BRPI0017460B1 - uso de lipossomos consistindo de ésteres de l-carnitina - Google Patents

Abstract

uso de lipossomos consistindo de ésteres de l-carnitina. é descrito o uso de ésteres de l-carnitina para a preparação de lipossomas para o transporte de um plasmídeo ou polinucleotídeo modificado ou de ocorrência natural. composições compreendendo tais lipossornas são também divulgadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE Ll-POSSOMOS CONSISTINDO DE ESTERES DE L-CARNITINA".

Pedido dividido do PI 0009765-9, depositado em 11.04.2000. A invenção descrita aqui refere-se a uma classe de novos éste-res de L-carnitina e acil L-carnitinas e a seu uso como lipídios catiônicos a-dequados para favorecer a distribuição intracelular de compostos farmacolo-gicamente ativos, facilitando seu transporte transmembramático ou para a promoção de sua interação com locais específicos na membrana celular (receptores). A invenção descrita aqui também se refere a outros ésteres conhecidos de L-carnitina e acil L-carnitinas úteis para as mesmas finalidades conforme os novos compostos acima mencionados. O que se quer dizer aqui pelo termo "distribuição intracelular" é a transfecção celular com polinucleotídeos ou plasmídeos de origem natural ou modificados, dotados de atividade terapêutica (distribuição de gene) ou a introdução de drogas ou peptídeos imunogênicos nas células.

Muitas das substâncias farmacologicamente ativas tais como, por exemplo, polipeptídeos e proteínas ou drogas em geral, precisam penetrar nas células para exercer seus efeitos influenciando as funções celulares a nível subcelular ou molecular. Para essas moléculas, a membrana celular constitui uma barreira relativamente impermeável. A membrana celular, na verdade, desempenha uma função protetora, impedindo a entrada de substâncias potencialmente tóxicas, mas também a passagem de compostos com atividade terapêutica. A composição complexa da membrana celular inclui fosfolipídios, glicolipídios e proteínas; sua função é influenciada pelos componentes citoplasmáticos, tais como Ca++ e outros íons, ATP, microfila-mentos, microtúbulos, enzimas e proteínas que se ligam ao Ca++. A interação entre os componentes estruturais e citoplasmáticos das células, e a resposta a sinais externos são responsáveis pela seletividade mostrada por e entre os vários tipos diferentes de células. O efeito de barreira das membranas pode ser superado combinando-se substâncias em complexos com formulações lipídicas que reproduzem a composição dos lipídios de membrana aue ocorrem naturalmente. Esses lipídios são capazes de se fundir com as membranas e de liberar as substâncias combinadas com as mesmas nas células. Os complexos lipídicos são capazes não somente de facilitar a transferência intracelular por meio de fusão com as membranas, mas também podem diminuir a repulsão de cargas entre a membrana e a molécula que tem de penetrar na celular. Lipídios antipáticos, tais como fosfolipídios da membrana, formam vesículas lipídicas ou lipossomas em sistemas aquo-sos.

Os lipossomas são vesículas nas quais um volume aquoso está completamente contido por uma ou mais membranas compostas de molécu-las lipídicas, usualmente fosfolipídios. Os fosfolipídios, os quais consistem em uma cabeça hidrofílica e um par de cadeias de carbono (cauda hidrofóbi-ca), são os principais componentes das membranas biológicas. Em solução aquosa, as caudas hidrofóbicas se auto-associam para excluir água, ao passo que as cabeças hidrofílicas interagem com o meio, formando espontaneamente populações de vesículas de diâmetros variados. Os lipídios são, geralmente, zwitteriônicos, neutros ou aniônicos. Essas vesículas podem ser usadas como veículos de drogas, moléculas pequenas, proteínas, nucleotí-deos e plasmídeos.

Nos últimos anos, os lipossomas catiônicos, uma classe de vesículas positivamente carregadas, preparadas a partir de lipídios sintéticos, têm sido extensivamente usados para a transferência de material genético nas células. A carga negativa do DNA pode interagir com as cargas positivas dos lipídios catiônicos, formando um complexo estável de DNA-lipossoma. A simplicidade e versatilidade dessa tecnologia tornaram os lipossomas um veículo importante para a distribuição de genes para terapia genética em seres humanos. Atualmente, a maioria dos vetores usados para a terapia genética e aprovados pelo NIH Recombinant Advisory Committee inclui sistemas virais e sintéticos. A infecção viral envolve uma série de mecanismos complexos de forma a ser capaz de atacar uma célula específica e trazer o DNA no núcleo. A razão para o uso de vetores virais para terapia genética é baseada sobre a possibilidade de substituição dos genes virais por genes que codificam uma função terapêutica, sem eliminar a capacidade da partícula viral de infectar as células. As limitações da terapia viral referem-se àqueles elementos virais que podem ser imunogênicos, citopáticos e recombinogênicos.

Existem muitas esperanças quanto ao uso de lipídios catiônicos para a terapia genética. Esses vetores possuem grande potencial comparado àqueles de origem biológica, uma vez que eles são muito mais seguros, menos tóxicos e também são capazes de incorporar genes de grande tamanho. Quando comparado a vetores do tipo biológico, contudo, eles têm um baixo rendimento de transcrição genética intracelular. Deve ter em mente, contudo, que o uso de tais sistemas de transfecção está em estágio inicial de pesquisa. Os lipídios catiônicos exercem um papel muito importante na formação do complexo de DNA-lipídio, na interação célula-complexo, na fusão com a membrana, na liberação de DNA dentro da célula e na transcrição.

Existem exemplos importantes de aplicações in vivo de liposso-mas catiônicos. O primeiro experimento clínico sobre terapia genética foi conduzido através de introdução de um vetor de expressão contendo o gene HLA-B7 humano lipossoma-complexado para o tratamento de melanoma. Outra aplicação importante refere-se ao tratamento de fibrose cística pulmonar por meio da administração, através da via pulmonar ou um spray nasal, do vetor de expressão SV-40C-FTR lipossoma-complexado. Outros experimentos clínicos envolvendo o uso de lipossomas em terapia genética para o câncer estão, atualmente, em progresso.

Quatro elementos constituintes são, geralmente, identificados na estrutura dos lipídios catiônicos: a cabeça catiônica positivamente carregada, o espaçador, o lipídio âncora e a ligação por ligante. A cabeça catiônica é responsável pelas interações entre os lipossomas catiônicos e o DNA, entre o complexo DNA-lipossoma e a membrana celular e outros componentes da células. Ela consiste em grupos mono- ou policatiônicos (dependendo do número de cargas) que podem ser variavelmente substituídos. O espaçador é a parte da molécula que separa a cabeça catiôni-ca da cauda hidrofóbica e está envolvido em assegurar contato ótimo entre a cabeça catiônica e as cargas negativas dos fosfatos de DNA. O lipídio âncora é a parte de hidrocarboneto não-polar da molécula e determina as propriedades tísicas da camada lipídica dupla, tal como sua rigidez e taxa de troca com os lipídios da membrana. O que se quer dizer por "ligação por ligante" é a ligação entre as cadeias de hidrocarboneto e o resto da molécula. Essa ligação determina a estabilidade química e a biodegradabilidade dos lipídios catiônicos.

Em anos recentes, o uso de lipossomas tem aumentado crescentemente no setor de cosméticos. O sucesso dos lipossomas nesse campo se deve ao fato de que esses compostos são muito bem tolerados pela pele. Eles são usados como vesículas para ingredientes ativos e como compostos que favorecem a absorção dos últimos. A literatura científica e de patentes é rica em referências quanto aa preparaçãoe uso de lipossomas; existem, contudo, muito poucas referências descrevendo o uso de derivados de carnitina úteis para a distribuição de genes, uma vez que não está disponível nenhum documento sobre a distribuição de drogas que lide com técnicas conhecidas para a preparação de compostos as quais se comparam remotamente àquelas de acordo com a invenção descrita aqui. O pedido de patentef EP 0 279 887' descreve o uso de um derivado de carnitina, isto é, fosfatidil carnitina, opcionalmente em misturas com outros fosfoiipídios e lipídios (colesterol, fosfatidil colina, fosfatidil serina) para a preparação de lipossomas.

No exemplo proporcionado com relação à preparação de lipossomas, lipossomas de fosfatidil carnitina são produzidos, os quais incorporam propanolol, uma droga conhecida como sendo ativa como um agente anti-hipertensivo, antiangina e antiarritmia. O derivado de carnitina é usado aqui levando-se em conta o tropismo miocárdico acentuado da carnitina. Esse tropismo torna possível evitar que os lipossomas sejam metabolisados pelo fígado ao invés de atingirem o local alvo desejado. A presença de fosfatidil carnitina também torna possível administrar os lipossomas oralmente, uma vez que eles são resistentes às lipases intestinais.

Em J. Med. Chem., 18 de Junho de 1998; 41(13): 2207-15, é descrita uma variedade de ésteres de L-carnitina úteis para a distribuição genética, mas eles não são descritos ou propostos como agentes úteis para a distribuição de drogas. O WO 96/39193 descreve novos agentes como drogas de obje-tivação que são objetivados para entrar na mitocôndria via o sistema de translocase de carnitina-acilcarnitina, mas não sugere os mesmos como a-gentes úteis para a preparação de lipossomas. O EP 559 625 B1 descreve uma variedade de ésteres de L-carnitina e acil L-carnitinas dotados de atividade seletiva de relaxamento da musculatura do trato gastrointestinal.

Nos últimos anos, os biólogos moleculares identificaram numerosos defeitos a nível cromossômico que causam doenças hereditárias em seres humanos.

Um setor importante da medicina moderna refere-se ao tratamento dessas doenças hereditárias baseadas em genética por meio do uso de protocolos de terapia genética.

Conforme já mencionado, os lipossomas catiônicos são extensivamente usados para a distribuição intracelular de compostos farmacologi-camente ativos, facilitando o transporte transmembramático ou promovendo sua interação com locais específicos da membrana celular (receptores).

Esses vetores possuem grande potencial comparado àqueles de origem biológica, uma vez que eles são muito mais seguros, menos tóxicos e também são capazes de incorporar genes de grande tamanho. Quando comparado a vetores do tipo biológico, contudo, eles têm um baixo rendimento de transcrição genética intracelular.

Além disso, a transferência de genes mediada pelos lipídios catiônicos convencionais requer que o DNA do plasmídeo e os lipídios catiôni- cos sejam mantidos separados e que sua mistura seja efetuada imediatamente antes da transferência de gene, Tentativas para estabilizar esses complexos de polinucleotídeo têm falhado em proporcionar resultados encorajadores; na verdade, eles permanecem estáveis apenas durante um breve período.

No campo da terapia genética ou distribuição de genes e distribuição de drogas existe, portanto, uma necessidade fortemente percebida de sistemas locais-específicos estáveis, reproduzíveis os quais também são ativos após um período adequado de tempo.

Descobriu-se agora que uma classe de lipídios catiônicos poderosamente ativa na promoção da distribuição intracelular de compostos far-macologicamente ativos compreende os novos ésteres de L-carnitina e acil L-carnitinas.

Esses novos compostos são estáveis e altamente seletivos devido ao fato de que eles são locais-específicos ao atingir o órgão alvo.

Essa característica torna os mesmos úteis para o transporte de compostos ativos diretamente ao local onde eles podem exercer sua atividade farmacológica.

Os compostos de acordo com a invenção descrita aqui são compostos com a fórmula geral (I): 0 O K 1 H3CX Λ O 11 O RI

hí?vYY >sM V \0 ° (i) onde: n é um número inteiro de 1 a 3; R é um hidrogênio ou alcanoíla, reta ou ramificada, com 2-6 áto- mos de carbono;

Ri e R2, os quais podem ser os mesmos ou diferentes, representam uma cadeia acila reta saturada ou insaturada com 3-20 átomos de carbono; e X' é 0 ânion de um ácido farmacologicamente aceitável.

Exemplos de R são acetila, propionila, butirila, vaierila e isovale- rila.

Exemplos de Ri e R2 são hexanoíla, undecanoíla, miristoíla, palmito Na ou oleoíla.

Exemplos preferidos de compostos de acordo com a invenção são: - éster de brometo de L-carnitina com 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 770); - éster de brometo de acetil L-carnitina com 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 771); - éster de brometo de propionil L-carnitina com 2-hidroxiacetil- 1.3- dipalmitoii glicerol (ST 772); - éster de brometo de isobutiril L-carnitina com 2-hidroxiacetil- 1.3- dipalmitoil glicerol (ST 773); - éster de brometo de isovaleril L-carnitina com 2-hidroxiacetil- 1.3- dipalmitoil glicerol (ST 774); - éster de brometo de L-carnitina com 1,3-diexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 810); - éster de brometo de acetil L-carnitina com 1,3-diexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 809); - éster de brometo de propionil L-carnitina com 1,3-diexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 808). O que se quer dizer por um ânion de um ácido farmacologica-mente aceitável é qualquer ânion de um ácido que não dá origem a efeitos colaterais ou tóxicos indesejados.

Esses ácidos são bem-conhecidos pelos farmacologistas e versados na tecnologia farmacêutica.

Exemplos desses ânions, embora não exclusivamente aqueles listados, são: cloreto; brometo; iodeto; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartarato; tartarato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato; fuma-rato ácido; glicerofosfato; fosfato de glicose; lactato; maleato; maleato ácido; mucato; orotato; oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metano sulfonato; pamoato e pamoato ácido.

Os compostos da fórmula (I), na forma de lipossomas, são agentes úteis para a distribuição de plasmídeos ou nucleotídeos modificados ou que ocorrem naturalmente úteis em terapia genética ou os quais codificam um peptídeo ou proteína útil como uma vacina e para a distribuição de drogas em geral tais como, por exemplo, drogas anticâncer, agentes antivirais, agentes antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoários, drogas úteis para a terapia de doenças do sistema cardiovascular ou peptídeos imunogênicos e outras drogas úteis em terapia.

Os lipossomas contendo o composto da fórmula (I) são preparados por meio de técnicas convencionais bem-conhecidas por aqueles versados na técnica; veja, por exemplo, Allen T.M., Drugs 56, 747-56 (1998). Os lipossomas de acordo com a presente invenção podem ser preparados também através do uso de outros componentes bem-conhecidos na prática da tecnologia de lipossomas. Em uma concretização da presente invenção, os lipossomas podem conter lipídios auxiliares, um termo o qual é bem compreendido nessa técnica. Exemplos de lipídios auxiliares são colesterol, 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina ou dioleoil fosfatidil colina.

Os lipossomas de acordo com a presente invenção são, adequadamente, apresentados como composições. Em uma concretização referente à distribuição de compostos farmacologicamente ativos, as composições são compreendidas como aquelas farmacêuticas, opcionalmente compreendendo veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos da fórmula (I), na forma de lipossomas, também podem ser úteis na preparação de composições cosméticas, compreendendo o lipossoma per se como um agente cosmético ativo e para a distribuição de substâncias com atividade cosmética tais como, por exemplo, agentes hidratantes, nutrientes, substâncias para limpeza facial, agentes anti-rugas, agentes anticelulite e agentes antiestrias.

Os lipossomas compreendendo os compostos da fórmula (I) podem ser administrados oral ou parenteralmente, intravenosamente, intra-muscularmente, subcutaneamente, transdermicamente ou na forma de s-prays nasais ou bucais. A invenção descrita aqui também se refere a lipídios catiônicos adicionais com a fórmula geral (11) já conhecidos por um uso diferent^EE3 559 625 mencionado acima).

De acordo com a presente invenção, os compostos da fórmula (II) são ésteres de L-carnitina úteis para a preparação de lipossomas os quais possuem atividade potente na distribuição de droga e apresentam características de estabilidade e seletividade ao atingir o órgão alvo, comparado àquelas dos compostos da fórmula (I) descritos acima. As mesmas propriedades vantajosas são aplicáveis no caso de cosméticos.

Esses compostos possuem a fórmula geral (II): (Π) onde: R3 é uma cadeia reta ou ramificada de acila, saturada ou insatura- da, com 4-26 átomos de carbono; R4 é uma cadeia reta ou ramificada de alquila, saturada ou insatu- rada, com 4-26 átomos de carbono; e X' é o ânion de um ácido farmacologicamente aceitável.

Exemplos de R3 preferidos são nonanoíla, dodecanoíla, miristoí-la, palmitoíla, estearoíla ou oleoíla.

Exemplos de R4 preferidos são nonila, undecila, tetradecila, he-xadecila ou oleíla.

Exemplos de compostos específicos da fórmula (II) de acordo com a invenção descrita aqui são: - undecil éster de cloreto de palmitoil L-carnitina (ST 983); - undecil éster de cloreto de estearoíl L-carnitina (ST 1055); - tetradecil éster de cloreto de estearoil L-carnitina (ST 1351); - tetradecil éster de cloreto de palmitoil L-carnitina (ST 1379); - tetradecil éster de cloreto de miristoil L-carnitina {ST 1380); - hexadecil éster de brometo de palmitoil L-carnitina (ST 1390); - oleil éster de cloreto de oleil L-carnitina (ST 1392).

Uma variedade de compostos da fórmula (II), isto é, ST 1380, ST 1390 e ST 1392, é conhecida e descrita em J. Med. Chem., 18 de Junho de 1998, 41(13): 2207-15 descrito acima, como agentes úteis para a preparação de lipossomas para a transfecção celular, dotados de atividade terapêutica, mas nunca tinham sido descritos como agentes úteis para a preparação de lipossomas para a distribuição de drogas.

Aqueles versados na técnica com experiência média no campo de formulações farmacêuticas estão cientes das dificuldades encontradas na preparação de complexos de droga-lipossoma; na verdade, é impossível estabelecer a priori se um lipossoma que é útil para a distribuição genética pode ser usado para a distribuição de droga, levando-se em conta os numerosos problemas que devem ser superados a fim de se obter um lipossoma capaz de complexação com uma droga e o qual irá distribuir a mesma de preferência ao órgão onde ela tem de exercer sua atividade curativa.

Os compostos da fórmula (II), na forma de lipossomas, são a-gentes úteis para a distribuição de drogas tais como, por exemplo, agentes anticâncer, antiangiogênicos, antivirais, antibacterianos, antifúngicos, anti-protozoários ou drogas úteis para a terapia de doenças cardiovasculares ou peptídeos imunogênicos e outras drogas úteis em terapia.

Os compostos da fórmula (II), na forma de lipossomas, também são úteis na preparação de composições cosméticas como agentes cosméticos per se ou para a distribuição de substâncias com atividade cosmética tais como, por exemplo, agentes hidratantes, nutrientes, substâncias para limpeza facial, agentes anti-rugas, agentes anticelulite e agentes antiestrias.

Os referidos lipossomas podem, opcionalmente, conter lipídios auxiliares, como é o caso dos lipossomas compreendendo os compostos da fórmula (II).

Os lipossomas compreendendo os compostos da fórmula (II) podem ser administrados oral ou parenteralmente, intravenosamente, intra- muscularmente, subcutaneamente, transdermicamente ou na forma de s-prays nasais ou bucais. A invenção descrita aqui também se refere a lipídios catiônicos adicionais com a fórmula geral (III) já conhecidos por um uso diferente (EP 559 625 mencionado acima).

De acordo com a presente invenção, os compostos da fórmula (III) são ésteres de L-carnitina úteis para a preparação de lipossomas os quais possuem atividade potente na promoção da distribuição de droga e apresentam características de estabilidade e seletividade ao atingir o órgão alvo, comparado àquelas dos compostos da fórmula (I) descritos acima. Esses compostos possuem a fórmula geral (III): íifl) em que: R5 é uma cadeia acila reta ou ramificada, saturada ou insaturada, com 4-26 átomos de carbono; R6 é uma cadeia alquila reta ou ramificada, saturada ou insaturada, com 4-26 átomos de carbono; e X' é o ânion de um ácido farmacologicamente aceitável; contanto que: quando R5 é estearoíla, R6 não é estearila, quando R5 é oleoíla, R6 não é estearila, quando R5 é palmitoíla, R6 não é palmitila, quando R5 é miristoíla, R6 não é miristila, quando R5 é lauroíla, Re não é laurila, quando R5 é oleoíla, R6 não é oleíla.

Os compostos reivindicados na forma de lipossomas são descritos em J. Med. Chem. 1988, 41, 2207-2215 exclusivamente para a distribuição genética.

Exemplos preferidos de R5 são nonanoíla, dodecanoíla, miristoí-la, palmitoíla, estearoíla ou oleoíla.

Exemplos preferidos de R6 são nonila, undecila, tetradecila, he-xadecila ou oleíla.

Exemplos preferidos de compostos da fórmula (III) de acordo com a invenção, descritos aqui são: - undecil éster de cloreto de palmitoil L-carnitina (ST 983); - undecil éster de cloreto de estearoil L-carnitina (ST 1055); - tetradecil éster de cloreto de estearoil L-carnitina (ST 1351); - tetradecil éster de cloreto de palmitoil L-carnitina (ST 1379).

Os compostos da fórmula (III) são agentes úteis para a distribuição de plasmídeos ou nucleotídeos modificados ou que ocorrem naturalmente em terapia genética ou os quais codificam um peptídeo ou proteína útil como uma vacina.

Os compostos da fórmula (III) podem ser administrados oral ou parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, transdermicamente ou na forma de sprays nasais ou bucais. O procedimento para a preparação de compostos da fórmula (I) de acordo com a invenção é representado no diagrama de reação a seguir, sendo entendido que esse diagrama aplica-se à fórmula geral (I) toda. Aqueles versados na técnica podem obter facilmente todos os grupos entendidos em R, Ri e R2, uma vez que todos os reagentes necessários estão comercialmente disponíveis ou são descritos na literatura e as condições de reação são aplicáveis, de modo geral, ao escopo todo da presente invenção; qualquer modificação, se necessária, é normalmente obtida dentro do conhecimento comum geral.

Com referência ao diagrama de reação 1 acima, a preparação dos compostos da fórmula (I) de acordo com a invenção é ilustrada aqui a-baixo. EXEMPLO 1 Preparação do éster de brometo de propionil L-carnitina com 2-hidróxi acetil 1,3 dipalmitoil qlicerol (ST 772) a) Preparação de 1,3-dipalmitato de 1.3-diidróxipropan-2-ona (1) Diidróxiacetona (7 g; 0,078 moi) foi dissolvida em 300 mL de clorofórmio anídrico a 0 °C (temperatura externa) sob um fiuxo de nitrogênio anídrico. À solução assim obtida, cloreto de palmitoíla (44 g; 0,16 mol) e piridina anídrica (15 mL) foram adicionados gota a gota. A mistura resultante, a temperatura da qual foi levada para a temperatura ambiente, foi mantida sob agitação durante 24 horas. A mistura foi, então, extraída na seguinte ordem: com 300 mL de uma solução aquosa de ácido clorídrico a 0,5%, 300 mL de uma solução aquosa de bicarbonato de sódio a 5% e, por fim, com 300 mL de água. A fase orgânica separada foi desidratada sobre sulfato de sódio anídrico, filtrada sobre um filtro de celulose e concentrada até secagem, ob-tendo-se o produto bruto (1). O produto bruto (1) foi obtido por meio de cristalização a partir de 500 mL de álcool etílico. 30,4 g de produto (1) foram obtidos.

Rendimento: 73%.

p.f. = 80-81 °C 1H RMN (CDCI3): 0,9 (6H, t, ÇH3CH2-); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m, -OCOCHsÇH^-); 2,4 (4H, t, -OCOÇH^-); 4,7 (4H, s, -OCÇHg-). b) Preparação de 1,2,3-triidróxipropano-1.3-dipalmitato (2) Água (7,5 mL) foi adicionada lentamente ao produto (1) (5 g, 9 mmoles) dissolvido em tetraidrofurano (125 mL) e tolueno (25 mL) sob agitação. A temperatura da suspensão branca leitosa obtida foi levada para 5 °C (temperatura externa) e boroidreto de sódio (500 mg; 13 mmoles) foi adicionado em pequenas porções. A suspensão foi mantida sob agitação durante 30 minutos a 5 °C. Ácido acético glacial foi, então, adicionado lentamente até que a efervescência produzida pela decomposição do boroidreto de sódio em excesso cessasse, finalmente obtendo-se uma solução.

Clorofórmio (100 mL) foi adicionado à solução, obtendo-se a formação de um sistema bifásico. A fase orgânica inferior consistindo em CHCI3 foi separada, sendo extraída na seguinte ordem: com água (25 mL), bicarbonato de sódio (25 mL de uma solução aquosa a 10%) e água (25 mL). A solução orgânica contendo (2) foi desidratada sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada até secagem, obtendo-se um produto semelhante à cera. O produto (2) foi obtido por meio de cristalização em a partir de acetona do produto bruto semelhante a cera. 4,8 g de produto (2) foram obtidos.

Rendimento: 94%. p.f. = 71-72 °C. 1H RMN (CDCI3): 0,9 (6H, t, ÇHgCH2-); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1.55 (4H, m, -OCOCHpCHp-V, 2,4 (4H, t, -OCOÇHg-); 4,2 (5H, m, -CHCHpCM. c) Preparação de 1,3-dipalmitoil-2-bromoacetil qlicerol (3) O produto (2) (2,5 g; 4,4 mmoles) foi solubilizado em clorofórmio anídrico (50 mL) sob agitação e a 0 °C (temperatura externa). À solução assim obtida foram lentamente adicionados piridina (0,42 ml) e, gota a gota, 3 ml de uma solução de clorofórmio contendo cloreto de bromoacetila (0,43 mL; 5,2 mmoles). A mistura de reação foi mantida durante 30 minutos a 0°C (temperatura externa) e durante 30 minutos em temperatura ambiente. A mistura de reação foi, então, tratada na seguinte ordem com: uma solução aquosa de ácido clorídrico a 1% (aproximadamente 50 mL), uma solução aquosa de bicarbonato de sódio a 5% (aproximadamente 50 mL) e água. O produto (3) foi purificado por meio de cristalização a partir de acetona, após desidratação da mistura de reação (com sulfato de sódio) e concentração até secagem. 2,5 g de produto (3) foram obtidos.

Rendimento: 89%. p.f. = 46-47 °C. 1H RMN (CDCIs): 0,9 (6H, t, CHpCHp-): 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1.55 (4H, m, -OCOCHpCHp-); 2,4 (4H, t, -OCOCHp-); 3,9 (2H, s, OCHpCOO-): 4,2-4,4 (5H, m, -CHCHpO-): 5,25 (1H, m, ÇHCH20-). d) Preparação do éster de brometo de L-propionil carnitina com 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoilqlicerol (4) Sal interno de L-propionil carnitina (0,95 g, 4,4 mmoles) previamente seco a vácuo a 40 °C foi suspenso em dimetilformamida anídrica (a-proximadamente 20 mL). O Produto (3) (3 g, 4,7 mmoles) foi adicionado à suspensão em pequenas porções. A suspensão foi lentamente aquecida para 38 °C e mantida nessas condições até que uma solução fosse obtida.

Após 10 minutos, a solução foi levada para 0 °C durante 30 minutos. Um precipitado foi obtido, o qual foi filtrado e lavado com etil éter e dissolvido em clorofórmio (100 mL). A solução opalescente obtida (30 ml_) foi filtrada sobre celite e concentrada. A essa última solução, foi adicionado he-xano (100 mL) e o precipitado do produto (4) obtido foi filtrado e seco a vácuo a 35 °C. 3,19 g do composto do título foram obtidos.

Rendimento: 80%. p.f. = 127-128 °C.

[apD = -3,9 (C = clorofórmio a 1%).

Análise elemental de C47H8sBrNOio % de C % de H %deN %deBr Calculado 62,23 9,78 1,54 8,81 Encontrado 62,73 10,15 0,79 8,77 1H RMN (CDCIs): 0,9-0,95 (6H, t, ÇH3CH2CH2-); 1,1-1,2 (3H, t, CH.pCHpCO): 1,2-1,4 (24H, m, CH2n=24); 1,5-1,6 (4H, m, OCCHpCHp-1: 2,3-2,4 (4H, t, -OCCHpCHp-1: 2,4-2,45 (4H, d.d., CHCHpO-); 2,95 (2H, d, -ÇHgCOOCHsCOO-); 3,5 (9H, s, N(CH3)3); 4,2 (4H, m, -CHpOCOCHp-): 4,35 (2H, m, -ÇHgN-); 4,65 (2H, d,d, -OCHpCO-): 5,25 (1H, m, -OCHpCHCHpO-): 5,75 (1H, m,-ÇHCH2N-). EXEMPLOS 2-7 Os seguintes compostos foram preparados da mesma forma conforme no exemplo precedente: - éster de brometo de L-carnitina com 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 770); - éster de brometo de acetil L-carnitina com 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 771); - éster de brometo de isobutiril L-carnitina com 2-hidroxiacetil- 1.3- dipalmitoil glicerol (ST 773); - éster de brometo de isovaleril L-carnitina com 2-hidroxiacetil- 1.3- dipalmitoil glicerol (ST 774); - éster de brometo de L-carnitina com 1,3-diexanoil-2- hidroxiacetil glicerol (ST 810); - éster de brometo de acetil L-carnitina com 1,3-diexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 809); - éster de brometo de propionil L-carnitina com 1,3-diexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 808).

Uma concretização preferida da invenção descrita aqui consiste na preparação de lipossomas com drogas anticâncer e particularmente li-possomas que atuam como vesículas para canftotecinas, por exemplo, a-queles descritos no WO 97/31003. Em uma concretização mais preferida, a invenção descrita aqui proporciona lipossomas para a distribuição de canftotecinas com a fórmula geral (IV): o (IV) onde: R7 é um grupo -C{Rn)=N-0(n)Rio, na qual Rio é hidrogênio ou um grupo CrC5 alquila ou CrC5 alquenila reto ou ramificado ou um grupo C3-C10 cicloalquila ou um grupo (C3-C10) cicloalquil - (Cr C5) alquila reto ou ramificado ou uma C6-Ch arila ou um grupo (C6-C14) aril - (C1-C5) alquila reto ou ramificado ou um grupo he-terocíclico ou heterociclo - (C1-C5) alquila reto ou ramificado, 0 referido grupo heterocíclico contendo pelo menos um heteroá-tomo selecionado de átomos de nitrogênio, opcionalmente substituído por um grupo (C1-C5) alquila e/ou oxigênio e/ou enxofre; os referidos grupos alquila, alquenila, cicloalquila, arila, aril-alquila, heterocíclico ou heterociclo-alquila sendo opcionalmente substituídos por outros grupos selecionados de: halogênio, hi-dróxi, C1-C5 alquila, C1-C5 alcóxi, fenila, ciano, nitro, -NR12R13 onde R12 e R13, os quais podem ser os mesmos ou diferentes, são hidrogênio, (C1-C5) alquila reta ou ramificada, 0 grupo -COOH ou um de seus ésteres farmaceuticamente aceitáveis; ou 0 grupo -CONR14R15 onde R14 e R15, os quais podem ser os mesmos ou diferentes, são hidrogênio, (C1-C5) alquila reta ou ramificada; ou R10 é um resíduo de C6-C10 aroíla, opcionalmente substituído por um ou mais grupos selecionados de: halogênio, hidróxi, C1-C5 alquila reta ou ramificada, CrC5 alcóxi reto ou ramificado, fenila, ciano, nitro, -NRi6Ri7 onde Ri6 e R17, os quais podem ser os mesmos ou diferentes, são hidrogênio, C1-C5 alquila reta ou ramificada; R10 é um resíduo de poliaminoalquila; ou R10 é um resíduo de glicosila; n é 0 número 0 ou 1;

Rn é hidrogênio, C1-C5 alquila reta ou ramificada ou C1-C5 alquenila reta ou ramificada, C3-C10 cicloalquila, (C3-C10) cicloalquil - (C-r C5) alquila reta ou ramificada, C6-Ci4arila, (C6-Ci4) aril - (C1-C5) alquila reta ou ramificada; R8 e Rg, os quais podem ser os mesmos ou diferentes, são hidrogênio, hidroxila, C1-C5 alcóxi reto ou ramificado; seus Nróxidos, isômeros simples, particularmente os isômeros syn e anti do grupo -C(R-u)=N-0(n)Rio, seus possíveis enanciômeros, diaste-reoisômeros e misturas relacionadas, seus sais farmaceuticamente aceitáveis e seus metabólitos ativos.

Os compostos da fórmula (IV) são descritos no pedido de patente Européia nQ 99830124.6, depositado em 9 de Março de 1999.

Com relação aos compostos da fórmula (IV) nos quais n é 1 e R10 é conforme definido acima, com a exceção de aroíla, esses compostos podem ser preparados começando de 7-aldeído canftotecina (fórmula IVa, Rn hidrogênio) ou 7-ceto canftotecina (fórmula IVa, Rn é outro que não hidrogênio): (IVa) onde R7 é o grupo -C(Rn)=0 e Rn é conforme definido na fórmula (IV), Re e R9 são conforme definido na fórmula (IV). O composto da fórmula (IVa) é reagido com o composto da fórmula (Va), R10O-NH2, onde R10 é conforme acima, a fim de proporcionar os compostos da fórmula (I) na qual R7 é o grupo -C(Rii)=N-O-Ri0, R10 é definido conforme na fórmula (IV), exceto com relação à aroíla. A reação pode ser realizada com métodos convencionais conhecidos por versados na técnica, o processo consistindo na formação normal de oximas. De preferência, a proporção molar de 7-aldeído ou 7-ceto canftotecina para hidroxilamina estará na faixa de 1:3 a 3:1. Os sais relevantes de hidroxilamina também podem ser usados. A reação é realizada na presença de uma base, por exemplo, uma base inorgânica tal como carbonato de potássio ou uma base orgânica, tal como trietilamina ou diazabiciclononano, usando-se solvente polares, de preferência metanol ou etanol e realizando-se a reação em uma temperatura oscilando da temperatura ambiente à temperatura do ponto de ebulição do solvente, opcionalmente na presença de agentes de desidratação, por exemplo, sulfato de sódio ou magnésio, peneiras moleculares. Se requerido, a reação também pode ser realizada na presença de um catalisador, por exemplo, um ácido de Lewis.

Alternativamente, os compostos acima mencionados podem ser preparados a partir da oxima de 7-aldeído canftotecina (obtido conforme descrito em Sawada e outros, Chem. Pharm. Bull. 39, 2574 (1991)) ou a partir da 7-cetona ou 7-acilcanftotecina através de reação com um haleto de R-ιο-Χ, onde X é, de preferência, iodo, em um solvente polar, por exemplo, tetraidrofurano ou álcoois e na presença de uma base, por exemplo, hidreto de sódio ou carbonato de potássio.

Com relação aos compostos da fórmula (IV) na qual n é 1 e Rio é aroíla, conforme definido na fórmula (IV), esses compostos podem ser preparados começando de 7-oxima canftotecina, a preparação da qual foi descrito no parágrafo anterior, com cloretos de R10-COCI acila, em solventes polares e na presença de uma base, de preferência piridina ou diretamente em piridina, conforme descrito por Cho e outros, J. Org. Chem. 62, 2230 (1997).

Com relação aos compostos da fórmula (IV) na qual n é 0 e Rio é conforme definido acima, com a exceção de aroíla, os compostos podem ser preparados começando de 7-aldeído canftotecina (fórmula IVa, Rn é hidrogênio) ou 7-ceto canftotecina (fórmula IVa, Rn é outro que não hidrogênio): onde R7 é o grupo -C(Rn)=0 e Rn é conforme definido na fórmula (IV), Rs e R9 são conforme definido na fórmula (IV). O composto da fórmula (IVa) é reagido com o composto da fórmula (Vb), Rio-NH2, onde R-io é conforme definido acima, a fim de proporcionar compostos da fórmula (IV), na qual R7 é o grupo -C(Rn)=N-R10, Rio é definido conforme na fórmula (IV), exceto com relação à aroíla. A reação pode ser realizada com métodos convencionais conhecidos por versados em tecnologia farmacêutica, o processo consistin- do na formação normal de iminas. De preferência, a proporção molar de 7-aldeído ou 7-ceto canftotecina para imina estará na faixa de 1:3 a 3:1. Os sais relevantes de amina também podem ser usados. A reação é realizada na presença de uma base, por exemplo, uma base inorgânica tal como carbonato de potássio ou uma base orgânica tal como trietilamina ou diazabici-clononano, usando-se solventes polares, de preferência metanol ou etanol e realizando-se a reação em uma temperatura oscilando da temperatura ambiente à temperatura do ponto de ebulição do solvente, opcionalmente na presença de agentes de desidratação, por exemplo, sulfato de sódio ou magnésio, peneiras moleculares. Se requerido, a reação também pode ser conduzida na presença de um catalisador, por exemplo, um ácido de Lewis conforme descrito, por exemplo, por Moretti e Torre, Synthesis, 1970, 141; ou por Kobayashi e outros, Synlett, 1977,115. 7-Aldeído canftotecina e 7-oxima canftotecina são descritos no pedido de patente Européia EP 0056692 e no artigo acima citado de Sawada e outros, Chem. Pharm. Bull. 39,2574 (1991).

Os Ni-óxidos dos compostos da fórmula (IV) são preparados de acordo com métodos conhecidos de oxidação de nitrogênio heteroaromático, de preferência através de oxidação com ácido acético ou trifluoroacético e peróxido de hidrogênio ou através de reação com peróxi-ácidos orgânicos (A. Albini e S. Pietra, Heterocyclic N-oxides, CRC, 1991).

Com relação à significância variada de R-io presente nos diferentes reagentes da fórmula V, esses reagentes estão comercialmente disponíveis ou podem ser preparados de acordo com métodos familiares a partir da literatura, a qual o versado no setor pode recorrer, conforme suplementado por seu conhecimento do assunto.

Sais farmaceuticamente aceitáveis são obtidos com métodos convencionais descritos na literatura e os quais não requerem outra descrição. EXEMPLO 8 7- benzilóximinometilcanftotecina (CPT 172) 500 mg (1,33 mmol) de 7-formilcanftotecina são dissolvidos em 100 ml de etanol. 15 ml de piridina e 638 mg (4 mmoles) de cloridrato de 0-benzilidroxilamina são adicionados. A solução é submetida a refluxo durante 5 horas. O solvente e evaporado in vacuo e o resíduo assim obtido é purificado por meio de cromatografia fiash sobre sílica gel usando-se uma mistura de hexano/acetato de etila a 4:6 como o eluente.

Rendimento: 65%. p.f. = 200-205 °C dec. O produto obtido consiste em uma mistura a aproximadamente 8:2 dos dois isômeros syn e anti (isômero A: Rf de 0,32; isômero B, Rf de 0,19 sobre sílica gel Merck 60 F254; eluente: hexano:acetato de etila a 3:7). HPLC: as análises foram realizadas em um aparelho equipado com uma bomba quaternária {HP 1050) com um injetor Rheodyne (circuito de 20 μΙ) e um detector por disposição de diodos (HP 1050) operado pelo programa HPLC-ChemStation. A aquisição de espectros foi feita a partir de 200 a 600 nm e os cromatogramas foram registrados a 360 e 400 nm.

Uma coluna de fase reversa C18 (Rainin C18; 25 x 0,4 cm, Vari-an) foi usada como uma pré-coluna RP18. A análise foi realizada com um gradiente de eluição linear, começando de acetonitrila:água a 30:70 a aceto-nitrila a 100% em 20 minutos, com uma taxa de fluxo de 1 ml/min. Os tempos de retenção eram: 12,51 minutos para o isômero B e 14,48 minutos para o isômero A. 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6): δ: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,87 (8m, H2-19A+H2-19B), 5,18 (s, H2-5B), 5,21 (8s, H2-Ph B), 5,30 (H2-Ph A), 5,40 (s, H2-5A), 5,45 (s, H2-17A+H2-17B), 6,53 (s, -OH A+-OH B), 7,3-7,6 (m, Ar A+ Ar B+H-14A+H-14B), 7,75 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,95 (m, H-10A+H-10B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18-8,27 (m, H-12A+H9-B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (dd, H-9A), 9,38 (s, CH=N A). m/z de massa 481 (M+ 100) 374 (30) 330 (70) 300 (30) 273 (20) 243 (20) 91 (34). EXEMPLO 9 7-butóxiiminometilcanftotecina (CPT 184) 400 mg (1,06 mmol) de 7-formilcanftotecina são dissolvidos em 80 ml de etanol. 12 ml de piridina e 400 mg (3,18 mmoles) de cloridrato de O-t-butilidroxilamina são adicionados. A solução é submetida a refluxo durante 4 horas. O solvente e evaporado in vacuo e o resíduo assim obtido é purificado por meio de cromatografia flash sobre sílica gel usando-se uma mistura de hexano/acetato de etila a 4:6 como o eluente. 322 mg (0,72 mmol) de um sólido amarelo são obtidos.

Rendimento: 68%. p.f. = 250 °C dec. O produto obtido consiste em uma mistura a aproximadamente 8:2 dos dois isômeros syn e anti (isômero A: Rf 0,31; isômero B, Rf 0,24, sobre sílica gel Merck 60 F254; eluente: hexano:acetato de etila a 3:7). HPLC: as análises foram realizadas em um aparelho equipado com uma bomba quaternária (HP 1050) com um injetor Rheodyne (circuito de 20 μΙ) e um detector por disposição de diodos (HP 1050) operado pelo programa HPLC-ChemStation. A aquisição de espectros foi feita a partir de 200 a 600 nm e os cromatogramas foram registrados a 360 e 400 nm.

Uma coluna de fase reversa C18 (Rainin C18; 25 x 0,4 cm, Vari-an) foi usada como uma pré-coluna RP18. A análise foi realizada com um gradiente de eluição linear, começando de acetonitrila:água a 30:70 a aceto-nitrila a 100% em 20 minutos, com uma taxa de fluxo de 1 ml/min. Os tempos de retenção eram: 12,92 minutos para o isômero B e 14,61 minutos para o isômero A. 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6): δ: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,30 (s, t-but.B), 1,47 (s, t-but.A), 1,87 (m, H2-19A+H2-19B), 5,18 (s, H2-5 B), 5,37 (H2-5 A), 5,42 (s, H2-17A+H2-17B), 6,54 (s, -OH A+-OH B), 7,35 (s H-14A), 7,36 (s, H-14B), 7,69-7,83 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16-8,27 (m, H-9A+H-12B), 8,40 (s, CH B), 8,62 (dd, H-12A), 9,31 (s, CHA). m/z de massa 448 (M+ 28) 391 (40) 374 (100) 362 (40) 330 (34) 57 (17).

PREPARAÇÃO DOS LIPOSSOMAS

Os compostos de acordo com a invenção podem ser usados para preparar lipossomas multilamelares (MLV) e lipossomas unilamelares (SUV), ambos na forma de pós secos e como suspensões em soluções a-quosas.

Os compostos de acordo com a invenção, preparados conforme descrito nos exemplos 1-7, são usados para preparar os lipossomas de ar cordo com o procedimento a seguir. Uma quantidade adequada do composto é dissolvida em clorofórmio; a solução é concentrada in vacuo até secagem em um evaporador giratório até que uma película lipídica seja obtida. A película lipídica é seca sob vácuo elevado até que os últimos vestígios restantes de solvente tenham sido eliminados e, então, dissolvida em álcool te/c-butílico ou com água. A solução assim obtida é liofilizada, obtida como um pó seco macio.

Os pós são hidratados com uma quantidade adequada de solu^ ção aquosa obtendo-se o lipossoma do composto usado o qual é, então, complexado com o potinucleotídeo ou com a droga desejada.

Outro método de preparação de lipossomas consiste em adsor-ção de uma película lipídica consistindo em um composto de acordo com a invenção em um solvente, sobre um suporte inerte adequado tal como sorbi-tol, manitol ou outros carboidratos farmacologicamente aceitáveis. A mistura é seca a vácuo, obtendo-se um sólido o qual pode ser fácil e muito rapidamente hidratado antes de uso.

Preparados na forma de pós-secos apresentam a vantagem de serem estáveis durante longos períodos e são fáceis de usar.

Além disso, os compostos de acordo com a invenção podem ser usados para preparar lipossomas complexados com DNA ou com a droga desejada, na forma de pós-secos, de acordo com o seguinte procedimento. O composto de acordo com a invenção é dissolvido em álcool ferc-butílico ou com água; a solução assim obtida é misturada com DNA ou a droga desejada e a mistura é liofilizada, obtendo-se o complexo o qual pode-se definir como pró-lipossoma-DNA ou pró-lipossoma-droga, na forma de um pó seco macio.

Os pós assim obtidos (pró-lipossomas) podem ser usados para a preparação de composições farmacêuticas as quais podem ser administradas via aerossol ou as quais, alternativamente, quando reconstituídas com água ou com uma solução tampão adequada, podem ser administradas pa-renteral ou oralmente. i Os lipossomas complexados com DNA ou com drogas, em uma forma sólida, também podem ser obtidos com o método de adsorção da película lipídica sobre um suporte inerte tal como sorbitol, manitol ou outros carboidratos por meio do método descrito acima.

Testaaem da formação de lipossoma ) A formação de lipossoma foi testada por meio de um método colorimétrico, usando-se um pigmento solúvel em água, de acordo com o seguinte procedimento. Uma solução aquosa do pigmento Arsenazo III solúvel em água (p.m. = 776,37; 2,3 mg/mL).

Essa solução foi usada ao invés de água para hidratar as pelícu-i Ias lipídicas originárias da preparação acima mencionado.

Uma alíquota da suspensão contendo o lipossoma encapsulan-do o pigmento foi diluída a 100 vezes com água.

Dois mL da suspensão de lipossoma foram usadas para se obter a primeira leitura de densidade óptica a 660 nm; a leitura foi obtida em rela-> ção a uma amostra igual definida como um placebo. 200 μΙ de uma solução de CaCl2 (15 mg/mL; 100 mM) foram adicionados à primeira amostra e a densidade óptica foi medida a 660 nm contra o placebo, ao qual 200 μΙ de água foram adicionados. O valor de absorbância obtido foi indicado como leitura 2. Prosseguiu-se através da adição à amostra de 100 μΙ de uma solu-i ção de Triton X-100 (5% v/v; concentração final de 0,26%) e ao placebo 200 μΙ de água; a leitura de densidade óptica a 660 nm forneceu o valor de densidade óptica definido como leitura 3. Para calcular o percentual de pigmento encapsulado, a seguinte fórmula foi usada: 0/ . . . . leitura 3 - leitura 2x100 % de pigmento encapsulado =------------------------- leitura 3 ) O percentual de pigmento encapsulado proporciona uma medida da formação de lipossoma e, em média, é de aproximadamente 40%: a veri- ficação do tamanho do lipossoma foi realizada usando-se Dispersão de luz a Laser com um início positivo.

EXEMPLOS DE PREPARADOS DE LIPOSSOMAS

Preparação de lipossomas de undecil éster de cloreto de palmitoil L-carnitina (ST 983) na forma de: a) Pós liofilizados 65 mg, 0,11 mmol de undecil éster de palmitoil L-carnitina foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio, em um frasco de 100 mL. A solução foi evaporada até que uma película lipídica fosse obtida, a qual foi seca a vácuo durante 3 horas. O produto assim obtido foi dissolvido em álcool ferc-butílico e essa solução foi rapidamente esfriada para -70°C com nitrogênio líquido e liofilizada durante 24 horas.

Um sólido branco esponjoso macio foi obtido. b) Pós adsorvidos 143 mg, 0,231 mmol de undecil éster de palmitoil L-carnitina foram dissolvidos em 10 mL de clorofórmio. A solução assim obtida foi vertida em pequenas porções em um frasco de 100 mL contendo 750 mg de sorbi-tol. Ao final da adição das várias porções da solução de clorofórmio, o clorofórmio foi rapidamente evaporado. O sólido assim obtido foi seco a vácuo durante 3 horas. 893 mg de um produto branco sólido foram obtidos.

Antes do uso, o produto é hidratado rapidamente com um volume adequado de água a fim de se obter uma solução isotônica.

c) Suspensões em MLV 65 mg, 0,11 mmol de undecil éster de palmitoil L-carnitina foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio, em um frasco de 100 mL. A solução assim obtida foi evaporada até que uma película lipídica fosse obtida, a qual foi, então, seca a vácuo durante 3 horas. A película lipídica foi hidratada com 10 mL de água, a 30 °C, durante 3 horas, obtendo-se uma suspensão em MLV. A suspensão em MLV, adequadamente diluída, foi complexada com um polinucleotídeo ou com uma droga e usada para ensaios biológicos.

e) Suspensões em SUV 65 mg, 0,11 mmol de undecil éster de palmitoil L-carnitina foram dissolvidos em 20 ml_ de clorofórmio, em um frasco de 100 ml_. A solução assim obtida foi evaporada até que uma película lipí-dica fosse obtida, a qual foi, então, seca a vácuo durante 3 horas. A película lipídica foi hidratada com 10 mL de água, a 30 °C, durante 3 horas, obtendo-se uma suspensão em MLV. A suspensão em MLV foi extrudada 10 vezes através de um filtro de policarbonato com um tamanho de poro de 200 nm. A suspensão em li-possoma unilamelar assim obtida foi complexada com um polinucleotídeo ou com uma droga e usada para ensaios biológicos. f) Testaqem da estabilidade física dos lipossomas A estabilidade física da suspensão de lipossoma foi testada por meio de turbidimetria durante um período de 30 dias.

Uma medição da absorbância a 600 nm durante um determinado intervalo de tempo foi realizada para cada suspensão a ser testada. O valor médio de absorbância medido no tempo 0 permaneceu constante para todas as formulações testadas.

Foi considerado que as moléculas apresentavam valores de conformidade durante os períodos de tempo considerados.

As suspensões em lipossoma MLV e SUV podem ser preparadas através de combinação dos compostos de acordo com a invenção com lipídios auxiliares tais como colesterol, 1 -palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina (POPC) ou dioleil fosfatidil colina (DOPE).

Os compostos são combinados com lipídios auxiliares para fins de obtenção de lipossomas com membranas mais estáveis. Aqui abaixo, na seção que descreve a preparação dos lipossomas, um exemplo de um preparado é fornecido, no qual um composto de acordo com a invenção é combinado com um lipídio auxiliar tal como colesterol ou POPC. EXEMPLOS DE PREPARADOS DE LIPOSSOMAS PARA DISTRIBUIÇÃO DE DROGA EXEMPLO 10 Preparação de taxol-ST 983 com lipossomas MLV (1:40) 20 mg, 0,0234 mmoles de taxol e 556 mg, 0,9417 mmoles de ST 983 foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio. A solução foi concentrada até que uma película lipídica fosse obtida sobre a superfície do frasco de vidro.

Após eliminar os últimos vestígios de clorofórmio com o auxílio de uma bomba a vácuo, 20 mL de álcool ferc-butílico foram adicionados à película lipídica e a solução assim obtida foi subdividida em 19 frações, as quais foram imediatamente congeladas a -70 °C com nitrogênio líqüido e liofilizadas durante 24 horas. Cada fração de sólido continha taxol (1,05 mg) e ST 983 (29,2 mg).

Para se obter a suspensão lipossômica final, o produto liofilizado foi hidratado no momento do uso com água (450 μί) ou outras soluções salinas, agitado durante 10 minutos e deixado descansar durante 30 minutos a fim de permitir a finalização do processo de intumescimento (hidratação).

Lipossomas MLV foram obtidos.

Testaaem da estabilidade física do preparado A estabilidade física do preparado foi testada por meio de turbi-dimetria com o registro de uma TDC (Curva de Acionamento de Tempo) a 800 nm, a 20 °C, durante 20 horas.

Uma tendência constante de turvação, indicativa da estabilidade do preparado, foi registrada, sem nenhum fenômeno de precipitação. Testaaem da estabilidade química do taxol no preparado A estabilidade química do taxol foi testada por HPLC.

As condições cromatográficas eram como segue: Coluna: μΒοη03ρ8θΙ< C-18 Eluente: acetonitrila:água a 70:30 Detector UV-VIS: 227 nm Taxa de fluxo: 1 mL/min.

Tempo de retenção: 4,5 minutos A concentração de taxol, determinada contra um padrão, era de 2,13 mg/mL. O percentual de taxol encapsulado era de 98%. EXEMPLO 11 Preparação de taxol-ST 983 com lipossomas SUV 20 mg, 0,0234 mmol de taxol e 556 mg, 0,9417 mmol de ST 98c foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio. A solução foi concentrada até que uma película lipídica fosse obtida sobre a superfície do frasco de vidro.

Após eliminar os últimos vestígios de clorofórmio com o auxilie de uma bomba a vácuo, 20 mL de álcool te/c-butílico foram adicionados è película lipídica e a solução assim obtida foi subdividida em 19 frações, aí quais foram imediatamente congeladas a -70 °C com nitrogênio líqüido e liofilizadas durante 24 horas. Cada fração de sólido continha taxol (1,05 mg' e ST 983 (29,2 mg).

Para se obter a suspensão de lipossoma SUV final, o produte liofilizado foi hidratado com uma solução de PBS (1 mL), submetido a ultra som durante 20 minutos a 0 °C. A filtração foi realizada em um filtro de 400 nm a fim de elimina os vestígios de titânio liberado pela prova de ultra-som.

Testaqem da estabilidade física do preparado A estabilidade física do preparado foi testada por meio de turbi dimetria com o registro de uma TDC (Curva de Acionamento de Tempo) £ 800 nm, a 20 °C, durante 20 horas.

Uma tendência constante de turvação, indicativa da estabilidade do preparado, foi registrada, sem nenhum fenômeno de precipitação. Testaqem da estabilidade química do taxol no preparado A estabilidade química do taxol foi testada por HPLC.

As condições cromatográficas eram como segue: Coluna: pBondapack C-18 Eluente: acetonitrila:água a 70:30 Detector UV-VIS: 227 nm Taxa de fluxo: 1 mUmin.

Tempo de retenção: 4,5 minutos Análise por HPLC da suspensão de lipossoma SUV proporcionou os mesmos resultados que a suspensão correspondente de lipossoma MLV e, nesse caso, o percentual de taxol encapsulado era de 98%.

Análise por HPLC repetida após 24 horas não revelou nenhurr novo pico que não o pico de taxol, indicando a estabilidade do ingrediente ativo. EXEMPLO 12 Preparação de lipossomas de taxol-ST 983-colesterol (1:15) Esses tipos de lipossomas foram preparados de forma a se obtei complexos com membranas mais estáveis. 6 mg, 0,0101 mmol de taxol, 62,2 mg, 0,105 mmol de ST 983 e 40 mg de colesterol foram dissolvidos em 10 mLde clorofórmio. A solução foi concentrada até que uma película lipídica fosse obtida sobre a superfície do frasco de vidro.

Após eliminar os últimos vestígios de clorofórmio com o auxilie de uma bomba a vácuo, 6,3 mL de álcool ferc-butílico foram adicionados è película lipídica e a solução assim obtida foi subdividida em 5 frações, as quais foram imediatamente congeladas a -70 °C com nitrogênio liquido e liofilizadas durante 24 horas. Cada fração de sólido continha taxol (1,2 mg) ST 983 (12,44 mg) e colesterol (8 mg).

Para se obter a suspensão lipossômica final, o produto liofilizade foi hidratado no momento do uso com água (1000 pL) ou outras soluções salinas, agitado durante 10 minutos e deixado descansar durante 30 minutos a fim de permitir a finalização do processo de intumescimento (hidratação).

Lipossomas MLV foram obtidos.

Testaqem da estabilidade física do preparado A estabilidade física do preparado foi testada por meio de turbi-dimetria com o registro de uma TDC (Curva de Acionamento de Tempo) í 800 nm, a 20 °C, durante 6 horas.

Uma tendência constante de turvação, indicativa da estabilidade do preparado, foi registrada, sem nenhum fenômeno de precipitação. EXEMPLO 13 Preparação de lipossomas SUV de taxol-ST 772 (1:70) 20 mg, 0,0234 mmol de taxol e 1485 mg, 1,638 mmol de ST 772 foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio. A solução foi concentrada até que uma película lipídica fosse obtida sobre a superfície do frasco de vidro.

Após eliminar os últimos vestígios de clorofórmio com o auxílio de uma bomba a vácuo elevado, 20 mL de álcool terc-butílico foram adicionados à película lipídica. Para se obter uma solução clara, ela teve de ser aquecida para 60 °C. A solução foi imediatamente congelada a -70 °C com nitrogênio líqüido e liofilizada durante 24 horas.

Para se obter a suspensão de lipossoma SUV final, o produto liofilizado foi hidratado com uma solução de PBS {20 mL), submetido a ultra-som durante 20 minutos a 0 °C. A filtração foi realizada em um filtro de 400 nm a fim de eliminar os vestígios de titânio liberado pela prova de ultra-som.

Testaqem da estabilidade física do preparado A estabilidade física do preparado foi testada por meio de turbi-dimetria com o registro de uma TDC (Curva de Acionamento de Tempo) a 800 nm, a 20 °C, durante 6 horas.

Uma tendência constante de turvação, indicativa da estabilidade do preparado, foi registrada, sem nenhum fenômeno de precipitação. EXEMPLO 14 Preparação de lipossomas MLV de CPT 83-ST 983 (1:40) 6,3 mg, 0,0168 mmol de CPT 83 (7-carbonitrilo canftotecina, descrito no WO 97/31003) e 400 mg, 0,667 mmol de ST 983 foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio. A solução foi concentrada até que uma película lipídica fosse obtida sobre a superfície do frasco de vidro.

Após eliminar os últimos vestígios de clorofórmio com o auxílio de uma bomba a vácuo, 26 mL de álcool íerc-butílico foram adicionados à película lipídica e a solução assim obtida foi subdividida em 12 frações, as quais foram imediatamente congeladas a -70 °C com nitrogênio líqüido e liofilizadas durante 24 horas. Cada fração de sólido continha CPT 83 (0,525 mg) e ST 983 (33,33 mg).

Para se obter a suspensão lipossômica final, o produto liofilizado foi hidratado no momento do uso com água (1000 μΙ_) ou outras soluções salinas e agitado durante 10 minutos.

Lipossomas MLV foram obtidos.

Testaqem da estabilidade física do preparado A estabilidade física do preparado foi testada por meio de turbi-dimetria com o registro de uma TDC (Curva de Acionamento de Tempo) a 800 nm, a 20 °C, durante 20 horas.

Uma tendência constante de turvação, indicativa da estabilidade do preparado, foi registrada, sem nenhum fenômeno de precipitação. Testaqem da estabilidade química do CPT 83 no preparado A estabilidade química do CPT 83 foi testada por HPLC.

As condições cromatográficas eram como segue: Coluna: Supelcosil LC-ABZ

Eluente: tampão de fosfato a 20 mM:metanol a 40:60, pH = 7,3 Detector UV-VIS: 360 nm Taxa de fluxo: 1 mLVmin.

Tempo de retenção: 4,033 minutos A concentração de CPT 83, determinada contra um padrão, era de 0,502 mg/mL. O percentual de CPT 83 encapsulado era de 99%. EXEMPLO 15 Preparação de lipossomas SUV de CPT 83-ST 983 (1:40) 6,3 mg, 0,0168 mmol de CPT 83 e 400 mg, 0,667 mmol de ST 983 foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio. A solução foi concentrada até que uma película lipídica fosse obtida sobre a superfície do frasco de vidro.

Após eliminar os últimos vestígios de clorofórmio com o auxílio de uma bomba a vácuo, 26 mL de álcool ferc-butílico foram adicionados à película lipídica e a solução assim obtida foi subdividida em 12 frações, as quais foram imediatamente congeladas a -70 °C com nitrogênio líqüido e liofiiizadas durante 24 horas. Cada fração de sólido continha CPT 83 (0,525 mg) e ST 983 (33,33 mg).

Para se obter a suspensão de lipossoma SUV final, o produto liofilizado, hidratado com água (1000 μΙ_), foi submetido a ultra-som durante 40 minutos a 0 °C. A filtração foi, então, realizada em um filtro de 400 nm a fim de eliminar os vestígios de titânio liberado pela prova de ultra-som.

Testaqem da estabilidade química do CPT 83 no preparado A estabilidade química do CPT 83 foi testada por HPLC.

As condições cromatográficas eram como segue: Coluna: Supelcosil LC-ABZ

Eluente: tampão de fosfato a 20 mM:metanol a 40:60, pH = 7,3 Detector UV-VIS: 360 nm Taxa de fluxo: 1 mLimin.

Tempo de retenção: 4,033 minutos A concentração de CPT 83, determinada contra um padrão, era de 0,3 mg/ml_. O percentual de CPT 83 encapsulado era de 59%.

Análise por HPLC repetida após 24 horas não revelou nenhum novo pico que não o pico de CPT 83, indicando a estabilidade do ingrediente ativo.

Testaqem da estabilidade física do preparado A estabilidade física do preparado foi testada por meio de turbi-dimetria com o registro de uma TDC (Curva de Acionamento de Tempo) a 600 nm, a 20 °C, durante 20 horas.

Uma tendência constante de turvação, indicativa da estabilidade do preparado, foi registrada, sem nenhum fenômeno de precipitação. EXEMPLO 16 Preparação de lipossomas MLV de CPT 184-ST 983 (1:40) 7,29 mg, 0,0168 mmol de CPT 184 e 400 mg, 0,677 mmol de ST 983 foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio. A solução foi concentrada até que uma película lipídica fosse obtida sobre a superfície do frasco de vidro.

Após eliminar os últimos vestígios de clorofórmio com o auxílio de uma bomba a vácuo, 26 mL de álcool fe/r-butílico foram adicionados à película lipídica e a solução assim obtida foi subdividida em 12 frações, as quais foram imediatamente congeladas a -70 °C com nitrogênio tfqüido e liofiiizadas durante 24 horas. Cada fração de sólido continha CPT 184 (0,607 mg) e ST 983 (33,33 mg).

Para se obter a suspensão lipossômica final, o produto liofilizado foi hidratado no momento do uso com água (1000 pL) ou outras soluções salinas e agitado durante 10 minutos.

Lipossomas MLV foram obtidos.

Testaaem da estabilidade física do preparado A estabilidade física do preparado foi testada por meio de turbi-dimetria com o registro de uma TDC (Curva de Acionamento de Tempo) a 600 nm, a 20 °C, durante 20 horas.

Uma tendência constante de turvação, indicativa da estabilidade do preparado, foi registrada, sem nenhum fenômeno de precipitação. Testaqem da estabilidade química do CPT 184 no preparado A estabilidade química do CPT 184 foi testada por HPLC.

As condições cromatográficas eram como segue: Coluna: Supelcosil LC-ABZ

Eluente: tampão de fosfato a 20 mM:metanol a 40:60, pH = 7,3 Detector UV-VIS: 360 nm Taxa de fluxo: 1 mL/min.

Tempo de retenção: 25,5 minutos A concentração de CPT 184, determinada contra um padrão, era de 0,600 mg/mL. O percentual de CPT 184 encapsulado era de 99%. EXEMPLO 17 Preparação de lipossomas SÜV de CPT 184-ST 983 (1:40) 7,29 mg, 0,0168 mmol de CPT 184 e 400 mg, 0,667 mmol de ST 983 foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio. A solução foi concentrada até que uma película lipídica fosse obtida sobre a superfície do frasco de vidro.

Após eliminar os últimos vestígios de clorofórmio com o auxílio de uma bomba a vácuo, 26 mL de álcool terc-butílico foram adicionados à película lipídica e a solução assim obtida foi subdividida em 12 frações, as quais foram imediatamente congeladas a -70 °C com nitrogênio líquido e liofilizadas durante 24 horas. Cada fração de sólido continha CPT 184 (0,607 mg) e ST 983 (33,33 mg).

Para se obter a suspensão de lipossoma SUV final, o produto liofilizado, hidratado com água (1000 pL), foi submetido a ultra-som durante 40 minutos a 0°C. A filtração foi, então, realizada em um filtro de 400 nm a fim de eliminar os vestígios de titânio liberado pela prova de ultra-som.

Testaqem da estabilidade química do CPT 184 no preparado A estabilidade química do CPT 83 foi testada por HPLC.

As condições cromatográficas eram como segue: Coluna: Supelcosil LC-ABZ

Eluente: tampão de fosfato a 20 mM:metanol a 40:60, pH = 7,3 Detector UV-VIS: 360 nm Taxa de fluxo: 1 mL/min.

Tempo de retenção: 25,5 minutos A concentração de CPT 184, determinada contra um padrão, era de 0,36 mg/mL. O percentual de CPT 184 encapsulado era de 70%.

Análise por HPLC repetida após 24 horas não revelou nenhum novo pico que não o pico de CPT 184, indicando a estabilidade do ingrediente ativo.

Testaqem da estabilidade física do preparado A estabilidade tísica do preparado foi testada por meio de turbi-dimetria com o registro de uma TDC (Curva de Acionamento de Tempo) a 600 nm, a 20 °C, durante 20 horas.

Uma tendência constante de turvação, indicativa da estabilidade do preparado, foi registrada, sem nenhum fenômeno de precipitação.

Nos exemplos a seguir, os lipossomas foram preparados através do uso de lipídios auxiliares e/ou agentes crioprotetores. EXEMPLO 18 Preparação de lipossomas de CPT184-ST 983 Em um frasco de 2 I, 100 ml de metilclorofórmio foram adicionados a 20 mg de CPT 184 e 600 mg de ST 983 e a mistura foi ligeiramente aquecida até dissolução completa. A solução obtida foi concentrada em um rotavapor até que uma película lipídica fosse obtida, a qual foi ainda seca durante duas horas em uma bomba de alto-vácuo. A película lipídica foi hidratada com uma solução de lactose (6 g/300 ml de água) a 45 °C e deixada sob agitação no rotavapor durante cerca de 2 horas. A suspensão foi, então, submetida a ultra-som durante 2 horas, cada ciclo durante meia hora. Subsequentemente, o produto foi filtrado através de um filtro de 200 nm e liofili-zado.

Testaaem da estabilidade química do CPT 184 no preparado A estabilidade química do CPT 184 foi determinada por HPLC. O produto era estável durante as 24 horas do teste.

Testaaem da estabilidade física do preparado A estabilidade física do preparado foi testada por meio de turbi-dimetria. O produto era estável no decorrer de 24 horas do teste. O tamanho de partícula também era estável (valor médio de 100 nm). EXEMPLO 19 Preparação de lipossomas de CPT 184-ST 983 Para 1 ml de formulação lipossômica (POPC -1 -palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina a 5 mM; ST 983 a 1,25 mM; CPT 184 a 0,25 e trealose a 150 mM), o seguinte procedimento foi usado: 0,11 mg, 0,25 pmol de CPT 184 foram dissolvidos em 250 pL de acetato de etila, 3,79 mg, 4,89 pmoles de POPC foram dissolvidos em 100 μΙ_ de etanol e 0,74 mg, 1,25 pmol de ST 983 foram dissolvidos em 100 μί de etanol. As três soluções foram misturadas e submetidas a vórtice. Os solventes foram evaporados com um rotavapor em temperatura ambiente, 80 mbar. A película lipídica foi seca durante duas horas no escuro. A película lipídica foi suspensa em 1 ml de uma solução de diidrato de D(+)-trealose a 150 mM (Fluka, HPLC a 99%), esterilizada através de um filtro de 0,22 nm e submetida a vórtice durante dois minutos. A suspensão foi extrudada 21 vezes através de filtros de policarbonato de 200 nm. A suspensão lipossômica extrudada foi congelada em nitrogênio líquido e liofilizada por 2 noites. Um sólido branco foi obtido. EXEMPLO 20 Preparação de lipossomas de CPT 184-ST 983 O mesmo procedimento do Exemplo 19 foi usado, exceto que trealose a 500 mM foi usada. ATIVIDADE ANTICÂNCER DO COMPLEXO DE AGENTE ANTICÀNCER-ST 983 Como será visto aqui abaixo, o lipossoma de ST 983 mostrou acúmulo predominante a nível pulmonar. Essa característica de especifici-dade-local favoreceu seu uso em um modelo em murinos de carcinogênese pulmonar. O agente anticâncer usado nesse experimento era taxol.

Para induzir o tumor in vivo, camundongos Balb/c não anestesiados receberam injeções de 3 x 105 células de carcinoma pulmonar de muri-no M109 em 0,1 ml de RPMI-1640 (Sigma) no quadríceps femural da pata traseira direita.

Dez dias após implante do tumor, o complexo de lipossoma-taxol foi diluído com solução salina tamponada com fosfato (PBS, SIGMA, P-4417) e injetado intravenosamente em uma concentração de 2,5 mg/mL de ST 983 e 75 pg/mL de taxol. O taxol (paclitaxel INDENA) usado como um controle foi dissolvido no veículo cremophor EL (BASF) em uma concentração de 20 mg/mL e armazenado a +4 °C durante as próximas 24 horas, protegido contra a luz. No momento de uso, ele foi diluído com solução salina tamponada com fosfato (PBS, SIGMA) e injetado intravenosamente no mesmo volume e condições de concentração conforme descrito para o taxol transportado pelo li-possoma de ST 983. O cremophor foi preparado através de diluição a 1:1 com álcool etílico.

As administrações foram fornecidas durante sete dias consecutivos, começando do dia 10 após inoculação do tumor. Os animais foram mantidos sob observação até o dia 17 pós-inoculação e sacrificados por meio de deslocamento cervical e seus pulmões foram removidos para determinação do número de metástases. A coloração dos pulmões a fim de detectar metástases foi feita através de incubação dos pulmões durante 10 dias em 5 ml de solução de Bouin, consistindo em solução saturada de ácido pícrico a 71%, ácido acético glacial a 4,8% (Merck) e formaldeído a 24% 10% (Fluka). Ao final do período de incubação em solução de Bouin, os números de metástases foram contados.

Quando comparados aos camundongos de controle não tratados, o taxol transportado por cremophor não mostrou efeito de redução do número de metástases pulmonares, embora as últimas fossem menores do que aquelas dos controles não tratados, ao passo que o taxol complexado com o lipossoma de ST 983 mostrou uma redução significativa no número e tamanho das metástases pulmonares.

Análise estatística dos dados para o número de metástases pulmonares foi feita usando-se os testes não paramétricos de Mann-Whitney para dados não equivalentes.

Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 1 aqui abaixo. TABELA 1 Metástases pulmonares no 17° dia após inoculação de tumor M109 em ca-mundongos BALB/c após tratamento com taxol e taxoi/lipossoma de ST983 M = médio (1-2 mm de diâmetro) S = pequeno (< 1 mm de diâmetro) Testes de citotoxicidade in vitro Os ensaios de toxicidade foram feitos sobre céluJas HeLa e M109 em lâminas com 96 cavidades. No dia após a colocação nas lâminas, as células foram tratadas com as moléculas que estão sendo testadas durante as próximas 48 horas. As células foram, então, lavadas com PBS e deixadas em condições normais de desenvolvimento durante 48 horas. Após remoção do meio de desenvolvimento, as células foram incubadas sobre gelo com 16% de TCA, lavadas 3 vezes em H20, tratadas durante 30 minutos com sulfo-rodamina B (SRB) em ácido acético a 1%, lavadas 3 vezes em ácido acético a 1% apenas, incubadas durante 20 minutos em TRIS a 10 mM, pH de 10,5 e, por fim, as leituras foram tomadas a 540 nm.

Testes de citotoxicidade com CPT 83 Testes de citotoxicidade in vitro com o CPT 83 foram conduzidos de forma a avaliar a citotoxicidade do agente anticâncer complexado com o lipossoma, como uma indicação preliminar de atividade eficiente.

Para avaliar a capacidade do lipossoma de transportar o CPT 83 in vitro em células M109, o teste com sulfo-rodamina B descrito acima foi usado.

Além disso, a citotoxicidade do CPT 83 dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO) também foi avaliada quando comparado àquela da mesma molécula complexada com o lipossoma de ST 983. O complexo de lipossoma-CPT 83 foi usado nos ensaios de citotoxicidade nas concentrações indicadas nas Tabelas 2.1, 2.2 e 3.3 aqui a- baixo em ambas as configurações SUV e MLV. A proporção molar de lipos-soma:CPT 83 usada era de 40:1.

Os valores médios de citotoxicidade dos complexos de ST 983-CPT 83 nas configurações SUV e MLV fornecidas nas Tabelas 2.1,2.2 e 2.3 aqui abaixo indicam que o lipossoma de ST 983 é capaz de transportar CPT 83 da mesma forma que o DMSO, apresentando níveis de citotoxicidade da mesma ordem de magnitude. TABELA 2.1 Citotoxicidade (SRB) do ST 983-CPT 83 Concentrações em uM

Controle 13 0J3. 0.013 00013 0,911 0,294 0,705 0,908 0,911 0,745 0,198 0,525 0,821 0,83 0,884 0,204 0,801 0,906 0,91 0,833 0,25 0,748 0,856 0,853 0,854 0,254 0,778 0,867 0,873 0,793 0,231 0,739 0,802 0,803 0,792 0,193 0,602 0,827 0,829 0,901 0,248 0,69 0,904 0,89 Média 0,839125 0,352444 0,635333 0,767111 0,7667 s.d. 0,060645 0,034513 0,092925 0,042054 0,040149 Os valores fornecidos na tabela se referem às leituras de densidade óptica a 540 nm. TABELA 2.2 Citotoxicidade (SRB) do MLV de ST 983-CPT 83 Concentrações em üM

Controle 1,3 0,13 0,013 00013 0,895 0,038 0,04 0,095 0,088 0,82 0,038 0,046 0,109 0,124 0,896 0,041 0,049 0,128 0,127 0,847 0,041 0,042 0,105 0,115 continuação Controle 13 0J3 0.013 00013 0,863 0,041 0,053 0,111 0,107 0,794 0,043 0,041 0,073 0,095 0,829 0,039 0,044 0,08 0,085 0,893 0,041 0,044 0,064 0,065 Média 0,854625 0,04025 0,044875 0,095625 0,10075 s.d. 0,038682 0,001753 0,004357 0,021738 0,021359 Os valores fornecidos na tabela se referem às leituras de densidade óptica a 540 nm. TABELA 2.3 Citotoxicidade (SRB) do DMSO-CPT 83 Concentrações em uM

Controle 13 13 013 0.013 00013 0,898 0,281 0,33 0,406 0,8 0,809 0,774 0,267 0,302 0,407 0,804 0,816 0,857 0,3 0,285 0,57 0,863 0,886 0,787 0,286 0,287 0,383 0,836 0,841 0,808 0,285 0,318 0,474 0,851 0,863 0,745 0,288 0,317 0,467 0,79 0,795 0,775 0,312 0,328 0,429 0,806 0,831 0,864 0,318 0,305 0,421 0,81 0,878 Média 0,8135 0,292125 0,309 0,444625 0,82 0,839874 s.d. 0,053519 0,016848 0,017205 0,059269 0,026506 0,033237 Os valores fornecidos na tabela se referem às leituras de densidade óptica a 540 nm.

Atividade biológica do complexo de lipossoma de ST 983-CPT 184 A atividade biológica dos lipossomas do exemplo 18 (abaixo denominado lipossoma A) e do exemplo 20 (abaixo denominado lipossoma B) foi testada.

Toxicidade em camundongos saudáveis Os lipossomas A e B foram fornecidos oral, intravenosamente, em comparação ao CPT 184 livre, na dose de 1,2 mg/kg de acordo com o esquema q4dx4. Os dois lipossomas não tiveram efeitos significativos sobre o peso corporal, pulmões, fígado e rins. O lipossoma B intravenosamente e o lipossoma A oralmente fornecidos afetaram o peso do timo similarmente ao CPT 184 livre. O lipossoma A intravenosamente tinha apenas um efeito mínimo. Parâmetros hematológicos não mostraram variações significativas a-pós 24 horas com ambos os lipossomas. O lipossoma A intravenosamente fornecido de acordo com o esquema qd5 mostrou uma toxicidade comparável ao CPT 184 livre.

Trofismo pulmonar dos lipossomas Os lipossomas A e B mostraram acúmulo predominante a nível pulmonar. Os lipossomas foram fornecidos i.v. a 1,2 mg/kg. O CPT 184 livre foi fornecido oralmente a 1,2 mg/kg em DMSO. Os animais, camundongos saudáveis, foram sacrificados 24 horas após a última administração, Os pulmões foram excisados dos corpos e congelados em nitrogênio líqüido. Uma vez descongelados, os órgãos foram empoçados e homogeneizados em ácido acético a 0,1 %/acetonitrila a 1:5. Os homogenatos foram divididos em três alíquotas, duas das quais foram adicionadas com CPT 184 para cálculo da recuperação. As três amostras foram centrifugadas a 16.000 g durante 5 minutos. Os flutuantes foram coletados e extraídos com diclorometa-no. A fase orgânica foi seca com um speedvac e o resíduo foi redissolvido em acetonitrila de forma a se obter a quantidade correspondente a um animal em 50 pL para carga em HPLC. HPLC foi realizado em um Waters Symmetry C18 de 3,5 pm (4,6 x 7,5 mm). Um fluorímetro da Merck era o detector a uma excitação de 370 nm e emissão a 510 nm. O eluente era á-gua/acetonitrila a 60:40, isocrático. O volume de amostra era de 50 pL. A recuperação de CPT 184 foi de cerca de 70%. Ambos os lipossomas A e B proporcionaram um nível de acúmulo, com relação ao CPT 184, maior do que o CPT 184 livre em DMSO, conforme mostrado na Figura 3. DISTRIBUIÇÃO GENÉTICA Preparação de complexo de lipossoma-DNA

Lipossoma e DNA de plasmídeo foram adequadamente diluídos, separadamente, em PBS. O DNA foi, então, adicionado ao lipossoma e o complexo de lipossoma-DNA foi deixado descansar durante aproximadamente 30 minutos a 4 °C a fim de facilitar a formação de uma interação estável de lipossoma-DNA.

Nos experimentos in vitro, 1,2-dioIeoilóxi-3-trimetil-amônio pro-pano (DOTAP) foi usado como um lipídio catiônico de referência; 2,5 μ9 de DNA de plasmídeo foram usados por 2 x 105 células HeLa e a concentração de lipossoma era de 9 μΜ.

Nos experimentos in vivo, DOTAP e [2,3-(dioleoil)propil]trimeti-lamônio (DOTMA) foram usados como lipídios catiônicos de referência.

As proporções molares definidas nos resultados se referem a concentrações em nmoles dos respectivos lipídios catiônicos por mg de DNA.

Nos experimentos de transfecção in vivo, 25 μς de DNA de plasmídeo por animal foram usados. O plasmídeo pCMVIuc usado nesses experimentos continha o cDNA do gene da luciferase sob o controle transcripcional do promotor do citomegalovírus (CMV).

Determinação quantitativa da atividade de luciferase A atividade da proteína luciferase em células e tecidos foi determinada usando-se o kit da Boehringer Mannheim (cat. no. 1669 893).

As células foram lavadas 3 vezes em PBS e, então, removidas da lâmina com uma raspadeira em tampão de lise (fosfato de potássio a 100 mM, pH de 7,8, ditiotreitol a 1 mM - DTT) e submetidas a três ciclos consecutivos de congelamento e descongelamento. Após centrifugação em tubos de Eppendorf de 1,5 mL, o flutuante foi usado para o teste de luminescência não mais do que 5 horas após extração das proteínas. As medições de e-missão de luminescência foram feitas usando-se um luminômetro a 562 nm. Após um primeiro descongelamento em N2 líquido, seguido por trituração fina a fim de se obter um pó, os tecidos foram resuspensos em tampão de lise e incubados durante 10-15 minutos sobre gelo.

As amostras foram, então, centrifugadas em tubos de Eppendorf de 2 ml e o flutuante foi testado com relação à atividade de luciferase.

Análise por coloração DNA celular foi extraído de acordo com o procedimento de Use alcalina descrito por Sambrook, Fritsch e Maniatis em Molecular Cloning, 1989. 5 μς de DNA extraído das células foram pré-absorvidos sobre filtros de náilon (Boehringer) usando-se o kit de coloração da Biorad. Os filtros foram, então, pré-hibridizados durante 4 horas a 65 °C com uma solução contendo 0,5 M de pirofosfato de sódio {NaPi), EDTA a 1 mM, SDS a 7%. A prova rotulada com 32P(alfa) foi preparada usando-se DNA de plasmídeo pCMVIuc como um modelo e o kit aleatório da Amersham. O filtro foi hibridi-zado no mesmo tampão de pré-hibridização durante 12 horas a 42 °C usando-se 1 x 106 CPM/ml. O filtro foi, então, submetido a 3 lavagens de 10 minutos a 65 °C em um tampão contendo NaPi a 40 mM, SDS a 1%. A análise auto-radiográfica foi realizada com o auxílio de um formador de imagem fósforo o qual usa telas de fósforo ativadas por beta-radiação que são lidas e quantificadas por meio de um sistema fotomuitiplicador junto com um programa de análise de imagens. A densitometria realizada sobre a mancha foi feita usando-se um programa de análise de imagens IP-LabGel.

Testes de transfeccão de DNA de plasmídeo Uma variedade de testes de transfecção de DNA de plasmídeo foi realizada in vitro e in vivo. DOTAP e DOTMA foram usados como lipídios catiônicos de referência, a capacidade de transfecção dos quais foi amplamente caracterizada e descrita por Abkenet e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90, 6518. Nos experimentos in vivo, várias proporções molares diferentes de lipídios catiônicos para DNA de plasmídeo foram analisadas para fins de determinação da atividade dos lipídios catiônicos e as respectivas concentrações mais eficientes para transferência genética. A capacidade de transfecção dos vários lipossomas foi avaliada in vitro e in vivo usando-se o transportador de gene da luciferase contido no plasmídeo pCMVIuc, a atividade do qual, em termos de unidades relativas de luminescência (RLU) (descrita anteriormente) feita para facilidade de quantificação.

Como uma alternativa, a eficiência de transfecção de uma variedade de lipossomas catiônicos foi avaliada por meio de análise densitométri-ca (formador de imagens de fósforo) de amostras de DNA extraída de células transfectadas pré-absorvidas sobre filtros de nitrocelulose (coloração) e hibridizadas com marcadores de DNA de plasmídeo 32P-rotulados, conforme previamente descrito.

Testes de transfecção in vivo Dependência da eficácia de transfecção in vivo sobre a proporção molar de lipossoma de ST 983:DNA

Nesse experimento, a dependência da eficácia de transfecção no fígado, pulmão e coração sobre a proporção molar de lipossoma de ST 983:DNA de plasmídeo foi avaliada. As seguintes proporções molares de lipossoma por pg de DNA foram testadas: 12:1,24:1,36:1 e 48:1.

Grupos de 6 camundongos Balb/c pesando aproximadamente 20 g foram tratados intravenosamente com as quantidades acima mencionadas de complexo de lipossoma-DNA em volumes de 200 μΙ de PBS e foram sacrificados 24 horas após a administração do complexo. A atividade de luciferase extraída dos tecidos do pulmão, coração e fígado revelou uma distribuição predominantemente pulmonar de luciferase em todas as proporções molares analisadas. Na verdade, aproximadamente 99% da luciferase total extraída dos três tecidos estavam localizados nos pulmões. A proporção molar de lipossoma:DNA de 12:1 provou ser a melhor. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 3 aqui abaixo. TABELA 3 Eficácia de transfeccão in vivo do ST 983 como uma função da proporção molar de ST 983:DNA fua de DNA) Lipossoma RLU média/mg de proteína ± s.d. Proporção molar Fígado_________Pulmão________Coração de ST 983:DNA ST 983 2589±140 8818442±449529 28875±2593 12:1 1310±385 2257856±280480 7091+249 24:1 1035+347 301107+21503 8351±477 36:1 1571+156 112747±5655 5251+489 48:1 Controle 396±55 458±45 755±55 DOTMA 1352±226 3828742±161332 3363±123 12:1 Dependência da eficácia de transfeccão in vivo sobre as diferenças entre os preparados lipossômicos de SRT 983 Os valores da atividade de luciferase, como unidades relativas de luminescência (RLU), extraída dos pulmões de camundongos Balb/c tratados intravenosamente com diferentes preparados lipossômicos de ST 983 em uma proporção molar de lipossoma:DNA de 12:1, são relatados na Tabela 4.

Os dados obtidos, além de demonstrarem que o lipossoma de ST 983 é capaz de transportar DNA de plasmídeo in vivo, com classificações de eficácia maiores do que e/ou comparáveis àquelas do DOTMA, também mostram um grau de variabilidade entre os diferentes preparados de ST 983. Isso pode ser devido a uma variedade de características físico-químicas tais como o tamanho das vesículas lipossômicas ou as proporções relativas das vesículas em relação à estrutura unilamelar (SUV) ou multilamelar dos diferentes preparados de ST 983. Na verdade, os parâmetros físico-químicos listados acima foram amplamente descritos como determinantes na obtenção da eficácia ótima de transfecção in vitro e in vivo por R.l. Mahato e outros, Human Gene Therapy 9,1998: 2083. TABELA 4 Eficácia de transfeccão in vivo do ST 983 (diferentes preparados) Lipossoma RLU média/mg de proteína ± s.d. Proporção molar Pulmão deST983:DNA ST 3118235±184726 12:1 ST 983/#73 7285835+827067 12:1 ST 983/#4 1022117±60402 12:1 Controle 1523±98 DOTMA 3410125±189520 12:1 Dependência da eficácia de transfeccão in vivo sobre o tempo de pré-incubacão do complexo de lipossoma de ST 983-DNA A Tabela 5 apresenta as unidades relativas de luminescência extraídas do fígado, pulmão e coração de camundongos tratados intraveno-samente com o lipossoma de ST 983 pré-incubado com DNA de plasmídeo durante 30 minutos ou durante 3 horas antes de administração. Os animais tratados com ST 983 pré-incubado durante 3 horas com DNA mostraram um aumento de aproximadamente 5 vezes na atividade de luciferase no pulmão e no coração, quando comparado aqueles tratados com o mesmo lipossoma pré-incubado durante 30 minutos. Isso sugere que a formação de um complexo estável de lipossoma-DNA é um fenômeno dependente do tempo e exerce um papel crítico como um determinante da eficácia de transfecção in vivo. TABELA 5 Eficácia de transfeccão in vivo do ST 983 como uma função do tempo de pré-incubacão de lipossoma/DNA

Lipossoma Tempo RLU média/mg de proteína ± s.d. Proporção molar Fígado______Pulmão Coração de ST 983:DNA ST 983 30 min 3526+260 874882±65917 8118±263 12:1 ST983 3 h 2497±682 4225656±211731 37100±1853 12:1 Transfecção de DNA de plasmídeo em células HeLa com lipossoma de ST 772 As Figuras 1 e 2 mostram a eficácia de transfecção de DNA de plasmídeo do lipossoma de ST 772 em células HeLa. Para essa finalidade, análise densitométrica do DNA extraído das células transfectadas com ST 272 e com DOTAP como o lipídio catiônico de referência foi realizada. Os resultados da análise por coloração revela quantidades de DNA de plasmídeo da mesma ordem de magnitude conforme obtida com o DOTAP.

Claims (4)

1. Uso de undecil éster de cloreto de palmitoil L-carnitina ou um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um li-possoma.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sal de palmitoil L-carnitina é selecionado do grupo consistindo em cloreto; brometo; iodeto; aspartato; ácido aspartato; citrato; ácido citrato; tar-tarato; ácido tartarato; fosfato; ácido fosfato; fumarato; ácido fumarato; glice-rofosfato; fosfato de glicose; lactato; maleato; ácido maleato; mucato; orota-to; oxalato; ácido oxalato; sulfato; ácido sulfato; tricloroacetato; trifluoroaceta-to; metano sulfonato; pamoato e ácido pamoato.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente lipídios auxiliares.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido lipídio auxiliar é selecionado do grupo consistindo em co-lesterol, 1 -palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina e dioleil fosfatidil colina.