FI120454B - Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten biologisesti aktiivisten peptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten biologisesti aktiivisten peptidien valmistamiseksi Förfarande för tillverkning av farmaceutiskt användbara biologiskt aktiva peptider 5 Tämä keksintö liittyy menetelmään uusien farmaseuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on samantyyppinen korkea biologinen vaikutus kuin tunnetulia yhdisteellä BPC, mutta joilla on lyhyemmät aminohappoketjut.

10 Keksinnön tausta

Biologisesti aktiivinen proteiini, jolla on elimiä suojaavaa vaikutusta, joka eristettiin ihmisen tai eläimen kehosta ja nimitettiin BPC:ksi (Body Protecting Compound, kehoa suojaava yhdiste) esitettiin EP-julkaisussa nro 0 432 400 ja juikais-15 tiin myös: P. Sikirit et ai, Exp.Clin. Gastroenterol,, J_, 15-26, 1991. Tällä proteiinilla on korkea molekyylipaino, noin 40 000 ± 5 000 Daltonia, ja sen rakenne on ainoastaan osittain määritetty. Tällä yhdisteellä on hyvin laaja spektri biologisia vaikutuksia, kuten: haavoja suojaava vaikutus, maksaa suojaava vaikutus, viruk-senvastainen vaikutus, turvotusta vastusta vaikutus, yleinen tulehduksenvastainen 20 vaikutus, pahanlaatuisten kasvainten vastainen vaikutus ja muita vaikutuksia. Sitä olisi käytettävä mainittujen sairauksien hoidossa, lisäksi hermostojärjestelmän häiriöiden ja sairauksien hoidossa, dopamiinista johtuvan taudin sairauksissa, kirurgiassa, suutautiopissa, hedelmällisyyden parantamisessa ja eläinlääketieteessä. Mutta tämä laaja vaikutusspektri voi luultavasti olla seurausta määrittele-25 mättömästä rakenteesta tai jopa eristetyn yhdisteen BPC riittämättömästä puhtaudesta tai homogeenisuudesta.

Keksinnön yhteenveto 30 Olemme löytäneet synteettisiä peptidejä, jotka sisältävät ainoastaan 8-15 amino-happojäännöstä ketjussaan, joiden molekyylipaino on 900-1600 Daltonia, joilla on 2 luonnollisen kehoa suojaavan yhdisteen BPC biologinen vaikutus, mutta parempi selektiivisyys. Uusia peptidejämme voidaan tuottaa taloudellisemmin, ja vähemmillä sivureaktioilla, koska ne sisältävät vähemmän aminohappojäännöksiä kuin BPC.

5

Keksinnön kuvaus Tämän keksinnön erään näkökulman mukaisesti aikaansaadaan menetelmä synteettisten peptidien valinistamiseksi, joilla on yllättävän korkea biologinen vaiku-10 tus, varsinkin kehonsuojausmielessä. Joka tapauksessa nämä synteettiset yhdisteet, joilla on hyvin määritelty rakenne, ovat hyvin edullisia verrattuna ainoastaan osittain määriteltyyn suurimolekyyliseen proteiiniin BPC, joka on saatavissa ainoastaan vaikealla menetelmällä epäselvistä luonnollisista lähteistä.

15 Erityisemmin keksinnönmukaisessa menetelmässä valmistetaan uuteen luokkaan kuuluvia biologisesti hyvin aktiivisia peptidejä, käsittäen 8-15 aminohappojään-nöstä, joilla on seuraava pcrusrakennckaava, jossa käytetään kolmen kirjaimen aminohappokoodia, ja numerot jokaisen aminohappojäännöksen alapuolella viit-taavat jäännöksen asemaan peptidiketjussa: 20 Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 jossa yksi tai useampi aminohappojäännös on substituoitu, Substituentit Xaa, Yaa ja Zaa, joita voidaan käyttää, on esitetty seuraavassa taulukossa 1.

25

Taulukko 1 Jäännös Substituentti

Xaa neutraali alifaattinen aminohappo: Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Vai, Nle, Nva

Yaa emäksinen aminohappo: Lys, Arg, Orn, His Zaa hapan aminohappo: Glu, Asp, Aad, Apm 3

Edullisia peptidejä ovat seiiraavat:

Tunnistussekvenssi nro 1

Len Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Vai 51 5 10 15

Tunnistus sekvenssi nro 2

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Vai 1 5 10 15 10

Tunnistussekvenssi nro 3

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Vai 1 5 10 15 15 Erään toisen näkökulman mukaisesti valmistetaan analogisia peptidejä amidi- tai karboksipäätteiscssä muodossa C-päätteessä, joiden perusrakennekaava on edellä kuvattu ja molekyylipaino on alueella 900 - 1 600 Daltonia, jolloin ainakin yksi ja enintään seitsemän alueella 1 - 15 olevista aminohappotähteistä voidaan jättää pois, edellyttäen, että peptidi ei ole 20 ’’Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Gly-Leu-Val”.

Edullisia peptidejä ovat seuraavat:

Tunnistussekvenssi nro 4 25 Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Vai 15 10 14

Tunnistussekvenssi nro 5

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Vai 30 1 5 10 14 4

Tunnistussekvenssi nro 6 Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala 1 5 8 5 Tunnistussekvenssi nro 7

Asp Pro Pro Pro lie Arg Pro Ala Asp 1 5 9

Tunnistussekvenssi nro 8 10 Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp 1 5 9

Vielä erään näkökulman mukaisesti valmistetaan vastaavia syklisiä peptidejä, joivssa on uusi CO-N.H sidos ensimmäisen ja viimeisen aminohappojäännöksen 15 välillä molekyylissä. Edullisia peptidejä ovat seuraavat:

Tunnistussekvenssi nro 9

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Vai 25 10 13 20

Tunnistussekvenssi nro 10 Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp 2 5 9 25

Niinpä esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten biologisesti aktiivisten peptidien valmistamiseksi, jotka peptidit koostuvat 8-15 aminohappotähteestä ja esitetään seuraavalla yleisellä kaavalla:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 30 1 5 10 15 jossa: 5

Xaa tarkoittaa neutraalia alifaattista aminohappotähdettä, kuten Ala, bAla, Leu, lie, Gly, Vai, Nle, Nva

Yaa tarkoittaa emäksistä aminohappotähdettä, kuten Lys, Arg, Orn, H is 5 Zaa tarkoittaa hapanta aminohappotähdettä, kuten Glu, Asp, Aad tai Apin; joista ainakin yksi tähteistä Xaa tai Zaa voidaan jättää pois, tai valmistettaessa peptidejä, joiden molekyylipaino on alueella 900 - 1 600 Daltonia, ainakin yksi ja enintään seitsemän alueella 1 - 15 olevista aminohappotähteistä voidaan jättää 10 pois, edellyttäen, että peptidi ei ole ’Oly-Glu-PiO-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Gly-Leu-Val” ja vastaavien syklisten peptidien valmistamiseksi, joissa on CÖ-NH-sidos ensimmäisen ja viimeisen aminohappotähteen välillä, 15 tunnettu siitä, että peptidejä syntetisoidaan käyttämällä suojattujen aminohappojen vaihe vaiheelta -kondensaatiota homogeenisessa nestejärjestelmässä tai käyttämällä kiinteä faasi -20 menetelmää; sellaisten syklisten peptidien valmistamiseksi, joissa on CO-NH-sidos ensimmäisen ja viimeisen aminohappotähteen välillä molekyylissä, valmistetaan osittain suojattuja, halutun pituisia lineaarisia peptidejä, joissa on alkyyliesteriryhmä C-25 päätteessä, joka muunnetaan atsidiksi ja sen jälkeen kytketään ja suoja poistetaan; tai vaihtoehtoisesti osittain suojattuja lineaarisia peptidejä, joilla on vapaita pääte-ryhmiä, syklisoidaan difenyylifosforyyliatsidilia hyvin laimeassa liuoksessa.

30 6

Hakijat ovat havainneet, että käyttämällä edellä kuvattuja peptidejä, näillä peptideillä on biologinen vaikutus, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin kantaproteiinil-la BPC.

5 Kuvattujen peptidien farmakologinen tutkimus on tehty erilaisilla tavallisilla malleilla "in vitro" ja "in vivo" ja seuraavat farmakologiset ominaisuudet havaittiin: 1. Pakkokeinoisella rasituksella aiheutettu vatsahaava 10 Albino Wistar (uros-) rottia (180-200 g), on käytetty kokeissa. Kaikki eläimet on immobilisoitu selkäasentoon 48 tunniksi huoneenlämmössä. Välittömästi sen jälkeen ne tapettiin ja vammat mitattiin. Tunnistussekvenssien numeroiden 4, 6 ja 2 mukaisia peptidejä syötettiin annoksella 10 pg tai 10 ng/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti tai vatsaan yksi tunti ennen vahingollista menetelmää.

15

Sekä vatsan sisäiset että vatsaontelon sisäiset syötöt, jopa näin pieninä annoksina kuin 10 ng/kg b.w., olivat vahvasti suojaavia.

2. Haavan kvstamiini (= 2-aminoetaanitiolO -malli 20

Albino Wistar (naaras) rottia (180-200 g), on käytetty kokeissa. Kystamiinihydro-kloridia (= 2-aminoetaanitiolin hydrokloridia) (liuotettu tislattuun veteen) annoksena 400 mg/kg ruumiinpainoa, ihonalaisesti on syötetty. 24 tuntia myöhemmin eläimet tapettiin. Tunnistussekvenssin numero 4 mukaisia peptidejä on syötetty 25 annoksella 1,0 pg, 100 ng ja 50 ng/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti tai vatsaan. On saatu vahva ja annoksesta riippuvat suojaus. Sama vaikutus on havaittu sekä vatsaontelon että vatsan sisäisellä annosteliireitillä.

7 3. Tärpätillä aikaansaatu posken turvotus

Eläimet; Wistar urosrottia (180-240 g), N=10 jokaisessa ryhmässä. Tärpättiä annettiin limakalvon sisäisesti 0,02 ml/rotta. Vertailu; 0,9 % suolaliuosta limakalvon 5 sisäisesti (0,02 ml/rotta, 2 x), Tunnistussekvenssicn numerot 2 ja 4 mukaisia peptidejä annettiin annoksina .10 pg ja 30 ng/kg, vatsaontelon-ja vatsansisäisesti tunti ennen tärpättiä. Poskiturvotukset mitattiin 24 tuntia turvotuksen aikaansaamisen jälkeen. Statistinen analyysi; Mann-Whitney testi. Tutkitut peptidit olivat tehokkaita annoksella 10 pg/kg ruumiinpainoa.

10 4, Kirurgia: ihon avaamisen vaikutus

Uros Albino-rottia (10 jokaisessa kokeessa, 200-250 g ruumiinpainoiltaan) on käytetty kokeissa. Rottia, joilla oli ihohaavat, on yksitellen pidetty eri häkeissä. 15 Jokaiseen eläimeen asetettiin lievässä eetterinukutuksessa selän ihoon 3 cm:n leikkaukset ihon läpi 1,5 cm keskilinjan molemmille puolille. Yksi haava liitettiin sitten yhteen kahdella kirurgisella pidikkeellä ja toinen jätettiin käsittelemättä. Tunnistussekvenssin numero 4 mukaista peptidiä liuotettuna suolaliuokseen annoksina 1,0 pg ja 1,0 ng/kg ruumiinpainoa, tai suolaliuosta 0,5 ml/kg ruumiin-20 painoa vertailussa, annosteltiin ihonsisäisesti haavojen väliin välittömästi vamman jälkeen,

Tutkitun peptidin huomattava parantava vaikutus on ollut ilmeinen molemmissa haavoissa, joissa oli kirurgiset pidikkeet, kuten myös niissä, jotka jätettiin ilman 25 kirurgista käsittelyä. Viiden päivän jälkeen käsitellyssä ryhmässä oli pieni määrä tulehtuneita soluja ja niissä oli merkittävästi paremmin kehittyneitä verkkokuituja kuin vertailuryhmässä.

8 5. Vaikutus koepalovammoihin

Albino-urosrottia, Wistar-kanta (N = 10, 200-250 g ruumiinpaino) on käytetty kokeessa. Lievässä eetterinukutuksessa nenän limakalvo on altistettu hehkuvalle 5 polttimelle viiden sekunnin ajan. Tunnistussekvenssin numero 4 mukaista peptidiä käytettiin annoksena I0pg/kg ruumiinpainoa, vatsaontelon sisäisesti yksi tunti ennen vamman aikaansaamista. Vertailu: 5,0 ml/kg mumiinpainoa suolaliuosta vatsaontelon sisäisesti. Annostelu aiheutti tavallisesti kuonon huomattavaa turpoamista, mikä järjestään on johtanut kohtalokkaisiin seurauksiin vertailueläimille 10 (mutta ei käsitellyille eläimille!) yhdeksässä päivässä haavan aiheuttamisen jälkeen. Päinvastoin kuin vertailueläinvillä, havaittiin ainoastaan hyvin kohtuullista kuonon vamman jälkeistä turpoamista, Sen jälkeen normaali nenän kautta hengittäminen heikentyi ainoastaan lievästi ja pysyi häiriintymättömänä.

6. Vaikutus luunmurtumisen paranemiseen 15

Wistar-kannan Albino-urosrottia (270-300 g ruumiinpainoltaan) käytettiin kokeissa. Vasempaan sääriluuhun tehtiin murtuma manuaalisesti luun keskiosaan eetterinukutuksessa. Mitään immobilisointia ei käytetty ja eläimet saivat liikkua vapaasti häkeissä. Eläimet tapettiin 5., 8., 12. ja 30. päivänä vamman aiheuttamisen 20 jälkeen.

Tunnistussekvenssin numero 4 mukaista peptidiä annettiin annoksena 10,0 pg/kg ruumiinpainoa, vatsaontelon sisäisesti tuntia ennen vammaa ja sen jälkeen kerran päivittäin (viimeinen annostelu 24 tuntia ennen tappamista). Vertailuryhmä sai 25 samanaikaisesti yhtä suuren määrän suolaliuosta (0,9 %, 5,0 ml/kg ruumiinpainoa, vatsaontelon sisäisesti). Huomattiin merkittävästi nopeampi paraneminen kaikkien peptidillä käsiteltyjen eläimien yhteydessä kullakin tutkitulla aikavälillä. Huomattakoon, että kaikilla käsitellyillä eläimillä oli merkittävästi vähemmän paikallisia vamman jälkeisiä mustelmia kuin vertailueläimillä ja ne parantuivat vammautu-30 neesta toiminnasta paljon nopeammin.

9 7. Viruksen vastainen vaikutus

Viruksen vastainen vaikutus tutkittiin vastasyntyneillä hiirillä, BALB-C-kanta, 24 tunnin ikäisiä, molempia sukupuolia.

5 ARBO-virukset: TBE (= Tick Borne Encephalitis), Bhania, Dengue 1,2,3,4, Sin-bis, West-Mile, Calovo, Hepatitis A, LMC (Limphatic choriomeningitis) ja Herpes-tyyppiä 1 on annosteltu viruksen suspensiona laimennuksessa ΙΟ'2 (0,02 ml/hiiri), valmistettu yleisesti hyväksyttävällä tavalla ja ruiskutettu aivojen-10 sisäisesti (tai suun kautta, Hepatitis A). Elinvoimaisuuscrojen takia annoksia säädettiin niin, että ne olivat verrattavissa suhteen LD]0o 0,02 mkssa aivojensisäisesti (tai suun kautta, Hepatitis A) rokotetta 102 laimennuksessa. Tällä tavalla pystyimme vertailemaan erilaisten virustartuntojen kulkua, huolimatta mahdollisesti eri viruskonsentraatioiden rokottamisesta.

15

Tunnistussekvenssin numero 4 mukaista peptidiä käytettiin konsentraatiossa 20.0 pg/ml 0,9 % suolaliuoksessa ja annosteltiin ainoastaan kerran annoksella 2.0 pg/kg ruumiinpainoa, aivojensisäisesti tai vatsaontelonsisäisesti: 20 a) 2 tuntia ennen viruksen annostelemista (-2h) b) samanaikaisesti tartunnan kanssa (0).

Vertailu: sama tilavuus suolaliuosta aivojensisäisesti tai vatsaontelonsisäisesti. Tuloksista on tehty yhteenveto taulukkoon II: 25 numerot taulukossa osoittavat aikaa (päiviä), kunnes kaikki virustartunnan saaneet hiiret peptidillä tai suolaliuoksella (vertailu) käsitellyissä ryhmissä kuolivat.

10 Käsittely

Virusinfektiot suolaliuos Synteettinen fragmentti 4

-2hx I 0X -2hx 1........ 0X

i.p. i.c. i.p. i.c. i.p. i.c. i.p. i.c.

TBE a__5 5 5 5 n,d. n.d. 20 20

Bhania a 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Dengue la 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Dengue 2 a 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Dengue 3 a 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Dengue 4 a 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Sinbis a 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

WestNile a__5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Calovo a 5 5 5 5 n.d. n.d. 15 15

Hepatiitti Ä! 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20 LCM_ 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Herpes tyyppi 1 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Ei yhtään 5 5 5 5 n.d. n.d. 20 20

Terveet n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

i.p. = vatsaontelon sisäisesti i.c. = aivojensisäisesti n.d. = ei määritelty: eläimiä on tarkkailtu 40 päivää viruksien annostelun jälkeen.

5 Kuolemia ci havaittu, a ARBO-viruksia + virusten annostelu suun kautta x eläimiä käsiteltiin 2 tuntia ennen virusten annostelemista (-2h) tai samanaikaisesti virusten annostelun aikana (0) 10 o suolaliuosta kohtaan p<0,001; 8 hiirtä jokaisessa ryhmässä.

π 8. Masennuksen vastainen vaikutus

Masennuksen vastaisen vaikutuksen havaitsemiseksi käytettiin pakotettua pyor-tymistcstiä julkaisussa Porsolt et ai, Eur.J.Pharmacol., 47, 379-391, (1978) esite-5 tyn mukaisesti.

Wistar-urosrottia (180-240 g ruumiinpainoltaan) käytettiin tähän kokeeseen. Tun-nistussekvenssin numero 4 mukaista tutkittua peptidiä annettiin ensimmäisenä päivänä esitestin aikana ja toisena päivänä tuntia ennen koetta (vatsaontelon sisäi-10 sesti).

Vertailuryhmä: suolaliuosta vatsaontelon sisäisesti.

Eläimiä tarkkailtiin viisi minuuttia. Liikkumattomuusaika mitattiin (Tj).

15

Tj vertailuryhmässä oli noin 150 sekuntia, peptidillä käsitellyssä ryhmässä ainoastaan 60-70 sekuntia. Tämä vaikutus oli pitkäkestoista: 16 päivän jälkeen sitä oli yhä läsnä, 20 An no s-vaste: 10 μ - 10 ng/kg: täysi vaikutus 10 pg/kg; yhä vaikutusta 1 pg/kg: vaikutus häviämässä, 9. Vaikutus Parkinsonin taudin malliin 25

Tutkimukseen käytettiin hyvin tunnettuja Parkinsonin taudin malleja (Karakola S, et ai, Pharmacol. Toxicol., 67, 95-100, 1990): reserpinemalli ja MPTP-malli.

NMRl-Hannover uroshiiriä (MPTP-mallissa) tai molempia sukupuolia hiiriä (re-30 serpine-mallissa) käytettiin.

12 a) MPTPitä annosteltiin annoksella 30,0 mg/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti päivittäin kuutena seuraavana päivänä ja sitten seuraavina neljänä päivänä korkeammalla annoksella 50 mg/kg ruumiinpainoa. Tunnistussekvenssin numero 4 mukaista tutkittua peptidiä annosteltiin annoksella 1,5 pg ja 15,0 ng/kg ruumiin- 5 painoa vatsaontelon sisäisesti ennen kutakin MPTP:n annostelua tai 15 minuuttia jokaisen MPTP-annostelun jälkeen.

b) Reserpiiniä annosteltiin annoksella 5 mg/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti. Tutkittua peptidiä annosteltiin 10 pg tai 10 ng/kg ruumiinpainoa vatsaontelo lon sisäisesti 15 minuuttia ennen reserpiiniä tai 24 tuntia reserpiinin annostelun jälkeen samana annoksena.

Vertailut: yhtä suuri tilavuus suolaliuosta, 5 ml/kg ruumiinpainoa vastaontelon sisäisesti.

15

Havaittiin merkittävää lihasheikkouden, jäykkyyden (katalepsia) ja vapinan vähenemistä, kun oli esikäsitelty peptidillä.

Esikäsittely MPTP-mallissa tällä peptidillä vahvasti poisti katalepsian kehittymi-20 sen ja vähensi liikkumattomuutta ja vapinaa.

Jälkikäsittely (15 minuutin jälkeen) vahvasti ehkäisi MPTP-katalepsian lisäkehit-tymistä ja merkittävästi vähensi aivosyntyistä liikkumattomuutta ja vapinaa. Tavallisesti havaittu korkea kuolleisuus (50 %), ainoastaan yhden MPTP-annostelun 25 jälkeen oli vähentynyt peptidi-esikäsitellyissä kuten myös -jälkikäsitellyissä eläimissä.

10, Pentidiannostelun vaikutus verenvuotoshokkiin 30 Wistar-kannan aikuisia Albino naarasrottia (150-180 g) käytettiin kaikissa kokeissa.

13

Vaikutuksia verenvuotoshokkiin tutkittiin kahdessa koesarjassa.

a) Eläimet vuosivat verta (1 ml yli kolme minuuttia, 2 minuutissa loput) kuolemaan asti. Poistettua veren tilavuutta, joka tuotti kuoleman, tutkittiin tunnistusse- 5 kvenssin numero 4 peptidillä (10,0 pg tai I0ng/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti) tai suolaliuoksella (5,0 ml/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti) esikäsitellyissä (15 minuuttia ennen verenvuotoa) eläimissä. Merkittävästi korkeampi kuolettava verimäärän menettäminen verrattuna vertailuarvoihin havaittiin johdonmukaisesti siinä ryhmässä, jota oli käsitelty korkeammalla peptidien an-10 noksella.

b) Verenpainetta on alennettu kontrolloidulla verimäärän poistolla ja sen jälkeen pidetty arvossa 30-35 mm Hg viiden tunnin ajan, 15 Sitten tunnistussekvenssin numero 4 peptidiä (10,0 pg tai 10,0 ng/kg ruumiinpainoa) tai suolaliuosta (3,0 ml/kg ruumiinpainoa) lisättiin suonensisäisesti. Päinvastoin kuin vertailuryhmissä, verenpainearvot huomattavasti nousivat ja pysyivät eikä minkäänlaista kuolemaa havaittu peptidillä käsitellyissä eläimissä, 20 Siksi vaikuttaa siltä, että tutkittu peptidi on hyvin vaikuttava parantamaan veren menettämisen seurauksia.

11. Vaikutus kuolettavaan säteilyyn 25 NMRl-Hannover-hiiriä, 5-6 viikon ikäistä, molempia sukupuolia (18-22 g ruumiinpainoltaan) käytettiin kokeissa. Tunnistussekvenssin numero 4 mukaista synteettistä peptidiä annosteltiin 20 pg/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti) tunti ennen säteilyä tai sen jälkeen. Vertailueläimet saivat samanaikaisesti yhtä suuren määrän 0,9% suolaliuosta vatsaontelon sisäisesti (5,0 ml/kg). Naiiveja terveitä 30 eläimiä pidettiin tavallisissa olosuhteissa, niille ei annettu lääkkeitä eikä säteilyä ja niitä pidettiin terveinä vertailuina.

14 Säteily: Teatron® 80 (Co 60, 2200 Ci). Nukuttamattomiin hiiriin häkeissä, 16 hiirtä per ryhmä, kohdistettiin koko keholle säteilyä yli kuolettavan annoksen 9 Gy säteilyalueella 20 x 20 cm, etäisyys 80 cm.

5 Kuolemia havaittiin kaksi kertaa päivittäin. 30 päivän ajan.

Kaikki vertailueläimet kuolivat 7-12 päivässä (LD100/12).

Mitään kuolemaa ei havaittu terveissä (ei. säteilytetyissä) vertailueläimissä.

.10

Suhteessa vertailutietoihin mitään eroa ei. havaittu niiden ryhmien välillä, joita oli käsitelty peptidillä tunti säteilyn jälkeen. On kuitenkin havaittu merkittävä eloon-jäänti, kun yhdistettä on annosteltu tunti ennen säteilyä.

15 70 % lisäys I.Dioo-arvoon suhteessa vertailuun voitiin havaita.

12. Vaikutus aikaansaatuun enämuodostumisecn NMRI-Hannover naarashiiriä, kahden viikon ikäisiä, 25 g ruumiinpainoltaan, 20 mutta jotka eivät aikaisemmin olleet paritelleet, käytettiin kaikissa kokeissa. Naa-rashiirten, joilla oli kiima-aika, annettiin paritella yön yli hyvin kokeneiden uroshiirien kanssa. Hiiret tapettiin 20 päivän tiineyden jälkeen.

A-vitamiinia lisättiin annoksella 15700 U/kg ruumiinpainoa, lihaksensisäisesti, 25 kymmenentenä tiineyspäivänä (0,05 ml/lg ruumiinpainoa). Tunnistussekvenssien numero 4 mukaista peptidiä annettiin samanaikaisesti 10 pg tai 10 ng/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti.

Vertailu: suolaliuosta 5,0 ml/kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti.

30 Eläimiä, joita ei käsitelty A-vitamiinilla, saivat samaan aikaan vatsaonteloon suolaliuosta tai peptidiä 4 samana annoksena ja nämä olivat terveitä vertailuja.

15

Mitään epämuodostumia ei havaittu terveissä (suolaliuos) tai peptidillä käsitellyssä ryhmässä.

Tuloksista on yhteenveto taulukossa 111, ja ne osoittavat yllättäen annoksesta riip-5 puvaa tutkitun peptidin suojavaikutusta A-vitamiinilla aikaansaatuja epämuodostumia vastaan.

Taulukko III. Makroskooppinen tutkimus Käsittely Kokonaismäärä Määrä epämuodostuneita sikiöitä sikiöitä vertailuryhmä (suolaliuos) 55 0 A-vitamiini 54 36 A-vitamiini + peptidi 4 10 ng/kg 36 13 A-vitamiini + peptidi 4 10 p,g/kg 18 1 10 13. Akuutti myrkyllisyys

Synteettisten peptidien akuutti myrkyllisyys määriteltiin naarashiirissä (paino noin 20 g). Kuuden eläimen ryhmiä käytettiin jokaiseen kokeeseen ja vertailuun.

15 Tunnistussekvenssien numerot 2, 3 ja 6 mukaisia peptidejä lisättiin annoksina 8, 25 ja 50 mg/kg ruumiinpainoa suonensisäisesti. Vertailuryhmää käsiteltiin suolaliuoksella (0,9 %, 5,0 ml/kg ruumiinpainoa). Eläimiä tarkkailtiin myrkyllisyys-merkkejä ajatellen seuraavat 15 päivää.

20 Lisätyillä annoksilla ei havaittu mitään osoitusta myrkyllisyydestä tai kuolemasta. Mielenkiintoinen ilmiö oli, että havaittiin merkittävästi enemmän liikkuvuutta ja vilkkautta kahden tunnin aikana peptidien lisäyksen jälkeen.

Farmakologisten tutkimusten tulosten mukaan näillä peptideillä on vaikutusta 25 siinä mielessä, että ne suojaavat elimistöä kuormitusta ja sairauksia vastaan yleensä normalisoiden orgaaniset funktiot.

16

Niiden käyttö olisi siten myös tehokas useiden ihmisissä tai eläimissä esiintyvien tautien tai häiriöiden ennaltaehkäisyyn tai hoitoon. Erityisemmin näitä yhdisteitä käytetään scuraavien sairauksien käsittelyyn tai suojaan tai ennaltaehkäisyyn: - rasituksen aiheuttamat taudit ja sairaudet, 5 - erilaisten syiden aiheuttamat vatsahaavat, - erilaisten syiden aiheuttamat tulehdukset ja turvotukset, - tapaturmat, palovammat, luunmurtumat ja muut kirurgiset vammat, - virustartunnat, - shokki, 10 - Parkinsonin tauti, - säteilyvammat, - epämuodostumat.

Yleisesti kuvattuja peptidejä voidaan myös käyttää hyvin erilaissa farmaseuttisissa 15 koostumuksissa yhdessä ei-myrkyllisen farmaseuttisen kantajan tai kuljetusaineen kanssa, kuten täyteaineen, ei-myrkyllisen puskuriaineen tai fysiologisen suolaliuoksen kanssa. Näitä farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää paikallisesti tai systemaattisesti ja niitä voidaan käyttää missä vain hyväksytyssä muodossa kuten nesteenä, kiinteänä aineena, puolikiinteänä aineena, ruiskutettavana liuoksena, 20 tablettina, voiteena, huuhtelunesteenä, kapselina, suutabletteina tai vastaavina.

Näitä peptidejä annostellaan yleensä annoksena 10" -10’ mg/kg ruumiinpainoa, kun niitä annostellaan systeemisesti. Kun niitä annostellaan, paikallisesti, niitä käytetään korkeammissa konsentraatioissa, esim. 0,1 - 0,5 %.

25

Hyvin suotavaa on, että myrkyllisyysoireita ei olisi lainkaan annoksiin 50 mg/kg ruumiinpainoa asti ja hyvä yhdisteiden vaikutus suun kautta tapahtuvalla annoksella (vatsansisäisesti).

30 Tässä kuvattuja peptidejä voidaan syntetisoida käyttämällä suojattujen aminohappojen vaihe vaiheelta -kondensaatiota homogeenisessa nestejärjestelmässä tai 17 edullisesti käyttämällä kiinteä faasi -menetelmää. Syklisten peptidien valmistamiseksi, jotka ovat osittain suojattuja halutun pituisia lineaarisia peptidejä valmistetaan alkyyliesteriryhmällä C-päätteessä, joka muutetaan atsidiksi ja sen jälkeen kytketään ja suoja poistetaan. Vaihtoehtoisesti osittain suojattuja lineaarisia pepti-5 dejä, joilla on vapaita pääteryhmiä, voidaan syklisoida difenyylifosforyyliatsidilla hyvin laimeassa liuoksessa.

Keksintöä kuvataan nyt seuraaviin esimerkkeihin nähden, joiden kuitenkaan ei ole tarkoitettu rajoittavan esillä olevan keksinnön piiriä.

10

Esimerkki 1

Peptidisynteesi käyttämällä Boc-strategiaa 15 PeptidivSynteesi suoritettiin lähtien 100 mg:sta Boc-Val-PAM-hartsia C-päättcisen karboksipeptidin tuottamiseksi (PAM, joka on saatu yhtiöstä Applied Biosystems, substituointiaste 0,56 meg/g, aminopolystyreenin amino-asyyli-4-(oksimetyyli)-fenyylietikkahappojohdannainen). Boc-aminohappoja (Boc = tert.-butoksikarbo-nyyli-) kondensoitiin peräkkäin polymecr [kantajalla käyttämällä di-isopropyyli-20 karbodi-imidiä (DIPC) kondensointireagenssina, Jokaisessa vaiheessa Boc-ryhmä poistettiin 50 %: 1 la difluorietikkahapon (TFA) liuoksella dikloorimetaanissa. Aminoryhmä deprotonisoitiin sitten di-isopropyylietyyliamiinilla.

Jokaisen vaiheen konversion pitäisi olla suurempi kuin 99,5 %. Jos se ei ollut, 25 kondensointi toistettiin. Täydellisen synteesin jälkeen pilkkominen suoritettiin käyttämällä matalaa HF-meneteimää (2 tuntia lämpötilassa 0°C). Karboniumionin sieppaajana käytettiin anisolia. HF haihdutettiin typpivirralla. Raakapeptidi saatiin sitten kaatamalla öljyinen jäännös kuivaan eetteriin.

30 Sitten raakapeptidi puhdistettiin käänteisfaasi-PlPLCdlä käyttämällä kolonnia 5 x 150 mm, joka oli täytetty silikageelillä RP-3 8, gradienttieluointiliuotusjärjes- 18 telmällä: 0,1 % TFA vcsi/asetonitriilissä. Detektio: a 11 ravio 1 e ttiab so rp tio aallonpituudessa 225 nm.

Tunnistussekvenssin numero 4 peptidin synteesi on esitetty kuviossa 1.

5

Esimerkki 2

Peptidin synteesi käyttämällä Fmoc-strategiaa 10 Standardi Fmocdlä suojattuja aminohappoja käytettiin synteesiin (Fmoc = 9-fluo-renyylimetyylioksi-karbonyyli-). Sivuketjufunktiot suojattiin O-tcrt. butyylieste-reinä (Asp, Apm, Glu, Aad) ja Boc-johdannaisina (Lys). Ensimmäinen aminohappo sidottiin polymeeriseen kantajaBHA hartsiin (BHA = bentshydriiliaminohartsi) käyttämällä di-isopropyylikarbodi-imidiä kytkentäreagenssina. Jokaisessa vai-15 heessa Fmoc-suojaryhmä poistettiin piperidiiniilä. Sen jälkeen toinen jne. kaikki seuraavat aminohapot lisättiin käyttämällä samaa tapaa kunnes synteesi oli täydellinen. Pilkkoutuminen on tehty seoksella TFA/TFMSA/anisoli = 2 : 17 : 52 (til/til).

20 Peptidi puhdistettiin sitten, käyttämällä HPLC-menetelmää, joka on kuvattu esimerkissä 1.

Peptidin synteesi tunnistussekvenssillä numero 2 on esitetty kuviossa 2.

25 Esimerkki 3

Peptidin synteesi käyttämällä Ddz-strategiaa

Kaikkia aminohappoja käytettiin ja niiden α-aminofunktio oli suojattu Ddz:lla 30 (= a, a-dimetyyli-3,5-dimetoksibentsyylioksikarbonyyli-). Sivu funktiot suojattiin 19 Z-ryhmällä (= bentsyylioksikarbonyyli-) lysiinin tapauksessa ja O-t-Bu-ryhmällä (t-butyyliesteri) asparagiini- ja glutamiinihappojen tapauksessa.

Merrifield-kantajaa (ristisilloitettu ldoorimetyylisoidulla polystyreenigeeli) kapa-5 siteetilla 1,4 mmol/g käytettiin sitomaan ensimmäinen Ddz-aminohappo cesium-suolansa kautta. Kondensoinnin jälkeen disykloheksyylikarbodi-imidillä (DCC) poistettiin Ddz-suojaryhmä jokaisessa vaiheessa 5-%:isella TFAilla dikloorime-taanissa ja sen jälkeen pestiin ja deprotonisoitiin 10-%:isella dietyyliamiinilla di-kloorimetaanissa. Deprotonoinnin jälkeen seuraava kytkentävaihe suoritettiin 10 käyttämällä samaa menetelmää. Nämä kytkentävaiheet toistettiin kunnes peptidi-sekvenssi oli täydellinen.

Lopuksi peptidi pilkottiin polymecrikantajasta käyttämällä seosta HBr/TFA/ani-soli. Haihtuvan osan haihtumisen jälkeen juuri pilkottu peptidi saostettiin kuivasta 15 eetteristä ja kuivattiin, Raaka peptidi puhdistettiin sitten HPLC-menetelmällä kuten on kuvattu esimerkissä .1. Tunnistussekvenssin numero 6 peptidin synteesi on esitetty kuviossa 3,

Esimerkki 4 20

Syklisen peptidin synteesi

Peptidi osittain suojatussa muodossa: 25 OBzl NOa OBzi

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH

valmistettiin ensin menetelmän mukaisesti, joka on kuvattu esimerkissä 1 tai 2.

30 20 Tämän peptidin 0,0005 moiaarinen liuos dimctyyliformamidissa syklisoitiin, kun oli lisätty difenyylifosforyyliatsidia ja trietyyliamiinia lämpötilassa 20°C .12 tuntia.

5 Sitten tämä seos hydratiiin vcty/pailadium-puuhiili-katalysaattorilla lämpötilassa 25°C 8 tuntia.

Liviotin haihdutettiin huolellisesti ja raaka tuote puhdistettiin käyttämällä HPLC-meneteimää kuten on kuvattu esimerkissä 1.

10

Syklinen peptidi, jolla on tunnistussekvenssi numero 10:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp 2 5 9 15 saatiin 10 %:n saantona.

Esimerkki 5 20 .Lineaaristen ia syklisten peptidien synteesi käyttämällä Ddz-strategiaa

Samaa strategiaa Ddz-suojaryhmillä käytettiin lineaaristen ja syklisten, peptidien saamiseksi. Sivufunktiot suojattiin Z-ryhmällä (lysiini) ja O-bentsyyliesteriryh-millä - OBzl - (glutamiini-ja asparagiinihappo).

25

Polymeerinen kantaja oli HYCRAMK-hartsi (yhtiön ORPEGEN, Heidelberg, Saksa, tavaramerkki), joka on 4-bromikiOtonyyli-p-aIanyyli-amido-rnetyyli-poIysty-reeni). Ensimmäinen aminohappo (Ddz-valiini) sidottiin polymeerikantajaan ce-siumsuolansa kautta.

30 21

Sitten Ddz-ryhmä poistettiin käyttämällä trifluorietikkahappoa (5 %) dikloorime-taanissa ja aminoryhmä deprotonisoitiin di-isopropyytietyyliamunilla.

Seuraavassa vaiheessa Ddz-glysiini kytkettiin valiinijäännökseen polymeerimat-5 riisissä käyttämällä di-isopropyylikarbodi-imidiä (DIPC) 1-hydroksibentsotriatso-lin läsnäollessa.

Nämä vaiheet toistettiin kunnes peplidiketju oli täydellinen. Syntetisoitu peptidi suojatussa muodossa halkaistiin sitten huolellisesti HYCRAMK-kantajasta tetra-10 kis-(tnfenyyli-fosfiino)-palladiumilla (O) liuotettuna vedettömään tetrahydrofu-raaniin hapen poissaollessa. Lisäainetta kuten morfoliinia käytettiin akseptorimo-lekyylinä allyyliryhmille.

Polymeerikantaja suodatettiin pois ja pestiin tetrahydrofuraanilla. Peptidiliuos 15 suodatettiin sitten lyhyen silikageelikoJonnin läpi palladiumkatalysaattorin poistamiseksi.

Eluaatti, joka sisältää osittain suojatun peptidin 4a, kuivattiin liuottimen haihduttamisen jälkeen vakuumissa.

20

Tunnistussekvenssin numero 4 mukaisen, lineaarisen peptidin synteesi

Osittain suojattua peptidiä 4a liuotettiin 2,2,2-trifluorietanoliin ja hydrattiin palladium-puuhiilen läsnäollessa (10 %) vetykaasussa lämpötilassa 30°C. Katalysaatto-25 ri suodatettiin pois ja liuotin haihdutettiin vakuumissa. Raaka jäännös puhdistettiin sitten käyttämällä HPLC-menetelmää kuten on kuvattu esimerkissä 1. Peptidin puhdistamisen jälkeen saatiin tunnistussekvenssin numero 4 mukainen peptidi. Tuote oli identtinen yhdisteen kanssa, joka saatiin esimerkissä 1.

30 Tunnistussekvenssin numero 9 mukaisen syklisen peptidin synteesi 22

Osittain suojattua peptidiä 4a liuotettiin dimetyyliformamidi/dikloorimetaaniin (1:1) 0,001 mokarisen liuoksen muodostamiseksi. Syklisointia varten lisättiin DIPC:tä ja HOBt:tä ja jätettiin seisomaan lämpötilaan 20°C 30 tunniksi. Sitten liuos väkevöitiin pieneen tilavuuteen, laimennettiin 2,2,2-tri-fluorietanolilla ja 5 puhdistettiin antamalla sen kulkea kolonnin läpi, joka oli täytetty Scpha-dex LH-20:lla (= polydekstraani, yhtiön Pharmacia LKB tavaramerkki, Uppsala, Ruotsi). Fraktiot, joka sisältävät osittain suojattua syklistä peptidiä, kerättiin ja hydrattiin palladium-puuhiili (10 %) -katalysaattorilla lämpötilassa 30°C kuplitta-malla vetyä ja voimakkaasti, ravistaen 8 tuntia.

10

Sitten katalysaattori poistettiin suodattamalla ja liuos kuivattiin haihduttamalla liuotin vakuumissa. Raakapeptidiä puhdistettiin lisää HPLCdlä käyttämällä edellä esimerkissä 1 kuvattua menetelmää. Saatu puhdas syklinen peptidi identifioitiin tunnistussekvenssin numero 9 mukaiseksi peptidiksi.

15

Synteesi HYCRAMR-polymeerikantajalle käyttämällä Ddz-strategiaa ja syklisointia kuvattiin kuviossa 4 ja 5. Kaikkien syntetisoitujen peptidien puhtaus tarkistettiin HPLC-menetelmällä käyttämällä kolonnia silikageelillä RP-18 (oktadekyyli-silanisoitu), eiuoitu liuottimien seoksilla, jotka sisälsivät vettä/asetnitriiliä/trifluo-20 rietikkahappoa vähitellen tavallisella tavalla. Kaikissa tapauksissa puhtaus oli korkeampi kuin 95 %.

Peptidit karakterisoitiin aminohappoanalyysillä (arvot olivat JO %:n sisällä teoreettisesta), sekvenssianalyysillä, molekyylipaino määriteltiin massa - FAB spekt-25 rometrialla, ultra violetti- ja infrapunaspektreillä (kuviot 6 ja 7).

Koska ainoastaan keksintömme tiettyjä suoritusmuotoja on kuvattu erityisen yksityiskohtaisesti, on selvää alan ammattihenkilöille, että monia muita erityisiä suoritusmuotoja voidaan suorittaa ja monia muutoksia voidaan tehdä keksinnön hen-30 gessä ja oheisten patenttivaatimusten piirissä.

Claims (13)

23

1. Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten biologisesti aktiivisten peptidien valmistamiseksi, jotka peptidit koostuvat 8-15 aminohappotähteestä ja esitetään 5 seuraavalia yleisellä kaavalla: Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 jossa: 10 Xaa tarkoittaa neutraalia alifaattista aminohappotähdettä, kuten Ala, bAta, Leu, lie, Gly, Vai, Nle, Nva Yaa tarkoittaa emäksistä aminohappotähdettä, kuten Lys, Arg, Orn, His Zaa tarkoittaa hapanta aminohappotähdettä, kuten Glu, Asp, Aad tai Apm; 15 joista ainakin yksi tähteistä Xaa tai Zaa voidaan jättää pois, tai valmistettaessa peptidejä, joiden molekyyiipaino on alueella 900 - I 600 Daltonia, ainakin yksi ja enintään seitsemän alueella 1-15 olevista aminohappotähteistä voidaan jättää pois, edellyttäen, että peptidi ei ole 20 ’’Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Gly-Leu-Val” ja vastaavien syklisten peptidien valmistamiseksi, joissa on CO-NH-sidos ensimmäisen ja viimeisen aminohappotähteen välillä, 25 tunnettu siitä, että peptidejä syntetisoidaan käyttämällä suojattujen aminohappojen vaihe vaiheelta -kondensaatiota homogeenisessa nestejärjestelmässä tai käyttämällä kiinteä faasi -menetelmää; 30 24 sellaisten syklisten peptidien valmistamiseksi, joissa on CO-NH-sidos ensimmäisen ja viimeisen aminohappotähteen välillä molekyylissä, valmistetaan osittain suojattuja, halutun pituisia lineaarisia peptidejä, joissa on alkyyliesteriryhmä C-päättccssä, joka muunnetaan atsidiksi ja sen jälkeen kytketään ja suoja poistetaan; 5 tai vaihtoehtoisesti osittain suojattuja lineaarisia peptidejä, joilla on vapaita pääte-ryhmiä, syklisoidaan difenyylifosforyyliatsidilla hyvin laimeassa liuoksessa. 10

2, Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että molekyyli syk- iisoidaan amidisidoksella ensimmäisen ja viimeisen aminohappotähteen välillä.

3. Patenttivaatimuksen .1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tun-nistussekvenssin numero 1 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: 15 Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Vai 1 5 10 15

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tun-20 nistussekvenssin numero 2 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Vai 1 5 10 15

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tun- nistussekvenssin numero 3 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Vai. 1 5 10 15 30 25

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tun-nistussekvenssin numero 4 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Vai 51 5 10 14

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tun-nistussekvenssin numero 5 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava:

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tun-nistussekvenssin numero 6 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: 15 Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala 1 5 8

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tun-20 nistussekvenssin numero 7 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava; Asp Pro Pro Pro lie Arg Pro Ala Asp 1 5 9

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tunnistussekvenssin numero 8 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp 1 5 9 30 26

10 Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Vai 15 10 14

11. Patenttivaatimuksen I mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tunnistussekvenssin numero 9 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Vai 525 10 13

12. Patenttivaatimuksen 1. mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tunnistussekvenssin numero 10 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: 10 Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp 2 5 9

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on tunnistussekvenssin numero 11 mukainen peptidi, jolla on seuraava kaava: Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp 15 9 20 27