FI91413C - Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten CRF-analogien valmistamiseksi - Google Patents

Description

i 91413

MenetelmS farmaseuttisesti kayttOkelpoisten CRF-analogien valmistamiseksi

Tama keksintO kohdistuu menetelmaan farmaseuttises-5 ti kéyttOkelpoisen kortikotropiinia vapauttavan tekijSn j ohdannai sen valmi stamiseksi.

KeksinnOn tausta

Hypotalamuksella on keskeinen osa adenohypofyysin kortikotrooppisten solujen eritystoimintojen saatelyssa.

10 Hypotalamuksen erittamat aineet kasvattavat aivolisakkeen ACTH-erityksen nopeutta. Fysiologinen kortikotropiinia vapauttava aine (CRF), toisin sanoen lampaan (oCRF), ka-rakterisoitiin vuonna 1981 ja yhdysvaltalaisessa patentis-sa n:o 4 415 558 sen kaavan ilmoitettiin olevan: H-Ser-15 Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-

Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2.

Rotan CRF:lia (rCRF) on esitetty olevan kaava: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-20 Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-

Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2 j a siihen voidaan vaihtoehtoisesti viitata nimelia rotan amu-niini. Ihmisen CRF:n kaavan on madritetty olevan ilmeises-ti sama kuin rCRF:n. Synteettiset rCRF ja oCRF stimuloivat 25 ACTH- ja β-endorfiiniaktiivisuutta in vivo ja in vitro ja alentavat huomattavasti verenpainetta pitkdksi aikaa.

KeksinnOn vhteenveto

KeksinnGn mukaisesti valmistetuille CRF-peptidien analogeilla on ainakin olennaisesti sama edelia kuvattu 30 biologinen vaikutus kuin luonnon peptideilld.

Valmistettaviin farmaseuttisiin tuotteisiin kuulu-vat tailaiset CRF-analogit tai niiden ei-toksiset additio-suolat sekoitettuha farmaseuttisesti tai elSiniaakinnaili-sesti hyvåksyttavaan nestemaiseen tai kiinteaan kantajaan.

35 Tailaisia peptideja tai farmaseuttisesti tai eiainiaakin- 2 nailisesti hyvaksyttavia additiosuoloja voidaan keksinnOn mukaan antaa nisakkaille, erityisesti ihmisille ACTH-, β-endorfiini-, β-lipotropiinierityksen, muiden pro-opiome-lanokortiinigeenin tuotteiden ja kortikosteronin erityksen 5 saatelemiseksi ja/tai verenpaineen alentamiseksi ja/tai mielentilaan, kayttaytymis- ja ruoansulatustoimintoihin ja autonomisen hermoston toimintaan vaikuttamiseksi. Edullisten suoritusmuotolen vksitviskohtalnen kuvaus

Peptidien maarittelyssa kaytetty nimistd on Schro-10 derin & Lubken teoksessa "The Peptides", Academic Press (1965) erittelemS ja siinS on tavanomaisen esitystavan mukaisesti aminoryhma vasemmalla ja karboksyyliryhmM oi-kealla puolella. Normaaleja 3-kirjaimisia lyhennyksia k3y-tetaan alfa-aminohappotahteiden identifioimisessa, ja kun 15 aminohappotShteelia on isomeerimuotoja, tarkoitetaan ami-nohapon L-muotoa, ellei nimenomaisesti ole muuta esitetty, esimerkiksi Ser = L-seriini, Nle = L-norleusiini, Nva = norvaliini, Har homoarginiini, Orn = ornitiini jne. Lisaksi kaytetaan seuraavia lyhenteité: leu = joko L-leusii-20 ni tai CaCH3-L-leusiini (CML) ja ala = joko L-alaniini tai CaCH3-L-alaniini (CMA).

Keksintb kohdistuu CRF-analogin valmistamiseen, jolla on kaava (I) H-^-Rj-Ra-R^-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-25 Arg-Glu-R18-Leu-Glu-R2X-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-

Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2, jossa Rx on Ser tai des Rx; R2 on Gin, tai des R2; R3 on Glu, D-Tyr tai des R3; R4 on Pro tai D-Pro; Rle on Nle tai Met; R21 on Met tai Nle.

30 On syntetoitu CRF-agonisteja, jotka ovat ainakin yhta tehokkaita ja usein tehokkaampia kuin luonnon CRF. On edullista, etta naissa analogeissa on seuraavat tahteet, joilla on suuri alfa-kierteen muodostustaipumus: Rx on Ser, R2 on Gin, R3 on Glu ja R4 on Pro. Erityisen tehokkaaksi on 35 havaittu analogi: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp- 91413 3

Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2, johon jaijempana viitataan nimelia AHC ("alpha-helical CRF", alfa-kierteinen CRF); sen tehokkuus 5 sSilyy, vaikka si ta lyhennetaan N-paasta yhden - vilden tahteen verran. Jos sita kuitenkin lyhennetaan tahteiden 1-7, 1-8 tai 1-9 poistamiseksi, muodostuu CRF:n kil-pailevia antagonisteja.

Peptidit syntetoidaan sopivaa menetelmaa, kuten yk-10 sinomaan kiintean faasin tekniikkaa, osittaista kiintean faasin tekniikkaa, fragmenttikondensaatio- tai klassista liuoslisaysmenetelmaa kayttaen. Eraita CRF-analogeja, joissa ei ole D-isomeeri- tai epaluonnollisia aminohappo-tahteita, voidaan syntetoida myOs askettain kehitettya 15 yhdistelma-DNA-tekniikkaa kayttaen.

KeksinnOn mukaiselle menetelmaile CRF-analogien valmistamiseksi on tunnusomaista, etta (a) muodostetaan peptid!, jossa on vahintaan yksi suojaryhma ja jolla on kaava (II) 20 X^RiU^-RjUM-RsiX5 tai X)-R4-Pro-Ile-Ser(X2) -Leu-Asp( X5) -Leu-Thr (X2) -Phe-His( X) -Leu-Leu-Arg( X3) -Glu( X5) -R18-Leu-Glu-(X5) -R21-Ala-Lys (X6) -Ala-Glu (X5) -Gin (X4) -Glu (X5) - Ala-Glu (X5) -Gln( X4)-Ala-Ala-Leu-Asn( X4 )-Arg( X3) -Leu( X6) -Leu-Leu-Glu( X5) -Glu(X5)-Ala-X7 ja jossa X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X6 ovat kukin 25 joko vety tai suojaryhma ja X7 on joko suojaryhma tai kanta jahartsiin ankkuroiva sidos tai NH2 ja (b) suojaryhma tai -ryhmat tai ankkuroiva sidos lohkaistaan kaavan II mukaisesta peptidista.

Yhteista peptidien kemiallisille synteeseille on 30 eri aminohappoyksikdiden labiilien sivuketjuryhmien suo-jaus sopivilla suojaryhmilia, jotka estavat kemiallisen reak-tion siina kohdassa kunnes rynma lopuksi poistetaan. Tavallisesti yhteisena piirteena on myOs aminohapon tai fragmentin alfa-aminoryhnrån suojaus tSman kokonaisuuden 35 karboksyyliryhman reagoidessa ja sita seuraava alfa-amino- 4 ryhmSn suojauksen selektiivinen poistaminen, jolloin seu-raava reaktio voi tapahtua siina kohdassa. Tåmån mukaises-ti on yleistå, ettå synteesin jossain vaiheessa muodostuu vålituote, jossa on kaikki aminohappotåhteet halutussa 5 jårjestyksesså peptidiketjussa ja useissa nåistå tåhteistå on sivuketjuja suojaavia ryhmiå.

Tåman keksinnon alaan katsotaan kuuluviksi myos kaavan (II) mukaiset vålituotteet: X1-Rl(X2)-Ra(X4)-R,(X5 tai X) -R4-Pro-Ile-Ser (X*) -Leu-Asp{X5) -10 Leu-Thr (X2) -Phe-His (X) -Leu-Leu-Arg (X3) -Glu (Xs) -Rie-Leu-Glu- (Xs) -R21-Ala-Lys (X6)-Ala-Glu (Xs) -Gin (X4) -Glu (Xs) -Ala-Glu (X5) -Gin (X4) -Ala-Ala-Leu-Asn (X4) -Arg (X3) -Leu (X6) -Leu-Leu-Glu (X5) -Glu(X5)-Ala-X7 ja jossa X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X* ovat kukin joko vety tai suojaryhma ja X7 on joko suojaryhmå tai kan-15 tajahartsiin ankkuroiva sidos tai NH2 ja R-ryhmåt ovat edellå esitettyjen maaritelmien mukaisia.

X1 on joko vetyatomi tai α-aminoryhmåå suojaava ryh-må. xSllå merkityt α-aminoryhmån suojaryhmat ovat polypep-tidien vaiheittaisissa synteesimenetelmissa hyodyllisiksi 20 tunnettuja. X3:n kattamiin α-aminoryhmien suojaryhmien luokkiin kuuluvat (1) asyylityyppiset suojaryhmat kuten formyyli-, akrylyyli(Acr)-, bentsoyyli(Bz)- ja asetyyli-ryhmå, joita on edullista kåyttåå ainoastaan N-pååsså; (2) aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmat kuten bent-25 syylioksikarbonyyli(Z)- ja substituoitu Z-ryhma, kuten p- klooribentsyylioksikarbonyyli-, p-nitrobentsyylioksikar-bonyyli-, p-bromibentsyylioksikarbonyyli-, p-metoksibent-syylioksikarbonyyliryhma; (3) alifaattiset uretaani-suoja-ryhmat, kuten t-butyylioksikarbonyyli(BOC)-, di-isopropyy-30 limetoksikarbonyyli-, isopropyylioksikarbonyyli-, etoksi- karbonyyli-, allyylioksikarbonyyliryhma; (4) sykloalkyyli-tyyppiset uretaanityypin suojaryhmat, kuten fluorenyylime-tyylioksikarbonyyli(FMOC)-, syklopentyylioksikarbonyyli-, adamantyylioksikarbonyyli- ja sykloheksyylioksikarbonyyli-35 ryhma; ja (5) tiouretaanityyppiset suojaryhmat, kuten fe- 91413 5 nyylitiokarbonyyliryhma. Edullinen α-aminoryhman suojaryh-ma on BOC.

X2 on Thr:n ja Ser:n hydroksyyliryhman suojaryhma ja se on edullista valita asetyyli(Ac)-, bentsoyyli(Bz)-, 5 tert-butyyli-, trifenyylimetyyli(trityyli)-, tetrahydro- pyranyyli-, bentsyylieetteri(Bzl)- ja 2,6-diklooribentsyy-li(DCB)ryhmasta koostuvasta luokasta. Edullisin suojaryhma on Bzl. X2 voi olla vetyatomi, mika tarkoittaa, etta hyd-roksyyliryhmassa ei ole suojaryhmaa.

10 X3 on Arg:n ja Har:n guanidiiniryhman suojaryhma ja se on edullista valita luokasta, joka koostuu nitro-, p-tolueenisulfonyyli(Tos)-, Z-, adamantyylioksikarbonyyli-ja BOC-ryhmasta, tai X3 on vetyatomi. Tos on edullisin.

X4 on vetyatomi tai Asn:n tai Gln:n amidoryhman suo-15 jaryhma, joksi on edullista valita ksantyyli(Xan)-ryhma.

X5 on vetyatomi tai Asp:n tai Glu:n β- tai γ-karbok-syyliryhman esterin muodostava suojaryhma, joka on edullista valita bentsyyli-, 2,6-diklooribentsyyli-, metyyli-, etyyli- ja t-butyyliesterista koostuvasta luokasta. OBzl 20 on edullisin.

X6 on vetyatomi tai Lys:n tai Orn:n sivuketjun ami-nosubstituentin suojaryhma. Kuvaavia esimerkkeja sopivista sivuketjun aminosuojaryhmista ovat Z-, 2-klooribentsyyli-oksikarbonyyli(2-C1-Z)-, Tos-, t-amyylioksikarbonyyli-25 (Aoc)-, BOC-ryhma ja edelia eritellyt aromaattiset tai alifaattiset uretaanityyppiset suojaryhmat.

Kun His on mukana, X on vetyatomi tai imidatsoli-typen suojaryhma, kuten esimerkiksi Tos- tai 2,4-dinitro-fenyyli(DNP)-ryhma ja kun Tyr on mukana, X on vetyatomi 30 tai hydroksyylirynman suojaryhma, kuten esimerkiksi DCB- ryhma. Kun Met on mukana, rikkiatomi voidaan haluttaessa suojata hapella.

Sivuketjun aminosuojaryhman valinta ei ole kriit-tinen, paitsi etta suojaryhma ei saa poistua poistettaessa 35 a-aminoryhmien suojausta synteesin aikana. a-aminosuoja- 6 ryhmå ja sivuketjun aminoryhmåå suojaava ryhmå eivåt siten voi olla samoja.

X7 on NH2, suojaryhmå, kuten esimerkiksi esteri tai ankkuroivan sidoksen muodostava ryhmå, jollaista kåytetåån 5 kiinteån faasin synteesisså sitomaan peptidi kiinteåån kantajahartsiin ja joksi on edullista valita toinen kaavo-jen: -NH-bentshydryyliamiini(BHA)-kantajahartsi ja -NH-pa-réunetyylibentshydryyliamiini(MBHA)-kantajahartsi esittå-mistå ryhmistå. Lohkaisu BHA- tai MBHA-hartsista tuottaa 10 suoraan CRF-analogi-amidin. Kåyttåmållå tållaisen hartsin metyylijohdannaista voidaan valmistaa metyylisubstituoitu amidi.

Vålituotteen kaavassa ainakin yksi ryhmistå X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X6 on suojaryhma. Kutakin R-ryhmåå vastaa-15 maan valittu nimenomainen aminohappo ratkaisee, onko sii-hen liitetty myos suojaryhma edellå eriteltyyn ja alan menetelmistå yleisesti tunnettuun tapaan. Valittaessa tiettyå sivuketjun suojaryhmåå kåytettåvåksi synteesisså noudatetaan seuraavia sååntojås (a) suojaryhmån tulee kes-20 tåå α-aminosuojaryhmån poistamiseen valitun reagenssin vaikutusta ja sen tulee olla stabiili valituissa reaktio-olosuhteissa synteesin jokaisessa vaiheessa, (b) suojaryhmån tulee såilyttåå suojausominaisuutensa eikå se saa ir-rota liitåntåolosuhteissa ja (c) sivuketjun suojaryhmå 25 tåytyy voida poistaa halutun aminohapposekvenssin synteesin pååtyttyå reaktio-olosuhteissa, jotka eivåt aiheuta muutoksia peptidiketjussa.

Tåmån keksinnon katsotaan siis koskevan kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistusmenetelmåå, johon kuuluu 30 (a) ainakin yhden suojaryhmån sisåltåvån ja kaavan (II) mukaisen peptidin muodostaminen, jossa X, X1, X2, X3, X4, Xs ja X6 esittåvåt kukin joko vetyatomia tai suojaryhmåå ja X7 on joko suojaryhmå tai kantajahartsiin ankkuroivan sidoksen muodostava ryhmå tai NH2-ryhmå ja (b) suojaryhmån tai 35 -ryhmien tai ankkuroivan ryhmån irrottaminen mainitusta * 7 91413 kaavan (II) mukaisesta peptidista ja (c) nain saadun pep-tidin muuttaminen haluttaessa ei toksiseksi additiosuolak- seen.

Kun peptidit valmistetaan kemiallisella synteesil-5 la, ne on edullista valmistaa kiintedn faasin synteesime-netelmåS, kuten esimerkiksi Merrifieldin artikkelissa J.

Am. Chem. Soc., 85, s. 2149 (1964) kuvaamaa menetelmaa kayttaen, vaikka muitakin vastaavla alalla tunnettuja ke-miallisia synteesimenetelmia voldaan kayttaa kuten edelia 10 on malnlttu. Klintean faasin synteesi aloltetaan peptldln C-paasta lllttamaiia suojattu α-amlnohappo sopivaan hart-siln tavalla, joka on ylelsesti esitetty 21. tammikuuta 1981 RIvierille et al. mydnnetyssa yhdysvaltalaisessa pa-tentissa n:o 4 244 946, jonka julkaisu liitetaan tahan 15 viitteena. Tailainen lahtOaine rCRF-analogien valmistamis-ta vårten voldaan tehda liittamaiia α-aminosuojattu Ile BHA-hartsiin.

B0C:lia suojattu Ile liitetaan BHA-hartsiin mety-leenikloridia ja dimetyylifortnamidia (DMF) kayttaen. Kun 20 BOC-Ile on liitetty kantajahartsiin, α-aminosuojaryhma poistetaan kayttaen esimerkiksi trifluorietikkahappoa (TFA) metyleenikloridissa, TFA:a yksin tai yhdessS HCl:n kanssa dioksaanissa. On edullista kayttaa 50 tilavuus-% TFA: a metyleenikloridissa ja 0-5 paino-% 1,2-etaanidi-25 tiolia. Suojaus poistetaan noin 0 °C:n ja huoneen lampOti-lan vaiilia olevassa låmpOtilassa. Muita normaaleja spe-sifisten α-aminoryhmien poistamiseen tarkoitettuja lohkai-sureagensseja ja -olosuhteita voidaan kayttaa Schroderin & Lubken teoksessa "The Peptides", 1 ss. 72-75 (Academic 30 Press 1965) kuvattuun tapaan.

Ile:n α-aminosuojaryhmSn poistamisen jalkeen loput α-amino- ja sivuketjusuojatut aminohapot liitetaan vai-heittain toisiinsa halutussa jarjestyksessa edelia maari-tellyn vaiituoteyhdisteen valmistamiseksi. Sen sijaan, 35 etta jokainen aminohappo lisattaisiin synteesissa erik- 8 seen, voidaan joitakin niistå vaihtoehtoisesti liittåå toinen toisiinsa ennen niiden lisåamista kiinteåfaasi-reaktoriin. Sopiva liitantareagenssi on alan hallitsevan valittavissa. Erityisen sopivia liitåntareagensseja ovat 5 Ν,Ν'-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC1) ja N,N'-di-iso-propyylikarbodi-imidi.

Kiinteån faasin peptidisynteesisså kåytetyt akti-vointireagenssit ovat alalia hyvin tunnettuja. Esimerkkeja sopivista aktivointireagensseista ovat karbodi-imidit, ku-10 ten esimerkiksi N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. Muita aktivointireagensseja ja niiden kayttoa peptidisynteesisså ovat kuvanneet Schroder & Lubke yllåmainitun teoksen kap-paleessa III ja Kapoor artikkelissa J. Phar. Sci., 59, ss. 15 1-27 (1970).

Jokaista suojattua aminohappoa tai aminohapposek-venssiå pannaan kiinteåfaasireaktoriin noin nelinkertainen ylimåårå ja ne liitetåån toisiinsa liuoksessa, jossa on dimetyyliformamidia (DMF) ja CH2Cl2:a (1:1) tai pelkåsså 20 DMFsssa tai CH2Cl2:ssa. Kun aminohapot tai -sekvenssit liitetåån toisiinsa manuaalisesti, liitosreaktion onnistumis-ta tarkkaillaan synteesin joka vaiheessa ninhydriinireak-tion avulla E. Kaiserin et al. artikkelissa Anal. Biochem. 34, 595 (1970) kuvaamaan tapaan. Jos liitosreaktio ei on-25 nistu tåydellisesti, liitosmenettely toistetaan ennen kuin α-aminosuojaryhmå poistetaan seuraavan aminohapon liittå-mistå edeltåvånå vaiheena. Liitosreaktiot voidaan suorit-taa automaattisesti esimerkiksi automaattisella Beckmann 990 -syntetointilaitteella kåyttåen esimerkiksi Rivierin 30 et al. artikkelissa Biopolymers, 1978, 17, ss. 1927-1938 esittåmåå ohjelmaa.

Sen jålkeen kun haluttu aminohapposekvenssi on saa-tu valmiiksi, vålituotepeptidi poistetaan kantajahartsista kåsittelemållå sitå jollain reagenssilla, esimerkiksi nes-35 temåisellå vetyfluoridilla, joka ei lohkaise ainoastaan 91413 9 peptidiå hartsista, vaan myos kaikki jåljella olevat si-vuketjujen suojaryhmat X2:n, X3:n, X4:n, X5sn ja X6sn ja a-aminosuojaryhman Xx (ellei se ole asyyliryhma, jonka on tarkoitus olla mukana tuotepeptidissa) peptidin valmista-5 miseksi. Kun vetyfluoridia kåytetåån lohkaisuun, anisolia tai kresolia ja metyylietyylisulfidia lisåtåån reaktioas-tiaan puhdistavaksi lisaaineeksi. Kun Met on mukana sek-venssisså, BOC-suojaryhma voidaan lohkaista trifluorietik-kahapolla (TFA)/etaaniditiolilla ennen peptidin lohkaisua 10 hartsista S-alkylaation vålttåmiseksi.

Synteettisen hCRFsn on osoitettu olevan ACTH- ja β-END-LI-erityksen tehokas stimulaattori in vivo eri rotta-preparaateissa. Plasman ACTH- ja β-END-LI-taso on korkea ainakin 5-20 minuutin ajan sen jålkeen, kun nembutaalilla 15 nukutetuille urosrotille ja lepaaville uros- tai naarasro-tille, joilla on laskimonsisMiset kanyylit, on annettu hCRF:å laskimonsisåisesti. hCRF:lla on lisåksi havaittu olevan dramaattinen rottien ja koirien verenpainetta alen-tava vaikutus.

20 CRF-agonistit alentavat verenpainetta siinå maårin, ettå ne voivat olla erityisen arvokkaita korkean verenpai-neen hoidossa ja myos tietyn tyyppisiin kirurgisiin ope-raatioihin joutuvien potilaiden hoidossa.

CRF stimuloi voimakkaasti aivolisakkeen ja lisamu-25 nuaisen kuorikerroksen vålista akselia, ja CRF-analogien pitåisi olla hyodyllisia taman yhteyden toimintojen stimuloi jana eråissa potilastyypeissa, joiden endogeeninen glu-kokortikoidituotanto on vahaistå. CRF:n pitåisi esimerkik-si olla hyodyllinen palautettaessa entiselleen aivolisåke-30 lisamunuais-toiminta potilailla, joille on annettu ulkois-ta glukokortikoidihoitoa ja joiden aivolisakkeen ja liså-munuaisen kuorikerroksen toiminnot ovat pysyvåsti heiken-tyneet.

Useimmilla muilla sååtelypeptideillå on havaittu 35 olevan vaikutusta keskushermostoon ja ruoansulatuskana- 10 vaan. Koska ACTH- ja β-END-eritys on nisåkkåån stressivas-teen "sine qua non", ei ollut yllåttåvåå, ettå CRF:llå on merkittåvå vaikutus aivoihin ruumiin stressivasteen valit-tåjana. Taman mukaisesti aivoihin annettaville CRF-analo-5 geille pitåisi loytyå sovellutuksia normaalien ja mieli-sairaiden yksiloiden mielialan, oppimisen ja kåyttåytymi-sen muuntelussa. Koska CRF-agonistit kohottavat ACTH:n, P-END:n, β-lipotropiinin, muiden pro-opiomelanokortiini-geenin tuotteiden ja kortikosteronin tasoa, niitå voidaan 10 antaa pyrittaesså vaikuttamaan aivoihin ja aivojen ååri-alueisiin ja siten muistiin, mielialaan, kivun tuntemiseen jne., ja tarkemmin valppauteen, masennukseen ja/tai ahdis-tukseen. Kun CRF:a annetaan rottien aivokammioihin se li-saa niiden aktiivisuutta ja oppimiskykya, ja CRF-agonistit 15 voivat siten toimia luonnollisina stimulantteina.

CRF-analogien pitåisi olla myos kåyttokelpoisia py-rittåesså kasvattamaan veren virtausta nisåkkåiden, eri-tyisesti ihmisten ja muiden nisåkkåiden ruoansulatuskana-vaan. Kaikkien CRF-sukuisten peptidien on osoitettu laa-20 jentavan suoliliepeen suonipatjaa. oCRF inhiboi myos vat-sahapon tuottoa ja CRF-analogien oletetaan olevan myos tehokkaita mahahaavojen hoidossa, koska ne pienentåvåt nisåkkåiden vatsahapon tuottoa ja/tai inhiboivat niiden ruoansulatuskanavan toimintoja.

25 CRF-analogeja tai niiden ei-toksisia additiosuolo- ja, yhdistettynå farmaseuttisesti tai elåinlååketieteelli-sesti hyvåksyttåvåån kantajaan farmaseuttisen tuotteen muodostamiseksi, voidaan antaa nisåkkåille, ihmiset mukaan lukien, joko laskimonsisaisesti, ihonalaisesti, lihaksen-30 sisåisesti, ihon kautta, esimerkiksi nenånsisåisesti, ai-νο-selkåytimen tai suun kautta. Peptidien tulisi olla vå-hintåån noin 90 %:sti puhtaita ja olisi edullista, jos niiden puhtaus olisi våhintåån noin 98 %; epåpuhtaammatkin tuotteet ovat kuitenkin tehokkaita ja niitå voidaan hyvin 35 kåyttåå muita nisåkkåitå kuin ihmisiå hoidettaessa. Puh- 91413 11 taus tarkoittaa tåssa sitå, ettå haluttua peptidiå on esi-tetty paino-% -osuus kaikista mukana olevista samankaltai-sista peptideistå ja peptidifragmenteista. Lååkåri voi an-taa lååkettå ihmisille verenpaineen alentamiseksi tai en-5 dogeenisen glukokortikoidituotannon stimuloimiseksi. Tar- vittava annos vaihtelee nlmenomaisesta hoidettavasta ti-lasta, tilan vakavuudesta ja halutun hoidon kestosta riip-puen.

Nåitå agonisteja voidaan kåyttåå myos haluttaessa 10 arvioida hypotalamuksen, aivolisåkkeen ja lisåmunuaisten keskinåistå toimintaa nisåkkåisså, joilla epåillaan olevan sisåeritys- tai keskushermostosairaus antamalla lååketta sopivalla tavalla ja tarkkailemalla ruumiintoimintoja sen jålkeen. Lååkkeen antamista voidaan kåyttåå esimerkiksi 15 diagnostisena vålineenå Cushingin taudin ja affektiivisten sairauksien, kuten esimerkiksi masennussairauden perustei-den arvioimiseksi.

Tållaisia peptidejå annetaan usein farmaseuttisesti tai elåinlååketieteellisesti hyvåksyttåvinå ei-toksisina 20 suoloina kuten esimerkiksi happoadditiosuoloina tai esimerkiksi sinkki-, rauta-, kalsium-, barium-, magnesium-, alumiini- tai vastaavina metallikomplekseina (joita pide-tåån additiosuoloina tåsså sovellutuksessa). Kuvaavia esi-merkkejå tållaisista happoadditiosuoloista ovat hydroklo-25 ridi-, hydrobromidi-, sulfaatti-, fosfaatti-, tannaatti-, oksalaatti-, fumaraatti-, glukonaatti-, alginaatti-, male-aatti-, asetaatti-, sitraatti-, bentsoaatti-, sukkinaat-ti-, malaatti-, askorbaatti-, tartraatti- ja vastaavat suolat. Jos aktiivinen aines annetaan tablettimuodossa, 30 tabletti voi sisåltåå sideainetta, kuten esimerkiksi tra-ganttia, maissitårkkelystå tai gelatiinia; hajottavaa ai-netta, kuten esimerkiksi algiinihappoa; ja voiteluainetta, kuten esimerkiksi magnesiumstearaattia. Jos lååke halutaan antaa nesteenå, se voidaan makeuttaa ja/tai maustaa, ja 35 laskimonsisåisesti lååke voidaan antaa isotonisessa suo- 12 la-, fosfaattipuskuri- tai vastaavassa liuoksessa.

Peptidejå tulisi antaa lååkkeeksi lååkårin valvon-nassa, ja farmaseuttiset tuotteet sisåltåvåt peptidin ta-vallisesti tavanomaiseen farmaseuttisesti tai elåinlååke-5 tieteellieesti hyvåksyttåvåån kantajaan yhdistettynå. An-nostus on tavallisesti noin l:stå 200:een mikrogrammaa peptidia hoidettavan elåimen ruumiinpainokiloa kohti. Joissain tapauksissa nåitå peptidejå voidaan kåyttåå poti-laiden hoidossa ACTHsn tai kortikosteroidien antamisen si-10 jasta, tållaisissa tapauksissa niinkin pientå annostusta kuin 10 ng/ruumiinpainokilo voidaan kåyttåå. Tåsså kåyte-tyt låmpotilat on kaikki esitetty °C:na ja kaikki suhteet ovat tilavuussuhteita. Nestemåisten aineiden prosentti-osuudet ovat myos tilavuusosuuksia.

15 Seuraavassa esimerkisså esitetåån edullinen kiin- teån faasin tekniikkaan perustuva CRF-analogien synteesi-menetelmå.

Vertailuesimerkki

Kaavan H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-20 Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-

Glu-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2 mukaisen [ (Glu29) ]-rCRF:n synteesi suorite-taan vaiheittain esimerkiksi Bachem Incrstå saatavissa olevalla MBHA-vetykloridi -hartsilla, jonka substituutio-25 våli on noin 0,1-0,5 mmol/g hartsia.

Synteesi suoritetaan automaattisella Beckmann 99OB peptidien syntetointilaitteella sopivaa, edullisesti seu-raavaa ohjelmaa kåyttåen:

Vaihe Reagens s it i a operaat iot_Sekoitusaiat min.

30 1 CHjClj-pesu - 80 ml (2 kertaa) 3 2 Metanoli(MeOH)-pesu - 30 ml (2 kertaa) 3 3 CH2Cl2-pesu - 80 ml (3 kertaa) 3 4 50 prosenttia TFAsa ja 5 prosenttia 1,2-etaa- niditiolia CH2Cl2:ssa - 70 ml (2 kertaa) 12 35 5 Isopropanolipesu - 80 ml (2 kertaa) 3 91413 13 6 12,5 prosenttia TEA:ta CH2Cl2:ssa - 70 ml (2 kertaa) 5 7 HeOH-pesu - 40 ml (2 kertaa) 2 8 CH2Cl2-pesu - 80 ml (3 kertaa) 3 5 9 BOC-aminohappoa (10 mmol) 30 ml:ssa joko DMF:a tai CH2Cl2:a, kyseisen suojattavan aminohapon liukoisuudesta riippuen (1 kerta) ja DCCI:å (10 mmol) CH2Cl2:ssa 30-300 BOC-Ile:n liittamisesta on tuloksena substituutio, 10 joka on noin 0,35 mmol Ile:a grammaa hartsia kohti. Kai-kista kåytetyistå liuottimista poistetaan ilma huolelli-sesti, edullisesti suihkuttamalla inertilla kaasulla, esi-merkiksi heliumilla tai typellå mahdollisesti Met-tåhteen rikin ei-toivotusti hapettavan hapen poissaolon varmista-15 miseksi.

Suojauksen poiston ja neutraloinnin jalkeen pepti-diketju rakennetaan vaiheittain hartsille. Yleenså kåytetåån yhdestå kahteen mmol BOC-suojattua aminohappoa mety-leenikloridissa grammaa hartsia kohden ja lisaksi yksi 20 ekvivalentti 2-molaarista DCCI:å metyleenikloridissa kah-den tunnin aikana. Kun B0C-Arg(Tos):a liitetåån, kåytetåån seosta, jossa on 50 % DMF:a ja metyleenikloridia. Bzlså kåytetåån Ser:n ja Thr:n hydroksyylisivuketjun suojaryh-månå. p-nitrofenyyliesteriå (ONp) kåytetåån Asn:n tai 25 Gln:n karboksyylipåån aktivointiin ja esimerkiksi BOC-Asn(ONp):a liitetåån yli yon kåyttåen yhtå ekvivalenttia HOBt:a seoksessa, jossa on 50 % DMF:a ja metyleenikloridia. Asn:n ja Gln:n amidoryhmå suojataan Xanrllå, kun DCCI-liitosmenetelmåå kåytetåån aktiiviesteri-menetelmån 30 sijasta. 2-Cl-Z:å kåytetåån Lys:n sivuketjun suojaryhmånå. Tos:å kåytetåån Arg:n guanidiiniryhmån ja His:n imidatso-liryhmån suojaukseen, ja Glu:n tai Asp:n sivuketjun kar-boksyyliryhmå suojataan OBzl:llå. Synteesin pååtyttyå saa-daan seuraava tuote: BOC-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Pro-3 5 Pro-Ile-Ser(Bzl)-Leu-Asp(OBzl)-Leu-Thr(Bz1)-Phe-His(Tos)- 14

Leu-Leu-Arg(Tos)-Glu(OBzl)-Val-Leu-Glu(OBzl)-Met-Ala-Arg-(Tos )-Ala-Glu( OBzl) -Gln( Xan) -Leu-Ala-Glu( OBzl) -Gln( Xan) -Ala-His( Tos) -Ser( Bzl)-Asn( Xan) - Arg(Tos) -Lys(2-C1-Z ) -Leu-Met-Glu(OBzl)-Ile-Ile-kantajahartsi. o-aminosuojaryhm&n 5 polstoon kSytetty TFA-kAsittely on saattanut osittain tal kokonaan polstaa Xan:n.

Peptidln lohkaisemiseksi suojattu peptid! - hartsi-yhdistelmSsta ja peptidln suojauksen poistamiseksi yhdis-telmaa kasitellåån 1,5 ml:11a anisolia, 0,5 ml:11a metyy-10 lietyylisulfidia ja 15 ml:11a vetyfluoridia (HF) grammaa peptid!-hartsi -yhdistelmaa kohti ensin -20 eC:ssa 20 min ja sitten 0 eC:ssa puolen tunnin ajan. Sen j&lkeen kun HF on poistettu suurtyhjOssa hartsi-peptidi -yhdistelmaS pes-taan vuorotellen kuivalla dietyylieetterilia ja klorofor-15 milla ja peptidit uutetaan sitten 2-N etikkahapon vesi-liuoksella, josta ilma on poistettu ja erotetaan hartsista suodattamalla.

Peptidi puhdistetaan geelipermeaatiolla ja sitå seuraavalla puolipreparatiivisella HPLC-ajolla Rivierin et 20 al. teoksessa Peptides: Structure and Biological Function (1979), ss. 125-128 ja Rivierin et al. artikkelissa J. Chromatography (1983) kuvaamaan tapaan. Kromatograafisia fraktioita tarkkaillaan huolellisesti HPLC:lia ja ainoas-taan huomattavan puhtaaksi osoittautuneet fraktiot yhdis-25 tettiin.

Sen tarkistamiseksi, oliko saatu sekvenssi tarkal-leen oikea, rCRF-analogia hydrolysoitiin suljetuissa tyh-jdputkissa, joissa oli jatkuvasti kiehuvaa HCl:a, 3 μΐ tloglykolia/ml ja 1 nmol Nle:a (sis&isenå standardina) 9 30 tunnin ajan 140 °C:ssa. Beckmanin 121 MB aminohappoanaly-saattorilla hydrolysaateista tehdyt aminohappoanalyysit antoivat tulokseksi seuraavat aminohapposuhteet: Asx(l,9), Thr(0,8), Ser(3,1), Glx(9,0), Pro(2,l), Ala(3,8),

Val(0,9), Met(1,9), Ile(2,6), Leu(7,0), Phe(0,9), 35 Lys(l,0), His(2,0) ja Arg(3,0), miks vahvisti, ettå oli 91413 15 saatu oikea 41-tahteinen peptidi.

Eslmerkkl I

Kaavan: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-5 Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-

Glu-Glu-Ala-NH2 mukainen synteettinen peptid! AHC syntetoi-daan kayttaen yleisesti vertailuesimerkissa esitettya me-nettelytapaa.

Edelia esitetylia tavalla syntetoidun ja puhdiste-10 tun rCRF-peptidin speslflseksl optlseksl klertokulmaksl mitattiin Perkin Elmerin laitteella, malli 141, [a]^p o = -24,2 ± 1,0 (c=l 1 %:ssa etikkahapossa) (korjattu H20:n ja TFA:n mukanaolo huomioonottaen), ja sen puhtausaste oli noin 95 %.

15 Esimerkki II

Synteettisen peptidin AHC ja oCRF:n vaikutusta ACTH:n ja β-endorfiinin eritykseen tutkittiin in vitro ja myiis in vivo. Synteettisen oCRFrn viljeltyjen rotan aivo-lisakesolujen ACTH- ja β-endorfiinieritysta stimuloiva 20 vaikutus mitattiin kayttaen artikkelissa Endocrinology, 91, 562 (1972) yleisesti esitettyS menettelytapaa. Vaste, joka oli puolet maksimista, havaittiin peptidi AHC:n kon-sentraation ollessa noin 65 pikomol/1, kun synteettista oCRF:S tarvittiin noin 250 pikomol/1 tamfln vasteen saavut-25 tamiseksi. Eritysvaste maksimaalisiin (1-5 nM) AHC-kon- sentraatioihin on tasannetasolla. In vivo-testaus suorite-taan kSyttSen C. Rivierin et al. artikkelissa Science, 218, 377 (1982) esitettya yleista menettelytapaa.

Esimerkki III

30 Kaavan H-D-Tyr-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-

Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2 mukainen peptidi [D-Tyr3, D-Pro4, Nle18·21]-AHC(3-41) syntetoidaan. Esimerkissa II esitetyn yleisen 35 menettelytavan mukainen testaus osoittaa, etta sen ACTH:n 16 ja p-END-LI:n eritystå stimuloiva vaikutus on noln 470 % oCRF:n valkutukseen verrattuna ja etta se alentaa myOs ve- 22° renpainetta hyvin merkittavSsti. [o] c =-12,8° ± 1,0 (c=I; 1 %:ssa etlkkahapossa).

5 Esimerkki IV

KaavanH-D-Pro-Pro-lle-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2 mukalnen peptidi [D-Pro4, Nle18 21]-AHC(4-41) syntetoidaan. 10 Esimerkissa II esitetyn yleisen menettelytavan mukainen testaus osoittaa, etta sen ACTH:n ja p-END-LI:n eritysta stimuloiva vaikutus on noin 160 % oCRF:n valkutukseen verrattuna ja etta se alentaa myds verenpainetta hyvin mer-kittavasti. [a]^^c = -7,1° ± 1,0 (c-1; 50 %:ssa etikkaha-15 possa).

Claims (5)

91413 17 Patenttlvaatimukset

1. Menetelmå farmaseuttisesti kåyttOkelpoi sen kor-tikotroopiinia vapauttavan tekijan j ohdannaisen valmista- 5 miseksi, jolla on kaava (I) H-R1-R2-R3-R4-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Rie-Leu-Glu- R2i -Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2 jossa Rx on Ser tai des Rx; R2 on Gin, tai des R2; R3 on Glu, D-Tyr tai 10 des R3; R4 on Pro tai D-Pro; Rie on Nle tai Met; R21 on Met tai Nle; tunnettu siita, etta (a) muodostetaan peptidi, jossa on vahintaan yksi suojaryhma ja jolla on kaava (II) X1-R1(X2)-R2(X4)-R3(X5 tai X) -R4-Pro-Ile-Ser (X2) -Leu-Asp( X5 )-15 Leu-Thr (X2) -Phe-His( X) -Leu-Leu-Arg( X3) -Glu( X5) -Rie-Leu-Glu- (X5) -R21-Ala-Lys (X6) - Ala-Glu (X5) -Gln( X4) -Glu (X5) -Ala-Glu (X5) -Gln( X4)-Ala-Ala-Leu-Asn( X4) -Arg( X3) -Leu( X6) -Leu-Leu-Glu( X5) -Glu(X5)-Ala-X7 ja jossa X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X6 ovat kukin joko vety tai suojaryhma ja X7 on joko suojaryhma tai kan-20 tajahartsiin ankkuroiva sidos tai NH2 ja (b) suojaryhma tai -ryhmat tai ankkuroiva sidos lohkaistaan kaavan II mukaisesta peptidista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siita, etta valmistetaan yhdiste, jolla 25 on kaava H-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg- Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln- Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, 30 tunnettu siita, etta valmistetaan yhdiste, jolla on kaava H-D-Tyr-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu- Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu- Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. 18

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siitS, etta valmistetaan yhdiste, jolla on kaava H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-5 Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. 91413 19