JPH05503103A - 障害を受けた組織における血管漏洩を抑制する抗炎症ペプチド及びその組織の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 を　げた　織にお番る血　を　る　：症ペプチドびの　のｔ　′ 発明の利用分野 本発明は一般に、抗炎症薬、及び例えば能、皮膚、粘膜や筋肉の障害に関連して 起こる浮腫等の炎症性の応答における処置に関する。更に特別には、血管漏洩を 抑制できる性質を育する比較的小さい合成ペプチドの利用に関する。

本発明はナシ「ナル　インスティチューテス　オプ　ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｉｎ５ｔｉＬｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）によって承諾されたグランドナ ンバーＤ＾−０００９１（Ｇｒａｎｔ　Ｎｏ。

０Ａ−０００９１＞の元での政府の支持によってなされた。政府は本発明に関し ての確固たる権利を有する。

発　明　の　青　景 炎症は、障害あるいは外傷に対する身体的応答としての発赤、腫脹、発熱、およ び痛みによって現れる。さまざまな化学物質は、炎症反応の化学的メディエータ −としてかかわっている。その化学的メディエータ−には、ヒスタミンやキニン 、プロスタグランジン、血小板活性因子、ロイコトリエン、及び神経末端がら遊 離される物質、サブスタンスＰが含まれる。急性の炎症反応のメディエータ−は 、血管透過性の上昇、白血球の遊走、完膚、局所的な浮腫、及び壊死のうちの− 症状あるいはそれ以上の症状に関与していると思われる。

さまざまな生理学的応答は、炎症過程を形成する生化学的な成行きから生じる。

例えば、ピンクカードら（Ｐｉｎｃｋａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、）によって血小板活 性化因子（”ＰＡＦ″）が）炎症テキスト（ｔｈｅ　ｔｅｘｔ　ｌｎｆｌａｍａ ｔｉｏｎ）　：　即ちＢａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃｌ１ｎｉ ｃａｌ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　（Ｇａｌｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）の１０章に 記載されている。この種の構造的に関連する化合物群は、炎症反応に直接的にあ るいは非直接的に関連して起きるさまざまな生理学的な反応を促進するらしい。

著者らは、ＰＡＦがエンドトキンンショックや臓器移植の拒絶反応等のヒトの疾 病状態の発症原因に関連していることに気づいている。

腫脹は、組織が障害を受けた場合の特徴的な炎症応答である。腫脹は、体液の漏 出、及び組織マトリックスに血管が直接的に湿潤することによって引き起こされ る。障害を受けた後の血管からの漏出量の増加は、血管の直接的な損傷によるも のかもしれないし、あるいは血管が集まった内皮の細胞の間に間隔が開いてヒス タミン（炎症性のメディエータ−）等の物質が放出された後に起きるのかもしれ ない。程度の低い腫脹（あるいは浮Ｗ）では、障害を受けた細胞（例えば能にお ける障害は除く）の機能的な仕組みが影響を受けることはない。しかし、時とし て起こる障害によってはかなりの腫脹が起き、組織構成が破壊されるとともに細 胞への酸素の供給が妨害され、さらに血管領域からの広範囲の失血力弓１き起こ される。従って腫脹の過程を阻害することのできる薬理学上の薬物は、組織の障 害を処置する上で治療上の効果を有する。

炎症はまた、例えば喘息等のさまざまな慢性的な症状に関連しているが、炎症細 胞や特定のメディエータ−が喘息に密接に関連していることは現在のところ明ら かになってはいない。パーソン（Ｐｅｒｓｓｏｎ）は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　５ｕｐｐ、 　Ｎｏ、　１４４．　Ｖｏｌ、　８８．　ｐｐ、　１９０−２４０　（１９８６ ）に記載されたA表 題が”喘息の病原における毛細血管の浸透性の法則（Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　 ！１ｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐ ａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ａｓｔｈｍａ）″と題された論文の中で１喘息 患者の気管には製出した血しょうタンパク質が常に存在しているということを結 論づけている。

ステロイドや非ステロイドが抗炎症薬として当業者に知られている。１９８６年 ４月１日に発行された米国特許明細警笛４，５７９，８４４号で、発明者がロビ ーら（Ｒｏｖｅｅ　ｅｔａｌ、）の文献においては、コルチコステロイドと同時 にプロスタグランジン合成阻害剤を使用することによって、皮膚の炎症状態を局 所的に治療することが記載されている。１９８３年９月１３日に発行された米国 特許明細警笛４，４０４．１９８号で、発明者がケリー（Ｋｅｌｌｅｙ）の文献 においては、炎症を治療する目的でフェニルサリチル酸（ｐｈｅｎｙｌ　５ａｌ ｉｃｙｌａｔｅ）を含有する成分を局所的に適用することが記載されている。１ ９７６年９月１４日に発行された米国特許明細警笛３．９８０．７７８号で、発 明者がエイヤーら（＾ｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）の文献においては、局所的、経口 的あるいは非経口的に皮膚や粘膜の炎症を治療するのに用いられるステロイドに ついて記載されている。

イブプロフェン（これは抗炎症薬として知られている。）については、ＵＶ−Ｂ −誘導性の炎症に関連してテストされているが、日焼は治療においては限られた 有効性を有しており、また転置の高装置ＵＶ−Ｂによる光線療法の後に起きるＵ Ｖ−Ｂ−誘導性の炎症に関連した症状の除去に対してはプラセボ（ｐｌａｃｅｂ ｏ）よりは幾分効果があるだけでである。スターンらの文献（Ｓｔｅｒｎ　ｅｔ 　ａｔ、、＾ｒｃｈ、　Ｄｅｒ■、、＋２１．　ｐｐ、　５０８−５１２）参照 。

１９８９年１月３１日に発行された米国特許明細警笛４．８０１．８１２号で、 発明者がペイ（Ｗｅｉ）の文献においては、フルチコトロビンー遊離因子あるい はそのアナログを投与することによって患者の皮膚あるいは粘膜の炎症応答を阻 害する方法が記載されている。

特徴が解っている第１番目のコルチフトロビンー遊離因子（ＣＲＦ、またＣＲＨ あるいはコルチコリベリン（ｃｏｒｔｉｃａｌ　１ｂｅｒｉｎ）とも呼ばれてい る因子）は、ベールら（Ｖａｌｅ　ｅｔ　ａｌ、）によって１９８１年にヒツジ の視床下部から単離された４１−アミノ酸残基からなるペプチドである。その後 、ヒト−ＣＲＦの配列はｃＤＮＡの研究から導き出され、ラブド−ＣＲＦと同じ であることが見いだされた。更に最近では、ヤギ、仔ウシ、ブタ、及びホワイト サブカーフィッシュのＣＲＦの特徴が判明している。ひづめを持った哺乳動物の ＣＲＦは、ヒトとはかなり興なっていることが判っているが、ブタやサカナの配 列は、ヒトやラットの配列と４１残基のうちのわずか２個しか違わないことが判 っている。

神秘的なこととして、哺乳動物のＣＲＦに似た構造をもつペプチドは、ある橿の カエルの皮膚の細胞の中に及びサカナのウロフィシス（ｕｒｏｐｈｙｓｉＳ）中 に見いだされている。事実、ミドリカエル（Ｐｈｙｌｌｏｓｅｄｕｓａ　ｆｒｏ ｇ）の皮膚から単離された４０アミノ酸からなるペプチドであるソウバジン（ｓ ａｕｖａｇｉｎｅ）の構造は、ヒツジ−ＣＲＦについてのベールらによる記述よ りも数年前に報告されている。サッカーフィッ／ユのウロテンシンＩ　（ｕｒｏ ｔｅｎｓｉｎ　Ｉ）の構造は、ヒツジ−ＣＲＦの記述の後まさに数カ月で報告さ れ、カナダのレゾリス（Ｌｅｄｅｒｉｓ）らのグループによる独立した研究系統 から導き出された。ソウバジンやウロテンンンＩは、下垂体からアドレノコルチ コトロピンを遊離させるということがわかっているが、トリー−フロッグ（ｔｒ ｅｅ−ｆｒｏｇ　：南アメリカの乾燥地に生息するＰｈｙｌ　１ｏｓｅｄｕｓａ ｌｌｉ　）内における、あるいはサッカーフィッノユ内におけるこれらの機能は 未だ知られてはいない。現在、サッカーフィッシュはそれ自体の視床下部のＣＲ Ｆをもち、これはヒトやラットのＣＲＦの構造に非常に近いことが示されている 。このように、サッカーフィッシュは神経内分泌の調整に対してウロテンシンＩ を必要としないであろう。というのは、すでに視床下部内にＣＲＦを持っている からである。

ラットのフルチコトロビンー遊離因子（以下″ＣＲＦ”という）については、１ ９８４年１２月１８日に発行された米国特許明細警笛４，４８９．１６３号で、 発明者がリビエールら（Ｒｉｖｉａｒ　ａｔ　ａｌ、）の文献内に記載されてい る。ヒト及びラットのＣＲＦのアミノ酸配列は、下記のとおりである。：５ｅｒ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｌｅｕ −Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−旧５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ− Ｇｌｕ−１１ｅｔ−＾Ｉａ−Ａｒｇ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−＾１ａ −Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−＾１ａ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−＾ｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ −Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１１ｅ−Ｎ８２１９８３年１１４１５日に発行され た米国特許明細警笛４，４１５．５５８号で、発明者がベール、Ｊｒ、　ら（Ｖ ａｌｅ、　Ｊｒ、　ｅｔ　ａｌ、）の文献において、ヒツジのＣＲＦの合成につ いて、及びヒツジの視床下部の抽出物からのヒツジＣＲＦ　（ｏＣＲＦ）の単離 について記載されている。その合成されたｏＣＲＦは、血圧を低下させることが 見いだされた。ヒツジのＣＲＦのアミノ酸配列は下記のとおりである。：５ｅｒ −Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−＋１ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−＾ｓｐ−Ｌｅｕ −Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−１１ｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−＾１ａ−＾５ｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−＾１ ａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−＾ｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅ ｕ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−１１ｅ−＾１ａ−ＮＨ２ 一般的に同様のペプチドであるソウバジンについては、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　 Ｐｅｐｔ＋ｄｅ　２、　ｌ−１３（１９８１）に記述されている。ソウバジンは 哺乳動物において血圧を低下させ、かつＡＣＴＨ（アドレノコルチコトロピック ホルモン；副腎皮質刺激ホルモン）及びβ−エンドルフィンの分泌を刺激する生 理活性を育すると報告されている。

ソウバノンのアミノ酸配列は下記のとおりである。：ｐＧｌｕ−Ｇ　１ｙ−Ｐｒ ｏ−Ｐｒｏ−１１ｅ−５ｅｒ−１１ｅ−＾５ｐ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｕ（ｅｕ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−＾１ａ −Ａｌａ−Ａｓｎ−＾ｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｔｈｙ −１１ｅ−ＮＯ３ １９８５年７月９日に発行された米国特許明細警笛４，５２８，１８９号で、発 明者がレゾリスら（Ｌｅｄｅｒｉｓ　ｅｔ　ａｔ、）の文献、及び１９８５年８ 月６日に発行された米国特許明細警笛４．５３３．８５４号で、発明者がレゾリ スらの文献には、ホワイトサッカー及びコイのウロテンシンＩがそれぞれ、ＡＣ ＴＨ刺激剤として、及び血圧降下剤として機能することが記載されている。コイ のウロテンシン■のアミノ酸配列は、下記のとおりである。： Ｈ−Ａｓｎ−＾ｓｐ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−１１ｅ−５ｅｒ−１１ｅ−＾５ ｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−＾ｓｎ−Ｍｅ ｔ−１ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｎｅｔ−＾ｌａ−Ａｒｇ−＾５ｎ−Ｇｌｕ−＾５ｎ−Ｇｌ ｎ−＾ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾ｓｎ−＾ｒｇ−Ｌｙ ｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ２他のＣＲＦ−関連ペプチ ド、即ちホワイトサッカーのウロテンンン■は、２４位のアミノ酸がイソロイシ ンであることと、２７位のアミノ酸がグルタミン酸であることを除いては、コイ のウロテンシンと同じアミノ酸配列を有している。

リングら（Ｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、）による文献、ＢＢＲＣ，Ｖｏｌ、　＋２２ ．　ｌ）ｐ、　＋２１８−１２２４　（１９８４）にはヤギのＣＲＦの構造につ いて記載されている。それは、ヒツジのＣＲＦと同じである。ｘ−１シユら（Ｅ ｓｃｈ　ｅｔ　ａｔ、）による文献、ＢＢＲＣ，Ｖｏｌ、　１２２．　ｐｐ、　 ８９９−９０５　（＋９８４）には、クシのＣＲＦが記載されているが、それは ヒツジ及びヤギのＣＲＦと一つのアミノ酸残基だけ（ヤギやヒツジのＣＲＦにお ける３３番目のセリンがアスパラギンになっている。）が異なる。ブタのＣＲＦ はパッジ−ら（Ｐａｔｔｈｙ　ｅｔｌ、）による文献、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　８２．　ｐｐ、　８７６２−８７６８　（ ＋９８５）に記載されているように単離されて、特性が決定された。ブタのＣＲ Ｆは、ラブドやヒトのＣＲＦと共通のアミノ酸配列（＋−３９残基）を育してい て、４０と４１番目のアミノ酸だけがこれらと異なっている。４０番目の残基は 、アスパラギンあるいはイソロイシンのいずれかであり、４１番目の残基はフェ ニルアラニン−アミドである。

これらの一連のペプチドは、以下の記載のように要約される。（ここでアミノ酸 の一次構造は、ＩＵＰＡＣに従う一個のアルファベット記号によって記載されて いる。） コルチコリベ１ン　科　Ｃｏｒｔｉｃｏｌ＋ｂｅｒｉｎ　Ｓｕ　ｅｒｆａｉ＋ｉ ｌ　のペプチドＣＲＦ　（ヒト／ラブド）　５ＥＥＰＰＩＳＬＤＬ　ＴＦＨＬＬ ＲＥＶＬＥＭＡＲＡＥＱＬＡＱＱ　ＡＨ５ＮＲＫＬＭＥＩＩ”ＣＲＦ　（ブタ） 　５ＥＥＰＰＩＳＬＤＬ　ＴＦＨＬＬＲＥＶＬＥＭＡＲＡＥＱＬＡＱＱ　ＡＨ３ ＮＲＫＬＭＥＮＦ”ＣＲＦ（フィッシュ）　５ＥＥＰＰＩＳＬＤＬ　ＴＦＨＬＬ ＲＥＶＬＥＭＡＲＡＥＱＬＡＱＱ　ＡＨ５ＮＲＫＭＭＥＩＦ”ＣＲＦ　（ヒツジ ／ヤギ）　５ＱＥＰＰＩＳＬＤＬ　ＴＦＨＬＬＲＥＶＬＥＭＴＫＡＤＱＬＡＱＱ 　ＡＨ５ＮＲＫＬＬＤＩＡ”ＣＲＦ（ウシ）　５ＱＥＰＰＩＳＬＤＬ　ＴＦＨＬ ＬＲＥＶＬＥＭＴＫＡＤＱＬＡＱＱ　ＡＨＮＮＲＫＬＬＤＩＡ’ｕｒｏｌ（ウロ テンンンＩ）　ＮＤＤＰＰＩＳＩＤＬ　ＴＦＨＬＬＲＮＭＩＥ（サブカーフィブ ンユ）　ＭＡＲ［ＥＮＥＲＥＱ　ＡＧＬＮＲＫＹＬＤＥＶ−ｕｒｏｌ（ウロテン ンシＩ）　ＮＤＤＰＰ［５ＩＤＬ　ＴＦＨＬＬＲＮＭＩＥ（コイ）　ＭＡＲＮＥ ＮＱＲＥＱ　ＡＧＬＮＲＫＹＬＤＥＶ−ｓａｕｖ、　（ソウハ′グン）　ｐＥｃ ＰＰＩｓｌＤＬｓ　ＬＥＬＬＲＫＭＩＥＩＥＫＱＥＫＥＫＱＱＡ　ＡＮＮＲＬＬ ＬＤＴＩ”ヒツジ及びヒト／ラットのＣＲＦは、下垂体−副腎アキシス（ｐｉｔ ｕｉｔａｒｙ−ａｄｒｅｎａｌ　ａｘｉｓ）の内分泌機能についての臨床研究に 用いられてきた。通常、１から５μｇ／ｋｇの用量を静脈内投与すると、アドレ ノフルチコトロビン（副腎皮質刺激ホルモン）の内発的な遊離を引き起こし、同 時に体液（ｐｌａｓ■ａ）内におけるコルチコステロイドを増加させる。オース ら（Ｏｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）は、ＩＯμｇ／ｋｇ及び３０　ｔｔ　ｇ／ｋｇと いう更に高い用量のヒツジ−ＣＲＦを用いた。”合成されたヒツジのコルチコト ロピンー遊離因子の影響。体液中におけるアドレノコルチコトロピンとフルチゾ ールの用量一応答性”と題されたｓ　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７１ ．　Ｉｌ＋）、　５８７−５９５　（１９８３）に記載された文献が、ヒトにお けるこのホルモンの関係を示した最初のものである。

このホルモンの非−内分泌の効果としては、皮膚の充血（皮膚炎）、呼吸の短縮 、そして１分当りの心拍量の上昇、頻脈（＋２０％）及び起こりつる血圧低下な どの身体的な兆候等の症状を含む。これらのパラメーターは、３０分以内に正常 状態まで戻り、臨床上有害であるとは考えられなかった。ＣＲＦペプチドが比較 的安全であることは、ｌμｇ／ｋｇの用量のＣＲＦを正常な子供（６−１５歳） に静脈内投与した場合に効力を示したという事実から明らかにされた。このこと は、Ｊ、Ｌ、ロスら（Ｊ、　Ｌ、　Ｒｏｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、）によって、′正 常な子供におけるヒツジーコルチコトロピンー遊離ホルモン刺激テスト”と題さ れた、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、。

６２、　ｐｐ、　３９０−３９２　（１９８６）内の論文中において報告されて いる。

しかしながら、血管漏洩を減少させる効き目を有する、ＣＲＦ、ソウバジン、及 びウロテンノン■のどれよりも短いペプチドを持つものは有用性が高いであろう 。例えば、７個から１２個のアミノ酸残基を備えたペプチドを合成するための費 用は、４０個から４１個のアミノ酸残基の長さを育するペプチドを合成する費用 よりもずっと少額であろう。と言うのは、それぞれの残基には一個ずつ次々とア ミノ酸残基を結合させて合成しなければならないからである。また、より短いペ プチドから更に選択的な生物学的な作用、あるいは経口の／局所的な作用を得る ことのできる可能性は、かなり有用性の高い要素であろう。

発　明　の　要　約 本発明の目的は、皮膚、粘膜の炎症を抑制するため、また脳組織や筋肉内に血液 成分が漏出するのを減少させるために用いることのできる比較的小さな合成ペプ チドを提供することにある。皮膚や粘膜の炎症は、熱的な障害（過剰の加熱ある いは冷却）や光照射の障害、あるいは有害な内因性の物質や外因性の物質によっ て引き起こされる。脳組織への血液成分の漏出は、脳のバゾゲン性の浮腫（ｖａ ｓｏｇｅｎｉｃ　ｅｄｅ■ａ）と呼ばれる状態に陥ることであり、脳虚血や脳梗 塞、神経外科手術による頭蓋骨内の出血等のさまざまな有害な医療上の条件によ て引き起こされる。

この出願の第１番目の発明は、ＴＮ　Ａｔ−Ａ２−Ａ３−Ａｔ　Ａｓ　Ａｓ−Ｔ ｃである一次構造の配列を有する抗炎症ペプチドを提供することにあり、ここで ＴＮは約６００ダルトン以下の分子量を有するアミノ末端部位、ＡＩからＡ６の それぞれはアミノ酸（合成のあるいは天然のアミノ酸）であって、ＡＩからＡ８ が一体となってペプチドに抗炎症作用を提供するのに役立つ活性中心を構成して いる。そしてＴｃは、部分的にアミド化されたカルボキシル末端部位であるかあ るいはアミド化されたカルボキシル末端部位からなる。

Ｔ、Ｉは、活性中心の酵素的な分解に対する抵抗性を運搬するように選択される かあるいは修飾される。それぞれのＡ＋％Ａ２及びＡｓは、Ｄ一体あるいはＬ一 体で極性のあるアミノ酸でありｓ　Ａｓｓ　Ａ２及びＡ５が一体となってペプチ ドの二次構造をとり、ペプチドの親水性の部位を構成している。またそれぞれの Ａ３、Ａａ及びＡ６は、Ｄ一体あるいはＬ一体で非極性のアミノ酸であり、Ａ３ 、Ａａ及びＡ６が一体となってペプチドの二次構造をとり、疎水性の部位を構成 している。Ｔｃは、アミ７基あるいはアミド化されたアミノ酸である。

上記の一次構造の配列を有する抗−炎症ペプチドの分類は、時々この明細書中に おいて”メンフェンンス（ｎｏｃｉｆｅｎｓｉｎｓ　：外傷防衛器）”と呼ばれ る。何故なら、それらは病毒の刺激に対して組織を守り、かつ抗−炎症薬として 用いられることができるからである。

発明にかかるノシフェンンスベブチドは、その治療上有効量、例えば約１から２ ００μｇ／ｋｇの用量を、おそらく静脈内投与、皮肉投与、あるいは筋肉内投与 によって投与されるであろう。そのような投与によって脳及び中枢神経系の血管 の透過性が減少し、脳や中枢神経の損傷などの組織障害を治療する上での治療効 果が現れる。また、このような投与は、外科手術の際に組織に血液成分が漏出す るのを抑制し、最小限に抑えるのに用いられた場合にも臨床上の効果を発揮する ものであり、それによって痛みや不快を緩和し、また既に炎症を起こしてしまっ た患者に対して更に腫脹が起きるのを抑制できる。

図面の簡単な説明 図面において： 図」は、本発明の合成ペプチドの実施例を宇宙空間感覚で示した図で、この図に おいて合成ペプチドのモデルは、Ｎ−末端から軸方向あるいは基本骨格方向に下 降してＣ−末端に向かうように見られている。

図２は、従来より知られているヒト／ラットのＣＲＦ及び本発明の実施例である ４個のペプチドに対してそれぞれ行われた生物学的検定から得られたデータをプ ロブトした図で、用量の変化に関連して起きる血管漏洩の阻害（横軸）が塩水コ ントロール（縦軸）に関連していることを示している。

好ましい実施例の詳細な説明 脳が脳虚血あるいは脳梗塞等で障害を受けると、それからバゾゲン性の浮腫が発 生し、水分の量が上昇して脳の組織構造が圧迫され、同時に脳の組織構造が破壊 されて脳細胞への酸素の供給が妨害される。その患者は意識を失い、呼吸が停止 する。皮膚や粘膜表面が、過剰の加熱や冷却によって、あるいは光の照射によっ て、あるいは病毒物質の影響によって障害を受けた場合には、バランスを保って いた液体交換の状態から、血清及びその溶質が周囲の組織に向かって自由に通過 する段階へと変換される。一般的には、神経末端、あるいは障害を受けた組織内 の細胞のうちのいずれかから、血管の透過性の増加を引き起こす物質が放出され る。続いて血液内の液体及びタンパク質は、血管の区画領域から痛みや腫脹、そ の結果として起きる組織の損傷を起こしている組織の区画領域に向かって移動す る。

本発明においては、ノシフェンシプペプチド（あるいはそれらの塩）は、噌乳動 物の皮膚、粘膜、あるいは筋肉組織の裂傷のあるところあるいは脳に損傷のある ところに起きている炎症を抑制するのに用いられつる。その投与には、約０．０ ０１から５μｇ／ｋｇ　（体１１ｋｇあたり）の用量で、血管的投与、経口投与 、あるいは局所投与が含まれる。しかしながら、投与の形態は静脈内注射、陵内 注射、あるいは筋肉内注射によることが好ましく、投与する用量は少なくとも一 回で投与されて約１から約２００μｓ／ｋｇ　（体重１ｋｇあたり）が好ましい 。そして投与は、筋肉組織の故意の裂傷（例えば開腹手術や整形外科手術による 裂傷）に先立ち約２時間前から行われることができるし、また、手術や事故の後 の３日間にも行われることができる。

投与の際には血流に載せることが最も好ましいが、脳を髄液や脳、あるいは筋肉 内に局所注射して行われることも可能である。

ノンフェンシブペプチド（外傷防衛器ペプチド）は組織からの血管漏洩を抑制す る性質を有しているため、多種多様の治療上の応用がなされる。これらのペプチ ドの臨床上の適用がなされるであろう特定の組織としては、皮膚や粘膜（例えば まぶた、鼻の膜、口腔咽頭の膜、上部気管、食道、消化管下部）が含まれるし、 また、骨格筋、平滑筋、心筋、脳の血管、肺や腎臓の血管が含まれる。例えば、 これらのペプチドの治療上の適用としては、熱症（火傷）や日焼け、凍傷、ある いは皮膚の他の炎症状態の治療のために投与することを含む。このペプチドは、 腫脹や痛み、血しょうの管外書出を減少させるのに用いられることができるであ ろう。上部気道に付着した刺激剤に対してや、喘息のような慢性のアレルギー性 疾壱で沈着した刺激剤に対しては、このペプチドは刺激を減少させたり、気管支 の炎症を抑えたり、浮腫及び血しょうの管外書出を抑制したりする働きをするで あろう。全ての組織における裂傷や外傷性の障害、例えば刃物による怪我や外科 手術、自動車事故によって受けた外傷性の障害に対してはそのペプチドは、腫脹 を押え、痛み及び炎症を抑制するために用いられるであろう。組織の低酸素症、 虚血性無酸素症あるいは浮腫の結果起きる組織の梗塞は、例えば脳の打撲や心筋 の梗塞の後に起こり、そのような梗塞に対してこのペプチドは、血管成分の組織 マトリックスへの移動を抑制して組織の生き残りを図るために用いられる。臨床 的に敗血症性のンタックの状態から引き起こされるエンドトキンンや炎症メディ エータ−等の内因性あるいは外因性の化学物質の作用を妨害するために、このペ プチドは血液の失血を減少させるために用いられることができるであろう。また 例えば腎臓や肝臓、あるいは心臓などの器官の移植のために器官を摘出する際、 その前あるいは摘出の間中に、器官の血管の樹枝状構造を完全に保存するために 投与が利用されるであろう。

このノンフェンシブペプチドは、薬剤学的に受け入れ可能なキャリアと結合させ て投与することが可能であろう。そのキャリアとしては例えば、等張塩や燐酸緩 衝液などである。このペプチドは比較的小さいため、局所投与も可能である。

鼻の粘膜を通して小さなペプチドを投与する際の配合剤及び賦形剤については、 例えば英国特許出願明細書第８７１９２４８号で、１９８８年２月２４日に公開 されたサントスリミテッド（Ｓａｎｄｏｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）の出願の文献に記 載されている。傷のない皮膚の上から投与できるように透過性を高めた局所剤と しての配合は、好適に薬効が高められた製剤を含むものであり、その多くの製剤 については米国特許明細警笛４゜０９１．０９０号であって、１９７８年３月２ ３日に発行され、発明者がシポス（Ｓ　ｉ　ｐｏｓ　）の文献に記載されている 。そのノンフェンシブペプチドは、有機酸あるいは非有機酸を用いて薬剤学的に 受け入れ可能な塩の形態を形成し、その塩の形態で投与されることができる。薬 剤学的に受け入れ可能な塩の形態を形成する好適な酸の例としては、塩酸、硫酸 、燐酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、マロン酸、サリチル酸、フマル酸、コハク 酸、酒石酸、乳酸、グルコン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベンゼンスルホ ン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシメタンスルホン酸、ヒ ドロキシェタンスルホン酸が挙げられる。

塩はまた、好適な有機の薬剤学的に受け入れ可能な塩基を加えた塩としても形成 される。これらの有機の塩基はある種のものであり、その種類の制限は当業者に 容易に理解されるところである。単に例示の目的でその種類を列挙すると、メチ ルアミン、ツメチルアミン、及びトリエチルアミン等の七ノー、ジー、及びトリ アルキルアミン類；　モノ−、ジー、及びトリエタノールアミン等の七ノー、ノ ー、トリヒドロキシアルキルアミン類；　アルギニンやリジン等のアミノ酸；グ アニジノ：　Ｎ−メチルビペラジン；　モルフｔリン；　エチレンノアミン；Ｎ −ペンジルフェネチｌレアミン；　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等 が含まれる（参照として、例えば”薬剤学的な塩類（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　５ａｌｔｓ）”　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｓｃｉ、　６８　（１）：　ｌ− １９（＋９７７）を挙げる。）。

本発明の７シフエンンブペプチドは、Ｔ＋−Ａｓ−Ａ２−Ａ３−Ａ４　Ａ５　Ａ ａ−ＴＣと示される一次構造の配列を有している。このようにアミノ末端あるい はＴＮは、約６００ダルトン以下の分子Ｉを有しており、本発明のペプチドにと っての活性中心の酵素的な分解に対する抵抗性を運搬するように選択されるかあ るいは修飾されている。ＴＮのための好ましい部分は、ジー、トリー、テトラ− １あるいはペンタペプチドか、それらの誘導体である。特に好ましいＴＮの形態 は、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシンあるいはＤ−グルタミンである。特に好ま しいＴＮの誘導体の形態は、Ｎ−メチルフェニルアラニンあるいはピログルタミ ン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ）である。酵素的な分解に対して抵 抗性を運搬する育用な部分の他の例としては、ｐ−クロロ−フェニルアラニンあ るいはｐ−ニトロ−フェニルアラニンである。低級のアルキルがアルギニン及び リジンをアルキル化し、またアスパラギン及びグルタミンの０−エチルエーテル を形成した。安定化され、また有効性が増強されると共に作用の持続時間を長く された天然にないアミノ酸については、例えばネストールら（Ｎｅｓｔｏｒ　ｅ ｔ　ａｌ、）による、Ｊｏｕｒ、　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃ、　Ｃｈｅｗ、、　３１　 （１）。

ｐｐ、　８５−７２　（＋９８８）内の論文に示されている。

Ａｓ及びＡ２はそれぞれ塩基性で、極性のアミノ酸（合成のあるいは天然のアミ ノ酸）である。そしてＡ１及びＡ２は、Ｄ一体あるいはＬ一体の形態であり、そ れぞれは好ましくはアルギニン及びリジンの中から選択される。

それぞれのＡ３、Ａａ及びＡ６は、塩基性で非極性のアミノ酸であり、好ましく はロイシン、イソロイシン、及びメチオニンの中から選択され、これに対しＡ５ は酸性で極性のアミノ酸であり、好ましくはグルタミン酸及びアスパラギン酸の 中から選択される。

６個のアミノ酸残基であるＡｓからＡ６は、一体となってペプチドに抗−炎症作 用を提供するのに役立つそのペプチドのための活性中心を構成している。それぞ れのＡ１１Ａ２及びＡ５は極性のあるアミノ！！２（Ｄ一体あるいはＬ一体内の アミノ酸である。）であるため、Ａｓ、Ａ２及びＡもが一体となってペプチドの 二次構造をとることでペプチドの親水性の部位を構成している。また、それぞれ のＡ３、Ａ−及びＡ６は非極性のアミノａ（Ｄ一体あるいはＬ一体内のアミノ酸 である。）であるため、Ａ３、Ａ４及びＡ６が一体となってペプチドの二次構造 をとることでペプチドの疎水性の部位を構成している。活性中心がＤ一体及びＬ 一体を混合した形である場合、それらは”ランダムコイル（ｒａｎｄａｓ　ｃｏ ｉｌ）″を形成すると考えられている。

しかしながら、例えばそれらがすべてＬ一体である場合には、それらはα−ヘリ ックスを形成するものと考えられている。いずれにしても、３個の極性のある残 基が共に関連し、同様に３個の疎水性の残基が共に関連しているため、その分子 は両親媒性の性質を育している。

図１を見ると、特に好ましい実施例の宇宙空間感覚のモデルが示されている。

ここでは赤のハツチングは極性のある残基を表しており、これに対して青のハツ チングは疎水性の残基を表している。そのモデルは、その分子の軸にそってＮ− 末端から下流方向に眺められる。親水性の部位を時計回りの方向に読むと、ＡＩ はアルギニンとして示され、Ａ５はグルタミン酸として、そしてＡ２はリジンと して示されている。時計回りと反対方向に疎水性の部位を読むと、Ａｌはメチオ ニンとして示されており、Ａｓはロイシンとして、Ａａはイソロイシンとして示 されている。このように特に好ましいペプチドの実施例では、−次構造の配列は 次のように示される。： Ｔｎ　ＲＫ　Ｌ−Ｍ−Ｅ−１−Ｔｃ ［ここで、Ｔｃは、Ｄ−ロイシンアミドであり、そしてＴＮは、特定されないア ミノ酸である。］図１では、本発明のペプチドの疎水性領域及び親水性領域が、 その親水性領域とその疎水性領域とが概して反対になるように、活性中心の基本 骨格からそれぞれ外側に放射状に広がっていることも示している。即ち、その極 性の残基は、疎水性残基と互いに入り組んではいない。

第２番目の塩基性の残基（即ちＡ２）、酸性の残基（ＡＳ）、あるいは第３番目 の疎水性の残基（Ａ６）のうちのいずれかをＤ一体あるいはＬ一体のアスパラギ ンあるいはグルタミンで置換することによって、ここに記載された残基を変化さ せることが可能であると考えられているが、薬効は減少するようである。しかし ながら、アスパラギンあるいはグルタミンによる酸性残基の置換は、分子の安定 性を増加するであろう。何故ならば、酸性のカルボキシル基リガンドが、アルギ ニンあるいはりジン残基の塩基性のアミノリガンドとは、もはやうま（反応でき なくなるからである。

最後にＴｅは、アミ７基あるいはアミド化されたアミノ酸である。好ましいアミ ド化されたアミノ酸は、Ｄ−ロイシンアミドである。なぜならば、この残基はＣ −末端からの酵素的な開裂に抵抗性を示すからである。例えばフェニルアラニン 等の非極性の芳香族からなる残基も、Ｔｃのふされしい部分となることができる 。

ノシフェンシブベブチドは、種々の好適な化学的な方法によって合成することが できる。好ましい方法としては固相合成法が挙げられ、手動あるいは自動で行わ れる。それは最初にアール、ビー、メリフィールド（Ｒ，Ｂ、　１ｌｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ）によって開発された方法で、ジェイ、エム、ステワード及びジェイ、 デー、ヤング（Ｊ、　Ｍ、　Ｓｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ ）によって、′固相のペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄ ｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”（＋９８４）において記載されている。化学的合成 法とは、あらかじめ決められた配列に従って、Ｃ−末端から順番にアミノ酸を結 合してゆ（方法である。塩基性の固相法では、好適な不溶性の合成樹脂支持体に 、Ｃ−末端が保護されたアルファーアミノ酸をカブプリングすることが必要であ る。本発明の７シフエンシンベブチドでは、完全であるＣ−末端のアミドが合成 されるように、ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）あるいは４−メチルベンズヒド リルアミン（ＭＢＨＡ）からなる合成樹脂が必要とされる。合成法に用いるアミ ノ酸は、先に合成されている残基（あるいは合成樹脂支持体）に正確にペプチド 結合の形成ができるように、アルファーアミノ基を保護する必要がある。カルボ キシル基末端に縮合反応が完成した時、続いてそのアルファーアミノ保護基は次 の残基の付加ができるようにはずされる。アルファーアミノ基の保護基のＩｌ履 のいくらかについては、参考文献ジェイ、エム、ステワード及びジェイ、デー、 ヤング（Ｊ、　！１、５ｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ）によ って、′固相のペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙ ｎｔｈｅｓｉｓ）”（＋９８４）に記載されており、ここでは酸に不安定なウレ タンをベースとしたターシャリーープチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔｉａｒｙ −ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：　Ｂ　ｏ　ｃ　）が歴史的に好ましく用 いられている。他の保護基で、化学的手法に関連して用いられる基としては、塩 基に不安定な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙ ｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ　：　Ｆ　ＭＯＣ）を含む基が用いられ る。

また、反応性のアミノ酸側鎖の官能基は、合成が終了するまで保護することが必 要である。その複合体の機能的に保護された基の種類は、それらを利用する上で 手法や利用への限界とともにエム、ボーダンスキー（冒、　Ｂｏｄａｎｓｋｙ） による”ペプチド合成法（Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”　（＋９７ ６）や、ジェイ、エム、ステワード及びジェイ、デー、ヤング（Ｊ、　Ｍ、Ｓｅ ｔｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ）による”固相のペプチド合成法 （Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）″　（＋９ ８４）に記載されている。

固相反応合成法は、本発明のＣ−末端のアルファーアミ７基が保護されたアミノ 酸残基をカップリングすることによって開始される。カブプリングは、ジクロロ ヘキン力ルポジイミド（ＤＤＣ）等の活性化試薬を必要とし、１−ハイドロオキ シベンゾ−トリアゾール（ＨＯＢＴ）、ジイソプロピルカルボジイミド（Ｄ　Ｉ 　ＩＰＣ）、あるいはエチルジメチルアミノプロビルカルボジイミド（ＥＤＣ） を用いたり、あるいは用いなくて行われる。Ｃ−末端の残基をカップリングした 後アルファーアミノ基の保護基は、酸に不安定なターシャリーープチルオキシ力 ルポニル（Ｂｏｃ）基の場合ではジクロロメタン中のトリフル７口酢酸（２５％ あるいはそれ以上の濃度）を用いて取り除かれる。ジクロロメタン中のトリエチ ルアミン（１０％）を用いた中和段階では、フリーのアミン（その塩に対するア ミン）が回収される。Ｃ−末端残基が前記合成樹脂に加えられた後、脱保護基の 段階、中和の段階、及びカブプリングの段階のサイクルが、中間体の洗浄段階と ともに保護されたペプチド鎖を延長する目的で繰り返される。最終的に完全に保 護されたペプチドが合成樹脂支持体の上に合成された後、試薬を用いることによ って合成樹脂からペプチドを開裂させるとともに側鎖の保護基が外される。無水 のフッ化水素（ＨＦ）は、酸に不安定なターシャリー−ブチルオキシカルボニル 基（Ｂ。

Ｃ）の化学基を開裂する。例えばジメチルサルファイドやアニソール等の数種の 核性のスカベンジャー（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）を用いると、側鎖の官能基におけ る副反応をとりわけ避けることができる。

本発明にかかるたくさんのノシフェンンンペプチドが合成され、その抗−炎症作 用を生物学的検定法を用いてテストされている。これらのペプチドの特に好まし いものの合成法が実験例１として特別に記載されている。実験例２には、多くの これらのペプチドをまとめた表１、及び用量に対する応答性を比較的に示した表 ２を用いてその生物学的検定法の手法が記載されている。

実　験　例　１ 下記の構造式を有する本発明にかかるノシフェンシンペプチドの合成：Ｄ−Ａｌ ａ、　Ｈｉｓ、　Ｓｅｒ、　Ｄ−＾ｓｎ、＾ｒｇ、　Ｌｙｓ、　Ｌｅｕ、　Ｍｅ ｔ、　Ｇｌｕ、　ｌｌｅ、　Ｄ−Ｌｅｕ−ＮＨａのyプ チドが、４−メチルベンズヒドリルアミン　ハイドロクロライド合成樹脂（ＭＢ ＨＡＨＣ＋合成樹脂）上においてＣ−末端のアミドから順次合成された。アミン 置換基の範囲は合成樹脂（カルバイオケム、インコーポレーテブド（ＣａｌＢｉ ｏｃｈｅ■、ｌｎｃ、Ｌ　バケム、インコーボレーテッド（Ｂａｃｈｅｍ、ｌｎ ｃ、）製）１グラム当り０．４から０．６ミリモルのものが、商業的に入手でき る。活性アミンの１ミリモルに等価な量の合成樹脂が、適当な溶媒（ジクロロメ タン及び／またはメタノール）を用いて洗浄された。ジクロロメタン（ＤＣＭ） 中のトリエチルアミン（ＴＥＭ）を用いてＭＢＨＡ合成樹脂の中和が行われて塩 の形態が取り除かれ、アミノ酸誘導体を保護するテトラエチルアミン（ＴＥＡ） が続いて付加できるようになった。Ｃ−末端の残基、即ちＢｏｃ−ロイシン（モ ノハイドレート）は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）　中の１モルのジクロロへキシ ルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて反応性の合成樹脂のアミン基に結合された 。一般的には等モル置のカップリング試薬（ＤＣＣ）及びＢｏｃ−アミノ酸が、 過剰量（５倍量）の合成樹脂内に添加される。

そのＢｏｃ−アミノ酸は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）及び／またはジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ　）中に溶解されるが、特に合成樹脂の溶解度に左右される。

トリフルオロ酢酸溶液（２５％のジクロロメタン溶液）で酸性下膜保護基をし、 ジクロロメタン中のトリエチルアミン（１０％）を用いて中和された後、段階を 追ったｌｌＩ築が、アミノ末端方向に続けられる。Ｂｏａ−アルギニン（Ｔｏｓ ）、ＢＯｃ−ヒスチジン（Ｔｏｓ）、及びＢｏｃ−Ｄ−アスパラギンがジメチル ホルムアミド（ＤＭＦ）及びジクロロメタン（ＤＣＭ）の９：ｌの混合液中でカ ップルされた。ｐ−トルエン−スルホニル（Ｔｏｓ）基は、アルギニンのグアニ ジン及びヒスチジンのイミダゾールを保護するために用いられる。牛サンチル（ Ｘａｎ）環は、アスパラギンのアミド基を保護するために用いられた。２−クロ ロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃ１ｚ）は、リジンの側鎖に対して用いられ た。ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）は、セリンの水酸基で用いられ、ベンジルエス テル（ＯＢ、ｚｌ）は、グルタミン酸のカルボキシル基を保護するために用いら れた。

保護されたアミノ酸のカップリングを終えた際、次のような中間体を生成した。

即ち：　Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ、　Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）、　５ｅｒ（Ｂｚｌ）、　Ｄ −Ａｓｎ（Ｘａｎ）、　Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｌｙｓ（２ＣPｚ）、　Ｌ ｅｕ、　Ｎｅｔ、　Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、　ｌｉｅ、　Ｄ−Ｌｅｕ−合成樹脂支 持体である。保護されたペプチドの合成樹脂結合体の開裂、及び脱保護基は、フ ッ化水素（ＨＦ）、求核性のスカベンジャー（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるジメ チルサルファイド、及びアニソール（あるいはその等個物）を用いた酸分解を行 うことを必要とし、それは０℃で３０分という条件下で行われた。好ましくは、 予備的に低温、即ち０℃で２０分間で開裂を行った後、０℃で３０分間副反応の 可能性を減少するように開裂が行われた。代わりにフッ化水素に比較して高濃度 のジメチルサルファイド（ジメチルサルファイドとフッ化水素の体積比が３：１ ）を用い、０℃で３時間開裂反応が行われる”低量のＨＦ”法では、ＭＢＨＡお よびＢＨＡ合成樹脂で通常のＨＦ開裂が進行し、副反応を抑制することができる 。

開裂装置から減圧下でＨＦを除去してから、抽出を行う目的でドライエチルエー テル及び／またはクロロホルムを用いてペプチド−合成樹脂の多数回の洗浄が行 われる。続いて１モルの酢酸水溶液を用いて濾過が行われ、それにより得られた 濾過物は冷凍及び凍結乾燥がなされる。用いた合成樹脂の重量を測定して、得ら れたペプチドの収量が決定される。

実験例１は、好ましい実施例（Ｄ−ａ　−Ｈ−５−ｎ　−Ｒ−に−Ｌ−Ｍ−Ｅ　 −１−１−ＮＨａ）の合成法を示している。ノシフェンシプペプチドの系列は、 同様に合成され、かつテストされている。合成されたペプチドのだいたいの純度 は、約５７％から９４％（ＨＰＬＣによって決定される場合）の範囲であった。

表１には、本発明にかかる多種多様の化合物に対するアミノ酸配列及び純度のデ ータが整理して示されている。

この表記において表中にて用いられている生物学的検定法の結果及びその他の記 載についての略語は、即ち二人文字のアルファベット文字は、アミノ酸をコード しており、アルファベット文字の小文字は、アミノ酸のＤ体を表している。全て のペプチドは、カルボキシルアミド末端あるいはカルボン酸以外で合成された。

ｐＥ”はピログルタミル（ｐｙｒｏｇｌｕｔａ■ｙｌ）を　ＩＩＭ・”はメチオ ニンスルホキサイドを、そして”Ｆ”″はＮ−メチルフェニルアラニンを意味し ている。

実　験　例　２ 前記説明したような固相法、あるいは実験例１で説明したような変形法を用いて 本発明のペプチドは合成され、そしてほとんどのペプチドのだいたいの純度は高 速液相クロマトグラフィーによって得られ、表１に記載されている。このペプチ ドは、塩溶液または不活性なデキストリン溶液（モレキュゾールＯ１ｏ　Ｉｅｃ ｕｓｏ　ｌ　）　）のいずれかに溶解されて、ベンドパルビタールで麻酔をかけ たラットに静脈内注射された。その後、そのラットの後ろ足が５８−６０℃の水 に１分間浸漬されて、その後ろ足の！ｌの増加、即ち浮腫及び腫脹の指標が３０ 分後に測定された。いくらかのペプチドでは、筋肉の損傷後の血管の漏洩を抑制 する物質としての作用がテストされた。通常、緩衝液で治療された動物（コント ロール）の後ろ足の直置は、熱障害の後、約６８−８１％近く増加する。重量の 増加は、反対側の類似の部分の熱処理していない後ろ足と比較される。

新規なペプチドの生理活性のスクリーニングにおいては、最初は用量が５腸ｇ／ ｋｇで静脈内注射が行われた。後に研究を進めることによって、更に強い生理活 性が期待できるようになった場合においては、ｌａｇ／ｋｇの用量を静脈注射す るスクリーニングが行われた。特に意味のある重要な活性が存在するペプチドに 対しては、リッチフィールド及びウィルコキソン（Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ　ａｎ ｄ　Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）の方法に従う良い用量一応答性相関関係の分析が誘導さ れた。

このようにそれぞれのペプチドは、５８℃の水に１分間右の後ろ足を浸漬する１ ０分前に静脈内注射（条件として指定された置、通常は１または５１ｇ／ｋｇ、 あるいは充分な用量一応答性相関関係の分析近くの置で）され、そして、３０分 後に得られた両方の後ろ足のＭ　！　ｉｊ、ｌ］定された。統計学的なＭ密度を 得る目的で最小でも６匹の動物がそれぞれのグループで用いられた。重量％で表 した増加率は、（熱処理を施した後ろ足の！ＩＩ／Ｍ処理をしていない後ろ足の ＩＩ）ｘ＋ｏｏとして計算され、そして塩溶液を施したコントロールのグループ の値の％に比較された。尚、それらの計算は同時に行われた。塩溶液を施した動 物の後ろ足を室温の水（２２℃）に浸漬した後では、その後ろ足の重置が上昇す ることはなかったが、蝕処理を施した後の動物では、その後ろ足の重量は６８か ら８１％までもの上昇が認められた。

表　１ 表１のデータを参照すると、２９個の興なるノシフェン７プペプチドが準備され ており、それらを後ろ足が炎症を引き起こすような状況におかれた動物に投与す ると、統計学上の意味を育するほどの浮腫の抑制効果を示すということが理解で きる。これらの７シフエンンブペプチドのうちの多くのものは、腫脹を顕著に減 少する効果を示している。表１において、′塩水の値　％”が”１００％”であ るということは、腫脹の減少作用が全（ないということを意味しているので、− 次構造が”ａＨ５ｎＲＫＬＬＥ　Ｉ　ｌ″　（０，４％が投与された場合の塩水 の値は１９％という値を示している。）やａＨ３ｎＲＫＬＭｅ　Ｉ　ｌ″　（塩 水の値は２４％である。）、及びａＨ３ｎＲＫＩ　ＩＥ　Ｉ　ｌ”　（塩水の値 は２４％である、）であるようなペプチドは、この他（１）　−（３）として合 成されたペプチドも加えて、実質的に腫脹を抑制することのできる点で特に顕著 な評価を有するものである。（１）＝（４）として示されている４樺の本発明に かかるアナログについては更に分析が進められ、表２中の生物学的活性のデータ として示されているように従来のヒト／ラットのＣＲＦと比較して特徴的である 。

表　２ ＃図２におけ　ＥＤ５０（９５％）信用度）るへ゛７゛チド　：二く（１１文１ 　−一鼠１１ＫＬＩＥＩ」ｚＬｌｌ−−Ｌ！−”’ヒト／ラブドのＣＲＦ　Ｏ， ０＋３（，００２−、＋８９）　３２．０（１）　ａＨ３ｎＲＫＬＭＥ１１　０ ．１２（，０６−０，２５）　３．６　１（２）　ａＨ３ＮＲＫＬＭＥ１１　０ ．５６（，２８−１，１３）　２．４　１１５（３）　ａＨ５ｎＲＲＬＭＥ　Ｉ 　ｌ　Ｏ，８３（，２９−１，３９）　４．１　１１５（４）　ａＨ５ｎＲＫＬ ＬＥ１１　０．７２（，３Ｂ−１，４４）　２．９　１／６リブチフイールド及 びウィルコキソン（Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ　ａｎｄ　Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）　（＋ ９４９）の方法に従って対数〜プロビット分析されている。

表２及び図２を参照すると、従来より周知のヒト／ラブドのＣＲＦについての傾 きは、ノシフェンシンベブチドの傾きよりも大きく、平行ではないことがわかる 。このことは、ヒト／ラブドのＣＲＦがツノフェンシンとは異なる作用機序を有 しているらしいことを意味している。ヒト／ラブドのＣＲＦを用いることで得ら れる腫脹の抑制の最大値は６４％であり、これに対しノシフェンシンを用いた場 合ではそれは８０％以上であった。このようにノシフェンンンは、従来より周知 のヒト／ラットのＣＲＦよりも血管の漏洩を減少させることができる点でかなり 効果的であると思われる。

要約すると、本発明の７ノフエンンンは、打撲（脳組織）、火傷あるいは凍傷に よる障害（皮膚組織）、喘息（粘膜）、及び外科手術（腹部の筋肉及び／または 整形外科的な筋肉）等の障害を受けた組織の治療に用いることができることがわ かる。

本発明は、好ましい特定の実施例と関連して上記に記述されていると理解すべき であって、その記載事項や実験例は本発明を説明するために記述されており、こ れにより本発明の範囲を制限するものではない。本発明の範囲は以下の請求の範 囲によって限定される。

０．０＋　０．１　１．０ ｍｇ／ｋｇ榊除１馳を射 ム＝従来技術にががるヒト／ラットのＣＲＦΔ＝本発明のペプチド（１） ・＝本発明のペプチド（２） 口＝本発明のペプチド（３） ０＝本発明のペプチド（４） 要　約　書 次の一次構造の配列を有する比較的小さな合成の抗−炎症ペプチドが提供された 。即ちその配列は、Ｔｎ　Ａｌ−Ａ２−Ａ３　Ａａ−Ａｓ　Ａａ−Ｔｃ　にこで 、ＴＮはアミノ末端部位であり、ＡｌからＡ６のそれぞれはＤ一体あるいはＬ一 体の合成のあるいは天然のアミノ酸であり、更にＴｃは部分的にアミド化された カルボキシル末端部位であるかあるいはアミド化されたカルボキシル末端部位で ある。］それぞれのＡＩ、Ａ２及びＡ５は極性のあるアミノ酸であり、これに対 しそれぞれのＡ３、Ａ４及びＡ６は非極性のアミノ酸である。これらの比較的小 さな合成ペプチドは血管漏洩を抑制し、脳や皮膚、粘膜及び筋肉における障害に 関連して起きる浮腫を治療する場合などの適用例において哺乳動物に有効に投与 される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の一次構造の配列を有することを特徴とする抗−炎症ペプチド。 【配列があります】 ［ここで、ＴＮは約６００ダルトン以下の分子量を有するアミノ末端部位、Ａ１ からＡ６のそれぞれはアミノ酸（合成のあるいは天然のアミノ酸）であって、Ａ １からＡ６が一体となってペプチドに抗−炎症作用を提供するのに役立つ活性中 心を構成しており、Ｔｃは部分的にアミド化されたカルボキシル末端部位である かあるいはアミド化されたカルボキシル末端部位からなる。 更にここで、 ＴＮは、活性中心の酵素的な分解に対する抵抗性を運搬するように選択されるか あるいは修飾され、； それぞれのＡ１、Ａ２及びＡ５は、Ｄ−体あるいはＬ−体で極性のあるアミノ酸 であって、Ａ１、Ａ２及びＡ５が一体となってペプチドの二次構造をとることで ペプチドの親水性の部位を構成しており、； それぞれのＡ３、Ａ４及びＡ６は、Ｄ−体あるいはＬ−体で非極性のアミノ酸で あって、Ａ３、Ａ４及びＡ６が一体となってペプチドの二次構造をとることでペ プチドの疏水性の部位を構成しており、； Ｔｃは、アミノ基あるいはアミド化されたアミノ酸である。］２．前記疎水性の 部位及び前記親水性の部位は、その親水性部位とその疎水性部位とが概して反対 になるように、それぞれ外見上その活性中心である基本骨格から放射状に広がっ ていることを特徴とする請求の範囲第１項記載の抗−炎症ペプチド。 ３．前記Ａ１及びＡ２は、それぞれ塩基性で極性を有するアミノ酸であることを 特徴とする請求の範囲第１項記載の抗一炎症ペプチド。 ４．前記Ａ５は、酸性で極性を有するアミノ酸であることを特徴とする請求の範 囲第１項記載の抗一炎症ペプチド。 ５．前記Ａ３、Ａ４及びＡ６は、塩基性で非極性のアミノ酸であることを特徴と する請求の範囲第１項記載の抗−炎症ペプチド。 ６．前記ＴＮは、ジ−、トリ−、テトラ−またはペンタ−ペプチド、あるいはそ れらの誘導体であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の抗一炎症ペプチド 。 ７．前記ＴＮは、Ａ１のアミノ酸に隣接して結合しているＤ−アスパラギン、Ｄ −チロシンあるいはＤ−グルタミンを含むことを特徴とする請求の範囲第６項記 載の抗一炎症ペプチド。 ８．前記誘導体は、Ｎ−メチルフェニルアラニンあるいはピログルタミン酸（ｐ ｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ）を含むことを特徴とする請求の範囲第６項 記載の抗一炎症ペプチド。 ９．前記Ｔｃは、Ｄ−ロイシンアミドあるいはフェニルアラニンであることを特 徴とする請求の範囲第１項記載の抗一炎症ペプチド。 １０．下記の一次構造の配列を有することを特徴とするペプチド。 【配列があります】 ［ここで、 ＴＮは、約６００ダルトン以下の分子量を有するアミノ末端部位であり、Ｔｃは 、部分的にアミド化されたカルボキシル末端部位であるかあるいはアミド化され たカルボキシル末端部位であり、Ａ１は、Ｄ−あるいはＬ−体のアルギニンであ り、Ａ２は、Ｄ−あるいはＬ−体のアルギニンまたはリジンであり、Ａ３は、Ｄ −あるいはＬ−体のメチオニン、ロイシンあるいはイソロイシンであり、 Ａ４は、Ｄ−あるいはＬ−体のイソロイシン、ロイシン、メチオニンあるいはメ チオニンスルフォキサイドであり、 Ａ５は、Ｄ−あるいはＬ−体のグルタミン酸、グルタミンあるいはアスパラギン 酸であり、そして Ａ６は、Ｄ−あるいはＬ−体のイソロイシン、ロイシンあるいはアスパラギンで ある。］ １１．前記ＴＮは、ジ−、トリ−、テトラ−またはペンタ−ペプチド、あるいは それらの誘導体であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のペプチド。 １２．前記ＴＮは、Ａ１のアミノ酸に隣接して結合しているＤ−アスパラギン、 Ｄ−チロシンあるいはＤ−グルタミンを含むことを特徴とする請求の範囲第１１ 項記載のペプチド。 １３．前記誘導体は、Ｎ−メチルフェニルアラニンあるいはビログルタミン酸を 含むことを特徴とする請求の範囲第１１項記載のペプチド。 １４．前記Ｔｃは、Ｄ−ロイシンアミドあるいはフェニルアラニンであることを 特徴とする請求の範囲第１０項記載のペプチド。 １５．下記の一次構造の配列を有することを特徴とする合成ペプチド。 【配列があります】 ［ここで、 ＴＮは、ジ−、トリ−、テトラ−またはペンタ−ペプチド、あるいはそれらの誘 導体であり、そして Ｔｃは、アミノ基あるいはアミド化されたアミノ酸である。］１６．前記ＴＮは 、酸素的な分解に対する抵抗性を運搬することを特徴とする請求の範囲第１５項 記載の合成ペプチド。 １７．抗一炎症作用を示す用量の下記に示す一次構造の配列を有するペプチドあ るいはそのペプチドの薬剤学的に受け入れ可能な塩を、組織の障害あるいは組織 の炎症を起こす以前の約２時間以内に投与するか、あるいは組織の障害あるいは 組織の炎症を起こした後の３日の間投与することを特徴とする哺乳動物における 炎症を治療する方法。： 【配列があります】 ［ここで、 ＴＮは、約６００ダルトン以下の分子量を有するアミノ末端部位であり、Ｔｃは 、部分的にアミド化されたカルボキシル末端部位であるかあるいはアミド化され たカルボキシル末端部位であり、それぞれのＡ１、Ａ２及びＡ５は、Ｄ−体ある いはＬ−体で極性のあるアミノ酸であり、 それぞれのＡ３、Ａ４及びＡ６は、Ｄ−体あるいはＬ−体で非極性のアミノ酸で ある。］ Ａ３、Ａ４及びＡ６が一体となってペプチドの二次構造をとることでペプチドの 疎水性の部位を構成しており、； Ｔｃは、アミノ基あるいはアミド化されたアミノ酸である。］１８．前記投与の 用量が、約１から約２００μｇ／ｋｇ（体重１ｋｇあたり）の少なくとも一回で あることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の炎症を治療する方法。 １９．前記投与が、静脈内注射、皮内注射あるいは筋肉内注射で行われることを 特徴とする請求の範囲第１８項記載の炎症を治療する方法。 ２０．前記ペプチドは、薬剤学的に受け入れ可能なキャリアとともに投与される ことを特徴とする請求の範囲第１７項記載の炎症を治療する方法。