KR20010071563A

KR20010071563A - 불안정한 디펩티딜 펩티다제 ｉｖ 억제제의 화합물

Info

Publication number: KR20010071563A
Application number: KR1020007014586A
Authority: KR
Inventors: 데무쓰한스-울리히; 슈미트외른; 호프만토르슈텐; 그룬트콘라드
Original assignee: 추후제출; 프로비오드룩 게젤샤프트 퓌어 아르츠나이미텔포르슝 엠베하
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2001-07-28
Also published as: AU758843B2; JP2002518518A; CA2335978A1; PL345060A1; CN100345866C; IL140338A0; US20010020006A1; JP3761781B2; HUP0102250A2; AU4777299A; KR100630254B1; US7053055B2; CN1306541A; IS5739A; NZ508721A; WO1999067279A1; DE19828114A1; HUP0102250A3; NO20006483D0; RU2226195C2

Abstract

본 발명은 화학식 A-B-C(여기서, A는 아미노산이고, B는 A와 C사이의 화학 결합이거나 아미노산이고 C는 DP IV의 불안정한 억제제이다)로 나타낸 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV)의 불안정한 억제제의 화합물에 관한 것이다.

상기 화합물은 포유동물의 손상된 글루코스 내성, 포도당뇨증, 과지질혈증, 대사적 산성혈증, 당뇨병, 당뇨성 신경병증 및 신장 병증, 및 당뇨병의 속발증을 치료하는데 사용된다.

Description

불안정한 디펩티딜 펩티다제 ＩＶ 억제제의 화합물{Compounds of unstable dipeptidyl peptidase IV inhibitors}

본 발명은 화학식 A-B-C[여기서, A는 아미노산이고, B는 A와 C 사이의 화학 결합이거나 아미노산이고, C는 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV)의 불안정한 억제제이다]를 갖는, 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV)의 불안정한 억제제의 화합물에 관한 것이다.

아미노아실 티아졸리디드, 아미노아실 피롤리디드, N-디펩티디딜, O-아실 하이드록실아민 및 기타 화합물이 혈청 효소인 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV) 및 이의 동족 효소의 억제제로서 작용하는 것으로 공지되어 있다[문헌참조: DEMUTH, H. -U., J. Enzyme Inhibition 3, 249(1990); DEMUTH, H. -U., HEINS, J., in Dipeptidyl Peptidase IV(B. Fleischer, Ed.) R.G. Landes, Biomedical Publishers, Georgetown, 1995, 1-37].

예를 들어, 이식하는 경우에 T-세포-매개된 면역 반응이 디펩티딜 펩티다제 IV의 안정한 억제제에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: KOROM, S., DEMEESTER, I., STADLBAUER, T.H.W., CHANDRAKER, A., SCHAUB, M., SAYEGH, M.H., BELYAEV, A., HAEMERS, A., SCHARPE, S., KUPIEC-WEGLINSKI, J.W., Inhibition of CD 26/dipeptidyl peptidase IV activity in vivo prolongs cardiac allograftsurvival in rat recipients, Transplantation 63, 1495(1997)]. 류마티스 관절염도 억제될 수 있다[문헌참조: TANAKA, S., MURAKAMI, T., HORIKAWA, H., SUGIURA, M., KAWASHIMA, K., SUGITA, T., Suppression of arthritis by the inhibitors of dipeptidyl peptidase IV. Int. J. Immunopharmacol. 19, 15(1997)].

또한, 포유동물 혈액중의 DP IV 또는 DP IV-동족 효소 활성의 안정한 억제제(효능제)를 투여함과 연관된 일시적인 효소 활성의 저하는 DP IV 및 DP-IV 형 효소에 의한 내인성 (또는 추가로 외부에서 투여됨) 인슐린 자극성 펩타이드 위 억제성 폴리펩타이드 1-42(GIP_1-42)와 글루카곤형 펩타이드 아미드-1 7-36(GLP-1_7-36)(또는 GLP-1_7-37또는 이의 동족체)의 분해를 감소시키기 때문에, 인슐린 자극성 펩타이드 호르몬 또는 이의 동족체 농도의 강하가 감소되거나 지연되는 것으로 밝혀졌다. (내인성이거나 외부에서 도입된) 인크레틴 또는 이의 동족체의 안정성이 클수록 DP-IV 효능제의 작용에 의해 췌장내 랑게르한스 세포의 인크레틴 수용체의 인슐린성 자극에 대한 이의 유용성을 증가시키고, 특히, 신체 고유의 인슐린의 효과를 변화시켜 처리된 기관내 탄수화물 대사를 자극시킨다. 결과로서, 처리된 유기제의 혈청중의 혈당 농도는 과혈당증 특유의 글루코스 농도 이하로 감소된다.

결과적으로, 혈중 글루코스의 농도가 지속적으로 상승되어 나타나는 과체중, 포도당뇨증, 과지질혈증 및 심각한 대사 산성혈증 및 당뇨병과 같은 대사적 변화를 DP IV-억제제에 의해 예방하거나 약화시킬 수 있다[문헌참조: DE 196 16 486].

실험적으로 또한 DP IV-억제제를 사용하여 HIV가 CD 26(DP IV) 양성 세포에침투하는 것을 예방할 수 있다[문헌참조: WAKSELMAN, M., NGUYEN, C., MAZALEYRAT, J.-P., CALLEBAUT, C., KRUST, B., HOVANESSIAN, A.G., Inhibition of HIV-1 infection of CD 26+ but not CD 26-cells by a potent cyclopeptidic inhibitor of the DPP IV activity of CD 26. Aabstract P 44 of the 24th European Peptide Symposium 1996].

또한 DP IV가 신경활성 펩타이드[예를 들어, 뉴로펩타이드 Y 및 CLIP]의 활성을 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: MENTLEIN, R., DAHMS, P., GRANDT, D., KRUGER, R., Proteolytic processing of neuropeptide Y and peptide YY by dipeptidyl peptidase IV. Regul. Pept. 49, 133(1993); WETZL, W., WAGNER, T., VOGEL, D., DEMUTH, H.-U., BALSCHUN, D., Effects of the CLIP fragment ACTH 20-24 on the duration of REM sleep episodes. Neuropeptides, 31, 41(1997)].

DP-IV 억제제의 이들 다양한 작용은, 조직의 특정 병리생리학적 증상에 사용되는 경우 이의 작용이 또 다른 정상적인 생리학적 상태, 예를 들어, 또 다른 기관에 효과를 나타낼 수 있다는 것을 제안한다. 이들 효과는 표적 기관에 대한 양성 및 음성적인 결과 모두를 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명의 과제는 DP IV 억제제의 높은 생물 유용성을 갖고 특정 표적 조직 또는 표적 기관내에서 정확히 한정된 시간동안 작용이 지속되는 DP IV의 효능제를 제공하는 것이다.

특히, 본 발명의 과제는 높은 생물 유용성을 갖는, 정확하게 한정된 짧은 시간동안 작용을 하는 DP IV의 억제제를 제공하는 것이다.

이들 과제는 화학식 A-B-C[여기서, A는 아미노산이고, B는 A와 C사이의 화학적 결합이거나 아미노산이고, C는 DP IV의 불안정한 억제제이다]을 갖는, 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV)의 불안정한 억제제의 화합물을 제공함으로써 해결된다.

B가 결합인 경우, 특히 이것은 펩타이드 결합이고; B가 아미노산인 경우, 바람직하게 A와 C는 펩타이드 결합으로 연결된다.

본 발명에 따른 화합물은 이의 작용 부위, 이의 작용 개시 시간 및 작용지속 시간이 정확하게 한정될 수 있는 DP IV의 억제제로서 사용될 수 있다.

투여시, 화합물은 예를 들어, 적합한 효소에 의해 절단되고 불안정한 "C" 억제제는 그룹 A-B가 제거됨에 의해 방출된다. 억제제는 화학적 및 효소적 기작 모두에 의해 방출된다. 예를 들어, 에스테라제, 프로테아제 및 펩티다제는 본 발명에 따른 화합물로부터 활성 성분이 방출되도록 작용한다. 상기 에스테라제, 프로테아제등은 예를 들어, 문헌[참조: WO 97/45117, US 5433955, US 5614379 및 US 5624894]에 기술되어 있다.

방출된 불안정한 억제제는 이어서 이미 존재하는 DP IV와 반응하여 이를 억제시킬 수 있다. 직접적인 결과로서, 예를 들어, 상기 언급된 인슐린 자극성 펩타이드가 보다 적게 분해되어 이로써 인슐린의 효과가 증가된다.

DP IV의 불안정한 억제제 자체만을 투여하는 것은 이들이 생체내에서 매우 신속하게 분해되고 이어서 특히 사람 신체중에 억제제를 골고루 분포시키는 것이 불가능하기 때문에 DP IV를 억제시키는데 단점을 갖는 것으로 입증되었다. 특히, 경구 투여시, 상기 억제제는 불안정하여 이들은 실질적으로 전혀 활성을 갖지 못한다. 따라서, 지금까지 특히, 당뇨병 치료시 안정한 억제제가 사용되어 왔다.

놀랍게도, 현재, 불안정한 "C" 억제제가 이들을 화학식 A-B-C의 그룹으로서 마스킹시킴으로써 충분히 안정화될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

또한 피리디늄 질소 원자에서 양으로 하전된 카보닐메틸 피리디늄 그룹을 갖는 화학식 A-B-C의 화합물로서 안정화시킬 수 있다는 것은 놀라운 일이다. 결과로서, A-B 라디칼이 제거된후에 억제제의 활성 친핵성 반응 중심부를 차지하는 그룹상에 메틸렌 그룹이 전자-친화성을 나타낸다. 반응 중심부의 활성화를 근거로 친핵성 부분이 화합물 A-B-C에 비특이적으로 도킹할정도로 친핵성 경향이 증가하여 억제제가 불활성화되어 있을 것으로 예상할 수 있다. 그러나, 놀랍게도, 억제제의 상기 불활성화는 일어나지 않는다.

DP IV 억제제를 사용하여 표적 효소 DP IV상에 단지 단기 효과만을 요구하는 생리학적 조절 회로를 중재하기 위해 본 발명에 따라 예를 들어, 단지 단기 작용만을 갖고 한정된 반감기후에는 화학적 화합물이 어떠한 억제 활성을 갖지 않도록 되는 성분 C로서 억제제가 제공된다.

예를 들어, 당뇨병에서 인크레틴 효과를 강화시키기 위해 억제제의 작용 지속 시간은 몇분정도로도 충분한 반면에 예를 들어, 이식의 경우에 DP IV-매개된 면역 반응의 억제는 장기 작용성인 억제제를 요구한다.

방출된 후 본 발명에 따른 불안정한 억제제는 예를 들어, 피레라진 유도체로 폐환되고 이어서 불활성화된다. 이러한 반응은 자발적으로 일어나고 디펩타이드 유도체의 C-말단 카보닐 작용기상에 N-말단 아미노 질소의 친핵성 작용으로 인한것이고 아미노산/이미드 결합 주변의 시스/트랜스 이성질체화에 의해 촉진되고 이때 이성질체화는 특히 프롤린-함유 펩타이드에서 촉진된다.

더욱이, 분해 과정은 화합물이 목적하는 표적 부위(예; 혈액 순환계)에 도달한 경우에 시작되고 목적하는 활성을 나타내기 시작한다.

본 발명에 따른 억제제의 이들 성질은 억제제가 방출된후 분자내 폐환에 의해 DP IV-억제제가 목적한 바대로 일시적으로 한정되게 불활성화되도록 유도하기 위한 기타 DP IV-억제제를 디자인하는데 사용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따라 C가 C-말단에 활성 카보닐 그룹을 갖는 디펩타이드 유도체인 화합물이 바람직하다. 바람직하게, C는 디펩티딜 클로로알킬 케톤, 디펩티딜 붕소산 또는 디펩디딜 시아니드 화합물 또는 디펩티딜 피리디늄 메틸 케토 화합물이다. 상기 억제제는 특히 효과적인 불안정한 DP IV-억제제인 것으로 입증되었다. 디펩타이드 그룹의 예로서 Ile-Thia, Ile-Pyr, Val-Thia 및 Val-Pyr가 언급될 수 있다.

본 발명에 따라, 억제제(성분 C)는 또한 염형태로 존재할 수 있고 아세테이트, 숙시네이트, 타르트레이트 또는 푸마레이트와 같은 유기염 또는 포스페이트 또는 설페이트와 같은 무기산 라디칼이 바람직하다. 특히 푸마레이트가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라, B가 프롤린, 하이드록시프롤린, 티아졸리딘카복실산, 데하이드로프롤린, 피페콜산, 아제티딘카복실산 또는 아지리딘카복실산인 화합물이 사용되고 특히 프롤린 및 하이드록시프롤린인 것이 바람직하다.

특히, 본 발명에 따른 화합물은 또한 DP IV의 억제제가 각 환자의 필요에 따라 방출된다는 장점을 갖는다.

본 발명에 따른 화합물이 DP IV 분자와 상호작용하는 경우 이것은 효소에 의해 그룹 A-B 및 억제제 C로 절단된다. 억제제 C는 DP IV 분자를 억제하여 이것은 더이상 화합물을 절단할 수 없게 된다. 추가의 DP IV 분자가 존재하는 경우, 마지막 DP IV가 분자가 억제될 때까지 화합물은 계속적으로 절단된다(충분한 양의 상응하는 화합물이 투여된 경우). 잔여 화합물은 분해되지 않고 따라서 DP IV 분자의 농도가 다시 상승하거나 억제제 분자가 DP IV로 대체되거나 억제제 분자가 제거되거나 불활성화될때까지 억제제 저장소를 구성하고 본 발명에 따른 화합물은 이어서 다시 절단되어 억제제를 방출한다.

추가로, 본 발명은 또한 각각의 유기체가, 개체의 경우마다 상이하게 존재하는 DP IV의 양을 억제시키는데 필요한 정확한 양의 억제제를 방출할 수 있다는 장점을 갖는다. 예를 들어, 환자가 고농도의 DP IV를 갖는 경우, 대량의 억제제가 방출될 것이고; 단지 약간의 상승된 DP IV의 농도인 경우 단지 소량의 억제제가 방출된다.

특히, A-B가 화학식 Ile-Pro 또는 Gly-Pro(?)의 디펩타이드인 화합물이 바람직하다.

따라서, 본 발명은 세린 펩티다제 디펩티딜 펩티다제 IV의 불안정한 억제제의 신규 화합물에 관한 것이고 이때 화합물은 다양한 장애, 특히, 당뇨병과 관련된 대사적 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

놀랍게도, 상기 마스킹된 억제제는 추가로 마스킹되지 않은 억제제 보다 상당히 월등한 효과를 나타낸다: 동일한 양의 마스킹되지 않은 DP IV-억제제 및 본 발명에 따른 화합물이 사용되는 경우, 본 발명에 따른 화합물이 위스타 랫트의 글루코스 내성에 있어서 현저히 개선된 결과를 나타낸다.

본 발명에 따른 화합물의 추가의 장점은 DP IV-억제제 작용의 개시 및 또한 작용의 지속시간은 그룹 A-B를 적합하게 선택하여 일시적으로 조절될 수 있다는 사실에 있다. 특히, 본 발명에 따른 화합물로부터 그룹 A-B의 방출은 아미노산 라디칼 A의 성질에 좌우된다: 그룹 A의 정의에 대해서 라디칼 A-B가 DP IV에 의해 화합물 A-B-C로부터 방출되는 속도는 하기의 순서로 나타낼 수 있다: Ile<Val<Phe<Pro<Ala<Gly. 상응하는 DP IV-촉매화된 방출의 속도 상수는 1s^-1내지 100s^-1이다. 정확하게 일시적으로 한정된 방식으로 DP IV-억제제를 방출시키는 방법이 유용하다: 예를 들어, 글루코스-풍부 영양물을 섭취하는 즉시 효소가 즉각적으로 작용하는 경우, 예를 들어, A 그룹으로 Gly 아미노산을 갖는 화합물 A-B-C가 선택되고; 억제제의 작용을 지연시킬 경우 예를 들어, 아미노산 Ile를 그룹 A로서 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 사용함으로써 DP-IV 억제제를 지체 없이, 예를 들어, 실질적으로 영양물 섭취와 동시에 소장의 점막을 통해 수송시킬 수 있다.

더욱이, DP IV-억제제가 방출되는 부위 및 이들이 작용하는 부위는 또한 라디칼 A-B의 특성에 의해 조절될 수 있다.

디펩티딜 펩티다제 IV 뿐만 아니라 다양한 기타 아미노 펩티다제(예: 피로글루타밀 아미노펩티다제 및 프롤릴 아미노펩티다제)는 포유동물의 혈액에 존재한다. 라디칼 A-B를 적절하게 선택하여 본 발명에 따라 아미노펩티다제에 의해 방출되는 DP IV-억제제를 결정할 수 있고 따라서 억제제가 작용하는 부위를 결정할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물 또는 상응하는 약제학적 조성물은 또한 DP IV의 세포-, 조직- 또는 기관-특이적인 억제에 사용될 수 있다. 그룹 A-B는 단지 혈관에 존재하고 충분히 신속한 속도로 억제제를 방출시키는 효소들만이 표적화되도록 선택될 수 있다.

요약하면, 본 발명에 따른 불안정한 DP IV-억제제를 사용하여 완전히 놀라운 방식으로 하기의 사항들을 수행할 수 있는 것으로 언급될 수 있다:

1. 억제제의 작용을 증가시킬 수 있고;

2. 환자의 요구에 따라 억제제가 방출되도록 할 수 있고;

3. 일시적으로 조절되는 방식으로 화합물로부터 억제제를 방출시킬 수 있고;

4. 억제제가 화합물로부터 방출되는 부위가 조절될 수 있고;

5. DP-IV 억제제의 저장소가 제공될 수 있고;

6. 개시제의 작용지속 시간 또는 개시제의 작용 종결이 이의 마스킹이 탈피되는 시간으로부터 정확하게 한정될 수 있다.

본 발명에 따라, 통상적인 담체 또는 부형제와 임의로 배합된 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 함유함을 특징으로하는, 특히 경구 투여용의 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명에 다른 화합물 또는 이들을 함유하는 조성물은 포유동물의 DP IV 활성을 조절함에 의해 치료될 수 있는 포유동물의 장애, 예를 들어, 사람의 대사적 장애의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

특히, 이들은 포유동물의 손상된 글루코스 내성, 포도당뇨증, 과지질혈증, 대사적 산성혈증, 당뇨병, 당뇨성 신경병증 및 신장병증 및 당뇨병의 후유증을 치료하는데 사용될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 불안정한 억제제의 단기 작용지속 시간때문에 특히, DP IV의 장기적 억제를 요구하는 사람 또는 동물 체내의 과정에 최소한의 영향을 미치거나 이에 대한 영향을 예방할 수 있다.

본 발명에 따른 불안정한 DP IV-억제제 C의 합성 및 불안정한 DP IV-억제제의 화합물(A-B-C)의 합성

불안정한 DP IV-억제제 C(화학식 A-B-C에 상응함)의 제조는 실시예 1.1 및 1.2에 나타낸다. 본 발명에 따른 불안정한 DP IV-억제제의 화합물의 합성은 실시예 1.3에 나타낸다. 출발 물질, 각각의 경우에 상응하는 펩티딜 클로로메틸 케톤은 공지된 방법[문헌참조: WEINSTEIN, B., Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Marcel Dekker, New York, Basle, 1977]에 따라 제조한다. 실시예 1.1 및 1.2를 통해 제조되는 N-말단-보호된 디펩타이드 유도체인 피리디늄 메틸 케톤은 매우 안정하고 완전히 특성화될 수 있다. 정상적인 대기 습도에서, N-말단 탈블록킹된 디펩타이드 유도체는 탈블록킹된 후 즉시 세포내 분해 과정을 거쳐 분해 시점을 결정할 수 없다. HPLC 및 질량 스펙트럼으로 산물을 특성화한다.

1.1 H-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^_의 합성

a) Z-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^-

구조식:

제조: z-Val-Pro-클로로메틸케톤 10mmol을 피리딘에 용해시키고 5일동안 25℃에서 교반시킨다. 과잉의 피리딘을 2mbar 진공에서 증류시킨다. Z-Val-Pro-피리디늄 메틸 케톤을 HPLC로 정제한다. 화합물은 오일이다.

실험식: C₂₄H₃₀N₃O₄Cl

분자량: 459.97 Da

수율: 이론치의 45.8%

HPLC: 체류 시간: 2.3분, LiChrosper 100 RP-18(125-4), λ=220nm, 유속=0.5ml/분, 물중의 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

체류 시간: 19.3분, Nucleosl 7 C₈, λ=220nm, 유속=8ml/분, 물중 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

¹H NMR(DMSO-d₆) δ_H: 0.8-1.0(6H, m, H₁₂and H₁₃), 1.8-2.1(3H, m, H₁₁and H₁₆), 2.2-2.4(2H, m, H₁₇), 3.4-3.7(2H, m, H₁₅), 3.7-4.1(2H, m, H₂₀and H₂₁), 4.3-4.5(1H, dd, 5Hz, 8Hz, H₉), 4.8-5.1(2H, m, H₇), 5.8-6.2(3H, m, H₁₄, H₁₉), 7.2-7.5(5H, m, H₂-H₆), 8.2-8.3(2H, m, H₂₂and H₂₃), 8.6-8.7(1H, m, H₂₄), 8.8-9.0(1H, d, 6Hz, NH)

¹³C NMR(DMSO-d₆) δ_C: 136.8(C₁), 127.9(C₂, C₃), 127.8(C₄, C₅), 128.4(C₆), 66.7(C₇), 156.3(c₈), 57.9(C₉), 170.8(C₁₀), 29.7(C₁₁), 18.5(C₁₂, C₁₃), 63.7(C₁₄), 47.2(C₁₅), 25.1(C₁₆), 27.9(C₁₇), 200.3(C₁₈), 71.1(C₁₉), 146.1(C₂₀, C₂₁), 128.3(C₂₂, C₂₃), 146.4(C₂₄)

MALDI-TOF-MS m/z: 424.6Da(M+H⁺, 염화 이온 없음)

b) H-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^-

구조식:

제조: Z-보호 그룹을 5분의 반응 시간동안 HBr/빙초산을 사용하여 Z-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₄)/Cl^-로부터 제거한다. 2ml의 HBr/빙초산(33%)을 Z-보호된 펩타이드 1.0mmol에 첨가하고 혼합물을 약 10분동안 23℃에서 교반시킨다. 진공 농축시킨다. 펩타이드를 디에틸 에테르를 사용하여 메탄올로부터 브롬화수소의 형태로 침전시키고 흡입 여과하고 진공 건조시킨다.

실험식: C₁₆H₂₄N₃O₂Cl

분자량: 325.84Da

수율: 이론치의 97.7%

HPLC: 체류시간: 7.4분, Lichrosper 100 RP-18(125-4), λ=220nm, 유속=0.5ml/분, 물중의 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

MALDI-TOF-MS m/z: 291.2Da(M + H⁺, 염화 이온 없음)

1.2 H-Phe-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^-의 합성

a) Z-Phe-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^_

구조식:

제조: 2ml의 피리딘을 10mmol의 Z-Phe-Pro-클로로메틸 케톤에 첨가한다. 혼합물을 4일동안 23℃에서 교반시킨다. 과량의 피리딘을 2mbar 진공에서 증류시킨다. 조악한 산물을 60g의 실리카 겔상에서 정제한다. 클로로포름/메탄올(9:1 용적부)의 용출물에서 처음의 산물을 수거하고 용출물의 극성이 증가함에 따라 클로로메틸 케톤을 수거한다. Z-Phe-Pro-피리디늄 메틸 케톤을 최종적으로 HPLC 정제한다.

실험식: C₂₈H₃₀N₃O₄Cl

분자량: 508.01Da

수율: 이론치의 69.6%

HPLC: 체류시간: 17분, LiChrosorb RP 8(Hibar), λ=220nm, 유속=8.0ml/분, 물중의 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

체류시간: 3.4분, LiChrosper RP- 8(125 * 4), λ=220nm, 유속=1.5ml/분, 25분내의 물중의 아세토니트릴 농도 기울기 30 내지 80%(0.1% TFA)

체류시간: 10.2분, Nucleosil 7 C₈, λ=220nm, 유속=8ml/분, 물중의 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

¹H NMR(DMSO-d₆) δ_H: 1.7-2.1(4H, m, H₂₀, H₂₁), 2.7-3.0(2H, m, H₁₁), 3.4-3.9(2H, m, H₁₉), 4.4-4.6(1H, m, H₉), 4.6-4.8(2H, m, H₂₄, H₂₅), 5.0-5.1(2H, dd, H₇), 5.7-5.8(1H, d, H₁₈), 5.9-6.1(2H, dd, H₂₃), 7.2-7.4(10H, m, H₂-H₆, H₁₃-H₁₇), 8.6-8.8(1H, dd, H₂₈), 8.2-8.3(2H, d, H₂₆and H₂₇), 8.8-8.9(1H, d, NH)

¹³C NMR(DMSO-d₆) δ_C: 136.8(C₁), 127.9(C₂, C₃), 127.6(C₄, C₅), 128.4(C₆), 65.5(C₇), 156.3(C₈), 54.1(C₉), 170.9(C₁₀), 36.4(C₁₁), 137.6(C₁₂), 126.6(C₁₃, C₁₄), 128.4(C₁₅, C₁₆), 129.3(C₁₇), 63.1(C₁₈), 46.9(C₁₉), 25.1(C₂₀), 27.6(C₂₁), 200.7(C₂₂), 66.3(C₂₃), 146.2(C₂₄, C₂₅), 128.2(C₂₆, C₂₇), 146.4(C₂₈)

MALDI-TOF-MS m/z: 472.8 Da(M + H⁺, 염화 이온 없음)

b) H-Phe-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^-

구조식:

제조: Z-보호 그룹을 5분동안의 반응 시간후에 Z-Phe-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₄)/Cl^-로부터 제거한다. 2ml의 HBr/빙초산(33%)을 Z-보호된 펩타이드 1.0mmol에 첨가하고 혼합물을 약 10분동안 23℃에서 교반시킨다. 진공 농축시킨다. 펩타이드를 디에틸 에테르를 사용하는 브롬화수소의 형태로 침전시키고 흡입 여과하고 진공 건조시킨다.

실험식: C₂₀H₂₄N₃O₂Cl

분자량: 373.88Da

수율: 이론치의 98%

HPLC: 체류시간: 6.9분, LiChrosper 100 RP-18(125-4), λ=220nm, 유속= 0.5ml/분, 물중의 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

MALDI-TOF-MS m/z: 337.2Da(M + H⁺, 염화 이온 없음)

1.3 H-Gly-Pro-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^-의 합성

a) Z-Gly-Pro-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^-

구조식:

제조: 2ml의 피리딘을 10mmol의 Z-Gly-Pro-Val-Pro-클로로메틸 케톤에 첨가한다. 혼합물을 23℃에서 4일동안 교반시킨다. 과량의 피리딘을 2mbar 진공에서 증류시킨다. Z-Gly-Pro-Val-Pro-피리디늄 메틸 케톤을 HPLC로 정제한다.

실험식: C₃₁H₄₀N₅O₆Cl

분자량: 614.14 Da

HPLC: 체류시간: 17.4분, LiChrosorb RP 8 Hibar, λ=220nm, 유속 8ml/분,물중의 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

체류시간: 5.4분, LichroCART 100 RP-18(250-4), λ=220nm, 유속=0.5ml/분, 물중의 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

체류시간: 17.7분, Nucleosil 100 7 C₈, λ=220nm, 유속=5ml/분, 물중의 이소크래틱 50% 아세토니트릴(0.1% TFA)

¹³C NMR(DMSO-d₆) δ_C: 134.4(C₁), 128.9(C₂, C₃), 128.2(C₄, C₅), 129.8(C₆), 65.3(C₇), 157.2(C₈), 39.0(C₉), 165.7(C₁₀), 56.0(C₁₁), 41.6(C₁₂), 24.6(C₁₃), 29.0(C₁₄), 170.5(C₁₅), 52.1(C₁₆), 171.9(C₁₇), 30.3(C₁₈), 18.6, 19.3(C₁₉, C₂₀), 58.9(C₂₁), 47.2(C₂₂), 25.0(C₂₃), 29.4(C₂₄), 196.5(C₂₅), 65.8(C₂₆), 137.9(C₂₇, C₂₈), 129.1(C₂₉, C₃₀), 146.5(C₃₁)

MALDI-TOF-MS m/z: 579.7Da(M + H⁺, 염화 이온 없음)

b) H-Gly-Pro-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)/Cl^-

구조식:

제조: Z-보호 그룹을 5분동안의 반응 시간후에 Z-Phe-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₄)/Cl^-로부터 제거한다. 2ml의 HBr/빙초산(33%)을 Z-보호된 펩타이드 1.0mmol에 첨가하고 혼합물을 약 10분동안 23℃에서 교반시킨다. 진공 농축시킨다. 펩타이드를 디에틸 에테르를 사용하여 브롬화수소의 형태로 침전시키고 흡입 여과하고 진공 건조시킨다.

실험식: C₂₃H₃₄N₅O₄Cl

분자량: 480.0 Da

수율: 이론치의 95%

MALDI-TOF-MS m/z: 443.9Da(M + H⁺, 염화 이온 없음)

1. 수용액중에서 불안정한 DP IV-억제제와 이의 마스킹된 형태의 분해

실시예 1.1 및 1.2에서 제조된 억제제의 안정성을 분석하기 위해 억제제를 완충액 수용액에서 항온처리하고 이의 분자내 폐환 반응을 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 사용하여 조사한다(도 2 및 도 3). 이러한 반응 산물은 각각 피라진 유도체이다(도 1).

분자량이 337.2Da인 H-Phe-Pro-피리디늄 메틸 케톤이 물이 제거되면서 분자량이 319.2Da인 사이클릭 피라진 유도체로 분해되는 것은 3분내에 정량적으로 완료된다(도 2).

분자량이 291.2Da인 H-Val-Pro-피리디늄 메틸 케톤이 물이 제거되면서 분자량이 273.2Da인 사이클릭 피라진 유도체로 분해되는 것은 60분 내에 정량적으로 완료된다(도 3).

분자내 반응동안에 일어나는 피라진의 이중 결합 시스템의 형성이 UV 스펙트럼에 의해 폐환 반응을 정량적으로 분석할 수 있도록 해준다(도 4). 0.1M HEPES 완충액, pH=7.6, 25℃에서, 불안정한 DP IV-억제제의 분자내 폐환에 대해 이로부터 결정된 속도 상수는 표 1에 나타낸다.

불안정한 DP IV-억제제의 폐환 계수

화합물	k 분^-1	반감기(분)
H-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)	8.7 x 10^-4(± 4 x 10^-5)	13.3
H-Phe-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)	1.2 x 10^-3(±3.9 x 10^-5)	9.6

이와 대조적으로 본 발명에 따른 화합물 H-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅) 및 H-Gly-Pro-Val-Pro-CH₂(N⁺C₅H₅)는 동일한 조건하에서 24시간동안 완전하게 안정성이 있는 것으로 입증되었다.

2. 수용액중에서 본 발명에 따른 불안정한 DP IV-억제제 또는 이를 포함하는 화합물과 디펩티딜 펩티다제 IV의 상호반응

DP IV 표적 효소를 기질의 존재하에 불안정한 억제제로 항온처리하는 경우, 초기에 효소의 억제가 관찰된다: 실험 시간이 경과함에따라 이와 병행하여 발생되는, 억제제의 분자내 폐환과 같은 자발적으로 일어나는 화학 반응으로 반응내 억제제의 농도가 감소되어 억제가 다시 감소한다. 상기 효과는 도 5 및 6에 나타낸다.억제제의 농도가 시간에 따라 감소하기 때문에 기질의 효소-촉매화된 가수분해의 속도는 시간이 경과함에 따라서 다시 증가한다.

비-마스킹된 DP IV-억제제와는 대조적으로, 본 발명에 따른 화합물 H-Gly-Pro-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)는 효소의 부재하에 완충된 수용액중에서 24시간동안 안정한 것으로 입증되었다. 활성 DP IV-억제제인 H-Val-Pro-CH₂-(N⁺C₅H₅)는 단지 DP IV 효소(DP IV-억제제를 방출시키기 위해 실시예에서 사용됨)가 첨가되는 경우에만 N-말단 디펩타이드 H-Gly-Pro-OH가 제거되면서 방출된다. 따라서, 질량 스펙트럼에서 본 발명에 따른 항온 처리된 화합물 50% 이상이 60분의 항온 처리 시간후에도 검출될 수 있다. 이러한 지연된 방출로 인해 또한 놀랍게도 표적 효소의 목적하는 효과적인 억제 뿐만 아니라 불안정한 DP IV-억제제와 비교하여 현저히 감소된 농도의 본 발명에 따른 화합물과 관계된 활성을 지연시킨다(도 8).

Claims

화학식 A-B-C(여기서, A는 아미노산이고, B는 A와 C 사이의 화학 결합 또는 아미노산이고, C는 DP IV의 불안정한 억제제이다)로 나타낸, 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV) 억제제의 화합물.
제1항에 있어서, B가 프롤린, 하이드록시프롤린, 티아졸리딘카복실산, 데하이드로프롤린, 피페콜산, 아제티딘카복실산 또는 아지리딘카복실산임을 특징으로하는 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, B가 프롤린 또는 하이드록시프롤린임을 특징으로하는 화합물.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, C가 디펩티딜 알킬 케톤 유도체와 같은 C-말단에서 활성 카보닐 그룹을 갖는 디펩타이드 유도체임을 특징으로하는 화합물.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, C가 디펩티딜 클로로알킬 케톤, 디펩티딜 붕소산, 디펩티딜 시아니드 또는 디펩티딜 피리디늄 메틸 케톤 라디칼임을 특징으로하는 화합물.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 억제제가 염형태로 존재함을 특징으로하는 화합물.
제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, A-B가 화학식 Ile-Pro 또는 Gly-Pro의 디펩타이드임을 특징으로하는 화합물.
통상적인 담체 또는 부형제와 임의로 배합된 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물을 포함함을 특징으로하는, 특히 경구 투여용의 약제학적 조성물.
DP IV의 일시적으로 조절된 생체내 억제를 위한 약제를 제조하는데 있어서 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약제학적 조성물의 용도.
DP IV의 세포-, 조직- 또는 기관-특이적인 억제에 있어서 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약제학적 조성물의 용도.
포유동물의 DP IV 활성을 조절함에 의해 치료될 수 있는 포유동물의 장애를 치료하는데 있어서 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약제학적 조성물의 용도.
제10항에 있어서, 사람의 대사적 장애를 치료하기 위한 용도.
제10항에 있어서, 포유동물의 손상된 글루코스 내성, 포도당뇨증, 과지질혈증, 대사적 산성혈증, 당뇨병, 당뇨 신경병증 및 신장병증 및 당뇨병의 속발증을 치료하기 위한 용도.