ES2202704T3 - Agente antitumoral que comprende un complejo de una oxidorreductasa de un polimero y un substrato del enzima. - Google Patents

Agente antitumoral que comprende un complejo de una oxidorreductasa de un polimero y un substrato del enzima.

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN AGENTE ANTITUMORAL QUE ES UNA COMBINACION DE UNA OXIDORREDUCTASA CONJUGADA QUIMICAMENTE CON UN POLIMERO, Y DE UN SUSTRATO DE DICHA OXIDORREDUCTASA. DICHO AGENTE ANTITUMORAL PRESENTA UNA ACTIVIDAD CITOTOXICA SELECTIVA PARA UN TUMOR.

Description

Agente antitumoral que comprende un complejo de una oxidorreductasa de un polímero y un substrato del enzima.
La presente invención se refiere a un grupo de agentes antitumorales que por sí mismos no son tóxicos y exhiben una acción citotóxica selectiva para los tumores mejorada.
Se ha encontrado que varios agentes antitumorales tales como la mitomicina y la doxorrubicina exhiben su efecto antitumoral basándose en su capacidad de generar especies moleculares de oxígeno reactivas. Un trabajo previo de R. Bray y sus colaboradores (Nature, vol. 182, p. 1144-1146, 1958) y más recientemente T. Yoshikawa y sus colaboradores (Cancer Res., vol. 55, p. 1617-1620, 1995) presentaba que la actividad antitumoral de la xantina oxidasa (denominado aquí en lo sucesivo "XO") se alcanza probablemente a través de la generación de especies moleculares de oxígeno reactivas. Sin embargo, una nueva evaluación más crítica del efecto antitumoral de la XO natural por R. Bray y J. C. Swann mostró que el efecto era insignificante (Structure and Bonding, vol. 11, p. 107-144, 1972, publicado por Elsevior, una nota añadida al pie de la página 112). Esto también fue confirmado de nuevo por los inventores de la presente invención.
Especies moleculares de oxígeno reactivas generadas a partir de esos fármacos antitumorales exhiben un efecto antitumoral basado en su naturaleza altamente citotóxica. Sin embargo, una distribución sistémica de esos fármacos provoca efectos secundarios indeseables (J. Clin. Invest., vol. 98, p. 1253-1260, 1996). Por ejemplo, la XO natural conduce a una unión a los vasos sanguíneos después de la administración a la sangre debido a su alta afinidad de unión a células endoteliales vasculares (Biochem. J., vol. 289, 523-527, 1993). Se espera que la unión de XO a los vasos sanguíneos provoque efectos secundarios graves tales como: i) El radical anión superóxido generado a partir de XO dañaría oxidativamente los vasos sanguíneos; ii) La reacción entre el superóxido y el óxido nítrico formado endógenamente conduce a la dilatación de los vasos sanguíneos y disminuye la presión sanguínea o regula así la presión sanguínea (Pharmacol. Rev., vol. 43, p. 109-142, 1991), lo que podría provocar hipertensión debido a un nivel disminuido de óxido nítrico en los vasos sanguíneos (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, p. 10045-10048, 1991); iii) El producto de reacción de superóxido y el óxido nítrico, a saber el peroxinitrito (ONOO^{-}), daña oxidativamente de forma adicional los vasos sanguíneos. Por lo tanto, no es ventajoso aplicar XO natural para uso clínico. Además, el anticuerpo anti-XO endógeno (Brit. J. Biomed. Sci., vol. 51, 124-127, 1994) puede reducir la actividad de XO después de la inyección intravenosa.
Para mejorar la eficacia del fármaco mientras se reducen los efectos secundarios sistémicos, es necesario aportar este enzima antitumoral selectivamente al tejido tumoral. Los inventores de esta invención encontraron previamente que los fármacos macromoleculares y los lípidos se acumulan preferiblemente en el tejido tumoral en comparación con otros órganos normales, y además se retienen en el tejido tumoral durante un período más prolongado. Este fenómeno se denomina el efecto EPR (efecto de permeabilidad y retención aumentadas, Cancer Res., vol. 46, p. 638-792, 1986). La eficacia terapéutica aumentada y la reducción de efectos secundarios podrían alcanzarse incrementando el peso molecular del agente antitumoral (J. Controlled Rel., vol. 19, p. 315-324, 1992).
A partir de la publicación Y. Matsumara y H. Maeda, Cancer Research, Vol. 46, Nº 12, 1986, páginas 6387-6392, se conoce "smancs" como una proteína anticancerígena conjugada a polímeros, a saber un conjugado de neocarcinostatina (NCS) con un copolímero de estireno-ácido maleico (SMA). Además, se describen allí algunos resultados referentes a ovomucoide, albúmina de suero bovino (BSA), albúmina de suero de ratón, IgG de ratón y neocarcinostatina que es el compuesto originario de smancs (véase la figura 1, Tablas 1 y 2). La NCS es el material antitumoral producido en el medio en el cultivo de streptomyces cartkinostaticus var. F-41 Kuroya y no es el tipo de agente antitumoral que depende de la acción de una molécula de oxígeno activa producida a partir del enzima y su substrato.
En la publicación de J. Tsuji y otros, International Journal of Immunopharmacology, Vol. 7, Nº 5, 1985, páginas 725-730, se describe el enzima uricasa conjugada a PEG, que es totalmente diferente de la oxidorreductasa. La uricasa se usa como un agente terapéutico para la hiperuricemia y la gota, pero no se usa como un agente anticancerígeno.
El objetivo de la presente invención es proporcionar un grupo de agentes antitumorales que exhiba una acumulación selectiva en los tumores mejorada y por lo tanto una citotoxicidad selectiva para los tumores mejorada.
Este objetivo se cumple mediante la presente invención, de acuerdo con la cual se proporcionan agentes antitumorales cada uno de los cuales se caracteriza por una combinación de una oxidorreductasa en forma de xantina oxidasa, D-aminoácido oxidasa, glucosa oxidasa y/o galactosa oxidasa, oxidorreductasa que está químicamente conjugada con poli(etilenglicol), y de un substrato de la oxidorreductasa en forma de hipoxantina, xantina, un D-aminoácido, glucosa y/o galactosa.
El agente antitumoral de acuerdo con la presente invención es una combinación de un componente de enzima activo (A) en forma de la oxidorreductasa definida previamente y de su substrato (B) en forma del substrato definido previamente. Durante la administración de (A) y más delante de (B), se forma una especie molecular activa (C), tal como un peróxido.
El componente de enzima activa (A), mediante su conjugación con polímero, posee un carácter de orientación a los tumores. A saber, el agente antitumoral exhibe una acumulación selectiva en tejido tumoral y ejerce una acción antitumoral si el substrato conocido (B) para el componente de enzima activo (A) se inyecta más adelante. Debido a la reacción enzimática, se forman componentes de radicales libres activos (C) (O_{2}^{-}- H_{2}O_{2}). Tanto la xantina oxidasa conjugada con poli(etilenglicol) (A) como su substrato (B) no muestran toxicidad por sí mismos. La potente actividad antitumoral sólo es evidente cuando su substrato (B) se administra separadamente más tarde. Haciendo esto, se observa menos toxicidad sistémica mientras que se exhibe una actividad antitumoral notable. Así, la presente invención ofrece grandes ventajas.
Los presentes inventores han encontrado una mejora significativa de la acumulación en tumores de XO en tejido tumoral después de que la XO se haya conjugado químicamente con poli(etilenglicol) (en lo sucesivo denominado aquí "PEG"; la XO conjugada químicamente con PEG se denomina aquí en lo sucesivo "PEG-XO") y de ahí el efecto antitumoral notable de tales conjugados, como PEG-XO.
La conjugación de PEG al grupo amino \varepsilon de los residuos de lisina sobre la superficie molecular de la XO reduciría la afinidad de unión a células endoteliales que contienen un alto nivel de cargas aniónicas. El enmascaramiento de los grupos amino catiónicos con PEG reduce la unión de PEG-XO a células endoteliales dando como resultado un tiempo de circulación en sangre mejorado y de ahí una acumulación de PEG-XO en el tumor por el efecto EPR. Administrando hipoxantina, el substrato de XO, después de la administración de PEG-XO, una acción antitumoral selectiva para el tumor puede ser efectuada por el producto de esta reacción enzimática, que es el peróxido (figura 1).
Según se menciona más adelante, los efectos previos también pueden lograrse usando otras oxidorreductasas además de XO con la administración subsiguiente de sus substratos apropiados.
Cuando se pone la invención en práctica, una cantidad terapéuticamente eficaz de la oxidorreductasa químicamente conjugada con PEG se administra a un paciente. Subsiguientemente, un substrato de la oxidorreductasa se administra adicionalmente.
Como las oxidorreductasas usadas en la presente invención, pueden citarse, por ejemplo, xantina oxidasa,
D-aminoácido oxidasa, glucosa oxidasa y galactosa oxidasa, entre las cuales se usa preferiblemente la xantina oxidasa.
Si se usa xantina oxidasa como la oxidorreductasa, su substrato es hipoxantina o xantina. Substratos de D-aminoácido oxidasa, glucosa oxidasa y galactosa oxidasa son D-aminoácidos, glucosa y galactosa, respectivamente.
Estas oxidorreductasas se conjugan químicamente con PEG.
La conjugación química de las oxidorreductasas con PEG puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales. La reacción se llevará a cabo bajo condiciones relativamente suaves, baja temperatura, pH de neutro a ligeramente alcalino en una solución acuosa para evitar la desnaturalización del enzima. También podría llevarse a cabo en disolventes incluyendo amoníaco líquido. Por otra parte, debe evitarse una modificación del residuo o los residuos de aminoácido que implique a la actividad enzimática. La conjugación de XO con PEG se describe más adelante.
La XO es una oxidorreductasa que tiene la hipoxantina o la xantina como substrato y produce ácido úrico y especies moleculares de oxígeno reactivas incluyendo peróxido (O_{2}^{-}) y H_{2}O_{2} aunque en una pequeña extensión. La XO puede obtenerse fácilmente a partir de leche bovina, sin embargo, la fuente de XO no está limitada a la lecha bovina en la presente invención.
De acuerdo con los hallazgos previos de los presentes inventores, el PEG es un polímero adecuado para se usado para la conjugación. Se sabe bien que el PEG es biocompatible y reduce la inmunogenicidad de proteínas extrañas durante la conjugación y mejora adicionalmente el tiempo de circulación en sangre de los conjugados (cfr: en Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, por Harris, J.M. Ed., Plenum: Nueva York, 1992, p. 153-169). Puede obtenerse PEG activado mediante varios métodos tales como la reacción de condensación entre PEG carboxilado y N-hidroxisuccinimida.
También puede usarse un PEG distinto al PEG de cadena simple normal, PEG biantenario, que tiene cadenas de PEG ramificadas dobles en un solo punto de conjugación. Este PEG biantenario se sintetiza usando PEG ramificado con succinimidilo. Tiene varias ventajas como un modificador de oxidorreductasa, tal como más reducción de la inmunogenicidad y una estabilidad incrementada contra la temperatura o diversas proteasas.
La conjugación de XO con PEG se lleva a cabo en tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,4, a temperatura ambiente o inferior, durante de 30 a 60 minutos en este caso. La extensión de la conjugación puede controlarse cambiando la relación de alimentación de PEG activado a residuos de lisilo en la XO. En el presente ejemplo, se obtuvo XO conjugada a 17-50% de residuos de lisina con succinimidil-PEG añadiendo un exceso molar de 1,2-6,7 de PEG a 1 mol de lisina en XO.
PEG-XO u otras macromoléculas biocompatibles pueden aportarse selectivamente a un tumor sólido debido al efecto EPR que se describe previamente (o véase Cancer Res., vol. 46, p. 6387-6392, 1986). Mediante la administración de hipoxantina o xantina inyectándolas intravenosamente después de la acumulación adecuada de PEG-XO en el tumor, pero después de la depuración en la circulación general o en órganos normales, la XO en el sitio del tumor genera especies moleculares de oxígeno reactivas tales como O_{2}^{-}- y H_{2}O_{2}, y ejerce una acción antitumoral única sin efectos secundarios sistémicos.
Los resultados de esta táctica terapéutica que usa XO e hipoxantina contra el modelo del tumor sólido S-180 en ratones demuestra la supresión significativa del crecimiento tumoral (figuras 1 y 2). Estos resultados sugieren que: i) las especies moleculares de oxígeno reactivas, que se generan mediante la reacción entre XO e hipoxantina, tienen una potente actividad antitumoral, y ii) la reacción entre XO e hipoxantina se produce en el tumor sólido o alrededor de su periferia. En contraste con esto, la XO natural no mostraba una actividad antitumoral significativa bajo las condiciones usadas (figura 1). Los efectos secundarios sistémicos de la terapia con PEG-XO/hipoxantina, que se evaluaron usando el peso corporal como parámetro, no parece ser tan significativos. Los resultados mostraban sólo una pérdida transitoria de peso corporal, el día 8-9, pero se recuperaban el día 10 (figura 3). No se observó hematotoxicidad o toxicidad hepática grave o significativa.
Para tratar el cáncer usando los agentes antitumorales de la presente invención, se administra en primer lugar una cantidad terapéuticamente eficaz de la oxidorreductasa químicamente conjugada, y después de dejar un espacio de tiempo adecuado para la acumulación de la oxidorreductasa químicamente conjugada en el tumor, se administra su substrato, la dosificación eficaz y de baja toxicidad del substrato es 10-100 mg/kg de peso corporal/día.
El tiempo apropiado para administrar el substrato es preferiblemente de 6 a 100 horas después de la administración de la oxidorreductasa químicamente conjugada.
Los agentes antitumorales de la presente invención pueden administrarse en la forma de una inyección o una dosificación oral. En el caso de la inyección, es aplicable cualquier subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial o local/directa. El tipo de preparación para la administración oral puede seleccionarse opcionalmente. Algunos ejemplos de este tipo son tabletas, gránulos, píldoras, medicinas líquidas, del tipo de jarabe aceitoso o acuoso, grageas y gotas.
Ejemplos
La presente invención se describe mediante ejemplos mostrados a continuación con detalle que no limitan el alcance de la invención.
Procedimiento de Síntesis Ejemplo 1 Síntesis de PEG-XO
XO de leche bovina (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, EE.UU. de A.) se purificó en primer lugar mediante ultrafiltración y se concentró con el uso de un "sistema Amicon" (una membrana de tamiz molecular) con una membrana PM 30 (tamaño de corte 30.000). La concentración de la solución de XO se ajustó hasta 10 mg/ml de proteína con tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7,4). Se añadió a la solución de XO PEG activado con succinimida (Pm 5000, Shearwater Polymers, Huntsville, AL) en relaciones molares de PEG sobre el grupo amino \varepsilon de la lisina en XO de 1,2 y 6,7, respectivamente, para preparar PEG-XOs que tenían una extensión baja y una alta de conjugación de PEG.
Los derivados de PEG sin reaccionar con grupos funcionales, los componentes descompuestos y otras impurezas se retiraron de forma similar mediante ultrafiltración usando una membrana PM-10 según se menciona previamente. Los conjugados así obtenidos se almacenaron en tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7,4) que contenía salicilato sódico 1 mM a 4ºC.
Características Fisicoquímicas y Bioquímicas Ejemplo 2 Determinación de la extensión de la conjugación a PEG
La extensión de la conjugación a PEG se determinó mediante la pérdida de grupos amino libres como resultado del acoplamiento a PEG. Se usó ácido 2,4, 6-trinitrobencenosulfónico para cuantificar los grupos amino libres de PEG-XO espectroscópicamente según se describe por Fields (Methods Enzymol., vol. 25, p. 464-468, 1972). Se usó glicina como un aminoácido estándar. Las concentraciones de proteína de XO natural y PEG-XO se cuantificaron usando the DC Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU. de A.). La relación molar de alimentación en exceso de succinimidil-PEG a 1,2 ó 6,7 con respecto a los grupos amino \varepsilon de la lisina en XO daba como resultado 17% o 49% de conjugación de PEG a XO, respectivamente. PEG-XO que tiene una porción de PEG de 17% o 49% de los grupos amino modificada mediante la conjugación se denomina aquí en lo sucesivo "PEG-XO-bajo" y "PEG-XO-alto", respectivamente.
El peso molecular de estos conjugados de PEG-XO era 383 kDa o 543 kDa, respectivamente, que se estimaron sobre la base del grado de conjugación, es decir, de la pérdida de grupos amino que se obtenía mediante el ensayo de TNBS. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1 Características fisicoquímicas y bioquímicas de XO natural y PEG-XO
Relación de alimentación (relación % conjugado Pm (kDa) Actividad de XO
molar de PEG/grupos amino) (U/mg de proteína)
XO Natural - 0 298 2,12
PEG-XO-bajo 1,2 17 383 2,40
PEG-XO-alto 6,7 49 543 1,15
Ejemplo 3 Cromatografía de exclusión por tamaños
El incremento del tamaño molecular de la XO después de la conjugación a PEG se demostró por medio de la cromatografía de exclusión por tamaños usando el sistema de FPLC (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) equipado con un columna Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia LKB) usando una fase móvil de tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7,4). La elución de los conjugados se detectó a 280 nm (figura 4).
Ejemplo 4 Actividad enzimática de PEG-XO
La actividad enzimática se determinó cuantificando la formación de ácido úrico a partir de hipoxantina midiendo el incremento de absorbancia a 290 nm, un máximo de absorción de ácido úrico. La concentración inicial del substrato hipoxantina era 50 \muM. La reacción enzimática se llevó a cabo en tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7,4) a temperatura ambiente. Una unidad de actividad de XO se define como la velocidad de la formación de 1 \mumol de ácido úrico por minuto. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
PEG-XO-bajo mostraba un ligero incremento de la actividad (110%) en comparación con XO natural. PEG-XO-alto, incluso después de una conjugación de 49% del grupo amino, retenía 54% de la actividad enzimática original de XO natural.
Estudios farmacocinéticos Ejemplo 5 Distribución in vivo de conjugado de PEG-XO después de la inyección intravenosa
La distribución in vivo de XO natural y PEG-XO alto se examinó usando derivados marcados con ^{125}I radioemisores. Tanto XO natural como PEG-XO-alto radiomarcados se prepararon mediante el método de la cloramina T.
Células tumorales de sarcoma 180 se implantaron subcutáneamente con 2 x 10^{6} células en ratones ddY macho de 6 semanas de edad, que pesaban 30-35 g, de SLC Inc., Shizouka, Japón. El estudio de la distribución en órganos o tejido se organizó el día 7-10 después de la inoculación del tumor, cuando los tumores tenían 5-7 mm de diámetro, pero no contenían región necrótica.
Se administró XO natural o PEG-XO-alto marcados con ^{125}I a ratones a través de la vena de la cola (100 \mul/ratón). Después de 24 h, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron muestras de sangre mediante punción cardíaca, y se sometieron a reperfusión con solución salina que contenía heparina para retirar componentes sanguíneos en los vasos sanguíneos de los tejidos. El tejido tumoral así como tejidos normales, incluyendo el hígado, el cerebro, el bazo, músculo, piel, corazón, pulmón, colon y riñón, se recogieron y se pesaron. Las radiactividades de esos tejidos se midieron mediante un contador gamma.
Según se muestra en la figura 5, se encontró que PEG-XO-alto mejoraba significativamente la acumulación tanto sanguínea como tumoral en comparación con la de XO natural, mientras que se observaba un incremento ligero o insignificante en la acumulación en otros órganos normales para PEG-XO-alto. Por otra parte, se observó menos acumulación de PEG-XO-alto en el riñón que con XO natural.
Ejemplo 6 Desarrollo temporal de la acumulación tumoral de conjugado de PEG-XO
El desarrollo temporal de la acumulación tumoral de PEG-XO-alto se examinó midiendo la actividad enzimática derivada de PEG-XO-alto en el tejido tumoral. Ratones que tienen tumores se prepararon como se describe previamente. Se inyectó intravenosamente (i.v.) PEG-XO-alto (2 U/ml, 100 \mul) a los ratones. Después de un período dado, el tejido tumoral se retiró según se describe previamente. El tejido tumoral se homogeneizó a continuación con tres volúmenes de tampón de fosfato potásico 20 mM, pH 7,6, que contenía ácido etilendiaminotetraacético 2 mM, fluoruro de amidinofenilmetanosulfonilo 2 mM, ditiotreitol 10 mM, 0,5 \mug/ml de leupeptina. Los homogenados se centrifugaron a 10.000 g durante 20 minutos y cada sobrenadante se aplicó a un sistema de FPLC con una columna Superose 6 HR 10/30 similar a la sección previa. La actividad enzimática de la fracción de PEG-XO-alto se determinó fluorométricamente, es decir, la formación de isoxantopterina fluorescente a partir de pterina se midió con una excitación a 345 nm y una emisión a 390 nm, en la que la hipoxantina se reemplazó por pterina como substrato. La cuantificación se realizó usando la curva de calibración de la isoxantopterina auténtica (Aldrich Chemical, Milwauikee, WI).
La acumulación tumoral de PEG-XO-alto con su actividad enzimática se demostró midiendo la actividad de XO del homogenado del tumor antes y 24 horas después de la inyección de PEG-XO-alto. Los resultados se muestran en la figura 6.
En tejido de tumor sólido S-180 sin la administración de PEG-XO-alto, la actividad de XO aparece sólo en una fracción correspondiente a XO natural. Esto significa que había existido una pequeña cantidad de XO en el tejido tumoral endógenamente (figura 6A). Por otra parte, con el tejido de tumor sólido después de la inyección de PEG-XO-alto (0,2 U/ratón), se observaba un nuevo pico grande de actividad de XO en el intervalo de peso molecular diferente de la XO natural. Este nuevo pico que consistía en los números de fracción de 11, 12 y 13 corresponde al intervalo de peso molecular de PEG-XO-alto, según se demuestra en la figura 4.
Así, las figuras 6A y 6B muestran que la actividad de XO en el tumor, correspondiente al intervalo de peso molecular de PEG-XO-alto, aparecía después de la administración de PEG-XO-alto.
Además, la actividad de PEG-XO-alto se incrementaba de una manera dependiente del tiempo (figura 7).
Actividad antitumoral in vivo Ejemplo 7 Actividad antitumoral de PEG-XO in vivo
Se implantó sarcoma 180 subcutáneamente con 2 x 10^{6} células en ratones ddY macho de 6 semanas de edad, que pesaban 30-35 g. Cuando los tumores se hacían palpables (5-7 mm de diámetro), habitualmente 7 días después de la implantación, el tratamiento se reanudó.
Después, XO natural o PEG-XO-alto se inyectó intravenosamente (2 veces, 0,6 U/ratón, la primera vez 7 días y la segunda vez 9 días después de la inoculación del tumor) a los ratones. Se inyectó intraperitonealmente hipoxantina (13,3 mg/kg) seis veces, cada vez más de 6 horas después de la última vez, según se indica por asteriscos (*) en las figuras 1 a 3. Se observó una supresión significativa (p < 0,05) del crecimiento tumoral en ratones administrados con PEG-XO-alto. Sin embargo, un tratamiento similar mediante XO natural no mostraba una reducción significativa del crecimiento del tumor (figura 1). Los pesos del tumor 15 días después de la inoculación del tumor eran 0,36 \pm 0,12 g (control), 0,31 \pm 0,03 g (tratamiento con XO natural) y 0,22 \pm 0,05 g (tratamiento con PEG-XO-alto), respectivamente, lo que indica que se alcanzaba 39% de inhibición del crecimiento tumoral mediante sólo dos administraciones de PEG-XO-alto.
Mediante tres administraciones de PEG-XO-alto (7, 8 y 9 días después de la inoculación del tumor, 0,6 U/ratón) y 6 inyecciones intraperitoneales subsiguientes de hipoxantina (13,3 mg/kg) según se indica por los asteriscos (*), se observó una actividad antitumoral notable de PEG-XO-alto (figura 2). 13 días después de la inoculación del tumor, los pesos del tumor eran 0,057 \pm 0,24 g (control) y 0,13 \pm 0,08 g (tratamiento con PEG-XO-alto), correspondientes a una inhibición de 77% del crecimiento tumoral por PEG-XO-alto.
Ejemplo 8 Efecto secundario sistémico de PEG-XO
Para examinar el efecto secundario sistémico de la administración de PEG-XO-alto, se investigó el cambio del peso corporal después de la administración de PEG-XO-alto. Se inyectó intravenosamente PEG-XO-alto 3 veces (7,8 y 9 días después de la inoculación del tumor, 0,6 U/ratón). Se inyectó intraperitonealmente hipoxantina (13,3 mg/kg) 6 veces según se indicaba por los asteriscos (*).
\newpage
Según se muestra en la figura 3, se observó una disminución ligera pero significativa del peso corporal el día 8 y el día 9, pero a continuación el peso corporal se recuperó hasta el nivel normal aproximadamente el día 10 o más tarde. Así, la toxicidad es reversible y transitoria.
La invención se ilustra mediante los dibujos adjuntos.
La figura 1 muestra el efecto de XO natural y PEG-XO-alto sobre el crecimiento de tumor sólido S-180 en ratones ddY (administración 2 veces).
La figura 2 muestra el efecto de PEG-XO-alto sobre el crecimiento de tumor sólido S-180 en ratones ddY (administración 3 veces).
La figura 3 muestra el cambio en el peso corporal de ratones ddY con y sin un tratamiento con PEG-XO-
alto/hipoxantina.
La figura 4 muestra una cromatografía de exclusión por tamaños de XO natural y PEG-XO.
La figura 5 muestra la distribución corporal de XO natural y PEG-XO-alto marcados con ^{125}I después de la inyección intravenosa a ratones ddY que tienen tumor sólido S-180.
Las figuras 6A y 6B muestran la actividad de XO de tejido de tumor sólido S-180 antes y 24 horas después de una inyección de PEG-XO-alto, respectivamente.
La figura 7 muestra la acumulación dependiente del tiempo de PEG-XO-alto en tejido tumoral.

Claims (2)

1. Agente antitumoral, caracterizado por una combinación de una oxidorreductasa en forma de xantina oxidasa, D-aminoácido oxidasa, glucosa oxidasa y/o galactosa oxidasa, oxidorreductasa que está conjugada químicamente con poli(etilenglicol), y de un substrato de la oxidorreductasa en forma de hipoxantina, xantina, un D-aminoácido, glucosa y/o galactosa.
2. Agente antitumoral de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la oxidorreductasa es xantina oxidasa y el substrato de la oxidorreductasa es hipoxantina o xantina.
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