JP2638666B2 - 血液調節ペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液調節（hemoregulatory）活性を有して
おり、造血を刺激するため、およびウイルス性、真菌類
性および細菌性感染症を治療するために使用することが
できる新規ペプチドに関する。

（従来の技術） コロニー形成促進因子、インターフェロンおよび様々
なタイプのペプチドのような種々の調節メッセンジャー
および修飾因子によって、骨髄造血の調節が為される。
メトカーフ（Metcalf），セル（cell）,43:5（1985）；
バセルガ・アール（Baserga R.）、フォア・ピー（Foa
P.）、メトカーフ・ディー（Metcalf D.）、ポリ・イー
イー（Polli EE）（eds），バイオロジカル・レギュレ
ーション・オブ・セル・プロリファレーション（Biolog
ical Regulation of Cell Proliferation）（1986）；
ニコラ（Nicola）ら，ジャーナル・オブ・セルーラー・
フィジオロジー（J.Cell Physiol.）128:501（1986），
ゾウンボス（Zoumbos）ら,Proyr.Hemat.1:341および14:
201（1986）；ウェルナー（Werner）ら，イクスペリエ
ンチア（Experientia）42:521（1986）参照。20年前、
リトマ（Rytomaa）およびキビエニミ（Kivieniemi）セ
ル・ティシュー・キネット（Cell Tissue Kinet）1:329
−340（1968）；リトマ（Rytomaa）ら，コントロール・
オブ・セルーラー・グロウス・イン・アダルト・オーガ
ニズムス（Control of Cellular Growth in Adult Orga
nisms）pp106−138（1967）には、成熟顆粒球（顆粒球
性カローン）の抽出物がカバーガラス培養におけるラッ
ト骨髄造血細胞増殖を特に抑制することが報告された。
その後、彼等は、3,000ダルトン以下の分子量を有する
因子が移植可能なラット顆粒球性白血病を後退させるこ
とができ、同様に、ヒトにおいて白血病細胞の成長を遅
らせることができることを示した。パウコビッツ（Pauk
ovits）とその他の者は、ラット骨髄細胞から同様の因
子を抽出し、それが骨髄細胞のトリチウムチミジン摂取
を抑制することを示した。パウコビッツ・ダブリュ・ア
ール（Paukovits W.R.），セル・ティシュー・キネット
（Cell Tissue Kinet）4:539−547（1971）；ナトゥー
ルホルシュ（Naturforsch）37:1297（1982）参照。1979
年に、ボール（Boll）ら，アクタ・ヘマトロジカ（Acta
Haematologica）6:130（1979）は、培養においてヒト
骨髄細胞へのラット顆粒球抽出物の抑制効果を示し、多
くの他の研究者は、齧歯類動物骨髄細胞からのこの粗顆
粒球抽出物がインビトロでｇ−CFUCおよび／またはgm−
CFUCの発達を抑制することを示した。

この生物学的薬物を顆粒球性カローンと称し、これ
は、この論理学的概念に従って、それを分泌すると同じ
組織において作用する細胞増殖の内因性抑制因子であっ
た。粗抽出物から得た該物質は、種特異性はないが組織
特異性が高いことがわかった。さらに、非毒性であり、
可逆性の活性を有することがわかった。

1982年には、下記構造： pGlu−Glu−Asp−Cys−Lys を有する合成血液調節ペンタペプチドが、インビトロお
よびインビボの両方で、骨髄造血細胞に対して選択的抑
制効果を有し、主な効果が骨髄造血幹細胞（CFU−gm）
に対してであると思われると報告された。パウコビッツ
（Paukovits）ら，ツァイトシュリフト・エフ・ナトゥ
ールホルシュング（Z.Naturforsch）37:1297（1982）お
よび米国特許第4,499,081号参照。このペプチドは、骨
髄抽出物において少量が見いだされる自然に生起する顆
粒球形成抑制因子の類似物である。造血、特に顆粒球形
成を抑制することによって、ペプチドは、静態細胞が細
胞分割を始めることを防止しようとし、その結果、細胞
毒性抗癌薬によって攻撃され易くなる。細胞毒性薬を用
いて、治療における保護的機能を提供することに加え
て、ペプチドは、骨髄造血系に関する癌細胞の増殖、す
なわち骨髄球性白血病を抑止するのに使用することもで
きる。

1987年には、レラム（Laerum）らは、このペプチドの
酸化生成物がジスルフィド架橋基によって形成される二
量体（HP−５）であることを報告した。この二量体は、
インビトロでヒトおよびマウスCFU−gmの両方のコロニ
ー形成を強く刺激しかつインビボでマウス骨髄造血細胞
を調節するモノマーとは反対の効果を有する。これは、
欧州特許出願第87309806.5号に開示されている。

該二量体は、組織反応を抑制する免疫抑制治療によっ
て、すなわち骨髄移植手術において、骨髄機能を抑制さ
れた患者を含む、骨髄損傷、顆粒球減少症および再生不
良性貧血を含む低減された骨髄造血活性に冒されている
患者における骨髄造血を刺激するのに有用であると報告
されている。該化合物は、腫瘍性およびウイルス性疾患
に関する細胞増殖抑制性化学的治療および放射線治療の
後、骨髄のより迅速な再生を促進するのに使用すること
もできる。これらは、患者が骨髄欠損の後の免疫応答不
全による重篤な感染症を有する場合に特に有用なもので
ある。

HP−５二量体におけるジスルフィド結合の存在は、モ
ノマーがインビボで可能な代謝産物であることを示唆し
ている。モノマーが造血を抑制するので、骨髄造血を刺
激するためにインビボで使用する場合、HP−５二量体の
安定性は、決定的である。安定な二量体の同定は、この
潜在する問題を除くと思われる。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、血液調節活性を有しており、造血を刺激
し、細菌性、ウイルス性および真菌類性疾患を治療する
のに使用することができる、下記式（Ｉ）として示すペ
プチドを提供するものである。これらのペプチドは、外
科手術的に生じる骨髄抑圧（myelosuppression）、エイ
ズ（AIDS）、先天性脊髄形成異常症、骨髄および器官の
移植のような種々の臨床学的状況によって生じる細胞数
の低下を有する患者における白血球の回復において；感
染症による白血球減少症を有する患者の保護において；
重度のやけどの患者の治療において、そして、いくつか
の細胞周期特異性抗ウイルス薬（cell−cycle specific
antiviral agents）によって見られる骨髄抑圧の改善
において有用である。このペプチドは、免疫抑圧された
患者および“正常な”患者の両方において、ウイルス
性、真菌類性および細菌性の感染症、特に、カンジダお
よびヘルペスの治療においても有用である。

これらの化合物は、米国特許第4,499,081号のモノマ
ーと一緒に使用して、骨髄細胞における高い活性および
低い活性の交互に起こるピークを提供し、従って、造血
の自然の日周期（circadian rhythm）を大きくすること
ができる。この方法では、細胞増殖抑制治療によって、
低い骨髄活性の期間が与えられ、従って、骨髄損傷の危
険性が低減するが、連続する活性のピークによって、再
生が促進されるであろう。本発明は、式（Ｉ）で示され
る化合物および医薬的に許容される担体からなる医薬組
成物を提供するものである。

また、本発明は、必要とする動物に、式（Ｉ）で示さ
れる化合物の有効量を投与することからなるヒトを含む
動物の骨髄造血系を刺激する方法を提供するものであ
る。

本発明は、必要とする動物に、式（Ｉ）で示される化
合物の有効量を投与することからなるヒトを含む免疫抑
圧された動物および正常な動物においてウイルス性、真
菌類性および細菌性感染症を治療する方法を提供するも
のである。

（課題を解決するための手段） 本発明のペプチドは、式： ［式中、 ｍは２、３または４であり； Ａはピログルタミン酸、プロリン、グルタミンまたはグ
ルタミン酸であり； Ｂはグルタミン酸またはアスパラギン酸であり； Ｃはグルタミン酸またはアスパラギン酸であり； Ｄはリシンまたはそのカルボキシアミド誘導体であり； Ｅはグルタミン酸、アスパラギン酸またはペプチド結合
を意味する］ で示される化合物またはその医薬上許容される塩であ
る。

また、本発明は、該化合物の医薬的に許容される塩複
合体をも含む。式（Ｉ）において、Ａは、ピログルタミ
ン酸、プロリン、グルタミンまたはグルタミン酸に対応
するアミノ酸残基の末端アミノ基からなっている。同様
に、Ｄは、リシンまたはそのカルボキシアミド誘導体に
対応するアミノ酸残基の末端カルボキシル基からなって
いる。

本明細書では、ペプチドを記載するために、当技術分
野において一般に用いられる略語および記号を使用す
る。

pGlu＝ピログルタミン酸、 Pro＝プロリン、 Cln＝グルタミン、 Glu＝グルタミン酸、 Asp＝アスパラギン酸、 Lys＝リシン、 Arg＝アルギニン、 Cys＝システイン、 Tyr＝チロシン、 Sub＝ジアミノスベリン酸、 Hna＝ジアミノヘキシン酸、 Pim＝ジアミノピメリン酸、 Adp＝ジアミノアジピン酸。

慣用の表示に従って、アミノ末端は左側であり、カル
ボキシ末端は右側である。全てのキラルアミノ酸は、Ｄ
またはＬ絶対配置であってよい。

アミノ末端は、アシル化によって保護されてもよい。
このような保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル
（ｔ−Boc）、CH₃COおよびAr−CO（Ar＝ベンジル）が挙
げられる。

Ｃ−末端は、天然アミノ酸の場合のようなカルボキシ
またはカルボキシアミド もしくはヒドロキシメチル（−CH₂−OH）であってよ
い。

好ましい化合物は、ＡがpGluであり、ＢがGluであ
り、ＣがAspであり、ＤがLysであり、Ｅがペプチド結合
であり、キラルアミノ酸がＬ絶対配値である化合物であ
る。

特に好ましい化合物は、 および である。

本発明の化合物、二量体がジスルフィド架橋基ではな
く炭素−炭素結合を含んでいる架橋基によって結合して
いる点で従来技術の化合物とは異なる。炭素−炭素結合
は、インビボで容易に開裂せず、従って、欧州特許出願
第87309806.5号の化合物よりもインビボでより安定であ
る。

本発明のペプチドは、メリフィールド（Merrifiel
d），ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエティ（J.Am.Chem.Soc.）,85,2149（1964）の固相技
術によって製造されるか、または当技術分野で公知の溶
液法を成功裏に用いることができる。ジェイ・エム・ス
チュワート（J.M.Stewart）およびジェイ・ディー・ヤ
ング（J.D.Young），“ソリッド・フェース・ペプチド
・シンセシス（Solid Phase Peptide Synthesis）",ピ
ース・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Compan
y），ロックフォード，イリノイ（1984）またはエム・
ボダンスキー（M.Bodansky），ワイ・エイ・クラウサー
（Y.A.Klauser）およびエム・エイ・オンデッティ（M.
A.Ondetti），“ペプチド・シンセシス（Peptide Synth
esis）",ジョーン・ウイリー・アンド・サンズ・インコ
ーポレイテッド（John Wiley ＆ Sons Inc.），ニュー
ヨーク，ニューヨーク（1976）に一般的に記載されてい
るペプチド合成方法は、本発明のペプチドを製造するの
に使用することができ、本明細書に引用して記載する。

各アミノ酸またはペプチドは、ペプチドの技術分野に
おいて公知であるように、適当の保護されている。例え
ば、アミノ基の、特にα−位での保護のためには、フル
オレニルメトキシカルボニル基（Fmoc）またはｔ−ブト
キシカルボニル（ｔ−Boc）基が好ましい。適当に置換
されたカルボニルベンジルオキシ基は、リシンのε−ア
ミノ基およびAspおよびCluの、各々βおよびγカルボキ
シ基に関するベンジル基に関して使用することができ
る。カルボベンジルオキシ保護基の適切な置換は、クロ
ロ、ブロモ、ニトロまたはメチルによるオルトおよび／
またはパラ置換であり、保護基の反応性を変えるために
用いられる。ｔ−Boc基以外の保護基は、穏やかな酸処
理によって除去されないものが最も好都合である。これ
らの保護基は、接触水素添加のような方法、当技術分野
において公知であるアンモニアまたはHF水溶液中のナト
リウム処理法によって除去される。

固相法を用いる場合、ペプチドは、逐次、カルボキシ
末端から出発し、ペプチドのアミノ末端に向かって作用
されながら構築される。固相合成は、米国特許第4,244,
946号に一般的に開示されている如きベンズヒドリルア
ミン樹脂（BHA）、メチルベンズヒドリルアミン樹脂（M
BHA）もしくはクロロメチル樹脂（CMR）、またはフェニ
ルアセトアミドメチル樹脂（PAM）のような適当な樹脂
に保護されたアミノ酸のＣ末端を共有的に結合すること
によって開始される。生成ペプチドのカルボキシ末端が
カルボキシアミドである場合は、BHAまたはMBHA支持樹
脂を使用する。生成ペプチドのカルボキシ末端がカルボ
キシ基である場合は、一般的にCMRまたはPam樹脂を用い
るが、これは、カルボキシアミドまたはエステルを生成
するためにも使用することができる。

α−アミノ基における保護基は、穏やかな酸処理（す
なわち、トリフルオロ酢酸）によって除去される。ジ−
Boc（ジアミノジカルボン酸）は、適切なカップリング
剤を使用して樹脂上の２つのアミノ酸とカップリングさ
れる。如何なる遊離カルボキシル基もＤの適切な保護誘
導体によってアミド化される。当技術分野において公知
の適切な脱保護、中和およびカップリングサイクルを用
いて、所望のペプチドが形成されるまで、中間体を単離
せずに、逐次、アミノ酸を添加する。次いで、完全なペ
プチドは、如何なる状態においても、担持樹脂から脱保
護されるか、および／またはスプリットする。

HFまたはHBr/酢酸によるペプチド支持樹脂の処理によ
って、樹脂からペプチドがスプリットされ、カルボン酸
のようなカルボキシ端末アミノ酸を生成する。

エステルが望まれる場合は、トリエチルアミンの存在
下、CMRまたはPam樹脂を、メチル、エチル、プロピル、
ブチルまたはベンジルアルコールのような適切なアルコ
ールで処理して、樹脂からペプチドを開裂し、直接、エ
ステルを生成する。

本発明のペプチドのエステルは、カルボン酸前駆体か
ら慣用的な方法によって製造することもできる。代表的
には、カルボン酸は、酸触媒の存在下、アルコールで処
理される。他方、カルボン酸を、酸ハロゲン化物のよう
な活性化されたアシル中間体に転換し、好ましくは塩基
の存在下、アルコールで処理することができる。

支持樹脂からペプチドを開裂する好ましい方法は、ア
ニソールまたはジメトキシベンゼンのような適当な陽イ
オン捕捉剤の存在下、無水HFによってペプチド支持樹脂
を処理することである。この方法は、同時に、硫黄原子
を保護するチオアルキル基以外の全ての保護基を除去
し、樹脂からペプチドをスプリットする。この方法でCM
RおよびPam樹脂から加水分解されたペプチドは、カルボ
ン酸であり、BHA樹脂からスプリットしたものは、カル
ボキシアミドとして得られる。

ペプチドの末端アミノ基の変形は、当技術分野におい
て一般的に公知であるようなアルキル化またはアシル化
によって行われる。これらの変形は、ペプチドに結合さ
れる前にアミノ酸によって、または合成され、末端アミ
ノ基が遊離された後であり、保護基が除去される前にペ
プチドによって、行うことができる。

代表的には、４級アミンの存在下、アシルのハロゲン
化物、無水物または対応するアルキルもしくはアリル酸
の活性化エステルを用いて遊離アミノ基によってアシル
化を行う。モノアルキル化は、リチウムまたはシアノホ
ウ水素化ナトリウムのような穏やかな還元剤の存在下、
適当な脂肪族アルデヒドまたはケトンによるアミノ基の
還元的アルキル化によって、最も都合よく行われる。ジ
アルキル化は、塩基の存在下、過剰量のハロゲン化アル
キルによってアミノ基を処理することによって行うこと
ができる。

ペプチドの溶液合成は、アミド結合を形成するために
使用される慣用の方法を用いて行われる。代表的には、
遊離カルボキシル基を有する保護ｔ−Bocアミノ酸は、
所望によって１−ヒドロキシベンゾチアゾール（HOBT）
またはジメチルアミノピリジン（DMAP）のような触媒の
存在下、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DC
C）のような適切なカップリング剤を使用して遊離アミ
ノ基を有する保護アミノ酸とカップリングされる。保護
ｔ−Boc−アミノ酸の遊離カルボキシルの活性化エステ
ル、無水物または酸ハロゲン化物の形成のような他の方
法、およびその後の、所望によって塩基の存在下におけ
る保護アミノ酸の遊離アミンとの反応も適切である。例
えば、保護Boc−アミノ酸またはペプチドを、Ｎ−メチ
ルモルホリン、DMAP（ジメチルアミノピリジン）または
トリアルキルアミンのような塩基の存在下、塩化メチレ
ンまたはテトラヒドロフラン（THF）のような無水溶媒
中、クロロギ酸イソブチルで処理して、“活性化無水
物”を形成し、その後、これを他の保護アミノ酸または
ペプチドの遊離アミンと反応させる。これらの方法によ
って形成されたペプチドをアミノまたはカルボキシ末端
で慣用的な方法を使用して選択的に脱保護し、同様の方
法を使用して他のペプチドまたはアミノ酸とカップリン
グする。ペプチドが完全である場合、パラジウムまたは
プラチナ触媒の存在下での水素添加、アンモニア水溶
液、フッ化水素酸水溶液またはアルカリ水溶液中でのナ
トリウムによる処理によるのような、前記のように保護
基を除去することができる。

脱保護の後、最終ペプチドが塩基性基を含む場合、酸
付加塩を製造することができる。ペプチドの酸付加塩
は、適当な溶媒中、標準的な方法で、親の化合物および
塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、
コハク酸またはメタンスルホン酸のような過剰量の酸か
ら製造することができる。酢酸塩形は、特に有用であ
る。最終ペプチドが酸性基を含む場合、陽イオン塩を製
造することができる。代表的には、親の化合物を、適当
な陽イオンを含んでいるヒドロキシド、カルボネートま
たはアルコキシドのような過剰量のアルカリ試薬で処理
する。医薬的に許容される塩の中に存在する陽イオンと
しては、Na⁺、K⁺、Ca⁺⁺およびNH₄ ⁺のような陽イオンが
挙げられる。Na⁺およびNH₄ ⁺が特に好ましい。

一般的に、刺激効果を及ぼすために、0.1〜10mgの投
薬範囲内、例えば、１日につき体重70kg当たり１〜5mg
の範囲で注射によってまたは経口的にヒト患者に本発明
のペプチドを投与することができ、注入または同様の技
術による投与の場合、投与量は、体重70kg当たり30〜30
0mgの範囲内であり、例えば、６日間にわたって約100mg
であってよい。原則的には、患者の細胞外液中、約10
^-13M〜10^-5Mのペプチドの濃度を得るのが望ましい。

また、本発明は、活性成分として、１またはそれ以上
の前記定義の式（Ｉ）で示される化合物を含有し、かつ
医薬的に許容される担体または賦形剤を含有する医薬組
成物を提供するものである。本発明の組成物は、例え
ば、経口、鼻腔内、非経口または直腸内投与用に適した
形態である。

本明細書において使用する場合、“医薬的に”という
用語は、本発明の獣医学的適用を含む。

これらのペプチドは、被包されるか、錠剤に打錠され
るか、または経口投与用エマルジョンもしくはシロップ
の形態に調製される。医薬液に許容される固体または液
体担体を添加して、該組成物を増強または安定化する
か、または該組成物を容易に調製することができる。液
体担体としては、シロップ、落花生油、オリーブ油、グ
リセリン、食塩水および水が挙げられる。固体担体とし
ては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和
物、白土（terra alba）、ステアリン酸マグネシウム、
もしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アラビアゴ
ム、寒天またはゼラチンが挙げられる。該担体として
は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸
グリセリルのような持続放出性物質のみ、またはワック
スと一緒のものが挙げられる。固体担体の量は変化する
が、好ましくは、投薬ユニットにつき約20mg〜約1gの間
が好ましい。医薬液な調製物は、錠剤形態に関しては、
必要な場合には、ミル、混合、顆粒化、および圧縮を、
ゼラチン硬カプセル形態に関しては、ミル、混合および
充填を含む慣用の製薬学的方法に従って製造される。液
体担体を使用する場合、調製剤は、シロップ、エリキシ
ル、エマルジョンまたは水性もしくは非水性懸濁液の形
態である。このような液体製剤は、直接経口投与する
か、ゼラチン軟カプセルに充填することができる。器官
特異性担体系を使用することもできる。

本発明のペプチドまたはその誘導体を含む別の医薬組
成物は、非経口投与用の溶液または凍結乾燥粉末として
製剤化することができる。粉末は、使用前に、適当な希
釈剤または他の医薬的に許容される担体の添加によって
再調製することができる。液体製剤は、一般に、緩衝化
溶液、等張溶液、水溶液である。好適な希釈剤として
は、通常の等長食塩水、水または緩衝化した酢酸ナトリ
ウムもしくは酢酸アンモニウム水溶液中の標準５％デキ
ストロースである。このような製剤は、特に、非経口投
与に特に適しているが、経口投与用に使用するか、また
は計量された投与量の吸入用吸入器または噴霧器中に入
れることができる。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、
ヒドロキシセルロース、アラビアゴム、ポリエチレング
リコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン
酸ナトリウムのような賦形剤を添加するのが望ましい。

直腸内投与に関して、本発明のペプチドの粉砕粉末
と、ココアバター、グリセリン、ゼラチンまたはポリエ
チレングリコールのような賦形剤と混合して、坐剤に成
形する。粉砕粉末は、油状調製物、ゲル、クリームまた
はエマルジョンと混合し、緩衝化または非緩衝化され、
経皮パッチ（transdermal patch）を介して投与され
る。

同様に、鼻腔内スプレイは、水溶液中で製剤化し、エ
アロゾルペロペラントを有するスプレイ容器中に入れる
か、または手動圧縮によって得られる。１またはいくつ
かの活性成分を含有するカプセルは、例えば、ラクトー
スまたはソルビトールのような不活性担体と活性成分と
を混合し、該混合物をゼラチンカプセルに充填すること
によって調製される。

本発明の化合物を含有する投薬ユニットは、式（Ｉ）
で示されるペプチドまたはその塩の0.1〜10mg、例えば
１〜5mgを含有するのが好ましい。

また、本発明は、対象（患者）に前記医薬組成物の有
効量を投与することからなる骨髄造血の刺激方法を提供
するものである。

さらに、本発明は、必要とする動物に前記医薬組成物
の有効量を投与することからなる免疫抑制された動物ま
たは正常な動物においてウイルス性、真菌類性および細
菌性感染症を治療する方法を提供するものである。

以下の試験によって、式（Ｉ）で示される化合物の生
物学的活性を示す。

基質細胞（stromal cells）によるコロニー形成促進活
性の誘発 ヒト骨髄基質細胞菌株、C6を、RPMI−1640培地および
５％FBS中、プラスチック製組成培養皿中で、増殖して
群を形成する。実験の前日に、この培地を、血清を添加
していないDMEMに変える。これらの培養物に、化合物を
１時間添加し、次いで該培養物を洗浄する。培地を新し
いDMEMと代え、細胞を37℃、５％CO₂で24時間インキュ
ベートする。24時間後、C6細胞培養上清を回収し、無菌
濾過し、下記造血コロニー形成促進活性（CSA）の存在
について検査できるまで、凍結させる。

軟寒天検査 ルイス（Lewis）ラットから骨髄細胞を得る。これ
を、血清を含有しないDMEM中10⁶細胞/mlに調節する。以
下のものを使用する単一層寒天系を使用する：栄養に富
んだDMEM（NaHCO₃、ピルベート、アミノ酸、ビタミン、
およびHEPES緩衝液）;0.3％バクト（Bacto）寒天、およ
び20％ルイスラット血清。これに、ラット骨髄細胞（最
終濃度＝10⁵細胞/ml）と一緒に上記によって得られたC6
細胞菌株上清の希釈液（10〜2.5％）を添加する。寒天
プレートを37℃、５％CO₂で７〜８日間インキュベート
する。増殖する骨髄細胞のコロニー（CFU−Ｃ）を顕微
鏡を用いて計数する。数えた寒天コロニーの数はC6骨髄
基質細胞菌株上清内に存在するCSAの量に比例する。

単純疱疹マウスモデル 感染の前７日間、Balb/cマウスに、化合物10および1n
g/kgの投与量で0.2mlを、１日１度、腹腔内注射する。
対照マウスには、希釈緩衝液、DPBSおよび熱不活性化し
た0.5％正常マウス血清の混合液0.2mlを注射する。

各後足肉趾（pad）に、PBS 0.05mlに懸濁した5.0×1
0⁵/pfuを注射することによって、マウスを単純疱疹包ウ
イルス（菌株MS）に感染させる。該マウスに、瀕死（食
物または水を得ることができない）になるまで化合物ま
たは対照注射液を与え続ける。一般的に、感染の後、約
８日で、後足の麻痺が生じる。脳炎が生じるまで、麻痺
が進行する。

他方、膣経路によってウイルスを摂取する。MS−NAP
菌株の5.0×10⁵/pfuを含有する綿栓をマウスの膣に挿入
する。

ウィルコキシン（Wilcoxin）試験を用いて、対照グル
ープと対比して処置したグループにおいて、生存数の有
意な増加が見られるか否かを測定する。

カンジダ攻撃 カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）菌株B3
11aを使用する。この菌株は、通過させ、次いで、−70
℃で凍結されたマウスであった。B311aは、5.0〜8.0×1
0⁴cfu/マウスの範囲内の免疫抑制されたマウスに対し
て、および1.0〜2.0×10⁵cfu/マウスの範囲の正常マウ
スに関して毒性である。カンジダの凍結貯蔵による試料
を、サブローデキストロース傾斜培地上で増殖させ、次
いで、18時間、50mlのサブローブロスの振盪培地に移し
た。細胞を３回洗浄し、次いで、血球計数板によって計
数し、メチレン染料排除によって生存数を確認した。生
存数の計数を、接種物上で行い、数を確認した。

カンジダに感染した全てのマウス（Balb/c）を、食塩
水0.2mlに懸濁した細胞によって静脈内感染させた。い
くつかのマウスを、300ラッドの放射線によって致死以
下に脊髄抑圧する。毎日、放射の後の最初の２時間、陽
性対照として、動物に化合物CSFまたは賦形剤を注射す
る。放射および治療開始後７日目に、静脈内投与によっ
てカンジダ・アルビカンスによって、該マウスを攻撃す
る。これは、ほぼ、正常マウスに対するLD₇₅を表すこと
に注意する。他の研究では、マウスを免疫抑制しない。
これらの研究において、マウスは、放射されたマウスと
同一の方法で感染の後７日目に治療を開始する。両モデ
ルにおいて、マウスを瀕死になるまで従わせ、変化は、
ウィルコキシン試験を使用して比較された生存数であ
る。

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明す
る。該実施例は、本発明の範囲を限定するものではな
く、本発明の化合物の製造方法および使用方法を示すも
のである。

該実施例において、全ての温度は摂氏である。アミノ
酸分析は、ジオネックス・オートイオン（Dionex Autoi
on）100によって行われた。ペプチド含有量分析は、ア
ミノ酸分析に基づいた。FAB質量分析は、高速原子衝撃
を使用するVG ZAB質量分析によって行った。使用する略
語は、以下の通りである： Arg＝アルギニン、 Asp＝アスパラギン酸、 Ｔ−Boc＝tert−ブチルオキシカルボニル、 Bz＝ベンジル、 Cl−Ｚ＝ｐ−クロロカルボベンジルオキシカルボニ
ル、（Ｚ＝カルボベンジルオキシカルボニル） DCC＝ジシクロヘキシルカルボジイミド、 DIEA＝ジイソプロピルエチルアミン、 EDC＝（Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド、 Glu＝グルタミン酸、 ｐ−Glu＝ピログルタミン酸、 Tyr＝チロシン、 Hna＝ジアミノヘキシン酸、 HOBT＝ヒドロキシベンゾトリアゾール、 Lys＝リシン、 NMP＝Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、 Pro＝プロリン、 Gln＝グルタミン、 Cys＝システイン、 Ｎ−MeArg＝Ｎ−メチルアルギニン、 Prc＝ビスBOC−S,S′−1,3−プロパンジイルシステイ
ン、 Etc＝ビスBOC−S,S′−1,2−エタンジイルシステイ
ン、 Buc＝ビスBOC−S,S′−1,4−ブタンジイルシステイ
ン。

（実施例） 実施例１ （ｐ−Glu−Glu−Asp）_２−Pim−（Lys）_２の製造 ｔ−BOC−Lys（Cl−Ｚ）−O CH₂−Pamレジン（0.63ミ
リモル/g）をベックマン（Beckman）900B合成器にかけ
た。脱保護工程において、塩化メチレン（CH₂Cl₂）中で
40％トリフルオロ酢酸（TFA）を用いてｔ−Boc基を除去
した。トリフルオロ酢酸塩を10％DIEA/CH₂Cl₂によって
中和した。2mM DCCおよびHOBTを使用して2mMジ−BOC−
2,6−ジアミノピメリン酸（780mg）をカップリングし
た。室温で２時間、CH₂Cl₂ 15mlおよびDMF10mlの混合液
中でカップリングを行った。カイザー（Kaiser）試験を
使用して、カップリングをモニターした。如何なる残存
遊離カルボキシル基をも、CH₂Cl₂/DMF（15/10）25ml中
で3mM H−Lys（Ｚ）−OBz・HCl（1.65g）および3mM DCC
および3mM HOBTを使用することによって２回アミド化し
た。

カップリングの２時間後、該樹脂をCH₂Cl₂ 15mlで２
回、DMF 15mlで２回、MeOH/CH₂Cl₂（1:1）15mlで２回、
最後にCH₂Cl₂ 15mlで２回洗浄した。40％TFA/CH₂Cl₂を
使用するｔ−Bocの脱保護および10％DIEA/CH₂Cl₂を使用
する中和の後、2mM Boc−Asp（Bzl）（0.646g）および2
mM DOCおよび2mM HOBTを添加し、CH₂Cl₂/DMF（15/10）2
5ml中で２時間カップリングした。次いで、該樹脂を前
記洗浄工程にかけた。CH₂Cl₂/DMF（15/10）25ml中で2mM
Boc−Glu（Bzl）（0.674g）、2mM DCCおよび2mM HOBT
をカップリングする前に、脱保護工程および中和工程を
繰り返した。洗浄、脱保護および中和工程の後、樹脂を
洗浄工程にかける前に２時間、CH₂Cl₂/DMF（15/10）25m
l中で2mM pGlu（0.258g）、2mM DCCおよび2mM HOBTをカ
ップリングした。カップリングの完了をカイザー試験に
よってモニターし、各工程で唯一のカップリングが必要
とされた。合成が完了した後、樹脂を乾燥し、計量し
た。終了:1.2g。

ペプチド樹脂（1.2g）を開裂装置に充填し、−15℃で
２時間、フッ化水素酸（HF）10mlおよびアニソール1ml
を使用して開裂した。減圧下でHFの除去後、樹脂とペプ
チドの混合物をエーテルで広範囲に洗浄し、氷酢酸（30
ml）中でペプチドを抽出した。ロータベープ（rotava
p）によって、該抽出物からほとんどの酸を除去し、残
留物を水で希釈し、凍結乾燥した。酢酸抽出物は粗ペプ
チド810mgを有していた。

酢酸抽出物から得た粗ペプチド（80mg）を、調製用Ｃ
−18カラムを用いてさらに精製した。予め平衡化した
（0.1％TFA/H₂O中で）カラムに通した。80％アセトニト
リル、20％H₂Oおよび0.1％TFAの線形勾配液を使用し
て、該ペプチドを溶離した。

３つの異性体を一緒に溶出した（8.52分）。これら
を、30％（CH₃CN中0.1％TFA）、70％（H₂O中0.1％TFA）
〜80％（CH₃CN中0.1％TFA）、20％（H₂O中0.1％TFA）の
勾配液を使用し、流速1.5ml/分間で35分かけて、Ｃ−18
カラムによって分離した。以下の画分が流出した： 画分1:18.69分、 画分2:19.68分、 画分3:22.95分。

アミノ酸分析の結果は、以下の通りであった：アミノ酸分析 観察 Glu 1.99 Asp 1.0 Lys 1.05 ビスアミノピメリン酸 N.D.。

質量分析＝1157.5（Ｍ＋Ｈ）^＋。

実施例２ （pGlu−Glu−Asp）_２−Sub−（Lys）_２の製造 A.BOC−SUB−Lys−（ε−Ｚ）COOBz.の合成： アール・ナット（R.Nutt）の方法［ジャーナル・オブ
・オーガニック・ケミストリー（J.Org、Chem.）45,307
8,1980）を使用して、ビス−BOC（1,1）ジアミノスベリ
ン酸（Sub）を合成した。

塩化メチレン（CH₂Cl₂）10mlに2mM Boc−Sub（808m
g）、4mM Lys−（ε−Ｚ）−COOBz・HCl（1.56g）およ
び4mM HOBT（0.613g）を溶解し、該溶液を、氷／アセト
ン浴を用いて−15℃に冷却した。4mMジイソプロピルエ
チルアミン（DIEA）（0.692ml）を添加し、次いで、水
可溶性カルボジイミド（EDF）0.772g（4mM）を添加し
た。１時間の攪拌の後、混合物を室温に温めた。３時間
後、塩化メチレンを蒸発させ、残留物を酢酸エチル200m
lに溶解した。該溶液を、まず1N HClで、次いで、1N Na
OH、NaCl飽和溶液および水で洗浄した。該洗浄を３回繰
り返した。各洗浄液は約100mlであった。有機層をMgSO₄
で乾燥し、蒸発させた。BOC−Sub−（ε−Ｚ）Lys−COO
Bz（収率79％）1.86gを得、如何なる精製も行わなない
でさらに使用した。

B.BOC Asp−（β−OBz）Sub Lys−（ε−Ｚ）−COOBz.
の合成： 4N HCl−ジオキサンにBOC−Sub−Lys（ε−Ｚ）−COO
Bz（1.8g）を30分間溶解し、次いで、蒸発乾固した。残
留物をエーテルで洗浄し、一晩乾燥した。塩酸塩をCH₂C
l₂ 30mlに溶解し、BOCAsp−（β−OBz）（1.292g）を添
加した。該溶液を−15℃に冷却し、HOBT 0.613g、DIEA
0.554mlおよびEDC 0.772gを添加した。２時間攪拌した
後、混合物を室温に温めた。18時間（一晩）の後、反応
混合物を処理した。CH₂Cl₂を蒸発させ、残留物を酢酸エ
チル200mlに溶解した。該溶液を1N HCl、1N NaOH、NaC
l飽和溶液、および水で洗浄した（該洗浄を３回繰り返
した。各洗浄液は約100mlであった）。MgSO₄で有機層を
乾燥し、蒸発させた。BOC−Asp−（β−OBz）−Sub−Ly
s−（ε−Ｚ）COOBz1.9g（収率73％）。このペプチド
は、如何なる精製をも行わないでさらに使用した。

C.BOC−Glu−（γ−OBz）Asp−（β−OBz）Sub−Lys−
（ε−Ｚ）COOBzの合成： 4N HClジオキサン15mlにBOC−（β−OBz）Asp−Sub−
（ε−Ｚ）Lys−COOBz.1.8gを溶解した。15分後、溶媒
を除去し、残留物をエーテルで洗浄し、乾燥した。塩酸
塩をＮ−メチルピロリドン（NMP）15mlに溶解した。該
溶液を−15℃に冷却し、4mM BOC−Glu（γ−OBz）（1.
338）、DIEA0.204ml、EDC0.772gおよびHOBT0.612gを添
加した。該混合物を室温に徐々に温めながら一晩攪拌し
た。冷却したNaCl飽和溶液中10％Na₂CO₃1を含有する
フラスコに、該反応混合物を加えた。沈殿物を濾過し、
水で洗浄し、減圧乾燥した。BOC−（γ−OBz）Glu−
（β−OBz）Asp−Sub−（ε−Ｚ）Lys−COOBz（1.3g）
を得、如何なる精製をも行わないでさらに使用した。収
率:68％。

D.pGlu−（γ−OBz）Glu−（β−OBz）Asp−Sub−（ε
−Ｚ）Lys−COOBz.の合成： 4N HClジオキサン15mlにBOC−（γ−OBz）Glu−（β
−OBz）Asp−Sub−（ε−Ｚ）Lys−COOBz1.2gを溶解し
た。15分後、溶媒を除去し、残留物をエーテルで洗浄
し、乾燥した。塩酸塩をNMP15mlに溶解した。該溶液を
−15℃に冷却し、4mM pyro−Glu（ｐ−Glu）（.516
g）、DIEA0.106ml、EDC0.772gおよびHOBT 0.612gを添加
した。該混合物を室温に徐々に温めながら一晩攪拌し
た。冷却したNaCl飽和溶液中10％Na₂CO₃1を含有する
フラスコに、該反応混合物を加えた。沈殿物を濾過し、
水で洗浄し、減圧乾燥した。pGlu−（γ−OBz）Glu−
（β−OBz）Asp−Sub−（ε−Ｚ）Lys−COOBz（0.830
g）を得、如何なる精製も行わないでさらに使用した。
収率:69％。

E.pGlu−Glu−Asp−Sub−Lys−COOHの合成： ０℃で、HF 5ml/アニソール1.5mlを用いてpGlu−
（γ−OBz）Glu−（β−OBz）Asp−Sub−（ε−Ｚ）Lys
−COOBz（0.200g）を脱保護した。Hfを除去し、ペプチ
ドをエーテルと0.1N酢酸の間で分配した。水性層を洗浄
し、凍結乾燥した。pGlu−Glu−Asp−Sub−Lys−COOH0.
089gを得た。このペプチド20mgを、アイソクラチッチ条
件（10％アセトニトリル、90％水および0.1％トリフル
オロ酢酸、流速5.6ml/分）を用いて、C18プレプ・ビア
デク（prep Vyadec）カラムによって精製した。FAB質量
分析:M＋Ｈ＝1171.4。アミノ酸分析:Asp（1.0）、Glu
（2.19）、Lys（1.01）、Sub N.D.。HPLC:C18ビアデク
0.23×25mm分析カラムによる保持時間＝7.01分［流速Ａ
＝水中0.1％TFAおよびＢ＝アセトニトリル中0.1％TFAの
０％〜80％Ｂ勾配液1.5ml］。

実施例３ （pGlu−Glu−Asp）_２−Lan−（Lys）_２の製造 ［Lan＝ランチオニン（SCH₂CH（NH₂）COOH］ ベックマン990合成装置の反応容器にｔ−BOC−Lys（C
l−Ｚ）−CH₂PAM（0.63mM/g）0.5gを入れた。塩化メチ
レン中40％TFAを用いて、ｔ−BOC基を除去した。トリフ
ルオロ酢酸塩を10％DIEA/CH₂Cl₂によって中和した。室
温で、CH₂Cl₂15mlおよびDMF10ml中4mM DCCおよびHOBTを
用いて、2mMビスBOCランチオニンをカップリングした。
カイザー試験を用いて、カップリングをモニターした。
CH₂Cl₂/DMF（15/10）25ml中で3mM H−Lys−Ｏ−Bz・HCl
および3mM DCCおよびHOBTを用いて、如何なる遊離残存
カルボキシル基をもアミド化した。カップリング樹脂を
CH₂Cl₂、30％MeOH−CH₂Cl₂およびCH₂Cl₂（25ml×３）で
広範囲に洗浄した後、標的ペプチドにおいて残存するア
ミノ酸（Asp、Glu、pGlu）と一緒に脱保護、中和および
カップリングのサイクルを繰り返した。各カップリング
に関して、4mMの各アミノ酸、DCCおよびHOBTを用いた。
カイザー試験を用いて各カップリングをモニターした。
合成の完了の後、樹脂を乾燥し、計量した。

ペプチド樹脂を開裂装置に充填し、−15℃で２時間、
フッ化水素酸（HF）10mlおよびアニソール1mlを用いて
開裂した。HFの除去後、樹脂をエーテルで広範囲に洗浄
し、ペプチドを氷酢酸（30ml）で抽出した。ロータベー
プでほとんどの酢酸を除去し、残留物を水で希釈し、凍
結乾燥した。HPLCによって精製した後、ペプチドを得
た。

実施例４ （Pro−Asp−Asp）_２−Sub−（Lys）_２の調製 ｔ−BOC−Lys（Cl−Ｚ）−CH₂ Pam（0.63mM/g）0.5g
をベックマン990合成装置の反応容器に充填した。塩化
メチレン中40％TFAを用いて、ｔ−BOC基を除去した。10
％DIEA/CH₂Cl₂によってトリフルオロ酢酸塩を中和し
た。室温で、CH₂Cl₂15mlおよびDMF10ml中、4mM DCCおよ
びHOBTを用いて、2mMビスBOCジアミノスベリン酸をカッ
プリングした。カイザー試験を用いて、カップリングモ
ニターした。CH₂Cl₂/DMF（15/10）25ml中、3mM H−Lys
−Ｏ−Bz・HClおよび3mM DCCおよびHOBTを用いて、如何
なる遊離残存カルボキシル基をもアミド化した。カップ
リングの後、CH₂Cl₂、30％MeOH−CH₂Cl₂およびCH₂Cl₂お
よびCH₂Cl₂（25ml×３）で、該樹脂を広範囲に洗浄し
た。標的ペプチド中の残存するアミノ酸（Asp、Aspおよ
びPro）と一緒に脱保護、中和およびカップリングのサ
イクルを繰り返した。各カップリングのために、4mMア
ミノ酸、DCCおよびHOBTを用いた。カイザー試験を用い
て各カップリングをモニターした。合成の完了の後、樹
脂を乾燥し、計量した。

ペプチド樹脂を開裂装置に充填し、−15℃で２時間、
フッ化水素酸（HF）10mlおよびアニソール1mlを用いて
開裂した。HFの除去後、該樹脂をエーテルで広範囲に洗
浄し、ペプチドを氷酢酸（30ml）で抽出した。ロータベ
ープによってほとんどの酢酸を除去し、残留物を水で希
釈し、凍結乾燥した。HPLCによって精製した後、ペプチ
ドを得た。

実施例５ （pGlu−Asp−Asp）_２−Pim−（Lys）_２の調製 ベックマン990合成装置の反応容器にBOC−Lys（Cl−
Ｚ）−CH₂ PAM（0.63mM/g）0.5gを充填した。塩化メチ
レン中40％TFAを用いてｔ−BOC基を除去した。10％DIEA
/CH₂Cl₂によってトリフルオロ酢酸塩を中和した。室温
で、CH₂Cl₂15mlおよびDMF10ml中、4mM DCCおよびHOBTを
用いて、2mMビスBOCピリメン酸をカップリングした。カ
イザー試験を用いてカップリングをモニターした。CH₂C
l₂/DMF（15/10）25ml中、3mM H−Lys−Ｏ−Bz・HCl、お
よび3mM DCCおよびHOBTを用いて、如何なる遊離残存カ
ルボキシル基をもアミド化した。カップリングの後、該
樹脂を、CH₂Cl₂、30％MeOH−CH₂Cl₂およびCH₂Cl₂（25ml
×３）で広範囲に洗浄した。標的ペプチド中の残存する
アミノ酸（Asp、Aspおよびｐ−Glu）と一緒に、脱保
護、中和およびカップリングのサイクルを繰り返した。
各カップリングのために4mMアミノ酸、DCCおよびHOBTを
用いた。カイザー試験を用いて、各カップリングをモニ
ターした。合成が完了した後、該樹脂を乾燥し、計量し
た。開裂装置にペプチド樹脂を充填し、−15℃で２時
間、フッ化水素酸（HF）10mlおよびアニソール1mlを用
いて開裂した。HFの除去の後、該樹脂をエーテルで広範
囲に洗浄し、ペプチドを氷酢酸（30ml）で抽出した。ロ
ータベープでほとんどの酢酸を除去し、残留物を水で希
釈し、凍結乾燥した。HPLCによって精製した後、ペプチ
ドを得た。

実施例６ （pGlu−Glu−Asp）_２−Pim−（Arg−CONH₂）_２の調製 ベックマン990合成装置の反応容器にBOC−Tos Arg−B
HA（0.5mM/g）0.5gを充填した。塩化メチレン中40％TFA
を用いてBOC基を除去した。10％DIEA/CH₂Cl₂によってト
リフルオロ酢酸塩を中和した。室温で、CH₂Cl₂15mlおよ
びDMF10ml中、2mM DCCおよびHOBTを用いて1mMビスBOCピ
メリン酸をカップリングした。カイザー試験を用いてカ
ップリングをモニターした。CH₂Cl₂/DMF（15/10）25ml
中、3mM H−Lys−BOz・HCl、および3mM DCCおよびHOBT
を用いて、如何なる遊離残存カルボキシル基をもアミド
化した。カップリングの後、該樹脂を、CH₂Cl₂、30％Me
OH−CH₂Cl₂およびCH₂Cl₂（25ml×３）で広範囲に洗浄し
た。標的ペプチド中の残存するアミノ酸（Asp、Gluおよ
びｐ−Glu）と一緒に脱保護、中和およびカップリング
のサイクルを繰り返した。各カップリングのために3mM
アミノ酸、DCCおよびHOBTを用いた。カイザー試験を用
いて各カイザーをモニターした。合成が完了した後、該
樹脂を乾燥し、計量した。

開裂装置にペプチド樹脂を充填し、−15℃で２時間、
フッ化水素酸（HF）10mlおよびアニソール1mlを用いて
開裂した。HFの除去の後、該樹脂をエーテルで広範囲に
洗浄し、ペプチドを氷酢酸（30ml）で抽出した。ロータ
ベープでほとんどの酢酸を除去し、残留物を水で希釈
し、凍結乾燥した。HPLCによって精製した後、ペプチド
を得た。

実施例７ 類似物： （Try−Glu−Asp）_２−Sub−（Lys）₂; （pGlu−Tyr−Glu−Asp）_２−Sub−（Lys）₂; （pGlu−Glu−Tyr−Asp）_２−Sub−（Lys）₂; （pGlu−Glu−Asp−Tyr）_２−Sub−（Lys）_２ を含有するチロシンの合成 手動式振盪容器にBOC−Lys（Cl−Ｚ）−Ｏ−レジン
［ペニンスラ・ラブズ（Peninsula Labs^R）、置換0.49m
M/g］2gを充填した。脱保護および中和の後、50％Ｎ−
メチル−２−ピロリジノン（NMP）およびジクロロメタ
ン（DCM）25ml中、4mMジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）（824mg）および4mM1−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール・水和物（HOBT）（612mg）を用いて2mM ジ−BO
Cジアミノスベリン酸（808mg）を樹脂にカップリングし
た。反応を一晩進行させ、次いで、10mM H−Lys（Ｚ）
−OBz・HCl（4.06g）、10mMジイソプロピルエチルアミ
ン（DIEA）（1.29g）、10mM DCC（2.06g）および10mM H
OBT（1.53g）を添加した。２時間後、NMP/DCM（1:1）中
10％無水酢酸を用いて未反応アミノ基をキャップした。
得られたBOC−Sub−Lys−樹脂の約1/3を別の反応容器に
移した。樹脂を含む主たる画分を画分Ｉと命名し、少な
い画分を画分IIと命名する。標準的な脱保護、中和およ
びカップリングサイクルを用い、画分IIにおいて、樹脂
にBOC−Tyr（Br−Ｚ）、BOC−Asp（OBz）、BOC−Glu（O
Bz）およびｐ−Cluをカップリングした。5mMアミノ酸、
DCCおよびHOBTを用いた。NMP/DCM（1/1）25ml中でカッ
プリングを行い、カイザー試験を用いて完了をモニター
した。画分Ｉにおいて、樹脂に5mM BOC−Asp（OBz）を
カップリングした。得られたBOC−Asp−Sub−Lys樹脂の
1/4を別の容器にした（画分III）。残存する樹脂を画分
IVと命名する。標準的な脱保護、中和およびカップリン
グサイクルを用いて、画分IIIにおいて、樹脂にBOC−Ty
r（Br−Ｚ）、BOC−Glu（OBz）およびｐ−Gluをカップ
リングした。5mMアミノ酸、DCCおよびHOBTを用いた。NM
P/DCM（1/1）25ml中でカップリングを行い、カイザー試
験を用いて完了についてモニターした。主な画分（画分
IV）において、樹脂に5mM BOC−Glu（OBz）をカップリ
ングした。この樹脂の1/3を別の容器に移し、5mM p−Gl
uをpGlu−Glu−Asp−Sub−Lys−レンジの合成において
得られたこの画分（画分VI）とカップリングした。5mM
BOCTyr（Br−Ｚ）を主な画分（画分Ｖ）にカップリング
し、該樹脂をさらに半分に分けた。該樹脂の半分をその
まま用い、該樹脂の他の半分（画分VII）を5mM p−Glu
とカップリングして、ｐ−Glu−Tyr−Glu−Asp−Sub−L
ys−レンジを合成した。反応計画は以下のとおりであ
る。

これらの樹脂ペプチドを脱保護し、０℃で１時間HF/
アニソールを用いて開裂した。粗ペプチド（約100mg）
を、水/0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、およびアセト
ニトリル/0.01％TFA緩衝液系を用いて、Ｃ−18ビダク2.
5cm×30cm調製用カラムによって精製した。

実施例８ （pGlu Glu Asp）₂Prc（Lys）_２の調製 ａ）ビスBOC−S,S′−１−３−プロパンジイルシステイ
ンの合成： メタノール3mlを乾燥アンモニウムで飽和し、メタノ
ール0.5ml中BOC−システイン0.5gを添加し、次いで、1,
3−ジブロモプロパン0.35mlを添加した。10分後、メタ
ノール0.5mlに入れたBOC−システイン0.5gをさらに添加
した。4.5時間後、溶媒を蒸発し、油状残留物を水に溶
解した。溶液のpHを９に調節し、溶液をエーテルで抽出
した。水性層をpH2に酸性化し、酢酸エチルで抽出し
た。有機層を乾燥し、蒸発し、ビスBOC−S,S−1,3−プ
ロパンジイルシステイン1.12gを得た。如何なる精製も
行わないで該アミノ酸を使用した。FAB/MSM＋Ｈ＝469。

ｂ）（pGluGluAsp）₂Prc（Lys）_２の調製 手動式振盪器にBOC−Lys樹脂（0.53g、置換0.63mM/
g）を充填し、脱保護および中和サイクルの後、NMP/DCM
（1/1）10ml中、1mM DCC（206mg）および1mM HOBT（153
mg）を用いて、ビスBOC−S,S′−1,3−プロパンジイル
システイン（290mg、0.6mM）をカップリングした。２時
間後、該樹脂をNMPおよびDCMで洗浄し、2mM H−Lys
（Ｚ）−OBz（765mg）を添加し、次いで、NMP/DCM（1/
1）4ml中、1.5mM DCC（390mg）および1.5mM HOBT（230m
g）を添加した。18時間後、該樹脂をNMPおよびDCM20ml
を用いて洗浄した。BOC−Asp（OBz）、BOC−Glu（OBz）
およびｐ−Gluのカップリングのために、通常の脱保護
および中和およびカップリングサイクルを繰り返した。
1mMアミノ酸、DCCおよびHOBTを用いた。NMP/DCM（1/1）
5ml中でカップリングを行った。カイザー試験を用いて
カップリングの完了をモニターした。得られた樹脂ペプ
チド（416mg）を脱保護し、０℃で２時間、アニソール
0.5mlおよびHF8mlを用いて開裂した。HFを蒸発し、ペプ
チド樹脂混合物をエーテルで洗浄し、氷酢酸で抽出し
た。凍結乾燥の後、粗ペプチド130mgを得た。粗ペプチ
ド（61.5mg）を、アセトニトリル−水（0.1％TFA）緩衝
液系を用いてC18ビダク調製用カラムによって精製し
た。純ペプチド16.5mgを得た。

FAB/MS:M＋Ｈ 1249.3 アミノ酸分析 Asp 2.0（２） Glu 4.28（４） Dpc 1.14 Lys 1.96（２） 実施例９および10 ビスBOC−S,S′−1,3−プロパンジイルシステイン（Pr
c）の製造方法に従って、ビスBOC−S,S′−1,2−エタン
ジイルシステイン（Etc）およびビスBOC−S,S′−1,4−
ブタンジイルシステイン（Buc）を製造した。

（pGluGluAsp）₂Prc（Lys）_２の製造方法に従って、
（pGluGluAsp）₂Etc（Lys）₂30mgおよび（pGluGluAsp）
₂Buc（Lys）₂17mgを製造した。

実施例11 （pGlu−Glu−Asp）₂Sub（Ｎ−MeArg）_２の合成 ヒドロキシメチル樹脂0.5g（0.45meq/g）をDCM（5m
l）に懸濁し、0.5mM BOC−NMe Arg（221mg）、0.5mMジ
メチルアミノピリジン（61mg）および0.5mM DCC（103m
g）と反応させた。アシル化樹脂をDCM（３×）、NMP
（３×）、およびDCM（４×）で洗浄した。DCM20ml中、
フェニルイソシアナート0.5mlを用いて未反応ヒドロキ
シ基をキャップした。該樹脂をDCMおよびNMPで完全に洗
浄した。40％TFA/DCMを用いてBOC基を除去した。0.05mM
DCM（20.2mg）中10％DIEAで中和した後、0.125mM DCC
（25.7mg）および0.125mM HOBT（19.1mg）を用いてBOC
−Subをカップリングした。72時間後、樹脂をNMPおよび
DCMで洗浄した。BOC−Asp（OBz）、BOC−Glu（OBz）お
よびｐ−Gluのカップリングのために、通常の脱保護、
中和およびカップリングサイクルを繰り返した。1mMア
ミノ酸、DCCおよびHOBTを用いた。NMP/DCM（1/1）5ml中
でカップリングを行った。カイザー試験を用いてカップ
リングの完了をモニターした。得られた樹脂ペプチド
（484mg）を脱保護し、０℃で２時間、アニソール0.5ml
およびHF10mlを用いて開裂した。HFを蒸発させ、ペプチ
ド樹脂混合物をエーテルで洗浄し、氷酢酸で抽出した。
凍結乾燥の後、粗ペプチド12.5mgを得た。粗ペプチド
（6mg）を、アセトニトリル−水（0.1％TFA）緩衝液系
を用いてＣ−18ビダク調製用カラムによって精製した。
純ペプチド2.2mgを得た。

実施例12 （pGlu−Glu−Asp）₂Sub（Hna）_２の合成 ヒドロキシメチル樹脂0.5g（0.4meq/g）をDCM（5ml）
に懸濁し、2,N−BOC−6,N−Ｚ−2,6ジアミノ−４−ヘキ
シン酸（Hna）126mg（0.335mM）、ジメチルアミノピリ
ジン（DMAP）40mg（0.335）、DCC69mg（0.335）およびH
OBT50mg（0.335）と反応した。該アシル化樹脂をDCM
（３×）、NMP（３×）、およびDCM（４×）で洗浄し
た。DCM20ml中、フェニルイソシアナート0.5mlを用い
て、未反応のヒドロキシ基をキャップした。該樹脂をDC
MおよびNMPで完全に洗浄した。40％TFA/DCMを用いてBOC
基を除去した。DCM中10％DIEAで中和した後、BOC−Sub4
4mg（0.11mM）を、DCC50mg（0.22mM）およびHOBT33.6mg
（0.11mM）を用いてカップリングした。16時間後、該樹
脂をNMPおよびDCMを用いて洗浄した。BOC Asp（OBz）、
BOC−Glu（OBz）およびｐ−Gluのカップリングのために
通常の脱保護および中和およびカップリングを繰り返し
た。1mMアミノ酸、DCCおよびHOBTを用いた。NMP/DCM（1
/1）5ml中でカップリングを行った。カイザー試験を用
いてカップリングの完了をモニターした。得られた樹脂
ペプチド（608mg）を脱保護し、０℃で２時間、アニソ
ール0.6mlおよびHF10mlを用いて開裂した。HFを蒸発さ
せ、ペプチド樹脂混合物をエーテルで洗浄し、氷酢酸で
抽出した。凍結乾燥の後、粗ペプチド93.7mgを得た。ア
セトニトリル−水（0.1％TFA）緩衝液系を用いて、Ｃ−
18ビダク調製用カラムによって粗ペプチド（20.6mg）を
精製した。純ペプチド7.5mgを得た。アミノ酸分析およ
びFAB−MSによって構造を確認した。

FAB/MS:M＋Ｈ 1163 アミノ酸分析 Asp 2.0（２） Glu 4.01（４） Sub 2.01（１） Hna 1.44（２） 実施例13 （pGlu−Glu−Asp）₂Adp（Lys）_２の合成 ａ）ビスBOC 2,5（S,S）ジアミノアジピン酸の合成 アール・ナット（R.Nutt）の方法［ジャーナル・オブ
・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Chem）45,3078,
1980］を用いて、ビス−BOC 2,5（S,S）ジアミノアジピ
ン酸を合成した。メタノール240mlおよびピリジン80ml
の混合液に、NaOCH₃192mgおよびBOC−Asp（OBz）57.56g
を添加した。溶液をホモジニアスにして、反応混合液を
０℃に冷却した。プラチナ電極を用いて、電流（100ボ
ルト）約1.5アンペアを反応混合液に流した。溶液の温
度を15℃〜25℃に維持した。出発物質の消失の後、TLC
（クロロホルム：メタノール：酢酸/95:4:1）を行っ
た。５時間後、反応を停止した。ロータベープによって
溶媒を除去した。油状の茶色の残留物を酢酸メチル150
に溶解した。該溶液を室温で18時間放置した。濾過によ
って沈殿物を除去し、濾液を蒸発させた。ビスBOC 2.5
ジアミノスベリン酸（61.7g）の粗ジベンジルエステル
を得た。粗生成物61gを、ヘキサンを充填したシリカゲ
ルカラムにかけた。該カラムを、逐次、ヘキサン中10
％、20％、25％および30％酢酸エチルで溶離した。画分
をTLCによって分析した。所望の生成物を含有する画分
をプールし、ロータベープによって溶媒を除去した。精
製した生成物（3.78g）を真空乾燥した。ジベンジルエ
ステル3gをメタノール120mlに溶解し、10％Pd/木炭378m
gを用いてパー（Parr）装置中で水素添加した。５時間
で水素添加を終了した。該溶液を濾過し、濾液をロータ
ベープで濃縮した。クロロホルムで充填されたカラム上
でフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーを用いて、
粗ビスBOC 2,5−ジアミノアジピン酸を精製した。該カ
ラムを、逐次、98:2:0.1、98:2:0.5、95:4:1、90:8:2、
85:10:5および70:20:10のクロロホルム、メタノールお
よび酢酸で溶離した。所望の生成物を含有する画分をプ
ールし、ロータベープで濃縮し、残留物を真空乾燥した
（1.07g）。生成物の構造をNMRおよび質量分析データを
用いて確認した。

ｂ）（pGluGluAsp）₂Adp（Lys）_２の合成 BOC−Lys（Cl−Ｚ）−PAM樹脂（0.63mM）0.5gを手動
式振盪器に入れた。塩化メチレン中40％TFAを用いてBOC
基を除去した。トリフルオロ酢酸塩を10％DIEA/DCMによ
って中和した。2mMビスBOC 2,5ジアミノアジピン酸（Ad
p）を、DCM15mlおよびNMP15ml中、4mM DCCおよびHOBTを
用いてカップリングした。DCM/NMP（1/1）30ml中、3mM
H−Lys（Ｚ）−OBzおよび3mM DCCおよびHOBTを用いて、
如何なる遊離カルボキシル基をもアミド化した。カップ
リングの後、該樹脂をDCM、NMPで広範囲に洗浄した。標
的ペプチド中の残存するアミノ酸（Asp、GluおよびpGl
u）と一緒に脱保護、中和およびカップリングのサイク
ルを繰り返した。各カップリングのために4mMの各アミ
ノ酸、DCCおよびHOBTを用いた。カイザー試験を用い
て、各カップリングの完了をモニターした。合成が終了
した後、該樹脂ペプチドを開裂装置に入れ、−15℃で２
時間、HF10mlおよびアニソール1mlを用いて開裂した。H
Fの除去後、該樹脂をエーテルで広範囲に洗浄し、氷酢
酸でペプチドを抽出した。ロータベープによってほとん
どの酢酸を除去し、残留物を水で希釈し、凍結乾燥し
た。HPLCによる精製の後、所望のペプチドを得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェイムズ・エドワード・タルマッジ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19355、 マルバーン、ジェイムズ・トーマス・ロ ード 22番 (56)参考文献 欧州公開267741（ＥＰ，Ａ１) Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（Ｎ. Ｙ．），16（４），274−280（1988) Ｉｎｓｔ，Ｎａｔｌ．Ｓａｎｔｅ Ｒ ｅｃｈ．Ｍｅｄ．，［Ｃｏｌｌｏｑ. ］，162（Ｉｎｈｉｂ．Ｈｅｍａｔｏｐ ｏｉｅｓｉｓ），51−54（1987)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式： ［式中、 ｍは２、３または４であり； Ａはピログルタミン酸、プロリン、グルタミンまたはグ
   ルタミン酸であり； Ｂはグルタミン酸またはアスパラギン酸であり； Ｃはグルタミン酸またはアスパラギン酸であり； Ｄはリシンまたはそのカルボキシアミド誘導体であり； Ｅはグルタミン酸、アスパラギン酸またはペプチド結合
   を意味する］ で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
2. 【請求項２】Ａがピログルタミン酸であり、Ｂがグルタ
   ミン酸であり、Ｃがアスパラギン酸であり、Ｄがリシン
   であり、Ｅがペプチド結合である請求項（１）記載の化
   合物。
3. 【請求項３】（pGlu−Glu−Asp）_２−Pim−（Lys）_２で
   ある請求項（１）記載の化合物。
4. 【請求項４】（pGlu−Glu−Asp）_２−Sub−（Lys）_２で
   ある請求項（１）記載の化合物。
5. 【請求項５】薬物として使用するための請求項（１）〜
   （４）のいずれか１つに記載の化合物。
6. 【請求項６】請求項（１）〜（４）のいずれか１つに記
   載の化合物と、医薬上許容される担体とからなることを
   特徴とする造血組織刺激用医薬組成物。
7. 【請求項７】請求項（１）〜（４）のいずれか１つに記
   載の化合物と、医薬上許容される担体とからなることを
   特徴とするウイルス性、真菌類性または細菌性感染症の
   治療用医薬組成物。