JP2001527065A - 免疫調節化合物を含有するγ−グルタミルおよびβ−アスパルチルおよびそれを用いた方法 - Google Patents
免疫調節化合物を含有するγ−グルタミルおよびβ−アスパルチルおよびそれを用いた方法Info
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Abstract
Description
種類の白血球の成熟および分化を促進させるγ−L−グルタミル、γ−D−グル
タミル、β−L−アスパルチル、またはβ−D−アスパルチル部分のいずれかを
含む免疫促進化合物に関する。このように、白血球細胞の分化および増殖を選択
的に促進することによって、病気を引き起こす細菌に対する体の免疫力を高める
ことができ、さらに自己炎症状態を調節して改善する。
718号の一部継続出願であり、この出願は、共に1995年11月28日に出
願されたロシア特許出願第95119704号および第95120266号の優
先権を主張している。さらに、本出願は、1997年12月25日に出願された
ロシア特許出願第97120940号に関連し、その優先権を主張している。米
国特許出願第08/634,718は参照により本願明細書に引用されるものと
する。
するために適用された細胞網である。一度免疫系統が活性化されると、それは体
内に「自己でない」実態を除去するようにデザインされたエフェクタ機能を高め
るようにさまざまな細胞や分子の関与をうながす。リンパ球は免疫系統の細胞で
あり、異物の存在を明確に認識し選択的に除去することができる。インベーダと
の反応で特別でないものとしてみなされる好中球などの免疫系統の他の細胞と対
比すると、リンパ球の特徴は、特殊性、多様性、記憶および免疫反応に対する自
己/非自己認識を与えることである。
る。Bリンパ球は、骨髄から発生しその中で成熟して、抗体分子の形成に寄与す
る。Tリンパ球も、骨髄から生じるが、これは胸腺内で成熟する。T細胞には2
つの主要な副群がある。すなわち、Tヘルパー細胞とT細胞毒性細胞である。こ
れら2つのタイプのT細胞は、2つの膜糖たんぱく質のうちのいずれか、すなわ
ちCD4またはCD8が存在することによって区別できる。抗原複合体(特定の
たんぱく質に連結した異物分子)によって活性化される場合、Tヘルパー細胞(
CD4を表す)は、サイトカインとして総称して公知のさまざまな成長因子を分
泌することによって応答する。これらのサイトカインは、T細胞毒性細胞を含む
免疫系統の他の細胞を活性化させる信号である。活性化される場合、T細胞毒性
細胞(CD8を表す)は、体内をモニタし、体内から病原細胞、異物細胞、ウィ
ルスに感染した細胞、腫瘍細胞を除去する。
チドホルモンにより調整される。このようなホルモンの1つに、49−アミノ酸
残基ペプチドのチモポイエチンがある。チモポイエチンの残基32−36である
Arg−Lys−Asp−Val−Tyrは、チモポイエチンの生物活性を保持
し、チモペンチン(thymopentin) と呼ばれる免疫調節薬の基本となるものである
。チモペンチンを治療時に投与する使用目的には、慢性関節リウマチ、皮膚病の
状態、バクテリア、ウィルス、菌による感染、手術や癌治療による免疫低下の反
転、B型肝炎ウィルスのワクチン接種に対する反応の強化、および後天性免疫不
全症候群(AIDS)が含まれており、Tヘルパー(CD4)細胞はウィルスに
より特に攻撃される状態にある(クリスチャン, ジェイ. エス.(Christian, J.S
.)の 「チモペンチンの薬理学、臨床投与および毒性に関する報告書(A review o
f the Pharmacology, Clinical Applications, and Toxicology of Thymopentin
)」、トランスジェニカ(Transgenica)、ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオ
テクノロジー(The Journal of Clinical Biotechnology) 、1、23〜34頁、
1994年)。
hymogen)と呼ばれるGlu−Trpである。連鎖−Glu−Trp−も、チモポ
イエチンの合成の前駆体である分子に発生するが、−Glu−Trp−は、49
−アミノ酸ホルモンの一部ではなく、チモポイエチンの生物活性に寄与するもの
として見なされるジペプチドでもない。チモゲンは、ロシアで発見され、主に、
疫病の予防や感染治療に使用された。チモゲンは、チェルノブイリ原発事故によ
り放射能に偶発的に被爆したことが原因でリンパ球がダメージを受けた後の免疫
機能を増大させるために使用された。(カビンソン等(Khavinson et al.)、国際
特許公開第WO92/17191号公報および国際特許公開第WO93/088
15号公報、「薬学ジペプチド組成およびその使用方法(Pharmaceutical Dipept
ide Compositions and Methods of Use Thereof)」。)
トリペプチドグルタチオンである。合成γ−L−グルタミル分子も候補薬として
使用されてきた。γ−L−グルタミル部分は分子の活性部分のキャリヤとして使
用されるため、これらの候補薬は、「プロドラッグ」と呼ばれる。例えば、γ−
L−グルタミニル−4−ヒドロキシ−3−ヨードベンゼンは、人体およびマウス
の黒色腫の細胞株において抗癌作用を発揮する。この化合物の抗癌作用は、癌細
胞付近で4−ヒドロキシ−3−ヨードベンゼンの酵素放出によるものであると考
えられる(プレジオソ等(Prezioso et al.) 、「γ- グルタミルトランスペプチ
ダーゼの発現は抗癌プロドラッグであるγ−グルタミニル−4−ヒドロキシ−3
−ヨードベンゼンの成長抑制作用を調整する (γ-Glutamyltranspeptidase Expr
ession Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodru
g γ-glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene)」、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・キャンサー(International Journal of Cancer) 、56、874頁〜
879頁、1994年)。また、γ−L−グルタミル−ドーパミンおよびγ−L
−グルタミル−5−ヒドロキシ−トリプトファンは、ドーパミンと5−ヒドロキ
シ−トリプトファンを脳神経に運び供給することがあるプロドラッグとして記載
されている(リカムワ等(Likamwa et al.)、「γ−L−グルタミル−5−ヒドロ
キシ−L−トリプトファンの抗ナトリウム排泄増加作用は正常脳の5−ヒドロキ
シトロタミンの脱カルボキシル化に依存する(The Antinatriuretic Action of
γ-L-glutamyl-5-hydroxy-L-tryptophan is Dependent on its Decarboxylation
to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain)」、ブリティッシュ・ジャーナル・
オブ・クリニカル・ファーマコロジィ(British Journal of Clinical Pharmacol
ogy)、387:265〜269、1994年)。
19日に公開された国際特許公開第WO96/40740号公報には、式X−A
−D−Trp−Y(I)のペプチドが開示されており、ここで、A=D−Glu
またはD−イソグルタミン酸(D−iGlu)であり、X=H、Gly、Ala
、Leu、Ile、Val、Nva、Pro、Tyr、Phe、Trp、D−A
la、D−Leu、D−Ile、D−Val、D−Nva、D−Pro、D−T
yr、D−Phe、D−Trp、γ−アミノブチル酸またはε−アミノカプロン
酸であり、Y=Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Nva、Pro、T
yr、Phe、Trp、D−Ala、D−Leu、D−Ile、D−Val、D
−Nva、D−Pro、D−Tyr、D−Phe、D−Trp、γ−アミノブチ
ル酸、ε−アミノカプロン酸、OH、または1〜3C置換アミノである。化合物
(I)は、免疫抑制作用(例えば、脾細胞の増殖抑制)をもち、人体、獣医学、
実験的生化学に有益であるとされている。
「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連し、免疫調節特性を有する新しい種類の
化合物の実施形態に与えられた名前である。本発明の一部継続出願である米国親
特許出願第08/634,718号には、新しい種類の化合物の数種の化合物が
記載され、請求され、さらにこれらの化合物を用いて免疫調節治療方法が請求さ
れている。ベスチム化合物自体は、γ−L−グルタミル−L−トリプトファンの
化学構造を有する。
族または複素環式アミノ酸またはその誘導体、およびnは1または2である。我
々は、新しい種類の一部として(ベスチム、γ−L−グルタミル−L−トリプト
ファン以外にも)、これらの化合物が含まれることを発見し、ここでRは水素、
Xは、γ−D−グルタミル−L−トリプトファン、γ−L−グルタミル−D−ト
リプトファン、β−L−アスパルチル−L−トリプトファンおよびβ−D−アス
ルチル−L−トリプトファンなどのL−トリプトファンおよびD−トリプトファ
ンである。式1において星印を付けたα炭素は立体構造をもつものであり、nが
2のとき、Xの立体構造とは異なる。特別な好適な実施形態は、γ−D−グルタ
ミル−L−トリプトファンである。式1のペプチドは、無毒の有機または無機酸
を有する製薬的に許容可能な塩を形成することがある。カルボキシル基の塩は、
任意の適切な無機または有機塩基で形成される無毒カルボキシル酸塩を含む。
テムで検査された場合、免疫促進作用が有益なものとなる。この生物学上の作用
のメカニズムは、骨髄Tリンパ球前駆体の分化、リンパ球増殖の促進、およびイ
ンターロイキン−2を含むさまざまなサイトカインの発生の誘導に関する。ベス
チムの薬理効果の最終結果によると、Tヘルパーリンパ球、すなわちCD4マー
カを含む細胞の数が選択的に増加する。
生体内では、体重1kg当たり10ng〜1μgの投与量で作用し、免疫促進剤
の投与よりも500から100万倍高い投与量で毒性が見られない。動物実験で
は、経口投与後に活性である。
る場合、免疫機能が増加した。これらの実験変化は、臨床結果に有益な正の指示
薬(positive indicator)により達成された。
ファンは、ベスチムのものと、さらに広範囲の投与量で観察されるIL−2誘導
と比較すると、生物学上の作用がさらに高くなることが分かる。
ベスチムとその類似体は、伝染病の免疫治療や、放射線への被爆または癌の化学
治療や手術などのその他のストレス因子により、予め低下していた免疫反応の回
復の薬として効果的である。
た状態により生じた免疫不全を緩和して患者に有益に投与され、微生物からの危
険な感染を改善し減少させるように患者に投与され、特に、それぞれ感染しやす
い傾向にある入院中の患者や、手術を受けている患者や、癌の化学治療を受けて
いる患者に対しては被害を受けている場所を処置するように投与される。さらに
、式1の免疫調節化合物は、ウィルス除去を容易にし、病原有機体の免疫監視を
高め、さらには例えば、疱疹ウィルス、水痘ウィルス、肝炎ウィルスおよびHI
Vなどの病気を患っているかまたはその保有者である患者の病気の再発を減少さ
せるために、症候性または無症候性ウィルスに感染している患者に投与され、例
えば、癌などの状態で、自然細胞が体に「異物」として認識されるような自然細
胞を変更する病気の患者に投与され、さらに免疫系統を均衡に調整するために、
慢性関節リウマチ、多発硬化症、強皮症などの自己炎症(自己免疫)の病気の患
者に投与される。
法以外に、式1の免疫調節化合物は、例えば、インフルエンザのワクチン接種と
組み合わせて伝染病の疑いのある健康な患者に投与したり、例えば、肝炎用のワ
クチン接種、この専門用語はワクチン接種の「アジュバント」として本発明で使
用されるワクチン接種と組み合わせて病原体への免疫反応を高めるように投与し
てもよい。
量で投与され、1回の投与または1ヵ月以上の期間にわたって断続的に与えられ
、さらに投与経路は、非経口注射、経口または鼻吸入、または経口摂取によるも
のが好ましい。
調節する特有の化学物質である。例えば、Tヘルパー細胞数を増加させるために
免疫系統を調節すると、バクテリアやウィルスからの感染を処理する有機体の能
力が増大する。また、Tヘルパー細胞の数を増大するように調節することによっ
て、ホストに対して異物である癌細胞に対して体が闘いやすくなる。この代わり
に、これらの物質によって、内因性組織に対してホストのT細胞による過度の攻
撃が生じる自己認識処理の混乱から生じた病気に対してホストが調節を行うこと
もできる。このような場合、本発明の化合物は、慢性関節リウマチおよび多発硬
化症などの自発的な炎症(自己免疫)の病気の兆候や症状が改善されるように、
T細胞数を調整する。
「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連するもので、免疫調節特性を有する新し
い種類の化合物の実施形態に与えられた名前である。免疫促進投与量よりも50
0または500,000倍を超える服用量で毒性は観察されない。ベスチム化合
物自体は、γ−L−グルタミル−L−トリプトファンの化学構造を有する。新し
い種類の合成免疫調節分子は、式1に示すように、アミノ末端にγ−L−グルタ
ミル部分、γ−D−グルタミル−部分、β−L−アスパルチル部分、またはβ−
D−アスパルチル部分を有する。
Xは芳香族または複素環式アミノ酸またはその誘導体であり、好ましくはここで
はX=L−トリプトファンおよびD−トリプトファンである。「X」の芳香族ま
たは複素環式アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−またはジ−(C1-C6
)アルキル置換アミド、アリルアミドおよび(C1-C6 )アルキルまたはアリル
エステルである。「R」の適切なアクリルまたはアルキル部分は、1〜6炭素の
枝分かれしたアクリル基かまたは枝分かれしていないアクリル基、2〜10の炭
素原子からのアクリル基、およびカルボベンゾキシル基およびt−ブチルオキシ
カルボニル基などの阻止基である。式1で星印を付したα炭素は、立体構造をも
つもので、nが2である場合、Xの立体構造とは異なるものである。
ン以外にも)、γ−L−グルタミル−Nin−ホルミル−L−トリプトファン、N
−メチル−γ−L−グルタミル−L−トリプトファン、N−アセチル−γ−L−
グルタミル−L−トリプトファン、γ−D−グルタミル−L−トリプトファン、
γ−L−グルタミル−D−トリプトファン、β−L−アスパルチル−L−トリプ
トファン、およびβ−D−アスパルチル−L−トリプトファンなどの化合物が含
まれる。
形成することがある。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、リン酸一水素ナト
リウムおよび硫酸水素カリウムなどの塩化水素、臭化水素、硫酸およびリン酸お
よび酸金属塩を含む。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、モノ−、ジ−、ト
リカルボン酸を含む。このような酸の例は、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸
、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸
、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸、ヒドロキシゲンゾ酸(hydroxygenzoic)
、酢酸フェニル、桂皮酸、サリチル酸、2−フェノキシ安息香酸、およびメタン
スルホン酸や2−ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸である。カルボ
キシル基の塩は、任意の適切な無機または有機塩基で形成された無毒のカルボキ
シル酸塩を含む。例示的に、これらの塩は、例えば、ナトリウムやカリウムなど
のアルカリ金属、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニ
ウムを含むIIIA族の軽金属、および例えば、トリエチルアミン、プロカイン
、ジベニルアミン、1−エチレンアミン、N,N−ジベンジル−エチレンジアミ
ン、ジヒドロアビエチルアミン:N−(低級)アルキル−ピペリジン、他の適切
なアミンを含むトリアルキルアミンなどの第1、第2、第3アミンを含む。
が存在すると、2つの重要な特性が与えられるとされている。この2つの特性と
は、アミノペプチダーゼによる分解に対する抵抗力と、潜在能力の増大である。
しかしながら、本発明の類似体の1つであるγ−D−グルタミル−L−トリプト
ファンは、ベスチムよりもさらに高い生物学上の作用と、より広範囲の服用量の
範囲を有することが分かっている。本発明のこの特定の好適な実施形態は、「S
CV−07」と称することもある。
亜急性毒性の動物実験を行った。すべての実験において、アンプルに無菌凍結乾
燥粉末として調整したベスチムを、無菌0.9%NaCl溶液で溶解し、筋肉内
注射を行った。
になるグループに無作為抽出した。ベスチムを1回投与(筋肉内)させた後、1
4日間毎日動物を検査した。 マウス − 5,000.0 mg/kg ラット − 500.0 mg/kg 犬 − 500.0 mg/kg
内蔵(心臓、肺、胸膜腔および腹膜腔、筋肉、胃、小腸および大腸、肝臓、脾臓
、膵臓、腎臓、膀胱、甲状腺、脳、皮膚および睾丸/卵巣)の肉眼検査および組
織病理検査を行った。
血液内指標、生化学指標、生理的指標、肉眼検査および組織病理検査の記録結果
はすべて正常値内のものであった。
を投与した。 ラット:3カ月および6カ月毎日、1mg/kgおよび100mg/kgを筋
肉内投与 犬:1カ月および3カ月毎日、1mg/kg、10mg/kgおよび100m
g/kgを筋肉内投与
血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。肉眼レベルと組織
病理レベルでのすべての組織の形態上の外観は正常であった。ラットへの両投与
ともに実験動物の体重が僅かに増えた。
液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。検査したすべての組
織の肉眼検査および組織病理検査に著しい変化は見られなかった。注射部位での
局所的炎症反応はなかった。
または亜急性毒性を受けないことが分かった。治療トライアル用の予測投与量に
対して検査で用いた投与量は、1回の投与の場合では約5,000,000倍で
あり、繰り返し投与した場合では約100倍のものであった。
をマウスの胸腺細胞を用いて検査した。胸腺細胞を2度洗浄し、2%致死子牛血
清を含有するRPMI1640媒体内に再懸濁(resuspend) させた。細胞懸濁を
96個のウェルがある板(1ウェル当たり1×106 個の細胞)内に配置した。
次いで、ペプチド(または制御ウェルの担体)を所望の濃度でウェル内に添加し
た。CO2 の培養器内で37℃、4時間、ペプチドまたは担体で細胞を培養した
。培養後、エオシンB(Eosin B) を用いて細胞の生存能力を顕微鏡で算出した。
その結果を表Aに示す。
ァンは、細胞の生存能力を減少させ(表A)、したがって、0.1mg/mlの
投与量で細胞に有毒なものとなることが分かった。
学におけるチモペンチンの「チモポイエチンからチモペンチンまで:実験的研究
(Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies) 、Surv. Immunol. Res
. 、4、1〜10頁、1985年)は、免疫調節薬が免疫不均衡が低応答性また
は高応答性の状態にあろうが、免疫不均衡を回復するように作用する。これらの
薬の双方向の作用は、不均衡の状態を均衡した目標値に回復する生体調整の性質
により生じる。低応答性の場合、Tリンパ球を調整するホルモン投与は、自己防
衛システムの機能を最適化しさらに調整するため、自己ではない有機体がさらに
除去しやすくなるように作用する。高応答性の場合、免疫調節薬を投与すると、
有益な「自己」の存在を間違って攻撃することが減少する自己免疫処理を弱める
ようである。低応答性の免疫状態と高応答性の免疫状態におけるベスチムの臨床
投与のカテゴリーに関して記載し、例示して述べる。
病気の過程の結果として生じる免疫抑制である。2つ目は、他の病気の治療によ
り生じた免疫不全、いわゆる医原性免疫不全である。3つ目は、後天性免疫不全
症候群(AIDS)を引き起こすヒト免疫不全ウィルス(HIV)によりTリン
パ球が直接攻撃されることから生じる免疫不全である。
および感染である。細胞性および体液性免疫応答が弱まることで、さまざまな有
機体による感染媒体に感染しやすくなるため、栄養不良の人、広範囲に癌が進行
した患者や病気で衰弱した人は、病気になりやすく、さらに死に至る確率も高く
なる。免疫応答の不全が広がった状態を免疫性欠如と呼ぶ。さまざまなタイプの
感染、特にウィルス感染が免疫抑制となる。免疫系統のTヘルパーリンパ球成分
をより強力なものにできるベスチムなどの薬は、患者の感染への抵抗力を高める
ための重要な治療薬となる。例えば、ベスチムまたはその類似体は、 −− 共通した深刻な臨床問題である院内感染(病院で誘発される感染)の危
険性を下げるために病院への許可前または許可直後に、患者、特に年配の患者に
投与され、 −− このような患者は特に感染しやすい傾向にあるため、犠牲になっている
個所を処置するように投与され、 −− 例えば、インフルエンザ接種や肝炎接種と組み合わせて流行性の感染の
疑いがある患者に対して、病原体への免疫応答を活性化させるように投与され、 −− 例えば、疱疹ウィルス、バクテリアウィルス、肝炎ウィルスやHIVの
保有者である患者に対して、病原有機体の免疫監視を高め、病気の再発の可能性
を下げる目的で、無症候性のウィルスが感染した患者に投与される。
る薬治療が原因である。さまざまな化学治療薬が癌患者に投与され、これらの薬
は、通常、成熟リンパ球および成長中のリンパ球の両方に対して細胞毒であり、
さらには顆粒球前駆体および単球前駆体に対しても細胞毒である。したがって、
癌の化学治療は、ほとんどの場合、免疫抑制期間および感染の危険性が高い期間
に行われる。癌の放射線治療も同じ危険性を伴う。薬物治療(顆粒球群促進因子
)は、癌の化学治療後に生じる感染と戦わせるように血液中の好中球を増やすた
めに用いられるが、リンパ球の機能を回復させるための薬物治療は現在のところ
用いられていない。動脈瘤の治療やバイパス形成手術などの大手術では、人体の
免疫機能も下がる。大手術により起こる血中リンパ球の低下の理由は明らかでは
ないが、感染の可能性を下げながら、このような患者のリンパ球機能を高める薬
剤には治療薬剤として重要なものである。
生じるもので、これは、外傷後またはある種の血液病の治療用にこの臓器を手術
で除去したり、または鎌状細胞病で梗塞が形成された結果引き起こされる。脾臓
がない患者は、ある細胞、特に肺炎連鎖球菌などの被包バクテリアの感染を受け
やすい。脾臓は、このような最近に対する保護用体液性免疫応答を誘導するため
に必要であることは明らかである。ベスチムは、微生物による汚染に対して、脾
臓がない患者または胸腺がない患者の抵抗力を高める働きをする。
を用いて説明するが、この例は説明を目的とするもので、本発明を限定するもの
ではない。
ルとN−ベンジルオキシカルボン−L−グルタミン酸α−ベンジルエステルを、
ムーア等(Moor et al.)のJ. Chem. Soc.、2349(1966)に記載されるよ
うに調製し、さらにL−トリプトファンベンジルエステルp−トルエンスルホン
酸を、アライ等(Arai et al.)、J. Org. Chem.、48、121(1983)に記
載されるように調製した。D−トリプトファン、N−メチルモルホリン、イソブ
チルクロロホルム、パラジウム−炭触媒(10%)、N−ヒドロキシスクシンイ
ミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、N,N−ジメチルホルムアミド、テト
ラヒドロフラン、アセトニトリルをフルカ社(Fluka)から購入し、トリフロロ酢 酸をメルック社(Merck)から購入した。
被覆させた板のKieselgel 60 F254 (メルック社)上で上昇TL
Cを実行した。 A.クロロホルム/メタノール/酢酸 90:8:2 B.2−プロパノール/25% NH4 OH/水 50:5:15 C.ブタノール/酢酸/水 3:1:1 UV光、ニンヒドリン、J2 でペプチドを配置した。
同じ溶媒系を用いた。すなわち、溶媒A−0.1%トリフルオロ酢酸水と、溶媒
B−アセトニトリルである。
(モデル116)、データマスタ(Data Master)(モデル621)、および分析 カラムゾルバックス(Zorbax)ODS 4.6×150mm、5μからなるギルソ
ン(Gilson)クロマトグラフ上で分析作業を実行した。流量は1ml/minであ
った。230nmでペプチドを制御した。溶離液は、20分間、10〜40%B
または10〜90%の線形の勾配であった。
ンコレクタ(モデル202)、分光光度計(ホロクロム(Holochrome))、および
予備カラムゾルバックス ODS 21.2×250mm、8μからなるギルソ
ンクロマトグラフ上で予備浄化を実行した。流量は10ml/minであった。
230nmでペプチドを制御した。溶離液は、80分間、0〜40%Bの線形の
勾配であった。
作して、アスペクト(Aspect)2000コンピュータを備えたブルッカー(Brucker
)CPX−300を用いて、すべてのスペクトラムを記録した。0.5mlのC D3 ODで50mgのペプチドを溶解し、ここで 1H残留信号を3.35ppm
で参照としてとった。特別な記載がなければ、通常の獲得パラメータは、温度は
周囲温度で、スペクトラム幅は4,500Hzで、パルス幅は1μs(60 )で
、時間ドメインにおいて8192データ点であった。16384点アドレスで処
理を実行した。緩和遅延は2sであった。
ミン酸α−ベンジルエステル(0.74g、2mmol)とN−メチルモルホリ
ン(0.22ml、2mmol)の溶液を−15℃に冷却する。イソブチルクロ
ロホルム(0.28ml、2mmol)を添加して、この混合物を混合無水化合
物を形成するために3分間、−10℃に置く。乾燥テトラヒドロフランにおいて
L−トリプトファンベンジアルエステルp−トルエンスルホン酸(0.93g、
2mmol)とN−メチルモルホリン(0.22ml、2mmol)の溶液を−
5℃に冷却し、添加して、約5℃の冷蔵庫に反応混合物を置く。次の日、溶液を
塩からフィルタがけし、乾燥テトラヒドロフラン(20ml)で洗浄し、真空内
で蒸発させる。エチルアセテート(50ml)で残留物を溶解し、同量の水、2
N H2 SO4 溶液、水、5%NaHCO3溶液、さらに再度水で洗浄する。こ
れを無水Na2 SO4 にわたって乾燥させ、乾燥剤からフィルタがけし、約10
mlまで真空内で濃縮する。ヘキサン(50ml)を用いた希釈で生成物を分離
する。生成量は820mg(62%)である。Rf(A)は0.75である。
ルタミル−L−トリプトファンジベンジルエステル(0.6g、0.9mmol
)の溶液を、5時間Pd/C(10%、200mg)で水素と化合させる。触媒
を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる。生成量は26
0mgである。
る。生成量は190mgである。RF(B)は0.5で、RF(C)は0.45
である。前述したように、このような特定の好適な実施形態は、「SCV−07
」と呼ばれることがある。
ボニル−L−グルタミン酸α−ベンジルエステル(0.99g、2.6mol)
およびN−ヒドロキシスクシンイミド(0.3g、2.6mmol)の溶液を氷
水浴で冷却し、N,N−ジメチルホルムアミド(3ml)においてジシクロヘキ
シルカルボジイミド(0.56g、2.7mmol)の溶液を攪拌して添加する
。0℃で1時間この混合物を攪拌して、室温で一晩置く。分離したN,N−ジシ
クロヘキシユリアを濾過で除去し、D−トリプトファン(0.64g、3.1m
mol)およびトリエチルアミン(0.46ml、3.3mmol)を濾過水に
添加する。この混合物を室温で16時間攪拌して、水(50ml)で希釈する。
分離した油をエチルアセテート(3×20ml)で抽出して、組み合わせた有機
層を2NH2 SO4 溶液(2×20ml)と水(4×30ml)で洗浄して、N
a2 SO4 で乾燥させて、乾燥剤からフィルタがけし、約10mlまで真空内で
濃縮させる。ヘキサン(30ml)を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は
1.2g(81%)である。Rf(A)は0.7である。
ルタミル−D−トリプトファンαベンジルエステル(0.6g、0.9mmol
)の溶液を、2時間Pd/C(10%、200mg)で水素と化合させる(TL
C制御)。触媒を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる
。生成量は285mgである。
る。生成量は180mgである。Rf(B)は0.5で、Rf(C)は0.45
である。 γ−L−グルタミル−D−トリプトファンは、γ−D−グルタミル−L−トリ
プトファンと同じ 1H NMRおよび13C NMRスペクトルを有する。
を合成した。0.1gのNa−tert−Boc−ニンホルミル−L−トリプト
ファン−メリフィールド樹脂(Trp0.7mmol/g樹脂の含量)を反応室
に配置する。自動合成プログラムは以下のとおりである。
l、HOBtおよびジシクロヘキシルカルボジイミド(DCI)から調製された
1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の活性エステルでカップリング
が実行された。** カイザー(Kaiser)のニンヒドリン検査によりカップリング完了が検証された
(カイザー等、Anal.Biochem.、34:595、1970)。カッ
プリングが完全に終了していない場合は、もう一度繰返した。
ゾールを含有する液体フッ化水素(HF)でポリマーから分割した。0℃の真空
内でHFを除去し、ペプチドを30%水性酢酸で抽出し、エチルエーテルで洗浄
し、凍結乾燥させて、0.2N水酸化ナトリウムで脱ホルミル化した後、予備高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)により純化した。
ュールのものと同じ方法により、すべてのベスチム類似体を合成させてもよい。
ランス)、溶離液0.1%TFA/アセトニトリル、勾配10〜40%、14分
ラン、カラムデルタ−パック(Delta-Pack)C−18、300Å、5μm、3.9
×150MMを用いた。生成物の保持時間は8.1minであり、HPLCピー
ク下での平均領域として測定された純度は99.7%であった。 2. アミノ酸分析:LKBアミノ酸アナライザアルファプラス(Alpha Plus)4
151を用いて、24時間、115℃の真空内で0.2%トリプトアミンを含有
する4Nメタンスルホン酸に生成物を加水分解した。グルタミン酸のペプチド含
有量は1.0で、トリプトファンは0.04であり、所望の残留物の存在を確認
した。 3. 薄層クロマトグラフィー(TLC):システム1 − n−ブタノール:
エチルアセテート:酢酸:水=1:1:1:1、Rf=0.72、システム2
− sec−ブタノール:酢酸:トルエン:水=6:1:2:1、Rf=0.4 4. 核磁気共鳴分析法(NMR):アスペクト(Aspect)200コンピュータを
備えたNMR分光計ブルーカー(Bruker) GXP−300。炭素でペプチド(0
.001M/l溶液)のNMRスペクトラムを検出したGluに対して、30.
0;31.0;57.2;176.6;178.3ppm、Trpに対して、3
5.7;58.3;113.1;116.6;123.4;124.3;126
.6;129.0;131.0;140.3;179.4ppmであった。 5. 高速原子衝撃質量分析法(FAB−MS)、分子イオン:計算、334.
13 Da;333.73獲得。
例1Eに記載するような錠剤の製剤により説明する。
エステル(5g、0.087M)をメタノール(40ml)に溶解し、NaHC
O3 (0.73g、0.087M)を添加した。空気を低速の流れの窒素と取り
替え、10%パラジウム炭触媒(30ml水に2.5g)を添加した。さらにも
う一度、低速の流れの窒素をフラスコを通して流し、低速の流れの水素の導入を
開始した。強力な攪拌により触媒の懸濁を保持した。4時間、濾過により触媒を
除去して、メタノール(10ml)により洗浄した。濾過水を真空内で蒸発させ
、残留物をアセトニトリルで粉末にした。固体の生成物をフィルタ上で収集し、
アセトニトリルで洗浄して、真空内で乾燥させた。 生成量:2.14g(70%)
98.9%グリシン、1%ステアリン酸マグネシウムおよび0.1%の本発明の
ペプチドか、または94.9%グリシン、5%デンプンおよび0.1%の本発明
のペプチドのいずれかを用いて錠剤に製剤した。各100mGの錠剤は、本発明
の類似体の100μgを含有した。
−Glu−L−Trp(ベスチム類似体)を、5連続日、1日につき表に示す異
なる服用量で水溶液の形でマウスに経口的に投与した。5匹の動物を用いて各ペ
プチドを服用させた。48時間後、脾臓を除去し、96ウェルの底が平坦な培養
板に10%致死子牛血清で満たしたRPMI−1640培地において、IL−2
生成物誘導酵素ConA(5μg/ml)がある生体外で、さらに24時間脾臓
細胞を培養した。マウスのIL−2−依存細胞株CTLL−2(ギリス等(Gilli
s et al.)、1978)において、上澄みにあるIL−2レベルを測定した。
、ベスチムよりも高い生物学的作用を呈した。IL−2の導入をより広範囲の服
用量で観察し、服用量が大きい場合、この類似体はIL−2導入を低下させなか
った。
イーグル培地でマイクロタイトレーション(テラサキ)板において生体内でペプ
チドで培養した。反Thy−1抗体を用いて補体依存性の細胞毒分析評価により
、 Thy−1抗原発現を決定した。
の本発明の類似体であるγ−L−Glu−D−Trpの作用と比較すると高い作
用を呈した。
た。実験の直前に異なる物質濃度を有する溶液を調製するためにすべてのペプチ
ドを水に可溶性にした。
底が平坦な培養板に10%致死子牛血清で満たしたRPMI−1640培地で培
養した。IL−2生成物を5μg/mlCon Aで24時間培養で誘導した。
所望の濃度でペプチドを「0」時間で細胞培養に添加する。IL−2−依存CT
LL−2細胞株(ギリス等、1978)において、培養上澄みにあるIL−2レ
ベルを求めた。
過した2人の癌患者に投与した。
明のペプチドγ−D−グルタミル−L−トリプトファンの影響を決定した。表に
示した濃度で塩水に希釈したペプチドとともに1251照度計(LKB)の作業
キュベットにドナーの全血液の標本を挿入した。各キュベットにルミノールを添
加し、10分間キュベットを培養した。この後、37℃で40分間、照度計のウ
ェルで培養し、続けて攪拌した。「ルミナ(Lumina)」コンピュータプログラムを
用いて生育させたスーパーオキサイドラジカル量を形成し、40分間光の総量と
して表した(mV/min)。各試料を3通りに検証した。
養培地でアガロースを溶解して最終的な濃度を1%にした。この混合物を組織培
養皿に移して、ゲル状にした。このゲルに、直径2mmの一連のウェルを3mm
間隔で切り分けた。10μlの好中球(1ml当たり2.5×106細胞)を中
央のウェルに添加した。ランダム移動を測定するために他のウェルを培地の片側
に満たし、促進された移動を測定するために10−7Mで走化性FMLPでこれ
らのウェルをもう一方の片側に満たした。CO2 培養器で120分間皿を培養し
た。「0」時間に所望の濃度のペプチドを細胞に添加した。マイクロスケールを
用いて顕微鏡で細胞移動を読出し、走化性指標である促進移動/ランダム移動と
して表した。
の濃度でシリコン処理した管に、フィコル−パック(Ficoll-Pack)分離によりド ナーの血液から得たヒト好中球白血球を移した。ヒト(huan)の血清を用いてオプ
ソニンを作用させた酵母セルを食細胞活動の対象物としてしようした。管内に酵
母細胞を添加し(1好中球当たり10酵母細胞)、40分間CO2 培養器で細胞
懸濁を培養した。この細胞を遠心分離法を用いて洗浄した後、ガラススライドに
細胞塗抹を調製して、ギムザ染色により染色した。食細胞を顕微鏡下で算出した
。
イシン、5μg/mlポリミキシンBおよび0.5μg/mlコンカナバリンA
で満たしたRPMI−1640培地において底が平坦の96ウェル培養板のCO 2 培養器で、72時間、1ml当たり5×106 の近交ホワイトラットの3つの
培養組織を培養した。培養期間の終了前の16時間、3H−チミジンで細胞をパ
ルスラベルした。チテルテック(Titertek)細胞ハーベスタを用いてガラスファイ
バフィルタ上で細胞を採取し、β液体シンチレーションカウンタで算出した。増
殖率を1分当たりの数として表す。
によるIL−2生成を促進し、前駆体Tリンパ球の成熟を誘導し、T細胞の増殖
を促進することが可能なものである。特に、好適な本発明のペプチドであるγ−
D−Glu−L−Trp(SCV−07)は、ヒト好中球白血球機能活動、特に
食細胞活動および酸素ラジカル生成を促進させることで、免疫機能を高めること
が示されている。本発明のペプチド、特にSCV−07は、Tリンパ球とTヘル
パーリンパ球数の総数と周辺の血液のCD4/CD8の比率を増大させることが
示されている。最後に、本発明のペプチド、特にSCV−07はまた、ヒト好中
球白血球移動と殺菌活動を促進させることが分かっている。
を目的としたものであって、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範
囲は添付の請求の範囲により規定されるものであることを理解されたい。
ァンを含む請求項12記載の方法。
チルおよびそれを用いた方法
種類の白血球の成熟および分化を促進させるγ−L−グルタミル、γ−D−グル
タミル、β−L−アスパルチル、またはβ−D−アスパルチル部分のいずれかを
含む免疫促進化合物に関する。このように、白血球細胞の分化および増殖を選択
的に促進することによって、病気を引き起こす細菌に対する体の免疫力を高める
ことができ、さらに自己炎症状態を調節して改善する。
718号の一部継続出願であり、この出願は、共に1995年11月28日に出
願されたロシア特許出願第95119704号および第95120266号の優
先権を主張している。さらに、本出願は、1997年12月25日に出願された
ロシア特許出願第97120940号に関連し、その優先権を主張している。米
国特許出願第08/634,718は参照により本願明細書に引用されるものと
する。
するために適用された細胞網である。一度免疫系統が活性化されると、それは体
内に「自己でない」実態を除去するようにデザインされたエフェクタ機能を高め
るようにさまざまな細胞や分子の関与をうながす。リンパ球は免疫系統の細胞で
あり、異物の存在を明確に認識し選択的に除去することができる。インベーダと
の反応で特別でないものとしてみなされる好中球などの免疫系統の他の細胞と対
比すると、リンパ球の特徴は、特殊性、多様性、記憶および免疫反応に対する自
己/非自己認識を与えることである。
る。Bリンパ球は、骨髄から発生しその中で成熟して、抗体分子の形成に寄与す
る。Tリンパ球も、骨髄から生じるが、これは胸腺内で成熟する。T細胞には2
つの主要な副群がある。すなわち、Tヘルパー細胞とT細胞毒性細胞である。こ
れら2つのタイプのT細胞は、2つの膜糖たんぱく質のうちのいずれか、すなわ
ちCD4またはCD8が存在することによって区別できる。抗原複合体(特定の
たんぱく質に連結した異物分子)によって活性化される場合、Tヘルパー細胞(
CD4を表す)は、サイトカインとして総称して公知のさまざまな成長因子を分
泌することによって応答する。これらのサイトカインは、T細胞毒性細胞を含む
免疫系統の他の細胞を活性化させる信号である。活性化される場合、T細胞毒性
細胞(CD8を表す)は、体内をモニタし、体内から病原細胞、異物細胞、ウィ
ルスに感染した細胞、腫瘍細胞を除去する。
チドホルモンにより調整される。このようなホルモンの1つに、49−アミノ酸
残基ペプチドのチモポイエチンがある。チモポイエチンの残基32−36である
Arg−Lys−Asp−Val−Tyrは、チモポイエチンの生物活性を保持
し、チモペンチン(thymopentin) と呼ばれる免疫調節薬の基本となるものである
。チモペンチンを治療時に投与する使用目的には、慢性関節リウマチ、皮膚病の
状態、バクテリア、ウィルス、菌による感染、手術や癌治療による免疫低下の反
転、B型肝炎ウィルスのワクチン接種に対する反応の強化、および後天性免疫不
全症候群(AIDS)が含まれており、Tヘルパー(CD4)細胞はウィルスに
より特に攻撃される状態にある(クリスチャン, ジェイ. エス.(Christian, J.S
.)の「チモペンチンの薬理学、臨床投与および毒性に関する報告書(A review of
the Pharmacology, Clinical Applications, and Toxicology of Thymopentin)
」、トランスジェニカ(Transgenica)、ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオ テクノロジー(The Journal of Clinical Biotechnology) 、1、23〜34頁、
1994年)。
hymogen)と呼ばれるGlu−Trpである。連鎖−Glu−Trp−も、チモポ
イエチンの合成の前駆体である分子に発生するが、−Glu−Trp−は、49
−アミノ酸ホルモンの一部ではなく、チモポイエチンの生物活性に寄与するもの
として見なされるジペプチドでもない。チモゲンは、ロシアで発見され、主に、
疫病の予防や感染治療に使用された。チモゲンは、チェルノブイリ原発事故によ
り放射能に偶発的に被爆したことが原因でリンパ球がダメージを受けた後の免疫
機能を増大させるために使用された。(カビンソン等(Khavinson et al.)、国際
特許公開第WO92/17191号公報および国際特許公開第WO93/088
15号公報、「薬学ジペプチド組成およびその使用方法(Pharmaceutical Dipept
ide Compositions and Methods of Use Thereof)」。)
トリペプチドグルタチオンである。合成γ−L−グルタミル分子も候補薬として
使用されてきた。γ−L−グルタミル部分は分子の活性部分のキャリヤとして使
用されるため、これらの候補薬は、「プロドラッグ」と呼ばれる。例えば、γ−
L−グルタミニル−4−ヒドロキシ−3−ヨードベンゼンは、人体およびマウス
の黒色腫の細胞株において抗癌作用を発揮する。この化合物の抗癌作用は、癌細
胞付近で4−ヒドロキシ−3−ヨードベンゼンの酵素放出によるものであると考
えられる(プレジオソ等(Prezioso et al.) 、「γ- グルタミルトランスペプチ
ダーゼの発現は抗癌プロドラッグであるγ−グルタミニル−4−ヒドロキシ−3
−ヨードベンゼンの成長抑制作用を調整する (γ-Glutamyltranspeptidase Expr
ession Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodru
g γ-glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene)」、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・キャンサー(International Journal of Cancer) 、56、874頁〜
879頁、1994年)。また、γ−L−グルタミル−ドーパミンおよびγ−L
−グルタミル−5−ヒドロキシ−トリプトファンは、ドーパミンと5−ヒドロキ
シ−トリプトファンを脳神経に運び供給することがあるプロドラッグとして記載
されている(リカムワ等(Likamwa et al.)、「γ−L−グルタミル−5−ヒドロ
キシ−L−トリプトファンの抗ナトリウム排泄増加作用は正常脳の5−ヒドロキ
シトロタミンの脱カルボキシル化に依存する(The Antinatriuretic Action of
γ-L-glutamyl-5-hydroxy-L-tryptophan is Dependent on its Decarboxylation
to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain)」、ブリティッシュ・ジャーナル・
オブ・クリニカル・ファーマコロジィ(British Journal of Clinical Pharmacol
ogy)、387:265〜269、1994年)。
19日に公開された国際特許公開第WO96/40740号公報には、式X−A
−D−Trp−Y(I)のペプチドが開示されており、ここで、A=D−Glu
またはD−イソグルタミン酸(D−iGlu)であり、X=H、Gly、Ala
、Leu、Ile、Val、Nva、Pro、Tyr、Phe、Trp、D−A
la、D−Leu、D−Ile、D−Val、D−Nva、D−Pro、D−T
yr、D−Phe、D−Trp、γ−アミノブチル酸またはε−アミノカプロン
酸であり、Y=Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Nva、Pro、T
yr、Phe、Trp、D−Ala、D−Leu、D−Ile、D−Val、D
−Nva、D−Pro、D−Tyr、D−Phe、D−Trp、γ−アミノブチ
ル酸、ε−アミノカプロン酸、OH、または1〜3C置換アミノである。化合物
(I)は、免疫抑制作用(例えば、脾細胞の増殖抑制)をもち、人体、獣医学、
実験的生化学に有益であるとされている。
「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連し、免疫調節特性を有する新しい種類の
化合物の実施形態に与えられた名前である。本発明の一部継続出願である米国親
特許出願第08/634,718号には、新しい種類の化合物の数種の化合物が
記載され、請求され、さらにこれらの化合物を用いて免疫調節治療方法が請求さ
れている。ベスチム化合物自体は、γ−L−グルタミル−L−トリプトファンの
化学構造を有する。
または複素環式アミノ酸またはその誘導体、およびnは1または2である。我々
は、新しい種類の一部として(ベスチム、γ−L−グルタミル−L−トリプトフ
ァン以外にも)、これらの化合物が含まれることを発見し、ここでRは水素、X
は、γ−D−グルタミル−L−トリプトファン、γ−L−グルタミル−D−トリ
プトファン、β−L−アスパルチル−L−トリプトファンおよびβ−D−アスル
チル−L−トリプトファンなどのL−トリプトファンおよびD−トリプトファン
である。式1において星印を付けたα炭素は立体配置をもつものであり、nが2
のとき、Xの立体配置とは異なる。特別な好適な実施形態は、γ−D−グルタミ
ル−L−トリプトファンである。式1のペプチドは、無毒の有機または無機酸を
有する製薬的に許容可能な塩を形成することがある。カルボキシル基の塩は、任
意の適切な無機または有機塩基で形成される無毒カルボキシル酸塩を含む。
促進作用をもつ。この生物学上の作用のメカニズムは、骨髄Tリンパ球前駆体の
分化、リンパ球増殖の促進、およびインターロイキン−2を含むさまざまなサイ
トカインの発生の誘導に関する。ベスチムの薬理効果の最終結果によると、Tヘ
ルパーリンパ球、すなわちCD4マーカを含む細胞の数が選択的に増加する。
生体内では、体重1kg当たり10ng〜1μgの投与量で作用し、免疫促進剤
の投与よりも500から100万倍高い投与量で毒性が見られない。動物実験で
は、経口投与後に活性である。
る場合、免疫機能が増加した。これらの実験変化は、臨床結果に有益な陽性の指
示薬(positive indicator)により達成された。
、ベスチムのものと、さらに広範囲の投与量で観察されるIL−2誘導と比較す
ると、生物学活性がさらに高くなることが分かる。
ベスチムとその類似体は、伝染病の免疫治療や、放射線への被爆または癌の化学
治療や手術などのその他のストレス因子により、予め低下していた免疫反応の回
復の薬として効果的である。
た状態により引き起こされた免疫不全を緩和して患者に有益に投与され、微生物
からの危険な感染を改善し減少させるように患者に投与され、特に、それぞれ感
染しやすい傾向にある入院中の患者や、手術を受けている患者や、癌の化学治療
を受けている患者に対しては被害を受けている場所を処置するように投与される
。さらに、式1の免疫調節化合物は、ウィルス除去を容易にし、病原微生物の免
疫監視を高め、さらには例えば、疱疹ウィルス、水痘ウィルス、肝炎ウィルスお
よびHIVなどの病気を患っているかまたはその保有者である患者の病気の再発
を減少させるために、症候性または無症候性ウィルスに感染している患者に投与
され、例えば、癌などの状態で、自然細胞が体に「異物」として認識されるよう
な自然細胞を変更する病気の患者に投与され、さらに免疫系統を均衡に調整する
ために、慢性関節リウマチ、多発硬化症、強皮症などの自己炎症(自己免疫)の
病気の患者に投与される。
法以外に、式1の免疫調節化合物は、例えば、インフルエンザのワクチン接種と
組み合わせて伝染病の疑いのある健康な患者に投与したり、例えば、肝炎用のワ
クチン接種、この専門用語はワクチン接種の「アジュバント」として本発明で使
用されるワクチン接種と組み合わせて病原体への免疫反応を高めるように投与し
てもよい。
量で投与され、1回の投与または1ヵ月以上の期間にわたって断続的に与えられ
、さらに投与経路は、非経口注射、経口または鼻吸入、または経口摂取によるも
のが好ましい。
調節する特有の化学物質である。例えば、Tヘルパー細胞数を増加させるために
免疫系統を調節すると、バクテリアやウィルスからの感染を処理する生体の能力
が増大する。また、Tヘルパー細胞の数を増大するように調節することによって
、ホストに対して異物となる癌細胞に対して体が闘いやすくなる。この代わりに
、これらの物質によって、内因性組織に対してホストのT細胞による過度の攻撃
が生じる自己認識処理の混乱から生じた病気に対してホストが調節を行うことも
できる。このような場合、本発明の化合物は、慢性関節リウマチおよび多発硬化
症などの自発的な炎症(自己免疫)の病気の兆候や症状が改善されるように、T
細胞数を調整する。
「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連するもので、免疫調節特性を有する新し
い種類の化合物の実施形態に与えられた名前である。免疫促進投与量よりも50
0または500,000倍を超える服用量で毒性は観察されない。ベスチム化合
物自体は、γ−L−グルタミル−L−トリプトファンの化学構造を有する。新し
い種類の合成免疫調節分子は、式1に示すように、アミノ末端にγ−L−グルタ
ミル部分、γ−D−グルタミル−部分、β−L−アスパルチル部分、またはβ−
D−アスパルチル部分を有する。
は芳香族または複素環式アミノ酸またはその誘導体であり、好ましくはここでは
X=L−トリプトファンおよびD−トリプトファンである。「X」の芳香族また
は複素環式アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−またはジ−(C1-C6) アルキル置換アミド、アリールアミドおよび(C1-C6)アルキルまたはアリー ルエステルである。「R」の適切なアシルまたはアルキル部分は、1〜6炭素の
枝分かれしたまたは枝分かれしていないアルキル基、2〜10の炭素原子からの
アシル基、およびカルボベンジルオキシ基およびt−ブチルオキシカルボニル基
などの保護基である。式1で星印を付したα炭素は、立体配置をもつもので、n
が2である場合、Xの立体配置とは異なるものである。
ン以外にも)、γ−L−グルタミル−Nin−ホルミル−L−トリプトファン、N
−メチル−γ−L−グルタミル−L−トリプトファン、N−アセチル−γ−L−
グルタミル−L−トリプトファン、γ−D−グルタミル−L−トリプトファン、
γ−L−グルタミル−D−トリプトファン、β−L−アスパルチル−L−トリプ
トファン、およびβ−D−アスパルチル−L−トリプトファンなどの化合物が含
まれる。
形成することがある。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、リン酸一水素ナト
リウムおよび硫酸水素カリウムなどの塩化水素、臭化水素、硫酸およびリン酸お
よび酸金属塩を含む。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、モノ−、ジ−、ト
リカルボン酸を含む。このような酸の例は、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸
、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸
、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸(hydroxygenzoic)
、酢酸フェニル、桂皮酸、サリチル酸、2−フェノキシ安息香酸、およびメタン
スルホン酸や2−ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸である。カルボ
キシル基の塩は、任意の適切な無機または有機塩基で形成された無毒のカルボン 酸塩を含む。例示的に、これらの塩は、例えば、ナトリウムやカリウムなどのア
ルカリ金属、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウム
を含むIIIA族の軽金属、および例えば、トリエチルアミン、プロカイン、ジ
ベンジルアミン、1−エチレンアミン、N,N−ジベンジル−エチレンジアミン
、ジヒドロアビエチルアミン:N−(低級)アルキル−ピペリジン、他の適切な
アミンを含むトリアルキルアミンなどの第1、第2、第3アミンを含む。
が存在すると、2つの重要な特性が与えられるとされている。この2つの特性と
は、アミノペプチダーゼによる分解に対する抵抗力と、潜在能力の増大である。
しかしながら、本発明の類似体の1つであるγ−D−グルタミル−L−トリプト
ファンは、ベスチムよりもさらに高い生物学活性と、より広範囲の服用量の範囲
を有することが分かっている。本発明のこの特定の好適な実施形態は、「SCV
−07」と称することもある。
亜急性毒性の動物実験を行った。すべての実験において、アンプルに無菌凍結乾
燥粉末として調整したベスチムを、無菌0.9%NaCl溶液で溶解し、筋肉内
注射を行った。
一になるグループに無作為抽出した。ベスチムを1回投与(筋肉内)させた後、
14日間毎日動物を検査した。 マウス − 5,000.0 mg/kg ラット − 500.0 mg/kg イヌ − 500.0 mg/kg
内蔵(心臓、肺、胸膜腔および腹膜腔、筋肉、胃、小腸および大腸、肝臓、脾臓
、膵臓、腎臓、膀胱、甲状腺、脳、皮膚および睾丸/卵巣)の肉眼検査および組
織病理検査を行った。
血液内指標、生化学指標、生理的指標、肉眼検査および組織病理検査の記録結果
はすべて正常値内のものであった。
を投与した。 ラット:3カ月および6カ月毎日、1mg/kgおよび100mg/kgを筋
肉内投与 イヌ:1カ月および3カ月毎日、1mg/kg、10mg/kgおよび100
mg/kgを筋肉内投与
血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。肉眼レベルと組織
病理レベルでのすべての組織の形態上の外観は正常であった。ラットへの両投与
ともに実験動物の体重が僅かに増えた。
血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。検査したすべての
組織の肉眼検査および組織病理検査に著しい変化は見られなかった。注射部位で
の局所的炎症反応はなかった。
または亜急性毒性を受けないことが分かった。治療トライアル用の予測投与量に
対して検査で用いた投与量は、1回の投与の場合では約5,000,000倍で
あり、繰り返し投与した場合では約100倍のものであった。
をマウスの胸腺細胞を用いて検査した。胸腺細胞を2度洗浄し、2%致死子牛血
清を含有するRPMI1640媒体内に再懸濁させた。細胞懸濁液を96個のウ
ェルがある板(1ウェル当たり1×106個の細胞)内に配置した。次いで、ペ プチド(または制御ウェルの担体)を所要の濃度でウェル内に添加した。CO2 の培養器内で37℃、4時間、ペプチドまたは担体で細胞を培養した。培養後、
エオシンB(Eosin B) を用いて細胞の生存能力を顕微鏡で算出した。その結果を
表Aに示す。
ァンは、細胞の生存能力を減少させ(表A)、したがって、0.1mg/mlの
投与量で細胞に有毒なものとなることが分かった。
学におけるチモペンチンの「チモポイエチンからチモペンチンまで:実験的研究
(Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies) 、Surv. Immunol. Res
. 、4、1〜10頁、1985年)は、免疫調節薬が免疫不均衡が低応答性また
は高応答性の状態にあろうが、免疫不均衡を回復するように作用する。これらの
薬の双方向の作用は、不均衡の状態を均衡した目標値に回復する生体調整の性質
により生じる。低応答性の場合、Tリンパ球を調整するホルモン投与は、自己防
衛システムの機能を最適化しさらに調整するため、自己ではない有機体がさらに
除去しやすくなるように作用する。高応答性の場合、免疫調節薬を投与すると、
有益な「自己」の存在を間違って攻撃することが減少する自己免疫処理を弱める
ようである。低応答性の免疫状態と高応答性の免疫状態におけるベスチムの臨床
投与のカテゴリーに関して記載し、例示して述べる。
病気の過程の結果として生じる免疫抑制である。2つ目は、他の病気の治療によ
り生じた免疫不全、いわゆる医原性免疫不全である。3つ目は、後天性免疫不全
症候群(AIDS)を引き起こすヒト免疫不全ウィルス(HIV)によりTリン
パ球が直接攻撃されることから生じる免疫不全である。
よび感染である。細胞性および体液性免疫応答が弱まることで、さまざまな細菌 による感染媒体に感染しやすくなるため、栄養不良の人、広範囲に癌が進行した
患者や病気で衰弱した人は、病気になりやすく、さらに死に至る確率も高くなる
。免疫応答の不全が広がった状態を免疫性欠如と呼ぶ。さまざまなタイプの感染
、特にウィルス感染が免疫抑制となる。免疫系統のTヘルパーリンパ球成分をよ
り強力なものにできるベスチムなどの薬は、患者の感染への抵抗力を高めるため
の重要な治療薬となる。例えば、ベスチムまたはその類似体は、 −− 共通した深刻な臨床問題である院内感染(病院で誘発される感染)の危
険性を下げるために病院への許可前または許可直後に、患者、特に年配の患者に
投与され、 −− このような患者は特に感染しやすい傾向にあるため、犠牲になっている
個所を処置するように投与され、 −− 例えば、インフルエンザ接種や肝炎接種と組み合わせて流行性の感染の
疑いがある患者に対して、病原体への免疫応答を活性化させるように投与され、 −− 例えば、疱疹ウィルス、バクテリアウィルス、肝炎ウィルスやHIVの
保有者である患者に対して、病原有機体の免疫監視を高め、病気の再発の可能性
を下げる目的で、無症候性のウィルスが感染した患者に投与される。
る薬治療が原因である。さまざまな化学治療薬が癌患者に投与され、これらの薬
は、通常、成熟リンパ球および成長中のリンパ球の両方に対して細胞毒であり、
さらには顆粒球前駆体および単球前駆体に対しても細胞毒である。したがって、
癌の化学治療は、ほとんどの場合、免疫抑制期間および感染の危険性が高い期間
に行われる。癌の放射線治療も同じ危険性を伴う。薬物治療(顆粒球群促進因子
)は、癌の化学治療後に生じる感染と戦わせるように血液中の好中球を増やすた
めに用いられるが、リンパ球の機能を回復させるための薬物治療は現在のところ
用いられていない。動脈瘤の治療やバイパス形成手術などの大手術では、人体の
免疫機能も下がる。大手術により起こる血中リンパ球の低下の理由は明らかでは
ないが、感染の可能性を下げながら、このような患者のリンパ球機能を高める薬
剤には治療薬剤として重要なものである。
生じるもので、これは、外傷後またはある種の血液病の治療用にこの臓器を手術
で除去したり、または鎌状細胞病で梗塞が形成された結果引き起こされる。脾臓
がない患者は、ある細菌、特に肺炎連鎖球菌などの被包バクテリアの感染を受け
やすい。脾臓は、このような細菌に対する保護用体液性免疫応答を誘導するため
に必要であることは明らかである。ベスチムは、微生物による汚染に対して、脾
臓がない患者または胸腺がない患者の抵抗力を高める働きをする。
を用いて説明するが、この例は説明を目的とするもので、本発明を限定するもの
ではない。
ルとN−ベンジルオキシカルボン−L−グルタミン酸α−ベンジルエステルを、
ムーア等(Moor et al.)のJ. Chem. Soc.、2349(1966)に記載されるよ
うに調製し、さらにL−トリプトファンベンジルエステルp−トルエンスルホン
酸を、アライ等(Arai et al.)、J. Org. Chem.、48、121(1983)に記
載されるように調製した。D−トリプトファン、N−メチルモルホリン、クロロ ぎ酸イソブチル 、パラジウム−炭素触媒(10%)、N−ヒドロキシスクシンイ
ミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、N,N−ジメチルホルムアミド、テト
ラヒドロフラン、アセトニトリルをフルカ社(Fluka)から購入し、トリフルオロ 酢酸をメルック社(Merck)から購入した。
被覆させた板のKieselgel 60 F254(メルック社)上で上昇TL Cを実行した。 A.クロロホルム/メタノール/酢酸 90:8:2 B.2−プロパノール/25% NH4OH/水 50:5:15 C.ブタノール/酢酸/水 3:1:1 UV光、ニンヒドリン、J2でペプチドを配置した。
同じ溶媒系を用いた。すなわち、溶媒A−0.1%トリフルオロ酢酸水と、溶媒
B−アセトニトリルである。
(モデル116)、データマスタ(Data Master)(モデル621)、および分析 カラムゾルバックス(Zorbax)ODS 4.6×150mm、5μからなるギルソ
ン(Gilson)クロマトグラフ上で分析作業を実行した。流量は1ml/minであ
った。230nmでペプチドを制御した。溶離液は、20分間、10〜40%B
または10〜90%の線形の勾配であった。
ンコレクタ(モデル202)、分光光度計(ホロクロム(Holochrome))、および 分取 カラムゾルバックス ODS 21.2×250mm、8μからなるギルソ
ンクロマトグラフ上で予備浄化を実行した。流量は10ml/minであった。
230nmでペプチドを制御した。溶離液は、80分間、0〜40%Bの線形の
勾配であった。
照としてとった。特別な記載がなければ、通常の獲得パラメータは、温度は周囲
温度で、スペクトル幅は4,500Hzで、パルス幅は1μs(60)で、時間 ドメインにおいて8192データ点であった。16384点アドレスで処理を実
行した。緩和遅延は2sであった。
ミン酸α−ベンジルエステル(0.74g、2mmol)とN−メチルモルホリ
ン(0.22ml、2mmol)の溶液を−15℃に冷却する。クロロぎ酸イソ ブチル (0.28ml、2mmol)を添加して、この混合物を混合無水化合物
を形成するために3分間、−10℃に置く。無水テトラヒドロフランにおいてL
−トリプトファンベンジアルエステルp−トルエンスルホン酸(0.93g、2
mmol)とN−メチルモルホリン(0.22ml、2mmol)の溶液を−5
℃に冷却し、添加して、約5℃の冷蔵庫に反応混合物を置く。次の日、溶液を塩
からフィルタがけし、無水テトラヒドロフラン(20ml)で洗浄し、真空内で
蒸発させる。酢酸エチル(50ml)で残留物を溶解し、同量の水、2N H2 SO4溶液、水、5%NaHCO3溶液、さらに再度水で洗浄する。これを無水 Na2SO4 上で乾燥させ、乾燥剤からフィルタがけし、約10mlまで真空内 で濃縮する。ヘキサン(50ml)を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は
820mg(62%)である。Rf(A)は0.75である。
グルタミル−L−トリプトファンジベンジルエステル(0.6g、0.9mmo
l)の溶液を、5時間Pd/C(10%、200mg)上で水素化させる。触媒
を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる。生成量は26
0mgである。
る。生成量は190mgである。RF(B)は0.5で、RF(C)は0.45
である。前述したように、このような特定の好適な実施形態は、「SCV−07
」と呼ばれることがある。
ボニル−L−グルタミン酸α−ベンジルエステル(0.99g、2.6mol)
およびN−ヒドロキシスクシンイミド(0.3g、2.6mmol)の溶液を氷
水浴で冷却し、N,N−ジメチルホルムアミド(3ml)においてジシクロヘキ
シルカルボジイミド(0.56g、2.7mmol)の溶液を攪拌して添加する
。0℃で1時間この混合物を攪拌して、室温で一晩置く。分離したN,N−ジシ
クロヘキシル尿素を濾過で除去し、D−トリプトファン(0.64g、3.1m
mol)およびトリエチルアミン(0.46ml、3.3mmol)を濾過水に
添加する。この混合物を室温で16時間攪拌して、水(50ml)で希釈する。
分離した油を酢酸エチル(3×20ml)で抽出して、組み合わせた有機層を2
NH2SO4溶液(2×20ml)と水(4×30ml)で洗浄して、Na2SO4 で乾燥させて、乾燥剤からフィルタがけし、約10mlまで真空内で濃縮させる
。ヘキサン(30ml)を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は1.2g(
81%)である。Rf(A)は0.7である。
グルタミル−D−トリプトファンαベンジルエステル(0.6g、0.9mmo
l)の溶液を、2時間Pd/C(10%、200mg)上で水素化させる(TL
C制御)。触媒を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる
。生成量は285mgである。
る。生成量は180mgである。Rf(B)は0.5で、Rf(C)は0.45
である。 γ−L−グルタミル−D−トリプトファンは、γ−D−グルタミル−L−トリ
プトファンと同じ 1H NMRおよび13C NMRスペクトルを有する。
子を合成した。0.1gのNa−tert−Boc−ニンホルミル−L−トリプ
トファン−メリフィールド樹脂(Trp0.7mmol/g樹脂の含量)を反応 器 に配置する。自動合成プログラムは以下のとおりである。
1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の活性化エステルでカップリン
グが実行された。** カイザー(Kaiser)のニンヒドリン検査によりカップリング完了が検証された (カイザー等、Anal.Biochem.、34:595、1970)。カッ
プリングが完全に終了していない場合は、もう一度繰返した。
ールを含有する液体フッ化水素(HF)でポリマーから開裂した。0℃の真空内
でHFを除去し、ペプチドを30%水性酢酸で抽出し、エチルエーテルで洗浄し
、凍結乾燥させて、0.2N水酸化ナトリウムで脱ホルミル化した後、分取高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)により純化した。
ュールのものと同じ方法により、すべてのベスチム類似体を合成させてもよい。
ランス)、溶離液0.1%TFA/アセトニトリル、勾配10〜40%、14分
ラン、カラムデルタ−パック(Delta-Pack)C−18、300Å、5μm、3.9
×150MMを用いた。生成物の保持時間は8.1minであり、HPLCピー
ク下での平均領域として測定された純度は99.7%であった。 2. アミノ酸分析:LKBアミノ酸アナライザアルファプラス(Alpha Plus)4
151を用いて、24時間、115℃の真空内で0.2%トリプタミンを含有す
る4Nメタンスルホン酸に生成物を加水分解した。グルタミン酸のペプチド含有
量は1.0で、トリプトファンは0.04であり、所望の残留物の存在を確認し
た。 3. 薄層クロマトグラフィー(TLC):システム1 − n−ブタノール: 酢酸エチル :酢酸:水=1:1:1:1、Rf=0.72、システム2 − s
ec−ブタノール:酢酸:トルエン:水=6:1:2:1、Rf=0.4 4. 核磁気共鳴分析法(NMR):アスペクト(Aspect)200コンピュータを
備えたNMR分光計ブルーカー(Bruker) GXP−300。、ペプチド(0.0
01M/l溶液)を炭素NMRスペクトルで検出した:Gluに対して、30.
0;31.0;57.2;176.6;178.3ppm、Trpに対して、3
5.7;58.3;113.1;116.6;123.4;124.3;126
.6;129.0;131.0;140.3;179.4ppmであった。 5. 高速原子衝撃質量分析法(FAB−MS)、分子イオン:計算、334.
13 Da;333.73獲得。
例1Eに記載するような錠剤の製剤により説明する。
エステル(5g、0.087M)をメタノール(40ml)に溶解し、NaHC
O3(0.73g、0.087M)を添加した。空気を低速の流れの窒素と取り 替え、10%パラジウム炭触媒(30ml水に2.5g)を添加した。さらにも
う一度、低速の流れの窒素をフラスコを通して流し、低速の流れの水素の導入を
開始した。強力な攪拌により触媒の懸濁を保持した。4時間、濾過により触媒を
除去して、メタノール(10ml)により洗浄した。濾過水を真空内で蒸発させ
、残留物をアセトニトリルで粉末にした。固体の生成物をフィルタ上で収集し、
アセトニトリルで洗浄して、真空内で乾燥させた。 生成量:2.14g(70%)
98.9%グリシン、1%ステアリン酸マグネシウムおよび0.1%の本発明の
ペプチドか、または94.9%グリシン、5%デンプンおよび0.1%の本発明
のペプチドのいずれかを用いて錠剤に製剤した。各100mGの錠剤は、本発明
の類似体の100μgを含有した。
−Glu−L−Trp(ベスチム類似体)を、5連続日、1日につき表に示す異
なる服用量で水溶液の形でマウスに経口的に投与した。5匹の動物を用いて各ペ
プチドを服用させた。48時間後、脾臓を除去し、96ウェルの底が平坦な培養
板に10%致死子牛血清で満たしたRPMI−1640培地において、IL−2
生成物誘導酵素ConA(5μg/ml)がある生体外で、さらに24時間脾臓
細胞を培養した。マウスのIL−2−依存細胞株CTLL−2(ギリス等(Gilli
s et al.)、1978)において、上澄みにあるIL−2レベルを測定した。
、ベスチムよりも高い生物学的活性を呈した。IL−2の導入をより広範囲の服
用量で観察し、服用量が大きい場合、この類似体はIL−2導入を低下させなか
った。
イーグル培地でマイクロタイトレーション(テラサキ)板において生体内でペプ
チドで培養した。反Thy−1抗体を用いて補体依存性の細胞毒分析評価により
、 Thy−1抗原発現を決定した。
の本発明の類似体であるγ−L−Glu−D−Trpの作用と比較すると高い作
用を呈した。
た。実験の直前に異なる物質濃度を有する溶液を調製するためにすべてのペプチ
ドを水に可溶性にした。
底が平坦な培養板に10%致死子牛血清で満たしたRPMI−1640培地で培
養した。IL−2生成物を5μg/mlCon Aで24時間の培養で生成した
。所要の濃度でペプチドを「0」時間で細胞培養に添加する。IL−2−依存C
TLL−2細胞株(ギリス等、1978)において、培養上澄みにあるIL−2
レベルを求めた。
過した2人の癌患者に投与した。
明のペプチドγ−D−グルタミル−L−トリプトファンの影響を決定した。表に
示した濃度で塩水に希釈したペプチドとともに1251照度計(LKB)の作業
キュベットにドナーの全血液の標本を挿入した。各キュベットにルミノールを添
加し、10分間キュベットを培養した。この後、37℃で40分間、照度計のウ
ェルで培養し、続けて攪拌した。「ルミナ(Lumina)」コンピュータプログラムを
用いて発生したスーパーオキシドラジカル量を計算し、40分間光の総量として
表した(mV/min)。各試料を3通りに検証した。
養培地でアガロースを溶解して最終的な濃度を1%にした。この混合物を組織培
養皿に移して、ゲル状にした。このゲルに、直径2mmの一連のウェルを3mm
間隔で切り分けた。10μlの好中球(1ml当たり2.5×106細胞)を中
央のウェルに添加した。ランダム移動を測定するために他のウェルを培地の片側
に満たし、促進された移動を測定するために10−7Mで走化性FMLPでこれ
らのウェルをもう一方の片側に満たした。CO2培養器で120分間皿を培養し た。「0」時間に所望の濃度のペプチドを細胞に添加した。マイクロスケールを
用いて顕微鏡で細胞移動を読出し、走化性指標である促進移動/ランダム移動と
して表した。
の濃度でシリコン処理した管に、フィコル−パック(Ficoll-Pack)分離によりド ナーの血液から得たヒト好中球白血球を移した。ヒト(huan)の血清を用いてオプ
ソニンを作用させた酵母セルを食細胞活動の対象物として使用した。管内に酵母
細胞を添加し(1好中球当たり10酵母細胞)、40分間CO2培養器で細胞懸 濁を培養した。この細胞を遠心分離法を用いて洗浄した後、ガラススライドに細
胞塗抹を調製して、ギムザ染色により染色した。食細胞を顕微鏡下で算出した。
イシン、5μg/mlポリミキシンBおよび0.5μg/mlコンカナバリンA
で満たしたRPMI−1640培地において底が平坦の96ウェル培養板のCO 2 培養器で、72時間、1ml当たり5×106の近交ホワイトラットの3つの培
養組織を培養した。培養期間の終了前の16時間、3H−チミジンで細胞をパル
スラベルした。チテルテック(Titertek)細胞ハーベスタを用いてガラスファイバ
フィルタ上で細胞を採取し、β液体シンチレーションカウンタで算出した。増殖
率を1分当たりの数として表す。
によるIL−2生成を促進し、前駆体Tリンパ球の成熟を誘導し、T細胞の増殖
を促進することが可能なものである。特に、好適な本発明のペプチドであるγ−
D−Glu−L−Trp(SCV−07)は、ヒト好中球白血球機能活動、特に
食細胞活動および酸素ラジカル生成を促進させることで、免疫機能を高めること
が示されている。本発明のペプチド、特にSCV−07は、Tリンパ球とTヘル
パーリンパ球数の総数と周辺の血液のCD4/CD8の比率を増大させることが
示されている。最後に、本発明のペプチド、特にSCV−07はまた、ヒト好中
球白血球移動と殺菌活動を促進させることが分かっている。
を目的としたものであって、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範
囲は添付の請求の範囲により規定されるものであることを理解されたい。
ル、β−L−アスパルチルまたはβ−D−アスパルチル部分を有する合成免疫調
整分子を提供する。式(A)では、「n」は1または2であり、Rは水素、アシ ルまたはアルキルであり、Xは芳香族または複素環式アミノ酸またはその誘導体
である。特定の好適な実施形態は、γ−D−グルタミル−L−トリプトファンで
あり、免疫調節活動を有する。
チルおよびそれを用いた方法
種類の白血球の成熟および分化を促進させるγ−L−グルタミル、γ−D−グル
タミル、β−L−アスパルチル、またはβ−D−アスパルチル部分のいずれかを
含む免疫促進化合物に関する。このように、白血球細胞の分化および増殖を選択
的に促進することによって、病気を引き起こす細菌に対する体の免疫力を高める
ことができ、さらに自己炎症状態を調節して改善する。
718号の一部継続出願であり、この出願は、共に1995年11月28日に出
願されたロシア特許出願第95119704号および第95120266号の優
先権を主張している。さらに、本出願は、1997年12月25日に出願された
ロシア特許出願第97120940号に関連し、その優先権を主張している。米
国特許出願第08/634,718は参照により本願明細書に引用されるものと
する。
するために適用された細胞網である。一度免疫系統が活性化されると、それは体
内に「自己でない」実態を除去するようにデザインされたエフェクタ機能を高め
るようにさまざまな細胞や分子の関与をうながす。リンパ球は免疫系統の細胞で
あり、異物の存在を明確に認識し選択的に除去することができる。インベーダと
の反応で特別でないものとしてみなされる好中球などの免疫系統の他の細胞と対
比すると、リンパ球の特徴は、特殊性、多様性、記憶および免疫反応に対する自
己/非自己認識を与えることである。
る。Bリンパ球は、骨髄から発生しその中で成熟して、抗体分子の形成に寄与す
る。Tリンパ球も、骨髄から生じるが、これは胸腺内で成熟する。T細胞には2
つの主要な副群がある。すなわち、Tヘルパー細胞とT細胞毒性細胞である。こ
れら2つのタイプのT細胞は、2つの膜糖たんぱく質のうちのいずれか、すなわ
ちCD4またはCD8が存在することによって区別できる。抗原複合体(特定の
たんぱく質に連結した異物分子)によって活性化される場合、Tヘルパー細胞(
CD4を表す)は、サイトカインとして総称して公知のさまざまな成長因子を分
泌することによって応答する。これらのサイトカインは、T細胞毒性細胞を含む
免疫系統の他の細胞を活性化させる信号である。活性化される場合、T細胞毒性
細胞(CD8を表す)は、体内をモニタし、体内から病原細胞、異物細胞、ウィ
ルスに感染した細胞、腫瘍細胞を除去する。
チドホルモンにより調整される。このようなホルモンの1つに、49−アミノ酸
残基ペプチドのチモポイエチンがある。チモポイエチンの残基32−36である
Arg−Lys−Asp−Val−Tyrは、チモポイエチンの生物活性を保持
し、チモペンチン(thymopentin) と呼ばれる免疫調節薬の基本となるものである
。チモペンチンを治療時に投与する使用目的には、慢性関節リウマチ、皮膚病の
状態、バクテリア、ウィルス、菌による感染、手術や癌治療による免疫低下の反
転、B型肝炎ウィルスのワクチン接種に対する反応の強化、および後天性免疫不
全症候群(AIDS)が含まれており、Tヘルパー(CD4)細胞はウィルスに
より特に攻撃される状態にある(クリスチャン, ジェイ. エス.(Christian, J.S
.)の「チモペンチンの薬理学、臨床投与および毒性に関する報告書(A review of
the Pharmacology, Clinical Applications, and Toxicology of Thymopentin)
」、トランスジェニカ(Transgenica)、ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオ テクノロジー(The Journal of Clinical Biotechnology) 、1、23〜34頁、
1994年)。
hymogen)と呼ばれるGlu−Trpである。連鎖−Glu−Trp−も、チモポ
イエチンの合成の前駆体である分子に発生するが、−Glu−Trp−は、49
−アミノ酸ホルモンの一部ではなく、チモポイエチンの生物活性に寄与するもの
として見なされるジペプチドでもない。チモゲンは、ロシアで発見され、主に、
疫病の予防や感染治療に使用された。チモゲンは、チェルノブイリ原発事故によ
り放射能に偶発的に被爆したことが原因でリンパ球がダメージを受けた後の免疫
機能を増大させるために使用された。(カビンソン等(Khavinson et al.)、国際
特許公開第WO92/17191号公報および国際特許公開第WO93/088
15号公報、「薬学ジペプチド組成およびその使用方法(Pharmaceutical Dipept
ide Compositions and Methods of Use Thereof)」。)
トリペプチドグルタチオンである。合成γ−L−グルタミル分子も候補薬として
使用されてきた。γ−L−グルタミル部分は分子の活性部分のキャリヤとして使
用されるため、これらの候補薬は、「プロドラッグ」と呼ばれる。例えば、γ−
L−グルタミニル−4−ヒドロキシ−3−ヨードベンゼンは、人体およびマウス
の黒色腫の細胞株において抗癌作用を発揮する。この化合物の抗癌作用は、癌細
胞付近で4−ヒドロキシ−3−ヨードベンゼンの酵素放出によるものであると考
えられる(プレジオソ等(Prezioso et al.) 、「γ- グルタミルトランスペプチ
ダーゼの発現は抗癌プロドラッグであるγ−グルタミニル−4−ヒドロキシ−3
−ヨードベンゼンの成長抑制作用を調整する (γ-Glutamyltranspeptidase Expr
ession Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodru
g γ-glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene)」、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・キャンサー(International Journal of Cancer) 、56、874頁〜
879頁、1994年)。また、γ−L−グルタミル−ドーパミンおよびγ−L
−グルタミル−5−ヒドロキシ−トリプトファンは、ドーパミンと5−ヒドロキ
シ−トリプトファンを脳神経に運び供給することがあるプロドラッグとして記載
されている(リカムワ等(Likamwa et al.)、「γ−L−グルタミル−5−ヒドロ
キシ−L−トリプトファンの抗ナトリウム排泄増加作用は正常脳の5−ヒドロキ
シトロタミンの脱カルボキシル化に依存する(The Antinatriuretic Action of
γ-L-glutamyl-5-hydroxy-L-tryptophan is Dependent on its Decarboxylation
to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain)」、ブリティッシュ・ジャーナル・
オブ・クリニカル・ファーマコロジィ(British Journal of Clinical Pharmacol
ogy)、387:265〜269、1994年)。
19日に公開された国際特許公開第WO96/40740号公報には、式X−A
−D−Trp−Y(I)のペプチドが開示されており、ここで、A=D−Glu
またはD−イソグルタミン酸(D−iGlu)であり、X=H、Gly、Ala
、Leu、Ile、Val、Nva、Pro、Tyr、Phe、Trp、D−A
la、D−Leu、D−Ile、D−Val、D−Nva、D−Pro、D−T
yr、D−Phe、D−Trp、γ−アミノブチル酸またはε−アミノカプロン
酸であり、Y=Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Nva、Pro、T
yr、Phe、Trp、D−Ala、D−Leu、D−Ile、D−Val、D
−Nva、D−Pro、D−Tyr、D−Phe、D−Trp、γ−アミノブチ
ル酸、ε−アミノカプロン酸、OH、または1〜3C置換アミノである。化合物
(I)は、免疫抑制作用(例えば、脾細胞の増殖抑制)をもち、人体、獣医学、
実験的生化学に有益であるとされている。
「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連し、免疫調節特性を有する新しい種類の
化合物の実施形態に与えられた名前である。本発明の一部継続出願である米国親
特許出願第08/634,718号には、新しい種類の化合物の数種の化合物が
記載され、請求され、さらにこれらの化合物を用いて免疫調節治療方法が請求さ
れている。ベスチム化合物自体は、γ−L−グルタミル−L−トリプトファンの
化学構造を有する。
または複素環式アミノ酸またはその誘導体、およびnは1または2である。我々
は、新しい種類の一部として(ベスチム、γ−L−グルタミル−L−トリプトフ
ァン以外にも)、これらの化合物が含まれることを発見し、ここでRは水素、X
は、γ−D−グルタミル−L−トリプトファン、γ−L−グルタミル−D−トリ
プトファン、β−L−アスパルチル−L−トリプトファンおよびβ−D−アスル
チル−L−トリプトファンなどのL−トリプトファンおよびD−トリプトファン
である。式1において星印を付けたα炭素は立体配置をもつものであり、nが2
のとき、Xの立体配置とは異なる。特別な好適な実施形態は、γ−D−グルタミ
ル−L−トリプトファンである。式1のペプチドは、無毒の有機または無機酸を
有する製薬的に許容可能な塩を形成することがある。カルボキシル基の塩は、任
意の適切な無機または有機塩基で形成される無毒カルボキシル酸塩を含む。
促進作用をもつ。この生物学上の作用のメカニズムは、骨髄Tリンパ球前駆体の
分化、リンパ球増殖の促進、およびインターロイキン−2を含むさまざまなサイ
トカインの発生の誘導に関する。ベスチムの薬理効果の最終結果によると、Tヘ
ルパーリンパ球、すなわちCD4マーカを含む細胞の数が選択的に増加する。
生体内では、体重1kg当たり10ng〜1μgの投与量で作用し、免疫促進剤
の投与よりも500から100万倍高い投与量で毒性が見られない。動物実験で
は、経口投与後に活性である。
る場合、免疫機能が増加した。これらの実験変化は、臨床結果に有益な陽性の指
示薬(positive indicator)により達成された。
、ベスチムのものと、さらに広範囲の投与量で観察されるIL−2誘導と比較す
ると、生物学活性がさらに高くなることが分かる。
ベスチムとその類似体は、伝染病の免疫治療や、放射線への被爆または癌の化学
治療や手術などのその他のストレス因子により、予め低下していた免疫反応の回
復の薬として効果的である。
た状態により引き起こされた免疫不全を緩和して患者に有益に投与され、微生物
からの危険な感染を改善し減少させるように患者に投与され、特に、それぞれ感
染しやすい傾向にある入院中の患者や、手術を受けている患者や、癌の化学治療
を受けている患者に対しては被害を受けている場所を処置するように投与される
。さらに、式1の免疫調節化合物は、ウィルス除去を容易にし、病原微生物の免
疫監視を高め、さらには例えば、疱疹ウィルス、水痘ウィルス、肝炎ウィルスお
よびHIVなどの病気を患っているかまたはその保有者である患者の病気の再発
を減少させるために、症候性または無症候性ウィルスに感染している患者に投与
され、例えば、癌などの状態で、自然細胞が体に「異物」として認識されるよう
な自然細胞を変更する病気の患者に投与され、さらに免疫系統を均衡に調整する
ために、慢性関節リウマチ、多発硬化症、強皮症などの自己炎症(自己免疫)の
病気の患者に投与される。
法以外に、式1の免疫調節化合物は、例えば、インフルエンザのワクチン接種と
組み合わせて伝染病の疑いのある健康な患者に投与したり、例えば、肝炎用のワ
クチン接種、この専門用語はワクチン接種の「アジュバント」として本発明で使
用されるワクチン接種と組み合わせて病原体への免疫反応を高めるように投与し
てもよい。
量で投与され、1回の投与または1ヵ月以上の期間にわたって断続的に与えられ
、さらに投与経路は、非経口注射、経口または鼻吸入、または経口摂取によるも
のが好ましい。
調節する特有の化学物質である。例えば、Tヘルパー細胞数を増加させるために
免疫系統を調節すると、バクテリアやウィルスからの感染を処理する生体の能力
が増大する。また、Tヘルパー細胞の数を増大するように調節することによって
、ホストに対して異物となる癌細胞に対して体が闘いやすくなる。この代わりに
、これらの物質によって、内因性組織に対してホストのT細胞による過度の攻撃
が生じる自己認識処理の混乱から生じた病気に対してホストが調節を行うことも
できる。このような場合、本発明の化合物は、慢性関節リウマチおよび多発硬化
症などの自発的な炎症(自己免疫)の病気の兆候や症状が改善されるように、T
細胞数を調整する。
「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連するもので、免疫調節特性を有する新し
い種類の化合物の実施形態に与えられた名前である。免疫促進投与量よりも50
0または500,000倍を超える服用量で毒性は観察されない。ベスチム化合
物自体は、γ−L−グルタミル−L−トリプトファンの化学構造を有する。新し
い種類の合成免疫調節分子は、式1に示すように、アミノ末端にγ−L−グルタ
ミル部分、γ−D−グルタミル−部分、β−L−アスパルチル部分、またはβ−
D−アスパルチル部分を有する。
は芳香族または複素環式アミノ酸またはその誘導体であり、好ましくはここでは
X=L−トリプトファンおよびD−トリプトファンである。「X」の芳香族また
は複素環式アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−またはジ−(C1-C6) アルキル置換アミド、アリールアミドおよび(C1-C6)アルキルまたはアリー ルエステルである。「R」の適切なアシルまたはアルキル部分は、1〜6炭素の
枝分かれしたまたは枝分かれしていないアルキル基、2〜10の炭素原子からの
アシル基、およびカルボベンジルオキシ基およびt−ブチルオキシカルボニル基
などの保護基である。式1で星印を付したα炭素は、立体配置をもつもので、n
が2である場合、Xの立体配置とは異なるものである。
ン以外にも)、γ−L−グルタミル−Nin−ホルミル−L−トリプトファン、N
−メチル−γ−L−グルタミル−L−トリプトファン、N−アセチル−γ−L−
グルタミル−L−トリプトファン、γ−D−グルタミル−L−トリプトファン、
γ−L−グルタミル−D−トリプトファン、β−L−アスパルチル−L−トリプ
トファン、およびβ−D−アスパルチル−L−トリプトファンなどの化合物が含
まれる。
形成することがある。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、リン酸一水素ナト
リウムおよび硫酸水素カリウムなどの塩化水素、臭化水素、硫酸およびリン酸お
よび酸金属塩を含む。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、モノ−、ジ−、ト
リカルボン酸を含む。このような酸の例は、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸
、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸
、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸(hydroxygenzoic)
、酢酸フェニル、桂皮酸、サリチル酸、2−フェノキシ安息香酸、およびメタン
スルホン酸や2−ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸である。カルボ
キシル基の塩は、任意の適切な無機または有機塩基で形成された無毒のカルボン 酸塩を含む。例示的に、これらの塩は、例えば、ナトリウムやカリウムなどのア
ルカリ金属、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウム
を含むIIIA族の軽金属、および例えば、トリエチルアミン、プロカイン、ジ
ベンジルアミン、1−エチレンアミン、N,N−ジベンジル−エチレンジアミン
、ジヒドロアビエチルアミン:N−(低級)アルキル−ピペリジン、他の適切な
アミンを含むトリアルキルアミンなどの第1、第2、第3アミンを含む。
が存在すると、2つの重要な特性が与えられるとされている。この2つの特性と
は、アミノペプチダーゼによる分解に対する抵抗力と、潜在能力の増大である。
しかしながら、本発明の類似体の1つであるγ−D−グルタミル−L−トリプト
ファンは、ベスチムよりもさらに高い生物学活性と、より広範囲の服用量の範囲
を有することが分かっている。本発明のこの特定の好適な実施形態は、「SCV
−07」と称することもある。
亜急性毒性の動物実験を行った。すべての実験において、アンプルに無菌凍結乾
燥粉末として調整したベスチムを、無菌0.9%NaCl溶液で溶解し、筋肉内
注射を行った。
一になるグループに無作為抽出した。ベスチムを1回投与(筋肉内)させた後、
14日間毎日動物を検査した。 マウス − 5,000.0 mg/kg ラット − 500.0 mg/kg イヌ − 500.0 mg/kg
内蔵(心臓、肺、胸膜腔および腹膜腔、筋肉、胃、小腸および大腸、肝臓、脾臓
、膵臓、腎臓、膀胱、甲状腺、脳、皮膚および睾丸/卵巣)の肉眼検査および組
織病理検査を行った。
血液内指標、生化学指標、生理的指標、肉眼検査および組織病理検査の記録結果
はすべて正常値内のものであった。
を投与した。 ラット:3カ月および6カ月毎日、1mg/kgおよび100mg/kgを筋
肉内投与 イヌ:1カ月および3カ月毎日、1mg/kg、10mg/kgおよび100
mg/kgを筋肉内投与
血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。肉眼レベルと組織
病理レベルでのすべての組織の形態上の外観は正常であった。ラットへの両投与
ともに実験動物の体重が僅かに増えた。
血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。検査したすべての
組織の肉眼検査および組織病理検査に著しい変化は見られなかった。注射部位で
の局所的炎症反応はなかった。
または亜急性毒性を受けないことが分かった。治療トライアル用の予測投与量に
対して検査で用いた投与量は、1回の投与の場合では約5,000,000倍で
あり、繰り返し投与した場合では約100倍のものであった。
をマウスの胸腺細胞を用いて検査した。胸腺細胞を2度洗浄し、2%致死子牛血
清を含有するRPMI1640媒体内に再懸濁させた。細胞懸濁液を96個のウ
ェルがある板(1ウェル当たり1×106個の細胞)内に配置した。次いで、ペ プチド(または制御ウェルの担体)を所要の濃度でウェル内に添加した。CO2 の培養器内で37℃、4時間、ペプチドまたは担体で細胞を培養した。培養後、
エオシンB(Eosin B) を用いて細胞の生存能力を顕微鏡で算出した。その結果を
表Aに示す。
ァンは、細胞の生存能力を減少させ(表A)、したがって、0.1mg/mlの
投与量で細胞に有毒なものとなることが分かった。
学におけるチモペンチンの「チモポイエチンからチモペンチンまで:実験的研究
(Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies) 、Surv. Immunol. Res
. 、4、1〜10頁、1985年)は、免疫調節薬が免疫不均衡が低応答性また
は高応答性の状態にあろうが、免疫不均衡を回復するように作用する。これらの
薬の双方向の作用は、不均衡の状態を均衡した目標値に回復する生体調整の性質
により生じる。低応答性の場合、Tリンパ球を調整するホルモン投与は、自己防
衛システムの機能を最適化しさらに調整するため、自己ではない有機体がさらに
除去しやすくなるように作用する。高応答性の場合、免疫調節薬を投与すると、
有益な「自己」の存在を間違って攻撃することが減少する自己免疫処理を弱める
ようである。低応答性の免疫状態と高応答性の免疫状態におけるベスチムの臨床
投与のカテゴリーに関して記載し、例示して述べる。
病気の過程の結果として生じる免疫抑制である。2つ目は、他の病気の治療によ
り生じた免疫不全、いわゆる医原性免疫不全である。3つ目は、後天性免疫不全
症候群(AIDS)を引き起こすヒト免疫不全ウィルス(HIV)によりTリン
パ球が直接攻撃されることから生じる免疫不全である。
よび感染である。細胞性および体液性免疫応答が弱まることで、さまざまな細菌 による感染媒体に感染しやすくなるため、栄養不良の人、広範囲に癌が進行した
患者や病気で衰弱した人は、病気になりやすく、さらに死に至る確率も高くなる
。免疫応答の不全が広がった状態を免疫性欠如と呼ぶ。さまざまなタイプの感染
、特にウィルス感染が免疫抑制となる。免疫系統のTヘルパーリンパ球成分をよ
り強力なものにできるベスチムなどの薬は、患者の感染への抵抗力を高めるため
の重要な治療薬となる。例えば、ベスチムまたはその類似体は、 −− 共通した深刻な臨床問題である院内感染(病院で誘発される感染)の危
険性を下げるために病院への許可前または許可直後に、患者、特に年配の患者に
投与され、 −− このような患者は特に感染しやすい傾向にあるため、犠牲になっている
個所を処置するように投与され、 −− 例えば、インフルエンザ接種や肝炎接種と組み合わせて流行性の感染の
疑いがある患者に対して、病原体への免疫応答を活性化させるように投与され、 −− 例えば、疱疹ウィルス、バクテリアウィルス、肝炎ウィルスやHIVの
保有者である患者に対して、病原有機体の免疫監視を高め、病気の再発の可能性
を下げる目的で、無症候性のウィルスが感染した患者に投与される。
る薬治療が原因である。さまざまな化学治療薬が癌患者に投与され、これらの薬
は、通常、成熟リンパ球および成長中のリンパ球の両方に対して細胞毒であり、
さらには顆粒球前駆体および単球前駆体に対しても細胞毒である。したがって、
癌の化学治療は、ほとんどの場合、免疫抑制期間および感染の危険性が高い期間
に行われる。癌の放射線治療も同じ危険性を伴う。薬物治療(顆粒球群促進因子
)は、癌の化学治療後に生じる感染と戦わせるように血液中の好中球を増やすた
めに用いられるが、リンパ球の機能を回復させるための薬物治療は現在のところ
用いられていない。動脈瘤の治療やバイパス形成手術などの大手術では、人体の
免疫機能も下がる。大手術により起こる血中リンパ球の低下の理由は明らかでは
ないが、感染の可能性を下げながら、このような患者のリンパ球機能を高める薬
剤には治療薬剤として重要なものである。
生じるもので、これは、外傷後またはある種の血液病の治療用にこの臓器を手術
で除去したり、または鎌状細胞病で梗塞が形成された結果引き起こされる。脾臓
がない患者は、ある細菌、特に肺炎連鎖球菌などの被包バクテリアの感染を受け
やすい。脾臓は、このような細菌に対する保護用体液性免疫応答を誘導するため
に必要であることは明らかである。ベスチムは、微生物による汚染に対して、脾
臓がない患者または胸腺がない患者の抵抗力を高める働きをする。
を用いて説明するが、この例は説明を目的とするもので、本発明を限定するもの
ではない。
ルとN−ベンジルオキシカルボン−L−グルタミン酸α−ベンジルエステルを、
ムーア等(Moor et al.)のJ. Chem. Soc.、2349(1966)に記載されるよ
うに調製し、さらにL−トリプトファンベンジルエステルp−トルエンスルホン
酸を、アライ等(Arai et al.)、J. Org. Chem.、48、121(1983)に記
載されるように調製した。D−トリプトファン、N−メチルモルホリン、クロロ ぎ酸イソブチル 、パラジウム−炭素触媒(10%)、N−ヒドロキシスクシンイ
ミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、N,N−ジメチルホルムアミド、テト
ラヒドロフラン、アセトニトリルをフルカ社(Fluka)から購入し、トリフルオロ 酢酸をメルック社(Merck)から購入した。
被覆させた板のKieselgel 60 F254(メルック社)上で上昇TL Cを実行した。 A.クロロホルム/メタノール/酢酸 90:8:2 B.2−プロパノール/25% NH4OH/水 50:5:15 C.ブタノール/酢酸/水 3:1:1 UV光、ニンヒドリン、J2でペプチドを配置した。
同じ溶媒系を用いた。すなわち、溶媒A−0.1%トリフルオロ酢酸水と、溶媒
B−アセトニトリルである。
(モデル116)、データマスタ(Data Master)(モデル621)、および分析 カラムゾルバックス(Zorbax)ODS 4.6×150mm、5μからなるギルソ
ン(Gilson)クロマトグラフ上で分析作業を実行した。流量は1ml/minであ
った。230nmでペプチドを制御した。溶離液は、20分間、10〜40%B
または10〜90%の線形の勾配であった。
ンコレクタ(モデル202)、分光光度計(ホロクロム(Holochrome))、および 分取 カラムゾルバックス ODS 21.2×250mm、8μからなるギルソ
ンクロマトグラフ上で予備浄化を実行した。流量は10ml/minであった。
230nmでペプチドを制御した。溶離液は、80分間、0〜40%Bの線形の
勾配であった。
照としてとった。特別な記載がなければ、通常の獲得パラメータは、温度は周囲
温度で、スペクトル幅は4,500Hzで、パルス幅は1μs(60)で、時間 ドメインにおいて8192データ点であった。16384点アドレスで処理を実
行した。緩和遅延は2sであった。
ミン酸α−ベンジルエステル(0.74g、2mmol)とN−メチルモルホリ
ン(0.22ml、2mmol)の溶液を−15℃に冷却する。クロロぎ酸イソ ブチル (0.28ml、2mmol)を添加して、この混合物を混合無水化合物
を形成するために3分間、−10℃に置く。無水テトラヒドロフランにおいてL
−トリプトファンベンジアルエステルp−トルエンスルホン酸(0.93g、2
mmol)とN−メチルモルホリン(0.22ml、2mmol)の溶液を−5
℃に冷却し、添加して、約5℃の冷蔵庫に反応混合物を置く。次の日、溶液を塩
からフィルタがけし、無水テトラヒドロフラン(20ml)で洗浄し、真空内で
蒸発させる。酢酸エチル(50ml)で残留物を溶解し、同量の水、2N H2 SO4溶液、水、5%NaHCO3溶液、さらに再度水で洗浄する。これを無水 Na2SO4 上で乾燥させ、乾燥剤からフィルタがけし、約10mlまで真空内 で濃縮する。ヘキサン(50ml)を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は
820mg(62%)である。Rf(A)は0.75である。
グルタミル−L−トリプトファンジベンジルエステル(0.6g、0.9mmo
l)の溶液を、5時間Pd/C(10%、200mg)上で水素化させる。触媒
を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる。生成量は26
0mgである。
る。生成量は190mgである。RF(B)は0.5で、RF(C)は0.45
である。前述したように、このような特定の好適な実施形態は、「SCV−07
」と呼ばれることがある。
ボニル−L−グルタミン酸α−ベンジルエステル(0.99g、2.6mol)
およびN−ヒドロキシスクシンイミド(0.3g、2.6mmol)の溶液を氷
水浴で冷却し、N,N−ジメチルホルムアミド(3ml)においてジシクロヘキ
シルカルボジイミド(0.56g、2.7mmol)の溶液を攪拌して添加する
。0℃で1時間この混合物を攪拌して、室温で一晩置く。分離したN,N−ジシ
クロヘキシル尿素を濾過で除去し、D−トリプトファン(0.64g、3.1m
mol)およびトリエチルアミン(0.46ml、3.3mmol)を濾過水に
添加する。この混合物を室温で16時間攪拌して、水(50ml)で希釈する。
分離した油を酢酸エチル(3×20ml)で抽出して、組み合わせた有機層を2
NH2SO4溶液(2×20ml)と水(4×30ml)で洗浄して、Na2SO4 で乾燥させて、乾燥剤からフィルタがけし、約10mlまで真空内で濃縮させる
。ヘキサン(30ml)を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は1.2g(
81%)である。Rf(A)は0.7である。
グルタミル−D−トリプトファンαベンジルエステル(0.6g、0.9mmo
l)の溶液を、2時間Pd/C(10%、200mg)上で水素化させる(TL
C制御)。触媒を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる
。生成量は285mgである。
る。生成量は180mgである。Rf(B)は0.5で、Rf(C)は0.45
である。 γ−L−グルタミル−D−トリプトファンは、γ−D−グルタミル−L−トリ
プトファンと同じ 1H NMRおよび13C NMRスペクトルを有する。
子を合成した。0.1gのNa−tert−Boc−ニンホルミル−L−トリプ
トファン−メリフィールド樹脂(Trp0.7mmol/g樹脂の含量)を反応 器 に配置する。自動合成プログラムは以下のとおりである。
1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の活性化エステルでカップリン
グが実行された。** カイザー(Kaiser)のニンヒドリン検査によりカップリング完了が検証された (カイザー等、Anal.Biochem.、34:595、1970)。カッ
プリングが完全に終了していない場合は、もう一度繰返した。
ールを含有する液体フッ化水素(HF)でポリマーから開裂した。0℃の真空内
でHFを除去し、ペプチドを30%水性酢酸で抽出し、エチルエーテルで洗浄し
、凍結乾燥させて、0.2N水酸化ナトリウムで脱ホルミル化した後、分取高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)により純化した。
ュールのものと同じ方法により、すべてのベスチム類似体を合成させてもよい。
ランス)、溶離液0.1%TFA/アセトニトリル、勾配10〜40%、14分
ラン、カラムデルタ−パック(Delta-Pack)C−18、300Å、5μm、3.9
×150MMを用いた。生成物の保持時間は8.1minであり、HPLCピー
ク下での平均領域として測定された純度は99.7%であった。 2. アミノ酸分析:LKBアミノ酸アナライザアルファプラス(Alpha Plus)4
151を用いて、24時間、115℃の真空内で0.2%トリプタミンを含有す
る4Nメタンスルホン酸に生成物を加水分解した。グルタミン酸のペプチド含有
量は1.0で、トリプトファンは0.04であり、所望の残留物の存在を確認し
た。 3. 薄層クロマトグラフィー(TLC):システム1 − n−ブタノール: 酢酸エチル :酢酸:水=1:1:1:1、Rf=0.72、システム2 − s
ec−ブタノール:酢酸:トルエン:水=6:1:2:1、Rf=0.4 4. 核磁気共鳴分析法(NMR):アスペクト(Aspect)200コンピュータを
備えたNMR分光計ブルーカー(Bruker) GXP−300。、ペプチド(0.0
01M/l溶液)を炭素NMRスペクトルで検出した:Gluに対して、30.
0;31.0;57.2;176.6;178.3ppm、Trpに対して、3
5.7;58.3;113.1;116.6;123.4;124.3;126
.6;129.0;131.0;140.3;179.4ppmであった。 5. 高速原子衝撃質量分析法(FAB−MS)、分子イオン:計算、334.
13 Da;333.73獲得。
例1Eに記載するような錠剤の製剤により説明する。
エステル(5g、0.087M)をメタノール(40ml)に溶解し、NaHC
O3(0.73g、0.087M)を添加した。空気を低速の流れの窒素と取り 替え、10%パラジウム炭触媒(30ml水に2.5g)を添加した。さらにも
う一度、低速の流れの窒素をフラスコを通して流し、低速の流れの水素の導入を
開始した。強力な攪拌により触媒の懸濁を保持した。4時間、濾過により触媒を
除去して、メタノール(10ml)により洗浄した。濾過水を真空内で蒸発させ
、残留物をアセトニトリルで粉末にした。固体の生成物をフィルタ上で収集し、
アセトニトリルで洗浄して、真空内で乾燥させた。 生成量:2.14g(70%)
98.9%グリシン、1%ステアリン酸マグネシウムおよび0.1%の本発明の
ペプチドか、または94.9%グリシン、5%デンプンおよび0.1%の本発明
のペプチドのいずれかを用いて錠剤に製剤した。各100mGの錠剤は、本発明
の類似体の100μgを含有した。
−Glu−L−Trp(ベスチム類似体)を、5連続日、1日につき表に示す異
なる服用量で水溶液の形でマウスに経口的に投与した。5匹の動物を用いて各ペ
プチドを服用させた。48時間後、脾臓を除去し、96ウェルの底が平坦な培養
板に10%致死子牛血清で満たしたRPMI−1640培地において、IL−2
生成物誘導酵素ConA(5μg/ml)がある生体外で、さらに24時間脾臓
細胞を培養した。マウスのIL−2−依存細胞株CTLL−2(ギリス等(Gilli
s et al.)、1978)において、上澄みにあるIL−2レベルを測定した。
、ベスチムよりも高い生物学的活性を呈した。IL−2の導入をより広範囲の服
用量で観察し、服用量が大きい場合、この類似体はIL−2導入を低下させなか
った。
イーグル培地でマイクロタイトレーション(テラサキ)板において生体内でペプ
チドで培養した。反Thy−1抗体を用いて補体依存性の細胞毒分析評価により
、 Thy−1抗原発現を決定した。
の本発明の類似体であるγ−L−Glu−D−Trpの作用と比較すると高い作
用を呈した。
た。実験の直前に異なる物質濃度を有する溶液を調製するためにすべてのペプチ
ドを水に可溶性にした。
底が平坦な培養板に10%致死子牛血清で満たしたRPMI−1640培地で培
養した。IL−2生成物を5μg/mlCon Aで24時間の培養で生成した
。所要の濃度でペプチドを「0」時間で細胞培養に添加する。IL−2−依存C
TLL−2細胞株(ギリス等、1978)において、培養上澄みにあるIL−2
レベルを求めた。
過した2人の癌患者に投与した。
明のペプチドγ−D−グルタミル−L−トリプトファンの影響を決定した。表に
示した濃度で塩水に希釈したペプチドとともに1251照度計(LKB)の作業
キュベットにドナーの全血液の標本を挿入した。各キュベットにルミノールを添
加し、10分間キュベットを培養した。この後、37℃で40分間、照度計のウ
ェルで培養し、続けて攪拌した。「ルミナ(Lumina)」コンピュータプログラムを
用いて発生したスーパーオキシドラジカル量を計算し、40分間光の総量として
表した(mV/min)。各試料を3通りに検証した。
養培地でアガロースを溶解して最終的な濃度を1%にした。この混合物を組織培
養皿に移して、ゲル状にした。このゲルに、直径2mmの一連のウェルを3mm
間隔で切り分けた。10μlの好中球(1ml当たり2.5×106細胞)を中
央のウェルに添加した。ランダム移動を測定するために他のウェルを培地の片側
に満たし、促進された移動を測定するために10−7Mで走化性FMLPでこれ
らのウェルをもう一方の片側に満たした。CO2培養器で120分間皿を培養し た。「0」時間に所望の濃度のペプチドを細胞に添加した。マイクロスケールを
用いて顕微鏡で細胞移動を読出し、走化性指標である促進移動/ランダム移動と
して表した。
の濃度でシリコン処理した管に、フィコル−パック(Ficoll-Pack)分離によりド ナーの血液から得たヒト好中球白血球を移した。ヒト(huan)の血清を用いてオプ
ソニンを作用させた酵母セルを食細胞活動の対象物として使用した。管内に酵母
細胞を添加し(1好中球当たり10酵母細胞)、40分間CO2培養器で細胞懸 濁を培養した。この細胞を遠心分離法を用いて洗浄した後、ガラススライドに細
胞塗抹を調製して、ギムザ染色により染色した。食細胞を顕微鏡下で算出した。
イシン、5μg/mlポリミキシンBおよび0.5μg/mlコンカナバリンA
で満たしたRPMI−1640培地において底が平坦の96ウェル培養板のCO 2 培養器で、72時間、1ml当たり5×106の近交ホワイトラットの3つの培
養組織を培養した。培養期間の終了前の16時間、3H−チミジンで細胞をパル
スラベルした。チテルテック(Titertek)細胞ハーベスタを用いてガラスファイバ
フィルタ上で細胞を採取し、β液体シンチレーションカウンタで算出した。増殖
率を1分当たりの数として表す。
によるIL−2生成を促進し、前駆体Tリンパ球の成熟を誘導し、T細胞の増殖
を促進することが可能なものである。特に、好適な本発明のペプチドであるγ−
D−Glu−L−Trp(SCV−07)は、ヒト好中球白血球機能活動、特に
食細胞活動および酸素ラジカル生成を促進させることで、免疫機能を高めること
が示されている。本発明のペプチド、特にSCV−07は、Tリンパ球とTヘル
パーリンパ球数の総数と周辺の血液のCD4/CD8の比率を増大させることが
示されている。最後に、本発明のペプチド、特にSCV−07はまた、ヒト好中
球白血球移動と殺菌活動を促進させることが分かっている。
を目的としたものであって、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範
囲は添付の請求の範囲により規定されるものであることを理解されたい。
Claims (14)
- 【請求項1】 少なくとも2つのアミノ酸残基と式1 の構造を有する化合物であって、前記式中、 nは1または2であり、Rは水素、2〜10炭素原子を有するアクリル、また
は1〜6炭素を有するアルキルであり、XはL−トリプトファン、D−トリプト
ファン、β−L−アスパルチル−L−トリプトファン、またはβ−D−アスパル
チル−L−トリプトファンであり、式1中で星印をつけたα炭素は立体構造を有
し、nが2のとき、Xの立体構造とは異なる構造を有することを特徴とする化合
物。 - 【請求項2】 XはL−トリプトファンである請求項1記載の化合物。
- 【請求項3】 XはD−トリプトファンである請求項1記載の化合物。
- 【請求項4】 製薬上認可される塩形の請求項1記載の化合物。
- 【請求項5】 γ−D−グルタミル−L−トリプトファン化合物。
- 【請求項6】 β−L−アスパルチル−L−トリプトファン化合物。
- 【請求項7】 β−D−アスパルチル−L−トリプトファン化合物。
- 【請求項8】 製薬上認可される担体を有した混合物の請求項5、6、7の
いずれか1項に記載の化合物からなる製薬組成。 - 【請求項9】 体重1kg当たり約1ng〜約1,000μgの範囲にある
請求項3記載の化合物を有する治療服用量を患者に投与するステップからなる治
療方法。 - 【請求項10】 前記投与は、1回の服用または周期的な複数回の服用であ
る請求項9記載の方法。 - 【請求項11】 前記投与は、非経口的注射、経口もしくは鼻吸引、または
経口摂取である請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 製薬上認可される形で式1 の構造を有する化合物を、体重の約1ng〜約1,000μgの範囲の服用量で
患者に投与するステップからなる免疫調節治療方法であって、前記式中、 nは1または2であり、Rは水素、2〜10炭素原子を有するアクリル、また
は1〜6炭素を有するアルキルであり、XはL−トリプトファン、D−トリプト
ファン、β−L−アスパルチル−L−トリプトファン、またはβ−D−アスパル
チル−L−トリプトファンであり、式1中で星印をつけたα炭素は立体構造を有
し、nが2のとき、Xの立体構造とは異なる構造を有することを特徴とする免疫
調節治療方法。 - 【請求項13】 前記投与は、患者の免疫系統の調節に効果的である請求項
12記載の方法。 - 【請求項14】 前記投与化合物は、γ−D−グルタミル−l−トリプトフ
ァンを含む請求項12記載の方法。
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