PT94702B - Processo de preparacao de peptidos hemorreguladores - Google Patents

Description

INVENTORES:

Pradip Kumar Bhatnagar, William Francis Huffman e James Eduiard Talmadge

Reivindicação do direito de 4q da Convenção de Paris de prioridade (ao 20 de Março de abrigo do artigo 1883):

Estados Unidos ns. 07/300,579 da América em 14 de Julho de 1989 sob o

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PATENTE NP. 94 702

Processo de preparaçao de péptidos hemorreguladores para que

SMITHKLINE REECHAM CORPORATION, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO presente invento refere-se à preparação de compostos cuja fórmula geral é a-b-c-e-nh co-d \ /

CH

I <çh₂>x

P <ÇH2>n

CH / \

A-B-C-E-NH CO-D (I) onde :

Yi e Y? são independentemente um do outro, CHy> °'^J S» v é 0, 1 , 2 , 3 ou 4; m é 0, 1 ou 2;

n é 0, 1 ou 2;

A é ácido piroglutâmico, prol ina, glutamina, tirosina ou ácido glutâmico;

R é ácido glutâmico, tirosina ou ácido aspártico!

C é ácido glutâmico, tirosina ou ácido aspárticoí

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D é lisina, arginina, tirosina, N-meti1arginina, ácido diamino-hexinóico ou a carboxiamida ou o seu derivado hi droxi metiloj

E é ácido glutâmico, ácido aspártico, ligação peptídica;

tirosina ou uma

que :
quando	Yl e Y2	são	S, x seja 2, 3 ou	4	e m e n	sejam 1;
tpiando	Yl e Y2	são	CH2, x seja 0, 1	ou	2 e m e	n sejam
quando	Y-[ é S e	Y2	é CH2, x seja 0 e	n	seja 1;	ou
quando	Y2 é S e	Y1	é CH2, x seja 0 e	m	seja 1;

ou ou de um seu sal, aceitável farmaceuticamente, caracterizado por compreender;

a) o acoplamento de aminoácidos protegidos para se formar um composto protegido adequado, de fórmula:

A-B-C-E-NH CO-(D' ] \ /

CH

I <ÇH2>m (ÇH₂)_x <ÇH2>n

CH

Z \

A-B-C-E-NH CO—[D'J

b) a remoção de quaisquer grupos protectores e, se necessário a clivagem do péptido, a partir da resina; e

c) opcionalmente a formação de uro seu sal farmaceuticamente acei tável .

O invento refere-se ainda ao processo de preparação de uma composição farmacêutica contendo os compostos anteriores.

Estes compostos têm propriedades hemorreguladoras e podem ser usados para estimular hematopoiese.

?. 58 14455-CTP 1

-3estimular i nf ecci osas

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo de aplicação do invento

O presente invento refere-se a novos péptidos que têm actividades hemorreguladoras e que podem ser usados para i hematopoiese e para o tratamento de doenças virais, fúngicas e bacterianas.

Antecedentes do invento

Uma variedade de mensageiros reguladores e modificadores reguladores, tais como, factores de estimulação de colónias, interferões, e diferentes tipos de péptidos, são responsáveis pela regulação da mieiopoiese. Metcalf, Cel1. 43:5 (1985);

Baserga R., Foa P., Metcalf D., Polli EF (eds), Biological

Regulation of Cell Proliferation (1986), Nicola et al., J. Cell

Physiol. 128:501 (1986), Zoumbos et al.. Proyr. Hemat. 1:341 e

14:201 (1986); Werner et al.. Experientia 42:521 (1986). Há vinte anos, Rytomaa e Kivieniemi Cell Tissue Kinet 1:329-340 (1968);

Rytomaa et al . , Control of Cellular Growth in Adult Organisnis pp

106-138 (1967) relataram que extractos de granulócitos maduros (Chalone granulocitica) podiam inibir especificamente a proliferação de células mielopoiéticas de ratazana em culturas incli tapadas nadas/. lais tarde, demonstraram que o factor, que tinha uma massa molecular menor do que 3000 daltons, era capaz de induzir a regressão de uma leucemia granul oci ti ca transpl ant.ável de ratazanas, bem coroo retardar o crescimento de células de leucemia em humanos. Paukovits e outros, extraíram um factor similar de células de medula óssea de ratazanas e mostraram que ele inibia a absorção de timidina tritiada das células de medula óssea, Paukov i t, s , W. R. , Cell Tissue Kinet 4:539-547 (1971 ) Naturforsch 37:1297 (1982). Em 1979, Boll et al . , Acta Haematologica 6:130 (1979) demonstraram os efeitos inibidores de extractos granulociticos de ratazana em células de medula óssea humana, em cultura, e vários outros investigadores, demonstraram que este extracto granulocítico bruto inibia o desenvolvimento de g-CFVC e/ou gm-CFUC 1n vi vo de células de medula óssea de

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-4Este agente biológico foi nomeado chalone de granulócitos,o qual, de acordo com este conceito teórico, deveria ser um inibidor endógeno da proliferação celular, actuando à medida que é segregado, no próprio tecido. O material obtido a partir dos extractos brutos revelou ser não específico em termos das espécies,mas ser altamente específico em termos dos tecidos. Mais ainda, descobriu-se ser não tóxico e ter actividades reversíveis.

Em 1982, um pentapéptido sintético hemorregulador, com a seguinte estrutura:

pGlu-G]u-Asp-Ci s-Li s foi descrito como tendo um efeito inibidor sobre células mieiopoiéticas quer in vitro quer in vivo, onde o efeito principal parece ser sobre hemocitoblastos mielopoiéticos (CFU-gm). Paukovits et al,, Z. Naturforsch 37:1297 (1982) e Patente

E.1J.A. Nó. 4 499 081. Acredita-se que este péptido seja um análogo de um factor de inibição da granuiopoiese que ocorre naturalmente, que foi encontrado em quantidades diminutas em extractos de medula óssea. O péptido, por inibição da hematopoiese, e, em particular, da granulopoiese tende a impedir as células quiescentes de entrarem em divisão celular e, assim, se tornarem susceptíveis de ataque por drogas citotóxicas anticancerosas. Além de proporcionarem uma função protectora em terapia usando drogas citotóxicas, os péptidos também podem ser células usados para deter a proliferação de/cancerosas relacionadas com o sistema raielopoiético, i.e leucemia mielóide.

Em 1987, Laerum et al., descreveram que o produto de oxidação deste péptido era um dimeio (HP-5) formado por pontes de d'sulfureto. Este dímero tem o efeito oposto^do monómero já que estimula fortemente a formação de colónias em CEU-gm humano e murino, ln vitro_;e regula células murinas mielopoiéticas in___vivo.

Isto é reivindicado no Pedido Europeu NQ. 87309806.5.

O dímero é descrito como sendo útil na estimulação da mielopoiese em pacientes que sofrem de actividade mielopoiética reduzida, incluindo danos na medula óssea, agranulocitose e anemia aplástica, incluindo pacientes que têm a função da medula ''Γ*·?'

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14455-CTP 1 óssea deprimida ’ devido a tratamento iraunossupressivo para suprimir as reacções do tecido, i.e. em cirurgia de transplante de medula óssea. Os compostos podem, também, ser usados para promover a regeneração mais rápida da medula óssea após quimioterapia citoestática e terapia por radiação para doenças neoplásticas e virais. Podem ser de valor particular nos casos em que os pacientes têm infecções sérias devido à falta de respostas imuno!ógicas que se seguem a falha na actividade da medula óssea.

A presença da ligação disulfureto no dímero HP-5 sugere que o monómero é um metabolito possível i n v iVo. Como o monómero inibe a hematopoiese, a estabilidade do t’i mero HP-5 é crítica quando usado in vivo para estimular a mielopoiese. A identificação de um dímero estável eliminaria este problema potenci al.

Sumário do Invento

Este invento refere-se a péptidos que, a partir daqui, passarão a ser representados pela fórmula (I), que têm actividades hemorreguladoras e podem ser usados para estimular a heinatopoiese e tratar doenças bacterianas, virais e fúngicas. Estes péptidos são úteis no restauro dos leucócitos em pacientes com baixas contagens celulares resultantes duma variedade de situações clínicas, tais como, mielossupressão induzida por cirurgia, SIDA, mieiodisplasia congénita, transplantes de medula óssea e de órgãos; na protecção de pacientes com leucopenia de infecção; no tratamento de pacientes gravemente queimados e no melhoramento da mie]ossupressão observada com alguns agentes antivirais específicos para o ciclo celular. Os péptidos são, também, úLeis no tratamento de doenças infecciosas virais, bacterianas e fúngicas, em particular, Candida e Herpes, quer pacientes imunosuprimjdos quer em pacientes normais.

em

Estes compostos podem ser usados em combinação com os monómeros da Patente E.U.A. NO. 4 499 081 para proporcionar picos alternantes de alta e baixa actividade nas células de medula o ri tino rircadiano natural ossea aumentando assim, da hematopoiese. Desta forma, a terapia citoestática pode ser dada

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eni períodos de baixa actividade da medula óssea, reduzindo-se, assim, o risco de danos na medula óssea, enquanto que, ^a regeneração será promovida no pico seguinte de actividade. Este invento é, também, uma composição farmacêutica que compreende o composto de fórmula (I) e um portador farmaceuticamente aceitável.

Este invento constitui, ainda, um método para a estimulação do sistema mielopoiético de um animal, incluindo seres humanos, que compreende a administração, a um animal em carência, de uma quantidades efectiva de um composto de fórmula (I).

Este invento constitui, também, um método de tratamento de infecções virais, fúngicas e bacterianas em animais imunosuprimidos e normais, incluindo seres humanos, que compreende a administração, a um animal em carência, de uma quantidade efectiva de um composto de fórmula (I).

Descrição Detalhada do Invento

Os péptidos deste invento são ilustrados pela fórmula (T):

A-B-C-E-NH CO-D \ /

CH (CH₂)_m

I ^Yi

CH₂)

I (ÇH₂ )_n CH /\

A-B-C-E-NH CO-D

Y-| e Y₂ são, independentemente uin do outro, CH₂ ou S; x é 0, 1, 2 , 3 ou 4 5 m é 0, 1 ou 2; n é 0, 1 ou 2;

Λ é ácido pi rogl ut âini co , prolina, glutamina, tirosina ou

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-7ácido glutâmico;

R é ácido glutâmico, tirosina ou ácido aspártico;

C é ácido glutâmico, tirosina ou ácido aspártico;

D é lisina, arginina, tirosina, N-meti1arginina, ácido diamino-hcxinoico ou a carboxiamida, ou o seu derivado hidroximetilo;

G é ácido glutâmico, ácido aspártico, tirosina ou uma ligação peptídica; desde que:

quando	Y]	e	Y2	sao	S, x é	2,	3 ou	4	e	men são 1;
quando	Yi	e	Y2	são	ch2, X	é	0, 1 '	ou	2	e m e n são
quando	Yi	é	S e	Y2	é ch2,	X	é 0 e	n	é	1; ou
quando	Y2	é	S e	Yi	é ch2,	x	é 0 e	m	é	1 ;

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Também estão incluídos neste invento, sais complexos dos compostos deste invento. Deve ser notado que, na fórmula (I), A compreende o grupo amino terminal do resíduo de aminoácido correspondente a ácido piroglutâmico, prolina, glutamina, tirosina ou ácido glutâmico. De forma similar, D compreende o grupo carboxilo terminal do resíduo de aminoácido correspondente a lisina, arginina, tirosina, N-met11arginina, ácido diaminohexinóico ou a carboxiamida ou o seu derivado hidroximeti1o .

As abreviaturas e símbolos usados, de forma comum, na arte são aqui usados para descrever os péptidos:

pGl υ	- ácido piroglutâmico
Pro	= prolina
Gin	= g1u tam ina
Gl u	= ácido glutâmico
A s p	ácido aspártico
L i s	- lisina
Arg	= arginina
Gi Ξ	- cisteína
Ti r*	= tirosina
Sub	= ácido diaminosubérico
Hna	= ácido di ainino-hexi noi co

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-8Pira = ácido diaminopimélico Adp = ácido diaminoadípico

Km acordo com a representação convencional, a terminação amino está à esquerda e a terminação carboxi está à direita. Todos os aminoácidos quirais podem estar na configuração absoluta D o u L .

A terminação amino pode ser protegida por acilação. Exemplos de tais grupos protectores são, t-butoxicarbonilo (t-Boc) , CHgCO e Ar—CO (Ar = benzi lo).

A terminação C pode ser carboxi, como no caso do aminoácido

O

II natural ou da carboxiamida (-CNHg), ou hidroximetilo (-CHg-OH).

Compostos preferidos são aqueles em que Yj e Y₂ são CH₂ e x é 1 ou 2 ou, onde, A é pGlu, B é Glu, C é Asp, D e Lis e E é uma ligação péptidica, e os aminoácidos quirais estão na configuração absoluta L.

Compostos especialmente preferidos são:

pGlu-Glu-Asp-NH

CO-Lis pGlu-Glu-Asp-NH

CO-Lis (CH₂)₃ θ pGlu-Glu-Asp-NH

s (CH₂)4

Λ pGlu-G]u-Asp-NH CO-Li s

Os facto de 1ig ação 1jgação assim, é 87309806.

compostos deste invento diferem dos da arte anterior no o dímero estar ligado por uma ponte que contém uma carbono-carbono, em vez de uma ponte disulfureto.

carbono-carbono nao é facilmente clivada in vivo e, mais estável i n vi vo que os compostos do Pedido Europeu

5.

Os péptidos deste invento são preparados pela técnica de fase sólida de Merrifield, J. Am. Chem. Soc.. 85, 2149 (1964) ou, métodos em solução conhecidos na arte podem ser aplicados com sucesso. Os métodos de síntese de péptidos, avançados de forma geral em J. M. Stewart e J. D. Young, Solid Phase Peptide

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Synthesis Pierce Chemical Company Rockford, II ( 1984) ou M. Bodansky, Y. A. Klauser e Μ. A. Ondetti, Peptide Synthesis. John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y. (1976), podem ser usados para produzir os péptidos deste invento.

Cada aminoácido ou péptido é protegido convenientemente, tal como conhecido na arte dos péptidos. Por exemplo, o radical fluoroenilmetoxi carbonilo {Fmoc) ou o grupo t-butoxicarbonilo (t-Boc) são preferidos para a protecção do grupo amino, especialmente na posição a. Um grupo carbobenziloxi substituído convenientemente pode ser usado para o grupo £-amino da lisina, e o grupo benzilo para os grupos β e Jf-carboxi de Asp e Glu, respectivamente. Substituição conveniente do grupo protector carbobenziloxi, é a substituição orto e/ou para com cloro, bromo, nitro ou metilo, e é usada para modificar a reactividade do grupo protector. À excepção do grupo t-Boc, os grupos protectores mais convenientes são aqueles que não são removidos por tratamento ácido moderado. Estes grupos protectores são removidos por métodos tais como, hidrogenação catalítica, sódio em amoníaco líquido ou tratamento com HF, como conhecido na arte.

Se são usados os métodos de fase sólida, o péptido é construído sequencialmente a partir da terminação carboxi, avançando-se no sentido da terminação amino do péptido. Começa-se a síntese em fase sólida pela ligação covalente da terminação C de um aminoácido protegido a uma resina adequada, tal como uma resina de benzidrilamina (BHA), resina de metilbenzidrilamina (MBHA) ou resina de clorometilo (CMR), como é apresentado, na generalidade, na Patente E.U.A. No. 4 244 946, ou resina de feni1acetamidometilo (PAM). Usa-se uma resina de suporte BHA ou MBHA se a terminação carboxi do produto peptídico for a carboxianiida. Uma resina CMR ou Pam é, geralmente, usada, se a terminação do produto peptídico for um grupo carboxi, embora esta também possa ser usada para produzir uma carboxiamida ou um éster.

O grupo protector no grupo α-amino é removido por tratamento

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-10ácido moderado (i.e. ácido trifluoroacético). Para compostos nos quais Yj e/ou Y2 são CHg em vez de S, acopla-se um di-Boc (ácido diaminodicarboxí 1 i co) a dois dos aminoácidos da resina, usando ura agente de acoplamento conveniente. Quaisquer grupos carboxilo livres são amidados com um derivado,protegi do convenientemente, de T). Ciclos convenientes de desprotecção, acoplamento, conhecidos na arte, são usados sequencialmente aminoácidos sem isolamento do intermediário, até se ter formado o péptido desejado. O péptido completo pode, então, ser desbloqueado e/ou separado da resina portadora qualquer ordem. O tratamento,com HF ou HBr/ácido acético, de péptido suportado numa resina, separa o péptido da resina e produz o aminoácido terminado por carboxi, como um ácido carboxí1i co.

neutralização e para adicionar em um

Se se desejar um éster, a resina CMR ou Pam pode ser tratada com o álcool apropriado, tal como álcool metilico, etílico, propilico, butílico ou benzilico, na presença de trietilamina, para clivagem do péptido da resina e produção do éster directamente.

Os ésteres dos péptidos deste invento também podem ser preparados por métodos convencionais, a partir do percursor ácido carboxílico. Tipicamente, o ácido carboxílico é tratado com um álcool na presença de um catalisador ácido. Alternativamente, o ácido carboxílico pode ser convertido num intermediário acilo activado, tal como um halogeneto de acilo, e tratado com um álcool, de preferência, na presença de uma base.

preferido para a clivagem de um péptido, de uma ,é o tratamento do péptido suportado na resina cora presença de um depurador de catiões, tal como o dimetoxibenzeno. Este método remove, simultaneaos grupos protectores, except.o um grupo tioalquilo enxofre, e separa o péptido da resina. Os péptidos desta forma, das resinas CMR e Pam são ácidos os que são separados da resina BHA são obtidos como

O método resina suporte PF ari d ro na ani sol >- ou o mente. todos <}ue protege o h i. dro 1 i sados , carbox ί1 i cos, carboxiamidas.

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-liai ifáticos moderado,

A modificação do grupo amino terminal do péptido é conseguida por alquilação ou acilação, tal como é, geralmente, conhecido na arte. Estas modificações podem ser levadas a cabo no aminoácido antes da incorporação no péptido, ou no péptido depois de ter sido sintetizado e do grupo terminal amino ter sido libertado, mas antes dos grupos protectores terem sido removidos.

Tipicamente, a acilação é levada a cabo no grupo amino livre usando o halogeneto de acilo, o anidrido ou o éster activado do ácido alquilico ou arílico correspondente, na presença de uma amina terciária. A mono-alquilação é feita convenientemente pela alquilação redutiva do grupo amino com um aldeído ou uma cetona apropriados, na presença de um agente redutor tal como o cianoboro-hidreto de lítio ou de sódio. A dialquilação pode ser levada a cabo por tratamento do grupo amino com um excesso de um halogeneto de alquilo na presença de uma base.

A síntese de péptidos em solução é conseguida usando os métodos convencionais utilizados para formar ligações amida.

Tipic: monte, um aminoácido protegido com t-Boc,que.tem um grupo carboxi’o livre é acoplado a um aminoácido protegido que tem um grupo amino livre, usando um agente acoplador conveniente, tal como N,N-diciclo-hexi1carbodiiraida (DCC), opcionalmente, na presença de catalisadores tais como, 1-hidroxibenzotriazole (KOBT) ou dimeti1aminopiridina (DMAP). Outros métodos, tais como de a formaçao de ésteres, anidridos ou halogenetos/ácidos, activados, dmn carboxilo livre de um aminoácido protegido por t-Boc, e reacção subsequente com a amina livre dum aminoácido protegido, opciona1 mente, na presença de uma base, são, também, adequados. Por· exemplo, um aminoácido ou um péptido protegidos por Boc é ! rafado coin cloroformato de isobutilo, nuin solvente anidro, tal como 'loreto de metileno, ou tetra-hidrofurano (THF ), na presença de uma base, tal como N-metilmorfolina, DMAP (dimeti1aminopiridina) ou uma amina trialquilada, para formar o anidrido activado, que, sc faz reagir subsequentemente, com a amina livre de outro aminoácido ou péptido protegidos- O péptido formado por estes métodos pode ser desprotegido selectivamente, usando técnicas

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-12convencionais, na terminação amino ou carboxi, e acoplado a outros péptidos ou aminoácidos, usando técnicas similares. Depois do péptido ter sido completado, os grupos protectores podem ser removidos como foi descrito anteriormente, tal como por hidrogenação na presença de catalisador de paládio ou de platina, tratamento com sódio em amoníco líquido, ácido fluorídrico ou bases.

Se o péptido final, depois de ter sido desprotegido,, contém _de ácido um grupo básico, pode-se preparar um sal ácido de adição/. Os sais de acido ácidos de adiçao7 dos péptidos sao preparados de uma maneira padrão num solvente adequado, a partir do composto pai e de um excesso de um ácido tal como ácido clorídrico, bromidrico, sulfúrico, fosfórico, acético, maleico, succínico ou metano-sulfónico. A forma acetato do sal é especificamente útil. Se o péptido final contém um grupo ácido, sais catiónicos podem ser preparados. Tipicamente, o composto pai é tratado com um excesso de um reagente alcalino, tal como um hidróxido, carbonato ou alcoxido que contenham o catião apropriado. Catiões tais como Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺ e NH4⁺, são exemplos de catiões presentes em sais

NH4⁺ sao especialmente farmaceuticaraente aceitáveis. Na⁺ preferidos.

Em geral, por forma a exercerem um efeito estimulador, os péptidos deste invento podem ser administrados a pacientes humanos por injecção ou oral mente, na gama de dosesdeO,1-10 mg, por exemplo, 1-5 mg por 70 kg de peso do corpo por dia, se administrados por infusão ou técnicas similares, a dose pode estar na gama 30-300 mg por 70 kg de peso do corpo,por exemplo, cerca de 100 mg durante seis dias. Em princípio, é desejável produzir uma concentração do péptido de cerca de 10“^ M a ΙΟ'^ΪΙ _no fluido extracelular do paciente.

De acordo com uma outra característica do presente invento, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo, como ingrediente activo, um ou mais compostos de fórmula (I), tal como aqui foi definido anteriormente, ou seus sais fisiologicamente compatíveis, em associação com um portador farmacêutico ou

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excipiente. As composições, de acordo cora o invento, podera ser apresentadas, por exemplo, numa forma conveniente para administração oral, nasal, parenteral ou rectal.

Tal como usado aqui, o termo farmacêutico inclui as aplicações veterinárias do invento.

Estes péptidos podem ser encapsulados, comprimidos ou preparados como uma emulsão ou xarope para administração oral. Portadores sólidos ou líquidos, farmaceuticamente aceitáveis, podem ser adicionados para realçar ou estabilizar a composição, ou para facilitar a preparação da composição. Portadores líquidos incluem xarope, óleo de amendoim, azeite, glicerina, solução salina e água, Portadores sólidos incluem amido, lactose, sulfato de cálcio di-hidratado, terra alba, estearato de magnésio ou ácido esteárico, talco, pectina, acácia, agar ou gelatina. O portador pode incluir, também, um material de libertação sustida tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo, só ou com uma cera. A quantidade do portador sólido varia mas, de preferência, encontrar-se-á entre cerca de 20 mg até cerca de 1 g por unidade de dosagem. As preparações farmacêuticas são feitas seguindo as técnicas convencionais de farmácia envolvendo moagem, mistura, granulação e compressão, quando necessário, para a forma de comprimidos; ou moagem, mistura e enchimento para a fórmula de cápsulas de gelatina dura. Quando é usado um portador líquido, a preparação terá a Forma de uro xarope, elixir, emulsão ou uma suspensão aquosa ou não aquosa. Tal formulação líquida pode ser administrada directamente p.o. ou dentro de uma cápsula de gelatina mole. Sistemas portadores específicos para órgãos podem, também, ser usados.

Composições farmacêuticas alternativas dos péptidos deste invento, ou dos seus derivados, podem ser formuladas como soluções ou pós liofilizados para administração parenteral. Os pós podem ser reconstituídos por adição de um diluente adequado ou ou tro portador farmaceuticamente aceitável, antes do uso. A formula ção líquida é, geralmente, uma solução aquosa tamponada, isotónica. Exemplos de diluentes adequados são, solução salina isotónica

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4normal, padrão 5% de dextrose em água ou solução tamponada de acetato de sódio ou de amónia. Tal formulação é especialmente adequada para a administração parenteral, mas pode, também, ser usada para a administração oral ou contida num inalador de dose graduada ou nebulizador para insuflação. Pode ser desejável adicionar excipientes tal como polivinilpirrolidina, gelatina, hidroxicelulose, acácia, polietilenoglicol, manitol, cloreto de sódio ou citrato de sódio.

Para administração rectal, um pó pulverizado dos péptidos deste invento, pode ser combinado com excipientes tais como manteiga de cacau, glicerina, gelatina ou polieti1enoglicois e moldado num supositório. Os pós pulverizados podem, também, ser compostos com uma preparação oleosa, gel, creme ou emulsão, tamponados ou não tamponados e administrados através dum penso transdérmico.

Os sprays nasais podem ser formulados duma forma similar em solução aquosa e carregados em recipientes de spray, quer com um aerosol propulsor quer munidos com meios para compressão manual. Podem ser produzidas cápsulas contendo um ou mais ingredientes activos, por exemplo, por mistura dos ingredientes activos com portadores inertes, tais como lactose ou sorbitol, e enchendo cápsulas de gelatina com a mistura.

Unidades de dosagem contendo os compostos deste invento contêm, preferencialmente, 0,1-10 mg, por exemplo 1-5 mg, do péptido de fórmula (I) ou um seu sal.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é proporcionado um método de estimulação da mielopoiese, que compreende a administração de uma quantidade efectiva de uma composição farmacêutica tal como aqui foi definido anteriormente, a um paciente.

Outro aspecto do presente invento proporciona um método para o tratamento de infecções virais, fúngicas e bacterianas era animais imunosuprimidos e normais, que compreende a administração a um animal em carência, de uma quantidade efectiva de uma composição farmacêutica como foi definida anteriormente.

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As actividades biológicas dos compostos de fórmula (T) são demonstradas no seguinte teste.

Indução de actividade Estimuladora de Colónias por Células

Estromai s

A linha C6 de células estroraais da medula óssea humana é feita crescer até à confluência em placas para cultura de tecidos plásticos, ein meio RPMT-1640 e 5% de FBS. Um dia antes da experiência este meio é mudado para DMEM sem soro adicionado. Os compostos são adicionados a estas culturas durante uma hora e, depois, lavadas das culturas. O meio é reposto com DMEM fresco e as células são incubadas durante 24 horas a 37°C, 5% de COg- Após 24 horas a cultura sobrenadante de células 06 é colhida, filtrada em condições de esterilidade e congelada até poder ser analisada quanto a presença de actividade hematopoiética estimulante de colónia (CSA), como é indicado abaixo.

z

Ensaio de Agar mole

Obtêm-se células de medula óssea de ratazanas de Lewis. São ajustadas a 10θ células/ml em DMEM sem soro. Usa-se um sistema de ágar de camada simples utilizando o seguinte: DMEM enriquecido com nutrientes (NaHCOg, piruvato, aminoácidos, vitaminas e tampão HEPES}; 0,3% de Bacto agar e 20% de soro de ratazana de Lewis. A isto foram adicionadas diluições do sobrenadante das células de linha C6 do ensaio anterior (10-2,5%) com células de medula óssea de ratazanas (concentração final = 10® células/ml). As z

placas de agar são incubadas a 37°C, 5% COg durante 7-8 dias. As colónias de células de medula óssea em proliferação (CFU-C) são contadas utilizando um microscópio. O número de colónias em agar contado é proporcional à quantidade de CSA presente no sobrenadante das células estromais da medula óssea de linha CB.

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-16TABELA 1

Actividade estimulante hematopoiética de colónia usando 5% de sobr en adant.e

Dose

1000 1 00

0 1

0,1

0,01

0,001

Percentagem de controlo (pGlu-Glu-Asp)2~Sub-(Li s)g (Exemplo 2)

192

241

207

188

154

Modelo Herpes Simplex do ratinho

Nos sete dias antes da infecção, ratinhos Balb/c são injectados intraperitonialmente uma vez por dia com um volume de 0,2 ml, em doses de 10 e 1 ng/kg do composto. Ratinhos de controlo recebem injecções de 0,2 ml de uma mistura do tampão de diluição, DPRS e 0,5% de soro de ratinho normal, inactivado pelo calor.

Os ratinhos são infectados com um virus Herpes Simplex (estirpe MS), por injecção de 5,0 x 10^/pfu em suspensão em 0,05 ml de PRS em cada almofada da pata traseira. Os ratinhos injecções continuam a receber/do composto ou injecções do controlo até estarem moribundos (incapazes de conseguirem comida ou água). Usual mente, ocorre paralisia das patas traseiras, aproximadamente, oito dias depois da infecção. A paralisia progride até ocorT-er encefalite.

Mternati vamente, o vírus é inoculado por meio fie uma via vaginal. Um tampão de algodão contendo 5,0 x 10^/pfu da estirpe MS NAP é inserido na vagina do ratinho.

Usa-se um teste de Wilcoxin para determinar se há um aumento significativo da sobrevivência no grupo tratado relativamente ao grupo de controlo.

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-17Desafio com Candida

É usada a estirpe B311a de Candida albicans. Esta estirpe tem sido passada por ratinhos e depois congelada a -70°C. A B311a é virulenta para ratinhos imunossuprimidos na gama de 5,0 a 8,0 x x 10⁴ cfu/ratinho e, para ratinhos normais, na gama de 1,0 a 2,0 x 105 cfu/ratinho. Fez-se crescer uma amostra do lote congelado de Candida em fitas de dextrose Sabouraud e, a seguir foi transferida para 50 ml de culturas sob agitação de caldo de Sabouraud, durante 18 horas. As células foram lavadas três vezes e, depois, contadas por hemocitóroetro e a viabilidade foi confirmada por exclusão de corante de metileno. Foram executadas contagens de viabilidade no inoculo para confirmar as contagens.

Todos os ratinhos (Balb/c) infectados com Candida foram infectados por i.v. com células em suspensão em 2 ml de solução salina. Alguns ratinhos são mielodeprimidos subletalmente com 300 rads de irradiação. Duas horas a seguir à irradiação os animais começam a ser injectados com composto CSF como um controlo positivo ou excipiente, todos os dias. Sete dias após a irradiaçãoe o começo Ido tratamento, os ratinhos são desafiados” com Candida albicans por administração intravenosa. É de notar que isto representa, aproximadamente, uma LD75 para ratinhos normais. Noutros estudos, os ratinhos não estão imunossuprimidos. Nestes estudos os ratinhos começam a ser tratados sete dias após infecção, da mesma maneira que os ratinhos irradiados. Em ambos os modelos os ratinhos são seguidos até estarem moribundos e a variação na sobrevivência é comparada usando o teste de Wilcoxin.

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar este invento. Os Exemplos não pretendem, de maneira alguma, limitar o alcance deste invento, mas são fornecidos para mostrar como fazer e usar os compostos deste invento.

Nos Exemplos, todas as temperaturas são em graus Centígrados As análises de aminoácidos foram feitas num Dionex Autoion 100. As análises para o conteúdo de pèptidos são baseadas na análise de aminoácidos. Os espectros de massa FAB foram realizados num

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espectrómetro de massa VG ZAB usando bombardeamento com átomos rápidos. Âs abreviaturas usadas são as seguintes:

Arg = arginina Asp = ácido aspártico t-BOC = terc-buti1oxicarboni1 o Bz = benzilo

Cl Z = p-clorocarbobenziloxicarboni!o (Z = carbobenzi1oxicarboni1 o)

DCC = diciclo -hexilcarbodiimida

DTFA = diisopropi1eti1amina

FDC = (N-eti]-N’-(3-dirneti1aminopropi1) carbodi imida Glu = ácido glut-âmico p Glu = ácido piroglutâroico Tir = tirosina

Hna - ácido diamino-hexinoico HOBT = hidroxibenzotriazole Lis = lisina

NNP = N-niet i 1-2-pirrol i d inona

Pro - prolina

Gin - glut.amina

C i s = cisteína

Pim = NH-CH-CO (ácido diaminopimélico1 f

(ÇH2)3

NH-CH-CO

Sub = NH-CH-CO (ácido diaminosubérico)

I (CH₂)4 I

NH-CH-CO

Adp - NH-CH-CO (™2>2

NH-CH-CO

M-MeArg = N-meti1arginina

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- bis-BOC-S,S ’ -1,3-propanodi ilcisteína = bi s-BOC-S,S’-1,2-etanodiilcisteína = bis-BOC-S,S’-1,4-butanodi ilei steína

Prc

Etc

Buc

-19EXEMPLO 1

Preparação de: (p-Glu-Glu-Asp)g-Pim-(Lis)g

CO-Lis (CH₂)₃ p-Glu-Glu-Asp-NH

CO-Lis

Meio grama de t-Boc-Lis(Cl-Z-OCHg-resina Pam (0,63 mmol/g) foi carregado no vaso reaccional de um sintetizador Beckman 990 B. No passo de desprotecção o grupo t-Boc foi removido usando 40% de ácido trifluoroacético (TFA) em cloreto de metileno (CH₂C1₂), o sal de trifluoroacetato foi neutralizado por 10% de DIEA/CH₂C1₂. Dois mM (780 mgs) de ácido Di-Boc-2,6-diaminopimé1ico foram acoplados, usando 2 mM de DCC e HOBT. O acoplamento foi feito na mistura de 15 ml de CH₂C1₂ e 10 ml de DMF à temperatura ambiente durante duas horas. O teste de Kaiser foi usado para verificar o acoplamento. Quaisquer grupos carboxilo que restavam livres foram amidados duas vezes, usando 3 mM (1,65 g) de Η-Lis-(Z)-OBz.HC1 e 3 mM de DCC e 3 mM de HOBT em 25 ml de CH₂C1₂/DMF (15/10).

Após duas horas de acoplamento a resina foi lavada duas vezes com 15 ml de CH₂C1₂, duas vezes com 15 ml de DMF, duas vezes com 15 ml de MeOH/CH₂Cl₂ (1:1) e, finalmente, duas vezes com 15 ml de CHgClg. Após a desprotecção do t-Boc, usando 40% TFA/CH₂C1₂ e neutralização, usando 10% DIEA/CH₂C1₂, foram adicionados e acoplados 2 mM (0,646 g) de Boc-Asp(Bzl) e 2 mM de DCC e 2 mM de HOBT, durante 2 horas em 25 ml de CH₂C1₂/DMF (15/10). A resina foi então sujeita a um passo de lavagem tal como descrito anteriormente. 0 passo de desprotecção e o passo de neutralização foram repetidos antes de 2 mM (0,674 g) de Boc-Glu{Bzl), 2 mM de DCC e 2 mM de HOBT serem acoplados em 25 ml de CH₂C1₂/DMF

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(15/10). Depois dos passos de lavagem, desprotecção e neutralização foram acoplados 2 mM (0,2589) de pGlu, 2 mM de DCC e 2 mM de HOBT em 25 ml de CH₂C1₂/DMF (15/10) durante 2 horas, antes da resina ser sujeita a um passo de lavagem. O acabamento do acoplamento foi verificado pelo teste de Kaiser, e só acoplamento simples foi necessário em cada passo. Após o acabamento da síntese a resina foi seca e pesada. Rendimento: 1,2 g

A resina de péptido (1,2 g) foi carregada num aparelho de clivagem e clivada usando 10 ml de ácido fluorídrico (HF) e 1 ml de anisole a -15°C durante duas horas. Após remoção sob vácuo do HF, a mistura da resina e do péptido foi lavada extensivamente com éter e o péptido foi extraído em ácido acético glacial (30 ml ) . A maior parte do ácido foi removida dos extractos num rotavap e o resíduo foi diluído era água e liofilizado. O extracto de ácido acético tinha 810 mg do péptido bruto.

O péptido bruto (80 mg) obtido da extracção com ácido acético, foi ainda mais purificado, usando uma coluna preparativa C-18. Foi passado através duma coluna pré-equilibrada (em 0,1% TFA/H₂O). O péptido foi eluído usando um gradiente linear de 80% de acetonitrilo, 20% de H₂O e 0,1% TFA.

Foram co-eluídos três isómeros (8,52 min). Estes foram separados numa coluna C-18 usando um gradiente de 30% (0,1% TFA em CH₃CN), 70% (0,1% TFA em H₂0) a 80% (0,1% TFA em CH₃CN), 20% (0,1% TFA em H₂O) durante 35 minutos a um caudal de 1,5 ml/min.

Foram eluídas as seguintes fracções: fracção 1: 18,69 min fracção 2: 19,68 min fracção 3: 22,95 min

A análise de aminoácidos deu os seguintes resultados:

Análise de aminoácidos Observado

Glu 1,99

Asp 1,0

Lis 1,05

Acido Bis-aminopimélico N.D.

espec. massa = 1157,5 (M+H)⁺

Λ S

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-21 EXEMPLO 2

Preparação de: ( pGlu-Glu-Asp ) j>-Sub- ( Li s ) £ /pGlu-Glu-Asp-NH-fJH-CO-Li (ÇH₂)₄ pGlu-Glu-Asp-NH-CH-CO-Li s x y

A. Sintese de BbC-SUB-Lys-(£-Z)COOBz.:

O ácido Bis-BOC-(1,1)-diaminosubérico (Sub ) foi sintetizado usando o método de R. Nutt (J. Org. Chem. 45, 3078, 1980).

Dois mM de Boc-Sub ( 808 ing ) , 4 mM de Lis-(£-Z)-COOBz.HCl (1,56 g) e 4 mM de HOBT (0,613 g) foram dissolvidos em 10 ml de cloreto de metileno (CHgClg) θ a solução foi arrefecida a -15°C usando um banho de gelo/acetona. Quatro mM (0,692 ml) de diisopropileti1amina (DIEA) foram adicionados, seguido da adição (EDC) de 0,772 g (4 mM) de carbod i. imi da solúvel em água/. Após agitação durante uma hora deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente. Após três horas, o cloreto de metileno foi evaporado e o resíduo foi dissolvido em 200 ml de acetato de etilo. A solução foi lavada primeiro com HCl IN, depois com NaOH IN, solução saturada de NaCl e água. As lavagens foram repetidas três vezes e cada lavagem era de cerca de 100 inl . A camada orgânica foi seca sobre MgSO4 e evaporada. Obteve-se 1,86 g de BOC-Sub-(£-Z)LisCOOBz (rendimento de 79%) e usado sem qualquer purificação posterior.

B. Síntese de BOC Asp-(β-ΟΒζ)Sub- Lis-(£-Z )-COOBz. :

Dissolveu-se BOC-Sub Lis-{£-Z)-COOBz (1,8 g) em HCl 4N-dioxano durante meia hora e, depois, evaporou-se até à secura. O resíduo foi lavado com éter e seco durante noite. 0 sal cloridrato foi dissolvido em 30 ml de CHgClg e adicionou-se BOCAsp-(B-OBz) (1,292 g). A solução foi arrefecida a -15°C e adicionaram-se 0,613 g de HOBT, 0,554 ml de DTEA e 0,772 g de

EDC. Após se ter agitado durante duas horas, deixou-se aquecer a mistura até à temperatura ambiente. Após 18 horas (durante a noite) a mistura reaccional foi trabalhada. O CHgClg foi evaporado e o resíduo dissolvido em 200 ml de acetato de etilo. A solução foi lavada com HCl IN, NaOH IN, solução saturada de NaCl

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-22e água (as lavagens foram repetidas três vezes e cada lavagem foi de cerca de 100 ml). A camada orgânica foi seca sobre MgSO4 e evaporada. BOC-Asp-(β-ΟΒζ)-Sub-Lis~(f~Z)-COOBz 1,9 g (rendimento 73%). este péptido é usado sem qualquer purificação posterior.

C . Síntese de BOC-Glu-()f-OBz )-Asp-(β-ΟΒζ )-Sub-Li s-( Ε-Z ) . COOBz . :

Dissolveu-se 1,8 g de BOC-(β-ΟΒζ)-Asp-Sub- (f-Z)-Lis-COOBz em 15 ml de HCl 4N-dioxano. Após quinze minutos o solvente foi removido e o resíduo foi lavado com éter e foi seco. 0 sal cloridrato foi dissolvido em 15 ml de N-metiIpirrolidona (NMP). A solução é arrefecida até -15”C e foram adicionados 4 mM (1,388 g) de BOC-Glu-^T-OBz), 0,204 ml de DTEA, 0,772 g de EDC e 0,612 g de HOBT. Agitou-se a mistura durante a noite enquanto aquecia, gradua1 mente, até à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi adicionada a um balão contendo um litro de uma solução gelada de 10% N32CO3 em NaCl saturado. Os precipitados foram filtrados, lavados com água e secos sob vácuo. Obteve-se BOC-(Tf-OBz )-Gl u-{ βΟΒζ )-Asp-Sub-( f-Z )-Li s-COOBz (1,3 g) e foi usado sem qualquer purificação posterior. Rendimento: 68%.

a t é. 0.105

D. Si ntese de pGlu-(X-OBz)-Glu~(β-ΟΒζ)-Asp-Sub-(f-Z)Lis-COOBz.:

Dissolveu-se 1,2 g de BOC- (tf -OBz )-Gl u-( β-ΟΒζ )-Asp-Sub- ( T-Z ) -Lis-COOBz em 15 ml de HCl 4N-dioxano. Após quinze minutos, o solvente foi removido e o resíduo lavado com éter e seco. O sal cloridrato foi dissolvido em 15 ml de NMP. A solução é arrefecida 1 5°C e adicionaram-se 4 mM (0,516 g) de piro-Glu( p-G1 u ) , m 1 DTEA, 0,772 g EDC e 0,612 g de HOBT. Agitou-se a mistura duranl.e a noite enquanto aquecia, gradualmente, até â temperatura ambiente. A mistura reaccional foi adicionada a um balão contendo uin litro de uma solução gelada de 10% Na^COg em NaCl saturado. Os precipitados foram filtrados, lavados com água e secos sob vácuo. Obteve se pGlu(£-OBz)-Glu-(β-ΟΒζ)-Asp-Sub-(£-7)-Li s-COOBz (0,830 g) e foi usado sem qualquer purificação posterior. Rendimento:

69%.

E. Sintese de pGlu-Glu-Asp-Sub-Lis-COOH:

Desprotegeu-se pGlu-(γ-ΟΒζ)-Glu-(β-ΟΒζ)-Asp-Sub-(f-Z)-LisCOOBz (0,200 g), usando 5 ml HF/1,5 ml anisole a 0°C. O HE é

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•D removido e o péptido sofre partição entre éter e ácido acético 0,1 N. A camada aquosa é lavada e liofilizada. Obtém-se 0,089 g de pGlu-Glu-Asp-Sub-Lis-COOH. São purificados vinte mg deste péptido numa coluna preparativa C-18 Vyadec, usando condição isocrática (10% acetonitrilo, 90% água e 0,1% de ácido trifluoroacético, caudal 5,6 ml/minuto). FAB MASS: M+H - 1171,4.

Análise de aminoácidos: Asp (1,0), Glu (2,19), Lis (1,01), Sub

N. D.. HPLC: Tempo de retenção numa coluna analítica C-18 Vyadec

O, 23x25 mm 7,01 minuto (caudal 1,5 ml, gradiente 0% a 80% BA = = 0,1% TFA em água e B - 0,1% TFA em acetonitrilo).

EXEMPLO 3

Preparação de (pGlu-Glu-Asp)g-Lan-(Lis)g [Lan = Lantionina(SCHgCHtNHg)COOH)]

Meio grama de t-Boc-Lis(Cl-Z)-CH2 PAM (0,63 πιΜ/g ) é carregado no vaso reaccional de um sintetizador Beckman 990. O grupo t-Boc é removido usando 40% TFA em cloreto de metileno. O sal do ácido trifluoroacético é neutralizado por 10% DIEA/CH2CI2· Dois mM de bis-BOC-lantionina são acoplados, usando 4 mM de DCC e HOBT em 15 ml de CH2CI2 e 10 ml de DMF, à temperatura ambiente. O teste de Kaiser é usado para verificar o acoplamento. Quaisquer grupos carboxilo que tenham ficado livres, são amidados usando 3 mM de H-Lis-O-Bz.HC1; e 3 mM de DCC e HOBT em 25 ml de CH₂C1₂/DMF (15/10). Após a resina de acoplamento ser lavada extensivamente com CH₂Cl2, 30% MeOH-CH₂Cl2 e CH₂Cl2 (25 ml x 3), os ciclos de desprotecção, neutralização e acoplamento são repetidos com os restantes aminoácidos do péptido alvo (Asp, Glu, pGlu). São usados quatro mM de cada aminoácido, DCC e HOBT para cada acoplamento. Cada acoplamento é verificado usando o teste de Kaiser. Após o acabamento da síntese, a resina é seca e pesada.

A resina-péptido é carregada num aparelho de clivagem e clivada usando 10 ml de ácido fluorídrico (HF) e um ml de anisole a -15°C durante duas horas. Após a remoção do HF a resina é lavada extensivamente cora éter, e o péptido é extraído com ácido acético glacial (30 ml). A maior parte do ácido acético é removido num rotavap e o resíduo diluído em água e liofilizado. Obtém-se o péptido após purificação por HPLC.

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EXEMPLO 4

Preparação de (Pro-Asp-Asp)?-Sub-(Lis)?

Carrega-se meio grama de t-BOC-Lis(Cl-Z-CHg-Pam (0,63 mM/g) no vaso reaccional de um sintetizador Beckman 990. O grupo t-BOC é removido usando 40% TFA em cloreto de metileno. 0 sal do ácido trifluoroacético é neutralizado por 10% DIEA/CH₂C1₂. Dois mM de ácido Bis-BOC-diaminosubérico são acoplados usando 4 mM de DCC . e HOBT em 15 ml de CH₂C1₂ e 10 ml de DMF à temperatura ambiente. É usado o teste de Kaiser para verificar o acoplamento. Quaisquer grupos carboxilo que tenham restado livres são amidados usando 3 mM de Η-Lis-O-Bz.HCI; e 3 mM de DCC e HOBT em 25 ml de CH₂C1₂/ /DMF (15/10). Após acoplamento, a resina é lavada extensivamente com CH₂C1₂, 30% MeOH-CH₂Cl₂ e CH₂C1₂ e CH₂C1₂ (25 mlx3). Os ciclos de desprotecção, neutralização e acoplamento são repetidos com os aminoácidos restantes no péptido alvo (Asp. Asp e Pro). São usados quatro mM do aminoácido, DCC e HOBT para cada acoplamento. Cada acoplamento é verificado usando o teste de Kaiser. Após acabamento da síntese, a resina foi seca e pesada.

A resina-péptido é carregada num aparelho de clivagem, e clivada usando 10 ml de ácido fluorídrico (HF) e um ml de anisole a -15°C durante duas horas. Após a remoção do HF, a resina é lavada extensivamente com éter e o péptido é extraído com ácido acético glacial (30 ml). A maior parte do ácido acético é removido num rotavap e o resíduo é diluído em água e liofilizado. 0 péptido é obtido após purificação por HPLC.

EXEMPLO 5

Preparação de (pGlu-Asp-Asp)y-Pim-(Lis ) ₂

Carrega-se meio grama de BOC-Lis(Cl-Z)-CH₂~PAM (0,63 mM/g) no vaso reaccional dum sintetizador Beckman 990. O grupo t-BOC é removido usando 40% TEA em cloreto de metileno. O sal do ácido trifluoroacético é neutralizado por 10% DIEA/CH₂C1₂. São acoplados 2 mM do ácido Bis-BOC-pimélico, usando 4 mM de DCC e HOBT era 15 ml de CH₂C1₂ e 10 ml de DMF à temperatura ambiente. O teste de Kaiser é usado para verificar o acoplamento. Quaisquer grupos carboxilo que tenham restado livres são amidados usando 3 mM de H-Lis-O-Bz.HCI; e 3 mM de DCC e HOBT em 25 ml de CH₂C1₂/DMF

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-25(15/10). Após o acoplamento, a resina é lavada extensivamente com Cllp-Cl?, 30% MeOH-CH j>^l 2 e CHgClg (2 5 ralx3). Os ciclos de desprotecção, ami noácidos neutralização e acoplamento são repetidos com os restantes no péptido alvo (Asp_? Asp e p-Glu). Para cada acoplamento, são usados 4 mM de aminoácido, DCC e HORT. Cada acoplamento é verificado usando o teste de Kaiser. Após o acabamento da sintese a resina é seca e pesada.

A resina — péptido carrega-se num aparelho de clivagem e é clivada usando 10 ml de ácido fluorídrico (HF) e um ml de anisole a -15°C durante duas horas. Após remoção do HF, a resina é lavada extensivamente com éter e, o péptido, é extraído com ácido acético glacial (30 ml). A maior parte do ácido acético é removido num rotavap resíduo é diluído em água liofilizado. O péptido obtém-se após purificação por HPLC.

EXEMPLO 6

Preparação de (pGlu-Glu-Asp) 2-Pi m- ( Arg-CONH2_12 Carrega-se meio grania de BOC-Tos-Arg-BHA{ 0,5 mM/g ) no vaso reaccional dum sintetizador Beckman 990. O grupo BOC é removido υsanoo

40% TFA em cloreto de metileno. O sal do áci do trifluoroacético é neutralizado por 10% DTEA/CHpG^- Acopla-se um mM de ácido Bis-BOC-piraélico, usando 2 mM de DCC e HOBT em 15 ml de C’’2C12 ^e 10 ml de DMF à temperatura ambiente. O teste de Kaiser é usado para verificar o acoplamento. Quaisquer grupos carboxilo que tenham restado livres são amidados usando 3 mM de H-biy ORz.HC1; e 3 mM de DCC e HORT em 25 ml de CHgC^/DME (15/1P). Após o acoplamento a resina é lavada extensivamente com

30% de MeOH-CH2Cl_?. e CH2CI ₂ (25 mlx3). Os ciclos

CH2^c_! 2 de desprotecção, neutralização e acoplamento são repetidos coei os aminoácidos restantes no péptido alvo (Asp, Glu e p-Glu). Para cada acoplamento são usados 3 mM do aminoácido, DCC e HOBT. Cada acoplamento é verificado usando o teste de Kaiser. Após o acabamento da síntese, a resina é seca e pesada.

A resina — péptido é carregada num aparelho de clivagem, e clivada usando 10 ml de ácido fluorídrico (HE) e um ml de anisole a -15°C durante duas horas. Após a remoção do HF, resina é

é extraído com ácido do ácido acético é diluído em água e ação por HPLC.

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26lavada extensivamente com éter e o péptido acético glacial (30 ml). A maior parte removida num rotavap e o residuo é liofilizado. O péptido é obtido após purifi

EXEMPLO 7

Síntese de análogos contendo tirosina :

(Ti r-Glu-Asp)p-Sub-( L i s ; 21 (pGlu-TÍr-Glu-Asp)2~^Sub_(Li « }? '> (pGlu-Gl u T i r-Asp ) j>-Sub- ( L i s ) 2 » (pGlu-Glu-Asp-Tir)9-Sub-( Li s)2 ·

Carregam-se dois gramas de BOC-Lis(Cl-Z)-Ο-Resina (Península Labs(^), substitu ição 0,49 mM/g) no vaso de agitação manual. Após os passos de desprotecção e neutralização, acoplam-se à resina 2 mM (808 mg) de ácido di-BOC-diaminosubérico, usando 4 mM (824 mg) de d i ciclo-hexi 1 carbodi imi da (DCC) e 4 mM (612 mg) de hidrato de 1 -hidroxibenzotriazole (HOBT) em 25 ml 50% de N-metil-2- pirrolidinona (NMP) e diclorometano (DOM). Deixou-se a reacção prossguir durante a noite, seguindo-se a adição de 10 mM (4,06 g) de Η-Li s (Z)-OBz.HCl, 10 mM (1,29 g) de di i sopropi 1 et i 1 amí na (DTEA), 10 mM (2,06 g) DCC e 10 mM (1,53 g) de HOBT. Após duas horas, os grupos amino que não reagiram foram tapados, usando 10% de anidrido acético em NMP/DCM (1:1). Aproximadamente um terço do POC-^ub-Lis-Resina foi transferido para outro vaso reaccional. A maior da resina é chamada fracção T e a fracção menor é fracção TI. Os ciclos padrão de desprotecção. izaçao e ; ;.r :opl amimto, foram usados para acoplar à resina ção TT BOC-Ti r(Br-7. ) , BOC-Asp ( OBz ) , ROO- Gl u ( ORz ) , e p-Glu.

* racç.tr eh ama d ?. ί ut r ,·. ¹ r .·.. , n a

U s a m ^roi acabamento

- cinco mM do aminoácido, de DCC e de HOBT. '•-il izado em 25 ml de NMP/DCM ( 1 /1 ) e

O aeoplaroenLo v e r i f i c o u s e o <ic'^r n usando o teste de Kaiser. Acop1 arare - se à resina da cinco mM de BOC-Asp(ORz). Um quarto do BOC-Asp-Sub Lis ri-sina restante é chamada fracção TV. desprdecção, neutralização e acoplamento •esina resultante foi transferido para outro vaso (fracção TTT).

Ciclos padrão de foram usados para acop¹ ar à resina na fracção TTT, BOC-Tir(Br-Z), BOC-Glu(ORz) e

ρ-Gl u . Foram usados cinco mM do aminoácido, DCC e HOBT. O acoplamento foi realizado em 25 ml de NMP/DCM (1/1) e, o acabamento foi verificado usando o teste de Kaiser. Acoplaram-se à resina na fracção maior (fracção IV), 5 mM de BOC 01υ(OBz). Um terço desta resina foi transferida para outro vaso e, 5 mM de p-Glo foram acoplados a esta fracção (fracção VT), resultando na sintese de pGl u-GI u-Asp-Sub-I.i s-Resi na . Acoplaram-se 5 mM de BOC Tir(Br-7.) à fracção maior (fracção V) e, a resina, foi, a seguir, dividida em metades. Metade da resina foi guardada tal como estava e, à outra metade da resina (fracção VTI), aco;;l aram-se 5 mM de p-Glu, resultando na síntese de p-Glu-Tir-Rlu-Asp-Sub-Lis-Resina. O esquema é descrito na página seguinte.

SEGUE ESQUEMA

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BOC-Sub-Li s-Resina

1/3 resina(Fr.II)_J_2/3 resina(Fr.T) mM(2,47g)BOC-Tir(Br-Z) mM(1,03)DCC 5 »M( 726mg/HOBt.

BOC-Ti r-Sub-Lis-Resina

BOC-Asp-Sub-Li s-Resina

ROC-Asp-Ti r-Sub-Li s-Resina

ROC-Glu-Asp-Tir-Sub-Lis-Resina

5mM(1,65g)BOC-G1u(OBz) 5mM(I,03)DCC 5mM(726mg)HOBt p-Glu-GIu-Asp-Ti r-Sub-Li s-Resina PKB-11624-27- e/563mg

3/4 resina(Fr.TV) | 1/4 resina(Fr.TIT)

5mM(2,47g)BOC-Ti r ( Rr-Z)

5mM(1,03)DCC 5mM(726rog)HOBt

ROC-Ti r-Asp-Sub-Li s-Resina

5mM(1,65g)BOC-G]u(OBz)

5mM(1,03)DCC 5mM(726mg)HOBt

BOC-G1u-Ti r-Asp-Sub-Lis-Resi na

6mM(1,66gJBOC-Glu(ORz) 5mM(1,03)DCC 5mM( 726mg )HOBt.

5h)W( 0,65g)p-Glu 5mM( 1 ,03 )T)CC 5mM( 726mg)HOBt.

p-Glu-Glu-T i r-Asp-Sub-Li s-Resi na PKB-11624-27~d/903mg

BOC-G]u-Asp-Sub-Li s-Resina

2/3 resina(Fr.V)

5mM(2,47g)BOC-Tir{Br-Z) 5roM(1,03)DCC 5mM(726mg)HOBt

ROC-Ti i—Glu-Asp-Sub-Li s-Resi na

1/2 resina{Fr.VTT)

ROC-Ti r-Glu-Asp-Sub-Lis-Resi na PKR-11624-27-d/301mg

1/3 resina(Fr.VT)

5mM(0,65g)p-Glu 5mM(1,03)DCC 5mM(726mg)HOBt p-Glu-Glu-Asp-Sub-Li s-Resina PKB-11624 27-d/903 mg

5mM(0,65g)p-G1u 5mM{1,03JDCC 5mN( 726mg )HORt.

pGlu-Ti r-Glu-Asp-Sub-Li s-Resina PKB-11624-27e/860mg

258 14455-CIP 1

Estas resinas-péptidos foram desprotegidas e clivadas usando HF/anisole a 0°C durante uma hora. Os péptidos em bruto (aprox. 100 mg) foram purificados numa coluna preparativa C-18 2,5 cm x 30 cm, usando água/0,1% ácido trifluoroacético (TFA) e sistema tampão acetonitrilo/O,01% TFA.

Análise de aminoácidos*

	FAB/MS (M+H)	Asp	Gl u	Sub	Lis
Tir-Glu-Asp)2-Sub-(Li s)2	1274	2,08(2)	2,4 (2)	1,08(1)	2(2)
pGlu-Tir-Glu-Asp)2-Sub-(Li s)2	1497	2,1 (2)	3,9 (4)	1,01(1)	2(2)
pGlu-Glu-Tir-Asp)2~Sub-( Lis )2	1497	2,2 (2)	3,86(4)	0,98(1)	2(2)
pGlu-Glu-Asp-Tir)2~Sub-(Lis )2	1497	2,2 (2)	4,06(4)	1,0 (2)	2(2)

w ...

número entre parêntesis indica as razões teóricas. As razões experimentais foram determinadas em relação à Lis.

EXEMPLO 8

Preparação de (pGlu-Glu-Asp)g-Prc-(Lis)g a) Síntese de bis-BOC-S,S’-1,3-propanodiileisteína:

')

Saturaram-se 3 ml de metanol com amoníaco seco, foram adicionados 0,5 g de BOC-cisteína em 0,5 ml de metanol seguido pela adição de 0,35 ml de 1,3-dibromopropano. Dez minutos mais tarde, adi ci onaraiu-se 0,5 g de BOC-cisteína em 0,5 ml de metanol, adicionais. Após 4,5 h, evaporou-se o solvente e o resíduo oleoso foi dissolvido em água. 0 pH da solução foi ajustado a 9 e a solução foi extractada com éter. A camada aquosa foi acidificada a pH 2 e extractada com acetato de etilo. A camada orgânica foi seca e evaporada para dar 1,12 g de Bis-BOC-S,S-l,3-propanodiileistei na. O aminoácido foi usado sem qualquer purificação posterior, FAB/MS M+H = 469.

b) Preparação de (pGlu-Glu-Asp)g-Prc-(Lis)2

Carregou-se Boc-Lis-Resina (0,53 g, substituição 0,63 mM/g) num agitador manual e, após os ciclos de desprotecção e neutralização, acoplou-se bi s-BOC-S,S *-1,3-propanodi ilei steina (290 mg, 0,6 mM), usando 1 mM (206 mg) de DCC e 1 mM (153 mg) de HOBt era 10 ml de NMP/DCM (1/1). Após duas horas, a resina foi lavada com NMP e DCM e adicionaram-se 2 mM (765 mg) de H-Lis(Z)ΐ 2 5 Ρ

-ι ,ι ς γ; CTP 1

- ORz , segu i do pel a adi ção Ce 1 , 5 π;Μ ( .390 mg ) de DGG e 1,5 mM ( .3,30 mg) de HORt em 4 ml de XMP/PGM (1/1). Após 18 horas, a resina foi lavada usando 30 ml de NMP e ROM. Os ciclos padrão de desprotecção e neutralização e acoplamento foram repetidos para o acoplamento de ROO-Asp(OBz), ROC-Glu(ORz) e p-Glu. Usou-se um mM do aminoácido, OCO e HOBT. O acoplamento foi feito em 5 ml de NMP/RCM (1/1). O acabamento do acoplamento foi verificado usando o teste de Kaiser. A resina — péptido resultante (41,6 mg), foi desprotegida e clivada, usando 0,5 ml de anisole e 8 ml de HF a 0”G, durante 3b. O HF foi evaporado e a mistura resina- péptido foi lavada com éter e extractada com ácido acético glacial. Após 1iofi1ízação, obtiveram-se 130 mg de péptido bruto. O péptido bruto (61,5 mg) ^oi purificado numa coluna preparativa C-18 Vydac, usando o sistema tampão acetonitri1 o-água (0,1% TFA). Obteve-se 16,5 mg de péptido puro.

FAR/MS:	M+H 1249,3
Analise	d e am i η e á c i d o s
Asp	3,0 (3)
Glu	4,38(4)
Dpc	1,14
lis	1,96(3)
EXEMPLOS 9 e 10

Seguindo o procedimento para bis-ROC-S,S’-1 ,3-propanodii1 císteina (Pre), preparou-se bi s - ROG-S, S' - 1 , 3-et. anod i i 1 ci stei na ( E+ c } p j s-BOC-S , S ’ -1 ,4 -butanod i i 1 ci ste i na ( Ruc) .

Seguindo os procedimentos dados para (pGlu-Glu-Aspg-Prc-(^T,-is)r>, prepararam-se 30 mg de ( pGl υ-Gl u- A sp ) pFtc ( L i s ) p e 17 mg do { pGl u-G1 u-Asp ) oRuc ( Li s ) o .

EXEMPLO 1 1 y p _n (pGlu· fil u - A sp ) pSub ( N-Me Arg } ?

Suspendeu-se 0,5 g (0,45 meq/g) de resina de hidroxi metilo em DC^M (5 ml), e fez-se reagir com 0,5 mM (331 mg) de BOC-MeArg, 0,5 m.M (61 mg) de dimeti1aminopiridina, e 0,5 mM (103 mg) de DCG. A resina acilada foi lavada com DCM (3x) , NMP (3x) e DGM ( 4x ) . Os grupos hidroxi que não reagiram foram tapados, usando 0,5 ml de

-31 feni1isocianato em 20 ml de DCM. A resina foi lavada rui dadosamente com DCM e NMP. O grupo ROC foi removido usando 40% T^A/DCM. Após neutralização com 10% DTFA em ΠΓΉ, acoplam-se 0,05 m^M (20,2 mg) de ROC-Sub, usando 0,125 mM (25,7 mg) de DCC e 0,125 m^M (19,1 mg) HOBt. Após 72 h, a resina foi lavada com NMP e DCM. 9s ciclos normais de desprotecção, neutralização e acoplamento, fe-Hii! '-epetidos para o acoplamento de BOS-Asp (ORz ) , BOC-Glu(ORz) c p-Glu. Usou-se um mM de aminoácido, DCC e HORT. O acoplamento foi Γ“i to em 5 rol de NMP/DCM {1/1 ). O acabamento do acopl3mento foi ver-i ficado usando o teste de Kaiser. A resultante resina-péptido (484 mg) foi desprotegida e clivada usando 0,5 ml de anisole e 10 inl de HF a 0”C, durante duas horas. O HF foi evaporado e a mistura péptido-resina foi lavada com éter e extractada com ácido acético glacial. Após 1iofi1ização, obtiveram-se 12,5 mg do péptido bruto. O péptido bruto (6 mg) foi purificado numa coluna preparativa O18 Vydac. usando o sistema tampão acetonitrilo-água (0,1% TFA). Obteve-se 2,2 mg de péptido puro .

FXFMP7.0 1 2

Ή’Ίρςρ de (pGlu-Glu-Asp)2-Sub-(Hna)ρ

Suspendeu-se 0,5 mg (0,45 roeq/g ) de resina de hidroxi metilo em DCM (5 ml) e fez-se reagir com 126 mg (0,335 mM) de ácido ) ^Λ , N·?νν 6 , N-Z-2,6-di ami no-hexi nói co (Hna), 40 mg (0,335 mg) de d 5meti1aminopiridina (DMAP), 69 mg (0,335 mM) de DCC e 50 mg (0,335 n,M) de HORT. A resina acilada foi lavada com DCM ( 3x ) , NMP (3x) c DCM (4x). Os grupos hidroxi que não reagiram foram· tapados usando 0,5 ml de fenil isocianato em 20 ml de DCM. A resina foi lavada cuidadosamente com DCM e NMP. Removeu -se o grupo BOC usaude 40% TFA/DCM. Após a neutralização com 10% DTFA em DCM, acoplou se 44 mg (0,11 mM) de ROC-Sub usando 50 mg (0,22 mM) de DCC o 33,6 mg (0,11 mM) de HOBí. Após 16 h, a resina foi lavada usando NMP e DCM. Os ciclos padrão de desprotecção e neutralização e acoplamento foram repetidos para o acoplamento de BOC Asn(ORz), ROC-Glu(OBz) e p-G1u. Usaram-se um mM do aminoácido DCC e HOBt. O acoplamento foi feito em 5 ml de NMP/DCM (1/1). O acabamento do acoplamento foi verificado usando o teste de Paise—. A resina — péptido resultante (608 mg) foi desprotegi da

25 β

14455 CTP 1

-32e clivada usando 0,6 ml de anisole e 10 ml de HF a 0ⁿC, durante 2 h. O HF foi evaporado e a mistura péptido resina foi lavada com éter· e extractada com ácido acético glacial. Após 1iofi1ização, obtiveram-se 93,7 mg do péptido bruto. O péptido bruto (20,6 mg) foi purificado numa coluna preparativa C-18 Vydac, usando o sistema tampão acetonitrilo-água (0,1% TFA). Obtiveram-se 7,5 mg do péptido puro. A análise de aminoácidos e FAB MS, confirmaram a estrutura.

FAB/MS: M+H 1163 Análise de aminoácidos

Asp	2,0	(2)
Glu	4,01	(4)
Sub	2,01	d )
Hna	1 , 44	(2)
	EXEMPLO	1 3

Sintese de ( pGl u-Gl u-Asp ) gAdp( Li s ) y>

a) Síntese do ácido Bis-BOC-2,5-(S,S)-diaminoadípico.

Sintetizou-se o ácido Bis-ROC-2,5-(S,S)-diaminoadípico usando o método de R. Nutt (J. Org. Chem. 45, 3078, 1980). A uma mistura de 240 ml de metanol e 80 ml de piridina juntaram-se 192 mg de NaOCHg e 57,56 g de BOC-Asp(OBz). Quando a solução estava homogénea, a mistura reaccional foi arrefecida a 0”C. Usando eléclrodos de platina, passou-se através da mistura reaccional ¹,5 Amps de corrente (100 volt). A temperatura da solução foi mantida entre 15°C e 25°C. 0 desaparecimento do material inicial foi seguido por TLC (clorofórmio:metanol :ácido acético/95:4:1 ) . A reacção foi parada após cinco horas. O solvente é removido num rotavap. 0 resíduo oleoso castanho foi dissolvido em 150 ml de acetato de metilo. Deixou-se a solução repousar durante 18 horas à temperatura ambiente. Os precipitados foram removidos por filtnação íí o filtrado foi evaporado. Obteve-se oester dibenzilo bruto do ácido bis-BOC-2,5-diaminosubérico (61,7 g). Carregararo- -se sessenta e um gramas do produto bruto numa coluna de sílica gel enchida em hexano. A coluna foi eluida sequencialmente com 25%

10%, 20%/e 30% de acetato de etilo ein hexano. As fracçoes foram analisadas por TLC. Juntarain-se as fracçoes contendo o produto

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desejado e o solvente foi removido num rotavap. 0 produto purificado (3,78 g) foi seco in vacuo. Dissolveram-se três gramas do éster dibenzilico em 120 mis de metanol e hidrogenou-se num aparelho Parr, usando 378 mg de 10% Pd/carvão vegetal. A hidrogenação completou-se em cinco horas. A solução foi filtrada e o filtrado foi concentrado num rotavap. O ácido bis-BOC-2,5-diaminoadípico bruto foi purificado usando cromatografia flash em sílica gel numa coluna enchida em clorofórmio. A coluna foi sequencialmente eluída com 98:2:0,1, 98:2:0,5, 95:4:1, 90:8:2, 85:10:5 e 70:20:10 clorofórmio, metanol e ácido acético. Juntaram-se as fracções contendo o produto desejado e concentraram-se num rotavap e o resíduo foi seco sob vácuo (1,07 g). A estrutura do produto foi confirmada usando dados espectroscópicos de RMN e de massa.

b) Síntese de (pGlu-Glu-Asp)₂Adp(Lis)₂

Carrega-se meio grama de BOC-Lis-(Cl-Z(-resina PAM (0,63 mM) num vaso de agitação manual. O grupo BOC é removido usando 40% de TFA em cloreto de metileno. 0 sal do ácido trifluoroacético é neutralizado por 10% DIEA/DCM. Usando 4 mM de DCC e HOBt em 15 ml de DCM e 15 ml de NMP acoplou-se 2 mM de ácido bis BOC 2,5-diaminoadípico (Adp). Quaisquer grupos carboxilo livres são amidados, usando 3 mM de H-Lis(Z)-Obz e 3 mM de DCC e HOBt em 30 ml de DCM/NMP (1/1). Após o acoplamento, a resina é lavada extensivamente com DCM, NMP. Os ciclos de desprotecção, neutralização e acoplamento, são repetidos com os restantes aminoácidos no péptido alvo (Asp, Glu e pGlu). São usados, para cada acoplamento, quatro mM de cada aminoácido, DCC e HOBt. Verifica-se o acabamento de cada acoplamento usando o teste de Kaiser. Após o acabamento da sintese a resina-péptido é carregada num aparelho de clivagem e é clivada, usando 10 ml de HF e 1 ml de anisole a -15°C, durante duas horas. Após remoção do HF a resina é lavada extensivamente com éter e o péptido é extraído em ácido acético glacial. A maior parte do ácido acético é removida num rotavap e o residuo é diluído em água e liofilizado. Obtém-se o péptido desejado após purificação por HPLC.

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Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de um composto de fórmula I:

   A-R-C-E-NH CO-D \/

   CH

   I (CH₂)_m

   I

   Yl

   I (CH₂)_x I

   I

   Y2

   I (CH₂)_n

   I

   CH z \

   A-BC-E-NH CO-D onde

   Y^ ^e V2 ^são> independentemente um do outro, CH2 ou S; x é 0, 1 , 2, 3 ou 4; m é 0, 1 ou 2;

   n é 0, 1 ou 2;

   A é ácido pirog]utâmico, prolina, glutamina, tirosina ou ácido glutâmico;

   B é ácido glutâmico, tirosina ou ácido aspártico;

   C é ácido glutâmico, tirosina ou ácido aspártico;

   D é lisina, arginina, tirosina, N-meti1arginina, ácido diamino-hexinóico ou a carboxi anii da , ou o seu derivado hidroximetilo

   E é ácido glutâmico, ácido aspártico, tirosina ou uma ligação peptídica; desde que:

   quando Yi e Y ₂ são S, x se ja 2, 3 OU 4 e in e n s e j am 1 : quando *1 e Y₂ são CH₂, x seja 0, 1 ou 2 e m e n sejam quando Vl é S e Y₂ é CH₂, x seja 0 e n seja 1; ou quando V₂ é S e Yt é ch₂, x seja 0 e m seja 1;

   ou de um seu sal, aceitável farmaceuticamente, caracterizado por compreender:

   a) o acoplamento de aroinoácidos protegidos para se formar um

   71 258. 14455-CTP 1

   -35composto protegido adequado, de fórmula:

   A-B-C-E-NH CO-[D’] \ /

   CH (CHg)_m

   I ^Yi

   I (ÇH2)x ?

   (CHg)_n

   I

   CH / \

   A-B-C-E-NH CO-[D’] onde A, B, C, E, Yj , Yg, m, x e n são definidos como anteriormente para a fórmula T e [D’] é uma resina de clorometilo, de meti1benzidrilamina,de benzidri1amina ou de feni1acetamidometilo ou D definido tal como anteriormente para a fórmula T;

   b) a remoção de quaisquer grupos protectores e caso necessário, a clivagem do péptido a partir da resina; e

   c) a formação opcional de um seu sal aceitável farmaceuticamente.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto no qual Yj e Yg são CHg.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por x ser 1 ou 2.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, por Yj ser enxofre.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, por Yj e Yg serein enxofre.

   caracteri zado :ar acter iz ad o

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A ser ácido piroglutâmico, B ser ácido glutâmico, C ser ácido aspártico, T) ser lisina e E ser uma ligação peptídica.

   71 2 58 14455-CTP 1

   por se preparar um composto q u e é 3 - Processo de acordo eow a por se preparar um composto que é 9 - Processo de acordo COtll ci por se preparar um dos compost o s c · 0 r. s i st indo em:

   {pGlu-G¹u-Asp)2 Pi ^m~(Lys)?· reivindicação 1, caracterizado ( pGl u-Gl u- Asp ) 2~Sub -(bys }? · rei vindicação 1, caracterizado escolhido do entre o grupo (Ti r-Glu- Asp)2^-Sub-(Lis)2 (pGlu-Τΐr-Glu-Asp)2^-Sub-(Li s)2 (pGlu-Glu-Tir-Asp)2~Sub-(Li s ) 2 {pGlu-Glu-Asp-Tir)2~Sub-(Li s ) 2 (pGl υ-Glu-Asp)2^-Eub-(N-MeArg)2 (pGlυ-Glu-Asp)2-Sub-(HNA)2 (pGlu-Glu-Asp)2^_Prc-(Lis)2 (pGlu-Glu-Asp)2-Etc-(Li s)2 (pGlu-Glu —A sp)2~Buc~(Li s ) 2
7. 10 - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica. caracterizado por compreender associar um composto de fórmula (T) ou um seu sal, farmaceuticamente aceitável, definido como na reivindicação 1 , com um portador aceitável f armaceut, ica-