JP4896728B2 - ブラジキニンｂ１受容体の拮抗薬 - Google Patents

Description

米国だけでも二百万人を越える人々が、慢性疼痛により日常的に無力化している（Ｔ．Ｍ．Ｊｅｓｓｅｌｌ ＆ Ｄ．Ｄ．Ｋｅｌｌｙ， Ｐａｉｎ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ ｉｎ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＮＥＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅ．Ｒ．Ｋａｎｄｅｌ，Ｊ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｔ．Ｍ．Ｊｅｓｓｅｌｌ，ｅｄ．，（１９９１））。残念なことに、疼痛に対する現行の治療は、一部にしか有効でなく、ライフスタイルの変化、衰弱、および／または危険な副作用の原因となることも多い。例えば、アスピリン、イブプロフェンおよびインドメタシンなどの非ステロイド性抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）は、炎症性疼痛に対して適度に有効ではあるが、腎毒性でもあり、高い用量は、胃腸の炎症、潰瘍形成、出血、心血管リスク増大、および錯乱を引き起こす傾向がある。オピオイドで治療した患者は、多くの場合、錯乱および便秘を経験し、長期のオピオイド使用は、耐薬性および依存症を随伴する。リドカインおよびミクセリチン（ｍｉｘｅｌｉｔｉｎｅ）などの局所麻酔薬は、疼痛を抑制すると同時に正常な感覚を喪失させる。加えて、局所麻酔薬は、全身使用すると、有害な心血管作用を随伴する。このように、目下、慢性疼痛の治療には、まだ対処されていない要求がある。

疼痛は、環境から受け取り、神経系によって伝達および翻訳されるシグナルに基づく知覚である（総説については、Ｍｉｌｌａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｉｎ：ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ５７：１−１６４（１９９９）参照）。熱および接触などの侵害刺激により、皮膚の特殊感覚受容器が、シグナルを中枢神経系（「ＣＮＳ」）に送る。このプロセスは、侵害受容と呼ばれ、これを媒介する抹消感覚ニューロンが、侵害受容器である。侵害受容器（複数を含む）からのシグナルの強さならびにＣＮＳによるこのシグナルの抽出および加工に依存して、人は、侵害刺激を痛いと体験することもあり、しないこともある。疼痛の知覚が、刺激の強度に対して正確に対応している場合、疼痛は、この所期の保護機能に役立つ。しかし、あるタイプの組織損傷は、この人の疼痛閾値が低下したために比較的無害な刺激を強烈に痛いと知覚する、痛覚過敏または前侵害受容（ｐｒｏｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ）として知られている現象を引き起こす。炎症と神経損傷の両方が、痛覚過敏を誘発し得る。従って、日焼け、変形性関節症、大腸炎、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、炎症性腸疾患、膠原血管病（関節リウマチおよび狼瘡を含む）などのような炎症性状態に罹患している人は、多くの場合、痛覚増強を経験する。同様に、外傷、手術、切断術、膿瘍、灼熱痛、膠原血管病、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒、卒中、視床痛症候群、糖尿病、ヘルペス感染症、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素および化学療法は、過度の痛みを生じさせる神経損傷の原因となる。

侵害受容器が正常および痛覚過敏状態下で外部シグナルを変換するメカニズムが、よりよくわかるようになると、痛覚過敏に関与するプロセスの的をしぼって、疼痛閾値の低下を抑制し、これにより、経験する疼みの量を低減することができる。

ブラジキニン（ＢＫ）および関連ペプチド、カリジン（Ｌｙｓ−ＢＫ）（表３参照）は、心血管系および腎臓系でのキニンの生理作用を媒介する。しかし、これらの活性ペプチド、ＢＫおよびカリジンは、血漿および他の生体液中のペプチダーゼにより、ならびに様々な細胞から放出されるものにより急速に分解され、このため血漿中でのＢＫの半減期は、約１７秒であると報告されている（１）。ＢＫおよびカリジンは、カルボキシ末端アルギニン残基を除去してＡｒｇ欠失（Ｄｅｓ−Ａｒｇ）ＢＫまたはＡｒｇ欠失カリジンを生じさせるカルボキシペプチダーゼＮにより、体内で急速に代謝される。Ａｒｇ欠失カリジンは、人間の主キニンのうちの一つであり、人間においてキニンの異常生理作用を媒介する。非常に強い炎症誘発性ペプチドであることに加え、Ａｒｇ欠失ＢＫまたはＡｒｇ欠失カリジンは、血管拡張、血管透過性および気管支収縮を誘発することが知られている（総説については、Ｒｅｇｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｒａｂｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｋｉｎｉｎｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，３２（１）：１−４６（１９８０）参照）。加えて、Ａｒｇ欠失ＢＫおよびＡｒｇ欠失カリジンは、炎症および炎症性疼痛の特に重要な媒介因子であり、これらの維持に関与していると思われる。Ａｒｇ欠失カリジンの過剰生産が、敗血症性ショック、関節炎、アンギナおよび偏頭痛などの疼痛が顕著な特徴である状態に関係しているという証拠も相当な数ある。

キニンの多面発現性作用を媒介する膜受容体には、Ｂ１およびＢ２と呼ばれる二つの異なる種類のものがある。両方の種類の受容体が、人間を含む様々な種からクローニングされ、配列されている（Ｍｅｎｋｅら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｂ１ ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１５８３−２１５８６（１９９４）； Ｈｅｓｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（ＢＫ−２） ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８４，２６０−２６８（１９９２））。これらは、７つの推定膜貫通領域を有する代表的なＧ蛋白結合受容体である。様々な組織にいおいて、ＢＫ受容体は、あらゆる既知第二メッセンジャーに結合している。ＢＫに対してより高い親和性を有するＢ２受容体は、ブラジキニン受容体の最も一般的な形態であると思われる。ブラジキニンに対する本質的にすべての正常な生理反応および多数の異常生理反応が、Ｂ２受容体によって媒介される。

この一方で、Ｂ１は、ＢＫと比較して、より高い親和性をＡｒｇ欠失ＢＫに対して有する（表３参照）が、Ａｒｇ欠失ＢＫは、Ｂ２受容体では不活性である。加えて、Ｂ１受容体は、殆どの組織で正常には発現されない。これらの発現は、外傷または組織損傷時に、ならびに一定の種類の慢性炎症または全身性傷害の際に誘発される（Ｍａｒｃｅａｕ，Ｆ．ら，Ｋｉｎｉｎ Ｂ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｉｍｍｕｎｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３０：１−２６（１９９５））。さらに、Ｂ１受容体により媒介される反応は、ウサギ、ラットおよびブタにおいて細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）または炎症性サイトカインの投与後にゼロレベルからアップレギュレートされる（Ｍａｒｃｅａｕら，（１９９８））。

このＢ１受容体誘発性発現に連結したキニンの疼痛誘発特性が、Ｂ１受容体を、特異的に損傷組織に向けることができ、正常な組織では最少の作用しか有さない抗炎症薬、抗侵害受容薬、抗痛覚過敏薬および鎮痛薬の開発における興味深いターゲットにしている。Ｂ１受容体をターゲットにする様々なペプチド拮抗薬が同定されているが、鎮痛治療薬としてのこれらの開発は、組織および血清ペプチダーゼによる非常に急速な分解および効率的な腎クリアランスに起因する低効能な半減期により挫折している。より最近、非天然アミノ酸置換基を有するペプチド類似体が、インビトロ安定性アッセイにおいて耐ペプチダーゼ性であると証明された（総説については、Ｒｅｇｏｌｉら，Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３４８：１−１０（１９９８）； Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ｐｒｅｓｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４３：１５５−１６１（１９９９）；およびＳｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ− Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８２：３７−４１（２００１）参照）。

ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）と蛋白質の共有結合型接合は、治療用蛋白質のインビボでの循環半減期を有意に延ばすアプローチとして広く認知されている。ＰＥＧ化は、主に腎クリアランスを遅らせることによりこの作用を達成する。ＰＥＧ部分が、この蛋白質に相当な流体力学的半径を付加するからである（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら，Ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｓ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．，ｉｎ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄｉｔｏｒ．（１９９２），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐ．３４７−３７０．）。蛋白質のＰＥＧ化により、多くの場合、付与されるさらなる利点には、溶解度上昇、蛋白分解性分解に対する耐性、および治療用ポリペプチドの免疫抗原性低下が挙げられる。蛋白質ＰＥＧ化のメリットは、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａｇｅｎ（商標）／Ｅｎｚｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（商標）／Ｅｎｚｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（商標）／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ／Ｅｎｚｏｎ）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（商標）／Ｒｏｃｈｅ）およびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（商標）／Ａｍｇｅｎ）を含む幾つかのＰＥＧ化蛋白質の製品化、ならびに臨床試験中の他の多数のものから明らかである。この一方で、小さな治療用ペプチドのＰＥＧ化は、ユニークな課題であり、あまり広く応用されていない。ペプチドＰＥＧ化に対する大きな障害の一つは、生物活性が最終的な接合体に保存されるという必須要件である。治療用ペプチドは、多くの場合、活性に必要な最小限の配列を含むものであり、従って、非常に小さいため、置換に対して比較的耐性がない。ＰＥＧ部分は、ペプチドこれ自体より不相応に大きく、この結果、活性に必要な特異的ペプチド：受容体結合相互作用を立体的に妨げる可能性がより高い。これ故、ＰＥＧ化に耐え、さらに、有用な治療薬であるに足る比活性を保持するペプチドの能力は、全く予想できず、経験的に求めなければならない（Ｍｏｒｐｕｒｏｇｏら，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ α ａｎｄ ε Ａｍｉｎｏ Ｇｒｏｕｐｓ ｗｉｔｈ ＰＥＧ ｉｎ ａ Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ Ａｎａｌｏｇｕｅ：Ｔａｉｌｏｒｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：１２３８−１２４３（２００２））。

明らかに、炎症および疼痛のための新しい安全で有効な治療が必要である。循環寿命を増す（クリアランスを遅らせる）こと、溶解度を上昇させること、安定性を強化すること、および／または分子の免疫抗原性を低下させることにより治療中の全身暴露によりよく耐えることができるＢ１特異的ペプチド拮抗薬があると、有利であろう。循環寿命増加は、低頻度の投薬方式をもたらし、低頻度の投薬スケジュールは、医師にとっても、患者にとっても、より便利であり、自己投与に関係する患者には特に有用であろう。低頻度の投薬の他の利点には、患者に導入される薬が少ないこと、およびコンプライアンスが増すことを挙げることができる。

（発明の要約）
従って、本発明の目的は、公知ペプチドＢ１拮抗薬と比較して明白に勝っている薬物動態特性を有し、さらに、充分にＢ１受容体活性に拮抗するので、炎症、疼痛および他のＢ１によって媒介される状態（喘息およびアレルギー性鼻炎を含むが、これらに限定されない）の治療または予防に治療上有用であるＢ１受容体の新規結合剤を提供することである。本発明は、こうした薬剤を、Ｂ１受容体の新規ペプチド拮抗薬および接合ペプチド拮抗薬の形態で提供する。一つの実施態様において、本発明の新規Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬は、配列番号１５から５４のいずれか一つで示されるようなアミノ酸配列を含む。

本発明の一部の実施態様によると、２０個の遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸またはこれらの立体異性体のＤ−アミノ酸のいずれかから独立して選択される１個またはそれ以上、好ましくは１個から９個の間のアミノ酸残基が、配列番号１５から５４で示されるようなペプチド配列のいずれかの末端または両末端に結合されることとなる。

もう一つの反応混合物において、本発明は、公知ペプチドＢ１拮抗薬と比較して明白に勝っている薬物動態特性を有し、さらに、充分に、このＢ１受容体に結合し、この活性に拮抗するため治療使用することができる、接合ペプチドも提供する。

本発明の一つの側面は、式Ｉ：
Ｆ−［（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_ｎ］ Ｉ
（式中、
Ｆは、Ｘ^１またはＹ^１に共有結合しているビヒクルであり
（好ましくは、Ｆは、ＰＥＧ部分またはこの誘導体である）；
Ｘ^１およびＹ^１は、各場合、独立して、それぞれ、式−Ｌ^１−Ｐ^１および−Ｌ^２−Ｐ^２のペプチドであり；
Ｌ^１およびＬ^２は、各場合、独立して、リンカーであり；
ｎは、０から３であり；ならびに
Ｐ^１およびＰ^２は、各場合、独立して、ブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬である）
接合ペプチドを含む。好ましくは、Ｐ^１およびＰ^２は、配列番号５から２６、４３から６０およびこれらの誘導体のうちのいずれか１つで示されるようなアミノ酸配列を含む。

本発明のもう一つの目的は、本発明の接合ペプチドがこの中に分散されている賦形剤担体材料を含む医薬組成物を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、賦形剤ならびに本発明の少なくとも１つのペプチドおよび／または接合ペプチドを含む組成物の医薬的に有効な量をこの必要がある哺乳動物に投与することを含む、治療的治療方法を提供することである。

本発明のペプチドおよび／または接合ペプチドは、炎症ならびに炎症および神経障害由来の慢性疼痛状態、敗血症性ショック、関節炎、変形性関節症、アンギナ、喘息、アレルギー性鼻炎ならびに偏頭痛を含む（しかし、これらに限定されない）Ｂ１活性化により媒介される疾病の治療に、治療的価値を有する。

本発明のペプチドおよび／または接合ペプチドは、適切な医薬用担体と調合し、この必要があるヒト（または他の哺乳動物）などの患者に有効量を投与することにより、治療または予防目的で使用することができる。

本明細書に開示するペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドのアミノ酸配列の保存的修飾により、さらなる有用なペプチドおよび／または接合ペプチドを得ることができる。保存的修飾により、こうした修飾が成されるペプチドおよび／または接合ペプチドのものに類似した機能的、物理的および化学的特性を有するペプチドおよび／または接合ペプチドが生産されることとなる。本明細書に開示するペプチドおよび／または接合ペプチドのこうした保存修飾形も、本発明の実施態様であると考える。

本発明のもう一つの側面は、本明細書において説明するような接合ペプチドを製造する方法に関し、この方法は、構造：
（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_Ｎ
（上記構造において、
Ｘ^１およびＹ^１は、各場合、独立して、それぞれ、式−Ｌ^１−Ｐ^１および−Ｌ^２−Ｐ^２のペプチドであり；
Ｌ^１およびＬ^２は、各場合、独立して、リンカーであり；
ｎは、０から３であり；ならびに
Ｐ^１およびＰ^２は、各場合、独立して、ブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬である）
を有する化合物をビヒクル（Ｆ）と反応させて、式：Ｆ−［（Ｘ^１）］、Ｆ−［（Ｘ^１）］−Ｆ、Ｆ−［（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_ｎ］、Ｆ−（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_ｎ、またはＦ−（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_ｎ−Ｆの接合ペプチドを得る段階を含む。好ましくはは、Ｆは、ＰＥＧ部分またはこの誘導体である。さらに好ましくは、Ｐ^１およびＰ^２は、各場合、独立して、配列番号５から６０で示されるペプチド配列の少なくとも１つを含むブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬である。さらにいっそう好ましくは、Ｘ^１は、配列番号２７から４１で示されるようなペプチドである。本発明のさらなる側面および利点は、後続の発明の詳細な説明を考究することにより明らかになるであろう。

（発明の詳細な説明）
本発明は、置換に対して全く耐性がないと一般に考えられている種類のペプチドを、Ｎ末端でアミノ酸置換して、および／またはＮ末端で様々なビヒクルに接合させて、同種類の公知ペプチドと比較して劇的に持続性の効能プロフィールを有する治療上有用なペプチドおよび／またはペプチド接合体を生じさせることができ、この結果、これらを炎症および疼痛の処理に使用することができるという驚くべき発見に基づく。従って、本発明のペプチドおよび／またはペプチド接合体は、公知Ｂ１ペプチド拮抗薬を超えるとてつもない治療上の利点をもたらす。さらに詳細には、本発明者らは、公知Ｂ１ペプチド拮抗薬に関するこれらの治療上の使用についての前述の欠点は、Ｎ末端でのアミノ酸置換により、および／または効能のあるインビボ半減期を長期化すると同時に拮抗薬の活性および特異性の保存を最大にする被定義サイズおよび組成のペプチジルまたは非ペプチジルリンカーを使用して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など（しかし、これに限定されない）のビヒクルにペプチド拮抗薬を接合させることにより、克服できることを見出した。加えて（または）、より小さなＰＥＧポリマーに接合したペプチド接合体と比較して、より大きなＰＥＧポリマーに接合したＢ１ペプチド拮抗薬にはインビトロ活性の有意な低下がもたらされるにもかかわらず、大きなＰＥＧ接合体の延長された循環半減期により、露出が有意に大きくなり、効能が有意に長期化することを発見した。加えて、本発明者らは、Ｂ１受容体のペプチド拮抗薬に結合したＰＥＧ分子のサイズが、固有拮抗薬活性および効能のあるインビボ半減期の最適化に不可欠なパラメータであることを見出した。例えば、アセチル化Ｂ１拮抗薬は、疼痛の適切なインビボモデルにおいて、多数の投薬の後、最大４時間は効能を示した。驚くべきことに、本明細書に開示する手法で５ｋＤおよび２０ｋＤのＰＥＧ分子に接合させた同ペプチドは、１回のボーラス注射後、それぞれ、２日までの間および少なくとも４日間、効能を示した。

本発明のブラジキニンＢ１受容体のペプチドおよびビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチド拮抗薬ならびにこれらの製造および使用方法を説明する前に、本発明により考慮さえるペプチドおよび／または接合ペプチド拮抗薬ならびに方法論は、勿論、少しばかり変わることがあるので、本発明は、記載する特定のペプチドおよび／または接合ペプチド拮抗薬に限定されないことを理解しなければならない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることとなるので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的とするものであり、限定と解釈されないことは、理解しなければならない。

本明細書に記載する目的のためにおよび手法でビヒクルに接合することが考慮されるブラジキニンＢ１受容体結合ペプチドには、本明細書に開示する新規Ｂ１結合ペプチド拮抗薬ならびに当該技術分野では周知のＢ１結合ペプチド拮抗薬が挙げられるが、これらに限定されず、また前記周知ペプチド拮抗薬には、以下の出版物（各々が、この全文、本明細書に参照により組み込まれている）のいずれか一つに開示されているいずれかのペプチドが挙げられるが、これらに限定されない： Ｒｅｇｏｌｉら，Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．，３４８：１−１０（１９９８）； Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら，Ｋｉｎｉｎ Ｂ_１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，８０：２８７−２９２（２００２）； Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ｐｒｅｓｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４３：１５５−１６１（１９９９）； Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８２：３７−４１（２００１）； ＰＣＴ国際公開第９８／０７７４６号；ならびに米国特許第４，６９３，９９３号、同第４，８０１，６１３号、同第４，９２３，９６３号、同第５，６４８，３３６号、同第５，８３４，４３１号、同第５，８４９，８６３号、同第５，９３５，９３２号、同第５，６４８，３３３号、同第５，３８５，８８９号、同第５，４４４，０４８号、および同第５，５４１，２８６号。

本明細書全体を通して用いる用語は、特定の事例において別様に限定されていない限り、以下のとおり定義する。

天然アミノ酸残基は、３つの方法で論じる： アミノ酸のフルネーム、標準三文字コード、または下に示すチャートに従って標準一文字コード。

Ａ＝Ａｌａ Ｇ＝Ｇｌｙ Ｍ＝Ｍｅｔ Ｓ＝Ｓｅｒ
Ｃ＝Ｃｙｓ Ｈ＝Ｈｉｓ Ｎ＝Ａｓｎ Ｔ＝Ｔｈｒ
Ｄ＝Ａｓｐ Ｉ＝Ｉｌｅ Ｐ＝Ｐｒｏ Ｖ＝Ｖａｌ
Ｅ＝Ｇｌｕ Ｋ＝Ｌｙｓ Ｑ＝Ｇｌｎ Ｗ＝Ｔｒｐ
Ｆ＝Ｐｈｅ Ｌ＝Ｌｅｕ Ｒ＝Ａｒｇ Ｙ＝Ｔｙｒ
明確に他の指示をしない限り、天然または非天然アミノ酸のここでの呼称は、このアミノ酸のＤ異性体とＬ異性体の両方を包含するものと解釈する。非天然アミノ酸のためにここで用いる略記は、米国特許第５，８３４，４３１号、ＰＣＴ国際公開第９８／０７７４６号、およびＮｅｕｇｅｂａｕｅｒら，（２００２）に記載されているものと同じであり、前記参照は、この全文、本明細書に参照により組み込まれている。加えて、略記「Ｄａｂ」および「Ｄ−Ｄａｂ」は、非天然アミノ酸、Ｄ−２−アミノ酪酸のＬ異性体とＤ異性体をそれぞれ指すものと解釈する。略記「３’Ｐａｌ」および「Ｄ−３’Ｐａｌ」は、非天然アミノ酸３’−ピリジルアラニンのＬ異性体とＤ異性体をそれぞれ指すものと解釈する。また、略記「Ｉｇｌ」は、「Ｉｇｌａ」および「Ｉｇｌｂ」（それぞれ、α−（１−インダニル）グリシンおよびα−（２−インダニル）グリシン）の両方を包含すると解釈する。同様に、「ＤＩｇｌ」は、「Ｄ−Ｉｇｌａ」および「Ｄ−Ｉｇｌｂ」（それぞれ、α−（１−インダニル）グリシンおよびα−（２−インダニル）グリシンのＤ異性体）の両方を包含すると解釈する。好ましくは、ここで用いる場合のＩｇｌは、Ｉｇｌｂであり、Ｄ−Ｉｇｌは、Ｄ−Ｉｇｌｂである。

「ビヒクル接合ペプチド」または「接合ペプチド」とは、生物活性を有し、哺乳動物に投与したとき治療効果をもたらす化合物を意味する。２つのパートが、（１）少なくとも１つのＢ１ペプチド拮抗薬、および（２）ペプチドの残基これ自体に、またはペプチドの残基に共有結合しているペプチジルもしくは非ペプチジルリンカー（芳香族リンカーを含むが、これらに限定されない）に共有結合している、後で定義する少なくとも１つのビヒクルを含む。

「ＰＥＧ接合ペプチド」または「ＰＥＧ化ペプチド」とは、生物活性を有し、哺乳動物に投与したとき治療効果をもたらすツー・パート化合物を意味する。これらの２つのパートには、（１）少なくとも１つのＢ１ペプチド拮抗薬、および（２）ペプチドの残基これ自体に、またはペプチドの残基に共有結合しているペプチジルもしくは非ペプチジルリンカー（芳香族リンカーを含むが、これらに限定されない）に共有結合している少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が挙げられる。

「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」とは、カップリング剤、またはカップリング剤もしくは活性化部分での（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジン、オキシラン、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドまたはマレイミド部分での）誘導化を伴うまたは伴わない、ポリアルキレングリコール化合物またはこの誘導体を意味する。

ＰＥＧは、市販されている、または当該技術分野では周知の方法（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ １３８−１６１）に従ってエチレングリコールを開環重合することにより調製することができる、公知水溶性ポリマーである。本出願において、用語「ＰＥＧ」は、このＰＥＧのサイズおよび末端での変性にかかわらず、一官能形から多官能形までのあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するように広く用いており、式：
Ｘ−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−１ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、 ＩＩ
（式中、ｎは、２０から２３００であり、Ｘは、Ｈまたは末端変性、例えばＣ_１−４アルキル、である）
によって表すことができる。

好ましくは、本発明において用いるＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終わる、すなわち、Ｘは、ＨまたはＣＨ_３である（「メトキシＰＥＧ」）。Ｘ＝ＣＨ_３の場合、ＯＨで終わる式ＩＩで示されるＰＥＧのもう一方の末端は、活性化する部分にエーテル酸素結合によって共有結合している。Ｘ＝Ｈの場合、ＰＥＧの両末端が、活性化する部分にエーテル結合によって結合し、この結果、直鎖二官能性ＰＥＧが生じる。化学構造の中で用いる場合、用語「ＰＥＧ」は、リンカーの遊離炭素原子と反応してエーテル結合を形成するために利用することができる酸素を残し、示されているヒドロキシル基の水素がない上記式ＩＩを包含する。より具体的には、ＰＥＧをペプチドに接合させるために、ＰＥＧは、「活性化」形でなければならない。活性化ＰＥＧは、式ＩＩＩ：
（ＰＥＧ）−（Ａ） ＩＩＩ
によって表すことができ、この式中のＰＥＧ（上で定義済み）は、活性化部分（Ａ）の炭素原子に共有結合して、エーテル結合を形成し、および（Ａ）は、ペプチドのアミノ酸残基またはこのペプチドに共有結合しているリンカー部分にあるアミノ、イミノまたはチオール基と反応することができる反応性基を含有する。

活性化ＰＥＧの製造方法は、当該技術分野では周知である。例えば、米国特許第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、およびＰＣＴ国際公開第９５／０６０５８号参照（これらは、各々は、これら全文、本明細書に参照により組み込まれている）。適する活性化ＰＥＧは、多数の従来どおりの反応によって製造することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ−ＮＨＳ−ＰＥＧ）は、Ｂｕｃｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｅｒｒ，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８２：１３７９−１３８４（１９８１）の方法に従って、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応させることにより、ＰＥＧ−モノメチルエーテル（これは、Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅから市販されている）から製造することができる。ＰＥＧ−アルデヒドなどの他の活性化ＰＥＧは、市場の供給源、例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（アラバマ州、ハンツヴィル）またはＥｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から入手することができる。本発明のために好ましい活性化ＰＥＧの例は、ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドおよびＰＥＧ−ブチルアルデヒドであり、これらは、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（アラバマ州、ハンツヴィル）から市販されている。ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドは、式ＰＥＧ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨＯによって表され、米国特許第５，２５２，７１４号に記載されている。前記特許は、全文、本明細書に参照により組み込まれている。加えて、二官能性ＰＥＧアルデヒドを使用して、二量体型接合体を製造することができる。

さらなるの好ましいアミン反応性ＰＥＧには、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）およびメトキシ−ＰＥＧスクシンイミドブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカーボネート、またはｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネートが挙げられ、これらは、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（アラバマ州、ハンツヴィル）、Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）、または日本油脂株式会社（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（日本、東京）から、様々な分子量で入手することができる。さらなる好ましい活性化ＰＥＧ部分には、式ＰＥＧ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２によって表されるＰＥＧビニルスルホン、ならびに下に図示するｍＰＥＧ−ヨードアセテートおよびｍＰＥＧ−チオエステル：

を含む（しかし、これらに限定されない）チオール反応性官能基が挙げられる。本発明のＰＥＧ接合ペプチドを生じさせるためのもう一つの好ましい活性化ＰＥＧは、ＰＥＧ−マレイミドである。マレイミドモノメトキシＰＥＧなどの化合物は、本発明のＰＥＧ接合ペプチドを生じさせるために特に有用である。

本発明のＰＥＧ接合ペプチドを生じさせるためにさらにいっそう好ましい活性化ＰＥＧは、１個より多くの活性化残基を有する多価ＰＥＧである。好ましい多価ＰＥＧ部分には、下に示すものが挙げられるが、これらに限定されない：

ＰＥＧについては、あらゆる分子量、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ（ｎは、２０から２３００である）を実際に望むとおりに使用することができる。ＰＥＧにおける繰り返し単位の数「ｎ」は、ダルトンで記載する分子量に対して割り当てられている。活性化リンカー上のＰＥＧの総合分子量が医薬用途に適するほうが、好ましい。従って、ＥＰＧ分子の総合分子量は、１００，０００Ｄａを超えるべきではない。

好ましくは、本発明のＰＥＧ接合ペプチドにおいて使用されるＰＥＧの総合または合計分子量は、約３，０００Ｄａから６０，０００Ｄａ（合計ｎは、７０から１，４００である）、さらに好ましくは約８，８００Ｄａから３６，０００Ｄａ（合計ｎは、約２００から約８２０である）である。ＰＥＧについての最も好ましい総合分子量は、約２０，０００Ｄａから２４，０００Ｄａである（合計ｎは、約４５０から約５４０である）。

ポリプロピレングリコールなどの他のポリアルキレングリコールを、本発明において使用してもよい。他の適切なポリアルキレングリコール化合物には、次のタイプの荷電または天然ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない：デキストラン、コロミン酸または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体。

用語「含む」は、ペプチドまたは接合ペプチドが、所定の配列のＮまたはＣ末端のいずれかまたは両方に追加の分子単位（アミノ酸が、挙げられるが、これに限定されない）を含むことができることを意味する。勿論、これらの追加の分子単位は、このペプチドまたは接合ペプチドの活性に有意に干渉してはならない。

ここで用いる用語「天然ペプチド」は、本明細書に開示する、または当該技術分野では周知の非接合Ｂ１ペプチド拮抗薬を指す。

用語「誘導化する」および「誘導体」または「誘導化された」は、それぞれ、プロセス、および得られたペプチドまたは接合ペプチド［この場合、（１）前記ペプチドまたは接合ペプチドは、環状部分、例えば接合ペプチドの中のシステイニル残基間の架橋、を有する；（２）前記ペプチドまたは接合ペプチドは、架橋しているか、架橋部位を有する；例えば、培養で、またはインビボで、前記ペプチドまたは接合ペプチドは、システイニル残基を有し、故に、架橋二量体を形成する；（３）−ＮＨ_２末端基を有する接合ペプチドのＮ末端は、−ＮＲＲ^１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ^１、−ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基、または非置換もしくは置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−により置換されている（この場合のＲ、Ｒ^１および環状置換基は、後で定義するとおりである）；（５）Ｃ末端は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２または−ＮＲ^３Ｒ^４によって置換されている（この場合のＲ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、後で定義するとおりである）］ならびに（６）個々のアミノ酸部分が、選択された副鎖または末端残基と反応することができる物質で処理することにより変性されている場合の接合ペプチドを包含する。誘導体は、後でさらに説明する。

用語「Ｂ１」は、ブラジキニンＢ１受容体を意味する（Ｊｕｄｉｔｈ Ｍ Ｈａｌｌ，Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ＢＫ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．５６：１３１−１９０（１９９２）参照）。特に別様に述べない限り、Ｂ１またはブラジキニンＢ１受容体は、ヒトブラジキニンＢ１受容体（ｈＢ１）を意味すると解釈する。好ましくは、ｈＢ１は、野生型受容体である。さらに好ましくは、ｈＢ１は、ゲンバンクアクセッション番号ＡＪ２３８０４４に記載のブラジキニン受容体である。

ここで一般に用いる用語「ペプチド」は、アミノ酸数４から４０の分子を指し、アミノ酸数１０から２０の分子が好ましく、アミノ酸数１５から１８のものが、最も好ましい。ここで用いる用語「ジペプチド」は、アミノ酸数２の分子を指す。ここで用いる用語「トリペプチド」は、アミノ酸数３の分子を指す。

蛋白質−蛋白質相互作用の構造解析を利用して、大きな蛋白質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを提案することもできる。こうした解析では、結晶構造が、蛋白質リガンドの重要な残基の素性および相対配向を示唆し、このことから類似ペプチドを設計することができる。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｖｏｌｕｍｅ １５，ｐａｇｅｓ １２６６−１２７０（１９９７）参照。これらの解析方法を利用して、受容体蛋白質と、本発明のペプチド、ビヒクル接合ペプチドまたはＰＥＧ接合ペプチドとの間の相互作用を調査することもでき、これが、結合親和性を増大させるために前記ペプチドまたは接合ペプチドのさらなる変性を示唆することもある。

ペプチド、ビヒクル接合ペプチドまたはＰＥＧ接合ペプチドＢ１拮抗薬に関して用いる場合にここで用いる用語「有効量」および「治療有効量」は、望ましい結果をもたらすために（すなわち、本発明のペプチド、ビヒクル接合ペプチドおよび／またはＰＥＧ接合ペプチドでの治療のために）充分な量または用量を指す。本発明に関連して、望ましい結果とは、例えば炎症および／または疼痛の望ましい軽減、またはＢ１の１つまたはそれ以上の生物活性のレベルの観察可能な低下を支持することを指す。より具体的には、治療有効量は、この（これらの）薬剤でインビボで治療した被験者において、問題の状態、例えば炎症または疼痛、を随伴する臨床的定義された病理学的プロセスの１つまたはそれ以上を、ある期間、抑制するために充分なペプチドおよび／または接合ペプチドの量である。有効量は、選択される具体的なペプチドおよび／または接合ペプチドＢ１拮抗薬に依存して変化し得、ならびに治療すべき被験者に関する様々な因子および状態ならびにこの疾患の重症度にも依存する。例えば、ペプチドおよび／または接合ペプチドＢ１拮抗薬をインビボで投与することになる場合、中でも、患者の年齢、体重および健康状態などの因子、ならびに前臨床動物研究において得られた用量応答曲線および毒性データが、考慮されるであろう。この（これらの）薬剤をインビトロで細胞と接触させることになる場合、取り込み、半減期、用量、毒性などのようなパラメータを評価するために、様々な前臨床インビトロ試験も設計することになろう。所定の薬剤についての有効量または治療有効量の決定は、充分に当業者の能力の範囲内である。

用語「薬理学的に活性な」は、そう記載されている物質が、医学的パラメータまたは疾病状態（例えば疼痛）に影響を及ぼす活性を有すると判定されることを意味する。本発明に関連して、一般に、この用語は、Ｂ１によって誘導されるか、Ｂ１によって媒介される疾病または異常な医学的状態または疾患、より具体的には、炎症または疼痛の拮抗作用を指す。

用語「拮抗薬」、「阻害剤」および「逆作動薬」（例えば、Ｒｉａｎｎｅ Ａ．Ｆ．ｄｅ Ｌｉｇｔら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０００，１３０，１３１参照）は、対象となる関連蛋白質の生物活性を遮断、妨害、低減、低下またはなんらかの方法で干渉する分子を指す。本発明の好ましい「拮抗薬」または「阻害剤」は、Ｂ１に結合し、Ｂ１活性のインビトロアッセイにおいて５００ｎＭまたはそれ以下のＩＣ_５０でこれを阻害する分子である。本発明のさらに好ましい「拮抗薬」または「阻害剤」は、Ｂ１に結合し、Ｂ１活性のインビトロアッセイにおいて１００ｎＭまたはそれ以下のＩＣ_５０でこれを阻害する分子である。本発明の最も好ましい「拮抗薬」または「阻害剤」は、Ｂ１に結合し、Ｂ１活性のインビトロアッセイにおいて５０ｎＭまたはそれ以下のＩＣ_５０でこれを阻害する、ならびに少なくとも１つの一般に認められている疼痛インビトロ動物モデルにおいて測定して疼痛を予防、改善もしくは撤廃する、および／または浮腫、炎症もしくは疼痛のインビボ動物モデルにおいて生化学的攻撃を抑制する分子である。

加えて、本発明のペプチドまたは接合ペプチドの生理学的に許容される塩も、ここに包含される。ここで用いるフレーズ「生理学的に許容される塩」および「薬理学的に許容される塩」は、交換可能であり、医薬適合性（すなわち、温血動物の治療に有用）であることが知られているか、いずれわかるあらゆる塩を指す。幾つかの具体的な例は、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；ハロゲン化水素酸塩、例えば塩酸塩および臭化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；シュウ酸塩；塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸などを含む（しかし、これらに限定されない）無機および有機酸の塩である。本発明の化合物が、カルボキシ基などの酸性官能基を含む場合、このカルボキシ基に適する医薬的に許容されるカチオン対は、当業者には周知であり、アルカリカチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン、第四アンモニウムカチオンなどが挙げられる。「薬理学的に許容される塩」のさらなる例については、以下およびＢｅｒｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１（１９７７）を参照のこと。

「保護基」は、一般に、求核反応、求電子反応、酸化反応、還元反応などの望ましくない反応から、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシ、メルカプトなどの選択された反応性基を保護するために使用される、当業者には周知の基を指す。好ましい保護基は、本明細書中、適所に示す。アミノ保護基の例には、アラルキル、置換アラルキル、シクロアルケニルアルキルおよび置換シクロアルケニルアルキル、アリル、置換アリル、アシル、アルコキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、シリルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アラルキルの例には、ベンジル、オルト−メチルベンジル、トリチルおよびベンズヒドリル（これらは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アシルアミノ、アシルなど、ならびにホスニウム塩およびアンモニウム塩などの塩で場合により置換されていてもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、インダニル、アントラセニル、９−（９−フェニルフルオレニル）、フェナントレニル、デュレニルなどが挙げられる。シクロアルケニルアルキルまたは置換シクロアルケニルアルキルラジカル（好ましくは、６から１０個の炭素原子を有するもの）の例には、シクロヘキセニルメチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。適するアシル、アルコキシカルボニルおよびアラルコキシカルボニル基には、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ベンゾイル、置換ベンゾイル、ブチリル、アセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタロイルなどが挙げられる。保護基の混合物を使用して、同じアミノ基を保護することができ、例えば、第一アミノ基をアラルキル基とアラルコキシ基の両方によって保護することができる。アミノ保護基は、これらが結合している窒素原子と一緒に複素環、例えば、１，２−ビス（メチレン）ベンゼン、フタルイミジル、スクシンイミジル、マレイミジルなどを形成することもでき、この場合、これらの複素環基は、隣接アリールおよびシクロアルキル環をさらに含むことができる。加えて、複素環基は、ニトロフタルイミジルのように、一、二または三置換されていてもよい。アミノ基は、塩酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの付加塩を形成することにより、酸化などの望ましくない反応から保護することもできる。アミノ酸保護基の多くが、カルボキシ、ヒドロキシおよびメルカプト基の保護にも適する。例えば、アラルキル基。アルキル基、例えばｔ−ブチルは、ヒドロキシおよびメルカプト基の保護にも適する。

シリル保護基は、１個またはそれ以上のアルキル、アリールおよびアラルキル基によって場合により置換されているケイ素原子である。適するシリル保護基には、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ジメチルフェニルシリル、１，２−ビス（ジメチルシリル）ベンゼン、１，２−ビス（ジメチルシリル）エタンおよびジフェニルメチルシリルが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ基のシリル化により、モノまたはジシリルアミノ基が生じる。アミノアルコール化合物のシリル化により、Ｎ，Ｎ，Ｏ−トリシリル誘導体にすることができる。シリルエーテル官能基からのシリル官能基の除去は、別の反応段階として、またはアルコール基との反応中にインサイチューで、例えば金属水酸化物またはフッ化アンモニウム試薬で処理することにより、容易に達成することができる。適するシリル化剤は、例えば、塩化トリメチルシリル、塩化ｔ−ブチル−ジメチルシリル、塩化フェニルジメチルシリル、塩化ジフェニルメチルシリル、またはこれらとイミダゾールもしくはＤＭＦの併用生成物である。アミンのシリル化方法およびシリル保護基の除去方法は、当業者には周知である。対応するアミノ酸、アミノ酸アミドまたはアミノ酸エステルからのこれらのアミン誘導体の製造方法も、アミノ酸／アミノ酸エステルまたはアミノアルコール化学を含む有機化学の技術分野の技術者には公知である。

保護基は、この分子の残りの部分に影響を及ぼさない条件下で除去する。これらの方法は、当業者には公知であり、酸水解、水素化分解などが挙げられる。好ましい方法は、保護基の除去、例えば、アルコール、酢酸などまたはこれらの混合物のような適する溶媒系中の炭素担持パラジウムを利用する水素化分解によるベンジルオキシカルボニル基の除去を含む。ｔ−ブトキシ−カルボニル保護基は、ジオキサンまたは塩化メチレンなどの適する溶媒系中、ＨＣｌまたはトリフルオロ酢酸などの無機または有機酸を利用して除去することができる。得られたアミノ酸を中和して、遊離アミンを生じさせることが容易にできる。メチル、エチル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−メトキシフェニルメチルなどのようなカルボキシ保護基は、当業者には周知の加水分解および水素化分解条件下で除去することができる。

本発明の化合物は、互変異性形で存在し得る基、例えば、次の例にて説明される、環状および非環状アミジンおよびグアニジン基、ヘテロ原子置換ヘテロアリール基（Ｙ’＝Ｏ、Ｓ、ＮＲ）：

などを含有することがあり、一つの形が本明細書において指名、記載、表示および／または特許請求の範囲に記載されていたとしても、こうした指名、記載、表示および／または特許請求の範囲への記載には、すべての互変異性形が本質的に含まれるものと解釈することに留意しなければならない。

本発明では、本発明の化合物のプロドラッグも考慮されている。プロドラッグは、このプロドラッグを患者に投与した後、インビボでの生理作用、例えば加水分解、代謝などにより、本発明の化合物に化学変性される活性または不活性化合物である。プロドラッグの製造および使用に関わる適性および技法は、当業者には公知である。エステルを含むプロドラッグの一般的な考察については、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｔｕｎｅｋ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗ １６５（１９８８）およびＢｕｎｄｇａａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５）を参照のこと。マスクされたカルボン酸アニオンの例には、アルキル（例えば、メチル、エチル）、シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル）、アラルキル（例えば、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル）およびアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、ピバロイルオキシメチル）などの様々なエステルが挙げられる。アミンは、アリールカルボニルオキシメチル置換誘導体としてマスクされており、これは、インビボでエステラーゼによって分解されて、遊離薬物およびホルムアルデヒドを放出する（Ｂｕｎｇａａｒｄ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２５０３（１９８９））。また、酸性ＮＨ基、例えばイミダゾール、イミド、インドールなどを含有する薬物は、Ｎ−アシルオキシメチル基でマスクされている（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５））。ヒドロキシ基は、エステルおよびエーテルとしてマスクされている。欧州特許第０３９，０５１号（Ｓｌｏａｎ ａｎｄ Ｌｉｔｔｌｅ，４／１１／８１）には、マンニッヒ塩基ヒドロキサム酸プロドラッグ、これらの製造および使用が開示されている。

接合ペプチドの構造
概説。本発明のビヒクル接合ペプチドは、次の式：
Ｆ−［（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_ｎ］ （ＩＶ）
（式中、
Ｘ^１およびＹ^１は、各場合、独立して、それぞれ、式−Ｌ^１−Ｐ^１および−Ｌ^２−Ｐ^２のペプチドであり；
Ｆは、Ｘ^１またはＹ^１に共有結合しているビヒクルであり；
Ｌ^１およびＬ^２は、各場合、独立して、不在であるか、０から９個のアミノ酸残基を有するリンカーであり；
ｎは、０から３であり；ならびに
Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２は、各場合、独立して、ブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬である）
によって表すことができる。

式ＩＶのビヒクル接合ペプチドは、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２が、各場合、独立して、配列番号５から６０のいずれか一つで示されるようなペプチド配列を有するブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬およびこの誘導体である、好ましい実施態様を含むであろう。

ビヒクル接合ペプチドのさらなる好ましい実施態様には、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２が、式：
ＮＨ_２−ａ^０ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５ａ^６ａ^７ａ^８ａ^９ａ^１０ａ^１１ａ^１２ａ^１３ａ^１４−ＣＯＯＨ
（式中、
ａ^０は、塩基性側鎖を有する１個か２個の残基を含有する塩基性または中性芳香族、脂肪族、複素環式または脂環式アミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドであるか、不在であり；
ａ^１、ａ^２、ａ^３およびａ^４は、各場合、独立して、塩基性または中性、芳香族、脂肪族、複素環式または脂環式アミノ酸であり；
ａ^６は、Ｓｅｒであり；
ａ^５、ａ^７およびａ^８は、各場合、独立して、芳香族、脂肪族、複素環式または脂環式アミノ酸であるが、但し、ａ^５、ａ^７およびａ^８のうちの少なくとも一つが、ＤまたはＬ配置のＣｈｇ、Ｃｐｇ、Ｉｇｌａ、Ｉｇｌｂ、ＮｉｇａおよびＮｉｇｂから選択されることを条件とし；ならびに
ａ^９、ａ^１０、ａ^１１、ａ^１２、ａ^１３およびａ^１４は、各場合、独立して、天然アミノ酸であるか、不在である）
によって定義される、式ＩＶのビヒクル接合ペプチドが挙げられよう。

さらに好ましくは、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２は、式：
ＮＨ_２−ａ^０ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５ａ^６ａ^７ａ^８ａ^９ａ^１０ａ^１１ａ^１２ａ^１３ａ^１４−ＣＯＯＨ
（式中、
ａ^０は、塩基性アミノ酸、または塩基性側鎖を有する１個か２個の残基を含有するジペプチドであるか、不在であり；
ａ^１は塩基性アミノ酸であり；
ａ^２はＰｒｏであり；
ａ^３はＨｙｐであり；
ａ^４はＧｌｙであり；
ａ^５およびａ^８はインダニルアミノ酸であり；
ａ^６はＳｅｒであり；
ａ^７はＤ−インダニルアミノ酸であり；
ａ^８はＣｐｇであり；および
ａ^９、ａ^１０、ａ^１１、ａ^１２、ａ^１３およびａ^１４は、各場合、独立して、いずれかの天然アミノ酸であるか、不在である）
によって定義される。

さらにいっそう好ましくは、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２は、式：
ＮＨ_２−ａ^０ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５ａ^６ａ^７ａ^８ａ^９ａ^１０ａ^１１ａ^１２ａ^１３ａ^１４−ＣＯＯＨ
（式中、
ａ^０は、塩基性アミノ酸、または塩基性側鎖を有する１個か２個の残基を含有するジペプチドであるか、不在であり；
ａ^１は塩基性アミノ酸であり；
ａ^２はＰｒｏであり；
ａ^３はＨｙｐであり；
ａ^４はＧｌｙであり；
ａ^５はＣｐｇであり；
ａ^６はＳｅｒであり；
ａ^７はＤＴｉｃであり；および
ａ^８はＣｐｇであり；および
ａ^９、ａ^１０、ａ^１１、ａ^１２、ａ^１３およびａ^１４は、各場合、独立して、いずれかの天然アミノ酸であるか、不在である）
によって定義される。

さらにいっそう好ましくは、本発明のビヒクル接合ペプチドは、ｎ＝０ならびにＸ^１が、配列番号２７から４１で示されるようなペプチドおよびこの誘導体から成る群より選択されるペプチドである場合の式ＩＶのビヒクル接合ペプチドを含む。

本発明は、ブラジキニンＢ１受容体（Ｂ１）結合し、この活性に拮抗する、ならびに非接合ペプチドＢ１拮抗薬と比較して明白に勝ったインビボでの薬物動態特性を有するＰＥＧ接合ペプチドも提供する。本発明のＰＥＧ接合ペプチドは、下記式（Ｖ）：
Ｆ−［（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_ｎ］
（式中、
Ｘ^１およびＹ^１は、各場合、独立して、それぞれ、式−Ｌ^１−Ｐ^１および−Ｌ^２−Ｐ^２のペプチドであり；
Ｆは、Ｘ^１またはＹ^１に共有結合しているＰＥＧ部分であり；
Ｌ^１およびＬ^２は、各場合、独立して、不在であるか、０から９個のアミノ酸残基を有するリンカーであり；
ｎは、０から３であり；ならびに
Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２は、各場合、独立して、ブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬である）
によって表すことができる。

式ＶのＰＥＧ接合ペプチドは、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２が、各場合、独立して、配列番号５から６０のいずれか１つで示されるようなペプチド配列を有するブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬およびこれらの誘導体である、好ましい実施態様を含むであろう。

ＰＥＧ接合ペプチドのさらなる好ましい実施態様には、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２が、式：
ＮＨ_２−ａ^０ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５ａ^６ａ^７ａ^８ａ^９ａ^１０ａ^１１ａ^１２ａ^１３ａ^１４−ＣＯＯＨ
（式中、
ａ^０は、塩基性もしくは中性芳香族、脂肪族、複素環式もしくは脂環式アミノ酸、または塩基性ジペプチドもしくはトリペプチドであるか、不在であり；
ａ^１、ａ^２、ａ^３およびａ^４は、各場合、独立して、塩基性または中性、芳香族、脂肪族、複素環式または脂環式アミノ酸であり；
ａ^６は、Ｓｅｒであり；
ａ^５、ａ^７およびａ^８は、芳香族、脂肪族、複素環式または脂環式アミノ酸であるが、但し、ａ^５、ａ^７およびａ^８のうちの少なくとも一つが、ＤまたはＬ配置のＣｈｇ、Ｃｐｇ、Ｉｇｌａ、Ｉｇｌｂ、ＮｉｇａおよびＮｉｇｂから選択されることを条件とし；ならびに
ａ^９、ａ^１０、ａ^１１、ａ^１２、ａ^１３およびａ^１４は、各場合、独立して、なんらかの天然アミノ酸であるか、独立して不在である）
によって定義される、式ＶのＰＥＧ接合ペプチドが挙げられよう。

さらに好ましくは、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２は、式：
ＮＨ_２−ａ^０ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５ａ^６ａ^７ａ^８ａ^９ａ^１０ａ^１１ａ^１２ａ^１３ａ^１４−ＣＯＯＨ
（式中、
ａ^０は、塩基性アミノ酸または塩基性ジペプチドであるか、不在であり
ａ^１は塩基性アミノ酸であり；
ａ^２はＰｒｏであり；
ａ^３はＨｙｐであり；
ａ^４はＧｌｙであり；
ａ^５およびａ^８はインダニルアミノ酸であり；
ａ^６はＳｅｒであり；
ａ^７はＤ−インダニルアミノ酸であり；
ａ^８はＣｐｇであり；および
ａ^９、ａ^１０、ａ^１１、ａ^１２、ａ^１３およびａ^１４は、各場合、独立して、なんらかの天然アミノ酸であるか、不在である）
によって定義される。

さらにいっそう好ましくは、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２は、式：
ＮＨ_２−ａ^０ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５ａ^６ａ^７ａ^８ａ^９ａ^１０ａ^１１ａ^１２ａ^１３ａ^１４−ＣＯＯＨ
（式中、
ａ^０は、塩基性アミノ酸または塩基性ジペプチドであるか、不在であり
ａ^１は塩基性アミノ酸であり；
ａ^２はＰｒｏであり；
ａ^３はＨｙｐであり；
ａ^４はＧｌｙであり；
ａ^５はＣｐｇであり；
ａ^６はＳｅｒであり；
ａ^７はＤＴｉｃであり；
ａ^８はＣｐｇであり；および
ａ^９、ａ^１０、ａ^１１、ａ^１２、ａ^１３およびａ^１４は、各場合、独立して、なんらかの天然アミノ酸であるか、不在である）
によって定義される。

本発明のさらにいっそう好ましいＰＥＧ接合ペプチドには、ｎ＝０ならびにＸ^１が、配列番号２７から４１で示されるようなアミノ酸配列を有するペプチドおよびこの誘導体から成る群より選択されるペプチドである場合の式ＶのＰＥＧ接合ペプチドが挙げられる。本発明のさらにいっそう好ましいＰＥＧ接合ペプチドには、ｎ＝０ならびにＸ^１が、配列番号２７から４１で示されるようなアミノ酸配列を有するペプチドおよびこの誘導体から成る群より選択されるペプチドである場合のものが挙げられる。さらにいっそう好ましくは、本発明のＰＥＧ接合ペプチドは、下記式：
Ｆ’−Ｒ_Ｚ ＶＩ
（式中、
Ｆ’は、多価ビヒクルであり；
Ｒは、各場合、独立して、−（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_ｎであり、この場合、Ｒは、Ｆ’に共有結合しており；
Ｘ^１およびＹ^１は、各場合、独立して、それぞれ、式−Ｌ^１−Ｐ^１および−Ｌ^２−Ｐ^２のペプチドであり；
Ｌ^１およびＬ^２は、各場合、独立して、不在であるか、０から９個のアミノ酸残基を有するリンカーであり；
ｎは、０から３であり；
Ｚは、２から８であり；ならびに
Ｐ^１およびＰ^２は、各場合、独立して、ブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬である）
またはこの生理学的に許容される塩によって表すことができる。

本発明のさらにいっそう好ましいＰＥＧ接合ペプチドには、ｎが０であり、Ｚが、４から８であり、ならびにＸ^１が、配列番号２７から４１で示されるようなアミノ酸配列を有するペプチドおよびこれらの誘導体から成る群より選択されるペプチドである、式ＶＩのＰＥＧ接合ペプチドが挙げられる。

本明細書で定義するような、Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２のフラグメント（すなわち、「部分配列」）、類似体および誘導体であるペプチド配列を有するペプチド接合体も、本発明の一部と解釈され、この場合、こうした接合ペプチドは、インビトロおよび／またはインビボ抗Ｂ１活性に関して、本明細書に具体的に開示するペプチド接合体と実質的に同等である。

用語「類似体」は、ペプチド、接合ペプチド（非接合Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２）ならびに／または式（ＩＶ）および（Ｖ）によりそれぞれ規定されるビヒクル−もしくはＰＥＧ−接合ペプチドのいずれかのペプチジルリンカー（Ｌ）のアミノ酸の直線配列に由来する、ならびにインビトロおよび／またはインビボ抗Ｂ１活性に関して、本明細書に具体的に開示する類似の非接合ペプチドまたは接合ペプチドと比較して実質的に同等な分子を結果として生じさせる、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加を表す分子を意味すると解釈する。

本発明の接合ペプチド類似体は、（Ｐ）（Ｐ^１および／または（存在する場合には）Ｐ^２）または（Ｌ）（Ｌ^１および／または（存在する場合には）Ｌ^２）の配列に一つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を一般に有するであろう。保存的アミノ酸変化は、ポリペプチドの構造および／または機能を不安定する可能性が最少であり、一般に、あるアミノ酸についての、構造および／または機能が類似した別のアミノ酸（例えば、サイズ、電荷および／または形が類似した副鎖を有するアミノ酸）での置換を伴うと、一般に理解されている。これらの置換の性質は、当業者には公知であり、具体例としてのアミノ酸置換を表１および２にまとめる。

新たなシステインが、遊離チオールとして残っている場合、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣに変えることが、さらに好ましい。

（保存的であろうと、非保存的であろうと）望ましいアミノ酸置換は、当業者が、こうした置換を望むときに決めることができる。例えば、アミノ酸置換を利用して、ペプチド配列の重要な残基を同定することができ、または本明細書に記載する非接合および／もしくは接合ペプチド分子の親和性を増加もしくは減少させることができる。

一定の実施態様において、保存的アミノ酸置換は、一般には化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基も包含する。

前のセクションで述べたように、天然残基は、配列の修飾に有用であり得る共通の副鎖基に分類することができる。例えば、非保存的置換は、これらの類の一構成員を別の類の一構成員と交換することを含むことができる。こうした置換残基は、非ヒトオーソログと相同であるペプチドの領域に導入してもよいし、またはこの分子の非相当領域に導入してもよい。加えて、鎖の配向に影響を及ぼすためにＰまたはＧを用いて修飾を行うこともできる。

こうした修飾を行う場合、アミノ酸の疎・親水性指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。各アミノ酸には、これらの疎水性および電荷特性を基に一定の疎・親水性指数が割り当てられており、これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。

蛋白質への相互作用性生体機能の付与におけるアミノ酸疎・親水性指数の重要性は、当該技術分野において理解されている。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。一定のアミノ酸は、類似した疎・親水性指数またはスコアを有する他のアミノ酸を置換し、類似した生物活性をなお保持することができることが知られている。疎・親水性指数を基に交換を行う場合、疎・親水性指数が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内ものが、特に好ましく、±０．５の範囲内のものが、さらにいっそう好ましい。

類似のアミノ酸の置換を、親水性を基に有効に行うことができることも、当該技術分野では理解されている。この隣接アミノ酸の親水性により決定されるような蛋白質の最大局所平均親水性は、この免疫抗原性および抗原性、すなわち、この蛋白質の生物学的性質と相関する。

以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−０．１）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似した親水性値を基に交換を行う場合、親水性値が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内のものが、特に好ましく、±０．５の範囲内のものが、さらにいっそう特に好ましい。親水性を基に第一アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は、「エピトープのコア領域」とも呼ばれる。

当業者は、周知の技術を利用して、本明細書に記載する非接合および／または接合ペプチドの適する類似体を決定することができるであろう。当業者は、活性を保持しながら、天然ペプチドにおいて発生する残基を化学的に類似したアミノ酸で置換すること（保存的アミノ酸置換）ができることも知っているだろう。従って、生物活性または構造に重要であり得る領域であっても、この生物活性を破壊することなく、またこの非接合ペプチドもしくは接合ペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に付すことができる。

加えて、当業者は、活性または構造に重要である非接合および／または接合ペプチド配列内の残基を同定する構造−機能研究を再考することができる。こうした比較にかんがみて、ペプチド配列におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、こうした予測された本発明の非接合および／または接合ペプチドの重要なアミノ酸残基を化学的に類似したアミノ酸置換で置換することを選んでもよい。

多数の科学出版物が、二次構造の予測に充てられている。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）； Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）； Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）； Ｃｈｏｕら，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）； Ｃｈｏｕら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）参照。さらに、現在では、二次構造の予測を助けるコンピュータプログラムを利用することができる。

二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）； Ｓｉｐｐｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−９（１９９６））、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）； Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）； Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−８（１９８７））、および「進化的関連（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ，上記、およびＢｒｅｎｎｅｒ，上記、参照）が挙げられる。

本発明のペプチドおよび／または接合ペプチド類似体および誘導体は、本明細書に具体的に開示するこれらの類似ペプチドおよび／または接合ペプチドが有用（すなわち、インビトロおよび／またはインビボでのＢ１活性の拮抗薬）であるのと同じ意味で有用であろう。

（ペプチド）
本発明のペプチドには、配列番号１５から３５および３９から５４で示す配列を含むペプチドが挙げられる。本発明のビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチドの中のペプチド配列Ｐ^１および（存在する場合には）Ｐ^２は、述べたように、Ｂ１に結合し、この活性に拮抗する（例えば、これを低下させる）ペプチドを含む。本発明の好ましいビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチドは、配列番号５から６０およびこれらの誘導体から成る群より選択される少なくとも１つのペプチド配列を含む。さらに好ましくは、さらに好ましくは、本発明のビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチドは、配列番号２７から４１およびこれらの誘導体から成る群より選択される少なくとも１つのペプチド配列を含む。

（ビヒクル）
ここで用いる用語「ビヒクル」は、分解を防止する、および／または半減期を拡大する、毒性を低減する、免疫抗原性を低下させる、または治療用ペプチドもしくは蛋白質の生物活性を増大させる分子を指す。本発明に関連して有用なビヒクルは、当該技術分野では公知であり（例えば、ＰＣＴ国際公開第９８／０７７４６号、これは、全文、本明細書に参照により組み込まれている）、当業者には、すべて、容易に入手することができる。本発明に関連して、好ましいビヒクルには、ポリメチルエチレン−グリコール、ポリヒドロキシプロピレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびオキシド、ポリメチルプロピレングリコール、ポリヒドロキシプロピレンオキシド、直鎖および分枝鎖プロピレングリコールならびにこれらの誘導体、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールならびにこれらのモノメチルエーテル、モノセチルエーテル、モノ−ｎ−ブチルエーテル、モノ−ｔ−ブチルエーテルおよびモノオレイルエーテル、ポリアルキレングリコールとカルボン酸のエステル、ならびにポリアルキレングリコールとアミンの脱水縮合産物、ならびに他のアルキレンオキシドおよびグリコールならびにこれらの誘導体、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルアセテート）、共重合体ポリ（ビニルアセテート−ｃｏ−ビニルアルコール）、ポリビニルオキサゾリドン、ポリ（ビニルメチルオキサゾリドン）およびポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ（アクリルアミド）およびポリ（メタクリルアミド）ならびにこれらの他のアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アセトアミドアクリルアミド）、およびポリ（Ｎ−アセトアミドメタクリルアミド）ならびにこれらのアミドの他のＮ−置換誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の１つの側面は、非ペプチジルリンカー部分に、またはペプチドＢ１拮抗薬に共有結合で融合しているペプチジルリンカーのアミノ酸残基に結合している少なくとも一つのビヒクル（Ｆ）の存在を必要とする。本発明に関連して、好ましいビヒクルは、本明細書において定義するようなＰＥＧ分子を構成する。さらにいっそう好ましいビヒクルは、本明細書において定義するような多価ＰＥＧ分子を構成する。

本明細書において具体的に開示するまたは引用するビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチド分子を、（Ｘ^１）−（Ｙ^１）_ｎ（上で定義したとおり）によって表される領域内でわずかに変性して、本発明の類似体を作ることができるが、但し、Ｂ１の拮抗作用が実質的に維持されることを条件とする。

本発明のビヒクルまたはＰＥＧ接合ペプチドとこれらの類似体の間のこととして、（Ｐ）領域の３個より多くの非末端残基が異ならないほうが、好ましい。さらに好ましくは、本発明によって考慮される類似体には、本発明のビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチドの（Ｐ）領域のいずれかの特定の非末端部位において２個以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する分子が挙げられる。最も好ましくは、特に指定（Ｐ）領域における、本発明のビヒクルまたはＰＥＧ接合ペプチドとこれらの考慮される類似体の間の配列の相違は、一つまたはそれ以上の「保存的修飾」の形態での相違である。

（リンカー）
ここで用いる用語「リンカー」は、式ＩＶおよびＶ（上記）のいずれかで示されるようなＬ^１および（存在する場合には）Ｌ^２を指し、本明細書では（Ｌ）と略記する。好ましくは、（Ｌ）は、本質的にペプチジルであり（すなわち、ペプチド結合によって互いに結合されているアミノ酸から成り）、１から９個のアミノ酸から成る。さらに好ましくは、（Ｌ）は、２０の天然アミノ酸から選択される、１から９個のアミノ酸から成る。さらにいっそう好ましい実施態様において、前記ペプチジルリンカーの１から９個のアミノ酸は、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミンおよびリシンから選択される。さらにいっそう好ましくは、ペプチジルリンカーは、アミノ酸から成り、これらのアミノ酸の大多数が、立体障害のないアミノ酸、例えば、ペプチド結合によって連結されたグリシンとアラニンである。従って、好ましいペプチジルリンカーは、ポリ（Ｇｌｙ）_１−８、特に（Ｇｌｙ）_３（配列番号６１）、（Ｇｌｙ）_５（配列番号６２）および（Ｇｌｙ）_７（配列番号６３）、ならびにポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）_２−４およびポリ（Ａｌａ）_１−８である。ペプチジルリンカーの他の具体的な例には、（Ｇｌｙ）_５Ｌｙｓ（配列番号６４）および（Ｇｌｙ）_５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号６５）が挙げられる。ＧｌｙとＡｌａの他の組合せも好ましい。上の命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）_５Ｌｙｓは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓを意味する。ペプチジルリンカーは、ビヒクルとの接合のためのＮ−末端システイン、別のチオールまたは求核分子を含有してもよい。さらに好ましいリンカーは、マレイミド、ヨードアセトアミドまたはチオエステル官能化ビヒクルと接合のためのＮ末端システインもしくはホモシステイン残基または他の２−アミノ−エタンチオールもしくは３−アミノ−プロパンチオール部分を含有する。マレイミド活性化ＰＥＧとペプチドの反応によって形成された初期３−スルファニルスクシンイミド付加体（１ｃ）を過剰な塩基で処理することにより、この安定性が低いスイクシンイミド付加体を加水分解安定性の６−メチルカルバモイル−５−オキソ−チオモルホリン−３−カルボキサミド形（１ｄ、図式１）に転化させる。また、図式２および３に示すように、市販のチオエステルＰＥＧまたはヨードアセトアミドＰＥＧ（アラバマ州、ハンツヴィルのＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を化学選択的接合に使用してもよい。

もう一つの好ましいリンカーは、ほぼ１ｋ ＰＥＧ分子のサイズであると概算される、ランダムＧｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＨ；配列番号６６）を含む大型可撓性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカーである。加えて、ペプチジルリンカーは、非ペプチジルセグメント、たとえば、式−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−の炭素数６の脂肪族分子を含むことができる（剛性（ｒｉｇｉｄ）リンカー：−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧ−；配列番号６７）。

また、反応性求核因子を含有する非ペプチジルリンカーが、Ｘ^１および（存在する場合には）Ｙ^１に存在してもよい。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｓ＝２０）のようなアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、なんらかの非立体障害性の基、例えば、低級アルキル（例えば、Ｃ_１−Ｃ_６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニルなど、によってさらに置換されていてもよい。具体例としての非ペプチジルリンカーは、ＰＥＧリンカーである（下に示す）：

（式中、ｎは、リンカーが、１００から５０００キロダルトン（ｋＤ）、好ましくは１００から５００ｋＤの分子量を有するようなｎであり、ｍは、１から３である）。好ましくは、非ペプチジルリンカーは、芳香族である。これらのリンカーは、ここで説明するものと同し手法で誘導体を形成するように変性することができる。

加えて、ＰＥＧ分子は、ＰＥＧアルデヒドを使用する還元アルキル化またはヒドロキシスクシンイミドもしくはＰＥＧの炭酸エステルを使用するアシル化のいずれかによって、Ｎ末端アミンまたは選択された副鎖アミンに結合させることができる。上で説明したいずれのリンカーも、このアプローチに使用することができる。また、適切に官能化されたＰＥＧを、配列番号５から２６もしくは配列番号４３から６０として示すようなブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬のいずれかに直接結合させることができ、または配列番号５から２６もしくは４３から６０として示すようなブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬のいずれかに共有結合で融合しているペプチジルリンカーのアミノ酸残基に直接結合させることができる。

ビヒクルおよび／またはターゲットペプチドは、多価であり得るので、本発明のプロセスにより様々なビヒクル：ペプチド構造を製造できることは、理解されるであろう。例として、一価のビヒクルと一価のペプチドは、１：１接合体を生じさせるであろうし；二価のペプチドと一価のビヒクルは、ペプチド接合体が２個のビヒクル分子を有する接合体を形成することができ、これに対して二価のビヒクルと一価のペプチドは、２個のペプチド単位が、単一のビヒクル分子に連結している種を生じさせることができる。より高い価のビヒクルを使用すると、単一のビヒクル部分に結合したペプチド単位のクラスタが形成されることとなり、これに対してより高い価のペプチドは、多数のビヒクル分子で覆われることとなり得る。ペプチド分子は、活性化ビヒクルと反応するであろう１つまたはそれ以上の反応性基を有することができ、複雑な構造を形成する可能性を常に考慮しなければならず；ビヒクルとペプチドの１：１付加体のような単純構造の形成を望む場合、または二価のビヒクルを使用してペプチド：ビヒクル：ペプチド付加体を形成することを望む場合、活性化ビヒクルとペプチド材料の所定比率、これらの所定濃度を用いること、および所定の条件（例えば、継続時間、温度、ｐＨなど）下で反応を行って、記載の生成物の比率を作り、次いで、記載の生成物を他の反応生成物と分離することが、有益であろう。試薬の反応条件、比率および濃度は、比較的簡単な試行錯誤実験によって得ることができ、これらの実験は、通常技能の技術者の能力の範囲内であり、必要に応じて適切に規模を拡大する。同様に、生成物の精製および分離は、当業者には公知の従来どおりの技法によって達成される。しかし、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および［ｔｈｅ］は、この文脈に明確な別様の指図がない限り、多数の指示対象を包含する。従って、例えば、「ビヒクル接合ペプチド拮抗薬」または「ＰＥＧ接合ペプチド拮抗薬」への言及は、こうした接合体の混合物を包含し、ならびに「治療方法」への言及は、当業者には周知であろう、または本明細書を読むとわかることになるであろう、等々のタイプの１つまたはそれ以上の治療方法への言及を包含する。

システインアミノ酸残基を有するペプチドおよびポリペプチドのチオール基とｍＰＥＧ−マレイミドの接合による従来どおりのＰＥＧ化は、有機溶媒を伴うまたは伴わないリン酸緩衝液中で実行される。ＰＥＧ化ペプチドおよびポリペプチドの水への高い溶解性ならびに水中でのピロリジン−２，５−ジオン環の潜在的不安定性が、ＰＥＧ化ペプチドおよび蛋白質の大規模な生産および精製へのこの方法の適用の妨げとなっている。しかし、本発明者らは、システイン残基を有するペプチドおよびポリペプチドのチオール基とｍＰＥＧ−マレイミドの接合についての新規非水系条件をここに開示する。この新規プロセスによって、中から高収率のＰＥＧ化ペプチドおよびポリペプチドが得られ、ならびにマイケル付加とアミノ分解が併用されてワン・ポットとなる（図式４）。両方の条件が、沈殿によるＰＥＧ化ペプチドおよびポリペプチドの直接単離をもたらす。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式４に示したプロセスのもう一つの実施態様では、メタノール（ＭｅＯＨ）の代わりに以下の溶媒のうちの１つまたはそれ以上を含む溶媒を用いてもよい：メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アセトニトリル（ＡｃＮ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式４に示したプロセスのもう一つの実施態様では、ＴＢＭＥの代わりに次の溶媒のうちの１つまたはそれ以上を含む溶媒を用いてもよい：ジエチルエーテル、メチルイソプロピルエーテルおよびジイソプロピルエーテル。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式４に示したプロセスのもう一つの実施態様では、図式４に示したような反応１）を約２０℃から約６０℃の温度で行うことができる。好ましくは、図式４に示したような反応１）は、約３０℃から約５０℃の温度で行うことができる。さらに好ましくは、図式４に示したような反応１）は、約３５℃から約４５℃の温度で行うことができる。最も好ましくは、図式４に示したような反応１）は、室温で行うことができる。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式４に示したプロセスのもう一つの実施態様では、図式４に示したような反応２）を約２０℃から約６０℃の温度で行うことができる。好ましくは、図式４に示したような反応２）は、約３０℃から約５０℃の温度で行うことができる。さらに好ましくは、図式４に示したような反応１）は、約３５℃から約４５℃の温度で行うことができる。最も好ましくは、図式４に示したような反応２）は、室温で行うことができる。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式４に示したプロセスのもう一つの実施態様では、図式４に示したような沈殿反応を少なくとも１０分間、行うことができる。さらに好ましくは、図式４に示したような沈殿反応は、少なくとも６０分間、行うことができる。最も好ましくは、図式４に示したような沈殿反応は、約６０分間、行うことができる。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式４に示したプロセスのもう一つの実施態様では、沈殿、濾過および／または精製反応を１回より多く行うことができる。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式４に示したプロセスのもう一つの実施態様では、沈殿および／または精製反応を１回より多く行うことができる。

部分保護ペプチドは、多官能性ペプチドの特定部位の選択的変性が可能であるので、この戦略に特に有用な試薬である。これらの保護基は、ペプチド合成の技術分野の技術者には公知の確立された脱保護法を用いて、ＰＥＧ接合体から除去される。この用途に適する部分保護ペプチドは、ペプチド合成の技術分野の技術者には公知の直交型保護（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）戦略を用いて製造することができる。ブラジキニンＢ１受容体の部分保護ペプチド拮抗薬の合成および接合の実例を、図式５に示す。副鎖アミンが接合部位としての役割を果たす類似体は、容易に入手できる被直交型保護塩基性アミノ酸から製造することができる。

表３（配列番号５から６０）に記載したものなどのＢ１拮抗薬ペプチドの部分保護形は、同様の方法を用いてＰＥＧ部分に接合させることができる。

図式５に示したプロセスの一つの実施態様では、部分保護ペプチド５ｃのアミン副鎖をｔ−ブチルカルバモイル（Ｂｏｃ）部分によってマスクし、得られたペプチドを、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはこれらの混合物などの有機溶媒中でいずれかの前記ＰＥＧアルデヒドと反応させる。中間体イミンの形成は、粉末４Åモレキュラーシーブなどの脱水剤の添加により加速することができる。室温で１から２４時間攪拌した後、得られたイミンを、１から４当量のトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加により還元する。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式５に示したプロセスのもう一つの実施態様では、５ｃなどの部分保護ペプチドとの反応を約２０℃から約６０℃の温度で行うことができる。好ましくは、図式５に示したような５ｃなどの部分保護ペプチドとの反応は、約２０℃から約５０℃で行うことができる。さらに好ましくは、図式５に示したような５ｃなどの部分保護ペプチドとの反応は、約３５℃から約４５℃で行うことができる。図式５に示したような５ｃなどの部分保護ペプチドとの反応の殆どは、室温で行うことができる。

図式５に示したプロセスのもう一つの実施態様では、部分保護ペプチド５ｃのアミン側鎖をｔ−ブチルカルバモイル（Ｂｏｃ）部分によってマスクし、得られたペプチドを、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、Ｎ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）またはこれらの混合物などの有機溶媒中、いずれかの前記ＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはｐ−ニトロフェニルエステルＰＥＧ試薬と反応させる。活性化ＰＥＧエステルは、一官能性変異体であってもよいし、直鎖二官能性変異体であってもよく、これらの両方が、Ｎｅｋｅｒまたは日本油脂株式会社（ＮＯＦ）などの供給業者から市販されている。加えて、３から６個のヒドロキシスクシンイミドまたはｐ−ニトロフェニルエステル部分を含有する分枝鎖多官能性ＰＥＧ活性化エステルは、本発明の接合体の製造に特に有用である。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式５に示したプロセスのもう一つの実施態様では、５ｃなどの部分保護ペプチドとの反応を、約２０℃から約６０℃の温度、約４時間から約１０日の範囲の反応時間で行うことができる。好ましくは、図式５に示したような５ｃなどの部分保護ペプチドとの反応は、約２０℃から約５０℃の温度、約１２時間から約５日の範囲の反応時間で行うことができる。さらに好ましくは、図式５に示したような５ｃなどの部分保護ペプチドとの反応は、約３５℃から約４５℃の温度、約１から約５日の範囲の反応時間で行うことができる。図式５に示したような５ｃなどの部分保護ペプチドとの反応の殆どは、室温、約１から約４日の範囲の反応時間で行うことができる。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式５に示したプロセスのもう一つの実施態様では、図式５に示したような側鎖保護基の除去を約−２０℃から約６０℃の温度で行うことができる。この反応は、約５容量％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と５０容量％のＴＦＡの間で使用するジクロロメタンなどの相溶性溶媒中で行うことができる。好ましくは、図式５に示したような酸によって媒介される保護基の除去は、約１０から約２５容量％のＴＦＡを使用して、約０℃から約４０℃の温度で行うことができる。さらに好ましくは、図式５に示したような酸によって媒介される保護基の除去は、ジクロロメタン中、約１０から約２０容量％のＴＦＡを使用して、約０℃から約２５℃の温度で行うことができる。最も好ましくは、図式５に示したような酸によって媒介される保護基の除去は、ジクロロメタン中、約２０容量％を使用して、室温で行うことができる。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式５に示したプロセスのもう一つの実施態様では、図式４に示した生成物５ｄを逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは膜透析により精製することができる。さらに好ましくは、上述の精製法のうちの２つまたはそれ以上の組合せを併用して、または別々に使用して、本発明の接合体を精製することができる。

上記または下記実施態様のいずれかとともに、図式５に示したプロセスのもう一つの実施態様では、前記精製方法を１回より多く行うことができる。

（誘導体）
本発明のペプチドおよび／または接合ペプチドの誘導体も、ここで考慮されている。こうした誘導体は、本明細書に開示するビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチドの溶解度、吸収、生物学的半減期などをさらに改善することができる。また、付加部分により、本明細書に開示するペプチドおよび／または接合ペプチドの何らかの望ましくない特性を削除または減弱することができる。具体例としての誘導体には、次の場合のビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチドが挙げられる。

１．ペプチドおよび／もしくは接合ペプチドまたはこれらの一部が環状である。例えば、ペプチドおよび／または接合ペプチドのペプチド部分は、ジスルフィド結合の形成により環化し得る２個またはそれ以上のシステイン残基を（例えば、ペプチジルリンカー内に）含有するように、変性することができる。環化誘導体の製造に関して参照するための引用については、国際公開第００／２４７８２号を参照のこと。

２．ペプチドならびに／またはビヒクル−もしくはＰＥＧ−接合ペプチドが、架橋しているか、分子間架橋できるようにされている。例えば、接合ペプチドのペプチド部分は、１個のＣｙｓ残基を含有するように変性することができ、これによって同様の分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができる。

３．１つまたはそれ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合（ペプチド結合）が、非ペプチジル結合によって置換されている。具体例としての非ペプチジル結合は、−ＣＨ_２−カルバメート［−ＣＨ_２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ_２−スルホンアミド［−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ_２−第二アミン、およびアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６（式中、Ｒ^６は、低級アルキルである）］である。

４．Ｘ^１における接合ペプチドのＮ末端システイン残基が、Ｎ末端誘導基で置換されていてもよい。実例としてのＮ末端誘導体基には、−ＮＨＲ^１（式中、Ｒ^１は、モノアルキルである）が挙げられる。

二官能性因子剤での誘導化は、ビヒクル接合ペプチドまたはこれらの官能性誘導体を水不溶性支持マトリックスまたは他の高分子ビヒクルに架橋させるために有用である。一般に使用されている架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含む）が挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］−プロピオイミデートなどの誘導化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化性中間体が生じる。また、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックスならびに米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号、および同第４，３３０，４４０号に記載されている反応性基質が蛋白質の固定に利用される。

炭水化物（オリゴ糖）基は、蛋白質の糖付加部位であることが知られている部位に適便に結合させることができる。一般に、Ｏ結合オリゴ糖は、セリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合しており、一方、Ｎ結合オリゴ糖は、これらが配列Ａｓｎ−Ａａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（この場合、Ａａａは、プロリンを除くあらゆるアミノ酸であり得る）の一部である場合は、アスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合している。Ａａａは、好ましくは、プロリン以外の１９の天然アミノ酸のうちの一つである。それぞれのタイプで見出されるＮ結合またはＯ結合オリゴ糖およびこれらの糖残基の構造が違う。両方に共通し見出される糖の１つのタイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と呼ばれる）である。シアル酸は、通常、Ｎ結合オリゴ糖とＯ結合オリゴ糖、両方の末端残基であり、この負の電荷によってグリコシル化接合ペプチドに酸性の特性をもたらすことができる。こうした部位（複数を含む）を本発明のビヒクル接合ペプチドのリンカーに組み込むことができる。こうした部位は、当該技術分野では公知の合成または半合成手順により、さらにグリコシル化することができる。

他の可能な変性には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、システインの硫黄原子の酸化、リシン、アルギニンおよび／またはヒスチジン副鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐａｇｅｓ ７９−８６（１９８３））。

本明細書に別様に開示されていない限り、本明細書に記載するペプチドおよび／または接合ペプチドの合成（適切なアミノ酸誘導体の製造、ペプチドを形成するためのこれらの活性化およびカップリング、ならびにペプチドの精製およびこれらの純度を判定するための方法を含む）は、溶液相合成についてＨｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ「有機化学法（Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ）」Ｖｏｌ．１６，ｐａｒｔｓ Ｉ ＆ ＩＩ，（１９７４）に概説されているような、ペプチド化学の全体知識に含まれている。固相法による合成についての適する技法も当該技術分野では公知であり、こうした技法には、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐａｇｅｓ ３３５−３６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｉｔｏｒｓ）（１９７３）； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌｕｍｅ ８５，ｐａｇｅ ２１４９（１９６３）； Ｄａｖｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ １０，ｐａｇｅｓ ３９４−４１４（１９８５）； Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）； 米国特許第３，９４１，７６３号； Ｆｉｎｎら，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐａｇｅｓ １０５−２５３（１９７６）；およびＥｒｉｃｋｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐａｇｅｓ ２５７−５２７（１９７６）に記載されているものが挙げられる。ペプチド合成の技術分野の熟練した化学者は、本記載ペプチドを標準的な溶液法により、または手動もしくは自動固相法により、合成することができるであろう。固相合成は、この原価効率のため、個々のペプチドの製造に好ましい技法である。

医薬組成物
（概説）
本発明は、例えば炎症および疼痛（炎症性疼痛ならびに関連痛覚過敏および異痛を含むが、これらに限定されない）の予防または治療において、本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドの医薬組成物を使用する方法も提供する。本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドは、視床痛症候群、糖尿病、毒素および化学療法、敗血症性ショック、関節炎、混合型および非血管症候群、一般炎症、関節炎、リウマチ病、狼瘡、変形性関節症、炎症性腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性または不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分での皮膚病訴、日焼け、心臓炎、炎症性腸疾患、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、上皮組織損傷または機能不全、単純疱疹、糖尿病性神経因性疼痛、ヘルペス後神経痛、灼熱痛、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、緊張性頭痛、アンギナ、偏頭痛、手術の痛み、呼吸部、尿生殖器部、胃腸部もしくは脈管部における内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性鼻炎、喘息、アレルギー性皮膚反応、心因性痒み、白斑、一般胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍形成、十二指腸潰瘍、または血管運動神経性もしくはアレルギー性鼻炎を含む（しかし、これらに限定されない）、Ｂ１の活性化に随伴するまたはＢ１の活性化によって媒介される他の有痛状態の予防または治療にも治療価値を有する。

本発明は、急性疼痛、歯痛、背部疼痛、腰痛、外傷からの痛み、手術の痛み、切断または膿瘍に起因する痛み、灼熱痛、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒、卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素および化学療法、一般頭痛、偏頭痛、群発頭痛、混合型血管および非血管症候群、緊張性頭痛、一般炎症、関節炎、リウマチ病、狼瘡、変形性関節症、炎症性腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性または不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分での皮膚病訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛ならびに関連痛覚過敏および異痛、神経因性疼痛ならびに関連痛覚過敏および異痛、糖尿病性神経因性疼痛、灼熱痛、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、喘息、アレルギー性鼻炎、上皮組織損傷または機能不全、単純疱疹、ヘルペス後神経痛、呼吸部、尿生殖器部、胃腸部もしくは脈管部における内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、心因性痒み、白斑、一般胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍形成、十二指腸潰瘍および気管支疾患の予防または治療のための本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドの使用も提供する。

従って、本発明は、急性疼痛、歯痛、背部疼痛、腰痛、外傷からの痛み、手術の痛み、切断または膿瘍に起因する痛み、灼熱痛、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒、卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素および化学療法、一般頭痛、偏頭痛、群発頭痛、混合型血管および非血管症候群、緊張性頭痛、一般炎症、関節炎、リウマチ病、狼瘡、変形性関節症、炎症性腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性または不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分での皮膚病訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛ならびに関連痛覚過敏および異痛、神経因性疼痛ならびに関連痛覚過敏および異痛、糖尿病性神経因性疼痛、灼熱痛、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、喘息、アレルギー性鼻炎、上皮組織損傷または機能不全、単純疱疹、ヘルペス後神経痛、呼吸部、尿生殖器部、胃腸部もしくは脈管部における内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、心因性痒み、白斑、一般胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍形成、十二指腸潰瘍および気管支疾患などの疾患を治療するための薬物の製造における１つまたはそれ以上の本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドの使用にも関する。

ここで用いる「治療」または「治療すること」は、有益なまたは望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明のために、有益なまたは望ましい結果には、次のうちの１つまたはそれ以上が挙げられるが、これらに限定されない：急性、慢性、炎症性、神経因性または手術後疼痛を含む疼痛および／または炎症のあらゆる側面の改善または緩和。本発明のために、有益なまたは望ましい結果には、次のうちの１つまたはそれ以上が挙げられるが、これらに限定されない：疼痛および／または炎症のあらゆる側面を含む疼痛および／または炎症を随伴する１つまたはそれ以上の症状の（重症度の低減を含む）緩和（例えば、疼痛および／もしくは炎症の継続期間の短縮、ならびに／または疼痛の感度または感覚の低下）。

こうした医薬組成物または薬物は、注射による投与用、または経口投与、肺投与、経鼻投与、経皮投与もしくは他の形態での投与用であり得る。一般に、本発明は、（疼痛または本明細書に提供する他の病状のいずれかを予防、改善または撤廃するために有効な量での）本発明の少なくとも１つのペプチドおよび／または少なくとも１つのビヒクル接合ペプチドの有効量とともに医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、保存薬、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む医薬組成物を包含する。こうした組成物は、様々な緩衝液分（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存薬（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの重合体ビヒクル接合ペプチドの粒状製剤への、またはリポソームへの材料の組み込みを含む。ヒアルロン酸も使用することができ、これは、循環における長期持続時間を促進する作用を有し得る。こうした組成物は、本発明のビヒクル接合ペプチドの物理的状態、安定性、インビボでの放出率、およびインビボでのクリアランス率にさらに影響を及ぼし得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐａｇｅｓ １４３５−１７１２（１９９０）参照。前記参照は、本明細書に参照により組み込まれている。本組成物は、液体形で、または乾燥粉末（例えば、凍結乾燥形）として製造することができる。経皮調合物である場合には、移植可能な持続放出性調合物も考慮される。

（経口剤形）
経口固体剤形は、ここでの使用が考慮されており、これらは、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＣｈａｐｔｅｒ ８９（本明細書に参照により組み込まれている）に概説されている。固体剤形には、錠剤、カプセル、ピル、トローチもしくはローゼンジ、カシェ剤またはペレットが挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイド封入を用いて、本組成物を調合することもできる（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号において報告されているプロテイノイドミクロスフェアなど）。リポソーム封入を用いることができ、これらのリポソームは、様々なポリマーから誘導することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号参照）。可能な固体剤形の説明は、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ（１９７９）のＣｈａｐｔｅｒ １０に与えられている（前記参照は、本明細書に参照により組み込まれている）。一般に、この調合物は、本発明のビヒクル接合ペプチド、ならびに本ビヒクル接合ペプチドを胃の環境からは保護し、腸内で放出させることができる不活性成分を含むであろう。

また、本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドこれら自体の経口剤形は、特に考慮されている。これに関しては、必要な場合には、これらのペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドを、経口送達により意図した効果が生じるように化学変性することができる。Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）などの変性脂肪族アミノ酸の塩を担体として使用して、本発明のビヒクル接合ペプチドの吸収を増進することもできる。「経口薬物送達組成物および方法（Ｏｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ）」と題する米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと。

本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドは、粒径約１ミリメートルの顆粒またはペレットの形態での多成分微粒子（ｆｉｎｅ ｍｕｌｔｉ−ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ）として調合物に含めることができる。カプセル投与用の材料の調合物は、粉末としてであってもよいし、軽く圧縮したプラグとしてであってもよいし、またはさらに錠剤としてであってもよい。治療薬を圧縮によって製造することもできる。

着色剤および着香剤は、すべて含めることができる。例えば、本ペプチドおよび／もしくはビヒクル接合ペプチドまたはこれらのなんらかの誘導体を（例えば、リポソームまたはミクロスフェア封入により）調合し、この後、着色剤および着香剤を含有する清涼飲料などの食品の中にさらに含めることができる。

不活性材料で本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドを希釈または増量することができる。これらの希釈剤には、炭水化物、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、変性デキストランおよびデンプンを挙げることができる。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む一定の無機塩も充填剤として使用することができる。市販希釈剤には、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌなどがある。

固体剤形への治療薬の調合の際に崩壊剤を含めてもよい。崩壊剤として使用される材料には、デンプンをベースにした市販の崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂを含む、デンプンが挙げられるが、これらに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトも使用することができる。崩壊剤のもう１つの形態は、不溶性カチオン交換樹脂である。粉末ゴムは、崩壊剤として、および結合剤として使用することができ、これらには、寒天、カラヤゴムまたはトラガカントゴムなどの粉末ゴムを挙げることができる。アルギン酸およびこのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。

結合剤は、本医薬組成物の成分を結合させて、硬質錠剤を形成するために使用することができ、これらには、アラビアゴム、トラガカントゴム、デンプンおよびゼラチンなどの天然産物から材料が挙げられる。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は、両方とも、本治療薬を顆粒にするためにアルコール溶液で使用することができる。

減摩剤を調合物に含めて、調合プロセス中の粘着を防止することができる。滑沢剤は、治療薬とダイ壁の間の層として使用することができ、これらには、ステアリン酸（このマグネシウムおよびカルシウム塩を含む）、ポリテトラヒドロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油および蝋を挙げることができるが、これらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｘｗａｘ ４０００および６０００などの可溶性滑沢剤も使用することができる。

調合中のビヒクル接合ペプチドの流動性を改善することができる、および圧縮中の再配列を助長する潤滑剤を添加してもよい。こうした潤滑剤には、デンプン、タルク、熱分解法シリカおよびケイアルミン酸塩水和物を挙げることができる。

本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドの水性環境への溶解を助長するために、界面活性剤を湿潤剤として添加してもよい。こうした界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン系洗剤を挙げることができる。カチオン系洗剤を使用してもよく、これらには、塩化ベンズアルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを挙げることができる。界面活性剤として調合物に含めることができる可能性がある非イオン系洗剤のリストは、ラクロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で、または種々の比率での混合物として、調合物中に存在し得る。

本ペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドの取り込みを増進するた添加剤も、調合物に含めることができる。この特性を有する可能性がある添加剤には、例えばオレイン酸、リノール酸およびリノレイン酸などの様々な脂肪酸が挙げられる。

制御放出調合物が望ましいこともある。本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドは、分散メカニズムまたは浸出メカニズムのいずれかにより放出させる不活性マトリックス、例えばゴム、に組み込むことができる。ゆっくりと分解するマトリクス、例えばアルジネートまたは多糖類、を調合物に組み込むこともできる。本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドのもう１つの制御放出形は、Ｏｒｏｓ治療薬系（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法、すなわち、浸透圧効果に起因して一つの小さな開口部に水が入り薬物を押出すことができる半透膜の中に薬物を封入する方法による。一部の腸溶コーチングも、遅延放出効果を有する。

（肺送達形）
本発明の医薬組成物の肺送達も、ここで考慮されている。本ペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチド（またはこれらの誘導体）は、吸入するうちに哺乳動物の肺に送達され、肺上皮層を横断して血流に至る。これに関して有用であり得る高分子の肺送達に関する報告には、Ａｄｊｅｉら，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌｕｍｅ ７，ｐａｇｅｓ ５６５−５６９（１９９０）； Ａｄｊｅｉら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６３，ｐａｇｅｓ １３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）； Ｂｒａｑｕｅｔら，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ １３（ｓｕｐｐｌ．５），ｓ．１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）； Ｈｕｂｂａｒｄら，Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ ３，ｐａｇｅｓ ２０６−１２（１９８９）（α１−アンチトリプシン） ；Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌｕｍｅ ８４，ｐａｇｅｓ １１４５−１１４６（１９８９）（α１−プロテイナーゼ）； Ｏｓｗｅｉｎら、「蛋白質のエーロゾル適用（Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（１９９０）（組換えヒト成長ホルモン）； Ｄｅｂｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ １４０，ｐａｇｅｓ ３４８２−３４８８（１９８８）（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）；および米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる。

治療製品の肺送達用に設計された広範な機械装置が、本発明の実施における使用に考慮されており、これらには、ネブライザ、定量吸入器および粉末吸入器（これらは、すべて、当業者によく知られている）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施に適する市販装置の幾つかの具体的な例には、ミズーリ州、セントルイスのＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．により製造されている、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ；コロラド州、エングルウッドのＭａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにより製造されているＡｃｏｒｎ ＩＩ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ；ノースカロライナ州、リサーチ・トライアングル・パークのＧｌａｘｏ Ｉｎｃ．により製造されているＶｅｎｔｏｌｉｎ ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ ｉｎｈａｌｅｒ；およびマサチューセッツ州、ベッドフォードのＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．によって製造されているＳｐｉｎｈａｌｅｒ ｐｏｗｄｅｒ ｉｎｈａｌｅｒがある。

こうした装置すべてが、本明細書に記載するペプチドおよび／もしくはビヒクル接合ペプチドならびに／またはこれらの誘導体の分散に適する調合物の使用を必要とする。一般に、各調合物は、利用される装置のタイプに特有のものであり、治療に有用な希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または担体に加えて、適切な噴射剤材料の使用を必要とし得る。

これらの肺用組成物のための医薬的に許容される担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトースおよびソルビトールなどの炭水化物が挙げられる。調合物に使用するための他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣが挙げられる。天然または合成界面活性剤を使用することができる。（ペプチドの送達に関するこの使用とはさらに別に）ＰＥＧを使用することができる。シクロデキストランなどのデキストラン、胆汁酸塩、セルロースおよびセルロース誘導体も使用することができる。緩衝調合物などでアミノ酸を使用することもできる。

加えて、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接錯体、または他のタイプの担体が、考慮される。

ジェットタイプまたは超音波タイプ、いずれかのネブライザでの使用に適する調合物は、一般に、溶液１ミリリトル（ｍＬ）あたり生物活性薬約０．１から２５ミリグラム（ｍｇ）の濃度で水に溶解した本記載ペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドを含むであろう。この調合物は、（例えば、ペプチドの安定化および浸透圧の調節のために）緩衝液および単糖も含むことができる。ネブライザ用調合物は、エーロゾルを形成する際の溶液の霧化に起因する蛋白質の表面誘起凝集を低減または防止するために、界面活性剤を含有することもできる。

定量吸入装置で使用するための調合物は、界面活性剤を利用して噴射剤に懸濁させた本記載ペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドを含有する微粉を一般に含む。噴射剤は、この目的に利用されるあらゆる従来どおりの材料、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンもしくは炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む）またはこれらの組合せであり得る。適する界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタンおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸は、界面活性剤として有用であり得る。

粉末吸入装置から分散させるための調合物は、本記載ペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドを含有する乾燥微紛を含むであろう。また、前記装置からの前記微粉の分散を促進する量、例えばこの調合物の５０から９０重量％、でラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールなどの増量剤も含有することができる。

（経鼻送達形）
本ペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドの経鼻送達も考慮される。経鼻送達により、本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドを、この治療製品を鼻に投与後、この製品を肺に蓄積させる必要なく、直接血流に送ることができる。経鼻送達用の調合物には、デキストランまたはシクロデキストランを伴うものが挙げられる。他の粘膜を通した輸送による送達も考慮される。

（ポンプ送達）
本発明の一定の実施態様では、本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドの局所送達が、Ｂ１媒介疾患の治療または予防のために考慮されている。本発明によって考慮される局所送達の１つの方法は、薬剤が作用する局所部位での薬剤の注射である。

局所送達のためのもう１つの方法は、所望の身体部位に薬物を送るためにカテーテルを挿入し、ポンプを使用してこのカテーテルを通して薬物（複数を含む）を推し進めることを含む。体内に移植されたカテーテルとともに使用される体外装着型薬物ポンプは、当業者には公知である。

局所送達のためのさらにもう１つの方法には、植え込み型薬物送達装置が挙げられる。体外ポンプおよびカテーテルシステムを使用する技術の不利益に対処するために開発された植え込み型装置は、当業者には公知である。植え込み型薬物送達ポンプは、薬物を貯蔵するためのレザバー；新鮮な製剤を注入することができ、前記レザバーから定期的に古い薬物を除去することもできる注入口；および場合により、所望の部位に薬物を送達するためのカテーテルを具備する。好ましい植え込み型装置には、Ｄｕｒｏｓ ｉｍｐｌａｎｔ（カリフォルニア州、マウンテンビューのＡｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｓｙｎｃｈｒｏ Ｍｅｄ ＩまたはＩＩ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ミネアポリスのＭｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．）などが挙げられるが、これらに限定されない。

加えて（または）、本発明は、本明細書において上で先程述べた、および／または当業者には公知である、様々な緩速放出性もしくは徐放性調合物またはミクロ粒子調合物のいずれかにおいて使用するためのペプチドおよび／または接合ペプチドを提供する。

（用量）
投薬することができる本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドの有効用量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティおよび毒性などのパラメータを取り扱う当業者には周知の手順により決定することができる。好ましい実施態様において、有効用量範囲は、当業者には公知である常用のインビトロおよびインビボ試験からのデータを使用して、当業者により決定される。例えば、下の実施例６において説明する具体例としてのアッセイなどのインビトロ細胞培養アッセイは、当業者が、何らかの量のＢ１誘発活性を阻害するために必要な本ペプチドまたは接合ペプチドの平均阻害濃度（ＩＣ）または平均有効濃度（ＥＣ）（例えば、５０％、ＩＣ_５０；または９０％、ＩＣ_９０）を容易に決定することができるデータをもたらすであろう。次に、当業者は、所定のＩＣ値と等しい、またはそれ以上の本ペプチドの最少血漿中濃度（Ｃ_ｍｉｎ）が得られるように、１つまたはそれ以上の常用動物モデルからの薬物動態データ、例えば、下の実施例９において説明する具体例としての薬物動態データを使用して適切な用量を選択することができる。複雑な疾病または疾患を治療するための方法に関する投与計画は、治療薬の作用を修飾する様々な因子、例えば、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、治療する状態の重症度、投与回数、ならびに他の臨床因子を考慮して、掛かりつけの臨床医により決定されるであろう。一般に、一日あたりの投与計画は、体重のキログラム（ｋｇ）あたり、本ペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチド１．０から１００００マイクログラム（μｇ）、好ましくは体重のキログラムあたり１．０から１０００μｇ、最も好ましくは体重のキログラムあたり１．０から１５０μｇの範囲内であろう。

（併用療法）
もう一つの側面において、本発明は、本発明のペプチドおよび／または接合ペプチドの一定量ならびにＮＳＡＩＤの一定量を投与することを含む、疼痛および／もしくは炎症、またはＢ１活性化に随伴するあらゆる状態もしくは疾患を治療する（他の実施態様では、予防する）ための方法を含む。用語「ＮＳＡＩＤ」は、非ステロイド性抗炎症化合物を指す。ペプチド拮抗薬および／または接合ペプチド拮抗薬とＮＳＡＩＤの相対量および比率は、変化し得る。一部の実施態様では、同程度の疼痛または炎症を改善するために必要とされるＮＳＡＩＤの通常の用量を低減させるために充分なペプチド（複数を含む）および／または接合ペプチド（複数を含む）が投与されることとなる。一部の実施態様では、同程度の疼痛または炎症を改善するために必要とされるＮＳＡＩＤの通常の用量を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれ以上低減させるために充分なペプチド（複数を含む）および／または接合ペプチド（複数を含む）が投与されることとなる。この低減を所定の投与で投与される量、および／または所定の期間にわたって投与される量（頻度低減）に反映させることができる。

もう１つの側面において、本発明は、ＮＳＡＩＤの有効量と併用で本発明の少なくとも１つのペプチドおよび／または少なくとも１つの接合ペプチドの有効量を投与することを含む、ＮＳＡＩＤ疼痛または炎症治療を強化するための方法を提供する。ここで用いる「併用での投与」は、ＮＳＡＩＤならびに本発明のペプチドおよび／または接合ペプチドが、有効量で個体に投与されるあらゆる状況を包含するという意味も持つ。ここで用いる「併用での投与」は、同時投与および／または別の時点での投与を含む。併用での投与は、共共調合物（すなわち、本発明のペプチドおよび／または接合ペプチドならびにＮＳＡＩＤが、同じ組成物中に（併せて）存在する）としての投与、および／または別の組成物としての投与も包含する。本発明のペプチド（複数を含む）および／または接合ペプチド（複数を含む）ならびに少なくとも１つのＮＳＡＩＤを異なる投薬頻度および／または間隔で投与できることは、理解される。例えば、本発明の接合ペプチドは、週に１度投与してもよく、この一方でＮＳＡＩＤは、より頻繁に投与することができる。本発明のペプチド（複数を含む）および／または接合ペプチド（複数を含む）ならびにＮＳＡＩＤは、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与できること、ならびに異なる投薬計画が、投与（複数を含む）の経過につれて変化し得ることは、理解される。投与は、疼痛または炎症の発症前であってもよい。従って、もう１つの側面において、本発明は、個体における疼痛および／または炎症を治療する、個体における疼痛および／または炎症の発生率を低下させる、個体における疼痛および／または炎症の発現または進行を緩和および／または遅延させるための方法を提供し、前記方法は、本発明の少なくとも１つのペプチドおよび／または少なくとも１つの接合ペプチドの有効量を少なくとも１つのＮＳＡＩＤの有効量と併用で投与することを含む。こうした方法は、ＮＳＡＩＤの使用が一般に指示されている疼痛および／または炎症を含むあらゆる病因のあらゆる疼痛および／または炎症の治療または予防を含む。こうした方法は、Ｂ１活性化により媒介される、またはＢ１活性化に随伴すると、本明細書において上で先程述べた、または下で述べるあらゆる状態または疾患の治療または予防にも適する。一部の実施態様において、この疼痛および／または炎症は、手術後の痛みである。一部の実施態様において、この疼痛および／または炎症は、火傷または創傷に随伴する。他の実施態様において、この疼痛および／または炎症は、関節リウマチに随伴する。他の実施態様において、この疼痛および／または炎症は、変形性関節症に随伴する。他の実施態様において、この疼痛および／または炎症は、ヘルペス後神経痛に随伴する。一部の実施態様において、ＮＳＡＩＤは、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、ナプロシン、ジクロフェナク、ケトプロフェン、トルメチン、スリンダク、メフェナム酸、メクロフェナム酸、ジフルニサル、Ｒｕｆｅｎｉｓａｌ、ピロキシム、スドキシカム、イソキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ＤＵＰ−６９７、フロスリド、メロキシカム、６メトキシ−２ナフチル酢酸、ＭＫ−９６６、ナブメトン、ニメスリド、ＮＳ−３９８、ＳＣ−５７６６、ＳＣ５８２１５、Ｔ−６１４、またはこれらの組合せから成る群より選択される。

（実施例）
以下の実施例は、説明のためだけに提供するものであり、いかなる点においても本発明の制限と解釈されず、本発明の制限と見なすべきではない。本発明の精神または範囲を逸脱することなく、本明細書に開示する化合物を変更および変形できることは、当業者には理解されるであろう。本発明の化合物は、以下の方法のうちの１つまたはそれ以上に従って合成することができる。一般手順は、立体化学が特定されていない化合物の調製に関するがごとく示されていることに注意しなければならない。しかし、こうした手順は、一般に、特定の立体化学の化合物、例えばある基の立体化学が（Ｓ）または（Ｒ）である化合物、に適用可能である。加えて、一方の立体化学（例えば（Ｒ））を有する化合物は、公知の方法を用いて、例えば転位により、反対の立体化学（すなわち（Ｓ））を有するものを製造するために、多くの場合、利用することができる。

Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬およびＰＥＧ接合Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬の合成および精製。

本発明の様々なペプチドは、当該技術分野では周知の合成技術を使用して合成することができる。本発明の様々なペプチドの好ましい合成方法は、下で説明するようなカルボジイミド活性化を用いるＦＭＯＣ法を使用する。

パート１： カルボジイミド化学を使用する樹脂へのＦｍｏｃ−アミノ酸の溶解。

Ｆｍｏｃ−アミノ酸（３から４当量）を乾燥ＤＣＭ／ＮＭＰ混合物に溶解した（ＮＭＰまたはＤＭＦを使用して完全な溶解を助長した）。ＮＭＰ中のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、アミノ酸と同じ当量）の溶液をこのアミノ酸溶液に添加した。ＤＣＭ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ、アミノ酸と同じ当量）の溶液をこのアミノ酸溶液に添加した。この溶液を約２０分間混合した。次いで、この活性酸性溶液を樹脂に添加した（必要な場合には、添加前に沈殿を除去した）。樹脂がニンヒドリン試験により陰性になるまで、この反応物を攪拌した。カップリングが完了したら、樹脂を回収し、ＤＭＦで数回洗浄した。

パート２： ペプチド−樹脂からのＮ末端Ｆｍｏｃの除去。

Ｆｍｏｃ保護ペプチジル樹脂をピペリジン／ＤＭＦ（２／８）で３分間、処理した。樹脂を排液し、処理を１５分間、繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭで数回洗浄した。次の段階が、段階３で説明するような樹脂からのペプチドの切断を含む場合には、この樹脂を空気乾燥させた。

パート３： ＴＦＡ切断および脱保護。

パート２からの乾燥樹脂をフラスコに入れ、樹脂１ｇにつき１０から２５ｍＬの切断用カクテル（９５％ ＴＦＡ、２．５％ 水、１．５％ トリイソプロピルシラン、および１％ エタンジチオール）を添加した。この反応物を３から４時間、攪拌した後、減圧下での濾過によって樹脂を除去し、ＴＦＡで２回洗浄した。併せた濾液を減圧下での回転蒸発により〜２０％に濃縮した。この液を−５０℃に冷却し、１０倍量の冷乾燥エーテルで沈殿させた。沈殿を回収した。次に、このペプチドを、０．５％のＴＦＡを含有する水／アセトニトリル混合物に溶解し、凍結乾燥させた。この後、水中１０％アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡから水中５０％アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡの勾配でＣ１８ ＨＰＬＣを用いてこの粗生成物を精製した。１ｇの粗生成物について、２５０ｘ５０ｍｍ Ｃ１８カラムを、２１５および２５４ｎｍでの二重波長検出で、Ａｇｉｌｅｎｔ分取ＨＰＬＣにおいて９０ｍＬ／分の流量で用いた。注入物を分画し、各画分を質量分析法によって分析した。質量分析を基に試験管をプールし、減圧下で濃縮して、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、ペプチドＢ１拮抗薬を白色の粉末として得た。特性付けは、ＨＰＬＣ−ＭＳおよびＭａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析によって遂行した。

本発明の様々なＰＥＧ接合ペプチドは、次のように調製した。

異なるペプチジルリンカーをＮ末端に有し、各々、末端から二番目にシステイン基を有する、配列番号５から６０から成る群より選択される様々な活性ブラジキニンＢ１受容体拮抗薬（例えば、配列番号２７から４１）を、上述の方法を用いて合成した。これらのペプチド類似体を、例えば下で説明する方法Ａおよび方法Ｂを使用して、これらのペプチド類似体のＮ末端システインチオールへのマレイミド活性化ポリマーの部位特定カップリングにより、異なるサイズおよび配置のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で誘導化した。得られたＰＥＧ−ペプチド接合体は、インビトロおよびインビボバイオアッセイの前に、イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、凍結乾燥またはダイアフィルトレーションによって濃縮し、緩衝液に透析した。

方法Ａ：
システインを有するペプチドを、５０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中のＰＥＧ−マレイミドと、２．５から５ｍｇ／ｍＬ ペプチドで、および１．２倍モル過剰のマレイミド：チオールの反応化学量論比で反応させることによって、ＰＥＧ接合ペプチドを調製した。この反応物を室温（２０から２５℃）で１から１．５時間攪拌した。完了したら、１０倍モル過剰のβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）：マレイミドで反応を停止させ、さらに３０から６０分間、室温で攪拌させておいた。

反応の進行は、４．６ｘ２５０ｍｍ、５マイクロメートル Ｃ４カラム（メリーランド州、コロンビアのＧｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ；カタログ番号＃２１４ＴＰ５４）に５μＬの反応物を注入することにより、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してモニターした。未反応ペプチドおよびＰＥＧ−ペプチド接合体を、０．１％トリフルオロ酢酸中、５から９０％のアセトニトリルの線形勾配で溶離した。一般に、９０％より多くのペプチド類似体が、反応に消費される。

直鎖マレイミド活性化ＰＥＧポリマー（ＭＷ＝５ｋＤまたは２０ｋＤ、ＰＤ＝１．０１から１．０２）は、シアーウォーター株式会社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）または日本油脂株式会社（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（日本、東京）により供給された。

精製：
ＰＥＧ接合ペプチドは、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０％ＥｔＯＨ、ｐＨ４で予め平衡させておいてＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（Ａｍｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。充填前、反応混合物を２０％ ＥｔＯＨで１０倍に希釈し、氷酢酸でｐＨを３．５に調整した。これらの希釈反応混合物を、２．５ｍｇ／ｍＬのペプチド：樹脂比を超えないように、適切なサイズのカラムに充填した。

次に、カラムを２カラム量（ＣＶ）の１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０％ ＥｔＯＨ、ｐＨ４で洗浄し、１０から２０ＣＶにわたって１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０％ ＥｔＯＨ、ｐＨ４中、０から２００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配で溶離した。２５４ｎｍまたは２２０ｎｍ、いずれかでの吸収をモニターすることにより、未変性ペプチドおよびＰＥＧ−ペプチド接合体を検出した。これらの条件下、過剰なＰＥＧおよびβ−ＭＥは、結合せず流出する画分中に洗い出され、接合体は、〜５０ｍＭ ＮａＣｌから始まる広いピークで溶離され、遊離ペプチドは、〜２００ｍＭ ＮａＣｌでの溶離により充分に分離された。

溶離されたピーク画分は、ＲＰ−ＨＰＣＬによって評価し、均一性およびＰＥＧ接合ペプチドと一致する保持時間を基にプールした。プールした接合体ピーク画分を乾燥により濃縮し、この後、水で再構成し、緩衝液に透析した。また、ダイアフィルトレーションを用いて濃縮し、バッファと接合体を交換してもよい。

ＰＥＧ−ペプチド接合体の最終プールをＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、一般に、〜９８％接合体であった。接合体の組成および濃度は、アミノ酸分析、ペプチド配列決定および吸収分光分析の併用により決定した。

図式１の１ｃによって表される化合物の溶液安定性を、上で説明したＣＥＸ法を使用し、周囲温度、ｐＨ＝７．２リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中で経時的にモニターした（図１（Ａ））。化合物１ｃは、１ｄ、ならびにスクシンイミド部分の加水分解から生じた２つの産物への急速な転化を示した（ＩＲ、ＭＳ／ＭＳおよびＮＭＲ試験の併用により構造判定）。

方法Ｂ：
ｍＰＥＧ−マレイミド（１．０当量）を、攪拌機、温度プローブおよびＮ_２導入口を装備した三つ口丸底フラスコの中で、３０℃で、無水ＭｅＯＨに溶解した。ｍＰＥＧ−マレイミドが全部溶解したら、Ｎ末端システイン残基を有するペプチド（１．３当量）をこの透明な溶液に添加し、室温で３時間、攪拌した。逆相ＨＰＬＣは、ｍＰＥＧ−マレイミドの消失および初期３−スルファニル−スクシンイミド付加体の新たなピークを示す。次に、１０当量のジイソプロピル−エチルアミン（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃ Ｃｏｒｐ．）をこの溶液に添加し、２５℃で少なくとも２４時間、攪拌した。固定相としてＴＯＳＯＨＡＡＳ ＳＰ−５ＰＷ（２０μｍ）を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより、反応をモニターした。ＣＥＸ分析は、９８％を超える転化、１．５％未満の３−スルファニル−スクシンイミド付加体の残存を示した。ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）を添加（この反応に使用したメタノール量の二倍）し、得られた濁った溶液を室温で１時間、攪拌した。この白色の沈殿を濾過して除去し、真空下、室温で一晩乾燥させて、粗製６−メチル−カルバモイル−５−オキソ−チオモルホリン−３−カルボキサミド結合生成物（１ｄ）を得た。

精製：
上の粗生成物を、ＭｅＯＨ−Ｈ_２Ｏ−ＡｃＯＨ系を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ（固定相として、ｃ１８ ＹＭＣ ＯＤＳ ＮＱ）によって精製して、６−メチル−カルバモイル−５−オキソ−チオモルホリン−３−カルボキサミド結合生成物を、逆相クロマトグラフィー分析により純度＞９８％で得た。これらの純粋な画分を併せ、真空下で濃縮乾固し、得られた白色の残留物を、透明な溶液を得るために足る最少量の温ＭｅＯＨ（〜３０℃）に溶解し、この後、ＴＢＭＥ（使用したＭｅＯＨの量の二倍）で処理した。得られた濁った溶液を室温で１時間、攪拌し、沈殿を濾過して除去し、真空下、室温で少なくとも１６時間、乾燥させた。純粋な生成物（１ｄ）が、オフホワイトとして、全収率７４％、ＣＥＸおよびＲＰＣ純度＞９８％で得られる。接合体の組成およびペプチドの含有率は、アミノ酸分析、ペプチド配列決定、多核ＮＭＲ法および吸収分光分析の併用によって判定した。化合物１ｄの溶液安定性は、ｐＨ＝７リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中、周囲温度でモニターし、上で説明したＣＥＸ法を使用して経時的にモニターした。この化合物は、６日間にわたって注目される有意な変化がなく、有意に高く安定していることが判明した。

逆相（ＲＰ）およびカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー分析は、ダイオードアレーまたは可変波長検出器およびサーモスタット付きオートサンプラーを具備するＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで行った。標準クロマトグラフ条件を下に略述する：
１．ＲＰ−ＨＰＬＣ法条件
カラム： ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ、３μｍ、１２０Å、４．６ｘ１００ｍｍ
カラム温度： ４０℃
移動相： Ａ）水中、０．１％ＴＦＡ
Ｂ）ＭｅＯＨ中、０．１％ＴＦＡ
流量： １．１ｍＬ／分
勾配： 時間 ％Ｂ
０ ５
１０ ４０
３０ ９５
３５ ９５
３５．１ ５
４０ ５
検出： ２２０ｎｍでのＵＶ
注入量： サンプル濃度に依存して２０μＬまたは５０μＬ
サンプル濃度： ２．５から１０ｍｇ／ｍＬ
サンプル希釈剤： ダルベッコのＰＢＳ、および安定性試験において使用される他の緩衝液
２．一般的なカチオン交換クロマトグラフィー分析方法
カラム： ＴＯＳＯＨ、ＴＳＫ−ＧＥＬ、ＳＰ−５ＰＷ、１０μｍ、７．５ｘ７．５ｍｍ
カラム温度： ２５℃
移動相： Ａ）水／ＥｔＯＨ（８：２）、ｐＨ３．５中、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４
Ｂ）水／ＥｔＯＨ（８：２）、ｐＨ３．５中、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および０．５Ｍ ＮａＣｌ
流量： １．０ｍＬ／分
勾配： 時間 Ｂ％
０ ０
３ ０
２５ ４５
４０ １００
４５ １００
４５．１ ０
５０ ０
検出： ２２０ｎｍでのＵＶ
注入量： サンプル濃度に依存して１０から５０μＬ
サンプル濃度： ２．５から１０ｍｇ／ｍＬ
サンプル希釈剤： ダルベッコのＰＢＳ、および安定性試験において使用される他の緩衝液

ＰＥＧチオエステルを使用するＰＥＧ接合Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬の合成および精製。

システインを有するペプチドを、５０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７中のＰＥＧ−マレイミドと、２．５から５ｍｇ／ｍＬ ペプチドで、および１．２倍モル過剰のマレイミド：チオールの反応化学量論比で反応させることによって、ＰＥＧ接合ペプチドを調製した。この反応物を室温（２０から２５℃）で１８から２６時間攪拌した。完了したら、１０倍モル過剰のβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）：マレイミドで反応を停止させ、さらに３０から６０分間、室温で攪拌させておいた。これらの反応物を、上の実施例１の方法Ａについて説明したとおり精製した。

ＰＥＧチオエステルまたはヨードアセテートを使用するＰＥＧ接合Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬の合成および精製。

Ｎ末端システイン残基を有するペプチドを、５０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７中のＰＥＧ−ＯＰＴＥ（オルト−ピリジルチオエステル）と、２．５から５ｍｇ／ｍＬ ペプチドで、および１．２倍モル過剰の活性化ＰＥＧ：ペプチドの反応化学量論比で反応させることによって、ＰＥＧ接合ペプチドを調製した。この反応物を室温（２０から２５℃）で１８から２６時間攪拌した。完了したら、１０倍モル過剰のシステイン：過剰なＰＥＧ試薬で反応を停止させ、さらに３０から６０分間、室温で攪拌させておいた。これらの反応物を、上の実施例１の方法Ａについて説明したとおり精製した。

また、ＰＥＧ−ヨードアセトアミドを上で説明したように使用して、ＰＥＧ部分がチオエーテル結合により結合している接合体を形成することができる（図式３）。この場合、１．５モル当量の活性化ＰＥＧ反応物を使用し、反応時間を２４時間に増加し、１０モル当量のβ−メルカプトエタノールで反応を停止させ、上の実施例において説明したとおり精製する。

ＰＥＧプロピオンアルデヒドを使用するＰＥＧ接合Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬の合成および精製。

米国特許第５，８２４，７８４号（この特許は、この全文、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている方法を使用し、Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬、例えば、配列番号５から６０および２７から４１のうちのいずれか１つをＰＥＧで選択的にＮ末端変性することができる。例えば、配列番号６で示されるようなペプチド（２４５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を、１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および６０ｍＭ ＮａＣｎＢＨ_３を含有する１０ｍＬの溶液に溶解した。この混合物を攪拌しながら４℃に冷却し、２．３５ｇの２０Ｋ ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド（アラバマ州、ハンツヴィルのＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）で処理した。この混合物を３日間、攪拌し、この後、実施例１の方法Ｂにおいて説明したとおりＲＰおよびＣＥＸクロマトグラフィーによって精製した。

また、アミン反応性官能基を有するＰＥＧを、図式５に図示した方法に従って、部分保護Ｂ１ペプチド拮抗薬と反応させることができる。接合反応後、固相および溶液相ペプチド合成の技術分野の技術者には公知の方法を使用して、副鎖の保護基を切断し、得られたＰＥＧ−ペプチド構築物を上で説明したとおり精製する。多官能性ＰＥＧアルデヒド（反応性基３から６個）を過モル量の保護ペプチドと反応させて、位置化学的におよび化学量論的に定義されている様式で複数のペプチドが結合している多価ＰＥＧ構築物を得ることもできる。

ＰＥＧ Ｎヒドロキシ−スクシンイミドを使用するＰＥＧ接合Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬の合成および精製。

Ｂ１受容体ペプチド拮抗薬、例えば、配列番号５から６０のうちのいずれか１つを、図式５に図示した方法に従って部分保護Ｂ１ペプチド拮抗薬を使用して、特定のＮ末端または副鎖窒素原子で選択的にＰＥＧ化することができる。例えば、２．５ｍＬの無水ＤＭＦ中の部分的デカペプチド（１．４３ｇ、１．０２５ｍｍｏｌ）の溶液を、２５ｍＬのジクロロメタン中、３．５ｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ ＰＴＥ−２００ＧＳ（２０ｋＤ ４−アームのスクシンイミジルグルタレート；日本、東京の日本油脂株式会社（ＮＯＦ））および１．０ｍＬのジイソプロピルエチルアミンと併せた。得られた無色の溶液を室温で２日間、攪拌し、この後、減圧下で蒸発させた。得られた残留物を２５ｍＬの脱イオン水に溶解し、分画分子量１０，０００の透析膜（米国、イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ）内に配置した。化合物を２４時間、水に透析し（緩衝液交換３回）、この後、凍結乾燥させて、保護された四価ＰＥＧ生成物を得た。得られた白色の固体を６０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、２０ｍＬの無水ＴＦＡで処理した。室温で２日間、攪拌した後、この反応混合物を減圧下で蒸発させ、この後、上のとおり溶解し、透析した。透析された材料を凍結乾燥させ、この後、前に説明したようなイオン交換クロマトグラフィーによって精製して、四価生成物を白色の固体として得た。同様のやり方で、１から６個のスクシンイミジルグルタレート部分を有するＰＥＧを使用して、一または多官能性ペプチド構築物を調製した。

Ｂ１活性のペプチド ＰＥＧ接合ペプチド拮抗薬のインビトロＢ１阻害活性
Ｂ２活性と比較してＢ１活性を選択的に阻害することができるペプチドおよび／または接合ペプチドを、下のセクションＡ、ＢおよびＣにおいて説明するものなどのアッセイを使用して特定した。

Ａ．カルシウムフラックスを使用するヒトＢ１受容体機能のインビトロアッセイ：
Ｇ_ｑ結合Ｂ１受容体の活性化により、細胞内カルシウムの増加が生じる。故に、カルシウム感受性発光蛋白質エクオリンをＢ１受容体活性化の指示薬として使用することができる。エクオリンは、発色団補因子セレンテラジンに結合すると生物発光複合体を形成する２１ｋＤａ発光蛋白質である。この複合体にカルシウムが結合すると、セレンテラジンの酸化反応により、アポエクオリン、セレンテラミド、ＣＯ_２、および従来どおりの発光測定により検出することができる光が生じる。

安定なＣＨＯ Ｄ−／ヒトＢ１受容体（ゲンバンクアクセッション番号ＡＪ２３８０４４）／エクオリン細胞系統を樹立し、比率１：１のＤＭＥＭとＨＡＭのＦ１２（Ｇｉｂｃｏ １１７６５−０４７）、ハイグルコース（Ｇｉｂｃｏ １１９６５−０８４）、１０％熱不活性化透析血清（Ｇｉｂｃｏ ２６３００−０６１）、１Ｘ 非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ １１１４０−０５０）、１Ｘ グルタミン−Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ １０３７８−０１６）およびヒグロマイシン、３００μｇ／ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ ８４３５５５）を含有するスピンナー瓶内の懸濁液中で維持した。照度計アッセイの１５から２４時間前、９６ウエル黒壁透明底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３９０４）に細胞数２５，０００／ウエル（細胞数２．５Ｅ６／１０ｍＬ／プレート）でプレーティングする。

ウエルから培地を除去し、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および１５μＭ セレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ ｈ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ＃９０６０８；Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ（ミシガン州、アナーバー））を含有する６０μＬの無血清ＨＡＭのＦ１２で置換する。次いで、これらのプレートを１．５から２時間、インキュベートする。拮抗薬化合物の１：３または１：５希釈物が入った１０点ＩＣ_５０化合物プレートおよび作動薬アクチベータプレート（２０ｎＭ ｄｅｓ−Ａｒｇ１０−Ｋａｌｌｉｄｉｎ 最終濃度、ＥＣ_８０）を、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含有するＨａｍのＦ１２を使用して調製する。セレンテラジンのインキュベーション後、自動フラッシュ−照度計プラットフォームを使用して、Ｂ１拮抗薬化合物を細胞プレートに分配し、細胞プレートの下にあるＣＣＤカメラにより５秒間隔で１２枚の細胞プレートの画像を撮影して、化合物に伴う何らかの作動薬活性があるかを判定する。次に、ｈＢ１作動薬、ｄｅｓ−Ａｒｇ_１０−Ｋａｌｌｉｄｉｎ、を細胞プレートに添加し、さらに１２枚の画像を記録して、拮抗薬（複数）のＩＣ_５０を決定する。

Ｂ．カルシウムフラックスを使用するｈＢ２受容体機能のインビトロアッセイ：
ｈＢ２受容体活性化により誘導される細胞内カルシウムフラックスを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（マサチューセッツ州、ウェズリー）から購入したｈＢ２組変え細胞系統（ＣＨＯ−Ｋ１）（カタログ番号：ＲＢＨＢ２Ｃ０００ＥＡ）を使用し、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）で分析する。ＨａｍのＦ１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．；カタログ番号：１１７６５−０４７）、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ ＩＩ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ユタ州、ローガンのＨｙＣｌｏｎｅ；カタログ番号：ＳＨ３００６６０３）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ 原液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号：１２４５４−０１３）および０．４ｍｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８；５０ｍｇ／ｍＬ 活性ジェネティシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１０１３１−２０７）が入っているＴ２２５フラスコの中で細胞を培養する。培地は、１日おきに交換する。ＦＬＩＰＲアッセイの２４時間前、ｈＢ２／ＣＨＯ細胞をＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄し、１０ｍＬのＶｅｒｓｅｎｅ（１：５０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１５０４０−０６６）を各フラスコに添加する。３７℃で５分インキュベートした後、Ｖｅｒｓｅｎｅを除去し、細胞をフラスコから引き離し、培地に再び浮遊させる。細胞をカウントし、細胞２５，０００個／ウエルを９６ウエル黒壁透明底アッセイプレート（マサチューセッツ州、アクトンのＣｏｓｔａｒ；カタログ番号：３９０４）にプレーティングする。細胞を３７℃ ＣＯ_２インキュベータの中で一晩、インキュベートする。

細胞から培地を吸出し、６５μＬの色素負荷緩衝液で置換する。この負荷緩衝液は、１０％［ｗ／ｖ］プルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含有するＤＭＳＯに溶解した０．５ｍＭ Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ（オレゴン州、ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の原液を、０．１％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２．５Ｍ プロベネシド（プロベネシドは、アニオン輸送蛋白質の活性を阻害し、従って、細胞における色素負荷を増進する）を含有する透明ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１μＭの濃度に希釈することにより調製する。細胞を１時間、室温で、色素負荷する。アッセイ緩衝液で細胞を２回洗浄することにより、過剰な染料を除去する。このアッセイ緩衝液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡおよび２．５ｍＭ プロベネシドを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）から成る。これらの洗浄サイクルの後、各ウエルに１００μＬ量を残し、プレートをＦＬＩＰＲ Ｓｙｓｔｅｍでアッセイするために準備する。アッセイ緩衝液を使用して、拮抗薬化合物の１：３または１：５希釈物が入っている単点（最終濃度１０μＭ）ＰＯＣ拮抗薬化合物プレートまたは１０点ＩＣ_５０化合物プレート、および作動薬アクチベータプレート（ブラジキニン最終濃度０．３ｎＭ、ＥＣ_８０）を作製する。細胞プレートおよび化合物プレートをＦＬＩＰＲに装填し、アッセイ中、細胞プレートの９６すべてのウエルから同時に蛍光読み取り値を取る。１秒読み取り値を１０取って、ウエルごとに安定なベースラインを確立し、この後、Ｂ１拮抗薬プレートからの２５μＬを迅速に（５０μＬ／秒）添加する。蛍光シグナルを１秒間隔（１分）、この後、６秒間隔（２分）で合計３分間測定して、化合物に伴う何らかの作動薬活性があるかを判定する。次いで、Ｂ２作動薬、ブラジキニンを細胞プレートに添加し、さらに３分間、記録を取って、１０μＭでの阻害率（ＰＯＣプレート）または拮抗薬のＩＣ_５０を決定する。

ｈＢ１エクオリンアッセイで検定したビヒクル−またはＰＥＧ−接合ペプチドについてのＩＣ_５０値は、平均して、大きなＰＥＧポリマーに接合しているペプチドに付与されるインビトロ活性のほうがわずかに低かった。例えば、配列番号３６によって表されるペプチドおよび配列番号３７によって表されるこのアセチル化形は、ｈＢ１受容体で、それぞれ、３．０ｎＭ（＋／−５ｎＭ、ｎ＝８）および３．２ｎＭ（＋／−３．２ｎＭ、ｎ＝９）のＩＣ_５０という結果になった。しかし、本明細書において説明するとおりＰＥＧに接合させた同ペプチドは、約１０倍のＩＣ_５０の増加を示した。ペプチドの天然形、アセチル化形およびＰＥＧ接合形は、ｈＢ２ ＦＬＩＰＲアッセイでは、１０μＭまで不活性であった。ｈＢ１受容体、ｈＢ２受容体、いずれにおいても作動薬活性を示した化合物はなかった。

Ｃ．ｈＢ１受容体結合ペプチドの組織ベースのインビトロアッセイ：
本発明のペプチドおよび／またはビヒクル接合ペプチドのブラジキニンＢ１受容体に対する拮抗薬活性および選択性を、下で説明するインビトロヒト臍静脈（ＨＵＶ）収縮性アッセイで判定した：
酸素処理（９５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２）し、予め温めておいた（３７℃）、次の組成（単位ｍＭ）：ＮａＣｌ １１８．０、ＫＣｌ ４．７、ＭｇＳＯ_４ １．２、ＣａＣｌ_２ ２．５、ＫＨ_２ＰＯ_４ １．２、ＮａＨＣＯ_３ ２５．０およびグルコース１１．０（ｐＨ７．４）、の標準生理食塩液が入っている２０ｍＬ器官槽に、内皮剥脱血管を懸濁させた。高Ｋ＋溶液（８０ｍＭ ＫＣｌ）を、ＫＣｌでのＮａＣｌの等モル置換により調製した。Ｂ２受容体を阻害するため、およびペプチドの分解を防止するために、Ｈｏｅ １４０（１μＭ）、ｍｅｒｇｅｔｐａ（１μＭ）およびカプトプリル（１０μＭ）も、それぞれ、本実験を通して存在した。等尺張力記録のために力変換機に組織を接続し、この後、最適な静止張力のもとで充分な時間、平衡させた。実験は、各々８つの器官槽を有する半自動器官単離システムを使用し、多チャンネルデータ収集で行った。組織を先ず高Ｋ＋溶液（８０ｍＭ ＫＣｌ）に暴露して、対照濃度を得た。洗浄および続く６０分の平衡期間の後、様々な濃度の試験化合物またはレファレンス拮抗薬Ｌｙｓ−ｄｅｓＡｒｇ９［Ｌｅｕ８］−ＢＫが不在の状態（対照試料）または存在する状態（試験試料；Ｌｙｓ−ＤｅｓＡｒｇ９−ＢＫに暴露する１５分前に添加）で、組織を累積漸増濃度のレファレンス作動薬Ｌｙｓ−ＤｅｓＡｒｇ９−ＢＫに暴露して、濃度−反応曲線を得た。各試料におけるＬｙｓ−ＤｅｓＡｒｇ９−ＢＫに対する濃度−反応曲線を作成した。

測定したパラメータは、各作動薬濃度により誘導された張力の最大変化であり、結果をＫＣｌへの対照の反応に対するパーセントとして表した。作動薬のＥＣ_５０値（最大反応の半分を誘導する濃度）をこの濃度−反応曲線の線形回帰分析により計算した。試験化合物およびＬｙｓ−ｄｅｓＡｒｇ９［Ｌｅｕ８］−ＢＫの拮抗薬効力をｐＡ２値（作動薬濃度−反応曲線を二倍右方向にシフトさせる−ｌｏｇ濃度）に関して評価した。これらのｐＡ２値は、Ｖａｎ Ｒｏｓｓｕｍ（Ｖａｎ Ｒｏｓｓｕｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅｓ．ＩＩ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．，１４３：２９９−３３０（１９６３））に従って計算した。ｐＡ２値は、作動薬濃度−反応曲線の有意な右方向シフトを生じさせる拮抗薬濃度のみを用いて計算した。ｐＡ２値は、３回の測定の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として与える。差の統計学的有意性は、スチューデントｔ検定を使用して決定し、ｐ値＜０．０５は、統計的に有意とみなした。

Ｄ．ペプチドおよび／または接合ペプチドのインビトロＢ１阻害活性
背根神経節（ＤＲＧ）ニューロン培養物において各ペプチドおよび／または接合ペプチドがＢ１刺激ＣＧＲＰおよび物質Ｐ放出ならびにカルシウムシグナリングを阻害する能力を測定することにより、Ｂ１活性の阻害剤としての本ペプチドおよび／または接合ペプチドの有効性（すなわち、Ｂ１「中和」）も評価した。

背根神経節ニューロン培養物。
背根神経節は、妊娠時の終末麻酔したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（マサチューセッツ州、ウィルミントンのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の子宮部から外科手術により取り出した胎齢１９日（Ｅ１９）のラットの全脊髄分節から、無菌条件下で１つ１つ切開する。ＤＲＧを、５％熱不活性化ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含有する氷冷Ｌ−１５培地（ニューヨーク州、グランドアイランドのＧｉｂｃｏＢＲＬ）に回収し、一切の疎性結合組織および血管を除去する。このＤＲＧをＣａ^２＋およびＭｇ^２＋非含有ダルベッコリン酸緩衝食塩液（ＤＰＢＳ）、ｐＨ７．４（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で２回すすぐ。この後、パパイン解離系（ニュージャージー州、フリーホールドのＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）を使用して単個細胞浮遊液に解離する。簡単に言うと、３７℃で、５０分間、アール平衡食塩水（ＥＢＳＳ）中、２０Ｕ／ｍＬのパパインを含有する消化溶液中でＤＲＧをインキュベートする。ＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２（１：１）、１ｍｇ／ｍＬ オボムコイド阻害剤および１ｍｇ／ｍＬ オボアルブミン、ならびに０．００５％デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼ）から成る解離培地中で精密研磨パスツールピペットにより磨砕することにより、細胞を解離させる。解離した細胞を２００ｘｇで５分間、ペレッティングし、１ｍｇ／ｍＬオボムコイド阻害剤、１ｍｇ／ｍＬオボアルブミンおよび０．００５％ＤＮアーゼを含有するＥＢＳＳに再び浮遊させる。１０ｍｇ／ｍＬオボムコイド阻害剤、１０ｍｇ／ｍＬオボアルブミンを含有する勾配溶液により２００ｘｇで６分間、細胞浮遊液を遠心分離して、細胞破壊片を除去し、次いで、８８−μｍナイロンメッシュ（ペンシルバニア州、ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により濾過して、一切の凝集塊を除去する。細胞数を血球計数器で測定し、細胞を、ポリ−オルニチン １００μｇ／ｍＬ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）およびマウスラミニン １μｇ／ｍＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を塗布した９６ウエルプレートに、完全培地中、細胞数１０ｘ１０^３／ウエルで接種する。この完全培地は、最少必須培地（ＭＥＭ）とＨａｍのＦ１２（１：１）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）および１００％熱不活性化ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）から成る。これらの培養物を３７℃、ＣＯ_２ ５％および湿度１００％で保持する。非ニューロン細胞の成長を制御するために、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（７５μＭ）およびウリジン（１８０μＭ）を培地中でインキュベートする。

Ｂ１および抗Ｂ１ペプチドならびに／または抗Ｂ１接合ペプチドでの処理。
プレーティングの２時間後、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬの濃度（０．３８ｎＭ）の組換えヒトβ−Ｂ１または組換えラットβ−Ｂ１で処理する。系列希釈した抗Ｂ１抗体（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む正の対照を各培養プレートに適用する。試験ペプチドまたは試験接合ペプチド（例えば、実施例１からのもの）を、３．１６倍系列希釈を用いて１０の濃度で添加する。すべてのサンプルは、培養物に添加する前に完全培地で希釈する。インキュベーション時間は、一般に、ＶＲ１発現測定前の約４０時間である。

ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１発現の測定。
細胞をハンクス平衡塩類溶液中の４％ｐ−ホルムアルデヒドで１５分間、固定し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ）でブロックし、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）緩衝食塩液（ＴＢＳ）中の０．２５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）で１時間、室温で透過性化する。培養物を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＢＳで１回すすぎ、ウサギ抗ＶＲ１ ＩｇＧ（Ａｍｇｅｎで調製されたもの）とともに１時間半、室温でインキュベートし、この後、Ｅｕ標識抗ウサギ第二抗体（フィンランド、トゥルクのＷａｌｌａｃ Ｏｙ）とともに１時間、室温でインキュベートする。各抗体インキュベーション後にＴＢＳでの洗浄（ゆっくりと振盪しながら５分間 ｘ３）を適用する。Ｅｎｈａｎｃｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１５０μＬ／ウエル、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）を培養物に添加する。この後、時間分解蛍光光度計（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）で蛍光シグナルを測定する。ビヒクル接合ペプチドで処理したサンプルにおけるＶＲ１発現を、０から１０００ｎｇ／ｍＬのＢ１滴定の標準曲線との比較により判定する。ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１発現に対するＢ１作用の阻害率（最大可能阻害と比較したもの）を、Ｂ１処理していない対照との比較により決定する。

各ＰＥＧ接合ペプチドＢ１拮抗薬についての受容体結合および機能活性の減損は、付加したＰＥＧ基のサイズに直接関連し、〜５から２００倍の効力低下におよんだ。〜５から７個の残基のポリグリシンリンカーは、機能活性の保存に充分役立つが、より長いリンカーは、殆ど改善をしめさなかった（「可撓性リンカー」）か、活性を低下させることが判明した（「剛性リンカー」）。最後に、表８は、様々な異なるＰＥＧ接合ペプチドＢ１拮抗薬でのこの応用の幅を説明するものである。

ペプチドおよび／または接合ペプチドの安定性の判定

Ａ．ラット腎臓刷子縁微小絨毛アッセイ
Ｂｏｏｔｈら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１４２：５７５（１９７４））が記載した手順に従って、腎膜を準備する。蛋白質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，７２：２４８−２５４（１９７６））の方法によって決定する。

Ｂ．ラットまたはヒト肺Ｓ９ホモジネートアッセイ
ラットまたは人間の肺は、Ｓｋｉｄｇｅｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３３：３４７１（１９８４））が記載したとおり準備する。

試験化合物は、ＰＢＳ溶液（ｐＨ＝７．１）中、１ｍＭ濃度で調製する。試験化合物を手順ＡまたはＢからの組織の試料に添加し（２ｍｇ／ｍＬの最終蛋白質濃度）、３７℃でインキュベートする。様々な時点で、蛋白質を、アセトニトリル、アセトニトリル中０．１Ｍ ＨＣｌ、または水中１０％ＴＦＡで沈殿させる。沈殿を遠心分離により除去し、濾液を０．１μＭ膜によりさらに濾過する。この後、サンプルを、逆相ＨＰＬＣ（４．６ｘ３００ｍｍ Ｎｏｖａｐａｋ ＨＲ Ｃ１８（マサチューセッツ州、ミルフォードのＭａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）流量＝１ｍＬ／分、２０分にわたる１０％ＡＣＮ（０．１％ギ酸）−９０％水（０．１％ギ酸）から５０％ＡＣＮ（０．１％ギ酸）−５０％水（０．１％ギ酸）への直線勾配）により、質量分光検出で分析する。内部標準に対する時間Ｔでの試験化合物の濃度を一次損失関数（［化合物］_ｔ＝［化合物］_０（１−ｅ^{（−ｋｔ）}；「［化合物］０」および「［化合物］ｔ」は、それぞれ、ゼロ時における試験化合物の濃度およびサンプル抜き取り時点での試験化合物の濃度であり、可変項「ｔ」は、分析のためにサンプルを抜き取った時間であり、ｋは、試験化合物濃度の変化率である）に当てはめる。可変項「ｋ」は、ＪＭＰ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅにより供給される非線形回帰アプローチを使用して決定する。化合物濃度が経時的に低下することから、「ｋ」の値は負である。半減期は、次の式： Ｔ^１／２＝（Ｌｎ ２）／ｋ を使用して、「ｋ」のモデル導出値から計算する。

ラットおよびサル疼痛モデルにおける抗Ｂ１ペプチドおよびビヒクル接合抗Ｂ１ペプチドのインビボ抗侵害受容活性

Ａ．ラット神経因性疼痛モデル
雄Ｓｐａｒｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００ｇ）をイソフルラン吸入麻酔法で麻酔し、Ｌ５およびＬ６レベルの左腰脊髄神経を、ＫｉｍおよびＣｈａｎｇが最初に説明した（Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｓｐｉｎａｌ ｎｅｒｖｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．Ｐａｉｎ ５０：３５５−３６３，（１９９２））とおり、背根神経節に対して遠位、坐骨神経への入口より前で緊密に結紮する（４−０絹糸縫合糸）。切開部を閉じ、ラットを回復させる。金網観察用ケージにより足の足底間隙（足蹠と足蹠の間）に垂直にかける段階的刺激（４．０から１４８．１ｍＮの範囲にわたる、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント）からこの罹患した足（神経損傷側と同じ側）を引っ込めた時点の圧力を記録することにより評価すると、この処置により、機械的（触覚）異痛が左後ろ足に生じる。足引込め閾値（ＰＷＴ）は、刺激強度を順次増加および低下させ、Ｃｈａｐｌａｎ，Ｓ．Ｒ．らが記載している（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｃｔｉｌｅ ａｌｌｏｄｙｎｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｐａｗ． Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ，５３：５５−６３（１９９４））ようなＤｉｘｏｎノンパラメトリック検定を用いて引っ込めデータを分析することにより、決定した。

正常なラットおよび擬似手術ラット（神経を単離したが、結紮していないもの）は、反応なしに少なくとも１４８．１ｍＮ（１５ｇと等価）の圧力に耐える。脊髄神経結紮ラットは、この罹患した足への４．０ｍＮ（０．４１ｇと等価）ほどのわずかな圧力に対して反応する。ラットは、運動機能不全（例えば、足のひきずりまたは落下）を示さず、ＰＷＴが３９．２ｍＮ（４．０ｇと等価）未満であった場合のみ、試験に含めた。手術後少なくとも７日のラットを、皮下注射により試験ペプチドもしくは試験ビヒクル接合ペプチド（通常、それぞれ、約１ｍｇ／ｋｇおよび約６０ｍｇ／ｋｇのスクリーニング用量）または対照希釈剤（ＰＢＳ）で１回、治療し、ＰＷＴを、この後７日間、毎日、測定した。

Ｂ．ラットＣＦＡ炎症性疼痛モデル
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００ｇ）をイソフルラン吸入麻酔法により軽度に麻酔し、この左後ろ足に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、０．１５ｍＬを注射する。金網観察用ケージにより足の足底間隙（足蹠と足蹠の間）に垂直にかける段階的刺激（４．０から１４８．１ ｍＮの範囲にわたる、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント）からこの罹患した足を引っ込める圧力を記録することにより評価すると、この処置により、機械的（触覚）異痛がこの左後ろ足に生じる。ＰＷＴは、刺激強度を順次増加および低下させ、Ｃｈａｐｌａｎらが記載している（１９９４）ようなＤｉｘｏｎノンパラメトリック検定を用いて引っ込めデータを分析することにより、決定する。ラットは、運動機能不全（例えば、足のひきずりまたは落下）または皮膚欠損を示さず、ＰＷＴが３９．２ｍＮ（４．０ｇと等価）未満である場合のみ、試験に含める。ＣＦＡ注射後少なくとも７日のラットを、皮下注射により試験ペプチドおよび／もしくは試験ビヒクル接合ペプチド（通常、６０ｍｇ／ｋｇのスクリーニング用量）または対照溶液（ＰＢＳ）で１回、治療し、ＰＷＴを、この後７日間、毎日、測定する。次の式： ％ＭＰＥ＝１００^＊（治療ラットのＰＷＴ−対照ラットのＰＷＴ）／（１５−対照ラットのＰＷＴ）を用いて、平均足引込め閾値（ＰＷＴ）を最大可能効果率（％ＭＰＥ）に変換した。従って、１５ｇ（１４８．１ｍＮ）のカットオフ値は、１００％のＭＰＥと等価であり、対照反応は、０％ ＭＰＥと等価である。

本発明の好ましいペプチドおよびビヒクル接合ペプチドは、それぞれ、約１ｍｇ／ｋｇおよび約６０ｍｇ／ｋｇのスリーニング用量でのＰＤ関係での抗侵害受容作用を生じさせることが予想される。

Ｂ．ミドリザルＬＰＳ炎症モデル
Ｂ１活性の阻害剤としてのペプチドおよび／または接合ペプチドの有効性は、本質的にはｄｅＢｌｏｉｓおよびＨｏｒｌｉｃｋが記載している（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．１３２：３２７−３３５（２００２）；これは、本明細書に参照により組み込まれている）とおり、Ｂ１作動薬で局所的に攻撃した雄ミドリザル（セントキッツ・サバンナザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈａｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ Ｓｔ Ｋｉｔｔｓ））で評価することができる。

本発明のＰＥＧ接合ペプチド拮抗薬がＢ１誘発浮腫を抑制するかどうかを判定するために、雄ミドリザル（セントキッツ・サバンナザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈａｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ Ｓｔ Ｋｉｔｔｓ））を用い、Ｃａｒｉｂｂｅａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ Ｌｔｄ．の実験農場（西インド諸島、セントキッツ）で、下に説明する試験を行った。手順は、ｔｈｅ ＣＲ−ＣＨＵＭ（カナダ、モントリオール）およびＣａｒｉｂｂｅａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ Ｌｔｓ．（西インド諸島、セントキッツ）の動物管理委員会により再考され、受諾された。体重６．０±０．５ｋｇの動物（ｎ＝６７）を麻酔（５０ｍｇケタミン ｋｇ^−１）し、伏在静脈経由でのＬＰＳ（９０μｇ・ｋｇ^−１）または食塩水（１ｍＬ）の静脈内注射１回で前処置をした。

１．炎症試験
キニン誘発浮腫を、腹部皮下脂肪アッセイ（ｖｅｎｔｒａｌ ｓｋｉｎ ｈｏｌｄ ａｓｓａｙ）（Ｓｃｉｂｅｒｒａｓら，１９８７）により評価した。簡単に言うと、麻酔したサルにカプトプリル（アッセイの３０分前に１ｍｇ・ｋｇ^−１）を注射した。ｄＫＤ、ＢＫまたはビヒクル（１００μＬのリンガーズ・ラクテート中の２ｍＭ アマスタチン）の皮下注射１回を腹部に施し、較正したノギスを使用して皮下脂肪厚の増加を３０から４５分間モニターした。結果は、皮下注射前の皮下脂肪厚と皮下注射後の皮下脂肪厚の差として表した。カプトプリルおよびアマスタチンを使用して、カルボキシル末端およびアミノ末端、それぞれにおけるキニンの分解を減少させた。

拮抗薬シルド（ＳＣＨＩＬＤ）解析
ｄＫＤ（１から１００ｎｍｏｌ）誘発浮腫についての用量−反応関係を、異なる濃度のＰＥＧ−ペプチド拮抗薬が不在の状態または存在する状態で、ＬＰＳの２４時間後に判定した。ＢＫ（３０ｎｍｍｏｌ）を正の対照として使用した。

拮抗薬時間経過
１回のボーラス投与の後、４、２４、４８、７２および／または９６時間の時点で、拮抗薬による阻害の時間経過を判定した。ＢＫ（３０ｎｍｏｌ）を正の対照として使用した。

薬物
塩酸ケタミン、ＬＰＳ、アマスタチンおよびカプトプリルは、Ｓｉｇｍａ（米国、ミズーリ州）からのものであった。すべてのペプチドは、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（米国、カリフォルニア州）からのものであった。

統計
値は、平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍｅａｎ）として提示する。浮腫試験における注射前皮下脂肪厚を皮下攻撃後の値から引いた。アップル・コンピュータ用のＤｅｌｔａ Ｇｒａｐｈ ４．０ソフトウェアを使用して、曲線近似値およびＥＣ_５０計算値を得た。ボンフェローニ補正法を用い、二元配置分析、この後、対応のない片側スチューデントｔ検定によりデータを比較した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意と見なした。

ミドリザルへのＬＰＳ投与は、浮腫形成アッセイにおいて、Ｂ_１受容体作動薬に対するこれらの感受性をゼロレベルから上昇させた。比較として、Ｂ_２受容体作動薬ＢＫに対する反応には、影響を及ぼさなかった。

驚くべきことに、代表５ｋＤ ＰＥＧ接合ペプチドおよび同ペプチド類似体の２０ｋＤ ＰＥＧ接合ペプチドの１０ｍｇ／ｋｇでの１回の皮下投薬は、既に定着したＢ１作動薬誘発炎症応答を緩和するために、ならびに３日間および４日間、継続する毎日の作動薬攻撃を抑制するために、それぞれ充分であった。Ｂ１攻撃で９６時間までにタキフィラキシーは観察されなかった。Ｂ２ではなくＢ１において選択的である作用も判定した。さらに、１．２５時間までは両分子について急速な発症および効能は、同等であったが、５Ｋ ＰＥＧ接合ペプチドは、非接合ペプチド（すなわち、天然ペプチド）よりも長くｄＫＤ攻撃に応じた浮腫を抑制した

ラット薬物動態試験

様々なペプチドまたは接合ペプチド（水性媒体中）をボーラスとして静脈内（ｉｖ）または皮下（ｓｃ）経路により雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに投薬した。血液サンプルを様々な時点（例えば、注射後、０、１５、３０分ならびに／または１、２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、６０、７２、８４、９６、１２０、２４０および／もしくは３２０時間）でヘパリン処理試験管に回収した。遠心分離によりペレット化した細胞から血漿を除去し、冷凍するか、直ちに処理した。血漿中の対象化合物を分析物特異的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＥＬＩＳＡ法により定量した。クリアランス（ＣＬ）、見掛けのクリアランス（ＣＬ／Ｆ）、分布容量（Ｖｓｓ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、および終末半減期（ｔ_１／２）などの様々な標準薬物動態パラメータを非分画（ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ）法により計算した（例えば、表９参照）。

上で説明した本発明に様々な変更を施すことができることは、理解されるであろう。従って、本発明の範囲は、後続の特許請求の範囲において定義する。

Claims (3)

1. 配列番号１５、４９および５０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬、またはこれらの生理学的に許容される塩。
2. 配列番号１５のアミノ酸配列を含むブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬、またはこの生理学的に許容される塩。
3. 配列番号１５のアミノ酸配列を含むブラジキニンＢ１受容体のペプチド拮抗薬および少なくとも一つの医薬的に許容される希釈剤、賦形剤または担体を含む医薬組成物。