WO2012121058A1 - 新規な架橋構造を含むｔｎｆレセプターループペプチドの模倣ペプチドを用いた医薬組成物 - Google Patents

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equiv
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悠介 河野
秀司 藤田
真里 奥本
崇 中江
鈴木　秀明
美紀 前田
啓一 大谷
和広 青木
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Jitsubo株式会社
国立大学法人東京医科歯科大学
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an osteoclast growth inhibitor using a mimetic peptide of a TNF receptor loop peptide containing a novel cross-linked structure.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition using the peptide.
  • the site involved in the binding between the ligand and the receptor is identified, a peptide mimicking that part is synthesized, the function of the protein is analyzed, and the peptide as a blocking substance that inhibits the action of the protein or the protein Has attracted attention.
  • side chain-side chain cyclization or side chain-end group cyclization can be mentioned.
  • amino acid side chains that are not involved in ligand / receptor recognition can be linked to each other or to the peptide backbone.
  • terminal-terminal cyclization can be mentioned. In such a case, a completely cyclic peptide is obtained.
  • Crosslinking technology is indispensable for these cyclizations.
  • Representative examples of cyclization include crosslinking via disulfide bonds (SS bonds), amide bonds, thioether bonds, and olefin bonds. More specific examples include cyclization of two penicillamine residues linked by disulfide bridges (Mosberg et al., PNAS US, 80: 5871, 1983), and an amide bond between lysine and aspartic acid.
  • SS bonds disulfide bonds
  • amide bonds amide bonds
  • thioether bonds thioether bonds
  • olefin bonds More specific examples include cyclization of two penicillamine residues linked by disulfide bridges (Mosberg et al., PNAS US, 80: 5871, 1983), and an amide bond between lysine and aspartic acid.
  • a cyclization by formation Frlora et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.
  • Peptides with controlled conformation can be expected for many pharmacological uses.
  • problems in the development of peptides as pharmaceuticals That is, under physiological conditions, many of the peptides are degraded by specific and non-specific peptidases, resulting in poor metabolic stability, and b) because of their relatively high molecular weight, Poor absorption, c) fast excretion through the liver and kidney, and d) untargeted tissue because the peptide is structurally flexible and receptors for the peptide can be widely distributed in organisms -Undesirable side effects occur in the organ.
  • Receptor Activator of NF- ⁇ B also known as RANK, TRANCER or TNFRSF11A (tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a)
  • TNF receptor superfamily includes osteoclasts, dendritic cells, mammary epithelial cells, etc. It is expressed in.
  • RANK ligands (RANKL, or OPGL, ODF, TRANCE, and TNFSF11 (also known as TNF ligand superfamily member 11)) are TNF-like proteins that are expressed in osteoblasts, bone marrow stromal cells, T cells, and the like. ing.
  • RANK and RANKL have also been reported to be required for osteoclast differentiation, dendritic cell differentiation and mammary gland development in vivo and in vitro.
  • TNF ⁇ which belongs to the TNF family, not only works directly on bone marrow cells to promote osteoclast formation, but also works on osteoblasts to increase the level of RANKL and indirectly amplify the osteoclast-forming response of bone marrow cells. And greatly contribute to bone loss induced by ovariectomy and inflammation.
  • RANKL also increases bone resorption by osteoclasts.
  • the WP9QY peptide is a 9-amino acid cross-linked peptide having a 5-amino acid sequence resembling the sequence structure of the functional sites of the TNF receptor and RANK, and has the following structure (Japanese Patent Publication No. 2003-505503) And JP-T-2003-505514).
  • WP9QY peptide has been reported to inhibit cytotoxicity induced by TNF ⁇ (Takahashi et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15: 1266-1270). The WP9QY peptide has also been reported to block RANKL-induced signals and inhibit bone resorption and bone loss (Aoki et al., J. Clin. Invest. 2006; 116 (6): 1525-1534) .
  • a “peptidomimetic” is a compound that can mimic (agonist) or shield (antagonist) the biological effects of a peptide at the receptor level as a receptor ligand.
  • a peptidomimetic as the most likely agonist, a) metabolic stability, b) good bioavailability, c) high receptor affinity and receptor selectivity, and d) Factors such as minimal side effects need to be considered.
  • Factors such as minimal side effects need to be considered.
  • the same pharmacological considerations that should be considered for designing a peptidomimetic as an agonist above can also be applied to the design of peptide antagonists.
  • WP9QY peptide is known as a peptidomimetic that inhibits cytotoxicity induced by TNF ⁇ and inhibits bone resorption, but there is a problem that disulfide bonds are generally cleaved by reductase present in the living body. Further improved mimetic peptides were desired.
  • other cyclization forms exist, those having an amide in the cross-linking have a problem that they are cleaved by an enzyme that cleaves the amide structure existing in the living body.
  • free design of the crosslink and free change to the crosslink are desired to improve the physiological activity of the peptide, but there is a problem that it is difficult in the conventional cyclization format.
  • An object of the present invention is to provide an osteoporosis therapeutic agent comprising a WP9QY peptidomimetic having more desirable properties.
  • the present inventors synthesized a WP9QY peptide mimic having a novel cross-linked structure therein, which has osteoclast differentiation inhibitory activity and is decomposed. After confirming that the resistance to the enzyme was improved, the present invention was completed. That is, the present invention provides an osteoclast growth inhibitor using the novel WP9QY peptide mimic described below and a pharmaceutical composition containing the peptide.
  • Exemplary aspects of the invention are as follows. (1) Osteoclast growth inhibitor comprising a peptide represented by the following chemical formula
  • Z 1 and Z 3 each independently represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted acyl group having 1 to 16 carbon atoms, an unsubstituted or substituted alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and —C ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 is selected from the group consisting of polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000 Da and Z 2 is a hydroxyl group or an amino group An unsubstituted or substituted monoalkylamino group having 1 to 8 carbon atoms and a molecular weight of 100 to 10,000 Da represented by —NH—CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 Selected from the group consisting of glycol, where n is a natural number.)
  • the peptide is the peptide represented by Chemical Formula 2 of (1), and Z 1 is a hydrogen atom, an acetyl group, and —C ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) selected from the group consisting of polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 3,000 Da represented by nOCH 2 CH 2 OCH 3 (n is an integer), and Z 3 is a hydrogen atom, unsubstituted or substituted And a molecular weight of 1,000 to 1,000, represented by an acyl group having 1 to 8 carbon atoms and —C ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) nOCH 2 CH 2 OCH 3 (n is an integer)
  • Z 2 is selected from the group consisting of 3,000 Da polyethylene glycol, and Z 2 is a hydroxyl group, an amino group, and a molecular weight represented by —NH—CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) nOCH 2 CH 2 OCH 3
  • polyethylene glycol represents a polyethylene glycol having a number average molecular weight of 500 to 2000 Da, and n is an integer).
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient at least one of the peptides according to any one of (1) to (4) above.
  • Treatment of diseases selected from the group consisting of osteoporosis, Paget's disease, rheumatoid arthritis and other forms of inflammatory arthritis, osteoarthritis, prosthetic damage, osteolytic tumors, myeloma and tumor metastasis to bone The pharmaceutical composition according to (6) above, which is an agent.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a WP9QY peptidomimetic with improved properties, for example, improved resistance to peptidases or improved inhibitory activity against osteoclasts.
  • An example of the synthesis of a WP9QY peptidomimetic of the present invention is shown schematically.
  • An example of the synthesis of a WP9QY peptidomimetic of the present invention is shown schematically.
  • Synthesis examples of other WP9QY peptidomimetics of the present invention are shown schematically.
  • Synthesis examples of other WP9QY peptidomimetics of the present invention are shown schematically.
  • Synthesis examples of other WP9QY peptidomimetics of the present invention are shown schematically.
  • Synthesis examples of other WP9QY peptidomimetics of the present invention are shown schematically.
  • As a reference example a synthesis example of a WP9QY peptidomimetic having a thioether bridge is shown.
  • a synthesis example of a WP9QY peptidomimetic having an olefinic bridge is shown.
  • 3 shows the osteoclast differentiation inhibitory activity of the WP9QY peptidomimetics (Bdev-2, Bdev-5, Bdev-6, Bdev-8) of the present invention.
  • the WP9QY peptide mimic (Bdev-2, Bdev-3) of the present invention shows the osteoclast differentiation inhibitory activity.
  • 3 shows the osteoclast differentiation inhibitory activity of the WP9QY peptide mimics (Bdev-2, Bdev-25) of the present invention.
  • FIG. 3 shows the osteoclast differentiation inhibitory activity of the WP9QY peptide mimics (Bdev-2, Bdev-27, Bdev-28, Bdev-29, Bdev-30) of the present invention.
  • the result of the bone density reduction suppression test of the WP9QY peptide mimic (Bdev-2) of the present invention using a mouse model is shown.
  • n a natural number.
  • the WP9QY peptidomimetic of the present invention is a cyclic peptide, and has the same amino acid sequence as that of the WP9QY peptide in the ring, and has an —NR— bond in the crosslinked structure.
  • the WP9QY peptidomimetic of the present invention is a peptide having the following structure.
  • Z 1 and Z 3 are each independently a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted acyl group having 1 to 16 carbon atoms, an unsubstituted or substituted alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and — C ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 is selected from the group consisting of polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000 Da and Z 2 is a hydroxyl group, an amino group An unsubstituted or substituted monoalkylamino group having 1 to 8 carbon atoms, a molecular weight of 100 to 10,000 Da represented by —NH—CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 (Selected from the group consisting of polyethylene glycol)
  • Z 1 and Z 3 each independently represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted acyl group having 1 to 16 carbon atoms, an unsubstituted or substituted alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and —C ( ⁇ O) Selected from the group consisting of polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000 Da represented by —CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 , preferably a hydrogen atom, unsubstituted or substituted An acyl group having 1 to 10 carbon atoms, an unsubstituted or substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or —C ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH polyethylene glycol having a molecular weight of 300 ⁇ 5,000 Da represented by 3, more preferably a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted acyl group having 1 to 8 carbon
  • Z 2 is represented by a hydroxyl group, an amino group, an unsubstituted or substituted monoalkylamino group having 1 to 8 carbon atoms, —NH—CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 Selected from the group consisting of polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000 Da, preferably a hydroxyl group, an amino group, an unsubstituted or substituted monoalkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, —NH—CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 is a polyethylene glycol having a molecular weight of 300 to 5,000 Da, more preferably a hydroxyl group, an amino group, an unsubstituted or substituted carbon number of 1 to 4 monoalkylamino group, -NH-CH 2 CH 2 ( OCH 2 CH 2) n OCH 2 CH 2 molecular weight 500 represented by OCH 3 ⁇ 2,00 Polyethylene
  • Z 1 and Z 3 is an unsubstituted or substituted acyl group having 1 to 16 carbon atoms, an unsubstituted or substituted alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and —C ( ⁇ O) —CH. It is preferably selected from the group consisting of polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000 Da represented by 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 and the other is selected from a hydrogen atom or an acetyl group. .
  • Z 1 is a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted acyl group having 1 to 8 carbon atoms, or an unsubstituted or substituted alkyl group having 1 to 8 carbon atoms
  • Z 2 is a hydroxyl group or an amino group
  • Z 3 is —C ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 in the case of an unsubstituted or substituted acyl group having 1 to 8 carbon atoms or an unsubstituted or substituted monoalkylamino group having 1 to 8 carbon atoms.
  • Polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000 Da represented by (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 CH 2 OCH 3 is preferred.
  • substitutions to a substituted acyl group or acetyl group include alkylamino modification via a nitrogen atom and ether type substitution via an oxygen atom.
  • the substitution is not limited thereto, and a known method is used. It can be carried out.
  • “inhibition of osteoclast proliferation” used when expressing the action of the WP9QY peptidomimetic of the present invention refers to immature osteoclasts that are mature cells when the growth or proliferation of osteoclasts is inhibited. It is used to include any of the cases where it is inhibited from differentiating.
  • the WP9QY peptidomimetic of the present invention is effective for diseases involving TNF ⁇ / TNF receptors and also useful for diseases involving RANK / RANKL.
  • Diseases can include, for example, osteoporosis, Paget's disease, rheumatoid arthritis and other forms of inflammatory arthritis, osteoarthritis, prosthetic damage, osteolytic tumors, myeloma and tumor metastasis to bone, Without limitation, diseases involving TNF ⁇ / TNF receptor and / or RANK / RANKL are also included.
  • the peptide of the present invention may be a pharmaceutical composition containing any known pharmaceutically acceptable carrier.
  • the peptide of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the peptides of the present invention can be administered orally or parenterally. In the case of oral administration, it can be administered in the form of capsules, tablets, granules, liquids and the like. In the case of parenteral administration, it is administered in the form of injection solution, infusion preparation or the like.
  • the peptide of the present invention can be used alone or in combination with other osteoporosis therapeutic / prophylactic agents such as organic bisphosphonates.
  • the peptides of the present invention can be administered to, for example, humans or other warm-blooded animals (eg, rats, mice, rabbits, dogs, monkeys, etc.). Appropriate doses of the peptides of the present invention will vary depending on factors such as the disease or disorder being treated, the route of administration, the age and weight of the patient being treated.
  • the active ingredient is generally about 0.01 mg to 1000 mg, preferably about 1.0 to 200 mg per day, usually in human adults.
  • About 0.01 to 100 mg, preferably about 0.1 to 10 mg of the active ingredient is administered by intravenous injection.
  • the preparation of the present invention is preferably administered parenterally, for example, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, subcutaneously and the like.
  • KbOH 2,4-didocosyloxybenzyl alcohol
  • KaOH 3,4,5-Trioctadecyloxybenzyl alcohol
  • PPh 3 (147 mg, 0.560 mmol, 1.5 equiv) was added and stirred for 14 minutes. Furthermore, DEAD (33.7 ⁇ L, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) was added and stirred for 34 minutes. Next, PPh 3 (44.8 mg, 0.171 mmol, 0.5 equiv) was added and stirred for 2 minutes. Furthermore, DEAD (33.7 ⁇ L, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) was added and stirred for 3 hours and 15 minutes. Finally, DEAD (33.7 ⁇ L, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) was added and stirred for 21 minutes.
  • Example 10 Synthesis of Bdev-25 An outline of a synthesis route of Bdev-25 is shown in FIGS. Bdev-25 was synthesized as follows. Synthesis of Compound 41 Compound 41 was obtained in the same manner as in Synthesis Example of Compound 1 except that the starting Fmoc amino acid was changed to Fmoc-Gln (Trt) -OH (qy).
  • Example 11 Synthesis of Bdev-27, 28, 29, 30 An outline of the synthesis route of Bdev-27, 28, 29, 30 is shown in FIG. Bdev-27, 28, 29 and 30 were synthesized as follows. Synthesis of Compound 108 Compound 25 (319 mg, 0.113 mmol) was dissolved in CH 2 Cl 2 (2 mL) and Et 3 N (31.8 ⁇ L, 0.226 mmol, 2.0 equiv) and propionic anhyderide (29.1 ⁇ L, 0.226 mmol, 2.0 equiv) was added and stirred at room temperature for 45 minutes. The post-process equivalent to the synthesis
  • WP9QY peptide (disulfide bridge: compound number: STD) was used.
  • the WP9QY peptide is a process in which amino acids are sequentially condensed to 2,4 docosyloxybenzyl alcohol, a linear sequence is synthesized, a disulfide bond is formed by iodine oxidation, and 2,4 docosyloxybenzyl alcohol is cleaved with trifluoroacetic acid. It was prepared after.
  • the final concentration of peptide was 0.2 mg / ml. Thereafter, the reaction was carried out immediately at 37 ° C. 0.1 ml was sampled over time, and the reaction was stopped by adding a reaction stopping solution (25% TFA in acetonitrile 20 ⁇ L). Each sample was measured by HPLC, and peptide degradation by peptidase was measured. Sampling timing is 0 min, 0.5 min, 1 min, 2 min. If degradation of 50% or more is not obtained in 2 min, add 0.5 hr, 1 hr, 3 hr later In some cases, it was performed after 6 hours, and for peptides that were stable for a long time, sampling was performed as necessary in the range from 24 hours to 168 hours later. The time for half of the added peptide to degrade was measured. The results are shown in Table 3.
  • the WP9QY peptidomimetic of the present invention prepared according to the crosslinking method of the present invention has improved degradation resistance to peptidase compared to the WP9QY peptide of disulfide bridge or thioether bridge. .
  • Example 8 Osteoclast differentiation inhibition test
  • the osteoclast differentiation inhibitory activity of the WP9QY peptide mimic of the present invention was examined using cultured osteoclasts as follows. Bone marrow cells were collected from C57BL / 6JJc1 mice (body weight 18-20 g) purchased from autologous breeding or CLEA Japan, and RANKL (50 ng / ml, recombinant human RANKL purchased from Wako Pure Chemical Industries) and M-CSF Each medium containing (25 ng / ml, recombinant human M-CSF purchased from R & D System) (containing ⁇ -MEM, 10% FBS (SIGMA), penicillin 100U, streptomycin 100 ⁇ g / ml) Incubated for 4 days in the presence of WP9QY cross-linked peptidomimetic.
  • RANKL 50 ng / ml, recombinant human RANKL purchased from Wako Pure Chemical Industries
  • the solution prepared above was diluted with a culture medium and sterilized by filtration through a filter (0.22 ⁇ m) to obtain a peptide preparation.
  • Each peptide preparation solution was added so that it might become the target final concentration, and the bone marrow cell was cultured on the said conditions.
  • the peptide concentration was cultured such that the final concentration in the medium was 0.313 (10) ⁇ M.
  • no peptide addition and WP9QY peptide (disulfide bond) addition were used.
  • the results are shown in FIG. 8 and FIG. It was shown that Bdev-2 and Bdev-3 have a stronger osteoclast differentiation inhibitory effect than WP9QY peptide (disulfide bond) at low concentrations.
  • Example 9 Bone density decrease suppression test in mouse animal experiment
  • C57BL / 6JJcl mice (5 weeks old, male) purchased from CLEA Japan, Inc. were fed with a low-calcium diet in Metabolica to produce a low-calcium diet model mouse.
  • WP9QY and Bdev-2 were prepared daily to 0.72 mg / mL.
  • PBS (-) or peptide preparation solution (24 mg / kg) was subcutaneously administered 3 times a day for 6 days to the mice reared with metabolica.
  • As a mouse control a mouse fed with a normal diet with Metabolica was used. Bone density was evaluated with Peel Mode 20 of pQCT.
  • composition containing the mimetic peptide provided by the present invention is useful as an osteoclast growth inhibitor and further as a pharmaceutical composition for a specific disease.

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Abstract

　本発明の目的は、改善された特性を持つ新規なＴＮＦレセプターループペプチド（ＷＰ９ＱＹペプチド）の模倣ペプチドを提供することである。より具体的には、より望ましい特性を有するＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を含む骨粗鬆治療薬を提供することである。　破骨細胞の分化阻害活性をもつ、架橋構造中に－ＮＲ－を有する新規な架橋構造をもつＴＮＦレセプターループペプチドの模倣ペプチドが提供された。また、該ペプチドを用いた破骨細胞の増殖阻害剤および該ペプチドを含む医薬組成物が提供された。

Description

新規な架橋構造を含むＴＮＦレセプターループペプチドの模倣ペプチドを用いた医薬組成物
　本発明は、新規な架橋構造を含む、ＴＮＦレセプターのループペプチドの模倣ペプチドを用いた破骨細胞の増殖阻害剤に関する。本発明はまた、該ペプチドを用いた医薬組成物に関する。
　ほとんどすべての生理学的プロセスは、ペプチドまたはタンパク質および他の生物学的活性成分などの分子的認識に基づいている。今までに、ホルモン、酵素、インヒビター、酵素基質、神経伝達物質、免疫調節物質などの重要な生物学的機能を有する多くのタンパク質が発見されてきた。しかし、タンパク質は分子量が大きいがゆえに、それを合成することが困難であるばかりでなく、医薬品としての利用が困難であった。そのため、分子レベルでのその機能を解明することがなされてきている。
　生体内でのタンパク質の作用は、一般にはレセプターを介して作動される。レセプターもまたタンパク質であり、両者（リガンドおよびレセプター）の結合または接触が、生理作用に重要であると認識されている。そのため、リガンドとリセプターの結合にかかわる部位を特定し、その部分を模倣したペプチドを合成し、タンパク質の機能を分析するとともに、タンパク質に代わる作動物質あるいはタンパク質の作用を阻害する遮断物質としてのペプチドが注目されてきた。
　しかしながら、リガンド／レセプター間の結合または接触に関与する部分は、生体内では立体配置をとり、結合または接触部分のコンホメーションが重要であることが知られている。そのため、結合または接触に関与する部分のペプチドを、コンホメーションをもった状態で作製することが試みられてきた。
　ペプチドのコンホメーションにおける全体的な制御は、環化によりペプチド鎖の柔軟性を制限することにより可能である。生物活性ペプチドの環化は、その代謝安定性およびレセプターに対する選択性を改善するだけでなく、均質なコンホメーションとすることにより、ペプチドのコンホメーション分析を可能とする。環化の形態は、天然の環状ペプチドに見られるものと同じである。例えば、側鎖－側鎖の環化、または側鎖－末端基の環化をあげることができる。環化のために、リガンド／レセプター間の認識に関与しないアミノ酸の側鎖を、互いに結合させたり、またはペプチド主鎖に結合させたりできる。また別の態様としては、末端－末端の環化をあげることができ、かかる場合は、完全に環状のペプチドとなる。
　これらの環化のためには、架橋技術が欠かせないものとなっている。代表的な環化の例としては、ジスルフィド結合（ＳＳ結合）、アミド結合、チオエーテル結合、およびオレフィン結合を介した架橋をあげることができる。より具体的な例としては、二つのペニシラミン残基をジスルフィド架橋で連結することにより環化するもの（Mosberg ら、P.N.A.S. US, 80:5871, 1983)、リジンとアスパラギン酸との間にアミド結合を形成することにより環化するもの（Flora ら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (2005) 1065-1068）、または予めチオエーテル結合を導入した架橋部位を含むアミノ酸誘導体をペプチド結合に導入し、最後の縮合反応で環化するもの（Melinら US6,143,722）、およびオレフィンメタセシス反応を用いて主鎖に導入した（Ｓ）－α－２'－ペンテニルアラニン同士を架橋させて環化するもの（Schafmeisterら、J. Am. Chem. Soc., 122, 5891-5892, 2000）をあげることができる。また、コンホメーションを制御する為にペプチドの側鎖の修飾を必要としない方法としてペプチド主鎖骨格のアミドを構成する窒素を起点とした架橋構造も知られている。（GilonらBioplymers 31:745, 1991）。
　コンホメーションが制御されたペプチドは、多くの薬理用途が期待できる。しかし、医薬品としてのペプチドの開発においては、以下のような問題がある。すなわち、ａ）生理学的条件下では、ペプチドの多くは、特異的および非特異的なペプチダーゼにより分解されるため、代謝安定性が低いこと、ｂ）その分子量が比較的高いため、経口摂取後の吸収が悪いこと、ｃ）肝臓および腎臓を通過する排出が速いこと、および、ｄ）ペプチドは構造的に柔軟であり、またペプチドに対する受容体は生物体に広く分布しえるので、標的としない組織・器官において所望しない副作用が起こること、である。
　ＴＮＦレセプタースーパーファミリーに属する受容体Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－κＢ（ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥＲあるいはＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a）としても知られている）は、破骨細胞、樹状細胞、乳腺上皮細胞などで発現されている。ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ、またはＯＰＧＬ、ＯＤＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびＴＮＦＳＦ１１（TNF ligand superfamily member 11）としても知られている）は、ＴＮＦ様タンパク質であり、骨芽細胞、骨髄間質細胞およびＴ細胞などで発現されている。ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬは、インビボおよびインビトロにおいて、破骨細胞の分化や樹状細胞の分化さらには乳腺の発達に必要であることも報告されている。ＴＮＦファミリーに属するＴＮＦαは、直接骨髄細胞に働いて破骨細胞形成を促進させるだけでなく、骨芽細胞にも働きＲＡＮＫＬのレベルを亢進させて間接的に骨髄細胞の破骨細胞形成応答を増幅させ、卵巣切除や炎症によって誘導される骨損失に大きく寄与している。ＲＡＮＫＬはまた、破骨細胞による骨吸収を増加させる。
　ＷＰ９ＱＹペプチドは、ＴＮＦレセプターおよびＲＡＮＫの機能的部位の配列構造に似せた５アミノ酸配列をその環状内に有する、９アミノ酸からなる架橋ペプチドであり、以下の構造を有する（特表２００３－５０５５０３号公報、および特表２００３－５０５５１４号公報）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　ＷＰ９ＱＹペプチドは、ＴＮＦαにより誘導される細胞毒性を阻害することが報告されている（高橋ら、Nat. Biotechnol. 1997, 15: 1266-1270）。ＷＰ９ＱＹペプチドはまた、ＲＡＮＫＬによって誘導されるシグナルをブロックし、骨吸収および骨損失を阻害することが報告されている（青木ら、J. Clin. Invest. 2006; 116(6):1525-1534）。また、炎症性骨吸収を引き起こす関節リウマチモデルにおいてＷＰ９ＱＹペプチドが同用量の抗ＴＮＦ抗体投与と比べて骨吸収抑制効果が優れていることが報告されている（斉藤ら、Rheumatoid Arthritis, Vol.56, No.4, 1164-1174）。さらに、歯周病原因細菌による炎症性骨破壊をＷＰ９ＱＹペプチド投与により抑制することも報告されている（鈴木ら、J. Periodontal Res., 2006 Apr. 41(2):81-91）。
　本明細書で使用する「ペプチド模倣体」とは、レセプターのリガンドとして、ペプチドの生物学的効果をレセプターレベルで模倣（作動物質）または遮蔽（拮抗物質）することができる化合物である。最も可能性のある作動物質としてのペプチド模倣体を得るためには、ａ）代謝安定性、ｂ）良好な生物学的利用能、ｃ）高い受容体親和性および受容体選択性、ならびにｄ）最少の副作用、等の要因を考慮する必要がある。また、薬理および医学的観点から、しばしば、レセプターレベルでのペプチドの効果を模倣する（作動作用）だけでなく、必要であればレセプターを遮蔽する（拮抗作用）ことが望ましい。上記の作動物質としてのペプチド模倣体を設計するために考慮すべき薬理事項と同じことが、ペプチド拮抗物質の設計に対しても適用できる。
特表２００３－５０５５０３号公報 特表２００３－５０５５１４号公報
Mosberg ら、P.N.A.S. US, 80:5871, 1983 Charpentier ら、J. Med. Chem. 32:1184, 1989 Rodriguez ら、Int. J. Pept. Protein Res. 35:441, 1990 Schafmeisterら、J. Am. Chem. Soc., 122, 5891-5892, 2000 Goodmanら、J. Org. Chem. 2002, 67, 8820-8826 高橋ら、 Nat. Biotechnol. 1997, 15: 1266-1270 青木ら、J. Clin. Invest. 2006; 116(6):1525-1534 斉藤ら、Rheumatoid Arthritis, Vol.56, No.4, 1164-1174 鈴木ら、J. Periodontal Res., 2006 Apr. 41(2):81-91
　ＴＮＦαにより誘導される細胞毒性を阻害するとともに骨吸収を阻害するペプチド模倣体として、ＷＰ９ＱＹペプチドが知られているが、ジスルフィド結合は一般に生体内に存在する還元酵素で切断されてしまうという問題があり、さらに改善された模倣ペプチドが望まれていた。また、他の環化形式も存在するが、架橋中にアミドが存在するものは、生体内に存在するアミド構造を切断する酵素によって切断されてしまうという問題がある。さらには、架橋の自由な設計や架橋への自由な変更が、ペプチドの生理活性を改善するためには望まれているが、従来の環化形式では難しいという問題があった。
　本発明の目的は、より望ましい特性を有するＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を含む骨粗鬆治療薬を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規な架橋構造をその内部にもつＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を合成し、それが破骨細胞の分化阻害活性を持ちかつ分解酵素に対する耐性が改善されたことを確認し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下に記載する新規なＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を用いた破骨細胞の増殖阻害剤および該ペプチドを含む医薬組成物を提供するものである。
　本発明の例示的な態様は以下の通りである。
（１）下記の化学式で表されるペプチドからなる破骨細胞の増殖阻害剤
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
（ここで、Ｚ1およびＺ3は、それぞれ独立に、水素原子、無置換または置換された炭素数１～１６のアシル基、無置換または置換された炭素数１～８のアルキル基および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、Ｚ2はヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１～８のモノアルキルアミノ基、－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれる、ここでｎは自然数である。）
（２）上記ペプチドが、（１）の化２で表される前記ペプチドであって、かつ、Ｚ1は、水素原子、アセチル基、および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（ｎは整数である）で表される分子量１，０００～３，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、Ｚ3は、水素原子、無置換または置換された炭素数１～８のアシル基、および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎOＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（ｎは整数である）で表される分子量１，０００～３，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、そしてＺ2はヒドロキシル基、アミノ基、および－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１，０００～３，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれる、上記（１）に記載の阻害剤。
（３）下記の化学式で表されるペプチドからなる群より選ばれる上記（１）に記載の破骨細胞の分化または増殖阻害剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 、および
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（ここで、Ａｃはアセチル基を表し、ポリエチレングリコールは、５００～２０００Ｄａの数平均分子量をもつポリエチレングリコールを表し、ｎは整数である）。
（４）上記ペプチドが上記（２）の化１０、化１１又は化１２である上記（２）に記載の阻害剤。
（５）上記（１）～（４）のいずれか一つに記載のペプチドを用いて破骨細胞の増殖を阻害する方法。
（６）上記（１）～（４）のいずれか一つに記載のペプチドの少なくとも一つを有効成分として含有する医薬組成物。
（７）骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチおよび他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移からなる群から選択される疾病の治療剤である、上記（６）に記載の医薬組成物。
（８）骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチおよび他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移からなる群から選択される疾病の治療又は予防方法であって、このような治療又は予防が必要である哺乳類に、上記（１）～（４）のいずれか一つに記載のペプチドの少なくとも一つを有効量で投与することを含む、治療又は予防方法。
　本発明により、特性がより改善された、例えば、ペプチダーゼに対する耐性が向上した、または破骨細胞に対する阻害活性が向上したＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を含む医薬組成物が提供される。
本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を概略図で示している。 本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を概略図で示している。 本発明の他のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を概略図で示している 本発明の他のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を概略図で示している 本発明の他のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を概略図で示している 参考例としての、チオエーテル架橋をもつＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を示している。 参考例としての、オレフィン架橋をもつＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を示している。 本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-2、Bdev-5、Bdev-6、Bdev-8）の破骨細胞分化抑制活性を示している。 本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-2、Bdev-3）の、破骨細胞分化抑制活性を示している。 本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-2、Bdev-25）の破骨細胞分化抑制活性を示している。 本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-2、Bdev-27、Bdev-28、Bdev-29、Bdev-30、）の破骨細胞分化抑制活性を示している。 マウスモデルを用いた、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-2）の骨密度減少抑制試験の結果を示している。
　本明細書中で、ｎは自然数を表す。
　本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体は、環状ペプチドであり、その環状内にＷＰ９ＱＹペプチドと同様のアミノ酸配列をもち、かつ架橋構造中に－ＮＲ－結合を有することを特徴とする。具体的には、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体は、以下の構造を有するペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （ここで、Ｚ1およびＺ3は、それぞれ独立に、水素原子、無置換または置換された炭素数１～１６のアシル基、無置換または置換された炭素数１～８のアルキル基、および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、Ｚ2はヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１～８のモノアルキルアミノ基、－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれる）
　Ｚ1およびＺ3は、それぞれ独立に、水素原子、無置換または置換された炭素数１～１６のアシル基、無置換または置換された炭素数１～８のアルキル基および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれるが、好ましくは、水素原子、無置換または置換された炭素数１～１０のアシル基、無置換または置換された炭素数１～６のアルキル基、または、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量３００～５，０００Ｄａのポリエチレングリコールであり、さらに好ましくは水素原子、無置換または置換された炭素数１～８のアシル基、無置換または置換された炭素数１～４のアルキル基、または、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量５００～２，０００Ｄａのポリエチレングリコールである。
　Ｚ2は、ヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１～８のモノアルキルアミノ基、－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれるが、好ましくは、ヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１～６のモノアルキルアミノ基、－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量３００～５，０００Ｄａのポリエチレングリコールであり、さらに好ましくは、ヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１～４のモノアルキルアミノ基、－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量５００～２，０００Ｄａのポリエチレングリコールである。
　また、Ｚ1とＺ3は、一方が、無置換または置換された炭素数１～１６のアシル基、無置換または置換された炭素数１～８のアルキル基および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群から選ばれ、他方が、水素原子またはアセチル基から選ばれることが好ましい。
　さらに、Ｚ1が水素原子、無置換または置換された炭素数１～８のアシル基、または無置換または置換された炭素数１～８のアルキル基であり、かつＺ2がヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１～８のアシル基、無置換または置換された炭素数１～８のモノアルキルアミノ基である場合、Ｚ3は－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールであることが好ましい。
　置換されたアシル基又はアセチル基への置換は、例えば、窒素原子を介したアルキルアミノ修飾や酸素原子を介したエーテル型の置換があげられるが、これらに限定されず、公知の方法を用いて行うことができる。
　本明細書において、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の作用を表す際に用いる「破骨細胞の増殖阻害」とは、破骨細胞の生育または増殖を阻害する場合、未熟な破骨細胞が成熟細胞へと分化するのを阻害する場合のいずれも含む意味で用いる。
　本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体は、ＴＮＦα／ＴＮＦレセプターが関与する疾患に有効であるとともに、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬが関与する疾患にも有用である。疾患としては、例えば、骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチおよび他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移をあげることができるが、これらに限定されず、ＴＮＦα／ＴＮＦレセプターおよび／またはＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬが関与する疾患も含まれる。
　本発明のペプチドは、任意の既知の製薬上許容できるキャリアを含む医薬組成物としてもよい。
　本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩の形態にすることもできる。
　本発明のペプチドは、経口的または非経口的に投与されうる。経口投与の場合、カプセル、錠剤、顆粒剤、液剤などの形態で投与されうる。非経口投与の場合、注射液、点滴製剤などの形態で投与される。
　本発明のペプチドは、単独で用いる他、他の骨粗鬆治療・予防薬、例えば、有機ビスホスホネートと組み合わせてもちいることもできる。
　本発明のペプチドは、例えば、ヒトまたはその他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。本発明のペプチドの適切な投与量は、治療する疾患や障害、投与経路、治療をうける患者の年齢や体重などの要素によってさまざまである。経口投与の場合、一般的に通常ヒト成人においては、一日につき有効成分を約０．０１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは約１．０～２００ｍｇであり、非経口的に投与する場合は、一日につき有効成分を約０．０１～１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１～１０ｍｇ程度を静脈注射により投与する。
　本発明の製剤は、好ましくは、非経口的に、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下等に投与する。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　以下の実施例においては、下記の略号を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
ＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成
　図１および図２の合成スキームに従って、架橋構造としてジスルフィド結合の代わりに、－（ＣＨ2）4－ＮＨ－（ＣＨ2）4－を持つ、ＷＰ９ＱＹペプチド模倣体である架橋ペプチド（Bdev-７）を合成した。
　以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
（実施例１）合成中間体（化合物１４）の合成
１－１．原料である化合物１３の合成
化合物１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　2,4-ジドコシロキシベンジルアルコール（「ＫｂＯＨ」と表記する） (7.69 g, 10.1 mmol) をCH2Cl2 (200 mL) に溶解し、Fmoc-Gly-OH (4.52 g, 15.2 mmol, 1.5 equiv)、DIPCI (3147 μＬ, 20.2 mmol, 2.0 equiv)、およびDMAP (12.3 mg, 0.101 mmol, 0.01 equiv) を加えて室温で30分間攪拌した。沈殿物をろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣にMeOHを加えて析出した沈殿物をろ過し、MeOH懸洗を2回 、CH3CN懸洗を行い化合物1 (10.1 g, 96.7%) を得た。
化合物２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 　化合物1 (10.1 g, 9.74 mmol) をTHF (200 mL) に溶解し、piperidne (1863 μＬ, 17.5 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (1863 μＬ, 17.5 mmol, 1.8 equiv) を加えて室温で5分間攪拌した。反応液のpHが6前後になるまで濃塩酸を加えて減圧下溶媒を留去した。残渣にCH3CNを加えて析出した沈殿物をろ過し、CH3CN懸洗を2回行い化合物2 (8.21 g, 98.7%) を得た。
化合物3の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 　化合物2 (7.60 g, 8.96 mmol) をCH2Cl2 (180 mL) に溶解し、DIPEA (3589 μＬ, 20.6 mmol, 2.3 equiv) およびNsCl (2.59 g, 11.7 mmol, 1.3 equiv) を加えて室温で攪拌した。1時間後DIPEA (359 μＬ, 2.06 mmol, 0.2 equiv) を追加し室温で19分間攪拌した。反応液にMeOH (30 mL) を加えた後、減圧下溶媒を留去した。残渣にCH3CNを加えて析出した沈殿物をろ過し、CH3CN懸洗を2回行い化合物3 (8.95 g, 99.9%) を得た。
化合物4の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　化合物3 (4.70 g, 4.71 mmol) および化合物A (3.11 g, 9.46 mmol, 2.0 equiv) をTHF (94 mL) に溶解し、PPh3 (2.49 g, 9.50 mmol, 2.0 equiv) およびDEAD (4272 μＬ, 9.42 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で3時間攪拌した。PPh3 (248 mg, 0.946 mmol, 0.2 equiv) およびDEAD (427 μＬ, 0.942 mmol, 0.2 equiv) を加えて1時間攪拌した。PPh3 (245 mg, 0.934 mmol, 0.2 equiv) およびDEAD (427 μＬ, 0.942 mmol, 0.2 equiv) を加えて1時間15分攪拌した後、減圧下溶媒を留去した。残渣にCH3CNを加えて析出した沈殿物をろ過し、CH3CN懸洗を2回行い化合物4 (6.12 g,  99.2%) を得た。
化合物5の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　化合物4 (5.65 g, 4.31 mmol) をTHF (40 mL) に溶解し、PhSH (1328 μＬ, 12.9 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (1934 μＬ, 12.9 mmol, 3.0 equiv) を加え室温で1時間30分攪拌した。反応液にCH3CN (200 mL) を加えて析出した沈殿物をろ過し、CH3CN懸洗を2回行い化合物5 (4.77 g, 98.4%) を得た。
化合物6の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 　化合物5 (7.49 g, 6.65 mmol) をTHF (70 mL) に溶解し、Fmoc-Leu-OH (3.53 g, 9.98 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (2.27 g, 16.7 mmol, 2.5 equiv)、HATU (6.32 g, 16.6 mmol, 2.5 equiv) およびDIPEA (5800 μＬ, 33.3 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で6分間攪拌した。DIPEA (580 μＬ, 3.33 mmol, 0.5 equiv) を加えて8分間攪拌した。さらに、DIPEA (580 μＬ, 3.33 mmol, 0.5 equiv) を加えて1時間攪拌した。沈殿物をろ過し、ろ液を減圧下留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (n-hexane/EtOAc = 100 : 0 - 85 : 15) に付し、化合物6 (9.10 g, 93.7%) を得た。
化合物7の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 　化合物6 (1.05g,  0.721 mmol) をCH2Cl2 (36 mL) に溶解し、TFE (3.6 mL) およびTFA (360 μＬ) を加えて室温で40分間攪拌した。沈殿物をろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣にCH2Cl2を加えて水で3回洗浄し、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水MgSO4で乾燥、ろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/MeOH, 100 : 0 - 90 :10) に付し、化合物7 (478 mg, 92.2%) を得た。
化合物8の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 　化合物7 (4.08 g, 5.66 mmol, 1.2 equiv) をTHF (70 mL) に溶解し、化合物29（合成方法は後で記載する） (5.52 g, 4.72 mmol)、DIPCI (1104 μＬ, 7.09 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (963 mg, 7.08 mmol, 1.5 equiv)、およびDIPEA (4940 μＬ, 28.4 mmol, 6.0 equiv) を加えて室温で3時間攪拌した。HOAt (325 mg, 2.39 mmol, 0.5 equiv) およびDIPCI (368 μＬ, 2.36 mmol, 0.5 equiv) を加えて2時間攪拌した。溶媒を減圧下留去した後、化合物２の合成と同等の後処理を行い化合物8 (8.54 g, 98.5%) を得た。
化合物9の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 　化合物8 (8.54 g, 4.65 mmol) をTHF (93 mL) に溶解し、piperdine (891 μＬ, 8.37 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (904 μＬ, 6.04 mmol, 1.3 equiv) を加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (8.31 g) を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 脱Fmoc体 (8.31 g) をTHF (93 mL) に溶解し、Fmoc-Tyr(tBu)-OH (3.21 g, 6.99 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (1.59 g, 11.7 mmol, 2.5 equiv)、HATU (4.42 g, 11.6 mmol, 2.5 equiv)、およびDIPEA (4860 μＬ, 27.9 mmol, 6.0 equiv) を加えて室温で40分間攪拌した。化合物４の合成と同等の後処理を行い化合物9 (9.05 g, 94.7%) を得た。
化合物10の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 　化合物9 (4.17 g, 2.03 mmol) をTHF (41 mL) に溶解し、piperidine (389 μＬ, 3.65 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (395 μＬ, 2.63 mmol, 1.3 equiv) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (3.92 g) を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 　脱Fmoc体 (3.92 g) をTHF (41 mL) に溶解し、Fmoc-Gln(Trt)-OH (1.86 g, 3.04 mmol, 1.5 equiv)、HATU (1.93 g, 5.07 mmol, 2.5 equiv)、HOAt (691 mg, 5.07 mmol, 2.5 equiv)、およびDIPEA (2120 μＬ, 12.2 mmol, 6.0 equiv) を加えて室温で30分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物10 (4.83 g, 98.0%) を得た。
化合物11の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 　化合物10 (4.83 g, 1.99 mmol) をTHF (40 mL) に溶解し、piperidine (382 μＬ, 3.59 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (388 μＬ, 2.59 mmol, 1.3 equiv) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (4.63 g) を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 　脱Fmoc体 (4.63 g) をTHF (40 mL) に溶解し、Fmoc-Ser(tBu)-OH (1.15 g, 2.99 mmol, 1.5 equiv)、HATU (1.89 g, 4.98 mmol, 2.5 equiv)、HOAt (676 mg, 4.98 mmol, 2.5 equiv)、およびDIPEA (2082 μＬ, 11.9 mmol, 6.0 equiv) を加えて室温で45分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物11 (5.49 g) を得た。
化合物12の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 　化合物11 (5.49 g) をTHF (40 mL) に溶解し、piperidine (382 μＬ, 3.59 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (388 μＬ, 2.59 mmol, 1.3 equiv) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (4.65 g, 98.0% from  10) を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 　脱Fmoc体 (4.65 g, 1.95 mmol) をTHF (39 mL) に溶解し、Fmoc-Trp(Boc)-OH (1.54 g, 2.92 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (398 mg, 2.92 mmol, 1.5 equiv)、HATU (1.11 g, 2.92 mmol, 1.5 equiv)、およびDIPEA (1698 μＬ, 9.75 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で70分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物12 (5.32 g, 95.4%) を得た。
化合物13の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 　化合物12 (5.32 g, 1.86 mmol) をTHF (37.2 mL) に溶解し、piperidine (372 μＬ, 3.50 mmol, 1.9 equiv) およびDBU (372 μＬ, 2.49 mmol, 1.3 equiv) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (4.96 g) を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 　脱Fmoc体 (4.96 g) をTHF (12.6 mL) に溶解し、TBAF (1.0 M solution in THF, 6.0 mL, 6.00 mmol, 3.2 equiv) を加えて室温で19時間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣にCH2Cl2を加えて1 N HCl、水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水MgSO4で乾燥しろ過後、ろ液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/THF, 100 : 0 - 75 : 25) に付し、化合物13 (2.02 g, 45.3%) を得た。
化合物29の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 　3,4,5-トリオクタデシルオキシベンジルアルコール （「ＫａＯＨ」と表記する）(20.1 g, 22.0 mmol) をCH2Cl2 (220 mL) に溶解し、Fmoc-Tyr(tBu)-OH (15.2 g, 33.0 mmol, 1.5 equiv)、DIPCI (6856 μＬ, 44.0 mmol, 2.0 equiv)、およびDMAP (26.9 mg, 0.220 mmol, 0.01 equiv) を加えて室温で35分間攪拌した。化合物1の合成と同等の後処理を行い化合物28 (29.9 g, quant. y.) を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 　化合物28 (9.58 g, 7.07 mmol) をTHF (141 mL) に溶解し、piperidine (1260 μＬ, 12.7 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (1374 μＬ, 9.19 mmol, 1.3 equiv) を加えて室温で5分間攪拌した。TLCにて原料消失を確認後、化合物2の合成と同等の後処理を行い化合物29 (8.28 g,  q. y.) を得た。
１－２．原料である化合物３８の合成
化合物30の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 　3,4,5-トリオクタデシルオキシベンジルアルコール (3.00 g, 3.28 mmol) をCH2Cl2 (32.8 mL) に溶解し、Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3.08 g, 4.93 mmol, 1.5 equiv)、DIPCI (1023 μＬ, 6.57 mmol, 2.0 equiv)、およびDMAP (4.0 mg, 0.0328 mmol, 0.01 equiv) を加えて室温で42分間攪拌した。化合物1の合成と同等の後処理を行い化合物30 (5.32 g) を得た。
化合物31の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 化合物30 (5.32 g) をCH2Cl2 (32.8 mL) に溶解し、TIS (3284 μＬ) およびTFA (985.2 μＬ) を加えて室温で12分間攪拌した。TIS (3284 μＬ) を追加し更に53分間攪拌した。TFA (985.2 μＬ) を追加して更に16分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物31 (4.48 g) を得た。
化合物32の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 　化合物31 (4.48 g) をCH2Cl2 (65.7 mL) に溶解し、DIPEA (1258 μＬ, 7.22 mmol, 2.2 equiv) およびNsCl (873 mg, 3.94 mmol, 1.2 equiv) を加えて室温で37分間攪拌した。化合物3の合成と同等の後処理を行い化合物32 (4.75 g, q. y.) を得た。
化合物33の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 　化合物32 (4.38 g, 3.02 mmol) をCH2Cl2 (27 mL) に溶解し、TIS (6.0 mL) およびTFA (27 mL) を加えて室温で 2時間攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣にCH2Cl2加えて希釈し水で3回、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水MgSO4で乾燥、ろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/MeOH, 100 : 0 - 85 : 15) に付し、化合物33 (1.42 g, 84.8%) を得た。
化合物34の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 　2,4-ジドコソキシベンジルアルコール (2.09 g, 2.76 mmol) をCH2Cl2 (27.6 mL) に溶解し、化合物33 (2.29 g, 4.14 mmol, 1.5 equiv)、DIPCI (859 μＬ, 5.51 mmol, 2.0 equiv)、およびDMAP (3.4 mg, 0.0278 mmol, 0.01 equiv) を加えて室温で45分間攪拌した。化合物1と同等の後処理を行い化合物34 (4.13 g, quant. y.) を得た。
化合物35の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 　化合物34 (4.13) をTHF (55.1 mL) に溶解し、piperidine (491 μＬ) およびDBU (536 μＬ) を加えて室温で5分間攪拌した。TLCにて原料消失を確認後、化合物2の合成と同等の後処理を行い化合物35 (3.00 g, 98.2%) を得た。
化合物36の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 　化合物35 (332 mg, 0.300 mmol) をTHF (6 mL) に溶解し、Fmoc-Tyr(tBu)-OH (207 mg, 0.450 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (61.3 mg, 0.450 mmol, 1.5 equiv)、HATU (171 mg, 0.450 mmol, 1.5 equiv) およびDIPEA (261 μＬ, 1.50 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で53分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物36 (441 mg, 97.3%) を得た。
化合物37の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 　化合物36 (2.73 g, 1.81 mmol) をTHF (36.1 mL) に溶解し、piperidine (322 μＬ) およびDBU (351 μＬ) を加えて室温で5分間攪拌した。TLCにて原料消失を確認後、化合物2の合成と同等の後処理を行い化合物37 (2.25 g, 94.1%) を得た。
化合物38の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 　化合物37 (266 mg, 0.201 mmol) をTHF (4 mL) に溶解し、ミリスチン酸 (68.9 mg, 0.302 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (41.4 mg, 0.304 mmol, 1.5 equiv)、HATU (114 mg, 0.301 mmol, 1.5 equiv)、およびDIPEA (174 μＬ, 0.999 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で1時間50分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物38 (289 mg, 95.5%) を得た。
１－３．中間体である化合物１４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 　化合物13 (265 mg, 0.111 mmol)、化合物38 (289 mg, 0.192 mmol, 1.7 equiv)、およびPPh3 (118 mg, 0.450 mmol, 4.1 equiv) をTHF (11 mL) に溶解し、DEAD (201 μＬ, 0.443 mmol, 4.0 equiv) を加えて室温で61分間攪拌した。PPh3 (121 mg, 0.461 mmol, 4.2 equiv) およびDEAD (201 μＬ, 0.0.443 mmol, 4.0 equiv) を加えて59分間攪拌した。化合物３の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2CH2/THF, 100 : 0 - 88 : 12) に付し、光延反応物 (132 mg, 30.6%) を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 　光延反応物 (132 mg, 0.0340 mmol) をCH2Cl2 (3.4 mL) に溶解し、TFE (340 μＬ) およびTFA (34.0 μＬ) を加えて室温で70分間攪拌した。沈殿物をセライトろ過し、減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3/MeOH, 100 : 0 - 95 : 5) に付し、本発明の中間体である化合物14 (75.1 mg, 70.3%) を得た。
（実施例２）ＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-7）の合成
化合物15の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 　化合物14 (75.1 mg, 0.0239 mmol)、HOAt (4.2 mg, 0.0309 mmol, 1.3 equiv)、およびHATU (11.2 mg, 0.0295 mmol, 1.2 equiv) をTHF (4780 μＬ) に溶解し、DIPEA (20.8 μＬ, 0.119 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で17時間40分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物15 (64.5 mg, 86.6%) を得た。
化合物16の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 　化合物15 (64.5 mg, 0.0207 mmol) をTHF (414 μＬ) に溶解し、PhSH (6.38 μＬ, 0.0621 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (9.29 μＬ, 0.0621 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で1時間38分間攪拌した。PhSH (6.38 μＬ, 0.0621 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (9.29 μＬ, 0.0621 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で3時間29分間攪拌した。反応液に濃塩酸 (10 μＬ) を加えて減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物16 (55.6 mg, 91.3%) を得た。
Bdev-7の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 　化合物16 (21.8 mg, 0.0743 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (743 μＬ) を加えて室温で3時間攪拌した。沈殿物をろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣にIPEを加え沈殿物を析出させ、遠心分離後の残渣をHPLC精製し本発明の架橋ペプチドBdev-7 (2.8 mg, 2.6%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C78H111N12O16: 1471.8241, found 1472.1734。
他のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を以下のようにして合成した。
（実施例３）Bdev-3，-5，-6，-12および-13合成のための中間体（化合物１９）の合成
　Bdev-3，-5，-6，-12および-13合成のための中間体の合成の概略図を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　それぞれの合成は、以下のようにして行った。
化合物39の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 　化合物37 (746 mg, 0.562 mmol) をCH2Cl2 (11 mL) に溶解し、Et3N (160 μＬ, 1.14 mmol, 2.0 equiv) およびAc2O (100 μＬ, 1.06 mmol, 1.9 equiv) を加えて室温で52分間攪拌した。化合物3の合成と同等の後処理を行い化合物39 (698 mg, 0.524 mmol, 93.2%) を得た。
化合物40の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 　化合物35 (775 mg, 0.700 mmol) をTHF (14 mL) に溶解し、Boc-Tyr(tBu)-OH (354 mg, 1.05 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (143 mg, 1.05 mmol, 1.5 equiv)、HATU (399 mg, 1.05 mmol, 1.5 equiv) およびDIPEA (610 μＬ, 3.50 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で42分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物40 (935 mg, 96.1%) を得た。
化合物17の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 　化合物13 (944 mg, 0.394 mmol)、化合物39 (635 mg, 0.477 mmol, 1.2 equiv)、およびPPh3 (211 mg, 0.804 mmol, 2.0 equiv) をTHF (40 mL) に溶解し、DEAD (357 μＬ, 0.787 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で3時間7分攪拌した。次に、PPh3 (208 mg, 0.793 mmol, 2.0 equiv) を加えて33分間攪拌した。さらに、DEAD (357 μＬ, 0.787 mmol, 2.0 equiv) を加えて1時間50分攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣 (1.573 g) を次反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 　残渣 (1.573 g) をCH2Cl2 (47.7 mL) に溶解し、TFE (4770 μＬ) およびTFA (477 μＬ) を加えて室温で1時間攪拌した。沈殿物をセライトろ過し、ろ液にDIPEA (1050 μＬ) を加えた後、減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3/MeOH, 100 : 0 - 90 : 10 およびCHCl3/EtOH, 100 : 0 - 93 : 7) に付し、本発明の中間体である化合物17 (651 mg, 55.7%) を得た。
化合物18の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 　化合物17 (485 mg, 0.163 mmol)、HOAt (26.8 mg, 0.197 mmol, 1.2 equiv)、およびHATU (74.8 mg, 0.197 mmol, 1.2 equiv) をTHF (32.6 mL) に溶解し、DIPEA (142 μＬ, 0.815 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間30分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物18 (462 mg, 96.3%) を得た。
化合物19の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 　化合物40 (462 mg, 0.157 mmol) をTHF (1560 μＬ) に溶解し、PhSH (16.0 μＬ, 0.156 mmol, 1.0 equiv) およびDBU (70.0 μＬ, 0.468 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で50分間攪拌した。PhSH (32.0 μＬ, 0.312 mmol, 2.0 equiv) を加えて1時間11分攪拌した。PhSH (48.0 μＬ, 0.467 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (70.0 μＬ, 0.468 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で50分間攪拌した。反応液に濃塩酸 (78.0 μＬ) を加えて減圧下溶媒を留去した。化合物４の合成と同等の後処理を行い化合物19 (416 mg, 96.2%) を得た。
（実施例４）Bdev-3，-5，-6，-12および-13の合成
（１）Bdev-6の合成
　Bdev-6は、以下の通りにして合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 　化合物19 (48.2 mg, 0.0174 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (1740 μＬ) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev－７の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-6 (5.3 mg, 23.4%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C66H87N12O16: 1303.6363, found 1303.9331.
（２）Bdev-12の合成
　Bdev-12は、以下の通りにして合成した。
化合物20の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 　化合物19 (149 mg, 0.0540 mmol)、ミリスチン酸 (18.7 mg, 0.0819 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (11.1 mg, 0.0816 mmol, 1.5 equiv)、およびHATU (31.0 mg, 0.0815 mmol, 1.5 equiv) をTHF (1080 μＬ) に溶解し、DIPEA (47.0 μＬ, 0.270 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物20 (147 mg, 91.5%) を得た。
Bdev-12の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 　化合物20 (147 mg, 0.0494 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (5 mL) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-12 (28.0 mg,  37.4%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C80H113N12O17: 1513.8347, found 1514.2531.
（３）Bdev-3の合成
　Bdev-3は、以下の通りにして合成した。
化合物21の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 　化合物19 (111 mg, 0.0400 mmol)、MeO-PEG-CO2H（MW：２，０００Ｄａ、Ｉｒｉｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製） (121 mg, 0.0600 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (6.5 mg, 0.0480 mmol, 1.2 equiv)、およびHATU (18.3 mg, 0.0480 mmol, 1.2 equiv) をTHF (2 mL) に溶解し、DIPEA (34.8 μＬ, 0.200 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で53分間攪拌した。DIPEA (34.8 μＬ, 0.200 mmol, 5.0 equiv) を加えて56分間攪拌した。MeO-PEG-CO2H (121 mg, 0.0600 mmol, 1.5 equiv)、HATU (22.8 mg, 0.0600 mmol, 1.5 equiv)、およびDIPEA (17.4 mL, 0.0999 mmol, 2.5 equiv) を加えて2時間9分攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/MeOH, 100 : 0 - 90 : 10) に付し、化合物21 (313 mg) を粗生成物として得た。
Bdev-3の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 化合物21 (147 mg, 0.0494 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (5 mL) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-3 (28.0 mg,  37.4%) を得た。m/z 3140付近を中心に44マス間隔で1価イオン、1640付近を中心に22マス間隔で2価イオンを検出した。
（４）Bdev-5の合成
　Bdev-5は、以下の通りにして合成した。
化合物22の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 　化合物19 (161 mg, 0.0580 mmol) をCH2Cl2 (1160 μＬ) に溶解し、Et3N (15.8 μＬ, 0.112 mmol, 1.9 equiv) およびAc2O (11.0 μＬ, 0.116 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で40分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物22 (143 mg, 87.6%) を得た。
Bdev-5の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 　化合物22 (143 mg, 0.0508 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (5 mL) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-5 (25.6 mg,  37.4%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C68H88N12O17: 1345.6499, found 1345.5516.
（５）Bdev-13の合成
　Bdev-13は、以下の通りにして合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 　Bdev-５ (10.1 mg, 0.00750 mmol, 1.5 equiv)、ＯＭｅ－ＰＥＧ－ＮＨ2 （MW：2,000 Da、Iris Biotech社製）(10.4 mg, 0.00516 mmol)、およびDMT-MM (1.4 mg, 0.00506 mmol, 1.0 equiv) のTHF (1100 μＬ) およびMeOH (900 μＬ) 混合物を室温で7時間35分攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣にPEG-NH2 (10.4 mg, 0.00516 mmol) およびDMT-MM (5.7 mg, 0.0206 mmol)、およびDMF (1 mL) を加えて室温で4時間38分攪拌した。DMT-MM (14.2 mg, 0.0513 mmol) を加えて1時間20分攪拌した。HPLCにて精製を行いBdev-13 (3.6 mg, 14.5%) を得た。m/z 1700付近を中心に22マス間隔で2価イオン群、m/z 1150付近を中心に15マス間隔で3価イオン群、m/z 900付近を中心に11マス間隔で4価イオン群が検出した。
（実施例５）Bdev-2, -4, -8,および-10合成のための中間体（化合物２５）の合成
　Bdev-2,-4,-8,および-10合成の中間体の合成の概略図を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 　それぞれの合成は、以下のようにして行った。
化合物23の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
　化合物13 (890 mg, 0.372 mmol)、化合物40 (776 mg, 0.559 mmol, 1.5 equiv)、およびPPh3 (147 mg, 0.559 mmol, 1.5 equiv) をTHF (8 mL) に溶解し、DEAD (253 μＬ, 0.558 mmol, 1.5 equiv.) を加えて室温で54分間攪拌した。次に、PPh3 (148 mg, 0.564 mmol, 1.5 equiv.) を加えて20分間攪拌した。次に、DEAD (84.4 μＬ, 0.186 mmol, 0.5 equiv.) を加えて2時間20分攪拌した。次に、PPh3 (147 mg, 0.560 mmol, 1.5 equiv) を加えて14分間攪拌した。さらに、DEAD (33.7 μＬ, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) を加えて34分間攪拌した。次に、PPh3 (44.8 mg, 0.171 mmol, 0.5 equiv) を加えて2分間攪拌した。さらに、DEAD (33.7 μＬ, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) を加えて3時間15分攪拌した。最後に、DEAD (33.7 μＬ, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) を加えて21分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/THF, 100 : 0 - 90 : 10) に付し、光延反応物 (1.05 g, 75.0%) を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 　光延反応物 (637 mg, 0.169 mmol) をCH2Cl2 (16.9 mL) に溶解し、TFE (1690 μＬ) およびTFA (169 μＬ) を加えて室温で40分間攪拌した。沈殿物をセライトろ過し、減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3/EtOH, 100 : 0 - 95 : 5) に付し、化合物23 (294 mg, 58.1%) を得た。
化合物24の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 　化合物23 (294 mg, 0.0970 mmol)、HOAt (15.8 mg, 0.116 mmol, 1.2 equiv)、およびHATU (44.7 mg, 0.118 mmol, 1.2 equiv) をTHF (19.4 mL) に溶解し、DIPEA (84.5 μＬ, 0.485 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間10分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物24 (284 mg, 97.2%) を得た。
化合物25の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
 　化合物24 (284 mg, 0.0943 mmol) をTHF (943 μＬ) に溶解し、PhSH (29.0 μＬ, 0.282 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (42.3 μＬ, 0.283 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で2時間30分間攪拌した。化合物16の合成と同等の後処理を行い、Bdev-2,-4,-8,および-10合成の中間体である化合物25 (255 mg, 95.8%) を得た。
（実施例６）Bdev-2, -4, -8,および-10の合成
（１）Bdev-8の合成
　Bdev-8の合成は、以下のようにして行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 　化合物25 (55.1 mg, 0.0181 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (1810 μＬ) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-8 (12.0 mg, 52.6%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C64H85N12O15: 1261.6257, found 1261.4668.
（２）Bdev-4の合成
化合物26の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 　化合物25 (62.6 mg, 0.0222 mmol)、ミリスチン酸 (7.7 mg, 0.0337 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (4.5 mg, 0.0331 mmol, 1.5 equiv)、およびHATU (12.8 mg, 0.0337 mmol, 1.5 equiv) をTHF (444 μＬ) に溶解し、DIPEA (19.3 μＬ, 0.111 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物26 (56.9 mg, 84.7%) を得た。
Bdev-4の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 　化合物26 (56.9 mg, 0.0188 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (1514 μＬ) を加えて室温で5分間攪拌した。TIS (46.9 mL) を加えて3時間55分攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理を行いBdev-4 (4.0 mg, 14.5%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C78H111N12O16: 1471.8241, found 1471.8190.
（３）Bdev-2の合成
化合物27の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 　化合物24 (204 mg, 0.0724 mmol) をCH2Cl2 (1448 μＬ) に溶解し、Et3N (20.4 μＬ, 0.145 mmol, 2.0 equiv) およびAc2O (13.7 μＬ, 0.145 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で50分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物27 (200 mg, 96.3%) を得た。
Bdev-2の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000091
　化合物27 (200 mg, 0.0697 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (6970 μＬ) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理を行いBdev-2 (54.4 mg, 59.8%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C66H87N12O16: 1303.6363, found 1303.5524.であった。
（４）Bdev-10の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
 　Bdev-2 (13.1 mg, 0.0101 mmol) およびSUNBRIGHT　ME-020AS（日油株式会社製） (40.4 mg, 0.0202 mmol, 2.0 equiv) のDMF (404 μＬ) にEt3N (2.84 μＬ, 0.0202 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で22時間40分攪拌した。HPLC精製しBdev-10 (16.8 mg, 48.9%) を得た。
m/z 1700付近を中心に22マス間隔で2価イオンが検出された。
（実施例１０）Bdev－２５の合成
　Bdev－２５の合成経路の概略を図３、図４に示す。
Bdev－２５は、以下の通りにして合成した。
化合物41の合成
　原料となるFmocアミノ酸をFmoc-Gln(Trt)-OHに変更した以外は、上記化合物1の合成例と同様にして化合物41を得た (q.y.) 。
化合物42の合成
　化合物41 (13.50 g, 10.0 mmol) をTHF (180 mL) 及びDMF(20 mL)に溶解し、piperidne (2000μL) 及びDBU (2000μL) を加えて室温で5分間攪拌した。反応液のpHが6前後になるまで濃塩酸を加えて減圧下溶媒を留去した。残留物にアセトニトリル(540 mL)を加えて析出した沈殿物をろ過、アセトニトリルで懸洗を2回行い脱Fmoc体を得た。
　脱Fmoc体をTHF (140 mL) 及びDMF(60 mL)に溶解し、Fmoc-Ser(tBu)-OH (4.60 g, 12.0 mmol)、HOBt・H2O (1.84 g, 12.0 mmol)、HBTU (4.55 g, 12.0 mmol)及びDIPEA (8709 μL, 60.0 mmol) を加えて室温で30分間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残留物にアセトニトリル(700 mL)を加えて析出した沈殿物をろ過、アセトニトリルで懸洗を2回行い化合物42 (14.60 g, 97.8%) を得た。
化合物43の合成
　縮合するアミノ酸をFmoc-Trp(Boc)-OHを変更した以外は、上記の化合物42の合成例と同様に処理して得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン/THF = 100 : 0 → 90 : 10) にて精製し、化合物43 (12.6 g, 72.6%) を得た。
化合物91の合成
　化合物43 (2.60 g, 14.6 mmol) をDCM (40 mL) 、TFE ( 4 mL) に溶解し、TFA (39 μL) を加えて室温で15分間攪拌した。沈殿物をろ過後、ろ液に水(8 mL)を加えて減圧下に濃縮した。生成した沈殿を遠心（3500 rpm, 6 min）し、沈殿物をTHF, EtOHに溶解後、減圧乾固した。残渣をIPEで2回懸洗し、真空乾燥して化合物91 (98.6%) を得た。
化合物97の合成
　化合物29 (2.35 g, 2.02 mmol)、Fmoc-Nle(6-OH)-OH (890 mg, 2.41 mmol, 1.2 equiv)、DMT-MM (860 mg, 3.11 mmol, 1.5 equiv)、及びDIPEA (697 μＬ, 4.00 mmol, 2.0 equiv) のTHF (40 mL) 混合物を室温で40分攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物97 (2.97 g, 99.0%) を得た。
化合物98の合成
　化合物97を出発原料とし、縮合するアミノ酸をFmoc-Leu-OHを変更した以外は、上記の化合物42の合成例と同様にして化合物98 (89.6%) を得た。
化合物99の合成
　化合物98 を出発原料とし、縮合するアミノ酸をFmoc-Tyr(tBu)-OHを変更した以外は、上記の化合物98の合成例と同様にして化合物99 (2.65 g, 96.6%) を得た。
化合物100の合成
　化合物99 を出発原料とした以外は、上記の化合物82の合成例と同様にして化合物100 (97.1%) を得た。
化合物101の合成
　化合物100 (3.60 g, 1.37 mmol) をTHF (30 mL) に溶解し、piperidine (300 μL) 及びDBU (300 μL) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い化合物101  (3.20 g, 97.8 %) を得た。
化合物102の合成
　化合物101 (3.20 g, 1.34 mmol)、化合物40 (4.67 g, 3.36 mmol, 2.5 equiv)、及びPPh3 (1.41 g, 5.36 mmol, 4.0 equiv) をTHF (27 mL) に溶解し、DEAD (2430 μL, 5.36 mmol, 4.0 equiv) を加えて室温で45分攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (toluene/THF, 100 : 0 - 80 : 20) に付し、化合物102 (2.51 g, 49.7%) を得た。
化合物103の合成
　化合物102を出発原料とした以外は、上記の化合物14の合成例と同様にして化合物102 (2.51 g, 0.666 mmol) をCH2Cl2 (67 mL) に溶解し、TFE (6.6 mL) 及びTFA (660 μL) を加えて室温で30分間攪拌した。沈殿物をセライトろ過し、ろ液にDIPEA (1700 μL) を加えた後、減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物103 (1.89 g, 93.5%) を得た。
化合物104の合成
　化合物103を出発原料とした以外は、上記の化合物15の合成例と同様にして化合物104 (93.7%) を得た。
化合物105の合成
　化合物104を出発原料とした以外は、上記の化合物16の合成例と同様にして化合物105 (92.8%) を得た。
化合物106の合成
　化合物105を出発原料とした以外は、上記の化合物22の合成例と同様にして化合物106 (86.6%) を得た。
Bdev-25の合成
　化合物106を出発原料とした以外は、上記のBdev-5の合成例と同様にしてBdev-25 (27.1%) を得た。 HRMS m/z [M + H]+: calcd for C66H87N12O16: 1303.64, found 1303.72.
（実施例１１）Bdev－２７、２８、２９、３０の合成
　Bdev－２７、２８、２９、３０の合成経路の概略を図５に示す。
　Bdev－２７、２８、２９、３０は、以下の通りにして合成した。
化合物108の合成
　化合物25 (319 mg, 0.113 mmol) をCH2Cl2 (2 mL) に溶解し、Et3N (31.8 μL, 0.226 mmol, 2.0 equiv) 及びpropionic anhyderide (29.1 μL, 0.226 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で45分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物108 (301 mg, 92.9%) を得た。
化合物109の合成
　化合物25 (293 mg, 0.104 mmol) をCH2Cl2 (2 mL) に溶解し、Et3N (29.2 μL, 0.208 mmol, 2.0 equiv) 及びn-valeric anhyderide (40.8 μL, 0.208 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で45分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物109 (274 mg, 90.7%) を得た。
化合物110の合成
　化合物25 (315 mg, 0.111 mmol)、MeO-[(CH2)2O]3CH2CH2CO2H (Chempep社製: 31.3 mg, 0.132 mmol, 1.2 equiv)、HOAt (18.3 mg, 0.134 mmol, 1.2 equiv)、及びHATU (55.2 mg, 0.145 mmol, 1.3 equiv) をTHF (2220 μL) に溶解し、DIPEA (96.7 μL, 0.555 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で2時間10分攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物110 (176 mg, 52.2%) を得た。
化合物111の合成
　化合物25 (314 mg, 0.111 mmol)、MeO-[(CH2)2O]7CH2CH2CO2H (Chempep社製: 55.7 mg, 0.135 mmol, 1.2 equiv)、HOAt (18.7 mg, 0.137 mmol, 1.2 equiv)、及びHATU (50.6 mg, 0.133 mmol, 1.2 equiv) をTHF (2220 μL) に溶解し、DIPEA (96.7 μL, 0.555 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間10分攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物111 (146 mg, 40.9%) を得た。
Bdev-27の合成
　化合物108 (301 mg, 0.105 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (10 mL) 及びTIS (1 mL) を加えて室温で4時間30分攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理を行いBdev-27 (28.6 mg, 20.7%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C67H89N12O16: 1317.65, found 1317.52.
Bdev-28の合成
　化合物109 (274 mg, 0.0943 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (10 mL) 及びTIS (1 mL) を加えて室温で4時間30分攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理を行いBdev-28 (42.8 mg, 33.7%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C69H93N12O16: 1345.68, found 1345.58.
Bdev-29の合成
　化合物110 (176 mg, 0.0579 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (6 mL) 及びTIS (750 μL) を加えて室温で4時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理を行いBdev-29 (15.5 mg, 18.1%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C74H103N12O20: 1479.74, found 1479.57
Bdev-30の合成
　化合物111 (146 mg, 0.0454 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (5 mL) 及びTIS (750 μL) を加えて室温で4時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理を行いBdev-30 (3.7 mg, 4.9%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C82H119N12O24: 1655.85, found 1655.67.
（比較例）比較例化合物の合成
　比較例として、ＷＰ９ＱＹペプチド（ジスルフィド架橋：化合物番号：STD）を用いた。ＷＰ９ＱＹペプチドは、２，４ドコシロキシベンジルアルコールにアミノ酸を逐次縮合し、直鎖配列を合成した後、ヨウ素酸化によってジスルフィド結合を形成しトリフルオロ酢酸により２，４ドコシロキシベンジルアルコールを切断する工程を経て調製した。
（参考例）参考例の合成
　参考例として架橋部分が、チオエーテル架橋（化合物番号Comp.１）、またはオレフィン架橋（化合物番号Comp.３）に改変された改変体を用いた。チオエーテル架橋ＷＰ９ＱＹペプチドは、図６に記載の合成スキームに従って合成した。オレフィン架橋ＷＰ９ＱＹペプチドは、図７に記載の合成スキームに従って合成した。
（実施例７）ペプチダーゼに対する抵抗性
　カルボキシペプチダーゼおよびキモトリプシンを用いて、本発明のペプチドのペプチダーゼに対する抵抗性を検討した。ペプチダーゼに対する抵抗性は以下の通りにして測定した。
（カルボキシペプチダーゼによる分解）
　SIGMA社より購入したカルボキシペプチダーゼを、PBS(-)にて1 U/mlになるように酵素液を調製し、ウォーターバスにて37℃で保温した。次いで、DMSO:純水＝１：１混合溶媒にて5 mg/mlに調製したペプチド溶液をPBS(-)にて１mg/mlに調製し、酵素液とペプチド溶液を４：１で混合し、ペプチドの終濃度が0.2 mg/mlとなるようにした。その後速やかに37℃にして反応を行った。経時的に0.1 mlずつサンプリングし、反応停止液（25%TFA in アセトニトリル 20 μＬ）を加えて反応を停止した。各試料をHPLCにて測定し、ペプチダーゼによるペプチドの分解を測定した。サンプリングのタイミングは0分、0.5分、1分、2分にて行い、2分においても50％以上の分解が得られない場合は、さらに0.5時間後、1時間後、3時間後、加えて場合により6時間後に行い、長時間安定なペプチドに関しては、さらに24時間後から168時間後までの範囲で必要に応じてサンプリングを行った。添加したペプチドの半分が分解される時間を測定した。結果を表３に示す。
（キモトリプシンによる分解）
　SIGMA社より購入したキモトリプシンを、0.1 M Tris-HCl(pH8.0)にて4 U/mlになるように酵素液を調製し、ウォーターバスにて37℃で保温した。次いで、DMSO：純水=1：1にて5mg/mlに調製したペプチド溶液を0.1 M Tris-HCl(pH8.0)にて1 mg/mlに調製し、酵素液とペプチド溶液を４：１で混合しペプチド終濃度0.2 mg/mlとなるようにした。その後、速やかに37℃にして反応を行った。経時的に0.1 mlずつサンプリングし、反応停止液（25%TFA in アセトニトリル 20 μＬ）を加えて反応を停止した。各試料をHPLCにて測定し、キモトリプシンによるペプチドの分解を測定した。サンプリングのタイミングは0分、0.5分、1分、2分にて行い、2分において50％以上の分解が得られない場合は、さらに0.5時間後、1時間後、3時間後に行い、添加したペプチドの半分が分解される時間を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
 　ここで構造様式Ｐ－１とＰ－３はそれぞれ以下の構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
　上記の結果より、本発明の架橋化方法に従って作成された本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体が、ジスルフィド架橋またはチオエーテル架橋のＷＰ９ＱＹペプチドに比べて、ペプチダーゼに対する分解耐性が改善していることが示された。
（実施例８：破骨細胞分化抑制試験）
　本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の破骨細胞分化抑制活性を、培養破骨細胞を用いて、以下のようにして検討した。
　自家繁殖、もしくは日本クレアから購入したC57BL/6JJc1マウス（体重18-20 g）から骨髄細胞を採取し、ＲＡＮＫＬ（50 ng/ml、組換えヒトＲＡＮＫＬを和光純薬工業から購入）およびＭ－ＣＳＦ（25 ng/ml、組換えヒトＭ－ＣＳＦを、R&D Systemから購入）を含有する培地（α-MEM、10％FBS（SIGMA）、penicillin 100U、streptomycin 100 μg/ml、含有）にて、各ＷＰ９ＱＹ架橋ペプチド模倣体の存在下で、４日間培養した。
　各ペプチドは、DMSO：MQ=1:1にて5 mg/ml に調製（下記図８に示す実験に使用）もしくはDMSO：MQ=1:9にて4 mM に調製（下記図９に示す実験に使用）した溶液を培養培地にて希釈し、フィルター（0．22 μm）にて濾過滅菌し、ペプチド調製液とした。各ペプチド調製液を、目的の終濃度となるようにして加え、骨髄細胞を上記条件で培養した。
　培養3日目に新しい培地に交換し、4日目に3．6％ホルマリン（36％ホルマリンをPBS(-)にて希釈）にて10分間固定した後、アセトン：エタノール＝１：１にて30秒間透過処理し20分間乾燥させてＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）染色を行い、成熟破骨細胞を確認した。ペプチド濃度は、培地中の最終濃度が、0.313(10) μMになるようにして培養した。コントロールとして、ペプチド無添加およびＷＰ９ＱＹペプチド（ジスルフィド結合）添加を用いた。結果を、図８よび図９に示す。Bdev-2およびBdev-3が、低濃度において、ＷＰ９ＱＹペプチド（ジスルフィド結合）より強い破骨細胞分化抑制作用を持つことが示された。
　他の各ペプチドは、DMSO：MQ=1:9にて4 mM に調製した溶液を培養培地にて希釈し、上記と同様にして破骨細胞分化抑制作用を確認した。結果を図１０および図１１に示す。Bdev-25、Bdev-27及びBdev-28が、Bdev-2、Bdev-3と同様に強い破骨細胞分化抑制作用を持つことが示された。
（実施例９：マウス動物実験における骨密度減少抑制試験）
　日本クレア社より購入したC57BL/6JJclマウス(5週齢、雄)をメタボリカにて低カルシウム食を与え飼育し、低カルシウム食モデルマウスを作製した。WP9QYおよびBdev-2は、0.72 mg/mLに毎日調製した。メタボリカ飼育マウスに、PBS(-)もしくはペプチド調製液(24 mg/kg)を1日3回、6日間皮下投与した。マウスのコントロールはメタボリカで通常食を与え飼育したマウスを用いた。骨密度はpQCTのPeel Mode 20で評価した。
　各群間の体重変化に差はなかったが、骨密度は低カルシウム食マウスで有意に減少し、PBS投与群と比べ、WP9QY投与群で骨密度減少抑制傾向がみられ、Bdev-2投与群では有意な骨密度減少抑制効果が確認された（P>0.05）。結果を図１２に示す。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本発明により提供される模倣ペプチドを含んだ組成物は、破骨細胞の増殖阻害剤として、更には、特定の疾患に対する医薬組成物として有用である。

Claims (8)

  1. 　下記の化学式で表されるペプチドを含む破骨細胞の増殖阻害剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     、又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ここで、Ｚ1およびＺ3は、それぞれ独立に、水素原子、無置換または置換された炭素数１～１６のアシル基、無置換または置換された炭素数１～８のアルキル基および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（ｎは自然数である）で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、Ｚ2はヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１～８のモノアルキルアミノ基、－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（ｎは自然数である）で表される分子量１００～１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれる）
  2. 　前記ペプチドが、化１又は化２で表される前記ペプチドであって、かつ、Ｚ1は、水素原子、アセチル基、および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（ｎは自然数である）で表される分子量１０００～３，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、Ｚ3は、水素原子、無置換または置換された炭素数１～８のアシル基、および－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（ｎは自然数である）で表される分子量１０００～３，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、そしてＺ2はヒドロキシル基、アミノ基、および－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量５００～２，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれる、請求項１に記載の阻害剤。
  3. 　前記ペプチドが、下記の化学式で表されるペプチドからなる群より選ばれるペプチドである請求項１に記載の阻害剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     、および
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     （ここで、Ａｃはアセチル基を表し、ポリエチレングリコールは、５００～２０００Ｄａの数平均分子量をもつポリエチレングリコールを表す）。
  4. 　前記ペプチドが上記化８、化１０、化１１又は化１２である請求項１に記載の阻害剤。
  5. 　請求項１～４のいずれか一つに記載のペプチドを用いて破骨細胞の増殖を阻害する方法。
  6. 　請求項１～４のいずれか一つに記載のペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
  7. 　骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチ及び他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移からなる群から選択される疾病の治療剤である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチ及び他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移からなる群から選択される疾病の治療又は予防方法であって、このような治療又は予防が必要である哺乳類に、請求項１～４のいずれか一つに記載のペプチドの少なくとも一つを有効量で投与することを含む、治療又は予防方法。
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