CN102634492B - 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

聚乙二醇(PEG)化犬源尿酸氧化酶类似物，其中犬源尿酸氧化酶类似物为天然犬源尿酸氧化酶和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及突变体蛋白，聚乙二醇的平均分子量约为1kDa-40kDa，每个尿酸氧化酶单体平均偶联2-15个聚乙二醇分子。制备上述聚乙二醇(PEG)共价修饰的哺乳动物来源尿酸氧化酶的方法可使酶活保留率高于85.0％，纯度高于95.0％。按本发明方法得到的聚乙二醇(PEG)共价修饰的犬源尿酸氧化酶类似物及其药物组合物可用于预防和/或治疗血液肿瘤化疗导致的急性高尿酸血症和代谢紊乱导致的高尿酸血症及慢性痛风。

Description

聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术及制药领域。更具体而言，本发明涉及一种酶活保留率高、免疫原性低、半衰期长并可多次反复用药的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用。本发明是发明名称为“人源化尿酸氧化酶”(申请号：200910191240.3)发明专利的延伸。
背景技术
背景部分的陈述并不是对现有技术的全盘接受，相反，它反映了本发明人对进行此项发明时的技术情况的主观评价和解释。这些解释可能包括本发明人自己的、迄今为止尚未透露的对现有技术的洞悉。而这些洞悉本身并不是现有技术的一部分。
高尿酸血症是一种因嘌呤代谢过多而引起的疾病。人体内的嘌呤经过一系列代谢，最终形成的产物为尿酸。当血液尿酸浓度超过70mg/L时，便可引起高尿酸血症，根据其发病机理及持续时间的不同，它又可被细分为急性高尿酸血症和慢性高尿酸血症。急性高尿酸血症是血液肿瘤及其治疗中的一种常见并发症。血液肿瘤放化疗后可引起由细胞溶解增多和嘌呤代谢物释放导致体内尿酸浓度急剧升高，引起急性高尿酸血症，严重时可导致急性肾衰竭(Hershfield M S.Cecil Textbook ofMedicine(20th).1508-1515.)。血液肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。常见的血液肿瘤主要包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。慢性高尿酸血症是人体内嘌呤代谢紊乱导致的慢性代谢类疾病，而痛风则是一种由慢性高尿酸血症进一步发展而形成的疾病，并因尿酸结晶沉积到软组织导致急性或慢性病变。痛风的主要临床表现是反复发作的关节炎和(或)肾病变；同时血尿酸水平长期增高可使尿酸以结晶形式沉积于结缔组织，先形成肉芽肿，后逐渐形成痛风石(Nancy J G，Susan J K，Edna S，John S S et al.Arthritis Res Ther.2005.8(1)：R12)。近20余年来，随着人类生活水平的提高，慢性高尿酸血症/痛风的患病率不断攀升。英国流行病学调查显示，痛风患病率从1990年的1.19％增至1999年的1.4％(Wallace K，RiedelA，Joseph-Ridge N，Wortmann R.JRheumatol.2004.31：1582-1587.)。2008年我国山东沿海的调查结果显示：高尿酸血症患者占总人口的13.19％，而痛风的患病率高达1.14％(Miao Z，Li C，Chen Y，et al.J Rheumatol.2008；35：1859-1864)。该类疾病已成为危害人类健康的重要疾病。
本质上，高尿酸血症是人在进化过程中尿酸氧化酶的基因突变失活的结果，突变在人尿酸氧化酶基因编码序列中引入提前终止密码子(Wu X，Lee C C，Muzny D M，Caskey C T.Proc Natl Acad Sci USA.1989.86：9412-9416)，人类因此而不能自身合成活性尿酸氧化酶，从而导致嘌呤分解代谢终止于尿酸(Wu X，Muzny D M，Lee C C，Caskey C T.J Mol Evol.1992.34：78-84)。在非人类灵长目动物和其他哺乳动物的肝过氧化物酶体中的活性尿酸氧化酶可将溶解性低的尿酸盐(～11mg/dl)转变为易溶的尿囊素(～147mg/dl)后，由肾脏更有效的排泄(Wortmann R L，Kelley W N.Kelley’s textbook of rheumatology(6th).2001.1339-1376)。目前国际上已上市的尿酸氧化酶类药物有2002年FDA批准上市的由法国Sanofi公司生产的重组黄曲霉来源尿酸氧化酶(Rasburicase)(Bosly A，Sonet A，Pinkerton C R，McCowage G，Bron D，Sanz M A，Van den Berg H.Cancer.2003.98：1048-54)。由啤酒酵母发酵纯化的重组黄曲霉尿酸氧化酶药物Rasburicase可用于由肿瘤化疗引起的严重高尿酸血症的短期治疗，其治疗高尿酸血症疗效较别嘌醇显著。然而，由于黄曲霉来源的尿酸氧化酶与推测出的无活性人源尿酸氧化酶的同源性低于40％(Lee C C，Wu X，Gibbs RA，Cook R G，Muzny D M，Caskey C T.Science.1988.239：1288-1291)，多次给药后70％病人体内产生抗体，在产生抗尿酸氧化酶抗体的患者体内，黄曲霉尿酸氧化酶的功效迅速减小，并且发生了严重变应性反应(Navolanic P M，Pui C-H，Larson RA，et al.Leukemia.2003.17：499-514)。
用聚乙二醇(PEG)对蛋白进行共价修饰，证明能用来降低蛋白免疫原性、增加蛋白溶解度并延长蛋白的半衰期(Veronese FM，Pasut G.Drug Discov Today.2005；10：1451-458)。目前FDA已批准了多种PEG修饰重组蛋白药物上市。PEG要和目标分子结合，需对PEG分子一端或两端进行活化，根据要连接分子的特性来选择活化所需的功能基团。用于PEG共价修饰蛋白质的连接基团可以是任何生物相容的连接基团。常见的生物相容的连接基团包括酯基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、琥珀酰亚胺基(例如琥珀酰亚胺基琥珀酰酯(SS)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)、环氧基、氧羰基咪唑基、硝基苯基团(例如硝基苯碳酸盐(NPC)或三氯苯碳酸盐(TPC))、组氨酸基团或伯胺。活化后的PEG理论上可以和蛋白质中主要的氨基酸如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸等反应，反应可以在N端，也可以在C端，但以和赖氨酸和N端的基团反应最常见。
研究人员自19世纪70年代末即开始了PEG修饰尿酸氧化酶研究，Nihimura和Tsuji等人分别用氰尿酰氯活化的5kDa PEG修饰剂对单假丝酵母来源尿酸氧化酶进行修饰，但是当修饰率达到20％-30％时，酶活保留率均降低至50％以下，均无法在充分保留酶活的情况下进一步降低其免疫原性(NishimuraH，Ashihara Y，MatsushimaA，Inada Y，Enzyme.1979.24：261-264.Tsuji J-1，Hirose K，Kashara E，Naitoh M，Yamamoto I.Int JImmunopharmacol.1985.7：725-730.)。先前的研究人员还研究了PEG化的尿酸氧化酶对在人体内的反应。Davis等人将来源于单假丝酵母的尿酸氧化酶与分子量为5kDa的PEG结合，偶联物注射到五名试验者身上后，试验者血清中的尿酸氧化酶浓度降低到了检测不出的水平，四星期后再次注射后，用灵敏度相对不高的凝胶扩散方法没有检测到尿酸氧化酶的抗体(Davis F F，Abuchowshi A，Karp D.J Pharmacol ExpTher.1981.219：352-354.)。由上可知，PEG化的尿酸氧化酶在人体内是安全的，并且具备一定的效果，但是由于他们使用的尿酸氧化酶的高抗原性，以及当时使用的PEG试剂本身存在不足，使得这些制备物在长期安全性和有效性方面存在隐患。
随着第二代高分子量分枝状PEG的出现，人们对PEG修饰尿酸氧化酶进行了新的探索。美国Duke大学和Savient公司在得到重组猪-狒狒尿酸氧化酶以后，用10kDa mPEG-NPC对尿酸氧化酶的赖氨酸残基进行修饰(Pegloticase)(Michael H，Susan J.K.2006.US7056713B1)，当每个亚基偶联9条PEG后，酶活能保持75％以上，而且动物实验表明其已基本消除了免疫原性(Sherman MR，Saifer MG，Perez-Ruiz F.Adv Drug Deliv Rev.2008.60：59-68)。Pegloticase已于2010年9月14日得到FDA批准正式上市，可用于难治性痛风的长期治疗(6个月)。但是，90％的临床试验者产生了抗-Pegloticase抗体，而且该药只能用于静脉推注。潜在的免疫原性和给药途径的不便，将降低慢性痛风患者长期治疗的依从性。
美国的Phoenix药物公司同样进行了PEG修饰尿酸氧化酶的药物开发研究(Ensor C M，Clark M A，Holtsberg F W.2005.US 6913915B2)，他们修饰的尿酸氧化酶为单假丝酵母尿酸氧化酶；优选的PEG材料是mPEG-SC和mPEG-SPA，平均分子量为20KD；修饰的位点同样是赖氨酸残基，每个蛋白偶联18-22个PEG链，修饰后的尿酸氧化酶保持了75％的活性，在小鼠体内的半衰期达到了3天，远长于未修饰尿酸氧化酶的4小时(Bomalaski J S，Holtsberg F W，Ensor C M，Clark MA.J Rheumatol.2002，29：1942-1949)。该PEG修饰的尿酸氧化酶于2001年开始临床研究，但I期临床结果显示给药后体内药效减弱，因此终止于I期临床(Bolmalaski J S，Goddard D H，Grezlak D，et al.Arthritis Rheum.2002，46：S141)。
到目前为止，在世界范围内，还没有商业化的具有适当长半衰期，能在长期治疗中安全使用而无免疫原性的尿酸氧化酶产品。人源尿酸氧化酶基因因突变而失去活性，成为假基因。如果将其改造，恢复其降解尿酸的酶活性，必能降低外源尿酸氧化酶在人体中的免疫原性。但人源尿酸氧化酶基因在进化过程中，由于缺乏选择压力，累积了部分有害错义突变，很难找出并更正所有突变以恢复其尿酸氧化酶活性。微生物尿酸氧化酶的高活性和哺乳动物尿酸氧化酶的低免疫原性，使得这两大来源的尿酸氧化酶成了目前开发应用的长效尿酸氧化酶的研究热点。PEG修饰虽然可以降低微生物来源尿酸氧化酶免疫原性，但是仍然未能有效消除在人体内的免疫反应，国外开发的PEG修饰重组微生物尿酸氧化酶(如Phenix Inc.和EnzonInc.)均终止了长期治疗慢性痛风的临床研究。相反的，在哺乳动物尿酸氧化酶研究方面，杜克大学(DukeUniversity)和山景公司(SavientInc.)开发的PEG修饰类似猪源尿酸氧化酶研究已成功上市。这表明尿酸氧化酶蛋白同源性仍然是影响PEG修饰后蛋白免疫原性的重要因素。为了进一步提高尿酸氧化酶蛋白同源性，本发明人以与人源化尿酸氧化酶同源性更高、酶比活性更高的犬源尿酸氧化酶为基础进行了人犬嵌合尿酸氧化酶研究，已经分别申报国家专利(申请号：200910191240.3)与国际专利(申请号：PCT/CN2010/071020)。本发明在上述专利设计的犬源尿酸氧化酶类似物基础之上进行了PEG修饰研究，旨在提供新一代长效重组尿酸氧化酶，在保留高酶活的同时，延长体内半衰期、降低免疫原性，适用于肿瘤化疗引起的急性高尿酸血症和代谢紊乱导致的高尿酸血症及慢性痛风的治疗。
发明内容
本发明的目的就是提供新型的犬源尿酸氧化酶类似物的聚乙二醇偶联物。该偶联物涉及的犬源尿酸氧化酶类似物蛋白包括但不局限于天然犬源尿酸氧化酶蛋白和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及突变体蛋白。
本发明的另一目的是提供制备上述聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的方法。该方法包括制备四聚体含量高于95.0％的尿酸氧化酶蛋白、PEG修饰和修饰后蛋白的纯化。
本发明的另一目的是提供上述聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的应用。该偶联物可用于预防和/或治疗血液肿瘤化疗导致的急性高尿酸血症和代谢紊乱导致的高尿酸血症及慢性痛风。
在本发明的第一方面，用于PEG偶联的犬源尿酸氧化酶类似物均来源于申请号为200910191240.3的中国发明专利。它包括：犬源尿酸氧化酶蛋白(SEQ ID No：1)和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及其突变体蛋白。其中含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白的N端前240个氨基酸为犬源尿酸氧化酶蛋白第1-240位氨基酸，剩下的64个氨基酸为人源尿酸氧化酶的第241-304位氨基酸(SEQ ID No：2)；其中含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白的突变体蛋白包括但不局限于下述具有2-5种突变的突变体蛋白(各突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸)：S246T-S248G-R249Q(SEQ ID No：3)、L245H-A252E-I253M(SEQ ID No：4)；上述犬源尿酸氧化酶蛋白和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及其突变体蛋白的N端可截短1至9个氨基酸序列(SEQ ID No：5)，C端可截短1至3个氨基酸序列(SEQ ID No：6)。
在本发明的第二方面，用于对犬源尿酸氧化酶类似物进行PEG修饰的位点包括但不局限于尿酸氧化酶蛋白中N端的α氨基和赖氨酸残基的ε氨基。更优的，PEG修饰位点为赖氨酸残基的ε氨基。犬源尿酸氧化酶类似物通过氨酯键、仲胺键或酰胺键与PEG的活性基团进行共价连接。更优的，犬源尿酸氧化酶类似物通过酰胺键与PEG的活性集团进行共价连接。PEG的连接基团包括但不局限于琥珀酰亚胺基、硝基苯、酰胺基、酰胺亚基、胺基甲酸酯基、醛基、组氨酸基团。更优的，PEG的连接基团为琥珀酰亚胺基基团和硝基苯基团。更优的，PEG的连接基团为琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)和硝基苯碳酸盐(NPC)。其中聚乙二醇的封闭基团包括但不限于单甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、半乳糖或葡萄糖等。更优的，聚乙二醇的封闭基团为单甲氧基。聚乙二醇可以是支链的或直链的。更优的，聚乙二醇为直链。聚乙二醇的平均分子量约为平均分子量约为1kDa-40kDa。更优的，聚乙二醇的平均分子量为5kDa-20kDa。更优的，聚乙二醇的平均分子量为5kDa。每个犬源尿酸氧化酶类似物单体平均偶联2-15个聚乙二醇分子。更优的，每个尿酸氧化酶单体上偶联的聚乙二醇链的数量为4-12个。更优的，每个尿酸氧化酶单体上偶联的聚乙二醇链的数量为6-11个。
在本发明的第三方面，用于制备上述犬源尿酸氧化酶类似物的聚乙二醇偶联物。用于制备修饰前尿酸氧化酶四聚体的方法包括但不局限于分子筛层析、离子交换层析。更优的，制备修饰前尿酸氧化酶四聚体的方法为阴离子交换层析。偶联反应中犬源尿酸氧化酶类似物与聚乙二醇修饰剂的摩尔比为1∶40～1∶200。更优的，犬源尿酸氧化酶类似物与聚乙二醇修饰剂的摩尔比为1∶120～1∶160。偶联反应体系为碳酸盐缓冲液，其pH范围为8.0-11.0，离子强度范围为10-200mmol/L。更优的，碳酸盐缓冲的pH范围为9.5-10.5，离子强度范围为50-150mmol/L。采用的色谱层析法和/或超滤法，分离聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，包括而不限于分子筛层析、离子交换层析、疏水层析、切向流超滤。更优的，分离纯化聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的方法为分子筛层析。
在本发明的第四方面，提供了一种含有上述犬源尿酸氧化酶类似物的聚乙二醇偶联物的药物组合物及其应用。该药物组合物中含有有效剂量的选自权利要求1-18的任一偶联物和一种药学上可接受的载体，可用于预防和/或治疗血液肿瘤化疗导致的急性高尿酸血症和代谢紊乱导致的高尿酸血症及慢性痛风。血液肿瘤包括但不局限于白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。高尿酸血症及慢性痛风的主要症状包括但不局限于尿酸性肾病和痛风性关节炎。该药物组合物的给药途径包括但不局限于静脉注射、皮下注射、肌肉注射和腹腔注射或吸入雾状制剂。更优的，该药物组合物的给药途径为静脉注射和皮下注射。
未修饰四聚体尿酸氧化酶的分子量一般为140kDa，而分子量大于100kDa的蛋白分子即可有效的激活体内免疫系统。Phenix公司研发的20kDa mPEG修饰单假丝酵母来源尿酸氧化酶在2000年I期临床时由于高免疫原性而终止了其临床研究(Bolmalaski J S，Goddard D H，Grezlak D，et al.Arthritis Rheum.2002，46：S141)。目前已上市的Pegloticase为10kDa mPEG修饰，修饰后蛋白的分子量为540kDa(Sherman MR，Saifer MG，Perez-Ruiz F.Adv Drug Deliv Rev.2008.60：59-68)，这可能导致了Pegloticase在临床阶段仍然显示出了高免疫原性。而且，注射Pegloticase后产生抗体主要是针对Pegloticase的PEG部分，因此，利用更小分子量的5kDa mPEG进行修饰可能会降低针对PEG的抗体的产生进而降低整个PEG修饰尿酸氧化酶的免疫原性。Pegloticase在I期临床时曾进行了皮下注射的研究，但是由于其在注射部位释放缓慢并产生了注射部位刺激反应，因此Savient公司终止了Pegloticase皮下注射的研究(GansonN J，Kelly S J，ScarlettE，Sundy J S，Hershfield M S.Arthritis Res Ther.2006.8：R12)。利用更小的5kDa mPEG进行修饰可能会增加药物在注射部位的吸收速度，减少注射部位的刺激反应，并提高皮下注射的生物利用度。因此，在本发明的具体实施方案中，利用已经被用在多个已上市PEG修饰蛋白药物的5kDa mPEG进行犬源尿酸氧化酶类似物的修饰研究。
活性尿酸氧化酶是四聚体蛋白，尿酸氧化酶蛋白家族中大约三分之一的氨基酸是强疏水性氨基酸(Colloc′h N，Poupon A，Momon J P.Proteins.2000.39：142-154)，因此理论上讲四聚体蛋白间容易聚集形成八聚体及更大的聚合体。目前已经公开的微生物来源尿酸氧化酶晶体X衍射实验中已经证实了八聚体形式尿酸氧化酶的存在(Retailleau P，Colloc′h N，Civares D，et al.Acta Crystallogr.，Sect.D.2005.61：218-229.)。美国FDA的专家认为分子量超过100kDa的分子即可有效诱导机体产生免疫反应(Rosenberg，A S.AAPS J.2006.8：E501-507.)，而四聚体尿酸氧化酶蛋白的分子量已经达到140kDa，未修饰尿酸氧化酶多聚体将具有更高的免疫原性。本发明人曾尝试Phenyl或Butyl等疏水相互作用层析和黄嘌呤亲和层析等方法，但均无法有效分离不同聚集形式犬源尿酸氧化酶类似物蛋白，这说明活性尿酸氧化酶四聚体及多聚体的疏水性质无明显差异，这种聚集并非疏水聚合所致，且上述多聚体均为活性尿酸氧化酶形式；本发明人试验了离子相互作用层析，在本发明该方面的一个优选实施方案中，利用高分辨率的Source 15Q填料可有效分离不同聚集形式犬源尿酸氧化酶类似物蛋白：洗脱四聚体尿酸氧化酶蛋白所需的离子强度低于洗脱多聚体所需的离子强度，这表明在相同缓冲条件下，多聚体犬源尿酸氧化酶类似物蛋白聚集后掩盖了部分碱性氨基酸，进而使其等电点下移，在相同碱性环境下负电荷带电量高于四聚体蛋白。更优的，根据未修饰四聚体和多聚体尿酸氧化酶之间离子性质的差异利用阴离子交换层析的方法制备的四聚体尿酸氧化酶含量高于95.0％。
5kDa PEG修饰尿酸氧化酶研发的最大瓶颈问题为对蛋白进行充分修饰时酶活损失过快，进而失去了其有效性(Chen R H，Abuchowski A，Van Es T，Palczuk N C，Davis F F.Biocheim Biophys Acta.1981.660：293-298)。本发明人发现，四聚体尿酸氧化酶含量高于95.0％的尿酸氧化酶经5kDa PEG饱和修饰后，酶活保留率高于85％。在本发明该方面的一个具体实施方案中，本发明人比较了不同多聚体含量的四聚体修饰后酶活保留情况，将四聚体尿酸氧化酶含量为10.8％的尿酸氧化酶蛋白进行修饰后，酶活保留率仅为71.7％，将四聚体尿酸氧化酶含量高于95.0％的尿酸氧化酶蛋白进行修饰后，酶活保留率高于85.0％，这表明多聚体尿酸氧化酶蛋白含量的增加是5kDa PEG修饰尿酸氧化酶活性损失过大的原因。除去多聚体尿酸氧化酶不仅可消除产生潜在免疫原性的隐患，还可增加5kDa PEG修饰后酶活保留率，克服了5kDa PEG修饰尿酸氧化酶研发的最大瓶颈问题。
常用的蛋白PEG修饰位点包括N末端α-氨基修饰、赖氨酸ε-氨基修饰、半胱氨酸巯基修饰、C末端羧基修饰等。由于活性四聚体尿酸氧化酶蛋白分子量高达140kDa，其他激素和细胞因子常用的N、C末端定点修饰无法降低其免疫原性，而犬源尿酸氧化酶类似物蛋白中仅含有4个游离巯基，每个单体理论上最多仅能偶联4个PEG分子，仍然无法达到上述要求，因此仅能对犬源尿酸氧化酶类似物蛋白的Lys进行非定点修饰。由于尿酸氧化酶分子较大，在本发明该方面的一个实施方案中，将不同修饰比例的犬源尿酸氧化酶类似物免疫小鼠，发现只有当每个单体偶联6个以上的PEG才能充分降低未修饰蛋白免疫原性。更优的，每个尿酸氧化酶单体上偶联的聚乙二醇链的数量为6-11个。
PEG一般通过氨酯键、仲胺键或酰胺键与尿酸氧化酶蛋白中赖氨酸残基的氨基连接。更优的，利用酰胺键将PEG与蛋白进行共价连接。更优的，利用琥珀酰亚胺基将PEG与蛋白进行共价连接。琥珀酰亚胺基包括但不限于琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)、琥珀酰亚胺基甲酸酯(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羟基一琥珀酰亚胺(NHS)。琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)与琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)等相比，在水溶液中的稳定性更强，连接效率更高。在本发明的一个优选实施方案中，利用琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)将犬源尿酸氧化酶类似物赖氨酸残基的ε-氨基与5kDa PEG进行共价连接。
PEG是通过环氧化物环上的氢氧根离子的亲电进攻引发的环氧乙烷的负离子开环聚合而成的(Roberts M J，Bentley M D，Harris J M.Adv Drug Deliv Rev.2002.54：459-476.)，这种阴离子介导的聚合反应在两端均会残余一个羟基。如不对其一端进行封闭，在下一步活化过程中，两端羟基均可偶联活性基团，进而形成双功能修饰剂，导致两个或多个蛋白发生交联形成更大分子量偶联物，带来额外的免疫原性(Veronese F M.Biomaterials.2001.22：405-417)。如将一端的羟基进行封闭，即可得到蛋白质修饰时最常用的单甲氧基聚乙二醇(Monomethoxy PEG)mPEG；另一端未封闭的羟基可以跟不同的活性基团反应，进而对蛋白质分子中不同的基团进行修饰。在本发明的具体实施方案中，PEG试剂均为一端封闭的单功能试剂。聚乙二醇的封闭基团包括但不限于单甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、半乳糖或葡萄糖等。在本发明该方面的一个优选实施方案中，聚乙二醇的封闭基团为已经被成功用在多个已上市PEG修饰蛋白药物的安全性得到充分证明的单甲氧基。
活性基团为琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)的PEG修饰剂与蛋白偶联的常规pH范围为7.0-9.0(Roberts MJ，Bentley M D，Harris J M.Adv Drug Deliv Rev.2002.54：459-476.)。为了进一步提高犬源尿酸氧化酶类似物的溶解性、增加可用的犬源尿酸氧化酶类似物蛋白赖氨酸残基修饰位点和修饰的专一性，在本发明的一个优选实施方案中，将pH调整至9.0-11.0可使PEG试剂充分专一的与犬源尿酸氧化酶类似物蛋白赖氨酸残基的ε-氨基偶联，而不与犬源尿酸氧化酶类似物蛋白N端的α-氨基反应。更优的，修饰的pH范围为9.5-10.5。在该pH范围内常用的偶联反应体系包括但不局限于磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液和碳酸盐缓冲液，为了进一步维持犬源尿酸氧化酶类似物的溶解性，在本发明的一个优选实施方案中，选用碳酸盐作为偶联反应的缓冲体系。常用的碳酸盐缓冲液的浓度范围为10-200mmol/L，为了增加5kDa修饰剂的修饰效率，在本发明的一个优选实施方案中，选用50-150mmol/L作为碳酸盐缓冲的工作浓度。为了进一步增加犬源尿酸氧化酶类似物蛋白偶联的PEG的数量，可用的偶联反应中犬源尿酸氧化酶类似物与聚乙二醇修饰剂的摩尔比为1∶40～1∶160。更优的，偶联反应中犬源尿酸氧化酶类似物与聚乙二醇修饰剂的摩尔比为1∶120～1∶160。
修饰后蛋白常用的纯化方法包括而不限于分子筛层析、离子交换层析、疏水层析、切向流超滤。本发明人经过系统的研究发现，经多位点5kDPEG修饰后不仅未修饰蛋白的免疫原性充分降低，而且犬源尿酸氧化酶类似物蛋白的离子性质、疏水性质等也被充分覆盖，很难与常规的离子交换层析填料、疏水层析填料及反相作用填料结合。在本发明该方面的一个优选实施方案中，利用分子筛层析可有效将修饰后蛋白与未修饰蛋白及修饰过程中副产物分离。经该方法纯化的修饰后犬源尿酸氧化酶类似物蛋白经RP-HPLC和SEC-HPLC检测后，纯度均高于99.0％。
本发明所涉及的PEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物为临床药用制剂的有效成分，该制剂包括但不限于：稀释剂、稳定剂、防腐剂、溶解剂、乳化剂、佐剂和载体等。1)稀释液：磷酸盐、醋酸盐Tris-Hcl等缓冲液；2)pH值和离子强度；3)去污剂和溶解剂：山梨醇、Tween-20、Tween-80；4)充填剂：乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇。有效成分的有效剂量是指考虑到表观分子量和病人体重、年龄等因素的有效治疗或预防剂量。在本发明的一个优选实施方案中，制剂中用到的稀释液为10-20mM，pH7.4-9.0；溶解剂为0.004％-0.04％Tween-20；充填剂为4％-5％的甘露醇。
本发明所涉及的给药步骤包括但不局限于静脉注射、皮下注射、肌肉注射和腹腔注射或吸入雾状制剂。在本发明的一个优选的实施方案中，在与人同源性更高的食蟹猴体内注射5kDa mPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物后清除半衰期可达到134.3h，这表明mPEG-rCU蛋白注射到人体内后半衰期同样可大于1周，可实现1-2周注射一次的预期。而且，皮下注射的生物利用度高于60％，这表明在人体试验时可将皮下注射作为一个备选注射途径，这将提高病人长期治疗时的依从度。
本发明所涉及的包含有PEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物有效成分的药物组合物可用于预防和/或治疗血液肿瘤化疗导致的急性高尿酸血症和代谢紊乱导致的高尿酸血症及慢性痛风。血液肿瘤包括但不局限于白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。高尿酸血症及慢性痛风的主要症状包括但不局限于尿酸性肾病和痛风性关节炎。血液尿酸浓度升高是高尿酸血症最基本的诊断特征。在本发明的一个优选实施方案中，选用体内缺乏尿酸氧化酶同样以尿酸为最终产物的正常鸡作为实验动物评价了5kDa mPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物降低血液尿酸作用。结果表明，正常鸡对照组血液尿酸浓度一直稳定在220μm/L；注射5kDamPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物后，鸡体内血液尿酸浓度可在3-5天内稳定在50μm/L以下，而未修饰犬源尿酸氧化酶类似物注射1天内，血液尿酸浓度仅降至130μm/L左右，其后逐渐恢复正常。5kDa mPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物显示了良好的降低血液尿酸浓度的效果。
尿酸性肾病是高尿酸血症的常见病症，在本发明的一个优选实施方案中，利用自由喂食酵母粉与注射低浓度尿酸钠结晶的方法成功在大鼠体内构造了尿酸性肾病动物模型，并评价了5kDa mPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物对尿酸性肾病的预防作用。结果显示，给药组体内尿酸浓度可稳定在80μm以内，肌酐明显降低(p＜0.05)，表明供试品对高尿酸血症造成的肾脏损伤有一定保护作用。组织病理结果显示，与模型对照组比较，聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物组综合评分均明显降低(p＜0.001)，表明给药后动物肾脏损害明显减轻，提示聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物对高尿酸引起的大鼠肾脏损伤有较好的预防作用。
痛风性关节炎是高尿酸血症导致的另一常见病症，但是到目前为止，还没有准确评价痛风药物对痛风性关节炎治疗作用的动物模型。在本发明的一个优选实施方案中，利用向家兔膝关节周径注射尿酸钠结晶混悬液的方法成功构造了痛风性关节炎模型，并评价了5kDa mPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物对痛风性关节炎的治疗作用。实验结果证明，模型组动物注射尿酸钠结晶后，关节肿胀明显，6h时达到高峰；给药后24h，肿胀度可恢复至与空白组类似，提示注射5kDamPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物可明显降低尿酸钠结晶导致的关节肿胀。
本发明的5kDa PEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物与未修饰尿酸氧化酶相比具有更低的免疫原性和更好的稳定性；与PEG修饰微生物来源尿酸氧化酶相比具有更低的潜在的免疫原性；与其他10-20kDaPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物相比具有更高的皮下注射生物利用度和更低的免疫原性。本发明提供的PEG制备方法可进一步提高修饰后尿酸氧化酶蛋白酶活保留率，提高修饰位点的专一性和均一性，提高修饰蛋白的纯度。本发明提供的药物组合物可有效降低血液尿酸浓度、预防尿酸性肾病、治疗痛风性关节炎，可用于预防和/或治疗血液肿瘤化疗导致的急性高尿酸血症和代谢紊乱导致的高尿酸血症及慢性痛风。
至此已对本发明进行了详细描述，参照以下实例能够对之有更清楚的理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。
附图说明
附图1：修饰前犬源尿酸氧化酶类似物SEC-HPLC分析图。其中图A为0.1mmol/L NaCI洗脱组分，四聚体含量量高于95.0％，图B为0.3mmol/LNaCl洗脱组分四聚体尿酸氧化酶蛋白含量为14.5％。图中A为四聚体蛋白，B为八聚体蛋白，C为多聚体蛋白。
附图2：不同比例的PEG修饰的犬源尿酸氧化酶类似物SDS-PAGE电泳图。其中泳道1为未修饰蛋白，泳道2为1∶40比例修饰蛋白，泳道3为1∶80比例修饰蛋白，泳道4为1∶120比例修饰蛋白，泳道5为1∶160比例修饰蛋白，泳道6为蛋白marker。图中PEG修饰的犬源尿酸氧化酶类似物蛋白因迁移率变慢而比理论值偏大。
附图3：聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物纯度分析图。其中图A为RP-HPLC色谱图，图B为SEC-HPLC分析图。
附图4：聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物N端测序图。
附图5：聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物Maldi-tof分析图。
附图6：聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物降低正常鸡血尿酸作用分析图。其中■为对照组；●为未修饰犬源尿酸氧化酶类似物组；为聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物组。
附图7：聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物对家兔急性痛风性关节炎治疗作用分析图。其中■为空白对照组；●为模型对照组；▲为聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物组。
附图8：聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物食蟹猴药代动力学曲线。其中■为静脉给药；●为皮下给药。
具体实施方式
实例1.聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的修饰条件
本实例所涉及的犬源尿酸氧化酶类似物是采用基因工程技术获得的含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白的突变体蛋白(SEQ ID NO：5，以下实例中聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物均指此序列编码蛋白)，SDS-PAGE纯度及RP-HPLC纯度均高于95.0％。
取Source15Q阴离子交换层析填料，装入层析柱，用洗脱液(2M NaCl2 0.2mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲、pH＝10.3)冲洗5个柱体积再生后，用平衡液(0.2mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲、pH＝10.3)平衡。将上述纯化后样品匀速上样，上样结束后再用平衡液平衡至电导稳定。用含有0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L NaCl的洗脱液进行梯度洗脱，根据280nm吸收值强弱收集吸收峰，并进行SEC-HPLC检测。如附图1所示，0.1mmol/LNaCI洗脱组分四聚体尿酸氧化酶蛋白含量高于95.0％，0.3mmol/LNaCl洗脱组分四聚体尿酸氧化酶蛋白含量为14.5％。
将上述纯化后犬源尿酸氧化酶类似物蛋白超滤浓缩至4.0mg/ml，在pH＝10.3的0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲中按照摩尔比1∶40，1∶80，1∶120，1∶160补入干粉5kDa mPEG-SPA，4℃反应4h。反应结束后分别取样进行SDS-PAGE电泳，确定聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的修饰率。实验结果表明(附图2)：修饰比例为1∶40-1∶80可使每个尿酸氧化酶单体偶联2-6个5kDa mPEG；修饰比例为1∶120-1∶160可使每个尿酸氧化酶单体偶联6-11个5kDa mPEG。
将四聚体尿酸氧化酶蛋白含量分别为高于95.0％和14.5％的犬源尿酸氧化酶类似物蛋白超滤浓缩至4.0mg/ml，在pH＝10.3的0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲中按照摩尔比1∶120，补入干粉5kDa mPEG-SPA，4℃反应4h。反应结束后分别取样进行酶活保留率测定，确定未修饰尿酸氧化酶多聚体蛋白对酶活保留率的影响。由于尿酸在292nm处有特征吸收峰，产物在此波长范围内无吸收峰，而不同的尿酸浓度对应不同的吸光值，并且呈线性变化。随着尿酸被尿酸氧化酶降解，定时检测293nm处吸光度的减少量确定酶活：在比色杯中加入3mL 37℃预热溶于pH＝8.6硼酸缓冲液的100um尿酸溶液；再加入10ul适度稀释的酶液并混匀，连续测定292nm处吸光度变化；根据公式：C＝A/εL(其中C为尿酸浓度，A为反应体系292nm处吸光值，ε为尿酸摩尔消光系数，L为比色杯光程)计算尿酸降解浓度，并计算酶活.在37℃、pH8.6时，每分钟转化1u mol尿酸为尿囊素的酶量定义为一个活性单位(U)。如表所示，四聚体尿酸氧化酶蛋白含量高于95.0％的犬源尿酸氧化酶类似物蛋白修饰后酶活保留率为87.7％，而四聚体尿酸氧化酶蛋白含量为14.5％的犬源尿酸氧化酶类似物蛋白修饰后酶活保留率仅为71.7％。未修饰尿酸氧化酶多聚体可显著降低5kDa PEG修饰后蛋白的酶活保留率，而将该多聚体除去后，酶活保留率可高于85.0％。
实例2.聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的分离纯化
修饰后犬源尿酸氧化酶类似物样品用20mM PB，pH8.0透析过夜，透析后样品经超滤(50KD的Saturous切向流模块)浓缩后上Sephacryl S300分子筛层析柱，平衡缓冲为20mM PB，pH8.0，流速为7.0ml/min，上样后同时检测254nm和280nm吸收值，第一个峰为目标蛋白峰，所得到的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物蛋白经RP-HPLC和SEC-HPLC检测后纯度高于98.0％(附图3)。
实例3.不同修饰比例纯化后蛋白体内免疫原性测定
将1∶40，1∶80，1∶120，1∶160等四个不同修饰比例修饰后犬源尿酸氧化酶类似物蛋白按实例2所述方法纯化后注射小鼠检测其IgG抗体滴度。取24只昆明种大鼠，随机分为4组(n＝6)，每组分别注射不同修饰比例犬源尿酸氧化酶类似物蛋白，注射剂量1.0mg/kg。每五天注射1次，连续注射6次。末次注射后96h从眼静脉丛由毛细血管取血0.5ml，3000rpm离心15min分离血清，利用常规ELISA方法检测针对未修饰犬源尿酸氧化酶类似物蛋白的IgG抗体滴度。结果显示：1∶40修饰后针对犬源尿酸氧化酶类似物蛋白的IgG抗体滴度为1∶500，1∶80修饰后1∶40修饰后针对犬源尿酸氧化酶类似物蛋白的IgG抗体滴度为1∶300，1∶120修饰后对犬源尿酸氧化酶类似物蛋白的IgG抗体滴度为1∶120；1∶120修饰后对犬源尿酸氧化酶类似物蛋白的IgG抗体滴度为1∶80。修饰比例1∶120-1∶160时抗体滴度差异减少，综合平均修饰度检测结果，设定1∶120-1∶160为最优修饰比例。
实例4.聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物蛋白理化性质
1.平均修饰度检测：
将冻干除盐后犬源尿酸氧化酶类似物和聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物蛋白样品分别用超纯水稀释至0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml，取上述蛋白样品0.5ml，同时取0.5ml超纯纯水作为对照，加入0.5ml 4％碳酸氢钠溶液，混匀后加入0.5ml 0.1％TNBS，再次震荡混匀。将样品放入40度水域孵育2小时，取出样品后加入0.5ml 10％SDS，接着加入0.25ml 1N HCl，震荡混匀。以超纯水作为对照，在335nm处对紫外分光光度计调零，测量各样品在335nm处的紫外吸收值。将上述样品在335nm处的紫外吸收值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作图，进行线形回归以确定直线斜率k。聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的修饰度(％)＝(1-k1/k0)×100％。其中：k1为聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的直线斜率，k0为犬源尿酸氧化酶类似物的直线斜率。
结果显示1∶80比例修饰后每个蛋白平均偶联5.7个mPEG 5kDa；1∶120比例修饰后每个蛋白平均偶联7.9个mPEG 5kDa；1∶160比例修饰后每个蛋白平均偶联9.6个mPEG 5kDa。
2.修饰专一性检测：
将冻干除盐后1∶160比例修饰后聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物蛋白样品进行N端30位氨基酸序列测定，修饰前序列为MYKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKY，修饰后序列为MYxNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGxY，其中x为该循环无氨基酸特征吸收峰出现，该位置对应氨基酸为赖氨酸，表明赖氨酸残基的ε氨基被修饰，而N端甲硫氨酸残基仍可清晰测出，表明N端甲硫氨酸残基未被修饰，证明本发明设计的修饰方法可专一性偶联至赖氨酸残基的ε氨基(附图4)。
3.聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物蛋白分子量测定：
将冻干除盐后1∶160比例修饰后聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物蛋白样品进行Maldi-tof测定分子量，如附图5所示，修饰后蛋白分子量为93488.5，与平均修饰度推算的分子量相比略高。
实例5、聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物体内药效学研究
1.聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物降低正常鸡血尿酸作用试验
取30只正常鸡，按性别及给药前血尿酸值进行排序，随机分为3组，即未修饰犬源尿酸氧化酶类似物组、聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物组和对照组，每组10只，雌雄各半。修饰前后犬源尿酸氧化酶类似物剂量为为1.0mg/kg。分组给药前、单次给药后1、3、5、6、7、9天，禁食不禁水16h，从鸡翅静脉取血，3000rpm/min离心分离血浆，利用HPLC方法测定血清尿酸值。结果表明(附图6)，正常鸡对照组血液尿酸浓度一直稳定在220μm/L；注射5kDa mPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物后，鸡体内血液尿酸浓度可在3-5天内稳定在50μm/L以下，而未修饰犬源尿酸氧化酶类似物注射1大内，血液尿酸浓度仅降至130μm/L左右，其后逐渐恢复正常。5kDamPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物显示了良好的降低血液尿酸浓度的效果。
2.聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物对大鼠原发性尿酸性肾病预防作用
取30只雄性SD大鼠，按体重随机法分为空白对照组、模型对照组、聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物(1.0mg/kg)组共3组，每组6只。除空白组外，每组每日腹腔注射尿酸钠1次，注射剂量为100mg/10ml/kg，同时拌食法给予酵母粉；空白组仅给予普通鼠料饲养。从造模第1天开始，各组每周分别给予受试药1次，连续静脉给药5周。第五次给药前24h、第五次给药后24h，每组动物均眼静脉丛取血0.5ml，3000rpm离心15min分离血清，用HPLC法检测血清尿酸值；第五次给药后24h所取血液，同时在日本TMS-1024i型全自动生化分析仪上测定血清尿素氮和肌酐浓度。末次取血后放血处死大鼠，取一侧肾脏组织进行病理组织学检查。结果显示，给药组体内尿酸浓度可稳定在80μm以内，肌酐明显降低(p＜0.05)，表明供试品对高尿酸血症造成的肾脏损伤有一定保护作用。组织病理结果显示，与模型对照组比较，聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物组综合评分均明显降低(p＜0.001)，表明给药后动物肾脏损害明显减轻，提示聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物对高尿酸引起的大鼠肾脏损伤有较好的预防作用。
3.聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物对家兔急性痛风性关节炎治疗作用
取家兔18只，全雄，随机分为空白组、模型组、聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物组(1.0mg/kg)，每组6只。采用尿酸盐结晶(MSU)诱导兔急性关节炎模型方法，除空白组外，于各组给药后5分钟内，每只家兔膝关节脱毛消毒，于膝关节腔内注射无菌0.3ml(100mg/ml)MSU混悬液致炎。造模同时给予受试药1次，致炎前及致炎后3、6、12、24、48、72h，用软尺测量致炎侧关节周长，计算肿胀度(＝致炎后关节周长-致炎前关节周长)。实验结果证明(附图7)，模型组动物注射尿酸钠结晶后，关节肿胀明显，6h时达到高峰；给药后24h，肿胀度可恢复至与空白组类似，提示注射5kDa mPEG修饰犬源尿酸氧化酶类似物可明显降低尿酸钠结晶导致的关节肿胀。
实例6、聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物蛋白药代动力学和皮下注射生物利用度测定
本发明初步设想的临床拟用剂量为12mg/人，即0.17mg/kg(人以70kg体重计)，按体表面积公式计算本品大鼠等效剂量dB＝dA×kB/kA＝0.17mg/kg×0.71/0.11≈1.0mg/kg，以此剂量进行食蟹猴药代动力学和皮下注射生物利用度测定。每组食蟹猴4只，雌雄各半。皮下和静脉给药后即时(0h)、10min，1h、6h、1d、2d、3d、6d、8d、10d、12d、15d、18d和21d；经上肢肘静脉取血1.5ml，置肝素化试管中，3000rpm离心10min，分离血浆于-80℃冰箱中冷冻保存待测。血液尿酸浓度利用实例1中尿酸氧化酶活性法测定(附图8)。将每个点实验数据用DAS 2.0药代计算程序进行拟合，符合而房室模型，单次给药后皮下和静脉给药后清除半衰期分别为187.8和137.6，这表明聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物蛋白注射到人体内后半衰期同样可大于1周，可实现1-2周注射一次的预期h。用统计矩法计算皮下给药AUC后，与同剂量静脉给药的AUC进行比较，皮下给药后生物利用度为76.3％，这表明在人体试验时可将皮下注射作为一个备选注射途径，这将提高病人长期治疗时的依从度。

Claims (16)

1.聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中，犬源尿酸氧化酶类似物为序列如SEQ ID NO：5所示的嵌合突变体蛋白，聚乙二醇的平均分子量为1kDa-40kDa，每个尿酸氧化酶单体平均偶联2-15个聚乙二醇分子。
2.如权利要求1所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中聚乙二醇的连接基团通过氨酯键、仲胺键或酰胺键与尿酸氧化酶蛋白中N端和赖氨酸残基的氨基连接。
3.如权利要求1所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中聚乙二醇的连接基团包括琥珀酰亚胺基、硝基苯、酰胺基、胺基甲酸酯基或醛基。
4.如权利要求1所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中聚乙二醇的封闭基团包括乙氧基、丙氧基、丁氧基、半乳糖或葡萄糖。
5.如权利要求1所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中聚乙二醇的封闭基团为单甲氧基基团。
6.如权利要求1所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中聚乙二醇是支链的或直链的。
7.如权利要求1所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中聚乙二醇的平均分子量为5kDa-20kDa。
8.如权利要求7所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中聚乙二醇的平均分子量为5kDa。
9.如权利要求1所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中每个尿酸氧化酶单体上偶联的聚乙二醇链的数量为4-12个。
10.如权利要求9所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物，其中每个尿酸氧化酶单体上偶联的聚乙二醇链的数量为6-11个。
11.如权利要求1-10之一所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用色谱层析法制备四聚体含量高于95.0％的尿酸氧化酶四聚体，其中，所述尿酸氧化酶的序列如SEQ ID NO：5所示，色谱层析法包括分子筛层析或离子交换层析；
(2)偶联反应中所述尿酸氧化酶与聚乙二醇修饰剂的摩尔比为1∶40～1∶160；偶联反应体系为碳酸盐缓冲液，其pH范围为8.0-11.0，离子强度范围为10-200mmol/L；
(3)采用的色谱层析法和/或超滤法，分离聚乙二醇化的所述尿酸氧化酶，其中色谱层析法和/或超滤法包括分子筛层析、离子交换层析、疏水层析和/或切向流超滤。
12.如权利要求1-10之一所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物的药物组合物，其含有有效剂量的权利要求1-10之一所述的犬源尿酸氧化酶类似物的聚乙二醇化偶联物和一种药学上可接受的载体。
13.如权利要求1-10之一所述的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物在制备用于预防和/或治疗血液肿瘤化疗导致的急性高尿酸血症和代谢紊乱导致的高尿酸血症及慢性痛风的药物中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其中药物包括静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射或吸入雾状制剂。
15.如权利要求13所述的应用，其中血液肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。
16.如权利要求13所述的应用，其中高尿酸血症及慢性痛风的主要症状包括尿酸性肾病和痛风性关节炎。
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