PL176208B1

PL176208B1 - Nowa klasa peptydów o wysokiej czynności biologicznej i środek farmaceutyczny je zawierający

Info

Publication number: PL176208B1
Application number: PL93302304A
Authority: PL
Inventors: Predrag Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stiepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Original assignee: Marko Duvnjak; Zeljko Grabarevic; Boris Mildner; Stiepan Mise; Marijan Petek; Ivo Rotkvic; Sven Seiwerth; Predrag Sikiric; Ernest Suchanek; Branko Turkovic; Ivan Udovicic
Priority date: 1992-05-30
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 1999-04-30
Also published as: NO940299L; GR3024379T3; DK0572688T3; FI120454B; CA2114313A1; HU224073B1; CZ284972B6; AU4319693A; EP0572688A1; DE69312232T2; GR3024905T3; ES2103854T3; ES2107033T3; RU2111214C1; PL302304A1; HU9400252D0; RO112506B1; CA2114313C; UA32523C2; CZ20594A3

Abstract

Nowa klasa peptydów o wysokiej czynnosci biologicznej, znamienna tym, ze zawiera od 8 do 15 reszt aminokwasów i jest przedstawiona wzorem ogólnym: Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala 1 5 10 Xaa Xaa Xaa 15 w których: Xaa oznacza reszte obojetnego amino- kwasu alifatycznego, jak Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nie, Nva Yaa oznacza reszte aminokwasu zasadowe- go, jak Lys, Arg, Orn, His Zaa oznacza reszte aminokwasu kwasowe- go, jak Glu, Asp, Aad lub Apm; i w którym co najmniej jedna i co najwyzej 7 reszt aminokwasów w regionie 1-15 moze byc opuszczona i co najmniej jedna z pozostalych reszt aminokwasowych moze byc podstawiona, zgodnie z nastepujacym schema- tem podstawienia: jako podstawnik dla Xaa obojetny aminokwas ali- fatyczny: Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva.... Fig. 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowa klasa peptydów o wysokiej czynności biologicznej oraz środek farmaceutyczny je zawierający. Peptydy te są tego samego rodzaju co znany naturalny związek BPC, lecz o krótszych od niego łańcuchach aminokwasów, posiadających wysoką czynność biologiczną.

Stan techniki

Czynne biologicznie białko, wykazujące czynność organoochronną, które zostało wyizolowane z organizmu ludzkiego lub zwierzęcego i nazwane BPC (Body Protecting Compound - Związek Chroniący Organizm), zostało ujawnione w opisie patentowym EP 0432400 a także opublikowane przez P. Sikiric i współpr. w Exp. Clin, Gastroenterol., 1, 15-26, 1991. Białko to ma wysoki ciężar cząsteczkowy wynoszący około 40000 ± 5000 Daltonów a jego struktura jest ustalona tylko częściowo. Związek ten posiada bardzo szerokie spektrum czynności biologicznych, takich jak działanie ochronne na wrzody, działanie ochronne na wątrobę, działanie przeciwwirusowe, przeciwobrzękowe, ogólne działanie przeciwzapalne, działanie na nowotwory złośliwe i inne. Powinno być one stosowane w leczeniu cytowanych chorób, ponadto w leczeniu chorób i zaburzeń układu nerwowego, zaburzeń pochodzenia dopaminergicznego, w chirurgii, w stomatologii, w leczeniu płodności oraz w medycynie weterynaryjnej. Jednakże to szerokie spektrum czynności może być prawdopodobnie konsekwencją nieokreślonej struktury lub nawet niewystarczającej czystości lub jednorodności wyizolowanego związku BPC.

Odkryto syntetyczne peptydy mające tylko 8 do 15 aminokwasów w łańcuchu o ciężarze cząsteczkowym między 9ϋ0 a 1600 Daltonów, które posiadają czynność biologiczną naturalnego związku chroniącego organizm (BPC), ale mające zwiększoną selektywność. Nasze nowe peptydy można wytwarzać w sposób bardziej ekonomiczny, a także powodują one mniej działań ubocznych, ponieważ zawierają mniej reszt aminokwasów niż BPC.

W pierwszym aspekcie wynalazku jego istotą jest klasa syntetycznych peptydów, które wykazują nieoczekiwanie wysoką czynność biologiczną, zwłaszcza w odniesieniu do ochrony organizmu. W każdym przypadku te syntetyczne związki, posiadające dobrze zdefiniowaną strukturę, mają dużą zaletę w porównaniu z tylko częściowo zdefiniowanym, wysokocząsteczkowym białkiem BPC, które może być otrzymane tylko za pomocą trudnych procedur z niepewnych źródeł naturalnych.

Nowa klasa peptydów o wysokiej czynności biologicznej zawiera według wynalazku od 8 do 15 reszt aminokwasów i jest przedstawiona wzorem ogólnym:

176 208

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 w których:

Xaa oznacza resztę obojętnego aminokwasu alifatycznego, jak Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nie, Nva

Yaa oznacza resztę aminokwasu zasadowego, jak Lys, Arg, Orn, His

Zaa oznacza resztę aminokwasu kwasowego, jak Glu, Asp, Aad lub Apm;

i w którym co najmniej jedna i co najwyżej 7 reszt aminokwasów w regionie 1-15 może być opuszczona i co najmniej jedna z pozostałych reszt aminokwasowych może być podstawiona, zgodnie z następującym schematem podstawienia: jako podstawnik dla Xaa obojętny aminokwas alifatyczny: Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva, jako podstawnik dla Yaa aminokwas zasadowy: Lys, Arg, Orn, His, jako podstawnik dla Zaa aminokwas kwasowy: Glu Asp, Aad, Apm.

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa

10 15 w których:

Yaa oznacza resztę aminokwasu zasadowego, jak Lys, Arg, Orn, His Zaa oznacza resztę aminokwasu kwasowego, jak Glu, Asp, Aad lub Apm; i w którym co najmniej jedna z reszt Xaa lub Zaa może być opuszczona.

W szczególności wynalazek ten dotyczy nowej klasy czynnych biologicznie peptydów, zawierających od 8 do 15 reszt aminokwasów, które są przedstawione za pomocą poniższych podstawowych wzorów strukturalnych przy użyciu trzyliterowego kodu aminokwasów oraz liczb poniżej każdej z reszt aminokwasów, wskazujących pozycję tej reszty w łańcuchu peptydowym:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 w których to wzorach jedna lub więcej reszt aminokwasów jest podstawiona. Podstawniki Xaa, Yaa i Zaa, które mogą być użyte są pokazane poniżej w tabeli 1.

Tabela 1

Reszta	Podstawnik
Xaa	obojętny aminokwas alifatyczny: Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva
Yaa	aminokwas zasadowy: Lys, Arg, Om, His
Zaa	aminokwas kwasowy: Glu, Asp, Aad, Apm

Korzystne są następujące peptydy:

Sekwencja Nr 1

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 10 15

Sekwencja Nr 2

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val

1	5	10	15
Sekwencja Nr 3
Leu Glu Pro Pro	Pro	Leu Lys Pro Ala Asp Asp	Ala Leu Gly Val
1	5	10	15

Zgodnie z następnym aspektem niniejszego wynalazku jego istotą są analogiczne peptydy zakończone grupą amidową lub karboksylową na końcu C, mające wzory strukturalne takie jak opisano powyżej, w których opuszczona jest co najmniej jedna i co najwyżej

176 208 reszt aminokwasowych w regionie 1-15 i co najmniej jedna z pozostałych reszt aminokwasowych może być podstawiona zgodnie ze schematem podstawienia opisanym w tabeli 1.

Korzystne są peptydy następujące:

Sekwencja nr 4

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 15 10 14

Sekwencja Nr 5

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ale Gly Lau Val 15 10 14

Sekwencja Nr 6

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala 1 5 8

Sekwencja Nr 7

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp 1 5 9

Sekwencja Nr 8

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp 1 5 9

Zgodnie z następną postacią wynalazku, peptydy mające wzory strukturalne opisane powyżej i w których może być pominięta co najmniej jedna reszta aminokwasu i co najmniej jedna reszta aminokwasu może być podstawiona tak jak wskazano w tabeli 1, przekształca się w postać cykliczną przez utworzenie nowego wiązania CO-NH między pierwszą a ostatnią resztą aminokwasu w cząsteczce.

Korzystne są następujące peptydy:

Sekwencja nr 9

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

1 ²	5	10	¹³ \|
Sekwencja Nr 10
Gly Glu Pro Pro	Pro Gly Arg Pro	Ala Asp
1 2	5	9 . 9
Sekwencja Nr 11
Glu Pro Pro Pro	Leu Lys Pro Ala	Asn
1	5	9

Środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera jeden lub więcej związków z nowej klasy peptydów opisanych powyżej w mieszaninie z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem stałym lub ciekłym.

Zgłaszający stwierdzili, że przy stosowaniu peptydów opisanych powyżej wykazują one czynność biologiczną równą lub wyższą w porównaniu z macierzystym białkiem BPC.

Badania farmakologicznie opisanych peptydów przeprowadzono na różnych typowych modelach zwierzęcych in vitro i in vivo, wykonując następujące czynności farmakologiczne:

1. Wrzód trawienny indukowany przez stres spowodowany uwięzieniem

W eksperymentach użyto szczurów Albino Wistar (płci męskiej) o wadze 180-200g. Wszystkie zwierzęta unieruchamiano w pozycji leżącej na wznak na 48 godzin w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio po tym zabijano je i mierzono uszkodzenia. Peptydy o sekwencjach nr 4,6 i 2 stosowano w dawce 10 pg lub 10 ng/kg wagi ciała, i.p. lub i.q. na jedną godzinę przed rozpoczęciem szkodliwej procedury.

Silne działanie ochronne zaobserwowano zarówno przy podaniu i.q. jak i podaniu i.p., nawet w tak niskich dawkach jak 10 ng/kg wagi ciała.

2. Cysteaminowy model wrzodu

W eksperymentach użyto szczurów Albino Wistar (płci męskiej) o wadze 180-200g. Chlorowodorek cysteaminy (rozpuszczony w wodzie destylowanej) podawano podskórnie

176 208 w dawce 400 mg/kg wagi ciała. 24 Godziny później zwierzęta zabijano. Peptydy o sekwencji Nr 4 podawano w dawce 1,0/zg, 100 ng i 50 ng/kg wagi ciała i.p. i i.q. Uzyskano silne i zależne od dawki działanie ochronne. Taką samą czynność stwierdzono również dla drogi i.p. i również przy podaniu dożołądkowym.

3. Indukowne terpentyną obrzęki jamy ustnej.

Zwierzęta: Szczury Wistar płci męskiej (180-200g), N=10 w każdej grupie. Terpentynę podawano dośluzówkowo w ilości 0,02 ml/szczura. Kontrola: 0,9% solanka dośluzówkowo (0,02 ml/szczura, 2 x). Peptydy o sekwencji Nr 2 i 4 podawano w dawkach 10 /zg i 10 ng/kg, i.p. i i.g., na jedną godzinę przed terpentyną. Obrzęki jamy ustnej mierzono w 24 godziny po indukcji obrzęku. Analiza statystyczna: test Mann-Whitney. Badane peptydy były skuteczne w dawce 10 /zg/kg wagi ciała.

4. Chirurgia: wpływ na rozcięcia skóry

W eksperymentach użyto szczurów Albino Wistar płci męskiej (10 na każdy eksperyment, 200-250 g wagi ciała). Szczury z ranami skóry utrzymywano pojedynczo w oddzielnych klatkach. Na każdym ze zwierząt po lekkim znieczuleniu grzbietu wykonano dwa nacięcia o długości 3 cm, rozmieszczone na skórze równolegle w odległości 1,5 cm po obu stronach linii środkowej. Następnie jedną z ran chwytano dwoma klipsami chirurgicznymi, a drugą pozostawiono nienaruszoną. Bezpośrednio po zranieniu między ranami podano podskórnie peptyd o sekwencji Nr 4, rozpuszczony w solance, w dawkach 1,0 /zg i 1,0 ng/kg wagi ciała lub jako kontrolę solanką w ilości 0,5 ml/kg ciała.

Silne działanie gojące było w sposób oczywisty widoczne zarówno dla rany spiętej klipsami chirurgicznymi jak i dla rany pozostawionej bez działania chirurgicznego. Po 5 dniach grupa leczona wykazywała mniejszą ilość komórek zapalnych i znacznie lepiej rozwinięte włókna retykuliny niż grupa kontrolna.

5. Wpływ na poparzenia wywołane eksperymentalnie

W eksperymencie użyto szczurów Albino Wistar płci męskiej (N= 10, 200-250 g wagi ciała). Pod lekkim znieczuleniem eterowym śluzówkę nosa poddano działaniu gorącego przyżegadła przez czas 5 sekund. Peptyd o sekwencji Nr 4 stosowano w dawce 10/zg/kg wagi ciała, i.p., na 1 godzinę przed indukowaniem rany. Kontrola: 5,0 ml/kg wagi ciała solanki, i.p. W wyniku zastosowanej procedury zwykle uzyskiwano silne obrzmienie pyska, regularnie kończące się śmiercią dla zwierząt kontrolnych (lecz nie dla zwierząt leczonych!) w ciągu dziewięciu dni po zranieniu. W przeciwieństwie do zwierząt kontrolnych zaobserwowano bardzo umiarkowane pourazowe obrzmienie pyska. W następstwie tego normalne oddychanie przez nos było tylko lekko zaburzone i zwierzęta przeżyły w stanie nienaruszonym.

6. Wpływ na gojenie złamań

Do eksperymentów użyto szczury Albino płci męskiej ze szczepu Wistar (270-300 g wagi ciała). Pod znieczuleniem eterowym złamano ręcznie lewe piszczele w środku kości. Nie stosowano unieruchomienia, pozwalając zwierzętom poruszać się swobodnie po klatce. Zwierzęta zabijano 5-go, 8-go, 12-go i 30-go dnia po wywołaniu uszkodzenia.

Peptyd o sekwencji Nr 4 podawano w dawce 10,0 /zg/kg wagi ciała, i.p. na 1 godzinę przed uszkodzeniem a następnie raz dziennie (ostatnie podanie 24 godziny przed zabiciem). Grupa kontrolna otrzymywała w tym samym czasie równą objętość solanki (0,9%, 5,0 ml/kg wagi ciała i.p.). W każdym z badanych przedziałów czasowych u wszystkich zwierząt leczonych peptydem obserwowano znacznie poprawioną szybkość leczenia. Warte wzmianki jest to, że u wszystkich zwierząt leczonych obserwowano znacznie słabsze krwiaki pourazowe niż u zwierząt kontrolnych i że odzyskiwały one dość szybko uszkodzoną funkcję.

7. Czynność przeciwwirusowa

Czynność przeciwwirusową badano na nowonarodzonych myszach, szczep BALB C, w wieku 24 godzin, obu płci.

Wirusy ARBO: wirusy TBE (wirus kleszczowego zapalenia mózgu), Bhania, Denga 1, 2, 3, 4, Sinbis, WestNile, Calovo, wirus zapalenia wątroby typu A, LCM (limfocytowego zapalenia opon i splotów mózgowych) oraz wirus opryszczki typu I stosowano w postaci zawiesiny w rozcieńczeniu 10'² (0,02 ml/mysz), przygotowanej w generalnie akceptowany sposób i wstrzykiwano i.c. lub p.o. (wirus zapalenia wątroby typu A). Ze względu

176 208 na różnice zjadliwości dawki ustalano tak, aby były porównywalne odnośnie LD100 w 0,02 ml i.c. (lub p.o., wirus zapalenia wątroby typu A) szczepionki w rozcieńczeniu 10'2 W ten sposób możliwe było porównywanie przebiegu różnych infekcji wirusowych mimo ewentualnego szczepienia różnymi stężeniami wirusa.

Peptyd o sekwencji Nr 4 stosowano w stężeniu 20,0 μ g/ml w 0,9% roztworze solanki i podawano tylko raz w dawce 2,0 /zg/kg wagi ciała, i.c. lub i.p.:

a) 2 godziny przed podaniem wirusa (-2^h)

b) jednocześnie z zainfekowaniem (0).

Kontrola: taka sama objętość solanki i.c. lub i.p. Wyniki zestawiono w tabeli 2: liczby w tabeli oznaczają okres czasu (w dniach) do śmierci wszystkich myszy zainfekowanych wirusem w grupach leczonych peptydem lub solanką (kontrola).

Tabela 2

LECZENIE
Wirus infekujący	solanka	syntetyczny fragment 4
-2h^x	0*	-2hx,	0*
ⁱ.p.	i.c.	ⁱ.p.	i.c.	ⁱ.p.	i.c.	ⁱ.p.	i.c.
TBE a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
Bhania a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
Denga 1 a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
Denga 2 a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
Denga 3 a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
Denga 4 a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
Sinbis a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
WestNile a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
Calovo a	5	5	5	5	n.o.	n.o.	15	15
HfpatitisA⁺	5	5	5	5	n.o.	n.o.	20	20
LCM	5	5	5	5	n. o.	n. o.	20	20
Opryszczka typ 1 Brak	5	5	5	5	n.o.	n.o	20	20
(zdrowe)	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.

n.o. - nie oznaczano: zwierzęta obserwowano przez 40 dni po podaniu wirusa.

‘ Nie zaobserwowano żadnego przypadku śmierci, a - wirusy ARBO + - wirus podawano doustnie x - zwierzęta leczono 2 godziny przed podaniem wirusa (-2h) lub jednocześnie z podaniem wirusa (0).

vs. solanka p<0,001; 8 myszy w każdej z grup.

8. Czynność przeciwdepresyjna

W celu wykazania czynności przeciwdepresyjnej zastosowano test wymuszonego pływania według Porsolta i współpr., Eur. J. Pharmacolol, 47, 379^-3S^ił, 1978.

Do eksperymentów użyto szczury płci męskiej szczepu Wistar (180-240 g wagi ciała). Badany peptyd o sekwencji Nr 4 podawno pierwszego dnia po sesji wstępnej i drugiego dnia jedną godzinę przed eksperymentem, (i.p.).

Grupa kontrolna: solanka, i.p.

Zwierzęta obserwowano przez 5 minut. Mierzono czas znieruchomienia (T1).

Ti w grupie kontrolnej wynosił około 150 sekund, w grupie badanej tylko 60-70 sekund. Efekt ten charakteryzował się długim trwaniem; po 16 dniach był jeszcze widoczny.

Reakcja na dawkę: 10 μ g do 10 ng/kg: pełny efekt.

pg/kg: efekt jeszcze obecny ppgkg: efekt zanika.

9. Wpływ na model choroby Parkinsona

Do badań użyto dobrze znanych modeli choroby Parkinsona (Karakola S. i współpr., Pharmacolo. Toxicol., 67, 95-100,1990): model rezerpinowy i model MPTP.

176 208

Użyto myszy samców NMRI-Hannover (dla modelu MPTP) lub obu płci (dla modelu rezepinowego).

a) MPTP podawano w dawce mg/kg wagi ciała., i.p. raz dziennie przez sześć kolejnych dni, a następnie przez następne cztery dni w wyższej dawce· 50 mg/kg wagi ciała. Badany peptyd o sekwencji Nr 4 podawano w dawce 1,5 μ g i 15,0 ng/kg wagi ciała, i.p., 15 minut przed każdym podaniem MPTP lub 15 minut po każdym podaniu MPTP.

b) Rezerpinę podawano w dawce 5 mg/kg wagi ciała, i.p. Badany peptyd podawano w dawce 10 μ g lub 10 ng/kg wagi ciała, i.p. 15 minut przed rezerpiną lub 24 godziny po podaniu rezerpiny w tej samej dawce.

Kontrole: równa objętość solanki, 5 ml/kg wagi ciała, i.p.

Po uprzednim podaniu peptydu zaobserwowano znaczne zmniejszenie hipokinezji, sztywności (katalepsji) oraz drżenia.

W modelu MPTP uprzednie podanie tego peptydu silnie zmniejszało rozwijanie się katalepsji i zmniejszało występowanie akinezji oraz drżenia.

Późniejsze podanie (po 15 minutach) silnie zapobiegało dalszemu rozwijaniu się katalepsji MPTP i znacznie zmniejszało akinezję i drżenie. Wysoka umieralność (50%) obserwowana zwykle po jednym podaniu MPTP zmniejszała się u zwierząt którym podawano peptyd zarówno uprzednio jak i później.

10. Wpływ podawania peptydu na wstrząs krwiotoczny

We wszystkich eksperymentach używano dorosłych szczurów samic Albino szczepu Wistar (150-180 g).

Skutki wstrząsu krwiotocznego badano w dwóch seriach eksperymentów.

a) Zwierzęta wykrwiawiano (1 ml na 3 minuty, 2 minuty reszta) aż do śmierci. Oceniano ilość usuniętej krwi, która powodowała wynik śmiertelny u zwierząt, którym uprzednio (15 minut przed wykrwawieniem) podawano peptyd o sekwencji Nr 4 (10,0 μ g lub 10 ng/kg wagi ciała, i.p.) lub solankę (5,0 ml/kg wagi ciała, i.p.). W grupie zwierząt którym podano wyższą dawkę peptydu zanotowano znacznie wyższy ubytek krwi powodujący śmierć w porównaniu z grupą kontrolną.

b) Ciśnienie krwi obniżano przez usunięcie kontrolowanej objętości krwi, a następnie utrzymywano na wartości 30-35 mm Hg przez okres 5 minut.

Następnie podawano peptyd o sekwencji Nr 4 (10,0 μ g/ lub 10,0 ng/kg wagi ciała) lub solankę (kontrola, 3,0 ml/kg wagi ciała). W przeciwieństwie do grupy kontrolnej u zwierząt leczonych peptydem zanotowano znacznie podwyższone i utrzymujące się ciśnienie krwi oraz kompletny brak śmierci.

Zatem wydaje się, że badany peptyd jest wysoce skuteczny jeśli chodzi o zmniejszanie konsekwencji utraty objętości krwi.

11. Wpływ na śmiertelne promieniowanie

We wszystkich eksperymentach użyto myszy NMRI-Hanover w wieku 5-6 tygodni obu płci (18-22 g wagi ciała). Syntetyczny peptyd o sekwencji Nr 4 podawano w dawce 20 μ g/kg wagi ciała, i.p. 1 godzinę przez lub po napromieniowaniu. Zwierzęta kontrolne otrzymywały jednocześnie równą objętość 0,9% solanki i.p. (5,0 ml/kg). Jako zdrowa kontrola służyły nie stykające się dotąd z promieniowaniem, zdrowe zwierzęta trzymane w zwykłych warunkach, nie poddawane działaniu leków.

Napromieniowanie: Teatron 80 (Co 60, 2200 Ci). Nieznieczulone myszy w klatkach, po 16 myszy w grupie, poddano ekspozycji na napromieniowanie całego ciała ponadśmiertelną dawką 9 Gdy w obszarze napromieniowania 20 x 20 cm, odległość 80 cm. Śmierci notowano dwa razy dziennie przez 30 dni. Wszystkie zwierzęta kontrolne zmarły w ciągu

7-12 dni (LDi00/12).W kontrolnych grupach zdrowych zwierząt (nie nienapromieniowanych) nie zanotowano śmierci.

W grupach leczonych peptydem 1 godzinę po napromieniowaniu nie zaobserwowano różnicy w stosunku do grup kontrolnych. Jednakże zanotowano znaczną przeżywalność gdy związek podawano 1 godzinę przed napromieniowaniem. Zanotowano 70% wzrost LD100 w stosunku do grupy kontrolnej.

176 208

12. Wpływ na indukowane deformacje

We wszystkich eksperymentach użyto myszy samic NMRI - Hanover w wieku dwóch miesięcy, 25 g wagi ciała, ale nigdy przedtem nie poddawanych kopulacji. Myszy samice w fazie rui parowano na noc z doświadczonymi myszami samcami. Po 20 dniu ciąży myszy zabijano.

Witaminę A podawano w dawce 15700 j/kg wagi ciała, i.m., w dziesiątym dniu ciąży (0,05 ml/kg wagi ciała). Jednocześnie podawano peptyd o sekwencji Nr 4 w dawce 10 ug lub 10 ng/kg wagi ciała, i.p.

Kontrola: solanka 5,0 ml/kg wagi ciała, i.p.

Jako zdrowa kontrola służyły zwierzęta, którym nie podawano witaminy A, otrzymujące jednocześnie i.p. solankę lub peptyd 4 w tej samej dawce.

W grupach zdrowej (solanka) lub leczonej peptydem nie zaobserwowano deformacji.

Wyniki zestawione w tabeli 3 wykazują nieoczekiwanie znaczne i zależne od dawki działanie ochronne badanego peptydu przeciwko deformacjom spowodowanym przez witaminę A.

Tabela 3

Badanie makroskopowe

Leczenie	Łączna liczb płodów	Liczb zdeformownych płodów
grupa kontrolna (solanka)	55	0
witamina A	54	36
witamina A + peptyd 4 10 ng/kg	36	13
witamina A + peptyd 4 10 /zg/kg	18	1

13. Toksyczność ostra

Toksyczność ostrą syntetycznych peptydów oznaczano na myszach samicach (waga około 20 g). Do każdego eksperymentu i kontroli używano grup po 6 zwierząt.

Peptydy o sekwencjach Nr 2, 3,4 i 6 podawano w dawce 8, 25 i 50 mg/kg wagi ciała, i. v. Grupie kontrolnej podawano solankę (0,9%, 5,0 ml/kg wagi ciała). Obserwowano występowanie oznak toksyczności u zwierząt przez następne 15 dni.

W stosowanych dawkach nie zaobserwowano oznak toksyczności ani śmierci. Zaobserwowano interesujące zjawisko znacznie zwiększonej ruchliwości i ożywienia, trwające 2 godziny po podaniu peptydów.

Jak wynika z badań farmakologicznych, peptydy te wykazują czynność w sensie ochrony organizmu przed stresem i chorobami, normalizując generalnie funkcje organiczne.

Ich stosowanie powinno być również skuteczne w zapobieganiu i terapii kilku chorób lub zaburzeń ludzkich lub zwierzęcych. W szczególności związki te mogą być stosowane do leczenia:

- chorób i zaburzeń wywołanych przez stres,

- różnego pochodzenia wrzodów układu pokarmowego,

- stanów zapalnych i obrzęków różnego pochodzenia,

- urazów, poparzeń, złamań kości oraz generalnie w chirurgii,

- infekcji wirusowych,

- wstrząsów,

- choroby Parkinsona,

- do zapobiegania uszkodzeniom popromiennym,

- do zapobiegania deformacjom.

Generalnie opisane peptydy mogą być również stosowane w wielu rodzajach kompozycji farmaceutycznych w połączeniu z nietoksycznym nośnikiem farmaceutycznym lub podłożem takim jak wypełniacz, nietoksyczny bufor lub fizjologiczny roztwór solanki. Takie kompozycje farmaceutyczne mogą być stosowane miejscowo lub systemicznie i mogą mieć dowolną odpowiednią postać taką jak płyn, substancja stała, substancja półstała, roztwór do iniekcji, tabletka, maść, płyn do przemywania, kapsułka, lingwetka lub podobną.

176 208

Peptydy te mogą być generalnie przy podawaniu systemicznym podawane w dawce od 10 do 10 mg/kg wagi ciała. Przy podawaniu miejscowym będą one stosowane w wyższych stężeniach, na przykład 0,1% do 0,5%.

Bardzo korzystny jest brak jakichkolwiek oznak toksyczności aż do dawek 50 mg/kg wagi ciała i również dobra czynność związków przy podaniu doustnym (dożołądkowo).

Opisane peptydy mogą być syntetyzowane na drodze kolejnych etapów kondensacji zabezpieczonych aminokwasów w homogennym układzie ciekłym lub korzystnie przy użyciu metody w fazie stałej. W celu otrzymania peptydów cyklicznych otrzymuje się częściowo zabezpieczone peptydy liniowe o żądanej długości, na przykład z alkilową grupą estrową na końcu C, które następnie przekształca się w azydek, po czym sprzęga i odbezpiecza. Alternatywnie częściowo zabezpieczony liniowy peptyd z wolnymi grupami końcowymi można cyklizować za pomocą difenylofosforyloazydku w bardzo rozcieńczonym roztworze.

Wynalazek zostanie opisany w odniesieniu do poniższych przykładów, jednakże nie są one zamieszczone w celu ograniczania zakresu wynalazku.

Przykład 1. Synteza peptydu przy użyciu strategii Boc.

Syntezę peptydu prowadzono rozpoczynając od 100 mg żywicy Boc-Val-PAM, otrzymując peptyd z karboksylową grupą C-końcową (PAM otrzymany z firmy Applied Biosystems, o stopniu podstawienia 0,56 miliwali/g, jest to pochodna kwasu aminoacylo-4-(oksymetylo)fenylooctowego i aminopolistyrenu). Boc aminokwasy (Boc = t-butoksykarbonyl) kondensowano jeden po drugim na nośniku polimerycznym, stosując diizopropylokarbodiimid (DIPC) jako reagent do kondensacji. W każdym etapie grupę Boc usuwano 50% roztworem kwasu trifluorooctowego (TFA) w dichlorometanie. Następnie grupę aminową deprotonowano diizopropyloetyloaminą.

Konwersja powinna być w każdym etapie wyższa niż 99,5%. Jeśli tak nie jest, kondensacja powinna być powtórzona. Po zakończeniu syntezy przeprowadzano odszczepianie, stosując procedurę z HF w niskiej temperaturze (2 godziny w 0°C). Jako substancję wychwyującą jony karboniowe stosowano anizol. HF odparowywano za pomocą strumienia azotu. Surowy peptyd otrzymano następnie przez wylanie oleistej pozostałości do suchego eteru.

Następnie surowy peptyd oczyszczano przez HPLC z odwróconymi fazami, stosując kolumnę 5 x 150 mm wypełnioną żelem krzemionkowym RP-18, oraz gradient elucji układem rozpuszczalników: 0,1% TFA w układzie woda/acetonitryl. Detekcja: absorpcja w ultrafiolecie przy 225 nm. Synteza peptydu o sekwencji Nr 4 jest pokazana na fig. 1.

Przykład 2. Synteza peptydu przy użyciu strategii Fmoc.

Do syntezy stosowano standartowe aminokwasy zabezpieczone Fmoc (Fmoc = 9-fluorenylometyloksykarbonyl). Grupy funkcyjne w łańcuchach bocznych zabezpieczano jako estry o-t-butylowe (Asp, Apm, Glu, Aad) i jako pochodne Boc (Lys). Pierwszy aminokwas (Val) wiązano na polimerycznej żywicy (BHA = żywica benzhydryloaminowa) przy użyciu diizopropylokarbodiimidu jako reagenta sprzęgającego. W każdym etapie grupę zabezpieczającą Fmoc usuwano piperydyną. Następnie w ten sam sposób wprowadzano drugi i następne aminokwasy aż do zakończenia syntezy. Odszczepienia dokonywano za pomocą mieszaniny TFA/TFMSA/anizol = 2:17:52 (obj./obj.).

Następnie peptyd oczyszczano, stosując metodę HPLC opisaną w przykładzie 1.

Syntezę peptydu o sekwencji Nr 2 zilustrowano na fig. 2.

Przykład 3. Synteza peptydu przy użyciu strategii Ddz.

Wszystkie aminokwasy stosowano z funkcją α-aminową zabezpieczoną przez Ddz (= α, α-dimetylo-3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl). Boczne grupy funkcyjne zabezpieczano za pomocą grupy Z (=berzyloksykarbonyl) dla lizyny i grupy O-t-Bu (ester t-butylowy) dla kwasu asparaginowego i glutaminowego. Do związania pierwszego Ddz-aminokwasu poprzez jego sól cezową użyto nośnika Merrifielda (usieciowany chlorometylowany żel polistyrenowy) o pojemności 1,4 mmola/g. Po kondensacji z dicykloheksylokarbodiimidem (DCC) w każdym z etapów usuwano grupy zabezpieczające Ddz za pomocą 5% TFA w dichlorometanie, po czym przemywano i deprotonowano 10% trietyloaminą w dichlo176 208 rometanie. Po deprotonowniu tą samą metodą przeprowadzano następny etap sprzęgania. Te etapy sprzęgania powtarzano aż do zakończenia sekwencji peptydu.

Na końcu peptyd odszczepiano z nośnika polimerycznego, stosując mieszaninę HBr/TFA/anizol. Po odparowaniu lotnej części świeżo utworzony peptyd wytrącano z suchego eteru i suszono. Następnie surowy peptyd oczyszczano metodą HPLC w sposób opisany w przykładzie 1. Syntezę peptydu o sekwencji Nr 6 zilustrowno na fig. 3.

Przykład 4. Synteza peptydu cyklicznego.

Peptyd w postaci częściowo zabezpieczonej:

OBzl NO2 OBzl

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH otrzymano poprzednio metodą opisaną w przykładach 1 lub 2.

0,0005 Molowy roztwór tego peptydu w dimetyloformamidzie cyklizowano po dodaniu difenylofosforyloazydku i trietyloaminy w 20°C przez 12 godzin.

Następnie mieszaninę tę uwodorniano wodorem wobec katalizatora palladu na węglu w 25°C przez 8 godzin.

Rozpuszczalnik ostrożnie odparowywano, a surowy produkt oczyszczano stosując metodę HPLC opisaną w przykładzie 1.

Peptyd cykliczny o sekwencji Nr 10

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

5 I 10 otrzymano z wydajnością 10%.

Przykład 5. Synteza peptydów liniowych i cyklicznych przy użyciu strategii Ddz.

Taką samą strategię z grupami zabezpieczającymi Ddz zastosowano do otrzymania peptydów liniowych i cyklicznych. Boczne grupy funkcyjne zabezpieczano grupą Z (lizyna) estrowymi grupami O-benzylowymi OBzl (kwas glutaminowy i asparaginowy).

Jako nośnik polimeryczny zastosowano żywicę HYCRAM^r (znak towarowy firmy ORPEGEN, Heidelberg, Niemcy), to jest 4-bromokrotonylo-e-alanyloamidometylopolistyren. Pierwszy aminokwas (Ddz-walina) związano na nośniku polimerycznym poprzez jego sól cezową.

Następnie grupę Ddz usunięto, stosując kwas trifluorooctowy (5%) w dichlorometanie i odprotonowano grupę aminową za pomocą diizopropyloetyloaminy.

W następnym etapie Ddz-glicynę sprzęgano z resztą waliny na matrycy polimerycznej, stosując diizopropylodiimid (DIPC) w obecności 1-hydroksybenzotriazolu.

Etapy te powtarzano aż do zakończenia łańcucha peptydowego. Zsyntetyzowany peptyd w formie zabezpieczonej odszczepiano następnie ostrożnie z nośnika HYCRAMR za pomocą tetrakis(trifenylofosfino)palladu (O), rozpuszczonego w bezwodnym tetrahydrofuranie w nieobecności tlenu. Stosowano dodatek taki jak morfolina jako cząsteczkę akceptorową dla grup allilowych.

Nośnik polimeryczny odsączano i przemywano tetrahydrofuranem. Następnie roztwór peptydu przesączano przez krótką kolumnę z żelem krzemionkowym w celu usunięcia katalizatora palladowego.

Eluat, który zawiera częściowo zabezpieczony peptyd 4a po odparowaniu rozpuszczalnika suszono pod próżnią.

Synteza liniowego peptydu o sekwencji Nr 4.

Częściowo zabezpieczony peptyd 4a rozpuszczono w 2,2,2,-trifluoroetnolu i uwodorniano w obecności palladu na węglu (10%) gazowym wodorem w 30°C. Katalizator odsączono a rozpuszczalnik odparowywano pod próżnią. Następnie surową żywicę oczyszczano stosując metodę HPLC, jak opisano w przykładzie 1. Po oczyszczeniu otrzymywano peptyd o sekwencji Nr 4. Produkt był identyczny ze związkiem otrzymanym w przykładzie 1.

Synteza peptydu cyklicznego o sekwencji Nr 9.

Częściowo zabezpieczony peptyd 4a rozpuszczano w mieszaninie dimetyloformamid/dichlorometan (1:1), otrzymując roztwór 0,001 molowy. W celu cyklizacji dodawano

176 208

DIPC i HOBt i pozostawiano w 20°C na 10 godzin. Następnie roztwór zatężano do małej objętości, rozcieńczano 2,2,2,-trifluoroetanolem i oczyszczano przez przepuszczenie przez kolumnę wypełnioną Sephadexem LH-20. Zbierano frakcje zawierające częściowo zabezpieczony cykliczny peptyd 9a i uwodorniano je przepuszczając wodór i energicznie wstrząsając, stosując jako katalizator pallad na węglu w 30°C, przez 8 godzin.

Następnie katalizator usuwano przez filtrację i suszono roztwór przez odparowanie rozpuszczalnika pod próżnią. Surowy peptyd oczyszczano dodatkowo za pomocą HPLC, stosując opisaną metodę z przykładu 1. Otrzymany czysty peptyd cykliczny zidentyfikowano jako peptyd o sekwencji Nr 9.

Syntezę na nośniku polimerycznym HYCRAM^r przy zastosowaniu strategii Ddz i cyklizacji zilustrowano na fig. 4 i 5. Czystość wszystkich zsyntetyzowanych peptydów sprawdzano za pomocą metody HPLC, stosując kolumnę z żelem krzemionkowym RP-18 (oktadecylosilanizowany), eluując w zwykły sposób gradientowo mieszaniną rozpuszczalników o składzie woda/acetonitiyd/kwas trifluorooctowy. We wszystkich przypadkach czystość wynosiła powyżej 95%.

Peptydy charakteryzowno za pomocą analizy aminokwasów (wartości 10% teoretycznej), analizy sekwencji, oznaczano ciężar cząsteczkowy za pomocą spektrometrii masowej FAB, oraz sporządzano widma w nadfiolecie i podczerwieni (fig. 6 i 7).

Jakkolwiek opisano szczegółowo tylko niektóre z postaci wynalazku, to dla specjalistów widoczne będzie, że można zrealizować wiele innych szczególnych postaci, a także można dokonać wielu zmian, nie odchodząc od ducha i zakresu załączonych zastrzeżeń.

176 208 <£ o o CD — (U--o o

CQ__ _σ----<

CD

CL

ΝΕΟ

O n-1

CO o

NNn.

co o

N . CD O

N.

CD

O

2Q_ o

<3 o

CN

O

CN

ΓΝ

A o

CN

ΓΝ i _

O

CN

ΓΝ i

O

CN lL

Leu Glu Pro Pro Pro Leu m·

CO co u

o co

N.

CO CD O o co co

CN

X

Synteza peptydu o sekwencji Nr 4 przy użyciu strategii Boc

Odbezpieczony peptyd o sekwencji Nr

176 208 <

χ αο <υ

2>Ο _σ.

<

IL_______ ί

α.

cl ^$2-

□

CQ_|

Ο □

00ο

Σ3 cd.

cŁ cv □

αο.

Σ7 αο.

ο αο_ ο □

ω.

ο tN

α.

□ □ο.

ο □

σο-4 ο

□ αο· ο

□ αο.

ο □ COCO

Ζ3

CDθ' α

ωο αο.

ο

ι3

2ιχ>·

ο.

2ο_

2·

CL

α.

ο

Eg. 2

Ο οm

Ε

u.

ο ο□0 υ

οοο ο

ο00 §

’c (Ζ)

Σ

LL (— \

<

Odbezpieczony peptyd o sekwencji Nr ε

Ο8 <£

Synteza peptydu ο sekwencji Nr 2 przy użyciu strategii Fmoc

X

176 208 «3 ϋ

•rl σ _ <

£5 >1 •N

N

TJ

O

8.N

TJ

O —NI·

NlNI NlNlNvo

D

LO

N

TJ

Q

N

TJ

O

CL &N

TJ

O

N

Tl <=>□ _ cQ,

O '§

I '•p

LO cn

Synteza peptydu o sekwencji Nr 6 przy użyciu strategii Ddz •rl •O

U c

a)

S zpieczony peptyd o se a;

Λ

Ό

O

176 208

φ _σ <

Ν

-α

Ω

Ν

-ο

-°-Μ 00 °Ν

Νω ο

νοώ ο

ΝΟΩ

Ο

Ν_ ω

ο

Ν.

οο ο

Ν.

ω ο

Ν.

ω σ

Ν αν ο

σ------<

£-------Ν

TJ

Ο &.....

ΓΝ ΓΝΝΝΝ— ΓχΐΓΝ—¹ =5

Φ ”

Ν σ

α

Ν τα

Ω

Ν

Ό —

Q Ν

---03*

Ο

Ν

-σ

Ω

Ν §·'

----(Ν (0 ’ί’

Η •Η •ri

Ο

C <ϋ

Λ4 (U

Μ

Ο

Τ3

-Ρ a

ο a

>, c

ο

Ν υ

0) ·ρ4 a

Ν <ϋ

Λ (d

Ν

Ο

Ο •Η υ

χο σ

Ν ο

Synteza częściowo zabezpieczonego peptydu o sekwencji Nr 4 przy użyciu strategii Ddz

176 208

	io	03 σ\
	Ό	τ3
	>,	0 >1
	+J	S -u	O
	O Oj	o cu
o	Se φ	•rd Φ	Ό
	O Ch	O CU	Sd
	Ή	xn	+J <n
>1	O >1	Φ* >1	CU
+J 5d	xn C	N C	Φ U
cujs	Φ> 0	0 0	cus
0)	N N	N
CU-H	O O	>i O	Sd'rd
-n	φ	C 0)	β -I-I
>i O	Sd-H	N -H	N O
5 c	3= CU	O CU	O C
0 <1)	O N	-Η N	•id Φ
•H S	-Η Φ	rd Φ	rd S
c 44	C £1	44 Λ	44 44
•rd φ	•H Π3	>ι <0	Sd <U
J ω	U N	O N	U w

Fig. 5

Synteza liniowego peptydu o sekwencji Nr 4 i peptydu cyklicznego o sekwencji Nr 9 z częściowo zabezpieczonego liniowego peptydu 4a

176 208

Widmo w nadfiolecie peptydów o sekwencjach Nr 4 i 6 (woda, c = 1 mg/ml)

Absorbancja

Fig. 6

176 208

Widmo w podczerwieni peptydów o sekwencjach Nr 4 i 6 (pastylka KBr)

Transmitancja % Transmitancja

Λ000

3000

2000

176 208

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowa klasa peptydów o wysokiej czynności biologicznej, znamienna tym, że zawiera od 8 do 15 reszt aminokwasów i jest przedstawiona wzorem ogólnym:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 w których:

Xaa oznacza resztę obojętnego aminokwasu alifatycznego, jak Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nie, Nva

Yaa oznacza resztę aminokwasu zasadowego, jak Lys, Arg, Orn, His

Zaa oznacza resztę aminokwasu kwasowego, jak Glu, Asp, Aad lub Apm;

i w którym co najmniej jedna i co najwyżej 7 reszt aminokwasów w regionie 1-15 może być opuszczona i co najmniej jedna z pozostałych reszt aminokwasowych może być podstawiona, zgodnie z następującym schematem podstawienia:

jako podstawnik dla Xaa obojętny aminokwas alifatyczny:

Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nie, Nva, jako podstawnik dla Yaa aminokwas zasadowy: Lys, Arg, Orn, His, jako podstawnik dla Zaa aminokwas kwasowy: Glu Asp, Aad, Apm.
2. Nowa klasa peptydów o wysokiej czynności biologicznej, znamienna tym, że zawiera od 8 do 15 reszt aminokwasów i jest przedstawiona wzorem ogólnym:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 w których:

Xaa oznacza resztę obojętnego aminokwasu alifatycznego, jak Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva

Yaa oznacza resztę aminokwasu zasadowego, jak Lys, Arg, Orn, His Zaa oznacza resztę aminokwasu kwasowego, jak Glu, Asp, Aad lub Apm; i w którym co najmniej jedna z reszt Xaa lub Zaa może być opuszczona.
3. Peptydy według zastrz. 1 albo 2, których cząsteczka jest zcyklizowana przez wiązanie amidowe między pierwszą, a ostatnią resztą aminokwasu.

4. Peptyd o sekwencji Nr 1 o wzorze:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 1 5 10 15 5. Peptyd o sekwencji Nr 2 o wzorze: Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val 1 5 10 15 6. Peptyd o sekwencji Nr 3 o wzorze: Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 1 5 10 15 7. Peptyd o sekwencji Nr 4 o wzorze Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala . Asp Ala Leu Gly Yal 1 5 10 14 8. Peptyd o sekwencji Nr 5 o wzorze Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val 1 5 10 14

9. Peptyd o sekwencji Nr 6 o wzorze:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala 1 5 8

176 208
10. Peptyd o sekwencji Nr 7 o wzorze:

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp 1 5 9
11. Peptyd o sekwencji Nr 8 o wzorze:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp 1 5 9
12. Peptyd o sekwencji Nr 9 o wzorze:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 2 5 10 13
13. Peptyd o sekwencji Nr 10 o wzorze:

Gly Glu 2 Pro Pro Pro Gly 5 Arg Pro Ala Asp 9 14. Peptyd o sekwencji Nr 11o wzorze: Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn 1 5 9
15. Środek farmaceutyczny, zawierający jeden lub więcej związków według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 14 w mieszaninie z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem stałym lub ciekłym.