JP2002542302A - リポソームにおいての使用のための開裂可能な結合を有する複合体 - Google Patents

リポソームにおいての使用のための開裂可能な結合を有する複合体

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Abstract

(57)【要約】 治療薬に、開裂可能なジチオベンジル結合を介して結合されている、脂質類のような疎水性部分の複合体が記載される。該ジチオベンジル結合はおだやかなチオ開裂による開裂を受けやすく、その元のままの形で治療薬の放出を生ずる。該結合は非還元性条件下で安定である。該複合体はインビボ投与のためにそして内因性インビボ還元条件に応答してあるいは外因性還元剤の投与に応答して治療薬を放出するために、リポソーム類に導入されることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、疎水性部分、開裂可能な結合および治療薬からなる複合体（ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ）に関する。さらに特定的には、本発明はリポソーム配合物に導入
される、脂質、開裂可能な結合および医薬からなる複合体に関する。本複合体は
変性されていない状態で医薬を放出するために、インビボでおだやかなチオ開裂
（ときにはチオール類溶媒を加えての分解を言う）条件下に開裂可能である。
【０００２】 （技術分野） リポソーム類は種々の治療目的のためにそして特にリポソーム類の全身投与 により目標とする領域または細胞に治療薬を運ぶために、用いられる閉じられた
脂質小胞である。水溶性生体適合性重合体、特にポリエチレングリコールの鎖で
架橋された表面を有するリポソーム類は、重要な医薬運搬体となって来た。これ
らのリポソーム類は重合体コーティングがないリポソーム以上に延長された血液
循環活動寿命を提供する。架橋された重合体鎖はリポソームを遮蔽するかまたは
隠蔽し、かくして血漿たんぱく質による非特異的相互反応を最小化する。これは
また、マクロファージおよび細網内皮細胞システムの他の細胞により認知されな
かったリポソームが循環するので、インビボでリポソームが取り除かれるかまた
は排除される速度を遅延化する。さらに、いわゆる高められた浸透性および保持
作用に起因して、リポソーム類は損傷されたまたは拡張された血管構造物、例え
ば腫瘍、炎症の部位に蓄積する傾向を有する。
【０００３】 延長された血管循環時間は、目標領域、細胞または部位に到達することを、全
身的に投与されたリポソーム類に可能にするために、多くの場合望ましい。例え
ば約１２時間より長い血液循環活動時間は、リポソームが全身的に分布しそして
次に腫瘍領域に溢れ出なければならないので、腫瘍領域に対するリポソーム治療
のために好ましい。
【０００４】 リポソームに基づく治療に伴う１つの問題は、全身分布のために十分な時間に
わたってリポソーム内に医薬を保持すべきことである。この問題は、長く循環す
るリポソーム類、即ち、架橋された重合体鎖を有するリポソームが投与された時
に特に関係する問題である。有効に装入されそして長い期間にわたって保持され
そして次に放出されることが出来る医薬は比較的に少ない。
【０００５】 医薬保持を改良するための１つの方法は、取り込まれた医薬がより小さい浸透
性となる二重層にする脂質二重層成分を選ぶことである。しかしながら、脂質二
重層は、所望の時間に、例えば目標部位に局在化または十分な体内分布後に、二
重層を横切っての移送によりまたは脂質小胞破壊により医薬が放出されるように
十分に流動性であるべきである。
【０００６】 医薬保持を改良するための他の方法は、リポソームの脂質二重層中の脂質に医
薬を共有的に結合させることである（Ｗａａｌｋｅｓ、等によるＳｅｌｅｃｔｉ
ｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ．，６：１５−２２（１９９０）；Ａｓａｉ
、等によるＢｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２１：７６６−７７１（１９９
８））。
【０００７】 長い血液循環活動寿命を有しそして所望の時間にわたって、取り込んだ医薬を
保持することが出来、しかも要求に応じて医薬を放出することが出来るリポソー
ム組成物を配合することが望ましいだろう。これらの特徴を達成させるために当
業界において記載された１つの方法は、ジオレオイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＯＰＥ）のような非小胞形成性脂質およびメトキシ−ポリエチレング
リコール−ジステァロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰ
Ｅ）のような脂質を安定化する脂質二重層からリポソームを配合することであっ
た（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ，Ｄ．、等によるＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８８：１１５−
１１８（１９９６））。この方法において、そのｍＰＥＧは開裂可能な結合を介
してＤＳＰＥに結合されている。結合の開裂は、リポソーム含有物のすみやかな
放出のためにリポソームを不安定化する。
【０００８】 リポソーム類にＰＥＧ重合体鎖を結合するための不安定な結合は記載されてい
た（米国特許第５，０１３，５５６号、同第５，８９１，４６８号、ＷＯ９８／
１６２０１）。これらのリポソーム組成物中の不安定な結合は、リポソームから
ＰＥＧ重合体鎖を開放して、例えば目標リガンドに結合された表面を露出させる
かまたは目標細胞とのリポソームの融合を始動させる。
【０００９】 しかしながら、今日まで、インビボでの使用のために適当な条件下でリポソー
ムから重合体鎖を開放する手段は達成されていなかった。例えば或る種の開放可
能な結合は重合体鎖の開放を達成させるために、１，４−ジチオトレイトールの
ような有能なチオ開裂剤を必要とする。この還元剤はインビボでの使用のために
許容出来ない。リポソーム脂質にＰＥＧを結合する既知の開放可能な結合に関し
ての他の問題は、開放可能な結合の開裂が自然的なものではないそして望ましく
ない変性された脂質を生成することである。したがって、インビボでの使用のた
めに適しておりそして開裂後に、その自然のままの変性されていない形での医薬
または治療約を生成する開裂可能な結合が当業界においていぜんとして必要とさ
れている。
【００１０】 ＥＰ０３１７９５７において、Ｓｅｎｔｅｒはジサルファイドベンジルカルバ
メートまたはカーボネートリンカーを用いて抗体が医薬に結合されておりそして
ジサルファイド結合の還元が医薬放出を行う、医薬−抗体プロドラッグを記載し
ている。Ｓｅｎｔｅｒの教示は、１，４−ジチオトレイトール、グルタチオン、
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのような還元剤の作用下に医薬−リガンドプロドラッ
グ分子の開裂に特異的である。血液流を通して循環するリポソーム中に導入され
る場合、そのようなリンカーの挙動は、Ｓｅｎｔｅｒの開示に基づいては予想さ
れることが出来ない。例えば、リポソームにおいて、重合体と脂質との間のリン
カーはＰＥＧコーティング中に埋め込まれるかまたは隠蔽されるだろう。Ｓｅｎ
ｔｅｒにおけるような１種の医薬−リガンドプロドラッグの放出を心に描くこと
は比較的に容易である：しかしながら、重合体鎖のリポソーム表面コーティング
中におけるような密にパックされたバリア（障壁）の部分である場合のリンカー
の開放は容易に予想されることが出来ない。
【００１１】 上記のように、延長された血液循環時間は、ＰＥＧコーティングされたリポソ
ームの望ましい特徴であり、約１２時間より長い血液循環活動寿命は腫瘍領域に
対するリポソーム治療のために好ましい。Ｓｅｎｔｅｒの開示は、リポソームの
血液循環中のような内因性還元条件下に、リポソームに導入された複合体の放出
速度論に関してのガイダンスを提供していない。
【００１２】 （発明の開示）発明の概要： したがって、リポソームからの放出のために所望の時間期間にわたって医薬が
保持されている、リポソーム組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１３】 複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が、脂質二重層（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ
）中に固定するための疎水性部分、おだやかなチオ開裂（ときにはチオール類溶
媒を加えての分解とも言う：ｔｈｉｏｌｙｔｉｃ）条件に応答して開裂出来る結
合および治療薬から構成される、リポソームにおいて使用するための、複合体を
提供することが本発明の他の目的である。
【００１４】 １つの面において、本発明は、複合体が一般構造式： （式中、Ｌはリポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分であ
り、Ｒ1はジチオベンジル部分に共有結合された治療薬を表しそしてＣＨ2Ｒ1基
の配向はオルト位置またはパラ位置から選ばれる）を有する、リポソームの医薬
送り出しビヒクルにおいて使用するための複合体を包含する。
【００１５】 １つの態様において、治療薬が、ウレタン、アミン、アミド、カーボネート、
チオカーボネート、エーテルおよびエステルからなる群から選ばれた結合により
共有的に結合されている。
【００１６】 他の態様において、Ｌはコレステロール、ジアシルグリセロール類、燐脂質類
およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる。
【００１７】 なお他の態様において、Ｌは一般構造式： （式中、Ｒ2およびＲ3は約８〜約２４個の炭素原子を有するかあるいは他の態様
において、約１２〜２２個の炭素原子を有する炭化水素である）を有する複合体
を生成するためのジアシルグリセロール誘導体である。なお他の態様において、
Ｒ2とＲ3とは同じ長さの炭化水素鎖である。
【００１８】 他の態様において、医薬はマイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ：ブレオマイ
シン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、フルオロデオキシウリジン、ヨードデ
オキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシ
ルシトシン、ペントスタチン、キニジン、アトロピン、クロラムブシル、メトト
レキサート、ミトザントロンおよび５−フルオロウラシルからなる群から選ばれ
る。
【００１９】 なお他の態様において、治療薬は構造： （式中、Ｒ4は治療薬の残基を表す）を有する複合体を形成するためにジチオベ
ンジル部分に共有的に結合されている。
【００２０】 １つの態様において、Ｒ4は第一級アミンまたは第二級アミン部分を含有する
治療薬残基であり、それによりジチオベンジルと治療薬との間にウレタン結合を
形成する。この態様において、治療薬は、例えばマイトマイシンＡ、マイトマイ
シンＣ、ブレオマイシンまたはポリペプチド類であることが出来る。
【００２１】 他の態様において、Ｒ4は、ジチオベンジルと治療薬との間にエステル結合を
形成する、カルボキシ含有治療薬の残基である。この態様における例示的医薬は
クロラムブシルまたはメトトレキサートを包含する。
【００２２】 他の態様において、Ｒ4は、ヒドロキシル部分を含有する治療薬残基であり、
それによりジチオベンジルと治療薬との間にカーボネート結合を形成する。この
態様における例示的医薬は、フルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジ
ン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン、
ペントスタチン、キニジン、ミトザントロンおよびアトロピンを包含する。
【００２３】 他の面において、本発明は、上記一般構造式を有する複合体の約１〜約３０モ
ルパーセントを含む、小胞形成性脂質からなるリポソームを含むリポソーム組成
物を包含する。治療薬は、生理学的条件または人工的に誘導された条件に応答し
てインビボで複合体から放出される。
【００２４】 なお他の面において、本発明は、小胞形成性脂質から構成されそして上記複合
体の約１〜約３０モルパーセントから構成されるリポソームを造ることからなる
、リポソーム中に医薬を保持するための方法を包含する。リポソームは、生理学
的条件または人工的に誘導された条件に応答して複合体から放出するまで、リポ
ソーム中に医薬を有効に保持する。
【００２５】 本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、添付の図面と一緒に本発明の
以下の詳細な記載を読むときに、一層十分に認識されるだろう。
【００２６】発明の詳細な記載： Ｉ．定義： 語句“リポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分”は、リ
ポソームの脂質二重層の疎水性二重層領域中に組み込まれることが出来る疎水性
部分を含む任意の材料を意図する。そのような疎水性部分は、燐脂質類およびジ
アシルグリセロール類のような、疎水性脂質ティル（尾部）と親水性極性ヘッド
（頭部）とを有する両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）脂質を包含する、典型
的には脂質類である。トリグリセリド類、ステロール類、そして燐脂質類、ジア
シルグリセロール類、ステロール類およびトリグリセリド類の、誘導体そして天
然源から誘導されたまたは合成的に造られた他の脂質類がまた、意図される。
【００２７】 “治療薬残基”のような用語“残基”は、医薬分子の少なくとも１つの原子が
置き換えられるかまたは取り除かれて結合を形成する、他の分子との結合を形成
するために反応された医薬分子を意図する。
【００２８】 本明細書において用いられるものとして“ポリペプチド”は、アミノ酸の重合
体を言っておりそしてアミノ酸の特定の長さの重合体を言わない。したがって、
例えば用語ペプチド、オリゴペプチド、たんぱく質および酵素はポリペプチドの
定義内に包含される。この用語はまた、ボリペプチドのそのあとで表現される変
性、例えばグリコシル化、アセチル化、燐酸化、等を包含する。
【００２９】 以下の省略語が本明細書において用いられる：ＰＥＧ＝ポリ（エチレングリコ
ール）、ｍＰＥＧ＝メトキシ−ＰＥＧ、ＤＴＢ＝ジチオベンジル、ＤＳＰＥ＝ジ
ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ＨＳＰＣ＝水素添加された大豆
ホスファチジルコリン、ＭＭＣ＝マイトマイシンＣ。
【００３０】ＩＩ．複合体組成および製造方法： １つの面において、本発明は、形状： （式中、Ｌは、リポソームの脂質二重層に導入するために適当な疎水性部分であ
り，Ｒ1は、ジチオベンジル部分に共有的に結合された治療薬残基を表しそして
ＣＨ2Ｒ1基の配向はオルト位置およびパラ位置から選ばれる）の複合体を包含す
る。疎水性部分のＬは典型的には、ジアシルグリセロール類、ステロール類、燐
脂質類、これらの脂質の誘導体、他の天然に存在する脂質およびそれらの合成類
似体のような脂質類である。
【００３１】 本複合体において、治療薬は共有結合によりジチオベンジル部分に結合され、
それにより、構造式においてＲ1で表される医薬残基を形成する。結合は当業者
により認識されるように、医薬および反応化学に従って変化するだろう。好まし
い態様において、治療薬はウレタン、アミン、アミド、カーボネート、チオカー
ボネート、エーテルおよびエステルからなる群から選ばれた結合によりジチオベ
ンジル部分に共有的に結合されている。
【００３２】 ウレタン結合はＯ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ4またはＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ＝Ｒ4（但し、Ｒ 4 は治療薬残基を表す）の形を取る。例えばマイトマイシンＣ、マイトマイシン
Ａ、ブレオマイシンそして２、３の名前が挙げられる治療ポリペプチド類のよう
な第一級アミンまたは第二級アミンを含有する医薬は医薬中にアミン部分を有す
るウレタン結合を形成するように反応される。
【００３３】 カーボネート結合は、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｒ4（但し、Ｒ4は医薬残基を表す）の
形を取りそしてカーボネート結合は医薬中のフェノール、アルコールあるいはヒ
ドロキシル部分から由来する。チオカーボネートはＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ−Ｒ4（但し
、Ｒ4は医薬残基を表す）の形を取りそしてその結合は医薬中の部分から由来す
る。カーボネート結合を形成するようにジチオベンジルアルコールと反応するた
めのそのような部分を有する例示的医薬は、フルオロデオキシウリジン、ヨード
デオキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノ
シルシトシン、ペントスタチン、キニジン、ミトザントロンおよびアトロピンを
包含する。
【００３４】 エステル結合は、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ4（但し、Ｒ4は医薬残基を表す）の形を取
る。その結合は治療薬中のカルボン酸部分との反応から由来しそしてクロラムブ
シルとジチオベンジルとの間にエステル結合を有する複合体の例は下に示される
。メトトレキサートは、複合体のジチオベンジル部分とのエステル結合を形成す
ることが出来る医薬の他の例である。
【００３５】 ジチオベンジル部分に医薬を結合するウレタン、カーボネートまたはエステル
結合を有する複合体は一般に以下の構造式により表されることが出来る： （式中、Ｒ4は治療薬の残基を表す）。
【００３６】 他の態様において、複合体はエーテル結合を含み、その結合はＯ−Ｒ4（但し
、Ｒ4は治療薬残基を表す）の形を取る。その結合は典型的には、医薬上のアル
コール官能基との反応から由来する。
【００３７】 アミン結合は、Ｎ＝Ｒ4（但しＲ4は医薬残基を表す）の形の結合でありそして
その結合は、ジチオベンジルのＣＨ2部分と医薬中のＮとの直接結合である。ア
ミン結合が形成される医薬５−フルオロウラシルを有する複合体は下に示される
。アミド結合はまた、治療薬としてのペプチド類と形成されることが出来、その
場合において、アスパラギン酸またはグルタミン酸のようなアミノ酸残基の遊離
のカルボキシルがジチオベンジルアミンと縮合される。
【００３８】 アミド結合は、ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ4（但しＲ4は医薬残基を表す）の形を取る
。
【００３９】 図１は本発明に従う例示的複合体の製造のための合成反応方式を示す。この態
様において、中間体化合物であるパラ−ジアシルジグリセロールジチオベンズア
ルコール（化合物ＩＶ）の合成は、その後での選ばれた治療薬との反応のために
造られる。化合物ＩＶは、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール（化合物
Ｉ）を過酸化水素と反応させてラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパ
ンジオール）（化合物ＩＩ）を形成することにより、例１において記載されたと
おりにして造られる。ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオー
ル）は、疎水性部分Ｒを用いてアシル化される。例えばＲは、約８〜約２４個の
炭素原子を有する脂肪酸であることが出来る。例１はＲがステアリン酸である場
合の反応手順を詳細に記載している。他の態様において、Ｒは約１２〜約２２個
の炭素原子を有する脂肪酸である。化合物ＩＩのアシル化は、ラセミ−３，３’
−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイル）（化合物ＩＩＩ）を生成し、
これは塩化スルフリルおよび４−メルカプトベンズアルコールと反応されて所望
の中間体生成物パラ−ジアシルジグリセロール−ジチオベンズアルコール（化合
物ＩＶ）を形成する。化合物ＩＶは反応性カルボキシル部分（Ｒ’ＣＯ2Ｈ）を
含有する医薬と容易に反応されて、医薬がエステル結合を介してＤＴＢに結合さ
れている脂質−ジチオベンジル（ＤＴＢ）−医薬複合体（化合物Ｖ）を形成する
。化合物ＩＶはまた、反応性アミン部分（Ｒ’−ＮＨ2）を含有する医薬と容易
に反応されて、医薬がウレタン結合によりＤＴＢに結合されている脂質−ＤＴＢ
−医薬複合体（化合物ＶＩ）を生成する。化合物ＩＶはまた、反応性ヒドロキシ
ル部分（Ｒ’ＯＨ）を含有する医薬と容易に反応されて医薬がカーボネート結合
によりＤＴＢに結合されている、脂質−ＤＴＢ−医薬複合体（化合物ＶＩＩ）を
形成する。
【００４０】 種々の医薬が本発明の複合体において使用するために意図される。特に本発明
は、反応のために適当な、アミン（ＮＨまたはＮＨ2）、カルボキシル、スルフ
ヒドリルまたはヒドロキシル部分を有する医薬を意図する。本明細書において使
用される用語として、“反応のために適当な”とは、例えば医薬がジチオベンジ
ルアルコール、の形でのジチオベンジル部分と反応することが出来る、列挙され
た部位の１つを有することを意味する。例示的医薬は反応のために適当なＮＨ基
を有する、５−フルオロウラシル、反応性のカルボキシルを有するクロラムブシ
ルそして反応性アミン（アジリジン基）を有するマイトマイシンＣを包含する。
これらの医薬は本発明の例示的態様の合成を例示するために使用されそして図３
〜図９に関連して論じられている。使用するために意図される他の例示的医薬は
、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダ
ウノルビシン、フルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、エトポシ
ド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン、ペントスタチ
ン、キニジン、アトロピン、クロラムブシル、メトトレキサート、ミトザントロ
ンおよび５−フルオロウラシルを包含する。ポリペプチド類、アミノグリコシド
類、アルカロイド類はすべて本発明において使用するためにまた適当である。
【００４１】 例１はまた、本複合体を形成するための中間体化合物として役に立つことが出
来る、オルト−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコールの製造のための
反応条件を詳細に記載している。
【００４２】 図２Ａ〜図２Ｂは、脂質−ＤＴＢ−医薬複合体の製造（図２Ａ）および還元剤
の存在下に複合体のチオ開裂を示す。図２Ａにおいて示されるように、疎水性部
分Ｒがステアリン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ2Ｈ）のような脂肪酸Ｒ”（ＣＯ）
ＯＨから由来する、図１の化合物ＶＩＩは、ホスゲン（ＣＯＣｌ2）の存在下に
、アミン含有医薬であるＨ2Ｎ医薬と反応される。この反応は図２Ａにおいて例
示される脂質−ＤＴＢ−医薬複合体を生成する。還元性条件、即ちシステインま
たはグルタチオンのような還元剤にさらされた際、複合体は分解して図２Ｂに示
される生成物を生ずる。図示されているように、本複合体のチオ開裂（ときには
チオール類溶媒を加えての分解による開裂を言う：ｔｈｉｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅ
ａｖａｇｅ）は、変性されていない自然の状態での医薬の再生成を結果として生
ずる。このことは、下に示されるように、複合体中の医薬が患者にインビボ投与
するためにリポソーム類に容易に導入されることが出来るので、望ましい特徴で
ある。さらに、本複合体の形における医薬は、また下に示されるように毒性でな
い。投与の後にそして内因性還元剤にさらされるかあるいは外因性還元剤にさら
された際に、複合体は分解して、その生来の状態でのそして生物学的活性を有す
る医薬を生成する。
【００４３】 図３Ａにおいて、５−フルオロウラシルの複合体の製造のための合成反応方式
が例示されている。化合物ＩＶの、パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベ
ンザルアルコールは、パラ−トルエンスルホニルクロリドと反応されて中間体化
合物ＩＸを生成する。５−フルオロウラシルアニオンまたはそのナトリウム塩（
化合物Ｘ）との反応は所望の脂質−ＤＴＢ−５−フルオロウラシル複合体（化合
物ＸＩ）を生成する。還元剤Ｄ’−ＳＨにさらされた際の脂質−ＤＴＢ−５−フ
ルオロウラシル複合体（化合物ＸＩ）の分解は図３Ｂにおいて示される。その複
合体のチオ開裂（チオール類溶媒を加えての分解による開裂）は、変性されてい
ない形での５−フルオロウラシルの生成を生ずる。
【００４４】 図４はジアシルジグリセロール−ＤＴＢ−５−フルオロウラシル複合体の製造
のための別の合成反応方式を示す。図４において、クロロ蟻酸１−クロロエチル
（化合物ＸＩＩ）は、パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザルアルコ
ール（化合物ＩＶ）と反応されて反応性クロロエチルカーボネート−ＤＴＢ−ジ
アシルジグリセロール中間体（化合物ＸＩＩＩ）を形成する。その中間体は、次
にトリエタノールアミン（ＴＥＡ）の存在下に５−フルオロウラシルと反応され
て脂質−ＤＴＢ−５−フルオロウラシル複合体（化合物ＸＩＶ）を生成する。そ
の複合体のチオ開裂（チオール類溶媒を加えての分解による開裂）および５−フ
ルオロウラシルの生成はまた図４において示される。
【００４５】 本複合体の他の態様は、図５において示される。この態様において、反応性の
カルボキシル部分を含有する医薬であるクロラムブシル（化合物ＸＶ）は１，３
−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジメチルアミノピリジン（
ＤＭＡＰ）の存在下に、パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザルアル
コール（化合物ＩＶ）と反応されて脂質−ＤＴＢ−クロラムブシル複合体（化合
物ＸＶＩ）を形成する。還元剤にさらした際に、その複合体はチオ開裂的に分解
して示された生成物になる。クロラムブシルは次に変性されていない状態で再生
される。
【００４６】 図６Ａは、本発明の他の態様に従う複合体の合成を示す。示される反応方式に
おいて、反応性アミン部分を含有する医薬であるマイトマイシンＣ（図６Ｂ中の
化合物ＸＶＩＩ）は、ホスゲンの存在下にパラ−ジアシル−ジグリセロール−ジ
チオベンザルアルコール（化合物ＩＶ）と反応されてジアシルジグリセロール−
ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体（化合物ＸＶＩＩＩ）を形成する。合
成の詳細は例２において提供される。
【００４７】 図６Ｂは、ジアシルジグリセロール−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体のチオ
開裂分解を示す。還元剤の存在下に、その複合体は分解してマイトマイシンＣ（
ＸＶＩＩ）および図示される他の生成物を再生する。
【００４８】 上に記載されているように、本複合体における疎水性部分は任意の多種の疎水
性部分、例えば脂質類から選ばれることが出来る。上の例において、ジアシルジ
グリセロール脂質は、構造式： （式中、Ｒ2およびＲ3は約８〜約２４個の炭素原子を有する炭化水素である）を
有する複合体を形成するために用いられた。
【００４９】 疎水性部分としてのジアシルグリセロールに加えて、他の脂質が意図される。
図７は本複合体における疎水性部分としてコレステロールが使用される他の態様
を示す。コレステロール（化合物ＸＩＶ）は、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）
の存在下にジクロロメタン中のメタンスルホニルクロリドと反応される。得られ
た中間体は次にチオール誘導体に転換されそして最後に主要なジチオベンジルア
ルコールに転換され、これはジアシルグリセロールについて上記した様式と同じ
様式でマイトマイシンＣを結合するために用いられる。
【００５０】 コレステロール−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体の製造のための別の反応方
式は図８に示される。メトキシカルボニルジチオエチルアミンはクロロ蟻酸コレ
ステロールと直接に反応されてウレタン結合を形成する。次にメルカプトベンジ
ルアルコールはＤＴＢ−コレステロール化合物を得るために用いられる。マイト
マイシンＣは上にそして例２に記載されたとおりにして結合される。
【００５１】 上に記載された種々の複合体は単なる例示であることが当業者により認識され
よう。広い種々の他の疎水性部分そしてドキソルビシンおよびダウノルビシンの
ような他の医薬が本発明において使用するために意図されそして適当である。下
に記載される本発明を支持するのに行われた追加の研究において、図６Ａにおい
て造られたとおりの複合体（化合物ＸＶＩＩＩ）であるパラ−ジステアロイル−
ＤＴＢ−マイトマイシンＣが用いられた。参照を容易にするために、この複合体
は図９Ａにおいて示される。ジパルミトイル脂質のような、他のジアシル脂質が
用いられることが出来ることが認識されるべきでありそして図９Ｂはパラ−ジパ
ルミトイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体を示す。本複合体がまた異性体結
合を有することが出来ることがまた認識されよう。このことは図９Ｃに示される
ようなオルト−ジパルミトイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体により明らか
である。
【００５２】ＩＩＩ．複合体を含むリポソーム類の製造： 他の面において、本発明は、小胞形成性脂質および上記のような複合体からな
るリポソーム組成物を包含する。リポソーム類は、種々の治療目的のためにそし
て特にリポソーム類の全身投与により目標領域または細胞に治療薬を運ぶために
用いられる、閉じられた脂質小胞である。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）のような、親水性重合体鎖の表面コーティングを有するリポソーム類は、こ
れらのリポソーム類が重合体コーティングのないリポソーム類以上に、延長され
た血管循環活動寿命時間を提供するので、望ましい。その重合体は血液たんぱく
質に対してバリア（障壁）として働き、それによりたんぱく質の結合そしてマク
ロファージおよび細網内皮細胞システムの他の細胞による吸収および除去のため
にリポソームを認知するのを防止する。
【００５３】 本発明に従うリポソーム類は、１つの態様において、小胞形成性脂質および場
合により他の二重層成分（ｂｉｌａｙｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）である脂質と
組み合わせて複合体を含む。“小胞形成性脂質類”は水中で二重層小胞を自然に
形成する脂質類である。小胞形成性脂質は、好ましくは２つの炭化水素鎖、典型
的にはアシル鎖および極性ヘッド基を有する。２つの炭化水素鎖が典型的には長
さにおいて約１２〜約２４個の炭素原子でありそして種々の程度の不飽和を有す
る、当業界に知られている種々の合成小胞形成性脂質および天然に存在する小胞
形成性脂質が存在する。例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジル
エタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシ
トール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）のような燐脂質類である。本
発明において使用するために好ましい脂質は、水素添加大豆ホスファチジルコリ
ン（ＨＳＰＣ）である。他の好ましい群の脂質類はジアシルグリセロール類であ
る。これらの脂質類は市販されているかまたは刊行された方法に従って造られる
ことが出来る。
【００５４】 小胞形成性脂質は、或る程度の流動性または堅さを達成させるために、血清中
のリポソームの安定性を制御するために、そしてリポソーム中に取り込まれてい
る薬剤の放出の速度を制御するために、選ばれることが出来る。一層堅い脂質二
重層または脂質結晶二重層を有するリポソーム類は、比較的に堅い脂質、例えば
比較的に高い相転移温度、例えば約８０℃までの相転移温度を有する脂質を導入
することにより造られることが出来る。堅い脂質、即ち飽和された脂質は脂質二
重層における一層大きな膜堅さに寄与する。コレステロールのような他の脂質成
分は脂質二重層構造での膜堅さに寄与することがまた知られている。
【００５５】 脂質の流動性は、比較的に流動性の脂質、典型的には例えば室温または室温以
下（約２０〜２５℃）の比較的に低い液体ないしは液体−結晶相転移温度を有す
る液体相を有する脂質を導入することにより達成される。
【００５６】 リポソーム類はまた、脂質二重層中に導入されることが出来る、ステロール類
のような、他の成分を含むことが出来る。これらの他の成分は典型的には、二重
層膜の内部の疎水性領域と接触している疎水性部分、そして膜の外側の極性表面
に向かって配向された極性ヘッドグループを有する。
【００５７】 本発明のリポソーム類における他の脂質成分は、親水性重合体で誘導化された
小胞形成性脂質である。この脂質成分において、誘導体化された脂質は脂質二重
層の内部表面および外部表面の両方の上で親水性重合体鎖の表面コーティングの
形成を生ずる。典型的には，約１〜２０モルパーセントの誘導体化された脂質が
脂質組成物に含まれる。
【００５８】 小胞形成性脂質で誘導体化するために適当な親水性重合体は、ポリビニルピロ
リドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキ
サゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタ
クリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒド
ロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキ
シメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコールお
よびポリアスパルタミド（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）を包含する。それ
らの重合体は単独重合体としてあるいはブロック共重合体またはランダム共重合
体として使用されることが出来る。
【００５９】 好ましい親水性重合体鎖は好ましくは、約５００〜約１０，０００ダルトン、
好ましくは約１，０００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ鎖とし
てポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。ＰＥＧのメトキシ末端封鎖された
またはエトキシ末端封鎖された類似体はまた、好ましい親水性重合体である。こ
れらの重合体は、例えば約１２〜約２２０，０００ダルトンの、種々の重合体寸
法で市販されている。
【００６０】 本発明のリポソーム類は典型的には、約１〜約３０モルパーセント、好ましく
は約５〜約３０モルパーセント、さらに好ましくは約５〜約２０モルパーセント
の脂質−ＤＴＢ−医薬複合体を含む。本発明の支持に行われた研究において、小
胞形成性脂質である水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、メトキシ
−ポリエチレングリコールで誘導体化されたジステアロイルホスファチジルエタ
ノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）および図９Ａにおいて示された複合体であ
るパラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシン（化合物ＸＶＩＩＩ）からな
るリポソームが例４Ａ〜例４Ｂにおいて記載されているとおりにして造られた。
リポソーム配合物の１つは６０／３０／５／５のモル比で存在する脂質ＨＳＰＣ
／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／パラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイ
トマイシンＣ（化合物ＸＶＩＩＩ）であって、コレステロールを含んでいた（例
４Ａ）。コレステロールを含有しない第２配合物が造られそして特徴づけられた
（例４Ｂ）。この配合物において、脂質ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／パラ−
ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（化合物ＸＶＩＩＩ）が９０／５／
５のモル比で存在した。
【００６１】ＩＶ．複合体含有リポソーム類のインビトロ特徴づけ： Ａ．インビトロ医薬放出： リポソームが例４Ａ〜例４Ｂにおいて記載されたとおりにして造られそして還
元剤にさらした後のマイトマイシンＣの放出の速度を測定するためにインビトロ
で特徴づけられた。そのインビトロ研究のために、試験媒体に、典型的には約１
５０μＭの濃度でシステインを添加することにより還元条件が誘導された。イン
ビボ内因性還元条件は医薬の放出のための脂質−ＤＴＢ−医薬複合体のチオ開裂
分解を行うために十分であろうことが認識されよう。インビボでの還元条件はシ
ステインまたはグルタチオンのような適当な還元剤の投与により人工的に誘導さ
れることが出来ることがさらに意図される。
【００６２】 リポソーム配合物、例えばＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／
複合体化合物ＸＶＩＩＩ（以後“コレステロール含有配合物”と言う）およびＨ
ＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／複合体化合物ＸＶＩＩＩ（以後“コレステロール
含有なしリポソーム配合物”と言う）は、２４時間１５０μＭのシステインの存
在下に３７℃でインキュベートされた。サンプルを選ばれた時間の点で取り出し
そして複合体の量および遊離のマイトマイシンＣの量を定量化するために、高速
液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析した。ＨＰＬＣ条件は例５におい
て記載されている。
【００６３】 図１０Ａ〜図１０Ｂは、２種のリポソーム配合物についてのＨＰＬＣクロマト
グラムを示す。図１０Ａにおいて、コレステロール含有なしリポソーム配合物に
ついての結果が示される。時間がゼロで、検出出来る遊離のマイトマイシンＣは
存在せずそしてすべての測定出来る医薬は、リポソームに結合されている脂質−
ＤＴＢ−医薬複合体の形にある。インキュベーション時間が増加するにつれて、
リポソームから放出されそして遊離な形で検出出来るマイトマイシンＣの量が増
大し、それに対応してマイトマイシンＣ結合複合体の存在が減少している。
【００６４】 図１０Ｂは、コレステロール含有リポソーム配合物についての結果を示す。時
間ゼロで取り出された第１サンプルにおいて検出出来る遊離のマイトマイシンＣ
は存在しなかった。１５０μＭのシステイン中でのインキュベーションの１時間
後に、少量の遊離医薬が検出され、脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体結合
のリポソームの分解を示す。図１０Ａと比較して、コレステロール含有リポソー
ムは一層は一層ゆっくりとして複合体分解速度そしてそれに応じての医薬の一層
ゆっくりとしての放出を生ずる。
【００６５】 図１１は、図１０Ａ〜図１０Ｂにおけるクロマトグラムから決定されたとおり
の、２種のリポソーム配合物から放出されたマイトマイシンＣのパーセントを示
すプロットである。コレステロール含有なしリポソーム（中が黒いダイアモンド
形点）は、コレステロール含有リポソーム（中が黒い円形点）より一層高い放出
速度を有した。コレステロール含有なし配合物について２時間後に、５０％より
多くのマイトマイシンＣが複合体結合リポソームから放出された。両方の配合物
について、２４時間インキュベーション期間の終わりに８０％より多くの医薬が
放出された。
【００６６】 他の研究において、２種のリポソーム配合物が１．５ｍＭのシスティン中でイ
ンキュベーションされた。例５において記載されたとおりにして分析を行いそし
て図１２Ａ〜図１２Ｂにおいて結果を示す。図１２Ａはコレステロール含有なし
リポソーム（ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ
）中に導入されている脂質−ＤＴＢ−医薬複合体から放出されたマイトマイシン
Ｃのパーセントを示す。１５０μＭでインキュベーション中のパーセント放出が
比較のために示される（中が黒いダイアモンド形点）。見られるように、高い濃
度の還元剤（１．５ｍＭ：中が白いダイアモンド形点）は、複合体の分解の速度
および医薬放出の速度においての増大を生ずる。
【００６７】 図１２Ｂは、コレステロールを含有するリポソーム配合物についての結果を示
す。１．５ｍＭのシステイン還元剤（中が白い円形点）中でインキュベートされ
たリポソームは、１５０μＭのシステイン（中が黒い円形点）中でインキュベー
トされた同じリポソームより有意義に高い分解速度を有する。
【００６８】Ｂ．インビトロ細胞毒性： 脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体（化合物ＸＶＩＩＩ）を含有するリポ
ソームのインビトロ細胞毒性が、マウス肺癌系のＭ−１０９細胞を用いて評価さ
れた。例６において記載されているとおりに、Ｍ１０９細胞は、遊離のマイトマ
イシンＣの存在下にあるいはジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体
を含有するリポソームの存在下にインキュベートされた。例６Ａにおいて特定さ
れたモル比を用いて例４Ａ〜例４Ｂにおいて記載されたとおりにして造られたリ
リポソームが試験された。１５０μＭ、５００μＭおよび１０００μＭの濃度で
システインは、複合体のチオ開裂分解およびマイトマイシンＣの放出を行うため
に幾つかの試験細胞に加えられた。
【００６９】 ＩＣ５０値は、例６に記載されたとおりに、対照増殖速度の５０％阻止を起こ
させる医薬濃度して取り上げられる。結果を表１に示す。
【００７０】 １）ＭＭＣ＝マイトマイシンＣ ２）ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ジステアロイル− ＤＴＢ−ＭＭＣ（９０／４５／５／５） ３）ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ジステアロイル−ＤＴＢ−ＭＭＣ （９０／５／５） ４）ｎ．ｄ．＝行われなかった
【００７１】 細胞毒性研究から測定されたＭ１０９マウス癌細胞のパーセント増殖率が図１
３において示される。パーセント増殖率は、マイトマイシンＣの不存在下にそし
てシステインの不存在下に、Ｍ１０９細胞の増殖率に基づくパーセンテージとし
て表されそしてｎＭでのマイトマイシンＣ濃度の関数として示される。細胞の増
殖率は例６において記載されているとおりにして測定された。見られるように、
細胞増殖率のパーセントは、システインの濃度が増大するにつれて、コレステロ
ール含有リポソーム（中が白い円形点）およびコレステロール含有なしリポソー
ム配合物（中が黒い正方形点）の両方について減少している。システインが遊離
のマイトマイシンＣの活性に対して影響を有しないことそしてマイトマイシンＣ
が複合体から放出されて細胞増殖を有効に阻止することがまた見られることが出
来る。
【００７２】 遊離の形でのマイトマイシンＣで処理されたあるいはリポソームに結合された
脂質−ＤＴＢ−医薬複合体で処理されたＭ１０９マウス癌細胞のインビトロ増殖
率は図１４Ａ〜図１４Ｂに示される。図１４Ａにおいて、コレステロール含有な
しのリポソーム配合物についての結果が示される。プロットにおいてＭ１０９細
胞の増殖率は、医薬およびシステインの不存在下にＭ１０９細胞の増殖に基づく
パーセンテージとして表されそしてｎＭでのマイトマイシンＣの濃度の関数とし
て示される。遊離の形でのマイトマイシンＣ（中が白い三角形点）で処理された
細胞そして遊離の形でのマイトマイシンＣ ＋ １０００μＭ（中が黒い三角形
点）で処理された細胞は遊離の形での医薬の毒性に起因して増殖率における減少
を示す。ＨＳＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ＤＳＰＥ−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（
中が白い円形点）で処理された細胞そして１５０μＭ（中が白いダイアモンド形
点）、５００μＭ（中が黒い円形点）および１０００μＭ（中が白い正方形点）
の濃度で加えられた追加のシステインと共に該リポソーム配合物で処理された細
胞はシステイン投与量に依存する様式で細胞に対する細胞毒性を示した。
【００７３】 図１４Ｂは、コレステロール含有リポソーム配合物についての同様なプロット
である。コレステロールを含有するリポソーム ＋ １５０μＭ（中が白いダイ
アモンド形点）、５００μＭ（中が黒い円形点）および１０００μＭ（中が白い
正方形点）の濃度の追加のシステインで処理された細胞について、同じパターン
が観察された。即ち、システインの濃度が増大するにつれて細胞増殖率が減少し
た。これは、システイン濃度との直接の相関関係でシステイン誘発のマイトマイ
シンＣの放出を示す。リポソーム配合物とは異なって、遊離の形でのマイトマイ
シンＣ（中が白い三角形点）で処理された細胞のインビトロ増殖率は、遊離の形
でのマイトマイシンＣ ＋ １０００μＭのシステイン（中が黒い三角形点）で
処理された細胞の増殖率と同じであった。
【００７４】 図１５は、遊離のマイトマイシンＣの、そしてリポソーム配合物の、μＭでの
システイン濃度の関数としての、細胞毒性におけるパーセント増大を示す。細胞
毒性における増大は、ＩＣ５０における、パーセント低下、例えばシステインの
不存在におけるＩＣ５０に対してのシステインの存在におけるＩＣ５０ｘ１００
（（ＩＣ５０（システインなし）／ＩＣ５０（システイン有り））ｘ１００）に
より決定された。見られるように、細胞毒性のパーセントは、コレステロール含
有リポソーム配合物（中が白い三角形点）およびコレステロール含有なしリポソ
ーム配合物（中が黒い円形点）の両方について、システイン濃度が増大するにつ
れて有意義に増大している。遊離のマイトマイシンＣ（中が黒い正方形点）の細
胞毒性はシステインの存在により影響されなかった。
【００７５】 その細胞毒性データは、コレステロール含有なしリポソーム配合物がシステイ
ンにより一層影響されることを示している。或るシステイン濃度でのコレステロ
ール含有なしリポソーム配合物のＩＣ５０は、単独の遊離医薬のＩＣ５０より２
倍のみだけ低い。コレステロール含有リポソーム配合物はコレステロール含有な
しリポソーム配合物よりも低い細胞毒性である。そのデータはまた、システイン
が腫瘍細胞の細胞毒性効果を有しないことそしてシステインが遊離マイトマイシ
ンＣの細胞毒性に対して影響しないことを示している。システインがリポソーム
に結合されたマイトマイシンＣの細胞毒性を、投与量依存様式で増大させること
がまたデータから明らかである。したがって、リポソーム配合物について観察さ
れた細胞毒性効果は、脂質−ＤＴＢ−医薬複合体からのマイトマイシンＣのシス
テイン媒介放出により大部分が説明される。
【００７６】Ｃ．インビボ薬物速度論： コレステロール含有リポソームおよびコレステロール含有なしリポソーム配合
物のインビボ薬物速度論がねずみにおいて調べられた。例７において記載されて
いるとおりにして、遊離の形での、あるいは本発明に従う脂質−ＤＴＢ−マイト
マイシンＣ複合体の形でリポソームに導入された、マイトマイシンＣの約０．１
ｍｇ／ｍｌの一回の静脈内ボーラス注射（血管中を薬液が塊となって移動するよ
うな注射法）で動物を処置した。注射後に血液サンプルを取り出しそしてマイト
マイシンＣの量について分析した。結果を図１６Ａ〜図１６Ｂに示す。
【００７７】 図１６Ａは、静脈内注射後の時間での時間の関数としてねずみの血液中のマイ
トマイシンＣの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。見られるように、遊離の形で静脈内
に投与された遊離のマイトマンシンＣ（中が白い正方形点）は血液から迅速に取
り除かれる。リポソームに結合された脂質−ＤＴＢ−医薬複合体の形でのマイト
マイシンＣは実質的に長い時間期間にわたっての循環において残っている。コレ
ステロール含有リポソームと組み合わされたマイトマイシンＣ（中が黒いダイア
モンド形点）およびコレステロール含有なしリポソームと組み合わされたマイト
マイシンＣ（中が黒い円形点）は２０〜２５時間にわたって１０μｇ／ｍＬより
多くの濃度で血液中で検出された。
【００７８】 図１６Ｂは、試験配合物の静脈注射後の時間での時間の関数として血液中の残
っている注射投与量のパーセントを示す。約５分より長い時間の点で遊離のマイ
トマイシンＣ（中が白い正方形点）の投与量は血液中に実質的に残っていない。
しかしながら、リポソーム配合物の注射後２０時間でマイトマイシンＣの投与量
の約１５〜１８パーセントが循環に残っている。このことは、マイトマイシンＣ
−ＤＴＢ−脂質複合体が循環している間にリポソーム内に安定な状態のままであ
りそして最小のチオ開裂が血漿中で起こることを示している。それ故に、このシ
ステムは、延長された血液循環活動寿命を有しそして腫瘍中への高められた蓄積
を有する長く循環するリポソーム類（ＳｔｅａｌｔｈRリポソーム類）との適合
性（和合性）があると思われる。
【００７９】 （発明を実施するための最良の形態）Ｖ．実施例： 以下の例は本明細書に記載された本発明をさらに例示しそしていかなるやりか
たであっても、本発明の範囲を限定することが意図されない。
【００８０】材料： すべての材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのような適当な市
販の会社から得られた。
【００８１】例 １： パラ−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコール（化合物ＩＶ）および
オルト−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコールの合成： Ａ．パラ−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコール： この反応は図１において例示されている。化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩを造
るためにＳｙｎｄｅｒ，Ｗ．Ｒ．の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：９４９（１９８７））に従った。
【００８２】 ５ｍｌの水中の３−メルカプト−１，２−プロパンジオール（化合物Ｉ：１ｇ
（９．２６ミリモル））を含有する、１００ｍｌの丸底フラスコを氷浴中に置い
た。この迅速にかき混ぜているフラスコに、３０〜４０℃の温度を維持しながら
過酸化水素（正確に０．５モル当量、５２５μｌ（４．６３ミリモル））を滴下
して加えた。発熱処理の終わりに、その反応混合物を室温で一夜かき混ぜながら
放置した。２０ｍｌの分割量でアセトニトリルを連続的に添加することにより、
回転蒸発を用いて水を共沸させた。アセトニトリル添加の処理は３〜４回又はす
べての水が除去するまで繰り返され、透明な油状物を生じた。金属ヘラを用いて
フラスコをこすりそして−２０℃で一夜冷却した後に油状生成物は固体化した（
化合物ＩＩ、ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオール））。
このチョーク状固体を、Ｐ2Ｏ5状で真空乾燥させた。収量：６３０ｍｇ（６３％
）。
【００８３】 そのラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオール）生成物（化
合物ＩＩ）は、オーブン乾燥された１００ｍＬの丸底フラスコにその化合物（９
８０ｍｇ、４．６ミリモル）を加えそして乾燥塩化メチレン（４０ｍＬ）中に溶
解することによりアシル化された。これに、ステアリン酸（４．９２ｇ、１７．
１ミリモル）および触媒として４−（ジメチルアミノ）ピリジニウム４−トルエ
ンスルホネート（１．３８ｇ、４．６ミリモル）を加えそして２０分間、室温（
２５℃）でかき混ぜた。次にジイソプロピルカルボジイミド（３．１ｍｌ、２０
ミリモル）をピペットで加えそして室温で一夜反応させた。ＧＦ上ＴＬＣシリカ
（ヘキサン中１０％酢酸エチル）は、該ジオール基の完全な反応を示した。（ラ
セミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオール）Ｒｆ＝０．６０；ラ
セミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイル）Ｒｆ＝０．３
５）。ＡｍｂｅｒｌｙｓｔRＡ−２１のやや塩基性のイオン交換樹脂（〜３ｇ）
およびＡｍｂｅｒｌｙｓｔR１５の強い酸性のイオン交換樹脂（〜３ｇ）を反応
混合物に加えた。３０分間振り混ぜた後に、樹脂を濾過しそして濾液を乾燥する
ために取り出した。残留物を３回イソプロパノール（各々１００ｍＬ）から再結
晶化させた。固体生成物、ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジ
ステアロイル）（化合物ＩＩＩ）を集めそしてＰ2Ｏ5上で乾燥させた。 収率：７０％（４．１ｇ）、融点５４〜５５℃。
【００８４】 次の工程で、ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイ
ル）（化合物ＩＩＩ）（２．９７ｇ、２．３３ミリモル）をトルエン（３０ｍＬ
）中に溶解しそして氷浴中に置いた。塩化スルフリル（１．９ｍＬ、２３．２ミ
リモル）をフラスコ中にピペットで入れそしてその混合物を３０分間冷たい氷浴
温度でかき混ぜた。フラスコを次に室温に置きそしてもう３０分間かき混ぜた。
回転蒸発器を用いて過剰の塩化スルフリルを除去した。新しい（２０ｍｌ）分割
量のトルエンを反応フラスコに加えそして氷浴上に置いた。これに、ゆっくりと
した速度でトルエン中の４−メルカプトベンズアルコール（７８０ｍｇ、５．６
ミリモル）の溶液を加えた。５分間の反応時間後に、回転蒸発を用いてすべての
溶媒を蒸発させて乾燥した。温かい酢酸エチル（１０ｍＬ）を反応フラスコに加
えて固体を溶解しそして不溶性物質を濾去した。酢酸エチル溶液に５０ｍＬのエ
ーテルを加えて沈殿を生じさせそして固体生成物（パラ−ジアシル−ジグリセロ
ール−ジチオベンザルアルコール、化合物ＩＶ）を濾過により集めた。この処理
を２回繰り返した。収率：７５％。
【００８５】 生成物（パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザル−アルコール、化
合物ＩＶ）を精製するためにクロロホルム中シリカゲルカラム（２０ｘ２．５ｃ
ｍ）を造った。サンプルを最小容量のクロロホルム中に溶解しそして２つの異な
る移動性相の添加を用いてクロマトグラフィにかけた。まず１００％ＣＨＣｌ3
（１００ｍｌ）が溶離された。この分画は不純物ジチオベンジルアルコールを含
有した。この確認は、1ＨＮＭＲにより行われた。次にクロロホルム中１５％メ
タノールへの移動性相の変化を行い、フラッシュクロマトグラフィにかけること
により純粋な生成物を集めた。ＣＨ3ＯＨ：ＣＨＣｌ3（１５：８５）の５００ｍ
ｌで溶離することにより純粋なＤＧＴＢＡ（ＴＬＣによる１つのスポット）を集
めた。溶媒の蒸発後にその固体をｔ−ＢｕＯＨから凍結乾燥しそしてＰ2Ｏ5上で
真空乾燥させた。最終精製は収率を４０％（１．４ｇ）に低下させた。
【００８６】 ５ｍｇのサンプルを元素分析のために研究所（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ）に提出した。
【００８７】
【００８８】Ｂ．オルト−ジグリセロールジチオベンズアルコール： ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイル）（化合物
ＩＩＩ）（２００ｍｇ、０．１５６ミリモル）をトルエン（３０ｍＬ）中に溶解
しそして氷浴中に置いた。塩化スルフリル（３９μｌ、０．４７ミリモル）をピ
ペットでフラスコに入れそしてその混合物を３０分間冷たい氷浴温度でかき混ぜ
た。次にフラスコを室温に置きそしてもう３０分間かき混ぜた。回転蒸発器を用
いて過剰の塩化スルフリルを除去した。新しい（２０ｍＬ）分割量のトルエンを
反応フラスコに加えそして氷浴上に置いた。これにトルエン中の２−メルカプト
ベンズアルコール（４８ｍｇ、３５ミリモル）をゆっくりとした速度で加えた。
５時間の反応時間の後に回転蒸発を用いてすべての溶媒を蒸発させて乾燥した。
温かい酢酸エチル（１０ｍＬ）を反応フラスコに加えてその固体を溶解しそして
不溶性物質を濾去した。酢酸エチル溶液に５０ｍＬのエーテルを加えて沈殿を生
じさせそして固体生成物（オルト−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザル
アルコール）を濾過により集めた。この処理を２回繰り返した。固体をＰ2Ｏ5上
で真空乾燥させた。収率：７５％（１９０ｍｇ）。
【００８９】例 ２： パラ−ジアシルジグリセロールジチオベンザル−マイトマイシンＣ （化合物ＸＶＩＩＩ）の合成： この反応は図６Ａにおいて例示されている。 ５０ｍＬの丸底フラスコにホスゲン（３．１ミリモル）およびトルエン（５ｍ
Ｌ）を装入しそして溶液を０℃に冷却した。トルエン（２．５ｍＬ）中のパラ−
ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザル−アルコール（化合物ＩＶ、例１に
おいて記載されているとおりにして造られた：０．３１ミリモル）の溶液を造っ
た。次にそのアルコール溶液を該ホスゲン溶液に滴下して加えた。その混合物を
一夜放置して室温に温めた。１８時間後にその溶液を真空濃縮して過剰のホスゲ
ンを除去した。その粗製塩化アシルをトルエン（５ｍＬ）中に再溶解した。
【００９０】 マイトマイシンＣ（０．３１ミリモル）、ジメチルアミノピリジン（０．０３
１ミリモル）およびＤＭＦ（１ｍＬ）の溶液が造られた。マイトマイシンＣ溶液
を該塩化アシル溶液に滴下して加えた。１時間後に、トルエンを蒸発除去しそし
て粗製生成物をシリカ上でクロマトグラフィ（１：１ヘキサン：酢酸エチル）に
かけた。次に精製された生成物をｔ−ＢｕＯＨ（５０ｍＬ）中に取りそして凍結
乾燥した。生成物は紫色固体であった（１８３ｍｇ、５３％）Ｒｆ＝０．３８（
５０％ヘキサン：酢酸エチル）。
【００９１】例 ４： リポソーム製造： Ａ．コレステロール含有リポソーム： １．リポソーム製造： ６０〜６５℃で１ｍｌの脱水エタノールに、５９ｍｇのＨＳＰＣ、１４．４ｍ
ｇのコレステロール、１７．４ｍｇのｍＰＥＧ−ＤＳＰＥおよび７．４ｍｇのパ
ラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（６０／３０／５／５のモル比
）を加えそして溶解してしまうまで、約１０分間混合した。
【００９２】 蒸留水中１０ｍＭのヒスチジンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌからなる水和媒体
を７０℃に温めた。
【００９３】 混合しながら、温かい該脂質溶液を温かい（６３〜６７℃）該水和媒体に迅速
に加えて不均質寸法を有するリポソームの懸濁液を造った。その懸濁液を６３〜
６７℃で１時間混合した。
【００９４】２．押し出し： テフロン（登録商標）を裏張りしたスティンレススチール容器に入れられたポ リカーボネートフィルターカートリッジに通過させての制御された押し出しによ り、リポソームを所望の平均粒子寸法直径に大きさを整えて形を造った。そのリ ポソーム懸濁液は、６〜８時間期間の押し出し処理中に６３〜６５℃に維持され た。
【００９５】３．ダイアフィルトレーション： ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によりリポソーム
懸濁液からエタノールを除去した。消毒水中にヒスチジン（１０ｍＭ）および塩
化ナトリウム（１５０ｍＭ）を溶解することによりヒスチジン／塩化ナトリウム
溶液を造った。溶液のｐＨを約７に調節した。０．２２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ
フィルター中を通過させてその溶液を濾過した。リポソーム懸濁液は、該ヒスチ
ジン／塩化ナトリウム溶液を用いて約１：１（容量／容量）に希釈されそしてポ
リスルホン中空繊維限外濾過器中に通過されてダイアフィルトレーションが行わ
れた。エタノールを除去するために、該ヒスチジン／塩化ナトリウム溶液に対し
て８回容量交換が行われた。処理液体温度は約２０〜３０℃に維持された。合計
のダイアフィルトレーション時間は約４．５時間であった。
【００９６】４．滅菌濾過： リポソーム懸濁液を３３〜３８℃に加熱しそして０．２μｍのＧｅｌｍａｎ Ｓｕｐｏｒポリエーテルスルホンフィルター中に通過させて濾過した。合計の濾
過時間は約１０分であった。
【００９７】 各々の処理工程（水和、押し出し、透析および濾過）の後に、脂質濃度および
複合体／医薬濃度がＨＰＬＣにより測定された。リポソーム粒子寸法は動的光散
乱により測定されそして外部の懸濁媒体中の“遊離の”、結合されていないマイ
トマイシンＣの量はＨＰＬＣにより測定された。
【００９８】 １）複合体＝化合物ＸＶＩＩＩ、パラ−システアロイル−ＤＴＢ− マイトマイシンＣ、 ２）ＭＭＣ＝マイトマイシンＣ。
【００９９】Ｂ．コレステロール含有なしリポソーム配合物： ９０／５／５のモル比で、ＨＳＰＣ、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびパラ−ジステ
アロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣの脂質組成物を用いて、上に記載されたと
おりにしてリポソームを造った。特定的には８８．５ｍｇのＨＳＰＣ、１７．９
ｍｇのｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ＰＥＧの平均分子量＝２０００ダルトン）および ７．３ｍｇの該複合体を１ｍＬのエタノールに溶解した。リポソームの寸法、脂
質および医薬の濃度そして外部懸濁媒体中の遊離マイトマイシンＣの濃度は各々
の処理工程の後に測定された。
【０１００】 １）複合体＝化合物ＸＶＩＩＩ、パラ−ジステアロイル−ＤＴＢ− マイトマイシンＣ、 ２）ＭＭＣ＝マイトマイシンＣ。
【０１０１】例 ５： インビトロ特徴づけのためのＨＰＬＣ条件 ： 例４Ａおよび例４Ｂにおいて記載されたとおりにして造られたリポソームを、
０．６Ｍのオクタイルグルコピラノシド（ｏｃｔａｙｌｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏ
ｓｉｄｅ）に希釈した。リポソームを３７℃で１５０ｍＭのシステインの存在下
にインキュベートした。ゼロ時間、３０分、１時間、２時間、４時間および２４
時間でサンプルを取り出した。Ｗａｔｅｒ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ８の３．５ｘ
５ｃｍのカラムを用いてＨＰＬＣにより２０μＬ容量を分析した。流速は１ｍＬ
／分でありそして移動相勾配は以下のとおりであった：
【０１０２】
【０１０３】例 ６： 細胞毒性研究： Ａ．リポソーム製剤： 例４Ａ〜例４Ｂにおいて記載されたとおりにして造られたリポソームは、 ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（
９０／５／５）またはＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ジステ
アロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（９０／４５／５／５）からなっていた。
そのリポソーム製剤は０．４５μｍセルロース膜を通過させて滅菌濾過されそし
て押し出しにより寸法低下されなかった。リポソーム配合の後に、イソプロパノ
ール中１０〜２０倍希釈により溶解化されたリポソームにおいて３６０ｎｍでの
吸光度によりマイトマイシンＣの濃度が測定されそして燐脂質濃度は無機燐酸塩
アッセイにより測定された。
【０１０４】 コレステロール含有リポソームは２７５±９０ｎｍの平均直径を有した。コレ
ステロール含有なしリポソームは１５０±５０ｎｍの平均直径を有した。両方の
リポソーム配合物中の燐脂質濃度は１０μＭ／ｍＬでありそして両方の配合物中
のマイトマイシンＣの濃度は１２０μｇ／ｍＬであった。
【０１０５】Ｂ．化学的感受性アッセイおよび増殖率測定： 遊離のマイトマイシンＣあるいはリポソーム中に導入されたジステアロイル−
ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体の形でのマイトマイシンＣ、の細胞毒性作用は
僅かに修正された以前に記載されたメチレンブルー染色法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，
Ａ．Ｔ．等によるＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１０９，２０
３−２０９（１９９２））により比色的にアッセイされた。そのアッセイが完了
した際に、細胞は固定されそしてメチレンブルー染色アッセイを用いて評価され
た。
【０１０６】 そのアッセイにおいて、２００μｌ分割量（ＲＰＭＩ−１６４０媒地＋１０％
うし胎児血清）中の自然増殖培養からの１５００Ｍ１０９マウス癌細胞が９６ウ
エルの平底ミクロ滴定平板上で平板培養された。培養での２０時間後、細胞が結
合され且つ増殖を再開している間に、２０μｌの試験配合物（遊離のマイトマイ
シンＣまたはリポソーム配合物）を各々のウエルに加えた。医薬濃度における各
々１０倍増加について、４つの医薬濃度ポイントが試験された。各々の試験は、
３つ組ウエルにおいてそして２つの平行平板において行われた。それらの細胞は
７２時間連続して処置された。
【０１０７】 ７２時間の処置期間の後に１０分間各々のウエルに５０μｌの２．５％グルタ
ルアルデヒドの添加により培養を固定した。平板を脱イオン水で３回、０．１Ｍ
のほう酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄しそして次に室温（２０〜２５℃）
で１００μｌのメチレンブルー（０．１Ｍ緩衝液ほう酸塩中１％、ｐＨ８．５）
で６０分間染色した。平板を脱イオン水の５つの浴中ですすぎ洗いをして細胞に
結合していない染料を除去しそして次に乾燥した。染料は３７℃で６０分間２０
０μｌの０．１ＮのＨＣｌで抽出されそして光学濃度がミクロプレート分光測光
器を用いて測定された。
【０１０８】 分光測光吸光度と十分に相関している血球計を用いて細胞を計数することによ
り細胞数が決定された。初期細胞平板培養濃度は、研究の終わりでの細胞数と吸
光度との間の直線関係を確実にするために選ばれた。各々の研究において、６つ
のウエルが固定された後に初期の平均の吸光度を測定するために医薬が加えられ
た。この値は、増殖率（ＧＲ）そして以下の方程式：ＤＴ＝ｌｎ２／ｌｎ〔（Ｏ
Ｄt／ＯＤc）／ｈ〕（式中、ｌｎは自然対数を表し、ＤＴは時間での倍加時間を
表し、ＯＤtは研究の終わりでの試験ウエルの光学濃度を表し、ＯＤcは研究の開
始での対照ウエルの光学濃度を表しそしてｈは時間でのインキュベーションの持
続期間を表す）を用いて対照細胞及び医薬処理された細胞の倍加時間（ＤＴ）を
計算するために用いられた。
【０１０９】 増殖率は、ＧＲ＝（ｌｎ２／ＤＴ）として計算された。パーセント増殖阻止あ
るいは対照増殖率のパーセントは、医薬処理細胞の増殖率を非処理対照細胞の増
殖率により分割することにより得られた。対照増殖率の５０％の阻止を起こさせ
る医薬濃度（ＩＣ50）は増殖阻止曲線の２つの最も近い値の補間法により計算さ
れた。
【０１１０】 マイトマイシンＣは、１０-8〜１０-5Ｍの範囲でアッセイされた。結合された
複合体を有するリポソーム配合物は、１０-8〜３ｘ１０-5Ｍの範囲でアッセイさ
れた。相互作用研究のためにシステイン（ミズリー州セントルイスのＳＩＧＭＡ
製）は１５０、５００または１０００μＭの最終濃度で、マイトマイシンＣまた
はリポソーム配合物と一緒に加えられた。 結果を表１にそして図１３、１４および１５Ａ〜１５Ｂに示す。
【０１１１】例 ７： インビボ薬物速度論研究： Ａ．リポソーム配合物： コレステロール含有リポソームおよびコレステロール含有なしリポソームは例
５Ａおよび例５Ｂにおいて記載されているとおりにして造られた。
【０１１２】 遊離の形でのマイトマイシンＣの溶液は１１９μＬのエタノール中にマイトマ
イシンＣの１１．９ｍｇを溶解することにより造られた。溶解後、１０ｍＭヒス
チジン／１５０ｍＭ食塩水の溶液の約１１．８μＬを加えた。使用の前に、ヒス
チジン／食塩水溶液を用いて，該マイトマイシンＣ溶液を１００μｇ／ｍＬに希
釈しそして濾過した。
【０１１３】Ｂ．動物： ８匹のねずみを以下のとおりに処置グループに無作為的に分けた：
【０１１４】
【０１１５】 試験配合物の１回の静脈内注射がボーラス投与量として投与された。注射後に
以下の時間で各々の動物から血液サンプルを取り出した：３０秒、１５分、３０
分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６
時間。血液サンプル中のマイトマイシンＣの量を下に示されたＨＰＬＣ方法によ
り測定した。７．５％ＥＤＴＡの５．１ｍＬ中にヨードアセトアミドの１９９．
３ｍｇを入れることにより２００ｍＭのヨードアセトアミド溶液が造られた。そ
の２００ｍＭのヨードアセトアミド溶液の１５μＬを各々の１μＬの血液サンプ
ルに入れた。
【０１１６】Ｃ．血漿中のマイトマイシンＣを測定するためのＨＰＬＣ法： １．溶液調製： 脱イオン水を充たした１Ｌ容量のフラスコ中に１．３２１ｇの燐酸アンモニウ
ムを入れることにより１０ｍＭの燐酸アンモニウムを含有する水性緩衝液（ｐＨ
＝７）を造った。混合液をかき混ぜそしてｏ−燐酸を用いてｐＨを７．０に調節
した。使用の前に、その緩衝液を０．４５μｍのナイロンフィルター中に通過さ
せて濾過した。
【０１１７】 Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ二重ポンプ（ｂｉｎａｒｙ ｐｕｍｐ）を用
いて勾配プログラムによりメタノールの移動相および該水性緩衝液は、混合され
た。
【０１１８】２．標準溶液および品質対照サンプルの調製： ２つの別々の重量のマイトマイシンＣおよびマイトマイシンＣ複合体が標準お
よび品質対照サンプルとして調製された。１ｍｇのマイトマイシンＣおよび１ｍ
ｇのマイトマイシンＣ複合体が秤量されそして別々に１ｍＬの希釈液（２０％の
クロロホルムと８０％のメタノールとの混合液）に溶解された。両方の化合物の
原料溶液の濃度は１ｍｇ／ｍＬであって、標準および品質対照サンプルのために
、数種の希釈液が希釈において造られて５μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまで
の濃度を得た。
【０１１９】 ねずみ血漿の０．１ｍＬの分割量が、適当な容量（１０μＬ〜５０μＬ）のマ
イトマイシンＣ標準溶液と、そしてマイトマイシンＣ複合体標準溶液と、混ぜ合
わされた。その濃度範囲はマイトマイシンＣについて０．０５〜５．０μｇ／ｍ
ＬそしてマイトマイシンＣ複合体について０．１〜５μｇ／ｍＬであった。最終
容量はメタノールで１ｍＬに調節された。品質対照サンプルを造るために同様な
方法に従った。品質対照サンプルについての濃度は、ねずみ血漿において、マイ
トマイシンＣについて０．１、０．５および５μｇ／ｍＬでありそしてマイトマ
イシンＣ複合体について０．１、１および５μｇ／ｍＬであった。サンプルは、
室温で１０分間３，０００ｒｐｍで回転沈降（ｂｅ ｓｐｕｎ ｄｏｗｎ）され
た。上澄み液の３００μＬは、注射のための３００μＬの挿入管を含有するＨＰ
ＬＣ小瓶に移された。
【０１２０】３．サンプル調製： １００μＬの血漿サンプルは、９００μＬのメタノールを用いて変性され、次
に３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。上澄み液の３００μＬの分割量
は注射のための３００μＬの挿入管を含有するＨＰＬＣ小瓶に移された。
【０１２１】４．クロマトグラフィ条件： ＳｕｐｅｌｃｏRＣ−８（５μ、４．６ｍｍｘ５ｃｍ）カラムが用いられた。
移動相Ａは１０ｍＭの燐酸アンモニウム（ｐＨ７）であった。移動相Ｂはメタノ
ールであった。流速は１ｍＬ／分であってそして検出は３６０ｎｍでのＵＶによ
った。注射容量は４０μＬでありそして典型的な実験時間は１５分であった。勾
配プログラムは以下のとおりであった：
【０１２２】
【０１２３】５．アッセイおよび計算： 低い濃度から高い濃度までの調製された直線性標準（６つの濃度水準）が注射
された。品質対照および血漿サンプルは次に分析ために注射された。
【０１２４】 ピーク域および保持時間は、ＰＥ−Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ（版
４．１）システムにより決定された。マイトマイシンＣおよびマイトマイシンＣ
複合体の濃度は線形回帰プログラムを用いて計算された。その方法の直線性は６
つの濃度水準からの標準応答を用いて評価された。データは、１／ｘ2の重量係
数を用いて線形回帰方程式ｙ＝Ｂ*ｘ ＋ Ａに合わせられた。その方法の精度
および正確さは、品質対照サンプルからばかりでなく、標準の逆算濃度から評価
された。 結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。
【０１２５】 本発明は、特定の態様に関して記載されたけれども、本発明から離れることな
しに種々の変更および修正が行われることが出来ることが当業者に認識されるだ
ろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アミン−、ヒドロキシ−、またはカルボキシル−含有医薬とさらに反応するた
めのパラ−ジアシルジグリセロール−ジチオベンジルアルコールの製造のための
合成反応方式を示す。
【図２Ａ】 反応性ジアシルジグリセロ−ル−ジチオベンジルカーボネートに、アミノ含有
医薬を結合するための一般反応方式を示す。
【図２Ｂ】 図２Ａにおける複合体のチオ開裂（チオール類を加えての分解による開裂）後
の生成物を示す。
【図３Ａ】 ジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−５−フルオロウラシル複合体の製
造のための合成反応方式を示す。
【図３Ｂ】 図３Ａにおける複合体のチオ開裂後の生成物を示す。
【図４】 ジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−５−フルオロウラシル複合体の製
造のための別の合成反応方式そしてその複合体のチオ開裂後の生成物を示す。
【図５】 ジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−クロラムブシル複合体の製造のた
めの合成反応方式そしてその複合体のチオ開裂後の生成物を示す。
【図６Ａ】 ジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体の製造の
ための合成反応方式を示す。
【図６Ｂ】 図６Ａにおける複合体のチオ開裂後の生成物を示す。
【図７】 コレステロール−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体の製造のための合
成反応方式を示す。
【図８】 コレステロール−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体の製造のための他
の合成反応方式を示す。
【図９Ａ】 図９Ａ〜図９Ｃの３種の脂質−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体のう
ちの１種のパラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣの構造を示す。
【図９Ｂ】 図９Ａ〜図９Ｃの３種の脂質−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体のう
ちの１種のパラ−ジパルミトイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣの構造を示す。
【図９Ｃ】 図９Ａ〜図９Ｃの３種の脂質−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体のう
ちの１種のオルト−ジパルミトイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣの構造を示す。
【図１０Ａ】 図面において、システインの存在下でのリポソームのインキュベーションの時
間の関数として一連のクロマトグラムを示す、ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／
脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなっているリポソームについてのＨＰＬＣ
クロマトグラムである。
【図１０Ｂ】 図面において、システインの存在下でのリポソームのインキュベーションの時
間の関数として一連のクロマトグラムを示す、ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰ
ＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなっているリポソームに
ついてのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】 システインの存在下でのインキュベーションの時間の関数として、ＨＳＰＣ／
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒いダイアモンド
形点）およびＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−
マイトマイシンＣ（中が黒い円形点）、からなるリポソーム類から放出されたマ
イトマイシンＣのパーセントを示すプロットである。
【図１２Ａ】 １５０μＭ（中が黒い記号）の濃度および１．５ｍＭ（中が白い記号）の濃度
で、システインの存在下のインキュベーションの時間の関数として、ＨＳＰＣ／
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソームから
放出されたマイトマイシンＣのパーセントを示すプロットである。
【図１２Ｂ】 １５０μＭ（中が黒い記号）の濃度および１．５ｍＭ（中が白い記号）の濃度
で、システインの存在下のインキュベーションの時間の関数として、ＨＳＰＣ／
コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからな
るリポソームから放出されたマイトマイシンＣのパーセントを示すプロットであ
る。
【図１３】 遊離のマイトマイシンＣ（中が白い三角形点）、ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰ
Ｅ／脂質−ＤＴＢ−マイトマンシンＣからなるリポソーム（中が黒い正方形点）
、そしてＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイ
トマイシンＣからなるリポソーム（中が白い円形点）について、ｎＭでのマイト
マイシンＣの量の関数として、医薬およびシステインの不存在下にＭ１０９細胞
の増殖に基づくパーセンテージとして表された、Ｍ１０９細胞の増殖率のプロッ
トである。
【図１４Ａ】 ｎＭでのマイトマイシンＣ濃度の関数として、医薬またはシステインの不存在
化での、Ｍ１０９細胞の増殖に基づくパーセンテージとして表された、Ｍ１０９
細胞の増殖率のプロットである。遊離形でのマイトマイシンＣで処置された細胞
（中が白い三角形点）そして遊離形でのマイトマイシンＣ ＋１０００μＭのシ
ステインで処置された細胞（中が黒い三角形点）が示される。ＨＳＰＣ／ｍＰＥ
Ｇ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソーム配合物で処
置された細胞（中が白い円形点）そして１５０μＭ（中が白いダイアモンド形点
）、５００μＭ（中が黒い円形点）および１０００μＭ（中が白い正方形点）濃
度で加えられた追加のシステインを有する該リポソーム配合物で処置された細胞
がまた示される。
【図１４Ｂ】 ｎＭでのマイトマイシンＣ濃度の関数として、医薬またはシステインの不存在
下での、Ｍ１０９細胞の増殖に基づくパーセンテージとして表された、Ｍ１０９
細胞の増殖率のプロットである。遊離形でのマイトマイシンＣで処置された細胞
（中が白い三角形点）そして遊離形でのマイトマイシンＣ ＋１０００μＭのシ
ステインで処置された細胞（中が黒い三角形点）が示される。ＨＳＰＣ／コレス
テロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポ
ソーム配合物で処置された細胞（中が白い円形点）そして１５０μＭ（中が白い
ダイアモンド形点）、５００μＭ（中が黒い円形点）および１０００μＭ（中が
白い正方形点）の濃度で加えられた追加のシステインを有する該リポソーム配合
物で処置された細胞がまた示される。
【図１５】 システインの種々の濃度でのインビトロ中のＭ１０９細胞に対する、遊離のマ
イトマイシンＣ（中が黒い正方形点）、ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−
ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソーム（中が黒い円形
点）と組み合わされているマイトマイシンＣおよびＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰ
Ｅ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソーム（中が白い三角形点）
と組み合わされているマイトマイシンＣの、（（ＩＣ５０（システインなし）／
ＩＣ５０（システイン有り））ｘ１００により決定されたとおりの）細胞毒性に
おけるパーセント増大を示すプロットである。
【図１６Ａ】 遊離のマイトマイシンＣ（中が白い正方形点）、ＨＳＰＣ／コレステロール／
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒いダイアモンド
形点）からなるリポソームおよびＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ
−マイトマイシンＣ（中が黒い円形点）からなるリポソーム、の静脈内注射後の
時間での時間の関数としてねずみの血液中のマイトマイシンＣの濃度を示すプロ
ットである。
【図１６Ｂ】 遊離のマイトマイシンＣ（中が白い正方形点）、ＨＳＰＣ／コレステロール／
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒いダイアモンド
形点）からなるリポソームおよびＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ
−マイトマイシンＣ（中が黒い円形点）からなるリポソーム、の静脈内注射後の
時間での時間の関数としてねずみの血液中に残っている注射された投与量のパー
セントを示すプロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ザリプスキィ、サミュエル アメリカ合衆国 カリフォルニア、レッド ウッド シティ、トルーマン ストリート 1202 (72)発明者 ガビゾン、アルベルト、エイ イスラエル国 イエルサレム、ペレツ バ ーンスタイン ストリート 56 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 BB11 CC27 CC41 DD09A DD09F DD09H DD70A DD70H EE23A EE23F EE23H FF32 FF36 FF68 4C084 AA03 BA44 DA28 NA03 NA10 NA12 ZB262 4C086 AA01 AA02 CB03 CB09 MA01 MA04 MA10 MA24 NA03 NA10 NA12 ZB26 4C206 AA01 AA02 FA31 KA01 KA04 KA05 MA01 MA04 MA17 MA44 NA03 NA10 NA12 ZB26

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般構造式： （式中、Ｌはリポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分であ
    り、Ｒ1はジチオベンジル部分に共有結合された治療薬を表しそしてＣＨ2Ｒ1基
    の配向はオルト位置およびパラ位置から選ばれる）を有する複合体であって、リ
    ポソームの医薬送り出しビヒクルにおいて使用するための複合体。
  2. 【請求項２】 治療薬が、ウレタン、アミン、アミド、カーボネート、チオ
    カーボネート、エーテルおよびエステルからなる群から選ばれた結合により共有
    的に結合されている、請求項１の複合体。
  3. 【請求項３】 Ｌがコレステロール、ジアシルグリセロール類、燐脂質類お
    よびそれらの誘導体からなる群から選ばれる、請求項１の複合体。
  4. 【請求項４】 Ｌが一般構造式 （式中、Ｒ2およびＲ3は約８〜約２４個の炭素原子を有する炭化水素である）を
    有する複合体を生成するためのジアシルグリセロール誘導体類である、請求項１
    の複合体。
  5. 【請求項５】 Ｒ2およびＲ3が約１２〜約２２個の炭素原子を有する炭化水
    素である、請求項４の複合体。
  6. 【請求項６】 Ｒ2とＲ3とが同じ長さを有する炭化水素鎖である、請求項４
    の複合体。
  7. 【請求項７】 前記医薬が、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ブレオ
    マイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、フルオロデオキシウリジン、ヨー
    ドデオキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビ
    ノシルシトシン、ペントスタチン、キニジン、アトロピン、クロラムブシル、メ
    トトレキサート、ミトザントロンおよび５−フルオロウラシルからなる群から選
    ばれる、請求項１の複合体。
  8. 【請求項８】 治療薬が、構造： （式中Ｒ4は治療薬の残基を表す）を有する複合体を形成するためにジチオベン
    ジル部分に共有的に結合されている、請求項１の複合体。
  9. 【請求項９】 Ｒ4が第一級アミンまたは第二級アミン部分を含有し、それ
    によりジチオベンジルと治療薬との間にウレタン結合を形成する治療薬残基であ
    る、請求項８の複合体。
  10. 【請求項１０】 前記治療薬がマイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ブレ
    オマイシン及びポリペブチド類からなる群から選ばれる、請求項９の複合体。
  11. 【請求項１１】 Ｒ4がカルボキシル含有治療薬の残基であり、それにより
    ジチオベンジルと治療薬との間にエステル結合を形成する、請求項８の複合体。
  12. 【請求項１２】 前記医薬がクロラムブシル又はメトトレキサートである、
    請求項１１の複合体。
  13. 【請求項１３】 Ｒ4が、ヒドロキシ部分を含有し、それによりジチオベン
    ジルと治療薬との間にカーボネート結合を形成する治療薬残基である、請求項８
    の複合体。
  14. 【請求項１４】 治療薬がフルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリ
    ジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン
    、ペントスタチン、キニジン、ミトザントロンおよびアトロピンからなる群から
    選ばれる、請求項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 一般構造式： （式中、Ｌはリポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分であ
    り、Ｒ1はジチオベンジル部分に共有結合された治療薬を表しそしてＣＨ2Ｒ1基
    の配向はオルト位置およびパラ位置から選ばれる）を有する複合体の約１〜約３
    ０モルパーセントを含む、小胞形成性脂質からなるリポソームを含み、 しかも該治療薬は生理学的条件または人工的に誘導された条件に応答してイン
    ビボで該複合体から放出される、 リポソーム組成物。
  16. 【請求項１６】 治療薬がウレタン、アミン、アミド、カーボネート、チオ
    カーボネート、エーテル、およびエステルからなる群から選ばれた結合によりジ
    チオベンジル部分に共有的に結合されている、請求項１５の複合体。
  17. 【請求項１７】 Ｌがコレステロール、ジアシルグリセロール類、燐脂質類
    およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる、請求項１５の複合体。
  18. 【請求項１８】 Ｌが一般構造式： （式中、Ｒ2およびＲ3は約８〜約２４個の炭素原子を有する炭化水素である）を
    有する複合体を生成するためのジアシルグリセロール類である、請求項１５の複
    合体。
  19. 【請求項１９】 Ｒ2およびＲ3が約１２〜約２２個の炭素原子を有する炭化
    水素である、請求項１８の複合体。
  20. 【請求項２０】 Ｒ2とＲ3とが同じ長さの炭化水素鎖である、請求項１８の
    複合体。
  21. 【請求項２１】 前記医薬が、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ブレ
    オマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、フルオロデオキシウリジン、ヨ
    ードデオキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラ
    ビノシルシトシン、ペントスタチン、キニジン、アトロピン、クロラムブシル、
    メトトレキサート、ミトザントロンおよび５−フルオロウラシルからなる群から
    選ばれる、請求項１５の複合体。
  22. 【請求項２２】 治療薬が構造： （式中Ｒ4は治療薬の残基を表す）を有する複合体を形成するためにジチオベン
    ジル部分に共有的に結合されている、請求項１５の複合体。
  23. 【請求項２３】 Ｒ4が第一級アミンまたは第二級アミン部分を含有し、そ
    れによりジチオベンジルと治療薬との間にウレタン結合を形成する治療薬残基で
    ある、請求項２２の複合体。
  24. 【請求項２４】 前記治療薬が、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ブ
    レオマイシンおよびポリペプチド類からなる群から選ばれる、請求項２３の複合
    体。
  25. 【請求項２５】 Ｒ4が、カルボキシル含有治療薬の残基であり、それによ
    りジチオベンジルと治療薬との間にエステル結合を形成する、請求項２２の複合
    体。
  26. 【請求項２６】 前記医薬がクロラムブシルまたはメトトレキサートである
    、請求項２５の複合体。
  27. 【請求項２７】 Ｒ4が、ヒドロキシル部分を含有し、それによりジチオベ
    ンジルと治療薬との間にカーボネート結合を形成する治療薬残基である、請求項
    ２２の複合体。
  28. 【請求項２８】 治療薬がフルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリ
    ジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン
    、ペントスタチン、キニジン、ミトザントロンおよびアトロピンからなる群から
    選ばれる、請求項２７の複合体。
  29. 【請求項２９】 小胞形成性脂質からなりそして一般構造式： （式中、Ｌはリポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分であ
    り、Ｒ1はジチオベンジル部分に共有結合された治療薬を表しそしてＣＨ2Ｒ1基
    の配向はオルト位置およびパラ位置から選ばれる）を有する複合体の約１〜約３
    ０モルパーセントからなるリポソームを造り、 それにより前記造ることが、生理学的条件または人工的に誘導された条件に応
    答してインビボで該複合体から放出するまで医薬をリポソーム中に保持すること
    に有効である、 ことを含む、リポソーム中に医薬を保持するための方法。
  30. 【請求項３０】 前記造ることは、治療薬がウレタン、アミン、アミド、カ
    ーボネート、チオカーボネート、エーテルおよびエステルからなる群から選ばれ
    た結合により共有的に結合されている複合体を造ることを包含する、請求項２９
    の方法。
  31. 【請求項３１】 前記造ることは、Ｌがコレステロール、ジアシルグリセロ
    ール類、燐脂質類およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる結合により共有
    的に結合されている複合体を造ることを包含する、請求項２９の方法。
  32. 【請求項３２】 前記造ることは、Ｌが一般構造式： （式中、Ｒ2およびＲ3は約８〜約２４個の炭素原子を有する炭化水素である）を
    有する複合体を生成するためのジアシルグリセロール類である複合体を造ること
    を包含する、請求項２９の方法。
  33. 【請求項３３】 Ｒ2およびＲ3が約１２〜約２２個の炭素原子を有する炭化
    水素である、請求項１８の方法。
  34. 【請求項３４】 Ｒ2とＲ3とが同じ長さの炭化水素鎖である、請求項３２の
    複合体。
  35. 【請求項３５】 前記造ることは、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、
    ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、フルオロデオキシウリジン
    、ヨードデオキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、
    アラビノシルシトシン、ペントスタチン、キニジン、アトロピン、クロラムブシ
    ル、メトトレキサート、ミトザントロンおよび５−フルオロウラシルからなる群
    から選ばれる医薬を含む複合体を造ることを包含する、請求項２９の方法。
  36. 【請求項３６】 前記造ることは、構造： （式中、Ｒ4は治療薬の残基を表す）を有する複合体を形成するためにジチオベ
    ンジル部分に共有的に結合されている治療薬を含む複合体を造ることを包含する
    、請求項２９の方法。
  37. 【請求項３７】 Ｒ4が第一級アミンまたは第二級アミン部分を含有し、そ
    れによりジチオベンジルと治療薬との間にウレタン結合を形成する治療薬残基で
    ある、請求項３６の方法。
  38. 【請求項３８】 前記治療薬がマイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ブレ
    オマイシンおよびポリペプチド類からなる群から選ばれる、請求項３７の方法。
  39. 【請求項３９】 Ｒ4がカルボキシル含有治療薬の残基であり、それにより
    ジチオベンジルと治療薬との間にエステル結合を形成する請求項３６の方法。
  40. 【請求項４０】 前記医薬がクロラムブシルまたはメトトレキサートである
    、請求項３９の方法。
  41. 【請求項４１】 Ｒ4がヒドロキシル部分を含有し、それによりジチオベン
    ジルと治療薬との間にカーボネート結合を形成する治療薬の残基である、請求項
    ３６の方法。
  42. 【請求項４２】 治療薬がフルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリ
    ジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン
    、ペントスタチン、キニジン、ミトザントロンおよびアトロピンからなる群から
    選ばれる、請求項４１の方法。
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