KR100614212B1

KR100614212B1 - 피이지-유레이트 옥시데이즈 접합체 및 그의 이용

Info

Publication number: KR100614212B1
Application number: KR1020047014428A
Authority: KR
Inventors: 엘. 데이비드 윌리엄스; 마이클 에스. 허쉬필드; 수전 제이. 켈리; 마아크 지. 피. 사이퍼; 메리 알. 셔먼
Original assignee: 마운틴 뷰 파마슈티컬즈 인크.; 듀크 유니버서티
Priority date: 1998-08-06
Filing date: 1999-08-02
Publication date: 2006-08-21
Also published as: PL202799B1; IL183948A0; KR20010072287A; PL383331A1; RU2246318C2; EP1100542B1; PL346224A1; BRPI9912974B1; CZ303751B6; IL183948A; IL141220A0; RU2349341C2; HU228916B1; KR100488848B1; BRPI9917760B8; BRPI9912974B8; BR9912974A; HU226294B1; EP1100542A2; NZ509595A

Abstract

폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)(둘 다 PEG로서 불리워짐)에 공유적으로 결합된 자연 발생적 또는 재조합 유레이트 옥시데이즈(유리케이즈)로서, PEG의 평균 2 내지 10 가닥이 각 유리케이즈 서브유니트에 접합되고, 상기 PEG는 약 5kDa 내지 100kDa 사이의 평균 분자량을 가진다. 본 발명의 PEG-유리케이즈 접합체들은 실질적으로 비면역원성이며 변형되지 않은 효소의 요산 분해능의 최소 75%를 보유한다.

PEG, 유리케이즈, 비면역원성, 요산분해능, 사량체, 응집체

Description

피이지-유레이트 옥시데이즈 접합체 및 그의 이용 {PEG-URATE OXIDASE CONJUGATES AND USE THEREOF}

도 1A는 서브유니트 당 결합된 PEG의 가닥 수의 함수로서, 캔디다 유틸리스로부터의 PEG 접합된 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 1B는 서브유니트 당 결합된 PEG의 총 질량의 함수로서, 캔디다 유틸리스로부터의 PEG 접합된 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 2A는 서브유니트 당 결합된 PEG의 가닥 수의 함수로서, 돼지 간으로부터의 PEG 접합된 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 2B는 서브유니트 당 결합된 PEG의 총 질량의 함수로서, 돼지 간으로부터의 PEG 접합된 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 3A는 서브유니트 당 결합된 PEG의 가닥 수의 함수로서, PEG 접합된 돼지-비비 키메릭(PBC) 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 3B는 서브유니트 당 결합된 PEG의 총 질량의 함수로서, PEG 접합된 PBC 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 4A는 서브유니트 당 결합된 PEG의 가닥 수의 함수로서, 아스퍼질러스 플라부스로부터의 PEG 접합된 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 4B는 서브유니트 당 결합된 PEG의 총 질량의 함수로서, 아스퍼질러스 플 라부스로부터의 PEG 접합된 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 5A는 서브유니트 당 결합된 PEG의 가닥 수의 함수로서, PEG 접합된 재조합 콩 뿌리 결절 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 5B는 서브유니트 당 결합된 PEG의 총 질량의 함수로서, PEG 접합된 재조합 콩 뿌리 결절 유리케이즈에 의한 활성 보유를 나타낸다.

도 6은 돼지-비비 키메릭 유리케이즈(PBC 유리케이즈), 아미노 말단 및 카르복시 말단 모두가 절단된 PBC 유리케이즈(PBC-NT-CT), 및 돌연변이 R291K 및 T301S를 함유하는 돼지 유리케이즈(PKS 유리케이즈)의 추론된 아미노산 서열들을 돼지 및 비비의 서열과 비교하여 나타낸 것이다.

도 7은 생쥐 혈청에서의 유리케이즈의 활성을, PEG 변형된 PBC 유리케이즈를 4회 또는 5회 각각 복강 내로 주사한 후 각각의 주사 후 24 시간째에 측정한 것을 최초 주사 후 24 시간째에 측정한 값에 대하여 비교하여 나타낸 것이다.

도 8은 유리케이즈 결핍 생쥐의 혈청 내에 주사된 PEG 변형된 PBC 유리케이즈의 활성과 혈청 및 소변 내 요산의 농도 사이의 반비례 관계를 나타내는 것이다.

도 9는 PEG 변형된 PBC 유리케이즈로써 치료된 유리케이즈 결핍(uox -/-) 생쥐에 있어서, 소변 농축 결함의 심각성이 경감된 것을 나타낸다.

도 10은 PEG 변형된 PBC 유리케이즈로써 치료된 유리케이즈 결핍(uox -/-) 생쥐에 있어서, 신장성 요붕증의 심각성이 경감된 것을 나타낸다.

도 11은 PEG 변형된 PBC 유리케이즈로써 치료된 유리케이즈 결핍(uox -/-) 생쥐에 있어서, 자기공명 현미경 검사에 의하여 보여지는 바와 같이, 요산-유도성 신장병의 심각성이 경감된 것을 나타낸다.

도 12는 BALB/c 생쥐의 순환으로부터, 주사된 PBC 유리케이즈 옥타머(8량체)의 촉진된 클리어런스를 유리케이즈 사량체와 비교하여 나타낸 것으로서, 이 때 두 유리케이즈는 모두 서브유니트 당 10 kDa PEG의 5-6 가닥과 결합된 것이다.

본 출원에 기재된 연구의 일부는 국립보건원(NIH: National Institutes of Health)의 그랜트(Grant) DK48529로부터의 지원에 의하여 이루어졌다. 따라서, 미합중국 정부는 이 발명에 일정한 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 단백질의 순환 기간을 연장하고 그들의 면역원성을 감소시키기 위하여 단백질을 화학적으로 변형시키는 것에 관한 것이다. 보다 상세히, 본 발명은 폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol)) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)(poly(ethylene oxide))를 유레이트 옥시데이즈(Urate Oxidase)에 접합시키는 것에 관한 것으로서, 이는 유레이트 옥시데이즈의 요산분해능을 손상시키지 않으면서 그것의 면역원성을 실질적으로 제거하는 방법이다.

본 발명의 배경에 포함된 설명들은 선행 기술에 대한 인정이라기 보다는, 본 발명이 이루어진 시기에 본 기술 분야의 상태에 대한 본원 발명자 자신들의 주관적인 언급 및 설명을 반영하는 것이다. 이러한 설명들은 사적이며 지금까지 공개되지 않은 발명에 대한 인식을 포함할 수 있고, 이러한 인식 자체는 선행 기술의 일 부가 아니다.

유레이트 옥시데이즈들(유리케이즈들 E.C.1.7.3.3)은 요산을 보다 용해성인 산물, 즉 보다 쉽게 분비되는 퓨린 대사산물인 알란토인(allantoin)으로 산화시키는 것을 촉매하는 효소이다. 인간은 고등 영장류로의 진화 과정 동안 얻은 유리케이즈에 대한 유전자에 있어서의 여러 돌연변이의 결과로서, 효소적으로 활성인 유리케이즈를 생성하지 못한다. Wu, X 일동, (1992), J. Mol. Evol 34: 78-84. 따라서, 민감한 사람들에게 있어서, 혈액 내에 과잉 농도의 요산이 존재하는 것(고뇨산혈증) 및 소변 내에 과잉 농도의 요산이 존재하는 것(고뇨산뇨증)은 심한 관절염(통풍), 외관을 손상시키는 요산염 침착(통풍결절), 및 신부전을 일으킬 수 있다. 일부 감염 환자들에게 있어서는, 알로퓨리놀(allopurinol)(요산 합성 억제제)과 같이 시중에서 구입할 수 있는 약물이 치료 제한적인 부작용을 초래하거나 또는 이러한 상태를 적절히 치료하지 못하기도 한다. Hande, KR, 일동., (1984) Am J. Med. 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192. 유리케이즈를 주사하면 최소한 일시적으로는 고뇨산혈증 및 고뇨산뇨증을 경감시킬 수 있다. 그러나, 유리케이즈는 인간에게 있어 외래 단백질이므로, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus)로부터의 변형되지 않은 단백질의 일차 주사 조차도 처치된 환자 중 몇몇 퍼센트에 있어서는 과민 반응(anaphylactic reaction)을 일으키며(Pui, C-H 일행, (1997) Leukemia 11:1813-1816), 또한 면역학적 반응들은 장기간에 걸친 치료나 간헐적인 치료에 대한 유리케이즈의 효용을 제한한다. Donadio, D. 일행, (1981) Nouv Press Med 10:711-712; Leaustic, M. 일행, (1983) Rev. Rhum Mal Osteoartic 50:553-554.

고뇨산혈증에 대한 가능한 차선적 치료법이 수십년 동안 알려져 왔다. Kissel, P. 일행, (1968) Nature 217:72-74. 유사하게, 심각한 통풍을 앓고 있는 특정 군의 환자들이 주사가능한 유리케이즈의 안전하고 효과적인 형태에 의해 치료될 가능성이 있다고 하는 것이 오래 동안 인식되어 왔다. Davis, FF 일행, (1978) in GB Broun, 일행(Eds.) Enzyme Engineering, Vo. 4(pp. 169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H 일행, (1979) Enzyme 24:261-264; Nishmura, H 일행 (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S. 일행 (1981) Lancet 2(8241):281-283; Abuchowski, A 일행 (1981) J. Pharmacol Exp. Ther 219:352-354; Chen, RH-L, 일행 (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298; Chua, CC 일행 (1988) Ann Int. Med. 109:114-117; Greenberg, ML, 일행, (1989) Anal. Biochem. 176:290-293. 동물 장기에서 유래한 유리케이즈들은 주사에 의한 안전한 투여를 허용하는 용매에 거의 불용성이다. 미합중국 특허 제 3,616,231 호. 미생물이나 식물로부터 유래한 특정 유리케이즈들은 의학적으로 허용가능한 용매들에 보다 용해성이다. 그러나, 미생물 효소의 주사는 생명에 위협을 가할 수 있는 앨러지(allergic) 반응 또는 순환에 있어 유리케이즈들의 불활성화 및/또는 촉진된 면역 클리어런스(clearance)를 야기할 수 있는 면역학적 반응을 즉각적으로 일으킨다. Donadio 일행 (1981); Leaustic 일행 (1983). 돼지 및 비비(baboon)를 비롯한 포유동물, 또는 예컨대 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 또는 드로소필라 슈도옵스큐라(Drosophila pseudoobscura)와 같은 곤충의 유리케이즈로부터 도출된 아 미노산 서열에 기초한 효소들(Wallrath, LL 일행 (1990)Mol. Cell Biol. 10:5114-5127)은, 면역원성 및 생리적 pH에서의 불용성 문제로 인하여, 임상적 사용을 위한 적절한 후보가 되지 못하였다.

단백질과, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)(둘 다 PEG로 불리워짐)와의 공유 결합적인 변형이 단백질의 반감기를 늘리고 면역원성을 감소시키는데 사용되어 왔다. 미합중국 특허 제 4,179,337 호, 4,766,106 호 및 4,847,325 호; Saifer, MGP 일행, (1994) Adv. Exp. Med. Biol. 366:377-387. 연장된 순환 기간 및/또는 감소된 면역원성을 가지는 한편 기능적 활성을 유지하는 접합체를 제조하기 위하여 고분자량의 PEG를 결합시키는 것이, 다른 효소인 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase)(Somack, R. 일행 (1991) Free Rad. Res. Commun. 12-13: 553-562; 미합중국 특허 제 5,283,317 호 및 5,468,478 호) 및 다른 종류의 단백질들, 예컨대 시토킨들에 대해 이전에 수행되었었다(Saifer, MGP, 일행 (1997) Polym. Preprints 38:576-577; Sherman, MR. 일행 (1997) in JM Harris 일행 (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp.155-169) Washington, DC: American Chemical Society). 유리케이즈와, PEG외의 다른 중합체들과의 접합체에 대해서도 알려졌다. 미합중국 특허 제 4,460,683 호.

PEG 접합된 유리케이즈에 대한 보고된 거의 모든 시도들(즉, 유리케이즈에 PEG를 공유적으로 결합시키는 것)에 있어서, PEG는 아미노-말단 잔기 및 접근 가능한 라이신(lysine) 잔기를 비롯하여 주로 아미노기에 결합되었다. 주로 사용되는 유리케이즈들에 있어서, 네 개의 동일한 서브유니트들 각각에서의 라이신의 총 수는 25개(아스퍼질러스 플라부스 (미합중국 특허 제 5,382,518 호)) 내지 29개(돼지 (Wu, X 일행 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9412-9416)) 사이이다. 일부의 라이신들은 효소 본래의 구조에서는 PEG 결합을 위해 사용될 수 없다. 유리케이즈의 면역원성을 감소시키기 위한 가장 흔한 접근법은 저분자량 PEG의 많은 가닥들을 결합시키는 것이었다. 이것은 언제나 결과 접합체의 효소 활성에 있어 많은 손실을 가져왔다.

이전의 연구자들은 생체 내에서 요산의 알란토인으로의 전환을 촉매하기 위하여 유리케이즈를 주사해 왔다. Pui 일동(1997)을 참조하라. 이것은 프랑스 및 이태리에서 혈액암에 대한 세포독성 치료와 연관된 고뇨산혈증을 예방하거나 또는 일시적으로 치료하기 위하여, 그리고 통풍을 앓는 환자들에 있어서 심각한 고뇨산혈증을 일시적으로 완화시키기 위하여 균류(fungus) 아스퍼질러스 플라부스의 유리케이즈(유리코자임(Uricozyme

))를 사용한 기초가 되었다. Potaux, L. 일동 (1975) Nouv Press Med 4: 1109-1112; Legoux, R. 일동 (1992) J. Biol. Chem. 267: 8565-8570; 미합중국 특허 제 5,382,518 호 및 제 5,541,098 호. 짧은 순환 기간으로 인하여, 유리코자임

은 매일의 주사를 요한다. 또한, 유리코자임은 면역원성으로 인하여 장기간의 치료에는 적절하지 못하다.

5kDa의 PEG와 접합된 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 유리케이즈 제제의 단일 정맥내 주사는 주사 전 평균 혈청 요산염의 농도가 6.2 mg/dl였던 다섯명의 환자들에 있어서의 혈청 요산염 농도를 감지할 수 없는 수준으로 감소시켰는데, 이는 정상 범위 내에 있는 것이다. Davis 일동(1981). 그 환자들은 4 주 후 추가 접종을 받았으나, 그들의 반응은 보고되지 않았다. 비교적 정교하지 않은 겔 확산 어세이(assay)를 사용했을 때, 이차( 및 최종) 주사 후 유리케이즈에 대한 아무런 항체도 발견되지 않았다. 이 인용문은 인간 환자 또는 시험 동물의 장기간에 걸친 치료 또는 어느 정도 장기간에 걸친(subchronic) 치료로부터의 결과에 대해 아무런 보고를 하지 않았다.

5kDa PEG와 접합된 아르스로박터 프로토포미애(Arthrobacter protoformiae)로부터의 유리케이즈 제제가 주사전 혈청 요산염의 농도가 15mg/dL 였던 림프종 환자 한명에게 고뇨산혈증을 일시적으로 억제하기 위하여 사용되었다. Chua 일동(1988). 환자의 위독한 상태 및 짧은 치료 기간(14 일 동안 4 번의 주사)으로 인하여, 상기 접합체의 장기간의 효과 또는 안전성을 평가하기는 불가능하였다.

본 출원에서 "면역원성(immunogenicity)"이란 용어는 PEG-변형되거나 또는 변형되지 않은 유리케이즈(항원)의 주사 제제에 의한 면역 반응의 유도를 의미하는 한편, "항원성(antigenicity)"이란 용어는 이미 존재하는 항체와의 항원 반응을 의미한다. 종합적으로, 항원성 및 면역원성은 "면역반응성"으로 언급된다. PEG-유리케이즈에 대한 이전의 연구들에서 면역반응성은 다음 방법들을 포함한 여러 방법에 의하여 평가되었다: 1) 미리 형성된 항체들과 PEG-유리케이즈의 시험관 내(in vitro) 반응; 2) 유도된 항체 합성의 측정; 및 3) 반복 주사 후의 촉진된 면역 클리어런스 율(제거율) (accelerated clearance rates).

여러 공급원으로부터의 유리케이즈를 다양한 연결기(linker)를 통하여 PEG의 여러 가닥들과 결합시킴으로써 유리케이즈의 면역원성을 제거하려는 이전의 시도들은 제한된 성공만을 거두어 왔다. PEG-유리케이즈는 FF. Davis 및 Y. Inada 및 그의 동료들에 의하여 처음으로 개시되었다. Davis 일동(1978); 미합중국 특허 제 4,179,337 호; Nishimura 일동(1979); 일본 특허 제 55-99189 호 및 62-55079 호. '337 특허에서 개시된 접합체는 특정되지 않은 기원의 유리케이즈를 2,000 배 몰 과량의 750 달톤 PEG와 반응시킴으로써 합성된 것으로서, 다수의 중합체 분자들이 각 유리케이즈 서브유니트에 부착될 것이라는 점을 나타내었다. '337 특허는 500 내지 20,000 달톤, 바람직하게는 약 500 내지 5,000 달톤 분자량의 PEG 또는 폴리(프로필렌 글리콜) 중 어느 하나를 접합시켜, 옥시도리덕테이즈들(oxidoreductases)을 포함한 다양한 폴리펩티드 호르몬 및 효소들의 활성이고 수용성이며 비면역원성인 접합체를 제공하는 것을 개시하고 있는데, 이들 옥시도리덕테이즈들 중 유리케이즈는 세가지 예들 중 하나임을 개시하고 있다. 또한, '337 특허는 효소 한 분자당 10 내지 100 개의 중합체 가닥들을 결합시키는 것 및 최소한 40%의 효소 활성을 유지하는 것을 강조하였다. PEG를 유리케이즈의 적격 아미노기에 어느 정도 결합시킬 수 있는지, 잔류 고유(specific) 요산분해능, 또는 접합체의 면역원성에 대하여 아무런 시험 결과도 보고하지 않았다.

표 1에 유리케이즈의 PEG 결합에 관한 13개 인용 문헌들로부터의 데이터를 요약하였다. 이들 결과 중 일부는 도 1A-2B 에서 그래프로도 나타내었다. 이들 간행물 중 일곱 개는 캔디다 유틸리스(Candida utilis)로부터의 유리케이즈에 PEG 의 여러 가닥들을 결합시킴으로써 발생한, 시험관 내에서의 측정 요산분해능의 현저한 감소를 기술한다. 5kDa PEG의 다수 가닥들을 돼지 간 유리케이즈에 결합시킨 것도, Chen 간행물 및 동일 그룹에 의한 심포지움 보고서에 기재된 것과 같이, 유사한 결과를 나타내었다. Chen 일동 (1981); Davis 일동 (1978).

표 1에 요약된 연구 중에서, 유리케이즈의 면역반응성은 PEG 결합에 의하여, 그들 중 일곱 개의 연구에서 감소되는 것으로, 그리고 그들 중 다섯 개의 연구에서는 완전히 없어지는 것으로 보고되었다. 후자의 다섯 연구 중 세 개의 연구에서는, 면역반응성의 제거가, 요산분해능의 심대한 감소-초기 활성의 최대 15%, 28%, 또는 45%까지의 감소-와 함께 일어났다. Nishimura 일동(1979)(15% 활성); Chen 일동(1981)(28% 활성); Nishimura 일동(1981)(45% 활성). 네 번째 보고에서, PEG는 적격 라이신 잔기의 61%에 결합하는 것으로 보고되었으나, 잔류 고유 활성(또는 잔류 비활성)(specific activity)은 기술되지 않았다. Abuchowski 일동(1981). 그러나, 두명의 동일한 과학자를 포함하고 동일한 방법을 사용한 한 연구팀은 다른 곳에서 이러한 정도의 결합은 겨우 23-28% 정도의 잔류 활성을 가지도록 한다고 보고하였다. Chen 일동(1981). Abuchowski 일동 및 Chen 일동의 1981 논문은 유리케이즈의 면역반응성을 실질적으로 감소시키기 위하여, PEG는 적격 라이신 잔기의 대략 60%와 결합하여야 함을 나타내고 있다(표 1). 유리케이즈의 면역반응성이 사라진 것으로 보고하는 다섯 번째의 논문은 PEG 결합의 정도, 잔류 요산분해능, 또는 PEG-단백질 결합의 특성 등에 대하여 설명하고 있지 않다. Veronese, FM. 일동(1997)in JM Harris 일동 (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society.

PEG를 유리케이즈 내의 라이신 잔기들에 대해 보다 적은 비율로 결합시키는 것은 시험 동물들에 있어서 면역반응성을 감소시키지만 제거하지는 않았다. Tsuji J. 일동 (1985) Int. J. Immunopharmacol. 7:725-730 (결합된 아미노기의 28-45%); Yasuda Y. 일동(1990) Chem. Pharm. Bull. 38: 2053-2056 (결합된 아미노기의 38%). 대응하는 접합물들의 잔류 요산분해능은 그들의 최초 값의 33%(Tsuji 일동) 내지 60%(Yasuda 일동)의 범위에 있었다. Tsuji 일동은 PEG-유리케이즈 접합체를 7.5kDa 및 10kDa PEG들, 및 5kDa PEG로써 합성하였다. 얻어진 모든 접합체들은 다소 면역반응성이고 항원성이었으나, 현저히 감소된 효소 활성을 나타내었다 (표 1; 도 1A-1B).

다섯 명의 환자 각각에게 안전하게 두 번씩 투여된 캔디다 유틸리스로부터의 유리케이즈의 PEG 결합 제제는 그것의 초기 활성의 겨우 11% 정도의 활성만을 유지하는 것으로 보고되었다. Davis 일동 (1981). 몇 년 후, 아르스로박터 프로토포미애로부터의 PEG-변형된 유리케이즈를 진전된 림프종 및 심각한 고뇨산혈증을 앓고 있는 한 명의 환자에게 4회 투여하였다. Chua 일동 (1988). 상기 효소 제제의 잔류 활성은 측정되지 않았으나, Chua 일동은 효소 결합된 면역흡착제 어세이(ELISA : Enzyme-Linked immunosorbent assay)를 사용한 결과, 1 회 PEG-유리케이즈 주사 후 26 일째에 환자의 혈청에서 항유리케이즈 항체가 없음을 나타내었다.

표 1에 요약된 바와 같이, PEG 결합된 유리케이즈에 대한 이전의 연구들은 그것의 면역반응성을 실질적으로 감소시키기 위하여, 충분한 수의 PEG 가닥들을 결합시킴으로써 촉매 작용이 현저히 감소됨을 보여준다. 또한, 대부분의 이전의 PEG-유리케이즈 제제들은, 새로운 항원 결정기를 도입하고 또한 토끼에서 항체의 형성을 유도하는 것으로 알려진 시아누릭 클로라이드(cyanuric chloride), 즉, 트리아진 유도체(2,4,6-트리클로로-1,3,5-트리아진)에 의해 활성화된 PEG를 사용하여 합성되었다. Tsuji 일동 (1985).

표 1 : 이전 연구들로부터의 PEG-유리케이즈들의 특성

A. Sano 일동의 일본 특허 제 3-148298 호는 1kDa 내지 12 kDa 분자량을 가 지는 PEG로써 유도체화되어 항원성이 감소되고 "개선되고, 연장된" 활성을 나타내는 유리케이즈를 포함한 변형 단백질들 및 그러한 유도체화된 펩티드를 제조하는 방법을 개시하였다. 그러나, 가닥 수, 효소 어세이, 생물학적 테스트 또는 "개선되고, 연장된"의 의미 등에 대한 아무런 기재도 없다. 모두 Y. Inada에게 속하는 일본 특허 제 55-99189 호 및 62-55079 호는 각각 PEG-트리아진 또는 비스-PEG-트리아진(표 1에서 PEG2로서 기재된 것)으로 제조된 유리케이즈 접합체들을 개시하고 있다. Nishimura 일동(1979 및 1981)을 참조하라. 첫 번째 타입의 접합체에서, PEG들의 분자량은 2kDa 및 5kDa인 반면, 두 번째에서는 오직 5kDa PEG만이 사용되었다. Nishimura 일동(1979)은 선형 5kDa PEG로써 적격 라이신 43%를 변형시킨 후 요산분해능의 15%가 회복되었음을 보고한 반면, Nishimura 일동(1981)은 PEG2로써 라이신의 46% 또는 36%를 변형시킨 경우, 각각 31% 또는 45%의 회복을 보고하였다.

이전의 연구들은 유리케이즈의 면역원성 및/또는 항원성에 있어서의 현저한 감소가 PEG 결합에 의하여 달성되는 경우, 그것은 언제나 요산분해능의 상당한 손실을 수반함을 알려준다. 안전성, 편리성 및 생약학적 경비 절감 모두는 그들의 효능에 있어서의 감소 및 그 결과 투여량 증가 요구에 의하여 역으로 영향을 받았다. 따라서, 혈액 및 소변을 포함한 체액 내 요산의 증가된 수준을 낮추기 위한 안전하고 효과적인 다른 방법이 필요하다. 본 발명은 변형되지 않은 효소의 요산분해능을 모두 또는 거의 모두 보유하는, 실질적으로 비면역원성인 PEG-유리케이즈를 제공한다.

본 발명의 일 구현예는 접합되지 않은 유리케이즈의 요산분해능의 최소 약 75%를 유지하면서 현저하게 감소된 면역원성을 가지는, 유레이트 옥시데이즈(유리케이즈) 접합체이다. 이 구현예는 각 서브유니트가 선형(linear) 또는 분지형(branched)일 수 있는 PEG의 평균 2 내지 10 가닥과 공유적으로 결합될 수 있는 정제된 유리케이즈를 포함하며, 여기서 각 PEG 분자는 약 5kDa 내지 100kDa 사이의 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 의한 유리케이즈는 재조합체일 수 있다. 재조합체이거나 아니거나, 유리케이즈는 포유동물 기원일 수 있다. 이 구현예의 한 측면에서, 유리케이즈는 돼지, 소, 또는 양의 간(liver) 유리케이즈일 수 있다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, 유리케이즈는 키메릭(chimeric)일 수 있다. 키메릭 유리케이즈는 돼지 간 및/또는 소 간 유리케이즈의 일부분을 함유할 수 있다. 예컨대, 키메릭 유리케이즈는 돼지-비비(pig-baboon) 키메릭 유리케이즈(PBC 유리케이즈)일 수 있거나 또는 R291K 및 T301S 돌연변이를 함유하는 돼지 유리케이즈(PKS 유리케이즈)일 수 있다 (도 6의 서열 및 도 7 내지 도 12의 생리학적 및 면역원성 연구를 참조하라). 대안적으로, 유리케이즈는 타이로신 97이 히스티딘으로 치환된 비비 간 유리케이즈일 수 있으며, 이로 인해, 상기 유리케이즈의 고유 활성은 적어도 약 60% 정도 증가할 수 있다. 본 발명의 유리케이즈는, 기원이 무엇이든, 아미노 말단 또는 카르복시 말단 또는 양 말단 모두에서 절단된(truncated) 형태일 수도 있다. 마찬가지로, 유리케이즈는 균류(fungal) 또는 미생물(microbial)의 유리케이즈일 수 있다. 이 구현예의 한 측면에서, 균류 또는 미생물 유리케이즈는 자연 발생적이거나 또는 아스퍼질러스 플라부스, 아르스로박터 글로비포미스 또는 캔디다 유틸리스로부터의 유리케이즈의 재조합체 형태일 수도 있다. 또는, 유리케이즈는, 예컨대 자연 발생적으로 존재하거나 또는 드로소필라 멜라노가스터 또는 드로소필라 슈도옵스큐라로부터의 유리케이즈의 재조합체 형태와 같은, 무척추 동물 유리케이즈일 수 있다. 본 발명의 유리케이즈는, 예컨대 자연 발생적이거나 또는 콩(soybean) 뿌리 결절(Glycine max)로부터의 유리케이즈의 재조합체 형태와 같은 식물 유리케이즈일 수도 있다. PEG는 약 5kDa 내지 100kDa 사이의 평균 분자량을 가질 수 있으며; 바람직하게, PEG는 약 10kDa 내지 60kDa 사이의 평균 분자량을 가질 수 있고; 더욱 바람직하게는, PEG는 약 20kDa 내지 약 40kDa 사이, 예컨대 30kDa 과 같은 평균 분자량을 가질 수 있다. PEG의 공유적으로 결합되는 평균 가닥 수는 유리케이즈 서브유니트 당 2 내지 10개일 수 있고; 바람직하게는, 공유적으로 결합하는 평균 가닥 수는 서브유니트 당 3 내지 8개; 보다 바람직하게는, PEG의 평균 가닥 수는 서브유니트 당 4 내지 6개다. 이 구현예의 한 측면에서, 유리케이즈는 사량체(tetrameric)일 수 있다. PEG의 가닥들은 우레탄(카바메이트) 결합, 이차 아민 결합, 및/또는 아미드 결합을 통해 유리케이즈에 공유적으로 연결될 수 있다. 유리케이즈가 지금까지 언급된 유리케이즈들의 임의의 재조합체 형태인 경우에, 그 재조합체 형태는 실질적으로 자연 발생적인 형태의 서열을 포함할 것이다.

본 발명의 다른 구현예는, 체액 내에서 요산 수준을 낮추기 위한 제약학적 조성물로서, 위에서 기술된 임의의 PEG-유리케이즈 접합체와 제약학적으로 허용가 능한 담체를 함유하는 것이다. 그 조성물은 동결건조에 의하여 안정화될 수 있고, 또한 비경구 투여를 위한 적절한 용액을 제공하기 위한 재구성(reconstitution)에 의해 즉시 용해될 수도 있을 것이다.

본 발명은 또한 포유 동물의 체액 및 조직에 있어서 요산의 수준을 낮추기 위한 방법을 제공한다. 그 방법은 효과적인 요산 저하량의 PEG-유리케이즈를 포유 동물에게 투여하는 것을 포함한다. PEG-유리케이즈는 각 서브유니트가 선형 또는 분지형인 PEG의 평균 2 내지 10 개의 가닥들에 공유적으로 결합될 수 있는 두 개 또는 그 이상의 서브유니트를 가지는 정제된 유리케이즈일 수 있고, 이 때 PEG 각 분자는 제약학적으로 허용가능한 담체 내에서, 약 5kDa 내지 100kDa 사이의 분자량을 가질 수 있다. 포유 동물은 인간일 수 있다. 투여 단계는, 예컨대, 정맥내, 피부내, 피하, 근육내 또는 복강내 경로를 통한 주사 또는 분무화된 제제의 흡입을 포함할 수 있다. 상승된 요산 수준은 혈액, 소변 및/또는 다른 체액 및 조직 내에서 나타날 수 있으며, 또한 통풍, 통풍결절, 제2기 신부전(renal insufficiency), 장기 이식(organ transplantation) 또는 악성종양성 질환과 관련될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 유리케이즈의 여러 형태를 함유하는 용액으로부터 유리케이즈의 사량체(tetrameric form)를 분리하는 방법 및 그 방법의 산물이다. 초기에, 상기 용액은 사량체 유리케이즈 및 유리케이즈 응집체들을 함유할 수 있다. 상기 방법은 pH 약 9 내지 10.5 사이, 예컨대 pH 10.2에서, 최소한 하나의 분리 칼럼에 상기 용액을 적용하고; 용출액의 분획물들을 회수하여 분리된 사량체 유리케이즈를 함유할 수 있는 분획물을 확인하고(이 때 상기 분획물들은 실질적으로 유리케이즈 응집체를 포함하지 않는다); 분리된 사량체 유리케이즈의 분획물들을 수집하는 단계들을 포함할 수 있다. 상기 분리 칼럼은 이온 교환, 크기별 배제, 또는 다른 효과적인 분리 특성에 기초한 것일 수 있다. 상기 방법은 또한 사량체 유리케이즈의 존재 및/또는 유리케이즈 응집체의 부존재를 확인하기 위한 분획물들의 분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 다른 크로마토그래피 방법, 광 산란, 원심분리 및/또는 전기영동을 포함할 수 있다. 본 구현예의 한 측면에서는, 정제된 사량체 유리케이즈가 약 10% 미만의 유리케이즈 응집체들을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예의 상세한 설명

본 발명은 유리케이즈와 수용성 중합체, 바람직하게 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)와의 개선된 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 개선된 접합체의 제약학적 조성물을 제공한다. 이들 접합체들은 실질적으로 비면역원성이고 적어도 75%, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 95% 또는 그 이상의 변형되지 않은 효소의 요산분해능을 보유한다. 수용성 중합체들과 접합하기에 적절한 유리케이즈들은 박테리아, 균류(fungi), 및 식물과 척추 또는 무척추 동물의 조직으로부터 분리되는 자연 발생적인 유레이트 옥시데이즈(urate oxidase), 및 돌연변이되거나, 교잡된 것 및/또는 절단되어 효소적으로 활성인 유리케이즈의 변성체들을 포함하는 유리케이즈의 재조합체를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적절한 수용성 중합체들은 선형 및 분지형의 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포함하며, 이들은 모두 통상 PEG로 알려져 있다. 선형 PEG의 한 바람직 한 예는 일반식 CH₃O-(CH₂CH₂O)nH (여기서 n은 약 100 내지 약 2,300 사이에서 변한다)의 모노메톡시 PEG이다.

한 바람직한 포유동물 유리케이즈는 재조합 돼지-비비 키메릭 유리케이즈로서, 돼지 간 및 비비 간의 유리케이즈 서열의 부분들로 구성되고, 이들은 모두 Wu 일동(1989)에 의하여 처음 제조되었다. 그러한 키메릭 유리케이즈의 한 예는 돼지 유리케이즈 서열(서열번호 1)로부터의 처음 225 개 아미노산 및 비비 유리케이즈 서열(서열번호 2)로부터의 마지막 79 개 아미노산을 함유한다(돼지-비비 유리케이즈, 또는 PBC 유리케이즈; 도 6을 참조하라). 그러한 키메릭 유리케이즈의 다른 예는 돼지 서열(서열번호 1)의 7-225 잔기와 비비 서열(서열번호 2)의 226-301 잔기들을 함유하며; 이것은 아미노 및 카르복시 말단에서 절단된 PBC 유리케이즈(PBC-NT-CT; 도 6을 참조하라)와 동일하다. 키메릭 유리케이즈의 또다른 예는 돼지 서열(서열번호 1)로부터 처음 288 개 아미노산과 비비 서열(서열번호 2)로부터 마지막 16 개 아미노산을 함유한다. 후자의 것의 서열은 돼지 서열과 오직 두 위치에서만 상이하기 때문에 (291번 위치에서 아르기닌 대신 라이신(K)을, 301번 위치에서 쓰레오닌(threonine) 대신 세린(S)을 가짐), 이 돌연변이체를 돼지-K-S 또는 PKS 유리케이즈로 부른다. PKS, PBC 및 PBC-NT-CT 유리케이즈들은 각각 하나 이상의 라이신 잔기를 가지며, 따라서, 돼지 또는 비비 서열 중 어느 것 보다도 하나 이상 많은 PEG 결합을 위한 잠재적 위치를 가진다.

PBC 유리케이즈, PKS 유리케이즈 및 비비와 유사한 재조합 유리케이즈를 비 롯한 다양한 포유동물 유리케이즈들에 대한 cDNA를 서브클로닝하였고, E.coli 에서의 발현을 위한 적정 조건들을 표준법을 사용하여 결정하였다. Erlich, HA.(Ed)(1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. New York; Stockton Press; Sambrook, J. 일동(1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.를 참조하라. 재조합 유리케이즈들을 추출하고 정제하여, 표준 어세이법을 수정하여 그들의 안정성 및 활성을 평가하였다. Fridovich I. (1965) J. Biol. Chem. 240: 2491-2494; Nishimura 일동(1979) 및 실시예 1을 참조하라.

본 발명의 한 구현예에서, 유리케이즈는 생물학적으로 안정하고 비독성인 공유 결합을 통하여 비교적 적은 수의 PEG 가닥과 결합될 수 있다. 그러한 결합들은 우레탄(카바메이트) 결합, 이차 아민 결합, 및 아미드 결합을 포함할 수 있다. 그러한 결합에 적절한 다양한 활성화된 PEG들을 Shearwater Polymers, Huntsville, AL.로부터 상업적으로 구입할 수 있다.

예를 들어, 유리케이즈에 대한 우레탄 결합은 PEG의 숙신이미딜 카보네이트(succinimidyl carbonate: SC) 또는 4-니트로페닐 카보네이트(NPC)의 존재 하에 유리케이즈를 인큐베이션시킴으로써 형성할 수 있다. SC-PEG는 미합중국 특허 제 5,612,460 호에 기술된 방법을 사용하여 합성할 수 있으며, 상기 특허는 본원에 참고로 포함된다. NPC-PEG는 Veronese, FM 일동(1985)의 Appl. Biochem. Biotechnol 11: 141-152 및 미합중국 특허 제 5,286,637 호에 기재된 방법에 따라 PEG를 4-니 트로페닐 클로로포르메이트와 반응시킴으로써 합성할 수 있으며, 상기 특허권 또한 본원에 참고로 포함된다. '637 특허에 기재된 방법들은 비슷한 화학양론(stoichiometry)을 유지하기 위하여 반응물들의 농도를 조정함으로써 보다 높은 분자량의 PEG들에 적용된다. NPC-PEG 합성의 다른 방법은 Buttner W. 일동의 동독 특허 명세서 DD 279 486 A1 에 의해 기술된다.

유리케이즈에 대한 아미드 결합은 PEG의 카르복실산 유도체의 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 사용함으로써 얻어질 수 있다 (Shearwater Polymers). 이차 아민 결합은 2,2,2-트리플루오로에탄술포닐 PEG(트레실 PEG; Shearwater Polymers)를 사용하여 형성하거나 또는 PEG 알데히드 (Shearwater Polymers) 및 소디움 시아노보로하이드라이드를 사용한 환원성 알킬레이션에 의하여 형성될 수 있다.

5kDa 내지 30kDa 사이의 분자량을 가지는 PEG를 함유하는 접합체들에서, 변형되지 않은 효소의 요산분해능의 적어도 75%를 유지하면서, 서브유니트 당 결합하는 PEG 가닥의 최대 수는 콩 유리케이즈의 경우의 평균 2 가닥으로부터, PBC 유리케이즈의 경우의 10 가닥 이상의 범위이다 (실시예 1의 어세이 조건 및 도 1A 내지 도 5B의 결과들을 참조하라). 후자의 경우 PEG 결합의 정도는 총 아미노기의 약 1/3 수준에 해당한다. 본 발명의 한 구현예에서, 유리케이즈 서브유니트 당 결합되는 PEG의 평균 가닥 수는 2 내지 10 개이다. 바람직한 실시예에서, 유리케이즈 서브유니트 당 결합되는 PEG의 평균 가닥수는 3 내지 8 개이다. 보다 바람직한 실시예에서, 유리케이즈 서브유니트 당 공유적으로 결합하는 평균 가닥 수는 4 내지 6 개이다. 또 다른 실시예에서, 결합 반응에 사용하기 위한 PEG의 분자량은 5kDa 내지 100 kDa 이고, 바람직하게는 10kDa 내지 60 kDa 이며, 보다 바람직하게는 20kDa 내지 40kDa, 예컨대, 30 kDa 이다.

주어진 유리케이즈 형태에 대한 결합을 위한 PEG의 가닥 수 및 적정 분자량의 선택에 영향을 미칠 수 있는 여러 요소들이 있다. 일반적으로, 요산분해능의 상당한 손실 없이 면역원성을 감소 또는 제거하기 위해서는, 보다 큰 분자량의 PEG의 비교적 적은 가닥 수와 결합하기 보다는, 보다 낮은 분자량의 PEG의 상대적으로 많은 가닥들을 결합시키는 것을 요구한다. 예를 들어, 서브유니트 당 20kDa PEG의 6 가닥이나 또는 서브유니트 당 30kDa PEG의 4 가닥은 적정하게 효과적일 것이다. 마찬가지로, 각기 다른 유리케이즈 형태는 크기 및 가닥 수 모두에 대하여 다른 적정 조건들을 가질 것이다. 도 1A 내지 도 5B를 참조하라.

PEG 접합체는, 모든 시험된 유리케이즈들이 프랑스 및 이태리에 소재하는 Sanofi Winthrop 사에서 판매하는 균류 유리케이즈(유리코자임

)에서 안정화제로서 사용되는 8-아자크산틴(8-azaxanthine)과 같은 기질 유사체 또는 억제제의 첨가 없이, 생리학적 pH에서 완충액에 안정하며 용해성일 수 있게 한다. PBC 유리케이즈의 다른 두가지 접합체들, 즉 서브유니트 당 10kDa PEG의 대략 6 가닥들을 함유하는 것 하나와, 서브유니트 당 19kDa PEG의 대략 2 가닥을 함유하는 다른 하나는 37℃에서 한 달 이상 동안 생쥐의 혈청에서 인큐베이션시킨 후에도 현저한 활성을 유지하였다. 또한, 본 발명의 여러 접합체들은 생쥐 내에서, PEG-변형된 포유동물 및 미생물 유리케이즈들에 대하여 이전에 보고된 대략 8 시간 또는 24 시간의 반감기에 비하여, 이틀 이상의 순환 반감기를 가졌다. Chen 일동 (1981); Fuetges F. 일동 (1990) J. Contr. Release 11: 139-148; Fujita T. 일동 (1991) J. Pharmacobiodyn 14: 623-629. 보다 긴 반감기를 가지는 주사 단백질 약품들은 보다 비용 절감적이며 환자의 적응성을 더욱 개선할 수 있다. 연장된 반감기는 또한 신체 내에서 보다 잘 유지될 수 있는 약품임을 나타낸다.

PBC 유리케이즈의 PEG 접합체가 정제된 사량체 형태의 효소(네개의 35kDa 서브유니트들)로부터 제조되었을 때, 그들은 생쥐 내에서 현저하게 감소된 면역원성을 나타내었는데(도 7), 이는 보다 큰 형태의 효소(예를 들어 35kDa 서브유니트의 옥타머들; 도 12를 참조하라)로 된 PEG 접합체의 중간 정도의 면역원성, 및 변형되지 않은 효소의 매우 높은 면역원성과 대비된다. 본 발명의 PEG-유리케이즈를 유리케이즈 결핍 생쥐에게 반복 주사하였을 때, 두달 이상 동안 그들의 고뇨산혈증을 제거하고 요산 관련 손상에 대해 그들 신장의 기능 및 구조를 보호하였다 (도 8-11).

완전히 활성인 10kDa PEG를 가지는 PBC 유리케이즈 접합체들(도 3A-3B)을 주사하면, 이는 동형접합성 유리케이즈 결핍 생쥐의 고뇨산혈증을 현저하게 감소시킨다(도 8). 소변 내 요산 수준 또한 PEG 변형된 PBC 유리케이즈로 치료받은 모든 유리케이즈 결핍 생쥐들에 있어서 현저히 감소되었다. 유리케이즈 결핍 생쥐가 도 8의 데이터를 얻기 위하여 사용했던 것과 유사한 PEG-유리케이즈 제제로 된 일련의 주사를 투여받았다. 이 치료는 정상 조건 하에서 그리고 12 시간 동안의 급수 제한(water deprivation)후에 소변의 몰랄삼투압농도(osmolality)를 측정하는 것(도 9)과, 그들의 물 소비량 및 소변 유출량(도 10)을 측정함으로써 알 수 있는 것과 같이, 유전학적으로 유사한 치료받지 않은 생쥐들에서 대응하는 측정들을 한 것에 비하여, 소변 농축 장해의 심각성을 경감시켰다. 또한, 동형접합성 유리케이즈 결핍(uox -/-) "녹아웃(knockout)" 생쥐를 생후 10일 이내에 본 발명에 따른 PEG-유리케이즈로 치료를 시작하고 10 주간 치료를 계속한 바에 따르면, 자기공명 현미경 검사에 의하여 보여지는 바와 같이(도 11), 요산염에 의해 유도된 신장 구조 손상의 심각성을 감소시켰다. 현미경 측정법에 대해서는, Hedlund LW. 일동(1991)의 Fund. Appl. Toxicol. 16: 787-797; Johnson GA. 일동 (1992) in JC Gore, (Ed.), Reviews of Magnetic Resonance in Medicine, Vol. 4(pp. 187-219) New York: Pergamon Press를 참조하라.

자연 발생적 및 재조합 유리케이즈들의 정제된 제제들은 사량체(140kDa) 형태외에 효소 응집체들의 혼합물을 통상 함유한다. 사량체로 존재하는 각 유리케이즈 제제의 퍼센트는 일반적으로 대략 20%에서 90%까지 변한다. 다른 여러 단백질들의 PEG 결합하지 않은 응집체들이 높은 면역원성임을 나타내는 증거(예를 들어, Moore WV. 일동(1980)의 J. Clin. Endocrinol Metab. 51: 691-697을 보라)에도 불구하고, PEG-유리케이즈에 대한 이전 연구들은, PEG 접합된 응집체들의 잠재적 면역원성이 고려되지 않았음을 암시하면서, 응집체들의 함량을 제한하기 위한 노력에 대해서는 아무런 기술도 하지 않았다. 본 발명자들의 관찰에 근거하면, 그러한 응집체들은 이전의 PEG-유리케이즈의 합성을 위해 사용되는 효소 제제에 존재하였던 것으로 여겨진다. 그들의 존재는 비면역원성 접합체들의 제조를 더욱 어렵게 했을 수도 있다. 또한 PEG 결합된 유리케이즈에 대한 이전의 연구들에서 관찰된 다량의 요산분해능의 손실은 결합된 저분자량 PEG의 많은 수의 가닥들과 관련되는 것 같다. 한편, 여기 기술된 유리케이즈의 정제 및 PEG 결합 방법은, 예컨대 돼지-비비 키메릭 유리케이즈 및 A. 플라부스로부터의 효소와 같은 적어도 특정 유리케이즈들에 있어서 75% 이상의 요산분해능을 유지하면서, 서브유니트 당 PEG 10 가닥까지와의 공유 결합을 허용한다 (도 3A 및 4A를 참조하라).

또다른 바람직한 구현예에서, 사량체 형태 효소의 거의 모든 응집체들은, 실질적으로 사량체 제제인 유리케이즈의 PEG 접합 이전에, pH 약 9 내지 10.5 사이, 예컨대 pH 10.2 에서 이온 교환 또는 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있을 것이다. 제조용 칼럼으로부터의 각 분획물 내의 유리케이즈의 분자량은, 예컨대 HPLC, 전통적인 크기별 배제 크로마토그래피, 원심분리, 광산란, 비-변성 완충액(non-denaturing buffer) 내에서의 모세관 전기영동 또는 겔 전기영동 등을 포함하는 임의의 크기 의존적 분석 테크닉에 의하여 모니터될 수 있다. 크기별 배제 크로마토그래피를 사용하여 분리된 사량체 유리케이즈에 대해서는, 오직 140kDa 크기의 효소만을 함유하는 분획물들을 모아 PEG에 접합시키기 위하여 사용될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리된 사량체 유리케이즈에 대해서는, 이온 교환 칼럼으로부터의 분획물들을 크기에 대하여 분석함으로써, 어떤 분획물들이 감지할만한 응집체들을 포함하지 않고 사량체를 실질적인 양으로 함유하고 있는지를 결정한다. 그렇게 모아진 유리케이즈 중 적어도 90%는 사량체로서 존재할 수 있다; 따라서, 바람직하지 못한 응집체들은 총 분리된 유리케이즈의 약 10%, 5%, 2% 또는 보다 적은 비율을 구성할 것이다.

여기 제시된 결과들은, PEG 결합이 많이 이루어진 경우에도, 사량체 보다 큰 PBC 유리케이즈 형태들은 생쥐 내에서 매우 면역원성임을 나타낸다(도 12). 더구나, 유리케이즈 응집체들의 PEG 접합체들로 한번 주사맞은 생쥐 내에서, PEG 결합된 사량체 또는 PEG 결합된 응집체들을 연이어 주사하면, 그들 중 어떤 것의 요산분해능도 순환으로부터 재빨리 제거되었다. 반대로, 5% 미만의 응집체를 함유하는 유리케이즈로부터 제조된 접합체들은, 민감성 효소 결합 면역 어세이에 의하여 측정한 바와 같이, 감지할만한 항체의 생성 없이, 그리고 아무런 클리어런스 율(제거율)의 촉진 없이 여러번 반복적으로 주사할 수 있었다(도 7). 고도로 정제된 사량체 유리케이즈의 사용은 또한 이전에 기술된 PEG-유리케이즈 제제들로부터 본 발명의 개선된 접합체를 구별시킨다. 반대로, 일부 이전의 연구자들에 의하여 사용된 유리케이즈 제제들에 있어 상당 비율(예컨대, 10% 이상)의 응집체의 존재는 면역원성을 억제하기 위한 노력으로서, 그들을 PEG의 많은 가닥들과 결합하도록 하였다. 결과적으로, 얻어진 접합체들의 효소 활성은 현저히 감소되었다. 다른 구현예들에서, 본 발명은 사량체 형태가 아닌 PEG 결합된 유리케이즈들, 예를 들면, 유리케이즈 이량체와 같은 것들에 대해서도, 그러한 접합된 유리케이즈 제제가 그들 요산분해능의 최소 약 75%를 보유하고 실질적으로 비면역원성인 한, 명백히 고려의 대상으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 돌연변이되지 않은 효소에 비하여 예측할 수 없었을 정도로 증가된 효능을 가지는 돌연변이된 비비 간 유리케이즈가 제공된다. 이 개선된 영장류 유리케이즈는 통상의 재조합 DNA 기술에 의하여 제조되었 다. 비비 유리케이즈에 있어서 하나의 아미노산 잔기(97번 위치에서 타이로신 대신 히스티딘)의 치환이 특정 효소 활성에 있어 현저한 증가를 가져올 것이라고는 전혀 예측할 수 없었다. E.coli에서 발현하였을 때, 이 돌연변이 단백질은 그것이 유도된 재조합 비비 효소 보다 적어도 60% 높은 고유 활성을 가지는 것으로 나타났다.

또 다른 구현예에서, 돼지 또는 돼지-비비 키메릭 유리케이즈의 절단된 변종들을 발현시킴으로써 고유 활성은 증가되고/증가되거나 PEG 결합되지 않은 효소의 용해도가 개선되었는데, 상기 절단은 아미노 말단에서 적어도 최초 여섯 개의 아미노산 및/또는 카르복시 말단에서 적어도 마지막 세 개 아미노산을 발현된 단백질로부터 결실시킨 것이다(도 6을 참조하라). 카르복시 말단이 절단된 재조합 유리케이즈들은 퍼록시좀(peroxisomal) 타겟 서열의 제거로 인하여 PEG 결합 이전에 개선된 용해도를 보일 수 있다. Miura S. 일동(1994) Eur. J. Biochem. 223:141-146을 참조하라.

본 발명의 PEG-유리케이즈 접합체들은 포유동물, 바람직하게 인간의 체액 및 조직 내의 요산의 수준을 낮추는데 효과적이며, 따라서 통풍, 통풍결절, 제2기 신부전, 장기 이식 및 악성종양성 질환을 포함한 상태들과 관련된 상승된 요산 수준을 치료하는데 사용될 수 있다. PEG-유리케이즈 접합체들은 정맥내, 피하, 피내(intradermal), 근육내, 및 복강내 경로와 같은 많은 경로 중 어느 하나에 의하여 과잉 요산 수준을 가지는 포유동물 내로 주사될 수 있다. 또는, 그들은 분무화되어 흡입될 수 있다. Patton JS. (1996) Adv. Drug Delivery Rev. 19: 3-36 및 미 합중국 특허 제 5,458,135를 참조하라. 본 발명의 PEG-유리케이즈의 유효 투여량은 요산의 수준 및 개체의 크기에 따라 달라질 것이다. 본 발명에 따른 이러한 측면의 한 구체예에서, PEG-유리케이즈는 약 10㎍ 내지 약 1g 범위의 양으로 제약학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제 내에서 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 투여되는 양은 약 100㎍ 내지 500mg 사이이다. 보다 바람직하게, 접합된 유리케이즈는 1mg 내지 100mg 사이의 양으로, 예컨대 5mg, 20mg, 또는 50mg 의 양으로 투여된다. 실시예들의 투여량에 대해 주어지는 질량은 접합체 내의 단백질의 양을 언급한다.

PEG-유리케이즈를 함유하는 제약학적 제제는, 예를 들어 Gennaro, AR.(Ed.)(1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition Easton, PA: Mack Publishing Co.에 기술된 바와 같이, 종래 기술에 의하여 제조될 수 있다. 주사가능한 용액 제제를 위한 적절한 부형제로는, 예를 들어, 인산염 완충 생리식염수, 유산링거액(lactated Ringer's solution), 물, 폴리올 및 글리세롤 등을 포함한다. 비경구 투여를 위한 제약학적 조성물들은 제약학적으로 허용가능한 살균된 수용성 또는 비수용성 액체, 분산액, 현탁액, 또는 에멀젼들과, 사용 직전에 주사가능한 살균 용액 또는 분산액 내로 재구성하기 위한 살균 분말을 포함한다. 이러한 제제들은, 예컨대, 보존제, 용해제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 완충액, 항산화제 및 희석제와 같은 부가적인 성분들을 함유할 수 있다.

PEG-유리케이즈는 또한 체액 내에서 상승된 요산 수준을 지속적으로 억제하기 위하여 개체 내로 주입하기 위한 방출 조절된 조성물로서 제공될 수도 있다. 예를 들어, 폴리랙틱 액시드(polylactic acid), 폴리글리콜산, 재생 콜라겐, 폴리-L-라이신, 소디움 알지네이트(alginate), 젤란(gellan) 검, 키토산, 아가로스, 멀티라멜라(multilamellar) 리포좀 및 많은 다른 종래의 데포(depot) 제제들은 생물학적으로 활성인 조성물과 제제화될 수 있는 생부식성(bioerodible) 또는 생분해성(biodegradable) 물질들이다. 이 물질들은, 주입 또는 주사될 때, 서서히 분해되어 주위 조직으로 활성 물질을 방출한다. 예를 들어, PEG-유리케이즈를 캡슐화하는 한 방법은 미합중국 특허 제 5,653,974 호에 개시된 방법을 포함하며, 상기 특허는 본원에 참고로 포함된다. 생부식성, 생분해성 및 다른 데포 제제들의 사용에 대하여 본 발명은 광범위하게 고려하였다. PEG-유리케이즈의 전달을 위한 매트릭스 트래핑 시스템(matrix entrapment systems) 및 주입 펌프의 사용 또한 본 발명의 범위 내에 있다. PEG-유리케이즈는 또한 미포(micelles) 또는 리포좀(liposomes)에 유용하게 싸여질 수 있다. 리포좀 캡슐화 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. Lasic D. 일동(Eds.)(1995) Stealth Liposomes. Boca Raton, FL: CRC Press를 참조하라.

본 발명의 PEG-유리케이즈 제약학적 조성물들은 예컨대, 장기 이식 수여자(Venkataseshan, VS 일동 (1990) Nephron 56:317-321을 참조하라)와 같이 요산염에 의해 유도된 신부전증의 높은 위험성을 지닌 환자와, 일부 악성종양성 질환을 앓고 있는 환자들에 있어서 혈액 투석의 필요성을 감소시킬 것이다. 결정성 요산염이 많이 축적된(통풍결절) 환자들에 있어서, 그러한 제약학적 조성물은 현재 가능한 치료법 보다 더 빨리 생명의 질을 향상시킬 것이다.

어떠한 의미에서도 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 이하의 실시예들이 상기 기술한 다양한 측면들을 설명한다. 이들 실시예들은 다양한 크기의 활성화된(즉, 전자친화적인) PEG 유도체들을, 자연적으로 발생한 돼지, 균류 또는 박테리아의 유리케이즈들, 또는 재조합 콩, 돼지 또는 돼지-비비 키메릭 유리케이즈들로 구성된 조성물들과 접합함으로써 제조되는 PEG-유리케이즈들을 기술한다. 도 8 내지 11에 나타난 데이터는 고뇨산혈증 및 고뇨산뇨증(hyperuricosuria)을 치료하고, 고뇨산혈증 및 고뇨산뇨증이 발생하여 심각한 신장 손상이 일어난 동물 모델에 있어서의 신장 구조 및 기능을 유지하기 위한 본 발명의 PEG-변형된 PBC 유리케이즈의 활성에 대한 증거를 제공한다. Wu X. 일동(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 742-746. 이들 실시예들은 본 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 변형되지 않은 효소의 요산분해능의 적어도 75% 정도를 유지하는 실질적으로 비면역원성의 접합체들을 제조하기 위한 안내를 제공한다.

실시예 1

유리케이즈의 사량체 형태의 정제

유리케이즈의 사량체 형태(분자량 ca. 140kDa)를, 제조용 크기별 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피 후 분석용 크기별 배제 크로마토그래피를 이용하여 돼지 간 유리케이즈 용액으로부터 정제하였다. 돼지 간 유리케이즈는 St. Luis, MO 에 소재, Sigma-Aldrich 사의 제품 번호 U2350 또는 3377로부터; 또는 Indianapolis,IN. 소재의 Boehringer Mannheim 사로부터 구입하였다.

제조용 및 분석용 크기별 배제 크로마토그래피를 분자량을 알고 있는 단백질 로써 미리 보정한 수퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 상에서, 0.1M NaCl을 함유하는 소디움 카보네이트 완충액 내, pH 10-10.5, 바람직하게 pH 10.2에서 수행하였다. 수퍼덱스는 Piscataway, NJ. 소재 Amersham Pharmacia 로부터 구입하였다. 원하는 pH를 유지할 수 있고 계속되는 PEG 결합에 사용하기 위한 화학물질과 부합하는 것이라면 어떤 완충액도 사용할 수 있다. 그러한 완충액은 당업계에 잘 알려져 있다. 제조용 칼럼으로부터의 용출액의 자외선 흡수를 280nm에서 모니터하고, 원하는 사량체의 분자량에 해당하며 보다 큰 분자량 물질들을 가지지 않는 용출액의 유리케이즈-함유 부분들을 실시예 2에 기술된 바와 같이, 후속되는 비면역원성 PEG-유리케이즈의 합성에 사용하기 위하여 수집하였다. 다르게는, 유리케이즈의 사량체들을 다른 크기별 배제 매질을 사용하여, 예를 들면 수퍼로즈(Superose) 12(Amersham Pharmacia), 또는 약한 알칼리 용액과 부합되고 적절한 크기 분획 범위를 가지는 임의의 다른 매질을 사용하여 분리할 수도 있다. 그러한 매질은 즉시 구입가능하고 당업계에 잘 알려져 있다.

이온 교환 크로마토그래피는 0.1M 소디움 카보네이트 완충액으로 보정한 모노 큐(Mono Q) 칼럼 (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ.) 상에서, pH 10-10.5, 바람직하게 pH 10.2에서 수행하였다. PEG 결합에 사용하는 화학 물질과 부합할 수 있으며 원하는 pH를 유지할 수 있는 완충액이라면 칼럼으로의 유리케이즈의 흡착을 허용하기 위해 충분히 낮은 이온 세기에서 사용될 수 있다. 그러한 완충액들은 당업계에 잘 알려져 있다. 용출액의 자외선 흡수는 적용된 완충액 용액의 이온 세기를 증가시키는 것에 의해, 예를 들어, 소디움 카보네이트 완충액 내 0.5M NaCl의 선형 구배에 의해 이온 교환 수지로부터 유리케이즈를 용출시키는 동안 280nm에서 모니터되었다. 크기별 배제 HPLC는 그 후 실질적으로 비면역원성 PEG-유리케이즈를 합성하기 위하여, 감지할만한 응집체를 함유하지 않는, 원하는 유리케이즈의 사량체 형태를 함유하는 용출액 분획물을 특정하는데 사용되었다. 대안적으로, 유리케이즈의 사량체 형태는 다른 이온 교환 매질을 사용하여, 예를 들어 Q-세파로즈(Amersham Pharmacia) 또는 약간 알칼리성인 용액과 부합하는 임의의 다른 매질을 사용하여 분리할 수 있다. 그러한 매질은 즉시 구입가능하며 당업계에 잘 알려져 있다.

유리케이즈 활성을 표준법을 수정하여 어세이하였다. 예를 들어, Fridovich (1965); Nishimura 일동(1979)을 참조하라. 6-150μM(마이크로 몰) 어세이에서의 최종 농도를 제공하기 위해, pH 9.2의 50mM 소디움 보레이트 완충액 내의 요산 용액을 매일 신선하게 준비하였다. 유리케이즈 제제를 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. 카탈로그 번호 A-7030)을 함유하는 이 보레이트 완충액 내에서 희석하여 어세이에서 알부민의 최종 농도가 0.1mg/mL가 되도록 하였다. 마이크로평판 계측기(microplate reader) 내 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰(well) 내에서 효소의 다양한 희석물들과 기질을 혼합한 후, 25℃에서 요산의 제거 속도를 292nm 에서 3 분 동안 매 4 초마다 모니터하였다. 3 분 내에 10% 내지 40% 사이의 기질이 소비된 샘플로부터, 적어도 분당 흡수에 있어서의 최대 감소율을 계산하기 위하여, 적어도 20 개의 데이터 점들이 사용되었다. 유리케이즈 활성의 1 국제단위(IU)는 분당 요산 1 마이크로몰을 소비하는 효소량으로 정의되고; 고 유 활성(specific activities)은 IU/mg 단백질로 표현된다. 도 1A 내지 5B에서 상대적 유리케이즈 활성을 위한 일부 데이터는 어세이에서 100μM 요산을 사용하여 얻어졌다. 100μM 요산에서의 속도(V₁₀₀)에 대한 다른 결과들은 다음 식을 사용하여 각각의 효소 제제들에 대한 마이클 상수(K_M) 및 최대 속도(Vmax) 값들로부터 계산되었다:

V₁₀₀ = 100 X Vmax/(K_M+ 100)

여기서, K_M은 마이크로몰 단위로 표현된다.

실시예 2

사량체 돼지 유리케이즈로의 PEG 결합

pH 10.2의 0.1M 소디움 카보네이트 완충액 내의 사량체 유리케이즈 용액에, 모노메톡시PEG, 예를 들어 다양한 크기(5kDa 내지 30kDa)의 4-니트로페닐 카보네이트(NPC-PEG)의 활성화된 유도체를 유리케이즈 서브유니트(분자량 35kDa)의 각 몰 당 10-200 몰씩 첨가하였다. 이들 및 다른 적절한 활성화된 PEG들은 Shearwater Polymers 사로부터 구입할 수 있다. 이들 PEG를 단백질에 결합하기 위한 지시 사항이 인터넷 상 주소 www.swpolymers.com 에 있는 Shearwater Polymers 의 카탈로그 및 JM Harris 일동(Eds.)(1977)의 Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Washington, DC: American Chemical Society 에 주어져 있다. 결합 반응은 0℃ 내지 8℃에서 PEG 결합이 시간에 따라 더 이상 현저하게 변화하지 않을 때까지 진행되도록 두었다. 미반응 PEG는 그 후 크로마토그래피 및/또는 초여과(ultrafiltration)에 의하여 반응 산물로부터 제거되었다.

유리케이즈의 서브유니트 당 결합하는 PEG 가닥의 수는 Kunitani M. 일동(1991) J. Chromatogr. 588: 125-137; Saifer 일동 (1997) 및 Sherman 일동 (1997)에 의하여 기술된 방법을 적용하여 측정되었다. 간단히, 제조용(정제용) 이온 교환 또는 크기별 배제 칼럼으로부터의 PEG 결합 반응 혼합물 또는 분획물들을 조금씩 덜어, 이를 상온에서 0.1M NaCl을 함유하는 pH 10.2의 10mM 소디움 카보네이트 완충액 내의 TSK 5,000 PW_XL 칼럼 상에서 분석용 크기별 배제 HPLC에 의해 특성화하였다. HPLC 칼럼은 Montgomeryville, PA 소재 TosoHaas 사로부터 구입하였다. 단백질들과 PEG들을 자외선 흡수 및 굴절율 검출기에 의해 모니터하였다. 접합체 내 단백질의 양을, 적절한 변형되지 않은 표준 유리케이즈에 대하여, 자외선 흡광도로부터 계산하였다. 그 후 접합체 내 PEG의 양은 적절한 표준 PEG의 굴절율 피크의 면적과 비교하여, 굴절율에 대한 단백질의 기여도에 대하여 보정된 굴절율 피크의 면적으로부터 계산하였다.

도 2A는 서브유니트 당 결합한 PEG의 가닥 수의 함수로서 PEG 결합된 돼지 간 유리케이즈에 의한 활성의 보유를 나타낸다. 본 발명자들의 데이타(

,

)가 Chen 일동(1981)의 그것들과 비교된다. 큰 원 안의 데이터 점은 Chen 일동(1981)에 의한 비면역반응성인 것으로 보고된 접합체를 나타낸다. 도 2A에 나타난 바와 같이, 서브유니트 당 30kDa PEG 의 최대 6 가닥 또는 서브유니트 당 5kDa PEG 의 최대 7 가닥까지를 가지는 사량체 돼지 유리케이즈의 접합체들은 변형되지 않은 효소의 최소 75%의 활성을 보유하였다. 5kDa 또는 30kDa PEG의 가닥 수의 증가(서브유니트 당 약 4 가닥까지의 증가)에 따른 고유 활성에 있어서의 뚜렷한 증가는 접합체에 비하여 변형되지 않은 효소의 상대적인 불용해성 또는 불안정성을 반영할 수도 있다. 도 2B에 나타난 바와 같이, 서브유니트 당 30kDa PEG의 평균 3 가닥 이상을 가지는 돼지 유리케이즈의 접합체들은 Chen 일동(1981)에 의하여 면역반응성을 배제하기에 충분한 것으로 밝혀진 것 보다 큰 질량의 PEG를 함유한다.

실시예 3

사량체 재조합 PBC 유리케이즈의 PEG 접합체의 특성

재조합 돼지-비비 키메릭(PBC) 유리케이즈 cDNA를 pET3d 발현 벡터(Novagen, Madison, WI) 내로 서브클로닝하고, 결과 플라스미드 작제물을 Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Novagen) 균주 내로 형질전환하고 발현시켰다. 이러한 방법들은 분자 생물학의 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 수행하였다. Erlich (1989); Sambrook 일동(1989); Ausubel F. 일동(Eds.) (1997) Short Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons.를 참조하라.

도 6은 돼지(서열번호 1) 및 비비(서열번호 2)의 서열들과 비교하여, PBC 유리케이즈의 추론된 아미노산 서열(서열번호 1의 1-225 번 아미노산 및 서열번호 2의 226-304 번 아미노산)을 나타낸다. 돼지 서열에 나타난 것과 다른 비비 서열에서의 잔기들은 굵은 글씨로 나타내었다. 돼지 및 비비의 서열들은 최초로 Wu 일동(1989)에 의하여 결정되었고 본 발명자들에 의하여 확인되었다. 서열번호 1은 GenBank 서열에 있어서의 처음 메티오닐 잔기가 없는 것을 제외하고는, GenBank의 접근번호(Accession Number) p16164와 동일하다. 서열번호 2는 GenBank 서열에 있어서의 처음 메티오닐 잔기가 결실되고 잔기 153(도 6에서 잔기 154)에서 히스티딘이 쓰레오닌(threonine)으로 치환된 점을 제외하고는, GenBank의 접근번호 p25689와 동일하다.

PBC 유리케이즈의 사량체를 분리하여 실시예 1 및 2 에 기술한 바와 같이 다양한 분자량을 가지는 PEG들에 결합시켰다. 5kDa, 10kDa, 19kDa 또는 30kDa PEG로써 제조된 접합체들은 서브유니트 당 PEG 10 가닥까지 함유하였다. 최소한 10kDa의 PEG로써 제조된 것들은 재조합 유리케이즈의 초기 고유 활성의 95% 이상을 보유하였다(도 3A 및 3B).

서브유니트 당 10kDa PEG의 대략 6 가닥을 가지는 사량체 PBC 유리케이즈 접합체의 하기 특성들이 표시한 도면들에 나타나 있다 :

면역원성의 제거(도 7)와, 1) 고뇨산혈증 및 고뇨산뇨증의 치료에 있어서(도 8); 2) 소변 농축 결함의 심각성의 경감에 있어서(도 9); 그리고 3) 신장성 요붕증의 심각성을 경감시킴에 있어서(도 10)의 유리케이즈 결핍 생쥐에서의 효능. 또한, 이 PEG-유리케이즈는, 자기공명 현미경에 의하여 나타난 바와 같이(도 11), 요산 관련 신장 손상을 경감시켰다.

도 7은 생쥐 혈청에서의 PBC 유리케이즈의 활성을, PEG-유리케이즈를 4회 또는 5회 각각 복강 내로 주사한 후 각각의 주사 후 24 시간째에 측정한 것을 최초 주사 후 24 시간째에 측정한 값에 대하여 비교하여 나타낸 것이다. PEG 접합체들 은 PEG 활성을 위한 두가지의 다른 기술들을 사용하여 PBC 유리케이즈의 세가지 다른 제제로부터 제조하였다. 한가지 제제(

)는 유리케이즈 결핍(uox -/-) 생쥐 내에서 테스트되었고; 다른 두가지 제제(△,

)는 정상 BALB/c 생쥐 내에서 테스트되었다. 가장 면역반응성인 제제(△)는 PEG의 숙신이미딜 카보네이트 유도체(SC-PEG)를 사용하여, 서브유니트 당 5kDa PEG의 평균 7가닥에 결합한 유리케이즈 응집체들을 미지량 포함하는 정제된 PBC 유리케이즈로부터 제조한 것이었다. Zalipsky의 미합중국 특허 제 5,612,460 호는 여기에 참고로 포함된다. 중간정도로 면역반응성인 제제(

)는 PEG의 4-니트로페닐 카보네이트 유도체(NPC-PEG)를 사용하여, 서브유니트 당 19kDa PEG의 평균 2 가닥에 11% 응집체를 함유하는 PBC 유리케이즈 제제를 결합함으로써 제조하였다. Sherman 일동(1997). 가장 비면역반응성인 접합체(

)는 5% 미만의 응집된 유리케이즈를 함유하는 PBC 유리케이즈 제제에 서브유니트 당 10kDa NPC-PEG의 평균 6 가닥을 결합시킴으로써 제조하였다.

도 8은 혈청 및 소변 내 요산의 농도와 유리케이즈 결핍 (uox -/-) 생쥐의 혈청 내 주사된 PEG-유리케이즈의 활성 사이의 반비례 관계를 나타낸다. 0 시와 72 시간 후의 주사는 효소 서브유니트 당 10kDa PEG 평균 6 가닥에 접합된 PBC 유리케이즈 0.43IU를 함유한다.

도 9는 PEG 변형된 PBC 유리케이즈로 유리케이즈 결핍 생쥐를 치료하면 소변 농축 장애의 심각성이 경감되는 것을 나타낸다. 소변의 몰랄삼투압농도에 대한 데이터의 평균 및 표준 편차가, 하나의 정상 뮤린 유리케이즈 유전자(uox +/-)를 함 유하는 두 마리의 생쥐, 여섯 마리의 치료받지 않은 동형접합성 유리케이즈 결핍 생쥐들(uox -/-)와, 출생 후 3 일 내지 72 일이 되는 생쥐로서 95 또는 190 mIU의 PEG-유리케이즈로 주사된 여섯 마리의 동형접합성 유리케이즈 결핍 생쥐에 대하여 제시되어 있다. 생쥐들의 각 유전적 배경은 물을 무제한 공급받거나(진한 막대로 표시) 또는 그들의 소변을 수집하기 전 12 시간 동안 물을 주지 않은 것(빗금친 막대)이다.

도 10은 PEG 변형된 PBC로 유리케이즈 결핍 생쥐를 치료하면 비정상적으로 많은 물을 소비하고 비정상적으로 많은 소변을 유출하는 특징을 가지는 신장성 요붕증의 심각성이 경감되는 것을 나타낸다. 생쥐의 유전적 배경 및 치료 프로토콜은 도 9에서와 동일하다. 여섯 마리의 세 그룹 생쥐들에 대한 하루 물 소비량(진한 막대) 및 소변 유출량(빗금친 막대)의 평균 및 표준편차가 나타나 있다.

도 11은 PEG 변형된 PBC 유리케이즈로 유리케이즈 결핍 생쥐를 치료하는 것이, 자기공명 현미경에 의하여 나타나는 바와 같이, 요산에 의해 유도되는 신장병의 심각성을 경감시키는 것을 나타낸다. 세 그룹 생쥐의 유전적 배경과 치료 프로토콜은 도 9 및 도 10에서와 같았다. 자기공명 현미경법은 노오스캐롤라이나, Durham 소재, Duke University Medical Center의 Center for in vivo Microscopy에서 수행되었다.

도 8 내지 도 11에 요약된 결과에 더하여, PEG 변형된 PBC 유리케이즈로 치료한 후, 모든 유리케이즈 결핍 생쥐의 소변에서 요산 수준이 현저히 낮아진 것이 나타났다. 최종적으로, 도 12는 PEG 변형된 사량체 형태의 PBC 유리케이즈와는 달 리, 옥타머 형태(분자량=280kDa)는, 매우 광범위하게 PEG가 결합되는 경우에도, 생쥐 내에서 면역원성임을 나타낸다. 이러한 성질은 한번의 복강 내 주사 후 5 일 이내에 PEG 변형된 옥타머의 촉진된 제거로써 반영된다. 동일한 생쥐에게 8 일 및 15 일에 동일한 투여량의 동일한 PEG-유리케이즈 제제를 다시 주사하였다. 두 번째 및 세 번째 주사 후 24 시간에, PEG 결합된 옥타머로 주사받은 생쥐의 혈청에서 요산분해능은 감지할 수 없었으나, PEG 결합된 사량체로 주사받은 생쥐들의 혈청에서는 금방 감지되었다. 이러한 발견들은, 최초 주사 후 관찰되는 PEG 결합된 옥타머의 촉진된 제거와 조합하여, 효소의 PEG 결합 이전에 사량체 보다 큰 유리케이즈 형태 모두를 제거할 필요가 있음을 뒷받침한다.

실시예 4

캔디다 유틸리스 로부터의 유리케이즈의 PEG 접합

캔디다 유틸리스로부터의 유리케이즈를 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO; 카탈로그 번호 U1878) 또는 Worthington Biochemical Corporation(Freehold, NJ; 카탈로그 번호 URYW)로부터 구입하였다. 실시예 1 및 2 에 기술된 바와 같이 수행하여, 사량체 형태가 분리되었고 5kDa, 10kDa, 또는 30kDa PEG로써 PEG 접합체들을 합성하였다(도 1A-1B). 도 1A는 캔디다 유틸리스로부터의 PEG 결합된 유리케이즈에 의한 활성 보유를 서브유니트 당 결합된 PEG의 가닥 수의 함수로서 나타낸다. 본 발명자들의 데이타(

,

)를 Nishmura 일동(1979); Nishimura 일동(1981); Chen 일동 (1981); Davis 일동 (1981); Tsuji 일동 (1985); Yasuda 일동 (1990), 및 Fujita 일동 (1991)의 것들과 비교한다. 큰 원 안의 데이터 점들은 Nishimura 일동(1979 또는 1981)에 의한 비항원성 또는 Chen 일동(1981)에 의한 비면역반응성으로 보고된 접합체들이다.

도 1B는 서브유니트 당 결합된 PEG의 총 질량의 함수로서 캔디다 유틸리스로부터의 PEG 결합된 유리케이즈에 의한 활성의 보유를 나타낸다. 본 발명자들의 데이타(

,

)를 도 1 에서와 같은 동일한 보고에서의 데이터들과 비교한다. 큰 원 안에 있는 데이터 점들은 도 1A에서와 동일한 의미를 가진다.

도 1A 및 1B에 나타난 바와 같이, 서브유니트 당 5kDa 또는 30kDa의 PEG의 평균 최대 6 가닥까지 또는 10kDa PEG의 9 가닥까지와의 접합체들은 변형되지 않은 효소의 최소한 75%의 활성을 보유하였다. 부착된 30kDa PEG의 가닥 수가 증가함에 따라(서브유니트 당 5 또는 6 가닥까지) 고유 활성에 있어서의 뚜렷한 증가는 접합체들과 비교하여 변형되지 않은 효소의 상대적 불용해성 또는 불안정성을 반영할 수 있다.

실시예 5

아스퍼질러스 플라부스 로부터의 유리케이즈의 PEG 접합

아스퍼질러스 플라부스로부터의 유리케이즈를 Sanofi Winthrop(Gentilly Cedex, France)으로부터 구입하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하여, 다양한 분자량의 PEG들과의 접합체를 합성하였다(도 4A-4B). 아스퍼질러스 플라부스로부터의 효소를 서브유니트 당 30kDa PEG의 7 가닥까지 또는 5kDa PEG의 12 가닥까지와 결합시켜 제조된 접합체들은 이 균류 유리케이즈의 초기 고유 활성의 최소 75%를 보유하였다.

실시예 6

콩 유리케이즈의 PEG 접합

콩 뿌리 결절(노듈린 35로도 불림)로부터의 재조합 유리케이즈는 Kahn 및 Tipton에 의해 기술되는 바(Kahn K. 일동 (1997) Biochemistry 36: 4731-4738)에 따라 제조되고 정제되었으며, Dr. Tipton(University of Missouri, Columbia, MO)에 의하여 제공되었다. 실시예 1 및 2 에 기술된 바와 같이 수행하여 사량체 형태를 분리하고, 다양한 분자량의 PEG들로 접합체들을 제조하였다(도 5A-5B). 캔디다 유틸리스로부터의 유리케이즈(도 1A), 돼지 유리케이즈(도 2A), 돼지-비비 키메릭 유리케이즈(도 3A) 및 아스퍼질러스 플라부스로부터의 유리케이즈(도 4A)와는 대조적으로, 콩 효소는 초기 요산 분해능의 적어도 75%를 보유하면서, 서브유니트 당 30kDa PEG 또는 5kDa PEG의 대략 2 가닥 정도와의 결합만을 허용하였다.

실시예 7

아르스로박터 글로비포미스 ( Arthrobacter globiformis )로부터의 유리케이즈의 PEG 접합

아르스로박터 글로비포미스로부터의 유리케이즈를 Sigma-Aldrich(카탈로그 번호 U7128)로부터 구입하였다. 일본 특허 제 9-154581 호를 보라. 실시예 1 및 2 에 기재된 바와 같이 수행하여, 사량체 형태를 분리하고 5kDa 및 30kDa PEG로 접합체를 제조하였다. 서브유니트 당 5kDa PEG의 평균 3 가닥 이상과의 접합체가 초기 고유 활성의 60% 미만을 보유하였음에 반하여, 서브유니트 당 30kDa PEG의 평균 약 2 가닥과의 접합체는 초기 고유 활성의 최소 85%를 보유하였다.

실시예 8

아미노-절단된 돼지 및 PBC 유리케이즈의 PEG 접합

아미노 말단의 첫 번째 여섯 개 아미노산이 결실된 재조합 돼지 유리케이즈 및 PBC 유리케이즈를 실시예 3 에 기술된 것과 같은 표준 기술에 의하여 E.coli에서 발현시키고 그로부터 정제하였다. 실시예 1 및 2 에 기술된 바와 같이 수행하여, 아미노-절단된 유리케이즈들의 PEG 접합체들을 합성하여 초기 고유 활성의 적어도 75%를 보유하는 실질적으로 비면역원성인 접합체들을 제조하였다.

실시예 9

카르복시 말단 또는 아미노 및 카르복시 말단 모두에서 절단된 돼지 및 PBC 유리케이즈의 PEG 접합

카르복시 말단에서 마지막 세 개의 아미노산이 결실된 재조합 돼지 유리케이즈 및 PBC 유리케이즈를 실시예 3 에 기술된 바와 같은 표준 방법에 의하여 E.coli에서 발현시키고 그로부터 정제하였다. 이 카르복시 말단의 결실은, 그것이 퍼록시좀(peroxisomal) 타겟 신호를 제거함으로써, 변형되지 않은 효소의 용해도를 증가시킬 수 있다. Miura 일동(1994)을 보라. 실시예 1 및 2 에 기술된 바와 같이 수행하여, 카르복시-절단된 유리케이즈들의 PEG 접합체를 합성하여 초기 고유 활성의 최소 75%를 보유하는 실질적으로 비면역원성인 접합체를 제조하였다. 아미노 말단에서 여섯 개의 잔기가 절단되고 카르복시 말단에서 세 개의 잔기가 절단된 재조합 PBC 유리케이즈(PBC-NT-CT)의 서열이 도 6 에 나타나 있다. 이 유리케이즈는 실시예 1, 2 및 3 에 기술된 바와 같이 발현, 정제되고 PEG 결합되어, 초기 고유 활성의 최소 75%를 보유하는 실질적으로 비면역원성인 접합체로 제조되었다.

실시예 10

증가된 수의 PEG 부착 부위를 가지는 돼지 유리케이즈 돌연변이의 PEG 접합

재조합 돼지 유리케이즈가 실시예 3 에 기술된 바와 같이 제조되었는데, 여기서 PEG 부착 부위의 잠재적인 수가 하나 또는 그 이상의 아르기닌(arginine) 잔기를 라이신으로 치환함으로써 증가되었다. Hershfield MS. 일동(1991)의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7185-7189를 보라. 291 번 잔기의 아르기닌을 라이신으로 치환하고 301 번 위치의 쓰레오닌을 세린으로 치환한 그와 같은 돌연변이체의 한 예(PKS 유리케이즈)의 아미노산 서열이 도 6에 나타나 있다. 실시예 1 및 2 에 기술된 바와 같이 수행하여, PEG를 이 유리케이즈에 접합시켜 재조합 유리케이즈의 초기 고유 활성의 최소 75%를 보유하는 실질적으로 비면역원성인 접합체를 제조하였다.

실시예 11

재조합 비비 유리케이즈 돌연변이체의 PEG 접합

실시예 3에서와 같은 분자 생물학의 표준 방법을 사용하여, 97 번 위치에서 아미노산 치환(타이로신 대신 히스티딘으로의)을 가지는 재조합 비비 유리케이즈를 구성하였다(도 6 의 비비 서열을 보라). 실시예 1 및 2에서 기술한 바와 같이 수행하여, 재조합 비비 유리케이즈 돌연변이체의 사량체의 PEG 접합체를 합성하여 재조합 유리케이즈의 초기 고유 활성의 최소 75%를 보유하는 상당히 감소된 면역원성의 접합체를 제조하였다.

실시예 12

캔디다 유틸리스, 아스퍼질러스 플라부스, 및 아르스로박터 글로비포미스 로부터의 PEG 접합체의 면역원성

캔디다 유틸리스, 아스퍼질러스 플라부스, 및 아르스로박터 글로비포미스로부터의 유리케이즈를 실시예 4, 5 및 7 에 각각 기재한 곳으로부터 구입하였다. 실시예 1 및 2에서 기술한 바에 따라 수행하여, 5kDa, 10kDa, 20kDa 또는 30kDa PEG로 PEG 접합체들을 합성하였다. 이들 접합체들의 면역원성은 실질적으로 감소되거나 제거되었다.

본 발명의 PEG-유리케이즈 접합체들은 실질적으로 비면역원성이며 변형되지 않은 효소의 요산 분해능의 최소 75%를 보유한다.

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Claims

유리케이즈 접합체를 제조하는 방법으로서,

pH 9 내지 10.5 사이에서 하나의 분리 칼럼, 또는 분리 칼럼의 조합에 사량체 유리케이즈와 유리케이즈 응집체들을 함유하는 유리케이즈 용액을 적용하는 단계;

상기 칼럼으로부터, 사량체 유리케이즈의 응집체들을 함유하지 않고, 분리된 사량체 유리케이즈를 함유하는 하나 또는 그 이상의 분획물들을 회수하는 단계; 및

유리케이즈의 각 서브유니트가 PEG의 평균 2 내지 10 가닥들에 공유적으로 결합하고 PEG의 각 분자는 10kDa 내지 100kDa 사이의 분자량을 가지는 분리된 사량체 유리케이즈 접합체를 얻기 위하여, 상기 분리된 사량체 유리케이즈에 PEG를 접합하는 단계를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유리케이즈의 상기 용액을 pH 10.2에서 상기 칼럼에 적용하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 분리는 이온 교환 및 크기별 배제로 구성되는 군으로부터 선택되는 특성에 기초하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 사량체 유리케이즈의 존재 및 사량체 유리케이즈 응집체들의 부존재로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 측정하기 위하여 상기 분획물들을 분석하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 분석 단계는 크로마토그래피, 원심분리, 광 산란, 및 전기영동으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석을 포함하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 분리된 사량체 유리케이즈는 10% 미만의 유리케이즈 응집체들을 함유하는 방법.
청구항 제 1 항의 방법에 의해 생성되는, 사량체 유리케이즈의 응집체들이 존재하지 않는 분리된 사량체 유리케이즈의 PEG-접합체.
PEG에 접합된 유리케이즈를 포함하는 접합체로서,

PEG는 10kDa 내지 100kDa 사이의 평균 분자량을 가지며, 접합되지 않은 유리케이즈의 요산분해능의 최소 75%를 보유하고, 면역원성이 실질적으로 감소된 접합체.
제 9 항에 있어서,

상기 PEG는 폴리(에틸렌글리콜)인 것을 특징으로 하는 접합체.
제 10 항에 있어서,

상기 폴리(에틸렌글리콜)은 20kDa의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 접합체.
제 10 항에 있어서,

상기 폴리(에틸렌글리콜)은 10kDa의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 접합체.
제 10 항에 있어서,

상기 폴리(에틸렌글리콜)은 30kDa의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 접합체.
제 9 항에 있어서,

상기 유리케이즈는 사량체인 것을 특징으로 하는 접합체.
청구항 제 9 항의 접합체와 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 구성되는, 체액 또는 조직에서 요산 수준을 낮추기 위한 제약학적 조성물.