KR20060033711A - 다-약물 내성 종양의 치료 방법 - Google Patents

다-약물 내성 종양의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

다-약물 내성 세포에 미토마이신 C를 투여하기 위한 방법 및 미토마이신 C의 독성을 감소시키기 위한 방법이 기술된다. 상기 방법에서, 미토마이신 C는 약물이 절단가능한 디티오벤질 결합을 통해 지질과 같은 소수성 부위에 약물이 결합되어 있는 프로드럭 컨쥬게이트의 형태로 제공된다. 디티오벤질 결합은 온화한 티오분해에 의해 절단되기 용이하여, 미토마이신 C가 그의 본래적 형태로 방출되도록 한다. 상기 결합은 비 환원 조건 하에서는 안정하다. 프로드럭 컨쥬게이트는 인 비보 환원 조건 내 투여를 위해 또는 외인성 환원제의 투여에 응해 리포솜 내로 함입될 수 있다.

Description

다-약물 내성 종양의 치료 방법{Method for treating multi-drug resistant tumors}
본 발명은 미토마이신 C의 세포독성 감소 방법, 및 미토마이신 C를 다-약물 내성 세포에 투여하는 방법에 관한 것이다. 미토마이신 C는 절단가능한 결합을 통해 약물에 결합된 소수성 부위로 구성된 프로드럭 컨쥬게이트의 형태로 제공된다. 보다 특히, 프로드럭 컨쥬게이트는 절단가능한 결합을 통해 약물에 결합된 지질로 구성되며, 지질은 리포솜 제제 내로 함입된다. 프로드럭 컨쥬게이트는 비변형된 상태의 미토마이신 C의 방출을 위해 인 비보에서 온화한 티올 용해 조건 하에서 절단가능하다.
미토마이신은 유방, 위, 식도 및 방광 암을 포함하는 수 개의 상이한 유형의 암에 대해 주어지는 확립된 화학요법제이다. 제제는 DNA를 교차결합시켜 작용함으로써, 암 세포가 증식할 수 없게 한다. 환자에게 정맥내로 주어질 때, 독성으로 인한 공통적인 부작용으로는 열, 오심, 구토, 골수기능억제 등이 포함된다(HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, Wilson et al., Eds., 12th Editions, Part Eleven, page 1592,1991).
화학요법과 관련된 문제는 약물 독성뿐만이 아니다. 또다른 문제는 약물 내성이다. 일부 종양 유형, 예컨대, 비소세포성 폐암 및 결장암은 일차적 내성, 즉 현재 이용가능한 통상적인 화학요법제에의 최초 노출에 대한 반응의 부재를 나타낸다. 다른 종양 유형은 수많은 약물-민감성 종양 유형에서 전개되는 획득된 내성을 나타낸다. 약물 내성 암 세포는 두 가지 유형의 획득된 약물 내성을 증명한다: 세포 저해 단일 제제 내성 또는 동일한 메카니즘 작용을 갖는 항암제의 단일 계열에 대한 내성. 두 번째 유형은 상이한 메카니즘 작용을 갖는 여럿 또는 많은 화학적으로 다른 종류의 항암제에 대해 폭넓은 내성을 갖는 세포를 포함한다. 이 두 번째 유형의 획득된 내성은 다-약물 내성으로 공지되어 있다.
다-약물 내성은 또한 일차적 내성을 나타내는 신장 및 결장 암과 같은 일부 종양 세포에서 발견된다. 즉, 획득된 다-약물 내성과는 대조적으로, 특정한 종양 유형은 많은 화학요법제로의 최초의 치료에 대해 무-반응이다.
다-약물 내성은 종종 약물 유출에 관련된 세포 표면 당단백질, P-당단백질에 대한 정상 유전자, MDR1 유전자의 증가된 발현과 종종 관련된다. P-당단백질 발현은 세포내 약물 축적에서의 감소과 상호관련된다: 즉, P-당단백질은 세포 내에 약물이 축적되는 것을 막는, 세포로부터 약물을 제거하는 에너지-의존 펌프 또는 운반 분자로서 작용한다.
P-당단백질은 정상적으로는 표피 및 내피에서 일차적으로 발현되며, 흡수 및/또는 발현에서 역할을 하는 것으로 보인다. 그것은 세포 밖으로 소수성 약물을 펌핑하여 소수성 약물의 세포질 농도 및 그에 따른 독성을 감소시키는 활동적인 운 반자이다. 정상 세포에서, P-당단백질은 독성 대사물 또는 외인성 화합물을 몸으로부터 제거하는 기능을 한다(Endicott, J. and Ling, V., Annu. Rev. Biochem., 58: 137-171, (1989)).
P-당단백질을 발현하는 암은 MDR1 유전자를 정상적으로 발현하는 조직으로부터 유도된 암, 다시 말해 간, 결장, 신장, 이자 및 부신의 암을 포함한다. 유전자의 발현은 또한 백혈병, 림프종, 유방 및 난소암, 및 많은 다른 암에서 다-약물 내성을 갖는 약물로의 화학요법의 과정 동안 발견된다. 이들 암들은 최초에는 화학요법에 반응하나, 암이 재발될 때, 암세포는 빈번히 보다 많은 P-당단백질을 발현한다. P-당단백질을 정상적으로 발현하지 않으나, 암의 진행 동안 P-당단백질 발현이 증가하는 조직으로부터 유도된 암이 있다. 한가지 예는 모세포 붕괴(blast crisis)로 진행될 때, 이전의 치료 이력에 관련없이 보다 많은 P-당단백질을 발현하는 골수 백혈병이다(Gottesman, M. M. Cancer Research, 53: 747-754 (1993)).
MDR1-코딩된 P-당단백질 펌프는 독소루비신, 다우노루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 액티노마이신 D, 파클리탁셀, 테니포사이드 및 에토포사이드와 같은 대부분의 천연 산물 항암제를 포함한 많은 다른 물질을 인지하고 운반한다(Gottesman,M. et al., Current Opinion in Genetics 및 Development, 6: 610-617 (1996)). 보다 일반적으로,다-약물 내성과 종종 연관되는 약물은 식물 또는 균류 기원의 알칼로이드 또는 항생제이며, 그들은 빈카 알칼로이드, 안트라사이클린, 에피포도필로톡신 및 닥티노마이신을 포함한다. 멜파란, 니트로젠 머스타드 및 미토마이신 C와 같은 알킬화제에 대한 교차-내성이 때때로 관찰된다 (Endicott, J. and Ling, V., Annu. Rev. Biochem., 58: 137-171, (1989)). 명확하게, 암세포에서의 다-약물 내성은 성공적인 화학요법을 제한하며, 가엾은 환자 예후를 제시한다.
리포솜은 다양한 치료 목적을 위해, 특히 리포솜의 전신 투여에 의한 표적 지역 또는 세포에 치료제를 운송하기 위해 이용되는 폐쇄 지질 소포이다. 수용성, 생체적합성 폴리머의 쇄, 특히 폴리에틸렌 글리콜의 쇄로 이식된 표면을 갖는 리포솜은 중요한 약물 담체가 된다. 이들 리포솜은 폴리머 코팅이 결실된 리포솜에 비해 연장된 혈액 순환 수명을 제공한다. 이식된 폴리머 쇄는 리포솜을 보호하거나 가려 혈장 단백질에 의한 비특이적 상호작용을 최소화한다. 역으로 이것은 리포솜이 마크로파지 및 세망내피세포계의 다른 세포에 의해 인지되지 않고 순환하도록 하므로 리포솜이 생체 내에서 처리 또는 제거되는 속도를 늦춘다. 또한, 향상된 투과성 및 잔류 효과에 기인하여(Maeda H. et al., J. Controlled Release, 65 (1-2): 271 (2000)), 리포솜은 손상 또는 확장된 맥관계의 부위, 예컨대, 종양, 염증 부위에서 축적되는 경향이 있다.
연장된 혈액 순환 시간은 전신적으로 투여된 리포솜이 표적 지역, 세포 또는 부위에 도달하도록 하기 위해 종종 요구된다. 리포솜은 전신적으로 분배된 후, 종양 지역으로 침출되어야 하므로, 예를 들어, 약 12시간 이상의 혈액 순환 수명이 종양 지역에 대한 리포솜성-치료법에 바람직하다.
다-약물 내성 세포에 의해 흡수될 수 있는 미토마이신 C 의 제제를 제공하는 것이 바람직할 것이다. 또한 요구가 있는 즉시 약물을 방출할 수 있으면서도, 긴 혈장 순환 수명을 갖고, 원하는 시간 동안 포착된 약물을 보유할 수 있는 리포솜 조성물을 제제화하는 것이 바람직하다. 또한, 감소된 전신적 독성을 가지면서도 유리 형태의 약물만큼 효과적인 미토마이신 C의 제제를 제공하는 것이 바람직하다. 나아가, 종양에서의 내생적 조건에 반응하여 세포독성적 미토마이신 C 를 방출하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 목적은 유리 형태의 약물에 비해 상대적으로 감소된 독성을 제공하고, 다-약물 내성 세포에 의해 흡수될 수 있는 미토마이신 C 의 리포솜성 제제를 제공하는 것이다. 즉, 유리 형태로 투여될 때 다-약물 내성 세포 내에 축적될 수 없는 미토마이신 C가 여기에서 기술되는 리포솜성 제제로 함입된 프로드럭 컨쥬게이트의 형태로 투여될 때 다-약물 내성 세포 내에서 축적될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 소포-형성 지질 및 하기 일반식
Figure 112005062638341-PCT00001
을 갖는 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트의 컨쥬게이트로 구성된 리포솜 조성물의 형태의 미토마이신 C를 제공하는 것을 포함하는, 미토마이신 C의 생체 내 세포독성을 감소시키는 방법을 포함한다:
여기에서, L은 리포솜성 지질 이중층 내로의 함입을 위해 적합한 소수성 부위이고, R1은 디티오벤질 부위에 공유결합적으로 결합되는 미토마이신 C 이며, CH2R1 그룹의 배향은 오르토 위치 및 파라 위치 중에서 선택된다.
한 구체예에서, 미토마이신 C는 우레탄(카바메이트) 결합에 의해 공유결합적으로 결합된다.
또다른 구체예에서, L은 콜레스테롤, 디아실글리세롤 및 인지질로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
또다른 구체예에서, 미토마이신 C는 하기 구조를 갖는 컨쥬게이트를 형성하는 디티오벤질 부위에 공유결합적으로 결합된다:
Figure 112005062638341-PCT00002
여기에서, R4는 미토마이신 C의 아지리딘 부위의 2급 아민이 디티오벤질 및 미토마이신 C 간의 우레탄 결합을 형성하는 미토마이신 C의 잔기를 나타낸다.
또다른 측면에서, 본 발명은 소포-형성 지질 및 하기 일반식
Figure 112005062638341-PCT00003
을 갖는 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트의 컨쥬게이트로 구성된 리포솜 조성물의 형태의 미토마이신 C를 제공하는 것을 포함하는, 미토마이신 C를 다-약물 내성 세포에 투여하는 방법을 포함한다:
여기에서, L은 리포솜성 지질 이중층으로의 함입에 적합한 소수성 부위이고, R1은 디티오벤질 부위에 공유결합적으로 결합된 미토마이신 C이며, CH2R1 그룹의 배향은 오르토 위치 또는 파라 위지 중에서 선택된다.
본 발명의 이들 및 다른 목적 및 특징은 본 발명의 하기 상세한 설명이 수반된 도면과 함께 읽혀질 때 보다 완전히 예측될 수 있을 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 아민-, 하이드록시- 또는 카복실-함유 약물과의 추가적 반응을 위한 파라-디아실디글리세롤-디티오벤질알콜의 제조를 위한 합성 반응도를 보여준다;
도 2a는 반응성 디아실디글리세롤-디티오벤질카보네이트에 아미노-함유 약물을 결합시키기 위한 일반적인 반응도를 보여준다 ;
도 2b는 도 2a에서 컨쥬게이트의 티오분해성 절단 후의 산물을 보여준다 ;
도 3a는 디아실디글리세롤-디티오벤질-미토마이신-C 컨쥬게이트의 제조를 위한 합성 반응도를 보여준다;
도 3b는 도 3a에서의 컨쥬게이트의 티오분해성 절단 후의 산물을 보여준다;
도 4는 콜레스테롤-디티오벤질-미토마이신-C 컨쥬게이트의 제조를 위한 합성 반응도를 보여준다;
도 5는 콜레스테롤-디티오벤질-미토마이신-C 컨쥬게이트의 제조를 위한 또다른 합성 반응도를 보여준다;
도 6a-6c는 세 개의 지질-디티오벤질-미토마이신-C 컨쥬게이트, 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신-C (도 6a), 파라-디팔미토일-DTB-미토마이신-C (도 6b) 및 오르토-디팔미토일-DTB-미토마이신-C (도 6c)의 구조를 보여준다;
도 7a-7b는 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (도 7a) 및 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (도 7b)로 구성된 리포솜에 대한 HPLC 크로마토그램이며, 여기에서 각각의 도면은 시스테인의 존재 하에서의 리포솜의 배양의 시간의 함수로서 크로마토그램의 시리즈를 보여준다;
도 8은 시스테인의 존재 하에서의 배양의 시간의 함수로서 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (폐쇄 다이아몬드) 및 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (폐쇄 원)로 구성된 리포솜으로부터 방출된 미토마이신 C의 퍼센트를 보여주는 플롯이다;
도 9A-9b는 150 μM(폐쇄 기호) 및 1.5 mM (개방 기호)의 농도의 시스테인의 존재 하에서의 배양의 시간의 함수로서 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (도 9a) 및 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (도 9b)로 구성된 피로솜으로부터 방출된 미토마이신 C의 퍼센트를 보여주는 플롯이다;
도 10은 유리 미토마이신 C (개방 삼각형), HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (폐쇄 사각형)로 구성된 리포솜, 및 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (개방 원)으로 구성된 리포솜에 대한 미토마이신 C 양(nM)의 함수로서, 약물 및 시스테인의 부재 하에서의 M109 세포의 성장률의 플롯이다;
도 11a는 미토마이신 C 농도(nM)의 함수로서, 약물 또는 시스테인의 부재 하에서의 M109 세포의 성장에 기초한 퍼센트로서 표현된 M109 세포의 성장률의 플롯이다. 유리 형태의 미토마이신 C(개방 삼각형) 및 1000μM 시스테인이 더해진 유리 형태의 미토마이신 C(폐쇄 삼각형)로 처리된 세포를 보여준다. 또한, HSPC/PEG-DSPE/지질-미토마이신 C로 구성된 리포솜 제제(개방 원) 및 150μM(개방 다이아몬드), 500μM(폐쇄 원) 및 1000μM(개방 사각형)의 농도로 첨가된 추가적인 시스테인을 갖는 리포솜 제제로 처리된 세포를 보여준다.
도 11b는 미토마이신 C 농도(nM)의 함수로서, 약물 또는 시스테인의 부재 하에서의 M109 세포의 성장에 기초한 퍼센트로서 표현된 M109 세포의 성장률의 플롯이다. 유리 형태의 미토마이신 C(개방 삼각형) 및 1000μM 시스테인이 더해진 유리 형태의 미토마이신 C(폐쇄 삼각형)로 처리된 세포를 보여준다. 또한, HSPC/PEG-DSPE/지질-미토마이신 C로 구성된 리포솜 제제(개방 원) 및 150μM(개방 다이아몬드), 500μM(폐쇄 원) 및 1000μM(개방 사각형)의 농도로 첨가된 추가적인 시스테인을 갖는 리포솜 제제로 처리된 세포를 보여준다.
도 12는 시스테인의 다양한 농도에서의 인비트로에서의 M109에 대한 유리 미토마이신 C(폐쇄 사각형), HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜(폐쇄 원) 및 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜(개방 삼각형)과 관련된 미토마이신 C의 ((IC50시스테인 무/IC50시스테인)×100)에 의해 측정된) 세포독성에서의 퍼센트 증가를 보여주는 플롯이다.
도 13a는 유리 미토마이신 C(개방 사각형), HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜(폐쇄 다이아몬드) 및 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜(폐쇄 원)의 정맥 내 주사 후 수 시간 내의 시간의 함수로서 쥐의 혈액 내에서의 미토마이신 C의 농도를 보여주는 플롯이다.
도 13b는 유리 미토마이신 C(개방 사각형), HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜(폐쇄 다이아몬드) 및 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜(폐쇄 원)의 정맥 내 주사후 수 시간내의 시간의 함수로서 쥐의 혈액 내에서의 주사된 투여량의 잔여량의 퍼센트를 보여주는 플롯이다.
도 14는 미토마이신 C (폐쇄 사각형) 또는 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C으로 구성된 리포솜 형태의 미토마이신 C (폐쇄 원)의 주사 후, 수 일 내의 시간의 함수로서, 평균 체중량(그램)을 보여주는 플롯이다.
도 15a는 비처리되거나(대조군 마우스; (폐쇄 사각형)) 유리 미토마이신 C (개방 삼각형) 또는 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C으로 구성된 리포솜 (폐쇄 원)으로 처리된 마우스의 발에서 M109 종양 세포로 접종 후 일자의 함수로서 중앙 족저 크기(median footpad size)(mm)를 보여주는 플롯이다;
도 15b는 비처리되거나(대조군 마우스; (폐쇄 사각형)) 2 mg/kg (점선) 또는 4 mg/kg (직선)의 유리 미토마이신 C (개방 삼각형), 또는 2 mg/kg (점선) 또는 4 mg/kg (직선)의 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜 (폐쇄 원)로 처리된 마우스의 발에 M109 종양 세포의 접종 후 일자의 함수로서, 중앙 족저 크기(median footpad size)(mm)를 보여주는 플롯이다;
도 16a는 비처리되거나(대조군 마우스; (폐쇄 사각형)) 6 mg/kg의 유리 미토마이신C (개방 삼각형) 또는 5일, 12일 및 19일에 주어진 3회의 투여량의 6 mg/kg의 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜(폐쇄 원, 폐쇄 다이아몬드)로 처리된 마우스의 발에서 M109 종양 세포로의 접종 후 일자의 함수로서, 중앙 족저 크기(median footpad size)(mm)를 보여주는 플롯이며, 폐쇄 다이아몬드에 의해 표현된 동물은 6-8, 14-16, 및 21-23일에 주어진 시스테인 주사를 받았다;
도 16b은 도 16a의 처리된 마우스에 대해 종양 접종 후 일자의 함수로서 4mm 미만의 족조 종양 크기를 가진 마우스의 생존 퍼센트를 보여주는 플롯이다;
도 17은 비처리된 (사각형), 6 mg/kg의 유리 미토마이신 C (삼각형)로 처리되거나, 단일 투여량 6 mg/kg의 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜으로 처리되거나(원) 6 mg/kg의 2회 투여 및 시스테인 (다이아몬드)으로 처리된 마우스에서의 C26 종양 세포의 접종 후 시간의 함수로서 생존 퍼센트를 보여주는 플롯이다 ;
도 18은 비처리된 마우스 비처리된(폐쇄 사각형), 8 mg/kg의 유리 미토마이신 C (개방 삼각형)으로 처리된, 8 mg/kg의 단일 투여량(폐쇄 원, 직선) 또는 2회 투여량(폐쇄 원, 점선)의 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜으로 처리된 마우스에서의 M109-R 종양 세포의 접종 후 시간의 함수로서 중앙 족저 크기(median footpad size)(mm)를 보여주는 플롯이다;
도 19a는 비처리된(폐쇄 사각형), 2 회의 10 mg/kg 투여량의, 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 코팅을 갖는 리포솜 내에 포획된 독소루비신(Stealth®, 개방 삼각형), 2 회의 10 mg/kg의 투여량의, HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 으로 구성된 리포솜(폐쇄 원)(시스테인 무(폐쇄 원, 직선) 또는 5mg/kg 시스테인과 함께 (폐쇄 원, 점선))으로 처리된 마우스에 대한, 종양 접종 후 일자의 함수로서 중앙값의 체중(그램)의 플롯이다 ;
도 19b는 비처리된(폐쇄 사각형), 2 회의 10 mg/kg 투여량의, 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 코팅을 갖는 리포솜 내에 포획된 독소루비신 (Stealth®;, 개방 삼각형)으로 처리된, 2 회의 10 mg/kg의 투여량의, HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C으로 구성된 리포솜(시스테인 무(직선) 또는 5 mg/kg 시스테인과 함께 (점선))으로 처리된 마우스에 대한, 종양 접종 후 일자의 함수로서 중앙값의 족저 두께의 플롯이다 ;
도 19c는 비처리된 (폐쇄 사각형), 2 회의 10 mg/kg 투여량의, 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 코팅을 갖는 리포솜 내에 포획된 독소루비신(Stealth®, 개방 삼각형), 2 회의 10 mg/kg 투여량의, HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C으로 구성된 리포솜(폐쇄 원)(시스테인 없이 (직선) 또는 5mg/kg 시스테인과 함께 (점선))로 처리된 마우스에 대한, M109R 세포의 종양 접종 후 일자의 함수로서 5mm 미만의 족저 종양을 갖는 마우스의 생존 퍼센트의 플롯이다.
발명의 상세한 설명
정의
구 "리포솜성 이중층 내로의 함입에 적합한 소수성 부위"는 리포솜성 지질 이중층의 소수성 이중층 지역과 융합될 수 있는 소수성 부분을 포함하는 임의의 물질을 의도하는 것이다. 그러한 소수성 부위는 일반적으로 인지질 및 디아실글리세롤과 같은, 소수성 지질 꼬리 및 친수성 극성 머리를 갖는 양친성 지질을 포함한 지질이다. 트리글리세리드, 스테롤, 인지질, 디아실글리세롤, 스테롤 및 트리글리세리드의 유도체 및 천연 공급원으로부터 유도되거나 인공적으로 합성된 기타 지질들 또한 예상된다.
"치료적 약물 잔기"에서의 용어 "잔기(residue)"는 약물 분자 중 적어도 하나의 원자가 결합으로부터 대체되거나 희생되는, 또다른 분자와 함께 반응하여 결합을 형성하는 약물 분자를 의도한다.
"지질-DTB-미토마이신 C"에 대한 참조는 도 6a의 화합물 XVIII이다.
본 명세서에서 "폴리펩티드"는 아미노산의 폴리머를 말하며, 특정 길이의 아미노산 폴리머를 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 용어 펩티드, 올리고펩티드, 단백질 및 효소는 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 후-발현 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다.
하기 약어가 본 명세서 내에서 사용된다: PEG, 폴리(에틸렌 글리콜) ;mPEG, 메톡시-PEG; DTB, 디티오벤질 ; DSPE, 디스테아릴 포스파티딜에탄올아민 ; HSPC, 경화 소이 포스파티딜콜린 ; MMC, 미토마이신 C.
II. 컨쥬게이트 조성물 및 제조 방법
한 측면에서, 본 발명은 하기 식의 컨쥬게이트를 포함한다:
Figure 112005062638341-PCT00004
여기에서, L은 리포솜성 지질 이중층 내로의 함입에 적합한 소수성 부위이고, R1은 디티오벤질 부위에 결합되는 치료적 약물 잔기를 나타내며, CH2R1 그룹의 배향은 오르토 위치 및 파라 위치 중에서 선택된다. 소수성 부위, L은 일반적으로 디아실글리세롤, 스테롤, 인지질과 같은 지질, 이들 지질의 유도체, 기타 천연 발생 지질 및 그들의 합성 유사체이다.
컨쥬게이트에서, 치료적 약물은 공유 결합에 의해 디티오 벤질 부위에 결합되어, 상기 구조식에서 R4로 표현되는 약물 잔기를 형성한다. 결합은 약물 및 반응 화학에 따라 결정될 것이며, 이는 당업자에 의해 예측될 것이다. 바람직한 구체예에서, 치료적 약물은 우레탄, 아민, 아미드, 카보네이트, 티오-카보네이트, 에테르 및 에스테르로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 결합에 의해 디티오벤질 부위에 공유결합적으로 결합된다.
우레탄 결합은 O(C=O)NH-R4 또는 O(C=O)N=R4(R4는 치료적 약물 잔기를 나타낸다)의 형태를 취한다. 예를 들어, 미토마이신 C, 미토마이신 A, 블레오마이신 및 몇몇 명명한 치료적 폴리펩티드와 같은 일급 또는 이급 아민을 함유하는 약물은 반응하여 약물 내의 아민 부위와 우레탄 결합을 형성한다.
카보네이트 결합은 O(C=O) O-R4(R4는 치료적 약물 잔기를 나타낸다)의 형태를 취하고, 카보네이트 결합은 약물 내의 페놀 또는 알콜 또는 하이드록실 부위로부터 유도된다. 티오-카보네이트는 O(C=O)S-R4(R4는 치료적 약물 잔기를 나타낸다)의 형태를 취하며, 결합은 약물 내의 부위로부터 유도된다.
카보네이트 결합을 형성하는 디티오벤질 알콜과의 반응을 위해 그러한 적합한 부위를 갖는 예시적 약물은 플루오로데옥시우리딘, 아이오도데옥시우리딘, 에토포사이드, AZT, 아시클로비르, 비다라빈, 아라비노실 사이토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 미토잔트론 및 아트로핀을 포함한다.
에스테르 결합은 O(C=O)-R4(R4는 치료적 약물 잔기를 나타낸다)의 형태를 취한다. 결합은 치료적 약물 내의 카복실산 부위와의 반응으로부터 유도되며, 클로람부실 및 디티오벤질 간의 에스테르 결합을 갖는 컨쥬게이트의 예는 하기 기술된다. 메토트레세이트는 컨쥬게이트의 디티오벤질 부위와 함께 에스테르 결합을 형성할 수 있는 약물의 또다른 예이다.
약물을 디티오벤질 부위에 결합시키는 우레탄, 카보네이트 또는 에스테르 결합을 갖는 컨쥬게이트는 하기 구조에 의해 일반적으로 표현될 수 있다:
Figure 112005062638341-PCT00005
여기에서, R4는 치료적 약물 잔기를 나타낸다.
한 구체예에서, 컨쥬게이트는 O-R4(R4는 치료적 약물 잔기를 나타낸다)의 형태를 취하는 에스테르 결합을 포함한다. 결합은 일반적으로 약물 상의 알콜 기능기와의 반응으로부터 유도된다.
아민 결합은 N=R4(R4는 치료적 약물 잔기를 나타낸다)의 형태이며, 결합은 약물 내의 N을 갖는 디티오벤질의 CH2 부위와의 직접 결합이다. 아민 결합이 형성된 약물 5-플로오로우라실을 갖는 컨쥬게이트가 한 가지 예이다(U.S. 특허 제. 6,342,244호). 아미드 결합은 또한 아스파트산 또는 글루탐산과 같은 아미노산 잔기의 유기 카복실이 디티오벤질아민과 응축되는 치료제로서의 펩티드로 형성될 수 있다.
아미드 결합은 NH (C=O)-R4(R4는 치료적 약물 잔기를 나타낸다)의 형태를 취한다.
도 1은 본 발명에 따른 예시적 컨쥬게이트의 제조를 위한 합성반응도를 보여준다. 이 구체예에서, 중간체 화합물, 파라-디아실디글리세롤디티오벤즈알콜 (화합물 IV)의 합성은 선택된 치료적 약물과의 추가적 반응을 위해 제조된다. 화합물 IV는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 3-머캅토-1,2-프로판디올 (화합물 I)을 과산화수소와 반응시켜 rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디올) (화합물 II)를 형성함으로써 제조된다. Rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디올)는 소수성 부위 R로 아실화된다. 예를 들어, R은 약 8 내지 약 24개의 탄소원자를 갖는 지방산일 수 있다. 실시예 1은 R이 스테아르산인 반응 과정을 상술한다. 또다른 구체예에서, R은 약 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방산이다. 화합물 II의 아실화는 Rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디스테아로일) (화합물 III)을 수득하며, 이는 설푸릴 클로라이드 및 4-머캅토벤즈알콜과 반응하여 원하는 중간체 화합물, 파라-디아실디글리세롤-디티오벤즈알콜 (화합물 IV)을 형성한다. 화합물 IV는 또한 신속히 반응성 카복실 부위(R'CO2H)를 함유하는 약물과 반응하여 약물이 에스테르 결합을 통해 DTB에 결합되어 있는 지질-디티오벤질 (DTB)-약물 컨쥬게이트를 형성한다(화합물 V). 화합물IV는 또한 신속히 반응성 아민 부위 (R'-NH2)를 함유하는 약물과 반응하여 약물이 우레탄 결합을 통해 DTB에 결합되어 있는 지질-DTB-약물 컨쥬게이트를 형성한다 (화합물 VI). 화합물 IV는 또한 신속히 반응성 하이드록실 부위 (R'OH)를 함유하는 약물과 반응하여 약물이 카보네이트 결합을 통해 DTB에 결합되어 있는 지질-DTB-약물 컨쥬게이트를 형성한다(화합물 VII).
다양한 약물이 본 발명의 컨쥬게이트 내에서의 사용을 위해 고려된다. 특히, 본 발명은 반응에 적합한 아민 (NH 또는 NH2), 카복실, 설피드릴 또는 하이드록실 부위를 갖는 약물을 고려한다. 여기에서 사용된, "반응에 적합한"은 약물이 예를 들어 디티오벤질 알콜의 형태의, 디티오벤질 부위와 반응할 수 있는 열거된 부위 중 하나를 갖는 것을 의미한다. 예시적 약물은 반응에 적합한 NH 그룹을 갖는 5-플루오로우라실, 반응성 가콕실을 갖는 클로람부실 및 반응성 아민(아지리딘 그룹)을 갖는 미토마이신 C를 포함한다. 5-플루오로우라시오 및 클로람부실을 이용한 컨쥬게이트의 합성은 U.S. 특허 제6,365,179호에서 기술되며; 미토마이신 C를 이용한 컨쥬게이트의 합성은 도 2-6과 관련하여 논의된다. 사용을 위해 고려되는 다른 예시적 약물은 미토마이신 C, 미토마이신 A, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 플루오로데옥시우리딘, 아이오도데옥시우리딘, 에토포사이드, AZT, 아시클로비르, 비다라빈, 아라비노실 사이토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 아트로핀, 클로람부실, 메토트레세이트, 미토잔트론 및 5-플루오로우라실을 포함한다. 폴리펩티드, 아미노글리코사이드, 알카노이드 모두 본 발명에서의 사용을 위해 적합하다는 것이 예상될 것이다.
실시예 1은 또한 컨쥬게이트를 형성하기 위한 중간체 화합물로서 제공될 수 있는 오르토-디아실디글리세롤디티오벤즈알콜의 제조를 위한 반응 조건을 상술한다.
도 2a-2B는 지질-DTB-약물 컨쥬게이트의 제조 (도 2a), 및 환원제의 존재 하에서의 컨쥬게이트의 티오분해성 절단(도 2b)을 보여준다. 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 소수성 부위 R이 스테아르산 (CH3(CH2)16CO2H)과 같은 지방산 R"(CO)OH로부터 유도된 도 1의 화합물 VII은 포스젠(COCl2)의 존재 하에서 아민-함유 약물, H2N-약물과 반응한다. 이 반응은 도 2a에 표현된 지질-DTB-약물 컨쥬게이트를 수득한다. 환원 조건, 즉 시스테인 또는 글루타티온과 같은 환원에에 노출 시 컨쥬게이트는 분해되어 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같은 산물을 수득하게 한다. 볼 수 있는 바와 같이, 컨쥬게이트의 티오분해성 반응은 변형없는 자연 상태로 약물의 재형성을 만들어 낸다. 이는 하기에서 볼 수 있는 바와 같이 컨쥬게이트 내의 약물이 대상에게 인 비보 투여를 위해 신속하게 리포솜 내로 함입될 수 있으므로 바람직한 특성이다. 추가로, 컨쥬게이트 형태의 약물은 하기에서 볼 수 있는 바와 같이 독성적이지 않다. 투여 후, 그리고 내생적 환원제에의 노출 또는 외생적 환원제에의 노출시, 컨쥬게이트는 분해되어 자연 상태로의, 생물학적 활성을 갖는 약물을 수득하게 한다.
도 3a는 미토마이신 C 프로드럭 컨쥬게이트의 합성을 보여준다. 반응도에서, 반응성 아민 부위를 함유하는 약물인 미토마이신 C (화합물 XVII, 도 3b)는 포스젠의 존재 하에서 파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜 (화합물 IV)과 반응하여 디아실디글리세롤-디티오벤질-미토마이신-C 컨쥬게이트 (화합물XVIII)를 형성한다. 합성의 자세한 것은 실시예 2에서 제공된다.
도 3b는 디아실디글리세롤-DTB-미토마이신-C 컨쥬게이트의 티오분해성 분해물을 보여준다. 환원제의 존재 하에서, 컨쥬게이트는 분해되어 미토마이신 C (화합물 XVII) 및 기타 산물을 재형성한다.
상기 나타낸 바와 같이, 컨쥬게이트 내의 소수성 부위는 임의의 수의 소수성 부위, 에컨대, 지질로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 디아실디글리세롤 지질이 하기 구조를 갖는 컨쥬게이트를 형성하기 위해 이용될 수 있다:
Figure 112005062638341-PCT00006
여기에서 R2 및 R3는 약 8 내지 약 24개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소이다.
소수성 부위로서 디아실글리세롤에 추가로, 다른 지질들이 고려된다. 도 4 는 컨쥬게이트 내의 소수성 부위로서 콜레스테롤이 이용된 또다른 구체예를 보여준다. 콜레스테롤 (화합물 XIV)은 트리메틸아민(TEA)의 존재 하에서 메탄설포닐클로라이드 이디클로로메탄과 반응한다. 그 후 생성된 중간체를 티올 유도체, 마지막으로 주된 디티오벤질 알콜 전환시키고, 이를 이용하여 디아실글리세롤에 대해 상기 기술된 바와 같은 유사한 방식으로 미토마이신 C에 결합시킨다.
콜레스테롤-DTB-미토마이신-C 컨쥬게이트의 제조를 위한 대안적인 반응도를 도 5에서 볼 수 있다. 메톡시카보닐디티오에틸 아민을 콜레스테롤 클로로포메이트와 직접 반응시켜 우레탄 결합을 형성시킨다. 그 후, 머캅토벤질알콜을 이용하여 DTB-콜레스테롤 화합물을 얻는다. 미토마이신 C는 상기 설명 및 실시예 2에서와 같이 결합된다.
하기 기술된, 본 발명을 지지하여 수행된 연구에서, 도 3a에서 기술된 바와 같이 제조된 컨쥬게이트, 화합물 XVII, 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C가 이용되었다. 참조의 용이성을 위해, 이 컨쥬게이트를 도 6a에서 보여준다. 디팔미토일 지질과 같은 다른 디아실 지질들이 이용될 수 있음을 예상할 수 있을 것이며, 도 6b는 파라-디팔미토일-DTB-미토마이신 C 컨쥬게이트를 보여준다. 컨쥬게이트가 또한 이성체 결합을 가질 수 있음을 또한 예상할 수 있을 것이다. 이는 도 6c에서 볼 수 있는 오르토-디팔미토일-DTB-미토마이신 C 컨쥬게이트에 의해 명백하다.
III. 컨쥬게이트를 포함하는 리포솜의 제조
본 발명의 방법에 있어서, 미토마이신 C 프로드럭 컨쥬게이트는 소포-형성 지질 및 미토마이신 C 프로드럭 컨쥬게이트로 구성된 리포솜 조성물의 형태로 제공된다. 리포솜은 다양한 치료적 목적을 위해 이용되는, 특히 리포솜의 전신적 투여에 의한 표적 지역 또는 세포에 치료제를 운반하기 위해 이용되는 폐쇄 지질 소포이다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 친수성 폴리머 쇄로 코팅된 표면을 갖는 리포솜은 폴리머 코팅을 갖지 않는 리포솜에 비해 연장된 혈액 순환 수명을 제공하기 때문에 약물 담체로서 바람직하다. 폴리머는 혈액 단백질에 대한 장벽으로 작용함으로써 마크로파지 및 세망내피계의 다른 세포들에 의한 흡수 및 제거에 대한 단백질의 결합 및 리포솜의 인지를 방해한다.
본 발명에 따른 리포솜은 한 구체예에서 소포-형성 지질인, 지질과 배합된 컨쥬게이트 및 임의로 다른 이중층 성분을 포함한다. "소포-형성 지질"은 물 속에서 자발적으로 이중층 소포를 형성하는 지질이다. 소포-형성 지질은 바람직하게는 두 개의 탄화수소 쇄, 일반적으로 아실 쇄, 및 극성 머리 그룹을 갖는다. 두 개의 탄화수소 쇄가 일반적으로 약 12 내지 약 24개의 탄소 원자 길이이고 다양한 정도의 불포화도를 갖는, 당업계에 공지된 다양한 합성 소포-형성 지질 및 천연-발생 소포-형성 지질이 있다. 그 예는 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파디드산 (PA), 포스파티딜이노시톨(PI), 및 스핑고미엘린(SM)과 같은 인지질을 포함한다. 본 발명에서의 사용을 위해 바람직한 지질은 경화 소이 포스파티딜콜린 (HSPC)이다. 지질의 또다른 바람직한 패밀리는 디아실글리세롤이다. 이들 지질은 상업적으로 얻거나 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
소포-형성 지질은 혈청 내에서의 리포솜의 안정성을 조절하기 위한, 그리고 리포솜 내에 포획된 제제의 방출을 조절하기 위한 유동성 또는 강도의 정도를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 보다 단단한 지질 이중층 또는 액체 결정 이중층을 갖는 리포솜은 상대적으로 단단한 지질, 예컨대 상대적으로 높은 상 전이 온도, 예컨대 약 80℃이상의 온도를 갖는 지질의 함입에 의해 제조될 수 있다. 단단한 지질, 즉, 포화된 지질은 지질 이중층 내에서의 보다 큰 막 강도에 기여할 수 있다. 콜레스테롤과 같은 다른 지질 성분 또한 지질 이중층 구조 내의 막 강도에 기여하는 것으로 알려져 있다.
지질 유동성은 상대적으로 액상인 지질, 일반적으로 액체-결정 상 전이 온도, 예컨대, 실온 또는 그 미만의 온도에(약 20-25℃) 상대적으로 낮은 액체를 갖는 지질 상을 갖는 것의 함입에 의해 달성된다.
리포솜은 스테롤과 같은 지질 이중층 내로 함입될 수 있는 다른 성분을 또한 포함할 수 있다. 이들 다른 성분은 밀반적으로 내부와 접촉하는 소수성 부위, 이중층 막의 소수성 지역 및 외부 배양의 극성 머리 그룹 부위, 막의 극성 표면을 갖는다.
본 발명의 리포솜 내의 또다른 지질 성분은 친수성 폴리머로 유도된 소포-형성 지질이다. 이 지질 성분에서, 유도된 지질은 내부 및 외부 지질 이중층 표면 모두에서 친수성 폴리머 쇄로 코팅된 표면의 형성을 만든다. 일반적으로, 약 1-20 몰 퍼센트의 유도된 지질이 지질 조성물 내에 포함된다.
소포-형성 지질로의 유도에 적합한 친수성 폴리머는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필옥사졸린, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리하이드록시프로필 메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 폴리에틸렌글리콜, 및 폴리아스파트아미드를 포함한다. 폴리머는 호모폴리머 또는 블록 또는 랜덤 코폴리머로서 이용될 수 있다.
바람직한 친수성 폴리머 쇄는 바람직하게는 약 500 내지 약 10,000 달톤, 바람직하게는 약 1,000 내지 약 5,000 달톤의 분자량을 갖는 PEG 쇄로서의 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이다. PEG의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체 또한 바람직한 친수성 폴리머이다. 이들 폴리머는 다양한 폴리머 크기, 예컨대 약 12 내지 약 220,000 달톤의 폴리머 크기로 상업적으로 입수가능하다.
본 발명의 리포솜은 일반적으로 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트, 바람직하게는 약 5 내지 약 30 몰 퍼센트, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 20 몰 퍼센트의 지질-DTB-약물 컨쥬게이트를 포함한다. 본 발명을 지지하여 수행된 연구에서, 소포-형성 지질 경화 소이(soy) 포스파티딜콜린 (HSPC), 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG-DSPE)으로 유도된 디스테아릴 포스파티딜에탄올아민 및 도 6a의 컨쥬게이트, 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C (화합물 XVIII)로 구성된 리포솜이 실시예 4A-4B에서 기술된 바와 같이 제조된다. 리포솜 제제 중 하나는 60/30/5/5의 몰비율을 나타내는 지질HSCP/콜레스테롤/mPEG-DSPE/파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C (화합물 XVIII)과 함께 콜레스테롤을 포함했다 (실시예 4A). 콜레스테롤을 함유하고 있지 않은 두번째 제제가 제조되고 특징화되었다(실시예 4B). 이 제제에서, 지질HSCP/mPEG-DSPE/파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C (화합물 XVII)는 90/5/5의 몰비율을 나타내었다.
IV. 컨쥬게이트를 함유하는 리포솜의 인 비트로 특성
A. 인 비트로 약물 방출
리포솜은 실시예 4A-4B에 기술된 바와 같이 제조되었으며 환원제에의 노출 후 미토마이신 C의 방출률을 측정하기 위해 인비트로에서 특성화되었다. 인 비트로 연구에 대해, 환원 조건은 일반적으로 시험 매질에 대해 약 150μM의 농도의 시스테인의 첨가에 의해 유도된다. 인 비보에서, 내생적 환원 조건은 약물의 방출을 위한 지질-DTB-약물 컨쥬게이트의 티오분해성 분해물에 영향을 주기에 충분할 것임을 예상할 수 있을 것이다. 추가로 인비보에서의 환원 조건이 시스테인 또는 글루타티온과 같은 적합한 환원제의 투여에 의해 인공적으로 유도될 수 있음이 고려될 것이다.
리포솜 제제, 예컨대, HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/컨쥬게이트 화합물 XVI I I (이하, "콜레스테롤-함유 제제") 및 HSPC/mPEG-DSPE/컨쥬게이트 화합물 XVIII (이하 "콜레스테롤-비함유 리포솜 제제")를 24 시간 동안 150μM 시스테인의 존재 하에서 37 ℃에서 배양했다. 샘플을 선택된 시점에서 취하고, 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석을 수행하여 컨쥬게이트 및 유리 미토마이신 C의 약을 정량했다. HPLC 조건은 실시예 5에서 기술된다.
도 7a-7b는 두 개의 리포솜 제제에 대한 HPLC 크로마토그램을 보여준다. 도 7a에서는, 콜레스테롤-무함유 리포솜에 대한 결과를 보여준다. 시간 0에서, 유리 미토마이신 C은 탐지되지 않았으며, 모든 측정가능한 약물은 리포솜 결합된 지질-DTB-약물 컨쥬게이트였다. 배양 시간이 증가함에 따라, 리포솜으로부터 방출되고 유리 형태로 탐지가능한 미토마이신 C의 양이 증가하였으며, 컨쥬게이트-결합 미토마이신 C의 존재는 상응하는 감소를 나타냈다.
도 7b는 콜레스테롤을 함유하는 리포솜 제제에 대한 결과를 보여준다. 시간 0에서 취한 첫번째 샘플에서, 탐지가능한 유리 미토마이신 C는 없었다. 배양 1시간 후 150 μM 시스테인에서, 리포솜-결합 지질-DTB-미토마이신 컨쥬게이트의 분해물을 나타내는 적은 양의 유리 약물이 탐지되었다. 도 7a과의 비교에서, 콜레스테롤을 함유하는 리포솜은 더 늦은 컨쥬게이트 분해율 및 그에 따른 약물의 더 느린 방출을 얻게 했다.
도 8은 도 7a-7b의 크로마토그램으로부터 측정된, 두 개의 리포솜으로부터 방출된 미토마이신 C의 퍼센트를 보여주는 플롯이다. 콜레스테롤-무함유 리포솜 (폐쇄 다이아몬드)은 콜레스테롤을 함유하는 리포솜(폐쇄 원)보다 더 높은 방출율을 갖는다. 50% 이상의 미토마이신 C가 콜레스테롤-무함유 제제에 대해 2 시간 후 리포솜-결합 컨쥬게이트로부터 방출되었다. 이들 모두의 제제에 대해, 80% 이상의 약물이 24시간 배양 기간의 끝에서 방출되었다.
또 다른 연구에서, 두 개의 리포솜 제제는 1.5 mM 시스테인 중에서 배양되었다. 실시예 5에 기술된 바와 같은 분석이 수행되었으며, 결과는 도 9a-9b에서 보여준다. 도 9a는 콜레스테롤-무함유 리포솜 (HSPC/PEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C) 내로 함입된 지질-DTB-약물 컨쥬게이트로부터 방출된 미토마이신 C의 퍼센트를 보여준다. 150μM로의 배양 동안의 퍼센트 방출 또한 비교를 위해 보여준다(폐쇄 다이아몬드). 볼 수 있는 바와 같이, 환원제의 더 높은 농도에서의 배양(1.5 mM, 개방 다이아몬드)는 컨쥬게이트 분해의 속도 및 약물 방출의 속도에서의 증가를 일으킨다.
도 9b는 콜레스테롤을 함유하는 리포솜 제제에 대한 결과를 보여준다. 1.5 mM (개방 원)에서 배양된 리포솜은 150μM 시스테인 (폐쇄 원)에서 배양된 동일한 리포솜 보다 유의하게 더 높은 분해 속도를 갖는다.
B. 인 비트로 세포독성
지질-DTB-미토마이신 C 컨쥬게이트 (화합물 XVIII)을 함유하는 리포솜의 인 비트로 세포 독성을 마우스 암종주인 M-109 세포를 이용하여 측정하였다. 실시예 6에서 기술된 바와 같이, M109 세포를 유리 미토마이신 C 또는 디스테아로일-DTB-미토마이신 C 컨쥬게이트를 함유하는 리포솜의 존재 하에서 배양했다. 실시예 6A에특정된 몰 비율을 갖는 실시예 4A-4B에 기술된 바와 같이 제조된 리포솜을 시험했다. 150μM, 500 μM 및 1000 μm의 농도의 시스테인을 컨쥬게이트의 티오분해성 분해 및 미토마이신 C의 방출에 영향을 주기 위해 시험 세포의 일부에 첨가했다.
IC50 수치는 실시예 6에서 기술된 바와 같이 대조군 성장율의 50% 저해를 야기하는 약물의 농도로 택했다(IC50). 결과는 표 1에서 볼 수 있다.
표 1
Figure 112005062638341-PCT00007
세포독성 연구로부터 결정된 M109 마우스 암종 세포의 퍼센트 성장률은 도 10에서 볼 수 있다. 퍼센트 성장률은 미토마이신 C 및 시스테인의 부재 하에서의 M109 세포의 성장률에 기초한 퍼센트로서 나타내며, 미토마이신 C 농도(nM)의 함수로서 보여진다. 세포의 성장률은 실시예 6에서 기술된 바와 같이 측정된다. 볼 수 있는 바와 같이, 세포 성장률의 퍼센트는 콜레스테롤 함유 리포솜 (개방 원) 및 콜레스테롤-무함유 리포솜 제제(폐쇄 사각형) 둘 다에 대해 증가됨에 따라 감소한다. 시스테인이 유리 미토마이신 C의 활성에 영향을 미치지 않으며, 미토마이신 C는 컨쥬게이트로부터 방출되어 효과적으로 세포 성장을 저해함을 또한 볼 수 있다.
유리 형태의 미토마이신 C 또는 리포솜-결합 지질-DTB-약물 컨쥬게이트의 형태의 미토마이신 C로 처리된 M109 마우스 암종 세포의 인 비트로 성장율은 도 11a-11b에서 볼 수 있다. 도 11a에서는, 콜레스테롤 무함유 리포솜 제제에 대한 결과를 보여준다. 플롯에서, M109 세포의 성장률은 미토마이신 C 및 시스테인의 부재 하에서의 M109 세포의 성장에 기초한 퍼센트로서 나타내며, 미토마이신 C 농도(nM)의 함수로서 보여진다. 유리 형태의 미토마이신 C(개방 삼각형) 및 유리 형태의 미토마이신 C + 1000μM 시스테인 (폐쇄 삼각형)로 처리된 세포는 유리 형태의 약물의 독성에 기인하여 성장률에서 감소를 나타내었다. HSPC/PEG-DSPE/DSPE-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜 제제 (개방 원) 및 150 μM (개방 다이아몬드), 500 μM (폐쇄 원) 및 1000μM (폐쇄 사각형)의 농도로 추가적인 시스테인이 첨가된 리포솜 제제로 처리된 세포는 시스테인-투여량 의존 방식으로 세포 독성을 나타냈다.
도 11b는 콜레스테롤 함유 리포솜 제제에 대한 유사한 플롯이다. 동일한 패턴이 콜레스테롤 + 150 μM (개방 다이아몬드), 500 μM (폐쇄 원) 및 1000 μM (폐쇄 사각형) 농도의 추가 시스테인을 함유하는 리포솜 조성물로 처리한 세포에 대해 관찰되었다. 즉, 시스테인 농도가 증가함에 따라, 세포 성장율이 감소되었다. 이는 시스테인 농도과 직접 상호연관된 미토마이신 C의 시스테인-유도 방출을 나타낸다. 리포솜 제제와는 대조적으로, 유리 형태의 미토마이신 C로 처리된 세포(개방 삼각형)의 인 비트로 성장율은 유리 형태의 미토마이신 + 1000 μM 시스테인으로 처리된 세포 (폐쇄삼각형)의 성장율과 동일했다.
도 12는 유리 미토마이신 C 및 리포솜 제제의 시스테인 농도(μM)의 함수로서, 세포독성에서의 퍼센트 증가를 보여준다. 세포독성에서의 증가는 IC50, 예컨대, 시스테인의 부재 하에서의 IC50에 대한 시스테인 존재 하에서의 IC50 곱하기 100 ( (IC50시스테인 무/IC50시스테인) x 100))에서의 퍼센트 하락에 의해 측정된다. 볼 수 있는 바와 같이, 세포독성의 퍼센트는 시스테인 농도가 콜레스테롤 함유 리포솜 (개방 삼각형) 및 콜레스테롤-무함유 리포솜 제제 (폐쇄 원) 모두에 대해 증가함에 따라 유의하게 증가한다. 유리 미토마이신 C의 세포독성 (폐쇄사각형)은 시스테인의 존재에 의해 영향을 받지 않았다.
세포독성 데이타는 콜레스테롤-무함유 리포솜 제제가 시스테인에 의해 보다 영향을 받는다는 것을 보여준다. 특정 시스테인 농도에서 콜레스테롤-무함유 리포솜의 IC50은 유리 약물 단독의 것에 비해 단 2배 더 낮다.
콜레스테롤 함유 리포솜 제제는 콜레스테롤-무함유 리포솜 제제보다 세포독성이 낮다. 데이타는 또한 시스테인이 종양세포의 세포독성 영향을 갖지 않으며, 유리 미토마이신 C의 세포독성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 시스테인이 투여량-의존 방식으로 리포솜-결합 미토마이신 C의 세포독성을 증가시킨다는 것 또한 데이타로부터 명백하다. 따라서, 리포솜성 제제에 대해 관찰된 세포독성 효과는 지질-DTB-약물 컨쥬게이트로부터의 미토마이신 C의 시스테인-매개 방출에 의한 것이 대부분을 차지하였다.
C. 인 비보 약동학
콜레스테롤 함유 리포솜 및 콜레스테롤-무함유 리포솜 제제의 인 비보 약동학을 래트에스 측정하였다. 실시예 7에 기술된 바와 같이, 동물들을 유리 형태 또는 본 발명에 따른 지질-DTB-미토마이신 C 컨쥬게이트의 형태의 리포솜 내로 함입된 대략 0.1mg/mL의 미토마이신 C의 단일 볼루스 정맥내 주사로 처리했다. 주사 후, 혈액 샘플을 채취하고 미토마이신 C의 양을 분석했다. 결과는 도 13a-13B에서 볼 수 있다.
도 13a는 정맥 주사 후 수 시간 동안 시간의 함수로서 래트의 혈액에서의 미토마이신 C의 농도(㎍/mL) of 미토마이신 C를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 유리 형태로 정맥적으로 투여된 유리 미토마이신 C (폐쇄 사각형)는 신속하게 혈액으로부터 사라졌다. 리포솜-결합 지질-DTB-약물 컨쥬게이트 형태의 미토마이신 C는 실질적으로 더 긴 시간 동안 순환에서 남아있다. 콜레스테롤 함유 리포솜 (폐쇄다이아몬드) 및 콜레스테롤-무함유 리포솜 (폐쇄 원)과 연관된 미토마이신 C는 20-25 시간 동안 10 ㎍/mL 이상으로 혈액 내에서 탐지되었다.
도 13b는 시험 제제의 정맥 주사 후 수 시간 내의 시간의 함수로서 혈액 내에 남아있는 주사된 투여량의 퍼센트를 보여준다. 유리 미토마이신 C (폐쇄 사각형)의 투여량은 약 5분 이상의 시점에서 혈액 중에 실질적으로 거의 남이있지 않다. 그러나, 리포솜 제제의 주사 후 20 시간에서, 미토마이신 C의 투여량의 약 15-18 퍼센트가 순환 중에 남아 있다. 이는 미토마이신 C-DTB-지질 컨쥬게이트가 순환 동안 리포솜 내에서 안정하고, 최소의 티오분해성 절단이 혈장 내에서 발생한다는 것을 나타낸다.
그러므로, 이 시스템은 연장된 혈액 순환 수명 및 암에서의 향상된 축적을 갖는 장기간-순환하는 리포솜(Stealth® 리포솜)과 경쟁할만한 것으로 나타난다.
약물이 약물-DTB-지질 프로드럭 컨쥬게이트의 형태의 리포솜 내로 함입될 때 미토마이신 C의 독성에서의 감소는 도 14에 나타나있다. 리포솜은 90/5/5의 몰 비율의 HSPC, mPEG-DSPE 및 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C로 구성되었다(상기 기술된 콜레스테롤-무함유 제제). 세 개의 10 mg/kg 투여량의 리포솜을 암컷 Balb/c 마우스 내에 10 mg 약물/kg의 투여량으로 주사했다. 대조군 동물은 10 mg/kg의 투여량의 유리 미토마이신 C를 받았다. 동물의 체중을 도 14에서 볼 수 있는 바와 같이 시험 물질의 투여 후 3, 7, 및 11일에 측정하였다. 유리 형태의 미토마이신 C로 처리된 동물은 유의한 체중량 감소를 보였고, 시험 11일 경과 후 생존에 실패하였다. 리포솜 내로 함입된 프로드럭 컨쥬게이트 형태의 미토마이신 C를 받은 동물들은 체중량의 최소 감소를 보였으며, 모든 동물들이 시험 19일에 생존하였다.
다른 연구에서, 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조된 리포솜은 두 개의 아무스 암종 모델에서 시험되었다 : 종단점으로서 종양 크기를 갖는 M109 족저 접종 방식 및 종단점으로서 생존율을 갖는 C26 복막내 종양 모델. 시험 마우스를 종양 세포 (실시예 8)로 접종하고, 뒤이어 유리 미토마이신 C 또는 리포솜 내로 함입된 프로드럭 컨쥬게이트 형태의 미토마이신 C를 처리했다.
도 15a에서 표현된 연구에 대해, 종양 접종(M109 종양 세포) 7일 후, 마우스를 2 mg/kg의 투여량의 시험 화합물로 정맥적으로 처리했다. 두번째 정맥내 투여량은 종양 접종 13일 후 주어졌다. 족저 크기는 정해진 간격으로 측정되었다. 비처리된 대조군 마우스 (폐쇄 사각형) 및 유리 미토마이신 C (개방 삼각형) 또는 리포솜성 제제(HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C; 폐쇄 원)로 처리된 동물에 대한 결과는 도 15a에서 볼 수 있다. 비처리된 대조군 동물의 종양 크기는 시험 기간이 경과함에 따라 계속적으로 증가했다. 리포솜 내로 함입된 프로드럭 컨쥬게이트의 형태의 미토마이신 C로 처리된 동물에 대한 더 작은 족저 크기에 의해 명백한 바와 같이, 미토마이신 C로 처리된 동물은 더 느린 종양 성장을 겪었고, 리포솜성 제제는 유리 형태의 미토마이신 C에 상대적으로 더 높은 효능을 제공하였다.
도 15b는 2 mg/kg 및 4 mg/kg의 투여량의 미토마이신 C로의 유사한 연구로부터의 결과를 보여준다. 중앙 족저 크기(mm)를 마우스의 발에 M109 종양 세포의 접종 후 일자의 함수로서 측정하였다. 비처리된 마우스(대조군 마우스; (폐쇄 사각형))는 중앙 족저 두께에서 계속적인 증가를 보였다. 7, 14 및 21일에 유리 미토마이신 C (개방 삼각형) 2 mg/kg (점선) 또는 4 mg/kg (직선)로, 또는 7, 14 및 21일에 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜 (폐쇄 원) 2 mg/kg (점선) 또는 4 mg/kg (직선)로 처리된 마우스는 상응하는 투여량에서 유사한 종양 성장 프로파일을 보였다. 그러나, 유리 형태의 미토마이신 C로 처리된 동물은 낮은 생존률을 보였으며, 4 mg/kg 투여량의 유리 미토마이신 C이 주어진 동물에서는 80%의 독성 치사율을 보였다. 따라서, 리포솜 내로 함입된 프로드럭-컨쥬게이트의 형태로 투여된 미토마이신 C가 낮은 독성으로 유리 약물과 유사한 효능을 제공한다. 또다른 연구에서, 리포솜성 제제 상의 외생적 시스테인의 공투여의 효과를 평가하였다. 마우스를 M109 종양 세포로 접종하고, 비처리하거나 유리 약물 형태 또는 리포솜성-프로드럭 컨쥬게이트 형태의 6 mg/kg 미토마이신 C를 접종 5일 후 처리하였다. 6 mg/kg 리포솜성 프로드럭의 처리는 12일 및 19일에 반복되었다. 유리 MMC로의 처리는 마우스가 6 mg/kg의 1회 이상의 주사를 견딜 수 없었기 때문에 반복하지 않았다. 리포솜성-프로드럭으로 처리된 시험 마우스의 한 그룹은 또한 5mg/마우스의 시스테인을 받았다. 결과는 도 16a-16B에서 볼 수 있다. 도 16a는 중앙 족저 크기(mm)를 마우스의 발에 M109 종양 세포의 접종 후 일자의 함수로서 보여준다. 비처리된 대조군 마우스(폐쇄 사각형)는 족저 두께에서 계속적인 증가를 보였다. 5, 12, 및 19일 (폐쇄 원, 폐쇄다이아몬드)에 6 mg/kg의 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신로 구성된 리포솜으로 처리된 마우스는 유리 미토마이신 C으로 처리된 마우스(개방 삼각형) 보다 낮은 종양성장율을 보였다. 시스테인은 6-8, 14-16, 및 21-23일에 피하로 투여되었다. 리포솜성 제제 (폐쇄다이아몬드)로 처리된 마우스에의 시스테인 투여는 높은 효율성을 제공하였으며, 이들 시험 동물들은 족저 두께에서의 가장 느린 증가를 보였으나, 이러한 차이는 통계학적으로 유의하지는 않았다.
도 16b는 도 16a에서 설명한 바와 같이 처리된 마우스에 대해 4 mm 미만의 족저 종양 크기를 갖고 생존한 마우스의 퍼센트를 종양 접종 후의 일자의 함수로서 보여준다. 이 플롯은 하향 단계로서 두 가지 유형의 현상을 기록한다: 사망 (독성 사망) 및 4 mm 이상의 종양 측정. 모든 비처리된 마우스(폐쇄 사각형)는 약 시험 23일 후 4 mm 이상의 종양을 가졌다. 리포솜성 제제로 처리된 마우스(폐쇄 원, 폐쇄다이아몬드)는 유리 형태의 약물로 처리된 마우스(개방 삼각형)보다 더 긴 기간 동안 독성 사망 없이 4 mm 미만의 종양을 가졌다.
또다른 연구에서, 마우스에 106 개의 C26 종양 세포를 복막내로 접종하였다. 접종 4일 후, 마우스를 유리 형태 또는 리포솜 내로 함입된 약물-DTB-지질 컨쥬게이트로서의 6 mg/kg을 정맥 내로 투여하였다. 결과는 마우스에 C26 종양 세포의 접종 후 시간의 함수로서 생존 퍼센트를 플로팅한 도 17에서 볼 수 있다. 비처리된 마우스 (사각형)는 시험 23일 경과 후 생존에 실패하였다. 시험 40일 째, 6 mg/kg 유리 미토마이신 C (삼각형)을 처리된 마우스의 단 10% 만이 생존했다. 대조적으로 시험 40일 째, 리포솜 내의 프로드럭의 형태의 6 mg/kg 미토마이신 C로 처리된 마우스(원)의 30% 이상, 그리고 리포솜성 제제의 6 mg/kg (2 회의 투여량)으로 처리된 마우스(다이아몬드)의 40% 이상이 생존했다. 리포솜성 제제로 처리된 마우스가 유리 형태의 약물일 때보다 실질적으로 더 높은 투여량, 즉, 약 2배, 일부의 경우 3배 높은 미토마이신 C를 견딜 수 있었다는 것은 주목할만 하다.
또다른 연구에서, 다-약물 내성에 대해 선택된 M109 세포의 하위 세포주, M109R 세포가 사용되었다. 마우스를 M109R 암종 약물-내성 세포로 접종시킨 후, 시험 물질로 정맥적으로 5 및 12일에 처리했다. 결과는 도 18-19에서 볼 수 있다.
도 18은 M109R 종양 세포의 접종 후 시간의 함수로서 중앙 족저 크기(mm)를 보여준다. 비처리된 마우스(폐쇄 사각형)는 종양 크기에서 계속적인 증가를 보였다. HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 8 mg/kg 리포솜로 처리된 마우스(폐쇄 원, 직선)는 130일까지 유사한 투여량의 유리 미토마이신 C으로 처리된 마우스 (개방 삼각형)보다 더 작은 족저 크기를 보였다. HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 두 개의 8mg/kg 투여량으로 처리된 마우스 (폐쇄 원, 점선)는 168일 시험 기간에 걸쳐 족저 크기에서 측정할 수 없을만한 적은 증가를 보였다.
도 19a-19b는 미토마이신 C 투여량이 10 mg/kg이고, 시스테인이 시험 그룹 중 하나에 투여된, 유사한 시험 마우스의 결과를 보여준다. 도 19a는 비처리된 마우스 (폐쇄 사각형), 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 코팅을 갖는 리포솜 내에 포획된, 두 개의 10 mg/kg 투여량의 독소루비신으로 처리된 마우스(Stealth®;, 개방 삼각형), 두 개의 투여량의 10mg/kg의 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C로 구성된 리포솜(폐쇄 원)(시스테인 없이 (폐쇄 원 직선) 또는 5 mg/마우스 시스테인을 갖는 (폐쇄 원, 점선))으로 처리된 마우스에 대해, 종양 접종 후 일자의 함수로서 시험 마우스의 중앙 체중(그램)을 보여준다. 리포솜성-독소루비신으로 처리된 마우스는 ㅊ체중 손실을 보였으며, 이는 실제로 그들이 견딜 수 있었던 최대 수용 투여량임을 나타낸다. 대조적으로, 시스테인을 갖거나 갖지 않는 리포솜성 MMC 프로드럭으로는 체중 손실이 관찰되지 않았다.
도 19b는 시험 동물에 대한 중앙 족저 두께를 보여준다. HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C으로 구성된 리포솜 (폐쇄 원)(시스테인 유(폐쇄 원, 점선) 및 시스테인 무(폐쇄 원, 직선))의 형태의 미토마이신 C(5 및 12일에 10mg/kg의 두 개의 투여량)으로 처리된 마우스는 족저 크기의 성장을 거의 갖지 않았다. 사실, 마우스 개별 기준 상에서, 측정가능한 종양을 갖는 15 마리의 마우스 중 11마리가 완전한 종양 퇴행을 보였다.
비처리되거나 (개방 사각형) 또는 독소루비신 포획된 리포솜으로 처리된(개방 삼각형) 것은 족저 두께가 증가했다. 이 연구로부터의 데이타는 종양 접종 후 일자의 함수로서 5 mm 미만의 족저 두께를 갖는 마우스의 생존의 퍼센트로서 도 19c에서 표현된다.
도 18-19에서 볼 수 있는 데이타는 리포솜 내로 함입된 약물-지질 컨쥬게이트의 형태로 투여된 미토마이신 C가 다-약물 내성 세포에 의해 흡수될 수 있으며, 세포독성에 충분한 양으로 세포에 축적될 수 있음을 나타낸다. M109R 세포는 이들 약물-내성 암종 모델에서 예상된 바와 같이, 리포솜-포획 독소루비신에 대해 비반응적이었다(도 19b).
상기로부터 본 발명의 다양한 측면 및 특성이 명백하다. 여기에서의 연구는 미토마이신 C가 지질-DTB-미토마이신 C 프로드럭으로서 제제화될 때 인 비보로 투여될 수 있음을 보여준다. 이 발견은 유리 형태의 미토마이신 C가 극히 독성이고, 따라서 종종 인 비보 사용에 부적합하다는 사실을 중대하게 알려준다. 그럼에도, 지질, 프로드럭 컨쥬게이트, 미토마이신 C의 형태로 동물에게 투여될 때 유리 형태의 약물의 2-배 또는 3-배의 투여량으로 투여될 수 있다.
여기에서의 연구는 또한 다-약물 내성 세포가 지질-DTB-약물 컨쥬게이트의 형태로 투여될 때 미토마이신 C를 흡수할 수 있음을 보여준다. 조사 문헌은 건강한 조직에 상대적으로 다양한 일차적 종양이 증가된 수준의 티오레독신, 디설파이드 환원 효소를 갖는다는 것을 나타낸다(Powis etal., Free Radical Biology & Med., 29: 312 (2000); Engman,L., etal., Bioorganic 및 Medicinal Chemistry 11: 5091, (2000)). 종양 세포에서의 티오레독신의 증가된 수준은 환원 효소의 천연 공급원이 표적 조직에 집중되어 있기 때문에, 여기에서 기술된 미토마이신 C 컨쥬게이트로의 독특한 시너지를 제공한다.
V. 실시예
하기 실시예는 여기에서 기술된 발명을 추가로 설명하는 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
재료
모든 재료는 Aldrich Corporation와 같은 상업적으로 적합한 판매원으로부터 얻었다.
실시예 1
파라 -디아실디글리세롤 디티오벤즈알콜 (화합물 IV) 및 오르토-디아실글리세롤디티오벤즈알콜의 합성
A. 파라- 디아실디글리세롤디티오벤즈알콜
이 반응은 도 1에서 설명된다. W. R. (Jo㎛al of Lipid Research, 28: 949(1987)의 과정에 따라 화합물 II 및 III를 제조했다.
5ml의 물 중에 3-머캅토-1,2-프로판디올(화합물 I, 1 g, 9.26mmol)을 포함하고 있는 100 ml 둥근 바닥 플라스크를 빙수조에 두였다. 빠르게 교반하고 있는 이 플라스크에 30-40℃의 온도를 유지하면서 과산화수소 (정확하게 0.5 몰 당량, 525㎕, 4.63mmol)을 적가했다. 발열 과정의 마지막에, 반응을 실온에서 밤새 교반하도록 했다. 20 ml 분취량의 아세토니트릴의 계속적인 첨가에 의해 회전 증발로 물을 공비시켰다. 아세토니트릴 첨가의 과정을 3-4회 또는 모든 물이 제거될 때까지 반복하여 맑은 오일을 얻었다. 금속 주걱으로 플라스크를 긁고 -20℃에서 밤새 냉각시킨 후, 오일 산물을 고체화했다(화합물 II, rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디올)). 백악색의 고체를 진공에서 P205에 걸쳐 건조시켰다. 수득율: 630 mg, 63%.
Figure 112005062638341-PCT00008
rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디올) 산물 (화합물II)을 화합물 (980 mg, 4.6mmol)을 오븐-건조된 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 가하고, 건조 메틸렌 클로라이드(40 mL) 중에 용해시켜 아실화했다. 이것에, 스테아르산 (4.92 g, 17.1mmol) 및 4-디메틸아미노) 피리디늄 4-톨루엔설포네이트(1.38 g, 4.6mmol)를 촉매로서 가가고, 실온(25℃)에서 20분 동안 교반했다. 그 후, 디이소프로필카보디이미드 (3.1 mL, 20 mmmol)를 피펫팅하고, 실온에서 밤새 반응시켰다. TLC 실리콘 GF (헥산 중의 10% 에틸아세테이트)는 그올 그룹의 완전한 반응을 보였다.(rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디올) Rf=0.60 ; rac-3,3'- 디티오비스 (1,2-프로판디스테아로일) Rf=0.35). Amberlyst® A-21 약한 염기성의 이온-교환 수지(~3 g) 및 Amberlyst® 15 강한 산성의 이온-교환 수지(~3 g) 를 반응 혼합물에 가하였다. 교반 30분 후, 수지를 걸려내고 여액을 건조시켰다. 잔여물을 이소프로판올로부터 3회 재결정화했다(각 100 mL). 고체 산물, rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디스테아로일) (화합물 III)를 모으고, P205 상에서 건조시켰다. 수득율 : 70%, 4.1 g. 융점 54-55 ℃.
Figure 112005062638341-PCT00009
다음 단계에서, rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디스테아로일) (화합물III) (2.97 g, 2.33 mmol)의 용액을 톨루엔(30 mL) 중에 용해시키고, 냉수조 중에 두였다. 설푸릴 클로라이드(1.9 mL, 23.2mmol)를 플라스크에 피펫팅하고, 혼합물을 차가운 빙수조 온도에서 30분 동안 교반하였다. 그 후 플라스크를 실온에 두고 다시 30분 동안 교반하였다. 과량의 설푸릴 클로라이드를 회전 증발기로 제거하였다. 새로운 (20 mL) 분취량의 톨루엔을 반응 플라스크에 가하고, 빙수조 상에 두었다. 이것에, 톨루엔 중의 4-머캅토벤즈알콜 (780 mg, 5.6mmol)의 용액을 느린 속도로 가했다. 반응 5시간 후, 모든 용매를 회전 증발로 건조시까지 증발시켰다. 따뜻한 에틸 아세테이트 (10 mL)를 반응 플라스크에 가하여 고체를 용해시키고 불용성 물질을 여과했다. 에틸 아세테이트 용액에, 50 mL의 에테르를 침전물에 가하고, 고체 산물 (파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜, 화합물 IV)을 여과에 의해 모았다. 이 과정을 2회 반복했다. 수득율: 75%.
산물(파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘-알콜, 화합물 IV)을 정제하기 위해, 클로로포름 중의 실리카 겔 컬럼(20 x 2.5 cm)을 제조했다. 샘플을 최소량의 클로로포름 중에 용해시키고 2개의 다른 이동상의 첨가로 크로마토그래피를 했다. 맨 먼저, 100% CHCl3(100ml)가 용출되었다. 이 분획은 불순한 디티오벤질 알콜을 함유했다. 확인은 1HNMR에 의해 이루어졌다. 그 후, 클로로포름 중의 15% 메탄올로 이동상을 교환하여, 플래쉬 크로마토그래피에 의해 순수한 산물을 모았다. 500 ml의 CH30H : CHCl3 (15:85)의 용출에 의해 순수한 DGTBA (TLC에 의한 하나의 점)가 모였다. 용매의 증발 후, 고체를 t-BuOH로부터 동결건조하고, 진공에서 P205 상에서 건조시켰다. 최종 정제는 수득율을 40%, 1.4g로 하락시켰다.
Figure 112005062638341-PCT00010
5 mg의 샘플을 원소 분석을 위해 연구소에 제출했다(Midwest Micro Lab).
Figure 112005062638341-PCT00011
B. 오르토 - 디글리세롤디티오벤즈알콜
rac-3,3'-디티오비스 (1,2-프로판디스테아로일)(화합물 III) (200 mg, 0.156mmol)의 용액을 톨루엔(30 mL) 중에 용해시키고 빙수조 내에 두었다. 설프릴 클로라이드(39㎕, 0.47mmol)를 플라스크 내로 피펫팅하고, 혼합물을 차가운 빙수조 온도에서 30분 동안 교반했다. 그 후, 플라스크를 실온에 두고 다시 30분 동안 교반했다. 과량의 설프릴 클로라이드를 회전 증발기로 제거했다. 새로운(20 mL) 분취량의 톨루엔을 반응 플라스크에 가하고 빙수조 상에 두었다. 이것에, 톨루엔 중의 2-머캅토벤즈알콜 (48 mg, 35mmol)의 용액을 느린 속도로 가했다. 반응 5 시간 후, 모든 용액을 회전 증발로 건조시까지 증발시켰다. 따뜻한 에틸 아세테이트 (10 mL)를 반응 플라스크에 가하여 고체를 용해시키고, 불용성 물질을 여과했다. 에틸 아세테이트 용액에, 50 mL의 에테르를 침전물에 가하고, 고체 산물(오르토-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜)을 여과에 의해 모았다. 이 과정을 2회 반복했다. 고체를 진공에서 P205 상에서 건조시켰다. 수득율 : 75%, 190mg.
Figure 112005062638341-PCT00012
실시예 2
파라- 디아실디글리세롤디티오벤잘 -미토마이신 C (화합물 XVIII )의 제조
이 반응은 도 3a에서 설명된다.
50 mL 둥근 바닥 플라스크를 포스젠 (3.1 mmol) 및 톨루엔 (5 mL)으로 채우고, 용액을 0 ℃로 냉각시켰다. 톨루엔 (2.5 mL) 중의 파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘-알콜, (화합물 IV, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된, 0.31 mmol)의 용액을 제조했다. 그 후 알콜 용액을 포스젠 용액에 적가했다. 혼합물을 실온에서 밤새 따뜻하게 두었다. 18시간 후, 용액을 진공하에서 농축시켜 과량의 포스젠을 제거했다. 미정제 아실 클로라이드를 톨루엔 (5 mL) 중에서 재용해시켰다.
미토마이신 C (0.31 mmol), 디메틸아미노피리딘 (0.031mmol) 및 DMF (1 mL)의 용액을 재조했다. 미토마이신 C 용액을 아실 클로라이드 용액에 적가했다. 1 시간 후, 톨루엔을 증발시키고, 미정제 산물을 실리카 상에서 크로마토그래피했다 (1: 1 헥산: 에틸 아세테이트). 정제된 산물을 t-BuOH (50 mL) 중에 녹이고 동결건조시켰다. 산물은 보라색 고체(183 mg, 53%)였다. Rf = 0.38 (50% 헥산: 에틸 아세테이트);
Figure 112005062638341-PCT00013
실시예 4
리포솜 제조
A. 콜레스테롤 함유 리포솜
1. 리포솜 제조
59 mg HSPC, 14.4 mg 콜레스테롤, 17.4 mg mPEG-DSPE, 및 7.4 mg 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C (몰 농도 60/30/5/5)를 1 mL 탈수 에탄올에 60-65℃에서 가하고, 용해될 때까지, 대략 10분 혼합했다. 증류수 중의 10 mM 히스티딘 및 150 mM NaCl로 구성된 수화 매질을 70 ℃로 데웠다.
따뜻한 지질 용액을 신속하게 따뜻한(63-67 ℃) 수화 매질에 가하고, 혼합하여, 불균질한 크기를 갖는 리포솜의 현탁액을 형성하였다. 현탁액을 63-67℃에서 한 시간 동안 혼합했다.
2. 압출 성형
테플론-라인의 스테인레스 스틸 용기 내에 수용된 폴리카보네이트 필터 카트리지를 통해 조절된 압출 성형에 의해 원하는 평균 입자 직경으로 리포솜의 크기를 만들었다. 리포솜 현탁액을 압출 성형의 과정, 6-8시간에 걸쳐 63-65 ℃로 유지시켰다.
3. 여과작용
여과작용에 의해 에탄올을 리포솜으로부터 제거했다. 히스티딘/소듐 클로라이드 용액을 멸균수 중에 히스티딘 (10 mM) 및 소듐 클로라이드 (150 mM)를 용해시켜 제조했다. 용액의 pH를 대략 7로 조정했다. 용액을 0.22 μm Durapore 필터를 통해 여과했다. 리포솜 현탁액을 대략 1: 1 (v/v) 비율로 히스티딘/소듐 클로라이드 용액으로 희석하고, 폴리설폰 공동-섬유 초여과(hollow-fiber ultrafilter)를 통해 여과했다. 8회의 부피 교환을 히스티딘/소듐 클로라이드 용액에 대해 수행하여 에탄올을 제거했다. 과정의 액체 온도는 약 20-30 ℃로 유지시켰다. 총 여과작용 시간은 대략 4.5 시간이었다.
4. 멸균 여과
리포솜 현탁액을 33-38 ℃로 가열하고 0.2 μm 겔만 수퍼 폴리에테르설폰 ㅍ필터를 통해 여과했다. 총 여과시간은 대략 10분이었다.
각각의 진행 단계 (수화, 압출 성형, 투석 및 여과) 후, 지질 농도 및 컨쥬게이트/약물 농도를 HPLC에 의해 측정했다.
리포솜 입자 크기는 동적 광 산란에 의해 측정되었으며, "무(free)" 양의 외부 현탁액 중의 비결합된 미토마이신 C는 HPLC에 의해 측정되었다.
Figure 112005062638341-PCT00014
B. 콜레스테롤- 무함유 리포솜 제제
리포솜을 90/5/5의 몰 농도의 HSPC, mPEG-DSPE 및 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C의 지질 조성물로 상기 기술된 바와 같이 제조했다.
구체적으로, 88.5 mg HPSC, 17.9 mg mPEG-DSPE (PEG MW 2000 달톤) 및 7.3 mg의 컨쥬게이트를 1 mL 에탄올 중에 용해시켰다. 리포솜 크기, 지질 및 약물 농도 및 외부 현탁액 매질 중의 유리 미토마이신 C 농도는 각각의 진행 단계 후 측정하였다.
Figure 112005062638341-PCT00015
실시예 5
인 비트로 특성화를 위한 HPLC 조건
실시예 4A-4B에서 기술된 바와 같이 제조된 리포솜을 0.6 M 옥타일글루코피라노사이드 중에서 희석했다. 리포솜을 37℃에서 150 mM 시스테인의 존재하에서 배양했다. 시간 0, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간에서 샘플을 취했다. 20㎕ 부피를 Water Symmetry C8 3.5 x 5 cm 컬럼을 이용하여 HPLC에 의해 분석했다. 유속은 1 mL/min였으며, 이동상 구배는 다음과 같았다:
Figure 112005062638341-PCT00016
실시예 6
세포독성 연구
A. 리포솜 제조
실시예 4A-4B에서 기술된 바와 같이 제조된 리포솜은 HSPC/mPEG-DSPE/디스테아로일-DTB-미토마이신 C(90/5/5) 또는 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/디스테아로일-DTB-미토마이신 C(90/45/5/5)으로 구성된다. 리포솜 제조는 0.45 ㎛ 셀룰로스 막을 통해 의해 무균 여과되었으며, 압출 성형을 통해 크기가 작아지지는 않았다. 리포솜 형성 후, 이소프로판올 중에서 10-20 배 희석에 의해 가용화된 리포솜 중의 미토마이신 C 농도는 360 nm에서의 흡광도에 의해 측정되었으며, 인지질 농도는 무기 인산 에세이에 의해 측정되었다.
콜레스테롤을 함유하는 리포솜은 평균 직경 275 ± 90 nm를 가졌다. 콜레스테롤-무함유 리포솜은 평균 직경 150 ± 50 nm을 가졌다. 양쪽 리포솜 제제 중의 인지질 농도는 10 μM/mL였으며, 양쪽 제제 중의 미토마이신 C의 농도는 120 ㎍/mL였다.
B. 화학민감도 분석 및 성장율 측정
유리 미토마이신 C 또는 리포솜 내로 함입된 디스테아로일-DTB-미토마이신 C 컨쥬게이트 형태의 미토마이신 C의 세포독성 효과를 이전에 기술된 메틸렌 블루 염색법의 약간의 변형을 통해 색측정법으로 분석했다(Horowitz, A. T. etal., Biochim. Biophys. Acta, 1109: 203-209 (1992)) with slight modifications.
분석의 완성 시, 세포를 고정하고, 메틸렌 블루 염색 분석을 이용하여 평가하였다.
분석에서, 200 ㎕ 분취액 (RPMI-1640 배지 + 10% 소태아혈청) 중의 지수적 성장 배양액으로부터의 1500개의 M109 마우스 암종 세포를 96 웰의 평저(flat-bottom) 마이크로 타이터 플레이트 상에 플레이팅했다. 배양액에서 20 시간 후, 세포가 부착되고 성장이 재개되는 동안, 20 ㎕의 시험 제제(유리 미토마이신 C 또는 리포솜 제제)를 각각의 웰에 가했다. 약물 농도의 각 10 배 증가에 대해, 4 개의 약물 농도 포인트가 테스트되었다. 각각의 테스트는 3배수의 웰 및 2개의 비교 플레이트에서 수행되었다. 세포를 72시간 동안 계속적으로 처리되었다.
72 시간의 처리 기간 후, 50 ㎕ 2.5% 글루타르알데히드를 각각의 웰에 가하여 배양액을 10분 동안 고정시켰다. 플레이트를 탈이온화수로 3회 세척하고, 0.1 M 보레이트 완충액 (pH 8.5)으로 1회 세척한 후, 100 ㎕ 메틸렌 블루 (0.1 M 완충액 보레이트 중 1%, pH 8.5)로 실온(20-25 ℃)에서 60분 동안 염색했다. 플레이트를 5개의 수조의 탈이온화수 중에서 헹구어 비-세포 결합 염료를 제거한 후 건조했다.염료를 200㎕ 0.1N HCl로 60분 동안 37 ℃에서 추출하고, 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 광학 밀도를 측정하였다.
분광광도적 흡광도와 상호연관된 혈구계로 세포를 계수하여 세포 수를 측정하였다. 최초 세포 플레이팅 밀도는 연구 종점에서의 세포 수 및 흡광도 간의 선형적 관계를 보증하기 위해 선택되었다. 각각의 연구에서, 최초 평균 흡광도를 결정하기 위해 약물을 가하기 전에 6개의 웰을 고정하였다. 이 수치를 이용하여 하기 방정식을 이용하여 대조군 및 약물-처리 세포의 세포 성장율(Growth rate, GR) 및 배가 시간 (Doubling time, DT)을 계산하였다: DT = In 2/ln[(ODt/ODc)/h] ; 여기에서 DT = 배가 시간d(oubling time)(시간); ODt = 연구 종점에서의 시험 웰의 광학 밀도; ODc = 연구 시점에서의 대조군 웰의 광학 밀도 ; h = 배양 기간(시간).
성장율을 GR = (ln 2/DT)로서 계산하였다. 퍼센트 성장 저해 또는 대조군 성장율의 퍼센트는 비처리된 대조군 세포의 성장율로 약물-처리된 세포의 성장율을 나누어 얻었다. 대조군 성장율의 50% 저해를 야기하는 약물 농도(IC50)은 성장 저해 곡선의 2개의 밀접한 수치의 내삽법(interpolation)에 의해 계산하였다.
미토마이신 C는 10-8 ~10-5 M의 범위에서 분석하였다. 컨쥬게이트-결합을 갖는 리포솜성 제제는 10-8- 3 x 10-5 M의 범위에서 분석하였다. 상호작용 연구를 위해, 시스테인 (SIGMA, St. Louis, MO)을 미토마이신 C 또는 리포솜 제제와 함께 150, 500, 또는 1000㎛의 최종 농도로 가했다.
결과는 표 1 및 도 10, 11A-11B 및 12에서 볼 수 있다.
실시예 7
인 비보 약동학 연구
A. 리포솜 제제
콜레스테롤 함유 리포솜 및 콜레스테롤-무함유 리포솜을 실시예 5A 및 5B에서 기술한 바와 같이 제조했다.
유리 형태의 미토마이신 C의 용액을 119 ㎕ 에탄올 중에 11.9 mg의 미토마이신 C를 용해시켜 제조했다. 용해 후, 대략 11.8 ㎕의 10 mM 히스티딘/150 mM 염수 용액을 가했다. 이용 전, 미토마이신 C 용액을 히스티딘/염수 용액으로 100 ㎍/mL로 희석하고 여과했다.
B. 동물
8마리의 래트를 하기와 같이 치료 그룹으로 무작위로 골랐다:
Figure 112005062638341-PCT00017
시험 제제의 단일 정맥 주사를 볼루스 투여량으로서 투여했다. 혈액 샘플을 각각의 동물로부터 주사 후의 하기 시간들에서 채취했다: 30 초, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간. 혈액 샘플 중의 미토마이신 C의 양을 하기 주어진 HPLC 과정에 의해 측정했다. 200 mM 아이오도아세트아민 용액을 5.1 mL의 7.5% EDTA 중에 199.3 mg의 아이오도아세트아미드를 두어 제조했다. 15 ㎕의 200 mM 아이오도아세트아미드 용액을 각각 1㎕의 혈액 샘플 중에 두었다.
C. 혈장 중의 미토마이신 C를 측정하기 위한 HPLC 방법
1. 용액 제조
1.321 g의 암모늄 포스페이트를 탈이온수가 채워진 1 L 부피측정 플라스크 내에 넣어 10 mM 암모늄 포스페이프를 함유하는 수성 완충액, pH=7을 제조하였다. 혼합물을 교반하고, pH를 o-인산으로 7.0으로 조절하였다. 완충액을 사용전 0.45 ㎛ 나일론 필터를 통해 여과했다.
메탄올 및 수성 완충액의 이동상을 Waters Alliance 2원 펌프를 이용하여 구배 프로그램을 통해 혼합했다.
2. 표준 용액 및 특성 대조군 샘플
두 개의 분리된 중량의 미토마이신 C 및 미토마이신 C 컨쥬게이트를 표준 및 특성 대조군 샘플(quality control samples)로서 제조했다. 1 mg의 미토마이신 C 및 1 mg의 미토마이신 C 컨쥬게이트를 중량을 재고, 1 mL 희석액 (20% 클로로포름 및 80% 메탄올 혼합물) 중에 따로 녹였다. 화합물 둘 다에 대한 스톡 용액의 농도는 1 mg/mL였다. 여러 개의 희석물을 희석액 중에서 만들어 5 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL 농도의 표준 및 특성 대조군 샘플을 얻었다.
0.1 mL 래트 혈장의 분취량에 적당한 부피의 (10㎕-50㎕)의 미토마이신 C 및 미토마이신 C 컨쥬게이트 표준 용액을 탔다(spiked). 미토마이신 C 및 미토마이신 C 컨쥬게이트에 대한 농도 범위는 각각 0.05-5.0 ㎍/mL 및 0.1-5 ㎍/mL였다. 메탄올로 최종 부피를 1 mL로 조정했다. 유사한 과정을 거쳐 특성 대조군 샘플을 제조했다. 특성 대조군 샘플의 농도는 래트 혈장 중에서 미토마이신 C에 대해 0.1, 0.5 및 5 ㎍/mL였고, 미토마이신C 컨쥬게이트에 대해 0.1, 1 및 5 ㎍/mL였다. 샘플을 실온에서 10 분 동안 3,000 rp메서 회전시켰다. 300 ㎕의 상청액을 주입를 위한 300 ㎕ 인서트(insert)를 포함하는 HPLC 바이알로 옮겼다.
3. 샘플 제조
100 ㎕의 혈장 샘플을 900 ㎕의 메탄올로 변성시키고, 10 분 동안 3,000 rpm에서 원심분리했다. 300 ㎕ 상청액의 분취액을 주입를 위한 300 ㎕ 인서트를 포함하는 HPLC 바이알로 옮겼다.
4. 크로마토그래피 조건
Supelco® C-8, 5μ, 4.6mm x 5 cm 컬럼을 사용하였다. 이동상 A는 10 mM 암모늄 포스페이트, pH 7였다. 이동상 B는 메탄올이었다. 유속은 1 mL/min였으며, 탐지는 UV에 의해 360 nm에서 이루어졌다. 주입 부피는 40 ㎕였으며, 일반적 러닝 시간은 15 분이었다. 구배 프로그램은 하기와 같았다:
Figure 112005062638341-PCT00018
5. 분석 및 계산
낮은 것부터 높은 농도의 제조된 직선성 표준(6 개의 농도 수준)을 주입하였다. 정성 대조군 및 혈장 샘플을 분석을 위해 주입했다.
피크 영역 및 보유 시간을 PE-Nelson Turbochrom (Version 4.1) 시스템에 의해 측정했다. 미토마이신 C 및 미토마이신 C 컨쥬게이트의 농도는 선형 회귀 프로그램을 이용하여 계산하였다. 이 방법의 직선성은 6개의 농도 수준으로부터의 표준 반응을 이용하여 평가하였다. 데이터를 1/x2을 가중 요소로 갖는 y=B*x + A의 선형 회귀 방정식에 피팅하였다. 이 방법의 정밀도 및 정확도는 특성 대조군 샘플 뿐만아리나 표준의 역계산된 농도로부터 평가되었다.
결과는 도 13a-13B에서 볼 수 있다.
실시예 8
인 비보 연구
암컷 10주령 BALB/c 마우스를 특수한 Spathogen-free 설비 내에 두었다. M109 세포 또는 M109R 세포를 인 비트로 현탁액 중에서 키웠다. 마우스의 오른쪽 뒤 족저에 50㎕ (106 세포)를 주사했다. 족저 두께를 연구의 완성시까지 칼리퍼로 측정하고, 마우스가 희생될 때, 종양의 최종 수를 기록하였으며, 대조군 및 암-접종된 족저를 발목 수준에서 섹션하고 무게를 쟀다. 종양 무게는 정상 및 종양-포함 족저 간의 차이에 의해 추정되었다. 그룹 당 암의 최종 발생에서의 차이의 통계학적 유의성은 우연성 표(contingency) 및 Fisher의 정확한 테스트(Fisher's exact test)에 의해 분석되었다. 결과는 도15A-15B 및 도 16a- 16B, 도 18, 도 19a-19C에서 볼 수 있다.
본 발명이 특정 구체예와 관련하여 기술되었으나, 본 발명과 동떨어지지 않고 다양한 변화 및 변형이 만들어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (6)

  1. 소포-형성 지질 및 하기 일반식의 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트의 컨쥬게이트로 형성된 리포솜을 포함하는, 다-약물 내성 세포에 미토마이신 C를 투여하기 위한 의약의 제조를 위한 조성물:
    Figure 112005062638341-PCT00019
    여기에서, L은 리포솜성 지질 이중층 내로의 함입에 적합한 소수성 부위이고, R1은 디티오벤질 부위에 공유결합적으로 결합된 미토마이신 C이며, CH2R1 그룹의 배향은 오르토 위치 및 파라 위치 중에서 선택된다.
  2. 소포-형성 지질 및 하기 일반식의 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트의 컨쥬게이트로 형성된 리포솜을 포함하는, 미토마이신 C의 인 비보 세포 독성을 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한 조성물:
    Figure 112005062638341-PCT00020
    여기에서, L은 리포솜성 지질 이중층 내로의 함입에 적합한 소수성 부위이고, R1은 디티오벤질 부위에 공유결합적으로 결합된 미토마이신 C이며, CH2R1 그룹의 배향은 오르토 위치 및 파라 위치 중에서 선택된다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미토마이신 C가 우레탄 결합에 의해 공유결합적으로 결합되어 있는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, L이 콜레스테롤, 디아실글리세롤 및 인지질로 구성된 그룹으로부터 선택된 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 컨쥬게이트가 디티오벤질 부위에 공유결합적으로 결합되어 하기 구조를 갖는 컨쥬게이트를 형성하는 미토마이신 C를 포함하는 조성물:
    Figure 112005062638341-PCT00021
    여기에서, R4는 미토마이신 C의 잔기를 나타낸다.
  6. 제5항에 있어서, R4의 2급 아민 부위가 디티오벤질과 미토마이신 C 간의 우레탄 결합을 형성하는 조성물.
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