MXPA06004462A - Antagonistas del receptor b1 de bradiquinina - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a ciertos péptidos y péptidos conjugados biológicamente activos, los cuales pueden ser usados como terapéuticos o profilácticos contra enfermedades o condiciones ligadas a B1 como el agente causativo. En una modalidad preferida de la invención, se proporcionan péptidos PEG-conjugados biológicamente activos. En un aspecto de la presente invención, péptidos PEG-conjugados farmacológicamente activos de la presente invención, sonútiles para tratar dolor o inflamación.

Description

ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR Bl DE BRADIQUININA CAMPO DE LA INVENCIÓN Más de dos millones de personas en los Estados Unidos solamente son incapacitadas por dolor crónico en cualquier día dado (T. M. Jessell & D. D. Kelly, Pain and Analgesia in PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, tercera edición (E. R. Kandel, J. H. Schwartz, T. M. Jessell, ed. , (1991)).

Desafortunadamente, los tratamientos actuales para el dolor son únicamente parcialmente efectivos, y muchos también ocasionan alteración del estilo de vida, debilitamiento y/o efectos colaterales peligrosos. Por ejemplo, los fármacos anti-inflamatorios no esteroidales ("NSAID") , tales como aspirina, ibuprofeno e indometacina, son moderadamente efectivos contra el dolor inflamatorio, pero también son renalmente tóxicos, y dosis elevadas tienden a ocasionar irritación gastrointestinal, ulceración, sangrado, riesgo cardiovascular incrementado y confusión. Pacientes tratados con opioides, frecuentemente experimentan confusión y constipación, y el uso prolongado de opioide está asociado con la tolerancia y dependencia. Los anestésicos locales tales como lidocaína y mixelitina, inhiben simultáneamente el dolor y ocasionan pérdida de sensación normal. Además, cuando se usan, anestésicos sistémicamente locales están asociados con efectos cardiovasculares adversos. Así, existe REF. : 172470 actualmente una necesidad no cubierta en el tratamiento de dolor crónico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5 • El dolor es una percepción basada en señales recibidas del medio ambiente y transmitidas e interpretadas por el sistema nervioso (para revisión, véase Millan, M. J. , The induction of pain: an integrative review. Prog Neurobiol 57:1-164 (1999)). El estímulo nocivo tal como calor y tacto ocasionan que receptores sensoriales especializados en la piel envíen señales al sistema nervioso central ("SNC") . Este proceso es llamado nocicepción, y las neuronas sensoriales periféricas que lo median son nociceptoras . Dependiendo de la intensidad de la señal a partir del (los) nociceptor (es) y la abstracción y elaboración de tal señal por el CNS, una persona puede o no puede experimentar un estímulo nocivo doloroso. Cuando la percepción del dolor es apropiadamente regulada a la intensidad el estímulo, el dolor sirve su ' función protectora propuesta. Sin embargo, ciertos tipos de . tejidos dañados causan un fenómeno, conocido como hiperalgesia o pronocicepción, en el cual, estímulos relativamente inocuos son percibidos como intensivamente dolorosos debido a que el umbral del dolor de la persona ha sido disminuido. Tanto la inflamación como daño nervioso 5 pueden inducir hiperalgesia. Así, personas afligidas con condiciones inflamatorias, tales como quemaduras, osteoatritis, colitis, carditis, dermatitis, miositis, neuritis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedades vasculares del colágeno (las cuales incluyen artritis reumatoide y lupus) y similares, a menudo experimentan sensaciones incrementadas de dolor. De manera similar, el trauma, cirugía, amputación, abscesos, causalgia, enfermedades vasculares del colágeno, enfermedades desmielinantes, neuralgia trigeminal, cáncer, alcoholismo crónico, apoplejía, síndrome de dolor talámico, diabetes, herpes infeccioso, síndrome de inmunodeficiencia adquirida ("SIDA") , toxinas y quimioterapia, ocasionan lesiones nerviosas que resultan en dolor excesivo. Conforme los mecanismos por los cuales los nociceptores transducen señales externas bajo condiciones hiperparalgésicas y normales llegan a ser mejor entendidos, los procesos implicados en la hiperalgesia pueden ser dirigidos para inhibir la disminución del umbral del dolor y con ello, disminuir la cantidad de dolor experimentado. La bradiquinina (BK) y el péptido relacionado, calidina (Lys-BK) (véase Tabla 3) , median las acciones fisiológicas de las quininas en los sistemas cardiovasculares y renales. Sin embargo, los péptidos activos, BK y calidina, son rápidamente degradados por peptidasas en el plasma y otros fluidos biológicos y por aquellos liberados de una variedad de células, de manera que la vida media de la BK en el plasma se reporta por ser de aproximadamente 17 segundos (1) . La BK y calidina son rápidamente metabolizadas en el cuerpo por carbopeptidasa N, la cual remueve el residuo de arginina carboxiterminal para generar des-Arg de BK o des-Arg de calidina. La Des-Arg-calidina está entre las quininas predominantes en el hombre y media las acciones patofisiológicas de quininas en el hombre. Además de ser un péptido proinfla atorio muy potente, la des-Arg-BK o des-Arg-calidina se sabe, induce vasodilatación, permeabilidad vascular, y broncoconstricción (para revisión, véase Regoli and Barabe, Pharmacology of Brady inin and Related Kinins, Pharmacological Reviews, 32 (1): 1-46 (1980)). Además, la des-Arg-BK y des-Arg-calidina parecen ser mediadores particularmente importantes del dolor de inflamación e inflamatorio, así como también estar involucradas en el mantenimiento del mismo. Existe también un cuerpo de evidencia considerable que implica la sobreproducción de des-Arg-calidina en condiciones en las cuales ei dolor es una característica prominente tal como choque séptico, artritis, angina y migraña. Los receptores de membrana que median las acciones pleyotrópicas de quininas son de dos clases distintas, designadas Bl y B2. Ambas clases de receptores han sido clonadas y secuenciadas de una variedad de especies, que incluyen al hombre (Menke, et al, Expression cloning of a human bl bradykinin receptor. J. Biol. Chem. 269:21583-21586 (1994) ; Hess et al, Cloning and pharmacological characterization of a human bradykinin (BK-2) receptor. Biochem. Biophys. Res Commun. 184, 260-268 (1992)). Son receptores típicos acoplados a la proteína G que tienen siete regiones de empalme de membrana putativa. En varios tejidos, los receptores BK están acoplados a cada segundo mensajero conocido. Los receptores B2, los cuales tienen una afinidad superior para BK, parecen ser la forma más prevaleciente de receptor de bradiquinina. Esencialmente todas las respuestas fisiológicas normales y muchas respuestas patofisiológicas a bradiquinina, están mediadas por receptores de B2. Receptores de Bl por otro lado, tienen una afinidad superior para des-Arg-BK (véase Tabla 3) , comparada con BK, mientras des-Arg-BK es inactiva en los receptores B2. Además, los receptores Bl no son normalmente expresados en muchos tejidos. Su expresión es inducida después de la lesión o daño al tejido, así como también en ciertos tipos de inflamación crónica o ataque sistémico (Marceau, F. , et al., Kinin Bl receptors: a review. Immunpharmacology, 30:1-26 (1995)). Además, respuestas mediadas por receptores Bl son sobre-reguladas de un nivel nulo después de la administración de lipopolisacárido bacteriano (LPS) o citocinas inflamatorias en conejos, ratas y cerdos (Marceau et al., (1998)).

Las propiedades que inducen dolor de quininas acopladas con la expresión inducible de receptores Bl, hace que al receptor Bl un objetivo interesante en el desarrollo de agentes anti-inflamatorios, antinociceptivos, antihiperalgésicos y analgésicos, que pueden ser dirigidos específicamente a tejidos lesionados dentro de acciones mínimas en tejidos normales. Mientras que se ha identificado una variedad de antagonistas peptídicos que dirigen el receptor Bl, su desarrollo como analgésicos terapéuticos ha sido impedido por escasa vida media eficaz que resulta de degradación muy rápida por peptidasas del suero y tejido y eficiente aclaramiento renal. Más recientemente, los análogos peptídicos que tienen sustituyentes de aminoácido no naturales, han sido mostrados por ser resistentes a peptidasas en ensayos de estabilidad in vitro (para revisión, véase Regoli et al, Bradykinin receptors and their antagonists. European Journal of Pharmacology, 348: 1-10 (1998); Stewart, J. M. , et al, Bradykinin antagonists: present progress and future prospects. Immunopharmacology, 43: 155-161 (1999); and Stewart, J. M. , et al., Metabolism-Resistant Bradykinin Antagonists: Development and Applications. Biol. Chem., 382: 37-41 (2001)). La conjugación covalente de proteínas con poli (etilenglicol) (PEG), ha sido ampliamente reconocida como un procedimiento para extender significantemente la vida media de circulación in vivo de proteínas terapéuticas. La PEGilación logra este efecto predominantemente retardando la separación renal, puesto que las porciones PEG agregan radio hidrodinámico considerable a la proteína (Zalipsky, S., et al., Use of functionalized poly (ethyl ene glycol) s for modification of polypeptides . , in Poly (ethyl ene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications. , J. M. Harris, Editor, (1992) , Plenum Press : New York. p. 347-370. ) . Los beneficios adicionales a menudo conferidos por la PEGilación de proteínas incluyen solubilidad incrementada, resistencia a degradación proteolítica e inmunogenicidad reducida del polipéptido terapéutico. Los méritos de la PEGilación de proteína son evidenciados por la comercialización de varias proteínas PEGiládas que incluyen desa inasa de PEG-Adenosina (Adagen™/Enzon Corp.), PEG-L-asparaginasa (Oncaspar™/Enzon Corp.), PEG-Interferona -2b (PEG~Intron™/Shering/Enzon) , PEG-Interferona . -2a (PEGASYS™/Roche) y PEG-G-CSF (Neulasta™/Amgen) , así como también muchos otros en ensayos clínicos. La PEGilación de péptidos terapéuticos pequeños, por otro lado, presenta retos únicos y no se han aplicado ampliamente. Uno de los obstáculos más grandes para la PEGilación del péptido, es el requerimiento esencial de que la actividad biológica se preserve en el conjugado final. Debido a que los péptidos terapéuticos a menudo comprenden la secuencia mínima requerida para actividad y son por lo tanto muy pequeños, son relativamente intolerantes a la sustitución. Porciones PEG son desproporcionadamente más grandes que el péptido mismo y consecuentemente, es más probable que interfieran estéricamente con. el péptido específico: interacciones de enlace al receptor requeridas para determinar la actividad. Así, la capacidad del péptido para tolerar la PEGilación y todavía retener suficiente actividad específica para ser un terapéutico útil, es casi impredecible y debe ser empíricamente determinada (Morpurogo, et al., 'Selective Alkylation and Acylation of a and e Amino Groups with PEG in a Somatostatin Analogue: Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates . Bioconjugate Chem. 13:1238-1243 (2002)). Claramente, existe una necesidad para nuevos tratamientos seguros y efectivos para inflamación y dolor. Podrá ser una ventaja tener un antagonista de péptído específico Bl que sea mejor capaz de tolerar la exposición sistémica durante el tratamiento, mejorando la vida de circulación (aclaramiento retardado) , solubilidad, estabilidad y/o disminución de la inmunogenicidad de la molécula. La vida de circulación incrementada podría resultar en un régimen de dosificación menos frecuente y un programa de dosificación menos frecuente podría ser más conveniente para tanto especialistas como pacientes, y podría ser particularmente provechoso para aquellos pacientes involucrados en auto-administración. Otras ventajas para dosificación menos frecuentes pueden incluir menos fármacos siendo introducidos en pacientes y adaptabilidad incrementada .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, es un objeto de la presente invención, proporcionar nuevos agentes de enlace del receptor Bl con propiedades farmacocinéticas demostrablemente superiores in vivo, comparadas con antagonistas Bl de péptidos conocidos aún suficientemente para antagonizar la ' actividad del receptor Bl, de manera tal que son terapéuticamente útiles en el tratamiento o prevención de inflamación, dolor y otras condiciones mediadas por Bl que incluyen, pero no se limitan a, asma y rinitis alérgica. Tales agentes son proporcionados por la presente invención en la forma de nuevos antagonistas peptídicos y antagonistas peptídicos conjugados del receptor Bl . En una modalidad, los nuevos antagonistas peptídicos del receptor Bl de la presente invención, comprenden una secuencia de aminoácido como se muestra de conformidad con cualquiera de las SEC ID NOS: 15-54. De conformidad con algunas modalidades de esta invención, uno o más y preferiblemente entre uno a nueve residuos de aminoácidos, seleccionados independientemente de cualquiera de los veinte L-aminoácidos genéticamente codificados o D-aminoácidos estereoisoméricos, serán acoplados a cualquiera o ambos extremos de las secuencias peptídicas, como se muestra en las SEC ID NOS: 15-54. En otra modalidad, la presente invención también proporciona péptidos conjugados, los cuales tienen propiedades farmacocinéticas demostrablemente superiores in vivo, como se compara con los antagonistas Bl peptídicos conocidos aún que se enlazan suficientemente y antagonizan la actividad del" receptor Bl, de manera tal que pueden ser usados terapéuticamente. Un aspecto de . la invención comprende un péptido conjugado de fórmula I: F-tíX^-Y1)^ I en donde: F es un vehículo covalentemente unido X1 o Y1 (preferiblemente, F es una porción PEG o un derivado del mismo) ; X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -L1-?1- y L2-P2, respectivamente; L1 y L2 son independientemente en cada caso, enlazadores; n es 0 a 3; y P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina.- Preferiblemente, Pl y P2 comprenden una secuencia de aminoácido como se muestra en cualquiera de las SEC ID NOS: 5-26, 43-60, y derivados de las mismas. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende materiales portadores excipientes que tienen un péptido conjugado de la invención disperso en este. Otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos terapéuticos de tratamiento los cuales comprenden, administración a un mamífero en necesidad del mismo, de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición que comprende excipientes y al menos un péptido y/o péptido conjugado de la invención. Los péptidos y/o péptidos conjugados de la invención, tienen valor terapéutico para el tratamiento de enfermedades mediadas por la activación de Bl, que incluye, pero no se limita a, estados de inflamación y dolor crónico de origen inflamatorio y neuropático, golpe séptico, rinitis, osteoartritis, angina, asma, rinitis alérgica y migraña. Los péptidos y/o péptidos conjugados de la invención, pueden ser usados para procesos terapéuticos o profilácticos formulándolos con materiales portadores farmacéuticos apropiados y administrando una cantidad efectiva a un paciente, tal como un humano (u otro mamífero) , en necesidad del mismo.

Péptidos útiles adicionales y/o péptidos conjugados, pueden resultar de modificaciones conservativas de las secuencias de aminoácidos de los péptidos y/o péptidos conjugados a vehículos descritos en este documento. Se hacen modificaciones conservativas que producirán péptidos y/o péptidos conjugados que tienen características funcionales, físicas y químicas similares a aquellas de péptidos y/o péptidos conjugados a partir de tales modificaciones. Tales formas conservativamente modificadas de péptidos y/o péptidos conjugados descritos en este documento, también están contemplados por ser una modalidad de la presente invención. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para elaborar un péptido conjugado como se describe en este documento, que comprende las etapas de: hacer reaccionar un compuesto que tiene la estructura: (Xa)-(Y2)N en donde : X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -l ~P y L2-P2, respectivamente; L1 y L2 son independientemente en cada caso, enlazadores; n es 0 a 3; y P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina, con un vehículo (F) para dar un péptido conjugado de la fórmula: F- [ (X1) ] , F- [ (X1) ]-F, F- [ (X1) - (Y1)^ , F-(XJ)- (Y1)n, o F- (X1) - (Y1)n-F. Preferiblemente, F es una porción PEG o un derivado de la misma. Más preferiblemente,. P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina que comprende al menos, una de las secuencias peptídicas mostradas en la SEC ID NOS: 5-60.

Aún más preferiblemente, X1 es un péptido como se muestra en las SEC ID NOS: 27-41. Aspectos y ventajas adicionales de la presente invención llegarán a ser aparentes después de la consideración de la descripción detallada de la invención, la cual sigue.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que una clase de péptidos generalmente considerados por ser casi tolerantes a la sustitución, puede ser aminoácidos sustituidos a los N-términps y/o conjugados a varios vehículos al N-término para proporcionar péptidos terapéuticamente útiles y/o conjugados peptídicos con perfiles de eficacia dramáticamente sostenidos, comparados con los péptidos conocidos de la misma clase, y por lo tanto, permiten su uso para manejar la inflamación y dolor. De este modo, los péptidos y/o conjugados peptídicos de la presente invención proporcionan ventaja terapéutica tremenda sobre los antagonistas peptídicos. Más particularmente, los inventores han encontrado que las desventajas descritas previamente en antagonistas peptídicos de Bl conocidos con respecto a su uso farmacéutico, son superables sustituyendo aminoácidos al N- término y/o conjugando los antagonistas peptídicos a vehículos, tales como, pero no limitados a moléculas de polietilenglicol (PEG) usando enlazadores de peptidilo o no peptidilo de tamaño y composición definidos, los cuales maximizan la preservación de actividad y especificidad antagonista mientras prolongan de manera eficaz la vida medía in vivo. Adicionalmente (o alternativamente) , se descubrió que debido a la actividad in vitro ligeramente reducida conferida a los antagonistas peptídicos Bl conjugados a polímeros más grandes, la vida media de circulación extendida de los conjugados PEG grandes, proporciona exposición significantemente mayor y eficacia prolongada ín vivo, cuando se compara con conjugados peptídicos conjugados a polímeros PEG más pequeños. Además, los presentes inventores han encontrado que el tamaño de la molécula PEG unida a un antagonista peptídico del receptor Bl, es un parámetro crítico en la optimización de la actividad antagonista intrínseca y la vida media in vivo eficaz. Por ejemplo, un antagonista Bl peptídico acetilado, demuestra eficacia en modelos relevantes de dolor in vivo por un máximo de 4 horas después de la dosificación múltiple. De manera sorprendente, el mismo péptido conjugado a una molécula de PEG de 5 a kD y 20 kD en la manera descrita en este documento, demuestra eficacia por hasta 2 días y por al menos 4 días, respectivamente, después de una inyección de bolo único. . Antes que se describan el péptido y vehículo o antagonistas peptídicos conjugados a PEG del receptor Bl de bradiquinina de la presente invención, y métodos para elaborar y usar tales, se entiende que esta invención no está limitada a péptidos particulares y/o antagonistas peptídicos conjugados descritos, puesto que péptidos y/o antagonistas peptídicos conjugados y metodologías contempladas por la presente invención pueden, por su puesto, variar ligeramente. Se entiende que la terminología usada en este documento es para propósitos . de describir modalidades particulares únicamente, y no está propuesta para describir modalidades particulares únicamente, y no se pretende estar limitada puesto que el alcance de la presente invención será limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas. Los péptidos que se enlazan al receptor Bl de bradiquinina contemplados para conjugación a un vehículo para tales propósitos y en la manera descrita en este documento incluyen, pero no se limitan a, los nuevos antagonistas peptídicos de enlace a Bl descritos en este documento, así como también a antagonistas peptídicos de enlace a Bl, conocidos en la técnica que incluyen pero no se limitan a, cualquier péptido descrito en cualquiera de las siguientes publicaciones (cada una de las cuales está de este modo incorporada por referencia en su totalidad): Régoli et al., Bradykinín receptors and their antagonists. Eur. J. of Pharma., 348:1-10 (1998); Neugebauer, W., et al., Kinin Bi receptor antagonists 'with multi-enzymatic resistánce properties. Can. J. Physiol Pharmacol., 80:287-292 (2002); Stewart, J. M. , et al, Bradykinín antagonists: present progress and future prospects. Immunopharmacology, 43: 155-161 (1999); Stewart, J. M., et al., Metabolis -Resistant Bradykinin Antagonists: Development and Applications. Biol. Chem., 382: 37-41 (2001); Publicación de PCT WO 98/07746; y Patentes Estadounidenses Nos.: 4,693,993, 4,801,613, 4,923,963, 5,648,336, 5,834,431, 5,849,863, 5,935,932, 5,648,333, 5,385,889, 5,444,048, y 5,541, 286. Los términos usados a través de esta especificación son definidos como sigue, a menos que se limite de otro modo en los casos específicos. Residuos de aminoácidos naturales se discuten en tres formas: nombre completo del aminoácido, código estándar de tres letras, o código estándar de una sola letra de conformidad con el esquema mostrado abajo.

A = Ala G Gly M Met S = Ser C = Cys H His N Asn T = Thr D = Asp I lie P Pro V = Val E = Glu K Lys Q Gln = Trp F = Phe L Leu R Arg Y = Tyr_ A menos que se indique claramente de otro modo, es pretende una designación en este documento, de un aminoácido natural o no natural para abarcar tanto el isómero D como L del aminoácido. Las abreviaturas usadas en este documento para aminoácidos no naturales son las mismas como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,834,431, Publicación de PCT WO 98/07746, y Neugebauer, et al. (2002), cada una de las cuales está por este medio, incorporada por referencia en su totalidad. Adicionalmente, la abreviatura "Dab" y "D-Dab", está propuesta para referirse al isómero L y D del aminoácido no natura, ácido D-2-aminobutírico, respectivamente. La abreviatura "3' Pal" y "D-3' Pal", está propuesta para referirse al isómero L y D del aminoácido no natural de 3 ' -piridilalanina, respectivamente. También, la abreviatura "Igl" está propuesta para incluir tanto- "Igla" e "Iglb" (a-(1-indanil) glicina y - (2-indanil) glicina, respectivamente. De manera similar, "DIgl" está propuesto para incluir tanto "D-Igla" como "D-Iglb" (los isómeros D de a-(l-indanil) glicina y a- (2-indanil) glicina, respectivamente.

Preferiblemente, cuando se usa en este documento; Igl es Iglb y D-Igl es D-Iglb. Por "péptido conjugado a vehículo" o "péptido conjugado", significa un compuesto el cual tiene actividad biológica y el cual cuando se administra a un mamífero, proporciona un efecto terapéutico. Las dos partes incluyen (1) al menos un antagonista peptídico de Bl y (2) al menos un vehículo como se define en este documento posteriormente, covalentemente unido a un residuo del péptido mismo o a un enlazador peptidilo o no peptidilo (que incluye pero no se limita a enlazadores aromáticos) , que son covalentemente unidos a un residuo del péptido. Por "péptido PEG-conjugado" o "pépti'do PEGilado", significa un compuesto de dos partes, el cual tiene actividad biológica y el cual cuando se administra a un mamífero, proporciona un efecto terapéutico. Las dos partes incluyen (1) al menos un antagonista peptídico Bl y (2) al menos una porción de polietilenglicol (PEG) covalentemente unida a un residuo del péptido mismo o a un enlazador peptidilo o no peptidilo (que incluye pero no se limita a enlazadores aromáticos), que son covalentemente unidos a un residuo del péptido. Por "polietilenglicol" o "PEG", significa un compuesto de polietilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivatización con porciones de acoplamiento o activación (por ejemplo, con porciones de tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, disulfuro de ortopiridilo, vinilsulfona, yodoacetamida o maleimida) . El PEG es un polímero soluble en agua bien conocido, que es comercialmente disponible o puede ser preparado por polimerización de apertura de anillo de etilenglicol, de conformidad con métodos bien conocidos en la técnica (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161). En la presente solicitud, el término "PEG" es usado ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilenglicol, en forma mono- o poli-funcional, sin considerar el tamaño o modificación en un extremo del PEG, y puede ser representada por la fórmula: X-0(CH2CH2?)n-?CH2CH2OH II en donde n es 20 a 2300 y X es H o una modificación terminal, por ejemplo, un alquilo Cj.- . Preferiblemente, un PEG usado en la invención termina en un extremo con hidroxi o metoxi, es decir, X es H o CH3 ("metoxi PEG") . Se indica que cuando X = CH3, el otro extremo del PEG, el cual se muestra en la fórmula II que termina en OH, se une covalentemente a una porción de activación vía un enlace de oxígeno éter. Cuando X = H, ambos extremos del PEG están unidos para activar moléculas vía enlaces éter dando origen a PEG bis-funcionalizados lineales. Cuando se usa en una estructura química, el término "PEG" incluye la fórmula II anterior sin el hidrógeno del grupo hidroxilo mostrado, conduciendo a oxígeno disponible para reaccionar con un átomo de carbono libre de un enlazador para formar un enlace éter. Más específicamente, para conjugar PEG a un péptido, PEG debe estar en una forma "activada". El PEG activado puede ser representado por la fórmula III: (PEG) -(A) III en donde PEG (definido anteriormente) , se une covalentemente a un átomo de carbono de la porción de activación (A) para formar un enlace éter, y (A) contiene un grupo reactivo el cual puede reaccionar con un grupo amino, imino o tipo o un residuo de aminoácido de un péptido o una porción enlazadora covalentemente unida al péptido. Los métodos para la preparación de PEGs activados son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, véase Patentes Estadounidenses Nos. 5,643,575, 5,919,455, 5,932,462, y Publicación de PCT WO 95/06058 (cada una de las cuales esta por este medio, incorporada por referencia en su totalidad) . Los PEG activados adecuados pueden ser producidos por un número de reacciones convencionales. Por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimida de un PEG (M-NHS-PEG) puede ser preparado a partir de PEG-monometiléter (el cual es cómercialmente disponible de Union Carbide) por reacción con N,Nr -diciclohexilcarbodii ida (DCC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) , de conformidad con el método de Buckmann and Merr, Makromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981). Otros PEGs activados, tales como PEG-aldehídos, se pueden obtener a partir de una fuente comercial, por ejemplo, Nektar Therapeutics (Huntsville, Al) o Enzon, Inc. (Piscataway, N. J. ) . Ejemplos de PEG activados preferidos, para propósitos de la presente invención son, PEG~propionaldehído y PEG-butiraldehído, los cuales son comercialmente disponibles de Nektar Therapeutics (Huntsville, Al) . El PEG-propinoaldehído es representado por la fórmula PEG-CH2CH2CHO y se describe en la Patente Estadounidense No.5, 252, 714, la cual está completamente incorporada por referencia en este documento. Además, los aldehidos PEG bifuncíonales pueden ser usados para preparar conjugados di éricos. PEGs reactivos de aminas preferidos adicionales incluyen: metoxi-PEG succinimidil propionato (mPEG-SPA) y metoxi-PEG succinimido butanoato mPEG-SBA) , mPEG-carbonato de benzotriazol o mPEG-p-nitrofenil carbonato, los cuales son disponibles en una variedad de pesos moleculares de Nektar Therapeutics (Huntsville, Al), Enzon, Inc. (Piscataway, N. J.), o NOF Corporation (Tokio Japón). Porciones PEG activadas preferidas adicionales incluyen, funcionalidades tiol reactivas que incluyen, pero no se limitan a, PEG vinilsulfonas, representadas por la fórmula PEG-CH2CH2S02-CH=CH2, PEG-yodoacetato y mPEG-tioésteres representados abajo: mPEG- tioéster mPEG-yodoacetamida Otro PEG activado preferido para generar péptidos PEG-conjugados de la presente invención es PEG-maleimida. Los compuestos tales como maleimido monometoxi PEG, son particularmente útiles para generar los péptidos PEG-conjugados de la invención. Un PEG activado aún más preferido, para generar los péptidos PEG-conjugados de la presente invención, es un PEG multivalente que tiene más de un residuo activado. Porciones de PEG ultivalentes preferidas incluyen, pero no se limitan, a aquellas mostradas abaj o : Cualquier masa molecular para un PEG puede ser usada como se desee prácticamente, por ejemplo, . desde aproximadamente 1,000 Daltons (Da) hasta 100,000 Da (n es 20 hasta 2300) . El número de unidades de repetición "n" en el PEG es aproximado para la masa molecular descrita en Daltons. Se prefiere que la masa molecular combinada de PEG en un enlazador activado sea adecuada para uso farmacéutico. De este modo, la masa molecular combinada de las moléculas de PEG no debe exceder de 100,000 Da. Preferiblemente, la masa molecular total o combinada de PEG usada en un péptido PEG-conjugado de la presente invención, es desde aproximadamente 3,000 Da hasta 60,000 Da (n total es desde 70 a 1,400), más preferiblemente desde aproximadamente 8,800 Da hasta 36,000 Da (ri total es aproximadamente 200 hasta aproximadamente 820) . La masa combinada más preferida para PEG es desde aproximadamente ,000 Da hasta 24,000 Da (n total es aproximadamente 450 hasta aproximadamente 540) . Otros compuestos de polialquilenglicol, tales como propilenglicol, pueden ser usados en la presente invención. Otros compuestos de polialquilenglícol apropiados incluyen, pero no se limitan a, polímeros cargados o neutrales de los siguientes tipos: dextrano, ácidos colomínicos u otros polímeros a base de carbohidratos de aminoácidos y derivados de biotina. El término "que comprende" significa que un péptido o péptido conjugado puede incluir entidades moleculares adicionales que incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, en cualquiera o ambos de los término N o C de la secuencia dada. Por su puesto, estas entidades moleculares adicionales no deben interferir significantemente con la actividad del péptido o péptido conjugado. Como se usa en este documento, el término "péptido nativo", se refiere a un antagonista de péptido Bl no conjugado descrito en este documento o conocido en la técnica. . Los términos "derivatizante" y "derivado" o "derivatizado", comprenden procesos y péptidos resultantes o péptidos conjugados, respectivamente, en los cuales (1) el péptido o péptido conjugado tiene una porción cíclica; por ejemplo, reticulación entre residuos de cisteinilo dentro del péptido conjugado; (2) el péptido o péptido conjugado es reticulado o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el péptido o péptido conjugado, tiene un residuo cisteinilo y de este forma, dímeros retículados en cultivo o ín vivo; (3) el N-término de un péptido conjugado que tiene un grupo -NH2 terminal, es reemplazado por -NRR1, NRC(0)R1, -NRCÍOJOR1, -NRS(0)2R1, -NHC (0) HR, un grupo succinimida o benciloxicarbonil-NH-, sustituido o no sustituido, en donde R y R1 y los sustituyentes en el anillo son como se definen en este documento posteriormente; (5) el C-término es reemplazado por -C(0)R2 o -NR3R4 en donde R2, R3 y R4 son como se definen en este documento posteriormente; y (6) péptidos conjugados en los cuales porciones de aminoácidos individuales son modificadas a través del tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales. Los derivados son además descritos en este documento posteriormente. El término "Bl" significa el receptor Bl de bradiquinina (véase, Judith M Hall, A review of BK receptors. Pharmac. Ther. 56:131-190 (1992)). A menos que se indique específicamente de otro modo, Bl o el receptor Bl de bradiquinina es propuesto por significar . el receptor Bl de bradiquinina humana (hBl) . Preferiblemente, hBl es el receptor de tipo nativo. Más preferiblemente, hBl es el receptor de bradiquinina descrito en el Acceso de GenBank No. AJ238044. El término "péptido" como se usa de manera general en este documento, se refiere a moléculas de 4 a 10 aminoácidos, con moléculas de 10 a 20 aminoácidos siendo preferidas, y aquellas de 15 a 18 aminoácidos siendo más preferidas. El término "di-péptido" como se usa en este documento, se refiere a una molécula de dos aminoácidos. El término "tri-péptido" como se usa en este documento, se refiere a una molécula de tres aminoácidos. ' El análisis estructural de la interacción de proteína-proteína puede también ser usado para sugerir péptidos que imitan la actividad de enlace de ligandos de proteínas grandes. En tal análisis, la estructura de cristal puede sugerir la identidad y orientación relativa de residuos críticos del ligando de proteína del cual un péptido análogo puede ser designado. Véase por ejemplo, Takasaki et al., Nature Biotech., Volumen 15, páginas 1266-1270 (1997). Estos métodos analíticos pueden también ser usados para investigar la interacción entre una proteína receptora y un péptido, péptido conjugado con vehículo, o péptido PEG-conjugado de la presente invención, los cuales pueden sugerir además, modificación del péptido o péptido conjugado para incrementar la afinidad de enlace. Como se usa en este documento, los términos "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva", cuando se usan con referencia a un péptido, péptido conjugado con vehículo o antagonista Bl del péptido PEG-conjugado, se refieren a una cantidad o dosificación suficiente para producir un resultado deseado (es decir, para terapia con los péptidos, péptidos conjugados con vehículo y/o antagonistas Bl del péptido conjugado con vehículo de la presente invención. En el contexto de la presente invención, el resultado deseado es una reducción deseada en la inflamación y/o dolor, por ejemplo, o para soportar un decremento observable en el nivel de una o más actividades biológicas de Bl . Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad del péptido y/o péptido conjugado, suficiente para inhibir por algún periodo de tiempo, uno o más de los procesos patológicos asociados con la condición en la emisión, por ejemplo, de inflamación o dolor, en un sujeto tratado in vivo con el (los) agente (s). La cantidad efectiva puede variar dependiendo del péptido específico y/o antagonista Bl del péptido conjugado seleccionado, y también es dependiente de una variedad de factores y condiciones relacionadas con el sujeto a ser tratado y la severidad del trastorno. Por ejemplo, si el péptido y/o antagonista Bl del péptido conjugado es administrado in vivo, factores tales como la edad, peso y salud del paciente, así como también curvas de respuesta de dosis y datos de toxicidad obtenidos en trabajos preclínicos en animales, podrán ser entre estos, considerados. Si el (los) agente (s) están en contacto con las células in vitro, se podrá también diseñar una variedad de estudios pre-clínicos in vitro, para valorar tales parámetros como absorción, vida medía, dosis, toxicidad, etc. La determinación de una cantidad efectiva o una cantidad terapéuticamente efectiva por un agente dado, está también dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. El término "farmacológicamente activo", significa que una sustancia así descrita es determinada por tener actividad que afecta un parámetro médico o estado de enfermedad (por ejemplo, dolor) . En el contexto de la invención, este término se refiere típicamente a una enfermedad inducida por Bl o mediada por Bl o condición o trastorno médico anormal, y más específicamente, para el antagonismo de inflamación o dolor.

Los términos "antagonista", "inhibidor" y "agonista inverso" (por ejemplo, véase Rianne A. F. de Ligt, et. al, British Journal of Pharmacology 2000, 130, 131), se refieren' a una molécula que bloquea, obstaculiza, reduce, disminuye o en algunas formas, interfiere con la actividad biológica de la proteína asociada de interés. Un "antagonista" o "inhibidor" de la presente invención, es una molécula que se enlaza a, e inhibe Bl con un IC50 de 500 nM o menos en ensayos in vitro de la actividad Bl . Un "antagonista" o "inhibidor" más preferido de la presente invención, es una molécula que se enlaza a, o inhibe Bl con un IC50 de 100 nM o menos en ensayos in vi tro de actividad Bl . Un "antagonista" o "inhibidor" más preferido de la presente invención, es una molécula que se enlaza a, e inhibe Bl con un IC50 de 50 nM o menos en ensayos in vitro de actividad Bl y previene, mejora o suprime el dolor medido en al menos un modelo animal in vivo -aceptado de manera general del dolor y/o inhibe cambios bioquímicos en modelos animales in vivo de edema, inflamación o dolor. Adicionalmente, sales fisiológicamente aceptables de los péptidos o péptidos conjugados de la invención están también abarcados en este documento. Las frases "sales fisiológicamente aceptables" y "sales farmacológicamente aceptables" como se usa en este documento, son intercambiables, están propuestas para incluir cualquiera de las sales que son conocidas o descubiertas después para ser farmacéuticamente aceptables (es decir, empleadas en el tratamiento de - un animal de sangre caliente) . Algunos ejemplos específicos son: acetato; trifluoroacetato; hidrohaluros, tales como clorhidrato y bromhidrato; sulfato, citrato; tartrato; glicolato; oxalato; sales de ácidos orgánicos e inorgánicos, que incluyen, pero no se limitan, a ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido málico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido fenilacético, ácido mandélico y similares. Cuando los compuestos de la invención incluyen una función acídica tal como un grupo carboxi, entonces los pares de cationes farmacéuticamente aceptables adecuados para el grupo carboxi son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen, cationes alcalinos, alcalino térreos, amonio, amonio cuaternario y similares. Para ejemplos adicionales de "sales farmacológicamente aceptables", véase infra y Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977). "Grupo protector", se refiere de manera general, a grupos bien conocidos en la técnica, los cuales son usados para prevenir los grupos reactivos seleccionados, tales como carboxi, amino, hidroxi, mercapto y similares, de someterse a reacciones indeseadas, tales como nucleofílica, electrofílica, oxidación, reducción y similares. Grupos protectores preferidos están indicados en este documento en donde sea apropiado. Ejemplos de grupos amino protectores incluyen, pero no se limitan a, aralquilo, aralquilo sustituido, cicloalquenilalquilo y cicloalquenilalquilo sustituido, alilo, alilo sustituido, acilo, alcoxicarbonilo, aralcoxicarbonilo, sililo y similares. Ejemplos de aralquilo incluyen, pero no se limitan a, bencilo, orto-metilbencilo, tritilo y benzhidrilo, los cuales pueden ser opcionalmente sustituidos con halógeno, alquilo, alcoxi, hidroxi, nitro, acilamino, acilo y similares, y sales, tales como sales de fosfonio y amonio. Ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo, indanilo, antracenilo, 9- (9-fenilfluorenilo) , fenantrenilo, durenilo y similares. Ejemplos de radicales cicloalquenilalquilo o cicloalquenilalquilo sustituidos, que preferiblemente tienen 6-10 átomos de carbono, incluyen pero • no se limitan a, ciciohexenil metilo y similares. Grupos acilo, alcoxicarbonilo y aralcoxicarbonilo adecuados incluyen benciloxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, iso-butoxicarbonilo, benzoilo, benzoilo sustituido, butirilo, acetilo, trifluoroacetilo, tri-cloroacetilo, ftaloilo y similares. Una mezcla de grupos protectores puede ser usada para proteger el mismo grupo amino, tal como un grupo amino primario puede ser protegido por un grupo tanto aralquilo como un grupo aralcoxicarbonilo. Grupos amino protectores pueden también formar un anillo heterocíclico con el nitrógeno al cual están unidos, por ejemplo, 1, 2-bis (metilen) benceno, ftalimidilo, succinimidilo, maleimidilo y similares, en donde estos grupos heterocíclicos pueden incluir además anillos adjuntos arilo y cicloalquilo. Además, los grupos heterocíclicos pueden ser mono, di o tri-sustituidos, tales como nitroftalimidilo . Grupos amino pueden también ser protegidos contra reacciones indeseadas, tales como oxidación, a través de la formación de una sal de adición, tal como ácido clorhídrico, ácido toluensulfónico, ácido trifluoroacético y similares. Muchos de los grupos amino protectores son también adecuados para proteger grupos carboxi, hidroxi y mercapto. Por ejemplo, grupos aralquilo. Los grupos alquilo también son grupos adecuados para proteger grupos hidroxi y mercapto, tales como terc-butilo. Los grupos sililo protectores son átomos de silicio opcionalmente sustituidos por uno o más grupos alquilo, arilo y aralquilo. Grupos sililo protectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, trimetílsililo, trietilsililo, tri-isopropilsililo, terc-butildimetilsililo, dimetilfenilsililo, 1, 2-bis (dimetilsilil) benceno, 1, 2-bis (dimetilsilil) etano y difenilmetilsililo. La sililación de grupos amino proporciona grupos mono o di-sililamino. La sililación de compuestos de aminoalcohol puede conducir a un derivado N,N,0-tri-sililo.

La eliminación de la función sililo de una función de sililéter es fácilmente realizada por el tratamiento con, por ejemplo, un reactivo de hidróxido de metal o fluoruro de amonio, ya sea como una etapa de reacción discreta o in situ durante una reacción con el grupo alcohol . Los agentes de sililación adecuados son, por ejemplo, cloruro de trimetílsililo, cloruro de terc-butil-dimetilsililo, cloruro de fenildimetilsililo, cloruro de difenilmetilsililo o sus productos de combinación con imidazol o DMF. Los métodos para sililación de aminas y remoción de grupos sililo protectores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los métodos de preparación de estos derivados de amina a partir de aminoácidos correspondientes, amidas de aminoácidos o esteres de amino ácidos, son también bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de química orgánica que incluyen aminoácido/éster de aminoácido o química de aminoalcohol . Los grupos protectores son removidos bajo condiciones las cuales no afectarán la porción restante de la molécula. Estos métodos son bien conocidos en la técnica e incluyen hidrólisis acida, hidrogenólisis y similares. Un método preferido involucra eliminación de un grupo protector,' tal como remoción de un grupo benciloxicarbonilo por hidrogenólisis utilizando paladio en carbono en un sistema de solvente adecuado, tal como un alcohol, ácido acético y similares, o mezclas de los mismos. Un grupo t-butoxicarbonilo protector puede ser removido utilizando un ácido orgánico o inorgánico, tal como HCl o ácido trifluoroacético, en un sistema de solvente adecuado, tal como dioxano o cloruro de metileno. La sal amino resultante puede ser fácilmente neutralizada para proporcionar la amina libre. El grupo carboxi protector, tal como metilo, etilo, bencilo, terc-butilo, 4-metoxifenilmetilo y similares, puede ser eliminado bajo condiciones de hidrólisis e hidrogenólisis bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Se debe notar que los compuestos de la invención pueden contener grupos que pueden existir en formas tautoméricas, tales como grupos de amidina y guanidina cíclicos y acíclicos, grupos de heteroátomos heteroarilo sustituidos (Y' = O, S, NR) , y similares, los cuales se ilustran en los siguientes ejemplos: y una forma pensada es nombrada, descrita, exhibida y/o reivindicada en este documento, todas las formas tautoméricas están propuestas para ser inherentemente incluidas en tal nombre, descripción, exhibición y/o reivindicación. Los profármacos de los compuestos de esta invención están también contemplados por esta invención. Un profármaco es un compuesto activo o inactivo que es modificado químicamente a través de acción fisiológica in vivo, tal como hidrólisis, metabolismo y similares, en un compuesto de esta invención después de la administración del profármaco a un paciente. La capacidad de adecuación y técnicas involucradas en la elaboración y uso de profármacos, son bien conocidas en la técnica por aquellos de habilidades en el arte. Para una discusión general de profármacos que involucran esteres, véase Svensson and Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988) and Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985) . Ejemplos de un anión de carboxilato enmascarado incluyen una variedad de esteres tales como alquilo (por ejemplo, metilo, etilo) , cicloalquilo (por ejemplo, ciciohexilo), aralquilo (por ejemplo, bencilo, p-metoxibencilo) y alquilcarboniloxialquilo (por ejemplo, pivaloiloximetilo) . Aminas han sido enmascaradas como derivados arilcarboniloximetilo sustituidos, los cuales son desdoblados por esterasas in vivo liberando el fármaco y formaldehído libre (Bundgaard J. Med. Chem. 2503 (1989) ) . También, los fármacos que contienen un grupo NH acídico, tal como imidazol, imida, indol y similares, han sido enmascarados con grupos N-aciloximetilo (Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985) ) . Grupos hidroxi han sido enmascarados con esteres y éteres. El documento EP 039,051 (Sloan and Little, 4/11/81), describe profármacos de ácido hidroxámico de base Mannich, su preparación y uso.

Estructura de péptidos conjugados En General . Los péptidos conjugados con vehículo de la presente invención, pueden ser descritos por la siguiente fórmula : F- [ (X1) - {Y1) n] (IV) en donde : X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -iX-P1 y -L2-P2, respectivamente; F es un vehículo covalentemente unido a X1 o Y1; L1 y L2 son independientemente en cada caso, ausentes o enlazadores que tienen desde 0 a 9 residuos de aminoácidos; n es 0 a 3; y P1 y, si se presenta, P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina . Los péptidos conjugados con vehículo de fórmula IV, comprenderán modalidades preferidas en donde P1 y, si se presenta, P2 son . independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina que tiene una secuencia peptídica como se muestra en cualquiera de las SEC ID NOS: 5-60 y derivados de las mismas. Modalidades preferidas adicionales de los péptidos conjugados con vehículo incluirán, péptidos conjugados con vehículo de fórmula IV, en donde P1, y si se presenta, P2 se definen por la fórmula: NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a1-COOH en donde : a° es un aminoácido heterocíclico o alicíclico, alifático, aromático básico o neutral, di-péptido o tripéptido que contiene ya sea uno o dos residuos que tienen cadenas .laterales básicas, o ausentes; a1, a2, a3 y a4 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos básicos o neutrales; a6 es Ser; a5, a7 y a8 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos, siempre que al menos uno de a5, a7 y a8 se seleccione de Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga y Nigb de la configuración D- o L-; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente. Más preferiblemente, P1 y, si se presenta, P2 son definidos por la fórmula: NH2-a°a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH en donde : a° es un aminoácido básico, un dipéptido que contiene cualquiera de uno o dos residuos con las cadenas laterales básicas o ausentes; a1 es un aminoácido básico; a2 es Pro; a3 es Hyp; a4 es Gly; a5 y a8 son un aminoácido indanilo; a6 es Ser; a7 es un aminoácido D-indanilo; a8 es Cpg; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente. Aún más preferiblemente, P1 y, si se presenta, P2, son definidos por la fórmula: NH2-a°a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a1-COOH en donde: a° es un aminoácido básico, un dipéptido que contiene cualquiera de una o dos cadenas laterales básicas o ausentes; a1 es un aminoácido básico; a2 es Pro; a3 es Hyp; a4 es Gly; a5 es Cpg; a6 es Ser; a7 es DTic; a8 es Cpg; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente. Aún más preferiblemente, péptidos conjugados con vehículo de la presente invención incluyen, péptidos conjugados con vehículos de fórmula IV, en donde n=0 y X1 es un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos como se muestra en las SEC ID NOS: 27-41 y derivados de los mismos. La presente invención también proporciona péptidos PEG-conjugados los cuales se enlazan y antagonizan la actividad de los receptores Bl de bradiquinina (Bl) y los cuales tienen propiedades farmacocinéticas demostrablemente superiores in vivo, comparadas con antagonistas Bl de péptido no conjugado. Los péptidos PEG-conjugados de la presente invención, pueden ser descritos por la siguiente fórmula (V) : en donde : X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -L1-?1 y -L2-P2, respectivamente; F es una porción PEG covalentemente unida a X1 o Y1; L1 y L2 son independientemente en cada caso, ausentes o enlazadores que tienen desde 0 a 9 residuos de aminoácidos; n es 0 a 3; y P1 y, si se presenta, P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina . Los péptidos PEG-conjugados de fórmula V, comprenderán modalidades preferidas en donde P1 y, si se presenta, P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina que tiene una secuencia peptídica como se muestra en cualquiera de las SEC ID NOS: 5-60 y derivados de las mismas. Modalidades preferidas adicionales de los péptidos PEG-conjugados incluirán, PEG-conjugados de fórmula V, en donde P1, y si se presenta, P2 se definen por la fórmula: NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a1-COOH en donde: a° es un aminoácido heterocíclico o alicíclico, alifático, aromático básico o neutral, di-péptido o tripéptido básico o ausente; a1, a2, a3 y a4 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos básicos o neutrales; a es Ser; a5, a7 y a8 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos, siempre que al menos uno de a5, a7 y a8 se seleccione de Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga y Nigb de la configuración D- o L-; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente. Más preferiblemente, P1 y, si se presenta, P2 son definidos por la fórmula: NH2-a0a1a2a3a4a5a5a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH en donde: a° es un aminoácido básico, un dipéptido básico o ausente; a1 es un aminoácido básico; a es Pro; a es Hyp; a4 es Gly; a5 y a8 son un aminoácido indanilo; a6 es Ser; a7 es un aminoácido D-indanilo; a8 es Cpg; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente.

Aún más preferiblemente, P1 y, si se presenta, P2, son definidos por la fórmula : NH2-a0a1a a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH en donde : a° es un aminoácido básico, un dipéptido básico o ausente; a es un aminoácido básico; a es Pro; a es Hyp; a4 es Gly; a5 es Cpg; a6 es Ser; a7 es DTic; a8 es Cpg; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o independientemente ausente. Aún más preferiblemente, péptidos PEG-conjugados de la presente invención incluyen, péptidos PEG-conjugados de fórmula V, en donde n=0 y X1 es un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen secuencia de aminoácido como se muestra en las SEC ID NOS: 27-41 y derivados de los mismos . Péptidos PEG-conjugados aún más preferidos de la presente invención incluidos en donde n = 0 y X1 es un péptido - seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen una secuencia de aminoácido como se muestra en las SEC ID NOS: 27-41 y derivados de los mismos. Aún más preferiblemente, los péptidos PEG-conjugados de la presente invención pueden ser descritos por la siguiente fórmula: F'-Rz, VI o una sal del mismo fisiológicamente aceptable, en donde: F' es un vehículo multivalente; R es independientemente en cada caso, -(X1)-(Y1)n en donde R está covalentemente unido a F' ; X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -Ir-?1 y -L2-P2, respectivamente; L1 y L2 son independientemente en cada caso ausente o enlazadores que tienen desde 0 hasta 9 residuos de aminoácidos; n es 0 a 3; Z es 2 a 8; y P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina. Péptidos PEG-conjugados aún más preferidos de la presente invención incluyen péptidos PEG-conjugados de fórmula VI en donde n es 0, Z es 4 a 8, y X1 es un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen una secuencia de aminoácido como se muestra en las SEC ID NOS: 27-41 y derivados de los mismos.

También propuesto como parte de la presente invención, están péptidos conjugados que tienen secuencias peptídicas que son fragmentos (es decir, "subsecuencias") , análogos, y derivados de P1, y si se presentan, P2 son como se definen en este documento y en donde tales péptidos conjugados son sustancialmente equivalentes con respecto a la actividad anti-Bl in vi tro y/o in vivo, conforme los conjugados peptídicos se describen específicamente en este documento. El término "análogo" está propuesto por significar moléculas que representan una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones acidas derivadas del arreglo lineal de aminoácidos de los péptidos, péptidos conjugados (P1 no conjugado y, si se presenta, P2) y/o cualquier enlazador peptidilo (L) de vehículo o péptidos PEG-conjugados proporcionados por las fórmulas (IV) y (V) , respectivamente, y lo cual resulta en moléculas las cuales son sustancialmente equivalentes con respecto a la actividad anti-Bl in vitro y/o in vivo, comparada con un péptido conjugado o péptido no conjugado análogo, descrito específicamente en este documento . Los análogos peptídicos conjugados de conformidad con esta invención, típicamente tendrán una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en la secuencia de (P) (P1 y/o si se presenta, P2) o (L) (L1 y/o, si se presenta, L2) . Se reconoce de manera general, que los cambios de aminoácido conservativos son más probablemente perturbantes a la estructura y/o función de un polipéptido y de manera general, involucran sustitución de un aminoácido con otro que es similar en estructura y/o función (por ejemplo, aminoácidos con cadenas laterales similares en tamaño, carga y/o forma) . La naturaleza de estas sustituciones es bien conocida por un experto en la técnica y las sustituciones ejemplares de aminoácido se resumen en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1: Sustituciones de Aminoácidos Básico : Arg; Lys; His; Acídico: Glu; Asp Polar : Glu; Asp; Gln; Asn; Ser; Thr Hidrofílico : Asp; Glu; Asn; Ser; Thr; Tyr Hidrofóbico ; Ala; Met; lie; Leu; nor-Leu; Val Aromático : Phe; Trp; Tyr Pequeño: Gly; Ala; Ser; Thr; Met Tabla 2 : Sustituciones de Aminoácidos A 'no' Sustituciones Preferidas Sustitución ácido mas preferida Ala Gly; Leu; lie; Asn; Pro ' Val Arg Ala; Asn; Gln; Ser Lys Asn Arg; Gln; His; Lys; Ser; Tyr Gln Asp Asn; Ser; Thr; Gln Glu Cys Ala Ser Gln Ala; Arg; Glu; Leu; Lys; Met; Ser; Tyr Asn Glu Gln; Ser; Thr; Asn Asp Gly Pro His Asn; Gln; Lys; Tyr; Phe Arg lie Tyr; Val; Met; Ala; Phe; nor-Leu Leu Leu nor-Leu; lie; Val; Met; Ala; Phe lie Lys Asn; Asp; Ala; Glu; Gln; Ser; Tyr Arg Met Ala; Gln; Tyr; Trp; Phe " Leu Phe Leu; Val; lie; Ala; Met Leu Pro lie; Val Gly Ser Ala; Asn; Asp; Gly; Lys Thr Thr Ala; Gly; lie; Val; Lys Ser Trp Phe; Tyr; His Tyr Tyr Trp; Thr; Ser Phe Val Ala; lie; Met; Phe; Tyr; nor-Leu Leu Cambiar de A, F, H, I, L, M, P, V, W o' Y a C, es más preferido si la nueva cisteína permanece como un tiol libre. Las sustituciones deseadas de aminoácido (sean conservativas o no conservativas) , pueden ser determinadas por aquellos expertos en la técnica al tiempo en que tales sustituciones se desean. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácido pueden ser usadas para identificar residuos importantes de la secuencia peptídica, o para incrementar o disminuir la afinidad de las moléculas peptídicas conjugadas y/o no conjugadas descritas en este documento. En ciertas modalidades, las sustituciones conservativas de aminoácidos también abarcan residuos de aminoácidos que no se originan naturalmente, los cuales son típicamente incorporados por síntesis peptídica química. Como se notó en la sección anterior, residuos que se originan naturalmente pueden ser divididos en clases basados en propiedades de cadenas laterales comunes que pueden ser útiles para modificaciones de secuencia. Por ejemplo, sustituciones no conservativas pueden involucrar el cambio de un elemento de una de estas clases, por un elemento de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden ser introducidos en regiones del péptido que son homologas con ortólogos no humanos, o en las regiones no homologas de la molécula. Además, también se pueden hacer modificaciones usando P o G para propósitos de influenciar la orientación de la cadena. Haciendo tales modificaciones, el índice hidropático de aminoácidos puede ser considerado. A cada uno de los aminoácidos le ha sido asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga, estos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). La importancia del índice de aminoácido hidropático para conferir función biológica interactiva en una proteína, se entiende en la técnica. Kyte et al . , J. Mol. Biol . , 157:105-131 (1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o registro hidropático similar y todavía retienen una actividad biológica similar. Se prefiere hacer cambios basados en el índice hidropático, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de + 2, aquellos los cuales están dentro de + 1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de + 0.5 son aún más particularmente preferidos. También se entiende en la técnica, que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer efectivamente en base a la hidrofilicidad. La hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 +_ 1); glutamato (+3.0 + 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 + 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leuciña (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptofano (-3.4). Se prefiere hacer cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de + 2, aquellos los cuales están dentro de + 1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de + 0.5 son aún más particularmente preferidos. También se pueden identificar epítopes de secuencias de aminoácido primarias en base a su hidrofobicidad. Estas regiones son también referidas como "regiones nucleares epitópicas". Un experto en la técnica será capaz de determinar análogos adecuados de los péptidos conjugados y/o no conjugados expuestos en este documento, usando técnicas bien conocidas. Un experto en la técnica podrá saber también que se pueden sustituir aminoácidos químicamente similares por residuos que se originan en el péptido nativo mientras retienen actividad (sustituciones de residuos conservativos de aminoácidos) . Por lo tanto, aún áreas que pueden ser importantes para determinar la actividad biológica o para estructura, pueden ser sometidas a sustituciones * conservativas de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura de péptido conjugado o no conjugado.

Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar estudios de estructura-función identificando residuos dentro de la secuencia peptídica conjugada y/o no conjugada que son importantes para la actividad o estructura. En vista de tal comparación, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoácido en una secuencia peptídica. Un experto en la técnica puede optar por sustituir químicamente, sustituciones similares de aminoácidos por tales residuos de aminoácidos predichos importantes de péptidos conjugados y/o no conjugados de la presente invención. Se han dedicado un número de publicaciones científicas, a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J. , Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 (2) : 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2) : 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. reas Mol., Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al., Biophys. J. , 26: 367-384 (1979). Sin embargo, programas de ordenadores están actualmente disponibles para asistir en la predicción de la estructura secundaria. Métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "cargado" (Jones, ,D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(l):15-9 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym. , 183:146- 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad Sci., 84 (13) :4355-8 (1987)), y "enlace evolucionarlo" (Véase Home, supra, y Brenner-, supra) . Los péptidos y/o análogos peptídicos conjugados y derivados de conformidad con la invención, serán útiles para los mismos propósitos para los cuales los péptidos análogos y/o péptidos conjugados descritos específicamente en este documento son útiles (es decir, antagonistas de la actividad Bl in vitro y/o in vivo) .

Péptidos. Los péptidos de la presente invención incluyen péptidos que comprenden la secuencia mostrada en las SEC ID NOS: 15-35 y 39-54. Las secuencias peptídicas P1 y, si se presentan, P2 (P) , dentro del vehículo o péptidos PEG-conjugados de la presente invención, incluyen como se mencionó, péptidos que se enlazan a y antagonizan (es decir, disminuyen), la actividad de Bl . El vehículo o péptidos PEG-conjugados preferidos de la presente invención, comprenden al menos una secuencia peptídica - seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 5-60 y derivados de los mismos. Más preferiblemente, el vehículo o péptidos PEG-conjugados de la presente invención, comprenden al menos una secuencia peptídica seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 27-41 y derivados de los mismos.

Tabla 3 Péptidos de Bradiquinina Receptor /E f ecto Péptido Secuencia Peptidica Bradiquinina, BK Agonista. B2/B1 (SEG ID N0:1) Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Calidina, Lys-BK Agonista B2 (SEC ID N0:2) Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Met-Lys-BK Agonista. B2 (SEC ID 110:3) Met Lys Arg Pro Pro Gly he Ser Pro Phe Arg des-Arg-BK Agonista Bl {SEC ID N0:4) Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe [Le 8] -Des-Arg9-BK Antagonista Bl (SEC ID N0:5) Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu DALK Antagonista Bl (SEC ID NO: 6) Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu Antagonista B2 (SEC ID N0:7) DArg Arg Pro Hyp Gly Thi Ser DTic O c Arg Antagonista B1/B2 (SEC ID NO: 8) DArg Arg Pro Hyp Gly Thi Ser DTic Oic Antagonista B2 ( SEC ID N0:9) DArg Arg Pro Hyp Gly Thi Ser DHpe Oic Arg Antagonista Me- Bl (SEC ID N0:10) Ac Lys Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal lie Antagonista B1/B2 (SEC ID NO: 11) DArg Arg Pro Hyp Gly Igl Ser DIgl Oic Arg Antagonista Bl (SEC ID N0:12) Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Igl Ser DIgl Oic Antagonista Bl (SEC ID N0:13) Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic cpg Antagonista B1/B2 (SEC ID N0:14) DArg Arg Pro Hyp Gly Igl Ser Df5f Igl Arg Antagonista Bl (SEC ID N0:15) DOrn ys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg Antagonista Bl (SEC ID NO:16) DOmLys Arg Pro Thz Gly Cpg Ser Dtic cpg Antagonista Bl (SEC ID N0:17) 3PalLys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg Antagonista Bl (SEC ID NO: 18) 4Pal ys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg Antagonista Bl (SEC ID N0:19) Cha Arg Pro Hyp Gly cpg Ser Dtic Cpg Antagonista Bl (SEC ID NO: 20) 2-NalArg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtis Cpg Antagonista Bl (SEC ID N0:21) Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic cpg Antagonista Bl (SEC ID N0:22) DLysLys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg Antagonista Bl (SEC ID N0:23) Lys DOrn Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic cpg Antagonista Bl (SEC ID N0:24) Lys Cha Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic cpg Antagonista Bl (SEC ID NO: 25) Lys Abu Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg Antagonista Bl (SEC ID NO:26) Lys 2-Nal Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg D-Antagonista Bl (SEC ID NO: 3) Dab Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic cpg D-Antagonista Bl (SEC ID NO: 4) Ac Dab Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic pg Antagonista Bl (SEC ID N0:45) DOrnLys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic cpg Antagonista Bl (SEC ID NO:46) Ac DOrnLys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic cpg D- 3'Pa Antagonista Bl (SEC ID NO: 7) 1 Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic cpg S?C D- 3'Pa Antagonista Bl (SEC ID NO: 48) Ac 1 Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg D- D-2- Antagonista Bl (SEC ID NO:49) Lys Nal Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg D-2- Antagonista Bl (SEC ID NO: 50) Lys Nal Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg Me- Antagonista Bl (SEC ID NO:51) DOrn Arg Oic Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal lie Me- Antagonista Bl (SEC ID N0:52) As DOrn Arg Oic Pro Gly phe Ser D-ß-Nal lie Me- Antagonista Bl (SEC ID N0:53) DOrn Lys Arg Oic Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal lie Me— Antagonista Bl (SEC ID NO:54) DOrnLys Arg Oic Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal lie Antagonista Bl (SEC ID NO: 55) Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal lie Antagonista Bl (SEC ID NO: 56) Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal He Me- Antagonista Bl (SEC ID NO:57) Orn Arg Oic Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal He Me- Antagonista Bl (SEC ID NO: 58) Orn. Arg Ois Pro. Gly phe Ser D-ß-Nal He Me- Antagonista Bl (SEC ID NO: 59) Lys Arg Oic Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal He Me- Antagonista Bl (SEC ID NO: 60) Lys Arg Oic Pro Gly Phe Ser D-ß-Nal He Vehículos. El término "vehículo" como se usa en este documento, se refiere a una molécula que previene la degradación y/o incrementa la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad o incrementa la actividad biológica de un péptido o proteína terapéutica. Los vehículos útiles en el contexto de la presente invención son conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Publicación de PCT WO 98/07746) , la cual está por este medio, incorporada por referencia en su totalidad) , y están todos fácilmente disponibles para aquellos expertos en la técnica. En el contexto de la presente invención, los vehículos preferidos incluyen, pero no se limitan a, polimetilenglicol, polihidroxipropilenglicol, polipropilenglicoles y óxidos, polimetilpropilenglicol, polihidroxi-propilenóxido, polipropilenglicoles de cadena recta y cadena ramificada y derivados de los mismos, polietilenglicol • y polipropilenglicol y monometiléteres, monocetiléteres, mono- n-butiléteres, mono-t-butiléteres y monooleiléteres de los mismos, esteres y polialquilenglicoles con ácidos carboxílicos y productos de condensación por deshidratación de polialquilenglicoles con aminas y otros polialquilenóxidos y glicoles y derivados de los mismos, poli (vinilpirrolidona) , alcohol polivinílico, poli (vinilacetato) , copolímero poli (vinilacetato-co-alcohol vinílico), poliviniloxazolidona, poli (vinilmetiloxazolidona y poli (vinilmetiléter) , poli (ácido acrílico), poli (ácido metacrílico), polihidroxieti'lmetacrilatos, poli (acrilamida) y poli (metacrilamida) y otras amidas de los mismos, p'oli(N,N-dimetilacrilamina) , poli (N-isopropilacrilamida) , poli (N-acetamidoacrila ida) y poli (N-acetamidometacrilamida) , y otros derivados N-sustítuidos de las amidas. Un aspecto de la invención requiere la presencia de al menos un vehículo (F) unido a una porción enlazadora no peptidilo o un residuo de aminoácido de un enlazador de peptidilo que está covalentemente fusionado a un antagonista Bl peptídico. En el contexto de la presente invención, un vehículo preferido constituye una molécula PEG, como se define en este documento. Un vehículo aún más preferido, constituye una molécula PEG multivalente, como se define en este documento.

El vehículo o moléculas PEG-conjugadas específicamente descritas o referenciadas en este documento, pueden ser ligeramente modificadas dentro de las regiones denotadas por (X1)-(Y1)n (como se define supra) , para formar un análogo de conformidad con la invención, siempre que el antagonismo de Bl sea sustancialmente mantenido. Como entre el vehículo o péptidos PEG-conjugados de la presente invención y análogos del mismo, es preferible que no más de tres residuos no terminales en la región (P) sean diferentes. Más preferiblemente, análogos contemplados por la presente invención incluyen moléculas con hasta dos sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos en cualquier sitio no terminal particular de la región (P) del vehículo o péptido PEG-conjugado de la presente invención. Más preferiblemente, la divergencia en la secuencia entre un vehículo y un análogo del mismo contemplado, particularmente en la región especificada (P) , está en la forma de una o más "modificaciones conservativas" .

Enlazadores . El término "enlazador" como se usa en este documento, se refiere a L1 y, si se presenta L2 como se muestra en ya sea la fórmula IV y V { supra) , es abreviado en este documento por (L) . Preferiblemente, (L) es peptidilo en forma natural (es decir, elaborado de aminoácidos ligados en conjunto por enlaces peptídicos) y elaborados desde 1 hasta 9 aminoácidos. Más preferiblemente, (L) se elabora desde 1 hasta 9 aminoácidos, en donde los aminoácidos son seleccionados de los veinte aminoácidos que se originan naturalmente. En una modalidad aún más preferida, los 1 a 9 aminoácidos del enlazador peptidilo son seleccionados de cisteína, glicina, alanina, prolina, arginina, asparagina, glutamina y lisina. Aún más preferiblemente, un enlazador peptidilo se elabora de una mayoría de aminoácidos que son estéricamente no obstaculizados, tales como glicina y alanina ligados por un enlace peptídico. De este modo, enlazadores peptidilo preferidos son poli (Gly) ?_8, particularmente (Gly)3 (SEC ID NO: 100), (Gly)5 (SEC ID NO:101) y (Gly)7 (SEC ID NO: 102), así como también poli (Gly- la) 2_4 y poli (Ala) ?_8.

Otros ejemplos específicos de enlazadores peptidilo incluyen (Gly)5Lys (SEC ID NO: 103), y (Gly)5LysArg (SEC ID NO: 104). Otras combinaciones de Gly y Ala también son preferidas . Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly)5Lys significa Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys . Un enlazador peptidilo puede contener una cisteína N-terminal, otro tiol o nucleófilo para conjugación con un vehículo. Un enlazador más preferido contiene un residuo cisteína u ho ocisteína N-termina, u otra porción 2-amino-etantiol o 3-amino-?ropantiol para conjugación a vehículos funcionalizados de maleimida, yodoacetamida o tioéster. El tratamiento del aducto de 3-sulfanil succinimida inicial (le) formado por la reacción de un péptido con PEG activado con maleimida, con base en exceso, convierte el aducto de succinimida menos estable en la forma 6-metilcarbamoil-5-oxo-tiomorfolin-3-carboxamida hidrolíticamente estable (ld, Esquema de Reacción 1) . Alternativamente, PEGs de tioéster o yodoacetamido comercialmente disponibles (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) , pueden ser usados para la conjugación quimioselectiva como se representa en los Esquemas de Reacción 2 y 3.

Esquema de Reacción 1 1d Esquema de Reacción 2 H3CO(CH2CH20)n-CH2CH2 2a 2b 2d Esquema de Reacción 3 H3CO(CH2CH20)n-C.y2CH2NH2C- + 3-a 3-b Otro enlazador preferido es un enlazador flexible, largo, que comprende una secuencia aleatoria Gly/Ser/Thr (GSGSATGGSGSTASSGSGSATH; SEC ID NO: 105) que se estima sea aproximadamente el tamaño de una molécula PEG de Ik. Adicionalmente, un enlazador peptidilo puede comprender un segmento no peptidilo tal como una molécula alifática de 6 carbonos de la fórmula -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 (Enlazador Rígido: AEAAAKEAAAKEAAAKAGG-) . Alternativamente, un enlazador no peptidilo que contiene un nucleófilo reactivo puede estar presente en X1 y, si se presenta, Y2. Por ejemplo, pueden usarse enlazadores alquilo tales como -NH- (CH2) S-C (O) -, en donde s = 2-20. Estos enlazadores de alquilo puede además, ser sustituidos por cualquier grupo no esféricamente obstaculizante, tal como alquilo inferior (por ejemplo, Ca-C6) , acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2, fenilo, etc. Enlazadores no peptidilo ejemplares son los enlazadores PEG (mostrados abajo: en donde n es tal, que el enlazador tiene un peso molecular de 100 hasta 5000 kilodaltons (kD) , preferiblemente 100 a 500 kD, m es = 1-3. Preferiblemente, un enlazador no peptidilo es aromático. Los enlazadores pueden ser alterados para formar derivados en la misma manera como se describe en este documento. Además, las porciones PEG pueden ser unidas a la amina N-terminal o aminas de cadena lateral seleccionadas por ya sea alquilación reductiva usando aldehidos de PEG o acilación usando hidroxisuccinimido o esteres de carbonato de PEG. Cualquiera de los enlazadores descritos anteriormente puede ser usado en este procedimiento. Alternativamente, un PEG adecuadamente funcionalizado puede ser unido directamente a cualquiera de los antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina como se muestra en las SEC ID NOS: 5-26 ó SEC ID NOS: 43-60, o directamente a un residuo de aminoácido de un enlazador peptidilo que es covalentemente fusionado a cualquiera de los antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina como se muestra en las SEC ID NOS: 5-26 ó 43-60. Se apreciará que, puesto que el vehículo y/o los péptidos objetivos pueden ser multivalentes, es posible por el proceso de la invención, producir una ' variedad de estructuras de vehículo:péptido. Por medio del ejemplo, un vehículo univalente ' y un péptido univalente, producirán un conjugado 1:1; un péptido bivalente y un vehículo univalente, pueden formar conjugados en donde los conjugados peptídicos portan dos porciones de vehículos, mientras un vehículo bivalente y un péptido univalente pueden producir especies en donde dos entidades peptídicas están ligadas a una porción de vehículo único; el uso de vehículos de valencia superior, puede conducir a la formación de agrupamientos de entidades peptídicas unidas a una porción de vehículo único, mientras los péptidos de valencia superior pueden llegar a incrustarse con una pluralidad de porciones de vehículos . Las porciones peptídicas pueden tener más de un grupo reactivo, el cual reaccionará con el vehículo activado y la posibilidad de formar estructuras complejas siempre debe ser considerada; cuando se desea formar estructuras simples tales como aductos 1:1 de vehículo y péptido, o usar vehículos bivalentes para formar aductos de péptido: vehículo:péptido, será benéfico usar proporciones determinadas de vehículo activado y material peptídico, concentraciones predeterminadas de los mismos, y conducir la reacción bajo condiciones predeterminadas (tales como duración, temperatura, pH, etc.), para formar una proporción del producto descrito y después separar el producto de otros productos de reacción. Las condiciones, proporciones y concentraciones de reacción de los reactivos, se pueden obtener por experimentos de ensayo-error relativamente simples, los cuales están dentro de las capacidades de un experto de habilidad ordinaria con escalamiento apropiado como sea necesario. La purificación y separación de los productos es lograda de manera similar, por técnicas convencionales bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Sin embargo, como se usa en la especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", y "el", incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo. Así, por ejemplo, la referencia a "un antagonista de péptido conjugado con vehículo" o "un antagonista de péptido PEG-conjugado", incluye mezclas de tales conjugados, y la referencia al "método de tratamiento", incluye referencia a uno o más métodos de tratamiento del tipo el cual se conocerá por aquellos expertos en la técnica, o llegará a conocerse por ellos después de leer esta especificación y así sucesivamente. Las PEGilaciones convencionales a través de la conjugación de PEG-maleimida con un grupo tiol de péptidos y polipéptidos que tienen residuos de aminoácido de cisteína, se corren en amortiguador de fosfato con o sin solvente orgánico. La alta solubilidad de péptidos y polipéptidos PEGilados y la inestabilidad potencial del anillo pirrolidin-2,5-diona en agua, ha obstaculizado la aplicación de este método para producción y purificación a gran escala de péptidos y proteínas PEGilados. Por lo tanto, se describe en este documento, nuevas condiciones no acuosas para la conjugación de mPEG-maleimida con un grupo tiol de péptidos y polipéptidos que tienen residuos de cisteína. El nuevo proceso resulta en rendimientos moderados a altos de péptidos PEGilados y polipéptidos, y combina la adición Michael y aminólisis ' en un crisol (Esquema de Reacción 4) . Ambas condiciones resultan en aislamiento directo de péptidos y polipéptidos PEGilados a través de precipitación.

Esquema de Reacción 4 En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 4, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, se puede sustituir el metanol (MeOH) con un solvente que comprende uno o más de los siguientes solventes: metanol, etanol, alcohol isopropílico, n-propanol, n-butanol, diclorometano (DCM) , acetonitrilo (AcN) , tetrahidrofurano (THF) , dimetilformamida (DMF) , dimetilacetamida (DMAc) y N-metilpirrolidona (NMP) . En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 4, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, el TBME puede ser sustituido con un solvente que comprende uno o más de los siguientes solventes: éter dietílico, metilisopropiléter y diisopropiléter . En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 4, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, la reacción 1) como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 60°C. Preferiblemente, la reacción 1) como se representa por el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 50°C. Más preferiblemente, la reacción 1) como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente 35 °C hasta aproximadamente 45°C. Más preferiblemente, la reacción 1) como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida a temperatura ambiente . En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 4, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, la reacción 2) como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 60 °C. Preferiblemente, la reacción 2) como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 50°C. Más preferiblemente, la reacción 1) como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente 35 °C hasta aproximadamente 45 °C. Más preferiblemente, la reacción 2) como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida a temperatura ambiente. En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 4, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, la reacción de precipitación como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida por al menos 10 minutos. Más preferiblemente, la reacción de precipitación como se representa en el Esquema de Reacción 4, puede ser conducida por al menos 60 minutos. Más preferiblemente, la reacción de precipitación como se representan en el Esquema de Reacción 4, se conduce por aproximadamente 60 minutos.

En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 4, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, la reacción de precipitación, filtración y/o purificación, se puede conducir más de una vez. En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 4, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, las reacciones de precipitación y/o purificación se pueden conducir más de una vez. Los péptidos parcialmente protegidos son reactivos especialmente útiles para esta estrategia conforme permiten la modificación selectiva de sitios específicos de péptidos polifuncionales. Los grupos protectores son removidos de los conjugados PEG usando métodos de desprotección establecidos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de síntesis peptídica. Los péptidos parcialmente protegidos adecuados para esta solicitud, pueden ser preparados usando estrategias de protección ortogonal bien conocidas por personas expertas en la técnica de síntesis peptídica. Una ilustración de la síntesis y de conjugación de un antagonista peptídico parcialmente protegido del receptor Bl de bradiquinina, se representa en el Esquema de Reacción 5. Análogos en los cuales las aminas de cadenas laterales sirven como sitios de conjugación, pueden ser preparados de aminoácidos básicos ortogonalmente protegidos fácilmente disponibles . Esquema de Reacción 5 Las formas parcialmente protegidas de péptidos antagonistas Bl, tales como aquellas listada sen la Tabla 3 (SEC ID NOS: 5-60), pueden ser conjugadas a porciones PEG usando métodos similares. En una modalidad de los procesos representados en el Esquema de Reacción 5, las cadenas laterales de amina' de los péptidos parcialmente protegidos 5c, son enmascaradas por porciones de terc-butilcarbamoilo (Boc) y los péptidos resultantes se hacen reaccionar con cualquiera de los aldehidos de EPG previamente descritos, en solventes orgánicos tales como 1,2-dicloroetano (DCE), N,N- dimetilformamida (DMF) o mezclas de los mismos. La formación de la imina intermediaria puede ser acelerada por la adición de un agente deshidratante tal como tamices moleculares 4°A en polvo. Después de la agitación a temperatura ambiente por 1-24 horas, la imina resultante se reduce por la adición de 1-4 equivalentes de triacetoxi borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio. En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 5, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, las reacciones con péptidos parcialmente protegidos, tales como 5c, pueden ser conducidas a una temperatura de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 60 °C. Preferiblemente, las reacciones con péptidos parcialmente protegidos tales como 5a, como se representa en el Esquema de Reacción 5, pueden ser conducidas a una temperatura de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 50 °C. Más preferiblemente, las reacciones con péptidos parcialmente protegidos, tales como 5c como se representa en el Esquema de Reacción 5, pueden ser conducidas a una temperatura de aproximadamente 35 °C hasta aproximadamente 45 °C. La mayoría de las reacciones con péptidos parcialmente protegidos tales como 5a como se representa en el Esquema de Reacción 5, pueden ser conducidas a temperatura ambiente. En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 5, las cadenas laterales de amina de los péptidos parcialmente protegidos .5c, son enmascaradas por porciones de terc-butilcarbamoilo (Boc) , y los péptidos resultantes se hacen reaccionar con cualquiera de los reactivos PEG de p-nitrofeniléster o N-hidroxisuccinimida de PEG descritos previamente, en solventes orgánicos tales como 1, 2-dicloroetano (DCE), N, N-dimetilformamida (DMF), diclorometano, N-metilpirrolidina (NMP) o mezclas de los mismos. Los esteres de PEG activados pueden ser ya sea variedades monofuncionales o bifuncionales lineales, las cuales son comercialmente disponibles de proveedores tales como Nektar o NOF. Además, el éster de PEG activado polifuncional ramificado, que contiene porciones de 3-6-hidroxisuccinimida o p-nitrofeniléster, es especialmente empleado en la preparación de conjugados de la presente invención. En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 5, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, las reacciones con péptidos parcialmente protegidos tal como 5c, pueden ser conducidas a una temperatura de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 60 °C con tiempos de reacción que varían desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 10 días. Preferiblemente, las reacciones con péptidos parcialmente protegidos tales como 5c como se representa en el Esquema de Reacción 5, pueden ser conducidas a una temperatura de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 50 °C, con tiempos de reacción que varían desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 5 días. Más preferiblemente, las reacciones con péptidos parcialmente protegidos tales como 5c como se representa en el Esquema de Reacción 5, pueden ser conducidas a una temperatura de aproximadamente 35 °C hasta aproximadamente 45 °C, con tiempos de reacción que varían desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 días . La mayoría , de las reacciones con péptidos parcialmente protegidos, tales como 5c como se representa en el Esquema de Reacción 5, pueden ser conducidas a temperatura ambiente con tiempos de reacción que varían desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 días . En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 5, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, la remoción de los grupos protectores de cadena lateral como se representa en el Esquema de Reacción 5, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente -20 °C hasta aproximadamente 60 °C. Esta reacción puede ser realizada en un solvente compatible, tal como diclorometano, usando entre aproximadamente 5% de ácido trifluoroacético (TFA) y 50% de TFA en volumen. Preferiblemente, la remoción del grupo protector mediado por ácido como se representa en el Esquema de Reacción 5, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 40 °C, ' usando aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25% de TFA por volumen. Más preferiblemente, la remoción del grupo protector mediada por ácido como se representa en el Esquema de Reacción 5, puede ser conducida a una temperatura de aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 25 °C, usando aproximadamente 10% hasta aproximadamente 20% de TFA por volumen en diclorometano. Más preferiblemente, la remoción del grupo protector mediada por ácido, como se representa en el Esquema de Reacción 5, se puede conducir a temperatura ambiente usando aproximadamente 20% en volumen en diclorometano. En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 5, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, los productos 5d representados en el Esquema de Reacción 4, pueden ser CLAR de fase inversa purificado, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico o diálisis de membrana. Más preferiblemente, una combinación de dos o más de las técnicas de purificación mencionadas anteriormente, puede ser usada ya sea en combinación o secuencialmente, proporcionar los conjugados purificados de la presente invención. En otra modalidad del proceso representado en el Esquema de Reacción 5, en conjunto con cualquiera de las modalidades anteriores o posteriores, el método de purificación puede ser conducido más de una vez.

Derivativos . También contemplados en este documento, están derivados de péptidos y/o péptidos conjugados de la presente invención. Tales derivados pueden mejorar además, la solubilidad, absorción, vida media biológica y similares del vehículo o péptidos PEG-conjugados descritos en este documento. Las porciones agregadas pueden alternativamente eliminar o atenuar cualquier característica indeseable de los péptidos y/o 'péptidos conjugados descritos en este documento. Derivados ejemplares incluyen vehículo o péptidos PEG-conjugados en los cuales: 1. Los péptidos y/o péptido conjugado o alguna porción del mismo es cíclica. Por ejemplo, la porción del péptido de un péptido y/o péptido conjugado puede ser modificada para contener dos o más residuos de cisteína (por ejemplo, en el enlazador peptidilo), la cual será ciclizada por formación de enlace de disulfuro. Para citaciones para referencia en la preparación de derivados ciclizados, véase WO 00/24782. 2. El péptido y/o vehículo o péptido PEG-conjugado es reticulado o es proporcionado capaz de reticularse entre moléculas. Por ejemplo, la porción del péptido de un péptido conjugado se puede modificar para contener un residuo • Cys y co ello es capaz de formar un disulfuro intermolecular unido con una molécula similar. 3. Uno o más enlaces peptidilo [-C(0)NR-] (enlaces peptídicos) se reemplazan por un enlace no peptidilo. De forma ejemplar, los enlaces no peptidilos son -CH2-carbamato [-CH2-OC(0)NR-] , fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S (O) 2NR-] , urea [-NHC (O) H-] , amina CH2-secundaria y péptido alquilado [-C(0)NRd- en donde Rd es alquilo inferior]. 4. El residuo de cisteína N-terminal de un péptido conjugado en X1 puede ser sustituido con un grupo derivado N-terminal. De forma ejemplar grupos derivados N-terminal incluyen -NHR1 en donde R1 es monoalquilo. La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos conjugados con vehículo o sus derivados funcionales para una matriz de soporte insoluble en agua o para otros vehículos macromoleculares . Agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, flutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncional, que incluyen esteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas 'bifuncionales tal como bis-N-maleimido-1, 8-octano. Agentes derivatizantes tales como metil-3- [ (p-azidofenil) ditio] -propioimidato proporcionan intermediarios foto-activables que son capaces de formar reticulaciones en la presencia de luz. De forma alternativa, matrices insolubles en agua reactivas tales como carbohidratos activados por cianogenbromuro y los sustratos reactivos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440 se emplean para inmovilización de proteína. Grupos de carbohidratos (oligosacáridos) pueden ser convenientemente unidos a sitios que se conoce por ser sitios de glicosilación en proteínas. Generalmente, los oligosacáridos O-enlazados se unen a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) , mientras los oligo-sacáridos N-enlazados se unen a residuos de asparagina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-Aaa-Ser/Thr, en donde Aaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. Aaa preferiblemente es uno de los diecinueve aminoácidos que se originan de forma natural diferentes a prolina. Las estructuras de oligosacáridos N-enlazados u O-enlazados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que es comúnmente encontrado en ambos es ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico) . El ácido siálico usualmente es el residuo terminal de oligosacáridos tanto N-enlazado como O-enlazado y, por virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades acídicas para el péptido conjugado glicosilado. Tal (es) sitio (s) pueden ser incorporado (s) en el enlazador de los péptidos conjugados con vehículo de la invención. Tales sitios pueden además ser glicosilados por procedimientos sintéticos o semi-sintéticos conocidos en la técnica. Otras modificaciones posibles incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en cisteína, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina y/o histidina (Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)). A menos que se describa de otro modo en este documento, la síntesis de péptidos y/o péptidos conjugados descritos en este documento, que incluye la preparación de derivados de aminoácido apropiado, su activación y acoplamiento para formar péptidos y métodos para purificación de péptidos y determinación de su pureza, se incluyen en el cuerpo general del conocimiento , de química peptídica, como generalmente se describe en Houben-Weyl "Methoden der Organischen Chemie" Vol. 6, partes I y II (1974) para síntesis de fase de solución. Para síntesis por el método de fase sólida, se conocen bien en el arte técnicas adecuadas, e incluyen aquellas descritas en Merrifield, Chem. Polypeptides, páginas 335-361 (Katsoyannis and Panayotis editores) (1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., Volumen 85, página 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl., Volumen 10, páginas 394-414 (1985); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); Patente Estadounidense No. 3,941,763; Finn et al., The Proteins (3ra. Edición), Volumen 2, páginas 105-253 (1976); y Erickson et al., The Proteins (Tercera Edición) , Volumen 2, páginas 257-527 (1976) . Un experto químico en la técnica de síntesis peptídica será adecuado para sintetizar los péptidos descritos por métodos de solución estándar o por métodos de fase sólida automática y manual. La síntesis de fase sólida es la técnica preferida para elaborar' péptidos individuales porque su efectividad de costo .

Composiciones Farmacéuticas En general . La presente invención también proporciona métodos usando composiciones farmacéuticas de los péptidos inventivos y/o péptidos conjugados con vehículo, por ejemplo, en la prevención o tratamiento de inflamación y dolor (que incluye, pero no se limita a, dolor inflamatorio e hiperplasia asociada y Alodinia) . Los péptidos y/o péptidos conjugados con vehículo de la invención también tienen valor terapéutico para la prevención o tratamiento de otras condiciones dolorosas asociadas con o mediadas por activación Bl, que incluyen, pero no se limitan a, síndrome de dolor talámico, diabetes, toxinas y quimioterapia, apoplejía séptica, artritis, síndromes vascular mezclado y no vascular, inflamación general, artritis, enfermedades reumáticas, lupus, osteoartritis, trastornos inflamatorios del intestino, trastornos inflamatorios del ojo, trastornos inflamatorios o inestables de la vejiga, psoriasis, enfermedades en la piel con componentes inflamatorios, insolación, carditis, enfermedad inflamatoria del intestino, dermatitis, miositis, neuritis, enfermedad vascular de colágeno, condiciones inflamatorias crónicas, lesión o disfunción del tejido epitelial, herpes simple, dolor de neuropatía diabética, neuralgia post-herpética, causalgia, dolor simpatéticamente mantenido, síndromes de. desaferentización, dolor de cabeza por tensión, angina, migraña, dolor quirúrgico, alteración de motilidad visceral en regiones respiratoria, genitourinaria, gastrointestinal o vascular, heridas, . quemaduras, rinitis alérgica, asma, reacciones alérgicas de la piel, pruritos, vitíligo, trastornos grastointestinales generales, colitis, ulceración gástrica, ulceras duodenales o rinitis alérgica o vasomotor. La invención también se proporciona para el uso de los péptidos y/o péptidos conjugados con vehículo de la presente invención para la prevención o tratamiento de dolor agudo, dolor dental, dolor de espalda, dolor de espalda baja, dolor de trauma, dolor quirúrgico, dolor que resulta de amputación o abscesos, causalgia, enfermedades de desmielinación, neuralgia trigémina, cáncer, alcoholismo crónico, apoplejía, síndrome del dolor talámico, diabetes, síndrome de inmunodeficiencia adquirida ("SIDA") , toxinas y quimioterapia, dolor de cabeza general, migraña, dolor de cabeza en grupo, síndromes vascular mezclado y no vascular, dolor de cabeza por tensión, inflamación general, artritis, enfermedades reumáticas, lupus, osteoartritis, trastornos inflamatorios del intestino, trastornos inflamatorios del ojo, trastornos inflamatorios o indeseables de la vejiga, psoriasis, enfermedades de la piel con componentes inflamatorios, insolación, carditis, dermatitis, miositis, neuritis, enfermedades vasculares de colágeno, condiciones inflamatorias crónicas, dolor inflamatorio e hiperalgesia asociada y alodinia, dolor neuropático e hiperalgesia asociada y alodinia, dolor neuropático diabético, causalgia, dolor simpatéticamente mantenido, síndromes de desaferentización, asma, rinitis alérgica, lesión o disfunción del tejido epitelial, herpes simple, neuralgia post-herpética, alteración de motilidad visceral en regiones respiratoria, genitourinaria, gastrointestinal o vascular, heridas, quemaduras, reacciones alérgicas de la piel, pruritos, vitíligo, trastornos gastrointestinales generales, colitis, ulceración gástrica, ulceras duodenales y trastornos bronquiales.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso de uno o más de los péptidos y/o péptidos conjugados con vehículo de la presente invención en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un trastorno tal como dolor agudo, dolor dental, dolor de espalda, dolor de espalda baja, dolor de trauma, dolor quirúrgico, dolor que resulta de amputación o abscesos, causalgia, enfermedades de desmielinación, neuralgia trigémina, cáncer, alcoholismo crónico, apoplejía, síndrome del dolor talámico, diabetes, síndrome de inmunodeficiencia adquirida ("SIDA") , toxinas y quimioterapia, dolor de cabeza general, migraña, dolor de cabeza en grupo, síndromes vascular mezclado y no vascular, dolor de cabeza por tensión, inflamación general, artritis, enfermedades reumáticas, lupus, osteoartritis, trastornos inflamatorios del intestino, trastornos inflamatorios del ojo, trastornos inflamatorios o indeseables de la vejiga, psoriasis, enfermedades de la piel con componentes inflamatorios, insolación, carditis, dermatitis, miositis, neuritis, enfermedades vasculares de colágeno, condiciones inflamatorias crónicas, dolor inflamatorio e hiperalgesia asociada y alodinia, dolor neuropático e hiperalgesia asociada y alodinia, dolor neuropático diabético, causalgia, dolor simpatéticamente mantenido, síndromes de desaferentización, asma, rinitis alérgica, lesión o disfunción del tejido epitelial, herpes simple, neuralgia post-herpética, alteración de motilidad visceral en regiones respiratoria, genitourinaria, gastrointestinal o vascular, heridas, quemaduras, reacciones alérgicas de la piel, pruritos, vitíligo, trastornos gastrointestinales generales, colitis, ulceración gástrica, ulceras duodenales y trastornos bronquiales. Como se usa en este documento, "tratamiento" o "tratar" es un procedimiento para obtener resultados clínicos benéficos o deseados. Para propósitos de esta invención, resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejoramiento o alivio de cualquier aspecto de dolor y/o inflamación, que incluye dolor agudo, crónico, inflamatorio, neuropático o post-quirúrgico. Para propósitos de esta invención, resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: que incluyen severidad disminuida, alivio de uno o más síntomas asociados con dolor y/o inflamación que incluyen cualquier aspecto de dolor y/o inflamación (tal como reducción de la duración del dolor y/o inflamación, y/o reducción de la sensibilidad o sensación del dolor) . Tales medicamentos o composiciones farmacéuticas pueden ser para administración por inyección, u oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de administración. En general, la invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de al menos un- péptido y/o al menos un péptido conjugado con vehículo de la invención (en cantidades efectivas para prevenir, mejorar o suprimir dolor o cualquiera de las otras condiciones médicas proporcionadas en este documento) junto con diluyentes, excipientes, preservativos, solubilizadores, emulsificadores, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes de varios contenidos de amortiguador (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) , pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80), anti-oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), preservativos (por ejemplo, Timerosol, alcohol bencílico) y sustancias para dar volumen (por ejemplo, lactosa, manitol) ; incorporación del material en preparaciones particulares de péptidos conjugados con vehículo poliméricos tal como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas. Pueden también ser usados ácidos hialurónico, y esto puede tener el efecto de promover duración sostenida en la circulación. Tales composiciones pueden además influenciar el estado físico, estabilidad, proporción de liberación in vivo, y proporción de separación in vivo de los péptidos conjugados con vehículo de la presente invención. Véase, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18ava Edición, Mack Publishing Co., Easton, PA páginas 1435-1712 (1990), el cual es incorporado en este documento por referencia. Las composiciones pueden ser preparadas en forma líquida, o como un polvo seco (tal como forma liofilizada) . También se contemplan formulaciones de liberación sostenida implantables, como son formulaciones transdérmicas .

Formas de dosificación oral. Contempladas para uso en este documento, están formas de dosificación sólida, las cuales se describen de forma general en el Capítulo 89 de Remington'' s Sciences, anterior, el cual es incorporado en este documento por referencia. Formas de dosificación sólida incluyen tabletas, cápsulas, pildoras, trociscos o pastillas, saquillos o pelotillas. También se pueden usar encapsulación liposomal o protenoide para formular las presentes composiciones (tales como, por ejemplo, las microesferas protenoides reportadas en la Patente Estadounidense No. 4,925,673). Puede ser usada la encapsulación liposomal, y los liposomas pueden ser derivatizados con varios polímeros (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,013,556). Una descripción de posibles formas de dosificación sólida- se da en el Capítulo 10 de Marshall, K. , Modern Pharmaceutics, editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes (1979), incorporado en este documento por referencia. En general, la formulación incluirá un péptido conjugado con vehículo de la invención, así como ingredientes inertes los cuales permiten la protección contra el ambiente estomacal y liberación del péptido conjugado con vehículo en el intestino. También específicamente contempladas son formas de 5 dosificación oral de los mismos péptidos inventivos y/o péptidos conjugados con vehículo. En este sentido, si es necesario, los péptidos y/o péptidos conjugados con vehículo pueden ser químicamente modificados para que el suministro oral sea eficaz. También es posible usar una sal de un . aminoácido alifático modificado, tal como capriolato sódico de N- (8- [2-hidroxibenzoil] amino) (SNAC) , como un portador para mejorar la absorción de los péptidos conjugados con vehículo de la invención. Véase la Patente Estadounidense No.' 5,792,451, titulada Composición y Métodos para el Suministro de Fármaco en Forma Oral por sus siglas en inglés "Oral Drug Delivery Composition and Methods". Los péptidos y/o péptidos conjugados con vehículo de la invención pueden ser incluidos en la formulación como ulti-partículas finas en la forma de granulos o pelotillas 0 de un tamaño de partícula de aproximadamente un milímetro. La formulación del material para administración en cápsula debe también ser como un polvo, como tapones ligeramente comprimidos, o aún como tabletas. El terapéutico debe ser preparado por compresión. 5 Pueden ser incluidos todos los agentes colorantes y saborizantes. Por ejemplo, el péptido y/o péptido conjugado con vehículo o cualquier derivado del mismo puede ser formulado (tal como por encapsulación de liposoma o microesfera) y después además estar contenido dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene agentes colorantes y saborizantes. Se puede diluir o incrementar el volumen del péptido y/o péptido conjugado con vehículo de la invención con un material inerte. Estos diluyentes pueden incluir carbohidratos, especialmente, manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos y almidones modificados. Ciertas sales inorgánicas pueden también ser usadas como rellenadores, que incluyen trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell. Pueden ser incluidos desintegrantes en la formulación del terapéutico en una forma de dosificación sólida. Materiales usados como desintegrantes incluyen, pero no se limitan a, almidón, que incluye el desintegrante comercialmente disponible basado en almidón, Explotab. También Se pueden usar glicolato de almidón de sodio, Amberlita, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, cascara de naranja, carboximetilcelulosa acida, esponja natural y bentonita. Otra forma de los desintegrantes son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Se pueden usar gomas pulverizadas como desintegrantes y como aglutinantes, y estos pueden incluir gomas pulverizadas tal como agar, Karaya o tragacanto. Son también útiles ácido algínico y su sal de sodio como desintegrantes . Se pueden usar aglutinantes para retener los componentes de la composición farmacéutica juntos para formar una tableta dura, y pueden incluir materiales de productos naturales tal como acacia, tragacanto, almidón y gelatina.

Otras metilcelulosa (MC) incluyen, etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC) . Se pueden usar tanto polivinilpirrolidona (PVP) como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en soluciones alcohólicas para granular el terapéutico. Se puede incluir un agente anti-friccional en la formulación para prevenir la adherencia durante el proceso de formulación. Se pueden usar lubricantes como una capa entre el terapéutico y la pared del troquel, y estos pueden incluir, pero no se limitan a: ácido esteárico, que incluyen sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTPE) , parafina líquida, aceites y ceras vegetales. También se pueden usar lubricantes solubles tal como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de varios pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.

Se pueden agregar deslizantes que pueden mejorar las propiedades de flujo del péptido conjugado con vehículo durante la formulación y para ayudar al reacomodo durante la compresión. Tales deslizantes incluyen almidón, talco, sílice pirogénico y silicoaluminatos hidratados . Para ayudar a la disolución del péptido y/o péptido conjugado con vehículo de la invención en el ambiente acuoso, un tensoactivo se puede agregar como un agente humectante. Tales tensoactivos pueden incluir detergentes aniónicos tal como laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilsodio y sulfonato de dioctil sodio. Se pueden usar detergentes catiónicos y pueden incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que puede ser incluida en la formulación como tensoactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de castor hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensoactivos pueden estar presentes en la formulación ya sea solos o como una mezcla en proporciones diferentes. Los aditivos se pueden incluir en la formulación para mejorar la recuperación de los péptidos y/o péptido conjugado con vehículo. Aditivos potencialmente que tienen esta propiedad incluyen varios ácidos grasos, tales como, por ejemplo, ácido oléico, ácido linoléico y ácido linolénico. Se puede desear formulación de liberación controlada. El péptido y/o péptido conjugado con vehículo de la invención puede ser incorporado en una matriz inerte la cual permite liberación por ya sea mecanismos de difusión o lixiviado, por ejemplo, gomas. Se pueden también incorporar matrices degenerantes lentas en la formulación, por ejemplo, alginatos o polisacáridos. Otra forma de una liberación controlada del péptido y/o péptido conjugado con vehículo de la invención es por un método basado en el Oros therapeutic system (Alza Corp.), es decir, el fármaco es incluido en una membrana semipermeable la cual deja pasar agua y el fármaco se impulsa a través de una sola abertura pequeña debido a efectos osmóticos. Algunos revestimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retardada.

Formas de suministro pulmonar. También contemplado en este documento es suministro pulmonar de una composición farmacéutica de conformidad con la invención. El péptido y/o péptido conjugado con vehículo (o derivados del mismo) es suministrado a los pulmones de un mamífero inhala y recorre a través del pulmón epitelial que reviste a la corriente sanguíneo. Reportes que se refieren al suministro pulmonar de macromoléculas que pueden ser útiles en este sentido incluyen Adjei et al., Pharma. Res., Volumen 7, páginas 565-569 ' (1990); Adjei et al., Internatl. J. Pharmaceutics, Volumen 63, páginas 135-144 (1990) (acetato de leuprolida) ; Braquet et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., Volumen 13 (suppl. 5), s. 143-146 (1989) (endotelin-1) ; Hubbard et al., Annals Int. Med., Volumen 3, páginas 206-12 (1989) (páginas 206-12 (1989) (al-antitripsina) ; Smith et al., J. Clin. Invest., Volumen 84, páginas 1145-1146 (1989) (al-prpteinasa) ; Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (1990) (hormona del crecimiento humano recombinante); Debs et al., J. Immunol., Volumen 140, páginas 3482-3488 (1988) (interferon-? y factor a de necrosis del tumor) ; y Patente Estadounidense No. 5,284,656 (factor que estimula la colonia de granulocito). Contemplados para uso en la práctica de la invención son un amplio intervalo de dispositivos mecánicos designados para el suministro pulmonar de productos terapéuticos, que incluyen pero no se limitan a nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores en polvo, todos los cuales son familiares a aquellos expertos en la técnica.. Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles adecuados para la práctica de la invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri-; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewwod, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts. Todos los dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas, para la dispersión de los péptidos y/o péptidos conjugados con vehículo y/o derivados de los mismos descritos en este documento. De forma típica, cada formulación es específica al tipo de dispositivo empleado y puede involucrar el uso de un material impulsor apropiado, en adición al tolueno, adyuvantes de excipientes y/o portadores útiles en terapia. Portadores farmacéuticamente adecuados para estas composiciones pulmonares incluyen carbohidratos tal como trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa y sorbitol. Otros ingredientes para uso en formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Se pueden usar tensoactivos naturales o sintéticos. Se puede usar PEG (aún parte de su uso en derivatización del péptido) . Se pueden usar dextranos tal como ciclodextrano, sales de bilis, celulosa y derivados de celulosa. Se pueden usar aminoácidos, tal como en una formulación de amortiguador. Además, se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión, u otros tipos de portadores. Formulaciones adecuadas para uso con un nebulizador, ya sea a chorro o tipo ultrasónico, típicamente comprenderá el péptido y/o péptido conjugado con vehículo descrito disuelto en agua a una concentración de .aproximadamente 0.1 hasta 25 miligramos (mg) de agente biológicamente activo por mililitro (ml) de solución. La formulación también puede incluir un amortiguador y un azúcar simple (por ejemplo, para estabilización y regulación del péptido de presión osmótica) . La formulación del nebulizador puede también contener un tensoactivo, para reducir o prevenir superficies gue induce la agregación de la proteína causada por atomización de la solución en forma de aerosol. Formulaciones para uso con un dispositivo inhalador de dosis medida generalmente comprenderán un polvo finamente dividido que contiene el péptido /o péptido conjugado con vehículo descrito suspendido en un impulsor con la ayuda de un tensoactivo. El impulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo, o un hidrocarburo, que incluye triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Tensoactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitan y lecitina de soya. Ácido oléico pueden también ser útil como un tensoactivo. Formulaciones para dispersión de un dispositivo inhalador en polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene los péptidos y/o péptidos conjugados con vehículo descritos y pueden también incluir un agente de volumen, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa o xilitol en cantidades las cuales facilitan la dispersión del polvo del dispositivo, por ejemplo, de 50 hasta 90% en peso de la formulación.

Formas de suministro nasal. Se contempla también suministro nasal del péptido y/o péptido conjugado con vehículo. El suministro nasal permite el paso del péptido y/o péptidos conjugados con vehículo de la invención al torrente sanguíneo directamente después de administrar el producto terapéutico a la nariz, sin la necesidad para la deposición del producto en el pulmón. Formulaciones para suministro nasal que incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano. Se contempla también suministro vía transporte a través de otras membranas de la mucosa.

Suministro por bomba. En ciertas modalidades de la presente invención, se contempla suministro localizado de los péptidos y/o péptidos conjugados de la presente invención para tratar o prevenir trastornos mediados por Bl. Un método de suministro localizado contemplado por la invención es inyección del agente a un sitio local al actúa el agente.

Otro método para suministro localizado incluye insertar un catéter para dirigir el (los) fármaco (s) al sitio corporal deseado, y usar una bomba para impulsar un (os) fármaco (s) a través del catéter. Bombas de fármaco externamente implantadas usadas con un catéter internamente implantado se conoce cien por aquellos expertos en la técnica. Aún otro método para suministro localizado incluye dispositivos de suministro de fármaco implantable. Se han desarrollado bombas implantables para dirigir las desventajas de las técnicas que usan sistemas de catéter y bomba externa son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Bombas de suministro de fármaco implantáble a menudo incluyen un reservorio para almacenar el fármaco, un puerto de - inyección para mejorar la inyección de preparaciones de fármaco fresco así como para removerlo del fármaco viejo a intervalos regulares del reservorio, y opcionalmente un catéter para suministrar el fármaco al sitio deseado. Dispositivos implantables preferidos incluyen, pero no se limitan a, al implante Duros (Alza Corporation, Mountain View, CA) , el Sistema de Infusión SynchroMed I y II (Medtronic, Inc., Minneapolis) y similares. De forma adicional (o alternativa) , la presente invención proporciona péptidos y/o péptidos conjugados para uso en cualquiera de varias formulaciones de liberación lenta o sostenida o formulaciones de micropartícula previamente mencionadas en este documento anteriormente y/o conocidas por el técnico experto.

Dosificaciones . Las dosificaciones efectivas de los péptidos y/o péptidos conjugados de la invención a ser administrados se pueden determinar a través de procedimientos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica los cuales dirigen tales parámetros como vida media biológica, biodisponibilidad y toxicidad. En modalidades preferidas, un intervalo de dosificación efectiva se determinó por un experto en la técnica usando datos de estudios ín vi tro e in vivo de rutina bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, ensayos de cultivo celular in vitro, tal como los ensayos ejemplares descritos en el Ejemplo 6 posterior proporcionan datos de los cuales un experto en la técnica puede fácilmente determinar la concentración inhibitoria media (Cl) o concentración efectiva media (CE) del péptido o el péptido conjugado necesario para bloquear algunas cantidades de actividad inducida por Bl (por ejemplo, 50%, IC5o; o 90%, IC90) . Se pueden entonces ser seleccionadas dosis apropiadas por un experto en la técnica usando datos farmacocinéticos de uno o más modelos animales de rutina, tal como los datos farmacocinéticos ejemplares descritos en el Ejemplo 9, posterior, para que una concentración de plasma mínima (Cmin) del péptido se obtenga la cual sea igual a o exceda el valor IC determinado. El régimen de dosificación involucrado en un método para tratar la enfermedad o trastorno involucrado será determinado por el médico 5 tratante, considerando varios factores los cuales modifican la acción de agentes terapéuticos, tal ' como la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de la condición a ser tratada, tiempo de administración, y otros factores clínicos. Generalmente, el régimen diario deberá ser en el intervalo de 1.0-10000 microgramos (µg) del péptido y/o péptido conjugado con vehículo por kilogramo (kg) de peso corporal, preferiblemente 1.0-1000 µg por kilogramo de peso corporal, y más preferiblemente 1.0-150 µg por kilogramo de peso corporal.

. Terapia de combinación. En otro aspecto, la presente invención incluye un método para tratar (o, en otras modalidades, prevenir) dolor y/o inflamación, o cualquier condición o trastorno asociado con la activación de Bl, que comprende administrar una cantidad de péptido y/o péptido conjugado de la presente invención y una cantidad de un NSAID. El término "NSAID" se refiere a un compuesto antiinflamatorio no esteroidal. Las cantidades relativas y proporciones de antagonista del péptido y/o antagonista del 5 péptido conjugado y NSAID pueden variar. En algunas modalidades, suficiente del (los) péptido (s) y/o péptido (s) conjugado (s) serán administrados para permitir la reducción de la dosis normal de NSAID requerida para efectuar el mismo grado de mejorar el dolor o inflamación. En algunas modalidades, suficiente péptido (s) y/o péptido (s) conjugados de la presente invención será administrado para permitir la reducción de la dosis normal de NSAID requerido para efectuar el mismo grado de mejorar el dolor o inflamación por al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, o más. Esta reducción puede ser reflejada en términos de cantidad administrada a una administración dada y/o cantidad administrada sobre un periodo de tiempo dado (frecuencia reducida) . En otro aspecto, la invención proporciona métodos para mejorar el dolor de NSAID o tratamiento de inflamación que comprende administrar una cantidad efectiva de un NSAID en conjunto con una cantidad efectiva de al menos un péptido y/o al menos un péptido conjugado de la presente invención. Como se usa en este documento, "administración en conjunto" también significa abarcar cualquier circunstancia en donde en NSAID y un péptido y/o péptido conjugado de la presente invención se administran en una cantidad efectiva a un individuo, "administración en conjunto", como se usa en este documento, comprende administración simultánea y/o administración a diferentes tiempos. La administración en conjunto también abarca administración como una co-formulación (es decir, el péptido y/o péptido conjugado de la presente invención y NSAID están presentes (combinados) en la misma composición) y/o administración como composiciones separadas. Se entenderá que el (los) péptido (s) y/o péptido (s) conjugado (s) de la presente invención y al menos un NSAID, se pueden administrar a diferentes frecuencias y/o intervalos de dosificación. Por ejemplo, un péptido conjugado de la presente invención puede ser administrado semanalmente, mientras se puede administrar NSAID más frecuentemente. Se entenderá que el (los) péptido (s) y/o péptido (s) conjugados de la presente invención y el NSAID pueden ser administrado usando la misma ruta de administración o diferentes rutas de administración, y que diferentes regímenes de dosificación pueden cambiar sobre el curso de administración (es) . La administración puede aún ser antes del ataque dolor o inflamación. Por' lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar, reducir incidentes de, mitigar y/o retrasar el desarrollo o progreso del dolor y/o inflamación en un individuo, dichos métodos comprenden administrar una cantidad efectiva de al menos un péptido y/o al menos un péptido conjugado de la presente invención en ' unión con una cantidad efectiva de al menos un NSAID. Tales métodos incluyen tratar o prevenir cualquier dolor y/o inflamación de cualquier etiología, que incluye dolor y/o inflamación en donde el uso de un NSAID es generalmente prescrito. Tales métodos son también adecuados para tratar o prevenir cualquier condición o trastorno previamente mencionado en este documento anteriormente o en este documento posteriormente como es mediado por o asociado con activación Bl. En algunas modalidades, el dolor y/o inflamación es dolor post-quirúrgico . En algunas modalidades, el dolor y/o inflamación • es asociado con quemaduras o heridas. En otras modalidades, el dolor y/o inflamación es asociado con artritis reumatoide. En otras modalidades, el dolor y/o inflamación es asociado con osteoartritis. En otras modalidades, el dolor y/o inflamación es asociado con neuralgia post-herpética. En algunas modalidades, .el NSAID se selecciona del grupo que consiste de aspirina, acetominofeno, ibuprofeno, indometacina, naproxeno, naprosino, diclofenac, cetoprofeno, tolmetina, eslindac, ácido mefenamico, ácido meclofenamico, diflunisal, Rúfenisal, piroxim, sudoxicam, isoxicam, celecoxib, rofecoxib, DUP-697, flosulida, meloxicam, ácido 6-metoxi-2 naftilacético, MK-966, nabumetona, nimesulida, NS-398, SC-5766, SC58215, T-614, o combinaciones de estos.

EJEMPLOS Se presentan los siguientes ejemplos para propósitos únicamente ilustrativos y no se pretende, ni deben ser construidos como limitantes de la invención en cualquier manera. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que modificaciones y variaciones de los compuestos descritos en este documento pueden ser hechas sin violar el espíritu o alcance de la presente invención. Compuestos de conformidad con la invención se pueden sintetizar de conformidad con uno o más de los siguientes métodos. Se debe notar que los procedimientos generales se muestran como la relación para la preparación de compuestos que tienen estereoquímica no especificada. Sin embargo, tales procedimientos son generalmente aplicables a aquellos compuestos de una estereoquímica específica, por ejemplo, en donde la estereoquímica al rededor de un grupo es (S) o (R) . Además, los compuestos que tienen una estereoquímica (por ejemplo, (R) ) pueden a menudo ser utilizados para producir aquellos que tienen estereoquímica opuesta (es decir, (S) ) usando métodos bien conocidos, por ejemplo, por inversión.

Ejemplo 1. Síntesis y Purificación de antagonistas del Péptido del receptor Bl y Antagonistas del Péptido del Receptor Bl PEG-Co jugado. Se sintetizaron varios péptidos de la invención usando técnicas1 de síntesis bien conocidas en la técnica. Un método preferido para sintetizar varios péptidos de la invención usa una estrategia FMOC con activación de carbodiimida como se describe abajo.

Parte 1: Se' disolvió Fmoc-aminoácido a la resina usando química de carbodiimida. Se disolvió Fmoc-aminoácido (3-4 equivalentes) .en mezcla de DCM/NMP seca (se usó NMP o DMF para ayudar a completar la disolución) . Se agregó una solución de N-hidroxibenzotriazol (HOBt, mismo equivalente para aminoácido) en NMP a la solución de aminoácido. Se agregó una solución de N,N' -diciclohexil-carbodiimida (DCC, mismo equivalente para aminoácido) en DCM a la solución de aminoácido. La solución se mezcló por aproximadamente 20 minutos. La solución de ácido activado después se agregó a la resina (si se necesita, se removieron los precipitados antes de la adición) . La reacción se agitó hasta que la resina fue negativa por la prueba de ninhidrina. En la terminación del acoplamiento, la resina se coiectó y se lavó con DMF varias veces. Parte .2: Se removió Fmoc N-terminal del péptido-resina. La resina de peptidilo Fmoc-protegido se trató con piperidina/DMF (2/8) por 3 minutos. La resina se drenó y el tratamiento se' repitió por 15 minutos. La resina se lavó con DMF y después varias veces con DCM. La resina se secó con aire si la siguiente etapa involucra desdoblamiento del péptido de la resina como se describe en la etapa 3. Parte 3: Desdoblamiento y desprotección de TFA. La resina seca de la Parte 2 se colocó en un matraz y se agregó 10-25 ml/g de resina del cóctel desdoblado (TFA al 95%, agua al 2.5%, triisopropilsilano al 1.5% y etanditiol al 1%) . Después de agitar la reacción por 3-4 horas, la resina se removió por filtración bajo presión reducida y se lavó dos veces con TFA. Los filtrados combinados se concentraron a ~20% por evaporación rotatoria bajo presión reducida. El líquido se colectó a -50°C, y se precipitó con 10 veces de volumen de éster seco frío. Lo precipitado se colectó. El péptido después se disolvió en una mezcla de agua/acetonitrilo que contiene TFA al 0.5% y se liofilizó. El producto crudo después se purificó usando CLAR C18, en un gradiente de acetonitrilo al 10%/TFA al 0.1% en agua a acetonitrilo al 50%/TFA al 0.1% en agua. Para 1 g del producto crudo, se usó una columna C18 250x50 mm a una proporción de flujo de 90 mL/min en una CLAR prep Agilent con detección de longitud de onda dual a 215 y 254 nm. La inyección se fraccionó y cada fracción se analizó por espectrometría de masa. Los tubos se agruparon basados en espec. de masa, se concentraron bajo presión reducida para remover acetonitrilo, y se liofilizaron para obtener el antagonista Bl del péptido como polvos blancos. La caracterización se logró por CLAR-EM y determinación de masa Maldi-TOF. Varios péptidos PEG-conjugados de la invención se prepararon como sigue. Varios antagonistas del péptido del receptor Bl de bradiquinina activa se seleccionaron del grupo que consiste de la SEC ID NOS: 5-60) se sintetizaron con diferente enlazadores de peptidilo al N-término, y cada uno contiene una penúltima cisteína usando los métodos antes mencionados (por ejemplo, SEC ID NOS: 27-41). Estos análogos del péptido se derivatizaron con tamaños y configuraciones diferentes de poli (etilenglicol) (PEG) a través del acoplamiento dirigido al sitio del polímero activado de maleimida al tiol de cisteína N-terminal de los análogos del péptido usando, por ejemplo, el Método A o Método B descritos abajo. Los conjugados PEG-péptido resultantes se purificaron por cromatografía de intercambio iónico, se concentraron por liofilización o diafiltración y se dializaron en amortiguador antes para un bioensayo in vitro e in vivo.

Método A: Se prepararon péptidos PEG-conjugados haciendo reaccionar una cisteína que contiene péptido con PEG-maleimida en 50 mM de HaHP0 , 5 mM de EDTA, pH 6.5 a 2.5 - 5 mg/ml de péptido y una reacción estequiométrica de 1-2 veces de exceso molar de maleimida: tiol . La reacción se agitó a temperatura ambiente (20-25°C) por 1-1.5 horas. Una vez completa, la reacción se apagó con una 10 veces exceso molar de ß-mercaptoetanol (ß-ME) :maleimida y se dejó agitar unos 30-60 minutos adicionales a temperatura ambiente. El progreso del a reacción se monitoreo usando CLAR de fase inversa (CLAR-FI) por inyección de 5 µl de la reacción a una columna C4 5 micon, 4.6 x 250 mm (Grace Vydac; Columbia, MD) ; no. cat. : #214TP54) . El péptido sin reaccionar y el conjugado PEG-péptido se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo 5-90% lineal en ácido trifluoroacético al 0.1%. Típicamente, >90% del análogo de péptido se consumió en la reacción. Los polímeros PEG activados de maleimida lineales (PM= 5 kD o 20 kD, PD= 1.01-1.02) se proporcionaron por Shearwater Corp. o NOF Corp, (Tokio, Japón) .

Purificación : Los péptidos PEG-conjugados se purificaron por cromatografía de intercambio catiónico usando columnas HP de Sefarosa SP (Amersham Biosciences) pre-equilibradas con 10 mM de NaOAc, EtOH al 20%, pH 4. Antes de cargarla, las mezclas de reacción se diluyeron 10 veces con EtOH al 20% y el pH se ajustó a 3.5 con ácido acético glacial. Las mezclas de reacción diluidas se cargaron en una columna de tamaño apropiado tal que no se excede una proporción péptido: resina de 2.5 mg/ml. La columna después se lavó con 2 volúmenes de columna (CVs) de 10 mM NaOAc, EtOH al 20%, pH 4 y se eluyó con un gradiente 0-200 mM de NaCl lineal en 10 mM de NaOAc, EtOH al 20%, pH 4 sobre 10-20 CV. El péptido sin modificar y el conjugado PEG-péptido se detectó monitoreando la absorbancia en ya sea 254 nm o 220 nm. Bajo estas condiciones, los excesos de PEG y ß-ME fueron lavados en la fracción no enlazada a través del flujo, el conjugado se eluyó en un pico amplio partiendo de ~50 mM de NaCl y el péptido libre fue bien resuelto, eluyendo a ~200 M de NaCl. Las fracciones del pico eluido se evaluaron por CLAR-FI y se agruparon basadas en tiempos de homogeneidad y retención consistente con el conjugado PEG-péptido. El pico conjugado agrupado se concentró a sequedad, después se reconstituyó en agua y se dializó contra el amortiguador. De forma alternativa se puede usar la diafiltración para concentrar y amortiguar cambios al conjugado. Los grupos finales de conjugados PEG-péptido se analizaron por CLAR-FI y fueron típicamente conjugados al -98%. La composición conjugada y concentraciones se determinaron por una combinación de análisis de aminoácido, secuenciamiento del péptido y espectroscopia de absorbancia.

La estabilidad de la solución de compuestos representados por le en el Esquema de Reacción 1 se monitoreó a temperatura ambiente en salina amortiguada de fosfato pH = 7.2 (PBS) sobre tiempo usando el método CEX descrito anteriormente (Figura 1 (A) ) . El compuesto le se muestra por convertirse rápidamente a Id así como a dos productos resultantes de . hidrólisis de la porción de succinimida (estructuras determinadas por una combinación de experimentos IR, EM/EM y RMN) .

Método B: Se disolvieron mPEG-maleimida (1.0 eq) a 30°C en MeOH anhidro en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos equipado con un agitador mecánico, sonda de temperatura, y una entrada de N2. En la disolución total de mPEG-maleimida, se agregó un péptido que contiene un residuo de cisteína N-terminal (1.3 eq) en la solución clara y se agitó a temperatura ambiente por 3 horas. La CLAR de fase inversa muestra desaparición de mPEG-maleimida y un pico nuevo para el aducto 3-sulfanil-succinimida inicial. Después, diez equivalentes de diisopropil-etilamina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) se agregaron en la solución y se agitó a 25°C por al menos 24 horas. La reacción se monitoreo por cromatografía de intercambio iónico usando TOSOHAAS SP-5PW (20 µm) como fase estacionaria. El análisis CEX indicado sobre la conversión al 98% con menos de 1.5% del aducto 3- sulfanil-succinimida restante. Se agregó terc-butil-metil- éter (TBME) (dos veces el volumen de metanol usado en la reacción) y la solución turbia resultante se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. Lo precipitado blanco se filtró y se secó bajo vació a temperatura ambiente durante la noche para proporcionar la 6-metil-carbamoil-5-oxo- tiomorfolin-3-carboxamida cruda enlazada al producto (Id) .

Purificación : El producto crudo anterior se purificó por CLAR-FI usando sistema MeOH-H20-AcOH (cl8 YMC ODS NQ como fase estacionaria) para proporcionar la 6-metil-carbamoil-5-oxo-tiomorfolin-3-carboxamida enlazada al producto con una pureza de > 98% por cromatografía de fase inversa analítica. Las fracciones puras se combinaros y concentraron a sequedad bajo vacío y el residuo blanco resultante se disolvió en la cantidad mínima de MeOH caliente (~30°C) suficiente para dar una solución clara, después se trató con TBME (dos veces el volumen de MeOH usado) . La solución turbia resultante se agitó a temperatura ambiente por 1 hora y lo precipitado se filtró, se secó bajo vacío a temperatura ambiente por al menos 16 horas. El producto puro (Id) es obtenido como un blancuzco en 74% de rendimiento total con >98% de CEX y pureza CFI . Se determinó el contenido de la composición y péptido conjugado por una combinación de análisis de aminoácido, secuenciamiento del péptido, métodos de RMN multinucleares y espectroscopia de absorbancia. La estabilidad de la solución del compuesto ld se monitorearon a temperatura ambiente en salina amortiguada de fosfato (PBS) pH = 7 se monitoreo sobre tiempo usando el método CEX descrito anteriormente. Este compuesto proporcionó significantemente más estabilidad, sin cambios significantes notados en seis días. Se realizaron la cromatografía de intercambio catiónico (CEX) y de fase inversa analítica (Fl) en sistemas CLAR Angilent 1100 con serie de diodo o detectores de longitud de onda variable y automuestreado termoprobado . Las condiciones cromatográficas estándares se resumen abajo. 1. Condiciones del Método CLAR-FIcolumna: YMC ODS-AQ, 3µM, 120 A, 4.6 X 100 mm Temp. Columna 40°C Fases Móviles: A) TFA al 0.1% en agua B) TFA al 0.1% en MeOH Proporción de Flujo: 1.1 ml/min Gradiente Tiempo %B 0 5 10 40 30 95 35 95 35.1 5 40 5 Detección: UV a 220 nm Volumen de Inyección: 20 µL ó 50 µL dependiendo en la concentración de muestra Concentración de muestra: 2.5 hasta 10 mg/ml Diluyente de muestra: PBS Dulbecco y otros amortiguadores usados en los estudios de estabilidad 2. Método Cromatográfico de Intercambio Catiónico General Columna: TOSOH, TSK-GEL, SP-5PW, 10 µm, 7.5 x 75 mm Temp. Columna 25°C Fase Móviles: A) 20 mM NaH2PO4 en agua/EtOH (8:2), pH 3.5 B) 20 mM NaH2PO4 y 0.5 M NaCI en agua/EtOH (8:2), pH 3.5 Proporción de flujo: 1.0 ml/min Gradiente Tiempo %B 0 0 3 0 25 45 40 100 45 100 45.1 0 50 0 Detección: UV a 220 nm Volumen de inyección: 10 hasta 50 µl di spendií muestra Concentración de muestra: 2.5 hasta 10 r ng/m I Diluyente de muestra: PBS Dulbecco y otros amortiguadores usados en los estudios de estabilidad Ejemplo 2: Sintesis y Purificación de Antagonistas del Receptor Bl PEG-conjugado usando PEG Tioésteres . Se prepararon péptidos PEG-conjugados haciendo reaccionar un péptido que contiene cisteína con PEG-maleimida en 50 mM de NaHP04, 5 mM de EDTA, pH 7 a 2.5 - 5 mg/ml del péptido y una reacción estequiométrica de 1.2 veces exceso molar de maleimida : tiol . La reacción se agitó a temperatura ambiente (20-25°C) por 18-26 horas. Una vez completa, la reacción se apagó con 10 veces exceso molar de ß-mercaptoetanol (ß-ME) :maleimida y se dejó agitar por 30-60 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las reacciones se purificaron como se describe por el Método A en el Ejemplo 1 anterior.

Ejemplo 3. Síntesis y Purificación de Antagonistas del Péptido del Receptor Bl PEG-Conjugado usando PEG Tioésteres o Yodoacetatos . Se prepararon péptidos PEG-conjugados haciendo reaccionar un péptido que contiene un residuo de cisteína N-terminal con PEG-OPTE (orto-piridil tio éster) en 50 mM de NaHP04, 5 mM de EDTA, pH 7 a 2.5 - 5 mg/ml del péptido y una reacción estequiométrica de 1.2 veces exceso molar de PEG: péptido activado. La reacción se agitó a temperatura ambiente (20-25°C) por 18-26 horas. Una vez completa, la reacción se apagó con 10 veces exceso molar de cisteína: exceso de reactivo PEG y se dejó agitar por 30-60 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las reacciones se purificaron como se describe en el Método A del Ejemplo 1 anterior. De forma alternativa, se puede usar PEG-yodoacetamida como se describe anteriormente para formar conjugados en los cuales la porción PEG está unida vía un enlace de tioéter (Esquema de Reacción 3) . En este caso 1.5 molar de equivalentes de la reacción PEG activada se usan y el tiempo de reacción es incrementado por 24 horas, la reacción se apagó p/10 molar de equivalentes de ß- mercaptoetanol purificado como se describe en los ejemplos anteriores.

Ejemplo 4. Síntesis y Purificación de Agonistas de Péptido del Receptor Bl PEG-Conjugados usando PEG propionaldehído. Los agonistas de péptido del receptor Bl tal como cualquiera de las SEC ID NOS: 5-60 y 27-41 pueden ser selectivamente modificados N-terminalmente con PEG usando el método descrito en la Patente Estadounidense 5,824,784 (la cual se incorpora en este documento por referencia en su totalidad) . Por ejemplo, el péptido como se muestra en la SEC ID NO: 6 (245 mg, 0.14 mmol) se disolvió en 10 ml de la solución que contiene 100 mM de NaH2P04 y 60 mM de NaCNBH3. La mezcla se enfrió a 4°C agitándola y se trató con 2.35 g de 20K de propionaldehído mPEG (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) . La mezcla se agitó por 3 días, después se purificó por cromatografía CEX y Fl como se describe en el Método B del Ejemplo 1. De forma alternativa los PEG que contienen funcionalidades reactivas de amina se pueden hacer reaccionar con agonistas de péptido Bl parcialmente protegidos de conformidad con los métodos ilustrados en el Esquema de Reacción 5. Después de la reacción de conjugación, los grupos protectores de cadena lateral se desdoblan usando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de síntesis de péptido de fase sólida y solución, y los constructos PEG-péptido resultantes se purificaron como se describe anteriormente. Aldehidos PEG multifuncionales (grupos reactivos 3-6) se pueden hacer reaccionar con cantidades de exceso molar de péptidos protegidos para proporcionar constructos PEG multivalentes en las cuales los péptidos múltiples se unen en una manera regioquímicamente y estequiométricamente definida.

Ejemplo 5. Síntesis y Purificación de Agonistas de Péptido del Receptor Bl PEG-Conjugado usando PEG N-hidroxi-succinimidas . Los agonistas de péptido del receptor Bl tal como cualquiera de las SEC ID NOS: 5-60 pueden ser selectivamente pegilados en un átomo de nitrógeno de cadena lateral o N-terminal usando antagonistas de péptido Bl parcialmente protegidos de conformidad con los métodos ilustrados en el Esquema de Reacción 5. Por ejemplo una solución de parcialmente decapéptido (1.43 g, 1.025 mmol) en 2.5 ml de DMF anhidro, se combinó con 3.5 g (0.18 mol) de Sunbright PTE-200GS (succinimidilgluterato de 4 brazos de 20 kD, NOF, Tokio, Japón) y 1.0 ml de diisopropiletilamina en 25 ml de diclorometano. La solución incolora resultante se agitó a temperatura ambiente por 2 días, después se evaporó a presión reducida. El residuo resultante se disolvió en 25 ml de agua desionizada y se colocó en una membrana de diálisis de corte 10,000 PM (Pierce, 'Rockford II, USA). El compuesto se dializó contra agua por 24 horas (variación de 3 amortiguadores) , después se liofilizó para proporcionar el producto PEG tetravalente protegido. El sólido blanco resultante se disolvió en 60 ml de diclorometano y se trató con 20 ml de TFA anhidro. Después de la agitación a temperatura ambiente por 2 días, la mezcla de reacción se evaporó a presión reducida, después se disolvió en el dializado como anteriormente. El material dializado se liofilizó, después se purificó por cromatografía de intercambio iónico como previamente se describe para proporcionar el producto tetravalente como un sólido blanco. Porciones de succinimidilgluterato 1-6 que contienen PEG en una forma similar se pueden usar para preparar constructos de -péptido mono o polifuncional .

Tabla 4a : Péptidos X1 Tabla 4b : Péptido Y1 S?C ID NO: Secuencia del Péptido Y1 42 {N} GGGGGKKRPPGFSPL {C} Ejemplo 6: Actividad de Inhibición Bl ±n vltro de antagonistas de péptido PEG-péptido conjugado de actividad de Bl. Se identificaron péptidos y/o péptidos conjugados capaces de inhibir selectivamente la actividad de Bl comparada a la actividad de B2 usando ensayos tal como aquellos descritos en las Secciones A, B y C abajo.

A. Ensayo in vitro de la Función del Receptor Bl humano usando Flujo de Calcio: La activación del receptor Bl enlazado a Gq resulta en un incremento en el calcio celular. La fotoproteína aequorina sensible al calcio, puede, por lo tanto ser usada como un indicador de la activación del receptor Bl. La aequorina es una fotoproteína de 21 kDa que forma un complejo bioluminiscente cuando se enlaza a la coelenterazina de cofactor cromóforo. Después del enlace de calcio a este complejo, una reacción de oxidación de coelenterazina resulta en la producción de apoaequorina, coelenteramida, C02 y luz que puede ser detectada por luminometría convencional. Se estableció una línea celular estable de CHO D-/receptor Bl humano (GenBank No. de acceso AJ238044) /Aequorina y las líneas se mantuvieron en suspensión en botellas para centrifugar que contienen una proporción 1:1 de DMEM y HAM F12 (Gibco 11765-047), alta glucosa (Gibco 11965-084), suero Dializado Inactivado Caliente al 10% (Gibco 26300-061), IX de Aminoácido no Esenciales (Gibco 11140-050), IX de Glutamina-Pen-Strep (Gibco 10378-016) e Higromicina, 300 µg/ml (Roche 843555) . De quince a veinte horas antes del ensayo luminométrico, se colocaron 25,000 células/cavidad (células 2.5E6/10 ml/placa) en placas de ensayo de fondo claro de lados negros de 96 cavidades (Costar #3904) . El medio se removió de las cavidades y se colocó con 60 µl de suero libre de HAM F12 con 30 mM de HEPES (pH 7.5) y 15 µM de coelenterazina (Coelenterazina h Luciferina #90608; Assay Designs (Ann Arbor, MI) . Las placas después se incubaron por 1.5-2 horas. Las placas de compuestos IC50 de diez puntos que contienen 1:3 ó 1:5 diluciones de compuestos antagonistas y una placa activadora de agonista (20 nM de concentración final des- AeglO-Calidina, ECS0) se prepararon usando Ham F12 con 30 mM de HEPES, pH 7.5. Después de la incubación de coelenterazina, se usó una plataforma luminométrica instantánea automatizada para dispersar los compuestos antagonistas de Bl a la placa celular, una cámara CCD situada debajo de la placa celular tomó 12 imágenes de la placa celular a 5 segundos de intervalo para determinar si hay cualquier actividad agonista con los compuestos. El agonista hBl, des-Arg10-Calidina, es después agregado a la placa celular y se registraron otras 12 imágenes para determinar el IC50 del (los) agonista (s).

B. Ensayo in vitro de la Función del Receptor hB2 usando Flujo de Calcio: El flujo de calcio intracelular inducido por la activación del receptor hB2 es analizado usando una línea celular recombinante hB2 (CHO-Kl) adquirida de PerkinElmer (Wellesley, MA; no. de catálogo: RBHB2C000EA) en un lector en placa formadora de imagen fluorométrica (FLIPR) . Las células se cultivaron en un matraz T225 que contiene Mezcla de Nutriente Ham F12 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA; no. de catálogo: 11765-047), Suero de Bovino Clon II Fetal al 10% (HyClone, Logan, UT; no. de catálogo: SH3006603) , 1 mM de piruvato de sodio (100 mM de solución base, Invitrogen Corp., no. de catálogo: 12454-013) y 0.4 mg/ml de Geneticina (G418; 50 mg/ml de geneticina activa, Invitrogen, no. de catálogo: 10131-207) . El medio de cultivo es cargado cada día. 24 horas antes del ensayo FLIPR, las células hB2/CHO se lavaron una vez con PBS (Invitrogen) y se agregó 10 ml de Versene (1:5000, Invitrogen, no. de catálogo: 15040-066) a cada matraz. Después de 5 minutos de incubación a 37 °C, se removió el Versene y las células se separaron del matraz y se resuspendieron en- medio de cultivo. Las células se cuantificaron y se colocaron 25,000 células/cavidad en placas de ensayo de fondo claro de lados negros de 96 cavidades (Costar, Acton, MA; no. de catálogo: 3904). Las células se incubaron en un incubador de C02 a 37 °C durante la noche. El medio es aspirado de las células y se reemplazó con 65 µl de amortiguador cargado de tinte. El amortiguador cargado es preparado diluyendo una solución base de 0.5 mM de Fluo-4 AM (Molecular Probes, Eugene, OR) disuelto en DMSO que contiene ácido plurónico al 10% [p/v] a una concentración de 1 µM en Medio Eagle Modificado Dulbecco Claro (DMEM) que contiene BSA al 0.1%, 20 mM de HEPES, y 2.5 mM de probenecid (actividad de inhibir probenecid de la proteína de transporte del anión, y así mejorar la carga de tinte en las células) . Las células se cargaron de tinte por 1 hora a temperatura ambiente. Se removió el exceso de tinte lavando las células dos veces con amortiguador de ensayo. El amortiguador de ensayo consiste de Solución Salina Balanceada Hank (HBSS) que contiene 20 mM de HEPES, BSA al 0.1% y 2.5 mM de probenecid. Después de los ciclos de lavado, un volumen de 100 µl es dejado en cada cavidad, y la placa es preparada para ser ensayada en el Sistema FLIPR. Placas del compuesto antagonista POC de punto único (10 µM de concentración final) o placas del compuesto IC50 del punto diez que contiene diluciones 1:3 ó 1:5 de compuestos antagonistas y una placa activadora de agonista (0.3 nM de concentración final de bradiquinina, EC8o) se prepararon usando un amortiguador de ensayo. La placa celular y las placas del compuesto se cargaron en el FLIPR y durante en ensayo, se tomaron lecturas de fluorescencia simultáneamente de todas las 96 cavidades de la placa celular. Se tomaron lecturas de 1 a diez segundos para establecer una línea base estable para cada cavidad, después 25 µl de la placa del antagonista Bl es rápidamente agregado (50 µl/seg.). La señal de fluorescencia es media en intervalos de 1 segundo (1 minuto) seguido por 6 segundos (2 minutos) para un total de 3 minutos para determinar si hay cualquier actividad agonista con los compuestos. El agonista B2, bradiquinina es entonces agregado a la placa celular y se registran otros 3 minutos para determinar el porcentaje de inhibición a 10 µM (placas POC) o el IC50 del antagonista. Los valores IC50 para péptidos PEG-conjugados o con vehículo probado en el ensayo de aequorina hBl están en un promedio ligeramente reducido, en actividad in vitro, conferida para conjugados de péptidos para polímeros PEG más grandes. Por ejemplo, el péptido representado por la SEC ID NO: 36 y su forma acetilada representada por la SEC ID NO: 37, resulta en un IC50 de 3.0 nM (+/- 5 nM, n=8) y 3.2 nM (+/-3.2 nM, n=9) , respectivamente como el receptor hBl. Sin embargo, el mismo conjugado de péptido a PEG como se describe en este documento demostró aproximadamente un incremento 10 veces en IC50. Las formas nativas, acetiladas y PEG-conjugado del péptido ' son inactivas a 10 µM en el ensayo FLIPR hB2. Ninguno de los compuestos mostraron actividad agonista en ya sea el receptor hBl o hB2.

C. Tejido basado en Ensayos In vitro de Péptidos Enlazados al Receptor hBl: La actividad antagonista y selectividad para el receptor Bl bradiquinina de los péptidos y/o péptidos conjugados con vehículo de la presente invención se determinó con el ensayo de contractilidad de la Vena umbilical (HUV) humana in vitro descrito abajo: Se suspendieron recipientes con endotelio desnudo en baños de órganos de 20 ml que contienen una solución salina fisiológica estándar (37°C) oxigenada (02 al 95% y C02 al 5%) y pre-calentada de la siguiente composición (en nM) : NaCl 118.0, KCl 4.7, MgS04 1.2, CaCl2 2,5, KH2P04 1.2, NaHC03 25.0 y glucosa 11.0 (pH 7.4). Se prepararon soluciones K+ altas (80 mM de KCl) por reemplazo equimolar de NaCl con KCl. También están presente Hoe 140 (1 µM) , mergetpa (1 µM) y captoprilo (10 µM) a través de los experimentos para bloquear los receptores B2 y para prevenir la degradación del péptido, respectivamente. Los tejidos se conectaron a fuerzas transductoras para registrar tensión isométrica después permitir equilibrarse por un tiempo suficiente bajo tensión en reposo óptimo. Los experimentos se llevaron a cabo usando sistemas de órgano aislado semi-automáticos que poseen baños de ocho órganos cada uno, con adquisición de datos ulticanales . Los tejidos primero se expusieron a una solución K+ alta (80 mM de KCl) para obtener una contracción de control. Después de lavados y un periodo de equilibrio de 60 minutos subsecuentemente, los tejidos se expusieron a concentraciones incrementadas cumulativas del agonista Lys-desArg9-BK de referencia para obtener curvas de concentración-respuesta en la ausencia (preparaciones de control) o presencia de varias concentraciones de los compuestos de prueba o el agonista Lys-desArg9 [Leu8] -Bk de referencia (preparaciones de prueba) , el cual se agregó 15 minutos antes de la exposición a Lys-desArg9-BK. Se generó una curva de concentración-respuesta a Lys-desArg9-BK en cada preparación. El parámetro medido fue el cambio máximo en la tensión inducida por cada concentración de agonista y los resultados expresados como un porcentaje de las respuestas control para KCl. Los valores IC50 del agonista (concentración que produce una respuesta máxima media) se calcularon por análisis de expresión lineal de sus curvas de concentración-respuesta. Las potencias del agonista de los compuestos de prueba y Lys-desArg9 [Leu8] -BK se evaluaron en términos de valores pA2 (concentración -log que produce un cambio hacia la derecha de dos veces la concentración del agonista-curva de respuesta) , los cuales fueron calculados de conformidad con Van Rossum (Van Rossum, J. M., Cumulative dose-response curves. II. Technique for the making of dose-response curves in isolated organs and the evaluation of drug parameters. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., 143:299-330 (1963)). Los valores ?A2 fueron calculados usando solamente concentraciones antagonistas que causan un cambio hacia la derecha significante de la curva de respuesta-concentración del agonista. Los valores pA2 se dan como la meda + s.e.m de tres determinaciones . La significancia estadística de las diferencias se determinó usando la prueba t de Student y los valores p < 0.05 fueron considerados estadísticamente significantes.

D. Actividad de Inhibición Bl in vitro de Péptidos y/o Péptidos Conjugados La efectividad de los péptidos y/o péptidos conjugados como inhibidores de la actividad de Bl (es decir, "neutralización" de Bl) , puede también ser evaluada midiendo la capacidad de cada péptido y/o péptido conjugado para bloquear la liberación de CGRP y sustancia P estimulada por Bl y señalización de calcio en cultivos neuronales de Ganglios de Raíz Dorsal (DRG) .

Cultivos Neuronales de Ganglios de Raíz Dorsal. Se disecaron ganglios de raíz dorsal uno por uno bajo condiciones asépticas de todos los segmentos espinales de ratas embriónicas de 19 días de edad (E19) , que fueron quirúrgicamente removidos del útero de ratas Sprague-Dawley terminalmente anestesiadas a término de preñez (Charles River, Wilmington, MA) . Los DRG se colectaron en medio 115 enfriado en hielo (GibcoBRL, Grand Island, NY) , que contiene suero de caballo inactivado por calor al 5% (GibcoBRL) , y se removió cualquiera de" los tejidos o vasos sanguíneos de tejido conectivo suelto. Los DRG son enjuagados dos veces en salina amortiguada de fosfato de Dulbecco libre de Ca2+ y Mg2+ (DPBS), pH 7.4 (GibcoBRL). Los DRG son entonces disociados en suspensión de células únicas usando un sistema de disociación de papaína (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) . Brevemente, se incubaron DRG en una solución de digestión que contiene 20 U/ml de papaína en Solución de Sal Balanceada Earle (EBSS) a 37 °C por cincuenta minutos. Las células son disociadas por trituración a través de pipetas Pasteur limpiadas por fuego en un medio de disociación que consiste de MEM/Ham F12, 1:1, 1 mg/ml de inhibidor ovomucoide y 1 mg/ml de ovalbúmina, y 0.005% de desoxirribonucleasa I (DNase) . Las células disociadas son formadas en pelotillas a 200 x g por cinco minutos y re-suspendidas en EBSS que contiene 1 mg/ml de inhibidor ovamucoide, 1 mg/ml de ovalbúmina y 0.005% de DNAse. La suspensión celular es centrifugada a través de una solución gradiente que contiene 10 mg/ml de inhibidor ovamucoide, 10 mg/ml de ovalbúmina a 200 x g por seis minutos para remover los desechos celulares, y después filtrada a través de una malla de nylon de 88-µm (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) , para remover cualquier grumo. El número celular se determina con un hemocitómetro, y las células son sembradas en poli-ornitina 100 µg/ml (Sigma, St. Louis MO) y en placas de 96 cavidades revestidas con laminina de ratón 1 µg/ml (GibcoBRL) a 10 x 103 células/cavidad en medio completo. El medio completo consiste de medio esencial mínimo (MEM) y Ham F12, 1:1, penicilina (100 U/ml) , estreptomicina (100 µg/ml) , y suero de caballo inactivado por calor al 10% (Gibco BRL) . Los cultivos se mantuvieron a 37 °C, C02 al 5% y humedad al 100%. Para controlar el crecimiento de células no neuronales, se incluyeron en el medio 5-fluoro-2' -desoxiuridina (75 µM) y uridina (180 µM) .

Tratamiento con péptidos Bl y anti-Bl y/o péptidos conjugados anti-Bl. Dos horas después de colocar en placas, las células son tratadas con ß-Bl de rata recombinante o ß-Bl humano recombinante a una concentración de 10 ng/ml (0.38 nM) . Los controles positivos que comprenden anticuerpo anti-Bl serial diluido (R & D Systems, Minneapolis, MN) , son agregados a diez concentraciones usando diluciones seriales de 3.16 veces. Todas las muestras son diluidas en medio completo, antes de ser agregadas a los cultivos. El tiempo de incubación es generalmente aproximadamente 40 horas previo a la medición de la expresión VRl .

Medición de la Expresión VRl en Neuronas DRG. Los cultivos son fijados con paraformaldehído al 4% en solución salina balanceada de Hank por quince minutos, bloqueados con Superblock (Pierce, Rockford, IL) , y permeabilizados con Nonidet P-40 al 0.25% (Sigma) en salina amortiguada de Tris. HCl (Sigma) (TBS) , por una hora a temperatura ambiente. Los cultivos son enjuagados una vez con TBS que contiene Tween 20 al 0.1% (Sigma) e incubados con IgG anti-VRl de conejo (preparado en Amgen) por una y una hora y media a temperatura ambiente, seguido por incubación de anticuerpo de conejo anti-ratón etiquetado con Eu (Wallac Oy, Turku, Finlandia), .por una hora a temperatura ambiente. Los lavados con TBS (3 x cinco minutos con sacudimiento lento) , son aplicados después de cada incubación de anticuerpo. La solución mejorada (150 µl/cavidad) , Wallac Oy) , se agrega a los cultivos. La señal fluorescente es entonces medida en un fluorómetro de tiempo resuelto (Wallac Oy) . La expresión de VRl en muestras tratadas con péptidos conjugados con vehículos es determinada comparando con una curva estándar de titulación de Bl a partir de 0-1000 ng/ml. El porcentaje de inhibición (comparado con la inhibición máxima posible) del efecto Bl en la expresión VRl en neuronas DGR, se determina comparando con controles que no son tratados con Bl . La actividad funcional y de enlace al receptor deteriorado para cada uno de los antagonistas Bl del péptido PEG-conj gado, fue directamente relacionada con el tamaño del grupo PEG agregado y que varía desde ~5-200 veces reducciones en potencia. Los enlazadores de poliglicina de ~5-7 residuos, funcionan bien para preservar la funcionalidad, mientras los enlazadores más grandes ya sea mostraron poco mejoramiento ("enlazador flexible") o probaron ser un deterioro de actividad ("enlazador rígido") . Finalmente, la Tabla 8 ilustra la amplitud de esta solicitud con una variedad muy diferentes de antagonistas de Bl del péptido PEG-conjugado.

Tabla 8: Afinidad de enlace (Ki) y potencia funcional (IC50) en el receptor .Bl humano (bBl para antagonistas péptidos y péptidos PEGilados a: proceso generado por un crisol descrito en el Esquema de Reacción 4; b: aminación reductiva en el residuo N-terminal, amina epsilon; c: acilado en el residuo N-terminal, amina epsilon; d: acilado en el residuo N-terminal, amina alfa.

Ejemplo 7 : Determinación de la Estabilidad de Péptidos y/o Péptidos Conjugados A. Ensayo Microvilli Limítrofe con Cepillo en Riñon de Rata Se prepararon membranas de riñon de conformidad con el procedimiento expuesto por Booth et al. (Biochemical Journal, 142:575 (1974)). Las concentraciones de proteínas son determinadas por el método de Bradford (Anal. Biochemistry., 72:248-254 (1976)).

B. Ensayo Homogenado de Pulmón de Rata o Humano S9 Se preparó pulmón de rata o humano como se describe por Skidgel et al. (Biochemical Pharmacology 33:3471 (1984) ) . Los compuestos de prueba son preparados a una concentración de 1 mM en una solución de PBS (pH = 7.1) . Los compuestos de prueba son agregados a una preparación de tejido a partir del procedimiento A o B (concentración de proteína final de 2 mg/ml), e incubados a 37CC. En varios puntos de tiempo, la proteína es precipitada con acetonitrilo, HCl 0. ÍM en acetonitrilo o TFA al 10% en agua. Lo precipitado es removido por centrifugación, y lo filtrado además se filtra a través de una membrana de 0.1 µM. La muestra es entonces analizada por CLAR de fase inversa (4.6 x 300 mm de Novapak HR C18 (Waters Corporation, Milford, MA) , flujo = 1 mL/min, gradiente lineal de ACN al 10% (0.1% de ácido Fórmico) - agua al 90% (0.1% de ácido fórmico) a ACN al 50% (ácido fórmico al 0.1%) - agua al 50% (ácido fórmico al 0.1% durante 20 minutos), con detención de espectroscopia de masas. La concentración del compuesto de prueba al tiempo T relativo al estándar interno, se ajusta a una primera función de pérdida de orden ( [compuesto] t = [compuesto] 0 (l-e(-kt)); " [compuesto] 0" y " [compuesto] t", son la concentración del compuesto de prueba al tiempo cero y la concentración del compuesto de prueba al tiempo que la muestra es retirada, respectivamente; la . variable "t" es el tiempo en que la muestra es retirada para análisis; y k es la relación del cambio de concentración del compuesto de prueba) . La variable "k" es determinada usando un procedimiento de regresión no lineal proporcionado por el paquete de software Estadístico JMP. Dado que la concentración del compuesto de prueba disminuye con el tiempo, los valores de "k" son negativos. La vida media se calcula a partir del valor derivado del modelo de "k" usando la siguiente fórmula: T 1/2 = (Ln 2)/K.

Ejemplo 8 : Actividad antinociceptiva ±n vivo de péptidos anti-Bl y péptidos anti-Bl conjugados con vehículo en modelos de dolor de rata y mono A. Modelo de Dolor Neuropático en Rata. Ratas macho Sprague-Dawley (200 g) , son anestesiadas con anestesia inhalante de isoflurano y los nervios de la espina lumbar izquierda al nivel de L5 y L6, son estrechamente ligados (estructura de seda 4-0) , distales al ganglio de raíz dorsal y previo a la entrada en el nervio ciático, como se describe primero por Kim and Chung (An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain 50:355-363, (1992)). Las incisiones son cerradas y las ratas se dejan recuperar. Este procedimiento resulta en alodinia mecánica (táctil) en la pata trasera izquierda, valorada registrando la presión en la cual la pata afectada (ipsilateral al sitio de la lesión del nervio) , fue retirada de estímulo graduado (filamentos von Frey que varían desde 4.8 a 148.1 N) , aplicados perpendicularmente a la superficie plantar de la pata (entre las almohadillas de las patas), a través de jaulas de observación de malla de alambre. Se determinó un umbral de retiro de pata (PWT) , incrementando secuencialmente y disminuyendo la intensidad del estímulo y analizando los datos de retiro usando una prueba no paramétrica Dixon, como se describe por Chaplan, S.R., et al. (Quantitative assesment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Meth, 53:55-63 (1994)). Ratas normales y ratas con cirugía simulada (nervios aislados pero no ligados) , permanecieron al menos a 148.1 mN (equivalente a 15 g) de presión sin responder. Las ratas ligadas al nervio espinal responden tan poco como 4.0 mN (equivalente a 0.41 g) de presión en la pata afectada. Las ratas son incluidas en el estudio solamente si no exhiben disfunción motora (por ejemplo, arrastre o caída de pata) y su PWT fue por debajo de 39.2 mN (equivalente a 4.0 g) . -Al menos siete días después de la cirugía, las ratas son tratadas con péptidos de prueba o péptidos conjugaos con vehículo de prueba (usualmente una dosis seleccionada de aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 60 mg/kg, respectivamente) , o diluyente de control (PBS) una vez por inyección s.c. y se determinó el PWT cada día posteriormente por 7 días .

B. Modelo de Dolor Inflamatorio de CFA en Rata. Se anestesiaron ligeramente ratas macho Sprague-Dawley (20'0g) con anestesia inhalante de isoflurano y la pata trasera izquierda se inyecta con adyuvante Freund completo (CFA) , 0.15 ml . Este procedimiento resulta en alodinia mecánica (táctil) en la pata trasera izquierda, valorada registrando la presión en la cual la pata afectada es retirada del estímulo graduado (filamentos von Frey que varían desde 4.0 hasta 148.1 mN) , aplicados perpendicularmente a la superficie plantar de la pata (entre los cojinetes de las patas), a través de jaulas de observación de malla de alambre. El PWT es determinado incrementando o disminuyendo secuencialmente la intensidad del estímulo y analizando los datos de retiro usando una prueba no paramétrica Dixon, como se . describe por Chaplan et al., (1994). Las ratas son incluidas en el estudio solamente si no presentan disfunción motora (por ejemplo, arrastre o retiro de pata) , o piel quebrada y su PWT está por debajo de 39.2 mN (equivalente a 4.0 g) . Al menos siete días después, las ratas con inyección de CFA, son tratadas con péptidos de prueba y/o péptidos conjugados con vehículo de prueba (usualmente seleccionando dosis de 60 mg/kg) , o solución de control (PBS), una vez por inyección s.c. y se determina el PWT cada día posteriormente por 7 días . El umbral de retiro de pata promedio (PWT) , se convirtió al porcentaje de efecto máximo posible (%MPE) , usando la siguiente fórmula : %MPE = 100 * (PWT de ratas tratadas -PWT de ratas de control) / (15-PWT de ratas de control). De este modo, el valor límite de 15 g (148.1 mN) , es equivalente a 100% del MPE y la respuesta de control es equivalente a MPE al 0%. Los péptidos y péptidos conjugados con vehículo preferidos de la presente invención, se espera produzcan un efecto antinociceptivo con una relación PD en una dosis de selección de aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 60 mg/kg, respectivamente.

B . Modelo de Inflamación de LPS en Mono Verde. La efectividad de los péptidos y/o péptidos conjugados como inhibidores de la actividad Bl, puede ser evaluada en monos verdes Macho ( Cercopithaecus aethiops St Kitts) , cambiados localmente con agonistas de Bl esencialmente como se describe por deBlois and Horlik (British Journal of Pharmacology. 132:327-335 (2002)), la cual está incorporada en este documento por referencia en su totalidad) . Para determinar si los antagonistas de péptidos PEG-conjugados de la presente invención inhiben el edema inducido por Bl,, se condujeron estudios descritos abajo en monos verde macho ( Cercopithaecus aethiops St Kitts) , en la granja experimental Primates Ltd. Del Caribe (St Kitts, West Indias) . Los procedimientos son revisados y aceptados por los Comités de Cuidados Animales para el CR-CHUM (Montreal, Canadá) y de Primates Ltd. del Caribe (St Kitts, West Indias) . Los animales que pesaron 6.0 + 0.5 kg (n=67) , fueron anestesiados (50 mg de cetamina kg-1) y pre-tratados con una inyección intravenosa única de LPS (90 µg kg"1) o salina (1 ml) vía la vena safenosa. 1. Estudios de Inflamación Se evaluó el edema- inducido por quinina por el ensayo de pliegue de piel ventral (Sciberras et al . , 1987). Brevemente, se inyectaron monos anestesiados con captoprilo (1 mg kg"1 30 minutos antes del ensayo) . Una inyección subcutánea única de dKB, BK o el vehículo (2 mM de amastatina en 100 µl de lactato Ringer) , se dio en el área ventral y el incremento en el grosor de los pliegues de la piel se monitoreó por 30-45 min, usando un calibrador calibrado. Los resultados fueron expresados como la diferencia entre el grosor del pliegue de la piel antes y después de la inyección subcutánea. El captoprilo y amastatina se usaron para reducir la degradación de quininas en el término carboxilo y amino, respectivamente.

ANÁLISIS DE SHILD ANTAGONISTA La relación de respuesta de dosis para dKD (1-100 nmol) -edema inducido, se determinó a 24 horas posteriores al LPS en la ausencia o presencia de concentraciones diferentes de antagonista PEG-péptido. La BK (30 mmol) se usó como un control positivo.

CURSO DE TIEMPO ANTAGONISTA El curso de tiempo de la inhibición por el antagonista, se determinó a 4, 24, 48, 72 y/o 96 horas después de la administración de bolo único. Se usó la BK (30 nmol) como un control positivo.

FÁRMACOS El clorhidrato de cetamina, LPS, amastatina • y captoprilo, fueron de Sigma (MO, U.S. .). Todos los péptidos fueron de Phoenix Pharmaceuticals (CA, U.S. ): ESTADÍSTICAS Los valores son presentados como media + error estándar de la media (media s.e.). En estudios de edema, el espesor de la pre-inyección de los pliegues de la piel se sustrajo de los valores después del cambio subcutáneo. La curva de ajuste y los cálculos de EC5Q, fueron obtenidos usando software 4.0 Delta Graph por Apple Computers. Los datos fueron comparados por análisis de dos formas de varianza, seguido por pruebas t de Studen no apareadas, de un extremo, con corrección Bonferroni. Fue considerado estadísticamente significante p < 0.05. La administración de LPS a monos verdes se incrementó a partir de un nivel nulo de su sensibilidad a un agonista del receptor de Bl en un ensayo de formación de edema. Comparativamente, las respuestas al agonista receptor de B2 BK, no fueron afectadas . De manera sorprendente, una dosis subcutánea única a 10 mg/kg de un péptido PEG-conjugado de 5 kD representativo, y un péptido PEG-conjugado de 20 kD del mismo análogo peptídico, fue suficiente para revelar una respuesta inflamatoria inducida por el agonista Bl pre-establecido y suprimir los cambios agonistas diarios sucesivos por 3 y 4 días, respectivamente. No se observó taquifalaxis con el cambio de Bl hasta 96 h. El efecto también fue determinado por ser selectivo en Bl preferentemente que en B2. Además, el edema inhibido por PEG-conjugado de 5K, en respuesta a un cambio de dKD más prologando que el péptido no conjugado (es decir, péptido nativo) , aunque el rápido comienzo y eficacia fue comparable con ambas moléculas hasta 1.25 horas.

Ejemplo 9: Estudios Farmacocinéticos en Ratas Los varios péptidos y péptidos conjugados (en un medio acuoso) , fueron dosificados como un .bolo a ratas macho ' Sprague-Dawley vía una ruta intravenosa (iv) o subcutánea (sc) . Las muestras de sangre fueron colectadas en varios puntos de tiempo (por ejemplo, 0, 15, 30 minutos y/o 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84, 96, 120, 240, y/o 320 horas después de la inyección) , en tubos heparinizados . El plasma se removió de las pelotillas cellares después de la centrifugación y fueron ya sea congelados o inmediatamente procesados. El compuesto de interés en el plasma fue cuantificado por un método de EM-CL específico del analito o ELISA. Los varios parámetros de farmacocinéticas estándares tales como aclaramiento (CL) , aclaramiento aparente (CL/F) , volumen de distribución (Vss) , tiempo de residencia medio (MRT) , área bajo la curva (AUC) , y vida media terminal (t?/2) , fueron calculados por el método no compartimental (por e emplo, véase Tabla 9) : Tabla 9 : Estudios Farmacocinéticos de Antagonistas Bl de péptido y péptido PEGilado en Rata a: generado por el proceso de un crisol descrito en el esquema de Reacción 4; b: aminación reductiva en el residuo N-terminal, amina epsilon; c: 1 mpk sc; d: acilado en el residuo N-terminal, amina epsilon; e: 0.5 mpk sc; f: acilado en el residuo N-terminal, amina alfa g: 30 mpk sc; h: 1 mpk iv; e i: 3 mpk iv. Se apreciará que las varias modificaciones se pueden hacer en la invención como se describe anteriormente. Por consiguiente, el alcance de la invención está definido en las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Composición de materia de la fórmula: F- [ (X1) - (Y1)!!] , o una sal fisiológicamente aceptable de la misma, caracterizada porque: X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -lr-1?1 y -L-P2, respectivamente; F es un vehículo covalentemente unido a X1 o Y1; L1 y L2 son independientemente en cada caso, ausentes o enlazadores que tienen desde 0 a 9 residuos de aminoácidos; n es 0 a 3 ; y P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina. 2. Composición de materia de la fórmula: F'-Rz, o una sal del mismo fisiológicamente aceptable, caracterizada porque: F' es un vehículo multivalente ,- R es independientemente en cada caso, - (X1) - (Y1) n en donde R está covalentemente unido a F' ; X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -Ir-P1 y -L2-P2, respectivamente; L1 y L2 son independientemente en cada caso ausente o enlazadores que tienen desde 0 hasta 9 residuos de aminoácidos ; n es 0 a 3 ; Z es 2 a 8; y P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina. 3. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque
3. P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina seleccionados del grupo de péptidos que consiste de los péptidos mostrados en las SEC ID NOS: 5-26 y 43-50, y derivados de los mismos. 4. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque
4. X1 es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los péptidos mostrados en las SEC ID NOS: 27-41, y derivados de los mismos.
5. 5. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque n es 1 y P2 es un péptido que tiene una secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 2.
6. 6. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque n es O .
7. 7. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del grupo de péptidos que consiste de péptidos definidos por la fórmula: NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH en donde : a° es un aminoácido heterocíclico o alicíclico, alifático, aromático básico o neutral, di-péptido a1, a2, a3 y a4 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos básicos o neutrales; a6 es Ser; a5, a7 y a8 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos, siempre que al menos uno de a5, a7 y a8 se seleccione de Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga y Nigb de la configuración D- o L- ; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, un aminoácido natural o ausente.
8. 8. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque: a° es un aminoácido básico, un dipéptido básico o ausente; a1 es un aminoácido básico o di-péptido básico; a es Pro; a es Hyp; a4 es Gly; a5 y a8 son independientemente en cada caso, aminoácidos indanilo; as es Ser; a7 es un aminoácido D-indanilo; a8 es Cpg; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente.
9. 9. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque: a° es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, DLys, o un dipéptido que consiste de dos aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste de Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, o DLys; a1 es Arg; a2 es Pro; a3 es Hyp; a4 es Gly; a es Cpg; a es Ser; a7 es DTic; y a8 es Cpg.
10. 10. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque: a° es Lys-Lys; a1 es Arg; a2 es Pro; a3 es Hyp; a4 es Gly; a5 es Iglb; a6 es Ser; a7 es DIglb; y a8 es Oic.
11. 11. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque: a° es DArg; a es Arg; es Pro; a es Hyp; a4 es Gly; a5 es Igl; a es Ser; a7 es DIglb; y a8 es Oic,
12. 12. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del grupo de péptidos que consiste de péptidos definidos por la fórmula: NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a1 -COOH en donde : a° está ausente o es un aminoácido básico o un dipéptido básico; a1 es Arg; a2 es Pro; a3 es Pro; a4 es Gly; a5 es Me-Phe; a6 es Ser; a7 es D-ß-Nal; y a8 es He.
13. 13. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque dicho L1 es un enlazador peptidilo que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 1-00 hasta la SEC ID NO: 105, inclusive.
14. 14. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque dicho L1 es un enlazador peptidilo que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 100 hasta la SEC ID NO: 105, inclusive.
15. 15. Método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o condición asociada con o mediada por la actividad Bl, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto humano o animal, una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
16. 16. Método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o condición asociada con o mediada por la actividad Bl, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto humano o animal, una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de materia de conformidad con la reivindicación 3.
17. 17. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la enfermedad o condición se selecciona del grupo que consiste de inflamación, dolor inflamatorio, dolor agudo, dolor dental, dolor de espalda, dolor de espalda baja, dolor por trauma, dolor quirúrgico, trastornos inflamatorios del intestino, asma y rinitis alérgica.
18. 18. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la enfermedad o condición se selecciona del grupo que consiste de inflamación, dolor inflamatorio, dolor agudo, dolor dental, dolor de espalda, dolor de espalda baja, dolor por trauma, dolor quirúrgico, trastornos inflamatorios del intestino, asma y rinitis alérgica
19. 19. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y al menos un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
20. 20. Composición de materia de la fórmula: F- [ (X1) - (Y1)!!] , o una sal fisiológicamente aceptable de la misma, caracterizada porque: X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -iX-P1 y -L2-P2, respectivamente; F es un PEG covalentemente unido a X1 o Y1; L1 y L2 son independientemente en cada caso, ausentes o enlazadores que tienen desde 0 a 9 residuos de aminoácidos ; n es 0 a 3 ; y P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor Bl de bradiquinina.
21. 21. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque F' es un PEG multivalente .
22. 22. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-21, caracterizada porque P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del receptor de Bl de bradiquinina seleccionados del grupo de péptidos que consiste de los péptidos mostrados en las SEC ID NOS: 5-60 y derivados de los mismos.
23. 23. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque X1 es un péptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de los péptidos como se muestra en las SEC ID NOS: 27-41 y derivados de los mismos.
24. 24. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque n es 0 y Z es 2-8.
25. 25. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque Z es 4.
26. 26. Composición de materia de la fórmula: F- [ (X1) - (Y1)^] , o una sal fisiológicamente aceptable de la misma, caracterizada porque: X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -iX-P1 y -L2-P2, respectivamente; F es un vehículo covalentemente unido a X1 o Y1; L1 y L2 son independientemente en cada caso, ausentes o enlazadores que tienen desde 0 a 9 residuos de aminoácidos ; n es 0 a 3 ; y P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del grupo de péptidos que consisten de péptidos definidos por la fórmula: NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11aX2a13a:L4-COOH en donde : a° es un aminoácido heterocíclico o alicíclico, alifático, aromático básico o neutral, di-péptido o básico, o ausente ; a1, a2, a3 y a4 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos básicos o neutrales; a5 es Ser; as, a7 y a8 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos, siempre que al menos uno de a5, a7 y a8 se seleccione de Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga y Nigb de la configuración D- o L- ; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente.
27. 27. Composición de materia de la fórmula: F'-Rz, o una sal del mismo fisiológicamente aceptable, caracterizada porque: F' es un vehículo multivalente; R es independientemente en cada caso - (X1) - (Y1) a en donde R está covalentemente unido a F' ; X1 y Y1 son independientemente en cada caso, péptidos de la fórmula -L1-?1 y -L2-P2, respectivamente; L1 y L2 son independientemente en cada caso ausente o enlazadores que tienen desde 0 hasta 9 residuos de aminoácidos ; n es 0 a 3; Z es 2 a 8 ; y P1 y P2 son independientemente en cada caso , antagonistas peptídicos del grupo de péptidos que consiste de péptidos definidos por la fórmula : NH2-a°a1a2a3a4a5aea7a8a9a10a11a12a13a14-COOH en donde : a° es un aminoácido heterocíclico o alicíclico, alifático, aromático básico o neutral, di-péptido o básico, o ausente; a1, a2, a3 y a4 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos básicos o neutrales; as es Ser; a5, a7 y a8 son independientemente en cada caso, aminoácidos heterocíclicos o alicíclicos, alifáticos, aromáticos, siempre que al menos uno de a5, a7 y a8 se seleccione de Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga y Nigb de la configuración D- o L- ; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente.
28. 28. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-27, caracterizada porque : a° es un aminoácido básico, un dipéptido básico o ausente; a1 es un aminoácido básico; a2 es Pro; a3 es Hyp; a4 es Gly; a5 y a8 son independientemente en cada caso, aminoácidos indanilo; as es Ser; a7 es un aminoácido D-indanilo; a8 es Cpg; y a9, a10, a11, a12, a13 y a14 son independientemente en cada caso, cualquier aminoácido natural o ausente.
29. 29. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-27, caracterizada porque : a° es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, DLys, o un dipéptido que consiste de dos aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste de Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, o DLys; a1 es Arg; a2 es Pro; a3 es Hyp; a4 es Gly; a5 es Cpg; a6 es Ser; a7 es DTic; y a8 es Cpg.
30. 30. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-27, caracterizada porque : a° es DArg, o un dipéptido seleccionado del grupo que consiste de Lys-Lys, DLys-Lys, y DOrn-Lys; a1 es Arg; a2 es Pro; a3 es Hyp; a4 es Gly; a5 es Iglb; a6 es Ser; a7 es DIglb; y a8 es Oic.
31. 31. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-27, caracterizada porque : a° es DArg o un dipéptido Lys-Lys; a1 es Arg; a¿ es Pro a3 es Hyp a4 es Gly a5 es Igl a6 es Ser a7 es DIgl ; y a8 es Oic.
32. 32. Composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque P1 y P2 son independientemente en cada caso, antagonistas peptídicos del grupo de péptidos que consiste de péptidos definidos por la fórmula: NH2-a°a1a2a3a4a5asa7a8a9a10a11a12a13a14 -COOH en donde : a° es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys , DLys , o un dipéptido que consiste de dos aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste de Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys o DLys ; a1 es Arg ; a2 es Pro ; a3 es Pro ; a4 es Gly; a5 es Me- Phe ; a6 es Ser ; a7 es D- ß -Nal ; y a8 es He .
33. 33. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque dicho L1 es un enlazador peptidilo que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 100 hasta la SEC ID NO: 105, inclusive.
34. 34. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque dicho polietilenglicol tienen un peso molecular promedio seleccionado del grupo que consiste de: i. 5,000 Daltons; ii. 20,000 Daltons; iii. 24,000 Daltons; iv. 30,000 Daltons; v. 40,000 Daltons; vi. 60,000 Daltons;
35. 35. Composición de materia de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque dicha composición de materia es capaz de antagonizar la actividad del receptor Bl in vi tro y tiene una vida media terapéuticamente aceptable in vivo en mamíferos.
36. 36. Método para tratar, prevenir o aliviar una enfermedad o condición asociada con o mediada por la actividad Bl, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto humano o animal, una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de materia de conformidad con la reivindicación 34.
37. 37. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la enfermedad o condición se selecciona del grupo que consiste de inflamación, dolor inflamatorio, dolor agudo, dolor dental, dolor de espalda, dolor de espalda baja, dolor por trauma, dolor quirúrgico, trastornos del intestino inflamatorio, asma y rinitis alérgica.
38. 38. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la composición de materia de conformidad con la reivindicación 34 y al menos un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
39. 39. Uso de una composición de materia de conformidad con la reivindicación 34, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de inflamación, dolor inflamatorio, dolor agudo, dolor dental, dolor de espalda, dolor de espalda baja, dolor por trauma, dolor quirúrgico, trastornos del intestino inflamatorio, asma y rinitis alérgica.
40. 40. Antagonista peptídico del receptor Bl de bradiquinina, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 15-35, 39-54, derivados de los mismos y una sal del mismo, fisiológicamente aceptable.
41. 41. Antagonista peptídico del receptor Bl de bradiquinina, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 15-35 o una sal del mismo, fisiológicamente aceptable.
42. 42. Péptido de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 15-26.
43. 43. Péptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el aminoácido N-terminal es un D-aminoácido . 4 . Péptido de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el aminoácido N-terminal se selecciona del grupo que consiste de D-Dabl, DLys, DArg, y DOrn. 45. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un péptido antagonista del receptor Bl de bradiquinina, que comprende una secuencia de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de SEC ID NOS: 15-35 y al menos un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. 46. Método para tratar, prevenir o aliviar una enfermedad o condición asociada con o mediada por la actividad Bl, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto humano o animal, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un antagonista peptídico del receptor Bl de bradiquinina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 15-35 y al menos un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable . 47 . Método de conformidad con la reivindicación 46 , caracterizado porque la enfermedad o condición se selecciona del grupo que consiste de inflamación, dolor inflamatorio , dolor agudo , dolor dental , dolor de espalda , dolor de espalda baj a, dolor por trauma, dolor quirúrgico , trastornos del intestino inflamatorio , asma y rinitis alérgica . 48 . Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 , en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de inflamación, dolor inflamatorio , dolor agudo, dolor dental, dolor de espalda, dolor de espalda baja, dolor por trauma, dolor quirúrgico, trastornos del intestino inflamatorio, asma y rinitis alérgica. 49 . Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 45, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de inflamación, dolor inflamatorio, dolor agudo, dolor dental, dolor de espalda, dolor de espalda baja, dolor por trauma, dolor quirúrgico, trastornos del intestino inflamatorio, asma y rinitis alérgica .