JPH1160499A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

抗腫瘍剤

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JPH1160499A
JPH1160499A JP9240235A JP24023597A JPH1160499A JP H1160499 A JPH1160499 A JP H1160499A JP 9240235 A JP9240235 A JP 9240235A JP 24023597 A JP24023597 A JP 24023597A JP H1160499 A JPH1160499 A JP H1160499A
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智裕 澤
Takaaki Akaike
赤池孝章
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Abstract

(57)【要約】 【課題】高い抗腫瘍活性を有し、かつ腫瘍以外の正常組
織・臓器に対する副作用が極めて低い新たな抗腫瘍剤を
提供することを目的とする。 【解決手段】活性酸素生成酵素であるキサンチンオキシ
ダーゼ(XO）のリジン残基を活性化ポリエチレングリコ
ール(PEG）で化学修飾することにより、XOの血管内皮へ
の非特異的吸着をなくし、かつ、腫瘍部局所への集積性
を高めたPEG-XOとXOの基質であるヒポキサンチン(HX)と
の反応により生成する活性酸素分子種による癌細胞殺傷
を利用したユニークな作用機序をもつ抗腫瘍剤を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍局所に集積す
ることにより、選択的に、抗腫瘍効果を発揮する抗腫瘍
剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ドキソルビシンやマイトマイシンなどを
はじめとする多くの抗腫瘍剤が、その活性酸素生成を介
して、抗腫瘍活性を発現していることが、明らかとなっ
ている。本発明者の前田、赤池らも同様の知見を報告し
ている(Sato,K. et al.:Jpn.J.Cancer Res.,83.1204-12
09,1992)。また、吉川らは、キサンチンオキシダーゼ
（xanthine oxidase:XO）と、その基質であるヒポキサ
ンチン（hypoxanthine：HX）とを、VX2担癌ウサギの耳
静脈および大腿部動脈より、それぞれ、同時に投与する
と、産生する活性酸素は、抗腫瘍効果を発揮することを
報告している（Yoshikawa,T.et al.: Cancer Res. 55:1
617-1620,1995)。
【０００３】生成した活性酸素種は、その非常に高い細
胞傷害性により、癌細胞を殺傷するが、これら薬剤は、
腫瘍組織以外の正常臓器・組織にも分布するために、そ
の副作用が問題となる（Yen.H.C.et al.: J.Clin.Inves
t.98:1253-1260,1996)。
【０００４】すなわち、XOは、血管内皮細胞に対して、
非常に親和性が高く、通常は、血管内皮に結合した形で
存在している（T.Adachi,et al.:Biochem J.289:523-52
7,1993)ので、XOを血中に投与した場合、その多くが、
血管内皮に非特異的に吸着し、腫瘍局所への集積量が減
ることに加えて、生成するスーパーオキサイドは、血管
内皮細胞を傷害して、血管傷害をもたらすのみならず、
血管弛緩因子である一酸化窒素（NO）（Moncada,S.et a
l.: Pharmacol.Rev.43:109-142,1991)と急速に反応し、
それを消去するため(Pryor W.A.and G.L.Squadrito.: A
m.J.Physiol.268:699-722,1995)に、血圧の上昇をもた
らす（Nakazono,K.et al.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8
8:10045-10048,1991)とともに、スーパオキサイドとNO
の反応生成物であるperoxynitrite（ONOO-）は、さら
に、血管内皮細胞等を傷害すると考えられるなど、いく
つかの副作用発現を招来すると考えられ、吉川らのこの
系は、実用化が困難である。また、血中には、本来、抗
XO抗体が存在するといわれており（Ng Y.L.and Lewis,
W.H.: Brit.J.Biomed.Sci.51:124-127,1994)、XOを血中
に投与した場合、その抗XO抗体による中和反応が、XO活
性を低下させることが懸念される。
【０００５】
【発明が解決しょうとする課題】これまで用いられてき
たほとんどの抗腫瘍剤は、腫瘍細胞以外の正常細胞に対
しても非選択的に毒性を発現するために、その副作用が
大きな問題となっている。したがって、その抗腫瘍活性
を保持したまま副作用を軽減した薬剤の創製は、臨床的
に有用である。
【０００６】本発明の目的は、高い抗腫瘍活性を有し、
かつ腫瘍以外の正常組織・臓器に対する副作用が極めて
低い新たな抗腫瘍剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】副作用を低減し、かつ、
効率よく抗腫瘍活性を発現させるためには、用いる薬剤
を腫瘍組織へ選択的に送り込むことが必要となる。本発
明者らは、生体親和性の高い高分子物質や油質が、正常
組織に比べて、選択的に固型腫瘍に集積することを見い
だし（Enhanced Permeability and Retention effect,
EPR効果）（ Matsumura,Y.and Maeda,H.: Cancer Res.
46:6387-92,1986)(Maeda,H and Matumura,Y.:Therap.Dr
ug Carrier Sys.6:193-210,1989) 、この原理を利用し
て、薬剤を高分子化することで、非常に効率よく腫瘍局
所に選択的の薬剤を集め、さらに、生体内での活性半減
期を大幅に改善（延長）可能であり、かつ、副作用を低
減できることを明かにしている（Maeda,H.:J.Controlle
d Release,19:315-324,1992)。
【０００８】すなわち、腫瘍組織においては、i)新生血
管の増生、ii)血管透過性の亢進、iii)高分子物質の腫
瘍血管を介する回収の不全、iv)リンパ系を介する高分
子物質の回収の欠如、などの結果として、血中へ投与し
た生体親和性のある高分子物質は、腫瘍組織へのみ、選
択的に集積するようになる。これをEPR効果という。
【０００９】本発明者らは、XOが血管内皮へ吸着する原
因と考えられる塩基性のリジン残基（Adachi,T.et al.:
Biochem J.289:523-527,1993)を、ポリエチレングリコ
ール（poly(ethylene glycol)：PEG）で化学修飾し、PE
G結合X0（PEG-XO）となすことにより、血管内皮へのXO
の吸着性が低減し、その結果、腫瘍局所へのPEG-XOの選
択的集積性が著名に向上し、その後、XOの基質であるHX
を投与すると、腫瘍局所において、活性酸素分子種が発
生し、優れた選択的抗腫瘍効果を発揮することを見出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、特許請求
の範囲の各請求項に記載の発明からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明で使用される修飾剤として
は、上記したPEGの他に、非免疫原性合成高分子とし
て、ポリアスパラギン酸誘導体、Dーグルタミン酸とDーリ
ジンの共重合体等、両親媒性高分子として、スチレンマ
レイン酸共重合体（Maeda,H.et al.:J.Med.Chem,28:455
-461,1985) 、徐分解性高分子として、ポリ乳酸、デン
プン、ゼラチン等、生理活性高分子として、ピラン共重
合体等、が挙げられる。
【００１１】活性酸素生成酵素と修飾剤とのハイブリッ
ド合成は、塩化シアヌルを用いる方法、カルボジイミド
を用いる方法、その他の方法として、酸無水物、グルタ
ルアルデヒド、過ヨウソ酸、あるいはN-スクシニイミジ
ル-3-(2-ピリジルチオ）プロピオネートを用いる方法
等、公知の方法で実施できる。その際、当該酵素の立体
構造を破壊しないような温和な条件（低温、中性pH、水
溶液中）で行う。また、当該酵素の機能発現に重要な役
割を果たすアミノ酸残基の修飾は、避けなければならな
い。本発明の好適な例として、XOをPEGで修飾する場合
についてのべる。
【００１２】XOは、広範囲の動物の組織中にひろく分布
しており、HXまたはキサンチン（xanthine;XA)を基質と
して,尿酸と活性酸素を産生する酵素である。本発明に
用いるXOは、いずれの動物由来のものでもよい。本発明
者らの研究によれば、修飾剤としてのPEGは、一般的に
（全てではないが）酵素タンパク質に、非免疫原性と循
環系における安定性を付与する性質があり(Maeda,H.et
al.:Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical an
d Biomedical Applications, Harris,J.M.,Ed.,Plenum:
NewYork,1992,pp153-169)本発明に用いるのにふさわし
い。PEGの活性化は、たとえば、末端にカルボキシル基
を有するPEGとN-ヒドロキシスクシンイミドとを、カル
ボジイミドを用いて脱水縮合させると、アミノ基と反応
する活性化PEGが得られる。この他にも活性化PEGの合成
が可能である（図１）。
【００１３】活性化PEGによるXOの修飾反応は、常温な
いし低温、中性付近のpHで、30ー60分間行う。修飾率
は、XO分子上のリジン残基に対する活性化PEGの量比を
変えることにより、調節可能である。本発明において
は、リジン残基に対し、1.2ー10倍モル量、好ましく
は、5ー7倍モル量の活性化PEGを添加することにより、1
7ー80％好ましくは、40ー50％の修飾率のPEG-XOが得ら
れる。
【００１４】本発明のPEG-XOは、静脈内投与後、選択的
に、腫瘍組織へ集積していることが確認される（図
２）。また、血中でのPEG-XO活性は、時間とともに比較
的早く減少している（図３）のに対し、固型腫瘍への集
積は、時間とともに増加している（図４）。これらのこ
とから、PEG-XOは、これまで報告のあった高分子薬剤と
同様、EPR効果により固型腫瘍へと集積していることが
明らかである。
【００１５】本発明のPEG-XOを、あらかじめ、腫瘍組織
に選択的に集積させた後、6ー18時間後に、基質であるHX
あるいはXAを投与することで、腫瘍組織でのみ活性酸素
分子種を発生させることが可能となり、副作用のない、
ユニークな作用機序をもった抗腫瘍剤を提供することが
できる。事実、PEG-XOとHXの組み合わせによる治療を施
したマウスにおいては、非治療群に比べ、顕著な腫瘍の
増殖抑制がみられる（図５、６）。この結果は、PEG-XO
- HX系から生成する活性酸素種が、非常に強い抗腫瘍
活性を有していること、および腫瘍組織において、その
反応が効率よく進行していることを示している。一方、
PEG-XOの代わりに、未修飾のXOを用いた場合は、その抗
腫瘍効果は、PEG-XOに比べはるかに弱いものである（図
５）。これらの原因として、前記したように、血管内皮
への非特異的吸着による腫瘍への薬剤の送達の減少や、
血中に、本来存在するといわれている抗XO抗体（Ng Y.
L.and Lewis,W.H.: Brit.J.Biomed.Sci.51:124-127,199
4)による中和などが考えられる。いずれにせよ、PEGを
結合することにより、XOの腫瘍局所への生体利用性（bi
oavailability)が向上し、より活性の高い抗腫瘍システ
ムの構築が可能となることが、本発明により明かとなっ
た。
【００１６】PEG-XO - HX系の毒性については、体重の
変動をみる限り、その副作用は、それほど顕著ではない
と考えられる（図７）。この原因として、XO、およびHX
は、本来無毒性であり、他の正常組織へ単独で分布した
場合の副作用はほとんどないためと考えられる。むし
ろ、産物の尿酸は、ラジカルスカベンジャーとしての有
用性もある。また、この結果は、低毒性化合物の組み合
わせによる抗腫瘍活性発現システムが、低副作用の薬剤
システムを考える上で有望であることを示している。
【００１７】
【実施例】以下に、本発明の実施例を説明するが、本発
明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】実施例１ PEG-XOの合成 ウシ・ミルク由来のXO（シグマ・ケミカル社製、米国ミ
ズリー州）を、分子量３万以下の限外濾過膜を用いて、
精製し、１mMのサリチル酸ナトリウム（安定化剤）を含
むリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解し、４℃にて保存し
た。XO濃度が、10mg/mlとなるように、リン酸緩衝液（p
H7.4）を用いて希釈し、その溶液に、N-スクシンイミド
で活性化したPEG（図１、式１）（Shewater Polymers
社製、米国アラバマ州）の粉末を,XO内のリジン残基(89
残基）に対して、1.2あるいは6.7倍モル量となるように
添加し、中性pH、８℃、という温和な条件下で、30分間
反応させ、それぞれ異なる修飾率のPEG-XOを得た。反応
終了後、分子量３万以下の限外濾過膜を用いて、未反応
のPEG及びその他の不純物を取り除いた。得られたPEG-X
Oは、1 mMサリチル酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液（p
H7.4）に分散させて、使用時まで４℃にて保存した。
【００１９】（１）PEG-XOの化学的・生化学的性状 XOの酵素学的活性は、XAの代謝産物である、尿酸の生成
量を吸収極大290 nmで測定した(Hunt J.and Massey,V.:
J.Biol.Chem.267:21479-21485,1992)。XO活性の単位
は、１分間あたり1μＭの尿酸を生成する酵素活性とし
た。PEGによるXO内のリジン残基の修飾率は、Trinitoro
benezenesulfonic acid(TNBS)法により定量した（ Fiel
ds,R.:Methods Enzymol.25:464-468,1972)。得られたPE
G-XOの分子量は、ファルマシア社（ウプサラ、スェーデ
ン）のFPLCシステムにより測定した。カラムは、ファル
マシア社のSuperose 6HR (10 x 300 mm)を用いた。PEG-
XOの物理化学的および生化学的性状を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】XO分子中のリジン残基（XO１分子中89残
基）に対し、1.2、および6.7倍モル量の活性化PEGを添
加することにより、平均で17%(15残基相当量）、および
49％（44残基相当量）のリジン残基にPEGが結合したPEG
-XOを得た。今回用いたPEGの平均分子量が、5000である
ことから、その修飾率から求めたPEG-XOの分子量は、前
者が383kDa（以下、PEG-XO-lowと略す）、後者が543kDa
（以下、PEG-XO-highと略す）であった。ただし、ここ
では、XOがホモダイマーであると考えて計算してある。
PEGの結合による分子量の増加は、サイズ排除クロマト
グラフィーによっても確かめられた。図８に、それぞれ
未修飾のXO、PEG-XO-low、PEG-XO-highのクロマトグラ
ムを示す。PEG-XO-lowの場合、PEGで修飾することによ
り、若干の酵素活性の上昇が見られた。一方、PEG-XO-h
ighの場合、酵素活性の低下が見られたが、この場合で
も、もとの酵素の活性の43％は維持されていた。また、
得られたPEG-XOは、１カ月以上8℃に保存した場合に
も、酵素活性の低下は見られなかった。
【００２２】（２）PEG-XOの血中安定性 PEG-XO-lowを、6.0 U/mlとなるように、生理食塩水を用
いて希釈し、その100μlを、ddYマウス（雄、５週齢、S
LC株式会社、静岡）の尾静脈より投与した。経時的に採
血し、血中のXO活性、およびその活性画分の分子量を側
定した。すなわち、遠心分離して血球を取り除いた血漿
成分を、上記（１）で用いたFPLCシステムにかけ、その
各成分を分離し、その溶出液を、1mlづつ分画した。分
画中に含まれるXO活性を、プテリンを基質として用い
て、その酵素反応産物であるイソキサントプテリンの蛍
光（励起波長345 nm、発光波長390nm）を測定すること
で、XOの酵素活性を定量した(Akaike,T.et al.: J Clin
Invest.85:739-45,1990)。
【００２３】PEG-XO-low投与後、20分、４時間、12時間
のいずれの採血においても、見かけ上の分子量が、約38
0 kDaに対応する分子量領域において、XOの酵素活性が
最大となり、その後、時間を経るにしたがって、酵素活
性が減少した（図３）。いずれの場合も、PEG-XO-low
が、それぞれの分子量を保ったまま減少していることか
ら、血中において、PEGとリジン残基との結合は、保持
されたまま存在し、不活性化していることが示された。
同様の結果は、PEG-XO-highについても得られた。
【００２４】（３）PEG-XOの腫瘍組織への集積性とその
安定性 ddYマウスの背部皮下に、２X106個のSarcoma 180腫瘍細
胞を移植し、7-10日後、固型腫瘍の径が、おおよそ、５
ー10mmとなったマウスを選び出し、実験に用いた。PEG-
XO-highを、6.0 U/mlとなるように生理食塩水を用いて
希釈し、その100μlをddYマウスの尾静脈より投与し
た。その後、経時的に、固型腫瘍および各臓器・組織な
どを摘出し、それぞれ各種蛋白分解酵素阻害剤を含む緩
衝液中（Akaike,T.et al.:J Clin Invest,85(3):739-74
5,1990) でホモゲナイズし、その上清中に存在するXO活
性を上記（１）と同様の方法で測定した。その結果を図
２に示す。PEG-XO-highを投与しなかったマウスにおい
ては、内因性の未修飾XOの分子量に対応する画分にの
み、酵素活性が見られた。一方、PEG-XO-highを投与し
たマウスでは、これとは異なる高分子量画分に、新たな
大きなXO活性のピークが観察された。この分子量領域
は、PEG-XO-highのものと完全に一致し、尾静脈より投
与したPEG-XO-highが、固型腫瘍へ集積したものである
ことを示している。固型腫瘍におけるPEG-XO-highの活
性は時間の経過とに増大した（図４）。正常組織では、
肝臓において、若干のPEG-XO-highの活性がみられた
が、筋肉には、ほとんど検出されなかった。
【００２５】実施例２ PEG-XOの抗腫瘍活性 ddYマウスの背部皮下に、２x106個のSarcoma 180腫瘍細
胞を移植し、7日間飼育後、固型腫瘍が形成されたマウ
スを選び出し、実験に用いた。XO活性が、6.0U/mlとな
るように生理食塩水を用いて希釈し、その100 μlを、
尾静脈より投与した。XOを投与した６時間後、18時間後
に、HXの生理食塩水溶液（1.3 mg/ml）を腹腔内へ300
μl投与した。同様に、腫瘍移植８日目の６時間後、18
時間後にHXを投与した。さらに、９日目に第２回目のXO
を投与し、同様にHXをXO投与後6,18時間後に腹腔内投与
した。腫瘍の大きさを、ノギスを用いて毎日測定した。
また、治療実験終了後に、固型腫瘍を摘出して、その重
量を測定した。対照として、非治療群および未修飾XO投
与による治療群をもうけた。
【００２６】未修飾XO治療群においては、非治療群に比
べ若干の腫瘍サイズの減少が認められたものの、統計学
的な有意差は、認められなかった（非治療群に対してp=
0.34）（図5）。一方、PEG-XO-highで治療した群におい
ては、その腫瘍サイズに顕著な抑制効果を生じ、非治療
群の67 %になった（非治療群に対してp≦0.05）。治療
開始８日後の腫瘍重量は、非治療群0.36 +/- 0.12 g ，
未修飾XO治療群0.31 +/- 0.03 gに対し、PEG-XO-high治
療群では、0.22 +/- 0.05 gとなり、非治療群に比べ
て、39％の腫瘍増殖の抑制効果が見られた。さらに、図
６に示すように、PEG-XO-highの投与を１回増やすこと
により、ほぼ、完全に腫瘍の増殖が抑制された。治療開
始６日後の腫瘍重量を比較すると、非治療群では0.57 +
/- 0.24 gであったのに対し、PEG-XO-highで治療した群
では、0.13 +/- 0.08 gとなり、77％も抑制されていた
（非治療群に対してp<0.01)。このときの体重の推移を
図７に示す。PEG-XO-high投与初日には、若干の体重減
少が見られたが、その後、速やかに体重は回復し、以
後、顕著な毒性を示す体重減少は、認められなかった。
【００２７】
【発明の効果】本発明のPEG-XOとHX、あるいはPEG-XOと
XAとの組合わせによる抗腫瘍剤は、EPR効果により腫瘍
局所へXOが選択的に集積することにより、非常に高い抗
腫瘍活性を示し、かつ副作用も低い有用な医薬品とする
ことができる。本発明は、腫瘍選択的なドラッグデリバ
リーと、低毒性化合物との組み合わせによる抗腫瘍活性
の発現に基づく全くユニークな抗腫瘍剤を提供するもの
で、今後、固型腫瘍の新規な化学療法システムとして更
なる発展が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】タンパク質の化学修飾によく用いられる活性PE
G誘導体の合成スキームを示す図である。
【図２】PEG-XO-highの固型腫瘍組織への集積性を示す
図である。Sarcoma 180移植固型腫瘍モデルマウスに、P
EG-XO-highを静脈投与12時間後、固型腫瘍を摘出して、
そのホモジナイズ上清をFPLCシステムにより分離した後
の各フラクションのXO活性を調べた。図中斜線部分が、
PEG-XO-highに対応する画分である。
【図３】血中のPEG-XOの安定性を示す図である。マウス
尾静脈より、PEG-XO-lowを投与した後、図１と同じFPLC
システムにより、経時的に採取した血漿成分を分離した
各フラクションのXO活性を測定した。
【図４】同上の固型腫瘍組織におけるPEG-XO-highの集
積を経時的に調べた図である。
【図５】固型腫瘍モデルマウスに対する、未修飾XO、PE
G-XO投与群における抗腫瘍活性を示す図である。Sarcom
a 180腫瘍細胞移植後７日目および９日目に、未修飾XO
あるいはPEG-XOを、マウスの尾静脈より投与し、XO投与
６時間後、18時間後にHXを腹腔内投与し、その後の腫瘍
の大きさを経時的に測定した。図中矢印は、XO投与を示
す。
【図６】同上に、さらに、PEG-XO-highを１日増加（８
日目）させた場合の抗腫瘍活性を示す図である。
【図７】図６における体重推移を示す図である。
【図８】ファルマシア社のFPLCシステム（Superose 6H
R）を用いての、未修飾XO、PEG-XO-lowおよびPEG-XO-hi
ghの排除クロマトグラムを示す図である。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】高分子で化学修飾された生体由来の活性酸
    素生成酵素と当該酵素の基質とからなる抗腫瘍剤。
  2. 【請求項２】高分子がポリエチレングリコールである請
    求項１に記載の抗腫瘍剤。
  3. 【請求項３】活性酸素生成酵素がキサンチンオキシダー
    ゼであり当該酵素の基質がヒポキサンチンまたはキサン
    チンである請求項２に記載の抗腫瘍剤。
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