PT2108362E - Preparação lipossomal catiónica que compreende um taxano - Google Patents

Description

ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Preparação lipossomai catiónica que compreende um taxano" 0 presente invento refere-se a uma preparação lipossomal catiónica contendo um composto activo lipófilo, que é um taxano, possuindo elevada estabilidade que é adequada para aplicações terapêuticas.

Os lipossomas são pequenas vesículas esféricas compostas principalmente por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e outros componentes lipófilos. Os componentes lipídicos formam normalmente uma dupla camada, na qual a extremidade polar do anfifílico se encontra em contacto com a solução circundante, a qual é tipicamente uma solução aquosa. A extremidade hidrófoba não polar do anfifílico está em contacto com outra extremidade hidrófoba não polar de outro anfifílico formando desse modo uma dupla camada lipídica. Dependendo do tipo de anfifílicos utilizados, a membrana dos lipossomas pode ser classificada de acordo com a sua carga exterior como membranas líquidas neutras, carregadas negativamente ou positivamente. Têm sido desenvolvidos lipossomas para muitas aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Entre outras, são utilizados para administrar moléculas que não sejam suficientemente solúveis em água. Estas moléculas lipófilas são incorporadas na dupla camada lipossomal ou foram ligadas quimicamente à dupla camada lipídica. 0 paclitaxel, o representante mais proeminente da família dos taxanos, é um desses compostos altamente lipófilos. O paclitaxel é conhecido como Taxol, que é um fármaco formulado em óleo de rícino polietoxilado (Cremophor®EL) e etanol absoluto. Adicionalmente, o paclitaxel tem sido formulado em lipossomas.

Antes do Taxol® ser aplicado em humanos, o suporte farmacêutico com o composto terapêutico é diluido numa solução aquosa adequada. Contudo, tem sido observado que o suporte provoca graves reacções anafiláticas com risco de vida em animais e humanos, e é fisicamente incompatível com 2 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ alguns sistemas de infusão intravenosos. Deste modo, tem sido levadas a cabo várias tentativas para eliminar o Cremophor®EL reformulando o fármaco num veículo mais bem tolerado. Os lipossomas foram clinicamente caracterizados durante as últimas décadas e são conhecidos como um sistema de administração seguro e bem tolerado. Os lipossomas podem consistir em lípidos de ocorrência natural que possuem um grupo principal polar que é neutro ou está negativamente carregado. Os lípidos diacilglicéridos positivamente carregados não ocorrem na natureza.

Sharma et al. [1] fabricaram paclitaxel-lipossomas neutros de acordo com o denominado processo de película. Os lípidos, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilglicerol (PG) foram dissolvidos em conjunto com paclitaxel em clorofórmio. O clorofórmio foi evaporado a 40°C e a película paclitaxel-lípido foi dissolvida em tert-butanol. A solução foi aliquotada e liofilizada. 0 pó foi hidratado com tampão (NaCl/Tes/EDTA: 140 mM/10 mM/0,1 mM) dando origem a uma suspensão de lipossomas em bruto, a qual foi novamente processada num banho de ultra-sons a 20°C. A estabilidade química do fármaco foi demonstrada nestas formulações durante mais de 2 meses a 4°C e à temperatura ambiente. O pH é especificado na gama fisiológica de pH 7-7,5.

Na patente US 6, 090,955 Rezka et al. descreveram o fabrico de lipossomas de paclitaxel neutros a partir de fosfatidilcolina do ovo de acordo com o processo da película. A suspensão de lipossomas em bruto, pH 7,2-7,4, consistindo em vesículas em múltiplas camadas (MLV) foi homogeneizada com um homogeneizador de alta pressão. Para armazenagem mais prolongada é sugerida a formação de gel ou liofilização. Contudo, não foram apresentados dados referentes à estabilidade, por exemplo a estabilidade química do paclitaxel não foi abordada.

Recentemente, foi reportado que os lipossomas catiónicos representam não só uma outra variedade de sistema de suporte lipossomal mas também apresentam um efeito direccionado específico para as áreas neo-angiogénicas nos vasos sanguíneos [2]. Os lipossomas catiónicos têm sido frequentemente utilizados para administração de genes, mas sabe-se pouco acerca das suas caracteristicas de formulação 3 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ com outros compostos quando comparados com os lipossomas neutros ou aniónicos.

Campbell et al. [3] formularam lipossomas de paclitaxel com teor variado de lípido catiónico estabelecendo maior estabilidade física dos lipossomas contendo paclitaxel. Os lipossomas foram fabricados de acordo com o processo da película. A película foi hidratada com água, a qual foi aquecida a uma temperatura de 5-10°C acima da temperatura de transição de fase do respectivo fosfolípido que foi utilizado. A suspensão de lipossomas foi posteriormente tratada num banho de ultra-sons. O diâmetro lipossomal resultante encontrava-se na gama de 500-800 nm. Foi observado que a estabilidade física destes lipossomas era para um máximo de 3 dias. As condições tais como a temperatura e pH nas quais estes lipossomas foram mantidos não foram divulgados. Contudo, para uma formulação farmacêutica, uma estabilidade de alguns dias não é suficiente se for aplicada para fins clínicos.

Outra classe de moléculas altamente lipófilas são as epotilonas, especificamente epotilona A e B. Para ambos os compostos, tem sido descrita a falta de estabilidade a baixo pH e é atribuída a reacções de abertura de anel catalisadas por ácido do fragmento epóxido. Isto conduz a produtos de reacção que tinham perdido as suas excepcionais . [9] A aparente instabilidade da epotilona A e B não permite o desenvolvimento de formulações orais de epotilona A ou B, uma vez que o pH do estômago é cerca de 1-3 e rapidamente degradaria a epotilona A ou B citostática [10]. A semi-vida em plasma especialmente da epitilona B tem sido reportada como sendo extremamente baixa devido à sua degradação metabólica através de esterases. [11,12]. Isto é também verdade para outras epotilonas; em plasma de murino, a semi-vida aproximada in vitro de desoxi-epotilona B (epotilona D) foi determinada como sendo de 20 min, em plasma humano a semi-vida foi de aproximadamente 3 h [13]. Isto não permite uma exposição contínua de grau elevado do tumor ao fármaco e a insatisfatória actividade anti-tumoral das epotilonas A e B tem sido atribuída à sua fraca estabilidade metabólica [12]. 4 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Foram já descritas composições lipossomais de epotilonas A ou B. [WO 01/10412 Al] . Aqui, é referida a instabilidade geral destas epotilonas e isto é apresentado como um racional para a carga lipossomal. Contudo, não são apresentados dados que suportem que a estabilidade das epotilonas lipossomais é melhorada em relação às das epotilonas não lipossomais. A maior parte dos passos de preparação para o fabrico de epotilonas são realizados em ambiente aquoso (formação das vesículas, homogeneização e/ou remoção de componentes indesejados, reconstituição de formulações liofilizadas). Durante estes passos os componentes lipossomais bem como os ingredientes activos que são incorporados na membrana lipossomal ficam propensos à degradação. A estabilidade fisico-quimica de lipossomas contendo fármacos é um factor limitante no desenvolvimento de um produto farmacêutico com uma validade suficiente para armazenagem, distribuição e aplicação em humanos após fabrico.

Uma abordagem para aumentar a estabilidade físico-química de lipossomas contendo fármacos é a de remover a água de modo quantitativo da suspensão lipossomal. Os processos que têm sido aplicados com sucesso para remover água dos lipossomas são liofilização, secagem por pulverização ou evaporação. Tipicamente, uma suspensão lipossomal é fabricada dispersando os compostos anfifílicos num ambiente aquoso. Imediatamente após o fabrico do material aquoso a granel, a suspensão é desidratada por qualquer processo adequado e armazenada até à aplicação em estado seco. Durante o processo de secagem pode ser utilizado um agente estabilizante de modo a manter a estrutura lipossomal. A água que está normalmente associada com a superfície lipossomal polar é substituída pelo agente estabilizante durante a secagem para manter as características físico-químicas lipossomais. O fármaco permanece incorporado ou fortemente associado na/com a membrana lipossomal. A libertação de compostos é bem controlada. Num caso óptimo, o tamanho e distribuição de tamanho lipossomal não é afectada pelo processo e os compostos e lípidos incorporados permanecem quimicamente 5 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ intactos. No entanto, a desidratação de uma preparação lipossomal catiónica compreendendo um composto activo lipófilo não tinha ainda sido divulgada.

Deste modo, o problema subjacente do presente invento era o de proporcionar uma preparação lipossomal catiónica compreendendo um composto activo lipófilo com estabilidade fisico-quimica melhorada e aplicabilidade farmacêutica. A solução foi proporcionar uma preparação lipossomal catiónica que compreende pelo menos um anfifilico seleccionado a partir de lipidos catiónicos numa quantidade de pelo menos 30% molar, opcionalmente pelo menos um outro anfifilico numa quantidade até 69,9% molar, um composto activo lipófilo que é um taxano numa quantidade de pelo menos 2% molar e um agente estabilizante numa quantidade de cerca de 0,1% (m/v) a cerca de 20% (m/v) , caracterizada por a referida preparação lipossomal ser física e quimicamente estável numa solução aquosa durante pelo menos 12 horas a 2 a 8°C, e pelo menos durante 4 horas a temperatura ambiente, e caracterizada por possuir um pH entre 3 e 6,5.

No presente pedido, é divulgado um processo para produzir uma preparação lipossomal catiónica compreendendo pelo menos um anfifilico seleccionado a partir de lipidos catiónicos numa quantidade de pelo menos 30% molar, opcionalmente pelo menos um outro anfifilico numa quantidade até 69,9% molar, um composto activo lipófilo numa quantidade de pelo menos cerca de 0,1% molar e um agente estabilizante numa quantidade de cerca de 0,1% (m/v) até cerca de 20% (m/v), compreendendo os passos de a) proporcionar i. uma solução orgânica compreendendo um solvente orgânico, o referido composto activo e o referido lípido catiónico, e opcionalmente o referido anfifilico, ii. uma solução aquosa compreendendo o referido agente estabilizante, b) preparar uma preparação lipossomal catiónica a partir da referida solução a)i. e a)ii., em que a referida preparação compreende lipossomas catiónicos num meio aquoso, 6 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ c) opcionalmente homogeneizar a referida preparaçao pelo menos uma vez, e/ou d) opcionalmente efectuar uma filtração estéril da referida preparação, e) desidratar a referida preparação, e f) opcionalmente reconstituir os referidos lipossomas catiónicos do passo e) numa solução aquosa e em que opcionalmente antes do passo c) e/ou d) é incluído um passo de ultra-filtração.

Os solventes orgânicos preferidos a serem utilizados no passo a)i. são, apesar de não estarem limitados a estes exemplos, seleccionados a partir do seguinte grupo: metanol, etanol, propanol, isopropanol, etilenoglicol, tetra-hidrofurano, clorofórmio, tert-butanol ou éter dietílico ou uma mistura destes solventes. A preparação lipossomal de acordo com o invento compreende um taxano, preferivelmente paclitaxel ou docetaxel ou um seu derivado lipófilo numa quantidade de cerca de 2 a cerca de 20% molar, preferivelmente numa quantidade de cerca de 2 a cerca de 5% molar de paclitaxel, e preferivelmente numa quantidade de pelo menos 11% molar para o docetaxel ou succinil-paclitaxel. Lípidos catiónicos úteis no que diz respeito ao presente invento incluem, mas não estão limitados a: DDAB, dimetildioctadecilbrometo de amónio; metilsulfato de N-[l-(2,3-dioloíloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio; 1,2-diaciloxi-3-trimetilamóniopropanos, (incluindo mas não estando limitados a, dioleoíl (DOTAP), dilauroíloxi, dimiristoíloxi, dipalmitoíloxi, e distearoíloxi); N-[l-(2,3-dioleoíloxi)propil]-N,N-dimetilamina; 1,2-diacil-3-dimetil-amóniopropanos, (incluindo mas não estando limitados a, dioleoíl (DODAP), dilauroíl, dimiristoíl, dipalmitoíl e distearoíl); DOTMA, cloreto de N-[1-[2,3-bis(oleiloxi)]-propil]-N,N,N-trimetilamónio, (incluindo mas não estando 7 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ limitado a, dioleil (DOTMA), dilauril, dimiristil, dipalmitil e distearil); DOGS, dioctadecilamido-glicilespermina; DC-colesterol, 3β-[N-(Ν',N'-dimetilaminoetano)carbamoíl]- colesterol; DOSPA, trifluoroacetato de 2,3-dioleoíloxi-N-(2-(espermina-carboxamido)-etil)-N,N-dimetil-l-propanamínio; 1.2- diacil-sn-glicero-3-etilfosfocolinas (incluindo mas não estando limitado a dioleoíl (DOEPC), dilauroíl, dimiristoíl, dipalmitoíl, distearoíl e palmitoíl-oleoíl); β-alanil-colesterol; CTAB, brometo de cetiltrimetilamónio; diC14-amidina, N-t-butil-N'-tetradecil-3-tetradecilamino- propionamidina; 14Dea2; TMAG, cloreto de N-(alfa-trimetilamonioacetilo)didodecil-D-glutamato; cloreto de 0,0'-ditetradecanoíl-N-(trimetilamonioacetil)-dietanolamina; DOSPER, 1,3-dioleoíloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida; iodeto de Ν,Ν,Ν',N'-tetrametil-N,N'-bis(2-hidroxiletil)-2,3-dioleoíloxi-1,4-butano-diamónio; cloreto de 1-[2-(aciloxi)-etil]2-alquil(alcenil)-3-(2-hidroxietil)-imidazolínio, derivados tal como descrito por Solodin et al. (1995) Biochem. 43:13537-13544, tais como DOTIM, cloreto de l—[2— (9(Z)-octadecenoíloxi)etil]-2-(8(Z)-heptadecenil-3-(2-hidroxietil)imidazolínio; DPTIM, cloreto de 1—[2 — (hexadecanoíloxi)etil]-2-pentadecil-3-(2-hidroxietil)-imidazolínio; compostos derivados de 2,3-dialquiloxi-propilamónio quaternário, contêm um fragmento hidroxialquilo na amina quaternária, tal como descrito por exemplo, por Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:2550-2561, tais como: DORI, brometo de 1,2-dioleoí1-3-dimetil-hidroxi- etilamónio; DORIE, brometo de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamónio; DORIE-HP, brometo de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipropil-amónio; DORIE-HB, brometo de 1.2- dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxibutilamónio; DORIE-HPe, brometo de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipentil-amónio; DMRIE, brometo de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxil-etilamónio; DPRIE, brometo de 1,2-dipalmitiloxi-propil-3-dimetil-hidroxietilamónio; DSRIE, brometo de 1.2- disteriloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamónio.

Numa concretização preferida o lípido catiónico é seleccionado a partir de um composto de amónio quaternário tal como N-[1-(2,3-diaciloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio, que pode estar presente sob a forma de sal com um contra-ião farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um cloreto, 8 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ brometo, fluoreto, iodeto, nitrato, sulfato, metilsulfato, fosfato, acetato, benzoato, citrato, glutamato ou lactato. Numa outra concretização preferida o lípido catiónico é DOTAP. O anfifílico opcional pode ser seleccionado a partir de um anfifílico com uma carga neutra ou aniónica do seu fragmento hidrófilo (grupo principal). Um anfifílico adequado pode ser seleccionado a partir de esteróis ou lípidos tais como fosfolípidos, lisolípidos, lisofosfolípidos, espingolípidos ou lípidos pegilados, ou qualquer combinação destes. Um anfifílico preferido é um lípido neutro, esterol ou lípido pegilado tal como colesterol, lanoesterol, fitosterol, 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, incluindo mas não estando limitado a dioleílo (DOPE), 1,2-diacil-glicero-3-fosfocolinas, esfingomielina. O anfifílico opcional mais preferido é diacilfosfatidilcolina. Os lípidos pegilados referem-se aos lípidos que possuem um ou mais resíduos polietilenoglicol.

Uma solução aquosa adequada do presente invento compreende água, opcionalmente uma substância tampão e um agente estabilizante e possui um valor de pH entre 3 e 6,5, preferivelmente entre 4 e 6,5. Substâncias tampão adequadas são seleccionadas, por exemplo, a partir de ácido acético, ácido cítrico, Tris, Bis, ácido fosfático, ácido láctico e similares. 0 agente estabilizante é preferivelmente seleccionado a partir de um açúcar ou um álcool ou uma combinação destes tais como trealose, maltose, sacarose, glicose, lactose, dextrano, manitol ou sorbitol e utilizado na gama de até 20% (m/v). O agente estabilizante é utilizado na gama de cerca de 0,1 (m/v) a cerca de 20% (m/v) e mais preferivelmente na gama de cerca de 5 (m/v) a cerca de 15% (m/v) em relação ao volume total da dispersão lipossomal adicional no passo b). A preparação de uma dispersão lipossomal de acordo com o passo b) pode ser realizada de acordo com vários processos bem conhecidos na arte. Preferivelmente, é realizado o processo de película e o processo de injecção de solvente orgânico. 9 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

De acordo com o processo de película os lípidos catiónicos e opcionalmente anfifílicos e o composto lipófilo são dissolvidos num solvente orgânico ou uma mistura de diferentes solventes orgânicos que são seleccionados a partir de álcoois (tais como etanol ou tert-butanol), solventes halogenados (tais como diclorometano ou clorofórmio) ou outros solventes orgânicos adequados. Após dissolver os referidos compostos num solvente orgânico, o solvente orgânico da mistura ou diferentes solventes orgânicos são evaporados sob vácuo para produzir uma película fina. Em lugar de produzir uma película fina a partir da solução orgânica contendo os lípidos catiónicos, opcionalmente os anfifílicos e o compostos lipófilo podem ser secos por liofilização ou quaisquer outros meios adequados de modo que seja obtida uma mistura fármaco-lípido homogénea. É adicionada uma solução aquosa compreendendo um agente estabilizante para re-hidratar a película de lípido ou a mistura de lípidos seca resultante numa dispersão homogénea de vesículas multi-lamelares (MLVj. A injecção do solvente orgânico é realizada dissolvendo lípidos catiónicos e opcionalmente anfifílicos e o composto lipófilo num solvente volátil miscível com água, tal como um álcool ou um éter, preferivelmente etanol, e injectando esta solução numa solução aquosa compreendendo um agente estabilizante. A denominada fase orgânica compreende lípidos catiónicos e opcionalmente anfifílicos e o composto lipófilo e um solvente orgânico em que a fase orgânica não deveria exceder cerca de 5% (m/v), preferivelmente pelo menos 2,5% (m/v) na mistura líquida final.

Os lipossomas catiónicos do presente invento compreendem pelo menos uma quantidade de cerca de 30% molar de lípidos catiónicos, preferivelmente cerca de 40% molar, mais preferivelmente cerca de 50% molar, ainda mais preferivelmente cerca de 60% molar, cerca de 70% molar, cerca de 80% molar, ou até cerca de 99,9% molar e são caracterizados por possuir um potencial zeta positivo numa solução cerca de 0,05M de KC1 a um pH de cerca de 7,5 à temperatura ambiente.

Na técnica, o ajuste da dimensão dos lipossomas é frequentemente realizado por tratamento com ultra-sons. 10 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Contudo, no processo divulgado, a homogeneização no passo c) é preferivelmente realizada por extrusão, filtração através de filtros de membrana, homogeneização a alta pressão e/ou homogeneização de alta velocidade e a mais preferida por extrusão através de uma membrana com um tamanho de poro de cerca de 200 nm sob pressão. Podem igualmente ser utilizadas membranas com outros tamanhos de poro tais como 50 nm, 100 nm, 150 nm, 400 nm bem conhecidas na arte. A filtração através de filtros de membrana pode ser levada a cabo através de filtração em membranas compostos de PVDF, PES, filtros de nylon mas também podem ser utilizados outros materiais se for definido como adequado. O tamanho de poro das membranas deverá estar na gama de cerca de 200 nm a 450 nm, mas o tamanho de poro não está limitado aos tamanhos mencionados. Diferentes materiais e diferentes tamanhos de poro podem ser combinados, de tal modo que seja obtida uma solução que possa ser processada por filtração de qualidade estéril.

Para uso farmacêutico, constitui um pré-requisito que a formulação lipossomal possa ser esterilizada através de um filtro de qualidade esterilizante após o procedimento de preparação uma vez que se destinam frequentemente a serem utilizados por via parentérica num sujeito com essa necessidade. Os processos para esterilizar lipossomas deverão ser destrutivos em relação aos microrganismos, mas não deverão afectar as caracteristicas fisico-quimicas da formulação lipossomal de modo desfavorável. 0 modo preferido para esterilizar produtos farmacêuticos é a autoclavagem, por exemplo a 134°C durante um mínimo de 5 min ou a 121°C durante um mínimo de 15 min. Sob estas condições severas os lipossomas apresentam frequentemente degradação de teor considerável, por exemplo, sob a forma de aglomeração de lipossomas, mudança de tamanho lipossomal e distribuição de tamanho, hidrólise/oxidação de lípidos, degradação química ou libertação indesejada do composto lipófilo dos lipossomas. Deste modo, a filtração estéril e enchimento asséptico são processos preferidos para obter um produto lipossomal farmacêutico para aplicação parentérica. Tipicamente, a filtração de qualidade esterilizável é realizada uma vez ou repetidamente através de uma membrana com tamanhos de poro na gama de 0,1 a 0,45 pm. Dois a vários filtros com um diâmetro de poro definido podem igualmente ser ligados em série para 11 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ obter uma filtração de qualidade esterilizante. Os materiais normalmente utilizados são derivados de celulose tais como acetato de celulose ou membranas de polivinilo tais como PVDF, PES ou Nylon, mas podem igualmente ser utilizados outros materiais se forem definidos como adequados.

Podem igualmente ser utilizados processos de filtração para remoção de compostos indesejados da preparação lipossomal, tais como reagentes ou solventes utilizados no processo de fabrico, ou composto lipófilo não incorporado lipossomicamente. 0 tamanho de poro do filtro encontra-se preferivelmente entre o diâmetro lipossomal (tipicamente >60 nm) e o composto a ser removido (tipicamente <5 nm). Dependendo da diferença de tamanho podem ser utilizadas a ultra-filtração (1-1000 kDa de corte de peso molecular) ou micro-filtração (0,02-1 pm) . Em vez de filtração convencional foram desenvolvidas técnicas mais convenientes como a diálise ou filtração tangencial.

Uma preparação lipossomal esterilizada pode ser acondicionada de modo asséptico em ampolas apropriadas, por exemplo, frascos de vidro. A altura de enchimento dos frascos de vidro encontra-se preferivelmente na gama de 0,5-10 cm, mais preferido na gama de 1,0-5 cm, sendo o mais preferido na gama de 2,0-3,0 cm. Os frascos de vidro de qualidade farmacêutica podem ter a dimensão de 1 ml a 1000 ml. Uma dispersão lipossomal numa solução aquosa pode igualmente ser acondicionada em recipientes ou sacos de plástico estéreis.

Após o passo d) é realizada a desidratação (passo e)). A formulação é desidratada e reconstituída antes de uso com uma solução aquosa tal como água pura ou uma solução de um agente estabilizante de pH. O processo de desidratação é um passo importante no processo de fabrico de lipossomas catiónicos uma vez que pode influenciar directamente a qualidade da preparação lipossomal seca e ainda da dispersão lipossomal reconstituída. A desidratação pode ser realizada por liofilização, a qual pode ser dividida em três passos diferentes, (i) congelação, (ii) secagem primária, e (iii) secagem secundária que se encontram ligadas por rampas de temperatura/tempo/pressão definidas de modo exacto. 12 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ A congelação de uma dispersão lipossomal é um passo importante. É bem conhecido que a formação de cristais de gelo é fortemente dependente da velocidade de congelação resultando em diferentes tamanhos de poro da dispersão lipossomal congelada. A velocidade de secagem nos passos de secagem seguintes é principalmente influenciada pelo tamanho de poro durante a congelação.

Durante a secagem primária a água é removida sob vácuo da dispersão congelada. A temperatura da prateleira durante a liofilização bem como o vácuo aplicado controla fortemente o processo de secagem. A selecção de uma temperatura e pressão inadequadas pode resultar em vários problemas durante a liofilização como descongelação da dispersão congelada ou transição de fase dos lípidos.

Do mesmo modo durante a secagem secundária pode ocorrer a fusão do produto. 0 tempo de secagem primária bem como a temperatura e pressão da secagem secundária pode afectar fortemente a qualidade da preparação lipossomal se os parâmetros não se encontram em gamas adequadas. A qualidade da preparação lipossomal pode ser influenciada por o composto incorporado não possuir estabilidade física ou química ou devido a agregação ou formação de cristais. A desidratação é realizada por liofilização. A liofilização é preferivelmente realizada à pressão atmosférica e a suspensão lipossomal é congelada a uma temperatura de cerca de -20 a cerca de -60 °C, mais preferivelmente a uma temperatura de cerca de -30°C a cerca de -50°C e a muito preferivelmente a uma temperatura de cerca de -35°C a cerca de -45°C. O tempo é ajustado de modo a assegurar a completa congelação da dispersão lipossomal e é preferivelmente cerca de 3 a cerca de 10 horas, dependendo do tamanho, altura de enchimento, e tipo de recipiente de vidro, em que a dispersão lipossomal é colocada. A congelação e o passo de secagem primária encontram-se ligados por uma primeira rampa de temperatura. O incremento da temperatura é determinado pela diferença de temperatura durante a congelação e secagem primária. O tempo da rampa de temperatura encontra-se preferivelmente na gama de cerca de 13 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 0,1 a cerca de 24 horas, mais preferivelmente entre cerca de 3 a cerca de 5 horas. A secagem primária pode ser realizada a uma temperatura constante ou pode ser aplicada uma rampa de temperatura. A secagem com uma temperatura constante é preferivelmente realizada a uma temperatura entre 0°C e cerca de -50°C, mais preferivelmente entre cerca de -10°C a cerca de -30°C. É aplicado um vácuo apropriado de modo a assegurar a secagem do produto. O vácuo deverá estar a cerca de 1 mbar a cerca e 0,001 mbar, sendo o mais preferido de cerca de 0,05 mbar a cerca de 0,15 mbar, dependendo da temperatura da prateleira. Do mesmo modo o diagrama de fases da formulação tem que ser tomado em consideração para a selecção de um vácuo apropriado para o passo de secagem primária. O tempo para a secagem primária deverá ser suficiente para assegurar suficiente secagem da preparação lipossomal e deverá estar na gama de cerca de 10 horas a cerca de 200 horas, dependendo do liofilizador. A secagem primária pode igualmente ser realizada utilizando uma rampa de temperatura. A temperatura é lentamente aumentada durante a secagem primária. O aumento de temperatura encontra-se preferivelmente na gama de cerca de 0,1 a cerca de ΙΟΚ/hora. A temperatura pode ser aumentada no inicio ou no final da secagem primária. Pode ser aplicado uma teste de subida de pressão para determinar o final da secagem primária. A secagem primária e secagem secundária encontram-se ligadas por uma segunda rampa de temperatura. O incremento da temperatura é determinado pela temperatura no final da secagem primária e a temperatura no inicio da secagem secundária. O tempo da rampa de temperatura encontra-se preferivelmente na gama de cerca de 0,5 a cerca de 24 horas, mais preferivelmente entre cerca de 3 a cerca de 5 horas. A secagem secundária pode ser realizada a uma temperatura constante ou com uma rampa de temperatura. A secagem com uma temperatura constante é realizada a uma temperatura entre cerca de 0°C e cerca de 50°C, preferivelmente entre cerca de 10 a cerca de 20°C, sendo mais preferido a cerca de 20°C. É aplicado um vácuo apropriado de modo a assegurar a secagem do produto. O vácuo deverá ser 14 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ cerca de 1 mbar a cerca de 0,001 mbar, preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca 0,001 mbar. O tempo para a secagem secundária deverá ser suficiente para assegurar secagem suficiente da preparação lipossomal e deverá estar na gama de cerca de 1 hora a cerca de 50 horas. Pode ser aplicado um teste de subida de pressão para determinar o final da secagem secundária. O comportamento de reconstituição da preparação lipossomal desidratada tal como a sua re-constituibilidade, libertação do composto activo da membrana lipossomal ou propriedades fisico-quimicas do composto, por exemplo, degradação e similares podem ser dependentes da desidratação mas também do processo de reconstituição. Um comportamento óptimo de reconstituição é exibido quando após a adição de uma solução aquosa se forma uma dispersão lipossomal homogénea. Um protocolo de reconstituição simples é favorável, tal como a adição da solução aquosa seguida de suave agitação. Durante a reconstituição, os lipossomas secos são re-suspensos em água desde que a estabilidade físico-química do composto lipófilo na membrana lipossomal não seja comprometida. O comportamento de reconstituição pode ser examinado, por exemplo, por avaliação visual, microscopia ou medições de bloqueio de luz. O processo divulgado permite a produção de lipossomas catiónicos com um potencial zeta positivo em solução de KC1 cerca de 0,05M a um pH de cerca de 7,5 à temperatura ambiente, preferivelmente com um potencial zeta na gama de cerca de 25 mV a 100 mV em solução de KC1 cerca de 0,05M a um pH de cerca de 7,5 à temperatura ambiente.

Além disso, os valores de PI da preparação lipossomal catiónica inventiva são inferiores a cerca de 0,6, preferivelmente inferiores a cerca de 0,5, mais preferivelmente inferiores a cerca de 0,4 e o mais preferido inferiores a cerca de 0,3.

Os lipossomas catiónicos preparados pelo processo divulgado e os lipossomas catiónicos divulgados no presente invento possuem um diâmetro na gama de cerca de 20 a cerca de 400 nm, preferivelmente cerca de 100 a cerca de 400 nm e mais preferivelmente cerca de 200 a cerca de 300 nm. 15 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ É uma característica do presente invento que o composto activo lipófilo que é um taxano não se distribua de modo substancial na dupla camada lipossomal e não forme agregados de modo substancial numa dispersão lipossomal inventiva num período de pelo menos 0,5 horas, geralmente pelo menos 1 hora, preferivelmente pelo menos cerca de 2 horas, mais preferivelmente pelo menos cerca de 3 horas e o mais preferido pelo menos cerca de 4 horas à temperatura ambiente. Um lipossoma catiónico no qual o composto lipófilo activo não se distribua substancialmente na dupla camada lipossomal, é um em que geralmente menos de cerca de 20%, normalmente menos de cerca de 10%, geralmente menos de 5%, tipicamente menos de cerca de 1% e preferivelmente menos de cerca de 0,5% da quantidade total do composto activo lipófilo incorporada no lipossoma catiónico se distribuiu na dupla camada lipossomal.

Além disso, o presente invento é caracterizado por uma suficiente estabilidade química do composto lipófilo que é um taxano. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste fascículo possuirão o mesmo significado normalmente entendido pelas pessoas competentes na matéria a que o presente invento pertence. "Cerca" no contexto de valores de quantidades refere-se a um desvio médio máximo de +20%, preferivelmente ±10%, com base no valor indicado. Por exemplo, uma quantidade de cerca de 30% molar de lípido catiónico refere-se a 30% molar ±6% molar, e preferivelmente 30% molar ±3% molar de lípido catiónico em relação à molaridade total de lípido/anfifílico. "Anfifílico" refere-se a uma molécula que consiste num fragmento solúvel em água (hidrófilo) e um fragmento solúvel em solvente orgânico (lipófilo). Um anfifílico adequado do presente invento pode ser catiónico, neutro ou aniónico em relação à carga resultante do fragmento hidrófilo (grupo principal). Um anfifílico catiónico possui uma carga resultante positiva, um anfifílico neutro uma carga neutra e um anfifílico aniónico uma carga resultante aniónica. Um anfifílico, tal como utilizado no presente invento, é seleccionado a partir de esteróis tais como colesterol, 16 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ fitosterol ou lanoesterol ou lípidos tais como lisofosfolípidos, esfingolípidos ou lípidos pegilados tais como 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, incluindo mas não estando limitado a dioleílo (DOPE), 1,2-diacil-glicero-3-fosfocolinas, esfingomielina. Os lípidos pegilados referem-se a lípidos que possuem um ou mais resíduos polietilenoglicol. "Solução aquosa" refere-se a qualquer solução compreendendo água e opcionalmente pelo menos um aditivo adequado que se encontra completamente dissolvido em água. Tais aditivos podem ser tampões ou os seus componentes individuais, açúcares, álcoois, agentes estabilizantes. "Lípido catiónico" refere-se a um anfifílico que possui uma carga positiva (ao pH fisiológico) medida por instrumentação utilizada no tempo da medição. Quando estão presentes ácidos gordos ou cadeias alquilo no lípido catiónico, os mesmos podem ter uma dimensão de 12-24 carbonos, contendo até 6 insaturações (ligações duplas), e ligado à estrutura principal por ligações acilo ou éter; pode igualmente existir somente um ácido gordo ou cadeia alquilo ligado à estrutura principal. Quando existe mais de um ácido gordo ou cadeia alquilo ligado à estrutura principal, os ácidos gordos podem ser diferentes (assimétrico). São igualmente possíveis formulações mistas. "Lipossomas catiónicos" podem ser preparados a partir dos próprios lipidos catiónicos, ou em mistura com um outro anfifílico tal como esteróis ou lípidos como colesterol, fosfolípidos, lisolípidos, lisofosfolípidos, esfingolípidos ou lipidos pegilados com uma carga resultante negativa ou neutra, particularmente lípidos neutros tais como colesterol; 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas (incluindo mas não estando limitado a dioleílo (DOPE)); 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolinas; gema de ovo natural ou fosfatidilcolina de soja (PC), e similares; mono- e diacil-fosfoetanolaminas sintéticas. Podem igualmente ser incluídos ácidos gordos assimétricos, tanto sintéticos como naturais, e formulações mistas, para os derivados diacilo supra. "Preparação ou formulação lipossomal catiónica" refere-se quer a uma preparação ou formulação lipossomal desidratada como a uma dispersão lipossomal. 17 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ "Estabilidade química" do composto lipófilo refere-se a uma mudança significativa da sua estrutura química original e é definida como cerca de 5% de mudança na potência em relação ao valor de doseamento inicial (composto original), preferivelmente cerca de 2% ou aparecimento de produtos de degradação específicos que excedam o seu critério de aceitação no que diz respeito aos limites toxicológicos e aspectos de segurança. Para os compostos lipófilos tal como o paclitaxel a estabilidade pode ser definida por HPLC/LC-MS/MS e tipicamente significa menos de 5% de produtos de degradação do referido composto. Compostos de degradação típicos de paclitaxel são por exemplo Bacatina-III, 7-Epi-Taxol etc (Monografia do Paclitaxel, USP26, [Jan-Mar 2003], USPC, Inc.). "Composto incorporado no lipossoma" ou "composto incorporado lipossomicamente" ou "composto lipossomal" é utilizado de modo sinónimo e refere-se a um composto que é integrado na dupla camada lipídica do lipossoma ou associado com a dupla camada lipídica do lipossoma da preparação lipossomal. "Concentração" de x % molar de um composto anfifílico ou lipófilo refere-se à fracção molar deste composto da concentração total de lípidos. As concentrações de compostos solúveis em água são apresentadas em % (m/m) ou % (m/v) do total da preparação. "Composto lipófilo" refere-se a um composto que é caracterizado pela sua interacção favorável com a parte lipófila da membrana lipossomal. Em formulações lipossomais o composto lipófilo é incorporado principalmente (implantado) na membrana ou fortemente associado com a mesma. Não se encontra presente quantidade significativa no meio não lipossomal, tal como seria o caso para os compostos polares solúveis em água. "Dispersão lipossomal" refere-se a lipossomas numa solução aquosa. O termo suspensão lipossomal pode igualmente ser utilizado no mesmo sentido que "dispersão lipossomal" desde que nada seja indicado em contrário. 18 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ "Lipossomas" refere-se a vesículas esféricas microscópicas inclusas em membrana (50-2000 nm de diâmetro) obtidos artificialmente no laboratório ou em fábrica. 0 termo "lipossoma" engloba qualquer compartimento incluso numa dupla camada lipídica. Os lipossomas são igualmente referidos como vesículas lipídicas. De modo a formar um lipossoma as moléculas de lípido compreendem porções não polares (hidrófobas) e porções polares (hidrófilas) alongadas. As porções hidrófoba e hidrófila da molécula encontram-se preferivelmente posicionadas nas duas extremidades de uma estrutura molecular alongada. Quando esses lípidos são dispersos em água foram espontaneamente membranas de dupla camada referidas como lamelas. As lamelas são compostos por duas folhas mono-camada de moléculas lipídicas com as suas superfícies não polares (hidrófobas) viradas uma para a outra e as suas superfícies polares (hidrófilas) viradas para o meio aquoso. As membranas formadas pelos lípidos incluem uma porção da fase aquosa de um modo similar ao de uma membrana celular incluindo o conteúdo de uma célula. Deste modo, a dupla camada de um lipossoma possui similitudes com uma membrana celular sem os componentes proteicos presentes numa membrana celular. Tal como utilizado em ligação com o presente invento, o termo lipossoma inclui lipossomas multi-lamelares, que geralmente possuem um diâmetro na gama de 1 a 10 pm e são compreendidos como qualquer coisa entre duas a centenas de duplas camadas lipídicas concêntricas alternando com camadas de uma fase aquosa, e inclui igualmente vesículas uni-lamelares que são compreendidas de uma única camada lipídica e possuem geralmente um diâmetro na gama de cerca de 20 a cerca de 400 nm, preferivelmente cerca de 100 a cerca de 400 nm, mais preferivelmente cerca de 200 a cerca de 300 nm. As vesículas podem ser produzidas sujeitando lipossomas multi-lamelares a extrusão sob pressão através de membranas com poros de tamanho definido, ou através de homogeneização de alta pressão. Outros processos de homogeneização que são adequados são bem conhecidos na arte. "Estabilidade física" do composto lipófilo incorporado no lipossoma refere-se ao estado físico do composto. A formação de agregados extra-lipossomais (por exemplo, cristais do composto) é a forma mais comum de instabilidade 19 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ física de um composto. No caso dos taxanos, a agregação é visível pela formação de agulhas do taxano. A cristalização de um taxano pode ser medida através de inspecção visual da formulação lipossomal líquida, microscopia óptica ou medição do bloqueio de luz ou dispersão luminosa dinâmica. A estabilidade física da dispersão lipossomal refere-se igualmente a características tais como tamanho lipossomal e distribuição de tamanho ou à existência de partículas maiores que 1 μιη. Especialmente durante o fabrico da formulação lipossomal de um composto lipófilo as características lipossomais deverão ser mantidas. "Estabilidade físico-química" refere-se a uma combinação de estabilidade química e física. "Valor PI" refere-se ao índice de Polidispersibilidade que diz respeito à distribuição do tamanho de partícula numa dispersão lipossomal tal como medido através de técnicas de dispersão de luz dinâmica, por exemplo com um Malvern Metasizer 1000 ou 3000. "Agente estabilizante" refere-se a um agente que estabiliza lipossomas com compostos incorporados durante o fabrico de modo a manter a estabilidade físico-química do composto lipófilo e da formulação lipossomal. Por exemplo para os produtos liofilizados, são utilizados crio-protectores como agentes estabilizantes durante o fabrico. "Taxano" refere-se a uma classe de agentes antineoplásicos que possuem um mecanismo de acção microtubular e possuindo uma estrutura que inclui a estrutura anelar invulgar do taxano e uma cadeia lateral estereoespecífica que é necessária para a actividade citostática. Taxano refere-se ainda a uma variedade de derivados de taxano conhecidos, incluindo tanto derivados hidrófilos como derivados hidrófobos. Os derivados de taxano incluem, mas não estão limitados a, derivados de galactose e manose descritos em Pedido Internacional de Patente N° WO 99/18113; piperazino e outros derivados descritos em WO 99/14209; derivados de taxano descritos em EO 99/09021, WO 98/22451 e patente US N° 5,869,680; derivados 6-tio descritos em WO 98/28288; derivados sulfenamida descritos na 20 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Patente US Ν° 5,821,263; e derivados de paclitaxel descritos na Patente US N° 5,415,869. "Concentração total de lípidos" refere-se à concentração da soma dos compostos anfifilicos e compostos lipófilos. "Potencial zeta" refere-se ao potencial de superfície de uma partícula tal como uma partícula coloidal medido com um instrumento tal como um Zetasizer 3000 utilizando micro-electroforese Laser Doppler sob as condições especificadas. O potencial zeta descreve o potencial na fronteira entre a solução a granel e a região de corte hidrodinâmico ou camada difusa.

Em contraste com os processos descritos na arte, a estabilidade do composto activo incorporado durante os passos de fabrico a) a d) e passo de reconstituição f) do processo divulgado é ainda preferivelmente controlado por qualquer um dos seguintes meios: pH controlado (baixo) na fase aquosa temperatura controlada (baixa) velocidade (elevada) controlada de fabrico e/ou aplicação. O processo divulgado permite estabilização física e química do composto activo incorporado enquanto o lipossoma se encontra num meio aquoso.

As limitações do processamento de lipossomas em escala de produção como os processos divulgados na arte tal como mencionado acima, de um modo parcial ou geral, não possuem a capacidade aumento de escala de modo a satisfazer as exigências que são necessárias da produção para o mercado. Com o processo divulgado é divulgada pela primeira vez a produção em larga escala de lipossomas catiónicos estáveis fisico-quimicamente que compreendem um composto activo lipófilo. O fabrico de lipossomas catiónicos do presente invento, o enchimento estéril e a transferência para o liofilizador requer 4-18 horas. Mais tarde os lipossomas são armazenados, 21 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ por exemplo, sob a forma de pó liofilizado com um teor de água de cerca de 0,1 a cerca de 2,5%, preferivelmente cerca de 0,5 a cerca de 1%. Antes da aplicação o pó liofilizado tem de ser reconstituído, o que significa que os lipossomas são re-dispersos numa solução aquosa ou água, o que pode conduzir a instabilidade fisico-quimica da formulação lipossomal e do composto lipófilo incorporado. Deste modo, a estabilidade em uso tem de cobrir o período de tempo para a reconstituição, transferência para a enfermaria e aplicação ao paciente (que é de tipicamente várias horas) e deverá cobrir um mínimo de 8 h, idealmente 24 h. Deste modo, o período de tempo mínimo para manuseamento da preparação lipossomal aquosa é de 12 h a temperaturas refrigeradas (2-8°C) e adicionalmente 4 h à temperatura ambiente. O processo divulgado é um processo no qual a estabilidade química do lipossoma catiónico compreendendo um composto activo é garantida para o período de tempo descrito.

Deste modo, a preparação lipossomal do invento compreendendo um taxano é física e quimicamente estável em qualquer um dos passos b) a d) ou f) durante pelo menos 12 horas a cerca de 2°C até cerca de 8°C e pelo menos cerca de 4 horas à temperatura ambiente. A estabilidade física e química no contexto do presente invento diz respeito ao lipossoma catiónico bem como ao composto activo. A estabilidade físico-química do composto activo diz respeito ao composto lipófilo que é incorporado no lipossoma catiónico da preparação lipossomal. Incorporado significa que o composto podem ser integrado/implantado na dupla camada do lipossoma e/ou associado no interior e/ou exterior com o lipossoma.

Fisicamente estável no que diz respeito ao composto incorporado significa que, por exemplo, não são detectáveis de modo substancial produtos de agregação do composto. A instabilidade física é detectável através de medição de partículas não visíveis (por exemplo através de medição de bloqueio da luz), microscopia óptica e dispersão luminosa dinâmica (DLS). Estabilidade química significa que os produtos de degradação se encontram abaixo de 5% da 22 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ quantidade total do composto. A detecção de produtos de degradação pode ser realizada, por exemplo, através de HPLC.

Além das considerações acerca da estabilidade o pH de uma forma de dosagem farmacêutica é determinado pelo seu modo de aplicação. Em geral para uma aplicação i.v. (injecção, infusão) são preferidas as soluções a pH fisiológico. Deste modo, as soluções aquosas não tamponizadas ou um tampão fisiológico na gama de pH 7,0-7,5 são normalmente utilizados para o fabrico de lipossomas de paclitaxel. Nenhuma das divulgações que lida com a incorporação de paclitaxel em lipossomas catiónicos considera a estabilidade química do paclitaxel lipossomal. Em conformidade, o pH é escolhido considerando a tolerabilidade máxima da formulação farmacêutica no paciente, que está ao pH fisiológico. A ignorância do papel da estabilidade pelo mais recente artigo publicado acerca do paclitaxel em lipossomas catiónicos (tal como temperatura e pH, ver [3]) é suportada pelo facto do processo de fabrico ser realizado a temperatura elevada, tal como foi descrito anteriormente. É conhecido a partir da literatura científica que o paclitaxel num tampão aquoso é mais estável a um pH ácido na gama 3-5 [4]. Todavia, dados publicados para o paclitaxel formulado com lipossomas carregados negativamente ou neutros difere de modo significativo dos resultados com lipossomas carregados positivamente. Sharma e Straubinger [1] reportaram para os lipossomas neutros e aniónicos uma estabilidade química superior a 3 meses a 4°C e TA. Por outro lado foi determinado pelos requerentes que a decomposição em formulações catiónicas pode ocorrer numa escala de tempo de horas ou dias. Isto demonstra que as membranas lipossomais com composto incorporado representam um sistema altamente complexo, onde as interacções entre os componentes individuais são críticas para a estabilidade físico-química dos lipossomas com paclitaxel incorporado.

Experiências demonstram que a estabilidade química de (fosfoéster-)lipidos em lipossomas é dependente do pH do meio (exemplo [5], [7], [8]). A maioria dos lipossomas neutros e aniónicos apresentam óptima estabilidade físico-química a cerca de pH 6,5 e uma mais ou menos perda significativa de 23 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ estabilidade com ο aumento ou diminuição do valor de pH devido, por exemplo, à hidrólise de éster das estruturas do lipido. Vernooij et al. demonstram que estes resultados não podem ser transferidos para lipossomas catiónicos compostos de DOTAP e DOPE. Nestes lipossomas o DOTAP e o DOPE são os mais estáveis a um pH inferior a 6,4 e 6,1 respectivamente, e a taxa de hidrólise nesta região é quase independente do pH. Os autores não conseguiram explicaram a cinética de hidrólise observada com base no seu modelo existente, mas sugeriram que a hidrólise influenciada pela amina pode desempenhar um papel importante na modelação dos perfis de k-pH.

Contudo, é questionável se um dos supramencionados modelos se aplica a uma formulação contendo outro lipido neutro em lugar de DOPE. O pH óptimo para a estabilidade quimica dos lipidos utilizados para as formulações de lipossomas catiónicos não pode, deste modo, ser determinado a partir das divulgações do estado da técnica.

No presente invento foi determinado de modo surpreendente que os lipossomas catiónicos compreendendo paclitaxel são caracterizados por melhor estabilidade quimica a valores de pH ácido. Isto está em nitido contraste com os dados publicados para os lipossomas neutros e/ou aniónicos ([1], [6]).

Deste modo, o valor de pH do meio aquoso em qualquer um dos passos b) a d) e f) do processo divulgado é de tal modo que a referida preparação lipossomal mantém a estabilidade física e química durante pelo menos 12 horas a cerca desde cerca de 2°C a cerca de 8°C e durante pelo menos 4 horas à temperatura ambiente, preferivelmente o valor de pH está entre cerca de 3 a cerca de 7 e mais preferivelmente entre 4 e cerca de 6,5. 0 processo divulgado compreende ainda arrefecimento a uma temperatura entre cerca de -1°C e cerca de 15°C, preferivelmente a uma temperatura entre cerca de 1°C e cerca de 10°C, muito preferivelmente entre cerca de 2°C e cerca de 8 °C. 0 pedido divulga ainda um processo para produção de uma preparação lipossomal catiónica compreendendo um taxano como 24 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ anti-angiogénico e agente citotóxico. Tal preparação pode inibir a angiogénese sendo deste modo útil no tratamento de uma variedade de doenças tais como cancro, inflamação crónica e similares.

Deste modo, é divulgado um processo para produção de uma preparação lipossomal catiónica compreendendo pelo menos um anfifilico seleccionado a partir de lípidos catiónicos numa quantidade de pelo menos cerca de 30% molar, opcionalmente pelo menos um outro anfifilico numa quantidade até cerca de 68% molar, um taxano numa quantidade de pelo menos cerca de 2% molar e um agente estabilizante numa quantidade de cerca de 0,1% (m/v) a cerca de 20% (m/v) , compreendendo os passos de a) proporcionar i. uma solução orgânica compreendendo um solvente orgânico, o referido taxano e o referido lipido catiónico, e opcionalmente o referido anfifilico, ii. uma solução aquosa compreendendo o referido agente estabilizante, b) preparar uma preparação lipossomal catiónica a partir da referida solução a)i. e a)ii., em que a referida preparação compreende lipossomas catiónicos num meio aquoso, c) opcionalmente homogeneizar a referida preparação pelo menos uma vez, e/ou d) opcionalmente efectuar uma filtração estéril da referida preparação, e) desidratar a referida preparação e f) opcionalmente reconstituir os referidos lipossomas catiónicos do passo e) numa solução aquosa e em que opcionalmente antes do passo c) e/ou d) é incluído um passo de ultra-filtração.

No processo divulgado, a referida preparação lipossomal compreendendo o referido taxano é fisicamente e quimicamente estável em qualquer um dos passos b) a d) ou f) durante pelo menos 12 horas de cerca de 2 a cerca de 8°C e durante pelo menos 4 horas à temperatura ambiente. 25 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Geralmente, a proporção de um taxano na preparação lipossomal catiónica do presente invento é inferior a cerca de 20% molar. Em algumas concretizações, a preparação lipossomal catiónica compreende um taxano numa proporção de cerca de 0,5% molar a cerca de 20% molar, preferivelmente de cerca de 2% molar a cerca de 15% molar. Em outras concretizações, está presente um taxano em cerca de 1% molar a cerca de 5% molar, e ainda noutras concretizações de cerca de 5% molar a cerca de 15% molar e mais preferivelmente de cerca de 10% molar a cerca de 13% molar.

Numa concretização preferida do processo divulgado, a referida preparação lipossomal compreende um taxano, preferivelmente paclitaxel ou docetaxel ou um seu derivado lipófilo numa quantidade de cerca de 1% molar a cerca de 20% molar, preferivelmente numa quantidade de cerca de 2% molar a cerca de 5% molar para o paclitaxel ou preferivelmente numa quantidade de pelo menos 3% molar para o docetaxel ou succinil-paclitaxel e o mais preferido numa quantidade de pelo menos 5% molar para docetaxel ou succinil-paclitaxel. É uma caracteristica do presente invento que o taxano não se distribua substancialmente a partir da dupla camada lipossomal para a fase aquosa e não forme substancialmente cristais de taxano numa dispersão lipossomal num período de pelo menos 0,5 horas, geralmente pelo menos 1 hora, preferivelmente pelo menos cerca de 2 horas, mais preferivelmente pelo menos cerca de 3 horas e o mais preferido pelo menos cerca de 4 horas à temperatura ambiente. Um lipossoma catiónico no qual o taxano não se distribua de modo substancial a partir da dupla camada lipossomal é um em que geralmente menos de cerca de 20%, usualmente menos de cerca de 10%, normalmente menos de cerca de 5%, tipicamente menos de cerca de 1% e preferivelmente menos de cerca de 0,5% da quantidade total de taxano incorporado no lipossoma catiónico se distribuiu a partir da dupla camada de lipossoma.

Na preparação do presente invento, o composto activo lipófilo é um taxano, e numa concretização preferida o composto activo lipófilo é seleccionado a partir de paclitaxel, docetaxel ou qualquer seu derivado lipófilo. 26 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

No presente invento a referida preparação lipossomal compreende um taxano, preferivelmente paclitaxel ou docetaxel ou um seu derivado lipófilo numa quantidade de cerca de 1 a cerca de 20% molar, preferivelmente numa quantidade de cerca de 5% molar para o paclitaxel ou preferivelmente numa quantidade de pelo menos 5% molar para o docetaxel ou succinil-paclitaxel. Numa outra concretização preferida a referida preparação lipossomal compreende camptotecina lactona numa quantidade de cerca de 0,1% molar a cerca de 1% molar.

Numa concretização preferida a preparação inventiva compreende um agente estabilizante tal como trealose na gama de cerca de 5% (m/v) a cerca de 15% (m/v) em relação ao volume total da preparação.

Uma concretização preferida do presente invento consiste em proporcionar uma preparação lipossomal catiónica compreendendo pelo menos um anfifílico seleccionado a partir de lipidos catiónicos com pelo menos 30% molar, opcionalmente pelo menos um outro anfifílico até cerca de 65% molar, paclitaxel com cerca de 5% molar e um agente estabilizante com cerca de 0,1% (m/v) a cerca de 20% (m/v), caracterizada por a referida preparação lipossomal ser física e quimicamente estável numa solução aquosa durante pelo menos 12 horas de 2°C a 8°C e pelo menos 4 horas à temperatura ambiente. É ainda outra concretização preferida do presente invento proporcionar uma preparação lipossomal catiónica compreendendo pelo menos um anfifílico seleccionado a partir de lipidos catiónicos com pelo menos cerca de 30% molar, opcionalmente pelo menos um outro anfifílico até cerca de 65% molar, docetaxel com pelo menos 5% molar e um agente estabilizante com cerca de 0,1% (m/v) a cerca de 20% (m/v).

Outra concretização preferida do presente invento consiste em proporcionar uma preparação lipossomal catiónica compreendendo pelo menos um lípido catiónico com pelo menos cerca de 30% molar, opcionalmente pelo menos um outro anfifílico até cerca de 65% molar, succinil-docetaxel com 27 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ pelo menos cerca de 5% molar e um agente estabilizante com cerca de 0,1% (m/v) a cerca de 20% (m/v). É uma característica do presente invento que os lipossomas catiónicos possuem um potencial zeta positivo em solução de KC1 cerca de 0,05 M a cerca de pH 7,5 à temperatura ambiente, preferivelmente um potencial zeta na gama de cerca de 25 mV a 100 mV em solução de KC1 cerca de 0,05 M a cerca de pH 7,5 à temperatura ambiente, e mais preferivelmente um potencial zeta na gama de cerca de 35 mV a 70 mV em solução de KC1 cerca de 0,05 M a cerca de pH 7,5 à temperatura ambiente.

Uma outra caracteristica do presente invento é que qualquer preparação lipossomal inventiva compreende lipossomas com um tamanho médio de partícula de cerca de 50 nm a cerca de 400 nm, preferivelmente de cerca de 100 nm a cerca de 300 nm. A composição farmacêutica do presente invento pode estar numa forma seca, liofilizada ou sob a forma de uma suspensão líquida. A forma liofilizada é preferida, devido a poder ser armazenada de modo estável durante períodos até vários meses ou anos. A suspensões da composição farmacêutica do presente invento em baixo pH ácido (tamponizado ou acidificado) são estáveis durante períodos de horas até meses, dependendo da temperatura, teor em composto, e constituintes fosfolípidos.

Outro objecto do presente invento é o de proporcionar uma composição farmacêutica compreendendo qualquer uma das preparações lipossomais inventivas em conjunto com um suporte, diluente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica do presente invento é activa no campo do tratamento do cancro, tratamento de feridas bem como em várias doenças crónicas, e em geral no tratamento de doenças associadas com a actividade angiogénica aumentada através da administração da composição aos pacientes numa quantidade eficaz. Os lipossomas do presente invento pode ser administrados isoladamente ou em combinação com suportes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. As formas de aplicação 28 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ adequadas são as vias parentéricas de administração tais como intramuscular, intravenosa, intraperitoneal bem como administração subcutânea. As formas de dosagem adequadas para administração parentérica incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões e similares bem conhecidas na técnica. O objecto do invento é definido nas reivindicações.

Exemplos 1. Exemplo 1: Preparação de lipossomas com Paclitaxel incorporado (LipoPac™) 0 exemplo que se segue descreve o fabrico de lipossomas com paclitaxel incorporado (LipoPac™) que é aplicável a uma escala de 4 1, 12 1 e pelo menos 66 1. Todas as formulações liquidas são estequiometricamente compostas por - DOTAP-CI 50% molar - DOPC 47% molar - paclitaxel 3% molar - trealose di-hidrato 108,2 g/1 - etanol 1,33% (m/m)

Etanol é um produto intermediário. É proposto que o etanol seja pelo menos parcialmente removido por liofilização. Foram determinadas quantidades residuais usando o Protocolo 2 e 3 e determinou-se estar abaixo de 1%. 1.1 Solução etanólica de lipidos

Uma quantidade apropriada de DOTAP-CI, DOPC e paclitaxel são dissolvidos em etanol obtendo-se uma concentração final de 400 mM do total dos compostos lipófilos em etanol. Foi obtida uma solução límpida (solução etanólica de lipidos). A solução etanólica de lipidos pode ser armazenada até ao dia seguinte a 2-8°C. 1.2 Preparação da solução de trealose

Uma quantidade apropriada de trealose-di-hidrato é dissolvida em água para injectáveis (WFi) e agitada durante 29 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ pelo menos 5 minutos até ser obtida uma solução límpida. A solução preparada é filtrada através de uma membrana filtrante plana de 0,22 pm em PVDF (Millipak) à temperatura ambiente. Em alternativa, a solução de trealose pode ser filtrada através de uma membrana celulose-acetato de 0,22 pm (Sartobran® P) à temperatura ambiente ou através de uma membrana de filtração estéril de grau esterilizável (0,22 pm) à temperatura ambiente. Antes de iniciar a injecção de etanol o pH e a temperatura são ajustados a pH 3-7 e 2-8°C respectivamente e mantidos a esta temperatura. 1.3 Injecção de etanol A solução de lípidos em etanol é injectada em solução de trealose em agitação com uma velocidade de pelo menos 0,433 ml/min mas pode ser aumentada em conformidade. A solução de trealose é agitada com uma velocidade de pelo menos 280 rpm mas pode ser aumentada em conformidade. A injecção é levada a cabo com um funil de carga através de um capilar utilizando uma bomba de pistão. A dispersão em bruto obtida é agitada durante pelo menos 5 min. 1.4 Extrusão A dispersão em bruto é extrudida cinco vezes através de uma membrana em policarbonato de 200 nm. A dispersão lipossomal é forçada cinco vezes através da membrana aplicando uma pressão de pelo menos 2 bar. Durante a extrusão a temperatura é mantida a 2-8°C. 1.5 Filtração estéril

Após extrusão a dispersão lipossomal é filtrada através de um filtro de grau esterilizante (Millipak 200, 0,22 pm) . É aplicada de imediato uma pressão de pelo menos 2,5 bar. A filtração estéril é realizada a 2-8°C. Pode ser realizado um segundo passo de filtração estéril de modo a assegurar a remoção completa de bactérias. 1.6 Liofilização A liofilização tem de ser ajustada à dimensão determinada da escala de preparação resultando em preparações similares. 30 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Protocolo 1 para uma escala de 4 1; frascos 6R com um volume de enchimento de 2,1 ml/frasco: A liofilização é realizada utilizando um liofilizador Christ (Epsilon 2-12D). Resumidamente, as amostras são congeladas a -40°C durante 3 horas. A secagem primária foi realizada a -40°C, -30°C e -16°C. A pressão foi ajustada a 0,1 mbar. A secagem secundária foi realizada a +20°C e foi aplicado vácuo (0,01 mbar). Os frascos são fechados a aproximadamente 800 mbar de pressão sob azoto.

Protocolo 2 para uma escala de 12 1; frascos 50H com um volume de enchimento de 14 ml/frasco: A liofilização é realizada utilizando um liofilizador Christ. Resumidamente, as amostras são congeladas a -30°C durante 3 horas. Após congelação a temperatura e pressão são ajustadas a -16°C e 0,1 mbar. Após 60 h da secagem primária, a temperatura é aumentada para +20°C e a pressão é diminuída para 0,001 mbar em 3h. A secagem secundária é realizada durante 12h a +20°C e 0,001 mbar. Os frascos são fechados a aproximadamente 800 mbar de pressão sob azoto.

Protocolo 3 para uma escala de 66 1; frascos 100H com um volume de enchimento de 25 ml/frasco: A liofilização é realizada utilizando um liofilizador Kniese EK-10. Resumidamente, as amostras são congeladas a -40°C durante pelo menos 3 horas. Após congelação a temperatura do produto é aumentada para -16°C. A pressão é ajustada a 0,1 mbar. Após 12 da secagem primária, a temperatura é aumentada para 0°C em 59 h. A secagem secundária é realizada durante 12h a +20°C e 0,01 mbar utilizando uma rampa de 3h para ajustar a pressão e temperatura. Os frascos são fechados a aproximadamente 800 mbar de pressão sob azoto.

Protocolo 4 para uma escala de 66 1; frascos 100H com um volume de enchimento de 25 ml/frasco: A liofilização é realizada utilizando um liofilizador Kniese EK-10. Resumidamente, as amostras são congeladas a -40°C durante pelo menos 3 horas. Após congelação a 31 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ temperatura do produto é aumentada para -16°C. A pressão é ajustada a 0,1 mbar. Temperatura e pressão são mantidas constantes durante um período de tempo de 60 a 100 h. A secagem secundária é realizada durante 12h a +20°C e 0,01 mbar utilizando uma rampa de 3h para ajustar a pressão e temperatura. Os frascos são fechados a aproximadamente 800 mbar de pressão sob azoto.

Lipac™ foi fabricado de acordo com o procedimento acima descrito. Todas as preparações foram homogéneas em tamanho (Zave e PI) após extrusão e filtração estéril (Zave cerca de 220 nm e PI cerva de 0,2-0,3. Após liofilização, as amostras foram obtidas com um índice PI de 0,27 (lote GB100 Fig.l) resp. 0,56 (GB 261 Fig. 2) dependendo do protocolo de liofilização gue foi utilizado. GB100 tem sido fabricado de acordo com um protocolo de liofilização similar ao protocolo 4 enquanto que GB261 tem sido fabricado de acordo com um protocolo de liofilização similar ao protocolo 3.

As análises por HPLC dos diferentes lotes foram efectuadas com enfoque na degradação de paclitaxel dado ser observável pela formação de 7-epitaxol, um produto principal de degradação. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: Formaçao de 7-epitaxol em diferentes lotes

Lote Temperatura durante fabrico 7-Epitaxol 1 Temperatura ambiente 1,5 % 2 1,2 % 3 0,9 % 4 2 - 8°C 0,4 % 5 0,2 % 6 0,3 % 7 0,7 % 8 0,7 % 9 0,5 % A formação de 7-epitaxol está dependente da temperatura de fabrico do material a granel. Os lotes 1-3 foram 32 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ fabricados à temperatura ambiente em escala de 8-12 1. 0 7-epitaxol encontrava-se na gama de 0,9-1,5%. A diminuição da temperatura de fabrico para 2-8°C resultou numa diminuição do teor em 7-epitaxol para 0,2-0,7%. O pH de todas as suspensões de lipossomas durante o fabrico encontrava-se entre 4,7 e 6. 2. Exemplo 2: Influência do valor de pH na estabilidade em uso de paclitaxel lipossomai após reconstituição 2.1 Sumário O objectivo deste estudo era o de determinar a influência dos valores de temperatura e pH na estabilidade em uso do paclitaxel lipossomal após reconstituição de preparações liofilizadas. Os estudos foram realizados com diferentes amostras de paclitaxel lipossomal, o lote Si 175 a duas temperaturas diferentes e sete valores de pH diferentes (pH 5,0 a 8,0).

As amostras liofilizadas de paclitaxel lipossomal lote SÍ175 (preparado tal como acima divulgado no Exemplo 1) foram reconstituídas em 10 mM de soluções tampão BISTRIS ou TRIS, as quais foram antes ajustadas a valores de pH na gama de 5,0 a 8,0. As dispersões aquosas foram armazenadas à temperatura ambiente ou num frigorífico (2-8°C) durante até 32 h.

Temperatura Ambiente: A degradação do paclitaxel lipossomal depende fortemente do valor de pH da dispersão aquosa, o paclitaxel é estável a valores de pH de 6,0 e abaixo durante até 32 h. Somente cerca de 1% da substância activa degradou durante 32 h a pH 6,0. A valores de pH mais elevados a degradação aumentava de modo dramático desde cerca de 8% a pH 6,5 a cerca de 70% a pH 8,0 em 32 h. O principal produto de degradação era 7-epi-taxol. A sua quantidade formada durante 32 h aumentava de cerca de 1% a pH 6,0 até cerca de 25% a pH 8,0. A Bacatina III e 10-desacetiltaxol aumentaram de modo linear para cerca de 12% após 32 h a pH 8,0.

Uma estabilidade em uso aceitável de não mais de 2% de degradação de paclitaxel lipossomal à temperatura ambiente 33 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ poderia somente se o valor de pH da solução aquosa é 6,0 ou inferior. Posteriormente, a formação de compostos de degradação praticamente poderia ser negli genciada. Uma estabilidade em uso de 12h poderia ser alcançada sem problemas nesta gama de pH. Valores acima de pH 6, 0 a estabilidade em uso de 12h tem de ser reduzida e ajustada de acordo com as quantidades de produtos de deqradação aceites na dispersão.

Frigorífico: A degradação do paclitaxel lipossomal poderia ser retardada de modo significativo a baixas temperaturas. O paclitaxel é estável a valores de pH de 6,5 ou inferiores. Isto significa, que o valor crítico de pH poderia ser aumentado de 6,0 para 6,4 comparando com os ensaios conduzidos à temperatura ambiente. A valores de pH mais elevados a degradação aumentava, mas em menores graus do que à temperatura ambiente. A pH 8,0 mais do que duas vezes as quantidades de paclitaxel poderiam ser recuperadas após 32 h.

Os produtos de degradação eram formados nas mesmas proporções tal como nos ensaios conduzidos à temperatura ambiente mas em quantidades significativamente inferiores. Novamente, 7-epi-taxol foi o principal produto de degradação do paclitaxel (10% a pH 8,0) . Formaram-se Bacatina III e 10-desacetiltaxol em cerca de 5 a 6% a pH 8,0. As substâncias desconhecidas determinadas era as mesmas. A estabilidade em uso do paclitaxel lipossomal poderia ser significativamente melhorada a baixas temperaturas (2-8°C). Numa gama de pH de 5,0 a 6,5, as amostras reconstituídas podem ser armazenadas até 32 h sem a formação de produtos de degradação. A degradação é muito lenta quando comparada com a temperatura ambiente e valores de pH mais elevados.

Estes ensaios demonstraram que a armazenagem de paclitaxel lipossomal em meio ácido (pH inferior a 6,5) no frigorífico reduziu os processos de degradação da substância activa paclitaxel. A estabilidade em uso das dispersões podia ser estendida para mais do que 12 h sob estas condições. 34 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 2.2 Experimental 2.2.1 Sistema Teste - Formulação

Uma formulação de paclitaxel lipossomal tal como apresentada na Tabela 2 foi utilizada neste estudo:

Tabela 2: Formulação de lipossomas investigada

Formulação Lote No. Composição Teórica [mM] Volume de liofilizado por Frasco [mL] DOTAP DOPC Paclitaxel Paclitaxel lipossomal Si 175 O LO 4,7 0,3 2,1 2.2.2 Instrumentos

Sistema de HPLC: • Autoinjector: SIL-10ADVP com bastidor de amostras No. 11

• Bomba isocrática: LC-10ADVP

• Desgaseificador: DGU-14A

• Forno de coluna: CTO-IOASVP

• Detector DAD: SPD-M10AVP

• Controlador: SCL-10AVP • Software para avaliação: CLASS VP Versão 6.10 Shimadzu Deutschland GmbH; 47269 Duisburg, Alemanha

Medidor de pH: • InoLab pH Levei 2; WTW GmbH und Co. KG; 82362 Weilheim, Alemanha

Frigorífico e congelador normalmente disponíveis no laboratório. 35 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

2.2.3 Método de HPLC

Colunas: LiChroCART® 250-4, LiChrospher® 60, RP-select B, comprimento 250 mm, ID: 4 mm, tamanho de partícula: 5 pm; Order No.: 1.50839.0001 Pré-Coluna: e.g. 8/4 LiChrospher® 100-5 C18; Order No.1-50957 Merck KgaA, 64293 Darmstadt, Alemanha Volume de injecção: 10 pL Temperatura do forno: 35 °C Fase Móvel: acetonitrilo/THF/2 mM acetato de amónio (32/12/56, v/v/v; v = %Vol) Caudal: 1,00 mUmin Comprimento de onda do detector: 229 nm 2.2.4 Preparação das Amostras

As amostras liofilizadas (preparação descrita em Exemplo) foram reconstituídas em 10 mM de soluções tampão BISTRIS ou TRIS, que foram ajustadas a valores de pH na gama de 5,0 a 8,0 com ácido clorídrico. As soluções foram cuidadosamente agitadas até ser obtida uma dispersão homogénea ligeiramente turva, a qual estava livre de partículas visíveis. As soluções foram utilizadas 30 min após a preparação.

Preparação das soluções tampão 10 mM de BISTRIS

Cerca de 1,26 g de BISTRIS foram pesados para um copo de 1000 mL e diluídos com 600 mL de água (Aqua ad inject., medidos de modo exacto com um cilindro graduado). Posteriormente, cinco alíquotas de 100 ml desta solução foram ajustadas com ácido clorídrico (HC1) 1M a valores de pH de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 e 7,0. Cerca de 0,5 mL (pH 7,0) a 4,0 mL (pH 5,0) do ácido foram necessários para o ajuste dos valores de pH. O HC1 1M foi preparado por diluição de cerca de 9 g de HC1 (37%) com 100 mL de água (Aqua ad injec.) A capacidade tampão do tampão BISTRIS a valores de pH abaixo de 5,5 é baixa e pode ser negligenciada a um valor de 36 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ ρΗ de 5,0. Ainda assim foi escolhido, devido a que a maioria dos tampões não podia ser utilizado em combinação com lipossomas catiónicos.

Preparação das soluções tampão de TRIS

Cerca de 1,21 g de BISTRIS foram pesados para um balão aferido de 1000 mL e cheios ao volume com água (Aqua ad inject.). Posteriormente, duas alíquotas de 100 ml desta solução foram ajustadas com HC1 1M a valores de pH de 7,5, e 8,0. Cerca de 1 mL (pH 8,0) e 1,5 mL (pH 7,5) do ácido foram necessários. 2.2.5 Condições de Armazenagem e Planeamento de Amostragem

Após preparação, as amostras foram armazenadas tal como descrito na Tabela 3. A amostragem foi efectuada após 0,1,3,6,8,24 e 32 h após reconstituição. Em cada intervalo de amostragem, foram retiradas do frasco alíquotas de 200 pL da dispersão e os parâmetros pureza e teor de paclitaxel foram determinados através de análise por HPLC. Adicionalmente, o valor de pH da dispersão foi determinado em cada data de amostragem.

Tabela 3: Condições de Armazenagem amostra No. Valor de PH temperatura [°C] Tempo máx. de armazenagem [h] 001 5, 0 2 - 8 °C 34 002 5, 5 003 6, 0 004 6,5 005 7, 0 006 7,5 007 CO O 008 5, 0 Temperatura ambiente 34 009 5, 5 010 6, 0 011 6,5 012 7,0 013 7,5 014 CO o 37 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 2.3 Resultados e Discussão 2.3.1 Degradação do Paclitaxel lipossomal à Temperatura Ambiente A degradação do paclitaxel lipossomal depende fortemente do valor de pH da solução aquosa após reconstituição. Tal como se pode ver na Tabela 4, o paclitaxel é quimicamente estável a valores de pH de 6,0 e inferiores até 32 h. Somente cerca de 1% da substância activa degradou durante 32 h a pH 6,0. A degradação observável do paclitaxel tem inicio a valores de pH acima de 6,0 (ver Tabela 6 e Tabela 7). A pH 6,5 cerca de 10% da substância activa degradou durante 32 h. Aumentando o valor de pH de 7,0 para 8,0, a quantidade de produtos de degradação aumentava dramaticamente (ver Tabela 8). A pH 8,0 somente cerca de 30% da quantidade original de paclitaxel pode ser recuperada. Mesmo na primeira amostra (Oh) a pH 8,0, 10% do paclitaxel já degradaram, devido a que a primeira amostragem foi efectuada uma hora após reconstituição do frasco.

Uma estabilidade em uso aceitável de lipossomas incorporando paclitaxel á temperatura ambiente poderia somente ser alcançada se o valor de pH da solução aquosa for igual ou inferior a 6,0. Posteriormente, a formação de compostos de degradação quase poderia ser negligenciada. Uma estabilidade em uso de 12 h poderia ser alcançada sem problemas nesta gama de pH.

Para valores de pH superiores a 6,0, a estabilidade em uso tem de ser reduzida e ajustada de acordo com as quantidades dos produtos de degradação aceites na dispersão. O principal produto de degradação observado neste estudo foi o 7-epi-taxol. As quantidades aumentaram desde cerca de 1% a pH 6,0 a cerca de 25% a pH 8,0. Bacatina III e 10-desacetiltaxol aumentaram de modo linear para cerca de 12% após 32 h a pH 8,0 (ver Tabela 6, Tabela 7 e Tabela 8). 38 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Tabela 4. Influência do tempo de armazenagem e pH na degradação à temperatura ambiente

Valor de pH Total dos Produtos de Degradação % Área Diferença Absoluta Após Oh Após 8h Após 32h 5, 0 3,4 3,4 2, 8 -0,6 5, 5 3,3 3,3 3,4 + 0, 1 6, 0 3,4 3,8 4,5 + 1,1 6,5 3,6 5,4 9,4 + 5, 8 7,0 4,3 12,9 27, 1 + 22, 8 7,5 5,1 16,7 35, 6 + 30,5 8, 0 9,6 40,2 56,9 + 46,5

2.3.1 Degradação do Paclitaxel lipossomal a 2-8sC A degradação do paclitaxel lipossomal pode ser retardada a baixas temperaturas. Tal como pode ser visto na Tabela 5, o paclitaxel é estável a valores de pH < 6,5. Isto significa, que o valor critico de pH pode ser aumentado de 6,0 para 6,5 comparado com a temperatura ambiente. Na gama de pH 5,0 a 6,5 o sistema aquoso é estável (ver também Tabela 9 e Tabela 10). A decomposição tem início a valores de pH superiores a 6,5. A pH 7,0 cerca de 7% da substância activa degradou durante 32 h. A valores de pH superiores, a degradação aumentava, mas num grau menor quando comparado com os ensaios conduzidos à temperatura ambiente (ver Tabela 10 e Tabela 11). A pH 8,0 mais de duas vezes das quantidades de paclitaxel (30% a t.a. vs 64% a 2-8°C) puderam ser recuperados após 32 h. A estabilidade em uso do paclitaxel lipossomal pode ser significativamente melhorada a baixas temperaturas (2-8°C). Numa gama de pH de 5,0 a 6,4, as amostras reconstituídas podem ser armazenadas até 32 h sem a formação de produtos de degradação. A degradação é muito mais lenta quando comparada com a temperatura ambiente mesmo a valores de pH superiores. Para valores de pH acima de 6,5, a estabilidade em uso tem de ser ajustada de acordo com as quantidades de produtos de degradação aceites na dispersão.

Os produtos de degradação formaram-se nas mesmas proporções que nos ensaios conduzidos à temperatura ambiente mas em quantidades significativamente inferiores. De novo, o 39 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 7-epi-taxol foi ο principal produto de degradação do paclitaxel. As quantidades formadas durante 32h aumentaram de cerca de 3% a pH 7,0 até cerca de 10% a pH 8,0 (ver Tabela 11). Bacatina III e 10-desacetiltaxol formaram-se em cerca de 5 a 6% a pH 8,0.

Tabela 5. Influência do tempo de armazenagem e pH na degradação a 2-8°C

Valor de PH Total dos Produtos de Degradação % Área Diferença Absoluta Após Oh Após 8h Após 32h 5, 0 3,3 3,0 2,9 -0,4 5,5 3,2 3,0 2, 8 -0,4 6,0 3,3 3,1 3,1 -0,2 6,5 3,5 3,7 3,9 + 0,4 7,0 4,4 6,7 10,0 + 5,6 7,5 5,3 10,3 12, 8 + 7,5 O 00 10,2 25, 0 31,8 + 21,6

As mesmas substâncias desconhecidas foram encontradas como nos ensaios realizados à temperatura ambiente, embora em quantidades muito menores. 40 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 2.3.3. Dados primários

Tabela 6: degradaçao de paclitaxel lipossomal e formaçao de produtos de degradação a pH 5,0, 5,5 e 6,0 à temperatura ambiente (dados apresentados em % área)

Temperatura Ambiente Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi— Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 5,0 0 0,34 0, 59 96,6 2,5 0* 0 0 3,4 1 0,33 0, 56 96,9 2,3 0* 0 0 3,2 3 0* 0, 47 96,9 2, 7 0* 0 0 3,2 6 0,39 0, 52 96, 7 2,4 0* 0 0 3,3 8 0,38 0, 52 96, 7 2,5 0* 0 0 3,4 24 0* 0, 55 95,3 2,4 1,7 0 0 2,9 32 0,37 0* 97, 2 2,4 0* 0 0 2,8 Temperatura Ambiente Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil— taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 5,5 0 0,35 0,59 96, 7 2,3 0* 0 0 3,3 1 0,37 0, 59 96, 7 2,4 0* 0 0 3,3 3 0* 0, 51 96,9 2,6 0* 0 0 3,1 6 0, 41 0, 61 96,6 2,4 0* 0 0 3,4 8 0,37 0, 54 96, 7 2,4 0* 0 0 3,3 24 0* 0,57 94, 3 2,6 2,5 0 0 3,2 32 0, 44 0* 96,6 2,9 0* 0 0 3,4 Temperatura Ambiente Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 6,0 0 0, 29 0,62 96,6 2,5 0* 0 0 3,4 1 0, 38 0,67 96, 4 2,5 0* 0 0 3,6 3 0* 0,52 96, 8 2, 7 0* 0 0 3,2 6 0, 43 0,69 96, 4 2,5 0* 0 0 3, 7 8 0, 43 0,65 96,2 2, 7 0* 0 0 3, 8 24 0* 0, 80 94, 0 3,3 1,9 0 0 4, 1 32 0, 64 0* 95,5 3,9 0* 0 0 4,5 *: os picos correspondentes não puderam ser avaliados devido a interferências com o tampão BISTRIS; a %área de total dos produtos de degradação foram calculadas sem o composto desconhecido 1, pois muito provavelmente não é um metabolito de paclitaxel. 41 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Tabela 7: Degradação de paclitaxel lipossomal e formação de produtos de degradação a pH 6,5 e 7,0 à temperatura ambiente (dados apresentados em %área)

Temperatura Ambiente Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 6,5 0 0,37 0,64 96,4 2,5 0* 0 0 3,6 1 0,36 0, 72 96,1 2,8 0* 0 0 3,9 3 0* 0,65 96,0 3,4 0* 0 0 4,0 6 0,59 0,87 95,1 3,5 0* 0 0 4, 9 8 0, 64 1, 0 94,6 3,8 0* 0 0 5,4 24 0* 1,6 90,1 6,2 2,1 0 0 7, 8 32 0* 1, 8 88,1 7,6 2,5 0 0 9,4 Temperatura Ambiente Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 7, 0 0 0, 48 0, 78 95, 7 3,0 0* 0 0 4, 3 1 0, 66 1, 0 94,6 3,7 0* 0 0 5,4 3 0* 1,3 93,1 5,6 0* 0 0 6,9 6 1,3 2, 0 69,1 7,6 0* 0 0 10,9 8 1,5 2, 4 87,1 9,0 0* 0 0 12,9 24 4,0 4,5 69, 7 16,9 4,0 1,0 0 26,4 32 0* 4, 8 67,1 20,8 4,8 1,5 0 27, 1 *: os picos correspondentes não puderam ser avaliados devido a interferências com o tampão BISTRIS; a %área de total dos produtos de degradação foram calculadas sem o composto desconhecido 1, pois muito provavelmente não é um metabolito de paclitaxel. 42 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Tabela 8: Degradação de paclitaxel lipossomal e formação de produtos de degradação a pH 7,5 e 8,0 à temperatura ambiente (dados apresentados em %área)

Temperatura Ambiente Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 7, 5 0 0,61 0,93 94, 1 3,5 0,80 0 0 5, 1 1 0, 81 1,3 92, 1 5,1 0,66 0 0 7, 2 3 0, 93 1,8 88,8 72 1,4 0 0 9,9 6 1,9 2,5 84,5 9, 7 1,5 0 0 14, 1 8 2,2 3,0 81,2 11,2 2,0 0,46 0 16, 7 24 4, 4 5,1 65, 7 19,6 3,8 1,4 0 30,4 32 5,2 6, 7 59,6 22, 1 4,8 1, 7 0 35,6 Temperatura Ambiente Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 8, 0 0 1,2 1,8 89,4 6,6 1.1 0 0 9,6 1 2,0 2,9 83,3 10, 7 1,1 0 0 15,6 3 2,6 4, 4 73,0 16, 7 2.2 1,2 0 24,9 6 5,4 6,6 60,8 21,9 3,6 1,8 0 35,6 8 6,3 7, 0 55, 1 24, 5 4.8 2,4 0 40,2 24 10,5 10,8 32,5 29,4 12,1 4,3 0,43 55,3 32 11,1 12,8 27, 9 28,4 15, 2 4, 7 0 56,9 *: os picos correspondentes não puderam ser avaliados devido a interferências com o tampão BISTRIS; a %área de total dos produtos de degradação foram calculadas sem o composto desconhecido 1, pois muito provavelmente não é um metabolito de paclitaxel; o composto desconhecido 3 é muito provavelmente um artefacto (ex: impureza da preparação de amostra). 43ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Tabela 9: Degradação de paclitaxel lipossomal e formação de produtos de degradação a pH 5,0, 5,5 e 6,0 a 2 -8 °C (dados apresentados em %área)

Frigorifico (2-8 °C) Tempo [h] Bacatina 10-Desace- til-taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 5,0 0 0,34 0,59 96, 7 2,3 0* 0 0 3,3 1 0, 35 0, 43 96, 7 2,5 0* 0 0 3,3 3 0* 0, 41 98,6 2,8 0* 0 0 3,2 6 0,38 0,50 96, 7 2,4 0* 0 0 3,3 8 0* 0,56 97,0 2,4 0* 0 0 3, 0 24 0* 0,53 95, 8 2,4 1,3 0 0 2, 9 32 0* 0,53 95, 0 2,3 2,1 0 0 2, 9 Frigorifico (2-8 °C) Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 5,5 0 0,31 0,59 96, 8 2,3 0* 0 0 3,2 1 0,33 0, 43 96,6 2,6 0* 0 0 3,4 3 0,38 0,51 96,8 2,3 0* 0 0 3,2 6 0,38 0,55 96, 7 2,3 0* 0 0 3,3 8 0* 0,54 97, 0 2,5 0* 0 0 3,0 24 0* 0,58 95, 7 2,3 1,5 0 0 2,9 32 0* 0,57 95, 1 2,2 2,2 0 0 2,8 Frigorifico (2-8 °C) Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 6,0 0 0, 34 0,62 96, 7 2,3 0* 0 0 3,3 1 0, 32 0, 45 96,6 2,6 0* 0 0 3,4 3 0, 40 0,61 96, 7 2,3 0* 0 0 3,3 6 0, 40 0, 54 96, 7 2,4 0* 0 0 3,3 8 0* 0, 56 96,9 2,5 0* 0 0 3,1 24 0* 0, 59 95,8 2,4 1,2 0 0 3,0 32 0* 0, 58 95,1 2,5 1.8 0 0 3,1 *: os picos correspondentes não puderam ser avaliados devido a interferências com o tampão BISTRIS; a %área de total dos produtos de degradação foram calculadas sem o composto desconhecido 1, pois muito provavelmente não é um metabolito de paclitaxel 44 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Tabela 10: Degradaçao de paclitaxel lipossomal e formação de produtos de degradação a pH 6,5 e 7,0 a 2-8 °C (dados apresentados em %área)

Frigorifico (2-8 °C) Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil— taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 6,5 0 0, 40 0,63 96,5 2,4 0* 0 0 3,5 1 0, 30 0,51 96,3 2,9 0* 0 0 3, 7 3 0, 43 0,67 96,3 2,6 0* 0 0 3, 7 6 0, 45 0,60 96, 4 2,6 0* 0 0 3,6 8 0* 0, 74 96,3 3,0 0* 0 0 3, 7 24 0* 0,87 94, 8 2,9 1,4 0 0 3,8 32 0* 0, 86 94, 0 3,0 2,2 0 0 3,9 Frigorifico (2-8 °C) Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 7, 0 0 0, 52 0, 82 95,6 3,1 0* 0 0 4,4 1 0,29 0, 81 95,5 3,4 0* 0 0 4, 5 3 0,56 0, 89 95,2 3,4 0* 0 0 4, 8 6 0,63 1, 0 94, 9 3,5 0* 0 0 5,2 8 0* 1,5 92,3 5,2 1,0 0 0 6, 7 24 0* 1, 9 90,3 5, 7 2,1 0 0 7, 6 32 2,3 1, 9 87,8 5, 7 2,2 0 0 10,0 *: os picos correspondentes não puderam ser avaliados devido a interferências com o tampão BISTRIS; a %área de total dos produtos de degradação foram calculadas sem o composto desconhecido 1, pois muito provavelmente não é um metabolito de paclitaxel

Tabela 11: Degradação de paclitaxel lipossomal e formaçao de produtos de degradação a

pH 7,5 e 8,0 a 2-8 °C (dados apresentados em %área)

Frigorifico (2-8 °C) Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil- taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 7, 5 0 0,63 0,93 93,9 3,8 0,75 0 0 5,3 1 0,62 1, 1 93,0 4, 3 1,0 0 0 5,9 3 0, 94 1,3 91,9 4, 6 1,2 0 0 6,9 6 1,1 1,5 91,2 4, 7 1,5 0 0 7,3 8 1,4 2, 1 88,0 6,8 1,7 0 0 10,3 24 1,8 2,8 85,8 7, 7 1,9 0 0 12,4 32 2,0 3,0 85,1 7, 8 2,1 0 0 12,8 Frigorifico (2-8 °C) Tempo [h] Bacatina 10- Desacetil— taxol Pacli taxel 7- Epi- Taxol Desconhecido 1 Desconhecido 2 Desconhecido 3 Total dos Produtos de Degradação pH 8, 0 0 1,3 1,9 89,0 7, 1 0,80 0 0 10,2 1 1,3 2,3 87, 2 8,3 0,98 0 0 11,8 3 2,1 2,9 84, 5 9, 1 1,4 0 0 14, 1 6 2,5 3,5 82,3 9, 7 1,7 0,35 0 16,0 8 3,8 4, 8 72,6 15,2 2,4 1, 1 0 25,0 24 5,1 6, 7 66,3 17, 2 3,3 1,4 0 30,4 32 5,5 7, 6 63,9 17, 1 4,3 1,6 0 31,8 *: os picos correspondentes não puderam ser avaliados devido a interferências com o tampão BISTRIS; a %área de total dos produtos de degradação foram calculadas sem o composto desconhecido 1, pois muito provavelmente não é um metabolito de paclitaxel. 45 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 3. Exemplo 3: Aumento de estabilidade em uso de Paclitaxel incorporado em lipossomas catiónicos

De modo a investigar a estabilidade do paclitaxel incorporado em lipossomas catiónicos sob diferentes condições de pH, são adicionados durante a preparação vários aditivos, preferivelmente aditivos constituindo um pH ácido. Deste modo é examinada a epimerização em C-7 a formação de 7-epi-taxol. Estes compostos podem ser considerados a partir do grupo de ácidos inorgânicos e orgânicos. Exemplos de ácidos inorgânicos incluem ácido clorídrico (HC1), ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido carbónico, ou outros ácidos usualmente utilizados. Exemplos de ácidos orgânicos são os de fórmula geral para os ácidos mono-básicos R-C02H com R = CH3-(CH2)n; C6H5-(CH2)n- e n = 0-6, por exemplo, ácido acético ou ácido benzóico. Além disso podem ser utilizados ácidos di-básicos com a fórmula geral H02C-(CH2) n-C02H com n = 0-6 tais como ácido succínico, ácido adípico, ou derivados insaturados, tais como ácido maleico ou ácido fumárico, ou ácidos aromáticos tal como ácido ftálico. Ácidos hidroxi-carboxílicos tais como ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico são igualmente aditivos preferidos.

Preparação:

Uma preparação lipossomal compreendendo 10 mM DOTAP/DOPC/paclitaxel 50/47/3 é preparada através do processo de injecção de etanol tal como anteriormente descrito. A solução aquosa compreende trealose a 10% (m/v), pH = 5,5. A solução de trealose pode ser ajustada a pH 4,5 através da adição de ácido clorídrico, ácido cítrico, ou ácido láctico. Após a injecção de etanol a uma solução de lípidos e composto activo, a solução resultante é extrudida a 4°C e liofilizada tal como descrito anteriormente. O liofilizado é analisado por PCS em relação à distribuição de tamanho lipossomal e por HPLC para o teor em paclitaxel e 7-epi-taxol. A estabilidade em uso dos liofilizados é estabelecida tal como se segue: O liofilizado (preparado tal como descrito anteriormente) é reconstituído com água de qualidade MilliQ e deixado durante 24 horas à temperatura ambiente ou 4°C antes de análise. Ambas as análises PCS e HPLC são realizadas. 46 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Outra preparação lipossomal foi preparada à temperatura ambiente tal como descrito anteriormente com ácido cítrico e ácido láctico como aditivos para a solução aquosa de trealose. Sem liofilização, estas formulações foram caracterizadas pelo seu tamanho lipossomal e distribuição de tamanho (PCS) e concentração de fármaco e teor em 7-epi-taxol (%área, HPLC); Fig. 3

Resultado:

Quando os lipossomas são preparados a 4°C, liofilizados, e mantidos no frigorífico a formação de 7-epi-taxol não é observada após reconstituição tal como representado pelos dados na Tabela 12. Contudo, a estabilidade em uso (24 h, ta) dos liofilizados reconstituídos, depende da presença e volatilidade dos aditivos utilizados, tal como representado na Tabela 13. Sem utilização de aditivo, formam-se 6% de 7-epi-taxol. Isto é ligeiramente reduzido através da utilização de ácido clorídrico volátil. Após 24 h à temperatura ambiente, não se forma ou forma-se muito pouco 7-epi-taxol quando se utilizam ácidos orgânicos sólidos não voláteis, tais como ácido cítrico ou ácido láctico (Tabela 13). As formulações de paclitaxel lipossomal podem ser preparadas a 25°C tal como representado na Tabela 14 onde não se observou degradação de paclitaxel mesmo após armazenagem de 24 h a 25°C. A análise por HPLC após 120 h de mais armazenagem a 25°C não detectou 7-epi-taxol (dados não apresentados).

Tabela 12: Lipossomas catiónicos com Paclitaxel incorporado

preparados a 4°C

Preparação pH 7 ^media [nm] Valor PI Paclitaxel [%] 7-epi-taxol [%] 10% trealose LO LO 166 0,20 100 0 10% trealose/HCl 4,5 164 0, 17 100 0 10% trealose/ácido cítrico 4,5 171 0,182 100 0 10% trealose/ácido láctico 4,5 170 0, 17 100 0 47 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Tabela 13: Estabilidade em uso (24 h) de lipossomas catiónicos com

paclitaxel incorporado preparados a 4°C

Preparação PH ^média [nm] Valor PI Paclitaxel [%] 7-epi-taxol [%] 10% trealose 5,5 152 0,17 93,8 6,2 10% trealose/HCl 4,5 154 0, 17 95, 7 4,3 10% trealose/ácido cítrico 4,5 159 0, 16 98, 7 1,3 10% trealose/ácido láctico 4,5 148 0,21 100 0

Tabela 14: Estabilidade em uso (24 h, sem liofilização) de

lipossomas catiónicos com paclitaxel incorporado preparados a 25°C

Preparação pH ^média [nm] Valor PI Paclitaxel [%] 7-epi-taxol [%] 10% trealose/ácido cítrico 4,5 163,2 0,142 100 0 10% trealose/ácido láctico LO 158,4 0, 188 100 0 4. Exemplo 4: Preparação de lipossomas catiónicos incorporados com Docetaxel 4.1 preparação dos lipossomas via processo de película de lípidos

As formulações lipossomais compreendendo docetaxel foram preparadas utilizando o processo de película de lípidos como se segue: lípidos seleccionados e docetaxel são dissolvidos em clorofórmio num balão de fundo redondo. 0 balão é depois colocado em rotação sob vácuo (100 a 200 mbar, 40°C) até se formar uma película fina de lípidos. A película de lípidos é cuidadosamente seca a 40 °C sob vácuo máximo (3 a 5 mbar) durante aproximadamente 30 minutos. A película seca de lípidos é arrefecida num banho de gelo e é re-hidratada com uma solução arrefecida (4°C) de glicose ou trealose (pH 5-7) resultando numa suspensão de vesículas lipidicas multi-lamelares com uma concentração total de cerca de 10 a 20 mM. Uma vez formada a dispersão homogénea (após 15-20 de rotação) a dispersão lipossomal é extrudida (filtração sob pressão) preferivelmente a uma temperatura entre 4°C e 8°C 1-5 vezes através de membranas de policarbonato de dimensão apropriada, tipicamente entre 150 e 250 nm, opcionalmente seguido de 48 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ filtração estéril. A baixa temperatura durante o fabrico foi determinada como critica devido à maior estabilidade química do docetaxel e dos lípidos e devido à revelação de poder ser atingido um maior quociente de composto activo em relação aos lípidos (maior teor de docetaxel). A dispersão lipossomal formada é completamente caracterizada por HPLC, PCS e análise microscópica. 4.2 Preparação dos Lipossomas via Injecção de Etanol

As formulações lipossomais compreendendo docetaxel foram igualmente preparadas utilizando o processo de injecção de etanol tal como se segue: docetaxel e lípidos foram dissolvidos em etanol (ou outro solvente orgânico adequado) usualmente com uma concentração total de lípidos de cerca de 200-400 mM. Uma solução aquosa de um crio-protector, preferivelmente trealose a 10%, foi preparada a pH 5-7 e arrefecida a uma temperatura entre 4 e 8°C antes da injecção do solvente orgânico. A solução etanólica foi injectada (3-300 ml/min de velocidade de injecção) na solução de trealose arrefecida, vigorosamente agitada atingindo uma concentração final total de lípidos de 10 mM. Uma vez formada uma dispersão homogénea a dispersão lipossomal é extrudida (filtração sob pressão) preferivelmente a uma temperatura entre 4°C e 8°C 1-5 vezes através de membranas de policarbonato de dimensão apropriada , tipicamente entre 150 e 250 nm, opcionalmente seguido de filtração estéril. A baixa temperatura durante o fabrico foi determinada como crítica devido à maior estabilidade química do docetaxel e dos lípidos e devido à revelação de poder ser atingido um maior quociente de composto activo em relação aos lípidos (maior teor de docetaxel). A dispersão lipossomal formada é completamente caracterizada por HPLC, PCS e análise microscópica. 4.3 Variação do Teor de Docetaxel

Os lipossomas (10 mM de concentração total de lípidos, trealose a 10%) compreendendo DOTAP e DOPC são formados com diferentes teores de docetaxel. A composição geral é definida como 50% molar de DOTAp, (50-X)% molar de DOPC e X% molar de docetaxel onde o teor de docetaxel é variado de 3 a 13% 49 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ molar. A Tabela 15 lista formulações lipossomais de docetaxel e as suas características típicas, tais como tamanho médio lipossomal, distribuição de tamanho (PI), concentração de composto activo e lípidos (HPLC), existência de docetaxel extra-lipossomal (cristais de docetaxel) e a sua carga de superfície.

Tabela 15: Formulações lipossomais de docetaxel

Teor de Docetaxel Dimensão Lipossomal(PI) HPLC, Microscopia Potencial Zeta 3% molar 175 nm (0,20) de acordo com expectativa, sem cristais 65 mV 5% molar 168 nm (0,20) de acordo com expectativa, sem cristais 64 mV 7% molar 162 nm (0,24) de acordo com expectativa, sem cristais 60 mV 9% molar 166 nm (0,18) de acordo com expectativa, sem cristais 65 mV 11% molar 162 nm (0,20) de acordo com expectativa, sem cristais 62 mV 13% molar 162 nm (0,14) de acordo com expectativa, sem cristais 65 mV

Utilizando o processo de película de lípidos e o sistema DOTAP/DOPC, podem ser preparados lipossomas com docetaxel até 13%. É notável que, um maior teor de docetaxel pode ser incorporado na membrana lipossomal quando o fabrico ocorre a baixas temperaturas (4°C-8°C) quando comparado com temperaturas mais elevadas (temperatura ambiente, 40°C). O diâmetro médio dos lipossomas contendo docetaxel encontra-se entre 160 e 170 nm e o baixo valor de PI de ^0,2 indica uma distribuição de pequeno tamanho favorável. As concentrações determinadas (HPLC) estão de acordo com os valores teóricos. De acordo com a análise por HPLC o docetaxel, DOTAP e DOPC eram quimicamente estáveis durante o processo de fabrico a 4°C. Uma temperatura superior a 10°C durante o fabrico resultou na formação de produto de degradação de docetaxel tal como pode ser visto nos cromatogramas de HPLC. Todas as formulações foram verificadas por microscopia (lOx de ampliação) quanto aos agregados/cristais. Uma vez que o docetaxel é somente pouco solúvel em trealose ou água (~20 μΜ) a presença de cristais indicaria uma fracção significativa de docetaxel que não estaria implantada (solubilizada) na membrana lipossomal. Nenhuma das formulações investigadas 50 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ testou positivo para a presença de cristais de docetaxel. 0 potencial zeta (60-65 mV, Zetasizer 3000, Malvern) não se alterou com diferentes teores de docetaxel. 4.4 Variação do Teor de Docetaxel A liofilização dos lipossomas contendo docetaxel foi realizada com sucesso aplicando um procedimento tal como descrito anteriormente. Tal como representado na Tabela 16 a dimensão lipossomal não variou enquanto que o valor de PI (distribuição de tamanho) do respectivo liofilizado reconstituído é liqeiramente reduzido quando comparado com os da formulação não liofilizada.

Tabela 16: Efeito da Liofilização na Dimensão Lipossomal e Valor de PI

Teor de Docetaxel Dimensão Lipossomal (PI) antes de Liofilização após Liofilização 3% molar 175 nm (0,20) 171 nm (0,10) 5% molar 168 nm (0,20) 162 nm (0,08) 7% molar 162 nm (0,24) 166 nm (0,09) 9% molar 166 nm (0,18) 160 nm (0,08) 11% molar 162 nm (0,20) 156 nm (0,09) 13% molar 162 nm (0,14) 158 nm (0,07) A liofilização não apresenta influência negativa na estabilidade lipossomal. Tal como verificado por HPLC, os lípidos e docetaxel permaneceram quimicamente estáveis. 4.5 Determinação de Docetaxel não lipossomal

Foram realizados ensaios de centrifugação para determinar se existia algum docetaxel livre não-lipossomal nas formulações lipossomais de docetaxel. Estes ensaios foram realizados com tubos Centricon® (tubos de centrifugação com uma membrana semi-permeável que permite que pequenas moléculas passem retendo macro-moléculas). As formulações lipossomais (10 mM, trealose a 10%) baseadas em DOTAP e DOPC com 7, 11 e 13% molar de docetaxel foram centrifugadas a 4500g e a 4°C com tubos Centricon® (especificação da membrana de 30000 MWCO) . Após 30 min de centifugação o sobrenadante foi diluído com trealose com o volume que tinha sido obtido como permeado. As análises por HPLC encontram-se sumarizadas na Tabela 17. 51 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Tabela 17: Determinação de Docetaxel não-lipossomal (HPLC)

Teor de Docetaxel Sobrenadante Permeado Fracção não-lipossomal 7% molar 0,719 mM 0,026 mM 4% 11% molar 1,040 mM 0,038 mM 3% 13% molar 1,305 mM 0,059 mM 4%

Os resultados demonstram que o docetaxel pode ser incorporado na membrana lipossomal numa concentração de pelo menos 13% molar sem aumento da fracção de docetaxel não lipossomal. 4.6 Estabilidade Fisico-quimica das Formulações de Docetaxel

Uma formulação lipossomal contendo 5% molar de docetaxel foi utilizada para estudar a estabilidade fisico-quimica. Uma primeira experiência revelou que o teor de docetaxel na formulação não possui influência na estabilidade. Do mesmo modo não se verificou qualquer diferença para a formulação liquida (não liofilizada) e formulação liofilizada. A estabilidade em armazenamento a 4°C, 25°C e 40°C foi caracterizada por PCS (tamanho lipossomal e distribuição de tamanhos), medições de bloqueio de luz (dispositivo PAMAS), microscopia e HPLC. A estabilidade fisica é apresentada na Fig. 3. A todas as temperaturas, o tamanho lipossomal e distribuição de tamanhos não variou em 24 h.

Em principio, um maior número de partículas na formulação tal como medido por medições de bloqueio de luz (dispositivo PAMAS) indica uma fraca estabilidade física devido à agregação em curso de lipossomas resultando em maiores agregados (maiores que 1 pm). Usando uma configuração experimental adequada não se verificou tal aumento. A Fig. 4 mostra números de partículas que foram determinados durante a armazenagem a 25°C. A contagem de partículas após 24 h encontra-se na mesma gama quando comparada com o valor para as 8 h. A análise por HPLC da formulação em diferentes pontos de tempo revelou de modo claro uma boa estabilidade química a 4°C. A 40°C o aumento da degradação até 20% foi observado após armazenagem de 24 h. 52 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 4.7 Ensaios in Vitro A eficácia da formulação lipossomal de docetaxel é determinada in vitro analisando a diminuição da viabilidade celular em correlação com a concentração de composto activo. A concentração de composto activo à qual a viabilidade celular é inibida a 50% (IC5o) é utilizada como índice para o potencial inibitório. Células C-26 (linha celular do carcinoma do cólon do murino) e Ea.Hy 926 (linha celular endotelial humana transformada) são disseminadas a densidade constante (2xl04/cm2) em placas com 24 poços e cultivadas de um dia para o outro em condições de 5-5,5% C02, 37°C e -90% de humidade. No dia 1, o meio de cultura celular é substituído por uma mistura de meio fresco e uma série de 11 diluições consecutivas de composto activo é adicionada a cada poço (duplicados) para cobrir uma gama entre 0,1 e 1000 nM de concentração final de composto activo. Após 72 h, a viabilidade celular em cada poço é determinada medindo a actividade das desidrogenases mitocondriais (ensaio MTT). Em células viáveis o substrato MTT é convertido num corante azul impermeável às células (Formazan). Após lh o meio é removido, as células são lisadas com isopropanol/HCl 0,04% e a quantidade do azul de Formazan determinada como densidade óptica a um comprimento de onda de 550 nm (OD50nm) é quantificada num leitor ELISA. O ensaio é avaliado utilizando a análise de software Sigma Plot representando o valor médio O D 5 o nm em correlação com a respectiva concentração de composto activo. É calculada a curva de melhor ajuste com base na assunção do algoritmo de sigmóide duplo e o valor de IC50 é determinado de acordo com esta melhor curva de melhor ajuste com resultados tal como representados na Tabela 18.

Tabela 18: Valores de Ic50 para Taxotere e docetaxel incorporados em lipossomas

Formulação IC50 (C-26) IC50 (EA.hy 926) Taxotere® 5 nM 4 nM Formulação Lipossomal de Docetaxel 4 nM 7 nM

Os valores de IC50 revelam igual eficácia para o docetaxel formulado com Polisorbato 80 (Taxotere®, Aventis) e 53 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ formulação lipossomal de docetaxel (composição: DOTAP/DOPC/docetaxel 50:39:11) em ambas as linhas celulares, C-26 e EA.hy926. 4.8 Ensaios in Vitro (melanoma A-375 de ratinhos nus)

Materiais e métodos:

Ratinhos nus NMRI foram adquiridos a Elevage Janvier e alojados em jaulas isoladas ventiladas sob condições ambientais seguras (instalação SPF, 22°C, 30-70% humidade, 12 h ciclo luz/escuridão) com alimentos e água ad libitum. A concepção experimental foi revista e aprovada pelo governo local.

As células tumorais (linha celular melanoma A-375 humano, ATCC Nr: CRL-1619) foram desenvolvidas tal como descrito na folha de dados fornecida pela ATCC. As células tumorais (5xl06 em PBS) foram inoculadas s.c. no flanco dorsal direito dos ratinhos num volume de 50 μΐ no dia 0.

Os ratinhos foram distribuídos por grupos experimentais (8 animais por jaula), alojados e manuseados (incluindo monitorização do ganho de peso corporal) pelo menos cinco dias antes da inoculação do tumor (= dia -6 a 0). 0 tratamento inicia-se após os tumores atingirem um volume de aproximadamente 100 mm3. Os fármacos e as preparações lipossomais foram administrados através de cinco injecções iv, todos os outros dias em doses equivalentes. As preparações lipossomais foram preparadas tal como previamente descrito. As soluções foram lentamente administradas num

volume de ~5 μΐ/g de peso corporal. Os animais foram monitorizados clinicamente durante todo o ensaio e pelo menos durante uma semana após o tratamento terminar. A monitorização da dimensão do tumor foi realizada três vezes por semana após preparação e antes da aplicação durante o período de tratamento (pelo menos uma semana). As dimensões do tumor foram medidas com compasso de calibre e a dimensão do tumor foi calculada de acordo com a fórmula seguinte: V = Π L W2 / 6 (L = maior comprimento, W = largura do eixo perpendicular). O peso corporal dos animais individuais foi monitorizado pelo menos duas vezes durante o período de 54 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ manuseamento (por exemplo dia -6 e 0), após a inoculação do tumor e após o inicio do tratamento para todos os grupos. Sangue EDTA foi recolhido a partir de plexo retrobulbar em guatro pontos diferentes: durante o manuseamento (dia -3), preparação do tumor (dia 14) e no meio do tratamento (~dia 19) em 4 animais de todos os grupos de tratamento para hematologia. O número de glóbulos vermelhos e brancos e plaguetas foram determinados utilizando um contador de células automatizado (Abbott Cell Dyn 3500). Os resultados são apresentados na Fig. 5.

Enguanto gue os tumores no grupo de controlo apresentaram um rápido e progressivo crescimento tumoral, o LipoDoc™ (DOTAP:DOPC:docetaxel 50:39:11)apresentou uma forte redução na taxa de crescimento tumoral, o Taxotere® reduziu o crescimento tumoral apenas de forma limitada.

Tabela 19: Grupos experimentais e dose

Grupo Formulação Dose [mg/kg] N° de ratinhos 0 Trealose 10% - 8 1 LipoDoc” 5 8 2 Taxotere® 5 8 5. Exemplo 5: Paclitaxel Lipossomal (5% molar) 5.1 Preparação de lipossomas através de injecção de etanol

Uma formulação lipossomal compreendendo 5% molar de paclitaxel foi preparada utilizando o processo da injecção de etanol tal como se segue: paclitaxel e lipidos com uma razão molar 50:45:5 DOTAP/DOPC/paclitaxel foram dissolvidos em etanol (ou outro solvente orgânico adequado) usualmente com uma concentração total de lipidos de 200-400 mM. Uma solução aquosa de um crio-protector, preferivelmente trealose a 10%, pH 5-7, foi preparada e arrefecida a uma temperatura entre 4 e 8°C, preferivelmente 4°C, antes da injecção do solvente orgânico. A solução etanólica foi injectada (3-300 ml/min de velocidade de injecção) em solução de trealose arrefecida, vigorosamente agitada. Assim que se forma uma dispersão homogénea a dispersão lipossomal é extrudida (filtração sob pressão) preferivelmente a temperaturas entre 4°C e 8°C, 55 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ preferivelmente 4°C, 1-5 vezes através de membranas de policarbonato de tamanho apropriado, tipicamente entre 150 e 250 nm, opcionalmente seguida de filtração estéril. Além da temperatura de fabrico a cerca de 4°C as temperaturas de 25°C e 40°C foram avaliadas quanto ao seu efeito na qualidade do produto. As dispersões lipossomais formadas foram completamente caracterizadas por HPLC, pCS e análise microscópica. 5.2 Efeito da Temperatura no Processo de Preparação

Foi efectuado controlo de processo durante o procedimento de preparação após a injecção de etanol, após extrusão e após liofilização.

Após injecção de etanol: A todas as três temperaturas a injecção de etanol resultou em lipossomas com um tamanho lipossomal de cerca de 220 nm e uma distribuição de tamanho grande (PI) de cerca de 0,4-0,6 (de acordo com as medições PCS) . A análise por HPLC revelou degradação do paclitaxel quando formulado a 40°C enquanto que a 4 e 25°C a estabilidade química de cada constituinte foi comprovada. A microscopia revelou pequena quantidade de cristais de paclitaxel a 40°C mas não a 4 e 25°C.

Após extrusão: A 40°C ocorreram dificuldades durante a extrusão devido a entupimento das membranas. A substituição da membrana entupida não resolveu o problema. A microscopia da solução lipossomal que não passou a membrana revelou uma quantidade aumentada de cristais de paclitaxel não lipossomal que obviamente bloquearam a membrana. A extrusão a 40°C não era viável. Não era este o caso quando a extrusão era realizada a temperaturas inferiores. Nesse caso a análise por HPLC deu concentrações de acordo com as expectativas sem qualquer perda de material pelo processo de extrusão (5 vezes, membrana de 0,2 pm). Os dados de PCS após extrusão a 4 e 25°C eram comparáveis: tamanho lipossomal de cerca de 170 nm e distribuição de tamanho pequeno (PI) de cerca de 0,1-0,2.

Após liofilização: a liofilização da formulação preparada a 4°C e 25°C foi realizada com sucesso utilizando 56 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ um procedimento descrito no exemplo e caracterizado por HPLC, PCS e análise microscópica. 5.3 Ensaios in Vitro 5.3.1 Eficácia Terapêutica de Lipopac™ no melanoma A-375 de ratinhos nus

Materiais e métodos:

Ratinhos nus NMRI foram adquiridos a Elevage Janvier e alojados em jaulas isoladas ventiladas sob condições ambientais seguras (instalação SPF, 22°C, 30-70% humidade, 12h ciclo luz/escuridão) com alimentos e água ad libitum. A concepção experimental foi revista e aprovada pelo governo local.

As células tumorais (linha celular melanoma A-375 humano, ATCC Nr: CRL-1619) foram desenvolvidas tal como descrito na folha de dados fornecida pela ATCC. As células tumorais (5xl06 em PBS) foram inoculadas s.c. no flanco dorsal direito dos ratinhos num volume de 50 μΐ no dia 0.

Os ratinhos foram distribuídos por grupos experimentais (8 animais por jaula), alojados e manuseados (incluindo monitorização do ganho de peso corporal) pelo menos cinco dias antes da inoculação do tumor (= dia -6 a 0) . O tratamento inicia-se após os tumores atingirem um volume aproximadamente de 100 mm3. Os fármacos e as preparações lipossomais foram administrados através de injecções iv, três vezes por semana (Seg, Qua, Sex) durante as seguintes três semanas em doses equivalentes. As preparações lipossomais foram preparadas tal como previamente descrito. As soluções foram lentamente administradas num volume de ~10 μΐ/g de peso corporal.

Os animais foram monitorizados clinicamente durante todo o ensaio e pelo menos durante uma semana após o tratamento terminar. A monitorização da dimensão do tumor foi realizada três vezes por semana após preparação, antes da aplicação, durante o período de tratamento e durante o período de recuperação (pelo menos uma semana). As dimensões do tumor foram medidas com compasso de calibre e a dimensão do tumor 57 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ foi calculada de acordo com a fórmula seguinte: V = Π L W2 / 6 (L = maior comprimento, W = largura do eixo perpendicular). O peso corporal dos animais individuais foi monitorizado pelo menos duas vezes durante o periodo de manuseamento (por exemplo dia -6 e 0), após a inoculação do tumor, após o inicio do tratamento e durante o periodo de recuperação (pelo menos uma semana) para todos os grupos. Sangue EDTA foi recolhido a partir de plexo retrobulbar em quatro pontos diferentes: durante o manuseamento (dia -3), preparação do tumor (dia 7), no meio do tratamento (~dia 21) e no final do periodo de recuperação (dia 28) em 4 animais de todos os grupos de tratamento para hematologia. 0 número de glóbulos vermelhos e brancos e plaquetas foram determinados utilizando um contador de células automatizado (Abbott Cell Dyn 3500).

Enquanto os tumores no grupo de controlo apresentaram um rápido e progressivo crescimento tumoral, o LipoDoc™ (DOTAP:DOPC:paclitaxel 50:45:5) apresentou uma forte redução na taxa de crescimento tumoral, o Taxol® reduziu o crescimento tumoral apenas de forma limitada (Tabela 20, Fig. 6).

Tabela 20: Grupos experimentais e dose

Grupo Formulação Dose [mg/kg] N° de ratinhos 0 Trealose 10% - 8 1 LipoPac” 5 8 2 Taxol® 5 8 5.3.2 Eficácia Terapêutica de Lipopac™ no melanoma B-16 de ratinhos C57/BL6

Materiais e métodos:

Ratinhos C57/Black6 foram adquiridos a Charles River e alojados em jaulas isoladas ventiladas sob condições ambientais seguras (instalação SPF, 22°C, 30-70% humidade, 12h ciclo luz/escuridão) com alimentos e água ad libitum. A concepção experimental foi revista e aprovada pelo governo local.

As células tumorais (linha celular melanoma B-16 humano: CRL-6322) foram desenvolvidas tal como descrito na folha de 58 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ dados fornecida pela ATCC. As células tumorais (5xl06 em PBS) foram inoculadas s.c. no flanco dorsal direito dos ratinhos num volume de 50 μΐ no dia 0.

Os ratinhos foram distribuídos por grupos experimentais (8 animais por jaula), alojados e manuseados (incluindo monitorização do ganho de peso corporal) pelo menos cinco dias antes da inoculação do tumor (= dia -6 a 0) . As preparações lipossomais foram preparadas tal como anteriormente descrito. As soluções foram lentamente administradas num volume de ~10 μΐ/g de peso corporal.

Os animais foram monitorizados clinicamente durante todo o ensaio. As dimensões do tumor foram medidas com compasso de calibre e a dimensão do tumor foi calculada de acordo com a fórmula seguinte: V = Π L W2 / 6 (L = maior comprimento, W = largura do eixo perpendicular). O peso corporal dos animais individuais foi monitorizado pelo menos duas vezes durante o período de manuseamento (por exemplo dia -6 e 0), após a inoculação do tumor, e após o início do tratamento de todos os grupos. Sangue EDTA foi recolhido a partir de plexo retrobulbar em quatro pontos diferentes: durante o manuseamento (dia -3), preparação do tumor (dia 6), e no meio do tratamento (~dia 14) de 4 animais de todos os grupos de tratamento para hematologia. 0 número de glóbulos vermelhos e brancos e plaquetas foram determinados utilizando um contador de células automatizado (Abbott Cell Dyn 3500).

Enquanto os tumores no grupo de controlo apresentaram um rápido e progressivo crescimento tumoral, o LipoDoc™ (DOTAP: DOPC:paclitaxel 50:45:5) apresentou uma forte redução na taxa de crescimento tumoral, o Taxol® reduziu o crescimento tumoral apenas de forma limitada (Tabela 21, Fig. 7).

Tabela 21: Grupos experimentais e dose

Grupo Formulação Dose [mg/kg] N° de ratinhos 0 Trealose 10% / 8 1 LipoPac” 5 8 2 Taxol® 5 8 59 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ

Referências 1. Sharma, A. and R.M. Straubinger, Novel Taxol Formulations Preparation and Characterization of Taxol-Containing

Liposomes. Pharmaceutical Research, 1994. 11(6): pp. 889-896. 2. Thurston, G., et al., Cationic liposomes target angiogenic endothelial cells in tumors and chronic inflammation in mice. J Clin Invest, 1998. 101(7): pp. 1401-13. 3. Campbell, R.B., S.V. Balasubramanian, and R.M.

Straubinger, Influence of cationic lipids on the stability and membrane properties of paclitaxel-containing liposomes. J Pharm Sei, 2001. 90(8): pp. 1091-105. 4. Dordunoo, S. and H.M. Burt, Solubility and Stability of taxol: effects of buffers and cyclodextrins. International Journal of Pharmaceutics, 1996. 133: pp. 191-201. 5. Vernooij, E., et al., Chemical hydrolysis of DOTAP and DOPE in a liposomal environment. Journal of Controlled Release, 2002. 79(1-3): pp. 299-303. 6. Sharma, A., E. Mayhew, and R.M. Straubinger, Antitumor effect of taxol-containing liposomes in a taxol-resistant murine tumor model. Câncer Res, 1993. 53(24): pp. 5877-81. 7. Grit, M., Crommelin, D.J.A., Chemical stability of liposomes: implications for their physical stability.

Chemistry and Physics of Lipids, 1993. 64: pp. 3-18. 8. N.J. Zuidam, D.J.A Crommelin, Chemical Hydrolysis of

Phospholipids. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1995. 84: pp. 1113 - 1119. 9. M. Sefkow, M. Kiffe, G. Hõfle, Derivatization of the C12-C13 functional groups of epothilones A, B and C. Bioorg. & Medicinal Chem. Lett., 1998, 8: 3031-3036. 10. A. Regueiro-Ren et al., SAR and pH Stability of Cyano-Substituted Epothilones. Org. Lett. 2002, 4: 3816-3818. 60 ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 11. K.C. Nicolaou, A. Ritzen, K. Namoto, Recent developments in the chemistry, biology and medicine of the epothilones. Chem. Comm. 2001, 1523-1535. 12. F.Y.F. Lee et al., BMS-247550 : A novel epothilone analog with a mode of action similar to paclitaxel but possessing superior antitumor activity. Clin. Câncer Res. 2001, 7: 1429-1437. 13. T.-C- Chou et al., The synthesis, discovery and development of a highly promising class of microtubule stabilization agents. PNAS 2001, 98: 8113-8118. 14. K.-H. Altmann, M. Wartmann, T. 0'Reilly. Epothilones and related structures. Biochim. Et Biophys. Acta 2000, 1470: M79-M91. 15. S.J. Stachel et al., On the total synthesis and preliminary biological evaluations of 15(R) and 15(S) Aza-dEpoB. Org. Lett. 2000, 2: 1637-1639.

Lisboa, 2013-07-02

Claims (14)

1. ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Preparação lipossomal catiónica que compreende pelo menos um lípido catiónico de pelo menos 30% molar, opcionalmente pelo menos um outro anfifílico de até 69,9% molar, um taxano de pelo menos 2% molar e um agente estabilizante de 0,1% (m/v) a 20% (m/v), caracterizada por a referida preparação lipossomal ser física e quimicamente estável numa solução aquosa durante pelo menos 12 horas a 2 a 8°C e pelo menos 4 horas a temperatura ambiente e caracterizada por possuir um valor de pH entre 3 e 6,5.
2. 2. Preparação de acordo com a reivindicação 1, em que o taxano é seleccionado de entre docetaxel ou qualquer seu derivado lipófilo.
3. 3. Preparação de acordo com a reivindicação 1, em que o taxano é seleccionado de entre paclitaxel ou qualquer seu derivado lipófilo.
4. 4. Preparação de acordo com a reivindicação 1, em que o taxano é succinil-paclitaxel de pelo menos 3% molar.
5. 5. Preparação de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, que compreende menos de 5% de produtos de degradação do referido composto activo.
6. 6. Preparação de acordo com a reivindicação 5, que compreende menos de 5% de produtos de degradação de paclitaxel, em que os referidos produtos de degradação são Bacatina III ou 7-epi-taxol.
7. 7. Preparação de acordo com as reivindicações precedentes, que compreende um agente estabilizante na gama de 5% (m/v) a 15% (m/v).
8. 8. Preparação de acordo com as reivindicações precedentes, que compreende lipossomas com um tamanho médio de partícula de 50 nm a 400 nm, preferivelmente de cerca de 100 nm a cerca de 300 nm.
9. 9. Preparação de acordo com as reivindicações precedentes, que compreende lipossomas que possuem um ΕΡ 2 108 362/ΡΤ 2/2 potencial zeta positivo numa solução de KC1 0,05M a cerca de pH 7,5 à temperatura ambiente.
10. 10. Preparação de acordo com as reivindicações precedentes, caracterizada por possuir um pH entre 4 e 6,5.
11. 11. Preparação de acordo com as reivindicações precedentes, que compreende ácido citrico.
12. 12. Composição farmacêutica que compreende uma preparação lipossomal de acordo com qualquer das reivindicações 1-11, juntamente com um suporte, diluente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
13. 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, para utilização no tratamento de doenças associadas com actividade angiogénica aumentada.
14. 14. Utilização de uma preparação de acordo com as reivindicações 1-11, para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças associadas com actividade angiogénica aumentada. Lisboa, 2013-07-02