EA010015B1 - Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов - Google Patents

Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов Download PDF

Info

Publication number
EA010015B1
EA010015B1 EA200501800A EA200501800A EA010015B1 EA 010015 B1 EA010015 B1 EA 010015B1 EA 200501800 A EA200501800 A EA 200501800A EA 200501800 A EA200501800 A EA 200501800A EA 010015 B1 EA010015 B1 EA 010015B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fragment
peptide
peg
compound according
peptides
Prior art date
Application number
EA200501800A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501800A1 (ru
Inventor
Кристофер П. Хольмез
Дэвид Тумелти
Кан Иин
Original Assignee
Афимакс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Афимакс, Инк. filed Critical Афимакс, Инк.
Publication of EA200501800A1 publication Critical patent/EA200501800A1/ru
Publication of EA010015B1 publication Critical patent/EA010015B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/524—Thrombopoietin, i.e. C-MPL ligand
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Abstract

Настоящее изобретение относится к соединению, включающему пептидный фрагмент, разделительный фрагмент и фрагмент водорастворимого полимера, такой как фрагмент полиэтиленгликоля. Разделительный фрагмент находится между пептидным фрагментом и фрагментом водорастворимого полимера. Разделительный фрагмент имеет следующее строение: -NH-(CH)α-[O-(CH)β]γ-Oδ-(CH)ε-Y-, где каждый из коэффициентов α, β, γ, δ и ε представляет собой целое число, значения которых выбирают независимо друг от друга.

Description

В заявке на данное изобретение согласно 35 И.8.С.§1199(е) испрашивается приоритет по находящейся одновременно с ней на рассмотрении предварительной патентной заявке США № 60/469996 от 12 мая 2003 г. Содержание указанной предварительной заявки полностью включено в настоящее описание по ссылке.
Область техники
Настоящее изобретение относится к новому способу ковалентного присоединения водорастворимого полимера, например полиэтиленгликоля (ПЭГ), к пептидам и соединениям, полученным на основе пептидов. Кроме того, изобретение относится к новым терапевтическим композициям, включающим указанные соединения.
Уровень техники
В последние годы в связи с ростом интереса к исследованию белков было открыто большое количество пептидов с различными функциями. В связи с развитием методик генной рекомбинации и способов органического синтеза пептидов появилась возможность получать такие физиологически активные пептиды и их структурные аналоги в больших количествах. Многие из таких пептидов, обладающих специфической активностью, представляют собой чрезвычайно полезные фармацевтические препараты.
Примеры таких пептидов включают пептиды, которые присоединяются к эритропоетиновым (ЕРО) рецепторам (ЕРО-Я). Эритропоетин (ЕРО) представляет собой гормон гликопротеина, который включает 165 аминокислот и имеет 4 центра гликозилирования в 24, 38, 83 и 136 положениях аминокислот, а также имеет молекулярную массу приблизительно 34000 Дальтон (Да). Он стимулирует митотическое деление и дифференцирование клеток-предшественников эритроцитов и, таким образом, обеспечивает выработку эритроцитов. ЕРО необходим для процесса образования красных кровяных клеток; в перспективе, этот гормон может быть применен как в диагностике, так и в лечении заболеваний крови, характеризуемых низкой или нарушенной выработкой красных кровяных клеток. Был обнаружен ряд пептидов, взаимодействующих с ЕРО-Я. (См., например, патент США № 5773569, ХУгщЫоп е! а1.; патент США № 5830851, ХУгщЫоп е! а1.; и \УО 01/91780 8ιηί11ι-8\νίπΐ051<ν е! а1.)
Однако клиренс (с1еагапсе) пептидов, особенно при введении в кровеносную систему, обычно происходит очень быстро. Таким образом, желательно увеличить стойкость указанных пептидов. Кроме того, при получении пептидов от животных различных видов, созданных при помощи пептиднопротеиновой инженерии (рерйбе рго!ет епдшееттд), и/или имеющих строение, отличное от пептидов пациента, всегда имеется риск возникновения нежелательных симптомов из-за выработки антител. Следовательно, желательно также улучшить антигенность таких пептидов. Для того чтобы указанные пептиды можно было применять в качестве фармацевтических препаратов, необходимо улучшить как их стойкость, так и их антигенность.
Было показано, что химическая модификация пептидов макромолекулярными соединениями помогает улучшить антигенность и стойкость различных пептидов. Так, в качестве макромолекулярных реагентов для модификации пептидов широко используют полиэтиленгликоль и производные полиэтиленгликоля.
Наиболее обычная форма полиэтиленгликоля имеет следующее строение:
НО-(СН2СН2О)„СН2СН2-ОН
Вышеуказанный полимер, альфа-, омега-дигидроксилполиэтиленгликоль, может быть представлен при помощи укороченной формулы НО-РЕО-ОН, где символом -РЕО- обозначена следующая структурная единица:
-СН2СН2О-(СН2СН2О)ПСН2СН2Не прибегая к какой-либо частной теории механизма или действия, можно предположить, что в водной среде длинная, цепеобразная молекула или фрагмент РЕО быстро движется и находится в сильно гидратированном состоянии. Полагают, что такое быстрое движение обуславливает охватывание молекулой ПЭГ большого объема и предотвращает приближение к ней и взаимодействие с ней других молекул. В результате, присоединившись к другому химическому образованию (такому, как пептид), полимерная цепь ПЭГ может защищать указанное образование от иммунного ответа или других механизмов клиренса. В результате, присоединение ПЭГ приводит к улучшенной эффективности и безопасности медикамента, полученной при помощи оптимальной фармакокинетики, повышенной биодоступности и пониженной иммуногенности и частоте приема.
Например, некоторые активные производные ПЭГ удалось присоединить к пептидам, белкам и ферментам, что привело к хорошим результатам. ПЭГ растворим в органических растворителях. Присоединение ПЭГ к ферментам может приводить к образованию конъюгатов ПЭГ-фермент, которые растворимы и активны в органических растворителях. Присоединение ПЭГ к белку может снижать иммуногенность и скорость почечного клиренса конъюгата ПЭГ-белок по сравнению с немодифицированным белком, что может приводить к существенному увеличению продолжительности циркулирования конъюгата в кровеносной системе.
Например, имеются сообщения о том, что ковалентное присоединение ПЭГ к терапевтическим белкам, таким как интерлейкины (КпаиТ, Μ. 1. е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 1988, 263, 15, 064; Т8и!8ит1, Υ. е! а1., 1.
- 1 010015
Соп!го11еб Ве1еаке 1995, 33, 447), интерфероны (КПа, Υ. е! а1., Эгик Иек. ИеПуегу 1990, 6, 157), каталаза (ЛЬис1ю\\ък|. А. е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 1977, 252, 3, 582), супероксиддисмутаза (Веаисйатр, С. О. е! а1., Аппа1. Вюсйет. 1983, 131, 25) и аденозиндеаминаза (Сйеп, В. е! а1., ВюсЫт. В юрку. Ас!а 1981, 660, 293) увеличивает их время полужизни (ЬаИШё) ΐπ νίνο и/или снижает их иммуногенность и антигенность.
Кроме того, присоединение ПЭГ к поверхности может снижать адсорбцию белков и клеток на поверхности и изменять электрические свойства поверхности. Аналогично, присоединение ПЭГ к липосомам может привести к значительному увеличению времени полужизни этих частиц в кровеносной системе и, таким образом, может способствовать их роли в доставки медикамента. (1. М. Натк, Εά., Вютеб1са1 апб Вю!есйшса1 АррПсаПопк οί Ро1уе!йу1епе 61усо1 СйетЦру, Р1епит, Ыете ΥοιΈ 1992).
Наличие аминокислотного или пептидного мостика между ПЭГ и присоединенной макромолекулой дает некоторые преимущества, поскольку позволяет придавать различные свойства, которые могут быть введены при помощи подходящей аминокислоты или пептида. Примерами таких аминокислотных или пептидных мостиков могут служить: норлейцин (ΝΚ), применяемый для аналитических целей; С1у, меченый 14С или тритием, применяемый для фармакокинетического исследования; Ьук, применяемый для создания разветвленных структур; и Ме!-№е или Ме!-вА1а, применяемые для удаления ПЭГ при помощи обработки Β^СN (Уегопеке, Е. М. Вюта!епа1к, 2001, 22, 405).
Другой известный тип производного ПЭГ, содержащего аминокислотный мостик между ПЭГ и присоединенными макромолекулами, характеризуется наличием двух линейных цепочек ПЭГ, связанных друг с другом посредством двух функциональных групп трехфункционального разделительного фрагмента (спейсера), третья функциональная группа которого связывает белок. Лизин представляет собой трифункциональный аминокислотный спейсер, который связывает две цепочки ПЭГ при помощи своих альфа- и эпсилон-аминогрупп, в то время как карбоксильная группа лизина активирована с образованием гидроксисукцинимидного сложного эфира, предназначенного для связывания белка. Преимуществом этого производного ПЭГ является более низкая инактивация фермента во время связывания, а его «зонтообразная» структура эффективна при защите белков от протеолиза (расщепления белков) при приближении антител, а также при снижении иммуногенности (Уегопеке, Е. М. Вюта!епа1к, 2001, 22, 405).
Если часть активирующей группы была захвачена конечным аддуктом вида ПЭГ-пептид или ПЭГ липосома, то иногда образуются нежелательные побочные продукты типа ПЭГ - связующий мостик (Ппкег) - пептид или ПЭГ - связующий мостик - липосома. Егапсек е! а1. (1п!. 1. Нета!о1. 1998, 68, 1) сообщают, что такие связующие мостики могут иметь несколько видов нежелательных воздействий: (1) такие связующие мостики не обязательно иммунологически инертны, и существуют экспериментальные свидетельства, что такие группы отвечают за иммуногенность/антигенность протеинов ПЭГ; (2) некоторые связующие фрагменты содержат подвижные связи, которые могут расщепляться под действием химических агентов или ферментов; (3) связующие фрагменты, полученные из активированных ПЭГ, которые часто бывают относительно токсичными, могут создавать регуляторные проблемы; (4) определенные связующие группы, такие как триазиновые кольца, могут вызывать поперечную сшивку молекул.
Несмотря на достижения в области модифицированных ПЭГ соединений, полученных на основе пептидов, все еще существует необходимость создания новых соединений, модифицированных ПЭГ, обладающих улучшенной антигенностью и стойкостью.
Цитирование и/или обсуждение ссылок, использованных в настоящем разделе, а также во всем описании, не должно рассматриваться в качестве прототипа настоящего изобретения.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к соединению, полученному на основе пептида, включающему фрагмент пептида, разделительный фрагмент (спейсер) и фрагмент водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль. Разделительный фрагмент (спейсер) находится между фрагментом пептида и фрагментом водорастворимого полимера.
Настоящее изобретение также относится к соединению, полученному на основе пептида, которое также включает связующий фрагмент (линкер). Разделительный фрагмент (спейсер) находится между связующим фрагментом (линкером) и фрагментом водорастворимого полимера, а связующий фрагмент (линкер) находится между разделительным фрагментом (спейсером) и пептидом. В альтернативном случае, связующий фрагмент (линкер) может включать разделительный фрагмент (спейсер).
В одном из примеров реализации настоящего изобретения разделительный фрагмент (спейсер) имеет следующее строение:
где каждый из коэффициентов α, β, γ, δ и ε представляет собой целое число, значения которых выбирают независимо друг от друга.
В предпочтительных примерах реализации α - это целое число, 1<α<6; β - это целое число, 1<β<6; ε - это целое число, 1<ε<6; δ равно 0 или 1; γ - это целое число, 1<γ<10; и Υ представляет собой либо ΝΗ, либо СО.
В некоторых предпочтительных примерах реализации β=2, если γ>1.
- 2 010015
В одном особенно предпочтительном примере реализации α=β=ε=2; γ=δ=1; и Υ представляет собой ΝΗ.
В других примерах реализации γ=δ=0; 2<α+ε<5; и Υ представляет собой СО.
В некоторых других примерах реализации γ=δ=0; α+ε=5; и Υ представляет собой СО.
В других примерах реализации α=2; γ=δ=β=ε=0; и Υ представляет собой СО.
В одном из примеров реализации настоящего изобретения связующий фрагмент (линкер) имеет следующее строение:
где каждый из коэффициентов η и φ представляет собой целое число, значения которых выбирают независимо друг от друга, а N может быть ковалентно связан с Υ разделительного фрагмента.
В предпочтительных примерах реализации η - это целое число, 1<η<6; и φ - это целое число, 1<φ<6.
В одном особенно предпочтительном примере реализации η=φ=1.
В другом примере реализации связующий фрагмент представляет собой остаток лизина или лизинамида (остаток лизина, в котором карбоксильная группа превращена в амидный фрагмент СОNΗ2).
Предпочтительно фрагмент водорастворимого полимера - это фрагмент полиэтиленгликоля. Более предпочтительно, фрагмент полиэтиленгликоля имеет линейное строение и имеет молекулярную массу, превышающую 10 кДа. Еще более предпочтительно фрагмент полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу от 20 до 60 кДа. Наиболее предпочтительно фрагмент полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу, равную 20 кДа. Предпочтительно фрагмент полиэтиленгликоля имеет значение полидисперсности (М„/Мп) менее 1,20, более предпочтительно менее 1,1 и наиболее предпочтительно менее 1,05. Фрагмент водорастворимого полимера может быть двухмерным и включать два мономерных водорастворимых полимера, связанных посредством связующего или разделительного фрагмента.
В одном из примеров реализации настоящего изобретения молекула пептида представляет собой димер и включает два мономерных пептида, связанных связующим фрагментом.
В одном из примеров реализации пептидный фрагмент выбирают из пептидов, которые связывают эритропоетин-рецепторы. Неограничивающие примеры таких ЕРО-Я связывающих пептидов включают пептиды, описанные в опубликованных международных заявках РСТ/И800/32224 (номер публикации АО 01/38342 А2, с указанием и.8.), РСТ/И896/09810 (номер публикации АО 96/40749, с указанием и.8.) и РСТ/и801/16654 (номер публикации АО 01/91780 А1); и патенты США 5767078, 5773569, 5830851, 5986047 и 6221608. Дополнительные неограничивающие примеры таких ЕРО-Я связывающих пептидов описаны в предварительных патентных заявках США, сер. № 60/470245; 60/469993 и 60/470244, каждая из которых была заявлена 12 мая 2004 г.
В другом примере реализации пептидный фрагмент выбирают из пептидов, которые связывают тромбопоетин-рецепторы (ТЯО-Я). Неограничивающие примеры таких ТЯО-Я связывающих пептидов включают пептиды, описанные в патентах США 6552008, 6506362, 6498155, 6465430, 6333031, 6251864, 6121238, 6083913, 5932546, 5869451, 5683983, 5677280, 5668110 и 5654276; и в опубликованных патентных заявках США 2003/0083361, 2003/0009018, 2002/0177166 и 2002/0160013.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей соединение (соединения), описанные выше.
Подробное описание изобретения
Определения.
Аминокислотные остатки в пептидах обозначены следующим образом: фенилаланин обозначен РНе или Е; лейцин - Ьеи или Ь; изолейцин - 11е или I; метионин - Ме! или М; Валин - Уа1 или V; серин - 8ег или 8; пролин - Рго или Р; треонин - Т1г или Т; аланин - А1а или А; тирозин - Туг или Υ; гистидин - Ηίκ или Η; глутамин - С1п или О; аспарагин - Акп или Ν; лизин - Ьук или К; аспарагиновая кислота (акратаБс ас1б) - Акр или Ό; глутаминовая кислота - С1и или Е; цистеин - Сук или С; триптофан - Тгр или А; аргинин - Агд или Я; глицин - С1у или С.
Нетрадиционные аминокислоты в пептидах обозначены следующим образом: 1-нафтиламин обозначен 1-па1 или Νρ; 2-нафтиламин - 2-па1; Ν-метилглицин (также известный как саркозин) - МеС или 8с; и ацетилированный глицин (Ν-ацетилглицин) - АсС.
Термин «пептид» или «полипептид» относится к полимеру, в котором мономеры представляют собой альфа-аминокислоты, соединенные друг с другом амидными связями. Пептиды состоят из двух и часто большего количества мономеров. Пептиды, применяемые в настоящем изобретении, предпочтительно содержат в своей цепи менее 50 мономерных аминокислот.
В настоящем описании словосочетание «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным структурам и композициям, которые «обычно считают безопасными», т.е. которые физиологически переносимы организмом принимающего их человека и обычно не вызывают аллергических или подобных неблагоприятных реакций, таких как расстройство пищеварения, головокружения и подобных симптомов. Предпочтительно в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый» означает, что вещество одобрено органами государственного регулирования Федерального правительства или штата, или упомянуто Фармакопеей США или другой общеизвестной фармакопеей и разрешено для приема
- 3 010015 животными и, более конкретно, людьми. Термин «носитель» относится к разбавителю, вспомогательному веществу, наполнителю или транспортному средству, вместе с которым производят прием соединения. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода или масла, включая масла белкового, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, конопляное масло и подобные масла. В качестве носителей, в частности, в качестве растворов для инъекций предпочтительно применяют воду или водные растворы, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие фармацевтические носители описаны в публикации ВсштЦопХ Рйагтасеи11са1 Баеисек Е. Матйи.
В настоящем описании термин «агонист» относится к биологически активному лиганду, который связывает комплементарный ему биологически активный рецептор и активирует последний, либо вызывая в указанном рецепторе биологический отклик, либо усиливая уже имеющуюся биологическую активность указанного рецептора.
Разделительный фрагмент (спейсер).
В соответствии с настоящим изобретением пептидный фрагмент, присоединенный к фрагменту ПЭГ через разделительный фрагмент, имеет следующее строение.
В одном из примеров реализации настоящего изобретения разделительный фрагмент имеет следующее строение:
где каждый из коэффициентов α, β, γ, δ и ε представляет собой целые числа, значения которых выбраны независимо друг от друга.
В предпочтительных примерах реализации α - это целое число, 1<α<6; β - это целое число, 1<β<6; ε - это целое число, 1<ε<6; δ равно 0 или 1; γ - это целое число, 1<γ<10; и Υ представляет собой либо ΝΗ, либо СО.
В некоторых предпочтительных примерах реализации β=2, если γ>1.
В одном особенно предпочтительном примере реализации α=β=ε=2; γ=δ=1; и Υ представляет собой ΝΗ.
В других примерах реализации γ=δ=0; 2<α+ε<5; и Υ представляет собой СО.
В некоторых других примерах реализации γ=δ=0; α+ε=5; и Υ представляет собой СО.
В других примерах реализации α=2; γ=δ=β=ε=0; и Υ представляет собой СО.
В соответствии с настоящим изобретением фрагмент водорастворимого полимера (предпочтительно, ПЭГ) присоединен к концевой группе ΝΗ разделительного фрагмента. Водорастворимый фрагмент может быть присоединен непосредственно к разделительному фрагменту или он может быть присоединен опосредовано, например, при помощи амидного или карбаматного мостика (мостиков). В таких примерах реализации фрагмент ПЭГ включает по меньшей мере одну мономерную цепочку ПЭГ. В некоторых примерах реализации фрагмент ПЭГ включает две мономерных цепочки ПЭГ. Две мономерные цепочки ПЭГ, предпочтительно, связаны друг с другом через лизиновый остаток или лизинамид (остаток лизина, в котором карбоксильная группа превращена в амидный фрагмент ί.ΌΝΗ2). Более предпочтительно две цепочки ПЭГ связаны с альфа- и эпсилон-аминогруппами лизина, в то время как карбоксильная группа активирована с образованием гидроксисукцинимидных сложных эфиров для связывания разделительного фрагмента. Например, если лизинамид связывает две мономерные цепочки ПЭГ, то структура полученного димера может быть представлена формулой I, и в обобщенном виде - формулой II.
Формула I Формула II
В формуле I символом Ν2 обозначен атом азота ε-аминогруппы лизина, а символом Ν1 обозначен атом азота α-аминогруппы лизина. В предпочтительных примерах реализации С-концевой лизин двух пептидных мономеров представляет собой Ь-лизин. В альтернативных примерах реализации, один или более остатков лизина может быть Ό-лизином.
В соответствии с настоящим изобретением пептидный фрагмент присоединен к концевой группе Υ разделительного фрагмента. Разделительный фрагмент может быть присоединен как к С-концевой группе, так и к Ν-концевой группе пептида. Таким образом, в тех примерах реализации, в которых разделительный фрагмент присоединен к С-концевой группе пептида, Υ представляет собой ΝΗ. В тех же при
- 4 010015 мерах реализации, в которых разделительный фрагмент присоединен к Ν-концевой группе пептида, Υ представляет собой СО. В альтернативных предпочтительных примерах реализации, разделительный фрагмент, предлагаемый в соответствии с настоящим изобретением, в котором Υ представляет собой ΝΗ, присоединен при помощи амидной связи к ε-аминогруппе С-концевой группы лизинового остатка пептидного мономера.
Связующий фрагмент (линкер).
В другом предпочтительном примере реализации разделительный фрагмент, предлагаемый в соответствии с настоящим изобретением, присоединен к пептиду в виде части трифункционального связующего фрагмента (описанного ниже). В этом примере реализации единица Υ разделительного фрагмента представляет собой СО, и Υ разделительного фрагмента образует амидную связь с атомом Ν трифункционального связующего фрагмента.
В одном особенно предпочтительном примере реализации настоящего изобретения связующий фрагмент представляет собой трифункциональный связующий фрагмент, имеющий следующее строение:
-СО-(СН2)п-М-(СН2)Ф-СОгде каждый из коэффициентов η и φ представляет собой целое число, значения которых выбирают независимо друг от друга, N ковалентно связан с Υ связующего фрагмента, а Υ связующего фрагмента представляет собой СО.
В предпочтительных примерах реализации η - это целое число, 1<η<6; и φ - это целое число, 1<φ<6.
В одном особенно предпочтительном примере реализации η=φ=1.
Разделительный фрагмент может быть введен в пептид во время синтеза указанного пептида. Например, если разделительный фрагмент содержит свободную аминогруппу и вторую функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая может быть связана с другим молекулярным фрагментом, то разделительный фрагмент может быть присоединен к твердой подложке. После этого, пептид может быть синтезирован непосредственно на свободной аминогруппе разделительного фрагмента при помощи стандартных методик твердофазного синтеза.
В предпочтительном примере реализации разделительный фрагмент, содержащий две функциональные группы, сначала присоединяют к твердой подложке при помощи первой функциональной группы. Если необходимо синтезировать димерный пептид, то возможен следующий путь: связующий фрагмент Ьк, содержащий две или более функциональные группы, которые могут служить исходными точками для синтеза пептида, и дополнительную функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая может быть связана с другим молекулярным фрагментом, присоединяют к разделительному фрагменту, образуя связь между второй функциональной группой разделительного фрагмента и третьей функциональной группой связующего фрагмента. После этого, непосредственно на двух реакционноспособных азотных группах связующего фрагмента Ьк могут быть синтезированы два пептидных мономера при помощи любой методики твердофазного синтеза. Например, разделительный фрагмент, присоединенный к твердой подложке и имеющий свободную аминогруппу, может быть введен в реакцию со свободной карбоксильной группой лизинового связующего фрагмента.
В другом примере реализации разделительный фрагмент может быть присоединен к пептиду после синтеза пептида. Такое присоединение может быть осуществлено при помощи способов, хорошо известных в настоящей области техники. В одном из примеров реализации связующий фрагмент содержит по меньшей мере одну функциональную группу, способную связываться с целевой функциональной группой синтезируемого пептида. Например, разделительный фрагмент, имеющий свободную аминогруппу, может быть введен в реакцию с С-концевой карбоксильной группой пептида.
Фрагмент водорастворимого полимера/ПЭГ.
Фрагмент водорастворимого полимера, предлагаемый в соответствии с настоящим изобретением, включает (а) полиалкиленгликоль и его производные, включающие ПЭГ, мПЭГ, гомополимеры ПЭГ, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры этиленгликоля с пропиленгликолем, причем указанные гомополимеры и сополимеры могут быть как незамещенными, так и замещенными с одного конца алкильной группой; (Ь) целлюлозу и производные целлюлозы, включая метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу; (с) крахмал и декстрины, а также их производные; (ά) декстран и производные декстрана, включая сульфат декстрана, поперечно сшитый декстрин и карбоксиметилдекстрин; (е) гепарин и фрагменты гепарина; (1) поливиниловый спирт и этиловые эфиры поливинилового спирта; (д) поливинилпирролидон; (11) а,Ь-поли[(2-гидроксиэтил)-ОЬ-аспартамид]; и (ί) полиоксиэтилированные высокомолекулярные спирты (полиолы), но не ограничен указанными соединениями.
Указанные полимеры могут быть линейными, разветвленными или звездообразными, а их молекулярные массы могут изменяться в широком диапазоне.
Предпочтительно фрагмент водорастворимого полимера представляет собой ПЭГ. Для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительным ПЭГ является линейный ПЭГ с молекулярной массой, превышающей 20 кДа. Предпочтительно указанный ПЭГ имеет молекулярную массу приблизительно от 20 до 60 кДа. Более предпочтительно указанный ПЭГ имеет молекулярную массу приблизительно от 20 до 40 кДа. Наиболее предпочтительно указанный ПЭГ имеет молекулярную массу,
- 5 010015 приблизительно равную 20 кДа.
Фрагмент водорастворимого полимера ковалентно связан с разделительным или связующим фрагментом. В одном из примеров реализации фрагмент ПЭГ связан с Ν-концевой группой разделительного фрагмента.
Соединения, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, могут включать несколько фрагментов водорастворимого полимера (предпочтительно, ПЭГ) (например, 2, 3, 4 или более), и по меньшей мере один из нескольких указанных фрагментов водорастворимого полимера связан через разделительный фрагмент. Если соединение включает более одного фрагмента водорастворимого полимера, то эти несколько фрагментов водорастворимого полимера могут быть одинаковыми или химически отличными друг от друга фрагментами (например, фрагменты ПЭГ с различными молекулярными массами). В одном из примеров реализации изобретения фрагмент водорастворимого полимера представляет собой димер и включает два мономерных ПЭГ, связанных через разделительный фрагмент. В некоторых случаях на степень ПЭГилирования (количество фрагментов ПЭГ, присоединенных к пептиду и/или общее количество пептидов, к которым присоединен ПЭГ) может влиять отношение количества молекул ПЭГ к количеству молекул пептидов в реакции присоединения ПЭГ (ПЭГилирования), а также общая концентрация каждого из указанных веществ в реакционной смеси. В общем, оптимальное отношение количества молекул ПЭГ к количеству молекул пептидов (с точки зрения эффективности реакции, чтобы не оставалось непрореагировавших молекул пептидов и/или ПЭГ) определяется такими факторами, как желаемая степень ПЭГилирования (например, моно-, ди-, три- и т.д.), молекулярная масса выбранного полимера, строение полимера - разветвленное или неразветвленное, и условия реакции конкретного способа присоединения.
Существует несколько способов присоединения ПЭГ, доступных специалистам в настоящей области техники [см., например, Сообкоп е! а1., (1990) Вю/Тесйпо1оду 8:343 (РЕСу1а1юп ой ш!ег1еикт-2 а! йк д1усоку1а!юп кйе айет 811е-Фгес1е6 ти!адепек1к); ЕР 0401384 (присоединение ПЭГ к С-С8Г); Майк е! а1., (1992) Ехр. НешаЮ1. 20:1028-1035 (РЕСу1а!юп ой С-С8Г иктд !геку1 сй1от16е); РСТ номер публикации \νϋ 90/12874 (присоединение ПЭГ к эритропоетину, содержащему остаток цистеина, введенный рекомбинантным способом, при помощи цистеин-специфичного производного мПЭГ); патент США 5757078 (присоединение ПЭГ к ЕРО-пептидам); патент США 5672662 (Полиэтиленгликоль и родственные полимеры, монозамещенные пропионовой или бутановой кислотами и их функциональные производные для биотехнологического применения); патент США 6077939 (присоединение ПЭГ к Ν-концевому αуглероду в пептиде); Уегопеке е! а1., (1985) Арр1. Вюсйет. Вю!есйпо1. 11:141-142 (РЕСу1а!юп ой Ν!еттша1 α-сатйоп ой а рерйбе \\йй РЕС-т!горйепу1сагЬопа!е (РЕС-№С) ог РЕС-1псй1оторйепу1сагЬопа!е); и Уетопеке (2001) Вюта!епа1к 22:405-417 (Обзорная статья по присоединению ПЭГ к пептидам и белкам)].
Например, ПЭГ может быть ковалентно связан с остатками аминокислот через реакционноспособную группу. Реакционноспособные группы - это группы, к которым может быть присоединена активированная молекула ПЭГ (например, свободная аминогруппа или карбоксильная группа). Например, остатки Ν-концевых аминокислот и остатки лизина (К) содержат свободную аминогруппу; а остатки С-концевых аминокислот содержат свободную карбоксильную группу. В качестве реакционноспособных групп для присоединения ПЭГ могут быть использованы сульфгидрильные группы (например, находящиеся в остатках цистеина). Кроме того, были описаны способы введения активированных групп (например, гидразидных, альдегидных и ароматических аминогрупп) по С-концевой группе полипептида при помощи ферментов |8сй\\'агх е! а1. (1990) Ме1йо6к Епхутой 184:160; Воке е! а1. (1991) Вюсон)ида!е Сйет. 2:154; Саейпет е! а1. (1994) 1. Вю1. Сйет. 269:7224].
Например, молекулы ПЭГ могут быть присоединены к аминогруппам при помощи метоксилированного ПЭГ («мПЭГ»), имеющего иные реакционноспособные фрагменты. Неограничивающие примеры таких реакционноспособных фрагментов включают сукцинимидилсукцинат (88), сукцинимидилкарбонат (8С), мПЭГ-имидат, пара-нитрофенилкарбонат ШРС), сукцинимидилпропионат (8РА) и циануридхлорид. Неограничивающие примеры таких мПЭГ включают мПЭГ-сукцинимидилсукцинат (тРЕС88), мПЭГ2-сукцинимидилсукцинат (тРЕС2-88); мПЭГ-сукцинимидилкарбонат (тРЕС-8С), мПЭГ2сукцинимидилкарбонат (тРЕС2-8С); мПЭГ-имидат, мПЭГ-пара-нитрофенилкарбонат (тРЕС-№С), мПЭГ-имидат; мПЭГ2-пара-нитрофенилкарбонат (тРЕС2-№С); мПЭГ-сукцинимидилпропионат (тРЕС8РА); мПЭГ2-сукцинимидилпропионат (тРЕС2-8РА); мПЭГ-Л-гидроксисукцинимид (тРЕС-Ж8); мПЭГ2-Н-гидроксисукцинимид (тРЕС2-NΗ8); мПЭГ-циануридхлорид; мПЭГ2-циануридхлорид; тРЕС2Ьукто1-№С и тРЕС2-Еук-НН8.
Если присоединение ПЭГ неспецифично, а требуется пептид, содержащий специфично присоединенный ПЭГ, то требуемое соединение, к которому присоединен ПЭГ, выделяют очисткой из всей смеси соединений, к которым присоединен ПЭГ. Например, если необходимо получить пептид, в котором ПЭГ присоединен по концевому атому Ν, то форма с ПЭГ, присоединенным по концевому атому Ν, может быть выделена очисткой из множества пептидов со случайным присоединением ПЭГ (т.е. отделяют нужный фрагмент от других фрагментов с моноприсоединением ПЭГ).
- 6 010015
В некоторых примерах реализации ПЭГ присоединяют сайт-специфическим образом к пептиду или разделительному фрагменту. Ранее сайт-специфическое присоединение ПЭГ по Ν-концевой группе, боковой цепи и С-концевой группе потенциального аналога фактора высвобождения гормона роста осуществляли при помощи твердофазного синтеза [Рейх е1 а1. (1995) Ιηΐ. 1. Рерййе Рго1ст Век. 46:253]. Другой сайт-специфический способ включает присоединение пептида к крайним участкам цепочек ПЭГ, привитых на поверхность липосом сайт-специфическим способом при помощи реакционноспособной альдегидной группы на Ν-концевом участке, полученной при окислении Ν-концевого треонина периодатом натрия [2айр§ку еΐ а1. (1995) Вюсопф СЬет. 6:705]. Однако этот способ ограничен полипептидами, содержащими Ν-концевые остатки серина или треонина.
В одном из способов селективное Ν-концевое присоединение ПЭГ может быть осуществлено посредством восстановительного алкилирования, в основе которого лежит различная реакционная способность различных типов первичных аминогрупп (лизина относительно Ν-концевой группы), находящихся в конкретном фрагменте пептида или разделительном фрагменте и доступных для проведения реакций с образованием новых производных. В соответствующих реакционных условиях карбонильную группу, содержащую ПЭГ, селективно присоединяют к Ν-концевой группе пептида или разделительного фрагмента. Например, селективное присоединение ПЭГ к протеину по Ν-концевой группе осуществимо при помощи проведения реакции при таких значениях рН, которые выбирают в зависимости от разницы между рКа ε-аминогруппы лизинового остатка и α-аминогруппы Ν-концевого остатка пептида или разделительного фрагмента. При таком селективном присоединении ПЭГ главным образом присоединяется по Ν-концевой группе протеина, практически не затрагивая других реакционноспособных групп (например, аминогруппы боковой цепочки лизина). Для того чтобы можно было применять восстановительное алкилирование, ПЭГ должен содержать только одну реакционноспособную альдегидную группу, способную присоединяться к протеину (например, может быть применен ПЭГ-пропиональдегид).
Сайт-специфический мутагенез представляет собой еще один подход, который можно использовать для приготовления пептидов, применяемых для сайт-специфического присоединения полимеров. При помощи этого способа в пептиде создают последовательность аминокислот, пригодную для введения подходящей реакционноспособной группы в нужное положение внутри пептида. Например, в заявке νθ 90/12874 описано сайт-специфическое присоединение ПЭГ к белкам, модифицированным введением остатков цистеина или замещением других остатков остатками цистеина. В указанной публикации также описано приготовление мПЭГ-эритропоетина («мПЭГ-ЭПО») по реакции цистеин-специфического производного мПЭГ с остатком цистеина, введенным рекомбинантным способом и находящимся на ЭПО.
Если фрагмент ПЭГ нужно присоединить к разделительному фрагменту или связующему фрагменту, то могут быть использованы аналогичные способы присоединения. В этом случае, разделительный или связующий фрагмент содержит реакционноспособную группу, а для осуществления ковалентного присоединения используют активированную молекулу ПЭГ, содержащую соответствующую комплементарную реакционноспособную группу. В предпочтительных примерах реализации реакционноспособная группа разделительного или связующего фрагмента - это концевая реакционноспособная группа (т.е. находящаяся на конечном (концевом) участке разделительного или связующего фрагмента).
Пептиды, димеры пептидов и другие молекулы, полученные на основе пептидов, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть присоединены к водорастворимым полимерам (например, ПЭГ) при помощи любой химической реакции, применяемой для присоединения водорастворимого полимера (полимеров) к участку молекулы, связывающему рецептор (тесерЮг-Ыпйтд ротйоп) (например, пептид + разделительный фрагмент). В типичных примерах реализации для ковалентного присоединения водорастворимого полимера (полимеров) к участку молекулы, связывающему рецептор, применяют присоединение по одиночному центру (8шд1е айасйтеШ фшсйоп): однако в альтернативных примерах реализации может быть применено присоединение по множественным центрам (тц1йр1е а11ас1ипеЩ щпсОопЦ. включающее дополнительные изменения, при которых различные типы водорастворимого полимера присоединяют к участку молекулы, связывающему рецептор, на определенных центрах для присоединения, которые могут включать центр (центры) для ковалентного присоединения разделительного фрагмента и/или к одной или обеим пептидным цепочкам. В некоторых примерах реализации димер или мультимер более высокого порядка включает различные виды пептидных цепочек (т. е. гетеродимер или иной гетеромультимер). В качестве неограничивающего примера можно назвать димер, который может включать первую пептидную цепочку, содержащую центр для присоединения ПЭГ, а вторая пептидная цепочка может либо вовсе не содержать центров для присоединения ПЭГ, или подвергаться другим реакциям присоединения, отличным от реакций, характерных для первой цепочки: а в некоторых альтернативных примерах разделительный фрагмент может содержать или не содержать центр для присоединения ПЭГ, причем указанный разделительный фрагмент, при проведении реакции присоединения ПЭГ, может подвергаться другим реакциям присоединения, отличным от реакций, характерных для первой и/или второй пептидной цепочки. В альтернативном примере реализации применяют ПЭГ, присоединенный к разделительному фрагменту участка молекулы, связывающего рецептор, и другой водорастворимый полимер (например, углевод), присоединенный к боковой цепи одной из аминокислот пептидной части молекулы.
- 7 010015
Для присоединения ПЭГ к участку молекулы, связывающему рецептор (пептиды + разделительный фрагмент), может быть использован ряд различных типов полиэтиленгликоля (ПЭГ). По существу, может быть применен любой подходящий реакционноспособный ПЭГ-реагент. В предпочтительных примерах реализации реакция реакционноспособного ПЭГ-реагента приводит к образованию карбаматной или амидной связи при присоединении реагента к участку молекулы, связывающего рецептор. Неограничивающие примеры подходящих реакционноспособных типов ПЭГ включают коммерчески доступные соединения, перечисленные в каталоге «Эгид Эейуегу 8у51ет5 са(а1од (2003)» Корпорации ΝΘΡ (УеЬйи Сагбеп Р1асе Тотеег, 20-3 ЕЬйи 4-скоте, 8ЫЬиуа-ки, Токуо 150-6019) и в каталоге «Мо1еси1аг Епдшеетшд са1а1од (2003)», предоставляемом №к1ат Тйетареибск (490 Э15соуегу Элуе. Нии15уШе, А1аЬата 35806). В качестве неограничивающих примеров можно назвать следующие ПЭГ-реагенты, часто применяемые в различных примерах реализации: тРЕ^-ΝΗδ, тРЕС^АЬ-Э, тиШ-Агт РЕС, тРЕС(МАЬ)2, тРЕС2(МАЬ), тРЕС-ΝΗ^ тРЕС-8РА, тРЕС-8ВА, мПЭГ-тиоэфиры (тРЕС-1Ыое51ет5), мПЭГ-двойные сложные эфиры (тРЕС-ОоиЬ1е Е51ет5), тРЕС-ВТС, шРЕС-ВифтАЕП, тРЕС-АСЕТ, гетерофункциональные РЕС ^Н2-РЕС-СООН, Вос-РЕС-ΝΗδ, Ртос-РЕС-ΝΗδ, 1ЧН8-РЕС-У8, ΝΗδ-РЕС-МАЬ), ПЭГакрилаты (АСКЕ-РЕС-ΝΗδ); ПЭГ-фосфолипиды (например, шРЕС-О8РЕ), многолучевые (тиШаттеб) РЕС серии 8и1ЧВКПЕ, включающие ПЭГ серии СЬ, полученные на основе глицерина и активированные при помощи химических реакций, выбираемых специалистами в данной области техники; любые из активированных ПЭГ серии 8ЦКВК.ПЕ (неограничивающие примеры которых включают различные карбоксил-ПЭГ, р-№-РЕС8, ТтекуРРЕСк, альдегидные ПЭГ, различные ацеталь-ПЭГ, различные аминоПЭГ, различные тиол-ПЭГ, различные малеимидо-ПЭГ, гидроксил-ПЭГ-амин, амино-ПЭГ-СООН, гидроксил-ПЭГ-альдегид, ПЭГ типа ангидрида карбоновой кислоты, функционализированные ПЭГфосфолипиды и другие подобные и/или подходящие реакционноспособные ПЭГ, которые могут быть выбраны специалистами в данной области техники с целью конкретного применения и использования).
Пептидный фрагмент.
В качестве пептидного фрагмента могут быть использованы любые пептиды, полученные из организмов различных животных, включая человека, микроорганизмов или растений, а также пептиды, полученные при помощи генной инженерии, или синтетические пептиды. Примеры таких пептидов включают пептиды, связывающие ЕРО-К; пептиды, связывающие ТРО-К, цитокины, такие как различные интерфероны (например, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ); интерлейкин-2 и интерлейкин-3; гормоны, такие как инсулин, фактор высвобождения гормона роста (СКР); кальцитонин; пептид, связанный с геном кальцитонина (са1сйои1и депе те1а1еб рерббе) (ССКР); натрийуретический пептид предсердия (А№); вазопрессин; фактор высвобождения кортикотропина (СКР); вазоактивный пептид кишечника (УТР); секретин, гормон стимуляции α-меланоцитов (а-М8Н); адренокортикотропный гормон (АСТН); холецитокинин (ССК); глюкагон; паратироидный гормон (РТН); соматостатин; эндотелин; вещество Р; динорфин; окситоцин и пептид высвобождения гормона роста [СНКР, см., например, Епбостшо1оду, 114, 1537 (1984)]; факторы роста, такие как гормон роста (СН), инсулиноподобный фактор роста (1СР-1, 1СР-11), фактор роста нервов ф^СР), базовый (основной) фактор роста фибробластов (ЬРСР), трансформирующий фактор роста, эритропоетин, фактор, стимулирующий рост колонии гранулоцитов (С-С8Р), фактор, стимулирующий рост гранулоцитарно-моноцитарно-макрофагальной колонии (дтапи1осу1е тасторйаде со1опу-Шти1а1шд ГасЮг (СМ-С8Р)), тромбоцитарный фактор роста (РЭСР) и фактор роста эпидермиса (ЕСР); ферменты, такие как активатор плазминогена тканей (ΐ-РА); эластаза, супероксиддисмутаза (8ОЭ), билирубиноксидаза, каталаза, уриказа и аспарагиназа; другие протеины, такие как убихитин (иЬк|ш1т); протеин активации островковых клеток поджелудочной железы (1з1е1 асбуабпд рто1еш (1АР)); тимический фактор сыворотки крови (Тегит (кутю Гас1от (8ТР)); пептид-Т и ингибитор трипсина; а также производные указанных соединений.
Предпочтительно пептидный фрагмент включает один или более пептидов, причем длина каждого пептида составляет менее 50 аминокислот, более предпочтительно приблизительно от 10 до 25 аминокислот и наиболее предпочтительно приблизительно от 12 до 18 аминокислот.
В одном из предпочтительных примеров реализации пептидный фрагмент выбирают из пептидов, связывающих ЕРО-К, таких как, например, пептиды, описанные в патентах США 5773569, 5830851 и 5986047 ^т1дЫоп'ом, е1 а1.; в публикации международной заявки \УО 96/40749, ^т1дЫоп'ом, е1 а1.; в патенте США 5767078 и публикации заявки \УО 96/40772, Шйпкоп'ом и 21уш'ым; заявке ХУО 01/38342, Ва1и; и в публикации заявки XVО 01/91780, 8тйй-8теш1о5ку, е1 а1. Еще несколько примеров пептидов, связывающих ЕРО-К, которые могут быть использованы в качестве пептидного фрагмента, предлагаемого в соответствии с настоящим изобретением, описаны в предварительной патентной заявке СТТТА № 60/470245, поданной 12 мая 2003 г. Еще несколько примеров пептидов, связывающих ЕРО-К, которые могут быть использованы в качестве пептидного фрагмента, предлагаемого в соответствии с настоящим изобретением, описаны в предварительной патентной заявке США № 60/469993, поданной 12 мая 2003 г. И еще несколько примеров пептидов, связывающих ЕРО-К, которые могут быть использованы в качестве пептидного фрагмента, предлагаемого в соответствии с настоящим изобретением, описаны в предварительной патентной заявке США № 60/470244, поданной 12 мая 2003 г.
- 8 010015
В другом предпочтительном примере реализации пептидный фрагмент выбирают из пептидов, связывающих тромбопоетиновые рецепторы (111готЬоро1сПп-гссср1ог5 (ТРО-В)). Неограничивающие примеры таких ТРО-В связывающих пептидов включают примеры, описанные в патентах США 6552008, 6506362, 6498155, 6465430, 6333031, 6251864, 6121238, 6083913, 5932546, 5869451, 5683983, 5677280, 5668110 и 5654276; а также в опубликованных патентных заявках США 2003/0083361, 2003/0009018, 2002/0177166 и 2002/0160013.
В одном примере реализации пептидный фрагмент представляет собой мономерный пептид, содержащий в длину от 10 до 40 или более остатков аминокислот и имеющий последовательность ХзХ |Х3СРХбТ\УХ-Хх. в которой каждая аминокислота обозначена стандартным однобуквенным обозначением: Х3 представляет собой С; Х4 представляет собой В, Н, Ь или XV: Х5 представляет собой Μ, Р или I; а Хе выбирают независимо от других аминокислот из 20 генетически закодированных (деиейсаЦу еисос1сс1) Ь-аминокислот; Х7 представляет собой ϋ, Ε, I, Ь или V; а Х§ представляет собой С, который связывает и активирует эритропоетиновый рецептор (ΕΡΟ-В), или, в другом случае, действует как агонист ЕРО.
В другом примере реализации пептидный фрагмент представляет собой мономерный пептид, содержащий от 17 до приблизительно 40 аминокислот в длину, который включает следующую последовательность основной цепи аминокислот: ΕΥΑΟΗΜΟΡΙΤΧιΟζ)ΡΕΒ, в которой каждая аминокислота обозначена стандартным однобуквенным обозначением, а Х£ представляет собой триптофан (XV). 1-нафтилаланин (1-иа1) или 2-нафтилаланин (2-иа1).
В еще одном примере реализации пептидный фрагмент включает один или более ТРО-В связывающих пептидов со следующей последовательностью аминокислот: Ас-Пс-61и-61у-Рго-Т11г-Ьси-Агд61п-Ыа1(1)-Ьеи-А1а-А1а-Агд-§аг или Ас-11е-61и-61у-Рго-Т1п-Ьеи-Агд-61п-Тгр-Ьеи-А1а-А1а-Агд-§аг.
В одном из примеров реализации пептидный фрагмент непосредственно присоединен к разделительному фрагменту.
В другом примере реализации пептидный фрагмент присоединен к разделительному фрагменту через связующий фрагмент.
В соответствии с некоторыми примерами реализации настоящего изобретения два или более, предпочтительно приблизительно от двух до шести остатков аминокислот, независимо выбираемых из любых 20 генетически закодированных Ь-аминокислот или стереоизомерных им О-аминокислот, присоединяют к одному из концов или к обоим концам основной цепочки, описанной выше. Например, последовательность 66 часто присоединяют к одному из концов или к обоим концам основной цепочки для облегчения синтеза пептида. В соответствии с настоящим изобретением также предложены конъюгаты указанных пептидов, а также их производные и пептидомиметики пептидов, сохраняющие способность связывать ЕРО-В.
Стереоизомеры (например, ϋ-аминокислоты) двадцати традиционно применяемых аминокислот, аминокислот неприродного происхождения, таких как α,α-дизамещенные аминокислоты, Νалкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетрадиционные аминокислоты, также могут быть использованы в качестве соединений, подходящих для настоящего изобретения. Неограничивающие примеры нетрадиционных аминокислот включают β-аланин, 3-пиридил-аланин, 4-гидроксипролин, Офосфосерин, Ν-метилглицин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, норлейцин, 1- или 2-нафтилаланин, саркозин и другие подобные аминокислоты и имино кислоты.
В предпочтительных примерах реализации пептидные фрагменты, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, содержат внутримолекулярную дисульфидную связь между двумя остатками цистеина, находящимися в основной цепи аминокислот. Например
I----------1 ьУАснмарнх.усорьк ь¥Аснмсрпх,УСфрьк. или I I
Димерные и олигомерные пептиды.
В предпочтительном примере реализации мономерные пептидные фрагменты, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, подвергают димеризации или олигомеризации с образованием димеров или олигомеров. Кроме того, такие димеры и другие мультимеры могут быть гетеродимерами или гетеро мультимерами.
В одном из примеров реализации, пептидные мономеры, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть подвергнуты олигомеризации при помощи системы биотин/стрептавидин. Биотинилированные аналоги пептидных мономеров могут быть синтезированы обычными способами. Например, пептидные мономеры могут быть подвергнуты биотинилированию по С-концевому атому. Такие биотинилированные мономеры затем подвергают олигомеризации при помощи инкубации со стрептавидином [например, при молярном соотношении 4:1 при комнатной температуре в солевом растворе фосфатного буфера (РВ8) или среде ΒΡΜΙ с буфером НЕРЕ8 (1иуйгодеи) в течение 1 ч]. В модификации этого примере реализации биотинилированные пептидные мономеры затем могут быть подвергнуты олигомеризации при помощи инкубации с любым из коммерчески доступных антибиотиновых антител [например, антибиотин козы 1д6, полученный в Кпкедаатб & Репу ЬаЬога1опс5. 1ис. (ХУахЫпдЮп.
-9010015
ОС)].
Связующие фрагменты (линкеры).
В предпочтительных примерах реализации пептидные мономеры, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, подвергают димеризации путем ковалентного присоединения по меньшей мере к одному связующему фрагменту. Связующий фрагмент (Ьк), предпочтительно, но не обязательно, представляет собой азотсодержащий связующий фрагмент. Наиболее предпочтительно связующий фрагмент представляет собой трифункциональный связующий фрагмент, возможно, имеющий в концевом положении одну или две связи -СО-. В предпочтительном примере реализации настоящего изобретения связующий фрагмент Ьк включает следующую структуру:
где каждый из коэффициентов η и φ представляет собой целое число, значения которых выбирают независимо друг от друга, а N ковалентно связан с Υ разделительного фрагмента, и Υ разделительного фрагмента представляет собой СО. Наиболее предпочтительно связующий фрагмент связывает два пептидных мономера по С-концевым группам, путем одновременного присоединения к С-концевой аминокислоте каждого мономера. Например, если связующий фрагмент Ьк образует амидную связь с εаминогруппой С-концевого остатка лизина первого и второго пептидного мономера, то димер может быть представлен структурной формулой III, и в обобщенном виде - формулой IV.
В формуле IV символом Ν2 обозначен атом азота ε-аминогруппы лизина, и символом Ν1 обозначен атом азота ε-аминогруппы лизина. Для обозначения пептида, содержащего остаток лизина, в котором εаминогруппа С-концевого остатка лизина связана со связующим фрагментом, может быть написана следующая димерная структура: |рср1|бс-Ьу5|2-Ьк: для обозначения пептида, содержащего остаток лизина, в котором ε-аминогруппа С-концевого остатка лизина связана со связующим фрагментом, причем каждый пептид содержит внутримолекулярный дисульфидный мостик, может быть написана следующая димерная структура: [рерДбе-Ьук, б15и1Пбс|2-Ьк: для обозначения пептида, содержащего остаток лизина, в котором ε-аминогруппа С-концевого остатка лизина связана со связующим фрагментом, причем каждый пептид содержит внутримолекулярный дисульфидный мостик, а молекула разделительного фрагмента образует ковалентную связь между С-концевой группой лизина и фрагментом ПЭГ, может быть написана следующая димерная структура: [рерббе-Гук, б15и1Пбе|2-Гк-8расег-РЕС. или для обозначения пептида, содержащего остаток лизина, в котором ε-аминогруппа С-концевого остатка лизина связана со связующим фрагментом, причем каждый пептид содержит внутримолекулярный дисульфидный мостик, а молекула разделительного фрагмента образует две ковалентные связи между С-концевой группой лизина и фрагментом ПЭГ, может быть написана следующая димерная структура: [рерИбе-Гук, б15и1Пбе|2-Гк8расет-РЕО2.
В другом предпочтительном примере реализации связующий фрагмент представляет собой остаток лизина или лизинамида (остаток лизина, в котором карбоксильная группа была превращена в амидный фрагмент СОNΗ2). Более предпочтительно связующий фрагмент связывает С-концевые группы двух пептидных мономеров путем одновременного присоединения к С-концевым аминокислотам каждого мономера. Например, если С-концевый связующий фрагмент Ьк представляет собой лизинамид, то димер может быть представлен структурной формулой V, и в обобщенном виде - формулой VI.
- 10 010015
-ΝΗ2
Формула V
Формула VI
Мопотет!
Мопотег!
Мопотег2‘
М<тотег2
В формуле V символом Ν2 обозначен атом азота ε-аминогруппы лизина, а символом Ν1 обозначен атом азота α-аминогруппы лизина. Для обозначения пептида, связанного как с α-, так и с εаминогруппами связующего фрагмента, включающего лизин, может быть написана следующая димерная структура: [рерббе]2-Ьк; или для обозначения Ν-терминально ацетилированного пептида, связанного как с α-, так и с ε-аминогруппами связующего фрагмента, включающего лизин, может быть написана следующая димерная структура: [Лс-рерббе]2-Ьк; или для обозначения Ν-терминально ацетилированного пептида, связанного как с α-, так и с ε-аминогруппами связующего фрагмента, включающего лизин, причем каждый из пептидов содержит внутримолекулярный дисульфидный мостик, может быть написана следующая димерная структура: [Ас-рерббе, б15иШбе]2-Ьк; или для обозначения Ν-терминально ацетилированного пептида, связанного как с α-, так и с ε-аминогруппами связующего фрагмента, включающего лизин, причем каждый из пептидов содержит внутримолекулярный дисульфидный мостик, а молекула разделительного фрагмента образует ковалентную связь между С-концевой группой лизина и фрагментом ПЭГ, может быть написана следующая димерная структура: [Ас-рерббе, б15иШбе]2-Ек-8расег-РЕО.
Обычно, хотя и не обязательно, димеры пептидов, получаемые в соответствии с методиками, отличными от методик образования межмолекулярного дисульфидного мостика, также содержат одну или более дисульфидных связей между цистеиновыми остатками пептидных мономеров. Например, два таких мономера могут быть сшиты одним или более межмолекулярным дисульфидным мостиком. Предпочтительно два мономера содержат по меньшей мере одну внутримолекулярную дисульфидную связь. Наиболее предпочтительно оба мономера пептидного димера содержат внутримолекулярную дисульфидную связь, так что каждый мономер содержит циклический фрагмент.
Модификация пептидов.
Для получения других соединений, предлагаемых в соответствии с настоящим изобретением, может быть модифицирована концевая аминогруппа и/или карбоксильная группа пептидных соединений, предлагаемых в соответствии с настоящим изобретением. Модификация концевой аминогруппы включает метилирование (т.е. получение -ΝΗΟΗ3, -Ы(СН3)2), ацетилирование (например, уксусной кислотой или ее галогенопроизводным, таким как α-хлоруксусная кислота, α-бромуксусная кислота или αйодуксусная кислота), присоединение бензилоксикарбонильной группы (СЬх) или блокирование концевой аминогруппы при помощи любой блокирующей группы, содержащей карбоксилатную функциональную группу, определяемую как группа КСОО-, или сульфонильную функциональную группу, определяемую как группа К-8О2-, где К. выбирают из группы, состоящей из алкила, арила, гетероарила, алкиларила и подобных им радикалов и групп. Для снижения восприимчивости к протеазам или для ограничения конформационных изменений пептидного соединения к Ν-концевой группе также может быть присоединена дезаминокислота (так что Ν-концевая аминогруппа будет при этом отсутствовать). В предпочтительных примерах реализации Ν-концевую группу ацетилируют. В наиболее предпочтительных примерах реализации Ν-концевую группу глицина ацетилируют, получая Ν-ацетилглицин (ЛсО).
Модификация концевой карбоксильной группы включает замещение свободной кислоты карбоксамидной группой или образование циклического лактама на концевой карбоксильной группе с целью введения структурных ограничений. Пептиды, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, также могут быть подвергнуты циклизации, или к концевым группам пепетидов могут быть присоединены дезаминирующие или декарбоксилирующие остатки, так что полученный пептид не содержит концевых амино- или карбоксильных групп, что снижает восприимчивость к протеазам или ограничивает конформационные изменения пептида. С-концевые функциональные группы соединений, предлагаемых в соответствии с настоящим изобретением, включают амидную группу, алкиламидную группу, образованную низшим алкилом, диалкиламидную группу, образованную низшим алкилом, алкоксильную группу, образованную низшим алкилом, гидроксигруппу, карбоксильную группу или ее сложноэфирную группу, образованную низшим алкилом, а также ее фармацевтически приемлемые соли.
Боковые цепочки природного происхождения 20 генетически закодированных (деиебсабу еисобеб) аминокислот (или стереоизомерных Ό-аминокислот) могут быть замещены другими боковыми цепочками, например, такими группами, как алкил, низший алкил, циклический алкил, содержащий 4, 5, 6 или 7 атомов в цикле, амидной группой, алкиламидной группой, образованной низшим алкилом, диалкила- 11 010015 мидной группой, образованной низшим алкилом, алкоксильной группой, образованной низшим алкилом, гидроксигруппой, карбоксильной группой и ее сложноэфирной группой, образованной низшим алкилом, или 4-, 5-, 6- или 7-членным гетероциклом. В частности, могут быть использованы аналоги пролина, в которых 5-членный циклический фрагмент пролинового остатка замещен 4-, 6- или 7-членным циклом. Циклические группы могут быть как насыщенными, так и ненасыщенными, а ненасыщенные группы могут быть как ароматическими, так и неароматическими. Гетероциклические группы, предпочтительно, содержат один или более гетероатомов азота, кислорода и/или серы. Примеры таких групп включают следующие радикалы: фуразанил, фурил, имидазолидинил, имидазолил, имидазолинил, изотиазолил, изоксазолил, морфолинил (например, морфолино), оксазолил, пиперазинил (например, 1-пиперазинил), пиперидил (например, 1-пиперидил, пиперидино), пиранил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиразолил, пиридазинил, пиридил, пиримидинил, пирролидинил (например, 1-пирролидинил), пирролинил, пирролил, тиадиазолил, тиазолил, тиенил, тиоморфолинил (например, тиоморфолино) и тиазолил. Указанные гетероциклические группы могут быть как замещенными, так и незамещенными. Если группа имеет заместители, то такими заместителями могут быть следующие радикалы: алкил, алкоксильный радикал, галоген, кислород или замещенный или незамещенный фенил.
Пептидные фрагменты также могут быть легко модифицированы посредством фосфорилирования и других способов [например, описанных НгиЬу е! а1., в (1990) Вюсйет. 1. 268:249-262].
Пептидные фрагменты, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, также могут представлять собой модели для непептидных соединений, имеющих аналогичную биологическую активность. Специалистам в данной области техники должно быть известно, что существует множество способов создания соединений с такой же, как и у начального (1еаб) пептидного соединения биологической активностью или аналогичной желаемой биологической активностью, но с улучшенными относительно этого соединения качествами, такими как растворимость, стабильность и подверженность гидролизу и протеолизу [см., Могдаи аиб Сашог (1989) Апп. Вер. Меб. Сйеш. 24:243-252]. Указанные способы включают замещение основной цепи пептида основной цепью, составленной из фосфонатов, амидатов, карбаматов, сульфонамидов, вторичных аминов и Ν-метиламинокислот.
Фармацевтические композиции.
В соответствии с еще одной целью настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции на основе вышеописанных пептидов, модифицированных ПЭГ. Симптомы, которые могут быть смягчены или устранены при приеме таких композиций, включают симптомы, описанные выше. Такие фармацевтические композиции могут быть назначены для следующих типов приема: перорального, парентерального (внутримышечных, внутрибрюшных, внутривенных (ВВ) или подкожных инъекций), трансдермального (как пассивного, так и с использованием ионтофореза или электрофореза (е1ес!горогайои)), через слизистую оболочку (носовую, вагинальную, ректальную или подъязычную), или при помощи биоразрушаемых вставных элементов (Ьюегоб1Ь1е шкегб), и могут быть приготовлены в виде лекарственных форм, приемлемых для соответствующего способа приема. В общем, изобретение охватывает фармацевтические композиции, включающие эффективные количества терапевтически активных пептидов (например, пептидов, способных связывать ЕРО-В), вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульсификаторами, вспомогательными средствами и/или носителями. Такие композиции включают разбавители с различными содержаниями буферного вещества (например, трис-НС1, ацетат, фосфат), с разными рН и ионной силой; добавки, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, Тетееи 80, Ро1у§огЬа1е 80); антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия); консерванты (например, ТЫтег§о1, бензиловый спирт) и наполнители (например, лактоза, маннит); также они включают введение материала в порошковые рецептуры полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Также может быть использована гилауроновая кислота. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ίη νί\Ό и скорость клиренса ίη у1уо указанных протеинов и их производных. См., например, издание Ветшд1ои'8 Рйагтасеийса1 Зшеисек, 18'1' Еб. (1990, Маск РиЬШЫид Со., Еайои, РА 18042) с.1435-1712, включенное в настоящее описание по ссылке. Указанные композиции могут быть приготовлены в жидкой форме или могут находиться в виде сухого порошка (например, в лиофилизированной форме).
Пероральный прием.
Настоящее изобретение охватывает применение твердых лекарственных форм для перорального приема, которые, в основном, описаны в издании Ветшд1ои'8 Рйагтасеибса1 Зшеисек, 184Ь Еб. (1990, Маск РиЬШЫид Со., Еайои, РА 18042), глава 89, включенном в настоящее описание по ссылке. Твердые лекарственные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, драже или лепешки, облатки, подушечки, порошки или гранулы. Также для изготовления предлагаемых композиций может быть применено введение их в липосомную или протеноидную капсулу (как, например, введение в протеноидные микросферы, описанное в патенте США 4925673). Описание возможных твердых лекарственных форм, применяемых для терапевтических целей, имеется в публикации Маг8Йа11, К., находящейся в Мобеги Рйагтасеибск, изданной С.8. Ваикег и С.Т. Вйобек, Часть 10, 1979, включенной в настоящее описание по ссылке. В целом, рецептуры включают пептиды - агонисты ЕРО-В (или их химически модифицирован
- 12 010015 ные формы) и инертные ингредиенты, которые позволяют защищать активные ингредиенты от желудочных сред и высвобождать биологически активные материалы только в кишечнике.
Настоящее изобретение также охватывает применение жидких лекарственных форм, пригодных для перорального приема, включающих фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии и сиропы, которые могут содержать и другие компоненты, включающие инертные разбавители; вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспензирующие агенты; а также подсластители, вкусовые вещества и ароматизирующие вещества.
Пептиды могут быть химически модифицированы таким образом, что пероральный прием производного производит необходимый эффект. В общем случае, химическую модификацию определяют как присоединение по меньшей мере одного фрагмента к самой молекуле компонента, причем указанный фрагмент позволяет достичь следующего действия: (а) замедления протеолиза; и (Ь) поступления в кровоток из желудка или кишечника. Желательно также обеспечить повышенную стабильность компонента или компонентов и увеличить время их циркуляции в организме. Как уже было сказано выше, предпочтительной химической модификацией для фармацевтического применения является присоединение ПЭГ (ПЭГилирование). Также могут быть введены и другие фрагменты, которые включают пропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, жирные кислоты (например, миристиновая кислота), пептиды [см. Оепш5. М. 8. е1 а1., 1. Βίο1. СИет. 2002, 277, 35035], поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полипролин, поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан [см., например, ЛЬисйо№к1 аи! Όηνίδ (1981) 8о1иЬ1е Ро1утег-Еихуте А!!ис18, Еихутех аи! Эгидх. НосеиЬегд аи! ВоЬегК е!§. (^|1еу-[п1ег5с1епсе: №\ν Уогк, ΝΥ), и №\утагк е1 а1., (1982) 1. Арр1. Вюскет. 4:185-189].
Для композиций, принимаемых перорально, областью высвобождения лекарственного средства может быть желудок, тонкий кишечник (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка ((ершет) или подвздошная кишка) или толстый кишечник. Специалистам в данной области техники известны композиции, которые не растворяются в желудке, однако, высвобождают содержащийся в них материал в двенадцатиперстной кишке или в другой области тонкого кишечника. Предпочтительно высвобожденный материал не попадает в область разрушительного действия желудочных сред, что происходит либо благодаря защите пептида (или его производного), либо за счет высвобождения пептида (или его производного) за пределами желудка, например в кишечнике.
Для обеспечения полной защиты от воздействия желудочных сред, на лекарственную форму необходимо нанести покрытие, непроницаемое, по меньшей мере, при значениях рН, достигающих 5,0. Примерами наиболее часто применяемых инертных ингредиентов, которые используют в качестве кишечнорастворимых покрытий, являются целлюлозы ацетата тримеллитат (САТ), гидроксипропилметилцеллюлозы фталат (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, поливинилацетата фталат (РУАР), Еи!гадй Τ30Ό, Лсща1епс, целлюлозы ацетата фталат (САР), Еи!гадй Ь, Еи!гадй 8 и шеллак (8йе11ас). Указанные покрытия могут быть использованы в виде смешанных пленок.
На таблетки также может быть нанесено покрытие или смесь покрытий, которые применяют с иной целью, нежели для защиты от желудочных сред. Такие покрытия могут включать покрытие сахаром или покрытия, облегчающие глотание таблетки. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (такой, как желатин) для доставки сухого терапевтического средства (т. е. порошка), в то время как для жидких форм может быть использована оболочка из мягкого желатина. Материалом оболочки для облаток может быть плотный крахмал или другой пищевой бумажный материал. Для изготовления пилюль, лепешек, прессованных таблеток и таблеточных порошков подходят большинство методик обработки в массе.
Пептид (или его производное) может быть введен в композицию в виде мелких отдельных частиц в виде гранул или подушечек с размером частицы, приблизительно равным 1 мм. Композиция материала, применяемого для приема в виде капсул, также может находиться в виде порошка, слегка уплотненных гранул или даже таблеток. Такие терапевтические средства могут быть изготовлены при помощи прессования.
В композиции также могут быть включены красящие вещества и/или вкусовые вещества. Например, пептид (или его производное) могут быть включены в композицию (например, при помощи введения в липосомную капсулу или микросферу), а затем помещены в пищевой продукт, такой как охлажденный напиток, содержащий красящие вещества и вкусовые вещества.
Содержание пептида (или его производного) может быть увеличено или снижено за счет содержания инертного материала. Такие разбавители могут включать углеводы, в особенности маннит, αлактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. В качестве наполнителей могут быть также использованы определенные неорганические соли, включающие трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Примерами некоторых коммерчески доступных разбавителей являются Ра81-Р1о, Ет!ех, 8ТА-Рх 1500, Етсотргекк и Ауюе11.
При изготовлении твердой лекарственной формы, содержащей терапевтическую композицию, в нее также могут быть включены дезинтегрирующие агенты. Неограничивающие примеры материалов, используемых в качестве дезинтегрирующих агентов, включают крахмал, включая коммерчески доступный дезинтегрирующий материал, изготовленный на основе крахмала, Ехр1о!аЬ. Также могут быть использо
- 13 010015 ваны натрий-крахмала гликолят, АтЬет1йе, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, апельсиновая корка, кислая карбоксиметилцеллюлоза, природная губка и бетонит. В качестве дезинтегрирующих агентов также могут быть использованы нерастворимые катионообменные смолы. В качестве дезинтегрирующих агентов и связывающих веществ могут быть использованы порошкообразные природные полимеры (гумми), которые могут включать такие порошкообразные природные полимеры (гумми), как агар-агар, смолу Кагауа или трагакантовую камедь. Альгиновая кислота и ее натриевая соль также могут быть использованы в качестве дезинтегрирующих агентов.
Для связывания пептида (или его производного) с образованием твердой таблетки могут быть использованы связывающие вещества, включающие материалы, полученные из природных продуктов, таких как акация, трагакант, крахмал и желатин. Другие связывающие вещества включают метилцеллюлозу (МЦ (МС)), этилцеллюлозу (ЭЦ (ЕС)) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ (СМС)). Для получения гранул, содержащих пептид (или его производное), могут быть использованы поливинилпирролидон (РУР) и гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС) в спиртовом растворе. Для предотвращения слипания во время изготовления композиции пептида (или его производного) в композицию может быть включен антифрикционный агент. Для создания слоя между пептидом (или его производным) и стенкой прессформы могут быть использованы смазочные вещества, неограничивающие примеры которых могут включать стеариновую кислоту, включая ее магниевую и кальциевую соль, политетрафторэтилен (РТРЕ), жидкий парафин, растительные масла и воски. Также могут быть использованы растворимые смазочные вещества, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль с различной молекулярной массой, СатЬо^ах 4000 и 6000.
В композицию могут быть добавлены скользящие вещества, которые могут улучшать характеристики текучести медикамента во время изготовления композиции и способствовать его перераспределению во время прессования. Скользящие вещества могут включать крахмал, тальк, пирогенный оксид кремния и гидратированный кремнийалюминат.
Для улучшения растворимости пептида (или его производного) в водных средах может быть добавлено поверхностно-активное вещество, используемое в качестве смачивающего агента. Поверхностноактивные вещества могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, сульфосукцинат диоктил-натрия и сульфонат диоктил-натрия. Могут быть использованы катионные детергенты, которые могут включать бензальконийхлорид (ЬепхаПюпцпп сЫопбе) или бензэтомийхлорид (Ьепхсйютцпп сЫопбе). Список потенциальных неионных детергентов, которые могут быть включены в композицию в качестве поверхностно-активных веществ, включает лауромакрогол (1аиготасгодо1) 40, полиоксилстеарат-40 (ро1уоху1 40 5!еата!е), полиокиэтилен-гидрированное касторовое масло 10, 50 и 60, моностеарат глицерина, полисорбат 40, 60, 65 и 80, сложный эфир жирной кислоты и сахарозы, метилцеллюлозу и карбокисметилцеллюлозу. Указанные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в композиции протеина или его производного либо самостоятельно, либо в смеси компонентов в различных соотношениях.
Добавками, которые потенциально могут усиливать всасывание пептида (или его производного), являются, например, жирные кислоты: олеиновая кислота, линолевая кислота и линоленовая кислота.
Может возникнуть необходимость приготовления композиций для перорального приема с контролируемым высвобождением лекарственного средства. Пептид (или его производное) может быть введен в инертную матрицу, способную высвобождать вещество либо посредством диффузии, либо выщелачивания, например, в матрицу природного полимера (гумми). В композицию также могут быть включены медленно разлагаемые матрицы. Некоторые кишечно-растворимые покрытия также обладают свойством замедленного высвобождения. Другим видом контролируемого высвобождения является способ, разработанный на основе терапевтической системы Отое (А1ха Согр.), т.е. лекарственное средство заключают в полупроницаемую мембрану, в которую может поступать вода и выталкивать лекарственное средство через небольшое единичное отверстие в мембране за счет осмотического эффекта.
Для приготовления композиции могут быть использованы и другие покрытия. Эти покрытия включают разнообразные сахара, которые могут быть нанесены в чане для нанесения покрытия. Пептид (или его производное) также может быть введен пациенту в таблетке с пленочным покрытием, и материалы, применяемые для этой цели, могут быть разделены на две группы. Первая группа состоит из кишечнонерастворимых (попеп1епс) материалов и включает метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, провидон и полиэтиленгликоли. Вторая группа состоит из кишечнорастворимых (еп1епс) материалов, которые, в общем случае, представляют собой сложные эфиры фталевой кислоты.
Для получения оптимального пленочного покрытия может быть использована смесь материалов. Нанесение пленочного покрытия может быть произведено в чане для нанесения покрытий, или в псевдоожиженном слое, или посредством прессовочного нанесения покрытия.
Парентеральное введение.
Препараты для парентерального введения, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, включают стерильные водные и неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примерами неводных
- 14 010015 растворителей или доставочных средств являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и пригодные для введения органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Указанные лекарственные формы также могут содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, смачивающие, эмульгирующие и диспергирующие агенты. Стерилизация таких форм может быть произведена, например, фильтрованием через фильтр, задерживающий бактерии, введением стерилизующих веществ в композиции, облучением композиций или их нагреванием. Они также могут быть изготовлены с использованием стерильной воды или другой стерильной и пригодной для введения жидкости непосредственно перед введением.
Ректальное или вагинальное введение.
Композиции для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые, кроме активного вещества, могут содержать наполнители, такие как масло какао или суппозиторный воск. Композиции для введения через нос или для подъязычного введения также приготавливают, используя стандартные наполнители, хорошо известные в данной области техники.
Внутрилегочное (пульмональное) введение.
Настоящее изобретение также охватывает внутрилегочное введение пептидов - агонистов ЕРО-В (или их производных). Пептид (или его производное) вводят в легкие млекопитающего посредством вдоха, и далее он попадает в кровоток через эпителиальные ткани легких [см., например, Ай]е1 е! а1. (1990) Рйагтасеийас1 Векеагсй 7:565-569; АЩе1 е! а1. (1990) Ιηΐ. 1. Рйагтасеийск 63:135-144 (лейпролида ацетат (1еиргоШе асе1а1е)); Вгадие! е! а1. (1989) 1. СагйюуаксШаг Рйагтасо1оду 13(кир5):143-146 (эндотелин-1); НиЬЬагй е! а1. (1989) Аппа1к оГ 1п1егпа1 МеШсше, Уо1. III, с. 206-212 (а1-антитрипсин); 8тйй е! а1. (1989) 1. СЫт. Шуек!. 84:1145-1146 (а1-протеиназа); Октеш е! а1. (1990) Аегокой/айоп оГ Рго!еШ8, РгосеейШдк оГ 8утрокшт оп Векр1га!огу Эгид Эейуегу II Кеук!опе, Со1огайо (рекомбинантный гормон роста человека); ЭеЬк е! а1. (1988) 1. Iттиηо1. 140:3482-3488 (интерферон-γ и фактор некроза опухоли α) и патент США 5284656, заявленный Р1а1х е! а1. (фактор, стимулирующий рост гранулоцитарной колонии)]. Способ и композиция, применяемая для внутрилегочного введения лекарственных средств с целью достижения систематического эффекта, описаны в патенте США 5451569, заявленном Уопд е! а1.
Практическое применение настоящего изобретения охватывает широкий спектр механических устройств, предназначенных для внутрилегочного введения терапевтических продуктов; неограничивающие примеры таких устройств включают аэрозольные аппараты, ингаляторы, снабженные дозаторами, и ингаляторы порошкообразных средств; все вышеперечисленные устройства известны специалистам в данной области техники. Некоторые специфические примеры коммерчески доступных устройств, пригодных для применения настоящего изобретения, представляют собой аэрозольный аппарат ЦЦгауеп! (Ма1йпскгой! Шс., 8!. Ьоик, МО); аэрозольный аппарат Асогп II (Мащиек! Мейюа1 Ргойиск, Епд1е^оой, СО); ингалятор Уеп!о1ш, снабженный дозатором (О1ахо Шс., Векеагсй Тпапд1е Рагк, КС); и ингалятор порошкообразных средств 8рш11а1ег (Нкопк Согр., ВейГогй. МА).
Для всех указанных устройств необходимо применение композиций, пригодных для распыления пептида (или его производного). Как правило, каждая композиция специфична для каждого применяемого устройства и может включать, наряду с обычными разбавителями, вспомогательным веществами и/или носителями, применяемыми для терапии, использование подходящего газа-вытеснителя. Настоящее изобретение также охватывает применение липосом, микрокапсул или микросфер, соединений включения или носителей других типов. Химически модифицированные пептиды также могут быть изготовлены в виде различных композиций, тип которых зависит от типа химической модификации или типа применяемого устройства.
Композиции, пригодные для введения при помощи аэрозольного аппарата, как струйного, так и ультразвукового, обычно включают пептид (или его производное), растворенное в воде в концентрации приблизительно от 0,1 до 25 мг биологически активного протеина на 1 мл раствора. Композиция также может включать буферное вещество и простой сахар (например, для стабилизации протеина и регулировки осмотического давления). Композиции для аэрозольных аппаратов также могут содержать поверхностно-активное вещество для снижения или предотвращения поверхностной агрегации пептида (или его производного), вызываемой распылением раствора при образовании аэрозоля.
Композиции, пригодные для применения в ингаляторах, снабженных дозатором, обычно включают мелко размолотый порошок, содержащий пептид (или его производное), суспензированный в газевытеснителе при помощи поверхностно-активного вещества. Газом-вытеснителем может служить любой обычно применяемый для этой цели материал, такой как хлорфторуглерод, хлороводородофторуглерод, фтороводородоуглерод или углеводород, включающий трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, или комбинация указанных соединений. Подходящие поверхностно-активные вещества включают сложный триэфир сорбита и олеиновой кислоты и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества также может быть применена олеиновая кислота.
Композиции, пригодные для введения через ингалятор для порошкообразного материала, включают мелко размолотый сухой порошок, содержащий пептид (или его производное), который также может включать наполнитель, такой как лактоза, сорбит, сахароза или маннит в количествах, которые способст
- 15 010015 вуют рассеиванию порошка из устройства, например от 50 до 90 мас.% от массы композиции. Для наиболее эффективного ввода в периферическую часть легкого, лучше всего, если пептид (или его производное) приготовлен в виде частиц со средним размером менее 10 мм (или микрон), более предпочтительно от 0,5 до 5 мм.
Введение через носовые отверстия.
Настоящее изобретение также охватывает введение пептидов - агонистов ΕΡΟ-Κ. (или их производных) через носовые отверстия. Введение через носовые отверстия позволяет пептиду проникать непосредственно в кровоток сразу после введения терапевтического продукта в нос, что позволяет избежать осаждения продукта в легких. Композиции, предназначенные для введения через носовые отверстия, включают композиции, содержащие декстран и циклодекстран.
Дозировка.
По мере проведения дальнейших исследований будет предоставлена информация относительно уровня дозы, подходящего для каждого пептида, в зависимости от различных симптомов у конкретного пациента; таким образом, обычный специалист в данной области техники после рассмотрения истории болезни (Шетареийс еои1ех1), возраста и общего состояния здоровья пациента сможет назначить нужный уровень дозы. Выбранная дозировка зависит от желаемого терапевтического эффекта, способа введения средства и желаемой продолжительности лечения. Обычно млекопитающим вводят суточные дозы, составляющие от 0,001 до 10 мг на кг массы тела. Обычно для внутривенного введения или вливания дозы могут быть меньше. График приема лекарственного средства может изменяться в зависимости от времени полужизни в кровеносной системе и типа применяемой композиции.
Пептиды (или их производные), предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть введены в сочетании с одним или более дополнительных активных ингредиентов или фармацевтических композиций.
Примеры.
Ниже рассмотрены иллюстративные, не ограничивающие примеры реализации изобретения. Пример 1. Синтез молекулы Н-ТАР-Вос.
Стадия А. Синтез С/Ьх-ТАР.
СЬг-С1,ОСМ
(СЬх-ТАР) (ТАР)
Раствор ТАР (10 г, 67,47 ммоль, купленный в А1бпс11 СЬеш1са1 Со.) в безводном дихлорметане (ДХМ (ЭСМ)) охладили до 0°С. К раствору ТАР медленно, в течение 6-7 ч, добавили через капельную воронку раствор бензилхлороформата (С/Ьх-СТ СЬх = карбоксибензилокси) (4,82 мл, 33,7 ммоль) в безводном ДХМ (50 мл), поддерживая температуру реакционной смеси 0°С в течение всего прибавления. Полученной смеси затем дали нагреться до комнатной температуры (~25°С). Спустя еще 16 ч ДХМ отогнали в вакууме, и остаток разделяли в смеси 3н. НС1 и эфира. Водные слои собирали и нейтрализовали 50% водным ΝαΟΗ до рН 8-9 и экстрагировали этилацетатом. Слой этилацетата сушили безводным Ν;·ι28Ο4 и затем концентрировали в вакууме, получая сырой моно-СЬх-ТАР (5 г, приблизительно 50% выход). Это соединение использовали далее для выполнения стадии В без очистки.
Стадия В. Синтез СЬх-ТАР-Вос.
(СЬг-ТАР) (СЬг-ТАР-Вос)
Вос2О (3,86 г, 17,7 ммоль, Вос = трет-бутоксикарбонил) добавили к сильно перемешиваемой суспензии СЬх-ТАР (5 г, 17,7 ммоль) в гексане (25 мл). Перемешивание продолжали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавили ДХМ (25 мл) и промывали 10% водной лимонной кислотой (2 раза), водой (2 раза) и солевым раствором. Органический слой сушили безводным Ν;·ι28Ο4 и концентрировали в вакууме. Сырой продукт (выход 5 г) далее вводили непосредственно в реакцию на стадии С.
- 16 010015
Стадия С. Синтез Вос-ТАР.
(СЬг-ТАР-Вос)
Сырой СЬх-ТАР-Вос. полученный на стадии В, растворили в метаноле (25 мл) и гидрировали в присутствии 5% Ρά на угле (5% мас./мас.) в колбе под давлением в течение 16 ч. Смесь профильтровали, промыли метанолом и концентрировали фильтрат в вакууме, получая сырой продукт Η-ТАР-Вос (выход 3,7 г).
Общий выход операций А-С составил приблизительно 44% (рассчитано исходя из количества использованного СЬх-С1).
Пример 2. Присоединение разделительного фрагмента к пептиду по С-концевой группе.
На следующей схеме реакции показано присоединение разделительного фрагмента к пептиду по Сконцевой группе.
Пептид со свободной С-концевой группой.
Рер1йе ЗДаптйша:
о η
Η-ТАР-Вос был приготовлен в соответствии с примером 1. ЭЭС = Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид.
Пример 3. Присоединение разделительного фрагмента к пептиду со свободной кислотой в боковой цепи.
На следующей схеме реакции показано присоединение разделительного фрагмента к пептиду со свободной кислотой в боковой цепи.
Пептид со свободной кислотой в боковой цепи.
Ρβρΐίάβ иЙЬ ίτβθ 8Ие-сЬа1п асИ:
ТРА = трифторуксусная кислота (ТФУ).
Пример 4. Присоединение ПЭГ к пептиду при помощи мПЭГ -ΝΡΟ Пептид с ТАР на С-концевой группе.
где мПЭГ-№С имеет следующее строение:
- 17 010015 трео-ирс .
Пример 5. Присоединение ПЭГ к пептиду при помощи мПЭГ-8РЛ. Пептид с ТАР на С-концевой группе.
РерВбе ТАР оп СЧегггагиб:
ШРЕ&8РА οΜρ,οιεΑ
О к н О где мПЭГ-НРС имеет следующее строение:
Пример 6. Присоединение разделительного фрагмента и синтез пептида.
На следующей схеме реакции показано присоединение разделительного фрагмента к твердой подложке и синтез пептида на указанной твердой подложке
Пример 7. Синтез пептидного димера с разделительным фрагментом, присоединенным к смоле. Стадия А. Синтез участка Теп!аОе1-связующий фрагмент.
Вг
НО
Η
I
Η
К^СОэ, ОМЕ (ΤθηίθβθΙ ЬгогпИе)
Теп1аСе1 бромид (2,5 г, 0,48 ммоль/г, предоставленный Яарр Ро1утеге, Германия), фенольный связующий фрагмент (5 экв.) и К2СО3 (5 экв.) нагревали в 20 мл Ν,Ν-диметилформамиде (ДМФА (ΌΜΕ)) при 70°С в течение 14 ч. После охлаждения до комнатной температуры смолу промыли (0,1н. НС1, вода, ацетонитрил (ЛсС№), ДМФА, МеОН) и сушили, получая смолу янтарного цвета.
(Теп(аОеЫ1пкег)
- 18 010015
Н
Стадия В. Синтез участка Теп!аСе1-связующий фрагмент-ТАР(Вос).
(ТеШа6еЦ.1пкег) (Теп1а<ЗеШг1кег-ТАР(Вос))
2,5 г смолы, полученной в реакции на стадии А (выше) и Η-ТАР-Вос (1,5 г, 5 экв.) и ледяная АсОН (34 цл, 5 экв.) поместили в смесь 1:1 МеОН/тетрагидрофуран (ТГФ (ТНГ)) и встряхивали в течение ночи. К смеси добавили 1М раствор цианборгидрида натрия (5 экв.) в ТГФ и встряхивали еще 7 ч. Смолу отфильтровали, промыли (ДМФА, ТГФ, 0,1н. НС1, вода, МеОН) и сушили. Небольшое количество смолы бензоилировали бензилхлоридом и диизопропилэтиламином (ЭГЕА) в ДХМ, расщепляли 70%-ной трифторуксусной кислотой (ТФУ)-ДХМ и анализировали методами ЖХ/МС (ЬСМ8, Ыс.|шБ СЬгота!одгару Макк 8рес!готе!гу, Жидкостной Хроматографии/Масс-Спектрометрометрического анализа) и ЖХВД (НРЬС, жидкостной хроматографии высокого давления).
Стадия С. Синтез участка Теп!аСе1-связующий фрагмент-ТАР-Ьук.
(ТетСабеШпкег-ТАР-Сув) (ГепйОе)-ипкег-ТАР(Вос))
Смолу, полученную на стадии В (выше), обрабатывали активированным раствором ГтосЬук(Етос)-ОН (Гтос = 9-флуоренилметоксикарбонил, приготовленный из 5 экв. аминокислоты и 5 экв. НАТИ (Н^№,№-тетраметил-О-(7-азабензотриазол-1-ил)уронийгексафторфосфат), растворенного при концентрации 0,5М в ДМФА с последующим прибавлением 10 экв. Э1ЕА) и осторожно встряхивали в течение 14 ч. Смолу затем промыли (ДМФА, ТГФ, ДХМ, МеОН) и сушили с получением защищенной смолы. Оставшиеся аминогруппы были защищены обработкой смолы раствором 10% уксусного ангидрида, 10% пиридина в ДХМ в течение 20 мин с последующей промывкой как указано выше. Группы Гтос отщепляли, осторожно встряхивая смолу в 30% пиперидине в ДМФА в течение 20 мин с последующей промывкой (ДМФА, ТГФ, ДХМ, МеОН) и сушкой.
Стадия Ό. Синтез участка Теп!аСе1-связующий фрагмент-ТАР-Еук(пептид)2.
П*еп!йвеМ.1пкег*ТАР4,ув(Р*1ЯМ»>г) (Т4*Ш*0е1-ипкег-ТАР4.у*)
Смолу, полученную на стадии С (выше), подвергали повторным циклам обработки Гтосаминокислотой с активацией НВТИ/НОВ!, с последующим удалением Гтос пиперидином, синтезируя, таким образом, обе пептидные цепочки одновременно. Это удобно выполнять в автоматическом аппарате АВ1 433 для синтеза пептидов, поставляемом АррНеБ Вюкук!етк, 1пс. После окончательного удаления Гтос, концевые аминогруппы подвергали ацилированию уксусным ангидридом (10 экв.) и ЭГЕА (20 экв.) в ДМФА в течение 20 мин с последующей промывкой, как указано выше.
Стадия Е. Отщепление от смолы.
(ТепШМЧМкег.ТАрц.ув^ерМеЫ
ТЕА (Р’ерМйв Окпег *№ £расег)
- 19 010015
Смолу, полученную на стадии Ό (выше), суспензировали в растворе ТФУ (ТЕ А) (82,5%), фенола (5%), этандитиола (2,5%), воды (5%) и тиоанизола (5%) в течение 3 ч при комнатной температуре. Для отщепления также можно использовать другие отщепляющие смеси, например, ТФУ (95%), воду (2,5%) и триизопропилсилан (2,5%). Раствор ТФУ охладили до 5°С и вылили в Е!2О для осаждения пептида, отфильтровали, сушили под уменьшенным давлением, получили искомый пептидный димер, связанный с разделительным фрагментом. После очистки с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (НРЬС) на колонке С18 получили чистый пептидный димер, связанный с разделительным фрагментом.
Стадия Е. Окисление.
Димерный пептид (связанный с разделительным фрагментом), содержащий восстановленные цистеиновые остатки, окисляли до димерного пептида, содержащего дисульфидные мостики.
Димерный пептид растворяли в 20% ДМСО/вода (1 мг сухой массы пептида/мл) оставляли при комнатной температуре на 36 ч. Затем пептид очищали, загружая реакционную смесь в колонку С18 для препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (НРЬС) (^а!егк Эека-Раск С18, размер частиц 15 мкм, размер пор 300 А, 40 ммх200 мм длиной) с последующим линейным градиентом (дгаФап!) АсС№вода/0,01% ТФУ от 5 до 95% АсСN в течение 40 мин. Лиофилизация фракций, содержащих желаемый пептид, привела к получению пушистого белого твердого вещества.
Пример 8. Присоединение ПЭГ к пептидному димеру с разделительным фрагментом при помощи мПЭГ-№С.
Ас-РерМе—МН 5 Ас-РерСдв-ЫН ΗΝ\_ύ/^ тРЕО-МРС Ас-РерМв-ΝΗ ί О II ΜΝ ο-πιρεο
ОМЕ, ϋΙΕΑ г Ас-Рерайе—ΝΗ
Например,
Ас~О-ОЧ_-У-А-С-Н-И-О-Р-1-Т-К|гУ-С-а-р-С-К-Зс+<Н _______, ό
Αΰ-Ο-(ϊ4.-Υ-Α-έ-»-Μ-Ο-Ρ-4-Τ-Νρ·ν-0-Ο-Ρ-1.-Κ-$€·ΝΗΗΝ-\_ο^>
Димерный пептид, присоединенный к разделительному фрагменту, смешивали с равным количеством (в молярном отношении) активированного ПЭГ (мПЭГ-№С, изготавливаемый ΝΟΕ Согр., Япония,
- 20 010015 поставляемый №к!аг ТйегареиДс, США (ранее 8йеагтеа!ег Согр.)) в сухом ДМФА с образованием прозрачного раствора. Через 5 мин к указанному раствору прибавили 4 экв. ΌΓΕΑ. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч, затем очищали на колонке С18 при помощи обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления (НРЬС). Строение пептида с присоединенным ПЭГ подтверждено масс-спектрометрией ΜΑΣΏ!
мПЭГ-№С имел следующее строение:
тРЕв-ЫРС
Пример 9. Присоединение ПЭГ к пептидному димеру с разделительным фрагментом при помощи мПЭГ-8РА.
Присоединение ПЭГ к пептидному димеру с разделительным фрагментом также может быть произведено при помощи мПЭГ-8РА. мПЭГ-8РА имеет следующее строение:
ШРЕО-8РА
Пример 10. Ионообменная очистка.
Αο-Ο-Ο-ί-Υ-Α-ό-Η-Μ-Ο-Ρ-Ι-Τ-Νρν-^-Ο-Ρ-Ε-Ρ-δοΝΗ
8--3
Ас-О-<Э-Ь-У-А-С-Н-М-(3-Р-1-Т-МрУ-С-а-Р-Е-К-8сНЙ1Н^о/ ο ΗΝ^ΟΡΕβ ίДля идентификации ионообменных подложек, подходящих для очистки конъюгатов «пептид - разделительный фрагмент - ПЭГ» применяли образец, полученный в примере 8.
Общая пропись была следующей.
Ионообменную смолу (2-3 г) загружали в 1 см колонку, затем превращали в натриевую форму (0,2н. №1ОН загружали на колонку до тех пор, пока рН элюата не достигал 14), а затем превращали в водородную форму (промывали 0,1н. НС1 или 0,1М НОАс до тех пор, пока рН загрузки не становился равным рН элюата), а затем промывали 25% АсСЧ/водой до рН 6. Затем в 25% АсСЧ/воде (10 мг/мл) растворяли либо сам пептид до образования конъюгата, либо конъюгат пептид-ПЭГ, и рН доводили до значения менее 3 трифторуксусной кислотой, а затем загружали в колонку в отдельных экспериментах. Колонку промывали 2-3 объемами 25% АсСк/воды, равными объему колонки, собирая фракции по 5 мл, а затем пептид выделяли из колонки элюированием 0,1М NН4ОΑс в 25% АсС^воде, снова собирая фракции по 5 мл. Фракции, содержащие искомый пептид, обнаруживали при помощи жидкостной хроматографии высокого давления (НРЬС). Анализ при помощи испарительного детектора рассеяния света (Е8ЬО) показал, что, если пептид задерживался в колонке и подвергался элюированию раствором ИН4ОАс (обычно между фракциями 4 и 10), то, согласно наблюдениям, он не содержал загрязнений пептида, не связанного с ПЭГ. Если пептид подвергался элюированию в исходный промывной буфер (обычно первые 2 фракции), не наблюдали разделения искомого ПЭГ-конъюгата и избытка ПЭГ.
Ионообменные подложки выбирали на основании их способности отделять конъюгат пептид-ПЭГ от непрореагировавшего (или гидролизованного) ПЭГ, а также по их способности удерживать исходные димерные пептиды. В качестве подходящих ионообменных подложек были выбраны колонка, предварительно загруженная сильной катионообменной смолой Мопо 8 НК 5/5 (Атегкйат Вюкшепсек), подложка из микрогранулированной сильной катионообменной смолы 8Е53 Се11и1оке (\У11а1тап) и подложка из сильной катионообменной смолы 8Р 8ер11аго5е Рак! Иоте (Атегкйат Вюкаеисек).
Пример 11. Синтез трифункциональных молекул на основе α-аминокислот.
Разветвленные трифункциональные молекулы, имеющие структуру,
- 21 010015
т и η - целые числа, где х= ОН были синтезированы в соответствии со следующей схемой реакции:
т и η - целые числа.
Такие трифункциональные молекулы могут одновременно служить и связующим, и разделительным фрагментом.
Пример 12. Синтез трифункциональных молекул на основе третичных амидов.
Разветвленные трифункциональные молекулы, имеющие структуру, т и η - целые числа, где
были синтезированы в соответствии со следующей схемой реакции:
т и η - целые числа.
Такие трифункциональные молекулы могут одновременно служить и связующим фрагментом (фрагментами), и разделительным фрагментом.
Пример 13. Синтез гомотрифункциональных молекул.
Разветвленные гомотрифункциональные молекулы, имеющие структуру,
- 22 010015
где
были синтезированы в соответствии со следующей схемой реакции:
«•М,· 1-ΐ,η ηΐ* ме кпеде· т и η - целые числа.
Такие гомотрифункциональные молекулы могут одновременно служить и связующим фрагментом (фрагментами), и разделительным фрагментом.
Пример 14. Димеризация по С-концевой группе и присоединение ПЭГ с использованием трифункциональной молекулы.
Трифункциональная молекула, имеющая структуру
была приготовлена в соответствии с примером 12.
Указанную трифункциональную молекулу использовали для димеризации по С-концевой группе и присоединения ПЭГ в соответствии со следующей схемой реакции:
воМрКаае рерйдв БупйхкЬз Дс—)_е-о-р-Т—Ъ- й-О-И-к—А-А-К-А—К-ЫН2 мн2
- 23 010015
Пример 15. Димеризация по Ν-концевой группе и присоединение ПЭГ с использованием трифункциональной молекулы.
Трифункциональная молекула была приготовлена в соответствии со следующей схемой:
К раствору Вос-вА1а-ОН (10,0 г, 52,8 ммоль) (Вос= трет-бутоксикарбонил) и диэтилиминодиацетата (10,0 г, 52,8 ммоль) в 200 мл ДХМ при 0°С прибавили ЭСС (10,5 г, 50,9 ммоль) в течение 5 мин. Через 2 мин образовался белый осадок. Реакционную смесь оставили нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 24 ч. Мочевину отфильтровали через фильтр Шотта (средняя пористость), и растворитель отогнали под уменьшенным давлением. Остаток растворили в 500 мл ЕЮАс (ЕЮАс = этилацетат), отфильтровали, как описано выше, и переносили в делительную воронку. Органическую фазу промыли (насыщенный раствор NаНСΟ3, рассол, 1н. НС1), сушили (Мд§О4), фильтровали и сушили, получая бесцветное масло. В течение 10 мин масло застыло с образованием белых кристаллов.
О СО2Е1 о со2н
ЫНВос^^-Ы^ --► ^СОгЕ1 ХО2Н
Сырой диэфир растворили в 75 мл ТГФ (ТГФ = тетрагидрофуран) и добавили 75 мл МеОН (МеОН метанол) и 50 мл воды. К полученному раствору прибавили раствор КОН (КОН - гидроксид калия) (8,6 г, 153 ммоль) в 25 мл воды. Цвет реакционной смеси стал светло-желтым. После перемешивания в течение 12 ч (рН все время был ~12), органический растворитель испарили на роторном испарителе, и полученную суспензию разделяли в смеси ЕьО (ЕьО = диэтиловый эфир) и насыщенным раствором NаНСО3. Объединенные водные растворы подкислили до рН 1, насытили №1С1 и экстрагировали ЕЮАс. Фазу
- 24 010015
Е!ОАс промыли (рассол), сушили (Мд8О4) и концентрировали, получая 13,97 г продукта в виде белого твердого вещества (выход 90,2% после 2 стадий).
Примечания.
Выход падает до 73%, если реакцию с ОСС проводить в ΆοΟΝ. При использовании Э1С мочевина, являющаяся побочным продуктом, не может быть отделена от целевого продукта - единственный способ очистки - это хроматография; ОСС мочевина может быть количественно извлечена без использования хроматографии. Реакция также хорошо проходит с водорастворимым карбодиимидом.
К раствору дикислоты (1,00 г, 3,29 ммоль) и гидроксисукцинимида (0,945 г, 8,21 ммоль) в 50 мл АсСК прибавили ОСС (1,36 г, 6,59 ммоль) в течение 5 мин. Немедленно выпал белый осадок. Реакционную смесь перемешивали 22 ч и отфильтровали для удаления ОСС мочевины. Растворитель отогнали под уменьшенным давлением, остаток растворяли в Е!ОАс (250 мл) и переносили в делительную воронку. Органическую фазу промыли (насыщенный раствор №НСО31. рассол, 1н. НС1, рассол), сушили (Мд8О4), и концентрировали, получая белое твердое вещество. Вещество растворили в 75 мл АсСН отфильтровали и концентрировали, получая 1,28 г продукта в виде белого твердого вещества (выход 78,2%).
Примечания.
Выходы падают до 31% в ТГФ, до 68% в ДМФА (при использовании Э1С вместо ОСС) и до 57% в ДХМ/ДМФА. Исходная дикислота растворима в АсСК, таким образом, если при растворении перед добавлением ЭСС остается какой-либо осадок, его можно отфильтровать и отбросить.
Эта трифункциональная молекула была использована для димеризации по Ν-концевой группе и присоединения ПЭГ в соответствии со следующей схемой реакции:
вОШрЙавв
Пример 16. Синтез мПЭГ2-лизинол-ИРС.
Коммерчески доступный лизинол обрабатывали избытком мПЭГ2, получая мПЭГ2-лизинол. После этого мПЭГ2-лизинол обрабатывали избытком NРС, получая мПЭГ2-лизинол-ИРС.
- 25 010015
Пример 17. Присоединение ПЭГ с использованием трифункциональной молекулы (фрагмент ПЭГ включает две линейные цепочки ПЭГ).
В соответствии с примером 15 была приготовлена трифункциональная молекула, имеющая структуру
Стадия 1. Присоединение трифункционального связующего фрагмента к пептидным мономерам.
Для присоединения к связующему фрагменту, 2 экв. пептида смешивали с 1 экв. трифункционального связующего фрагмента в сухом ДМФА с образованием прозрачного раствора, и через 2 мин добавляли 5 экв. ΌΙΕΆ. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч. Растворитель удаляли под уменьшенным давлением, и сырой продукт растворяли в 80% ТФУ в ДХМ в течение 30 мин для удаления группы Вос, а затем очищали на колонке С18 при помощи обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления. Строение димера было подтверждено электрораспылительной массспектрометрией. Реакция присоединения происходит с присоединением связующего фрагмента к атому азота ε-аминогруппы лизинового остатка каждого мономера.
Стадия 4. Присоединение ПЭГ к пептидному димеру.
Присоединение ПЭГ через карбаматную связь.
Пептидный димер и молекулы, содержащие ПЭГ (мПЭГ2-лизинол-№С) смешивали в молярном соотношении 1:2 в сухом ДМФА, получая прозрачный раствор. Спустя 5 мин к указанному раствору до
- 26 010015 бавляют 4 экв. Б1ЕА. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч, а затем очищали на колонке С18 при помощи обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления. Строение пептида с присоединенным ПЭГ подтверждено масс-спектрометрией ΜΑΣΌΙ. Очищенный пептид,
Пептидный димер и молекулы, содержащие ПЭГ [мПЭГ2-^у8-NН§] смешивали в молярном соотношении 1:2 в сухом ДМФА, получая прозрачный раствор. Спустя 5 мин к указанному раствору добавляли 10 экв. Б1ЕА. мПЭГ2-^у8-NН§ доступен коммерчески, например, он обозначен в Мо1еси1аг Епщпееппд са!а1од (2003) №к!аг Тйегареийс (490 ОЬсоуегу Отке, НипЩуШе, А1аЬата 35806) № 2Ζ3Χ0Τ01. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем очищали на колонке С18 при помощи обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления. Строение пептида с присоединенным ПЭГ подтверждено масс-спектрометрией ΜΑΣΌΙ. Очищенный пептид, кроме того, подвергали очистке посредством ионообменной хроматографии, как указано ниже.
- 27 010015
Настоящее изобретение не ограничено указанными в описании примерами реализации. Действительно, ознакомившись с вышеуказанным описанием и сопроводительными рисунками, специалисты в данной области техники могут понять, что, кроме указанных примеров, существуют многочисленные модификации настоящего изобретения. Такие модификации также защищены прилагаемой формулой изобретения.
В описании настоящего изобретения упомянуты и обсуждены многочисленные публикации, включая патенты, патентные заявки, протоколы и различные публикации. Упоминание и/или обсуждение таких публикаций предназначено для разъяснения описания настоящего изобретения, но при этом ни одна из ссылок не является «прототипом» настоящего изобретения. Все публикации, упомянутые или обсужденные в настоящей спецификации, включены в описание в том объеме, который соответствует полному объему цитируемого источника.

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение, включающее пептидный фрагмент, разделительный фрагмент (спейсер) и фрагмент полиэтиленгликоля, в котором разделительный фрагмент находится между пептидным фрагментом и фрагментом полиэтиленгликоля и имеет следующее строение:
    где каждый из коэффициентов α, β, γ, δ и ε представляет собой целое число, значения которых выбирают независимо друг от друга, причем γ или δ не равен 0, а фрагмент полиэтиленгликоля ковалентно присоединен посредством карбаматной или амидной связи и имеет молекулярную массу более 20 кДа.
  2. 2. Соединение по п.1, в котором α - это целое число, 1<α<6; β - это целое число, 1<β<6; ε - это целое число, 1<ε<6; δ равно 0 или 1; γ - это целое число, 1<γ< 10 и Υ представляет собой либо ΝΗ, либо СО.
  3. 3. Соединение по п.2, в котором γ>1 и β=2.
  4. 4. Соединение по п.1, в котором α=β=ε=2; γ=δ=1 и Υ представляет собой ΝΗ.
  5. 5. Соединение по п.1, в котором фрагмент полиэтиленгликоля имеет линейное строение.
  6. 6. Соединение по п.1, в котором фрагмент полиэтиленгликоля имеет значение полидисперсности (М„/Мп) менее 1,20.
    - 28 010015
  7. 7. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент представляет собой пептидный мономер, включающий один пептид.
  8. 8. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент представляет собой пептидный димер, включающий два пептида, соединенные связующим фрагментом.
  9. 9. Соединение по п.7 или 8, в котором каждый пептид включает не более 50 аминокислотных мономеров, предпочтительно каждый пептид включает приблизительно от 10 до 25 аминокислотных мономеров.
  10. 10. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент включает один или более пептидов, связывающих рецепторы эритропоетина.
  11. 11. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент включает один или более пептидов, связывающих рецепторы тромбопоетина.
  12. 12. Соединение по п.1, в котором α=2; γ=δ=β=ε=0 и Υ представляет собой СО.
  13. 13. Соединение по п.1, в котором фрагмент полиэтиленгликоля включает по меньшей мере одну мономерную цепочку полиэтиленгликоля.
  14. 14. Соединение по п.13, в котором молекулярная масса каждой цепочки полиэтиленгликоля составляет от 20 до 40 кДа.
  15. 15. Фармацевтическая композиция, которая содержит соединение по любому из пп.1-14 и один или более фармацевтически приемлемых разбавителей, консервантов, солюбилизаторов, эмульсификаторов, вспомогательных средств и/или носителей.
  16. 16. Соединение, включающее пептидный фрагмент, разделительный фрагмент (спейсер) и фрагмент водорастворимого полимера, в котором разделительный фрагмент находится между пептидным фрагментом и фрагментом водорастворимого полимера и имеет следующее строение:
    -ΝΗ-(ΟΗ2)!Χ-[Ο-(ΟΗ2)!1]γ-Ο0-(ΘΗ2)ε-Υгде α=β=ε=2; γ=δ=1 и Υ представляет собой ΝΗ.
  17. 17. Фармацевтическая композиция, которая содержит:
    а) соединение, включающее пептидный фрагмент, разделительный фрагмент (спейсер) и фрагмент водорастворимого полимера, в котором разделительный фрагмент находится между пептидным фрагментом и фрагментом водорастворимого полимера и имеет следующее строение:
    где α=β=ε=2; γ=δ=1 и Υ представляет собой ΝΗ и
    б) один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, консервант, солюбилизатор, эмульсификатор, адьювант и/или носитель.
EA200501800A 2003-05-12 2004-05-12 Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов EA010015B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46999603P 2003-05-12 2003-05-12
PCT/US2004/014887 WO2004100997A2 (en) 2003-05-12 2004-05-12 Spacer moiety for poly(ethylene glycol) -modified peptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501800A1 EA200501800A1 (ru) 2006-08-25
EA010015B1 true EA010015B1 (ru) 2008-06-30

Family

ID=33452348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501800A EA010015B1 (ru) 2003-05-12 2004-05-12 Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов

Country Status (16)

Country Link
US (2) US7919118B2 (ru)
EP (2) EP2204193A3 (ru)
JP (2) JP2007500218A (ru)
KR (1) KR101160611B1 (ru)
CN (1) CN1849141A (ru)
AU (1) AU2004238364A1 (ru)
BR (1) BRPI0411166A (ru)
CA (1) CA2525399A1 (ru)
EA (1) EA010015B1 (ru)
IL (1) IL171885A0 (ru)
IS (1) IS8168A (ru)
MX (1) MXPA05012314A (ru)
NO (1) NO20055848L (ru)
NZ (2) NZ543934A (ru)
WO (1) WO2004100997A2 (ru)
ZA (1) ZA200509970B (ru)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7259146B2 (en) 2000-05-26 2007-08-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
US8663650B2 (en) * 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
MXPA05012315A (es) * 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Compuestos poli(etilenglicol) modificados novedosos y usos de los mismos.
EP2204193A3 (en) 2003-05-12 2010-08-18 Affymax, Inc. Novel spacer moiety for poly(ethylene glycol)-modified peptide-based compounds
DE602004020610D1 (de) 2003-05-12 2009-05-28 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
US20080026995A1 (en) * 2003-07-25 2008-01-31 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against p-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
FR2857875A1 (fr) * 2003-07-25 2005-01-28 Univ Reims Champagne Ardenne Vaccin therapeutique cible contre la p-glycoproteine 170 pour inhiber la resistance multidrogues dans le traitement des cancers
US20070275007A1 (en) * 2003-11-05 2007-11-29 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of Health And Human S Carbohydrate Antigen-Nanoparticle Conjugates and Uses Thereof as Antimetastatic Agents in Treating Cancer
US7589063B2 (en) 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
EP2275142A3 (en) 2006-06-30 2011-05-11 Andre Koltermann Conjugates for immunotherapy of cancer
JP2010503687A (ja) * 2006-09-15 2010-02-04 ザ バーナム インスティチュート 高親和性ＥｐｈＢ受容体結合化合物とその使用法
WO2008095004A2 (en) * 2007-01-31 2008-08-07 Affymax, Inc. Nitrogen-based linkers for attaching modifying groups to polypeptides and other macromolecules
WO2009027844A2 (en) * 2007-05-25 2009-03-05 Celtic Pharma Management L.P. Crf conjugates with extended half-lives
WO2009002947A2 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Affymax, Inc. Compounds and peptides that bind the trail receptor
CN101143894A (zh) * 2007-06-22 2008-03-19 中国药科大学 高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰方法和应用
EP2018835B1 (de) 2007-07-09 2014-03-05 Augustinus Bader Wirkstoff abgebendes Pflaster
WO2009058291A2 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 University Of Alabama In Huntsville Controlled molecular weight amino acid polymers having functionalizable backbones and end groups and processes for preparing the same
AU2008340058A1 (en) * 2007-12-20 2009-07-02 Merck Serono S.A. PEG-interferon-beta formulations
JP2011519375A (ja) * 2008-04-30 2011-07-07 ニュートロン ロウ 癌治療のためのコルチコトロピン放出因子の使用法
WO2011011073A1 (en) * 2009-07-22 2011-01-27 Ipsen Pharma S.A.S. Site-specific pegylated or site-specific lipidated igf-1 and analogues of igf-1
US8759299B2 (en) 2009-07-22 2014-06-24 Ipsen Pharma S.A.S. Analogues of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) having amino acid substitution at position 59
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
EP2590666B1 (en) 2010-07-06 2017-04-26 Augustinus Bader Topical application of erythropoietin for use in the treatment of injuries of the cornea
US9289488B2 (en) 2010-08-12 2016-03-22 Ac Immune Sa Vaccine engineering
AU2011322553B2 (en) 2010-10-26 2015-07-02 Ac Immune S.A. Liposome-based construct comprising a peptide modified through hydrophobic moieties
US9463255B1 (en) * 2011-09-29 2016-10-11 Stc.Unm Radiolabeled alpha-melanocyte stimulating hormone hybrid peptide for melanoma targeting
AU2014318579A1 (en) 2013-09-13 2016-04-14 The California Institute For Biomedical Research Modified therapeutic agents and compositions thereof
EP3082797A4 (en) 2013-12-18 2017-12-13 The California Institute for Biomedical Research Modified therapeutic agents, stapled peptide lipid conjugates, and compositions thereof
WO2016205488A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 The California Institute For Biomedical Research Modified therapeutic agents and compositions thereof
GB201609083D0 (en) 2016-05-24 2016-07-06 Syntab Therapeutics Gmbh Synthetic compound
KR102142978B1 (ko) * 2017-12-18 2020-08-11 경희대학교 산학협력단 신규 페길화 서브스턴스 ｐ
EP3572434B1 (en) 2018-05-25 2022-08-17 UPM-Kymmene Corporation Nanofibrillar cellulose hydrogel

Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
WO1996040750A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor
WO1996040189A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
WO1996040772A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Ortho Pharmaceutical Corporation Agonist peptide dimers
WO1998025965A2 (en) * 1996-12-11 1998-06-18 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
WO2000024782A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
WO2000024770A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Amgen Inc. Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
WO2000033881A1 (en) * 1998-12-08 2000-06-15 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Biologically active conjugates having a detectable reporter moiety and method of identification of said derivative
US6113906A (en) * 1993-10-27 2000-09-05 Enzon, Inc. Water-soluble non-antigenic polymer linkable to biologically active material
US20020015691A1 (en) * 2000-03-31 2002-02-07 Greenwald Richard B. Terminally-branched polymeric linkers containing extension moieties and polymeric conjugates containing the same
WO2002065988A2 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
WO2004014424A1 (en) * 2002-08-13 2004-02-19 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
WO2004101606A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
WO2004101600A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof
WO2004101611A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
WO2004108070A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4677195A (en) 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
EP0318512B1 (en) 1986-08-18 1998-06-17 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
WO1990008822A1 (en) 1989-02-03 1990-08-09 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin receptor
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
ES2085297T3 (es) 1989-05-27 1996-06-01 Sumitomo Pharma Procedimiento para preparar derivados de poli(etilenglicol) y proteina modificada.
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5292654A (en) 1990-12-13 1994-03-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Mutant EPO receptor and uses therefor
CA2288429C (en) 1991-03-15 2006-04-25 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
WO1992016192A1 (en) 1991-03-15 1992-10-01 Amgen Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US6153407A (en) 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US5830851A (en) 1993-11-19 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5773569A (en) 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
JP2763020B2 (ja) 1995-04-27 1998-06-11 日本電気株式会社 半導体パッケージ及び半導体装置
US5654276A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5677280A (en) 1995-06-07 1997-10-14 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5668110A (en) 1995-06-07 1997-09-16 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5683983A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5891418A (en) * 1995-06-07 1999-04-06 Rhomed Incorporated Peptide-metal ion pharmaceutical constructs and applications
HUP9901069A2 (hu) 1995-06-07 1999-07-28 Affymax Technologies, N.V. Az eritropoietin receptorhoz kötődő vegyületek és peptidek
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6346390B1 (en) 1996-03-08 2002-02-12 Receptron, Inc. Receptor derived peptides involved in modulation of response to ligand binding
US6103879A (en) 1996-06-21 2000-08-15 Axys Pharmaceuticals, Inc. Bivalent molecules that form an activating complex with an erythropoietin receptor
PT964702E (pt) 1996-08-02 2006-12-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Polipéptidos tendo um único polímero solúvel em água ligado ao n-terminal por covalência
US5932546A (en) 1996-10-04 1999-08-03 Glaxo Wellcome Inc. Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
US6221608B1 (en) 1997-01-22 2001-04-24 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods for identifying erythropoietin receptor binding protein
US6211608B1 (en) 1998-06-11 2001-04-03 Micron Technology, Inc. Field emission device with buffer layer and method of making
ES2404074T3 (es) 1998-08-06 2013-05-23 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
BRPI9912974B8 (pt) 1998-08-06 2021-05-25 Univ Duke conjugados de peg-urato oxidase e seu uso
CA2351739A1 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Gryphon Sciences Polyamide chains of precise length, methods to manufacture them and their conjugates with proteins
ATE315390T1 (de) 1998-11-17 2006-02-15 Smithkline Beecham Corp Zyklische polyamine zur behandlung der thrombozytopenie
CN1338924A (zh) * 1999-01-08 2002-03-06 艾米斯菲尔技术有限公司 聚合物输送剂和输送剂化合物
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
AUPQ873300A0 (en) 2000-07-12 2000-08-03 Medvet Science Pty. Ltd. A binding motif of a receptor (2)
DE60032783T2 (de) 1999-09-24 2007-12-06 Smithkline Beecham Corp. Thrombopoietinmimetika
ES2254224T3 (es) 1999-09-27 2006-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nueva proteina del receptor de hematopoyetina, nr12.
US6703480B1 (en) 1999-11-24 2004-03-09 Palani Balu Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use
US6858630B2 (en) 1999-12-06 2005-02-22 Smithkline Beecham Corporation Naphthimidazole derivatives and their use as thrombopoietin mimetics
JP2004512258A (ja) 2000-03-21 2004-04-22 ウィスコンシン　アルムニ　リサーチ　ファンデイション 生物系における細胞応答の調節のための方法および試薬
EP1149906A1 (en) * 2000-04-25 2001-10-31 Pliva, Farmaceutska, Industrija, Dionicko Drustvo Thrombopoietin receptor modulating peptide
DE60109625T3 (de) 2000-05-15 2017-08-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Flüssige arzneizubereitung enthaltend ein erythropoietin derivat
BR0111182A (pt) * 2000-05-26 2004-02-25 Ortho Mcneil Pharm Inc Peptìdeos neuroprotetores
PL365664A1 (en) 2000-08-02 2005-01-10 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Improved anti-viral and anti-tumor chemotherapy by administration of erythropoeitin
SK2772003A3 (en) 2000-09-08 2003-10-07 Gryphon Therapeutics Inc Synthetic erythropoiesis stimulating proteins
CA2431964C (en) 2000-12-20 2013-09-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US6531121B2 (en) 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
US20020169128A1 (en) 2001-04-09 2002-11-14 Geroge Sigounas Erythropoietin ameliorates chemotherapy-induced toxicity in vivo
DE60229958D1 (de) 2001-06-28 2009-01-02 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabilisierte proteinasen
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
US20050176627A1 (en) 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US9125880B2 (en) 2002-12-26 2015-09-08 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
GEP20084487B (en) 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof
EP2204193A3 (en) 2003-05-12 2010-08-18 Affymax, Inc. Novel spacer moiety for poly(ethylene glycol)-modified peptide-based compounds

Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US6113906A (en) * 1993-10-27 2000-09-05 Enzon, Inc. Water-soluble non-antigenic polymer linkable to biologically active material
WO1996040750A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor
WO1996040189A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
WO1996040772A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Ortho Pharmaceutical Corporation Agonist peptide dimers
WO1998025965A2 (en) * 1996-12-11 1998-06-18 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
WO2000024782A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
WO2000024770A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Amgen Inc. Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
WO2000033881A1 (en) * 1998-12-08 2000-06-15 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Biologically active conjugates having a detectable reporter moiety and method of identification of said derivative
US20020015691A1 (en) * 2000-03-31 2002-02-07 Greenwald Richard B. Terminally-branched polymeric linkers containing extension moieties and polymeric conjugates containing the same
WO2002065988A2 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
WO2004014424A1 (en) * 2002-08-13 2004-02-19 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
WO2004101606A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
WO2004101600A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof
WO2004101611A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
WO2004108070A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GREENWALD R. B. ET AL.: "Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates" ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, AMSTERDAM, NL, vol. 55, no. 2, 10 February 2003 (2003-02-10), pages 217-250, XP002275066, ISSN: 0169-409X, the whole document *
GREENWALD RICHARD B. ET AL.: "Controlled release of proteins from their poly(ethylene glycol) conjugates: Drug delivery systems employing 1,6-elimination." BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. 14, no. 2, 3 April 2003 (2003-04-03), pages 395-403, XP002318263, ISSN: 1043-1802, the whole document *
WRIGHTON N. C. ET AL.: "INCREASED POTENCY OF AN ERYTHROPOIETIN PEPTIDE MIMETIC THROUGH COVALENT DIMERIZATION" NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, vol. 15, 1 November 1997 (1997-11-01), pages 1261-1265, XP000749524, ISSN: 1087-0156, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
IL171885A0 (en) 2006-04-10
BRPI0411166A (pt) 2006-07-18
JP2012140466A (ja) 2012-07-26
MXPA05012314A (es) 2006-04-18
WO2004100997A3 (en) 2005-05-19
CA2525399A1 (en) 2004-11-25
EA200501800A1 (ru) 2006-08-25
NO20055848L (no) 2006-02-13
US20120115796A1 (en) 2012-05-10
US20070032408A1 (en) 2007-02-08
EP2204193A3 (en) 2010-08-18
EP2204193A2 (en) 2010-07-07
NZ543934A (en) 2008-06-30
CN1849141A (zh) 2006-10-18
EP1628686A2 (en) 2006-03-01
IS8168A (is) 2005-12-02
NZ563042A (en) 2008-09-26
US7919118B2 (en) 2011-04-05
KR101160611B1 (ko) 2012-06-28
WO2004100997A2 (en) 2004-11-25
AU2004238364A1 (en) 2004-11-25
ZA200509970B (en) 2006-11-29
KR20060023123A (ko) 2006-03-13
US8592365B2 (en) 2013-11-26
JP2007500218A (ja) 2007-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010015B1 (ru) Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов
AU2004238869B2 (en) Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof
US8106154B2 (en) Nitrogen-based linkers for attaching modifying groups to polypeptides and other macromolecules
JP6297969B2 (ja) 部位特異的モノｐｅｇ化エキセンジン類似体およびその調製方法
EA020005B1 (ru) Аналоги глюкозазависимого инсулинотропного полипептида
JP2003516366A (ja) 両親媒性ポリマーとこれを含有するポリペプチドコンジュゲート
JP4896728B2 (ja) ブラジキニンｂ１受容体の拮抗薬
JP7249591B2 (ja) 分解性ポリエチレングリコール結合体
KR20200138084A (ko) 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 및 이를 포함하는 경구 투여용 조성물
KR100359713B1 (ko) 펩신방출을억제하기위한펩티드
IL303229A (en) A biologically active substance conjugate is linked to a biotin unit, a fatty acid unit or a combination thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU