nel gruppo che consiste di acetile, propionile, butirrile, valerile e isovalerile.
  3. 3. Composto secondo la rivendicazione 1 in cui R1 e R2 sono scelti nel gruppo che consiste di esanoile, undecanoile, miristoile, palmitoile o oleoile.
  4. 4. Composto secondo la rivendicazione 1, in cui X è scelto nel gruppo che consiste di cloruro; bromuro; ioduro; aspartato; aspartato acido; citrato; citrato acido; tartrato; tartrato acido; fosfato, fosfato acido; fumarato; fumarato acido; glicerofosfato; glucosiofosfato; lattato; maleato; maleato acido; mucato; orotato; ossalato; ossalato acido; solfato; solfato acido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metansolfonato; pamoato e pamoato acido.
  5. 5. Composto secondo la rivendicazione 1, scelto nel gruppo che consiste di: - estere della L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil-l,3-dipalmitoil glicerolo (ST 770); - estere della acetil L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil- 1,3-dipalmitoil glicerolo {ST 771); - estere della propionil L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil-1,3-dipalmitoil glicerolo (ST 772); estere della isobutirril L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil-1,3-dipalmitoil glicerolo (ST 773); - estere della iso valerli L-carnitina bromuro con 2-idrossiacetil-1,3-dipalmitoil glicerolo (ST 774). - estere della L-carnitina bromuro con l,3-diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo (ST 810); - estere della acetil L-carnitina bromuro con l,3-diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo ST (809). - estere della propionil L-carnitina bromuro con 1,3- diesanoil-2-idrossiacetil glicerolo (ST 808).
  6. 6. Uso di un composto di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 per la preparazione di liposomi.
  7. 7. Liposoma comprendente un composto di formula (I) in
    n è un numero intero compreso tra 1 e 3; R è idrogeno o alcanoile, lineare o ramificato, avente 2-6 atomi di carbonio; RI e R2 uguali 0 diversi rappresentano una catena acilica lineare, satura 0 insatura, avente 3-20 atomi di carbonio; e X<- >è l’anione di un acido farmacologicamente accettabile.
  8. 8. Liposoma secondo la rivendicazione 7 in cui: R è scelto nel gruppo che consiste di acetile, propionile, butirrile, valerile, isovalerile; RI e R2 sono scelti nel gruppo che consiste di esanoile, undecanoile, miristoile, palmitoile o oleoile; X<- >è scelto nel gruppo che consiste di cloruro; bromuro; ioduro; aspartato; aspartato acido; citrato; citrato acido; tartrato; tartrato acido; fosfato; fosfato acido; fumarato; fumarato acido; glicerofosfato; glucosiofosfato; lattato; maleato; maleato acido; mucato; orotato; ossalato; ossalato acido; solfato; solfato acido; tricloroacetato; trifluoroacetato e metansolfonato ; pamoato e pamoato acido.
  9. 9. Liposoma della rivendicazione 7 o 8 comprendente ulteriormente lipidi helper. «
  10. 10. Liposoma della rivendicazione 9 in cui detto lipide helper è scelto nel gruppo che comprende colesterolo o dioleil fosfatidii colina.
  11. 11. Uso di un liposoma delle rivendicazioni 7, 8, 9 o 10, per la preparazione di una composizione utile per il trasporto di composti farmacologicamente attivi.
  12. 12. Uso secondo la rivendicazione 11 in cui il composto farmacologicamente attivo è un polinucleotide o un plasmide di origine naturale o modificato.
  13. 13. Uso secondo la rivendicazione 12 in cui il polinucleotide o il plasmide sono utili in terapia genica.
  14. 14. Uso secondo la rivendicazione 12 in cui il polinucleotide o il plasmide codificano per un peptide o una proteina utile come vaccino.
  15. 15. Uso secondo la rivendicazione 11 in cui il composto attivo è un farmaco.
  16. 16. Uso secondo la rivendicazione 15 in cui detto farmaco è scelto nel gruppo che consiste di: antitumorale, antiangiogenico, antivirale, antibatterico, <' >antimicotico, antiprotozoarico, un composto attivo sul sistema cardiovascolare, e peptidi immunogenici.
  17. 17. Uso secondo la rivendicazione 16 in cui detto farmaco è un antitumorale o un antiangiogenico.
  18. 18. Uso secondo la rivendicazione 17 in cui detto antitumorale è . scelto nel gruppo che consiste di taxolo o di un derivato della camptotecma.
  19. 19. Uso secondo la rivendicazione 18 in cui detto derivato della camptotecina è scelto nel gruppo che consiste di 7-carbonitrilecamptotecina (CPT 83) 7-benzilossiimminometilcamptotecina (CPT 172) o 7-butossiimminometilcamptotecina (CPT 184).
  20. 20. Uso di un liposoma delle rivendicazioni 7, 8, 9 o 10 per la preparazione di una composizione cosmetica.
  21. 21. Composizione farmaceutica comprendente un liposoma delle rivendicazioni 7, 8, 9 o 10.
  22. 22. Composizione secondo la rivendicazione 21 , nella quale detto liposoma comprende un composto farmacologicamente attivo.
  23. 23. Composizione secondo la rivendicazione 22 , nella quale il composto attivo è un plasmide o un polinucleotide di origine naturale o modificato.
  24. 24. Composizione secondo la rivendicazione 23 in cui il polinucleotide o il plasmide sono utili in terapia genica.
  25. 25. Composizione secondo la rivendicazione 24 in cui il polionucleotide o il plasmide codificano per un peptide o una proteina utile come vaccino.
  26. 26. Composizione cosmetica comprendente un liposoma delle rivendicazioni 7, 8, 9 o 10.
  27. 27. Composizione secondo la rivendicazione 26 , nella quale detto liposoma contiene una sostanza ad attività cosmetica.
  28. 28. Composizione secondo la rivendicazione 22 , nella quale detto composto è scelto nel gruppo che consiste di: antitumorale, antiangiogenico, antivirale, antibatterico, antimicotico, antiprotozoarico, un composto attivo sul sistema cardiovascolare o peptidi immunogenici.
  29. 29. Composizione secondo le rivendicazioni 21-28 , somministrabile per via orale, parenterale, endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, transdermica o sotto forma di spray nasale od orale.
  30. 30. Uso del liposoma di un composto di formula (II) m cui:
    R3 è una catena acilica lineare o ramificata, satura o insatura avente 4-26 atomi di carbonio; R4 è una catena alchilica lineare o ramificata, satura o insatura, avente 4-26 atomi di carbonio; e X<- >è l'anione di un acido farmacologicamente accettabile; per il trasporto di farmaci o di sostanze ad attività cosmetica.
  31. 31. Uso secondo la rivendicazione 30 in cui R3 è scelto preferibilmente nel gruppo che consiste di nonanoile, dodecanoile, miristoile, palmitoile, stearoile o oleoile.
  32. 32. Uso secondo la rivendicazione 30 in cui R4 è scelto preferibilmente nel gruppo che consiste di nonile, undecile, tetradecile, esadecile o oleile.
  33. 33. Uso secondo la rivendicazione 30 , in cui X<- >è scelto nel gruppo che consiste di: cloruro; bromuro; ioduro; aspartato; aspartato acido; citrato; citrato acido; tartrato; tartrato acido; fosfato, fosfato acido; fumarato; fumarato acido; glicerofo sfato; glucosiofosfato; lattato; maleato; maleato acido; mucato; orotato; ossalato; ossalato acido; solfato; solfato acido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metansolfonato; pamoato e pamoato acido.
  34. 34. Uso secondo le rivendicazioni 30-33 in cui il composto è scelto nel gruppo che consiste di: - palmitoil L-camitina cloruro undecil estere (ST 983); - stearoil L-camitina cloruro undecil estere (ST 1055); - stearoil L-camitina cloruro tetradecil estere (ST 1351); - palmitoil L-carnitina cloruro tetradecil estere (ST 1379); - miristoil L-carnitina cloruro tetradecil estere (ST 1380); - palmitoil L-camitina bromuro esadecil estere (ST 1390); - oleoil L-carnitina cloruro oleil estere (ST 1392).
  35. 35. Uso secondo la rivendicazione 30 in cui il farmaco è scelto nel gruppo che consiste di: antitumorale, antiangiogenico, antivirale, antibatterico, antimicotico, antiprotozoarico, un composto attivo sul sistema cardiovascolare, o peptidi immunogenici.
  36. 36. Uso secondo la rivendicazione 35 in cui detto farmaco è un antitumorale o un antiangiogenico.
  37. 37. Uso secondo la rivendicazione 36 in cui detto antitumorale è scelto nel gruppo che consiste di taxolo o di un derivato della camptotecina.
  38. 38. Uso secondo la rivendicazione 37 in cui detto derivato della camptotecina è scelto nel gruppo che consiste di 7-benzilossiimminometilcamptotecina (CPT 172) o 7-butossiimminometilcamptotecina (CPT 184).
  39. 39. Uso secondo la rivendicazione 30, in cui il liposoma comprendente ulteriormente lipidi helper.
  40. 40. Uso secondo la rivendicazione 39, in cui il detto lipide helper è scelto nel gruppo che consiste di colesterolo o di dioleil fosfatidii colina
  41. 41. Composizione comprendente un liposoma della rivendicazione 30, per il trasporto di farmaci o di una sostanza ad attività cosmetica.
  42. 42. Composizione secondo la rivendicazione 41, in cui il farmaco è scelto nel gruppo che consiste di antitumorale, antiangio genico, antivirale, antibatterico, antimicotico, antiprotozoarico, un composto attivo sul sistema cardiovascolare o peptidi immunogenici.
  43. 43. Composizione secondo la rivendicazione 41-42, somministrabile per via orale, parenterale, endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, transdermica o sotto forma di spray nasale od orale.
  44. 44. Uso di un liposoma di un composto di formula (III)
    (III) in cui: R5 è una catena acilica lineare o ramificata, satura o insatura avente 4-26 atomi di carbonio; R6 è una catena alchilica lineare o ramificata, satura o insatura, avente 4-26 atomi di carbonio; e X<- >è l’anione di un acido farmacologicamente accettabile; con la condizione che: quando R5 è stearoile R6 non è stearile, quando R5 è oleoile R6 non è stearile, quando R5 è palmitoile R6 non è palmitile, quando R5 è miristoile R6 non è miristile, quando R5 è lauroile R6 non è laurile, quando R5 è oleoile R6 non è oleile; per il trasporto di un polinucleotide o un plasmide di origine naturale o modificata.
  45. 45. Uso secondo la rivendicazione 44, in cui R5 è scelto preferibilmente nel gruppo che consiste di nonanoile, dodecanoile, miristoile, palmitoile, stearoile o oleoile.
  46. 46. Uso secondo la rivendicazione 44, in cui; R6 è scelto preferibilmente nel gruppo che consiste di nonile, undecile, tetradecile, esadecile o oleile.
  47. 47. Uso secondo la rivendicazione 44, in cui X<- >è scelto nel gruppo che consiste di: cloruro; bromuro; ioduro; aspartato; aspartato acido; citrato; citrato acido; tartrato; tartrato acido; fosfato, fosfato acido; fumarato; fumarato acido; glicerofosfato; glucosiofo sfato; lattato; maleato; maleato acido; mucato; orotato; ossalato; ossalato acido; solfato; solfato acido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metansolfonato; pamoato e pamoato acido.
  48. 48. Uso secondo le rivendicazioni 44-47, in cui il composto è scelto nel gruppo che consiste di: - palmitoil L-carnitina cloruro undecil estere (ST 983); - stearoil L-camitina cloruro undecil estere (ST 1055); - stearoil L-camitina cloruro tetradecil estere (ST 1351); - palmitoil L-carnitina cloruro tetradecil estere (ST 1379).
  49. 49. Uso secondo la rivendicazione 44, in cui il polinucleotide o il plasmide codificano per un peptide o una proteina utile come vaccino.
  50. 50. Uso secondo la rivendicazione 37, in cui il liposoma comprendente ulteriormente lipidi helper.
  51. 51. Uso secondo la rivendicazione 50, in cui il detto lipide helper è scelto nel gruppo che consiste di colesterolo o di dioleil fosfatidii colina.
  52. 52. Composizione comprendente un liposoma della rivendicazione 44, per il trasporto di un polinucleotide o un plasmide di origine naturale o modificata.
  53. 53. Composizione secondo la rivendicazione 52, in cui il polinucleotide o il plasmide codificano per un peptide o una proteina utile come vaccino.
  54. 54. Composizione secondo la rivendicazione 52-53, somministrabile per via orale, parenterale, endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, transdermica o sotto forma di spray nasale od orale.
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