JP2019048851A - リポソームナノ粒子中で使用するための修飾薬物 - Google Patents
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Abstract
【課題】リポソームナノ粒子中で使用するための修飾薬物の提供。
【解決手段】リポソームナノ粒子キャリアに充填させることに適した薬物誘導体が本明細書に提供される。いくつかの好ましい局面では、誘導体は、水溶性の低い薬物を、LNの膜内外のpH勾配またはイオン勾配によって、薬物をLNの水性の内側に能動的に充填させやすくする弱塩基部分で誘導体化されたものを含む。弱塩基部分は、場合により、リポソームの膜の内側の単一層に薬物を能動的に充填させやすくする親油性ドメインを含んでいてもよい。有益には、薬物誘導体のLN配合物は、溶解度が向上し、毒性が低下し、有効性が増加、および/または、対応する遊離薬物と比べて他の利点を有する。
【選択図】図10
【解決手段】リポソームナノ粒子キャリアに充填させることに適した薬物誘導体が本明細書に提供される。いくつかの好ましい局面では、誘導体は、水溶性の低い薬物を、LNの膜内外のpH勾配またはイオン勾配によって、薬物をLNの水性の内側に能動的に充填させやすくする弱塩基部分で誘導体化されたものを含む。弱塩基部分は、場合により、リポソームの膜の内側の単一層に薬物を能動的に充填させやすくする親油性ドメインを含んでいてもよい。有益には、薬物誘導体のLN配合物は、溶解度が向上し、毒性が低下し、有効性が増加、および/または、対応する遊離薬物と比べて他の利点を有する。
【選択図】図10
Description
(関連する出願との相互参照)
本願は、米国仮特許出願第61/055,929号(2008年5月23日出願)の利益を主張する。この仮特許出願は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
本願は、米国仮特許出願第61/055,929号(2008年5月23日出願)の利益を主張する。この仮特許出願は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
(発明の分野)
本発明は、一般的に、リポソームに封入されにくいか、またはリポソームに封入することができない薬物を化学的に修飾し、膜内外のpH勾配またはイオン勾配を示すリポソームナノ粒子(LN)に有効に充填させることが可能な誘導体を形成する方法に関する。いくつかの好ましい局面では、この誘導体は、LNから放出されると、遊離薬物に容易に変換されるプロドラッグである。また、本発明は、本発明の方法にしたがって製造した薬物誘導体、このような誘導体を含むLN配合物および医薬組成物、これらを製造する方法および使用する方法に関する。
本発明は、一般的に、リポソームに封入されにくいか、またはリポソームに封入することができない薬物を化学的に修飾し、膜内外のpH勾配またはイオン勾配を示すリポソームナノ粒子(LN)に有効に充填させることが可能な誘導体を形成する方法に関する。いくつかの好ましい局面では、この誘導体は、LNから放出されると、遊離薬物に容易に変換されるプロドラッグである。また、本発明は、本発明の方法にしたがって製造した薬物誘導体、このような誘導体を含むLN配合物および医薬組成物、これらを製造する方法および使用する方法に関する。
既にある多くの薬物開発戦略は、水溶性であり、生体利用可能な「新薬の開発につながる(druggable)」化合物の発見に基づいて予測されている。結果として、新しく開発された化合物のうち、溶解性が低く、バイオアベイラビリティが限定的なものは、治療性能が有望なものであっても、ほとんどが次の段階に進むことはない。
新薬の開発につながらない化合物の限定事項を克服するために、種々の薬物配合物および送達方法が開発されている。リポソームナノ粒子(LN)は、薬物を全身(静脈内)投与するための主要な薬物送達システムであり、多くのリポソーム薬物が現時点で上市されているか、または治験段階にある。LNは、一般的に、毒性が低く、血清での半減期、バイオアベイラビリティ、浸透性などを向上させるような広範囲の有益な薬学的性質を与えるように設計することができる。LN配合物は、従来の(遊離)形態で投与すると、水溶性が低いこと、血清での半減期が短いこと、正常な組織にも病気の組織にも同様に無差別に蓄積することが原因で効能が限定されている化学療法剤と組み合わせると特に有効である。
長期間にわたって循環するLNは、典型的には、100nm以下の直径を有しており、長期間にわたって血液循環中にとどまる。長期間にわたって循環するLNの寿命が長いことによって、LNを、感染、炎症、腫瘍の成長部位、または他の疾患に関連する薬物標的に、またはその周囲に蓄積させることができる。この蓄積は、上述の領域の脈管の局所構造によって促進され(「漏れがある(leaky)」脈管と呼ばれ)、この構造は、リポソームが通り抜けて治療標的に到達可能な大きな穴を特徴とする(非特許文献1、非特許文献2)。したがって、化学療法剤または他の薬物と、長期間にわたって循環するLNとの安定な会合によって、治療標的に到達する薬物の量を増加やし、LNから、治療濃度の薬物が制御(持続)放出され、標的がこれにさらされる時間が延び、健康な標的外の組織への蓄積が減り、これによって、有効性が上がり、毒性が下がる。固体腫瘍の場合、化学療法剤のLN配合物は、動物モデルおよび臨床試験の両方において、治療指数、忍容性、有効性および他の性質を顕著に向上させた。
LNの技術を目的の薬物に適用するには、薬物が、リポソームキャリアに充填され、治療標的で、または治療標的付近で適切な速度で放出されるように、薬物を修正する必要がある。薬物がリポソームに充填される性質は、薬物、リポソームの膜、リポソームの内部環境の化学的性質に依存する。一般的に、水溶性の薬物も脂溶性の薬物も、水溶性薬物と、リポソームの膜の内側に並ぶ極性リン脂質および/または水性のリポソームの内側との会合、および脂溶性薬物と脂質二重層との会合に関連する受動的な充填(passive loading)技術を用い、リポソームに充填させることができる。しかし、多くの有用な薬物は、受動的な充填方法に修正できないような、より複雑な溶解性プロフィールを有する。
溶解性の低い薬物をリポソームに保持させる1つのアプローチは、受動的な充填を容易にするように、薬物を修飾することである。例えば、特許文献1および関連する刊行物に記載されているように、リポソーム配合物は、タキサンに、負の電荷を有する「加水分解促進基」(HPG)を含有する炭化水素鎖を付加させて修飾することによって、脂質二重層への溶解性が向上した脂肪酸誘導体を形成させることが開発されている。しかし、受動的な充填方法は、一般的に、充填効率が悪く、薬物の保持性および放出性が低いリポソームが産出してしまい、得られた配合物の有用性も限定的なものとなる。
受動的な充填に関連する制限事項を克服するために、薬物を高い効率で充填し、とどまらせることが可能な、いくつかの能動的な充填技術が開発されている。特に有効なアプローチは、リポソームの膜を通じてpH勾配を作り出し、酸性のリポソームの内側を有するリポソームと、リポソームの内側よりもpHが高い外側環境(例えば、中性pH)とを作り出すことによって、弱塩基性の薬物を保持させることを含む(例えば、非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5)。弱塩基性薬物は、電荷が中性の(膜透過性の)形態および帯電した/プロトン化した(膜不透過性の)形態といった、2種類の同時に存在する(平衡状態の)形態で存在し得る。中性形態の薬物は、内側と外側の濃度が等しくなるまで、リポソーム膜を通って拡散する傾向があるだろう。しかし、酸性の内側環境によって、この中性形態がプロトン化し、それによって、この化合物が、リポソームの内側に捕捉され、取り込みが続く方向に進む。別のアプローチは、金属イオンの勾配を利用することを含む(例えば、非特許文献6)。リポソームの内側で金属イオン濃度が高く、外側環境には、金属イオンは存在しない。この保持方法は、pH勾配による技術と基本的には同じ原理による。弱塩基薬物の中性形態は、膜を通って浸透することができ、薬物−金属イオン複合体を形成することによって、リポソームの水性の内側にとどまる。この場合、薬物−金属イオン複合体の形成によって、薬物の連続的な取り込みが進む。
ある種の抗癌剤および抗菌剤(例えば、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン)は、pH勾配による能動的な充填技術を用い、LNに簡単に保持させ、安定してとどまらせることができる(例えば、非特許文献7、非特許文献8;非特許文献9)。しかし、多くの臨床的に重要な薬物は、弱塩基ではなく、したがって、このような能動的な充填技術に合うように修正することができない(例えば、非特許文献10)。例えば、特定のタキサン系薬物(例えば、パクリタキセル、ドセタキセル)、ポドフィロトキシン誘導体(例えば、エトポシド)を含む多くの抗癌剤は、標準的な方法を用いて、LNに簡単には配合することができない。
タキソテール(登録商標)(ドセタキセル)およびタキソール(登録商標)(パクリタキセル)は、市場で最も広範囲に処方されている抗癌剤であり、薬物動態がきわめて変わりやすい(ドセタキセル)、薬物動態が線形ではない(パクリタキセル)、配合物のビヒクル(Cremophor EL、Tween 80)と関連する重篤な過敏反応、投薬量を限定する骨髄抑制および神経毒性を含む、薬理学および毒性学での多くの懸案事項と関連がある。タキソテール(登録商標)の場合、薬物動態が非常に変わりやすいことによって、毒性および有効性に顕著な変動を生じ、結合していない薬物の全身暴露と関連する血液毒性にも顕著な変動を生じる。それに加え、タキサンの治療活性は、腫瘍細胞への薬物暴露時間に伴って増加するため、市販のタキサン配合物では、投薬量を限定する毒性のため、治療への有望性もかなり限定されてしまっている。
したがって、広範囲の薬物をLNとして配合することを可能にし、したがって、リポソーム送達技術の利点を実現することが可能な戦略が、当該技術分野で必要とされている。
Jain,Microcirculation、4:1−23(1997)
Hobbsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4607−4612(1998)
Maurer,N.、Fenske,D.、およびCullis,P.R.(2001)Developments in liposomal drug delivery systems.Expert Opinion in Biological Therapy 1、923−47
Cullisら、Biochim Biophys Acta.、1331:187−211(1997)
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Cheung BC、Sun TH、Leenhouts JM、Cullis PR:Loading of doxorubicin into liposomes by forming Mn2+−drug complexes.Biochim Biophys Acta(1998)1414:205−216
Drummondら、Pharmacol.Rev.、51:691−743(1999)
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Sempleら、J.Pharm.Sci.、94(5):1024−38(2005)
Soepenbergら、European J.Cancer、40:681−688(2004)
一局面では、式Iの薬物誘導体
が提供され、式中、
Dは、薬物であり;
nは、1、2または3であり;
Zは、式IIのリポソーム可溶化単位であり
ここで、
[L]は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
[S]は、
C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル(それぞれハロ;C1〜C10アルキル;シクロアルキル;−YR2からなる群より選択される1つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
−YR2で任意選択的に1箇所以上置換されたC1〜C10ヘテロアルキル
(ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり;
[N]は、一般式IIIの可溶化ドメイン
であり、式中、
RおよびR’は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール;プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか;または
RおよびR’は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。
ある局面では、[N]は、少なくとも約5.5のpKaを有する。
さらなる局面では、[N]は、約12.0以下のpKaを有する。
ある局面では、薬物誘導体は、水性の内側を有するリポソームナノ粒子に能動的に充填させるのに適している。
さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の水性の内側に、能動的に充填させるのに適している。ある局面では、リポソームナノ粒子の水性の内側は、その外側媒体よりも酸性のpHを有している。さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の水性の内側で、プロトン化されている。
他の局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の膜内にあるか、リポソームナノ粒子の膜に安定して会合するように、能動的に充填させるのに適している。これらの局面のうちいくつかでは、[N]は、式IVaまたはIVbの基から選択される:
〔式中、
Aは、カルボニル、メチレン、NR−C=O(Rは、HまたはC1〜C5アルキルである)からなる群より選択され;
R1およびR2は、独立して、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、C2〜C30アルケニル、C2〜C30アルキニルからなる群より選択され;
R3およびR4は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか;または
R3およびR4は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
また、本明細書に提示されている薬物誘導体のリポソームナノ粒子配合物も、本明細書で提供される。ある局面では、リポソームナノ粒子配合物は、水性の内側を有するリポソームナノ粒子に、薬物誘導体を能動的に充填させることによって形成される。
さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の膜内にある。ある局面では、リポソームナノ粒子の水性の内側は、その外側媒体よりも酸性のpHを有する。さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の水性の内側で、プロトン化されている。
さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の膜内にあるか、リポソームナノ粒子の膜に安定して会合している。さらなる局面では、[N]は、式IVaまたはIVbの群から選択される:
〔式中、
Aは、カルボニル、メチレン、NR−C=O(Rは、HまたはC1〜C5アルキルである)からなる群より選択され;
R1およびR2は、独立して、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、C2〜C30アルケニル、C2〜C30アルキニルからなる群より選択され;
R3およびR4は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか;または
R3およびR4は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
別の局面では、本明細書に提示した薬物誘導体のリポソームナノ粒子配合物と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
さらなる局面では、薬物をLNに保持させやすくするために、薬物を修飾する方法が本明細書で提供され、この方法は、式IIのリポソーム可溶化単位(Z)
〔式中、
[L]は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
[S]は、
C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル(それぞれハロ;C1〜C10アルキル;シクロアルキル;−YR2からなる群より選択される1つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
−YR2で任意選択的に1箇所以上置換されたC1〜C10ヘテロアルキル
(ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり;
[N]は、一般式IIIの可溶化ドメイン
であり、式中、
RおよびR’は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール;プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか;または
RおよびR’は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
を薬物に接合させる工程を含む。
さらに追加の局面では、薬物をリポソームナノ粒子に保持させる方法が本明細書で提供され、この方法は、式IIのリポソーム可溶化単位(Z)を前記薬物に接合させ、薬物誘導体を形成させる工程と;水性の内側を有するリポソームナノ粒子に、前記薬物誘導体を能動的に充填させる工程とを含み、
ここで、
式IIは、
ここで、
式IIは、
であり、
[L]は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
[S]は、
C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル(それぞれハロ;C1〜C10アルキル;シクロアルキル;−YR2からなる群より選択される1つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
−YR2で任意選択的に1箇所以上置換されたC1〜C10ヘテロアルキル
(ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり;
[N]は、一般式IIIの可溶化ドメイン
であり、式中、
RおよびR’は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール;プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか;または
RおよびR’は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。
ある局面では、薬物誘導体を、リポソームナノ粒子の水性の内側に、能動的に充填させる。さらなる局面では、リポソームナノ粒子の水性の内側は、その外側媒体よりも酸性のpHを有する。さらなるそれ以外の局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の水性の内側で、プロトン化されている。
ある局面では、薬物誘導体を、リポソームナノ粒子の膜内にあるか、リポソームナノ粒子の膜に安定して会合するように、能動的に充填させる。さらなる局面では、[N]は、式IVaまたはIVbの基である:
〔式中、
Aは、カルボニル、メチレン、NR−C=O(Rは、HまたはC1〜C5アルキルである)からなる群より選択され;
R1およびR2は、独立して、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、C2〜C30アルケニル、C2〜C30アルキニルからなる群より選択され;
R3およびR4は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか;または
R3およびR4は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
さらに別の局面では、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を、治療が必要な患者に投与する工程を含む、ある疾患または状態を治療する方法が提供される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
式Iの薬物誘導体:
〔式中、
Dは、薬物であり;
nは、1、2または3であり;
Zは、式IIのリポソーム可溶化単位であり
ここで、
[L]は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
[S]は、
C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル(それぞれハロ;C1〜C10アルキル;シクロアルキル;−YR2からなる群より選択される1つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
−YR2で任意選択的に1箇所以上置換されたC1〜C10ヘテロアルキル
(ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり;
[N]は、一般式IIIの可溶化ドメイン
であり、式中、
RおよびR’は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール;プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか;または
RおよびR’は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
(項目2)
[N]が、少なくとも約5.5のpKaを有する、項目1に記載の薬物誘導体。
(項目3)
[N]が、約12.0以下のpKaを有する、項目1に記載の薬物誘導体。
(項目4)
水性の内側を有するリポソームナノ粒子に能動的に充填させるのに適した、項目1に記載の薬物誘導体。
(項目5)
前記リポソームナノ粒子の水性の内側に、能動的に充填させるのに適した、項目4に記載の薬物誘導体。
(項目6)
前記リポソームナノ粒子の水性の内側が、その外側媒体よりも酸性のpHを有する、項目5に記載の薬物誘導体。
(項目7)
前記薬物誘導体が、前記リポソームナノ粒子の膜内にあるか、前記リポソームナノ粒子の膜に安定して会合するように、能動的に充填させるのに適した、項目4に記載の薬物誘導体。
(項目8)
[N]が、式IVaまたはIVbの基から選択される、項目7に記載の薬物誘導体、
〔式中、
Aは、カルボニル、メチレン、NR−C=O(Rは、HまたはC1〜C5アルキルである)からなる群より選択され;
R1およびR2は、独立して、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、C2〜C30アルケニル、C2〜C30アルキニルからなる群より選択され;
R3およびR4は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか;または
R3およびR4は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
(項目9)
項目1に記載の薬物誘導体のリポソームナノ粒子配合物。
(項目10)
水性の内側を有するリポソームナノ粒子に、前記薬物誘導体を能動的に充填させることによって形成される、項目9に記載のリポソームナノ粒子配合物。
(項目11)
前記薬物誘導体が、前記リポソームナノ粒子の水性の内側にある、項目10に記載のリポソームナノ粒子配合物。
(項目12)
前記リポソームナノ粒子の水性の内側が、その外側媒体よりも酸性のpHを有する、項目11に記載のリポソームナノ粒子配合物。
(項目13)
前記薬物誘導体が、前記リポソームナノ粒子の膜内にあるか、前記リポソームナノ粒子の膜に安定して会合している、項目10に記載のリポソームナノ粒子配合物。
(項目14)
[N]が、式IVaまたはIVbの基である、項目13に記載のリポソームナノ粒子配合物、
〔式中、
Aは、カルボニル、メチレン、NR−C=O(Rは、HまたはC1〜C5アルキルである)からなる群より選択され;
R1およびR2は、独立して、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、C2〜C30アルケニル、C2〜C30アルキニルからなる群より選択され;
R3およびR4は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか;または
R3およびR4は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
(項目15)
項目9に記載のリポソームナノ粒子配合物と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
(項目16)
薬物をLNに充填させやすくするために薬物を修飾する方法であって、該方法は、
式IIのリポソーム可溶化単位(Z)
〔式中、
[L]は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
[S]は、
C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル(それぞれハロ;C1〜C10アルキル;シクロアルキル;−YR2からなる群より選択される1つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
−YR2で任意選択的に1箇所以上置換されたC1〜C10ヘテロアルキル
(ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるスペーサーであり;
[N]は、一般式IIIの可溶化ドメイン
であり、式中、
RおよびR’は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール;プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか;または
RおよびR’は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
を前記薬物に接合させる工程を含む、方法。
(項目17)
薬物をリポソームナノ粒子に充填させる方法であって、該方法は、
式IIのリポソーム可溶化単位(Z)を前記薬物に接合させ、薬物誘導体を形成させる工程と;
水性の内側を有するリポソームナノ粒子に、前記薬物誘導体を能動的に充填させる工程とを含み、
ここで、
式IIは、
であり、
[L]は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
[S]は、
C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル(それぞれハロ;C1〜C10アルキル;シクロアルキル;−YR2からなる群より選択される1つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
−YR2で任意選択的に1箇所以上置換されたC1〜C10ヘテロアルキル
(ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり;
[N]は、一般式IIIの可溶化ドメイン
であり、式中、
RおよびR’は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール;プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか;または
RおよびR’は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい、方法。
(項目18)
前記薬物誘導体を、前記リポソームナノ粒子の水性の内側に、能動的に充填させる、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記リポソームナノ粒子の水性の内側が、その外側媒体よりも酸性のpHを有する、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記薬物誘導体を、前記リポソームナノ粒子の膜内にあるか、前記リポソームナノ粒子の膜に安定して会合するように、能動的に充填させる、項目18に記載の方法。
(項目21)
[N]が、式IVaまたはIVbの基である、項目20に記載の方法。
〔式中、
Aは、カルボニル、メチレン、NR−C=O(Rは、HまたはC1〜C5アルキルである)からなる群より選択され;
R1およびR2は、独立して、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、C2〜C30アルケニル、C2〜C30アルキニルからなる群より選択され;
R3およびR4は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか;または
R3およびR4は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。〕
本明細書で使用される場合、用語「リポソーム」または「リポソームナノ粒子」または「LN」は、1つ以上の脂質二重層を含み、それぞれの層が、対向するように配列した両親媒性脂質分子を含有する2つの単分子層を含む、自己集積性の構造を指す。両親媒性脂質は、極性(親水性)の頭部基が、1個または2個またはそれ以上の非極性(疎水性)アシル鎖またはアルキル鎖に共有結合している基を含む。疎水性アシル鎖と、その周囲にある水性媒体との接触がエネルギー的に好ましくないので、両親媒性の脂質分子は、極性頭部基が二重層の表面に向かって配列し、アシル鎖が二層の内側に向かって配列するように整列し、アシル鎖が水性環境と接触するのを効果的に防ぐ。
本明細書に記載した方法および組成物と組み合わせて有用なリポソームは、水性の区画に取り囲まれているか、または封入されている1つの脂質二重層(単層リポソーム)または複数の脂質二重層(多重層リポソーム)を有し得る。さまざまな種類のリポソームが記載されており、例えば、Cullisら、 Biochim.Biophys Acta、559:399−420(1987)に記載されている。
両親媒性脂質は、典型的には、リポソーム脂質ベシクルの主要な構造要素を含む。脂質の親水性の特性は、ホスファート、カルボキシル、スルファート、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、および他の同様の極性基の存在に由来する。限定されないが、1つ以上の芳香族基、脂環式基またはヘテロ環基で置換されていてもよい、飽和および不飽和の長鎖脂肪族炭化水素基を含む基を含むことによって、疎水性を付与することができる。好ましい両親媒性化合物の例は、ホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質であり、これらの代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール(phoasphatidylglycerol)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジリノレオイルホスファチジルコリンおよび卵スフィンゴミエリンが挙げられる。他の脂質(例えば、スフィンゴ脂質およびスフィンゴ糖脂質)も、本明細書に提供される方法および組成物で有用である。さらに、上述の両親媒性脂質を、トリアシルグリセロール、ステロールのような他の脂質と混合してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「C1〜10−アルキル」は、最も長い鎖が1〜10個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素鎖を指し、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「C2〜10−アルケニル」は、2〜10個の炭素原子を有し、1つ以上の二重結合を含有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素基を意味する。C2〜10−アルケニル基の非限定的な例としては、アリル、ホモ−アリル、ビニル、クロチル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニルなどが挙げられる。2個以上の二重結合を有するC2〜10−アルケニル基の非限定的な例としては、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、ヘプタジエニル、ヘプタトリエニル、オクタトリエニルなどの基、およびこれらの分枝形態が挙げられる。不飽和部(二重結合)の位置は、炭素鎖に沿って任意の位置であってよい。
本明細書で使用される場合、用語「C2〜10−アルキニル」は、2〜8個の炭素原子を有し、1つ以上の三重結合を含有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素基を意味する。C2〜10−アルキニル基の非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニルなどの基、およびこれらの分枝形態が挙げられる。不飽和部(三重結合)の位置は、炭素鎖に沿って任意の位置であってよい。2個以上の結合は、「C2〜10−アルキニル」が、ジ−インまたはエンジ−インであるように、不飽和であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアルキル」は、アルカン基が、1個以上、好ましくは、1個または2個の、O、S、Nから選択されるヘテロ原子を含有することを示す。存在する場合、このようなヘテロ原子は、任意選択的に、O、S、N、Siから選択されるヘテロ原子でさらに置換されているか、あるいは、ハロで任意選択的に置換されているアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基でさらに置換されている、。非限定的な例としては、(1つ以上の)エーテル基、チオエーテル基、エステル基、アミド基が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「アリール」および「シクロアルキル」は、5〜12個の炭素原子を含む、単環および二環の環構造を指し、好ましくは、5〜6個の炭素原子を含む単環の環を指す。このような環が、N、S、Oから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む場合(すなわち、ヘテロ環またはヘテロアリール環)、このような環は、合計で5〜12個の原子を含み、さらに好ましくは、5〜6個の原子を含む。ヘテロ環式環としては、限定されないが、フリル、ピロリル、ピラゾリル、チエニル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、モルホリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニルなどが挙げられる。環は、O、S、Nから選択される1つ以上のヘテロ原子で置換されていてもよい。存在する場合、このようなヘテロ原子は、任意選択的に、O、S、N、Siから選択されるヘテロ原子でさらに置換されているか、あるいは、ハロで任意選択的に置換されているアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基でさらに置換されている。
置換基C1〜10アルキル、C2〜10アルケニル、C2〜10アルキニル、C1〜10アルコキシ、C1〜10ヘテロアルキル、C1〜10アミノアルキル、C1〜10ハロアルキル、および/またはC1〜10アルコキシカルボニルは、存在する場合、ヒドロキシル、C1〜6アルコキシ、ハロゲン、シアノ、アミノまたはニトロのうち1つ以上で置換されていてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」または「ハロ」としては、塩素およびフッ素(これらが好ましい)、ヨウ素、臭素が挙げられる。
本発明は、一般的に、リポソームナノ粒子(LN)に薬物を充填させやすくするために、薬物を修飾するための医薬品化学の基本骨格に関する。いくつかの好ましい局面では、標準的な技術を用いるとリポソームに封入されにくいか、またはリポソームに封入することができない親油性/水不溶性の薬物を修飾し、リポソームの膜を通じてpH勾配を示すLNに有効に充填させることが可能な薬物誘導体を形成させる。本発明の種々の局面は、本明細書に提示した化学療法剤、方法、組成物に関連して記載されているが、リポソーム送達が有益である任意の薬物または治療薬剤(限定されないが、確立された化学療法剤、癌、炎症状態、感染症および他の徴候を治療する薬物を含む)とともに使用可能な柔軟性のある技術の基本骨格をあらわしている。
また、本明細書には、膜内外のpH勾配またはイオン勾配を示すLNに効果的に充填させることが可能な薬物誘導体、および、このような薬物誘導体を含むLN配合物および医薬組成物も提供されている。種々の実施形態では、リポソームに効果的に充填させることを妨害する1つ以上の性質(例えば、限定されないが、水溶性が低いこと)を有する既知の薬物を化学的に修飾することによって、薬物誘導体が調製される。いくつかの好ましい実施形態では、薬物は、化学療法剤である。
ある局面では、本明細書に提示されている薬物誘導体は、薬物を、誘導体化された薬物をLNに充填させやすくする1つ以上の特性を有する「可溶化単位」で誘導体化することによって形成される。種々の局面では、可溶化単位は、誘導体化された薬物をLNに効果的に充填させやすくするように、および/または好ましい条件下、治療標的で、または治療標的の周辺で、薬物をLNから効果的に放出させやすくするように、物理化学的に調整される。
いくつかの好ましい局面では、可溶化単位は、膜内外のpH勾配またはイオン勾配が存在する状態で、薬物誘導体をLNに能動的に充填させやすくする弱塩基性アミノ基を含む。本明細書で使用される場合、用語「弱塩基誘導体」は、本発明に提供される方法にしたがって、弱塩基性部分、例えば、一級アミン、二級アミンまたは三級アミンを含むように修飾された薬物を指す。
ある局面では、弱塩基部分は、イオン化可能なアミノ基であり、例えば、N−メチル−ピペラジノ基、モルホリノ基、ピペリジノ基、ビス−ピペリジノ基、またはジメチルアミノ基である。弱塩基薬物誘導体を合成するための修飾基の例としては、限定されないが、N−メチル−ピペラジノ基(例えば、抗癌剤Glivec(登録商標)の場合)、ビス−ピペラジノ基、ビス−ピペリジノ基(例えば、抗癌剤イリノテカンの場合)、ピペリジノ基、モルホリノ基、ジメチルアミノ基、アミノメチル(グリシン)基、アミノエチル(アラニン)基、アミノブチリル基、およびプロトン化可能なアミン基を有する脂質が挙げられる。
ある局面では、弱塩基性アミノ基は、
からなる群より選択され、式中、nは、1〜約10であるか、または、さらに好ましくは、1〜4である。
ある局面では、可溶化単位は、誘導体化の標的となる薬物に、可溶化単位を結合させやすくするリンカー単位をさらに含む。ある局面では、リンカーは、薬物上の遊離OH基と反応し、カルボキシルエステル結合を形成する反応性カルボニル基(例えば、カルボン酸部分)を含む。さらなる局面では、リンカーは、薬物上の遊離OH基と反応し、シリルエーテル結合を形成するジアルキルシリル基を含む。他の局面では、リンカーは、カルバメート基を含む。
種々の局面では、以下の一般構造を有する薬物誘導体が提供され、式中、Zは、水可溶化単位であり、Dは薬物であり、nは、1、2または3である:
ある局面では、Zは、式II
の基を含み、式中、
波線は、式IIAを、薬物の反応性基(例えば、遊離O原子)に接続する結合をあらわし、
[L]は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、;
[S]は、
C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル(それぞれハロ;C1〜C10アルキル;シクロアルキル;−YR2からなる群より選択される1つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
−YR2で任意選択的に1箇所以上置換されたC1〜C10ヘテロアルキル
(ここで、Yは、N、O、S、Siからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
R2は、H;N、O、Sからなる群より選択されるヘテロ原子;C1〜C10アルキル;それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される);
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり;
[N]は、膜内外にpH勾配またはイオン勾配を示すLNに薬物誘導体を充填させやすくする弱塩基性基を含む可溶化ドメインであり、ここで、[N]は、一般式IIIの可溶化ドメイン
であり、式中、
RおよびR’は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール;プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか;または
RおよびR’は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。
種々の局面では、可溶化単位は、LN内の特定の位置に薬物誘導体を能動的に充填させやすくするように調整される。例えば、ある局面では、薬物は、LNの水性の内側に薬物誘導体を能動的に充填させやすくする水可溶化単位で誘導体化される。アミン基を付加することは、水溶性を高める一般的な薬物修飾戦略であり(例えば、Capdevilleら、Nature Reviews Drug Discovery、1:493−502(2002);Pizzolato and Saltz,Lancet,361:2235−2242(2003))、可逆性の薬物接合体(例えば、酵素作用によって、in vivoで除去される基)を含むアミン薬物誘導体を製造するための種々の方法が当該技術分野で知られている。水溶性が高められた、アミン修飾された薬物の非限定的な例としては、抗癌剤Glivec(N−メチル−ピペラジン)、イリノテカン(ビス−ピペリジン)およびトポテカン(エチルジメチルアミノ基)が挙げられる。
他の局面では、薬物は、薬物誘導体がリポソースの膜内にあるか、またはリポソースの膜に安定して会合するように、薬物誘導体を能動的に充填させやすくするために、脂質可溶化単位で誘導体化される。ある局面では、脂質可溶化単位は、弱塩基性基と、親油性基とを含む。親油性基は、LNに薬物を能動的に充填しやすくするように、LN内での薬物の安定性を促進するように、および/または治療標的で、または治療標的の周辺で、薬物を放出しやすくするように選択されてもよい。ある局面では、親油性基は、リポソームの膜と類似の脂質組成物または相補的な脂質組成物を有する。いくつかのこのような局面では、脂質可溶化単位は、式IVaまたはIVbの基:
から選択され、式中、
Aは、カルボニル、メチレン、NR−C=O(Rは、HまたはC1〜C5アルキルである)からなる群より選択され;
R1およびR2は、独立して、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、C2〜C30アルケニル、C2〜C30アルキニルからなる群より選択され;
R3およびR4は、独立して、H;それぞれハロで任意選択的に置換された、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル;それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか;または
R3およびR4は、これらが結合している窒素原子とともに、4〜5個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の1つが含まれていてもよい。
弱塩基誘導体は、リポソームの膜を通じてpH勾配を付与し(内側が酸性)、封入された薬物とともにリポソームをインキュベーションすることによって、LNに充填させることができる。pHに依存して、弱塩基誘導体は、帯電した(プロトン化した)形態(例えば、pHがpKaよりも低い場合)または中性の形態(例えば、pHが、pKa以上である場合)のいずれかで存在してもよい。中性形態の場合のみ、リポソームの膜を迅速に透過することができる。酸性のリポソームの内側に到達すると、帯電した膜不透過性の形態が選ばれ、リポソームの内側に化合物が連続的に取り込まれ、とどまるようになる。
いくつかの好ましい局面では、本明細書に提示された弱塩基誘導体の薬物充填性は、誘導体アミン基および/または誘導体親油性基の1つ以上の性質を選択および/または改変することによって、細かく調整することができる。例えば、誘導体アミン基のpKaは、アミン基が、使用されるLN調製物の水性の内側でプロトン化し(例えば、低いpHで)、外側媒体で脱プロトン化する(例えば、中性または塩基性のpHで)ように選択することができる。
ある局面では、誘導体アミン基のpKaは、約12.0以下、約11.5以下、約11.0以下、約10.5以下、約10.0以下、約9.5以下、または約9.0以下である。
ある局面では、誘導体アミン基のpKaは、少なくとも約5.0、少なくとも約5.5、少なくとも約6.0、少なくとも約6.5、少なくとも約7.0、少なくとも約7.5、少なくとも約8.0、または少なくとも約8.5である。
弱塩基部分を含む可溶化単位は、修飾標的である薬物上にある、適切な任意の反応性官能基に結合していてもよい。このような官能基としては、特に、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、カルボキシル基が挙げられる。ある局面では、可溶化単位は、薬物上の遊離OH基を介して、例えば、カルボキシルエステル結合によって結合している。
ある局面では、薬物は、その誘導体の活性が、遊離薬物の活性と実質的に等価であるように、目的の治療活性にとって不可欠ではない領域で誘導体化される。例えば、ある局面では、弱塩基誘導体は、バッカチン骨格の7−OH基で誘導体化されたタキサンドセタキセルを含む。
さらなる局面では、薬物は、その誘導体が、目的の治療効果を発揮するために、親化合物または別の活性形態に変換されなければならないプロドラッグであるように、活性にとって不可欠な領域で誘導体化される。例えば、ある局面では、本明細書では、ドセタキセル活性にとって不可欠である2’−OH基で誘導体化されたドセタキセル誘導体が提供される。
本明細書で提供されるプロドラッグ誘導体は、好ましくは、in vivoでLNキャリアから放出され、生理学的条件にさらされると、迅速に遊離薬物に変換される。例えば、いくつかの好ましい局面では、本明細書で提示される弱塩基誘導体の誘導体アミノ基は、薬物から迅速に除去された後、例えば、内因性酵素の作用によって、および/または自然発生的な加水分解によってリポソームから放出される。
したがって、ある局面では、可溶化単位は、薬物誘導体に可逆的に接合し、特定の条件下で(例えば、保持させている間、配合中、貯蔵中、および/またはLN組成物を投与している間)安定なプロドラッグを形成し、治療標的で、または治療標的の周辺で、例えば、内因性酵素の作用によって、および/または特定の生理学的条件(例えば、pH、イオン強度)で、解離して遊離薬物を放出する。
ある局面では、弱塩基誘導体は、リポソームナノキャリアの内側で(例えば、低いpHで)安定であるが、リポソームから放出されると、プロドラッグが、迅速に活性形態に変換されるように、生理学的pHで「自己放出」する。このことは、例えば、アミノブチリル基をドセタキセルに結合させ、プロトン化されていない形態(pH7.4)で、エステルカルボニルへの求核攻撃による放出によって反応が始まることによって達成することができる。
ある局面では、弱塩基誘導体のエステル結合の加水分解安定性を、以下の1つ以上の効果を有効に利用することによって調整してもよい。
(i)誘起効果:生理学的pHでの開裂について、プロテアーゼを用いるか、または自然発生的な加水分解によって、またはカルボニル中心に近い位置に可溶化アミノ基を配置することによって(不安定化)、またはカルボニル中心から離れた位置に可溶化アミノ基を配置することによって(安定化)、エステルを、安定化させるか、または不安定化させてもよい。また、アミノ基のpKaは、この内容で、ある目的を果たす。帯電した(プロトン化した)アミンが、生理学的条件下で、エステル加水分解を促進する。アミノ基上にあるR基を適切に選択することによって、エステル開裂速度が理想的な状態になるように、N−中心を調節することができる。
(ii)化学効果および近接効果。例えば、アミノ単位のpKaが約6である、4−アミノブチリル(4−aminobutyrl)基とのエステル化によって、低いpH(例えば、硫酸アンモニウムが充填されたLN内部でみられるpH)でプロトン化した形態で存在する部分を生じる。LNキャリアからこのような誘導体が放出し、生理学的条件(例えば、pH7.4)にさらされると、遊離塩基形態の生成が促進され、遊離アミンが、エステルカルボニルへの求核攻撃によって、誘導体化単位が「自己放出」することによって反応が始まる。有利なことに、これにより、プロドラッグ誘導体が、LNから放出されると、活性形態に迅速に変換される。
さらなる局面では、弱塩基誘導体のシリルエーテル結合の加水分解安定性を、自然発生的な加水分解を促進することによって調節してもよい。エステルリンカーとは異なり、内因性の脱シリル化酵素は存在しない。したがって、シリルエーテル結合を含む誘導体は、好ましくは、生理学的条件下で加水分解可能なリンカー基を含む。シリル基の開裂速度の主な決定因子は、Si原子周辺の立体的なかさ高さである。この生理化学的性質の調節は、例えば、Me、Et、i−Pr、t−Bu、Phなどの系によって、ハロゲン化シリルのR基およびR’基の大きさを変えることを伴う。エステルの場合と同様に、アミノ基のpKaも、誘導体の安定性を決めるのにある種の役割を果たす。例えば、pKaが約6のアミノ基は、生理学的pHでは、大部分が遊離塩基として存在し、それによって、シリル基の解離が促進されるであろう。
さらなる局面では、親油性誘導体基の大きさおよび/または化学組成は、リポソームの膜中の溶解度および/またはリポソーム内での薬物の安定性を高めるように選択されてもよい(例えば、リポソームの膜に薬物を固定することによって)。
有利なことに、本明細書で提示される薬物の弱塩基誘導体は、遊離薬物よりも効果的に、リポソームに充填させることができる。ある局面では、本明細書に提示される弱塩基誘導体は、広範囲の薬物−対−脂質の比率にわたって(例えば、約0.01mg/mg〜約10mg/mgまで、またはそれ以上)、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、またはそれ以上の保持効率で、リポソームに保持させることができる。
さらなる局面では、本明細書に提示される弱塩基誘導体のLN配合物は、例えば、LNキャリア膜の脂質組成を改変することによって、薬物誘導体を持続放出させることによって最適化することができる。例えば、種々の局面では、本明細書で提示されるLN配合物は、in vivoでの放出半減期が、約1〜約96時間、または約2〜約72時間、または約4〜約48時間である。
本明細書で提供される方法を用い、リポソーム配合物にとって望ましい任意の薬物または治療薬剤を修飾することができる。いくつかの好ましい局面では、薬物は、親油性であるか、および/または水溶性が低い。有益には、本明細書で提供する方法にしたがって、このような薬物を修飾することによって、溶解度が向上し、毒性が低下し、有効性が増加し、および/または、遊離薬物と比べて他の利点を有する。
本明細書に提供する方法にしたがって修飾され、LNに充填可能な薬物の非限定的な例を、表1に示す。
いくつかの好ましい局面では、薬物は、化学療法剤である。本明細書で提供する方法にしたがって誘導体化が可能な、確立されている薬物または薬物分類の例としては、タキサン(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)、ポドフィロトキシン誘導体(例えば、エトポシドおよびテニポシド)が挙げられる。ドセタキセル(タキソテール)およびパクリタキセル(タキソール)を含むタキサンは、臨床的な腫瘍学で広範囲の用途を有する、重要な薬物群である。ほとんどの抗癌剤と同様に、タキサンは、癌細胞に対する選択性を有しておらず、健康な細胞にも損傷を与える場合がある。タキサンは、水溶液への溶解性が低いため、典型的には、CremophorおよびPolysorbate80のようなビヒクルに配合されるが、これら自体が、患者に有害な反応を引き起こす。ビヒクルの副作用を最小限にするために、ステロイド系前投薬および抗アレルギー前投薬を使用することが多い。有益には、本明細書で提供されるLNタキサン配合物は、毒性のあるビヒクルを使用することなく、タキサンを投与することができる。さらに、LNは、血流を出て、腫瘍部位での血管が「漏れがある」性質のため、大部分が腫瘍に高濃度で蓄積させることが可能であるので、LNタキサン配合物は、親化合物の承認済配合物であるタキソテールと比べ、副作用が低く、優れた抗癌活性(例えば、改善した治療指数)を付与することができる。
ある局面では、本明細書で提供するLN配合物は、腫瘍成長部位に特異的に到達する化学療法剤の量を増やし、および/または、例えば、LNの血漿半減期を長くし、および/またはLNキャリアから化学療法剤を持続放出させることによって、腫瘍が治療に活性な濃度の薬物にさらされる時間を長くする。
ある局面では、薬物は、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))またはパクリタキセルであり、これらの構造を以下に示す。これら2種類の薬物は、側鎖の窒素原子に存在するアシル基のレベルが異なっており(ドセタキセルの場合、tert−ブトキシカルボニルまたはBOC;パクリタキセルの場合、ベンゾイル)、ドセタキセルでは、C−10
OH基が遊離しているが、パクリタキセルではアセチル化されている。
OH基が遊離しているが、パクリタキセルではアセチル化されている。
本明細書で提供する方法にしたがう、ドセタキセルおよびパクリタキセルの修飾は、1つ以上の遊離OH単位を適切な基で誘導体化することを含む。ある局面では、薬物は、C−1 OHで誘導体化されている。その他の好ましい局面では、薬物は、C−2’、C−7、および/またはC−10のOHで誘導体化され、以下の誘導体を製造する。ここで、C−2’、C−7、および/またはC−10のOHに接続しているZ基は、独立して、Hであるか、または、プロトン化可能な窒素官能基を含有する残基である。任意の薬物は、遊離OH基または他の反応性官能基(天然の薬物または薬物の修飾された形態に存在し得る)で、ドセタキセルおよびパクリタキセルと同様の様式で誘導体化されていてもよい。
ある局面では、本明細書で提供するLN配合物は、種々の癌の治療に関し、現時点でIII相治験段階にあるリポソームのビンクリスチン(Marqibo(登録商標))の1つ以上の医薬としての性質を有する(例えば、Bomanら、Brit.J.Cancer 72:896−904(1995)、Shanら、Cancer Chemother.Pharmacol.58(2):245−55(2006)、Waterhouseら、Methods Enzymol.391:40−57(2005))。
種々の局面では、以下の一般構造を有する薬物誘導体が提供され、式中、Zは、水可溶化単位であり、Dは、薬物である:
ある局面では、Zは、式IIAの基を含み、
ここで、
(i)波線は、式IIAを、薬物(例えば、上の化合物3および/または4)の反応性基(例えば、遊離O原子)に接続する結合をあらわし;
(ii)[S]は、
(a)(CH2)n型の鎖(nは、1〜10の範囲であってよい)、または
(b)上述の(CH2)nの誘導体であって、1つ以上のH原子が、
1〜10個のC原子を含有する直鎖、分枝鎖もしくは環状のアルキル基;
N、O、S、Siのようなヘテロ原子であって、上記ヘテロ原子が、
H原子、もしくは、
N、O、Sのようなヘテロ原子、もしくは、
1〜10個のC原子を含有する直鎖、分枝鎖もしくは環状のアルキル基、もしくは、
1〜10個のC原子を含有しかつ1つ以上のハロゲン原子が組み込まれた直鎖、分枝鎖もしくは環状のアルキル基
とさらに接続していてもよいヘテロ原子;もしくは
1個のハロゲン原子
と置き換えられている誘導体、または
(c)上述の(CH2)nの誘導体であって、1つ以上のCH2が、
N、O、S、Siのようなヘテロ原子であって、上記ヘテロ原子は、
H原子、もしくは、
N、O、Sのようなヘテロ原子、もしくは、
1〜10個のC原子を含有する直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基、もしくは、
1〜10個のC原子を含有しかつ1つ以上のハロゲン原子が組み込まれた直鎖、分枝鎖もしくは環状のアルキル基
とさらに接続していてもよい、ヘテロ原子;
3〜10個の炭素原子からなる環構造;
3〜10個の炭素原子からなり、かつN、O、S、Siまたはハロゲンのような一つ以上のヘテロ原子が組み込まれた環構造;
3〜10個の炭素原子からなり、かつ原子対の間にある多重結合が組み込まれた環構造;
3〜10個の炭素原子からなり、かつN、O、S、Siまたはハロゲンのような一つ以上のヘテロ原子と、原子対の間にある多重結合とが組み込まれた環構造
と置き換えられている誘導体;または
(d)上述の(CH2)nの誘導体(隣接するC原子の対の1つ以上が、E−幾何学またはZ−幾何学を有する二重結合となっているか、または三重結合となっている)
を含む「スペーサー」である。
このようなスペーサー[S]の例としては、限定されないが、
が挙げられる。
(iii)[N]は、膜内外のpH勾配またはイオン勾配を示すLNに薬物誘導体を保持させやすくした、弱塩基性基を含む可溶化ドメインであり、以下のものから選択される。
(a)一般構造R−N−R’の置換基(ここで、N(窒素)原子が、スペーサーに接続しており、RおよびR’は、独立して:H;1〜10個のC原子と、任意で、N、O、S、Siおよびハロゲンのような1つ以上のヘテロ原子と、原子対の間にある多重結合とを含む、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基;または、3〜10個の炭素原子と、任意で、N、O、S、Siまたはハロゲンのような1つ以上のハロゲン原子と、原子対の間にある多重結合とからなる環構造の一部分であってもよい。
このようなRおよびR’の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、
(b)以下の代表的であるが、限定的ではない例によって示されるような、プロトン化可能な、窒素を含有するヘテロ環系、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピリダジン、モルホリン、チオモルホリン、キヌクリジン、イミダゾール、ピリジンなど、またはこれらの置換された改変体。ここで、波線は、ヘテロ環構造をスペーサーに接続する結合をあらわす。
したがって、上の式IIAの代表的な局面としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
異なっていても同じであってもよい3単位までの式IIAでドセタキセルを誘導体化すると、以下に示すA型、B型、C型、D型、E型、F型、G型のモノエステル、ジエステル、またはトリエステルが得られる。
同様の様式で、パクリタキセルを、以下に示すH型、I型、J型のモノエステル誘導体およびジエステル誘導体に変換してもよい。
ドセタキセルまたはパクリタキセルをこのような誘導体に加工することは、例えば、当業者によく知られている現代有機化学の標準的な技術を用い、保護されていない親薬物または部分的に保護された親薬物と、5のカルボン酸形態とをカップリングさせることを含む。
ある局面では、Zは、式IIBの基
を含み、式中、
(i)波線は、式IIBを、薬物[D](例えば、化合物3および/または4)の適切な反応性基(例えば、O原子)に接続する結合をあらわし、
(ii)「スペーサー」[S]は、式IIAについて上に詳細に示したとおりであり、
(iii)可溶化単位[N]は、式IIAについて上に詳細に示したとおりであり、
(iv)R’は、Hであるか、または、1〜10個のC原子と、任意で、N、O、S、Siおよびハロゲンのような1つ以上のヘテロ原子と、原子対の間にある多重結合とを含む、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基である。
このようなR’の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、
上の構造式IIBの代表的な局面としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
異なっていても同じであってもよい3単位までの6型でドセタキセルを誘導体化すると、以下に示すA型、B型、C型、D型、E型、F型、G型のモノカルバメート、ジカルバメート、またはトリカルバメートが得られる。
同様の様式で、パクリタキセルを、以下に示すH型、I型、J型のモノカルバメート誘導体およびジカルバメート誘導体に変換してもよい。
ドセタキセルまたはパクリタキセルをこのような誘導体に加工することは、例えば、当業者によく知られている現代有機化学の標準的な技術を用い、保護されていない親薬物または部分的に保護された親薬物と、6のイソシアネート形態(R”=H)またはイミダゾリド形態(R”≠H)とをカップリングさせることを含む。
ある局面では、Zは、一般式IICの基
であり、式中、
(i)波線は、式IICを、薬物[D](例えば、化合物3および/または4)の適切な反応性基(例えば、O原子)に接続する結合をあらわし;
(ii)「スペーサー」は、式IIAについて上に詳細に示したとおりであり、
(iii)基[N]は、式IIAについて上に詳細に示したとおりであり、
(iii)RAおよびRBは、独立して、1〜10個のC原子と、任意で、N、O、S、Siおよびハロゲンのような1つ以上のヘテロ原子と、原子対の間にある多重結合とを含む、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基である。
このようなRAおよびRBの例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる:H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル。
上の構造式IICの代表的な局面としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
異なっていても同じであってもよい3単位までの式IICでドセタキセルを誘導体化すると、以下に示すA型、B型、C型、D型、E型、F型、G型のモノ−シリルエーテル、ビス−シリルエーテル、またはトリス−シリルエーテルに変換される。
同様の様式で、パクリタキセルを、以下に示すH型、I型、J型のモノエステル誘導体およびジエステル誘導体に変換してもよい。
ドセタキセルまたはパクリタキセルをこのような誘導体に加工することは、例えば、当業者によく知られている現代有機化学の標準的な技術を用い、保護されていない親薬物または部分的に保護された親薬物と、式IICの塩化物形態またはイミダゾリド形態とをカップリングさせることを含む。
上に例示した、タキサンを用いる技術は、適切な固定部位(例えば、式IIA、IIBまたは式IICの可溶化単位[Z]の場合、OH基、COOH(カルボキシル)基、またはNH基)を有する任意の薬物に適用可能である。
ある局面では、薬物は、リンパ腫、肺癌、精巣癌の治療用に承認された、広範囲に用いられる抗癌剤であるエトポシドである。エトポシドは、水への溶解性が低く、代謝により不活性化を受け、かなり毒性の高い副作用を有する。種々の好ましい局面では、本明細書に提示するエトポシドLN配合物は、実質的に毒性が低く、溶解度およびバイオアベイラビリティが向上し、有効性が上がっている。
エトポシド8およびコルチコステロイドプレドニゾン9を示すために、タキサンについて上にくわしく説明したように、エステル誘導体、カルバメート誘導体、またはシリルエーテル誘導体に変換してもよい。これらの誘導体中の[Z]は、タキソール群の化合物について、すでに定義したとおりである。
同様の様式で、シクロスポリン10、アザチオプリン11などを、リポソーム配合物に適した誘導体に変換してもよい。
ある局面では、目的の薬物を、弱塩基性アミン基と、親油性基とを含む脂質可溶化単位で誘導体化する。いくつかの好ましい局面では、可溶化単位は、リポソームの膜を含む脂質の構造と類似した構造を有する。例えば、ある局面では、薬物誘導体は、一般式:[D]−[L]−[S]−[N]を有し、式中、[S]は、式IIA〜IICに関連して上に定義したようなスペーサーであり、以下に定義するように、[N]は、可溶化ドメインであり、[L]は、リンカーである。
ある局面では、[N]は、式IVAの基(「内部」誘導体)または式IVBの基(「末端」誘導体)であり、
(i)Aは、カルボニル基(C=O);カルバモイル基(NR−C=O、ここで、Rは、Hであるか、または1〜5個のC原子が組み込まれたアルキル基である);またはメチレン基(CH2)をあらわし;
(ii)R1およびR2は、30個までの炭素原子を含有し、任意で、隣接する炭素原子対の間にある多重結合が1つ以上の組み込まれた、直鎖または分枝鎖の親油性アルキル基をあらわし;
(iii)R3およびR4は、独立して、H;または、1〜5個のC原子が組み込まれたアルキル基(例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなど);または、環構造の分枝(例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリンなど)をあらわし;
(iii)リンカー[L]は、
(a)カルボニル基C=O;
(b)カルバモイル基NR−C=O(ここで、Rは、Hであるか、または1〜5個のC原子が組み込まれたアルキル基である);または
(c)上に定義されるようなRA−Si−RB基である。
以下のものは、弱塩基性部分と親油性部分とを含む可溶化基で誘導体化し、「末端」型(式IVB)誘導体および「内部」型(式IVA)誘導体を形成する、臨床的に重要な多くのタキサンである。このような誘導体は、例えば、当該技術分野で知られている技術を用い、任意の保護されていない親薬物または部分的に保護された親薬物と、リンカー[L]のカルボン酸形態、アシルイミダゾリド形態、カルバモイルイミダゾリド形態、シリルクロリド形態またはシリルイミダゾリド形態とカップリングさせることによって製造することができる。得られた誘導体を、薬物がリポソームの膜内にとどまるように、LNに能動的に充填させることができる。
式IVAのドセタキセル誘導体としては、以下の代表的な構造を有する、エステル、カルバメート、シリルエーテルが挙げられる。
式IVAのパクリタキセル誘導体としては、以下の代表的な構造を有する、エステル、カルバメート、シリルエーテルが挙げられる。
式IVBのドセタキセル誘導体としては、すでに記載した一般的な種類を有するエステル、カルバメート、シリルエーテルであって、以下の代表的な構造を有するものが挙げられる。
式IVBのパクリタキセル誘導体としては、すでに記載した一般的な種類を有するエステル、カルバメート、シリルエーテルであって、以下の代表的な構造を有するものが挙げられる。
同様に、エトポシド8、プレドニゾン9、シクロスポリン10、アザチオプリン11、およびその他の薬物を、薬物を、LN膜内に能動的に充填させることが可能なように、弱塩基性基と親油性基とを含む可溶化単位で誘導体化してもよい。化合物8〜11に関し、13および14は、式[D]−[L]−[S]−[N]の誘導体を指し、15および16は、式[L]−[S]−[N]の誘導体であり、ここで、[N]は、13型において、式IVBにしたがっており、14型において、式IVAにしたがっており、[L]および[S]は、上に記載したとおりである。
ある局面では、薬物は、例えば、治療への有効性、および本方法を使わない場合に薬物の医薬としての有用性を妨害するであろう1つ以上の性質(例えば、親油性および/または低い水溶性)に関し、コンビナトリアルライブラリから選択された新規化学部分(NCE)である。
さらなる局面では、薬物誘導体は、新しく開発された薬物および/または特性決定された薬物(例えば、新規化学部分(NCE))を改変することによって調製される。しばしば、化学ライブラリスクリーニングから得られた、医薬として有望な対象物は、医薬を開発し、使用するために理想的な候補物質よりも少ないことがわかっている。例えば、溶解性の問題は、ほとんどのNCEが開発段階に進まず、除外される主な理由である。本明細書に概説した化学的な基本骨格によって、既知の方法を用い、このような化合物を、LN中の配合を促進する弱塩基性化学部分で特定的に修飾することによって、このような化合物を開発し、使用することができる。本明細書に記載した医薬品化学の基本骨格を有する薬物候補物質を作製し、スクリーニングするための高スループットコンビナトリアル化学方法をくみこみ、薬物に似た性質を有する、発見された化合物で予想される既存の薬物開発戦略に置き換えることが可能な、薬物(および診断薬剤)を開発する代替的なアプローチを提供する。
したがって、ある局面では、目的の治療活性を有し、水溶性が低く、親油性であり、および/または、遊離化合物の使用を抑制するか、または妨害する他の性質、および/または、化合物をLNに有効に充填させるのを抑制する性質を有する薬物候補物質を同定する方法が本明細書で提供される。例えば、ある局面では、コンビナトリアル化学によって製造した化合物の集合をスクリーニングし、目的の治療活性を有する候補薬物を同定する工程と、この候補薬物について、1つ以上のさらなる性質をスクリーニングし、本明細書に記載した方法にしたがって誘導体化するための候補物質を同定する工程とを含む、方法が提供される。さらなる局面では、誘導体化するための候補物質を、弱塩基性基で誘導体化し、LN内に能動的に充填させ、LNをスクリーニングし、所望の治療活性を有する配合物候補物質を同定する。有益には、本明細書で提供するスクリーニング方法は、標準的な方法を用いて検出されないような、LN配合物中で使用する候補薬物を同定する。
本明細書で提供する方法および組成物で使用するリポソームは、標準的なベシクルを形成する脂質から作製することができ、その脂質は、一般的に、中性、負に帯電しているか、または正に帯電しているリン脂質およびステロール(例えば、コレステロール)を含む。脂質の選択は、一般的に、例えば、リポソームの大きさ、血流でのリポソームの安定性、所望な放出速度、および当該技術分野で知られている他の因子を考慮することによって導かれる。
ある局面では、本明細書に記載した方法および組成物で使用するリポソームの主要な脂質要素は、ホスファチジルコリンである。種々の長さの鎖と、種々の飽和度を有する種々のアシル鎖基を有するホスファチジルコリンを使用してもよい。ある局面では、C14〜C22の範囲の炭素鎖を有する飽和脂肪酸を含有するホスファチジルコリンが好ましい。飽和の長鎖ホスファチジルコリンは、これらの不飽和の対応物と比較して、in vivoで透過性が低く、安定性が高い。モノ不飽和またはジ不飽和の脂肪酸を有するホスファチジルコリン、および飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との混合物を有するホスファチジルコリンも使用してもよい。他の適切な脂質としては、例えば、脂肪酸が、エステル結合ではなく、エーテル結合によってグリセロールに結合しているエーテル脂質が挙げられる。また、本明細書で使用するリポソームは、スフィンゴミエリンまたはコリン以外の頭部基(例えば、エタノールアミン、セリン、グリセロール、ホスファチジン酸、イノシトール)を有するリン脂質で構成されていてもよい。
いくつかの好ましい局面では、リポソームは、ステロール、好ましくは、コレステロールを、モル比0.1〜1.0(コレステロール:リン脂質)で含む。好ましいリポソーム組成物の例としては、ジステアロイルホスファチジルコリン/コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン/コレステロール、ジミリストイルホスファチジルコリン/コレステロール、卵スフィンゴミエリン/コレステロールが挙げられる。
他の局面では、リポソームは、負に帯電した脂質または正に帯電した脂質を含有していてもよい。有用な負に帯電した脂質の例としては、限定されないが、ジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(distearoylphasphatidylglycerol)、ジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、これらの不飽和ジアシル鎖および混合アシル鎖の対応物、およびカルジオリピンが挙げられる。正に帯電した脂質の非限定的な例としては、N,N’−ジメチル−N,N’−ジオクタアシルアンモニウムブロミド(DDAB)およびN,N’−ジメチル−N,N’−ジオクタアシルアンモニウムクロリド(DDAC)、N−(1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、3β−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエチル)カルバモイル)コレステロール(DC−chol)、1,2−ジオレオイルオキシ−3−[トリメチルアンモニオ]−プロパン(DOTAP)、1,2−ジオクタデシルオキシ−3−[トリメチルアンモニオ]−プロパン(DSTAP)、1,2−ジオレオイルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムクロリド(DORI)、例えば、B.Martin、M.Sainlos、A.Aissaoui、N.Oudrhiri、M.Hauchecorne、J.−P.Vigneron、J.−M.LehnおよびP.Lehn、The design of cationic lipids for gene delivery.Current Pharmaceutical Design 2005、11、375−394で記載されているカチオン性脂質が挙げられる。
さらなる局面では、本明細書で使用するリポソームは、in vivoでのLNの安定性を高めるために、ポリマー層でコーティングされる(例えば、立体的に安定化されたリポソーム)。例えば、ある実施形態では、LNは、ポリ(エチレングリコール)に接合した脂質(PEG−脂質)を含有するリポソームから生成され、親水性表面層を形成し、LNの循環半減期を向上させ、治療標的(例えば、感染部位または腫瘍部位)に到達するLNの量を増やす。一般的なアプローチは、例えば、Workingら、J Pharmacol Exp Ther、289:1128−1133(1999);Gabizonら、J Controlled Release 53:275−279(1998);AdlakhaHutcheonら、Nat Biotechnol 17:775−779(1999);および、Koningら、Biochim Biophys Acta 1420:153−167(1999)に記載されている。有用なPEG−脂質の例としては、限定されないが、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−350](mPEG 350 PE);1,2−ジアシル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−550](mPEG 550 PE);1,2−ジアシル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−750](mPEG 750 PE);1,2−ジアシル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−1000](mPEG 1000 PE);1,2−ジアシル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000](mPEG 2000 PE);1,2−ジアシル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−3000](mPEG 3000 PE);1,2−ジアシル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5000](mPEG 5000 PE);N−アシル−スフィンゴシン−1−[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)750](mPEG 750セラミド);N−アシル−スフィンゴシン−1−[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)2000](mPEG 2000セラミド);およびN−アシル−スフィンゴシン−1−[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)5000](mPEG 5000セラミド)が挙げられる。
例えば、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980);米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号;Liposomes、Marc J.Ostro編、Marcel Dekker,Inc.、New York、1983、Chapter 1;および、Hopeら、Chem.Phys.Lip.40:89(1986)に記載されるように、リポソームを調製するために種々の方法が利用可能である(これらのすべてを本明細書に参考として援用する)。いくつかの好ましい局面では、リポソームは小さく、一般的に、Hopeら、Biochim.Biophys.Acta、812:55−65(1985)(本明細書で参考として援用する)に記載されているように、水和した脂質分散物を、100nmの孔を有するフィルターを通して押し出すことによって製造される、直径が約100nmのリポソームである。
ある方法では、不均一な大きさを有する多重膜ベシクルは、ベシクルを形成している脂質を、適切な有機溶媒または溶媒系に溶解させ、混合物を減圧下または不活性ガス下で乾燥させ、薄い脂質膜を形成することによって製造される。または、脂質を適切な溶媒(例えば、三級ブタノール)に溶解させ、次いで凍結乾燥させ、より均一な脂質混合物を作成する。この膜または粉末を、一価金属イオンまたは二価金属イオンの緩衝水溶液で覆い、典型的には、撹拌しながら15〜60分間水和させる。得られた多重膜ベシクルのサイズ分布は、撹拌条件を激しくすることによって、またはデオキシコレートのような可溶化洗浄剤を加えることによって、脂質を水和し、小さくなるようにシフトさせることができる。別の方法では、脂質を水混和性の有機溶媒(例えば、エタノール)に溶解させ、次いで、水性バッファーと混合し、多重膜リポソーム懸濁物を形成させる。または、脂質を水に混和しない有機溶媒に溶解し、水性媒体と、有機溶媒を蒸発させることによって生成したリポソームとを混合する。
リポソームを所望の大きさにサイジングするために、いくつかの技術が利用可能である。1つのサイジング方法は、米国特許第4,737,323号に記載されており、これを、本明細書に参考として援用する。リポソーム懸濁物を、浴またはプローブによる超音波処理によって超音波処理すると、大きさが約0.05ミクロン未満の小さな単層ベシクルになるまで、革新的にサイズが低下したものが得られる。均一化または微小溶液操作は、大きなリポソームを小さなリポソームに砕くせん断エネルギーに依存する、それ以外の方法である。典型的な均一化手順では、多重膜ベシクルを、所定のリポソーム径、典型的には、約0.1〜0.5ミクロンの径が測定されるまで、標準的な乳化ホモジナイザーで再循環させる。両方の方法では、粒径分布は、従来のレーザービームによる粒径識別法によって監視することができる。
リポソームを小さな孔のポリカーボネート膜または非対称なセラミック膜を通して押出成型することは、リポソーム径を、比較的十分に規定されたサイズ分布になるまで小さくするために、非常に有効な方法である。典型的には、所望なリポソームのサイズ分布が得られるまで、懸濁物を膜に1回以上循環する。リポソームを、連続的に小さな孔の膜を通すことによって押出加工し、リポソームの大きさを徐々に小さくしてもよい。
ある局面では、能動的な充填技術を用い、弱塩基誘導体をリポソームに充填させる方法が提供される。ある局面では、例えば、Maurer,N.、Fenske,D.、およびCullis,P.R.(2001)Developments in liposomal drug delivery systems.Expert Opinion in Biological Therapy 1、923−47;N.L.Boman、D.Masin、L.D.Mayer、P.R.CullisおよびM.B.Bally(1994)「Liposomal Vincristine Which Exhibits Increased Drug Retention and Increased Circulation Longevity Cures Mice Bearing P388 Tumors」、Cancer Res.54、2830−2833;D.N.Waterhouse、T.D.Madden、P.R.Cullis、M.B.Bally、L.D.Mayer、M.Webb、Preparation,characterization,and biological analysis of liposomal formulations of vincristine.Methods Enzymol.391(2005)40−57(本明細書に参考として援用する)に記載されるように、リポソームの膜を通じてpH勾配を付与し(リポソームの内側が酸性である)、リポソームを、封入される薬物とともにインキュベーションすることによって、リポソームに充填する。いくつかの好ましい局面では、一般的に、G.Haran、R.Cohen、L.K.Bar、Y.Barenholz、Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.Biochim.Biophys.Acta 1115(1993)201−215および米国特許第5,316,771号(本明細書に参考として援用する)に記載されているように、pH勾配は、硫酸アンモニウムによる勾配である。薬物をリポソームに充填させたら、組成物を、直接的に使用してもよく、または、組成物をさらに処理し、任意の充填されていない薬物を処理除去してもよい。
pHによる充填技術は、一般的に、リポソーム内部のpHを低くしてpH勾配を作り出すこと、次いで、薬物を充填させることの2工程を含む。膜内外のプロトン勾配は、種々の様式で作り出すことができる。リポソームは、pH4クエン酸バッファーのような低pHのバッファー中で調製し、次いで、外側のバッファー溶液をpH7.5のバッファーに交換することによって調製することができる(例えば、Maddenら、Chem.Phys.Lipids、53:37−46(1990))。または、イオノフォアを、カチオンの勾配(内側のカチオン濃度が高い)と組み合わせて用いることができる(例えば、Fenskeら、Biochim Biophy.Acta、1414:188−204(1998))。イオノフォア(例えば、ナイジェリシンおよびA23187)を、それぞれ、一価カチオンまたは二価カチオンの外側への移動と、内側へのプロトンの移動と組み合わせ、これにより、リポソームの内側を酸性にする。さらに、高濃度の弱塩基(例えば、硫酸アンモニウム)存在下、リポソームを調製することができる(Haranら、Biochim.Biophys.Acta、1151:201−215(1993))。外側のアンモニウム塩溶液を除去することによって、同じ原理にしたがってpH勾配を作り出し、これもまた、その次に起こる薬物充填プロセスに関与する。硫酸アンモニウムの充填技術は、この保持プロセスが、2種類の異なるアミンの交換(薬物が中に入り、アンモニアが外に出る)によって維持され、非常に低い外部pHで十分に機能するため、効果的な充填を達成するために大きなpH勾配は必要ではない。このことは、例えば、この薬物が、中性pHで不安定であるか、または不溶性である場合に、有益である。能動的な充填のために、pH勾配に加え、金属イオンの勾配を用いることができる(例えば、Cheungら、Biochim Biophys Acta、1414:205−216(1998))。この充填方法は、pH勾配技術と同じ基本的な原理による。弱塩基薬物の中性形態は、膜を透過することが可能であり、薬物−金属イオン複合体を形成させることにより、リポソームの水性の内側にとどまる。
水溶性弱塩基薬物をLNに充填させるために、薬物を水溶液(例えば、300mMショ糖、または適切なpHの等張性緩衝溶液)に溶解し、リポソーム懸濁物と混合し、次いで、適切な温度でインキュベーションすることができる。この薬物溶液は、薬物の溶解度を上げるために、少ない(膜を透過しない)量の水混和性の有機溶媒を含んでいてもよい(例えば、<10%エタノール)。インキュベーションの温度および時間は、脂質の組成および薬物の性質によって変わる。典型的には、コレステロールと、長鎖の飽和脂肪酸(例えば、DSPC/chol LN)で構成されているリポソームは、短鎖の飽和脂質(例えば、DMPC/chol)または不飽和脂質から形成されたLNよりも透過性が低く、迅速で効率的な充填を達成するために、高い温度が必要となる。例えば、DSPC/chol LNは、典型的には、60℃以上の温度を必要とし、充填は、典型的には、5〜15分後に終了するが、2時間かかる場合もある。
親油性弱塩基薬物を充填させるために、薬物を脂質と同様に処理することができる。例えば、脂質および薬物を一緒に混合し、リポソームを上述のように形成することができ、次いで、親油性薬物を、リポソーム二層の2つの単一層に分配する。上述の方法を用い、膜内外のpH勾配または他のイオン勾配に応答して、外側の単一層に存在する薬物を、リポソームの内側に保持させる(LN二層の内側の単一層に移動させる)。
さらなる局面では、本明細書に提示されるLN配合物を含む医薬組成物が提供される。また、本明細書に提示されるLN組成物を投与する工程を含む、疾患または状態を治療する方法が本明細書に提供される。なおさらなるの局面では、本明細書に記載のように、本明細書に記載のLN組成物と、本発明の方法論および用途を教示する指示資料とを含むキットが提供される。
リポソームと本発明の化合物とを含む医薬組成物は、標準的な技術および上述の技術にしたがって調製される。好ましくは、医薬組成物は、非経口投与される。すなわち、関節内(intraanicularly)投与、静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与される。さらに好ましくは、医薬組成物は、ボーラス注射または注入によって静脈内投与される。本発明で使用するために適した配合物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Philadelphia,Pa.、17th ed.(1985)中に見出される。
好ましくは、医薬組成物は、静脈内投与される。したがって、本発明は、許容されるキャリア、好ましくは、水性キャリアに懸濁したリポソームを含む、静脈内投与用の組成物を提供する。例えば、水、緩衝化した水、0.9%等張性食塩水などの種々の水性キャリアを使用してもよい。これらの組成物を、従来のよく知られている滅菌技術によって滅菌してもよく、または、滅菌濾過してもよい。得られた水性懸濁物を、そのまま使用するために包装してもよく、または、凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した製剤を、投与前に滅菌水溶液と混合する。組成物は、生理学的条件に近づけることが必要な場合、医薬的に許容される補助基質(例えば、pH調節剤および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール(PEG400)など)を含んでいてもよい。
医薬配合物中のリポソームの濃度は、さまざまであってもよく、例えば、約0.5mg/脂質mL未満、通常は、少なくとも約10〜50mg/脂質mLから、多くは100mg/脂質mLまたはそれ以上であってもよく、選択される特定の投与態様にしたがって、主に、流体の容積、粘度、安定性、必要とされる薬物の投薬量などによって選択される。
リポソームの電荷は、血管からのリポソームのクリアランスにおける重要な決定因子であり、負に帯電したリポソームの方が、網内系にすばやく取り込まれ(Juliano、Biochem.Biophys.Res.Commun.63:65 1(1975))、したがって、血流での半減期が短くなる。循環での半減期が長くなったリポソームは、典型的には、治療用途および診断用途で望ましく、リポソームは、腫瘍のような末梢の疾患に蓄積しなければならない。例えば、循環での半減期が2時間、8時間、12時間、または24時間までのリポソームが、特に好ましい。
さらに、リポソーム懸濁物は、脂質を遊離ラジカルから保護し、貯蔵中に脂質が過酸化物によって損傷を受けるのを防ぐ、脂質保護剤を含んでいてもよい。親油性の遊離ラジカル消失剤(例えば、α−トコフェロール)および水溶性の鉄特異的なキレート剤(例えば、フェリオキサミン)または抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸)が適している。
以下の実施例例証を用いて与えるが、これらは限定的なものではない。
実施例1−化学合成方法
弱塩基誘導体および修飾されていない薬物を、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)で定量した。この装置は、光ダイオードアレイ検出器(PDA)および三連四重極(TQ)MS検出器を取り付けたWaters(登録商標)Acquity(商標) UPLCシステムから構成されており、Empower(商標)データ収集ソフトウエアバージョン2.0を用いた(Waters、USA)。Waters(登録商標) Acquity(商標) BEH C18カラム(1.7μm、2.1×100mm)を用い、流速0.25mL/分で、分離を行い、移動相AおよびBは、それぞれ、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む水、および0.1%TFAを含むアセトニトリルであった。プレドニゾン誘導体およびエトポシド誘導体および修飾されていない薬物の場合、移動相は、0.1%ギ酸を含む水(A)および0.1%ギ酸を含むアセトニトリル(B)からなっていた。移動相は、カラム温度23℃で、プログラムした線形の勾配で運ばれた。
弱塩基誘導体および修飾されていない薬物を、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)で定量した。この装置は、光ダイオードアレイ検出器(PDA)および三連四重極(TQ)MS検出器を取り付けたWaters(登録商標)Acquity(商標) UPLCシステムから構成されており、Empower(商標)データ収集ソフトウエアバージョン2.0を用いた(Waters、USA)。Waters(登録商標) Acquity(商標) BEH C18カラム(1.7μm、2.1×100mm)を用い、流速0.25mL/分で、分離を行い、移動相AおよびBは、それぞれ、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む水、および0.1%TFAを含むアセトニトリルであった。プレドニゾン誘導体およびエトポシド誘導体および修飾されていない薬物の場合、移動相は、0.1%ギ酸を含む水(A)および0.1%ギ酸を含むアセトニトリル(B)からなっていた。移動相は、カラム温度23℃で、プログラムした線形の勾配で運ばれた。
ドセタキセル誘導体およびドセタキセルの場合、移動相の比率が50:50(A:B)から分離を開始した。この比率を、線形曲線を用いて2分間かけて10:90(A:B)まで変え、次いで、10:90(A:B)で0.5分間維持した。次いで、移動相を0.1分かけて50:50(A:B)に戻し、この比率を0.4分維持した後、次のサンプルを注入した。プレドニゾン誘導体およびプレドニゾンの場合、移動相の比率が80:20(A:B)から分離を開始した。この比率を、線形曲線を用いて4分かけて40:60(A:B)まで変え、次いで、0.1分かけて10:90(A:B)まで変化させた。後者の比率を0.4分間維持した。次いで、移動相を0.1分かけて80:20(A:B)まで戻し、この比率を0.9分間維持した後、次のサンプルを注入した。エトポシド誘導体およびエトポシドの場合、移動相の比率が80:20(A:B)から分離を開始した。この比率を、線形曲線を用いて1分かけて72.5:27.5(A:B)まで変え、次いで、3分かけて60:40(A:B)まで変え、0.1分かけて10:90(A:B)まで変えた。この比率を0.4分間維持した。次いで、移動相を0.1分かけて80:20(A:B)まで戻し、この比率を0.4分間維持した後、次のサンプルを注入した。
被分析物をPDAおよびTQ−MS検出器によって、波長230nm(ドセタキセルおよびドセタキセル誘導体の場合)、波長254nm(プレドニゾンおよびエトポシド誘導体の場合)で、それぞれ、ES+イオンモードおよびコーン電圧30Vで検出した。LN配合された誘導体を、TFAまたはギ酸で酸性にしたエタノールに溶解した(0.1%vol.)。血液の血漿サンプル中のLN配合された薬物を検出するために、血漿50μLを、TFAまたはギ酸で酸性にしたメタノール150μL(0.1%v/v)に加え、混合物を、10,000×g、4℃で30分間遠心分離処理し、沈殿したタンパク質をペレット状にした。プロドラッグを安定化させるために、メタノールを酸性にすることが必要であった。ドセタキセルおよびドセタキセル誘導体(TD−1)の場合、MS検出限界(LOD)は、TFAで酸性にしたメタノールを使用した場合、約1〜50ng/mLであった。この限界は、TFAの代わりにギ酸を用いることが必要な場合、nM未満の濃度まで下げることが可能である。
他の意味であると示されていない限り、1HNMRスペクトルおよび13CNMRスペクトルを、Bruker AV−300型(1Hの場合300MHz、13Cの場合75MHz)およびAV−400型(1Hの場合400MHz、13Cの場合100MHz)で、室温で記録した。化学シフトをパーツパーミリオン(ppm)でδスケールで報告し、カップリング定数Jは、ヘルツ(Hz)である。多重度は、「s」(一重線)、「d」(二重線)、「t」(三重線)、「q」(四重線)、「dd」(二重線の二重線)、「dt」(三重線の二重線)、「m」(多重線)、「b」(広がった)として記載する。低解像度質量分析スペクトル(m/z)は、電子スプレー(ESI)モードで得た。
LNに配合された誘導体を、Tecnai G2 20 TWIN Mk.2 Transmission Electron Microscope (CDRD Imaging、Vancouver、Canada)を用いて行ったCryo−TEMによって観察した。この装置を、bright−fieldモードで、200kVで操作した。FEI Eagle 4k HR CCDカメラおよび分析ソフトウレアFEI TIAを用いた低線量条件でデジタル画像を記録した。1〜3μmのアンダーフォーカスを用い、画像のコントラストを高めた。サンプルの調製を、Vitrobot Mark IV vitrification robot on Lacey Formvar 300 grids(Ted Pella製、番号01890)で行った。
すべての試薬および溶媒は、市販の製品であり、さらに精製することなく使用した。Silicycle 230〜400メッシュシリカゲルで、フラッシュクロマトグラフィーを行った。分析用TLCおよび分取用TLCを、蛍光指示薬を用い、Merckシリカゲル60プレートで行った。UV光、KMnO4またはp−アニスアルデヒドでスポットを視覚化した。
一般的な合成戦略
本明細書で提供する一般的な戦略(図10)は、適切な固定部位(例えば、OH基またはNH基)を含有する水不溶性の薬物1を、一般構造2によってあらわされる適切に調整された可溶化単位で誘導体化することを含む。また、この一般的なスキームは、親油性の弱塩基薬物誘導体の合成にも適用される。得られた水溶性接合体3を、推進力としてpH勾配またはイオン勾配を用い、LNに充填させることができる。誘導体3は、それ自体が活性であるか、および/または、生理学的条件下で活性な親薬物1に迅速に変換される。
本明細書で提供する一般的な戦略(図10)は、適切な固定部位(例えば、OH基またはNH基)を含有する水不溶性の薬物1を、一般構造2によってあらわされる適切に調整された可溶化単位で誘導体化することを含む。また、この一般的なスキームは、親油性の弱塩基薬物誘導体の合成にも適用される。得られた水溶性接合体3を、推進力としてpH勾配またはイオン勾配を用い、LNに充填させることができる。誘導体3は、それ自体が活性であるか、および/または、生理学的条件下で活性な親薬物1に迅速に変換される。
この技術は、例えば、(i)水への溶解度;(ii)プロトン化された窒素官能基のpKa;(iii)リポソーム充填条件下での安定性;(iv)生理学的条件下で遊離薬物の放出速度などの、3の多くの物理的性質に基づく。次に、これらの性質は、リンカー、スペーサー、2のR1基およびR2基の性質の関数である。
ある局面では、可溶化単位は、カルボキシリンカー基と、スペーサー(例えば、n−C1〜C4鎖)と、アミン基(例えば、N−メチルピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、またはジメチルアミン)とを含む。例示的な可溶化単位としては、
が挙げられ、式中、nは、1〜約10であるか、またはさらに好ましくは、1〜4である。
実施例2−タキサン誘導体
ドセタキセルは、N−メチル−ピペラジニルブタン酸を用い、C−2’位のヒドロキシル基で誘導体化され、以下に示すようなアミノエステルプロドラッグ(TD1)を形成する。
ドセタキセルは、N−メチル−ピペラジニルブタン酸を用い、C−2’位のヒドロキシル基で誘導体化され、以下に示すようなアミノエステルプロドラッグ(TD1)を形成する。
ドセタキセルの2’−O−(N−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル)誘導体(TD1)
リンカー合成:4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸塩酸塩
リンカー合成:4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸塩酸塩
4−ブロモブタン酸エチル(2.5mL、17.3mmol)の酢酸エチル(50mL)溶液を室温で撹拌し、これに1−メチルピペラジン(7.68mL、70mmol、4当量)を加えた。この溶液を25℃で1時間撹拌すると、この間に白色沈殿が発生し、次いで、油浴で1時間かけて70℃まで加熱した。TLC分析(ヘキサン中、20%酢酸エチル(EtOAc)、Rf=0.9(出発物質)、0.1(生成物)、ヨウ素、I2で視覚化)によって、臭化物試薬が完全に消費されていることが示された。反応物をEtOAc(100mL)で希釈し、分液漏斗に移し、有機相を水(100mL)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3、飽和、100mL×2回)、塩水(100mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム(MgSO4)で乾燥し、濃縮し、わずかに黄色の油状物を得た。この油状物を塩化メチレン(20mL)に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルの栓(ヘキサン中、20%EtOAc、SiO2 150mL)にロードした。所望の生成物を、徐々に極性を高めた溶出液(まず、ヘキサン中、20%EtOAc、次いで、EtOAc中、5〜25%MeOH(5%NH4OHを含有する)を用い、このシリカから溶出させた。
所望の物質を有する画分を保存し、濃縮し、エチル−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタノエートを得た(3.63g、定量的)。この得られた油状物を含有するフラスコに、水(20mL)および塩酸(HCl、10M、20mL、10当量)を加えた。このフラスコに還流コンデンサを取り付け、110℃で3時間加熱した。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、次いで、減圧下で油状残渣のみが残るまで濃縮した。この残渣を蒸留水に再び溶解し、濃縮プロセスを繰り返した。得られたシロップ状物を、85℃でエタノール(50mL)に溶解した。すべての固体を溶解するために必要な少量の水(約1mL)を加えた(大量の水を加えると、収率に悪い影響を与えるであろう)。この溶液を室温で3時間放置し、次いで、冷蔵庫(5℃)に移して16時間放置した。沈殿を濾別し、あらかじめ秤量しておいたバイアルに移し、Drieriteを入れたデシケーターに、高減圧状態で16時間放置し、4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸塩酸塩を結晶性の非吸湿性物質として得た(3.02g、1HCl塩を基準として80%)。
1H NMR(D2O,400MHz) δ (ppm)=3.60(br s,8H),3.26−3.22(m,2H),2.93(s,3H),2.43(t,J=7.0Hz,2H),1.99−1.91(m,2H).13C NMR(D2O,100MHz) δ (ppm)=176.5,55.9,50.2,48.7,42.8,30.3,18.7.
エステル化および塩形成:TD−1塩酸塩
エステル化および塩形成:TD−1塩酸塩
ドセタキセル(3.997g、4.95mmol)および4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸塩酸塩(1.213g、5.44mmol、1.1当量)のジクロロメタン(CH2Cl2、60mL)溶液を撹拌し、これにトリエチルアミン(NEt3、10.0mL、5当量)を加えた。この反応容器を氷浴で冷却し、向山試薬(2−クロロ−1−メチルピリジニウムヨージド、1.667g、6.53mmol、1.32当量)を加えた。この溶液は、ピリジニウム塩が溶解するにつれて、黄色になった。30分後にフラスコを氷浴からはずし、反応をさらに16時間進めた。TLCによって、出発物質から所望の生成物への変換は良好ではあるが、完結してはいないことが示された(CH2Cl2中、8%MeOH(5%NH4OH含有)、5%H2SO4エタノール溶液で染色)。この氷冷した溶液を撹拌しながら、さらに0.5当量の上述のピリジニウム塩(0.632g、0.5当量)およびアミノ酸(0.120g、0.1当量)を加えた。3時間後、反応混合物を高減圧下でロータリーエバポレーターで濃縮し、わずかに橙色の固体を得た。この固体をCH2Cl2(150mL)およびEtOAc(20mL)に溶解し、分液漏斗に移し、有機相と飽和NaHCO3溶液(100mL)とに分配した。次いで、有機相を塩水(100mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮し、わずかに金色のシロップ状物を得た。このシロップ状物をCH2Cl2(20mL)に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルカラム(CH2Cl2中、4%MeOH(5%NH4OH含有)、250mL、直径40mm)にロードし、徐々に極性を高めた溶媒(CH2Cl2中、4〜10%MeOH(5%NH4OH含有)、増分2%、500mL/増分)で溶出させた。
所望の物質を有する画分を集め、濃縮し、化合物3.8909g(80.5%)を得た。この化合物の1H NMR分析から、純度は良好であり、位置異性体に属するピークの存在(約10%)が示された。この物質をCH2Cl2に再び溶解し、上述と同じクロマトグラフィー条件に付し、CH2Cl2中、MeOHを5〜10%まで1%ずつ増加させた(500mL/増分)。純粋な物質を含む画分をTLCで同定し、集め、濃縮し、きれいなNMRスペクトルを有する化合物2.96gを得た。
この物質を2−プロパノール(45mL)に溶解し、冷却しつつ(0℃)、HCl(6.3mL、 ジエチルエーテル(Et2O)中1M、2.05当量)を滴下し、塩酸塩を生成させた。懸濁物を乾燥するまで濃縮し、得られたクリーム色の固体を高減圧下で乾燥し、2−プロパノール(45mL)にEt2O(10mL)を加えることによって再結晶化させた。ブフナー漏斗で沈殿を濾別し、高減圧下で18時間乾燥し、約2.5gを得た。ドセタキセル誘導体(TD−1)をNMR、質量分析計、元素分析、UHPLC−UVで特性決定し、属性および純度を確認した。UHPLC−UVによるクロマトグラフィー純度は、96.7%であった。
1H NMR(400MHz,D2O): δ (ppm)=8.11(d,J=7.4Hz,2H),7.65(t,J=7.4Hz,1H),7.56(t,J=7.7Hz,2H),7.43−7.37(m,4H),7.25(br t,J=6.2Hz,1H),6.09(m,1H),5.61(d,J=7.1Hz,1H),5.32(m,1H),5.27−5.24(m,2H),4.99(d,J=8.1Hz,1H),4.22−4.13(m,3H),3.83(br d,J=6.8Hz,1H),3.61(s,1H),3.21−3.09(m,2H),2.67−2.33(m,6H),2.23−2.17(m,1H),2.12−1.98(m,2H),1.97−1.76(m, 5H),1.68(s,3H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H). 13C NMR(100 MHz,D2O) δ (ppm)=211.22,173.26,172.48,170.57,167.58,157.22,138.72,136.13,134.48,129.96,129.29,129.00,128.77,126.95,84.49,80.87,78.51,76.55,75.55,75.04,74.26,72.65,71.28,57.39,55.59,50.32,48.78,46.29,42.83,42.68,35.25,34.73,30.13,29.83,29.60,27.51,25.900,23.69,22.43,20.75,18.77,16.78,13.60,9.55.
元素分析:TD−1+2HCl+1H2Oに基づく計算値:C,58.53;H,6.90;Cl,6.65;N,3.94;実測値:C,58.50;H,6.97;Cl,6.58;N,4.13;HPLC/MS(m/z);977.4(m+H)、UPLC−UVによる面積96.7%。
元素分析:TD−1+2HCl+1H2Oに基づく計算値:C,58.53;H,6.90;Cl,6.65;N,3.94;実測値:C,58.50;H,6.97;Cl,6.58;N,4.13;HPLC/MS(m/z);977.4(m+H)、UPLC−UVによる面積96.7%。
TD1類似体
TD1は、O−2’に二塩基性アミノ酸エステルを含有し、このエステルは、親化合物(ドセタキセル)が、周辺にある基の関与によって直接放出されるのに役立つと考えられる。TD1類似体群を、以下に示すように合成した。この類似体は、アミノ−アシルリンカーの鎖の長さがさまざまであり、この塩基性アミノ−アシル部分の構造は、隣接基の補助によって、エステルの加水分解を調節するように設計されており(Popら、Pharmaceutical Research、13(3):469−475(1996);Rautioら、J.Med.Chem.、43(3):1489−1494(2000))、種々の治療用途のために、親化合物が放出される速度を、精密に調節することができる。
TD1は、O−2’に二塩基性アミノ酸エステルを含有し、このエステルは、親化合物(ドセタキセル)が、周辺にある基の関与によって直接放出されるのに役立つと考えられる。TD1類似体群を、以下に示すように合成した。この類似体は、アミノ−アシルリンカーの鎖の長さがさまざまであり、この塩基性アミノ−アシル部分の構造は、隣接基の補助によって、エステルの加水分解を調節するように設計されており(Popら、Pharmaceutical Research、13(3):469−475(1996);Rautioら、J.Med.Chem.、43(3):1489−1494(2000))、種々の治療用途のために、親化合物が放出される速度を、精密に調節することができる。
閉環反応の場合、分子内エステル加水分解の場合のように、反応中心がsp2混成である場合、3〜7員環の環遷移状態が好ましい。アミンがカルボニルに直接作用し、親薬物および活性化したアシル−アンモニウム中間体を生成するモードA;アミンが一般的な塩基として作用し、溶媒(この場合には水)の求核性を高め、これにより加水分解速度が上がり、双性イオン性アミノ酸を放出するモードBの2種類の可能な加水分解モードが存在する。以下のように合成したTD1類似体はすべて、モードAによって加水分解することができる。短いアミノ酸エステル(n=1〜3)のみ、モードBによって加水分解することができる。
第1の類似体群では、弱塩基可溶化単位は、TD1と比較して長さがさまざまなアルキルリンカーを有するピペラジニルアミノ部分、を含む。この次の類似体群では、同じアルキルリンカーを用いており、アミノ部分は、さまざまであり、モルホリノ置換基およびピペリジニル置換基を含んでいた。アミノ部分は、次の順序で求核性が異なっている:N−メチルピペラジン>モルホリン>ピペリジン(例えば、Baldwin、J.Chem.Soc.Chem.Commun.、734−736(1976);Baldwinら、J.Org.Chem.、42(24):3846−3852(1977))。塩基性は逆であり、N−メチルピペリジンは、N-−メチルピペラジンよりもpKaが2単位大きい。このように、N−メチルピペラジノ化合物は、モードAの加水分解を受けやすく、低いpH値でプロトン化が達成されると予想される。
アミノ−エステルへのN−アルキル化(一般的な手順)
tert−ブチル 3−(4−メチルピペラジン−1−イル)プロパノエート
tert−ブチル 3−(4−メチルピペラジン−1−イル)プロパノエート
tert−ブチル 3−ブロモプロピオネート(3.0mL、18mmol)の酢酸エチル(15mL)溶液を0℃で撹拌し、これに4−メチルピペラジン(7.68mL、70mmol、4当量)を加えた。この溶液を25℃で1時間撹拌すると、この間に白色沈殿が発生し、次いで、油浴で2時間かけて55℃まで加熱した。TLC分析(ヘキサン中、20%EtOAc、Rf=0.9(出発物質)、0.1(生成物))によって、臭化物試薬が完全に消費されていることが示された。反応物をEtOAc(100mL)で希釈し、分液漏斗に移し、有機相を水(100mL)、NaHCO3(飽和、100mL×2回)、塩水(100mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮し、わずかに黄色の油状物を得た。この油状物を塩化メチレン(20mL)に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルの栓(ヘキサン中、20%EtOAc、SiO2 150mL)にロードし、所望の生成物を、徐々に極性を高めた溶出液(ヘキサン中、EtOAc、20%から開始し、200mL容積を増分10%で100%まで増加させる)を用い、このシリカから溶出させた。所望の物質を有する画分を濃縮し、tert−ブチル 3−(4−メチルピペラジン−1−イル)プロパノエート(4.1g、定量的)を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ (ppm)=3.45(d,J=3Hz,2H),2.64(t,J=7.3Hz,2H),2.47(br s,6H),2.38(t,J=7.3Hz,2H),2.25(s,3H),1.42(s,9H).
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を調製した。
2−(4−メチルピペラジン−1−イル)酢酸ベンジル
1H NMR(400MHz,CDCl3) δ (ppm)=7.33−7.27(m,5H),5.15(s,2H),3.25(s,2H),2.60(br s,4H),2.48(br s,4H),2.27(s,3H).
5−(4−メチルピペラジン−1−イル)ペンタン酸エチル
1H NMR(400MHz,CDCl3) δ (ppm)=4.10(q,J=7.2Hz,2H),2.43(br s,6H),2.35−2.28(m,4H),2.26(s,3H),1.79(br s,2H),1.62(p,J=7.2Hz,2H),1.54−1.46(m,2H),1.23(t,7.2Hz).
2−モルホリノ酢酸ベンジル
1H NMR(400MHz,CDCl3) δ (ppm)=7.46−7.30(m,5H),5.16(s,2H),3.74(t,J=4.7Hz,4H),3.25(s,2H),2.58(t,J=4.7Hz,4H).
tert−ブチル 3−モルホリノプロパノエート
1H NMR(400MHz,CDCl3) δ (ppm)=3.68(t,J=4.5,$H),2.63(t,J=7.3Hz,2H),2.44(t,J=4.5Hz,4H),2.39(t,J=7.3Hz,2H),1.44(s,9H).
4−モルホリノブタン酸エチル
1H NMR(400MHz,CDCl3) δ (ppm)=4.11(q,J=7.1Hz,2H),3.68(t,J=4.7Hz,4H),2.42−2.38(m,4H),2.37−2.31(m,4H),1.80(p,J=7.3Hz,2H),1.24(q,J=7.1Hz,3H).
5−モルホリノペンタン酸エチル
1H NMR(400MHz,CDCl3) δ (ppm)=4.11(q,J=7.1Hz,2H),3.68(t,J=4.7Hz,4H),2.42−2.38(m,4H),2.37−2.27(m,4H),1.80−1.73(m,2H),1.53−1.45(m,2H),1.24(q,J=7.1Hz,3H).
アミノ酸への加水分解(一般的な手順)
3−(4−メチルピペラジン−1−イル)プロピオン酸塩酸塩(TD11)
丸底フラスコにtert−ブチル 3−(4−メチルピペラジン−1−イル)プロパノエート(4.1g、18mmol)を入れ、磁気撹拌子を入れ、水(20mL)およびHCl(10M、20mL、10当量)を加えた。このフラスコに還流コンデンサを取り付け、油浴に置き、110℃の温度の浴で3時間加熱した。この反応物のTLC分析は行わなかった。反応物を油浴からはずし、室温まで冷却した。反応物を十分に冷却したら、油によって駆動する高減圧ポンプに接続したロータリーエバポレーターに移した。フラスコの内容物を、圧力が0.1mmHgになるまで濃縮し、油性残渣のみが残った。次いで、このフラスコをはずし、内容物を蒸留水に再び溶解し、エバポレーションプロセスを繰り返し、この時点でシロップ状物を得て、これは、高減圧下で水を除去すると泡立った。この未精製物質が、顕著な量の残留HClを含んでいる場合、以下の条件で結晶化を行うと、酸が再びエステル化し、収率に悪い影響を与えるであろうことを注記しておくべきである。エタノール(50mL)および磁気撹拌子を加え、フラスコを85℃の油浴に漬け、シロップ状になるまで溶解した。還流状態になっても、すべての物質は溶解しなかったので、すべての固体が溶解するまで、少量の水(約1mL)を滴下様式で加えた。この時点で過剰量の水を加えると、収率に悪い影響を与えるであろう。
得られた溶液を油浴からはずし、室温で3時間放置した後、冷蔵庫(5℃)に移して16時間放置した。固体を超音波処理によって懸濁させ、フラスコの側面からはがし、濾紙で覆ったブフナー漏斗で濾過した。次いで、あらかじめ秤量しておいたバイアルに結晶を移し、Drieriteを入れたデシケーターに、高減圧状態で16時間乾燥し、空気中で安定な、結晶性で非吸湿性の固体物質を得た(3.07g、1HCl塩を基準として82%)。1H NMR(D2O, 400 MHz) δ (ppm)=3.6(br s,8H),3.48(t,J=6.8Hz,2H),2.93(s,3H),2.83(t,J=6.8Hz,2H).
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を調製した。
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を調製した。
2−(4−メチルピペラジン−1−イル)酢酸塩酸塩(TD2)
1H NMR(D2O, 400 MHz) δ (ppm)=3.87(s,2H),3.85−3.35(br m,8H),2.93(s,3H).
5−(4−メチルピペラジン−1−イル)ペンタン酸塩酸塩(TD3)
1H NMR(D2O, 400 MHz) δ (ppm)=3.59(br s,8H),3.22(t,J=7.8Hz,2H),2.93(s,3H),2.36(t,J=7.2Hz,2H),1.75−1.69(m,2H),1.57(p,J=7.8Hz).
4−モルホリノブタン酸塩酸塩(TD4)
1H NMR(D2O, 400 MHz) δ (ppm)=4.02(br d,J=12.3Hz,2H),3.73(br t,J=12.3Hz,2H),3.46(br d,J=12.3Hz,2H),3.15−3.06(m,4H),2.41(t,J=7.1Hz,2H),1.97−1.89(m,2H).
2−モルホリノ酢酸塩酸塩(TD5)
1H NMR(D2O,400MHz) δ (ppm)=4.10−3.70(m,6H),3.50(br s,2H),3.2(br s,2H).
(3−モルホリノプロピオン酸塩酸塩(TD6)
1H NMR(D2O,400MHz) δ (ppm)=4.02(br d,J=12.3Hz,2H),3.73(br t,J=12.3Hz,2H),3.46(br d,J=12.3Hz,2H),3.39(t,J=7.0Hz,2H),3.13(br t,J=12.3Hz,2H),2.79(t,J=7.0Hz,2H).
5−モルホリノペンタン酸塩酸塩(TD12)
1H NMR(D2O, 400 MHz) δ (ppm)=4.02(br d,J=12.3Hz,2H),3.73(br t,J=12.3Hz,2H),3.46(br d,J=12.3Hz,2H),3.15−3.06(m,4H),2.41(t,J=7.1Hz,2H),1.72−1.66(m,2H),1.60−1.52(m,2H).
4−(ピペリジン−1−イル)ブタン酸塩酸塩(TD7)
1H NMR(D2O, 400 MHz) δ (ppm)=3.43(br d,J=12.1Hz,2H),3.04−2.99(m,2H),2.88 (td,J=2.7, 12.1Hz,2H),2.38(t,J=7.1Hz,2H),1.95−1.80(m,4H),1.76−1.55(m,3H),1.45−1.32(m,1H).
2−(ピペリジン−1−イル)酢酸塩酸塩(TD8)
5−(ピペリジン−1−イル)ペンタン酸塩酸塩(TD9)
1H NMR(D2O,400 MHz) δ (ppm)=3.43(br d,J=12.1Hz,2H),3.04−2.99(m,2H),2.80(td,J=2.7,12.1Hz,2H),2.38(t,J=7.1Hz,2H),1.88−1.78(m,2H),1.76−1.49(m,7H),1.45−1.32(m,1H).
3−(ピペリジン−1−イル)プロピオン酸塩酸塩(TD13)
1H NMR(D2O, 400 MHz) δ (ppm)=3.43(br d,J=12.1Hz,2H),3.29(t,J=7.1Hz,2H),2.88(td,J=2.7,12.1Hz,2H),2.76(t,J=7.1Hz,2H),1.85−1.80(m,2H),1.76−1.62(m,3H),1.45−1.32(m,1H).
2’−O−アシル化(一般的な手順)
TD4:モルホリノブタン酸エステル
25mLの丸底フラスコ中、4−モルホリノブタン酸塩酸塩(0.095g、0.45mmol、1.2当量)を、ピリジン(4mL)およびDBU(0.140mL、3当量)に溶かし、撹拌した溶液を氷浴で0℃で冷却し、アセトニトリル(2mL)を加え、次いで、タキソテール(登録商標)(0.303g、0.375mmol、1当量)を加えた。1−エチル−3−(3’−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI、0.180g、2.5当量)を15分かけて何回かにわけて加えた。得られた懸濁物を撹拌し、氷浴を16時間かけて融かしながら、室温まで徐々に加温した。TLC分析(EtOAc中、30%ヘキサン/6%MeOH(5%NH4OHを加えたもの))によって、この時点でほぼ完全に変換されていることがわかった。エタノール(2mL)を加え、フラスコをロータリーエバポレーターに移し、高減圧下で濃縮した。得られた油状物をエタノールに再び溶解し、再び濃縮した。乾燥した残渣を塩化メチレン(約4mL)に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルカラム(シリカ60mL、EtOAc中、30%ヘキサン/2%MeOH(5%NH4OHを加えたもの))にロードし、徐々に極性を高めた溶媒混合物(2〜8%MeOH、増分2%、100mL/増分)で溶出させた。所望の物質を有する画分を集め、濃縮し、所望の化合物を得た(0.255g、71%)。
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ(ppm)=8.11(d,J=7.4Hz,2H),7.71−7.48(m,3H),7.48−7.31(m,4H),7.25(m,1H),6.09(m,1H),5.63(d,J=7.1Hz,1H),5.40−5.16(m,3H),4.99(d,J=8.1Hz,1H),4.28−4.13(m,3H),3.86(br d,J=6.8Hz,1H),3.64(m,4H),2.67−2.10(m,14H),1.99−1.72(m,7H),1.68(s,3H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).
この物質をEtOAc/ヘキサンから再結晶化させ、生物学的試験および溶解度試験に使用した。再結晶化させた後、HPLC/MS(m/z);963.2(m+H)UVによる面積99.8%。
この物質をEtOAc/ヘキサンから再結晶化させ、生物学的試験および溶解度試験に使用した。再結晶化させた後、HPLC/MS(m/z);963.2(m+H)UVによる面積99.8%。
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を生成させた。
TD2:N−メチル−ピペラジニル酢酸エステル
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ(ppm)=8.11(d,J=7.4Hz,2H),7.66(t,J=7.4Hz,1H),7.57(t,J=7.7Hz,2H),7.41(m,4H),7.25(m,1H),6.08(m,1H),5.62(d,J=7.1Hz,1H),5.42(d,2H),5.27(s,1H),4.99(d,J=8.1Hz,1H),4.29−4.13(m,3H),3.85(br d,J=6.8Hz,1H),3.42−3.33(m,3H),2.71−2.27(m,16H),2.03(q,1H),1.92(s,3H),1.89−1.79(m,1H),1.68(s,3H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z);949.4(m+H)UVによる面積95%。
TD3:N−メチル−ピペラジニルペンタン酸エステル
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ(ppm)=8.11(d,J=7.4Hz,2H),7.66(t,J=7.4Hz,1H),7.57(t,J=7.7Hz,2H),7.41(m,4H),7.25(m,1H),6.08(m,1H),5.62(d,J=7.1Hz,1H),5.37−5.18(m,3H),4.99(d,J=8.1Hz,1H),4.29−4.13(m,3H),3.85(d,J=6.8Hz,1H 1H),3.63−3.48(m,5H),2.80−2.27(m,24H),2.27−2.13(m,1H),2.03(q,2H),1.97−1.54(m,19H),1.57−1.49(br m,H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z);990.6(m+H)UVによる面積96%。
TD5:モルホリノ酢酸エステル
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ(ppm)=8.12(d,J=7.4Hz,2H),7.64(t,J=7.4Hz,1H),7.59−7.50(m,2H),7.44−7.34(m,4H),7.32−7.20(m,1H),6.16(m,1H),5.64(d,J=7.1Hz,1H),5.42(br d,2H),5.27(s,1H),5.01(d,J=8.1Hz,1H),4.27−4.15(m,3H),3.89(d,J=6.8Hz,1H),3.71−3.58(m,4H),3.38(d,1H),2.54−2.26(m,9H),2.12−2.01(m,1H),1.92(s,3H),1.87−1.76(m,1H),1.69(s,3H),),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z);936.1(m+H)UVによる面積98%。
TD6:モルホリノプロピオン酸エステル
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ(ppm)=8.11(d,J=7.4Hz,2H),7.66(t,J=7.4Hz,1H),7.61−7.50(m,2H),7.45-7.33(m,4H),7.30-7.20(m,1H),6.09(m,1H),5.63(d,J=7.1Hz,1H),5.39−5.16(m,3H),5.00(d,J=8.1Hz,1H),4.27−4.13(m,3H),3.86(d,J=6.8Hz,1H),3.70−3.54(m,4H),2.72−2.56(m,4H),2.52−2.29(m,8H),2.29−2.14(m,1H),1.99−1.86(m,4H),1.86-1.75(m,2H),1.68(m,13H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z);950.9(m+H)UVによる面積94%。
TD8:ピペリジニル酢酸エステル
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ(ppm)=8.16(d,J=7.4Hz,2H),7.63(t,J=7.4Hz,1H),7.54(t,J=7.7Hz,2H),7.44−7.34(m,4H),7.27(m,1H),6.17(m,1H),5.65(d,J=7.1Hz,1H),5.49−5.38(m,2H),5.28(s,1H),5.01(d,J=8.1Hz,1H),4.24−4.15(m,3H),3.90(d,J=6.8Hz,1H),3.36−3.32(m,1H),3.19−3.11(m,1H),2.57−2.25(m,9H),2.16−2.06(m,1H),1.92(s,3H),1.87−1.76(m,1H),1.69(s,3H),1.65−1.50(m,4H),1.40−1.22(m,11H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z);933.8(m+H)UVによる面積94%。
TD7:ピペリジニルブタン酸エステル
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ(ppm)=8.11(d,J=7.4Hz,2H),7.65(t,J=7.4Hz,1H),7.56(t,J=7.7Hz,2H),7.44−7.33(m,4H),7.29−7.20(m,1H),6.09(m,1H),5.63(d,J=7.1Hz,1H),5.36−5.30(m,1H),5.29−5.26(m,2H),5.03−4.95(m,1H),4.27−4.14(m,3H),3.86(d,J=6.8Hz,1H),2.59−2.16(m,15H),2.01−1.75(m,8H),1.68(s,3H),1.64−1.54(m,5H),1.47(m,3H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z);962.5(m+H)UVによる面積94%。
TD9:ピペリジニルペンタン酸エステル
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ(ppm)=8.11(d,J=7.4Hz,2H),7.66(,J=7.4Hz,1H),7.57(t,J=7.7Hz,2H),7.45−7.33(m,4H),7.25(br s,1H),6.08(m,1H),5.62(d,J=7.1Hz,1H),5.31(m,1H),5.28−5.18(m,2H),4.99(d,J=8.1Hz,1H),4.27−4.15(m,3H),3.85(d,J=6.8Hz,1H),2.51−2.18(m,17H),1.97−1.75(m,5H),1.75−1.46(m,20H),1.43−1.38(m,10H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z);976.2(m+H)UVによる面積96%。
7−OHアシル化(一般的な手順)
保護:GCW00006−09
保護:GCW00006−09
ドセタキセル(0.746g、0.923mmol)を、塩化メチレン(20mL)およびピリジン(1.6mL)に溶解し、撹拌し、冷却した(−45℃)溶液に、クロロギ酸トリクロロエチル(Troc−Cl、0.137mL、1.01mmol、1.1当量)を滴下様式で加えた。反応物を低温で1時間撹拌し、第2の等しい量のTroc−Cl(0.137mL、1.01mmol、1.1当量)を滴下様式で加えた。次の16時間、反応物を撹拌しつつ、室温まで徐々に加温した。この時点で、TLC分析(ヘキサン中、30%EtOAc)によって、少量の出発物質が残っており、2’,10−ジ−Troc保護された化合物、2’,7−ジ−Troc保護された化合物、2’,7,10−トリ−Troc保護された化合物であると予想される3種類の新しいスポットが生成していることが示された。反応物を最小限の量のエタノールで希釈し、取り付けたロータリーエバポレーターで高減圧で乾燥するまで濃縮した。次いで、残渣を最小限の量のCH2Cl2に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルカラム(3cm×20cm、ヘキサン中、20%EtOAc)にロードした。徐々に極性を高めた溶媒混合物(ヘキサン中、20〜60%EtOAc、容積100mL、増分5%)を用い、所望の生成物をカラムから注意深く溶出させ、集め、透明画分を濃縮し、所望の異性体をアモルファス白色固体として得た(0.433g、40%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3) δ (ppm)=8.11(d,2H),7.61(t,1H),7.51(t,2H),7.45−7.33(m,5H),6.29(m,1H),6.16(s,1H),5.69(d,1H),5.59−5.56(m,1H),5.55−5.42(m,2H),5.35(br s,1H),4.96(br d,1H),4.89(d,1H),4.76(q,2H),4.69(d,1H),4.41−4.37(m,1H),4.32(d,1H),4.18(d,1H),3.96−3.91(m,3H),3.78(d,1H),2.61−2.53(m,1H),2.43(s,3H),2.39−2.18(m,3H),2.11−1.76(m,11H),1.73(br s,1H),1.69(s,3H),1.32(s,9H),1.28−1.17(m,6H).
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を作成した。
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を作成した。
エステル化:GCW00006−10
丸底フラスコに4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸塩酸塩(0.58g、2.61mmol)と磁気撹拌子を入れ、これに、塩化チオニル(15mL)を加えた。得られた溶液を加熱して1.5時間還流させ、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、無水トルエン(10mL)で懸濁させ、ロータリーエバポレーターで再び濃縮して白色固体を得て、高減圧ラインで、一定重量になり、塩化チオニルまたは塩酸の臭気がしなくなるまで3時間乾燥した。
GCW00006−09(0.433g、0.375mmol)の塩化メチレン(Dri−Solve、8mL)溶液に、磁気撹拌子を入れておき、これにN,N−ジメチルアミノ−ピリジン(DMAP、0.229g、5当量)を加えた。この溶液を0℃まで冷却し、上述のアミノアシルクロリド塩酸塩(0.100g、1.1当量)を数分間にわたって何回かにわけて加えた。DMAPは、モノアミノアシル化された化合物と一緒に溶出される傾向があるため、出発物質の消費についてTLC分析にもとづいて反応を追跡した。2時間後、ある程度出発物質がまだ残っていることがTLCによって観察され、さらなるアミノ−アシルクロリド塩酸塩(0.05g、0.55当量)を加えた。室温でさらに1時間撹拌した後、TLCによって、出発物質がほぼ完全に消費されたことが示された。反応物をロータリーエバポレーターで濃縮して油状物を得て、これを少量のCH2Cl2(5mL)に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカカラム(3cm×20cm、4:1 CH2Cl2/ヘキサン)にロードし、フラッシュクロマトグラフィー(4:1 CH2Cl2/ヘキサン、1−10%MeOH(5%NH4OHを含有する)を含む)に付した。所望の物質を含む画分を集め、濃縮して無色ガラス状物を得た(0.284g、57%)。
1H NMR(400MHz,CD3OD) δ (ppm)=8.11(d,J=7.5Hz,2H),7.61(t,J=7.7Hz,1H),7.51(t,J=7.7Hz,2H),7.43−7.39(m,4H),7.28−7.26(m,1H),6.13−6.05(m,2H),5.64(d,J=6.8Hz,1H),5.60−5.56(m,1H),5.55−5.42(m,2H),5.36−5.34(m,1H),4.99(d,J=6.8Hz,1H),4.92(d,J=11.2Hz,1H),4.83(d,J=11.2Hz,1H),4.19(dd,J=8.2,19.0Hz,1H),3.85(d,J=6.3Hz,1H),2.67−2.22(m,20H),2.05−1.89(m,4H),1.82−1.71(m,6H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z);1325.7(m+H)UVによる面積83%(10%メチルカーボネートが混入していた(m/z=1210.4))。
TD10を生成する脱保護:7−O−(N−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル)
GCW00006−10(0.276g、0.2mmol)をメタノールおよび酢酸(50mL、10%AcOH)に溶かし、この溶液を激しく撹拌し、亜鉛元素粉末(約0.1g)を加えた。反応をTLCで監視し、1時間以内に出発物質はすべて消費され、1種類の移動距離が小さなスポットに変換された(CH2Cl2中、10%MeOH(5%NH4OH含))。反応物をMeOH(50mL)で希釈し、濾紙で覆ったブフナー漏斗で濾過した。得られた溶液を、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで濃縮し、固いシロップ状物を得て、これをCH2Cl2(5mL)に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルカラム(3cm×15cm、CH2Cl2中、2%MeOH(5%NH4OH含))にロードし、徐々に極性を高めた溶媒(CH2Cl2中、2〜10%MeOH(5%NH4OH含)、増分2%、150mL/増分)で溶出させた。TLCで決定したように、透明物質を含有する画分を集め、濃縮し、白色固体(0.0764、39%)を得た。HPLC/MSから、位置は決定されないが、親化合物にメチルカーボネート置換基を含む少量の混入物質(約10%)が含まれていることが示されている。
(m/z=1035.3)1H NMR(400MHz,CD3OD) δ (ppm)=8.12(d,J=7.5Hz,2H),7.68(t,J=7.7Hz,1H),7.58(t,J=7.7Hz,2H),7.43−7.39(m,4H),7.28−7.26(m,1H),6.13−6.05(m,2H),5.67(d,J=6.8Hz,1H),5.60−5.56(m,1H),5.38(s,1H),5.14(br s,1H),5.01(d,J=6.8Hz,1H),4.52(br s,1H),3.98(d,J=6.3Hz,1H),2.67−2.22(m,18H),2.10−1.71(m,10H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.12(s,3H).13C NMR(100MHz,CD3OD) δ (ppm)=209.32,173.04,172.30,170.61,166.25,156.36,145.92,139.27,138.27,136.40,133.20,129.98,129.78,128.31,128.19,127.38,126.83,83.70,80.46,79.32,77.75,76.12,74.86,74.24,74.03,71.68,71.00,57.16,57.00,56.14,54.18,52.14,46.06,44.51,42.98,37.97,35.41,32.98,31.33,31.19,27.30,25.39,21.69,21.43,21.28,20.17.HPLC/MS(m/z);977.1(m+H)UVによる面積85%。
実施例3−水溶性プレドニゾン誘導体
N−メチル−ピペラジニル−ブタン酸エステル
リンカー合成
N−メチル−ピペラジニル−ブタン酸エステル
リンカー合成
4−ブロモブタン酸エチル(5.75g、29.5mmol;Aldrich No.167118)、1−メチルピペラジン(3.55mL、32.0mmol;Aldrich No.130001)、無水K2CO3(4.5g、32.5mmol;Fisher No.P208)をアセトニトリル(MeCN、150mL)中で混合し、18時間還流させた後、減圧下で濃縮した。次いで、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで抽出した(DCM、150mL×3回)。有機抽出物を合わせ、水(150mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、減圧下で濃縮し、4−(4−メチルピペリジン−1−イル)ブタン酸エチル(6.01g、96%)を黄色油状物として得た。
1H NMR(CDCl3):4.03(q,2H,J=7.15 Hz),2.29−2.44(m,7H),2.21−2.28(m,5H),2.18(s,3H),1.67−1.75(m,2H),1.18(t,3H,J=7.14 Hz) 13C NMR(CDCl3):174.4,61.1,58.5,56.1,54.0,47.0,33.2,23.1,15.2
ESI−MS:215.1[M+H]+;237.2[M+Na]+
ESI−MS:215.1[M+H]+;237.2[M+Na]+
4−4(メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸エチル(6.01g、28.1mmol)のテトラヒドロフラン(THF、150mL)溶液に、NaOH(1.20g、30mmol)の水(150mL)溶液を加えた。混合物を室温で18時間撹拌した後、乾燥するまで濃縮し、4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸ナトリウム(6.06g、定量的)を白色粉末として得た。
13C NMR(MeOH−d4): 181.0,58.2,54.2,52.4,44.8,35.7,23.2
ESI−MS:187.3[M+H]+;209.2[M+Na]+
エステル化
ESI−MS:187.3[M+H]+;209.2[M+Na]+
エステル化
4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸ナトリウム(128mg、0.615mmol)、プレドニゾン(200mg、0.559mmol)のアセトニトリル(MeCN、10mL)懸濁物に、2−クロロ−1−メチル−ピリジニウムヨージド(235mg、0.922mmol;Aldrich No.198005)を加えた。得られた懸濁物を室温で18時間撹拌した後、水(30mL)を加えて反応を停止させた。次いで、生成物を酢酸エチルで抽出し(EtOAc、20mL×4回)、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し(20mL×3回)、塩水(20mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。さらに、シリカゲルカラム(溶媒:1%NH4OH、10%MeOH、89%ジクロロメタン)で精製し、誘導体化されたプレドニゾンの遊離塩基(108mg、36%)を白色固体として得た。
1H NMR(CDCl3):7.64(d,1H,J=10.40),6.08(dd,1H,J=10.40,1.90),6.06(t,1H,J=2.90),5.06(ABq,2H,J=94.78,17.81),2.85(d,1H,J=12.32),2.65(t,1H,J=12.57),2.56−1.06(CM,32H),2.16(s,3H),1.34(s,3H),0.57(s,3H)
13C NMR(CDCl3):209.17,205.05,186.61,172.86,167.44,155.93,127.29,124.31,88.18,67.78,60.05,57.30,54.92,52.73,51.28,49.97,49.56,45.89,42.47,36.00,34.47,33.64,32.23,31.63,23.21,21.93,18.68,15.30
MS:527.4[M+H]+
N−メチル−ピペラジニル酢酸エステル
リンカー合成
13C NMR(CDCl3):209.17,205.05,186.61,172.86,167.44,155.93,127.29,124.31,88.18,67.78,60.05,57.30,54.92,52.73,51.28,49.97,49.56,45.89,42.47,36.00,34.47,33.64,32.23,31.63,23.21,21.93,18.68,15.30
MS:527.4[M+H]+
N−メチル−ピペラジニル酢酸エステル
リンカー合成
2−ブロモ酢酸エチル(4.93g、29.5mmol)、1−メチルピペラジン(3.55mL、32.0mmol;Aldrich No.130001)、K-2CO3(4.5g、32.5mmol;Fisher No.P208)をCH3CN(150mL)中で混合し、18時間還流させた後、減圧下で濃縮した。次いで、有機層を分離し、水層をDCMで抽出した(150mL×3回)。有機抽出物を合わせ、水(150mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、減圧下で濃縮し、4−(4−メチルピペリジン−1−イル)酢酸エチル(5.26g、96%)を黄色油状物として得た。
1H NMR(CDCl3):3.76(q,2H,J=7.14Hz),2.76(s,3H),2.30−1.90(br,4H),0.85(t,3H,J=7.14Hz)
13C NMR(CDCl3):169.55,59.90,58.93,54.44,53.26,52.47,45.59,13.84
ESI−MS:187[M+H]+
13C NMR(CDCl3):169.55,59.90,58.93,54.44,53.26,52.47,45.59,13.84
ESI−MS:187[M+H]+
2−4(メチルピペラジン−1−イル)酢酸エチル(5.26g、28.3mmol)のTHF(150mL)溶液に、NaOH(1.20g、30mmol)の水(150mL)溶液を加えた。混合物を室温で18時間撹拌した後、乾燥するまで濃縮し、4−(4−メチルピペラジン−1−イル)酢酸ナトリウム(5.24g、定量的)を白色粉末として得た。
13C NMR(MeOH−d4):169.55,59.90,58.93,54.44,52.47,45.59
ESI−MS:187.3[M+H]+;209.2[M+Na]+
エステル化
ESI−MS:187.3[M+H]+;209.2[M+Na]+
エステル化
2−(4−メチルピペラジン−1−イル)酢酸ナトリウム(111mg、0.615mmol)、プレドニゾン(200mg、0.559mmol)のCH3CN(10mL)懸濁物に、2−クロロ−1−メチル−ピリジニウムヨージド(235mg、0.922mmol;Aldrich No.198005)を加えた。得られた懸濁物を室温で18時間撹拌した後、水(30mL)を加えて反応を停止させた。次いで、生成物をEtOAcで抽出し(20mL×4回)、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し(20mL×3回)、塩水(20mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。さらに、シリカカラム(溶媒:1%NH4OH、10%MeOH、89%DCM)で精製し、誘導体化されたプレドニゾン(154mg、38%)を白色固体として得た。
1H NMR(CDCl3):7.71(d,1H,J=10.28),6.19(dd,1H,J=10.24,1.96),6.07(t,1H,J=1.93),4.93(ABq,2H,J=124.45,17.56),3.33(s,1H),2.89(d,1H,J=13.36),2.84−1.17(CM,32H),2.27(s,3H),1.43(s,3H),0.66(s,3H)
13C NMR(CDCl3):208.88,204.58,186.58,169.85,167.06,155.68,127.49,124.50,88.38,67.96,60.22,59.01,54.73,53.42,52.71,51.43,49.67,49.56,46.00,42.45,36.06,34.79,33.73,32.25,23.26,18.75,15.45
MS:449.3[M+H]+
実施例4−親油性プレドニゾン誘導体
内部リノレイルリンカー
1−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−3−(ジメチルアミノ)プロパン−2−オール
3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオール(98%、1.00g、8.39mmol、1.0当量)、イミダゾール(0.57g、8.39mmol、1.0当量)の乾燥ジクロロメタン(10mL)溶液を、アルゴン下、0℃で15分間撹拌した。この混合物に、固体のtert−ブチルジメチルシリルクロリド(1.26g、8.39mmol、1.0当量)を加え、得られた物質を0℃で2時間撹拌した。次いで、混合物をジクロロメタン20mLで希釈し、脱イオン水(15mL)に注いだ。有機層を分離し、水層をジクロロメタン(20mL)でさらに2回抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮し、未精製の1−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−3−(ジメチルアミノ)プロパン−2−オールを粘性透明油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
13C NMR(CDCl3):208.88,204.58,186.58,169.85,167.06,155.68,127.49,124.50,88.38,67.96,60.22,59.01,54.73,53.42,52.71,51.43,49.67,49.56,46.00,42.45,36.06,34.79,33.73,32.25,23.26,18.75,15.45
MS:449.3[M+H]+
実施例4−親油性プレドニゾン誘導体
内部リノレイルリンカー
1−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−3−(ジメチルアミノ)プロパン−2−オール
3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオール(98%、1.00g、8.39mmol、1.0当量)、イミダゾール(0.57g、8.39mmol、1.0当量)の乾燥ジクロロメタン(10mL)溶液を、アルゴン下、0℃で15分間撹拌した。この混合物に、固体のtert−ブチルジメチルシリルクロリド(1.26g、8.39mmol、1.0当量)を加え、得られた物質を0℃で2時間撹拌した。次いで、混合物をジクロロメタン20mLで希釈し、脱イオン水(15mL)に注いだ。有機層を分離し、水層をジクロロメタン(20mL)でさらに2回抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮し、未精製の1−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−3−(ジメチルアミノ)プロパン−2−オールを粘性透明油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
1H NMR:3.72−3.80(m,1H),3.63(d,2H,J=5.19),2.34−2.46(m,2H),2.33(s,6H),0.91(2,9H),0.08(s,6H)
3−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−N,N−ジメチル−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロパン−1−アミン
未精製の1−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−3−(ジメチルアミノ)プロパン−2−オール(1.0g、4.29mmol、1.0当量)のトルエン(10mL)溶液を、アルゴン下、0℃でNaH(60%、0.17g、4.29mmol、1.0当量)のトルエン懸濁物(5mL)に注意深く滴下し、得られた物質を15分間撹拌した。この撹拌した混合物に、リノレイルメタンスルホネート(1.47g、4.29mmol、1.0当量)のトルエン溶液(5mL)を滴下し、次いで、反応物を90℃で18時間撹拌した。次いで、混合物を室温まで冷却し、エタノール(10mL)をゆっくりと加えて反応を停止させた。次いで、混合物を濃縮し、残渣を脱イオン水(15mL)に入れ、EtOAc(20mL)で3回抽出した。有機抽出物を合わせ、脱イオン水(15mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィー(クロロホルム中、0〜5%MeOH)で精製し、3−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−N,N−ジメチル−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロパン−1−アミンを粘性透明油状物として109mg(収率53%)得た。
1H NMR:5.28−5.42(m,4H),3.47−3.62(m,4H),3.37−3.42(m,1H),2.77(t,2H,J=5.94),2.28−2.47(m,2H),2.25(s,6H),2.01−2.09(m,5H),1.50−1.58(m,2H),1.30 (br, 18H),0.09(s,9H),0.06(s,6H).
13C NMR:130.22,130.01,127.98,127.88,70.16,63.07,37.35,32.79,31.52,29.59,29.49,29.39,29.34,29.32,29.23,29.15,29.11,29.00,27.19,25.72,25.62,25.40,22.57,14.07.
3−(ジメチルアミノ)−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロパン−1−オール 3−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−N,N−ジメチル−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロパン−1−アミン(0.2g、0.42mmol、1.0当量)の乾燥THF(100μL)溶液に、TBAF(THF中1.0M、0.5mL、0.50mmol、1.2当量)を一度に加え、混合物を室温で2時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をEtOAc(15mL)と飽和塩化アンモニウム水溶液(10mL)とに分配した。層を分離させ、水層をEtOAc(10mL)でさらに2回抽出した。抽出物を合わせ、乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮し、未精製3−(ジメチルアミノ)−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロパン−1−オールを粘性ベージュ色油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
1H NMR:5.29−5.43(m,4H),3.77−3.82(m,1H),3.65−3.71(m,1H),3.42−3.51(m,3H),2.78(t,2H,J=5.97),2.54−2.57(m,2H),2.30(s,6H),2.02−2.09(m,4H),1.50−1.57(m,2H),1.30(br,15H),0.87−0.92(m,4H).
4−(3−(ジメチルアミノ)−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロポキシ)−4−オキソブタン酸
3−(ジメチルアミノ)−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロパン−1−オール(2.0g、5.45mmol、1.0当量)の乾燥THF(11mL)溶液に、無水コハク酸(0.60g、5.99mmol、1.1当量)を一度に加え、得られた物質をアルゴン下で18時間還流させた。混合物を濃縮し、次いで、EtOAc(10mL)に溶解し、脱イオン水(20mL)に注いだ。層を分離させ、水層をEtOAc(25mL)でさらに2回抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮し、未精製4−(3−(ジメチルアミノ)−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロポキシ)−4−オキソブタン酸を粘性黄色油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
1H NMR:5.29−5.43(m,4H),4.28(d,1H,J=11.25),3.92−3.98(m,1H),3.84(br,1H),3.60−3.67(m,1H),3.43−3.50(m,1H),3.11−3.15(d,1H,J=12.45),2.75−2.79(m,2H),2.67(s,6H),2.53−2.65(m,5H),2.01−2.08(m,4H),1.53−1.57(m,2H),1.29−1.30(br,18H),0.87−0.91(m,3H).
13C NMR:176.63,172.55,130.09,129.98,127.91,127.84,73.90,69.90,67.85,62.54,59.08,44.11,31.44,30.53,29.97,29.93,29.58,29.42,29.36,29.27,29.20,27.14,27.11,26.04,25.55,22.50,14.01.
外部リノレイルリンカー
1−(ジメチルアミノ)−4−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)ブタン−2−オール
3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオール(98%、1.00g、8.39mmol、1.0当量))のトルエン(10mL)溶液を、アルゴン下、0℃でNaH(60%、0.34g、8.39mmol、1.0当量)のトルエン懸濁物(5mL)に注意深く滴下し、得られた物質を15分間撹拌した。この撹拌した混合物に、リノレイルメタンスルホネート(2.87g、8.39mmol、1.0当量)のトルエン溶液(5mL)を滴下し、次いで、反応物を90℃で18時間撹拌した。次いで、混合物を室温まで冷却し、エタノール(10mL)をゆっくりと加えて反応を停止させた。混合物を濃縮し、残渣を脱イオン水(20mL)に入れ、EtOAc(30mL)で3回抽出した。有機抽出物を合わせ、脱イオン水(20mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィー(クロロホルム中、0〜5%MeOH)で精製し、1−(ジメチルアミノ)−4−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)ブタン−2−オールを粘性の透明油状物として得た。
4−(1−(ジメチルアミノ)−4−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)ブタン−2−イルオキシ)−4−オキソブタン酸
1−(ジメチルアミノ)−4−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)ブタン−2−オール(2.0g、5.45mmol、1.0当量)の乾燥THF(11mL)溶液に、無水コハク酸(0.60g、5.99mmol、1.1当量)を一度に加え、得られた物質をアルゴン下で18時間還流させた。混合物を濃縮し、残渣をEtOAc(10mL)と脱イオン水(20mL)とに分配した。層を分離させ、水層をEtOAc(25mL)でさらに2回抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮し、未精製4−(1−(ジメチルアミノ)−4−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)ブタン−2−イルオキシ)−4−オキソブタン酸を粘性黄色油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
内部リンカーを用いたプレドニゾンのエステル化
4−(3−(ジメチルアミノ)−2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルオキシ)プロポキシ)−4−オキソブタン酸の乾燥ジクロロメタン溶液(10mL)に、NEt3(100μL、0.74mmol、1.0当量)を滴下し、得られた物質をアルゴン下、室温で15分間撹拌した。PyBOP(0.48g、0.93mmol、1.25当量)を一度に加え、得られた物質を10分間撹拌した。この混合物にプレドニゾン(0.32g、0.89mmol、1.2当量)を加え、得られた物質を室温で18時間撹拌し、次いで、濃縮し、粘性の黄色油状物を得た(純度90%)。フラッシュカラムクロマトグラフィー(クロロホルム中、5〜15%MeOH、次いでEtOAc中、0〜15%MeOH)で精製し、所望の生成物を得た。
1H NMR (CDCl3):7.68(d,1H,J=10.23),6.20(dd,1H,J1=10.23,J2=1.86),6.07(s,1H),5.27−5.42(m,4H),4.80(dd,1H,J1=17.70,J2=5.61),4.09−4.36(m,3H),3.54−3.69(m,3H),3.34(m,1H),3.07−3.22(m,1H),2.94−2.98(m,1H),2.88(s,6H),2.74−2.78(m,3H),2.65−2.68(m,3H),2.37−2.50(m,3H),2.25(dd,1H,J1=12.24,J1=2.31),2.00−2.05(m,8H),1.42(s,3H),1.30(br,18H),0.89(m,3H),0.64(s,3H).
MS:808.8[M+H]+。
実施例5−エトポシド誘導体
4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸二塩酸塩(4、20mg、0.09mmol)をSOCl2(0.5mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。SOCl2を蒸発させ、さらに精製することなく、未精製の酸塩化物を、アルゴン雰囲気下、乾燥CH3CN(1mL)に溶解した。この溶液を0℃まで冷却し、エトポシド(6、50mg、0.085mmol)をCH3CN(1mL)に溶解し、滴下し、次いで、トリエチルアミン(10μL)を加えた。反応をTLCで監視しつつ、撹拌を2時間続けた。次いで、この溶液を減圧下で濃縮し、この未精製の生成物を水に入れ、酢酸エチルで抽出した(10mL×3回)。有機抽出物を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。この未精製の生成物をシリカゲル(230〜400メッシュ)カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中、5〜10%MeOHの勾配)で精製し、エトポシド誘導体7の所望な遊離塩基30mgを白色固体として得た。
4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸二塩酸塩(4、20mg、0.09mmol)をSOCl2(0.5mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。SOCl2を蒸発させ、さらに精製することなく、未精製の酸塩化物を、アルゴン雰囲気下、乾燥CH3CN(1mL)に溶解した。この溶液を0℃まで冷却し、エトポシド(6、50mg、0.085mmol)をCH3CN(1mL)に溶解し、滴下し、次いで、トリエチルアミン(10μL)を加えた。反応をTLCで監視しつつ、撹拌を2時間続けた。次いで、この溶液を減圧下で濃縮し、この未精製の生成物を水に入れ、酢酸エチルで抽出した(10mL×3回)。有機抽出物を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。この未精製の生成物をシリカゲル(230〜400メッシュ)カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中、5〜10%MeOHの勾配)で精製し、エトポシド誘導体7の所望な遊離塩基30mgを白色固体として得た。
1H NMR(CDCl3):6.83(s,1H),6.55(s,1H),6.27(s,2H),5.98−6.00(d,2H,J=7.15Hz),4.91−4.90(d,2H),4.73−4.78(q,1H),4.63−4.67(t,2H),4.40−4.46(t,1H),4.15−4.26(m,2H),3.75−3.78(t,2H),3.66(s,3H),3.55−3.62(m),3.49(s,3H),3.25−3.47(m),2.81−2.93(m),2.44−2.64(m),2.31(s,3H),1.87−1.97(m),1.39−1.40(d,3H).
ESI−MS:757.5[M+H]+.
実施例6−タクロリムス誘導体
4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ブタン酸塩酸塩(4、25mg、0.12mmol)をSOCl2(0.5mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌し、次いで、SOCl2を蒸発させ、さらに精製することなく、アルゴン雰囲気下、化合物5を乾燥CH3CN(1mL)に溶解した。この溶液を0℃まで冷却し、次いで、タクロリムス(8.80mg、0.1mmol)をCH3CN(1mL)に溶解したものを加え、次いで、トリエチルアミン(10μL)を加えた。撹拌を2時間続け、次いで、溶液を減圧下で濃縮した。この未精製の生成物を水に入れ、酢酸エチルで抽出した(15mL×3回)。有機抽出物を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。この未精製の生成物をシリカゲル(230〜400メッシュ)カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中、5〜10%MeOHの勾配)で精製し、タクロリムス誘導体9の所望の遊離塩基45mgを白色固体として得た。
1H NMR(CDCl3):5.63(m,1H),5.20−5.32(m,2H),6.27(s,2H),4.98−5.10(m),4.80(d,1H),4.63−4.63(d,1H),4.41−4.46(d,1H),4.25(s),3.87−3.92(m,2H),3.67−3.75(m),3.56−3.60(m),3.30−3.44(m),2.97−3.06(br m),2.30−2.75(br m),0.81−2.28(広がって連続した多重線)(スペクトルが結合したもの)
ESI−MS:973.0[M+H]+。
実施例7−シクロスポリンおよびアザチオプリン誘導体
シクロスポリンおよびアザチオプリン誘導体(例えば、以下に示す誘導体)は、親薬物と酸塩化物との反応を含む、タクロリムスで記載した方法に本質的にしたがって調製されるであろう。アザチオプリンは、求電子剤を用い、N−9で選択的に反応することが十分に確立されている(Mishraら、Ind.J.Chem.,Sec.B,26B:847−50(1987))。したがって、ある局面では、本明細書に提示するアザチオプリン誘導体は、N−9で誘導体化されるであろう。
シクロスポリンおよびアザチオプリン誘導体(例えば、以下に示す誘導体)は、親薬物と酸塩化物との反応を含む、タクロリムスで記載した方法に本質的にしたがって調製されるであろう。アザチオプリンは、求電子剤を用い、N−9で選択的に反応することが十分に確立されている(Mishraら、Ind.J.Chem.,Sec.B,26B:847−50(1987))。したがって、ある局面では、本明細書に提示するアザチオプリン誘導体は、N−9で誘導体化されるであろう。
実施例8−弱塩基性誘導体の溶解度
ドセタキセル誘導体の溶解度を、LNに能動的に充填させるのに使用するpH5の酢酸バッファー中で決定した。化合物を50mg/mlでエタノールに溶解した(但し、TD2は、25mg/mlで溶解した)。一定分量を10mM酢酸バッファー(pH5)で10倍に希釈し、pHを確認し、必要な場合、pH5に再び調節した。または、それぞれの化合物10mgをガラスバイアル内で秤量し、この化合物に10mM酢酸バッファー(pH5)2mLを加え、次いで、懸濁物を10分間超音波処理した。次いで、Microcon MY100フィルター(MWのカットオフ値100,000Da)を用いて析出物を除去し、濾液の薬物含有量をUPLC−UVで分析した。測定した溶解度は、平衡状態ではない条件下で決定した、動力学的溶解度(kinetic solubility)である。
充填中の水溶性を上げるために、場合により、少ない(膜を透過しない)量のエタノールを用いてもよい。したがって、バッファーおよび10%(v/v)エタノールを含有するバッファーの両方で、溶解度データを作成した。ドセタキセル誘導体の水への溶解度(表2)は、顕著に異なっており、この値は、ドセタキセルの値の約20〜500倍大きい(Duら、Bioorganic & Medicinal Chemistry、15:6323−30(2007))。溶解度は、N−メチルピペラジノ>ピペラジノ>>モルホリノの順序で低下していた。モルホリノ誘導体の溶解度は、ピペラジノ誘導体およびピペリジノ誘導体の溶解度よりもかなり低かった。
TD1のアミノ基のpKaは、酸−塩基滴定によって7.7であると決定され、この値は、LNに充填させるpH勾配として十分に適している。予想どおり、TD1塩酸塩の水への溶解度は、pHを上げるにつれて低下した(pH4で2.8mg/ml、pH5で1.7mg/ml)。
実施例9−弱塩基誘導体の安定性
異なるpH値および温度の水溶液中で、および生物学的媒体(マウス血漿)中で、ドセタキセル誘導体の化学安定性を決定した。ドセタキセル誘導体をアセトニトリルと混合したものを一定分量に分け、テフロン(登録商標)に覆われたふたで密閉した1mLのガラス製HPLCサンプルバイアル中、pH4.0および7.5でクエン酸緩衝液/HEPES(10mM/10mM)溶液と混合するか、または、マウス血漿と混合した(最終容積0.25mL、ドセタキセル誘導体の最終濃度50μg/ml)。37℃でインキュベーションして1時間後、4時間後、24時間後に、UPLC−UVによって薬物安定性を決定した。所定の時間点で、このサンプルに3倍過剰のメタノール/0.1%TFAを加えた。クエン酸/HEPESで緩衝化したサンプルを、上述のようにUHPLCで分析した。血漿サンプルの場合、メタノール/0.1%TFAを加えてタンパク質を沈殿させ、14,000×gで遠心分離処理することによってペレット状にし、薬物誘導体について上澄みを分析した。ヘパリン化したマウス血漿を、100mMリン酸ナトリウムバッファーを用いて50%になるまで希釈し、実験の間、pHを一定に保った。
異なるpH値および温度の水溶液中で、および生物学的媒体(マウス血漿)中で、ドセタキセル誘導体の化学安定性を決定した。ドセタキセル誘導体をアセトニトリルと混合したものを一定分量に分け、テフロン(登録商標)に覆われたふたで密閉した1mLのガラス製HPLCサンプルバイアル中、pH4.0および7.5でクエン酸緩衝液/HEPES(10mM/10mM)溶液と混合するか、または、マウス血漿と混合した(最終容積0.25mL、ドセタキセル誘導体の最終濃度50μg/ml)。37℃でインキュベーションして1時間後、4時間後、24時間後に、UPLC−UVによって薬物安定性を決定した。所定の時間点で、このサンプルに3倍過剰のメタノール/0.1%TFAを加えた。クエン酸/HEPESで緩衝化したサンプルを、上述のようにUHPLCで分析した。血漿サンプルの場合、メタノール/0.1%TFAを加えてタンパク質を沈殿させ、14,000×gで遠心分離処理することによってペレット状にし、薬物誘導体について上澄みを分析した。ヘパリン化したマウス血漿を、100mMリン酸ナトリウムバッファーを用いて50%になるまで希釈し、実験の間、pHを一定に保った。
LN中の配合物に適するには、誘導体は、pH4で安定でなければならない(LNキャリア内部のpH)。それに加え、プロドラッグ誘導体は、LNから放出されると、生理学的条件下(例えば、、pH7.4、および/または内因性酵素存在下)で、容易に活性な薬物を生成すべきである。表3は、pH4、pH7.4で、およびマウス血漿中、37℃で24時間インキュベーションした後の、ドセタキセル誘導体の加水分解安定性を示す。C−2’アミノエステルドセタキセル誘導体の中で、TD1〜4、TD7、TD9は、pH4で十分な安定性を有していた。TD4は、水への溶解度がきわめて低く、血漿中でインキュベーションしても、TD9になんら影響を与えないようであった。LNに充填させるのに、TD1〜3およびTD7が選ばれ、in vitroでの薬物放出について、このようなLNを試験した。
結果(表3および図1)から、この誘導体が、LN内部でみられる低いpH(pH4付近)で安定であり、in vivoでLNキャリアから放出された後、迅速に活性薬物へと変換することができることが示された。活性薬物への変換は、pHに依存し(高いpHほど速い)、血漿のような生体液に存在する加水分解酵素存在下では顕著に促進される。
実施例10−保持効率
ドセタキセルのピペラジニルエステル(TD1〜TD3)誘導体、ドセタキセルのピペリジンエステル(TD7)誘導体、ドセタキセルのC−7アミノエステル(TD10)誘導体、プレドニゾンのN−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル誘導体および酢酸エステル誘導体、エトポシドのN−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル誘導体を、LNに充填させる効率について試験した。
LNの調製
Bomanら、Cancer Res.;54:2830−2833(1994)に記載されているエタノール手順に基づいて、LNを調製した。簡単に言うと、脂質(リン脂質/Chol、モル比55/45)をエタノールに溶解し、60℃で、350mM硫酸アンモニウムを含有する水溶液にゆっくりと加え、微量の脂質マーカー[3H]CHE(0.15μCi/全脂質mg)を、エタノール中の他の脂質と一緒に溶解し、放出試験のためのLNを調製した。最終的なエタノール濃度は、15%(v/v)であった。Hopeら、Biochim.Biophys.Acta;812:55−65(1985)に記載されているように、得られたLN分散物を、60℃で、加熱したthermobarrel型押出成形機(Northern Lipids、Vancouver、Canada)を用い、2枚の重ね合わせた100nmポリカーボネートフィルター(Nucleopore、Pleasanton、CA)を通して押出成形した。残留エタノールおよび外側の硫酸アンモニウムを、室温で、接線流による透析濾過(tangential flow diafiltration)によって除去し、Midgee(商標) HOOP(商標)限外濾過カートリッジ(MWのカットオフ値100000;Amersham
Biosciences)を用い、300mMショ糖溶液と置き換えた。準弾性光散乱法(QELS)を用い、NICOMP370型サブミクロン粒子サイジング機(Particle Sizing Systems、Santa Barbara、CA)を用い、押出成形したLNのサイズ分布を評価した(目的サイズ100±20nm)。
Bomanら、Cancer Res.;54:2830−2833(1994)に記載されているエタノール手順に基づいて、LNを調製した。簡単に言うと、脂質(リン脂質/Chol、モル比55/45)をエタノールに溶解し、60℃で、350mM硫酸アンモニウムを含有する水溶液にゆっくりと加え、微量の脂質マーカー[3H]CHE(0.15μCi/全脂質mg)を、エタノール中の他の脂質と一緒に溶解し、放出試験のためのLNを調製した。最終的なエタノール濃度は、15%(v/v)であった。Hopeら、Biochim.Biophys.Acta;812:55−65(1985)に記載されているように、得られたLN分散物を、60℃で、加熱したthermobarrel型押出成形機(Northern Lipids、Vancouver、Canada)を用い、2枚の重ね合わせた100nmポリカーボネートフィルター(Nucleopore、Pleasanton、CA)を通して押出成形した。残留エタノールおよび外側の硫酸アンモニウムを、室温で、接線流による透析濾過(tangential flow diafiltration)によって除去し、Midgee(商標) HOOP(商標)限外濾過カートリッジ(MWのカットオフ値100000;Amersham
Biosciences)を用い、300mMショ糖溶液と置き換えた。準弾性光散乱法(QELS)を用い、NICOMP370型サブミクロン粒子サイジング機(Particle Sizing Systems、Santa Barbara、CA)を用い、押出成形したLNのサイズ分布を評価した(目的サイズ100±20nm)。
(薬物の充填)
ドセタキセル誘導体、エトポシド誘導体、プレドニゾン誘導体を、Haranら、Biochim.Biophys.Acta;1151:201−15(1993)に記載されている硫酸アンモニウムによる遠隔充填方法を用い、DSPC/Chol(55:45mol%)LNに充填させた。簡単に言うと、TD1を、10mM酢酸ナトリウムで緩衝化した300mMショ糖(pH5)で2mg/mLになるように溶解し、エトポシド誘導体を、10mM酢酸ナトリウムで緩衝化した300mMショ糖(pH5)で2.5mg/mLになるように溶解し、プレドニゾン誘導体を、10mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)で7mg/mLになるように溶解した。この溶解した誘導体を、あらかじめ加熱しておいた(60℃)LN懸濁物に加え、混合物を撹拌しつつ、60℃で所定時間(典型的には30分間)、インキュベーションした。LN配合物を、典型的には、脂質濃度5〜10mg/ml、薬物−対−脂質の重量比0.1〜0.4mg/mgで調製する。封入されていないドセタキセル誘導体を、Midgee(商標) HOOP(商標)限外濾過カートリッジ(MWのカットオフ値100000;Amersham Biosciences)またはサイズ排除クロマトグラフィーを用い、接線流による透析濾過によって除去した。外側の溶液を、緩衝化していない生理食塩水溶液と交換し、必要な場合、サンプルを濃縮した。in vivo試験用の、薬物を保持させたLN配合物を、0.2μmフィルター(Nalgene)を用いた濾過によって滅菌し、次いで、4℃で保存した。また、TD−1を、DPPC/chol(55:45mol%)およびDMPC/chol(55:45mol%)で構成されるLNに充填させた。
ドセタキセル誘導体、エトポシド誘導体、プレドニゾン誘導体を、Haranら、Biochim.Biophys.Acta;1151:201−15(1993)に記載されている硫酸アンモニウムによる遠隔充填方法を用い、DSPC/Chol(55:45mol%)LNに充填させた。簡単に言うと、TD1を、10mM酢酸ナトリウムで緩衝化した300mMショ糖(pH5)で2mg/mLになるように溶解し、エトポシド誘導体を、10mM酢酸ナトリウムで緩衝化した300mMショ糖(pH5)で2.5mg/mLになるように溶解し、プレドニゾン誘導体を、10mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)で7mg/mLになるように溶解した。この溶解した誘導体を、あらかじめ加熱しておいた(60℃)LN懸濁物に加え、混合物を撹拌しつつ、60℃で所定時間(典型的には30分間)、インキュベーションした。LN配合物を、典型的には、脂質濃度5〜10mg/ml、薬物−対−脂質の重量比0.1〜0.4mg/mgで調製する。封入されていないドセタキセル誘導体を、Midgee(商標) HOOP(商標)限外濾過カートリッジ(MWのカットオフ値100000;Amersham Biosciences)またはサイズ排除クロマトグラフィーを用い、接線流による透析濾過によって除去した。外側の溶液を、緩衝化していない生理食塩水溶液と交換し、必要な場合、サンプルを濃縮した。in vivo試験用の、薬物を保持させたLN配合物を、0.2μmフィルター(Nalgene)を用いた濾過によって滅菌し、次いで、4℃で保存した。また、TD−1を、DPPC/chol(55:45mol%)およびDMPC/chol(55:45mol%)で構成されるLNに充填させた。
Sephadex G50スピンカラムでサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、外側の(封入されていない)プロドラッグを、LNに封入されているプロドラッグから分離する前と後で、プロドラッグ濃度および脂質濃度を定量し、それぞれのプロドラッグ/脂質の比率を比較することによって、充填効率を決定した。FiskeおよびSubbarow、J.Biol.Chem.;66:375−379(1925)のリンアッセイによって、リン脂質の濃度を決定し、酵素比色アッセイ(Wako Chemicals、Richmond、VA)によってコレステロール濃度を定量した。本明細書に記載するように、超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)によって誘導体の濃度を決定した。充填させている間の、プロドラッグから親薬物への変換も、同様に監視した。結果を、図2(ドセタキセル誘導体)、図3(プレドニゾン誘導体)、図4(エトポシド誘導体)に示す。
実施例11−LN配合物の安定性
異なる脂質組成(DSPC/Chol、DPPC/Chol、DMPC/Chol、それぞれ、55/45mol%、誘導体/脂質の比率は0.2wt/wt)を有するLN−誘導体配合物を、0.9%生理食塩水中、誘導体濃度3mg/mlで調製した。このLN配合物を滅菌濾過し、5mLのガラス製バイアルに滅菌状態で充填し、このバイアルにストッパーを取り付け、ふたをして、7℃で保存した。種々の時間点(最初の1ヶ月は週に1回、その後は月に1回)で、4ヶ月間にわたって、LNの大きさ(QELS)、誘導体の保持率(Sephadex G−50スピンカラム法)および誘導体の完全性について、配合物を分析した。結果を図5A〜Cにまとめている。3種類すべての配合物は、きわめて安定であり、プロドラッグの放出は検出されず(図5B)、LN配合物の平均サイズおよびサイズ分布は、変化しておらず(図5C)、プロドラッグの加水分解は、4%未満であった(3.5〜3.8%、図5A)。他の分解生成物も観察されなかった。このデータは、LN配合物を開発する実現可能性を示している。配合物の凍結は、別の代替法である。
異なる脂質組成(DSPC/Chol、DPPC/Chol、DMPC/Chol、それぞれ、55/45mol%、誘導体/脂質の比率は0.2wt/wt)を有するLN−誘導体配合物を、0.9%生理食塩水中、誘導体濃度3mg/mlで調製した。このLN配合物を滅菌濾過し、5mLのガラス製バイアルに滅菌状態で充填し、このバイアルにストッパーを取り付け、ふたをして、7℃で保存した。種々の時間点(最初の1ヶ月は週に1回、その後は月に1回)で、4ヶ月間にわたって、LNの大きさ(QELS)、誘導体の保持率(Sephadex G−50スピンカラム法)および誘導体の完全性について、配合物を分析した。結果を図5A〜Cにまとめている。3種類すべての配合物は、きわめて安定であり、プロドラッグの放出は検出されず(図5B)、LN配合物の平均サイズおよびサイズ分布は、変化しておらず(図5C)、プロドラッグの加水分解は、4%未満であった(3.5〜3.8%、図5A)。他の分解生成物も観察されなかった。このデータは、LN配合物を開発する実現可能性を示している。配合物の凍結は、別の代替法である。
硫酸アンモニウムの勾配による技術を用いて調製したLNは、ベシクル内のpHが約4.0である(Maurer−Spurejら、Biochim.Biophys.Acta、1416:1−10(1999))。この誘導体が、pH7.4と比較して、pH4ではかなり安定性が増すという観点から(上の表2を参照)、LNに封入することによって、水溶液中の誘導体と比較して、捕捉された誘導体の加水分解安定性が大きく向上する。例えば、pH4で、TD1は、加水分解半減期が約49日(つまり7週間)であった。これとは対照的に、封入されたTD1は、4ヶ月間(16週間)で、ドセタキセルに変換されたのは3%未満であった。Cryo−TEM顕微鏡法から、このプロドラッグが、LNの内側に析出しており、その結果、顕著に高い安定性を有することがわかった。
TD1(タキソテール(商標)と同じ様式で、LN中に配合されたもの)およびタキソテール(商標)が、血液循環から除去される速度を、Swiss Websterマウスに配合物を静脈投与した後に観察した。マウスに、等モル量の投薬量(20mg/kg ドセタキセル)の配合物を、1回、静脈にボーラス注射し、TD1およびドセタキセルの血漿濃度をUHPLC−MSで決定した。結果を図5に示す。ドセタキセル/タキソテール(商標)およびその誘導体は、両方とも、血漿循環での半減期が数分間であり、血漿濃度は2時間で検出限界未満になった(図6)。これとは対照的に、この誘導体のDSPC/Chol LN配合物は、循環での半減期が、数分から10〜12時間に延び、血漿濃度は2桁高くなった(図6)。16時間の時点で、注射された投薬量の約24%が循環内にとどまっていた。LNに配合された誘導体の排出は、主に、LNキャリアの排出速度によって決定づけられると考えられる。このデータは、この誘導体のLN配合物が、循環内で安定であり、治療標的に有効に薬物を蓄積させるのに好ましい循環での半減期を達成することができることを示す。
実施例12−in vitroにおける、LNからの薬物誘導体の放出
LNに基づく薬物の活性は、キャリアから薬物が放出される速度に大きく依存する。例えば、薬物がLNキャリアから迅速に漏れ出してしまう場合、LNが疾患部位に到達しても、薬物をほとんど運ばないか、まったく運ばず、遊離薬物と比較して、治療上の利点はごくわずかであろう。一方、薬物が、LNから放出されるのが遅すぎる場合、疾患部位に到達する薬物の量は、決して治療濃度に達することはないであろう。薬物の残留/放出の主な決定因子は、LNキャリアの脂質組成、ベシクル内での薬物の形態である。不飽和脂質、または短いアシル鎖を有する脂質を用いると、薬物の放出が速くなる。LN内に薬物を析出させることにより、薬物の残留率を高くすることができる。薬物誘導体がLN内に析出するか否かは、cryo−TEMおよび/または当該技術で知られている他の方法を用い、LN配合物を観察することによって決定することができる。
LNに基づく薬物の活性は、キャリアから薬物が放出される速度に大きく依存する。例えば、薬物がLNキャリアから迅速に漏れ出してしまう場合、LNが疾患部位に到達しても、薬物をほとんど運ばないか、まったく運ばず、遊離薬物と比較して、治療上の利点はごくわずかであろう。一方、薬物が、LNから放出されるのが遅すぎる場合、疾患部位に到達する薬物の量は、決して治療濃度に達することはないであろう。薬物の残留/放出の主な決定因子は、LNキャリアの脂質組成、ベシクル内での薬物の形態である。不飽和脂質、または短いアシル鎖を有する脂質を用いると、薬物の放出が速くなる。LN内に薬物を析出させることにより、薬物の残留率を高くすることができる。薬物誘導体がLN内に析出するか否かは、cryo−TEMおよび/または当該技術で知られている他の方法を用い、LN配合物を観察することによって決定することができる。
in vitroでの、LNからのドセタキセル誘導体の放出を、マウス血漿中で評価した。初期のプロドラッグ−対−脂質の比率と、異なる時間点でみられるプロドラッグ−対−脂質の比率を比較することによって、薬物残留率を決定した。ドセタキセル誘導体を、微量の放射能標識された脂質マーカー3H−コレステリルヘキサデシルエーテル(3H−CHE)を含む、DSPC/chol LN、DPPC/Chol LN、DMPC/Chol LN(55:45mol%)に封入した。LN配合物を、最終的な脂質濃度0.75mg/mlでマウス血漿と混合した後、37℃でインキュベーションした。種々の時間点で、一定分量を採取し、Sephadex G−50スピンカラムを動かし、封入されていないプロドラッグを除去した(Pick,Arch.Biochem.Biophys.、212:186−194(1981))。溶出物中の誘導体濃度および脂質濃度を、それぞれUHPLCおよび液体シンチレーション計測によって決定した。
図7Aは、TD1がLN内に残留する率を示し、この残留率は、所定時間点で、サンプル中に見られる誘導体/脂質(またはプロドラッグ/脂質)の比率を、初期の薬物−対−脂質の比率で割ったものであると定義される。DSPC/Chol LNも、DPPC/Chol LNも、一連の16時間の実験にわたって、まったく放出しないか、ほとんど放出しないことが示されている。DMPC/Chol LNは、注射16時間後に、約6時間の半減期でプロドラッグが放出され、捕捉されたプロドラッグの16%が残っていた。0.1mg/mgおよび0.2mg/mgで充填させたDSPC/Chol LN配合物の残留プロフィールの比較から、薬物の残留率は、プロドラッグ−対−脂質の比率に依存しないことが示されている。マウス血漿で行ったin vitro放出試験は、in vivo試験とよく一致していた(図7B)。DSPC LNおよびDPPC/Chol LNと比較して、DMPC/Chol LNで放出の増加がみられることは、最も短いアシル鎖(C14)から長い鎖の脂質を有するDMPCにおける、膜透過性の低下と一致している。図7Cは、同じプロドラッグ−対−脂質の比率で、DSPC/cholに配合された他のドセタキセル誘導体(TD2〜3およびTD7)と比較して、DSPC/chol LN中のTD1のin vitro残留率を示す。すべての誘導体は、効果的に残留していた。TD7は、TD1と同じ速度で放出され、一方、TD2およびTD3は、わずかに速い速度で放出された(放出率は、100−残留率であると定義される)。in vitroデータおよびin vivoデータは、弱塩基誘導体が、LN内に有効に残留し、LNキャリアの脂質組成を変えることによって、放出速度を調節することができることを示している。
実施例13−薬物動態およびin vivoでの薬物放出
LNに封入されたドセタキセル誘導体の薬物動態(PK)を、タキソテール(商標)、市販のドセタキセル配合物、タキソテール(商標)と同様の様式で配合された誘導体のPKと比較した。タキソテール(商標)および同様に配合された誘導体は、薬物を溶解させるために、エタノール/ポリソルベート80/生理学的食塩水溶液を用い、タキソテール(商標)に関する処方箋情報で記載されているように配合した(Sanofi−Aventis,U.S.)。ドセタキセル誘導体を、硫酸アンモニウムによる充填技術を用い、薬物−対−脂質の比率0.2wt/wtで、DSPC/chol LN、DPPC/Chol LN、DMPC/Chol LN(55:45mol%)に封入した。脂質要素は、微量(0.15μCi/脂質mg)の脂質マーカー[3H]CHEを含んでおり、これにより、プロドラッグおよびLNキャリアの両方が、循環から排出されるのを監視することができる。
LNに封入されたドセタキセル誘導体の薬物動態(PK)を、タキソテール(商標)、市販のドセタキセル配合物、タキソテール(商標)と同様の様式で配合された誘導体のPKと比較した。タキソテール(商標)および同様に配合された誘導体は、薬物を溶解させるために、エタノール/ポリソルベート80/生理学的食塩水溶液を用い、タキソテール(商標)に関する処方箋情報で記載されているように配合した(Sanofi−Aventis,U.S.)。ドセタキセル誘導体を、硫酸アンモニウムによる充填技術を用い、薬物−対−脂質の比率0.2wt/wtで、DSPC/chol LN、DPPC/Chol LN、DMPC/Chol LN(55:45mol%)に封入した。脂質要素は、微量(0.15μCi/脂質mg)の脂質マーカー[3H]CHEを含んでおり、これにより、プロドラッグおよびLNキャリアの両方が、循環から排出されるのを監視することができる。
PK試験およびin vivo放出試験は、4つの時間点(1時間、4時間、8時間、16時間)に基づいており、各時間点あたり、マウス4匹に基づいていた。すべての配合物を、ドセタキセル(またはドセタキセルに等価)の投薬量20mg/kgで、被検体の体重に基づく容積(10mL/kg)で、尾の側面の静脈に静脈投与した。種々の時間に、マウスをケタミン/キシラジンで麻酔し、心穿刺によって血液を集め、EDTAマイクロタイター管に入れた。血液を採取したら、すぐに動物をと殺した。1,000gで10分間遠心分離処理することによって、全血から血漿を分離した。血漿タンパク質は、0.1%TFAで酸性にした150μlの氷冷したメタノールを血漿50μlに加えることによって沈殿させた。このメタノール溶液を、4℃、15,000×gで30分間遠心分離処理し、タンパク質をペレット状にし、ドセタキセルおよび薬物誘導体について、上澄みをUHPLCによって分析した。LN配合物の場合、血漿25〜50μlをシンチレーション液(PicoFluor 40、Perkin Elmer)に加え、シンチレーション計測によって脂質の濃度を分析した([3H]−CHE放射能活性)。血漿サンプル中にみられるプロドラッグ/脂質の比率を、注射したLN配合物の比率を100%として割ることによって、LN内に残ったプロドラッグの割合(薬物残留率)を算出した。結果を図7Bに示す。遊離ドセタキセルおよびドセタキセル誘導体は、LNに封入された形態よりもかなり速く排出されるため、血漿サンプルから回収したプロドラッグ/脂質の比率は、LNに封入されたプロドラッグのうち、残っている量の直接的な指標であると考えることができる。
実施例14−in vitroでの抗癌活性
誘導体が、活性薬物を生成する(生体変換)能力を、親化合物(ドセタキセル)のin vitroでの抗癌活性と比較して、TD1の抗癌活性を測定することによって、さらに観察した。卵巣癌細胞株ES−2、前立腺癌細胞株PC3、乳癌細胞株MDA435/LCC6を含む3つのヒト癌細胞株について、抗癌活性を評価した(BC Cancer Research Centre、Vancouver、BC)(Fields and Lancaster,Am.Biotechnol.Lab.、11:48−50(1993);Nakayamaら、J.Immunol.Methods、204:205−208(1997))。薬物に72時間暴露した後、Alamar Blueアッセイを用い、細胞毒性を決定した。簡単に説明すると、種々の量のTD1または親薬物(DMSOに溶解)存在下、細胞を96ウェルプレート中、37℃で72時間インキュベーションし、インキュベーションが終了したら、Alamar Blue溶液をすべてのウェルに加えた(20μl/ウェル、培養容積の10%)。プレートをインキュベーターに4時間戻し、λex=530nmおよびλem=590nmでサンプルの蛍光を決定した。生存率を以下の式にしたがって算出した:細胞生存率(%)=(Fplus drug−Fbackground)/(Fminus drug−Fbackground)×100、式中、Fplus drugは、薬物存在下での蛍光の読みであり、Fminus drugは、薬物が存在しない状態の細胞コントロールであり、Fbackgroundは、バックグラウンド蛍光である(培地のみ)。S字型曲線を濃度−生存率プロットにフィッティングさせることによってIC50値(nM)を算出し、これを表4に示す。TD1は、ドセタキセルと同様に活性であり、このことは、このプロドラッグが、活性化合物へと容易に変換されたことを示している。
誘導体が、活性薬物を生成する(生体変換)能力を、親化合物(ドセタキセル)のin vitroでの抗癌活性と比較して、TD1の抗癌活性を測定することによって、さらに観察した。卵巣癌細胞株ES−2、前立腺癌細胞株PC3、乳癌細胞株MDA435/LCC6を含む3つのヒト癌細胞株について、抗癌活性を評価した(BC Cancer Research Centre、Vancouver、BC)(Fields and Lancaster,Am.Biotechnol.Lab.、11:48−50(1993);Nakayamaら、J.Immunol.Methods、204:205−208(1997))。薬物に72時間暴露した後、Alamar Blueアッセイを用い、細胞毒性を決定した。簡単に説明すると、種々の量のTD1または親薬物(DMSOに溶解)存在下、細胞を96ウェルプレート中、37℃で72時間インキュベーションし、インキュベーションが終了したら、Alamar Blue溶液をすべてのウェルに加えた(20μl/ウェル、培養容積の10%)。プレートをインキュベーターに4時間戻し、λex=530nmおよびλem=590nmでサンプルの蛍光を決定した。生存率を以下の式にしたがって算出した:細胞生存率(%)=(Fplus drug−Fbackground)/(Fminus drug−Fbackground)×100、式中、Fplus drugは、薬物存在下での蛍光の読みであり、Fminus drugは、薬物が存在しない状態の細胞コントロールであり、Fbackgroundは、バックグラウンド蛍光である(培地のみ)。S字型曲線を濃度−生存率プロットにフィッティングさせることによってIC50値(nM)を算出し、これを表4に示す。TD1は、ドセタキセルと同様に活性であり、このことは、このプロドラッグが、活性化合物へと容易に変換されたことを示している。
実施例15−in vivoでの抗癌活性
LN−ドセタキセル誘導体配合物の抗癌効能を、ヒト乳癌(MDA−MB−435/LCC6)の皮下異種移植モデルに1回ボーラス注射した後、評価した。マウスMDA−MB−435/LCC6細胞を、2mM L−グルタミンおよび10%FBSを含むDMEM中、37℃、5%CO2環境で培養した。雌のRAG2−Mマウスに5×106(50μL)の細胞を、右の後ろ側の脇に皮下接種した。腫瘍の大きさが100〜150mm3に到達したら、動物を無作為にグループ分けし(1グループあたり6匹の動物)、タキソテール(商標)を投薬量25mg/kg、またはTD1のLN配合物(DSPC/Chol、DPPC/Chol、DMPC/Chol、55:45mol%、プロドラッグ/脂質の重量比0.2wt/wt)を3種類の異なる投薬量(31.25mg/kg、50mg/kg、110mg/kg、ドセタキセル25mg/kg、40mg/kg、88mg/kgに対応する)で、1回静脈ボーラス注射した。腫瘍の成長および動物の体重を3日ごとに測定した。腫瘍の成長は、デジタルカリパスで腫瘍の寸法を測定することによって監視し、腫瘍の容積は、長さ×(幅2)÷2の式にしたがって算出し、長さ(mm)は、腫瘍の長いほうの軸である。腫瘍が最大で700mm3まで到達したら動物をと殺し、腫瘍に潰瘍を生じた動物はと殺した。
腫瘍成長阻害(最適な%T/C);腫瘍成長の遅れ(T−C);治療された腫瘍と、コントロール腫瘍とで、大きさが2倍になるまでにかかる時間の差;NCIスコアを含む、抗癌活性の確立されたパラメーターを比較することによって、治療の有効性を評価した(Plowman J、Dykes DJ、Hollingshead M、Simpson−Herren L、Alley MC.1997.Human tumor xenograft models in NCI drug development.In:Teicher BA editor.Anticancer drug development guide: Preclinical screening,clinical trials,and approval.Totowa:Humana Press,Inc.pp101−125)。これに加えて、任意の薬物に関連する死(最後の投薬から15日以内で、腫瘍による負荷が低い)、最大体重減少(グループの平均)が報告されている。%T/C値およびNCIスコアは、以下のように算出した。各治療群(T)およびコントロール群(C)において、腫瘍について、毎日、特定の観察日の腫瘍容積の中央値から、1回目の処置の日の腫瘍容積の中央値を引くことによって測定し、腫瘍容積の変化を算出した。得られた値を用い、%T/C=(ΔT/ΔC)×100にしたがって、T/C率を算出した。最適な(最少)値を用い、抗腫瘍活性を定量した。NCIスコア0は、最適%T/C>42に割り当てられ、その治療が有効ではないことを意味する。スコア1は、最適%T/C値1〜42に割り当てられ、腫瘍の成長が阻害されていることを示す(Capdevilleら、Nature Reviews Drug Discovery、1:493−502(2002))。
LNキャリアの脂質組成が、封入されたTD1の有効性に及ぼす影響を図8Aに示している。DSPC/Chol LN配合物、DPPC/Chol LN配合物、DMPC/Chol LN配合物(TD1−対−脂質の比率0.2wt/wt)を、ドセタキセル40mg/kgに等価な投薬量で投与した。DSPC/Chol配合物は、腫瘍の成長を最も効果的に阻害し、DPPC/Chol、DMPC/Chol(最も活性が低い)配合物と続いた。抗腫瘍効能は、放出速度と大きく相関しており、最も遅い放出速度を示す配合物が、最も活性である。
DSPC/Chol配合物(TD1−対−脂質の比率0.2wt/wt)の治療活性を、25mg/kg タキソテール(商標)/ドセタキセルと比較し、3種類の異なる投薬量(ドセタキセル25、40、88mg/kg)で決定した。等モル量の投薬量(25mg/kg ドセタキセル)のタキソテール(商標)は、LN配合物よりもわずかに有効であった。しかし、LN配合物は、タキソテール(商標)のMTDよりもずっと高い投薬量で投与することができる。これらの投薬量では、DSPC/Chol LN配合物は、顕著に有効性が高かった(図8B)。最も顕著な腫瘍成長の抑制は、88mg/kg ドセタキセルで観察され、最適%T/C値は5%であり、腫瘍成長の遅れ(T−C)は、タキソテール(商標)では9日であったのに対し、29日であった(表5)。この結果は、LN配合物が、タキソテール(商標)よりもずっと潜在的に有効であることを示す。
実施例16−忍容性試験
忍容性試験は、有効性試験で使用する最大耐量(MTD)および投薬量範囲を確立することを目的としていた(有効性試験は、1回の静脈注射によるものであった)。1回の投薬によるMTD試験は、LNに封入されたTD1、ドセタキセルと同様の様式でタキソテール(商標)に配合されたTD1、タキソテール(商標)を用い、免疫力を低下させたSCID/Rag2−Mマウス(有効性試験でも用いた)で行った。この試験は、1回の投薬量を投与し、マウス3匹/群によるものであり、誘導体およびタキソテールについて3種類の投薬量、LN配合物(DSPC/Chol 55:45mol%、プロドラッグ/脂質の重量比0.2mg/mg)について5種類の投薬量で、用量漸増戦略によるものである。すべての配合物を、容積200μl/マウス20gで、尾の側面の静脈に静脈投与した。
薬物を投与してから14日間、毒性の徴候についてマウスを毎日監視した。体重変化および行動パラメーターの変化によって、忍容性を評価した。MTDは、体重が約15%減少するが、死に至らない投薬量であると定義される。個々のマウスの体重は、試験期間中、2日ごとに測定した。体重減少が、忍容性の良好な予測材料とならない場合、毒性のために、動物を殺す必要がなくなる投薬量を使用した。
結果を表6にまとめている。タキソテール(商標)の1回の投薬によるMTDは、29mg/kgであり、一方、TD1のMTDは、16mg/kgであった(ドセタキセル等価物のMTDは、20mg/kg プロドラッグに対応する)。TD1は、ドセタキセル20mg/kgと等価の投薬量で、急性毒性(致死)を示した。急性毒性は、注射後に薬物が蓄積することと関係があると考えられる。これとは対照的に、LNに封入されたTD1(DSPC/Chol 55:45mol% LN、プロドラッグ/脂質の重量比0.2mg/mg)は、なんら毒性の徴候を示すことなく、ドセタキセル88mg/kgと等価の投薬量まで高くなっても、十分に忍容性であった(顕著な体重の変化や、行動パラメーターの変化がみられなかった)(表6)。LN配合物のMTDは、タキソテール(商標)のMTD(29mg/kg)よりも少なくとも3倍大きく、このことは、忍容性がかなり高く(毒性がほとんどなく)、したがって、より高く、効果的な投薬量で投与することができることを示している。ビヒクル(ポリソルベート80/生理学的食塩水)単独では、有害な影響はみられなかった。
本発明をこのように記載してきたが、これらを多くの様式で変更してもよいことは明らかであろう。このような変更は、本発明の精神および範囲から逸脱するとはみなされず、当業者に明らかなこのようなすべての改変は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
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- 本願明細書に記載のリポソームナノ粒子中で使用するための修飾薬物など。
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