JP2002532407A

JP2002532407A - 多薬物耐性細胞に対する化合物の投与方法

Info

Publication number: JP2002532407A
Application number: JP2000587743A
Authority: JP
Inventors: ガビゾン，アルバート・エイ; ザリプスキー，サミュエル; ゴレン−ルベル，ドリト; ホロウィッツ，アヴィヴァ・ティー
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 1998-12-18
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2002-10-02
Also published as: AU769569B2; CA2353593A1; EP1140022B8; WO2000035422A2; MXPA01006201A; WO2000035422A3; EP1140022A2; DE69938148D1; ES2302391T3; IL143555A0; DE69938148T2; ATE385778T1; US20040161457A1; HK1040633A1; AU1940400A; EP1140022B1; US20060062842A1

Abstract

(57)【要約】薬剤耐性ガンを患うヒトの多薬物耐性細胞へ治療用化合物を投与する際の組成物。当該組成物は担体分子と担体に共有結合で付着したフォレート標的の配位子及び治療用化合物からなる。１つの好ましい態様では、担体は親水性高分子鎖の表面被膜を有するリポソームで、フォレート配位子は親水性高分子鎖の少なくとも一部の末端に付着し、治療用作用物質はリポソームに包含されている。組成物は細胞内に、細胞毒になるのに充分な量の治療用化合物の蓄積を達成させるのに効果がある。更に治療用化合物を多薬物耐性状態に悩むヒトに投与する際の方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は多薬物耐性ガン細胞へ治療用化合物を投与する方法に関する。

【０００２】

【発明の背景】

米国では、ガンは心臓疾患に次ぐ死亡の主要な原因である。治療に関する現在
の方法として、治療の時点で腫瘍が転移していない場合に効果的であるのは外科
手術または放射線療法のような局部的方法で、約３分の１の患者が治癒している
。残りの症例では、早期の微小転移が新生物の特徴で、化学療法などの全身的方
法がしばしば外科療法又は放射線と共に必要とされることを示している。

【０００３】ガンの化学療法における１つの問題は薬剤耐性である。幾つかの腫瘍型、例え
ば非小細胞性肺ガン及び結腸ガンは一次性耐性を示す。即ちよく使用されている
従来型化学療法作用物質への最初の曝露では応答を示さない。他の腫瘍型では後
天的耐性を示し、数多くの薬剤感受性腫瘍型に現れる。薬剤耐性腫瘍細胞は２種
の後天的薬剤耐性を表す；単一薬剤耐性又は作用が同一機構である抗ガン剤の単
一部類への耐性を示す細胞。第二型は、作用が異なる機構である数種又は多くの
化学的に異なる抗ガン剤に対する広い耐性を伴う。後天的耐性であるこの第二型
が多薬物耐性として知られているものである。

【０００４】多薬物耐性もまた腎臓及び結腸腫瘍などの一次性耐性を示す幾つかの腫瘍細胞
型でも見出される。それは後天性多薬剤耐性と対照的に、ある腫瘍型では多くの
化学療法作用物質での最初の処置には非応答である。

【０００５】多薬物耐性はしばしば細胞表面糖タンパク質のＰ−糖タンパク質に対する通常
の遺伝子であるＭＲＤ１遺伝子の過剰発現に付随していて、薬の排出を伴う。Ｐ
−糖タンパク質発現は細胞内薬物の蓄積の減少と関連する；即ちＰ−糖タンパク
質は細胞から薬を除去するエネルギー依存ポンプまたは輸送分子として働いて、
細胞内に薬を蓄積するのを防ぐ。

【０００６】Ｐ−糖タンパク質は通常は主として上皮及び内皮表面に発現し、吸収及び／又
は分泌の役割りを果たしているようである。それは活性輸送体で、細胞外に疎水
性薬物を排出し、細胞質濃度を減少させ毒性を減少させる。正常な細胞では、Ｐ
−糖タンパク質は体から毒性代謝物または生体異物化合物を消滅させるように働
く（Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，Ｊ．ａｎｄＬｉｎｇ，Ｖ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，５８：１３７−１７１，（１９８９））。

【０００７】Ｐ−糖タンパク質を発現するガンには、通常ＭＤＲ１遺伝子を発現する組織か
ら由来するガン、即ち肝臓、結腸、腎臓、膵臓および副腎のガンが含まれる。当
該遺伝子の発現は、白血病、リンパ腫、肺と卵巣ガン及び他の多くのガンに対す
る多薬物耐性薬物による化学療法の最中にも見られる。これらのガンは当初化学
療法に応答するが、ガンが再発するとガン細胞は頻繁により多くのＰ−糖タンパ
ク質を発現する。通常はＰ−糖タンパク質を発現しないがガンの進行と共にＰ−
糖タンパク質発現が増加する組織から由来するガンもある。１つの例は慢性骨髄
性白血病で、それが芽球化発症するとそれ以前の治療履歴に関係なくより多くの
Ｐ−糖タンパク質を発現する（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．Ｍ．ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓｅａｒｃｈ，５３：７４７−７５４（１９９３））。

【０００８】ＭＤＲ１がコード化しているＰ−糖タンパク質ポンプは、ドキソルビシン、ダ
ウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、アクチノマイシンＤ、パクリ
タキセル、テニポシド及びエトポシドなど多くの天然産生抗ガン薬を含む多くの
異なる物質を認識し、輸送する（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＤｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ，６：６１０−６１７（１９９６））。更に一般的には、しばしば多
薬物耐性に係わる薬物は、植物又はカビを源としたアルカロイド又は抗生物質で
、それらにはビンカアルカロイド、アンスラサイクリン、エピポドフィロトキシ
ン及びダクチノマイシンを含んでいる。メルファラン、ナイトロジェンマスター
ド及びマイトマイシンＣのようなアルキル化剤との交差耐性もときとして観測さ
れる（Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，Ｊ．ａｎｄＬｉｎｇ，Ｖ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，５８：１３７−１７１（１９８９））。

【０００９】明らかに、ガン細胞における多薬物耐性は良好な化学療法を制限し、芳しから
ぬ患者の予後を示唆する。多薬物耐性を克服するとして記述された１つの方法に
は、化学療法作用物質につきＰ−糖タンパク質の薬物輸送作用を阻害するベラパ
ミルなどのカルシウムチャンネル遮断剤の同時投与が含まれる。この方法はヒト
については未だ確認されておらず、多薬物耐性を克服する他の方策が必要とされ
ている。

【００１０】

【発明の要旨】

従って、本発明の１つの目的は、ガンを患っている患者に抗ガン治療作用物質
を投与するための組成物を提供することである。

【００１１】本発明のもう１つの目的は、多薬物耐性細胞に抗ガン治療作用物質を投与する
ための組成物を提供することである。１つの側面において、本発明にはガンを患うヒトの多薬物耐性細胞に治療剤を
投与するための組成物が含まれる。組成物は担体分子、担体に共有結合で付着し
ているフォレート（ｆｏｌａｔｅ）（葉酸エステル又は葉酸塩）配位子及び担体
と会合している治療作用物質から構成されている。

【００１２】１つの態様において、担体は天然又は合成高分子である。好ましい例として
は、高分子はポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである。他
の態様では、担体はペプチド又はタンパク質などの巨大分子である。

【００１３】好ましい態様では、担体はフォレート配位子が付着した親水性高分子鎖の表面
被膜を有するリポソームである。治療用作用物質はリポソームに含有されている
。

【００１４】もう１つの側面では、本発明にはガンを患うヒトの多薬物耐性細胞に治療用化
合物を投与する際のリポソーム組成物が含まれる。当該組成物には、遊離末端を
持つ親水性高分子で誘導体化された小胞形成脂質を含む小胞形成脂質で構成され
たリポソーム；親水性高分子鎖の少なくとも一部である遊離末端に付着したフォ
レート配位子及びリポソームに包含された治療用作用物質が含まれる。この組成
物は、細胞中に細胞毒性になる充分な量まで治療用化合物を蓄積させるのに効果
的である。

【００１５】１つの態様では、治療用作用物質は小胞形成脂質で形成したリポソーム脂質二
重層の中に分配できる疎水性作用物質である。もう１つの態様では、治療用作用
物質は生理的ｐＨでは中性な薬で、リポソームの内部の水相に包含される。

【００１６】他の態様では、治療用作用物質はドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビ
シン、イダルビシンなどのアンスラサイクリン抗生物質である。他の態様では、
薬はミトキサントロン又はアントラキノン薬である。

【００１７】１つの態様におけるリポソーム組成物中の親水性高分子は、ポリビニルピロリ
ドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサ
ゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシ−プロピルメタ
クリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメタ
クリル酸ヒドロキシプロピル、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル、ヒドロキシメ
チルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール及びポ
リアスパルトアミドから選択する。好ましい態様では、親水性高分子は少なくと
も約３，５００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。もう
１つの好ましい態様では、親水性高分子は３，５００〜１０，０００の間の分子
量を有するポリエチレングリコールである。

【００１８】なおもう１つの側面においては、本発明にはＭＤＲ１遺伝子の増加発現で特徴
ある細胞の細胞質へ治療用化合物を投与する際のリポソーム組成物が含まれる。
リポソームは、遊離末端を有する親水性高分子鎖で誘導体化された小胞形成脂質
を含む小胞形成脂質から構成されている。フォレート配位子は親水性高分子鎖の
少なくとも一部をなす遊離末端に付着し、治療剤はリポソーム内に包含されてい
る。

【００１９】他の側面では、本発明にはＰ−糖タンパク質を発現する細胞に治療用化合物を
投与する際のリポソーム組成物が含まれるが、リポソーム組成物は遊離末端を有
する親水性高分子鎖で誘導体化された小胞形成脂質を含む小胞形成脂質及び親水
性高分子鎖の少なくとも一部の遊離末端に付着したフォレート配位子を含有する
リポソームを含んでいる。治療用作用物質はリポソームに包含されている。

【００２０】更にもう１つの側面においては、本発明には多薬物耐性細胞に治療用化合物を
投与する際のリポソーム組成物が含まれる。当該リポソームは、遊離末端を有す
る親水性高分子鎖で誘導体化した小胞形成脂質を含む小胞形成脂質；親水性高分
子鎖の少なくとも一部の遊離末端に付着したフォレート配位子及びリポソーム内
に包含されている治療剤からなる。

【００２１】更にもう１つの側面においては、本発明には、（ｉ）遊離末端を有する親水性
高分子鎖で誘導体化された小胞形成脂質を含む小胞形成脂質類、（ｉｉ）親水性
高分子鎖の少なくとも一部の遊離末端に付着した葉酸の配位子及び（ｉｉｉ）リ
ポソーム内に包含された治療用作用物質からなるリポソームを調製して、Ｐ−糖
タンパク質を過剰発現する細胞に治療剤を投与する方法が含まれている。当該リ
ポソームは、多薬物耐性のＰ−糖タンパク質発現細胞を保因する被験者に投与さ
れる。

【００２２】なおもう１つの側面においては、本発明には遊離型では細胞に蓄積しない治療
用化合物を細胞に投与する方法が含まれる。その方法には、担体分子、担体に共
有結合したフォレート配位子及び担体に会合した治療剤からなる包合体を調製す
ることが含まれている。

【００２３】なおもう１つの側面においては、本発明には遊離型では細胞に蓄積しない治療
用化合物を細胞に投与する方法が含まれる。その方法には、（ｉ）遊離末端を有
する親水性高分子鎖で誘導体化された小胞形成脂質を含む小胞形成脂質類、（ｉ
ｉ）親水性高分子鎖の少なくとも一部の遊離末端に付着したフォレートの配位子
、及び（ｉｉｉ）リポソーム内に包含された治療用作用物質からなるリポソーム
の調製を含んでいる。当該リポソームは、細胞毒性に充分な量の化合物を細胞内
に蓄積させるために被験者へ投与する。

【００２４】本発明のもう１つの側面において、多薬物耐性新生物状況に悩んでいるヒトに
治療用化合物を投与する方法を意図している。この方法には、（ｉ）遊離末端を
有する親水性高分子鎖で誘導体化された小胞形成脂質を含む小胞形成脂質類、（
ｉｉ）親水性高分子鎖の少なくとも一部の遊離末端に付着したフォレートの配位
子、及び（ｉｉｉ）リポソーム内に包含された治療用作用物質からなるリポソー
ムの調製を含んでいる。そのリポソームを、被験者に投与して細胞毒性に充分な
量の化合物の蓄積を細胞内で達成させる。

【００２５】本発明のこれら及び他の目的や特徴については、添付図面と関連させて本発明
の詳細な説明を読めばより充分に理解できる。

【００２６】

【本発明の具体的な説明】

本発明は、一側面では多薬物耐性細胞に治療用作用物質を投与する際の組成物
を目的とする。実際、当該組成物はガン及び特にガン細胞表面にＰ−糖タンパク
質を発現するガンを患うヒトへの治療用作用物質の投与を提供する。上記のとお
り、腎臓ガン及び結腸ガンなどのある種のガンは二次的又は難治性耐性ではなく
、一次的耐性を多くの化学療法用作用物質に示す。本発明の組成物及び方法は、
これらのガンと同時に、例えば当初は１つの治療剤又は1群の薬剤に応答するが
、応答しなくなるか作用物質で治療に成功しない状態まで進んで多薬物耐性にな
ったガンのような難治性ガンの治療法も提供する。

【００２７】１つの側面では、本発明には、担体、葉酸標的化配位子及び投与する薬からな
る組成物が含まれる。フォレート配位子は担体に共有結合で付着し、薬は担体と
会合している。会合するとは、薬が共有結合的又は静電気的に付着するか、担体
により包含又はカプセル化されることを意味する。下記するように、当該組成物
は多薬物耐性細胞、即ち細胞に薬の蓄積を防ぐ流出ポンプとして働くＰ−糖タン
パク質を発現する細胞中に薬を蓄積させるのに効果的である。“細胞毒”は、細
胞中に蓄積した薬の量が正常な細胞機能発揮を起こさないようにするのに充分で
あり、好ましくは細胞死を起こさせることを意味する。

【００２８】本発明の１つの態様では、担体は天然又は合成高分子である。この態様におけ
る高分子はいかなる生体適合性高分子でも、毒性がなく、生物的に不活性で、非
アレルギー性で生体組織に刺激性のない高分子であり、望ましい生体分布性を達
成するのに充分な時間は物理的及び化学的に完全な状態を維持できるものであれ
ば成り得る。例示的な合成高分子にはポリグリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びセル
ロース類が含まれる。フォレート配位子は、端末又は担体自体に沿って担体に付
着、又は担体から調製した微粒子表面に付着しているが、これについては下に記
述する。投与する薬は同じように担体に付着するか、なんらかの方法で担体と会
合して担体及び標的化フォレート配位子と共に移動する。下に記述するように、
葉酸は当該抱合体を効果的に目標として多薬物耐性細胞に送達し、細胞内に薬を
蓄積する。

【００２９】もう１つの態様では、担体は薬物配位子と会合できる部分を有するタンパク質
又はペプチドである。タンパク質又はペプチドである担体は、組成物を投与して
望ましい生体分布を達成するのに充分な化学的及び物理的な全体性を有するもの
である。例示的な材料には、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリサッカライド、ア
ルブミン及びゼラチンが含まれる。

【００３０】本発明の好ましい態様では、担体はリポソームである。本発明により実施する
試験では、フォレート標的化リポソームを調製し、担体リポソームを用いて一般
的な考えを示した。しかしながら、このリポソームでの試験による有益な教訓は
、下記に記載した試験から明らかなように数多くの担体にも適用可能である。Ｉ．フォレート受容体標的化リポソームの調製Ａ．ｍＰＥＧ−葉酸及び葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの合成と特徴づけフォレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びジステアロイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）からなる抱合体は、図１に示したように葉
酸をＨ₂Ｎ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥにジシクロヘキシルカルボジイミドの介在で結合
して調製した。実施例１Ａに記載したように、出発成分のアミノ−ＰＥＧ脂質は
分子量２０００ダルトン及び３０００ダルトンのＰＥＧから既報の方法により合
成した（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３５３：
７１−７４（１９９４））。葉酸とメトキシ−ＰＥＧの抱合体、例えばホスホリ
ピッド部分なしの抱合体は同様な結合法で調製した。精製した抱合体の構造を¹
Ｈ−ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ及びＵＶ分光学で確認し、実施例１Ｂ〜１
Ｃで説明した。カルボジイミドで活性化した葉酸は、Ｈ₂Ｎ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ
とそのグルタミン酸残基のα又はγ−カルボキシル基で結合できる。フォレート
受容体とγ−抱合体は結合するが、α−抱合体は結合しないので各抱合体の量比
はカルボキシペプチダーゼＧ（ＣＰＧ）で定量した。実施例１Ｅで記述したよう
に、α−抱合体は酵素では反応しないが、γ−抱合体では容易に感知できる速度
でプテロイン酸−グルタミン酸結合が分裂されることが知られているので、カル
ボキシペプチダーゼＧ（ＣＰＧ）を使った方法を用いた（Ｗａｎｇ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，７：５６−６２（１９９６）
；Ｆａｎ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０；４５７３−
４５８０（１９９１）；ＬｅｖｙＣ．ａｎｄＧｏｌｄｍａｎＰ．，Ｂｉｏ
ｌＣｈｅｍ．，２４２：２９３３−２９３８（１９６７））。酵素的分裂はＨ
ＰＬＣにより抱合体の消滅で追跡した。この反応は、反応時間の延長や酵素の何
回もの追加が必要であるが８０％転換まで進行したので、葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰ
Ｅは８０％がγ−カルボキシ結合で残り２０％がα−結合抱合体であることを示
している。同様な方法を用いてｍＰＥＧ−葉酸の９０％はγ−カルボキシル基に
て結合していることを確認した。

【００３１】抱合体はここで記述する結合試験で特性評価をした。実施例２で説明するよう
に、３種の細胞系であるマウス肺ガン（Ｍ１０９），Ｍ１０９の多薬物耐性サブ
系統（Ｍ１０９Ｒ）及びヒト鼻咽頭表皮ガン（ＫＢ）を、葉酸を減少させた基質
（３ｎＭ葉酸）中で連続継代してそれらのフォレート受容体を上昇するようにし
た。当該処理の結果から３種の細胞サブ系統を“高フォレート受容体”（ＨｉＦ
Ｒ）と称することにし、本明細書で“低フォレート受容体”（ＬｏＦＲ）と称す
る親細胞系より葉酸結合能が２０〜８０倍に増加した。

【００３２】これらの細胞系及びそれらの葉酸結合能については実施例２Ｂで説明するよう
に、細胞を葉酸と３７℃で３０分間インキュベートして測定した。細胞系の２
種、Ｍ１０９−ＬｏＦＲとＫＢ−ＬｏＦＲ細胞は葉酸を減少させた基質中で２４
時間インキュベートした後、同様に葉酸との結合につき定量した。継代早期での
正常ヒト腺維芽細胞及びヒトメラノーマ系統Ａ３７５へのフォレートの結合も測
定し、受容体発現レベルの広範囲につき異なる細胞系のスペクトルを得た。

【００３３】結果は表１にまとめた。

【００３４】

【表１】

【００３５】レセプター量が最も低い（Ｍ１０９−ＬｏＦＲ）及び最も高い（ＫＢ−ＨｉＦ
Ｒ）受容体の系統を比較すると、葉酸結合能の違いは最大４８５倍まで観察され
た。また表１で見られるように、葉酸を減少させた基質で２４時間インキュベー
トした細胞系についてＭ１０９−ＬｏＦＲは葉酸結合の量を上昇させない。対照
的にＫＢ−ＬｏＦＲは葉酸結合で１５倍の増加を示し、受容体発現の迅速な上昇
を示した。

【００３６】葉酸の受容体過剰発現Ｍ１０９−ＨｉＦＲ細胞系について葉酸結合を特性評価
を行なう試験では、以下の観察が見られた：ｉ）結合は、プレート当たり１０³〜１．５×１０⁶の範囲の細胞数に直接比例
する。

【００３７】ｉｉ）ホスファチジルイノシトール−ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）で前
処理したＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞の単層培養（実施例２Ｂを参照）では、葉酸
による結合アッセイで示すようにそれらの葉酸受容体の９９％が失われており、
過剰発現したフォレート受容体はグリコホスホリピッド固着で細胞膜に結合して
いることを示した。対照的に、トリプシン処理では、（ａ）放射性標識葉酸はト
リプシン処理後でもプレートの細胞及び懸濁細胞に同程度結合し、（ｂ）細胞結
合した放射性標識葉酸はトリプシン処理後に殆ど全部回収（９１±１１％）され
ることからフォレートの受容体を破壊しないことが示唆された。そして、ｉｉｉ）酸洗浄（ｐＨ３）後では、２±１％の葉酸だけがＭ１０９Ｒ−ＨｉＦ
Ｒ細胞単層に結合して残存するので、過剰発現受容体への葉酸の結合はｐＨ感受
性であることを示した。内部移行を防ぐため、葉酸結合アッセイは約１℃で３０
分行なった。Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞は３７℃で４時間放射性標識葉酸とイン
キュベートし、酸洗浄すると、配位子の３０〜４０％は細胞に保持されている。
これはおそらく細胞により葉酸配位子の一部が内部移行化し、ｐＨが起こす受容
体からの解離を回避したものと思われる。

【００３８】実施例２Ｂに記述したように、葉酸、ｍＰＥＧ−葉酸及び遊離ＰＥＧにつき競
争的結合試験を実施した。この試験では、Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞を０．１μ
Ｍの放射性標識葉酸の一定量に曝露した。“コールド（非放射性）”葉酸、ｍＰ
ＥＧ−葉酸及び遊離ＰＥＧを０．１〜１００μＭの間に変化させた濃度でＭ１０
９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞に添加した。ＰＥＧ₂₀₀₀及びｍＰＥＧ₂₀₀₀−葉酸抱合体は自
由に水溶解する非脂質結合化合物である。後者誘導体は、下記の如く葉酸−ＰＥ
Ｇ₂₀₀₀−リポソームの一価型とみなすことができる。

【００３９】競争的結合アッセイの結果は図２に、各競争相手である遊離葉酸（白丸）、Ｐ
ＥＧ−葉酸（黒三角）及びＰＥＧ（黒四角）のμｍ濃度に対する結合のパーセン
トで示した。図で分かるようにｍＰＥＧ−葉酸は、放射性標識葉酸の受容体への
結合の競争において遊離葉酸より効果が低く、ビタミン分子へのＰＥＧ付着が葉
酸の受容体への結合能を５〜１０倍低下させていることを示している。遊離ＰＥ
Ｇは細胞結合を示さず、葉酸結合では競合しない。

【００４０】Ｂ．リポソームの調製６種のリポソーム処方を、実施例３に説明した手順に従って調製した。６種の
リポソーム組成物は表２にまとめた。

【００４１】

【表２】

【００４２】表２で見られるように、全ての処方がＨＳＰＣ，Ｃｈｏｌ及びＤＳＰＥを含有
しており、表の右手の欄に記したように本明細書では葉酸−ＰＥＧ／ｍＰＥＧ含
量に従って呼ぶこととする。図３Ａ〜３Ａにはリポソーム処方を図式的に示し
た。４種のフォレート標的化リポソーム処方を調製した（図３Ｂ，３Ｃ，３Ｅ，
３Ｆ）；２つの処方は、分子量２０００ダルトン（図３Ｂ；葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀）
又は３５００ダルトン（図３Ｃ；葉酸−ＰＥＧ₃₃₅₀）のＰＥＧ分子で調製した葉
酸−ＰＥＧ抱合体を含み、２つの処方には分子量２０００ダルトン（図３Ｅ，葉
酸−ＰＥＧ₂₀₀₀／ｍＰＥＧ及び図３Ｆ，葉酸−ＰＥＧ₃₃₅₀／ｍＰＥＧ）のｍＰＥ
Ｇで調製したｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ抱合体に加えて葉酸−ＰＥＧ抱合体が含まれる
。全ての４つの処方には、分子量２０００又は３３５０ダルトンのＰＥＧ由来の
葉酸−ＰＥＧ抱合体が、全リポソームリン脂質に対して０．５％のモル分率で含
まれている。２つの対照処方にはフォレートは含まれておらず（図３A及び３Ｄ
）、含まれているｍＰＥＧ₂₀₀₀−ＤＳＰＥのモル分率が異なる（それぞれ０．５
％及び７．５％）。

【００４３】下記で検討する本発明による試験において、非標的高ｍＰＥＧ及び低ｍＰＥＧ
処方である対照リポソーム処方のｉｎｖｉｔｒｏでの挙動は同様なのでデータ
は高ｍＰＥＧリポソームについてだけ提示した。

【００４４】Ｃ．Ｉｎｖｉｔｒｏでの結合試験放射性標識葉酸標的化リポソーム及び対照の非標的リポソームの結合性を、高
及び低フォレート受容体レベルの多薬物耐性細胞系であるＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ
及びＭ１０９Ｒ−ＬｏＦＲ細胞の単層培養物につき３７℃、２４時間でアッセイ
した。結果は図４Ａに示すが、トリプシン放出細胞に結合したリポソームの量を
百万の細胞当たりのホスホリピッドをピコモルで表し、各リポソーム処方につき
示した。図で分かるように、非標的化の従来型ｍＰＥＧリポソームの多薬物耐性細胞への
結合は、高及び低葉酸受容体レベルの両方で相当低い。高結合効率を持つ標的化
処方は、葉酸−ＰＥＧ₃₃₅₀抱合体を有するリポソームで、結合において非標的化
リポソームより２６倍の増加を達成した。従って、本発明の１つの態様では、組
成物は少なくとも約３，５００ダルトン、好ましい範囲は２５００〜１０，００
０ダルトンで、更に好ましくは３，５００〜１０．０００ダルトンの分子量のＰ
ＥＧ鎖を有するリポソーム担体を含んでいる。当該態様では当該組成物は結合に
おいて、約２，５００ダルトン未満及び具体的には２０００ダルトンの分子量の
ＰＥＧ鎖を有する組成物と比較して少なくとも１０倍、より好ましくは２０倍及
び更に好ましくは２５倍の増加を達成するのに効果的である。

【００４５】図４Ａにつき引き続き参照すると、ｍＰＥＧを処方へ添加した場合又はＰＥＧ
のつなぎを３３５０から２０００に短くすると結合がかなり減少する。結合はリ
ポソームの全てにおいてＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞の方がＭ１０９Ｒ−ＬｏＦＲ
細胞より強い。興味あることに、最も親和性の高いリポソーム処方、例えば葉酸
−ＰＥＧ₃₅₀₀を有するリポソームでは、ＬｏＦＲとＨｉＦＲ細胞との比較で結合
の相対増加が最も低かった（約３０％）。

【００４６】図４Ｂは、試験をＫＢ細胞系について行なった点を除いては図４Ａと同様なプ
ロットである。図で分かるように、ｍＰＥＧのリポソームへの添加は結合の効率
を減少させる。ｍＰＥＧが存在しない場合、より長いＰＥＧスペーサ（３３５０
ダルトン）はＫＢ細胞への結合効率をわずかに増加させるだけである。ＫＢ−Ｈ
ｉＦＲとＫＢ−ＬｏＦＲの相違は幾つかのリポソーム組成物についてＭ１０９Ｒ
細胞間で見られるより小さい。このことは、表１について上で検討したように２
４時間のインキュベーション期間におけるＫＢ細胞のフォレート受容体について
の急速な上方制御に関連すると思われる。

【００４７】細胞に会合したリポソームが細胞表面結合又は細胞内に内在化するかどうかを
検討するのに、結合アッセイの終了時にｐＨ３の酸性塩水による洗浄を実施した
。表３の最終欄で示した結果は、葉酸−ＰＥＧ₃₃₅₀の約２２％及び葉酸−ＰＥＧ ₃₃₅₀ ／ｍＰＥＧリポソームの３２％は酸洗浄で除去され、細胞に会合したリポソ
ームの２／３より多い部分がＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞により内部移行されてい
ることを示している。同様に表３で、１ｍＭ葉酸（リポソーム結合葉酸の濃度の
約７００倍過剰）を、リポソームと細胞のインキュベーションの最初又は最後の
時点でリポソーム／細胞混合物に加えた競争試験につき示す。表で見られるよう
に、標的化葉酸−ＰＥＧ₃₃₅₀リポソームとＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞のインキュ
ベーション期間の開始時に葉酸を添加してもリポソームの結合を部分的（４６％
）に阻害するだけであった。リポソーム／細胞の２４時間インキュベーションの
終了時に葉酸を加えても、酸洗浄実験によればリポソームの最大約２０〜３０％
が依然として細胞表面に結合している事実に関わらず、葉酸担持リポソームの細
胞からの顕著な置換は生じない。これらの試験により、葉酸−ＰＥＧリポソーム
の細胞性フォレート受容体への結合親和力は遊離葉酸より強いことを示している
が、これは一価類似体であるｍＰＥＧ−葉酸が結合力で５〜１０倍劣っているの
とは対照的である（表１）。葉酸標的化リポソームのより強い結合性は、リポソ
ームプラットホーム上における葉酸残基の多価提示状態に関係している。

【００４８】

【表３】

【００４９】上記したように、これらの試験は付着したフォレート配位子を有するＰＥＧ鎖
に加えてｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むリポソーム処方、例えば葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀／
ｍＰＥＧ及び葉酸−ＰＥＧ₃₃₅₀／ｍＰＥＧの処方は標的細胞への結合を妨害する
ことを示す。この示唆につき更に、実施例４の記載により調製したローダミン標
識リポソームヘ細胞を曝露し、共焦点顕微鏡で細胞を観察する試験を行なった。
Ｍ１０９−ＨｉＦＲ細胞を、ローダミン−葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀リポソーム（ＨＳＰ
Ｃ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−フォレート／ＤＰＰＥ−ローダミン（９８．
９：７０：１．０：０．１））又はローダミン−葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀／ｍＰＥＧ₂₀ ₀₀ リポソーム（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−
フォレート／ＤＰＰＥ−ローダミン（９１．９：７０：７：１．０：０．１））
と７時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で試験をした。結果は図５A〜５Ｂ及
び図５Ｃ〜５Ｄにローダミン−葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀リポソーム及びローダミン−葉
酸−ＰＥＧ₂₀₀₀／ｍＰＥＧ₂₀₀₀をそれぞれ示した。図５Ａ〜５Ｂに見られるよう
に、付加的ＰＥＧ鎖のない葉酸標的化リポソームに対して曝露したＭ１０９−Ｈ
ｉＦＲ細胞の細胞質にローダミン標識リポソームが詰め込まれていた。対照的に
図５Ｃ〜５Ｄに見られるように、付加的ｍＰＥＧを備えたリポソームは、細胞表
面に会合したローダミンの弱い信号やリポソームの細胞中への内部移行の不足が
立証するように細胞に対する結合力が乏しい。これらの結果は、フォレート配位
子がフォレート標的化リポソームにつき、過剰発現したフォレートの受容体を持
つ細胞への結合及び内部移行を仲介できること及び付加的ＰＥＧ鎖はこれらの工
程を妨害するようであることを立証する。

【００５０】本発明による他の試験では、Ｍ１０９−ＨｉＦＲ細胞をフォレート非存在培地
中でローダミン−葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀リポソーム（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ
−ＰＥＧ−フォレート／ＤＰＰＥ−ローダミン（９８．９：７０：１．０：．１
））とインキュベートした。インキュベーションの３０分後及び５０分後に、細
胞を共焦点顕微鏡で視覚化し、画像を図６Ａ〜６Ｂに示した。図６Ａで見るよう
に、インキュベーションの３０分後、フォレート標的化リポソームをＭ１０９
−ＨｉＦＲ細胞と会合し、５０分後には図６Ｂで見るように幾らかのリポソーム
は内部移行し、細胞の細胞質ゾル中に蓄積する。同じ試験で、幾らかの細胞を同
様にリポソーム結合葉酸濃度の約１０００倍に相当する２ｍＭ濃度の遊離葉酸に
曝露した。この競争的結合試験は、フォレート配位子とフォレートの受容体間の
相互作用を証明するために行なった。インキュベーションの３０分と５０分後、
細胞は視覚化したがリポソーム結合は観測されず（図６）、遊離フォレートはフ
ォレート標的化リポソームの細胞性フォレート受容体への結合を競争的に妨害で
きることを示唆した。４時間とか１９時間の長時間曝露の後では、Ｍ１０９−Ｈ
ｉＦＲ細胞へのフォレート標的化リポソームの結合を遊離で溶解性フォレートで
はもはや妨害できず、溶解性フォレート及び細胞の細胞質は図７Ａ〜７Ｂで見る
ことができるようにローダミン蛍光で染色される。

【００５１】いかなる特別な理論に結び付けるまでもなく競争的結合試験の結果は、結合親
和性はリポソームのフォレートがリポソームの多結合価のために遊離フォレート
より高いことによると思われる。しかし、特に相当過剰な（１０００倍）遊離フ
ォレート及び小さな分子のより早い移動度をナノ粒子（リポソーム）と比較して
考慮すると、フォレートリポソームについての平衡は長時間の後に達する。

【００５２】Ｍ１０９−ＨｉＦＲ細胞におけるフォレート標的化リポソームとフォレート受
容体の係わり合いの証拠は、ホスファチジルイノシトール−ホスホリラーゼＣ（
ＰＩ−ＰＬＣ）（実施例２Ｂ）による前処理によりフォレート受容体を破壊した
細胞で行なわれた試験で提供する。ＰＩ−ＰＬＣ前処理Ｍ１０９−ＨｉＦＲ細胞
をローダミン標識化のフォレート標識化リポソームに４℃で１時間曝露すると、
図８Ａの画像で見るように検出される結合がなくなった。しかしながら、図８Ｂ
の画像で分かるように、同じリポソームが非Ｐｉ−ＰＬＣ−処理細胞とは結合し
た。４℃では受容体との結合は生じるが、内部移行や受容体の細胞表面への再循
環は起こらない（ＫａｍｅｎＢ．Ａ．ａｎｄＣａｐｄｅｖｉｌａＡ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３：５９８３−５９８７（
１９８６））。フォレート標的化リポソームが酵素処理Ｍ１０９−ＨｉＦＲ細胞
へ会合する能力がないことで、グリコホスホリピッド固着フォレート受容体がリ
ポソーム−細胞会合に係わることの証明が得られた。１．ドキソルビシン担持リポソームを用いたＩｎｖｉｔｒｏ結合試験実施例５に記述した如く、ドキソルビシンを含有するフォレート標的化リポソ
ームを調製し、Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞とインキュベートした。比較のため、
Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞を同様に遊離ドキソルビシン又はドキソルビシンを含
むがフォレート標的化配位子がないリポソームとインキュベートした。ドキソル
ビシン分子の動きにつき蛍光を用いて追跡し、結果を図９Ａ〜９Ｆに示した。

【００５３】図９Ａ〜９Ｂは遊離ドキソルビシンに７分間（図９Ａ）と３０分間（図９Ｂ）
曝露した細胞の画像である。遊離ドキソルビシンの細胞膜を通しての流れ込みは
非常に迅速であことが図９Ａにおける光る細胞質染色で示される。図９Ｂで見る
ように、遊離薬物は早くも３０分以内に核に存在していた。

【００５４】細胞のドキソルビシン担持フォレート標的化リポソームとの相互作用の機構は
、遊離ドキソルビシンとの機構とはかなり異なったものであった。図９C〜９Ｅ
で分かるように、リポソームの細胞膜への付着は約２０分以内で観測された（図
９Ｃ）。６０分では内部移行が起こり、リポソームのドキソルビシンは細胞質ゾ
ルで検出され、幾らかの細胞では薬物は核の中に出現し始めた（図９Ｄ）。９０
分後、フォレート標的化リポソームから出てきたドキソルビシンが多くの細胞の
核に達し、細胞質の薬物の蛍光は消失した（図９Ｅ）．フォレート標的化リポソ
ームとは対照的に、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥで被覆された非標的化リポソーム（ＤＯ
ＸＩＬとして市販で既知）の処方は４時間インキュベーションしても、図９Ｆで
見るようにＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞とは会合を示さない。この試験を新鮮な固
定細胞で繰り返しても本質的に同様な結果であった。

【００５５】他の試験では、遊離ドキソルビシン又はドキソルビシン担持フォレート標的リ
ポソームと１時間処理した後、薬物非存在培地で２４時間インキュベーションし
て、Ｍ１０９−ＨｉＦＲ細胞のドキソルビシン保持能力を検討した。図１０Ａ〜
１０Ｄで見るように、遊離薬物（図１０Ａ）及びリポソーム包含薬剤（図１０Ｂ
）で１時間インキュベーションした後、細胞核はドキシルビシン蛍光で染色した
。しかしながら、図１０Ｃで見るように遊離薬物で処理した細胞では２４時間後
には蛍光は殆ど完全に消滅した。リポソームで処理した細胞での蛍光は図１０Ｄ
で見るように依然はっきりと検出できる。これらの結果はリポソームの薬物は遊
離薬物より薬剤耐性細胞の中に保有されることを示す。２．ＭＤＲ細胞における薬剤蓄積の更なる証拠実施例６に記述したように、フォレート標的化ドキソルビシン担持リポソーム
の形でフォレート受容体経路を経由した細胞内送達はＰ−１７０糖タンパク質流
出ポンプに打ち勝つことを示す為に試験を実施した。１つの試験では、Ｍ１０９
Ｒ−ＨｉＦＲ細胞中のＰ−１７０糖タンパク質ポンプの活性につきローダミン流
出アッセイを用いたフローサイトメトリーにより検討し、ベラパミル障害に対し
感受性があることを見出した（データは示していない）。この手法を用い、遊離
及びフォレート標的化リポソーム包括形で細胞内を送達されたドキソルビシン流
出の試験を行なった。Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞の単層を遊離及びリポソーム包
含形のドキソルビシンに１時間、ベラパミル存在下で曝露した。細胞を洗浄し、
更に２時間１０μモルのベラパミル中でインキュベートした。細胞はそれから細
胞のドキソルビシン含有量につき蛍光とフローサイトメトリーにより分析した。

【００５６】フローサイトメトリーからの結果は図１１Ａ〜１１Ｂに遊離ドキソルビシン処
理（図１１Ａ）及びリポソーム包含ドキソルビシン処理（図１１Ｂ）につき示し
た。図１１Ａで分かるように、曲線変化はベラパミル存在下で遊離ドキソルビシ
ンに曝露した後にＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞における細胞蛍光が明らかに増加す
ることを示している。対照的に、フォレート標的化リポソーム薬物へ曝露したＭ
１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞での細胞の蛍光レベルはベラパミルが存在しても存在し
なくても変化しないように見える（図１１Ｂ）。これらの観測は細胞抽出物から
のドキシルビシンの定量的蛍光法で確認し、表４にまとめた。

【００５７】

【表４】

【００５８】表で分かるように、フォレート標的化リポソームで送達したとき、ベラパミル
の存在は薬剤耐性細胞中での薬物蓄積量について何も効果を有さない。対照的に
遊離型で投与するとき、ドキソルビシンの細胞保持はベラパミルが存在すると約
４．５倍高い。薬剤保持は、フォレート標識化リポソームから投与すると約４〜
６倍高い。これらの結果は、細胞内に拡散した遊離ドキソルビシンはＰ−１７０
糖タンパク質ポンプ作用で汲み出されるが、フォレート受容体経路で進入したド
キソルビシンはＰ−糖タンパク質流出機械を回避することを示している。フォレート標的のリポソームを介しての細胞への薬物送達の増強を確認する追加
の試験では、薬剤耐性（Ｍ１０９Ｒ）細胞及び薬剤感受性（Ｍ１０９）細胞をそ
れぞれ０．２×１０^-5Ｍ及び０．２×１０^-6Ｍドキソルビシンに曝露した。細胞
会合薬物については、ドキソルビシンへ１時間及び４時間の曝露した後に測定し
た。結果は表５に示す。

【００５９】

【表５】

【００６０】表５のデータは、薬物に浸した細胞外培地には過剰な薬剤が存在していても、遊
離ドキソルビシンに曝露された薬剤耐性細胞は薬物を排出することを示す。対照
的に、フォレート標的化リポソームの形のドキソルビシンに曝露すると薬剤耐性
細胞は細胞内にドキソルビシンを蓄積する。予想したように、薬剤感受性細胞は
遊離形でもリポソーム包含形であってもドキソルビシンを蓄積する。これらのデ
ータは、遊離ドキソルビシンに曝露した薬剤耐性細胞は効率よく薬物を排出する
が、フォレート経路により送達されると細胞内への薬物送達と蓄積が生じる。

【００６１】薬剤耐性細胞での取り込み及び蓄積がフォレート経路に依存することは図１２
に提示した試験で支持されている。この試験では包含されたドキソルビシンを有
するフォレート標的化リポソームの２つの処方を調製した。１つの処方は薬物対
脂質比１３７．６μｇ／μモル（図１２の黒丸）であり、他は薬剤対脂質比１１
．３μｇ／μモル（白丸）を有する。Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞をリポソーム処
方とインキュベートし、薬剤の細胞への取り込みを時間の関数として観測した。
図１２で分かるように、ドキソルビシンの細胞の蓄積は、薬剤−脂質比が約１０
倍高いリポソームの方が常に約１０の係数にて高い。２４時間のインキュベーシ
ョン期間で、流出の証拠や停滞レベルもなしに腫瘍細胞による標的化リポソーム
薬物が絶え間なく蓄積するのが図１２の曲線から明らかである。

【００６２】他の１つの試験では、細胞核及び細胞の細胞質ゾルへのドキソルビシンの蓄積
量を細胞分別により測定した。Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞を遊離ドキソルビシン
又はフォレート標的化リポソームに包含されたドキソルビシンと１時間及び４時
間インキュベートした。細胞核及び細胞質ゾル中のドキソルビシンの蓄積は実施
例７で説明するように細胞ゾルから細胞核を分離して蛍光分析的に測定した。結
果は図１３に示したが、そこで分かるように１時間のインキュベーションでは遊
離ドキソルビシン（ＤＯＸ）及び標的化リポソームのドキソルビシンの両方で薬
物の多くが核画分で見出される。４時間のインキュベーションの後では、標的化
リポソームのドキソルビシンで得られた核の薬物濃度は遊離ドキソルビシンで得
られた濃度を超えている。フォレート標的リポソームに曝露し、細胞に蓄積した
薬物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析では、蓄積した薬物はその
ままの薬物で（データは示さない）、この経路での送達は薬物の分解を導かない
ことを示している。また腫瘍細胞を遊離ドキソルビシン又はフォレート標的化リ
ポソームのドキソルビシンに４時間曝露した後でも、検出された代謝物は顕著な
量ではなかった。３．細胞毒性遊離形及びフォレート標的化リポソーム包含形でＭ１０９−ＨｉＦＲ細胞に送
達されたドキソルビシンの細胞毒性を実施例８に記述したように比較した。簡単
に述べると、Ｍ１０９−ＨｉＦＲ細胞を遊離又はリポソームのドキソルビシンに
１時間曝露した後、洗浄し更に新鮮な培地中で５日間（１２０時間）インキュベ
ートした。図１４Ａで分かるように、フォレート標的化リポソーム（黒三角）中
のドキソルビシンの成長阻害曲線は遊離形（黒丸）で投与されたドキソルビシン
と類似しており、従来の非標的化リポソーム（黒四角）の形で投与したドキソル
ビシンより相当高い。

【００６３】類似な細胞毒性アッセイを多薬物耐性サブ系統であるＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲを
用いて行ない、結果を図１４Ｂで示す。薬物をフォレート標的化リポソーム（黒
三角）を通じて細胞に投与すると、従来の非標的化リポソーム（黒四角）から投
与した薬剤に比べて毒性での明らかな亢進が得られた。ＩＩ．組成物のｉｎｖｉｖｏにおける特性評価他のモデルにおいて、フォレート標的化リポソームからフォレート経路にて送
達された薬物の生物的活性を検討するため、Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞をｉｎ
ｖｉｔｒｏで試験薬物に曝露した。これらの細胞をマウス肉趾に接種した。この
ようにして、細胞の成長をｉｎｖｉｔｒｏ実験により相当長期にわたり追跡し
、ｉｎｖｉｖｏのミクロ環境因子群を活動させた。しかしながら、治療的実験
とは異なりｉｎｖｉｖｏの養子的アッセイであるこの型は、結果の解釈を複雑
にする薬学動態学的や生物分布因子には影響されない。

【００６４】従って、ｉｎｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を遊離ドキソルビシン又はリポソーム包
含で非フォレート標的化ドキソルビシン（ＤＯＸＩＬ^?）又はフォレート標的化
でリポソーム包含ドキソルビシンと、本発明のようにインキュベートした。実施
例９に記述した如く、腫瘍細胞を選択した処方の存在下で１時間インキュベート
し、１×１０⁶個の細胞をマウス肉趾に注入したが、各処理処方は８匹のマウス
に注入した。各処理群につきそれぞれのマウスの肉趾厚さを測定し、図１５Ａに
示した。

【００６５】図で分かるように、ドキソルビシンで処理しない腫瘍細胞を注入した対照マウ
ス（白丸）は、腫瘍細胞注入後において肉趾の厚さは増加しつづける。遊離ドキ
ソルビシン（黒丸）で処理した細胞を受けたマウス及びリポソーム包含ドキソル
ビシン（白四角）で処理した腫瘍細胞を受けたマウスは同じく肉趾厚みの増加が
起こった。フォレート標的化リポソーム（黒三角）の処理した細胞を注入したマ
ウスのみが肉趾厚さの増加を示さなかった。

【００６６】処理腫瘍細胞の注入後３４日目の試験終了時、各腫瘍保有マウスの肉趾の重量
を測定し、マウス肉趾の平均重量から差引いて各マウス肉趾の腫瘍重量を決定し
た。図１５Ｂは、処置状況毎に肉趾腫瘍重量をグラムで示した。見たように、フ
ォレート標的化ドキソルビシン包含リポソーム（黒三角）で処理した細胞を受け
たマウスにおける腫瘍は最も低い平均腫瘍重量を有した。

【００６７】表５には腫瘍の発生率及び処理群の各々につき腫瘍重量中央値をまとめた。

【００６８】

【表６】

【００６９】表５の結果では、フォレート標的化リポソームのドキソルビシンに曝露した腫瘍
細胞を注射したマウスに生じる腫瘍の数が、遊離ドキソルビシン、ＤＯＸＩＬ及
び対照と比べて５週間の追跡後で統計的に極度に減少することを示す。腫瘍重量
もフォレート標的化リポソームの群についてはより少ない。同様な試験で、各々の処方で処理した腫瘍細胞をマウスに皮下注射し、注射後の
時間の関数として触診可能な腫瘍の数を測定した。結果を図１６に示すが、対照
マウス（白丸）が最も多い数を有した。遊離ドキソルビシン処理細胞を受けたマ
ウス（黒丸）もゆっくりした初期腫瘍成長期の後、約２０日目の後には顕著な腫
瘍数を有した。リポソーム処方を受けたマウス（白丸は非標的化リポソームで、
黒三角はフォレート標的化リポソーム）は最も少ない腫瘍を有し、フォレート標
的化リポソームドキソルビシンについては腫瘍の数が最も少ない結果となった。

【００７０】

【実施例】ＩＩＩ．実施例以下の例は本発明のリポソーム組成の調製法及び特性評価を例証するものであ
り、制限を意図するものではない。

【００７１】実施例１葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ抱合体の調製と特性評価Ａ．抱合体の合成葉酸（Ｆｌｕｋａ，１００ｍｇ，０．２４４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（４ｍＬ）に
溶解する。アミノ−ＰＥＧ₂₀₀₀−ＤＳＰＥ（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔａｌ
．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３５３：７１−７４（１９９４）に説明があるように
調製した）及びピリジン（２ｍＬ）を葉酸−ＤＭＳＯ溶液に加え、次いでジシク
ロヘキシルカルボジイミド（１３０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。反応は
室温で４時間連続した。シリカゲルＧＦ（クロロホルム／メタノール／水７５
：３６：６）でのＴＬＣは生成物が生じたことによる新しいスポット（Ｒ₁＝０
．５７）を示した。反応混合物からアミノ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（Ｒ₁＝０．７６
）の消滅をニンヒドリン噴霧で確認した。ピリジンをロータリーエバポレーショ
ンで除去した。水（５０ｍＬ）を反応混合物に加えた。溶液を遠心分離して痕跡
の不溶物を除いた。上澄液をＳｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＣＥ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ
，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）管（ＭＷＣＯ３００，０００）にて塩水（５０ｍＭ
，２×２０００ｍＬ及び水（３×２０００ｍＬ）に対して透析した。得られた生
成物（ＴＬＣで１スポット）のみを含んでいる溶液を凍結乾燥し、残渣をＰ₂Ｏ₅ 上で減圧にて乾燥した。収量：４００ｍｇ、９０％。当該合成を図１に例証する
。

【００７２】同じプロトコールを用いてＨ₂Ｎ−ＰＥＧ₃₃₅₀−ＤＳＰＥから葉酸−ＰＥＧ−
ＤＳＰＥを調製した。同様な手順で葉酸をｍＰＥＧ₂₀₀₀−ＮＨ₂（Ｚａｌｉｐｓ
ｋｙ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９：１１７７−１１
８３（１９８３））に付着させた。生成物であるｍＰＥＧ−葉酸はシリカゲル（
７０−２００メッシュ、６０Å）カラムで、メタノール（１０−８０％）のクロ
ロホルム溶液の段階的傾斜法、次いで純生成物を溶出するのにクロロホルム／メ
タノール／水（６５：３０：５）を用いて精製した。Ｂ．ＵＶ分析による抱合体の特性評価フォレート含量値は、葉酸の吸光係数λ_max＝２８５ｎｍにおけるε＝２７，
５００Ｍ^-1ｃｍ^-1を用い、メタノール中（０．０５ｍｇ／ｍＬ）の抱合体を定量
的ＵＶ分光測光法で定量した。以下の葉酸含量値を計算した：葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀ −ＤＳＰＥにつき０．２９ｍｍｏｌ／ｇ（理論値の９４％、０．３１ｍｍｏｌ／
ｇ）；葉酸−ＰＥＧ₃₃₅₀−ＤＳＰＥにつき０．２１ｍｍｏｌ／ｇ（理論値の９７
％、０．２２ｍｍｏｌ／ｇ）及びｍＰＥＧ₂₀₀₀−葉酸につき０．４０ｍｍｏｌ／
ｇ０．４０ｍｍｏｌ／ｇ（理論値の９８％、０．４１ｍｍｏｌ／ｇ）。Ｃ． ¹Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６／ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ約１０／１ｖ
／ｖ）による抱合体の特性評価葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥについて：

【００７３】

【化１】

【００７４】Ｄ．質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）による抱合体の特性評価ＰＨＩ−ＥＶＡＮＳＭＡＬＤＩ三重静電アナライザー飛行時間型質量分析計
（デソープションレーザー：３３７ｎｍ，６００ピコ秒パルス幅）により、マト
リックス材としてゲントリンシン酸を用いてＣｈａｒｌｅｓＥｖａｎｓ＆
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ，ＣＡ）がスペクトルを得た
。当該スペクトルは、葉酸−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（分子量計算値３２００
Ｄａ）については３２８４を中心とした４４ＤＡ間隔の列でベル型分布を示した
；葉酸−ＰＥＧ３３５０−ＤＳＰＥ（分子量計算値４５４０Ｄａ）については４
５０１；及びｍＰＥＧ−葉酸（分子量計算値２４２３Ｄａ）については２４００
Ｄａであった。Ｅ．カルボキシペプチダーゼＧ介在分裂のＨＰＬＣモニタリングＨＰＬＣシステムには、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＰｒｏｄｉｇｙＣ８（４．
６．５０ｍｍ）カラムを備えたＳｈｉｍａｚｕ１０Ａを１ｍＬ／分、モニタリ
ングはλ＝２８５ｎｍを用いた。葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの分析には、システム
をメタノール／１０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７．０（９２：８、ｖ／ｖ）の
同一組成法で用いた。抱合体は保持時間５．７分の単一ピークで溶離した。ｍＰ
ＥＧ−葉酸の分析は、１０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐH７．０とメタノール（２
５分で０〜３５％）の傾斜溶離法で行なった。抱合体は保持時間１９．６分の単
一ピークで溶離した。両方の場合において、全抱合体ピーク面積の減少により抱
合体の葉酸部分からプテロイン酸の酵素的分裂を追跡することができた。葉酸−
ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の溶液を１５０ｍM Ｔｒｉｓ緩衝液、
ｐＨ７．３で調製した。この溶液の一部（１０μＬ）をＨＰＬＣに注入して時間
ゼロピーク積分を得た。酵素カルボキシペプチダーゼＧ（ＣＰＧ，Ｓｉｇｍａ，
１単位）を葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ溶液に添加した。得られた溶液を３０℃の水
浴でインキュベートし、一部（１０μＬ）を異なる時間間隔でＨＰＬＣに注入し
た。酵素的加水分解の速度は当初速いが、インキュベーションが４時間過ぎると
ゆるやかになる。追加的にＣＰＧの１単位を反応混合物へ４時間と２０時間に加
えた。データは２７時間まで集めた。インキュベーション時間の延長及び複数回
の酵素添加にも係わらず、抱合体の消滅は当初積分値の２０％を越えないので、
葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの８０％はγ−カルボキシル結合であることを示してい
る。ｍＰＥＧ−葉酸を基質として試験を行なうと、この抱合体はγ−カルボキシ
ル結合の葉酸残基を約９０％含有していた。実施例２細胞培養及び結合試験Ａ．細胞培養細胞は、１０％ウシ胎児血清、グルタミン２ｍM,ペニシリン５０単位／ｍＬ及
びストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを加えた通常又は葉酸非存在ＲＰＭＩ培地
、で培養した。血清含有葉酸非存在培地中の葉酸濃度は、通常の培養条件では２
．２６μＭ（１ｍｇ／Ｌ）であるのに対し、僅かに３ｎＭである。細胞は日常Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（ＢｅｙｔＨａｅｒｎｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）においてトリ
プシン（０．０５％）−ＥＤＴＡ（０．０２％）溶液の処理により流通しており
、ウシ胎児血清はＧＩＢＣＯ（ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）から得た。

【００７５】（ｉ）細胞系：Ｍ１０９は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのマウス肺ガン系統（Ｍａｒ
ｋｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔ．Ｒｅｐ．，６１：１
４５９−１４７０（１９９７）），及びこれらの細胞のサブ系統で多薬物耐性を
示すＭ１０９Ｒ（ドキソルビシンに対する耐性が約１００倍増加）を多くの試験
で使用した。両方の細胞系はｉｎｖｉｔｒｏで葉酸受容体を少量発現し、それ
ゆえにＭ１０９− ＬｏＦＲ及びＭ１０９Ｒ−ＬｏＦＲと称する。これらの細胞
を葉酸非存在培地中で数回継代すると、大量の葉酸受容体を発現する２種のサブ
系統が得られた。これらのサブ系統は低濃度葉酸条件でも原系と同様な世代時間
で成長するように適応していた。これらのサブ系統を、葉酸受容体の過剰発現を
強調するためにＭ１０９−ＨｉＦＲ及びＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲと称する。

【００７６】ＫＢ細胞であるヒト鼻咽頭表皮ガン（Ｓａｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，３４：９９５１−９９６１（１９９５））を同じように葉酸低濃度
培地で成長させて葉酸受容体を過剰発現する細胞、ＫＢ−ＨｉＦＲ細胞を得た。
本研究における他の細胞系はヒトメラノーマ系統のＡ３７５及びＧｅｎｅｔｉｖ
ｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨａｄａｓｓａｈＨｅｂｒｅｗＨｏｓｐ
ｉｔａｌが親切に提供してくれた正常ヒト線維芽細胞である。Ｂ．遊離フォレート、葉酸−ＰＥＧ抱合体及びリポソームの細胞結合結合は細胞会合リポソームの³Ｈ−Ｃｈｏｌ又は³Ｈ−葉酸の測定によりアッセ
イした。アッセイの４８時間前、５×１０⁵細胞を３５ｍｍ皿に播種して約１０⁶ 細胞／プレートを得た。細胞なしの培地及び血清で２日間プレインキュベートし
たプレートを対照として使用した。アッセイの際にはプレートを２回葉酸非存在
のＲＰＭＩ培地で洗浄し、０．１μＭ放射標識葉酸又は３０〜３００ナノモル量
のリン脂質のリポソームを含んだ葉酸非存在ＲＰＭＩ培地１ｍＬにおいて、３７
℃でインキュベートした。インキュベーション後、プレートは３回２ｍＬ氷冷Ｐ
ＢＳで洗浄し、放射標識物を０．５ＮＮａＯＨ１ｍＬで一夜抽出し、０．５ＮＨ
Ｃｌ１ｍＬで中和した。細胞と会合した放射能を分析する際には、細胞はトリプ
シン−ＥＤＴＡ処理してプレートから放出し、ＰＢＳで３回洗浄し、それから同
様な手順に従って抽出した。放射能は液体シンチレーションカウンターで計数し
て測定した。各リポソーム処方についてｃｐｍ／リン脂質の特定比に基づき、結
果を細胞百万個当たりのリン脂質ピコモルに転換した。

【００７７】酸洗浄処理したものを合わせる際は、各皿は酸性にした塩水（ｐＨ＝３）で２
回洗浄し、次いでＰＢＳで洗浄してから上記のように抽出した。細胞をホスファチジルイノシトール−ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）で細
胞を処理する際は、Ｍ１０９ＨｉＦＲ細胞は葉酸非存在ＲＰＭＩ培地で２回洗浄
して葉酸非存在ＲＰＭＩ培地中の０．１単位／ｍＬホスホイノシトールホスホリ
パーゼ−Ｃ（ＰＩ−ＰＬＣ）（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に３７
℃で６０分間曝露した。それから、細胞は葉酸非存在培地で２回洗浄し、フォレ
ート標的化リポソームに４℃で１時間曝露した。固定した細胞試料につき顕微鏡
観察を行なった。

【００７８】懸濁した細胞で行なった試験で、単層から得た細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処
理で放出し、次いで葉酸非存在培地で３回洗浄した（７分間、５００ｇ遠心分離
）。懸濁細胞（１〜１０×１０⁶細胞／ｍＬ）を放射標識遊離葉酸又はリポソー
ム（濃度は各試験で記した通り）と５ｍＬのプラスチック管中で３０分インキュ
ベートした。結合しない物質はＰＢＳで４回洗浄して除去した。実施例３リポソームの調製水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬ
ｉｐｉｄｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びメトキシＰＥＧ₂₀₀₀−ＤＳＰＥ（ｍＰ
ＥＧ−ＤＳＰＥ）からなるリポソームを、以前記載されたように（Ｚａｌｉｐｓ
ｋｙ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，４：２９
６−２９９（１９９３））調製した。リポソーム組成は上記表２で説明したが、
検討した如く全ての処方にＨＳＰＣ，Ｃｈｏｌ及びＤＳＰＥは含有しているので
、ここでは葉酸−ＰＥＧ／ｍＰＥＧの内容に従って呼ぶことにする。図３は図式
で処方を例証する。

【００７９】全てのリポソーム処方には微量の³Ｈ−コルヘキサデシルエーテル（ＮＥＮ，
Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を添加した。リポソームは、クロロホルム：メタノール（
１：１）脂質溶液のロータリーエバポレーション又はｔ−ブタノール脂質溶液の
凍結乾燥で得た凍結乾燥“ケーキ”により得られた薄層乾燥脂質膜を５５〜６０
℃で水和させて作成した。使用した緩衝液は、５０〜１００μモルホスホリピッ
ド／ｍＬにおいて、５％デキストロース／１５ｍM Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で
ある。水和の後に、ＬｉｐｅｘＢｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅ
ｒ，ＢＣ）から得たステンレス鋼装置を用いて１．０〜０．０５μｍの孔を持つ
二重積層ポリカーボネート膜を通過させる高圧押出しを行なった。リポソームは
０．２２μｍのセルロース膜をろ過させて滅菌した。リポソームの特性評価は：
リン含量に基づくホスホリピッド濃度、ドデシル硫酸ナトリウム溶液（１０％）
でリポソーム破裂した後に２８５ｎｍの葉酸ＵＶ吸収に基づく葉酸濃度、動的レ
ーザ分散法で測定した小胞の大きさ、幾つかの処方における遊離脂肪酸含量で検
査したホスホリピッドの加水分解を含んでいる。全てのリポソーム調製は平均し
た小胞の大きさは７０〜９０ｎｍで標準偏差は＜２５％であり、単峰形の径分布
であった。ホスホリピッドの加水分解は、ここで試験を行なった調製物では検出
されなかった。実施例４フォレート標的のリポソームとＭ１０９ＨｉＦＲ細胞の結合及び内部移行Ａ．リポソームの調製リポソームは実施例３の手順に従って調製したが、ＤＰＰＥ−ローダミン（Ａ
ｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を次の
ように含む：

【００８０】

【表７】

【００８１】Ｂ．共焦点顕微鏡法Ｍ１０９ＨｉＦＲ細胞は、各試験に先立つ２４時間前に、３５ｍｍの培養皿に
挿入した２４ｍｍのカバースガラスの上に蒔いた。細胞のリポソーム組成物又は
遊離ドキソルビシンに曝露する時間は各試験につき示した。細胞を緩衝化した４
％ホルマリン／１．５％メタノール（Ｂｉｏ−Ｌａｂ，Ｉｓｒａｅｌ）を含有す
るＰＢＳ溶液により４℃で１５分間固定した後、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎ
ｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）で４回洗浄した。次にカバーガラスを、９０％グリセ
ロール／１０％ＰＢＳ／０．１％ＮａＮ₃及び抗フェーディング剤の３％ＤＡＢ
ＣＯ（Ｓｉｇｍａ）からなる緩衝化封入剤で被覆したスライドの上にのせた。

【００８２】生きたままの（固定していない）細胞の顕微鏡的視覚化は、２ｍM ＭｇＳＯ₄ ／１ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ），ｐＨ７．０を含有するＰＢＳの中で行な
った。

【００８３】細胞の試験は反転Ｚｅｉｓｓ共焦点レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ４１０）（Ｃａ
ｒｌＺｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行なった。最大励起は、内部
Ｈｅ−ネオンレーザの５４３ｎｍ線でおこなった；蛍光発光はローダミン用の長
路透過防御フィルターＬＰ−５７０により５７０ｎｍ以上を観測した。ドキソル
ビシンについては最大励起として内部アルゴンレーザの４８８ｎｍ線により行な
った：蛍光発光は長路透過防御フィルターＬＰ−５１５により５１５ｎｍ以上で
観測した。水浸液対物レンズにＣ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ６３×１．２Ｗｃ
ｏｒｒ．（Ｚｅｉｓｓ）を用いた。画像はＴＩＦファイル形式に変換し、画像の
コントラストレベル及び明るさはＺｅｉｓｓＬＳＭ４１０プログラムを用いて
調整した。画像はＱＭＳマジカラー２プリンターから１２００ｄｐｉで印刷した
。実施例５ドキソルビシンリポソームの調製及びｉｎｖｉｔｒｏでの結合Ａ．リポソームの調製リポソームの調製はＧａｂｉｚｏｎ（Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｉｎｇ，３
：３９１−３９８，（１９９６））が記述した通りに行ない、水素化大豆ホスフ
ァチジルコリン（ＨＳＰＣ，ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，Ｂｉｒ
ｍｉｎｇｈａｍＬＡ，ＵＳＡ），コレステロール（Ｓｉｇｍａ），ＤＳＰＥ−
ＰＥＧ−フォレートから構成されていた。ドキソルビシンのホスホリピッドとの
比率は１１０〜１５０μｇ／μｇであった。フォレート標的配位子を欠いている
がＰＥＧの表面被覆を有するドキソルビシン担持リポソームはＣａｂａｎｅｓ，
Ａ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４：４９９−５０５，（１９
９８）に記述されており、商品名ＤＯＸＩＬ（ＳｅｑｕｕｓＰｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）で販売されている。Ｂ．Ｉｎｖｉｔｒｏでの結合Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦｒ細胞を遊離ドキソルビシン又はフォレート標的化リポソ
ーム中に包含されたドキソルビシンと、ドキソルビシン濃度４×１０^-5Mでイン
キュベートした。ドキソルビシン分子は蛍光を用いて追跡した。実施例６流出ポンプのベラパミル障害及びドキソルビシンの送達３５ｍｍ培養皿中のＭ１０９ＲＨｉＦＲ細胞の単層を、遊離薬物又はフォレ
ート標的化リポソームの形である０．５×１０^-5Ｍドキソルビシンに３７℃で１
時間、１０μモルのベラパミル（Ｔｅｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）の存在又は非存在下
で曝露した後、ＰＢＳ洗浄（７分、５００ｇ遠心分離）した。そして、洗浄した
細胞を洗浄し、更にベラパミルと２時間インキュベートした。細胞は０．０５％
トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，Ｎ
Ｙ）により単層からはずして２つの画分に分け、１つは蛍光を用いて細胞のドキ
ソルビシンを定量し、他の１つはフローサイトメトリーアッセイに供した。細胞
のドキソルビシン定量は、０．０７５ＮＨＣｌ／９０％イソプロピルアルコール
により一夜４℃で抽出し、遠心分離した後の上澄液につきドキソルビシンを蛍光
光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ，Ｌｕｍｉｔｒｏｎ，Ｉｓｒａｅｌ）により励起波長４
７０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで測定して行った。

【００８４】フローサイトメトリーは次のように行なった。上述した懸濁Ｍ１０９Ｒ−Ｈｉ
ＦＲ細胞を、ＦＡＣＳ−ＳｔａｒＰｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ，ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙＳｙｓｔｅｍ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ，ＣＡ）フローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーで分析し
た。細胞はシース液体として塩水を用い７０μｍノズルを通して約１０００細胞
／秒の速度で通過させた。４８８ｎｍのアルゴンレーザビームを２５０ｍWで励
起用の光源とした。赤色（ドキソルビシン由来）蛍光につき５７５ｎｍＤＦ２６
帯透過フィルターを用いて測定した。

【００８５】結果を図１１Ａ〜１１Ｂ及び表４に示した。実施例７細胞及び核のドキソルビシン定量Ｍ１０９−ＨｉＦＲ及びＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞を遊離ドキソルビシン又は
ドキソルビシン包括リポソームに１時間及び４時間曝露した。細胞での薬物蓄積
についての定量は、実施例６で上述したようなトリプシン処理細胞につき蛍光分
析を行なった。トリプシン処理し、ＰＢＳ洗浄したドキソルビシン曝露Ｍ１０９
Ｒ−ＨｉＦＲ細胞を、次に示す溶液：１００ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡ
／１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）／１０ｍＭＴｒｉｓ（Ｓｉｇｍ
ａ），ｐＨ７．４に４℃で１０分間懸濁して遠心分離（１５分、８００ｇ）した
。細胞核沈殿物を細胞の細胞質ゾルから分離し、ドキソルビシンを両画分から実
施例６に記載したように抽出した。結果は図１３に示す。実施例８細胞毒試験９６穴プレート（６回反復）に１０³細胞／穴の濃度で播種したフォレート非
存在ＲＰＭＩ培地中のＭ１０９ＨｉＦＲ及びＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞を遊離形
、非標的化リポソーム包括形及びフォレート標的化リポソーム包括形のドキソル
ビシンに１時間曝露した。曝露後、細胞は２回洗浄し、上記の培地で更に１２０
時間インキュベートした。細胞成育アッセイについては、２．５％グルタルアル
デヒド（Ｍｅｒｃｋ）を固定剤として用い、メチレンブルー（Ｍｅｒｃｋ）染色
を行ない、自動プレートリーダーにより６２０ｎｍの吸光度測定で行なった。結
果を図１４Ａ〜１４Ｂに示した。実施例９ｉｎｖｉｖｏでの養子腫瘍成長アッセイ１０週令雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを特定の病原菌非存在施設で飼育した。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ懸濁のＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞（１０⁷細胞／ｍｌ）を遊離、リポ
ソーム包括形（Ｄｏｘｉｌ^?）又はフォレート標的化リポソーム包括形のドキソ
ルビシン１０^-5Ｍに２時間曝露し、ＰＢＳで洗浄し、そして２×１０⁷細胞を再
懸濁した。健常で、同質遺伝的なＢＡＬＢ／ｃマウスの右後部足趾に５０μｌ（
１０⁶細胞）を注入した。足趾の厚さをカリパスで週に一度か二度で５週間測定
した。３５日後、マウスはと殺し、腫瘍の最終数を記録し、対照と腫瘍接種した
足趾を踝で切断して重量を測定した。腫瘍重量を、正常と腫瘍を有する足趾の重
量差として判断した。群当たりの最終発生率における差の統計的有意差を、分割
表及びフィッシャーの直接法により分析した。結果は図１５Ａ〜１５Ｂ及び表５
に示した。

【００８６】

【発明の効果】

本発明につき特定の態様につき記述してきたが、当事者であれば本発明から逸
脱することなく種々の変更及び修正をすることができることは明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はγ−カルボキシル−結合の抱合体の構造を示している葉酸−
ＰＥＧ−ＤＳＰＥ抱合体を調製する際の合成反応スキームである；

【図２】図２は放射標識葉酸０．１μモルの濃度にて，フォレートの受容体
（M１０９Ｒ−ＨｉＦＲ）が高密度であるネズミ肺ガン細胞にある細胞フォレー
ト受容体への放射性葉酸の結合を測定するために、以下の競合剤：遊離フォレー
ト（白丸）、遊離ＰＥＧ₂₀₀₀（黒四角）又はＰＥＧ−フォレート抱合体（黒三角
）が異なる濃度で存在している状態における競争的結合試験の結果を示す；

【図３】図３Ａ−３Ｆは、本発明のもとで調製したリポソーム組成物の概要
図解である；

【図４】図４Ａ−４Bは、種々な葉酸担持リポソーム及び対照リポソーム（葉
酸配位子なし）について、フォレート受容体が高密度（Ｍ１０９−ＨｉＦＲ）と
低密度（Ｍ１０９−ＬｏＦＲ）のマウス肺ガン細胞（図４Ａ）及びフォレート受
容体が高密度（ＫＢ−ＨｉＦＲ）と低密度なヒト表皮ガン細胞（ＫＢ−ＬｏＦＲ
）への結合を示している（図４Ｂ）；

【図５】図５Ａ−５Ｄは、ローダミン標識、フォレート標的化リポソーム（
図５Ａ−５Ｂ）及び付加的ＰＥＧ鎖を有するローダミン標識したフォレート標的
化リポソーム（図５Ｃ−５Ｄ）とインキュベートしたＭ１０９−ＨｉＦＲ細胞の
共焦点顕微鏡像である；

【図６】図６Ａ−６Ｂは、ローダミン−葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀リポソーム（ＨＳ
ＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−フォレート／ＤＰＰＥ−ローダミン（９８
．９：７０：１．０：０．１））と３０分間（図６Ａ）及び５０分間（図６Ｂ）
インキュベートしたＭ１０９−ＨｉＦＲ細胞の共焦点顕微鏡像である；

【図７】図７Ａ−７Ｂは、ローダミン−葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀リポソーム及び２
ｍMの遊離フォレートと４時間（図７A）及び１９時間（図７Ｂ）インキュベート
したＭ１０９−ＨｉＦＲ細胞の共焦点顕微鏡像である；

【図８】図８Ａ−８Ｂは、ホスファチジルイノシトール−ホスホリパーゼＣ
で処理し、ローダミン−葉酸−ＰＥＧ₂₀₀₀リポソームで１時間インキュベートし
たM１０９−ＨｉＦＲ（図８Ａ）及びM１０９−ＨｉＦＲ細胞（図８Ｂ）の共焦点
顕微鏡像である；

【図９】図９Ａ〜９Ｆは、Ｍ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞（Ｍ１０９のサブ系統
で多薬物耐性として選択した）を、遊離ドキソルビシンと７分間（図９Ａ）と３
０分間インキュベート（図９Ｂ）；ドキソルビシン担持フォレート標的化リポソ
ームと２０分（図９Ｃ），６０分間（図９Ｄ）及び９０分間（図９Ｅ）インキュ
ベート；ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ被覆の非フォレート標的化リポソーム（市販ではＤ
ＯＸＩＬとして既知）と４時間（図９Ｆ）インキュベートしたときの画像である
；

【図１０】図１０Ａ〜１０ＤはＭ１０９−ＨｉＦＲ細胞を、遊離ドキソルビ
シン（図１０Ａ）又はドキソルビシン含有フォレート標的化リポソーム（図１０
Ｂ）と１時間インキュベート及び１時間遊離ドキソルビシンとのインキュベーシ
ョン後に２４時間薬物不存在培地にインキュベート（図１０Ｃ）又は１時間ドキ
ソルビシン含有フォレート標的化リポソームとのインキュベーション後に２４時
間薬剤不存在培地にインキュベート（図１０Ｄ）したときの画像である。

【図１１】図１１A〜１１Ｂは、Ｐ−糖タンパク質遮断剤であるベラパミル
の存在又は非存在下、遊離ドキソルビシン（図１１Ａ）及びドキソルビシンを伴
うフォレート標的化リポソーム（図１１Ｂ）に曝露したＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細
胞のフローサイトメトリーアッセイの結果である；

【図１２】図１２は、フォレート標的化リポソームの中に包括されたドキソ
ルビシンに、薬剤と脂質の比が１３７．６μg／μモル（黒丸）及び１１．３μg
／μモル（白丸）においてＭ１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞を曝露したときのドキソル
ビシン取り込みの速度をプロットしたものである；

【図１３】図１３は、遊離ドキソルビシン及びドキソルビシンを包含したフ
ォレート標的化リポソームとM１０９Ｒ−ＨｉＦＲ細胞を１時間及び４時間曝露
した後のドキソルビシンの蓄積を示した棒グラフであるが、蓄積量を細胞核と細
胞質ゾルにおいて定量した；

【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、Ｍ１０９−ＨｉＦＲ（図１４Ａ）及びＭ１
０９Ｒ−ＨｉＦＲ（図１４Ｂ）を遊離型のドキソルビシン（黒丸）又はフォレー
トの標的化リポソーム包含型（黒三角）又は非フォレート標的化リポソーム包含
型（黒四角）に曝露したときの細胞毒の結果を示す。

【図１５】図１５Ａは、マウスの肉趾（足裏のふくらみ）に腫瘍細胞を注射
した後、平均の肉趾のｍｍで表した厚さの時間的経過を示すが、腫瘍細胞は注射
前にｉｎｖｉｔｒｏで遊離ドキソルビシン（黒丸）、リポソーム包含ドキソル
ビシン（白四角□）又はフォレート標的化リポソーム（黒三角）で処理してある
。対照マウスは無処置腫瘍細胞（白丸○）を受けた；図１５Ｂは、図１５Ａの試験動物の３４日目における平均の肉趾腫瘍のグラ
ム重量を示すが、肉趾腫瘍重量は３４日目における肉趾重量から健康マウスの平
均肉趾重量を差引いたものとした。そして、

【図１６】図１６は、未処理（対照、白丸）又は遊離ドキソルビシンのｉｎ
ｖｉｔｒｏ処理腫瘍細胞（黒丸）、非標的リポソームに包括したドキソルビシ
ン（白四角）及びフォレート標的化リポソーム中に包含したドキソルビシン（黒
三角）を皮下注射した後の触診可能腫瘍の数をプロットで示したものである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１月１２日（２００１．１．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１４】多薬物耐性被験者のガンを治療する薬剤を製造する際に、請
求項１１〜１３のいずれかに記載の組成物の使用。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年６月２８日（２００１．６．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６７

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６８】

【表６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ガビゾン，アルバート・エイイスラエル国96920 エルサレム，ペレズ・バーンステイン・ストリート 56 (72)発明者ザリプスキー，サミュエルアメリカ合衆国カリフォルニア州94061，レッドウッド・シティ，トルーマン・ストリート 1202 (72)発明者ゴレン−ルベル，ドリトイスラエル国93389 エルサレム，ベイト・アラバ・ストリート 22 (72)発明者ホロウィッツ，アヴィヴァ・ティーイスラエル国92548 エルサレム，ニリ・ストリート８Ｆターム(参考） 4C076 AA19 AA95 CC27 CC32 CC41 EE23 EE41 EE59 FF15 FF36 GG46 4C086 AA01 AA02 EA02 EA10 FA02 MA02 MA03 MA04 MA05 MA10 NA02 NA05 NA10 NA14 ZB26 4C206 AA01 AA02 FA31 KA05 MA02 MA03 MA04 MA05 MA10 NA02 NA05 NA10 NA14 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多薬物耐性細胞に対して治療用化合物を投与する際の組成物
で、担体分子；担体分子に付着した少なくとも１つのフォレート（ｆｏｌａｔｅ）配位子；及び
担体と会合した治療用化合物を含み、そのとき前記組成物は、細胞内に細胞毒となるのに充分な量の治療用化合物の蓄
積を達成させるのに効果がある。
【請求項２】担体が天然又は合成の高分子である、請求項１に記載の組成物
。
【請求項３】担体がタンパク質又はペプチドの巨大分子である、請求項１に
記載の組成物。
【請求項４】担体は親水性高分子鎖の表面被膜を有するリポソームで、高分
子鎖の末端にフォレート配位子が付着している、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】高分子が少なくとも約３，５００ダルトンの分子量を有するポ
リエチレングリコールである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】治療用作用物質が化学療法薬である、請求項２〜５のいずれか
に記載の組成物。
【請求項７】治療用作用物質がアンスラサイクリン抗生物質である、請求項
２〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】アンスラサイクリン抗生物質がドキソルビシン、ダウノルビシ
ン、エピルビシンイダルビシン、ミトキサントロン及びアントラキノン薬から
なる群から選択したものである、請求項７記載の組成物。
【請求項９】多薬物耐性細胞に対して治療化合物を投与する際に使用する薬
剤として、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】多薬物耐性の被験者のガンを治療する薬剤を製造する際の、
請求項１〜８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１１】遊離型では細胞に蓄積しない治療用化合物を、細胞に投与す
る際に薬剤として使用する組成物で、（ｉ）遊離末端を有する親水性高分子で誘
導体化した小胞形成脂質を含む小胞形成脂質からなるリポソーム、（ｉｉ）少な
くとも当該親水性高分子鎖の部分の遊離末端に付着したフォレート配位子、及び
（ｉｉｉ）リポソームの中に包含された治療用作用物質を含む；そのとき前記組
成物は細胞に投与すると、細胞の中に細胞毒性となるのに充分な量の化合物の蓄
積を達成するのに効果的である。
【請求項１２】前記の親水性高分子が、少なくとも約３，５００ダルトンの
分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】治療用作用物質が化学療法作用物質である、請求項１１又は
請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】多薬物耐性被験者のガンを治療する薬剤を製造する際に、請
求項１１〜１３のいずれかに記載の組成物の使用。