EA009294B1 - Антагонисты в1 рецептора брадикинина (варианты), фармацевтическая композиция, лекарственное средство, способ лечения заболеваний (варианты) - Google Patents

Антагонисты в1 рецептора брадикинина (варианты), фармацевтическая композиция, лекарственное средство, способ лечения заболеваний (варианты) Download PDF

Info

Publication number
EA009294B1
EA009294B1 EA200600817A EA200600817A EA009294B1 EA 009294 B1 EA009294 B1 EA 009294B1 EA 200600817 A EA200600817 A EA 200600817A EA 200600817 A EA200600817 A EA 200600817A EA 009294 B1 EA009294 B1 EA 009294B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
peptide
pain
independently
peptides
Prior art date
Application number
EA200600817A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600817A1 (ru
Inventor
Гордон Нг
Юйэ-Шэн Ли
Колин В. Гегж
ДжейА. Бенни К. Аскью
Томас Сторц
Юйэле Люй
Дерин К. Д`Амико
Марк А. Джаросински
Чуан-Фа Лю
Куай Хуанг
Original Assignee
Эмджен Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эмджен Инк. filed Critical Эмджен Инк.
Publication of EA200600817A1 publication Critical patent/EA200600817A1/ru
Publication of EA009294B1 publication Critical patent/EA009294B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/043—Kallidins; Bradykinins; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/18—Kallidins; Bradykinins; Related peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к ряду биологически активных пептидов и конъюгированных пептидов, которые могут быть использованы как терапевтические или профилактические агенты против заболеваний или состояний, связанных с В1, в качестве агента, вызывающего заболевание. В предпочтительном варианте осуществления изобретения представлены биологически активные конъюгированные с ПЭГ пептиды. В одном из аспектов настоящего изобретения фармакологически активные конъюгированные с ПЭГ пептиды, соответствующие настоящему изобретению, используют для лечения воспаления или боли.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области химии природных соединений, биохимии, медицине и фармакологии, конкретно к новым биологически активным пептидам и конъюгированым пептидам, являющимся антагонистами В1 рецептора брадикинина. Данный класс пептидов неожиданным образом оказался толерантным к замещению аминокислотами на Ν-конце и/или конъюгированию с различными носителями на Ν-конце в отношении сохранения биологической активности, что привело к образованию терапевтически эффективных пептидов и/или конъюгатов пептидов с резко замедленными профилями эффективности по сравнению с известными пептидами того же класса, что дает возможность их использования в качестве перспективных терапевтических или профилактических агентов, например, при лечении или снятии симптомов воспаления или боли.
Сведения о предшествующем уровне техники
Больше чем два миллиона человек только в Соединенных Штатах Америки становятся нетрудоспособными из-за хронической боли в любой произвольно взятый день (см. Т. М. ЛсззсП & Ό. Ό. Ке11у, Раш аиб Аиа1де81а (Боль и обезболивание) в монографии Рг1пс1р1ез О£ №ига1 8с1еисе (Принципы неврологии), третье изд. (под ред. Е. В. Каибе1, 1. Н. 8с11\\'аг1х. Т. М. беззе11. (1991)). К сожалению, современные препараты для лечения боли только частично эффективны и многие также являются причиной изменения образа жизни, слабости и/или опасных побочных эффектов. Например, нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты (ΝδΑΙΌδ), такие как аспирин, ибупрофен и индометацин, умеренно эффективны против воспалительной боли, но они являются также токсичными для почек, и высокие дозы имеюттенденцию вызывать желудочно-кишечное раздражение, изъязвление, кровотечение, повышенный риск сердечно-сосудистых событий и спутанность сознания. У пациентов, которых лечат опиоидами, часто бывает спутанность сознания и запор, и длительное применение опиоидов связано с толерантностью и зависимостью. Местные анестезирующие препараты, такие как лидокаин и микселитин, одновременно подавляют боль и вызывают потерю нормального восприятия. Кроме того, при систематическом применении местные анестезирующие препараты связаны с вредными сердечно-сосудистыми эффектами. Таким образом, в настоящее время имеется неудовлетворенная потребность в лечении хронической боли.
Боль представляет собой ощущение, основанное на сигналах, получаемых от окружающей среды и передаваемых и воспринимаемых нервной системой (в качестве обзора см. М111аи Μ. I., Тйе шбисйои о£ раш: аи ш1едгайуе геу1е\\' (Индукция боли, сводный обзор). Ргод. №игойю1., 57: 1-164 (1999)). Вредные стимулы, такие как тепло и контакт, приводят к тому, что специализированные сенсорные рецепторы в коже посылают сигналы в центральную нервную систему (ЦНС). Данный процесс называется ноцицепция, и периферические сенсорные нейроны, которые опосредуют его, являются ноцицепторами. В зависимости отсилы сигнала от ноцицептора(ов), а также извлечения и формирования данного сигнала посредством ЦНС субъект может или не может ощущать вредный стимул как болевой. Когда чье-либо ощущение боли соответствующим образом калибруется относительно интенсивности стимула, боль осуществляет свою защитную функцию. Однако некоторые типы повреждения ткани вызывают феномен, известный как гипералгезия или проноцицепция, при котором относительно безвредные стимулы воспринимаются как интенсивно болевые, поскольку болевые пороги субъекта снижены. Как воспаление, так и повреждение нервов могут вызвать гипералгезию. Так, субъекты, пораженные воспалительными состояниями, такими как солнечные ожоги, остеоартрит, колит, кардит, дерматит, миозит, неврит, воспалительная болезнь кишки, коллагеновые сосудистые заболевания (которые включают ревматоидный артрит и волчанку) и т.п., часто испытывают усиленные ощущения боли. Аналогично травма, хирургическое вмешательство, ампутация, абсцесс, каузалгия, коллагеновые сосудистые заболевания, демиелинизирующие заболевания, тригеминальная невралгия, рак, хронический алкоголизм, инсульт, таламический болевой синдром, диабет, герпетические инфекции, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины и химиотерапия вызывают повреждения нервов, которые приводят в результате к усиленной боли.
Поскольку механизмы, посредством которых ноцицепторы преобразуют внешние сигналы при нормальных и гипералгезивных состояниях, становятся более понятными, процессы, участвующие в гипералгезии, могут быть направлены на то, чтобы ингибировать снижение болевого порога и, таким образом, снизить уровень испытываемой боли.
Брадикинин (ВК) и родственный пептид каллидин (Ьук-ВК) (см. табл. 3) опосредуют физиологические воздействия кининов на сердечно-сосудистую и почечную системы. Однако активные пептиды ВК и каллидин быстро разрушаются пептидазами в плазме и других биологических жидкостях и теми, которые высвобождаются из ряда клеток, поэтому полупериод существования ВК, как показано, составляет приблизительно 17 с (1). ВК и каллидин быстро метаболизируются в организме карбоксипептидазой Ν, которая удаляет карбоксиконцевой остаток аргинина с образованием дез-Агд-ВК или дез-Агд-каллидина. Дез-Агд-каллидин находится в группе преобладающих кининов у человека и опосредует патофизиологические эффекты кининов в организме человека. В дополнение к тому, что он представляет собой очень сильный провоспалительный пептид, дез-Агд-ВК или дез-Агд-каллидин, как известно, вызывает вазодилатацию, проницаемость сосудов и бронхоконстрикцию (в качестве обзора см. статью Ведой и Ватайе,
- 1 009294
РНагтасо1оду оГ Вгабукшш апб Ве1а1еб Κίηίη§ (Фармакология брадикинина и родственных кининов), Р11агтасо1од1са1 Ве\зе\\ъ. 32(1): 1-46, (1980)). Кроме того, дез-Агд-ВК и дез-Агд-каллидин, по-видимому, являются особенно важными медиаторами воспаления и воспалительной боли, а также участвуют в ее поддержании. Имеется также важное доказательство, заключающееся в сверхпродукции дез-Агдкаллидина при состояниях, в которых боль представляет собой основную характеристику, таких как септический шок, артрит, стенокардия и мигрень.
Мембранные рецепторы, которые опосредуют плейотропное действие кининов, относятся к двум различным классам, названным В1 и В2. Оба класса рецепторов были клонированы и секвенированы из множества источников, включая человека (см. статьи Мепке е! а1., Ехртеккюп с1ошпд οί а Нитап Ы Ьгабук1шп гесерЮг (Клонирование экспрессии человеческого рецептора брадикинина В1), 1. Вю1. СНет., 269:21583-21586 (1994); Некк е! а1., С1ошпд апб рйаттасо1од1са1 с11агас1еп/а1юп οί а Нитап Ьгабукшш (ВК2) гесерЮг (Клонирование и фармакологическая характеризация человеческого рецептора брадикинина (ВК-2)), ВюсНет. ВюрНук. Век. Соттип., 184, 260-268 (1992)). Они представляют собой типичные Обелок-связанные рецепторы, имеющие семь предполагаемых участков перекрывания мембраны. В различных тканях рецепторы ВК связаны с каждым известным вторым переносчиком. Рецепторы В2, которые имеют повышенную аффинность к ВК, по-видимому, являются наиболее распространенной формой брадикининовых рецепторов. В основном все нормальные физиологические ответы и многие патофизиологические ответы на брадикинин опосредуются рецепторами В2.
С другой стороны, рецепторы В1 обладают повышенной аффинностью к дез-Агд-ВК (см. табл. 3) по сравнению с ВК, тогда как дез-Агд-ВК неактивен в отношении рецепторов В2. Кроме того, рецепторы В1 в норме не экспрессируются во многих тканях. Индукция их экспрессии происходит при травме или повреждении ткани, а также при определенных типах хронических воспалений или системном инсульте (см. статью Магсеаи Р. е! а1., Кшш В1 гесер1огк: а ге\зе\\· (Рецепторы кинина В1, обзор). 1ттипрйаттасо1оду, 30:1-26, (1995)). Более того, у кроликов, крыс и свиней происходит повышенная регуляция ответов, опосредованных рецепторами В1, от нулевого уровня после введения бактериального липополисахарида (ЬР8) или воспалительных цитокинов (см. статью Магсеаи е! а1., (1998)).
Свойства кининов вызывать боль, связанные с индуцируемой экспрессией рецепторов В1, делают рецептор В1 интересной мишенью при разработке противовоспалительных, антиноцицептивных, антигипералгезических и анальгетических агентов, которые могут быть специфически направлены на травмированные ткани при минимальном воздействии на нормальные ткани. Хотя идентифицирован ряд пептидных антагонистов, направленных на рецептор В1, их разработке в качестве терапевтических анальгетиков препятствуют малоэффективные полупериоды существования, обусловленные очень быстрым разложением тканевыми и сывороточными пептидазами, и эффективный почечный клиренс.
Совсем недавно было показано, что пептидные аналоги, имеющие замены в виде неприродных аминокислот, устойчивы к пептидазам в анализах стабильности ш νίΙΐΌ (в качестве обзора см. статьи Ведой е1 а1, Вгабукшш гесер!огк апб 1Не1г ап!адошк!к (Брадикининовые рецепторы и их антагонисты), Еигореап 1оитпа1 οί РНагтасо1оду, 348:1-10 (1998); 81е\таг( 1. М. е! а1, Вгабукшш ап!адошк!к: ргекеп! ргодгекк апб ГиШге ргокрес!к. (Антагонисты брадикинина, развитие в настоящее время и будущие перспективы), 1тшипорйагтасо1оду, 43:155-161, (1999) и 81ехтаг( 1. М. е! а1., Ме1аЬоЙ5т-Ве5151ап1 Вгабукшш Ап!адошк!к: Иеуе1ортеп1 апб АррНсабопк (Устойчивые к метаболизму антагонисты брадикинина, создание и применение), Вю1. СНет., 382:37-41, (2001)).
Ковалентное конъюгирование белков с полиэтиленгликолем (ПЭГ) широко признано как подход к существенному увеличению ш у1уо полупериодов существования терапевтических белков в системе кровообращения. ПЭГилирование достигает данного эффекта в основном путем замедления почечного клиренса, поскольку молекула ПЭГ значительно увеличивает гидродинамический радиус белка (см. статью 2а11р§ку, 8. е! а1., Ике оГ Гипсйопайхеб ро1у (е!йу1епе д1усо1)к Гог тобШсабоп оГ ро1урерйбек (Применение функционализированных полиэтиленгликолей для модификации полипептидов) в сборнике Ро1у(е!йу1епе д1усо1) сйет15!ту: Вю!есНшса1 апб Ь^οшеб^са1 аррйсабопк (Химия полиэтиленгликолей - применение в биотехнологии и биомедицине), под ред. 1. М. Нагпк. (1992), Р1епит Ргекк, №\ν Уотк, с. 347-370). Дополнительные преимущества, часто обусловленные ПЭГилированием белков, включают повышенную растворимость, устойчивость к протеолитическому разложению и пониженную иммуногенность терапевтического полипептида. Положительные эффекты ПЭГилирования белков подтверждаются производством ряда ПЭГилированных белков, включая ПЭГ-аденозиндезаминазу (Абадеп™/Епхоп Согр.), ПЭГ-Ьаспарагиназу (Опсакраг™/Епхоп Согр.), ПЭГ-Интерферон а-2Ь(РЕО-1п1гоп™/8сйег1пд/Епхоп). ПЭГИнтерферон а-2а (РЕОА8У8ТМ/Восйе) и РЕО-О-С8Р (Хеи1ак1а'|Л1/Атдеп). а также многие другие, проходящие клинические испытания. С другой стороны, ПЭГилирование маленьких терапевтических пептидов обнаруживает однозначные проблемы и широко не применялось. Одним из самых больших препятствий ПЭГилирования пептидов является то, чтобы в конечном конъюгате сохранялась биологическая активность. Поскольку терапевтические пептиды часто включают минимальную последовательность, необходимую для активности, и вследствие этого очень малы, они относительно интолерантны к заменам. Молекулы ПЭГ непропорционально больше, чем сам пептид и, следовательно, они с большей
- 2 009294 вероятностью будут стерически нарушать специфические взаимодействия связывания пептида с рецептором, необходимые для проявления активности. Таким образом, способность пептида переносить ПЭГилирование и при этом сохранять достаточную специфическую активность, чтобы быть эффективным терапевтическим агентом, является совершенно непредсказуемой и должна определяться эмпирическим путем (см. статью Мотритодо с1 а1., 8е1есДуе А1ку1а!юи аиб Асу1аДои о£ α- аиб ε-Атто Отоирк тейй РЕС ίη а 8отаЮ51а11п Апа1одие: Табогеб Сйет181ту ог ОрШшхеб Вюсоищда1С8 (Селективное алкилирование и ацилирование α- и ε-аминогрупп с помощью ПЭГ в аналоге соматостатина, специальные химические методы получения оптимизированных биоконъюгатов), Вюсоищда1е СНет.. 13:1238-1243, (2002)).
Очевидно, что необходимы новые, безопасные и эффективные терапевтические препараты для лечения воспаления и боли. Было бы полезно иметь специфический пептидный антагонист В1, который способен лучше переносить системное воздействие при лечении за счет увеличения периода существования в кровотоке (замедленного клиренса), растворимости, стабильности и/или снижения иммуногенности молекулы. Увеличенный период существования в кровотоке приводил бы в результате к режиму с менее частым дозированием, и схема менее частого дозирования была бы более удобной как для врачей, так и для пациентов и была бы особенно полезной для тех пациентов, которые сами принимают препарат. Другие преимущества менее частого дозирования могут включать уменьшение количества лекарственного препарата, вводимого пациентам, и повышенный уровень удобства.
Сущность изобретения
Соответственно, объектом настоящего изобретения является получение новых связывающих агентов рецептора В1 с очевидно улучшенными фармакокинетическими свойствами ίη угуо по сравнению с известными пептидными антагонистами В1, при этом в достаточной мере обладающими активностью антагонистов рецептора В1, чтобы они были терапевтически эффективными для лечения или предупреждения воспаления, боли и других опосредуемых В1 состояний, включая, но без ограничения перечисленным, астму и аллергические риниты. Данные агенты представлены в настоящем изобретении в форме новых пептидных антагонистов и конъюгированных пептидных антагонистов рецептора В1. В одном из вариантов осуществления новые пептидные антагонисты рецептора В1, соответствующие настоящему изобретению, включают последовательность аминокислот, как показано в любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 1554.
Согласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения, один или более и предпочтительно от одного до девяти остатков аминокислот, независимо выбранных из любых двадцати генетически кодируемых Ь-аминокислот или стереоизомерных Ό-аминокислот, будут связаны с одним из или обоими концами пептидных последовательностей, как показано в 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 15-54.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение представляет также конъюгированные пептиды, которые обладают очевидно улучшенными фармакокинетическими свойствами ίη угуо по сравнению с известными пептидными антагонистами В1, при этом они в достаточной мере связываются и антагонистически действуют на активность рецептора В1, чтобы их можно был использовать терапевтически.
Один из аспектов изобретения включает конъюгированный пептид формулы I г-КХ1)- (Υ1Μ I в которой
Р означает носитель, ковалентно связанный с X1 или Υ1 (предпочтительно, когда Р представляет собой молекулу ПЭГ или ее производное);
X1 и Υ1 в каждом случае независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ь1-Р1 и -Ь2-Р2, соответственно;
Ь1 и Ь2 в каждом случае независимо друг от друга означают линкеры;
η означает от 0 до 3; и
Р1 и Р2 в каждом случае независимо друг от друга означают пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1. Предпочтительно, когда Р1 и Р2 включают последовательность аминокислот, как показано в любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-26, 43-60, и ее производные.
Другим объектом настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей материалы наполнителя-носителя, включающие диспергированный в них конъюгированный пептид, соответствующий изобретению.
Другим объектом настоящего изобретения является разработка терапевтических способов лечения, которые заключаются во введении нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически эффективного количества композиции, включающей наполнители и по меньшей мере один пептид и/или конъюгированный пептид, соответствующий изобретению.
Пептиды и/или конъюгированные пептиды, соответствующие изобретению, обладают терапевтической ценностью в плане лечения заболеваний, опосредованных активацией В1, включая, но без ограничения перечисленным, воспаление и состояния хронической боли воспалительной и невропатической природы, септический шок, артрит, остеоартрит, стенокардию, астму, аллергический ринит и мигрень.
- 3 009294
Пептиды и/или конъюгированные пептиды, соответствующие изобретению, могут быть использованы с терапевтическими или профилактическими целями путем изготовления их с соответствующими материалами фармацевтического носителя и введения эффективного количества нуждающемуся в этом пациенту, такому как человек (или другое млекопитающее).
Дополнительные пептиды и/или конъюгированные пептиды могут быть результатом консервативных модификаций последовательностей аминокислот пептидов и/или конъюгированных с носителем пептидов, описанных в данном контексте. Консервативные модификации будут давать пептиды и/или конъюгированные пептиды, имеющие функциональные, физические и химические характеристики, подобные характеристикам пептидов и/или конъюгированных пептидов, из которых получены данные модификации. Такие консервативно модифицированные формы пептидов и/или конъюгированных пептидов, описанные в данном контексте, также рассматривают как вариант осуществления настоящего изобретения.
Другой аспект изобретения относится к способу получения конъюгированного пептида как описано в данном контексте, включающего стадии реакции соединения, имеющего структуру (Χ1)-(Υ1)Ν, в которой
X1 и Υ1 в каждом случае независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ь1-Р1 и -Ь2-Р2, соответственно;
Ь1 и Ь2 в каждом случае независимо друг от друга означают линкеры;
η означает от 0 до 3; и
Р1 и Р2 в каждом случае независимо друг от друга означают пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1, с носителем (Р), который дает конъюгированный пептид формулы Р-[(Х1)], Р-[(Х1)]-Р, Ρ-[(Χ1)-(Υ1)η], Ρ-(Χ1)-(Υ1)η или Ρ-(Χ1)-(Υ1)η-Ρ. Предпочтительно, когда Р представляет собой молекулу ПЭГ или ее производное. Более предпочтительно, когда Р1 и Р2 в каждом случае независимо друг от друга означают пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1, включающие по меньшей мере одну из пептидных последовательностей, представленных в 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-60. Даже более предпочтительно, когда X1 означает пептид, как показано в 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 27-41. Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны при рассмотрении детального описания изобретения, которое следует далее.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того факта, что класс пептидов, как правило, рассматриваемый как совершенно интолерантный к замещению, в данном случае может быть замещен аминокислотами на Ν-конце и/или конъюгирован с различными носителями на Ν-конце с образованием терапевтически эффективных пептидов и/или конъюгатов пептидов с резко замедленными профилями эффективности по сравнению с известными пептидами того же класса, и, следовательно, это дает возможность их применения для лечения воспаления и боли. Таким образом, пептиды и/или конъюгаты пептидов, соответствующие настоящему изобретению, дают огромное терапевтическое преимущество относительно известных пептидных антагонистов В1. Более подробно, авторы обнаружили, что ранее описанные недостатки известных пептидных антагонистов В1 в плане их терапевтического применения преодолимы путем замены аминокислот на Ν-конце и/или конъюгирования пептидных антагонистов с носителями, такими как, но без ограничения перечисленным, молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ), при использовании пептидильных или непептидильных линкеров определенного размера и композиции, которая максимально повышает антагонистическую активность и специфичность при пролонгировании эффективного полупериода существования ίη νίνο. Кроме того (или альтернативно), было обнаружено, что, несмотря на немного пониженную ίη νίίτο активность, которую дают антагонисты пептида В1, конъюгированные с более крупными полимерами ПЭГ, увеличенные полупериоды существования в кровотоке крупных ПЭГ-конъюгатов, обеспечивают существенно более сильное воздействие и пролонгированную эффективность ίη νίνο по сравнению с пептидными конъюгатами, конъюгированными с менее крупными полимерами ПЭГ. Кроме того, авторы обнаружили, что размер молекулы ПЭГ, присоединенной к пептидному антагонисту рецептора В1, является критическим параметром в оптимизации присущей антагонисту активности и эффективного полупериода существования ίη νίνο. Например, ацетилированный пептидный антагонист В1 продемонстрировал эффективность в соответствующих моделях боли ίη νίνο в течение максимум 4 ч после многократного дозирования. Неожиданно тот же самый пептид, конъюгированный с молекулой ПЭГ молекулярной массы 5 и 20 кДа описанным в данном контексте образом, продемонстрировал эффективность в период до 2 суток и по меньшей мере 4 суток, соответственно, после однократной болюсной инъекции.
Перед тем как описать пептидные и конъюгированные с носителем или ПЭГ пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1, соответствующие настоящему изобретению, и способы их получения и применения, следует иметь в виду, что данное изобретение не ограничено конкретными описанными пептидными и/или конъюгированными пептидными антагонистами, поскольку пептидные и/или конъюгированные пептидные антагонисты и методики, предусматриваемые настоящим изобретением, могут,
- 4 009294 конечно, несколько варьировать. Следует иметь в виду, что терминология, используемая в данном контексте, служит только для целей описания конкретных вариантов осуществления, и не предусмотрено, что она является ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
Пептиды, связывающие рецептор брадикинина В1, рассматриваемые в плане конъюгирования с носителем в целях и таким образом, как описано в данном контексте, включают, но без ограничения перечисленным, новые пептидные антагонисты, связывающие В1, описанные в данном контексте, а также пептидные антагонисты, связывающие В1, известные в области техники, включая, но без ограничения перечисленным, любой пептид, описанный в любой из следующих публикаций (каждая из которых таким включена в виде ссылки во всей своей полноте): Ведой с! а1., Вгабукйпп гессрЮгв апб 1йсй аШадошвй (Брадикининовые рецепторы и их антагонисты), Еиг. Т оГ Рйатша., 348:1-10 (1998); №идсЬаисг ^. с! а1., Κίηίη В1 гессрЮг аШадошбв тейй пшЫ-спхутайс гев151апсс ргорсгйсв (Антагонисты рецептора кинина В1 со свойствами ферментной полирезистентности), Сап. I. Рйувю1. Рйагтасо1., 80:287-292, (2002); 81с\саг( Т М. с! а1., ВгабуИшп аШадопЫв: ргсвсШ ргодгевв апб ГиШгс рговресГв (Антагонисты брадикинина, развитие в настоящее время и будущие перспективы), 1ттипорйагтасо1оду, 43:155-161, (1999); 8(с\саг( Т М. с! а1., Мс1аЬо115т-Вс5151ап1 ВгабуИшп ЛЩадопЫв: Оеуе1ортсп1 апб Аррйсайопв (Устойчивые к метаболизму антагонисты брадикинина, развитие и применение), Вю1. Сйст., 382:37-41, (2001); Публикация РСТ \УО 98/07746 и Патенты США \о\о: 4693993, 4801613, 4923963, 5648336, 5834431, 5849863, 5935932, 5648333, 5385889, 5444048 и 5541286.
Термины, используемые на протяжении данного описания, определены следующим образом, пока не ограничено иным образом в определенных случаях.
Остатки природных аминокислот описывают тремя путями: полное название аминокислоты, стандартный трехбуквенный код или стандартный однобуквенный код в соответствии с представленной ниже схемой.
А = А1а О = С1у Μ = Ме1 5 = Зег
С = Суз Н = ΗΪ5 N = Азп Т = Тпг
Ό = Азр 1 = Не Р = Рго V = Уа1
Е = С1и К = Ьуз О =О1п \Л/ = Тгр
Е = Рйе Ь = Ьеи А = Агд Υ = Туг
Если четко не указано иначе, предполагается, что обозначение в данном контексте природной или неприродной аминокислоты охватывает как Ό-, так и Ь-изомер аминокислоты. Сокращенные названия, используемые в данном контексте для неприродных аминокислот, такие же, как описано в патенте США Ыо. 5834431, публикации РСТ \УО 98/07746, и статье №идеЬаисг с! а1. (2002), все из которых таким образом включены в виде ссылки во всей своей полноте. Кроме того, сокращение ПаЬ и Ό-ОаЬ предназначено для обозначения Ь- и Ό-изомера неприродной аминокислоты, Ό-2-аминомасляной кислоты, соответственно. Сокращение 3'Ра1'' и Ό-3'РаГ1 предназначено для обозначения Ь- и Ό-изомера неприродной аминокислоты, 3'-пиридилаланина, соответственно. Кроме того, сокращение 1д1 предназначено для включения как 1д1а, так и 1д1Ь (а-(1-инданил)глицина и а-(2-инданил)глицина, соответственно). Аналогично Э1д1 предназначено для того, чтобы включить как Э-1д1а. так и Э-1д1Ь (Ό-изомеры α-(1инданил) глицина и а-(2-инданил)глицина, соответственно). Предпочтительно, как используют в данном контексте, чтобы 1д1 означало 1д1Ь и Э-1д1 означало Э-1д1Ь.
Термином пептид, конъюгированный с носителем или конъюгированный пептид обозначают соединение, которое обладает биологической активностью и которое при введении млекопитающему дает терапевтический эффект. Две части включают (1) по меньшей мере один пептидный антагонист В1 и (2) по меньшей мере один носитель, как определено в данном контексте ниже, ковалентно связанный с остатком самого пептида или с пептидильным или непептидильным линкером (включая, но без ограничения перечисленным ароматические линкеры), который ковалентно связан с остатком пептида.
Термином пептид, конъюгированный с ПЭГ или ПЭГилированныйй пептид обозначают соединение, которое обладает биологической активностью и которое при введении млекопитающему дает терапевтический эффект. Две части включают (1) по меньшей мере один пептидный антагонист В1 и (2) по меньшей мере одну молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ), ковалентно связанную с остатком самого пептида или с пептидильным или непептидильным линкером (включая, но без ограничения перечисленным, ароматические линкеры), который ковалентно связан с остатком пептида.
Термином полиэтиленгликоль или ПЭГ обозначают соединение полиалкиленгликоля или его производное, содержащее или не содержащее связывающие агенты или дериватизацию с помощью свя
- 5 009294 зывающих либо активирующих групп (например, с помощью тиоловой, трифлатной, трезилатовой, азиридиновой, оксирановой, ортопиридилдисульфидной, винилсульфоновой, йодацетамидной или малеимидной группы).
ПЭГ является хорошо известным водорастворимым полимером, который коммерчески доступен или может быть получен посредством полимеризации этиленгликоля с раскрытием цикла согласно способам, хорошо известным в области техники (см. монографию 8аиб1ет апб Каго, Ро1утег 8уп111С515 (Синтез полимеров), Асабетю Рте55, №\ν Уогк, т. 3, с. 138- 161). В настоящей заявке термин ПЭГ используют в широком смысле, чтобы охватить любую молекулу полиэтиленгликоля от моно- до полифункциональной формы безотносительно размера или модификации на конце ПЭГ, и она может быть представлена формулой
Х-О^НгСНгОЦ^СНгСНаОН, II в которой п составляет от 20 до 2300 и X означает Н или концевую модификацию, например С1-4 алкил.
Предпочтительно, когда ПЭГ, используемый в изобретении, оканчивается на одном из концов гидрокси- или метоксигруппой, т.е. X означает Н или СН3 (метоксиПЭГ). Отмечено, что, когда X = СН3, другой конец ПЭГ, который показан в формуле II, оканчивается ОН, ковалентно связывается с активирующей группой посредством эфирной кислородной связи. Когда X = Н, оба конца ПЭГ присоединяются к активирующим группам посредством эфирных связей, приводя к образованию линейных бифункциональных ПЭГ. При использовании в химической структуре термин ПЭГ включает вышеприведенную формулу II без атома водорода показанной гидроксильной группы, оставляя атом кислорода доступным для реакции со свободным атомом углерода линкера с образованием эфирной связи. Более детально, для того, чтобы конъюгировать ПЭГ с пептидом, ПЭГ должен быть в активированной форме. Активированный ПЭГ может быть представлен формулой III (ПЭГ)-(А) III в которой ПЭГ (как определено выше) ковалентно присоединяется к атому углерода активационной группы (А) с образованием эфирной связи, и (А) содержит реакционную группу, которая может реагировать с амино-, имино- или тиоловой группой на остатке аминокислоты пептида или линкерной молекулы, ковалентно связанной с пептидом.
Способы получения активированных ПЭГов хорошо известны в области техники, например, см. патенты США № 5643575, 5919455, 5932462 и публикацию РСТ АО 95/06058 (все из которых таким образом включены в виде ссылки во всей их полноте). Подходящие активированные ПЭГи можно получить с помощью ряда обычных реакций. Например, Ν-гироксисукцинимидный сложный эфир ПЭГ (Μ-ΝΗ8ПЭГ) можно получить из ПЭГ-монометилового эфира (который коммерчески производится фирмой Ипюп СатЫбе) посредством реакции с Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимидом (ЭСС) и Ν-гидроксисукцинимидом (ΝΗ8) согласно методу Висктапп и Мегг, (см. Макгото1. Сйет., 182:1379-1384, (1981)). Другие активированные ПЭГи, такие как ПЭГ-альдегиды, могут быть получены из коммерческого источника, например , №к1аг Тйетареибск (Нип18уШе, А1) или Епхоп. Бчс. (Р18са!а^ау, Ν. 1.). Примерами предпочтительных активированных ПЭГ для целей настоящего изобретения являются ПЭГ-пропионовый альдегид и ПЭГ-бутиральдегид, которые коммерчески производятся фирмой №к1ат Тйегареибск (НипбуШе, А1). ПЭГ-пропионовый альдегид представлен формулой ПЭГ-СН2СН2СНО и описан в патенте США № 5252714, который полностью включен в виде ссылки в данном контексте. Кроме того, для получения димерных конъюгатов могут быть использованы бифункциональные ПЭГ-альдегиды.
Дополнительные предпочтительные реакционные с амином ПЭГи включают: метокси-ПЭГсукцинимидилпропионат (мПЭГ-8РА) и метокси-ПЭГ-сукцинимидобутаноат (мПЭГ-8ВА), мПЭГбензотриазолкарбонат или мПЭГ-п-нитрофенилкарбонат, который производится в виде соединений различной молекулярной массы фирмой №к!ат Тйегареибск (Нип18У111е, А1), Епхоп, Бчс. (Р18са!а^ау, Ν.Ι.), или ΝΟΕ Сотротабоп (Токуо, 1арап). Дополнительные предпочтительные активированные молекулы ПЭГ включают тиоловые реакционные функциональности, включая, но без ограничения перечисленным, ПЭГ-винилсульфоны, представленные формулой ПЭГ-СН2СН28О2-СН=СН2, мПЭГ-йодацетатом и мПЭГ-тиоэфирами, приведенными ниже:
мПЭГ-тиоэфир мПЭГ-О-1 мПЭГ-йодацетамид
Другим предпочтительным активированным ПЭГ для генерации конъюгированных с ПЭГ пептидов, соответствующих настоящему изобретению, является ПЭГ-малеимид. Такие соединения, как малеимидомонометокси-ПЭГи особенно эффективны для генерации ПЭГ-конъюгированных пептидов, соответствующих изобретению.
Даже более предпочтительным активированным ПЭГ для генерации конъюгированных с ПЭГ пептидов, соответствующих настоящему изобретению, является поливалентный ПЭГ, имеющий более, чем один активированный остаток. Предпочтительные поливалентные молекулы ПЭГ включают, но без ог- 6 009294 раничения перечисленным, молекулы, представленные ниже:
(бСН2СН2)пО(СНг)3МН (ΟΟΗ2ΟΗ2)„Ο(ΟΗ2)3ΝΗ
НМ(СНа)3О(НгСНгСО)|>-СНг —|—(ОСН2СН2)пО(СНг)эЫН
ΗΝ(ΟΗ2)3Ο(Η2ΟΗ2ΟΟ)„ I— (ОСН2СН2)ПО(СН2ЙМН ,НЩСН2)3О(Н2СН2СО)п '(ОСН2СН2)ПО(СН2)3ЫН
ПЭГ любой молекулярной массы можно использовать так, как это желательно на практике, например от приблизительно 1000 Дальтон (Да) до 100000 Да (п составляет 20-2300). Число повторяющихся звеньев в ПЭГ приблизительно соответствует молекулярной массе, выраженной в дальтонах. Предпочтительно, когда объединенная молекулярная массы ПЭГ на активированном линкере пригодна для фармацевтического применения. Так, объединенная молекулярная масса молекул ПЭГ не должна превышать 100000 Да.
Предпочтительно, когда объединенная или общая молекулярная масса ПЭГ, используемого в конъюгированном с ПЭГ пептиде, соответствующем настоящему изобретению, составляет от приблизительно 3000 до 60000 Да (общее п составляет от 70 до 1400), более предпочтительно от приблизительно 8800 до 36000 Да (общее п составляет приблизительно от 200 до приблизительно 820). Наиболее предпочтительная объединенная масса для ПЭГ составляет от приблизительно 20000 до 24000 Да (общее п составляет от приблизительно 450 до приблизительно 540).
В настоящем изобретении могут быть использованы другие полиалкиленгликолевые соединения, такие как полипропиленгликоль. Другие подходящие полиалкиленгликолевые соединения включают, но не ограничены заряженными или нейтральными полимерами следующих типов: декстран, коломиновые кислоты или другие полимеры на углеводной основе, полимеры аминокислот и производные биотина.
Термин включающий (содержащий) означает, что пептид или конъюгированный пептид может включать дополнительные молекулярные структуры, включая, но без ограничения перечисленным, аминокислоты, на одном из или обоих Ν- или С-концах данной последовательности. Конечно, данные молекулярные структуры не должны существенным образом нарушать активность пептида или конъюгиро ванного пептида.
- 7 009294
Как используют в данном контексте, термин нативный пептид относится к неконъюгированному пептидному антагонисту В1, описанному в данном материале или известному в области техники.
Термины дериватизация и производное (дериват) или дериватизированный включают процессы и полученные в результате пептиды или конъюгированные пептиды, соответственно, в которых (1) пептид или конъюгированный пептид имеет циклическую часть, например перекрестную сшивку между цистеиниловыми остатками в конъюгированном пептиде; (2) пептид или конъюгированный пептид перекрестно сшит или имеет центр перекрестной сшивки, например пептид или конъюгированный пептид имеет цистеиниловый остаток и, таким образом, формирует перекрестно-сшитые димеры в культуре или ίη νίνο; (3) Ν-конец конъюгированного пептида имеет концевую группу -ΝΗ2, замещенную -ЫЯЯ1, ΝΚΤ(Θ)Κ?, -ΝΚΟ(Θ)ΘΚ1, -ΝΚ8(Θ)2Κ1, -ΝΗΟ(Θ)ΝΗΚ, сукцинимидной группой или замещенным либо незамещенным бензилкарбонил-ΝΗ-, где Я и Я1, а также заместители в цикле такие, как определено ниже; (5) С-конец замещен группой -С(О)Я или -МЯ3Я4, где Я2, Я3 и Я4 такие, как определено ниже; и (6) конъюгированные пептиды, в которых отдельные молекулы аминокислот модифицированы обработкой агентами, способными реагировать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Производные дополнительно описаны ниже.
Термин В1 означает В1 рецептор брадикинина (см. статью ίιιάίΐΐι Μ Ηαΐΐ, А гс\зс\\· ο£ ВК гсесрЮге (Обзор рецепторов ВК), Рйагшас. Тйег. 56:131-190, (1992)). Если специально не указано иначе, термин В1 или В1 рецептор брадикинина предусмотрен для обозначения человеческого В1 (1В1) рецептора брадикинина. Предпочтительно, когда 11В1 представляет собой рецептор дикого типа. Более предпочтительно, когда 1В1 представляет собой брадикининовый рецептор, описанный в ОепВапк Ассе55юп ηο. А1238044.
Термин пептид, как в основном используют в данном контексте, относится к молекулам из 4-40 аминокислот, причем молекулы из 10-20 аминокислот являются предпочтительными и из 15-18 аминокислот - наиболее предпочтительными. Термин дипептид, как используют в данном контексте, относится к молекуле из двух аминокислот. Термин трипептид, как используют в данном контексте, относится к молекуле из трех аминокислот.
Структурный анализ взаимодействия типа белок-белок может быть также использован для того, чтобы предсказать пептиды, которые имитируют активность больших белковых лигандов. В данном анализе кристаллическая структура позволяет предположить идентичность и относительную ориентацию важных остатков белкового лиганда, на основании которого может быть сконструирован аналогичный пептид. См. например, статью Такакак е1 а1., №1Шге Вю1есй., т. 15, с. 1266-1270, (1997). Данные аналитические методы также могут быть использованы для исследования взаимодействия рецепторного белка и пептида, конъюгированного с носителем пептида или конъюгированного с ПЭГ пептида, соответствующих настоящему изобретению, которое позволяет предположить дальнейшую модификацию пептида или пептидных конъюгатов с целью повышения аффинности связывания.
Как используют в данном контексте, термины эффективное количество и терапевтически эффективное количество при использовании в отношении пептидного, конъюгированного с носителем пептидного или конъюгированного с ПЭГ пептидного антагониста В1 относятся к количеству или дозе, достаточным для получения желательного результата (т.е. для терапии пептидными, конъюгированными с носителем пептидными или конъюгированными с ПЭГ пептидными антагонистами В1, соответствующими настоящему изобретению). В контексте настоящего изобретения желательный результат является желательным уменьшением воспаления и/или боли, например, или поддержкой наблюдаемого снижения уровня одной или более биологических активностей В1. Более конкретно, терапевтически эффективное количество представляет собой количество пептида и/или конъюгированного пептида, достаточное для ингибирования в течение некоторого периода времени одного или более клинически определенных патологических процессов, ассоциированных с рассматриваемым состоянием, например воспалением или болью, у субъекта, которое лечат ίη νίνο агентом(ами). Эффективное количество может варьировать в зависимости от конкретного выбранного пептидного и/или конъюгированного пептидного антагониста В1, и оно также зависит от множества факторов и состояний, связанных с субъектом, проходящим лечение, и тяжестью нарушения.
Например, если пептидный и/или конъюгированный пептидный антагонист В1 предназначен для введения ίη νίνο, такие факторы, как возраст, масса тела и состояние здоровья пациента, а также кривые зависимости доза-ответ и данные по токсичности, полученные в предклинических исследованиях на животных, должны быть в числе прочих приняты во внимание. Если агент(ы) предназначен для контактирования с клетками ίη νίίτο, следует также разработать множество предклинических исследований ίη νίίτο для оценки таких параметров, как всасывание, полупериод существования, доза, токсичности и т. п. Определение эффективного количества или терапевтически эффективного количества для заданного агента в значительной мере находится в компетенции специалистов в области техники.
Термин фармакологически активный означает, что субстанция, описанная таким образом, определена, как обладающая активностью, которая воздействует на медицинский параметр или болезненное состояние (например, боль). В контексте изобретения данный термин, как правило, относится к вызываемому В1 или опосредуемому В1 заболеванию или патологическому медицинскому состоянию или нарушению и, более конкретно, к антагонизму воспалению или боли.
- 8 009294
Термины антагонист, ингибитор и обратный агонист (например, см. статью Ктаиие Л.Р. бе Ыд1е1. а1, ΒτίίίδΡ 1оита1 о£ Рйаттасо1оду, 2000, 130, 131) относятся к молекуле, которая блокирует, препятствует, уменьшает, снижает или каким-либо образом нарушает биологическую активность ассоциированного белка, представляющего интерес. Предпочтительный антагонист или ингибитор, соответствующий настоящему изобретению, представляет собой молекулу, которая связывается и ингибирует В1 с 1С50 (50% ингибирующая концентрация) 500 нМ или меньше в анализах активности В1 ίη νίΙΐΌ. Более предпочтительный антагонист или ингибитор, соответствующий настоящему изобретению, представляет собой молекулу, которая связывается и ингибирует В1 с 1С50 100 нМ или меньше в анализах активности В1 ίη уйто. Наиболее предпочтительный антагонист или ингибитор, соответствующий настоящему изобретению, представляет собой молекулу, которая связывается и ингибирует В1 с 1С50 50 нМ или меньше в анализах активности В1 ίη νίΙΐΌ и предупреждает, облегчает или снимает боль, как измеряют с помощью по меньшей мере одной в целом приемлемой модели боли на животном ίη у1уо и/или ингибирует биохимические стимулы в модели отека, воспаления или боли на животном ίη у1уо.
Кроме того, в данном контексте охватываются также физиологически приемлемые соли пептидов или конъюгированных пептидов, соответствующих изобретению. Выражения физиологически приемлемые соли и фармакологически приемлемые соли, как используют в данном контексте, являются взаимозаменяемыми и предусматривают включение любых солей, которые, как известно или позднее показано, являются фармацевтически приемлемыми (т.е. используемыми при лечении теплокровного животного). Некоторыми конкретными примерами являются: ацетат, трифторацетат; гидрогалиды, такие как гидрохлорид и гидробромид, сульфат, цитрат, тартрат, гликолят, оксалат, соли неорганических и органических кислот, включая, но без ограничения перечисленным, хлористо-водородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, фосфорную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, яблочную кислоту, уксусную кислоту, щавелевую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, молочную кислоту, фумаровую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, фенилуксусную кислоту, миндальную кислоту и т.п. Когда соединения, соответствующие изобретению, включают кислотную функцию, такую как карбоксигруппа, подходящие фармацевтически приемлемые катионные пары для карбоксигруппы хорошо известны специалистам в области техники и включают щелочные, щелочно-земельные, аммонийные катионы и катионы четвертичного аммония и т.п. Относительно дополнительных примеров фармакологически приемлемых солей см. ниже и статью Ветдее! а1., 1. Рйатт. 8с1., 66:1, (1977).
Термин защитная группа, как правило относится к группам, хорошо известным в области техники, которые используют для предупреждения протекания нежелательных реакций, таких как нуклеофильные, электрофильные, окислительные, восстановительные и т.п., выбранных реакционных групп, таких как карбокси-, амино-, гидрокси-, меркаптогруппа и т. п. Предпочтительные защитные группы указаны в данном контексте в соответствующих местах. Примеры защитных групп аминогруппы включают, но без ограничения перечисленным, аралкил, замещенный аралкил, циклоалкенилалкил и замещенный циклоалкенилалкил, аллил, замещенный аллил, ацил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбонил, силил и т. п. Примеры аралкила включают, но без ограничения перечисленным, бензил, орто-метилбензил, тритил и бензгидрил, который может быть необязательно замещенным галогеном, алкилом, алкокси-, гидрокси-, нитро-, ациламиногруппой, ацилом и т.п., а также соли, такие как соли фосфония и аммония. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил, инданил, антраценил, 9-(9-фениофлуоренил), фенантренил, дуренил и т.п. Примеры циклоалкенилалкильных или замещенных циклоалкенилалкильных радикалов, предпочтительно имеющих 6-10 атомов углерода, включают, но без ограничения перечисленным, циклогексенилметил и т. п. Подходящие ацильные, алкоксикарбонильные и аралкоксикарбонильные группы включают бензилоксикарбонил, т-бутоксикарбонил, изобутоксикарбонил, бензоил, замещенный бензоил, бутирил, ацетил, трифтораецетил, трихлорацетил, фталоил и т.п. Для того чтобы защитить одну и ту же аминогруппу, можно использовать смесь защитных групп, например, первичная аминогруппа может быть защищена как арал кильной группой, так и арал коксикарбонильной группой. Защитные группы амина могут также образовывать гетероциклическое кольцо с атомом азота, к которому они присоединены, например, 1,2-бис(метилен) бензол, фталимидил, сукцинимидил, малеимидил и т.п., и при этом данные гетероциклические группы могут далее включать присоединенные арильные и циклоалкильные циклы. Кроме того, гетероциклические группы могут быть моно-, ди- или тризамещенными, как, например, нитрофталимидил. Аминогруппы могут быть также защищены от нежелательных реакций, таких как окисление, посредством образования аддитивной соли, такой как гидрохлорид, толуолсульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты и т.п. Многие защитные группы аминогрупп подходят также для защиты карбокси-, гидрокси- и меркаптогрупп, например, аралкильных групп. Алкильные группы также являются подходящими группами для защиты гидрокси- и меркаптогрупп, например трет-бутил.
Силильные защитные группы представляют собой атомы кремния, необязательно замещенные одной или более алкильных, арильных и аралкильных групп. Подходящие силильные защитные группы включают, но без ограничения перечисленным, триметилсилил, триэтилсилил, триизопропилсилил, третбутилдиметилсилил, диметилфенилсилил, 1,2-бис-(диметилсилил)бензол, 1,2-бис(диметилсилил) этан и дифенилметилсилил. Силилирование аминогрупп дает моно- или дисилиламиногруппы. Силилирование
- 9 009294 аминоспиртовых соединений может привести к образованию Ν,Ν,Ο-трисилильных производных. Удаление силильной функции из функции силилового эфира легко осуществить, например, при использовании реагента на основе гидроксида металла или фторида аммония, либо как отдельной стадии реакции, либо ίη δίίη в процессе реакции со спиртовой группой. Походящими силилирующими агентами являются, например, триметилсилилхлорид, трет-бутилдиметилсилилхлорид, фенилдиметилсилилхлорид, дифенилметилсилилхлорид или их комбинированные продукты с имидазолом или ДМФ (диметилформамидом). Способы силилирования аминов и удаления силильных защитных групп хорошо известны специалистам в области техники. Способы получения данных производных аминов из соответствующих аминокислот, амидов аминокислот или сложных эфиров аминокислот также хорошо известны специалистам в области органической химии, включая химию аминокислот/сложных эфиров аминокислот или аминоспиртов.
Защитные группы удаляют в условиях, которые не воздействуют на остальную часть молекулы. Данные способы хорошо известны в области техники и включают кислотный гидролиз, гидрогенолиз и т.п. Предпочтительный способ включает удаление защитной группы, например удаление бензилоксикарбонильной группы посредством гидрогенолиза с использованием палладия на угле в подходящей системе растворителей, такой как спирт, уксусная кислота и т.п. или их смесей. Трет-бутоксикарбонильную защитную группу можно удалить при использовании неорганической или органической кислоты, такой как НС1 или трифторуксусная кислота, в подходящей системе растворителей, такой как диоксан или метиленхлорид. Полученная в результате соль амина может быть легко нейтрализована с образованием свободного амина. Карбоксизащитная группа, такая как метил, этил, бензил, трет-бутил, 4метоксифенилметил и т.п. могут быть удалены в условиях гидролиза или гидрогенолиза, хорошо известным специалистам в данной области.
Следует отметить, что соединения, соответствующие изобретению, могут содержать группы, которые могут находиться в таутомерных формах, как циклические и нециклические амидиновые и гуанидиновые группы, замещенные гетероатомом гетероарильные группы (Υ1 = О, 8, ΝΚ) и т.п., которые проил люстрированы в следующих примерах
ΝΗΗ'
ΝΗΚ'
ΚΗΝ
ОН
ΚΗΝ
ΝΗΚ'
и, хотя в данном контексте названа, описана, представлена и/или заявлена одна форма, предусмотрено, чтобы все таутомерные формы были неотъемлемо включены в данное название, описание, представление и/или пункт формулы изобретения.
Пролекарственные формы соединений, соответствующих данному изобретению, также предусмотрены данным изобретением. Пролекарственная форма представляет собой активное или неактивное соединение, которое химически модифицируется посредством физиологического воздействия ίη νίνο, такого как гидролиз, метаболизм и т.п. в соединение, соответствующее данному изобретению, после введения пролекарственной формы пациенту. Пригодность и методики, включенные в получение и применение пролекарственных форм, хорошо известны специалистам в данной области техники. В плане общего обсуждения пролекарственных форм, включающих сложные эфиры, см. монографии 8νοη55οη и Типек, Οηΐβ Ме1аЬо115ш Яе\зе\\ъ (Обзоры по метаболизму лекарственных препаратов), 165, (1988) и Вшчбдаагб Оемщ! οί Ргобгидк (Констриурование пролекарственных форм), ЕЕе^аег. (1985). Примеры замаскированного аниона карбоксилата включают множество сложных эфиров, таких как алкиловый (например, метиловый, этиловый), циклоалкиловый (например, циклогексиловый), аралкиловый (например, бензиловый, р-метоксибензиловый) и алкилкарбонилоксиалкиловый (например, пивалоилоксиметиловый). Амины были замаскированы как арилкарбонилоксиметилзамещенные производные, которые расщепляются эстеразами ίη νίνο, высвобождая свободный лекарственный препарат и формальдегид (см. статью Вшчбдаагб, ί. Меб. Сйеш., 2503, (1989)). Кроме того, лекарственные препараты, содержащие кислую ΝΗ группу, такую как имидазол, имид индол и т.п., были замаскированы Ν-ацилоксиметиловыми группами (см. монографию Вшчбдаагб Оемщ! οί Ргобгидк (Конструирование пролекарственных форм), Е15еу1ег, (1985)). Гидроксигруппы были замаскированы как сложные и простые эфиры. Заявка ЕР 039051 (81οαη апб Ыб1е, 4/11/81) раскрывает пролекарственые формы основания Манниха гидроксамовой кислоты, их получение
- 10 009294 и применение.
Структура конъюгированных пептидов
Общие положения. Конъюгированные с носителем пептиды, соответствующие настоящему изобретению, могут быть описаны следующей формулой
Ρ-ΚΧ’ϊ-ίΥ’ϊηΙ (IV) в которой
X1 и Υ1 в каждом случае независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ь1-Р1 и -Ь2-Р2, соответственно;
Р означает носитель, ковалентно связанный с X1 или Υ1;
Ь1 и Ь2 в каждом случае независимо друг от друга отсутствуют или представляют собой линкеры, имеющие от 0 до 9 остатков аминокислот;
η означает от 0 до 3; и
Р1 и, если имеется, Р2 в каждом случае независимо друг от друга означают пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1.
Конъюгированные с носителем пептиды формулы IV будут содержать предпочтительные варианты осуществления, в которых Р1 и, если имеется, Р2 в каждом случае независимо друг от друга представляют собой пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1, имеющие последовательность пептида, как показано в любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-60, и ее производные.
Дополнительные предпочтительные варианты осуществления конъюгированных с носителем пептидов будут включать конъюгированные с носителем пептиды формулы IV, в которой Р1 и, если имеется, Р2 определены формулой
где а0 представляет собой основную или нейтральную ароматическую, алифатическую, гетероциклическую или алициклическую аминокислоту, дипептид или трипептид, включающий либо один, либо два остатка, имеющих основные боковые цепи, или отсутствует;
а1, а2, а3 и а4 в каждом случае независимо друг от друга представляют собой основные или нейтральные ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты; а6 представляет собой 8ет;
а5, а7 и а8 в каждом случае независимо друг от друга означают ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты при условии, что по меньшей мере одна из а5, а7 и а8 выбрана из С1щ. Срд, 1д1а, 1д1Ь, Νφα и №§Ь в Ό- или Ь-конфигурации; и а9, а10, а11, а12, а13 и а14 в каждом случае независимо друг от друга означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
Более предпочтительно, когда Р1 и, если имеется, Р2 определены формулой
где а0 представляет собой основную аминокислоту, дипептид, включающий либо один, либо два остатка с основными боковыми цепями, или отсутствует;
а1 означает основную аминокислоту;
а2 означает Рго;
а3 означает Нур;
а4 означает О1у;
а5 и а8 означает инданиламинокислоту;
а6 означает 8ет;
а7 означает Э-инданиламинокислоту;
а8 означает Срд; и а9, а10, а11, а12, а13 и а14 в каждом случае независимо друг от друга означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
Еще более предпочтительно, когда Р1 и, если присутствует, Р2 определены формулой
где а0 означает основную аминокислоту, дипептид, содержащий либо одну, либо две основные боковые цепи, или отсутствует;
а1 означает основную аминокислоту;
а2 означает Рго;
а3 означает Нур;
а4 означает О1у;
а5 означает Срд;
а6 означает 8ет;
- 11 009294 а7 означает ΩΤίο;
а13 означает Срд; и а9, а10, а11, а12, а13 и а14 в каждом случае независимо друг от друга означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
Еще более предпочтительно, когда конъюгированные с носителем пептиды, соответствующие настоящему изобретению, включают конъюгированные с носителем пептиды формулы IV, в которой η=0 и X1 означает пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, как показано в 8Е0 ΙΩ ΝΟΝΟ:27-41, и их производные.
Настоящее изобретение представляет также конъюгированные с ПЭГ пептиды, которые связывают и антагонистически действуют на активность рецепторов брадикинина В1 (В1) и которые обладают очевидно улучшенными фармакокинетическими свойствами ίη νίνο по сравнению с неконъюгированными пептидными антагонистами В1. Конъюгированные с ПЭГ пептиды, соответствующие настоящему изобретению, могут быть описаны следующей формулой (V):
Ε-[(Χ1)-(Υ1)η] V в которой
X1 и Υ1 в каждом случае независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ь1-Р1 и -Ь2-Р2, соответственно;
Р представляет собой молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с X1 или Υ1;
Ь1 и Ь2 в каждом случае независимо друг от друга отсутствуют или представляют собой линкеры, имеющие от 0 до 9 остатков аминокислот;
η составляет от 0 до 3; и
Р1 и, если присутствует, Р2, в каждом случае независимо друг от друга, означают пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1.
Конъюгированные с ПЭГ пептиды формулы V будут включать предпочтительные варианты осуществления, в которых Р1 и, если присутствует, Р2, в каждом случае независимо друг от друга, означают пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1, имеющие пептидную последовательность, как показано в любой из 8Е0 ΙΩ ΝΟΝΟ: 5-60, и их производные.
Дополнительные предпочтительные варианты осуществления конъюгированных с ПЭГ пептидов будут включать ПЭГ-конъюгаты формулы V, в которой Р1 и, если присутствует, Р2 определены формулой
в которой а0 представляет собой основную или нейтральную ароматическую, алифатическую, гетероциклическую или алициклическую аминокислоту, основной дипептид или трипептид или отсутствует;
а1, а2, а3 и а4, в каждом случае независимо друг от друга, представляют собой основные или нейтральные ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты;
а6 представляет собой 8ет;
а5, а7 и а8, в каждом случае независимо друг от друга, означают ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты при условии, что по меньшей мере одна из а5, а7 и а8 выбрана из СНд. Срд, 1д1а, 1д1Ь, Νί§;·ι и №§Ь в Ω- или Ь-конфигурации; и а9, а10, а11, а12, а13 и а14, в каждом случае независимо друг от друга, означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
Более предпочтительно, когда Р1 и, если присутствует, Р2 определены формулой
в которой а0 представляет собой основную аминокислоту, основной дипептид или отсутствует;
а1 означает основную аминокислоту;
а2 означает Рго;
а3 означает Нур;
а4 означает 61у;
а5 и а8 означает инданиламинокислоту;
а6 означает 8ет;
а7 означает Ω-инданиламинокислоту;
а8 означает Срд; и а9, а10, а11, а12, а13 и а14, в каждом случае независимо друг от друга, означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
Еще более предпочтительно, когда Р1 и, если присутствует, Р2 определены формулой
в которой а0 означает основную аминокислоту, основной дипептид или отсутствует;
- 12 009294 а1 означает основную аминокислоту;
а2 означает Рго;
а3 означает Нур;
а4 означает С1у;
а5 означает Срд;
а6 означает Зег;
а7 означает ΌΤίο;
а8 означает Срд; и а9, а10, а11, а12, а13 и а14 в каждом случае независимо друг от друга означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
Еще более предпочтительно, когда конъюгированные с ПЭГ пептиды, соответствующие настоящему изобретению, включают конъюгированные с ПЭГ пептиды формулы V, в которой п=0 и X1 означает пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих последовательность аминокислот, как показано в ЗЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 27-41, и их производные. Еще более предпочтительные конъюгированные с ПЭГ пептиды, соответствующие настоящему изобретению, включают соединения, в которых п=0 и Х1 означает пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих последовательность аминокислот, как показано в 8Е0 ΙΌ ΝΟΝΟ: 27-41, и их производные. Еще более предпочтительно, когда конъюгированные с ПЭГ пептиды, соответствующие настоящему изобретению, могут быть описаны следующей формулой
Ε'-Αζ, VI или ее физиологически приемлемой солью, в которой
Е' означает мультивалентный носитель;
Я в каждом случае независимо означает -(Х1)-(У1)п, где Я ковалентно связано с Е';
X1 и Υ1, в каждом случае независимо друг от друга, означают пептиды формулы -Ь1-Р1 и -Ь2-Р2, соответственно;
Ь1 и Ь2 в каждом случае независимо друг от друга отсутствуют или означают линкеры, имеющие от 0 до 9 остатков аминокислот;
п означает 0-3;
Ζ означает 2-8; и
Р1 и Р2 в каждом случае независимо друг от друга означают пептидные антагонисты В1 рецептора брадикинина.
Еще более предпочтительно когда конъюгированные с ПЭГ пептиды, соответствующие настоящему изобретению, включают конъюгированные с ПЭГ пептиды формулы VI, в которой п равно О, Ζ означает 4-8 и X1 представляет собой пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих последовательность аминокислот, как показано в 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 27-41, и их производные.
В качестве части настоящего изобретения рассматривают пептидные конъюгаты, имеющие последовательности пептидов, которые представляют собой фрагменты (т.е. субпоследовательности), аналоги и производные Р1 и, если присутствует, Р2, как определено в данном контексте, и где данные конъюгированные пептиды в значительной мере эквивалентны в отношении активности против В1 ΐπ νίίτο и/или ш νίνο пептидным конъюгатам, специально описанным в данном контексте.
Термин аналог предназначен для обозначения молекул, представляющих одну или более замен, делеций и/или добавлений аминокислот, полученных из линейного ряда аминокислот пептидов, конъюгированных пептидов (неконъюгированных Р1 и, если присутствует, Р2) и/или любых пептидильных линкеров (Ь) пептидов, конъюгированных с носителем или ПЭГ, представленных формулами (IV) и (V), соответственно, которые при этом дают в результате молекулы, в значительной мере эквивалентные в отношении активности против В1 ш νίίτο и/или ш νίνο по сравнению с аналогичными неконъюгированными пептидами или конъюгированными пептидами, специально описанными в данном контексте.
Аналоги конъюгированных пептидов, соответствующие данному изобретению, будут, как правило, иметь одну или более замен, делеций и/или инсерций аминокислот в последовательности (Р) (Р1 и/или, если присутствует Р2) либо (Ь) (Ь1 и/или, если присутствует, Ь2). В общем считают маловероятным, что консервативные замены аминокислот нарушают структуру и/или функцию полипептида и они, как правило, включают замеш,ение одной аминокислоты другой, которая близка по структуре и/или функции (например, аминокислоты с боковыми цепями, близкими по размеру, заряду и/или форме). Природа данных замен хорошо известна специалистам в данной области техники и итоги иллюстративных замен аминокислот приведены в табл. 1 и 2
Таблица 1. Замены аминокислот
Основные:
Агд; Ьук; Ηίκ;
Кислые:
С1и; Акр
Полярные:
С1и; Акр; О1п; Акп; Зег; Тйг
- 13 009294
Гидрофильные:
Акр; 61и; Аки; 8ег; ТЬг; Туг
Гидрофобные:
А1а; Ме1; 11е; Ьеи; иог-Ьеи; Уа1
Ароматические:
РЬе; Тгр; Туг
Маленькие:
61у; А1а; 8ег; ТЬг; Ме1
Таблица 2. Замены аминокислот
Аминокислота Поедпочтительные замены Наиболее гцэедпочтительпая замена
А1а О1у; Беи; Не ; Азп; Рго Уа1
Агд А1а; Азп; 61п; Зег Буз
Азп Агд; С1п; Ηίβ; Буз; Зег; Туг О1п
Азр Азп; Зег; Тпг; ΟΙ п С1и
Суз А1а Зег
О1п А1а; Агд; О1и; Беи; Буз; МеГ; Зег; Туг Азп
О1и О1п; Зег; ТЬг; Азп Азр
О1у Рго
ΗΪ3 Азп; О1п; Буз; Туг; РЬе Агд
Не Туг; Уа1; Ме(; А1а; РЬе; пог-Беи Беи
Беи пог-Беи; Не; Уа1; Ме1; А1а; РЬе Не
Буз Азп; Азр; А1а; С1и; С1п; Зег; Туг Агд
Ме1 А1а; О1п; Туг; Тгр; РЬе Беи
РЬе Беи; Уа1; Не; А1а; Ме1 Беи
Рго Не; Уа1 <31у
Зег А1а; Азп; Азр; О1у; Буз ТЬг
ТЬг А1а; О1у; Не; Уа1; Буз Зег
Тгр РЬе; Туг; ΗΪ3 Туг
Туг Тгр; ТЬг; Зег РЬе
Уа1 А1а; Не; Ме1; РЬе; Туг; пог-Беи Беи
Изменение с А, Е, Н, I, Ь, М, Р, V, Л или Υ на С более предпочтительно, если новый цистеин сохраняется в виде свободного тиола.
Желательные замены аминокислот (как консервативные, так и неконсервативные) могут быть определены специалистами в данной области техники в то время, когда данные замены желательны. Например, замены аминокислот могут быть использованы для идентификации важных остатков пептидной последовательности или для повышения либо снижения аффинности неконъюгированных или конъюгированных пептидных молекул, описанных в данном контексте.
В ряде вариантов осуществления консервативные замены аминокислот охватывают также остатки неприродных аминокислот, которые, как правило, включают посредством химического синтеза пептидов.
Как отмечено в предшествующем разделе, природные остатки можно разделить на классы на основе общих свойств боковой цепи, которые могут быть использованы для модификации последовательности. Например, неконсервативные замены могут включать обмен представителя одного из данных классов на представителя другого класса. Данные замещенные остатки могут быть введены в участки пептида, который гомологичен нечеловеческим ортологам, или в негомологичные участки молекулы. Кроме
- 14 009294 того, можно также сделать модификации, используя Р или С с целью воздействия на ориентацию цепи.
При осуществлении данных модификаций можно принимать во внимание коэффициент гидрофобности аминокислот. Для каждой аминокислоты определяли коэффициент гидрофобности на основе их характеристик гидрофобности и заряда, они составляют: для изолейцина (+4,5); валина (+4,2); лейцина (+3,8); фенилаланина (+2,8); цистеина/цистина (+2,5); метионина (+1,9); аланина (+1,8); глицина (-0,4); треонина (-0,7); серина (-0,8); триптофана (-0,9); тирозина (-1,3); пролина (-1,6); гистидина (-3,2); глутамата (-3,5); глутамина (-3, 5); аспартата (-3,5); аспарагина (-3,5); лизина (-3,9) и аргинина (-4,5).
Важность коэффициента гидрофобности аминокислот в создании интерактивной биологической функции белка принимают во внимание в области техники. См. статью Ку1е е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ., 157:105131, (1982). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими близкий коэффициент ии уровень гидрофобности и все еще сохраняют аналогичную биологическую активность. Для получения изменений на основе коэффициента гидрофобности предпочтительна замена аминокислот, коэффициенты гидрофобности которых лежат в пределах ±2, особенно предпочтительны те, которые имеют значения ±1, и еще более особенно предпочтительно те, которые имеют значения ±0,5.
В области техники также учитывают, что замена подобных аминокислот может быть эффективно осуществлена на основе гидрофильности. Самая высокая локальная средняя гидрофильность белка, если руководствоваться гидрофильностью соседних с ним аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологической особенностью белка.
Для остатков аминокислот определены следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серии (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Для получения изменений на основе близких значений гидрофильности предпочтительна замена аминокислот, значения гидрофильности которых лежат в пределах +2, особенно предпочтительны те, которые имеют значения ±1, и еще более особенно предпочтительно те, которые имеют значения ±0,5. Можно также идентифицировать эпитопы из первичных последовательностей аминокислот на основе гидрофильности. Данные участки называют также эпитопные участки ядра.
Компетентный специалист сможет определить подходящие аналоги неконъюгированных и/или конъюгированных пептидов, приведенных в данном контексте, при использовании хорошо известных методик. Специалисту в области техники следовало бы также знать, что можно заменить химически близкие аминокислот остатками, имеющимися в нативном пептиде при сохранении активности (консервативные замены остатков аминокислот). Вследствие этого даже области, которые могут быть важны для биологической активности или структуры, могут являться объектом консервативныхзамен аминокислотбез нарушения биологической активности или без вредного воздействия на структуру неконъюгированного пептида или конъюгированного пептида.
Кроме того, специалист в области техники может ознакомиться с исследованиями структурыфункции для идентификации остатков в последовательности неконъюгированного и/или конъюгированного пептида, важных для активности или структуры. В свете такого сравнения можно предсказать важность остатков аминокислот в пептидной последовательности. Специалист в области техники может выбрать проведение замен химически близкими аминокислотами данных предсказанных важных остатков аминокислот неконъюгированных и/или конъюгированных пептидов, соответствующих настоящему изобретению.
Ряд научных публикаций посвящен предсказанию вторичной структуры. См. статьи Мои11 1., Сигг. Ор. ίη Вю!есй., 7(4):422-427, (1996), Сйои е! а1., Вюсйетщ!гу, 13(2):222-245, (1974); Сйои е! а1., Вюсйетк!гу, 113(2):211-222 (1974); Сйои е! а1., Αάν. Епгуто1. Ке1а!. Лгеак Мо1. Βίο1., 47:45-148 (1978); Сйои е! а1., Αηη. Реу. Вюсйет., 47:251-276 и Сйои е! а1., Вюрйук. 1., 26:367-384, (1979). Более того, в настоящее время имеются компьютерные программы для помощи в предсказании вторичной структуры.
Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают поточную обработку данных (см. статьи 1опе§ Ό., Сигг. Ορίη. 8!гис!. Вю1., 7(3):377-87, (1997); 8ίρρ1 е! а1., 81гис!иге, 4(1):15-9, (1996)),профильный анализ (см. статьи Во\\те е! а1., 8с1спсс, 253:164-170 (1991); Споком е! а1., Ме!й. Еηζут., 183:146-159, (1990); СпЬ^кот е! а1., Ргос. Иа!. Асай. 8ск, 84 (13):4355-8, (1987)) и эволюционное связывание (см. статьи Ноте, выше и Вгсппсг. выше).
Аналоги и производные пептидов и/или конъюгированных пептидов, соответствующие изобретению, будут использованы для тех же целей, что используют аналогичные пептиды и/или конъюгированные пептиды, специально описанные в данном контексте (т.е. антагонисты активности В1 ίη уйго и/или ίη νί\Ό).
Пептиды. Пептиды, соответствующие настоящему изобретению, включают пептиды, содержащие последовательности, представленные с 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 15-35 и 39-54. Пептидные последовательности Р1 и, если присутствует, Р2 (Р) в конъюгированных с носителем или ПЭГ пептидах, соответствующих настоящему изобретению, включают, как отмечено, пептиды, которые связывают и антагонистически воз
- 15 009294 действуют (например, снижают) активность В1. Предпочтительные конъюгированные с носителем или ПЭГ пептиды, соответствующие настоящему изобретению, содержат по меньшей мере одну пептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-60 и ее производных. Более предпочтительно, когда конъюгированные с носителем или ПЭГ пептиды, соответствующие настоящему изобретению, содержат по меньшей мере одну пептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 27-41 и ее производных.
Таблица 3. Пептиды брадикинина
Рецептор/ Пептид Пептидная последовательность
Эффект
Агонист Брадикинин, ВК
В2/В1 (ЗЕО ГО N0:1)
Агд Рго Рго С!у РЬе Зег Рго РЬе Агд
Агонист В 2 Каллидин, Ьув Агд Рго Рго С1у РЬе Зег Рго РЬе Агд
Ьуз-ВК (ЗЕО Ю
N0: 2)
Агонист В2 МеМуя-ВК Ме< |_уа Агд Рго Рго С1у РЬе Зег Рго РЬе Агд
(ЗЕО ГО ΝΟ: 3)
Агонист 81 дез-Аг д-ВК Агд Рго Рго 01у РЬе Зег Рго РЬе
(ЗЕО 10 N0: 4)
Антагонист [Ьеи6]-Дез-Агд9 Агд Рго Рго 01у РЬе Зег Рго Ьеи
В1 -ВК
(ЗЕО Ю N0: 5)
Антагонист ОАЬК Ьуз Агд Рго Рго СНу РЬе Зег Рго Ьеи
В1 (ЗЕО ГО N0: 6)
Антагонист (ЗЕО 10 N0:7) ОАгд Агд Рго Нур 01у ТЫ Зег ϋΤίο СНс Агд
В2
Антагонйот (ЗЕО Ю N0:8) ОАгд Агд Рго Нур (31у ТЫ Зег ΟΤίο 01с
В1/В2
Антагонист (ЗЕО ГО N0:9) ОАгд Агд Рго Нур О1у ТЫ Зег ОНре 01с Агд
В2
Антагонист (ЗЕО ГО N0:10) Ас Ьуз Ьуз Агд Рго Рго 61у Ме-РЬе Зег О-Д-Иа! Не
В1
- 16 009294
Антагонист (ЗЕО Ю N0: 11) ОАгд Агд Рго Нур С1у 1д1 8ег ϋΙρΙ 0!с Агд
Β1/Β2 Антагонист (8ЕО Ю N0; 12) Ьуз Ьуз Агд Рго Нур 61у 1д1 Зег 0|д1 Οίο
Β1 Антагонист (8ЕО Ю МО: 13) Ьуз Ьуз Агд Рго Нур 01у Срд 8ег СЖс Срд
Β1 Антагонист (8Е0 Ю N0: 14) ОАгд Агд Рго Нур 01у 1д1 Зег ϋ15ί 1д1 Агд
Β1 Антагонист (ЗЕО Ю ΝΟ: 15) ООгпЬуз Агд Рго Нур 61у Срд Зег ОТс Срд
Β1 Антагонист (ЗЕО Ю ΝΟ: 16) ОогпЬуз Агд Рго ΤΓιζ <31у Срд Зег ϋίίο Срд
Β1 Антагонист (ЗЕО Ю N0: 17) ЗРа1Ьуз Агд Рго Нур 01у Срд Зег ϋΐίο Срд
Β1 Антагонист (ЗЕО Ю N0: 18) 4Ра1Ьуз Агд Рго Нур 01у Срд Зег ϋΐίο Срд
Β1 Антагонист (ЗЕО Ю N0: 19) СЬа Агд Рго Нур <Э1у Срд Зег ϋΐίο Срд
Β1 Антагонист (5ЕО Ю N0: 20) 2-Ыа! Агд Рго Нур 61у Срд Зег ϋΐίο Срд
Β1 Антагонист (ЗЕО Ю N0: 21) Ьуз Агд Рго Нур 01у Срд Зег Ойс Срд
В1 Антагонист (ЗЕО Ю N0: 22) ϋ Ьуз Ьуз Агд Рго Нур <Э1у Срд Зег ϋίίο Срд
Β1
- 17 009294
Антагонист (ЗЕО Ю N0: 23) Ьуа йОгл Агд Рго Нур 01у Срд Зег Эйс Срд
В1
Антагонист (ЗЕО ю N0: 24) Ьуа СЬа Агд Рго Нур СМу срд Зег ϋ(ΐο Срд
В1
Антагонист (ЗЕО ю N0: 25) Ьув АЬи Агд Рго Нур С1у Срд Зег ϋτίο Срд
В1
Антагонист (ЗЕО ю N0: 26) Ьуа 2-(Ча( Агд Рго Нур б!у Срд Зег Ойс Срд
В1
Антагонист (ЗЕО ю N0: 43) □-□аЬ ι Ьуа Агд Рго Нур 6!у Срд Зег рйс Срд
Β1
Антагонист (5Е0
Срд
Антагонист (ЗЕО Ю ΝΟ: 45) ООтпЬуз Агд Рго Нур С1у Срд Зег ϋΐίο Срд
В1
Антагонист (ЗЕО Ю ΝΟ: 46) Ас йОгпЬуа Агд Рго Нур С1у Срд Зег ϋίίο Срд
В1
Антагонист (ЗЕО ю N0: 47} 0-3’Ра1 Ьуз Агд Рго Нур 61у Срд Зег Ию Срд
В1
Антагонист (ЗЕО ю N0: 48) Ас О3’-Ра1 Ьуз Агд Рго Нур 0!у Срд Зег ΰΐίο Срд
В1
Антагонист (ЗЕО ю N0: 49) 0-Ьуз Ο-2-ΝβΙ Агд Рго Нур 6!у Срд Зег (Χίο Срд
В1
Антагонист (ЗЕО ю N0: 50) Ьуз ϋ-2-ΝθΙ Агд Рго Нур С!у Срд Зег ϋίίο Срд
- 18 009294
Антагонист (ЗЕО ГО N0: 51) 00т Агд О(с Рго 01у Ме-РЬе 5ег ϋ-^-ΝβΙ Не
В1 Антагонист (ЗЕО ГО N0: 52) Ас ООгп Агд Οίε Рго <51у Ме-РПе Зег О-Д-Ыа! Не
В1 Антагонист (ЗЕО Ю N0: 53) □от Ьув Агд Οίο Рго <31у Ме-РГге Зег Не
В1 Антагонист (ЗЕО ю N0: 54) Ас ООгп Ьув Агд СНс Рго В1у Ме-РОе Зег / Не
В1 Антагонист (ЗЕО го N0: 55) Цуе Агд Рго Рго <31у РИе Зег Ο-^-ΝίΙ Не
В1 Антагонист (ЗЕО го N0: 56) Ас Ьув Агд Рго Рго <Э1у РПе Зег Ο-β-Νώ Не
В1 Антагонист (ЗЕО го N0: 57) Огп Агд СНс Рго СНу Ме-РИе Зег Ο-^-ΝβΙ Не
В1 Антагонист (ЗЕО го N0: 58) Ас От Агд 0<с Рго 61у Ме-РЬе Зег Ο-β-ΝβΙ Не
В1 Антагонист (ЗЕО ю N0: 59) Ьув Агд 0(с Рго 01у Ме-Р1те Зег О-/?-На1 Не
В1 Антагонист (ЗЕО го ΝΟ: 60) Ас Ьув Агд Οίο Рго 01у Ме-Р1те Зег □-/?-ΝπΙ Не
Β1
Носители. Термин носитель, как используют в данном контексте, относится к молекуле, которая препятствует разложению и/или увеличивает полупериод существования, снижает токсичность или повышает биологическую активность терапевтического пептида или белка. Носители, используемые в контексте настоящего изобретения, известны в области техники (например, см. Публикацию РСТ XVО 98/07746, которая включена таким образом в виде ссылки во всей своей полноте), и все они легко доступны для специалистов в данной области техники. В контексте настоящего изобретения предпочтительные носители включают, но без ограничения перечисленным, полиметиленгликоль, полигидроксипроиленгликоль, полипропиленгликоли и оксиды, полиметилпропиленгликоль, полигидрроксипропиленоксид, полипропиленгликоли с неразветвленной и разветвленной цепью и их производные, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль и их монометиловые эфиры, моноцетиловые эфиры, моно-н-бутиловые эфиры, моно-трет-бутилэфиры и моноолеиловые эфиры, сложные эфиры полиалкиленгликолей и карбоновых кислот и продукты дегидратационной конденсации полиалкиленгликолей с аминами и другие полиалкиленоксиды и гликоли и их производные, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, поливинилацетат, сополимер поли(винилацетат-совиниловый спирт), поливинилоксазолидон, поливинилметилоксазолидон и поливинилметиловый эфир, полиакриловые кислоты, полиметакриловые кислоты, полигидроксиэтилметакрилаты, полиакриламид и полиметакриламид и их другиеамиды, поли(М,Ы-диметилакриламид) и поли(Ы-изопропилакриламид), поли(Ы-ацетамидоакриламид) и поли(Ы-ацетамидометакриламид) и другие Ν-замещенные производные амидов.
В одном из аспектов изобретения необходимо присутствие по меньшей мере одного носителя (Р), присоединенного к группе непептидильного линкера или остатку аминокислоты пептидильного линкера, который ковалентно слит с пептидным антагонистом В1. В контексте настоящего изобретения предпочтигельный носитель представлен молекулой ПЭГ, как определено в данном контексте. Еще более предпочтительный носитель представляет собой поливалентную молекулу ПЭГ, как определено в данном контексте.
- 19 009294
Конъюгированные с носителем или ПЭГ молекулы, специально описанные или представленные в ссылках в данном контексте, могут быть незначительно модифицированы на участках, отмеченных как (Х!)-(¥!)п (как определено выше), для формирования аналога, соответствующего изобретению, при условии, что антагонизм в отношении В1 сохраняется в существенной мере.
Что касается отношений конъюгированных с носителем или ПЭГ пептидов, соответствующих настоящему изобретению и их аналогов, предпочтительно, чтобы не больше, чем три неконцевых остатка на участке (Р) были различными. Более предпочтительно, когда аналоги, предусмотренные настоящим изобретением, включают молекулы, содержащие до двух замен, инсерций или делеций аминокислот в любом определенном положении участка (Р) конъюгированного с носителем или ПЭГ пептида, соответствующего настоящему изобретению. Наиболее предпочтительно, когда расхождение последовательности конъюгированного с носителем или ПЭГ пептида, соответствующего настоящему изобретению, и ее рассматриваемого аналога, в особенности, на заданном участке (Р) представлено в форме одной или более консервативных модификаций.
Линкеры. Термин линкер, как используют в данном контексте, относится к Ь и, если присутствует, Ь , как показано либо в формуле IV, либо V (см. выше) и сокращенно обозначается в данном контексте (Ь). Предпочтительно, когда (Ь) по своей природе представляет собой пептидил (т.е. получен из аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями) и состоит из от 1 до 9 аминокислот. Более предпочтительно, когда (Ь) состоит из от 1 до 9 аминокислот, где аминокислоты выбраны из двадцати природных аминокислот. В еще более предпочтительном варианте осуществления 1-9 аминокислот пептидильного линкера выбраны из цистеина, глицина, аланина, пролина, аргинина, аспарагина, глутамина и лизина. Еще более предпочтительно, когда пептидильный линкер состоит из большинства аминокислот, которые стерически незаблокированы, таких как глицин и аланин, связанных пептидной связью. Таким образом, предпочтительные пептидильные линкеры представляют собой поли(С1у)1-8, в особенности (С1у)3 (8ЕО ГО ΝΟ: 61), (О1у>5 (8ЕО ГО ΝΟ: 62) и (О1у)7 (8ЕО ГО ΝΟ: 63), а также поли (61у-А1аЦ-4 и поли(А1а)1-8. Другие специфические примеры пептидильных линкеров включают (С1у)5Ьу8 (8Е0 ГО ΝΟ: 64) и (61у)5Ьу8Агд (8Е0 ГО ΝΟ: 65). Другие комбинации 61у и А1а также предпочтительны. В качестве объяснения вышеприведенной номенклатуры, например, (С1у)5Ьу8 означает С1у-С1у-С1у-С1у-С1у-Еу5. Пептидильный линкер может содержать Ν-концевой цистеин, другой тиол или нуклеофил для конъюгирования с носителем. Более предпочтительный линкер содержит Ν-концевой остаток цистеина или гомоцистеина или другую 2-аминоэтантиоловую или 3-аминопропантиоловую группу для конъюгирования с функцмонализированными малеимидом, йодацетамидом или тиоэфиром носителями. Обработка исходного аддукта 3-сульфанилсукцинимида (1с), образованного при реакции пептида с ПЭГ, активированным малеимидом, избытком основания превращает менее стабильный аддукт сукцинимида в гидролитически стабильную 6-метилкарбамоил-5-оксотиоморфолин-3-карбоксамидную форму (16, см. схему 1). Альтернативно для стереоселетивного конъюгирования могут быть использованы коммерчески доступные тиоэфир- или йодацетамидо-ПЭГи (№к!аг ТйегареиЕск, Ηπηΐ8νί1^, АЬ), как представлено на схемах 2 и 3.
- 20 009294
Схема 2
Схема 3 ?Н * (СнЬпД .----- * Линкер
ΗΖΙ4 1
НзСОЮНзСНаОп-СНгСНэЫНд^—
3-а
3-Ь
НаСО(СН2СМ2О)п-1
3-с
Другой предпочтительный линкер представляет собой большой гибкий линкер, содержащий случайную последовательность Сбу/8ег/Тйг (С8С8АТОС8С8ТА88С8С8АТН; 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 66), который оценивают, как приблизительно имеющий размер 1 к ПЭГ. Кроме того, пептидильный линкер может включать непептидильный сегмент, такой как алифатическую молекулу из 6 атомов углерода формулы -СН2-СН2- СН2-СН2-СН2-СН2- (жесткий линкер: АЕАААКЕАААКЕАААКАСС; 8ЕО ГО ΝΟ: 67).
Альтернативно в X1 и, если присутствует, в Υ1 может быть непептидильный линкер, содержащий реакционный нуклеофил. Например, можно использовать алкильные линкеры, такие как -ЫН-(СН2)8С(Р)-, где 8 = 2-20. Данные алкильные линкеры могут быть далее замещены любой стерически неблокирующей группой, такой как низший алкил (например, С1-С6), низший ацил, галоген (например, С1, Вг), СК, ΝΗ2, фенил и т.п. Иллюстративные непептидильные линкеры представляют собой линкеры на основе ПЭГ (см. ниже):
В которых η такое, что линкер имеет молекулярную массу 100-5000 килодальтон (кДа), предпочтительно 100-500 кДа, т составляет 1-3. Предпочтительно, когда непептидильный линкер является ароматическим. Линкеры могут быть изменены для образования производных таким же образом, как описано в данном контексте.
Кроме того, молекулы ПЭГ могут быть присоединены к Ν-концевому амину или аминам выбранной
- 21 009294 боковой цепи путем либо восстановительного алкилирования при использовании альдегидов ПЭГ, либо ацилирования при использовании гидроксисукцинимидо- или карбонатных эфиров ПЭГ. В данном подходе может быть использован любой из вышеописанных линкеров. Альтернативно подходящим образом функционализированный ПЭГ может быть присоединен непосредственно к любому из пептидных антагонистов рецептора брадикинина В1, как показано в 8Е0 ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-26 или 8Е0 ΙΌ ΝΟΝΟ: 43-60, либо непосредственно к остатку аминокислоты пептидильного линкера, который ковалентно слит с любым из пептидных антагонистов рецептора брадикинина В1, как показано в 8Е0 ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-26 или 43-60.
Следует принимать во внимание, что, поскольку носитель и/или целевые пептиды могут быть поливалентными, способом, соответствующим изобретению, возможно получить множество структур носитель:пептид. Так пример, одновалентный носитель и одновалентный пептид будут образовывать конъюгат 1:1; двухвалентный пептид и одновалентный носитель могут образовать конъюгаты, в которых пептидные конъюгаты несут две молекулы носителя, тогда как двухвалентный носитель и одновалентный пептид могут образовать структуры, в которых два пептидных элемента присоединены к одной молекуле носителя; использование носителей с более высокими валентностями может привести к формированию кластеров пептидных элементов, связанных с одной молекулой носителя, тогда как пептиды с более высокими валентностями могут стать покрытыми множеством молекул носителя. Пептидные молекулы могут иметь больше, чем одну реакционную группу, которая будет реагировать с активированным носителем, и нужно всегда учитывать возможность формирования сложных структур, когда желательно образование простых структур, таких как аддукты 1:1 носителя и пептида, или использовать двухвалентные носители для получения аддуктов пептид: носитель: пептид, будет полезным использовать заданные соотношения активированного носителя и пептидного материала, их заданные концентрации и проводить реакцию в заданных условиях (таких как продолжительность, температура рН и т.п.) с тем, чтобы получить пропорцию описанного продукта, а затем отделить описанный продукт от других продуктов реакции. Условия реакции, пропорции и концентрации реагентов можно получить относительно просто в экспериментах методом проб и ошибок, которые находятся в компетенции обычного квалифицированного специалиста при соответствующем масштабировании при необходимости. Очистку и разделение продуктов аналогично осуществляют известными методиками, хорошо известными квалифицированным специалистам в данной области техники. При этом, как используют в описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста ясно не требуется иначе. Так, например, ссылка на конъюгированный с носителем пептидный антагонист или конъюгированный с ПЭГ пептидный антагонист включает смеси данных конъюгатов, и ссылка на способ лечения включает ссылку на один или более способов лечения того типа, который будет известен специалистам в области техники или станет им известен по прочтении данного описания и т. п.
Обычные варианты ПЭГилирования посредством конъюгирования мПЭГ-малеимида с тиоловой группой пептидов и полипептидов, имеющих остатки аминокислоты цистеина проводят в фосфатном буфере с использованием или без использования органического растворителя. Высокая растворимость ПЭГилированных пептидов и полипептидов и потенциальная нестабильность пирролидин-2,5-дионового цикла в воде затрудняют применение данного способа для крупномасштабного получения и очистки ПЭГилированных пептидов и белков. Вследствие этого авторы раскрывают в данном материале новые неводные условия конъюгирования мПЭГ-малеимида с тиоловой группой пептидов и полипептидов, имеющих цистеиновые остатки. Новый способ дает в результате средние до высоких выходы ПЭГилированных пептидов и полипептидов и сочетает введение по М|сЬае1 и аминолиз в одной емкости (см. схему 4). Оба условия приводят в результате к непосредственному выделению ПЭГилированных пептидов и полипептидов посредством осаждения.
- 22 009294
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 4, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления метанол (МеОН) может быть заменен растворителем, включающим один или более из следующих растворителей: метанол, этанол, изопропиловый спирт, н-пропанол, н-бутанол, дихлорметан (ОСМ), ацетонитрил(ЛеЫ), тетрагидрофуран(ТНР), диметилформамид (ДМФ), диметилацетамид (ΌΜΑβ) и Ν-метилпирролидон (ΝΜΡ).
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 4, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления ТВМЕ может быть заменен растворителем, включающим один или более из следующих растворителей: диэтиловый эфир, метилизопропиловый эфир и диизопропиловый эфир.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 4, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления реакция 1), как представлено на схеме 4, может быть проведена при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 60°С. Предпочтительно, когда реакция 1), как представлено на схеме 4, может быть проведена при температуре от приблизительно 30°С до приблизительно 50°С. Более предпочтительно, когда реакция 1), как представлено на схеме 4, может быть проведена при температуре от приблизительно 35°С до приблизительно 45°С. Наиболее предпочтительно, когда реакция 1), как представлено на схеме 4, может быть проведена при комнатной температуре.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 4, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления реакция 2), как представлено на схеме 4, может быть проведена при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 60°С. Предпочтительно, когда реакция 2), как представлено на схеме 4, может быть проведена при температуре от приблизительно 30°С до приблизительно 50°С. Более предпочтительно, когда реакция 2), как представлено на схеме 4, может быть проведена при температуре от приблизительно 35°С до приблизительно 45°С. Наиболее предпочтительно, когда реакция 2), как представлено на схеме 4, может быть проведена при комнатной температуре.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 4, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления реакция осаждения, как представлено на схеме 4, может быть проведена в течение по меньшей мере 10 мин. Более предпочтительно, когда реакция осаждения, как представлено на схеме 4, может быть проведена в течение по меньшей мере 60 мин. Наиболее предпочтительно, когда реакция осаждения, как представлено на схеме 4, может быть проведена в течение приблизительно 60 мин.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 4, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления реакция осаждения, фильтрации и/или очистки, как представлено на схеме 4, может быть проведена больше, чем один раз.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 4, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления реакции осаждения и/или очистки могут быть проведены больше, чем один раз.
Частично защищенные пептиды являются особенно эффективными реагентами для данной стратегии, поскольку они дают возможность селективной модификации специфических участков полифункциональных пептидов. Защитные группы удаляют с конъюгатов ПЭГ, используя принятые способы снятия защиты, известные специалистам в области синтеза пептидов. Частично защищенные пептиды, пригодные для данного применения, можно получить при использовании ортогональные защитных стратегий, хорошо известных специалистам, компетентным в области синтеза пептидов. Иллюстрация синтеза и конъюгирования частично защищенных пептидных антагонистов рецептора брадикинина В1 представлена на схеме 5. Аналоги, у которых амины боковой цепи служат в качестве центров конъюгирования, можно получить из легко доступных ортогонально защищенных основных аминокислот. Схема 5
ВосНЫ
ΝΗΒΟΟ
Пиперидин
ЫНВос
X = -СН2СН2СНО, · СНгСНгСНзСНО, •СНзСНгСОгИНЗ,« СНгСНгОСОг-ЫНЗ, или -СНгСНгОСоА-нитрофеннл
}.ΑΑ7..ΑΑβ-ΟΗ ΐ,-ΑΑιο-ΟΗ
- 23 009294
Частично защищенные формы антагонистических пептидов В1, таких как перечислены в табл. 3 (8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-60), могут быть конъюгированы с молекулами ПЭГ при использовании аналогичных способов.
В одном варианте осуществления способа, представленного на схеме 5, боковые цепи аминов частично защищенных пептидов 5с замаскированы трет-бутилкарбамоильными (Вос) группами, и полученные в результате пептиды реагируют с любым из ранее описанных альдегидов ПЭГ в органических растворителях, таких как 1,2-дихлорэтан (ОСЕ), Ν,Ν-диметилформамид (ДМФ) или их смеси. Образование промежуточного имина можно ускорить добавлением дегидратирующего агента, такого как порошковые 4А молекулярные сита. После перемешивания при комнатной температуре в течение 1-24 ч полученный в результате имин восстанавливают добавлением 1-4 эквивалентов триацетоксиборогидрида натрия или цианоборогидрида натрия.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 5, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления реакции с частично защищенными пептидами, такими как 5с, могут быть проведены при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 60°С. Предпочтительно, когда реакции с частично защищенными пептидами, такими как 5с, как представлено на схеме 5, могут быть проведены при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 50°С. Более предпочтительно, когда реакции с частично защищенными пептидами, такими как 5с, как представлено на схеме 5, могут быть проведены при температуре от приблизительно 35°С до приблизительно 45°С. Большинство реакций с частично защищенными пептидами, такими как 5с, как представлено на схеме 5, могут быть проведены при комнатной температуре.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 5, боковые цепи аминов частично защищенных пептидов 5с замаскированы трет-бутилкарбамоильными (Вос) группами, и полученные в результате пептиды реагируют с любым из ранее описанных реагентов на основе Ν-гидроксисукцинимида ПЭГ или п-нитрофенилового эфира ПЭГ в органических растворителях, таких как 1,2дихлорэтан (ЭСЕ), Ν,Ν-диметилформамид (ДМФ), дихлорметан, Ν-метилпирролидин (ΝΜΡ) или их смеси. Активированные сложные эфиры ПЭГ могут быть либо монофункциональными, либо линейными бифункциональными вариантами, оба их которых коммерчески доступны у таких производителей, как №к!аг или ΝΟΡ. Кроме того, разветвленный полифункциональный активированный ПЭГ сложный эфир, содержащий 3-6 гидроксисукцинимидных или нитрофенилэфирных групп, особенно подходит для получения конъюгатов, соответствующих настоящему изобретению.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 5, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления реакции с частично защищенными пептидами, такими как 5с, могут быть проведены при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 60°С при времени реакции, лежащим в интервале от приблизительно 4 ч до приблизительно 10 дней. Предпочтительно, когда реакции с частично защищенными пептидами, такими как 5с, как представлено на схеме 5, могут быть проведены при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 50°С при времени реакции, лежащим в интервале от приблизительно 12 ч до приблизительно 5 дней. Более предпочтительно, когда реакции с частично защищенными пептидами, такими как 5с, как представлено на схеме 5, могут быть проведены при температуре от приблизительно 35°С до приблизительно 45°С при времени реакции, лежащим в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 5 дней. Большинство реакций с частично защищенными пептидами, такими как 5с, как представлено на схеме 5, могут быть проведены при комнатной температуре при времени реакции, лежащим в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 4 дней.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 5, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления удаление защитных групп боковой цепи, как представлено на схеме 5, может быть проведено при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 60°С. Данную реакцию можно осуществить в совместимом растворителе, таком как дихлорметан, используя от приблизительно 5% трифторуксусной кислоты (ТФА) до 50% ТФА по объему. Предпочтительно, когда вызываемое кислотой удаление защитной группы, как представлено на схеме 5, может быть проведено при температуре от приблизительно 0°С до приблизительно 40°С при использовании от приблизительно 10 до приблизительно 25% ТФА по объему. Более предпочтительно, когда вызываемое кислотой удаление защитной группы, как представлено на схеме 5, может быть проведено при температуре от приблизительно 0°С до приблизительно 25°С при использовании от приблизительно 10 до приблизительно 20% ТФА по объему в дихлорметане. Наиболее предпочтительно, когда вызываемое кислотой удаление защитной группы, как представлено на схеме 5, может быть проведено при комнатной температуре при использовании приблизительно 20% ТФА по объему в дихлорметане.
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 5, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления продукты 5б, представленные на схеме 4, могут быть очищены ВЭЖХ (высокоэффективной хроматографией) с обращенной фазой, эксклюзионной хроматографией по размеру, ионообменной хроматографией или мембранным диализом. Более предпочтительно, когда можно использовать две или более из вышеупомянутых методик либо в комбинации, либо последовательно, чтобы получить очищенные конъюгаты, соответствующие настоящему изобретению.
- 24 009294
В другом варианте осуществления способа, представленного на схеме 5, в сочетании с любым из выше- или нижеописанных вариантов осуществления способ очистки осуществляют больше одного раза.
Производные. В данном контексте рассматривают также производные пептидов и/или конъюгированных пептидов, соответствующих настоящему изобретению. Данные производные могут дополнительно улучшать растворимость, всасывание, биологический полупериод существования и т.п. конъюгированных с носителем или ПЭГ пептидов, описанных в данном контексте. Введенные группы могут альтернативно элиминировать или ослаблять нежелательные свойства пептидов и/или конъюгированных пептидов, описанных в данном контексте. Иллюстративные производные включают конъюгированные с носителем или ПЭГ пептиды, в которых:
1. Пептиды и/или конъюгированные пептиды либо их какая-либо часть является циклической. Например, пептидная часть пептида и/или конъюгированного пептида может быть модифицирована так, чтобы она содержала два или более остатков цистеина (например, в пептидильном линкере), которая могла бы быть циклизована путем формирования дисульфидной связи. В плане цитирования ссылок относительно получения циклизованных производных см. \7Ο 00/24782.
2. Пептид и/или конъюгированный с носителем или ПЭГ пептид перекрестно сшит или сделан способным к перекрестному сшиванию молекул. Например, пептидная часть конъюгированного пептида может быть модифицирована так, чтобы она содержала один остаток Сук и, таким образом, была способна к формированию межмолекулярной дисульфидной связи с подобной молекулой.
3. Одна или более пептидильных |-Ο(Ο)ΝΚ-| связей (пептидных связей) замеш,ена непептидильной связью. Иллюстративные непептидильные связи представлены -СН2-карбаматом [-0Η2-Ο^Ο)ΝΚ-], фосфонатом, -СН2-сульфонамидом |-ΟΉ2-5>(Ο)2ΝΚ-|. мочевиной [-ΝΗ^Ο)ΝΗ-], -СН2-вторичным амином и алкилированным пептидом [^(Ο)ΝΚ6-], где Я6 означает низшие алкилы.
4. Ν-концевой остаток цистеина конъюгированного пептида в X1 может быть замещен Ν-концевой дериватизирующей группой. Иллюстративные Ν-концевые дериватизирующие группы включают -ΝΗΚ.1, где Я1 означает моноалкил.
Дериватизацию функциональными агентами используют для перекрестного сшивания конъюгированных с носителем пептидов или их функциональных производных с нерастворимой в воде поддерживающей матрицей или другими макромолекулярными носителями. Обычно используемые перекрестносшивающие агенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, Ν-гидроксисукцинимидные сложные эфиры, например, эфиры 4-азидосалициловой кислоты, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитио-бис-(сукцинимидилпропионат) и бифункциональные малеимиды, такие как бис-Ы-малеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитиопропиоимидат, дают фотоактивируемые промежуточные продукты, которые способны образовывать перекрестные связи в присутствии света. Альтернативно для иммобилизации белка используют реакционные нерастворимые в воде матрицы, такие как углеводы, активированные цианогенбромидом, и реакционные субстраты, описанные в ПатентахСША ΝοΝο 3969287, 3691016, 4195128, 4247642, 4229537 и 4330440. Углеродные (олигосахаридные) группы легко можно присоединить к центрам, известным как центры гликозилирования белков. Как правило, О-связанные олигосахариды присоединены к остаткам серина (Зег) или треоинина (Тйг), тогда как Νсвязанные олигосахариды присоединены к остаткам аспарагина (Акп), когда они являются частью последовательности Акп-Ааа-Зег/Тйг, где Ааа может быть любой аминокислотой за исключением пролина. Ааа предпочтительно означает одну из девятнадцати природных аминокислот, отличных от пролина. Структуры Ν-связанных или О-связанных олигосахаридов и сахарных остатков, обнаруженных в каждом типе, различны. Одним типом сахара, который обычно обнаруживают на обоих, является Ν-ацетилнейраминовая кислота (называемая сиалиловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком обоих, как Ν-связанных, так и О-связанных олигосахаридов и, вследствие своего отрицательного заряда, может обусловливать кислые свойства гликозилированного конъюгированного пептида. Данный центр(ы) могут быть введены в линкер конъюгированных с носителем пептидов, соответствующих изобретению. Такие центры могут быть дополнительно гликозилированы синтетическими или полусинтетическими способами, известными в области техники.
Другие возможные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, окисление атома серы в цистеине, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и/или гистидина (см. монографию С^е^дйίοη, Рго1етк: З1гис1иге апб Μο^ϋ^ РгорегБек (Белки, структурные и молекулярные свойства), ^. Н. Егеетап & СЬ., Зап Ειπ^ί^ο, с. 79-86 (1983)).
Если в данном контексте не указано иначе, синтез пептидов и/или конъютированных пептидов, описанных в данном контексте, включающий получение соответствующих производных аминокислот, их активацию и связывание с образованием пептидов, и способы очистки пептидов и определения их чистоты включены в общую часть знаний по химии пептидов, как в основном описано в монографии ΗοиЬеη-\Vеу1 Мебюбеп бег Ο^дашксйеп СИепие (Методы органической химии), т. 16, части I и II, (1974) для синтеза в растворенной фазе. Для синтеза твердофазным методом в области техники также известны подходящие методики, которые включают описанные в монографии МеглДе1б, Сйет. Рο1урерΐ^бек (Хи
- 25 009294 мия полипептидов), с. 335-361 (под ред. КабоуаппИ и Рапауобк), (1973); статьях Мегпйе1б, 1. Ат. Сйет. 8ос, т. 85, с. 2149 (1963); Эауб е! а1., Вюсйет. Шб., т. 10, с. 394-414 (1985); монографии 81е\\'аП апб Уоипд, 8обб Рйаке Рерббе 8уп111еб5 (Твердофазный синтез пептидов), (1969); Патенте США №. 3941763; работах Е1пп е! а1., Тйе Рго1еб15 (Белки), (3 изд.), т. 2, с. 105-253, (1976) и Епсккоп е! а1., Тйе Рго1еб15 (Белки), (3 изд.), т. 2, с. 257-527, (1976). Химик, компетентный в области синтеза пептидов, мог бы синтезировать описанные пептиды стандартными методами в растворе или ручными либо автоматизированными твердофазными методами. Твердофазный синтез является предпочтительной методикой получения отдельных пептидов вследствие его экономической эффективности.
Фармацевтические композиции
Общее. Настоящее изобретение представляет также способы применения фармацевтических композиций соответствующих изобретению пептидов и/или конъюгированных с носителем пептидов, например, для предупреждения или лечения воспаления и боли (включая, но без ограничения перечисленным, воспалительную боль и ассоциированную гипералгезию и аллодинию). Пептиды и/или конъюгированные с носителем пептиды, соответствующие изобретению также имеют терапевтическую ценность в плане предупреждения или лечения других болевых состояний, ассоциированных или опосредованных активацией В1, включая, но без ограничения перечисленным, таламический болевой синдром, диабет, токсины и химиотерапию, септический шок, артрит, смешанный сосудистый и несосудистый синдромы, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанку, остеоартрит, воспалительные нарушения кишки, воспалительные глазные нарушения, воспалительные или нестабильные нарушения мочевого пузыря, псориаз, кожные болезни с воспалительными компонентами, солнечные ожоги, кардит, воспалительную болезнь кишки, дерматит, миозит, неврит, коллагеновые сосудистые заболевания, хронические воспалительные состояния, повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани, простой герпес, диабетическую невропатическую боль, послегерпетическую невралгию, каузалгию, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, головную боль напряжения, стенокардию, мигрень, боль при хирургических операциях, нарушения висцеральной подвижности в респираторных, мочеполовых, желудочно-кишечных или сосудистых областях, раны, ожоги, аллергический ринит, астму, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные нарушения, колит, изъязвление желудка, рак двенадцатиперстной кишки или вазомоторный либо аллергический ринит.
Изобретение представляет также применение пептидов и/или конъюгированных с носителем пептидов, соответствующих изобретению, для предупреждения или лечения острой боли, зубной боли, боли в спине, боли в нижнем отделе спины, боли при травме, боли при хирургических операциях, боли, появляющейся в результате ампутации или абсцесса, каузалгии, демиелинизирующих заболеваний, невралгии тройничного нерва, рака, хронического алкоголизма, инсульта, таламического болевого синдрома, диабета, синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), токсинов и химиотерапии, общей головной боли, мигрени, кластерной головной боли, смешанного сосудистого и несосудистого синдромов, головной боли напряжения, общего воспаления, артрита, ревматических заболеваний, волчанки, остеоартрита, воспалительных нарушений кишки, воспалительных глазных нарушений, воспалительных или нестабильных нарушений мочевого пузыря, псориаза, кожных болезней с воспалительными компонентами, солнечных ожогов, кардита, дерматита, миозита, неврита, коллагеновых сосудистых заболеваний, хронических воспалительных состояний, воспалительной боли и ассоциированной гипералгезии и аллодинии, невропатической боли и ассоциированной гипералгезии и аллодинии, диабетической невропатической боли, каузалгии, симпатически поддерживаемой боли, синдромов деафферентации, астмы, аллергического ринита, повреждения или дисфункции эпителиальной ткани, простого герпеса, послегерпетической невралгии, нарушений висцеральной подвижности в респираторных, мочеполовых, желудочнокишечных или сосудистых областях, ран, ожогов, аллергических кожных реакций, зуда, витилиго, общих желудочно-кишечных нарушений, колита, изъязвления желудка, рака двенадцатиперстной кишки и бронхиальных нарушений.
Соответственно настоящее изобретение также относится к применению одного или более пептидов и/или конъюгированных с носителем пептидов, соответствующих изобретению, для изготовления лекарственного средства для лечения нарушения, такого как острая боль, зубная боль, боль в спине, боль в нижнем отделе спины, боль при травме, боль при хирургических операциях, боль, появляющаяся в результате ампутации или абсцесса, каузалгия, демиелинизирующие заболевания, невралгия тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, инсульт, таламический болевой синдром, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины и химиотерапия, общая головная боль, мигрень, кластерная головная боль, смешанный сосудистый и несосудистый синдром, головная боль напряжения, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанка, остеоартрит, воспалительные нарушения кишки, воспалительные глазные нарушения, воспалительные или нестабильные нарушения мочевого пузыря, псориаз, кожные болезни с воспалительными компонентами, солнечные ожоги, кардит, дерматит, миозит, неврит, коллагеновые сосудистые заболевания, хронические воспалительные состояния, воспалительная боль и ассоциированная гипералгезия и аллодиния, невропатическая боль и ассоциированная гипералгезия и аллодиния, диабетическая невропатическая боль, каузалгия, симпатически поддерживаемая боль, синдромы деафферентации, астма, аллергический ринит, повреждение или дисфункция эпите
- 26 009294 лиальной ткани, простой герпес, послегерпетическая невралгия, нарушения висцеральной подвижности в респираторных, мочеполовых, желудочно-кишечных или сосудистых областях, раны, ожоги, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные нарушения, колит, изъязвление желудка, рак двенадцатиперстной кишки и бронхиальные нарушения.
Как используют в данном контексте, терапия или лечение представляет собой подход к получению благоприятного или желательного клинических результатов. Для целей данного изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но не ограничены, одним или более из следующих параметров: улучшение или облегчение любого аспекта боли и/или воспаления, включая острую, хроническую, воспалительную, невропатическую или боль после хирургического вмешательства. Для целей данного изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но без ограничения один или более из следующих факторов: в том числе снижение тяжести, облегчения одного или более симптомов, ассоциированных с болью и/или воспалением, включая любой из аспектов боли и/или воспаления (таких как сокращение продолжительности боли и/или воспаления и/или уменьшения чувствительности либо ощущения боли).
Данные фармацевтические композиции или лекарственные средства могут быть предназначены для введения посредством инъекции или для перорального, легочного, назального, чрескожного или других форм введения. В целом изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие эффективные количества по меньшей мере одного пептида и/или по меньшей мере одного конъюгированного с носителем пептида, соответствующего изобретению (в количествах, эффективных для предупреждения, облегчения или устранения боли или любых других медицинских состояний, представленных в данном контексте) вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, наполнителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, вспомогательными компонентами и/или носителями. Данные композиции включают разбавители с различным содержанием буферов (например, трис-НС1, ацетатного, фосфатного), рН и ионной силой, дополнительные компоненты, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, Твин 80, Полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия), консерванты (например, тимеросол, бензиловый спирт) и наполняющие субстанции (например, лактозу, маннит); введение материала в гранулированные препараты пептидов, конъюгированных с полимерным носителем, таким как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.п., или в липосомы. Можно также использовать гиалуроновую кислоту, и это может дать эффект, способствующий увеличению продолжительности действия в кровотоке. Данные композиции могут, кроме того, влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения т у|уо и скорость клиренса ш у|уо конъюгированных с носителем пептидов, соответствующих настоящему изобретению. См. например, Всттд1оп'в Рйагтассийса1 8с1спссв (Справочник по фармацевтическим наукам Ремингтона), 18 изд., Маск РиЬйвЫпд Со., Еав1оп, РА, с. 1435-1712, (1990), который в данном контексте включен в виде ссылки. Композиции можно получить в жидкой форме или в виде высушенного порошка (такого как лиофилизированная форма). Предусмотрены также имплантируемые препараты с замедленным высвобождением, а также чрескожные препараты.
Пероральные дозированные формы. Для применения в данном контексте предусмотрены пероральные твердые дозированные формы, которые в основном описаны в главе 89 Всттдоп'в Рйагтассийса1 8с1спссв (Справочника по фармацевтическим наукам Ремингтона), см. выше, который в данном контексте включен в виде ссылки. Твердые дозированные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, пастилки или лепешки, облатки или пеллеты. Кроме того, для изготовления настоящих композиций можно использовать липосомальную или протеиноидную инкапсуляцию (такую как, например, протеиноидные микросферы, описанные в Патенте США Ыо. 4925673). Может быть использована липосомальная инкапсуляция, и липосомы могут быть дериватизированы различными полимерами (см. например, патент США Ыо. 5013556). Описание возможных твердых дозированных форм приведено в главе 10, написанной Матвйа11 Κ., в монографии Мобсгп Рйагтассийсв (Современные фармацевтические препараты), под ред. 6. 8. Вапксг апб С. Т. Вйобев, (1979), включенной в данном контексте в виде ссылки. Как правило, препарат будет включать конъюгированный с носителем пептид, соответствующий изобретению, а также инертные ингредиенты, которые обеспечивают защиту от среды желудка и высвобождение конъюгированного с носителем пептида в кишке.
Специально предусмотрены также пероральные дозированные формы самих пептидов и/или конъюгированных с носителем пептидов, соответствующих изобретению. В этом плане при необходимости пептиды и/или конъюгированные с носителем пептиды могут быть химически модифицированы таким образом, чтобы пероральная доставка была эффективной. Возможно также использование соли модифицированной алифатической аминокислоты, такой как Ы-(8-[2-гидроксибензоил]амино)каприлатнатрия (8ЫАС), в качестве носителя для усиления всасывания конъюгированных с носителем пептидов, соответствующих изобретению. См. Патент США Ыо. 5792451 под названием Ога1 Эгид Оейусгу Сотров1йоп апб Мййобв (Композиция для пероральной доставки лекарственных препаратов и способы).
Пептиды и/или конъюгированные с носителем пептиды, соответствующие изобретению, могут быть включены в препарат в виде тонких мультичастиц в форме гранул или пеллет с размером частиц приблизительно один миллиметр. Препарат материла для введения в виде капсул также может быть по
- 27 009294 рошком в форме легко спрессованных вставок или даже в форме таблеток. Терапевтический препарат можно изготовить прессованием.
Могут быть включены все красители и вкусовые агенты. Например, можно получить пептид и/или конъюгированный с носителем пептид или его любое производное (например, посредством инкапсуляции в липосомах или микросферах), а затем дополнительно ввести в пищевой продукт, такой как охлажденный напиток, содержащий красители и вкусовые агенты.
Можно разбавить или увеличить объем пептида и/или конъюгированного с носителем пептида, соответствующего изобретению, инертным материалом. Данные разбавители могли бы включать углеводы, в частности, маннит, α-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Некоторые неорганические соли могут быть также использованы в качестве наполнителей, включая трифосфат кальция, карбоната магния и хлорид натрия. Ряд коммерчески доступных разбавителей представлен Еак1-Е1о, Етбех, 8ТА-Вх 1500, Етсотргекк и Ау1се11.
В состав терапевтического препарата в твердой дозированной форму могут быть включены разрыхлители. Материалы, используемые в качестве разрыхлителей, включают, но без ограничения перечисленным, крахмал, в том числе коммерчески производимый разрыхлитель на основе крахмала Ехр1о1ай. Можно также использовать гликолят крахмала натрия, Амберлит, карбоксиметилцеллюлозу натрия, ультрамилопектин, альгинат натрия, апельсиновую цедру, кислую карбоксиметилцеллюлозу, натуральную губку и бентонит. Другую форму разрыхлителей представляют нерастворимые катионообменные смолы. Порошки камедей можно использовать в качестве разрыхлителей и в качестве связующих агентов, и они могут включать такие порошки камедей, как агар, карайю или трагакант. Альгиновую кислоту и ее натриевую соль также используют в качестве разрыхлителей.
Можно использовать связующие агенты для того, чтобы удерживать вместе компоненты фармацевтической композиции для образования твердой таблетки, и они включают материалы из натуральных продуктов, такие как акация, трагакант, крахмал и желатин. Другие агенты включают метилцеллюлозу (МС), этилцеллюлозу (ЕС) и карбоксиметилцеллюлозу (СМС). Как поливинилпирролидон (ΡνΡ), так и гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС) можно использовать в спиртовых растворах для грануляции терапевтического агента.
В препарат может быть включен антифрикционный агент для предупреждения прилипания в процессе изготовления. Скользящие агенты могут быть использованы как слой между терапевтическим препаратом и стенкой штампа, и они могут включать, но без ограничения перечисленным стеариновую кислоту, в том числе ее магниевые и кальциевые соли, политетрафторэтилен (РТЕЕ), жидкий парафин, растительные масла и воска. Могут быть также использованы растворимые смазывающие агенты, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфатмагния, полиэтиленгликоль различных молекулярных масс, Карбовакс 4000 и 6000.
Возможно добавление скользящих агентов, которые могли бы улучшить свойства текучести конъюгированного с носителем пептида при изготовлении и с целью способствовать прессованию. Данные скользящие агенты могут включать крахмал, тальк, пирогенный оксид кремния и гидратированный силикоалюминат.
Чтобы помочь растворению пептида и/или конъюгированного с носителем пептида, соответствующего изобретению, в водной среде, можно добавить поверхностно-активное вещество в качестве смачивающего агента. Данные поверхностно-активные вещества могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, диоксилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия. Могут быть использованы катионные детергенты, и они могут включать хлорид бензалкония или хлорид бензетония. Перечень потенциальных неионных детергентов, которые могут быть включены в препарат в качестве поверхностно-активных веществ, содержит лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен, гидрогенизированное касторовое масло 10, 50 и 60, глицеролмоностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, сложный эфир сахарозы и жирной кислоты, метил целлюлозу и карбоксиметил целлюлозу. Данные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в препарате либо в виде монокомпонента, либо в виде смеси в различных соотношениях.
В препарат могут быть также включены вспомогательные агенты для усиления всасывания пептидов и/или конъюгированного с носителем пептида. Вспомогательные агенты, потенциально обладающие данным свойством, включают различные жирные кислоты, такие как, например, олеиновая кислота, линолевая кислота и линоленовая кислота.
Может потребоваться препарат с контролируемым высвобождением. Пептид и/или конъюгированный с носителем пептид, соответствующий изобретению, могут быть введены в инертную матрицу, которая обеспечивает высвобождение путем механизмов либо диффузии, либо вытекания, например в камеди. В препарат можно также ввести медленно разрушающиеся матрицы, например, альгинаты или полисахариды. Другую форму пептида и/или конъюгированного с носителем пептида, соответствующего изобретению, с контролируемым высвобождением получают способом на основе терапевтической системы Огок (фирмы А1ха Согр.), т.е. лекарственный препарат заключают в полупроницаемую мембрану, которая позволяет воде проникнуть и вытолкнуть лекарственный препарат через маленькое отверстие вследствие осмотических эффектов. Некоторые энтеросолюбильные покрытия также обладают эффектом
- 28 009294 задержанного высвобождения.
Легочные формы доставки. В данном контексте предусмотрена также легочная доставка фармацевтической композиции, соответствующей изобретению. Пептид и/или конъюгированный с носителем пептид (или его производные) доставляют в легкие млекопитающего путем вдыхания и перехода через эпителиальную выстилку легких в кровоток. Сообщения, относящиеся к легочной доставке макромолекул, которые могут быть полезны в этом плане, включают статьи Аб_)е1 е! а1., Рйагта. Кек., т. 7, с. 565-569, (1990); Λάφι е! а1., ШетаЙ. I. Рйагтасеийск, т. 63, с. 135-144 (1990) (по ацетату лейпролида); Вгацие! е! а1., I. Сагбюуакс. Рйагтасо1., т. 13 (доп.5), с. 143-146 (1989) (по эндотелину-1); НийЬагб е! а1., Аппц1к Ιη!. Меб., т. 3, с. 206-12, (1989) (по а1-антитрипсину); 8тйй е! а1., I. С1т. Шуек!., т. 84, с. 1145-1146 (1989) (по а1-протеиназе); Οκ\\Όίη е! а1., ЛегокоИ/аиои о£ Рго1етк (Аэрозолизация белков), Ргос. 8утр. Кекр. Эгид Оейуегу ΙΙ, Кеуйопе, Со1огабо (1990) (по рекомбинантному гормону роста человека); ЭеЬке1а1.. I. Ιιηιηιιпо1., т. 140, с. 3482-3488 (1988) (по интерферону-γ и фактору некроза опухолей а) и Патент США №. 5284656 (по гранулоцитарному колониестимулирующему фактору).
Для применения изобретения на практике предусмотрен широкий круг медицинских устройств, разработанных для легочной доставки терапевтических продуктов, включая, но без ограничения перечисленным, распылители, дозированные ингаляторы и порошковые ингаляторы, все из которых знакомы специалистам в области техники. Некоторые конкретные примеры коммерчески производимых устройств, пригодных для практической реализации изобретения, представляют собой распылитель И1!гауек, производимый фирмой Ма11тскгоб!, Шс., 8!. Ьошк, Мккоий; распылитель Асот ΙΙ, производимый фирмой Мащиек! Мебка1 Ргобис!к, Е^к^ооб, Со1огабо; дозированный ингалятор Уекой^ производимый фирмой С1ахо Шс., Кекеагсй Тпаидк Рагк, №г111 СагоИт, и порошковый ингалятор 8р^ηйа1е^, производимый фирмой Р1коп8 Согр., Вебйэгб, Маккасйике!!к.
Для всех данных устройств требуется использование препаратов, пригодных для отмеривания описанных в данном контексте пептидов и/или конъюгированных с носителем пептидов и/или их производных. Как правило, каждый препарат специфичен в отношении типа используемого устройства и может кроме разбавителей, наполнителей, вспомогательных агентов и/или носителей, используемых в терапии, включать применение соответствующего материала пропеллента.
Фармацевтически приемлемые носители для данных легочных композиций включают углеводы, такие как трегалоза, маннит, ксилит, сахароза, лактоза и сорбит. Другие ингредиенты для применения в препаратах могут включать ЭРРС, ΩΟΕΕ, Э8РС и ^ΟРС. Можно использовать природные или синтетические поверхностно-активные вещества. Возможно использование ПЭГ (даже отдельно от его применения в дериватизации пептида). Могут быть также использованы декстраны, такие как циклодекстран, соли желчных кислот, целлюлоза и производные целлюлозы. Аминокислоты также могут быть использованы, например, в буферном составе.
Кроме того, предусмотрено применение липосом, микрокапсул или микросфер, аддуктов или других типов носителей.
Препараты, пригодные для применения с распылителем, как струйного, так и ультразвукового типа, будут, как правило, включать описанный пептид и/или конъюгированный с носителем пептид, растворенный в воде в концентрации приблизительно 0,1-25 миллиграмм (мг) биологически активного агента/миллилитр (мл) раствора. Препарат может также включать буфер и простой сахар (например, для стабилизации пептида и регуляции осмотического давления). Препарат для распыления может также содержать поверхностно-активное вещество для снижения или предупреждения поверхностной индуцируемой агрегацией белка, вызываемой распылением раствора при формировании аэрозоля.
Препараты для применения с дозированным ингаляционным устройством будут в основном включать тонко диспергированный порошок, содержащий пептид и/или конъюгированный с носителем пептид, суспендированный в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Пропеллент может быть любым принятым материалом, используемым для данной цели, таким как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или углеводородом, включая трихлорфторметан, дихлорфторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан или их комбинации. Подходящие поверхностноактивные вещества включают сорбит-триолеат и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества можно также использовать олеиновую кислоту.
Препараты для дозирования из порошкового ингаляционного устройства будут включать тонко диспергированный сухой порошок, содержащий описанные пептиды и/или конъюгированные с носителем пептиды, и может также включать инертный наполнитель, такой как лактоза, сорбит, сахароза, маннит, трегалоза или ксилит в количествах, которые облегчают рассеивание порошка из устройства, например, от 50 до 90% от массы препарата.
Назальные дозированные формы. Предусмотрена также назальная доставка пептида и/или конъюгированных с носителем пептидов. Назальная доставка пептиду и/или конъюгированным с носителем пептидам, соответствующим изобретению, проходить в кровоток непосредственно после введения терапевтического продукта в нос без необходимости депонирования продукта в легком. Препараты для назальной доставки включают препараты с декстраном или циклодекстраном. Предусмотрена также дос
- 29 009294 тавка путем транспорта через другие слизистые оболочки.
Доставка с помощью насоса. В ряде вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена локализованная доставка пептидов и/или конъюгированных пептидов, соответствующих настоящему изобретению, для лечения или предупреждения В1-опосредованных нарушений. Одним из способов локализованной доставки, предусматриваемым изобретением, является инъекция агента в локальную область, в которой действует агент.
Другой способ локализованной доставки включает введение катетера, чтобы направить лекарственный препарат(ы) в желательную область тела, и использование насоса для того, чтобы заставить лекарственный препарат(ы) дигаться через катетер. Насосы для лекарственных препаратов для наружного ношения, используемые с имплантированным внутри катетером хорошо известны специалистам в данной области.
Еще один способ локализованной доставки включает имплантируемые устройства для доставки лекарственных препаратов. Имплантируемые насосы, разработанные, чтобы преодолеть недостатки методик, в которых используют системы наружного насоса и катетера, хорошо известны специалистам в данной области. Имплантируемые насосы для доставки лекарственных препаратов часто включают резервуар для хранения лекарственного препарата, инъекционный порт для обеспечения инъекции свежих лекарственных препаратов, а также удаления старого лекарственного препарата из резервуара с регулярными интервалами и (необязательно) катетер для доставки лекарственного препарата в желательную область. Предпочтительные имплантируемые устройства включают, но не ограничены, имплантатом Виток (фирма Абха Согрога!юп, Моип!ат У1ете, СА), инфузионной системой 8упсНгоМеб I или II 1п!икюп 8ук!ет (фирмы Меб1тошс, 1пс., М1ппеаро11к) и т.п.
Дополнительно (или альтернативно) настоящее изобретение представляет пептиды и/или конъюгированные пептиды для применения в любом из различных препаратов с медленным или задержанным высвобождением или в препаратах микрочастиц, ранее упомянутых выше и/или известных компетентному специалисту.
Дозировки. Эффективные дозировки пептидов и/или конъюгированных пептидов, соответствующих изобретению, предназначенные для введения, можно определить с помощью процедур, хорошо известных специалистам в данной области, которые направлены на такие параметры, как полупериод биологического существования, биодоступность и токсичность. В предпочтительных вариантах осуществления специалист в области техники определяет диапазон эффективных доз с использованием данных рутинных исследований ш νίίΐΌ и ш у1уо, хорошо известных в области техники. Например, анализы клеточных культур ш ν 11го. такие как иллюстративные анализы, описанные в примере 6 ниже, будут представлять данные, на основании которых специалист в области техники может легко установить среднюю ингибирующую концентрацию (1С) или среднюю эффективную концентрацию (ЕС) пептида или конъюгированного пептида, необходимую для блокирования некоторого количества В1-индуцированной активности (например, 50%, 1С50; или 90%, 1С90).
Затем специалист в области техники и может выбрать подходящие дозы, используя фармакокинетические данные, полученные на основании рутинных моделей на животных, таких как иллюстративные фармакокинетические данные, описанные в примере 9 ниже, чтобы получить минимальную концентрацию в плазме (Ст1п) пептида, которая равна или превосходит установленное значение 1С. Схема дозирования, включенная в способ лечения указанного заболевания или нарушения, будет определена лечащим врачом с учетом различных факторов, которые модифицируют действие терапевтических агентов, таких как возраст, состояние, масса тела, пол и диета пациента, тяжесть состояния, которое лечат, время введения и другие клинические факторы. Как правило, суточная схема должна лежать в интервале 1,0-10000 микрограмм (мкг) пептида и/или конъюгированного с носителем пептида/килограмм (кг) массы тела, предпочтительно 1,0-1000 мкг/килограмм (кг) массы тела и наиболее предпочтительно 1,0-150 мкг/килограмм (кг) массы тела.
Комбинированная терапия. В другом аспекте настоящее изобретение включает способ лечения (или в других вариантах осуществления предупреждения) боли и/или воспаления либо любого состояния или нарушений, ассоциированного с активацией В1, заключающийся во введении количества пептида и/или конъюгированного пептида, соответствующего настоящему изобретению, и количества Ы8А1О. Термин Ы8А1О относится к нестероидному противовоспалительному соединению. Относительные количеств и соотношения пептидного антагониста и/или конъюгированного пептидного антагониста и Ы8А1О могут варьировать. В некоторых вариантах осуществления будут вводить достаточно пептида(ов) и/или конъюгированного пептида(ов), чтобы иметь возможность уменьшить нормальную дозу Ы8А1О, требующуюся для того, чтобы вызвать ослабление боли или воспаления в той же мере. В некоторых вариантах осуществления достаточное количество пептида(ов) и/или конъюгированного пептида(ов), соответствующего настоящему изобретению, будет введено так, чтобы обеспечить возможность снизить нормальную дозу Ы8А1О, требующуюся для того, чтобы вызвать ослабление боли или воспаления в той же мере, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по менышей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере при
- 30 009294 близительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80% или по меньшей мере приблизительно на 90% или больше. Данное снижение может быть отражено в показателях количества, вводимого при данном введении и/или в количества, вводимого в течение заданного периода времени (уменьшение частоты).
В другом аспекте изобретение представляет способы улучшения лечения боли или воспаления с помощью Ν8ΆΙΌ, заключающиеся во введении эффективного количества Ν8ΆΙΌ в сочетании с эффективным количеством по меньшей мере одного пептида и/или по меньшей мере одного конъюгированного пептида, соответствующего настоящему изобретению. Как используют в данном контексте, выражение введение в сочетании предусматривает также охват любого случая, в котором Ν8ΆΙΌ и пептид и/или конъюгированный пептид, соответствующий настоящему изобретению, вводят субъекту в эффективном количестве. Выражение введение в сочетании, как используют в данном контексте, включает одновременное введение и/или введение в различное время. Введение в сочетании также охватывает введение как совместного препарата (т.е. пептид и/или конъюгированный пептид, соответствующий настоящему изобретению, и Ν8ΆΙΌ присутствуют (комбинируются) в одной и той же композиции) и/или введение в виде раздельных композиций. Имеется в виду, что пептид(ы) и/или конъюгированный пептид(ы), соответствующий настоящему изобретению, и по меньшей мере одно Ν8ΛΙΌ могут быть введены с различной частотой и/или интервалами введения. Например, конъюгированый пептид, соответствующий настоящему изобретению, можно вводить раз в неделю, тогда как Ν8ΆΙΌ можно вводить более часто. Понятно, что пептид(ы) и/или конъюгированный пептид(ы), соответствующий настоящему изобретению, и Ν8ΆΙΌ можно вводить, используя один и тот же способ введения или различные способы введения, и что различные схемы дозирования могут изменяться в ходе введения(й). Введение может быть осуществлено даже до начала боли или воспаления. Вследствие этого в другом аспекте изобретение представляет способы лечения, уменьшения вероятности, облегчения и/или смягчения и/или задержки развития боли и/или воспаления у субъекта, причем данные способы заключаются во введении эффективного количества по меньшей мере одного пептида и/или по меньшей мере одного конъюгированного пептида, соответствующего настоящему изобретению, в сочетании с эффективным количеством по меньшей мере одного Ν8ΆΙΌ. Данные способы включают лечение или предупреждение любой боли и/или воспаления любой этиологии, включая боль и/или воспаление, при которых применение Ν8ΆΙΌ, как правило, предписано. Данные способы также подходят для лечения или предупреждения любого состояния или нарушения, ранее упомянутых выше или ниже, как опосредуемых или ассоциированных с активацией В1. В некоторых вариантах осуществления боль и/или воспаление является болью после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах осуществления боль и/или воспаление связаны с ожогами или ранами. В других вариантах осуществления боль и/или воспаление связаны с ревматоидным артритом. В следующих вариантах осуществления боль и/или воспаление связаны с остеоартритом. В других вариантах осуществления боль и/или воспаление связаны с постгерпетической невралгией. В некоторых вариантах осуществления Ν8ΆΙΌ выбрано из группы, состоящей из аспирина, ацетаминофена, ибупрофена, индометацина, напроксена, диклофенака, кетопрофена, толметина, сулиндака, мефенамовой кислоты, меклофенамовой кислоты, дифлунисла, руфенисала, пироксима, судоксикама, изоксикама, целекоксиба, рофекоксиба, ΌυΡ-697, флосулида, мелоксикама, 6-метокси-2-нафтилуксусной кислоты, МК-966, набуметона, нимесулида, Ν8-398, 8С-5766, 8С58215, Т-614 или их комбинаций.
Примеры
Следующие примеры представлены только с иллюстративными целями и не подразумеваются и их не следует истолковывать, как ограничивающие изобретение каким-либо образом. Специалисты в области техники будут учитывать, что могут быть получены модификации и варианты соединений, описанных в данном контексте, без нарушения сущности или объема настоящего изобретения. Соединения, соответствующие изобретению, можно синтезировать согласно одному или более из следующих способов. Следует отметить, что представлены общие способы, поскольку это относится к получению соединений, имеющих неопределенные стереохимические характеристики. Однако такие способы в целом применимы к данным соединениям со специфическими стереохимическими характеристиками, например, когда стереохимические характеристики групп представлены (8) или (В). Кроме того, соединения, имеющие одну стереохимическую форму (например, (В)), часто могут быть использованы для получения соединений, имеющих противоположные стереохимические характеристики (т.е. (8)) при использовании хорошо известных способов, например, путем инверсии.
Пример 1. Синтез и очистка пептидных антагонистов рецептора В1 и конъюгированных с ПЭГ пептидных антагонистов рецептора В1.
Различные пептиды, соответствующие изобретению, синтезируют с использованием методик синтеза, хорошо известных в области техники. В предпочтительном способе синтеза различных пептидов, соответствующих изобретению, используют стратегию ΡМΟС с активацией карбодиимида, как описано ниже.
Часть 1. Растворяют Ртос-аминокислоту для нанесения на смолу с использованием химии карбодиимидов.
Ртос-аминокислоту (3-4 эквивалента) растворяют в смеси сухого ИСМ/ΝΜΡ (ΝΜΡ или ДМФ ис
- 31 009294 пользуют для того, чтобы достигнуть полного растворения). Раствор Ν-гидроксибензотриазола (ΗΟΒΐ, такой же эквивалент, как для аминокислоты) в ΝΜΡ добавляют к раствору аминокислоты. Раствор Ν,Ν'дициклогексил карбодиимида (ЭСС, такой же эквивалент, как для аминокислоты) в ЭСМ добавляют к раствору аминокислоты. Раствор перемешивают в течение приблизительно 20 мин. Затем активированный кислый раствор добавляют к смоле (если необходимо, осадки удаляют перед добавлением). Реакцию перемешивают пока смола остается отрицательной при нингидриновом тесте. После завершения связывания смолу собирают и промывают ДМФ несколько раз.
Часть 2. Удаляют Ν-концевой Ршос с комплекса пептид-смола.
Смолу с Ршос-защищенным пептидилом обрабатывают пиперидином/ДМФ (2/8) в течение 3 мин. Смоле дают стечь и повторяют обработку в течение 15 мин. Смолу промывают ДМФ, а затем несколько раз ЭСМ. Смолу сушат на воздухе, если следующая стадия включает отщепление пептида от смолы, как описано на стадии 3.
Часть 3. Отщепление с помощью ТФА и снятие защиты.
Высушенную смолу, полученную в части 2, помещают в колбу и добавляют 10-25 мл/г смолы смеси для отщепления (95% ТФА, 2,5% воды, 1,5% триизопропилсиланаи 1% этандитиола). После перемешивания реакции в течение 3-4 ч смолу удаляют фильтрацией при пониженном давлении и дважды промывают ТФА. Объединенные фильтраты концентрируют до ~20% путем с помощью роторного испарителя при пониженном давлении. Жидкость охлаждают до -50°С и осаждают 10-кратным объемом холодного сухого эфира. Осадок собирают. Затем пептид растворяют в смеси воды/ацетонитрила, содержащей 0,5% ТФА и лиофилизируют. Затем сырец очищают, используя С18-ВЭЖХ на градиенте от 10% ацетонитрила/0,1% ТФА в воде до 50% ацетонитрила/0,1% ТФА в воде. Для 1 г сырца используют колонку С18 250x50 мм при скорости потока 90 мл/мин, на Ащ1сп1 для препаративной ВЭЖХ с детекцией при двух длинах волн 215 и 254 нм. Впрыскивание фракционируют и каждую фракцию анализируют массспекрометрией. Пробирки объединяют на основе масс-спектра, концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетонитрила и лиофилизируют для получения пептидных антагонистов В1 в виде порошков белого цвета. Получение характеристик осуществляют с помощью ВЭЖХ-МС и определение массы методом Ма1б1-ТОР.
Различные конъюгированные с ПЭГ пептиды, соответствующие изобретению, получаю следующим образом.
Различные активные пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1, выбранные из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟΝΟ: 5-60, синтезируют с различными пептидильными линкерами на Ν-конце, где каждый из них содержит предпоследний цистеин, используя вышеупомянутые способы (например, 8ΕΟ ГО ΝΟΝΟ: 27-41). Данные пептидные аналоги дериватизируют полиэтиленгликолем (ПЭГ) различного размера и конфигурации посредством сайт-направленного связывания полимера, активированного малеимидом, с тиолом Ν-концевого цистеина пептидных аналогов при использовании, например, Способа А или Способа В, описанных ниже. Полученные в результате конъюгаты ПЭГ-пептид очищают ионообменной хроматографией, концентрируют лиофилизацией или диафильтрацией и диализуют в буфер перед проведение биоанализа ίη νίΐτο и ίη νίνο.
Способ А. Конъюгированные с ПЭГ пептиды получают реакцией цистеинсодержащего пептида с ПЭГ-малеимидом в 50 мМ ΝαΗΡΟ4, 5 мМ ЭДТА (этанолдиаминтетраксусной кислотой), рН 6,5 при концентрации пептида 2,5-5 мг/мл и стехиометрией реакции как 1,2-кратного молярного избытка малеимида:тиола. Реакцию перемешивают при комнатной температуре (20-25°С) в течение 1-1,5 ч. По окончании реакцию гасят 10-кратным молярным избытком β-меркаптоэтанола (в-МЕ):малеимида и дают перемешиваться в течение дополнительных 30-60 мин при комнатной температуре.
Течение реакции мониторируют, используя ВЭЖХ с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) путем впрыскивания 5 мкл реакции в колонку С45 мкм 4,6 х 250 мм (Огасе Ууйас. Со1ишЫа, ΜΌ; номер по каталогу: #214ТР54). Непрореагировавший пептид и конъюгат ПЭГ-пептид элюируют линейным градиентом 590% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Как правило, в реакции используется >90% пептидного аналога.
Линейные полимеры ПЭГ, активированные малеимидом (мол. масса = 5 кДа или 20 кДа, ΡΌ=1,011,02) производит 811еаг\\Шег Согр. или ΝΟΓ Согр. (Токуо, 1арап).
Очистка. Конъюгированные с ПЭГ пептиды очищают катионообменной хроматографией с использованием колонок 8Ρ Зерйагоке ΗΡ (Ашегайаш Вюкаепсек), предварительно уравновешенных 10 мМ ΝηΟΑα 20% ΕΐΟΗ, рН 4. Перед нагрузкой реакционные смеси разводят в 10 раз 20% ЕЮН и подводят рН до 3,5 ледяной уксусной кислотой. Разведенные реакционные смеси нагружают на колонку подходящего размера, чтобы соотношение пептид:смола не превышало 2,5 мг/мл.
Затем колонку промывают 2 объемами колонки (СУ§) 10 мМ ΝΟΑ^ 20% ΕΐΟΗ, рН 4 и элюируют линейным градиентом 0-200 мМ №101 в 10 мМ М-ЮАс, 20% ΕΐΟΗ, ρΗ 4 более, чем 10-20 СУ. Немодифицированный пептид и конъюгат ПЭГ-пептид определяют мониторированием поглощения при длине волны либо 254 нм, либо 220 нм. В данных условиях избыток ПЭГ и β-МЕ вымывают в несвязанной проточной фракции, конъюгат элюируют в виде широкого пика, начинающегося при ~50 мМ ЯаС1, и хоро
- 32 009294 шо растворенный свободный пептид элюируется при ~200 мМ №С1.
Элюированные фракции пика оценивают с помощью ОФ-ВЭЖХ и объединяют на основе гомогенности и времени удерживания, соответствующих конъюгату ПЭГ-пептид. Объединенный пик конъюгата концентрируют высушиванием, затем восстанавливают в воде и диализуют против буфера. Альтернативно диафильтрацию можно использовать для концентрации и замены буфера конъюгатом.
Конечные пулы конъюгатов ПЭГ-пептид анализируют ОФ-ВЭЖХ, и они, как правило, содержат 98% конъюгата. Состав и концентрации конъюгата определяют с помощью комбинации анализов аминокислот, секвенирования пептидов и абсорбционной спектроскопии.
Стабильность раствора соединений, представленных 1с на схеме 1, мониторируют при комнатной температуре в забуференном фосфатом солевом растворе (РВ8) при рН=7,2 в течение времени, используя вышеописанный способ СЕХ (см. фиг. 1 (А)). Показано, что соединение 1с быстро превращается в 16, а также в два продукта, образующиеся в результате гидролиза сукцинимидной группы (структуры определяют комбинацией экспериментов с использованием ИК, МС/МС и ЯМР-спектрометрии).
Способ В. мПЭГ-малеимид (1,0 экв.) растворяют при 30°С в безводном МеОН в 3-горлой круглодонной колбе, снабженной механической мешалкой, температурным датчиком и входным отверстием для подачи Ν2. После полного растворения мПЭГ-малеимида в прозрачный раствор добавляют пептид, содержащий Ν-конечный остатокцистеина (1,3 экв.), и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. ВЭЖХ с обращенной фазой показывает исчезновение мПЭГ-малеимида и новый пик исходного 3-сульфанил-сукцинимидного аддукта. Затем в раствор добавляют десять эквивалентов диизопропилэтиламина (8ίβΐη;·ι-Λίάπο1ι ^гр., 81. Εοωδ, МО) и перемешивают при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч. Реакцию мониторирут ионообменной хроматографией с использованием ΤΟ8ΟНАА8 8Р-5Р№ (20 мкм) в качестве стационарной фазы. Анализ СЕХ показывает более чем 98% превращение при том, что остается меньше 1,5% 3-сульфанил-сукцинимидногоаддукта. Добавляют третичный бутил метиловый эфир (ТВМЕ) (два объема метанола, используемого в реакции) и полученный в результате мутный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Осадок белого цвета отфильтровывают и сушат под вакуумом при комнатной температуре в течение ночи, получая 6-метил-карбамоил-5-оксотиоморфлин-3-карбоксамидсвязанный продукт (16).
Очистка. Вышеуказанный сырец очищают ОФ-ВЭЖХ при использовании системы МеОН-Н^АсОН (с18 ΥΜί.ΌΩ8 ΝΟ в качестве стационарной фазы), получая 6-метил-карбамоил-5-оксо-тиоморфлин-3-карбоксамидсвязанный продукт чистоты >98% по данным хроматографии с обращенной фазой. Очищенные фракции объединяют и концентрируют досуха под вакуумом, и полученный в результате остаток белого цвета растворяют в минимальном количестве теплого МеОН (~30°С), достаточном для образования прозрачного раствора, затем обрабатывают ТВМЕ (два объема использованного МеОН). Полученный в результате мутный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч и осадок отфильтровывают, сушат под вакуумом при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч. Очищенный продукт (16) получают в виде не совсем белого вещества с общим выходом 74% с чистотой >98% поданным СЕХ и КРС (препаративной хроматографии). Состав конъюгата и содержание пептида определяют с помощью комбинации анализов аминокислот, секвенирования пептида, методов мультиядерной ЯМР-спектрометрии и абсорбционной спектроскопии.
Стабильность раствора соединения 16 мониторируют при комнатной температуре в забуференном фосфатом солевом растворе (РВ8) при рН=7 в течение времени, используя вышеописанный способ СЕХ. Показано, что данное соединение значительно более стабильно, и в течение шести дней не отмечено существенных изменений.
Аналитическую обратно-фазовую (КР) и катионообменную (СЕХ) хроматографию проводят в системах ВЭЖХ АдИеи! 1100 с диодной матрицей или детектором с изменяемой длиной волны и термостатируемым автоматическим устройством для отбора проб. Стандартные условия хроматографирования приведены ниже.
1. Условия методики ОФ-ВЭЖХ.
- 33 009294
Колонка: УМС ОО8-АО,Змкм, 120 А, 4,6 х 100 мм
Температура колонки: 40°С
Подвижные фазы: A) 0,1 % ТФА в воде B) 0,1% ТФА в МеОН
Скорость потока: 1,1 мл/мин.
Градиент: Время %В 0 5 10 40 30 95 35 95 35,1 5 40 5
Детекция: УФ при 220 нм
Объем введения: 20 мкл или 50 мкл в зависимости от концентрации образца
Концентрация 2,5-10 мг/мл
образца:
Разбавитель образца: РВ5 в модификации Дальбекко и другие буферы, используемые с исследованиях стабильности
2. Общий метод аналитической катионообменной хроматографии
Колонка:
ΤΟδΟΗ, Τ5Κ-ΘΕ6, 5Р-5РУУ, 10 мкм, 7,5 х 75 мм
Температура колонки:
25°С
Подвижные фазы:
А) 20 мМ МаН2РО4 в воде/ЕЮН (8:2), рН 3,5
В) 20 мМ №Н2РО4 и 0,5 М ИаС! в воде/ЕЮН (8:2), рН 3,5
Скорость потока:
1,0 мл/мин.
Градиент:
Время %В
100
100
Детекция:
УФ при 220 нм
Объем введения:
10-50 мкл в зависимости от концентрации
Концентрация образца
2,5-10 мг/мл образца:
Разбавитель образца: РВ5 в модификации Дальбекко и другие
буферы, используемые с исследованиях стабильности
- 34 009294
Пример 2. Синтез и очистка конъюгированных с ПЭГ пептидных антагонистов рецептора В1 с использованием тиоэфиров ПЭГ.
Конъюгированные с ПЭГ пептиды получают реакцией цистеин-содержащего пептида с ПЭГмалеимидом в 50 мМ ΝηΗΡΟ4, 5 мМ ЭДТА, рН 7 при концентрации пептида 2,5-5 мг/мл и стехиометрией реакции как 1,2-кратного молярного избытка малеимида:тиола. Реакцию перемешивают при комнатной температуре (20-25°С) в течение 18-26 ч. По окончании реакцию гасят 10-кратным молярным избытком β-меркаптоэтанола (в-МЕ):малеимида и дают перемешиваться в течение дополнительных 30-60 мин при комнатной температуре. Реакции очищают, как описано выше в способе А в примере 1.
Пример 3. Синтез и очистка конъюгированных с ПЭГ пептидных антагонистов рецептора В1 с использованием тиоэфиров ПЭГ или йодоацетатов.
Конъюгированные с ПЭГ пептиды получают реакцией пептида, содержащего Ν-концевой цистеин, с ПЭГ-ОРТЕ (орто-пиридилтиоэфир) в 50 мМ ΝηΗΡΟ4, 5 мМ ЭДТА, рН 7 при концентрации пептида 2,55 мг/мл и стехиометрией реакции как 1,2-кратного молярного избытка активированного ПЭГ:пептида. Реакцию перемешивают при комнатной температуре (20-25° С) в течение 18-26 ч. По окончании реакцию гасят 10-кратным молярным избытком реагента цистеин:избыток ПЭГ и дают перемешиваться в течение дополнительных 30-60 мин при комнатной температуре. Реакции очищают, как описано выше в способе А в примере 1.
Альтернативно используют ПЭГ-йодацетамид, как описано выше, для образования конъюгатов, в которых молекула ПЭГ присоединена посредством тиоэфирного линкера (см. схему 3). В данном случае используют 1,5 молярных эквивалента реакции активированного ПЭГ, и время реакции увеличивается до 24 ч, реакцию гасят об/10 молярных эквивалентов β-меркаптоэтанола, очищенного, как в вышеприведенных примерах.
Пример 4. Синтез и очистка конъюгированных с ПЭГ пептидных антагонистов рецептора В1 с использованием пропионового альдегида ПЭГ.
Пептидные антагонисты рецептора В1, такие как любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-60 и 27-41 могут быть подвергнуты селективной Ν-концевой модификации с помощью ПЭГ при использовании способа, описанного в патенте США 5824784 (который таким образом включен в виде ссылки во всей своей полноте). Например, пептид, как показано в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 (245 мг, 0,14 ммоль), растворяют в 10 мл раствора, содержащего 100 мМ Ν;·ιΗ;ΡΟ.·ι и 60 мМ ΝΟβΗ, Смесь охлаждают до 4°С при перемешивании и обрабатывают 2,35 г 20 К мПЭГ пропионового альдегида(№к!аг Тйегариейск, Ηυηΐδνί1^, АЬ). Смесь перемешивают в течение 3 дней, затем очищают обратно-фазовой или СЕХ-хроматографией, как описано в способе в примера 1.
Альтернативно можно провести реакцию ПЭГов, содержащих аминные реакционные функциональности, с частично защищенными пептидными антагонистами В1 согласно способам, проиллюстрированным на схеме 5. После реакции конъюгирования защитные группы боковой цепи отщепляют, используя методики, хорошо известные специалистам в области синтеза пептидов в твердой и растворенной фазе, и полученные в результате конструкции ПЭГ-пептид очищают, как описано выше. Можно также провести реакцию мультифункциональных альдегидов ПЭГ (3-6 реакционных групп) с избыточными молярными количествами защищенных пептидов для получения мультивалентных конструкций ПЭГ, в которых множество пептидов присоединено региохимически и стехиометрически определенным образом.
Пример 5. Синтез и очистка конъюгированных с ПЭГ пептидных антагонистов рецептора В1 с использованием Ν-гидроксисукциимидов ПЭГ.
Пептидные антагонисты рецептора В1, такие как любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-60, можно селективно пегилировать на специфическом атоме азота Ν-конца или боковой цепи при использовании частично защищенных пептидных антагонистов В1 согласно способам, проиллюстрированным на схеме 5. Например, раствор частичного декапептида (1,43 г, 1,025 ммоль) в 2,5 мл безводного ДМФ смешивают с 3,5 г (0,18 ммоль) 8ш1Ьпд1и РТЕ-200С8 (сукцинимидилглутерат с 4 ветвями молекулярной массы 20 кДа, ΝΟΕ, Тοкуο, барам) и 1,0 мл диизопропиоэтиламина в 25 мл дихлорметана. Полученный в результате бесцветный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 2 дней, затем выпаривают при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в 25 мл деионизированной воды и помещают в мембрану для диализа, отсекающую соединения молекулярной массы 10000 (фирмы Р1егсе, ЯοскΓο^ά11, И8А). Соединение диализуют против воды в течение 24 ч (3 замены буфера), затем лиофилизируют, чтобы получить защищенный тетравалентный продукт ПЭГ. Полученное в результате твердое вещество белого цвета растворяют в 60 мл дихлорметана и обрабатывают 20 мл безводного ТФА (трифторацетата). После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 дней реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении, затем растворяют и диализуют, как описано выше. Диализованный материал лиофилизруют, затем очищают ионообменной хроматографией, как описано ранее, для получения тетравалентного продукта в виде твердого вещества белого цвета. Аналогичным образом ПЭГи, содержащие 1-6 сукцинимидилглутератных групп, можно использовать для получения моно- или полифункциональных пептидных конструкций.
- 35 009294
Таблица 4а. Пептиды X1
5ЕО Ю ΝΟ: Последовательность пептида X1
27 {Ν} ΟββθΚΗΡΡβΡδΡί {С>
28 {Ν} ссессекнррсрзрь
29 (Ν) сееаесккнрагзрь (С]
30 (Ν) сееесекнкнррерзрцс]
31 {Ν} СС-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-КАРРСР8Р1- (С)
32 (Ν) сссесбккцрре [дмер] з [0-£-№ΐ] ι
33 (Ν) СССОССККНР [Нур] С [Срд] 3 [ΟΤίο] [Срд] (С)
34 (Ν> сесоссеаккнр [нур] е [Срд] з [отю] [Сро] [о
35 [Ν] ас-саесеокквр [Нур] 6 [Срд] 8 [ОТ«с] [Срд] (С)
36 {Ν} ΚΚΑΡ [Нур] 6 [Срд] 3 [ОТ1с] [Срд] (С]
37 {Ν} асуГККДР [Нур] β [Срд] 3 [ΟΤίο] [Срд] (С)
38 <14} СКНРРСРЗРЬ[С]
39 (Ν) соееее [ООгп] КАР [Нур] е [Срд] 8 [ΟΤίο] [Срд] [С)
40 (Ν) СССССО [ООгп] КНР ΐτηζ] е [Срд] 3 [ϋΤίο] [Срд] (С)
41 (Ν) ССССССК ЦЭОт] АР [Нур] С [Срд] δ [ϋΤίο] [Срд] [С]
Таблица 4Ь. Пептиды Υ1
ЗЕС1 Ю ΝΟ: Последовательность пептида Υ1
42 (Ν) ссеесккнррсгар!. [С]
Пример 6. Активность ингибирования В1 ίη уйго пептидными антагонистами В1 - конъюгированными с ПЭГ пептидами.
Пептиды и/или конъюгированные пептиды, способные селективно ингибировать активность В1 по сравнению с активностью В2, идентифицируют с использованием таких анализов, как описаны ниже в разделах А, В и С.
А. Анализ ΐη υϊΙιό функции человеческого рецептора В1 с использованием потока кальция
Активация Сч-связанного рецептора В1 приводит в результате к повышению уровня внутриклеточного кальция. Вследствие этого чувствительный к кальцию фотобелок экворин может быть использован как индикатор активации рецептора В1. Экворин представляет собой белок молекулярной массы 21 кДа, который образует биолюминесцентный комплекс при связывании с кофактором хромофора целентеразином. После связывания кальция с данным комплексом реакция окисления целентеразина приводит в результате к образованию апоэкворина, целентерамида, СО2 и света, который можно определить стандартной люминометрией.
Получена стабильная клеточная линия СНО О-/человеческого рецептора В1 (СеηΒаηк Ассеккюп по. А1238044)/экворина, и клетки поддерживают в суспензии во вращающихся флаконах, содержащих в соотношении 1:1 среды ΌΜΕΜ и НАМ Р12 (С1Ьсо 11765-047), высокую концентрацию глюкозы (С1Ьсо 11965-084), 10% инактивированную нагреванием диализованную сыворотку (С1Ьсо 26300-061), 1Х ненезаменимые аминокислоты (С1Ьсо 11140-050), 1Х глутамин-Реп (пенициллин)-81гер (стрептомицин) (С1Ьсо 10378-016) и гигромицин, 300 мкг/мл (Косйе 843555). За пятнадцать-двадцать четыре часа до люминометрического анализа 25000 клеток/лунку (2,5Е6 клеток/10 мл/планшет) помещают в 96-луночные планшеты для анализа с черными боковыми стенками и прозрачным дном (Сок!аг #3904).
Среду удаляют из лунок и заменяют 60 мкл бессывороточной среды НАМ Е12 с добавлением 30 мМ НЕРЕ8 (рН 7,5) и 15 мкМ целентеразина (Целентеразин и люциферин #90608; Аккау Эекщпк (Αηη АгЬог. М1). Затем планшеты инкубируют в течение 1,5-2 ч. Планшеты для соединения с десятью точками 1С50, содержащие разведения 1:3 или 1:5 соединений антагонистов и планшет с агонистическим активатором (20 нм дез-Агд10-Каллидина, конечная концентрация ЕС80) готовят, используя среду Хамса Е12 с
- 36 009294 добавлением 30 мМ НЕРЕ8, рН 7,5. После инкубирования целентеразина используют автоматизированную платформу экспресс-люминометра для внесения соединений антагониста В1 в планшет с клетками, камера ССЭ (камера с зарядовой связью), находящаяся под планшетом с клетками, делает 12 снимков планшета с клетками с интервалами 5 с для определения, имеется ли какая-либо агонистическая активность с соединениями. Затем в планшет с клетками добавляют агонист 11ΒΙ дез-Лг§10-Каллидин и делают еще 12 снимков для определения 1С50 антагониста(ов).
B. Анализ ίη νίίτο функции рецептора 11В2 с использованием потока кальция: Внутриклеточный поток кальция, индуцируемый активацией рецептора 1тВ2, анализируют с использованием рекомбинантной клеточной линии пВ2 (СНО-К1), приобретаемой в фирме Регк1иЕ1тег (^е11е§1еу, МА; номер по каталогу: КВНВ2СОООЕА), на ридере флуориметрического изображения для планшетов (ЕЫРЯ). Клетки культивируют в колбе Т225, содержащей питательную смесь Хамса Р12 (Ιηνίίτο^η Сотр., СаткЬаб, СА; номер по каталогу: 11765-047), 10% бычьей сыворотки эмбрионального клона II (НуС^е, Εο^η, ИТ; номер по каталогу: 8Н3006603), 1 мМ пирувата натрия (исходная концентрация 100 мМ, Ιηνίίτο^η Ρητρ., номер по каталогу: 12454-013) и 0,4 мг/мл генетицина (С418; 50 мг/мл активного генетицина, Ιηνίίτο^η, номер по каталогу: 10131-207). Среду для культивирования заменяют через день. За 24 ч до проведения анализа РМРК клетки РВ2/СНО один раз промывают РВ8 (Ιηνίίτο^η) и добавляют 10 мл Версена (1:5000, Ιηνίίτο^η, номер по каталогу: 15040-066) в каждую колбу. После инкубирования в течение 5 мин при 37°С Версен удаляют и клетки отделяют от колбы и ресуспендируют в среде для культивирования. Клетки подсчитывают, и 25000 клеток/лунку помещают в 96-луночные планшеты для анализа с черными стенками и прозрачным дном (^йат, ΛοΙοη, МА; номер по каталогу: 3904). Клетки инкубируют при 37°С в термостате с СО2 в течение ночи.
Среду отсасывают их клеток и заменяют 65 мкл буфера, нагруженного красителем. Нагруженный буфер получают разведением маточного раствора 0,5 мМ Ρ1υο-4 АМ (Μο^^^τ РгоЬек (Молекулярные зонды), Енгене, ОК), растворенного в ДМСО (диметилформамиде), содержащего 10% [мас./об.] плуроновой кислоты, до концентрации 1 мкМ в прозрачной среде Игла в модификации Дальбекко (ИМЕМ), содержащей 0,1% В8А (бычьего сывороточного альбумина), 20 мМ НЕРЕ8 и 2,5 мМ пробенецида (пробенецид ингибирует активность транспортного белка анионов и, таким образом, повышает нагрузку красителя в клетках). Клетки нагружают красителем в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток красителя удаляют двукратным промыванием клеток буфером для анализов. Буфер для анализов состоит из сбалансированного солевого раствора Хенка (НВ88), содержащего 20 мМ НЕРЕ8, 0,1% В8А и 2,5 мМ пробенецида. После циклов промывания в каждой лунке остается объем 100 мкл, и плата становится готовой для анализа в системе РМРР. Планшеты соединений антагонистов РОС с одной точкой (конечная концентрация 10 мкМ) или планшеты с десятью точками ΙΕ20 соединения, содержащие разведения 1:3 или 1:5 соединений антагонистов и планшет с активатора агониста (конечная концентрация брадикинина 0,3 нМ, ЕС80) получают при использовании буфера для анализа. Планшет с клетками и планшеты с соединением нагружают на РМРР и во время анализа чтение флуоресценции проводят одновременно со всех 96 лунок планшета с клетками. Проводят десять 1-секундных считываний для определения стабильного исходного уровня для каждой лунки, затем быстро добавляют 25 мкл из планшета с антагонистом В1 (50 мкл/с). Сигнал флуоресценции измеряют через интервалы 1 с (в течение 1 мин), а затем 6 с (в течение 2 мин) в целом в течение 3 мин с целью определения, имеется ли какая-либо агонистическая активность в отношении соединений. Затем в планшет с клетками добавляют агонист В2 брадикинина, и в течение следующих 3 мин проводят регистрацию для определения процента ингибирования при концентрации 10 мкМ (планшеты РОС) или ΙΕ'50 антагониста.
Значения ΙΕ20 для пептидов, конъюгированных с носителем или ПЭГ, тестированные в анализе с использованием экворина ЬВ1, в среднем имеют несколько пониженную активность ίη νίίτο у пептидов, конъюированных с более крупными полимерами ПЭГ. Например, пептид, представленный 8ЕО ΙΌ NΟ: 36 и его ацетилированная форма, представленная 8ЕО ΙΌ NΟ: 37, дает в результате Ιί.’50 3,0 нМ (± 5 нМ, η=8) и 3,2 нМ (± 3,2 нМ, η=9), соответственно, с рецептором ЬВ1. Однако тот же пептид, конъюгированный с ПЭГ, как описано в данном контексте, демонстрирует приблизительно 10-кратное повышение ΙΕ'50. Нативные, ацетилированные и конъюгированные с ПЭГ формы пептида неактивны до концентрации 10 мкМ в анализе ЬВ2 РМРР. Ни одно из соединения не проявляет агонистическую активность в отношении как рецептора ЬВ1, так и ЬВ2.
C. Анализы связывающих рецептор ЬВ1 пептидов ίη νίίτο на основе тканей.
Антагонистическую активность и селективность в отношении рецептора брадикинина В1 пептидов и/или конъюгированных пептидов, соответствующих настоящему изобретению, определяют с помощью нижеприведенного теста сократимости пуповинной вены человека (НИУ).
Освобожденные от эндотелия кровеносные сосуды суспендируют в ваннах для органов емкостью 20 мл, содержащих кислородосодержащий (95% О2 и 5% СО2) и предварительно нагретый (37°С) стандартный физиологический солевой раствор следующего состава (в мМ): №1С1 118,0, КС1 4,7, Мд§О4 1,2, СаС12 2,5, КН2РО4 1,2, NаНСΟз 25,0 и глюкозу 11,0 (рН 7,4). Растворы с высоким содержанием К+ (80 мМ КС1) получают посредством эквимолярного замещения №1С1 на КС1. Во всех экспериментах присут
- 37 009294 ствуют также Ное 140 (1 мкМ), мергетпа (1 мкМ) и каптоприл (10 мкМ) для блокирования рецепторов В2 и предупреждения разложения пептидов, соответственно. Ткани соединяют с датчиками с целью регистрации изометрического напряжения, затем дают уравновеситься в течение достаточного времени при оптимальном напряжении покоя. Эксперименты проводят с использованием полуавтоматизированных систем изолированных органов, каждая из которых имеет восемь ванн для органов с многоканальной регистрацией данных. Ткани сначала обрабатывают раствором с высоким содержанием К+ (80 мМ КС1) для получения контрольного сокращения. После промываний и последующего 60-минутного периода уравновешивания ткани подвергают воздействию кумулятивных возрастающих концентраций референсагониста Ьук-дезАгд9-ВК для построения кривых зависимости концентрация-ответ в отсутствие (контрольные препараты) или в присутствии различных тест-соединений или референс-антагониста ЬукдезАгд9[Ьеи8]-ВК (тест-препараты), которые добавляют за 15 мин до воздействия Ьук-дезАгд9-ВК. Кривую зависимости концентрация-ответ для Ьук-дезАгд9-ВК строят для каждого препарата.
Измеряемым параметром является максимальное изменение напряжения, индуцированное каждой концентрацией агониста, и результаты выражают как процент от контрольных ответов на КС1. Значения ЕС50 агониста (концентрация, дающая полумаксимальный ответ) вычисляют с помощью линейнорегрессионного анализа его кривых зависимости концентрация-ответ. Антагонистические активности тест-соединений и Ьук-дезАгд9[Ьеи8]-ВК оценивают в показателях значений рА2 (-1од концентрация, дающая двукратный сдвиг в правую сторону кривой зависимости концентрации агониста-ответа), которые рассчитывают согласно работам Vаη Воккит (см. монографию Vап Воккит 1. М., Сити1аЬуе бокегекроике сшуек. II. Тес11шс.|ие Гог 111е такшд оГ боке-гекроике сшуек т 1ко1а1еб огдаик аиб 111е еуа1иаЬои оГ бгид рагате1егк. (Кривые зависимости кумулятивная доза-ответ. II. Методика получения кривых зависимости доза-ответ в изолированных органах и оценки параметров лекарственных препаратов), АгсЬ. ШБ РЬагтасобуи. ТЬег., 143:299-330, (1963)). Значения рА2 рассчитывают, используя только концентрации антагонистов, которые вызывают существенный сдвиг вправо кривой зависимости концентрация агониста-ответ. Значения рА2 приведены как среднее ± к.е.т. (стандартная ошибка) по трем определениям.
Статистическая значимость разницы определяют, используя критерий Стьюдента и значения р<0,05 считают статистически значимыми.
Ό. Активность ингибирования В1 пептидов и/или конъюгированных пептидов ш уйго.
Эффективность пептидов и/или конъюгированных пептидов как ингибиторов активности В1 (т. е. нейтрализации В1) можно также оценить измерением способности каждого пептида и/или конъюгированного пептида блокировать стимулируемые В1 СОВР и высвобождение субстанции Р, а также передачу сигнала кальция в культурах нейронов ганглиев задних корешков спинного мозга (ЭВО).
Культуры нейронов ганглиев задних корешков. Ганглии задних корешков препарируют один за другим в асептических условиях из всех спинальных сегментов 19-дневных крысиных эмбрионов (Е19), которые хирургическим путем извлекают из матки беременных на определенном сроке крыс 8ргадиеЭа\\'1еу (СЬаг1ек В1уег, ЛйтшдГои, МА) под терминальной анестезией. ЭВО собирают в ледяных средах Ь-15 (О1йсоВВЬ, Огаиб Ыаиб, ΝΥ), содержащих 5% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки (О1йсоВВЬ) и удаляют всю свободную соединительную ткань и кровеносные сосуды. ЭВО дважды промывают в не содержащем Са2+- и Мд2+-забуференном фосфатом солевом растворе Дальбекко (ЭРВ8), рН 7,4 (О1йсоВВЬ). Затем ЭВО диссоциируют на суспензию отдельных клеток использованием папаиновой системы диссоциации (ЛойЫидГои Вюсйетюа1 Согр., ЕгееЬо1б, N1). Вкратце, ЭВО инкубируют в расщепляющем растворе, содержащем 20 ед./мл папаина в сбалансированном солевом растворе Игла (ЕВ88) при 37°С в течение пятидесяти минут. Диссоциацию клеток осуществляют тритурацией через отполированные огнем пастеровские пипетки в среде для диссоциации, состоящей из МЕМ/Хамса Е12, 1:1, 1 мг/мл овомукоидного ингибитора и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% дезоксирибонуклеазы I (ДНазы). Диссоциированные клетки осаждают при 200 х д в течение пяти минут и ресуспендируют в ЕВ88, содержащей 1 мг/мл овомукоидного ингибитора, 1 мг/мл овальбумина и 0,005% ДНазы. Клеточную суспензию центрифугируют в градиентном растворе, содержащем 10 мг/мл овомукоидного ингибитора, 10 мг/мл овальбумина при 200 х д с течение шести минут для удаления клеточного дебриса, а затем фильтруют через 88 мкм нейлоновое сито (Е1кЬег 8с1еиГШс, РйГкйигдЬ, РА) для удаления каких-либо комков. Число клеток определяют с помощью гемоцитометра, и клетки высевают в покрытые полиорнитином (100 мкг/мл) (81дта, 8Б Ьошк, МО) и мышиным ламинином (1 мкг/мл) (ОЛсоВВЬ) 96-луночные планшеты при концентрации 10х103 клеток/лунку в полную среду. Полная среда состоит из минимальной основной среды (МЕМ) и Хамса Е12, 1:1, пенициллина (100 ед./мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и 10% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки (О1йсоВВЬ). Культуры содержат при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности. Для контроля роста клеток, отличных от нейронов, в среду включают 5-фтор-2'дезоксиуридин (75 мкМ) и уридин (180 мкМ).
Обработка В1 и пептидами против В1 и/или конъюгированными пептидами против В1. Через два часа после посева клетки обрабатывают рекомбинантным человеческим β-В 1 или рекомбинантным крысиным β-В I в концентрации 10 нг/мл (0,38 нМ). Положительные контроли, содержащие серийно разведенное антитело против В1, (В & Ό 8ук1етк, МшиеароНк, М^ вносят в каждый планшет для культиви
- 38 009294 рования. Тест-пептиды или конъюгированные тест-пептиды (например, из примера 1) добавляют в десяти концентрациях, используя 3,16-кратные серийные разведения. Все образцы разводят в полной среде перед добавлением в культуры. Время инкубирования, как правило, составляет около 40 ч до измерения экспрессии ΥΚ1.
Измерение экспрессии УК1 в нейронах ЭКС. Культуры фиксируют 4% параформальдегидом в сбалансированном солевом растворе Хенка в течения пятнадцати минут, блокируют с помощью 8ирегЫоск (Р1егсе, КоскГогб, Ш) и повышают проницаемость мембраны с помощью 0,25% №шбе! Р-40 (81дта) в Трис НС1 (81§та)-забуференном солевом растворе (ТВ8) в течение одного часа при комнатной температуре. Культуры однократно промывают ТВ8, содержащим 0,1% Твин 20 (8щта) и инкубируют с кроличьими ЦС против УК1 (получены Атдеп) в течение полутора часов при комнатной температуре с последующим инкубированием Еи-меченного второго антитела против кролика (Аа11ас Оу, Тигки, Е1п1апб) в течение одного часа при комнатной температуре. Промывания ТВ8 (3 х пять минут при медленном встряхивании) используют после инкубирования с каждым антителом. К культурам добавляют усиливающий раствор (150 мкл/лунку, Аа11ас Оу). Затем сигнал флуоресценции измеряют в флуориметре с разрешением во времени (Аа11ас Оу). Экспрессию УК1 в образцах, обработанных конъюгированными с носителем пептидами, определяют сравнением со стандартной кривой титрования В1 от 0 до 1000 нг/мл. Процент ингибирования (по сравнению с максимальным возможным ингибированием) эффекта В1 на экспрессию УК1 в нейронах ЭКС определяют путем сравнения с контролями, которые не обработаны В1.
Нарушенное связывание рецептора и функциональная активность для каждого из конъюгированных с ПЭГ пептидных антагонистов В1 непосредственно связана с размером введенной группы ПЭГ и лежит в интервале ~5-200-кратного уменьшения активности. Полиглициновые линкеры из ~5-7 остатков хорошо действуют в плане сохранения функциональности, тогда как более длинные линкеры либо показывают незначительное улучшение (гибкий линкер), либо, как считают, вредят активности (жесткий линкер). Наконец, табл. 8 иллюстрирует широту данного применения на множестве различных конъюгированных с ПЭГ пептидных антагонистах В1.
Таблица 8. Аффинность связывания (К1) и функциональная активность (Κ''50) пептидных и ПЭГилированных пептидных антагонистов в отношении человеческого рецептора В1 (НВ1)
ПЭГ-активиров энный реагент Пептидов/ ПЭГ Пептид (ХЪ-СГЪо или 1 Ю ЬВ1 (нМ) 1С50 Ι1Β1 (нМ)
МеО-20К- малеимид3 1 ЗЕО Ю N0: 28 114 110
МеО-20Кмалеимид3 1 5ЕО Ю ΝΟ: 29 252 237
МеО-20Кмалеимид3 1 8 ЕС! Ю N0: 30 230 61
МеО-20Кмалеимид3 1 8Е0 Ю ΝΟ: 29+42 22 54
МеО-20К- малеимид3 1 5ЕО Ю ΝΟ: 32 9 69
МеО-20К- малеимид3 1 8Е<Э Ю N0: 33 75 98
МеО-20Кпропионовый альдегид 1 8ЕО Ю N0: 13 1 35
- 39 009294
Малеимид-20К- малеимиДа 2 ЗЕО Ю ΝΟ: 33 11 77
МеО-20К ЗРАС 1 ЗЕО Ю ΝΟ: 13 10 52
Тетракис-20К-ЗР Ас 4 ЗЕО Ю ΝΟ: 13 0,14 10
Тетракис-20К-5Р Αΰ 4 ЗЕО Ю ΝΟ: 13 0,14 10
отсутствует нет ЗЕО Ю ΝΟ: 13 0,10 0,5
отсутствует нет ЗЕО Ю ΝΟ: 15 0,19 1
отсутствует нет ЗЕО Ю ΝΟ: 49 0,77 0,5
отсутствует нет ЗЕО Ю ΝΟ: 50 0,2 6
отсутствует нет ЗЕО Ю N0: 22 0,38 2
отсутствует нет ЗЕО Ю ΝΟ: 37 0,8 1
a. Получено способом с использованием одной емкости, описанным в схеме 4;
b. Восстановительное аминирование на Ν-концевом остатке, ε-амин;
c. Ацилировано на Ν-концевом остатке, ε-амин;
б. Ацилировано на Ν-концевом остатке, α-амин;
Пример 7. Определение стабильности пептидов и/или конъюгированных пептидов.
A. Анализ микроворсинок щеточной каемки почки крысы.
Оболочки почек получают согласно способу, описанному Воо111 е! а1. (см. ВюсйетЫ 1оита1, 142:575, (1974). Концентрации белка определяют по методике ВгабТогб (см. Ат1. Вюсйетщйу., 72:248254, (1976)).
B. Анализ гомогената легкого крысы или человека 89.
Легкое крысы или человека получают, как описано в статье 8к1бде1 е! а1. (ВюскетЫ Ркагтасо1оду. 33:3471, (1984)).
Тест-соединения готовят в концентрации 1 мМ в растворе РВ8 (рН = 7,1). Тест-соединения добавляют к препарату ткани, полученному способом А или В (конечная концентрация белка 2 мг/мл) и инкубируют при 37°С. В различные моменты времени белок осаждают ацетонитрилом, 0,1 М НС1 в ацетонитриле или 10% ТФА в воде. Осадок удаляют центрифугированием и фильтрат дополнительно фильтруют через мембрану 0,1 мкМ. Затем образец анализируют ВЭЖХ с обращенной фазой (4,6 х 300 мм №сарак НК С18 ^а!ега Со^ро^аΐ^оη, Мбкогб, МА), скорость потока = 1 мл/мин, линейный градиент от 10% АСN (ацетонитрила) (0,1% муравьиной кислоты)-90% воды (0,1% муравьиной кислоты) до 50% АСN (0,1% муравьиной кислоты)-50% воды (0,1% муравьиной кислоты) в течение 20 мин при детекции массспектрометрией. Концентрацию тест-соединения во время Т относительно внутреннего стандарта доводят до потери функции первого порядка ([соединение |, = [соединение]0 (1-е(-к!)); [соединение]0 и [соединение]/' означают концентрацию тест-соединения во время ноль и концентрацию тест-соединения во время отбора образца, соответственно; вариабельное ΐ означает время отбора образца для анализа, и к означает скорость изменения концентрации тест-соединения. Вариабельное к определяют с использованием нелинейного регрессионного подхода, обеспеченного пакетом статистических программ ДМР. Исходя из того, что концентрация тест-соединения снижается в течение времени, значения к являются отрицательными. Полупериод существования рассчитывают на основании модельных значений к, используя следующую формулу: Т 1/2 = (Ьп 2)/к.
Пример 8. Антиноцицептивная активность ίη у1уо пептидов против В1 и конъюгированных с носителем пептидов против В1 на моделях боли на крысах и обезьянах.
А. Модель невропатической боли на крысах.
Самцов крыс 8ргадие Иате1еу (200 г) анестезируют посредством ингаляционной анестезии изофлураном и левые поясничные спинномозговые нервы на уровне Ь5 и Ь6 туго лигируют (шелковая шовная нить 4-0) дистально относительно ганглиев задних корешков и перед входом в седалищный нерв, как
- 40 009294 впервые описано К1т и Сйипд (статья Ап схрсптсп1а1 тобс1 Гог рспрйсга1 псигораШу ргобиссб Ьу ведтсп1а1 врта1 пегус Идайоп т Фе га! (Экспериментальная модель периферической невропатии, полученная сегментарным лигированием спинномозговых нервов у крыс), Раш, 50:355-363, (1992)). Разрезы зашивают, и крысам дают выздороветь. Данная процедура приводит в результате к механической (тактильной) аллодинии в левой задней лапе, как оценивают путем регистрации давления, при котором поврежденная лапа (находящаяся на той же стороне тела, что область повреждения нерва) отдергивается от градуированных стимулов (нити фон Фрея в интервале от 4,0 до 148,1 мН), накладываемые перпендикулярно плоской поверхности лапы (между подушечками лап) через проволочные клетки для наблюдения. Пороговое значение отдергивания лапы (Р^Т) определяют путем последовательного увеличения или снижения силы стимула и анализа данных по отдергиванию с использованием непараметрического теста Диксона, как описано в статье Сйар1ап 8.В. с! а1. (ОнапШаРус аввеввтеп! оГ 1асП1с а11обуша ш !йс га! ра\у (Количественная оценка тактильной аллодинии в лапе крысы), Е ЫсиговсЕ Мс!й., 53:55-63,(1994)).
Нормальные крысы и крысы после имитации хирургической операции (нервы изолированы, но не лигированы) выдерживают давление по меньшей мере 148,1 мН (эквивалентно 15 г) без реакции. Крысы с лигированным спинномозговым нервом реагируют на такое маленькое давление на поврежденную лапу, как 4,0 мН (эквивалентно 0,41 г). Крыс включают в исследование только, если у них не проявляется двигательное нарушение (например, волочение или отвисание лапы) и их Р\УТ составляет ниже 39,2 мН (эквивалентно 4,0 г). По меньшей мере через семь дней после хирургического вмешательства крыс лечат тест-пептидами или конъюгированными с носителем тест-пептидами (обычно скрининговая доза составляет приблизительно 1 мг/кг и приблизительно 60 мг/кг, соответственно) или контрольным разбавителем (РВ8) однократно путем подкожной инъекции, и Р\УТ определяют каждый день после 7 дней.
B. Модель воспалительной боли с использованием СЕА на крысах.
Самцов крыс 8ргадис ИаМсу (200 г) подвергают легкой анестезии посредством ингаляционной анестезии изофлураном и в левую заднюю лапу инъекционной вводят полный адъювант Фрейнда (СЕА), 0,15 мл. Данная процедура приводит в результате к механической (тактильной) аллодинии в левой задней лапе, как оценивают путем регистрации давления, при котором поврежденная лапа отдергивается от градуированных стимулов (нити фон Фрея в интервале от 4,0 до 148,1 мН), накладываемые перпендикулярно плоской поверхности лапы (между подушечками лап) через проволочные клетки для наблюдения. Р\УТ определяют путем последовательного увеличения или снижения силы стимула и анализа данных по отдергиванию с использованием непараметрического теста Диксона, как описано в статье Сйар1ап с! а1. (1994). Крыс включают в исследование только, если у них не проявляется двигательное нарушение (например, волочение или отвисание лапы) или порванная кожа, и их Р\УТ составляет ниже 39,2 мН (эквивалентно 4,0 г). По меньшей мере через семь дней после инъекции СЕА крыс лечат тест-пептидами и/или конъюгированными с носителем тест-пептида ми (обычно скрининговая доза составляет 60 мг/кг) или контрольным раствором (РВ8) однократно путем подкожной инъекции, и Р\УТ определяют каждый день после 7 дней. Среднее пороговое значение отдергивания лапы (Р\УТ) превращают в процент максимально возможного эффекта (% МРЕ), используя следующую формулу: %МРЕ = 100 * (Р\УТ леченых крыс Р\УТ контрольных крыс)/(15 - Р\УТ контрольных крыс). Таким образом, отсекающая величина 15 г (148,1 мН) эквивалентна 100% МРЕ и контрольная реакция эквивалентна 0% МРЕ.
Предпочтительные пептиды и конъюгированные с носителем пептиды, соответствующие настоящему изобретению, как ожидают, дают антиноцицептивный эффект, связанный с РИ при скрининговой дозе приблизительно 1 мг/кг и приблизительно 60 мг/кг, соответственно.
C. Модель воспаления с использованием ЬР8 на зеленых мартышках.
Эффективность пептидов и/или конъюгированных пептидов как ингибиторов активности В1 можно оценить на самцах зеленых мартышек (Ссгсорййассив асбиорв 8! Кй1в), которым местно введены агонисты В1, в основном, как описано в статье бе В1о1в и Ногйск (см. ВгШвй 1оигпа1 оГ Рйагтасо1оду, 132:327335, (2002)), которая таким образом включена в виде ссылки во всей своей полноте).
Для того чтобы определить, подавляют ли пептидные антагонисты, конъюгированные с ПЭГ, соответствующие настоящему изобретению, вызываемый В1 отек, нижеописанные исследования проводят на самцах зеленых мартышек (Ссгсорййассив асбиорв 8! Κίΐΐβ) на экспериментальной ферме СапЬЬсап Рпта!св Ь!б. (8! Кй!в, \Усв1 1пбюв). Процедуры описаны и приняты Комитетами по защите животных СВСНИМ (Мопйса1, Сапаба) и СапЬЬсап Рпта1св Ь!б. (8! Кй!в, \Усв1 1пб1св). Животных массой тела 6,0 ± 0,5 кг (п=67) анестезируют (50 мг кетамина кг-1) и предварительно однократно делают внутривенную инъекцию ЬР8 (90 мкгкг1) или солевого раствора (1 мл) через подкожную вену.
1. Исследования воспаления.
Вызываемый кинином отек оценивают с помощью анализа кожной складки на животе (см. статью 8с1Ьсггав с! а1., 1987). Вкратце, анестезированным обезьянам инъекционно вводят каптоприл (1 мг кг-1 за 30 мин. до проведения анализа). Однократную подкожную инъекцию бКЭ, ВК или носителя (2 мМ амастатина в 100 мкл лактата Рингера) делают в область живота и мониторируют увеличение толщины кожных складок в течение 30-45 мин, используя калиброванный кронциркуль. Результаты выражают как разницу между толщиной кожной складки до и после подкожной инъекции. Каптоприл и амастатин используют для уменьшения разложения кининов на карбоксильном и аминоконце, соответственно.
- 41 009294
Анализ антагонистов 8СШЬП
Зависимость доза-ответ для вызываемого 6ΚΌ (1-100 нмоль) отека определяют через 24 ч после ЬР8 в присутствии или в отсутствие различных концентраций ПЭГ-пептидного антагониста. ВК (30 нмоль) используют в качестве положительного контроля.
Действие антагониста во времени
Ход ингибирования посредством антагониста во времени определяют через 4, 24, 48, 72 и/или 96 ч после однократного болюсного введения. ВК (30 нмоль) используют в качестве положительного контроля.
Лекарственные препараты
Кетамина гидрохлорид, ЬР8, амастатин и каптоприл получают из фирмы 8ί§ιηα (МО, и.δ.А.). Все пептиды получают из фирмы Рйоешх Рйаттасеийсай (СА, И.8.А.).
Статистика
Значения представляют как среднее ± стандартная ошибка среднего (з.е.т.). В исследовании отека толщину кожной складки до инъекции вычитают из значений, полученных после подкожного введения. Аппроксимацию кривых и вычисления ЕС50 получают с использованием программы Эе11а СгарЬ 4.0 для компьютеров Арр1е. Данные сравнивают с помощью двухфакторной дисперсии с последующим использованием непарного одностороннего критерия Стьюдента с коррекцией Бонферрони. р < 0,05 рассматривают как статистически значимое.
Введение ЬР8 зеленым мартышкам повышает от нулевого уровня их чувствительность к агонисту рецептора В1 в анализе образования отека. Для сравнения ответы на агонист ΒΚ рецептора В2 не затронуты.
Неожиданно показано, что однократная подкожная доза в концентрации 10 мг/кг репрезентативного конъюгированного с ПЭГ пептида молекулярной массы 5 кДа и с ПЭГ пептида молекулярной массы 20 кДа одного и того же пептидного аналога достаточна для облегчения предварительно полученного вызываемого агонистом В1 воспалительного ответа и подавляет последующие ежедневные ведения агониста на 3 и 4 дня, соответственно. Тахифилаксию не отмечают при введении В1 в период до 96 ч. Определяют также, что эффект является селективным в отношении В1, а не В2. Кроме того, конъюгат ПЭГ 5Κ подавляет отек в ответ на введение 6ΚΌ более длительно, чем неконъюгированный (т.е. нативный) пептид, хотя быстрое начало и эффективность сравнимы у обоих молекул в период до 1,25 ч.
Пример 9. Исследования фармакокинетики на крысах.
Различные пептиды или конъюгированные пептиды (в водной среде) дозированно вводят как болюс самцам крыс 8ргадие Оа\\1еу внутривенным (ίν) или подкожным (зс) способом. Образцы крови отбирают в различные моменты времени (например, 0, 15, 30 мин и/или 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84, 96, 120, 240 и/или 320 ч после инъекции) в гепаринизированные пробирки. Плазму удаляют из осажденных клеток посредством центрифугирования и либо замораживают, либо немедленно обрабатывают. Соединение, представляющее интерес, количественно определяют в плазме способами аналитспецифической ЬС-Μδ/Μδ (жидкостная хроматография-масс-спектрометрия/масс-спектрометрия) или ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ). Различные стандартные фармакокинетические параметры, такие как клиренс (СЬ), выраженный клиренс (СЬ/Е), объем распространения (Узз), среднее время пребывания (МВТ), площадь под кривой (АИС) и конечный полупериод существования (11/2) рассчитывают неразделяющим методом (например, см. табл. 9).
Таблица 9. Фармакокинетические исследования пептидных и ПЭГилированых пептидных антагонистов В на крысах
ПЭГ-активированный реагент Пептид ов/ПЭГ Пептид ^1/2 (час.) дис ο-ϊηί
МеО-20К-малеимид® 1 ЗЕС) Ю ΝΟ: 33 28387
МеО-20К-пропионовый 1 5ЕО Ю ΝΟ: 13 33,7° 16877°
альдгидь
- 42 009294
Малеимид20К-малеимида 2 ЗЕО Ю N0: 33 25,6е 28580е
МеО-20К 8 РА® 1 ЗЕО Ю N0:13 27,3е 10701е
Т етракис-20К-ЗРА® 4 ЗЕО Ю N0: 13 28,7е 8475е
Тетракис-20К-ЗРА* 4 ЗЕО Ю ΝΟ: 13 30,8е 63239е
Отсутствует Нет ЗЕО Ю ΝΟ: 13 1,2® 255«
Отсутствует Нет ЗЕО Ю N0: 15 2,76е 7720е
Отсутствует Нет ЗЕО Ю N0: 13 0,6й 9
Отсутствует Нет ЗЕО Ю N0: 49 1,0' 13862'
Отсутствует Нет ЗЕО Ю N0: 50 2,0' 5529'
Отсутствует Нет ЗЕО Ю N0: 22 1,0' 7891'
Отсутствует Нет ЗЕО Ю N0: 37 0,4' 1122'
Отсутствует Нет ЗЕО Ю ΝΟ: 37 0,6° 18288«
a. Получено способом с использованием одной емкости, описанным в схеме 4;
b. Восстановительное аминирование на Ν-концевом остатке, ε-амин;
c. 1 трк кс(минимальная подавляющая концентрация, подкожно);
б. Ацилировано на Ν-концевом остатке, ε-амин;
е. 0,5 трк кс;
£. Ацилировано на Ν-концевом остатке, α-амин;
д. 30 трк кс; к: 1 трк ίν (внутривенно); и ί: 3 трк ίν
Следует иметь в виду, что в изобретении, как описано выше, могут быть сделаны различные модификации. В соответствии с этим объем изобретения определен следующей формулой изобретения.

Claims (53)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТНИЯ
    1. Конъюгат антагониста В1 рецептора брадикинина, который представляет собой химическое соединение формулы
    Ε-Ι^1)- (Υ’Η где
    X1 и Υ1 независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ь'-Р1 и -Ь2-Р2 соответственно;
    Е означает носитель, ковалентно связанный с X1 или Υ1;
    Ь1 и Ь2 независимо друг от друга отсутствуют или означают линкеры, содержащие от 0 до 9 остатков аминокислот;
    п означает от 0 до 3 и
    Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты В1 рецептора брадикинина, или его физиологически приемлемую соль.
  2. 2. Конъюгат антагониста В1 рецептора брадикинина, который представляет собой химическое соединение формулы
    Ε'-Κζ, где
    Е' означает мультивалентный носитель;
    Я независимо означает при этом Я ковалентно связан с Е';
    X1 и Υ1 независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ц-Р1 и -Ь2-Р2 соответственно;
    Ь1 и Ь2 независимо друг от друга отсутствуют или означают линкеры, содержащие от 0 до 9 остат
    - 43 009294 ков аминокислот;
    η означает 0-3;
    Ζ означает 2-8 и
    Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты В1 рецептора брадикинина, или его физиологически приемлемую соль.
  3. 3. Конъюгат по любому из пп.1-2, в котором Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты В1 рецептора брадикинина, выбранные из группы пептидов, имеющих аминокислотные последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 5-26, 43-60, и его производные.
  4. 4. Конъюгат по любому из пп.1-2, в котором X1 означает пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 27-41, и их производные.
  5. 5. Конъюгат по любому из пп.1-2, в котором η означает 1 и Р2 означает пептид, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 42.
  6. 6. Конъюгат по любому из пп.1-2, в котором η означает 0.
  7. 7. Конъюгат по любому из пп.1-2, в котором Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты, выбранные из группы пептидов с общей формулой \11-а а' а2а3а4а5а6а7а8а9а10а11 а а';а -СС)С)11, где а0 представляет собой основную или нейтральную ароматическую, алифатическую, гетероциклическую или алициклическую аминокислоту, основной дипептид или отсутствует;
    а1, а2, а3 и а4 независимо друг от друга представляют собой основные или нейтральные ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты;
    а6 представляет собой 8ег;
    а5, а7 и а8 независимо друг от друга означают ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты при условии, что меньшей мере одна из а5, а7 и а8 выбрана из С1д, Срд, 1д1а, 1д1Ь, №да и №дЬ в Ό- или Ь-конфигурации; и
    9 10 11 12 13 14 а , а , а , а , а и а независимо друг от друга означают природную аминокислоту или отсутствуют.
  8. 8. Конъюгат по п.7, в котором а0 представляет собой основную аминокислоту или основной дипептид либо отсутствует;
    а1 означает основную аминокислоту или основной дипептид;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает 61у;
    а5 означает инданиламинокислоту;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает Э-инданиламинокислоту;
    а8 означает Срд и а9, а10, а11, а12, а13 и а14 независимо друг от друга означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
  9. 9. Конъюгат по п.7, в котором а0 означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Агд, Ό-Агд, Οτη, Ό-Οτη, Ьу5, ЭЬу5 или дипептида, состоящего из двух аминокислот, независимо друг от друга выбранных из группы, состоящей из Агд, Ό-Агд, Οτη, Ό-Οτη, Ьу5 или Э-Ьук;
    а1 означает Агд;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает 61у;
    а5 означает Срд;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает ΌΤίο и а8 означает Срд.
  10. 10. Конъюгат по п.7, в котором а0 означает Ьук-Ьук;
    а1 означает Агд;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает 61у;
    а5 означает 1д1Ь;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает Э1д1Ь и а8 означает Οίο.
  11. 11. Конъюгат по п.7, в котором
    - 44 009294 а0 означает ЭАгд;
    а1 означает Агд;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает О1у;
    а5 означает 1д1;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает Э1д1 и а8 означает О1с.
  12. 12. Конъюгат по любому из пп.1-2, в котором Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты из группы пептидов, определенных формулой \11-а а' а2а3а4а5а6а7а8а9а10ап а12а13а14-СООН, где а0 отсутствует или представляет собой основную аминокислоту или основной дипептид;
    а1 означает Агд;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Рго;
    а4 означает О1у;
    а5 означает Ме-РНе;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает Ο-β-\η1; и а8 означает Не; и а9, а10, а11, а12, а13 и а14 независимо друг от друга означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
  13. 13. Конъюгат по любому из пп.1-2, в котором Ь1 представляет собой пептидильный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ \О: 61-8ЕЦ ΙΌ \О: 66.
  14. 14. Конъюгат по п.3, в котором Ь1 представляет собой пептидильный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ \О: 61-8ЕЦ ΙΌ \О: 66.
  15. 15. Способ лечения, предупреждения или облегчения заболевания или состояния, ассоциированного или опосредованного активностью В1 рецептора брадикинина, заключающийся во введении человеку или животному терапевтически эффективного количества конъюгата по любому из пп.1-2.
  16. 16. Способ лечения, предупреждения или облегчения заболевания или состояния, ассоциированного или опосредованного активностью В1 рецептора брадикинина, заключающийся во введении человеку или животному терапевтически эффективного количества конъюгата по п.3.
  17. 17. Способ по п.15, в котором заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительной боли, острой боли, зубной боли, боли в спине, боли в нижнем отделе спины, травматической боли, боли при хирургическом вмешательстве, воспалительных кишечных нарушений, астмы и аллергического ринита.
  18. 18. Способ по п.16, в котором заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительной боли, острой боли, зубной боли, боли в спине, боли в нижнем отделе спины, травматической боли, боли при хирургическом вмешательстве, воспалительных кишечных нарушений, астмы и аллергического ринита.
  19. 19. Фармацевтическая композиция, проявляющая антагонистическую активность в отношении В1 рецептора брадикинина, включающая конъюгат по любому из пп.1-2 в эффективном количестве и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.
  20. 20. Конъюгат антагониста В1 рецептора брадикинина, который представляет собой химическое соединение формулы
    Р-[(Х1)-(¥1)п], где
    X1 и Υ1 независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ь'-Р1 и -Ь2-Р2 соответственно;
    Р означает ПЭГ, ковалентно связанный с X1 или Υ1;
    Ь1 и Ь2 независимо друг от друга отсутствуют или означают линкеры, содержащие от 0 до 9 остатков аминокислот;
    п означает от 0 до 3 и
    Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1 или его физиологически приемлемая соль.
  21. 21. Конъюгат по п.2, в котором Р' означает мультивалентный ПЭГ.
  22. 22. Конъюгат по любому из пп.20-21, в котором Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты рецептора брадикинина В1, выбранные из группы пептидов, имеющих аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ \О\О: 5-60, и их производных.
  23. 23. Конъюгат по п. 21, в котором X1 означает пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ \О\О: 27-41, и их производных.
    - 45 009294
  24. 24. Конъюгат по п.21, в котором η означает 0 и Ζ означает 2-8.
  25. 25. Конъюгат по п.24, в котором Ζ означает 4.
  26. 26. Конъюгат антагониста В1 рецептора брадикинина, который представляет собой химическое соединение формулы
    Ρ-[(Χ1)-(Υ1)η], где
    X1 и Υ1 независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ь'-Р1 и -Ь2-Р2 соответственно;
    Р означает носитель, ковалентно связанный с Χ1 или Υ1;
    Ь1 и Ь2 независимо друг от друга отсутствуют или означают линкеры, содержащие от 0 до 9 остатков аминокислот;
    η означает от 0 до 3; и
    Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты из группы пептидов, определен-
    ных формулой \11-а а'а2а3а4а5а6а7а8а9а10а11 α αΉ -ίΌΟΙ 1,
    где а0 представляет собой основную или нейтральную ароматическую, алифатическую, гетероциклическую или алициклическую аминокислоту, основной дипептид или отсутствует;
    а1, а2, а3 и а4 независимо друг от друга представляют собой основные или нейтральные ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты;
    а6 представляет собой 8ег;
    а5, а7 и а8 независимо друг от друга означают ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты при условии, что по меньшей мере одна из а5, а7 и а8 выбрана из СЬд. Срд, Ιβίη, Ι^ίϋ, Νί§;·ι и Νί§ό в Ό- или Ь-конфигурации; и
    9 10 11 12 13 14 а , а , а , а , а и а независимо друг от друга означают природную аминокислоту или отсутствуют, или его физиологически приемлемую соль.
  27. 27. Конъюгат антагониста В1 рецептора брадикинина, который представляет собой химическое соединение формулы
    Ρ'-Βζ, где
    Р' означает мультивалентный носитель;
    В независимо означает -(Χ1)-(Υ1)η, при этом В ковалентно связан с Р';
    X1 и Υ1 независимо друг от друга означают пептиды формулы -Ь'-Р1 и -Ь2-Р2 соответственно;
    Ь1 и Ь2 независимо друг от друга отсутствуют или означают линкеры, содержащие от 0 до 9 остатков аминокислот;
    η означает 0-3;
    Ζ означает 2-8 и
    Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты из группы пептидов, определен-
    ных формулой ΝΗ^η1 а2а3а4а5а6а7а8а9а10ап а12а13а14-СООН,
    где а0 представляет собой основную или нейтральную ароматическую, алифатическую, гетероциклическую или алициклическую аминокислоту, основной дипептид или отсутствует;
    а1, а2, а3 и а4 независимо друг от друга представляют собой основные или нейтральные ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты;
    а6 означает 8ег;
    а5, а7 и а8 независимо друг от друга означают ароматические, алифатические, гетероциклические или алициклические аминокислоты при условии, что меньшей мере одна из а5, а7 и а8 выбрана из Сйд, Срд, Ιβία, Ιβίό, Νί§α и Νί§ό в Ό- или Ь-конфигурации; и
    9 10 11 12 13 14 а , а , а , а , а и а независимо друг от друга означают природную аминокислоту или отсутствуют, или его физиологически приемлемую соль.
  28. 28. Конъюгат по любому из пп.26-27, в котором а0 представляет собой основную аминокислоту или основной дипептид либо отсутствует;
    а1 означает основную аминокислоту;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает С1у;
    а5 означает инданиламинокислоту;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает Ό-инданиламинокислоту;
    а8 означает Срд и
    - 46 009294
    9 10 11 12 13 14 а , а , а , а , а и а в каждом случае независимо друг от друга означают аминокислоту или отсутствуют.
  29. 29. Конъюгат по любому из пп.26-27, в котором а0 означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Агд, Ω-Агд, Ογπ, Ω-Ογπ, Ьу8, ОЬук или дипептида, состоящего из двух аминокислот, независимо друг от друга выбранных из группы, состоящей из Агд, Ω-Агд, Ογπ, Ω-Ογπ, Ьу§ или ОЬук;
    а1 означает Агд;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает С1у;
    а5 означает Срд;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает ΩΤίο; и а8 означает Срд.
  30. 30. Конъюгат по любому из пп.26-27, в котором а0 означает Ω-Агд или дипептид, выбранный из группы, состоящей из Ьук-Ьук, ПЬук-Ьук и ΩΟγπЬу§;
    а1 означает Агд;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает С1у;
    а5 означает ^1Ь;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает Ю1д1Ь; и а8 означает Οίο.
  31. 31. Конъюгат по любому из пп.26-27, в котором а0 означает ОАгд или дипептид Ьук-Ьук;
    а1 означает Агд;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает С1у;
    а5 означает Щ;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает Ю1д1 и а8 означает Οίο.
  32. 32. Конъюгат по любому из пп.1-2, в котором Р1 и Р2 независимо друг от друга означают пептидные антагонисты из группы пептидов, определенных формулой \Н-а а' а2а3а4а5а6а7а8а9а10а11 а' аГа -СС)С)11, где а0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Агд, Ω-Агд, Ογπ, Ω-Ογπ, Ьук, ΩΩνδ или дипептида, состоящего из двух аминокислот, независимо друг от друга выбранных из группы, состоящей из Агд, Ω-Агд, Ογπ, Ω-Ογπ, Ьу§ или ΩΩνδ;
    а1 означает Агд;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Рго;
    а4 означает С1у;
    а5 означает Ме-РНе;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает Ω-β-Νη1 и а8 означает Не.
    а9, а10, а11, а12, а13 и а14 независимо друг от друга означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
  33. 33. Конъюгат по п.32, в котором Ь1 представляет собой пептидильный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕО ΙΩ ΝΟ: 61 - 8ЕО ΙΩ ΝΟ: 66.
  34. 34. Конъюгат по п.20, в котором полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, выбранную из группы 5000, 20000, 24000, 30000, 40000 и 60000 Да.
  35. 35. Конъюгат по п.34, который может антагонистически воздействовать на активность рецептора В1 брадикинина ίη νίίΐΌ и имеет терапевтически приемлемый полупериод существования ίη νίνο в организме млекопитающих.
  36. 36. Способ лечения, предупреждения или облегчения заболевания или состояния, ассоциированного или опосредованного активностью В1 рецептора брадикинина, заключающийся во введении человеку или животному терапевтически эффективного количества конъюгата по п.34.
    - 47 009294
  37. 37. Способ по п.36, в котором заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительной боли, острой боли, зубной боли, боли в спине, боли в нижнем отделе спины, травматической боли, боли при хирургическом вмешательстве, воспалительных кишечных нарушений, астмы и аллергического ринита.
  38. 38. Фармацевтическая композиция, проявляющая антагонистическую активность в отношении В1 рецептора брадикинина, включающая конъюгат по п.34 в эффективном количестве и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.
  39. 39. Применение конъюгата по п.34 для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из воспаления, воспалительной боли, острой боли, зубной боли, боли в спине, боли в нижнем отделе спины, травматической боли, боли при хирургическом вмешательстве, воспалительных кишечных нарушений, астмы и аллергического ринита.
  40. 40. Пептидный антагонист рецептора брадикинина В1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ ΝΟΝΟ: 15-35, 39-54, его производные и физиологически приемлемые соли.
  41. 41. Пептидный антагонист рецептора брадикинина В1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ ΝΟΝΟ: 15-35 или его физиологически приемлемые соли.
  42. 42. Пептидный антагонист по п.41, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕС) ΙΌ ΝΟΝΟ: 15-26.
  43. 43. Пептидный антагонист по п.40, в котором Ν-концевая аминокислота представляет собой Όаминокислоту.
  44. 44. Пептидный антагонист по п.43, в котором Ν-концевая аминокислота выбрана из группы, состоящей из Ό-ЭаЬ, ОЬук, ОАгд и ΌΟγπ.
  45. 45. Фармацевтическая композиция, проявляющая антагонистическую активность в отношении В1 рецептора брадикинина, включающая пептидный антагонист рецептора брадикинина В1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы 8ЕЦ ΙΌ ΝΟΝΟ: 15-35 в эффективном количестве, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.
  46. 46. Способ лечения, предупреждения или облегчения заболевания или состояния, ассоциированного или опосредованного активностью В1 рецептора брадикинина, заключающийся во введении человеку или животному терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей пептидный антагонист рецептора брадикинина В1, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟΝΟ: 15-35, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.
  47. 47. Способ по п.46, в котором заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительной боли, острой боли, зубной боли, боли в спине, боли в нижнем отделе спины, травматической боли, боли при хирургическом вмешательстве, воспалительных кишечных нарушений, астмы и аллергического ринита.
  48. 48. Применение фармацевтической композиции по п.19 для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из воспаления, воспалительной боли, острой боли, зубной боли, боли в спине, боли в нижнем отделе спины, травматической боли, боли при хирургическом вмешательстве, воспалительных кишечных нарушений, астмы и аллергического ринита.
  49. 49. Применение фармацевтической композиции по п.45 для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из воспаления, воспалительной боли, острой боли, зубной боли, боли в спине, боли в нижнем отделе спины, травматической боли, боли при хирургическом вмешательстве, воспалительных кишечных нарушений, астмы и аллергического ринита.
  50. 50. Пептидный антагонист В1 рецептора брадикинина, включающий пептид Р1 с формулой \11-а а' а2а3а4а5а6а7а8а9а10ап а12а13а14-СООН, где а0 представляет собой основную аминокислоту, основной дипептид или отсутствует;
    а1 означает основную аминокислоту;
    а2 означает Рго;
    а3 означает Нур;
    а4 означает С1у;
    а5 означает Срд;
    а6 означает 8ег;
    а7 означает ЭТю;
    а8 означает Срд и а9, а10, а11, а12, а13 и а14 независимо друг от друга означают любую природную аминокислоту или отсутствуют.
  51. 51. Пептидный антагонист по п.50, где основная аминокислота означает Агд, Ьук или Н1к.
  52. 52. Пептидный антагонист по п.51, где основная аминокислота представляет собой Ό- или Ь- 48 009294 означает Агд; означает Рго; означает Ηνρ; означает 61у; означает Срд; означает 8ег; означает ЭТю; означает Срд; и
    10 11 12 13 изомер.
  53. 53. Пептидный антагонист по п.52, где а0 означает ЭЛгд Ьук;
    а1 а2 а3 а4 а5 а6 а7 а8
    9 10 11 12 13 14 а , а , а , а , а и а независимо друг от друга могут отсутствовать.
EA200600817A 2003-10-22 2004-10-22 Антагонисты в1 рецептора брадикинина (варианты), фармацевтическая композиция, лекарственное средство, способ лечения заболеваний (варианты) EA009294B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51391303P 2003-10-22 2003-10-22
US53892904P 2004-01-24 2004-01-24
US10/972,236 US7605120B2 (en) 2003-10-22 2004-10-21 Antagonists of the brandykinin B1 receptor
PCT/US2004/034976 WO2005042027A2 (en) 2003-10-22 2004-10-22 Antagonists of the bradykinin b1 receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600817A1 EA200600817A1 (ru) 2006-12-29
EA009294B1 true EA009294B1 (ru) 2007-12-28

Family

ID=34990807

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600817A EA009294B1 (ru) 2003-10-22 2004-10-22 Антагонисты в1 рецептора брадикинина (варианты), фармацевтическая композиция, лекарственное средство, способ лечения заболеваний (варианты)

Country Status (15)

Country Link
US (4) US7605120B2 (ru)
EP (1) EP1677830B1 (ru)
JP (1) JP4896728B2 (ru)
KR (2) KR100860654B1 (ru)
AU (1) AU2004285467A1 (ru)
BR (1) BRPI0415755A (ru)
CA (1) CA2545499A1 (ru)
EA (1) EA009294B1 (ru)
EC (1) ECSP066575A (ru)
ES (1) ES2395546T3 (ru)
IL (1) IL175084A0 (ru)
MA (1) MA28160A1 (ru)
NO (1) NO20062198L (ru)
SG (1) SG149872A1 (ru)
WO (1) WO2005042027A2 (ru)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2400687T3 (es) * 2004-04-23 2013-04-11 Amgen Inc. Formulaciones de liberación sostenida
US20100047338A1 (en) 2008-03-14 2010-02-25 Angela Brodie Novel C-17-Heteroaryl Steroidal CYP17 Inhibitors/Antiandrogens, In Vitro Biological Activities, Pharmacokinetics and Antitumor Activity
US20080095849A1 (en) * 2005-04-25 2008-04-24 Amgen Inc. Peptide sustained release compositions and uses thereof
MX2008013304A (es) 2006-04-20 2008-10-27 Amgen Inc Compuestos de peptido 1 tipo glucagon.
US7403325B2 (en) * 2006-05-19 2008-07-22 Xerox Corporation Electrophoretic display device
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
WO2008153967A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 Contec Therapeutics, Inc. Bk1 antagonist conjugates
US20110118219A1 (en) 2008-03-25 2011-05-19 University Of Maryland, Baltimore Novel prodrugs of c-17-heteroaryl steroidal cyp17 inhibitors/antiandrogens: synthesis, in vitro biological activities, pharmacokinetics and antitumor activity
MX345226B (es) 2008-10-29 2017-01-20 Ablynx Nv Formulaciones de moleculas de union a antigeno de dominio sencillo.
RU2553214C2 (ru) 2008-10-29 2015-06-10 Аблинкс Н.В. Способы очистки однодоменных антигенсвязывающих молекул
CN102686600A (zh) 2009-02-05 2012-09-19 托凯药业股份有限公司 甾体cyp17抑制剂/抗雄激素物质的新型药物前体
WO2010108153A2 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
WO2010110887A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Robert Shorr Fatty acids
CA2805572A1 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 Martin Hegen Modified single domain antigen binding molecules and uses thereof
EP2725034B1 (en) 2010-09-22 2019-04-03 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins with no specificity for human tissues and uses thereof
DE102011118029A1 (de) 2011-06-20 2012-12-20 Universität Leipzig Modifizierte antibiotische Peptide mit variabler systemischer Freisetzung
EP2968370A4 (en) 2013-03-14 2016-09-21 Univ Maryland AGENT FOR ANDROGEN RECEPTOR DOWNWARD CONTROL AND USES THEREOF
JP2016528252A (ja) 2013-08-12 2016-09-15 トーカイ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アンドロゲン標的治療を使用する新生物障害の処置のためのバイオマーカー
US11401303B2 (en) * 2020-06-15 2022-08-02 Taian City Qihang Biotechnology Co. Synthetic peptide BRAP and application in preparation of anti-inflammatory drug for COVID-19 thereof
CA3151034A1 (en) * 2021-03-03 2022-09-03 Kashiv Biosciences, Llc Bioassay method for compounds useful to treat pain

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2435642A1 (de) * 1974-07-24 1976-02-05 Hoffmann La Roche Traegermaterial
EP0318162A2 (en) * 1987-11-25 1989-05-31 Texaco Development Corporation Novel bismaleimide derivatives
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5834431A (en) * 1995-09-08 1998-11-10 Cortech, Inc. Des-Arg9 -BK antagonists
US5849863A (en) * 1995-09-08 1998-12-15 University Of Colorado Cytolytic bradykinin antagonists
EP0885899A1 (en) * 1996-12-16 1998-12-23 Seiko Instruments Inc. Method for obtaining peptide fragments by use of fluorinated organic acids
US6075120A (en) * 1991-04-01 2000-06-13 Cortech, Inc. Bradykinin antagonist
WO2001062827A2 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6407207B1 (en) * 1992-03-30 2002-06-18 Merck & Co., Inc. Cloned and expressed human bradykinin BK-2 receptor

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4693993A (en) 1985-06-13 1987-09-15 Stewart John M Bradykinin antagonist peptides
US4801613A (en) 1985-06-13 1989-01-31 Nova Technology Limited Partnership Bradykinin antagonist peptides
US4923963A (en) 1987-09-02 1990-05-08 Nova Technology Limited Partnership Bradykinin antagonist peptides
US5648333A (en) 1988-11-24 1997-07-15 Hoechst Aktiengesellschaft Peptides having bradykinin antagonist action
US5416191A (en) 1991-04-01 1995-05-16 Cortech, Inc. Bradykinin antagonists
WO1992018156A1 (en) 1991-04-19 1992-10-29 Nova Technology Limited Partnership Bradykinin antagonist peptides
US5521158A (en) 1992-10-08 1996-05-28 Scios Nova Inc. Pseudopeptide bradykinin receptor antagonists
US5541286A (en) 1992-10-08 1996-07-30 Scios Nova Inc. Bradykinin antagonist pseudopeptide derivatives of olefinic aminoalkanoic acids
US5955430A (en) * 1993-09-24 1999-09-21 University Of Southern California Use of angiotensin II fragments and analogs thereof in tissue repair
ATE280777T1 (de) 1994-03-09 2004-11-15 Cortech Inc Bradykinin-antagonist peptide mit n- substituierten glycinen
US5648336A (en) 1994-11-18 1997-07-15 University Of Colorado Bradykinin antagonist peptides containing indane-substituted amino acids
AU3935897A (en) 1996-08-19 1998-03-06 Universite De Sherbrooke B1-bradykinin receptor antagonists and use thereof
US5935932A (en) 1997-06-13 1999-08-10 University Technology Corporation Bradykinin antagonists containing pentafluorophenylalanine
US6388054B1 (en) 1998-08-20 2002-05-14 John M. Stewart Anti-cancer compounds
US6875741B2 (en) * 1998-09-02 2005-04-05 Renuka Pillutla Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
EP1921088B1 (en) * 2001-05-11 2014-10-08 Amgen Inc. Peptides and related molecules that bind to tall-1
US7138370B2 (en) * 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
WO2004032862A2 (en) 2002-10-09 2004-04-22 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based materials, compositions and uses related thereto
EP1603392A2 (en) * 2003-03-07 2005-12-14 The University Of Toledo Paclitaxel hybrid derivatives

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2435642A1 (de) * 1974-07-24 1976-02-05 Hoffmann La Roche Traegermaterial
EP0318162A2 (en) * 1987-11-25 1989-05-31 Texaco Development Corporation Novel bismaleimide derivatives
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US6075120A (en) * 1991-04-01 2000-06-13 Cortech, Inc. Bradykinin antagonist
US6407207B1 (en) * 1992-03-30 2002-06-18 Merck & Co., Inc. Cloned and expressed human bradykinin BK-2 receptor
US5834431A (en) * 1995-09-08 1998-11-10 Cortech, Inc. Des-Arg9 -BK antagonists
US5849863A (en) * 1995-09-08 1998-12-15 University Of Colorado Cytolytic bradykinin antagonists
EP0885899A1 (en) * 1996-12-16 1998-12-23 Seiko Instruments Inc. Method for obtaining peptide fragments by use of fluorinated organic acids
WO2001062827A2 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UniProt 'Online! 1 November 1996 (1996-11-01), "Rat T-kininogen (T-KG)." XP002314946 retrieved from EBI accession no. UNIPR0T:Q63581 Database accession no. Q63581 the whole document & ANDERSON K. P. ET AL.: "PRIMARY STRUCTURE OF A GENE ENCODING RAT T-KININOGEN" GENE (AMSTERDAM), vol. 81, no. 1, 1989, pages 119-128, ISSN: 0378-1119 *
MORPURGO M. ET AL.: "SELECTIVE ALKYLATION AND ACYLATION OF ALPHA AND EPSILON AMINO GROUPS WITH PEG N A SOMATOSTATIN ANALOGUE: TAILORED CHEMISTRY FOR OPTIMIZED BIOCONJUGATES" BIOCONJUGATE CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, WASHINGTON, US, vol. 13, 2002, pages 1238-1243, XP008040597 ISSN: 1043-1802 cited in the application Abstract; Scheme 1; Introduction, paragraph 1 and 2. *
NEUGEBAUER WITOLD ET AL.: "Kinin B1 receptor antagonists with multienzymatic resistance properties" CANADIAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY AND PHARMACOLOGY, vol. 80, no. 4, April 2002 (2002-04), pages 287-292, XP009042834 ISSN: 0008-4212 cited in the application Abstract; Table 1, 2nd, 4th and 5th peptides. *
RAYMOND P. ET AL.: "Quantification of des-Arg<9>-bradykinin using a chemiluminescence enzyme immunoassay: application to its kinetic profile during plasma activation" JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V..AMSTERDAM, NL, vol. 180, no. 2, 27 March 1995 (1995-03-27), pages 247-257, XP004021047 ISSN: 0022-1759 Abstract; p. 249; col. 1, paragraph 2. *
STEWART JOHN M. ET AL.: "Metabolism-resistant bradykinin antagonists: Development and applications" BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 382, no. 1, January 2001 (2001-01), pages 37-41, XP009042832 ISSN: 1431-6730 cited in the application Abstract; Table 1, B-9958 *
ZALIPSKY S. ET AL.: "Use (ethylene glycol) chemistry of Functionalized Poly(Ethylene Glycol)s for Modification of Polypeptides" POLY(ETHYLENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, XX, XX, 1992, pages 347-370, XP002972803 cited in the application Abstract; Introduction; Scheme 7 *

Also Published As

Publication number Publication date
SG149872A1 (en) 2009-02-27
IL175084A0 (en) 2006-08-20
US8288351B2 (en) 2012-10-16
MA28160A1 (fr) 2006-09-01
BRPI0415755A (pt) 2006-12-19
US7605120B2 (en) 2009-10-20
NO20062198L (no) 2006-07-18
US20090137483A1 (en) 2009-05-28
ECSP066575A (es) 2006-10-17
ES2395546T3 (es) 2013-02-13
AU2004285467A1 (en) 2005-05-12
KR20080015054A (ko) 2008-02-15
EP1677830B1 (en) 2012-10-17
US8278280B2 (en) 2012-10-02
US20050215470A1 (en) 2005-09-29
JP4896728B2 (ja) 2012-03-14
WO2005042027A3 (en) 2006-02-09
KR20060105757A (ko) 2006-10-11
JP2007526240A (ja) 2007-09-13
US20090048149A1 (en) 2009-02-19
EP1677830A2 (en) 2006-07-12
CA2545499A1 (en) 2005-05-12
EA200600817A1 (ru) 2006-12-29
AU2004285467A2 (en) 2005-05-12
KR100860654B1 (ko) 2008-09-26
US20090137452A1 (en) 2009-05-28
WO2005042027A2 (en) 2005-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009294B1 (ru) Антагонисты в1 рецептора брадикинина (варианты), фармацевтическая композиция, лекарственное средство, способ лечения заболеваний (варианты)
TWI482626B (zh) 胃腸道病症的治療
EA010015B1 (ru) Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов
JP6084207B2 (ja) 虚血性脳損傷及び疼痛治療用の効率的な神経保護剤としてのｐｓｄ−９５の高親和性二量体阻害剤
RU2676713C2 (ru) Терапевтические пептиды
EA020018B1 (ru) Процессированные аналоги глюкозозависимого инсулинотропного полипептида
EA010016B1 (ru) Новые модифицированные полиэтиленгликолем соединения и их применение
EA020019B1 (ru) Аналоги глюкозозависимого инсулинотропного полипептида
EA029025B1 (ru) Аналоги глюкагона, проявляющие активность на рецепторе gip
EA020005B1 (ru) Аналоги глюкозазависимого инсулинотропного полипептида
CZ20021990A3 (cs) Amfifilní polymery a polypeptidové konjugáty je obsahující
JP2011528566A (ja) アンジオポエチン由来ペプチド
US20210261612A1 (en) Llp2a-bisphosphonate conjugates for osteoporosis treatment
WO2012121058A1 (ja) 新規な架橋構造を含むｔｎｆレセプターループペプチドの模倣ペプチドを用いた医薬組成物
JP2009518308A (ja) アポトーシスを阻害するための化合物及び方法
IE912671A1 (en) Peptides
ZA200603912B (en) Antagonists of the Bradykinin B1 receptor
JP2005510469A (ja) 自己免疫疾患の治療の構想における翻訳後型修飾を含むペプチドの使用
CN111032679B (zh) 治疗癌症的肽
MXPA06004462A (es) Antagonistas del receptor b1 de bradiquinina
WO2023088236A1 (zh) Mt1-mmp的双环肽配体及其缀合物

Legal Events

Date Code Title Description
TK4A Corrections in published eurasian patents
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU