KR0148264B1

KR0148264B1 - Crf 유사체

Info

Publication number: KR0148264B1
Application number: KR1019900701135A
Authority: KR
Inventors: 에도우어드 프레드릭 리비어 진; 워커 베일 쥬니어 와일리
Original assignee: 델버어트 어니스트 그랜즈; 더 솔크 인스티튜트 포오 바이오로지칼 스터디이즈
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-28
Publication date: 1998-10-15
Also published as: DK130890D0; EP0361954A2; JPH03501858A; NZ230731A; WO1990003393A1; AU4339889A; AU615805B2; CA1340964C; DK130890A; EP0361954A3; IL91663A0; KR900701835A; ZA897150B

Abstract

내용 없음

Description

[발명의 명칭]

CRF 유사체

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 펩티드 및 그러한 펩티드를 이용한 포유동물의 제약학적 치료방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 헨테트라콘타펩티드(hentetracontapeptide) CRF 유사체, 그러한 CRF 유사체를 함유하는 제약학적 조성물 및 그러한 CRF 유사체를 사용한 포유동물의 치료방법에 관한 것이다.

실험 및 임상적인 관찰은 시상하부가 하수체 선부 부신피질 자극(corticotropic) 세포 분비 기능의 조절에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 지지해 왔다. 과거 25년 동안, Guillemin, Rosenberg 및 Saffran 및 Schally는 독립적으로, 시험관내에서 항온처리되거나 기관배양에서 유지된 뇌하수체에 의해 ACTH의 분비 속도를 증가시키는 시상하부에서의 인자의 존재를 보여주었다.

동정된 분비 촉진제 중 어느 것도, 양의 CRF(oCRF)가 1981년에 동정되고 미합중국 특허 제 4,415,558 호에 공개된 바와 같이 식:

H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH₂을 갖는 것으로 밝혀질 때까지, 생리적 부신피질 자극 호르몬 방출 인자(CRF)에 대하여 기대되는 기준에 부합되지 못했다. oCRF는 포유동물의 혈압을 낮추어 주고 ACTH 및 β-엔도르핀의 분비를 자극한다.

쥐의 CRF(rCRF)가 분리되고, 정제되었으며 식:

H-Ser-Glu-Glu-Pro-Por-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Met-Glu-Ile-Ile-NH₂을 가지는 헨테트라콘타펩티드로서 동정되었다. 이는 대안적으로 쥐의 아무닌(amunine)이라 언급될 수 있다.

이제 사람의 CRF에 대한 식이 rCRF의 식과 동일한 것으로 결정되었으므로 rCRF 및 hCRF 란 용어는 호환적으로 사용된다. 합성 rCRF 및 oCRF는 시험관내 및 생체내에서 ACTH 및 β-엔도르핀성 활성(β-END-LI)을 자극하며 실질적으로 혈압을 낮추어 준다.

[발명의 요약]

상기 41-잔기 CRF 펩티드의 유사체는 시험관 내에서 천연 펩티드와 적어도 거의 동일한 생물학적 활성을 나타내고 생체내에서 실질적으로 더 긴 생물학적 효과의 지속시간을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 펩티드는 하기 D-이성체치환체 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개를 갖는다: 12-위치에 D-Phe, 20-위치에 D-Glu, 24-위치에 D-Ala 및 32-위치에 D-His. N-말단은 임의로하나부터 6 잔기 이하의 서열까지 단축될 수 있으며 N-말단 잔기는 아실화될 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물은 제약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 액체 또는 고체 담체내에 분산된 CRF 유사체 또는 그들의 무독성 부가염을 포함한다. 본 발명에 따른 그러한 펩티드 또는 제약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 그들의 부가염의 포유동물, 특히 사람에 대한 투여는 ACTH, β-엔도르핀, β-리포트로핀, 프로-오피오멜라노코르틴 유전자의 다른 생성물및 코르티코스테론의 분비를 조절하기 위하여, 및/또는 혈압을 낮추기 위하여, 또는 기분, 행동 및 장기능 및 자율 신경계의 활성에 영향을 미치기 위해 수행될 수 있다. 또한 CRF 유사체는 뇌하수체, 심장혈관, 위장 또는 중추신경계의 기능을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.

[바람직한 실시양태의 상세한 설명]

펩티드를 정의하는데 사용되는 명명법은 통상적인 표시에 따라, 아미노기가 좌측에 표시되고 카르복실기가 우측에 표시되는, Schroder Lubke의 The Peptides, Academic Press(1965)에 의해 규정되는 바와 같다. 표준 3-문자 약어는 알파-아미노산 잔기를 나타내기 위한 것이고, 아미노산 잔기가 이성체 형태를 가질 경우 다른 명시가 없는 한 그것은 아미노산의 L-형태이며, 예컨대, Ser=L-세린, Orn=오르니틴, Nle=노르로이신, Nva=노르발린 및 Har=호모아르기닌을 나타낸다.

본 발명은 하기 식 (I)을 갖는 CRF유사체를 제공한다:

Y-R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-R₁₂-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-R₂₀-R₂₁-R₂₂-R₂₃-R₂₄-R₂₅-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-R₃₂-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-R₃₈-R₃₉-Ile-R₄₁-NH₂, 상기 식에서 Y는 7 이하의 탄소원자를 갖는 아실기 또는 수소이고; R₁은 Ser또는 desR₁이고; R₂는 Glu, Gln, pGlu 또는 desR₂이고; R₃는 Glu 또는 desR₃이고; R₄는 Pro 또는 desR₄이고; R₅는 Pro 또는 desR₅이고; R₆는 Ile또는 desR₆이고; R₁₂는 D-Phe 또는 Phe 이고; R₂₀은 D-Glu 또는 Glu 이고: R₂₁은 Met 또는 Nle 이고: R₂₂는 Ala 또는 Thr 이고; R₂₃은 Arg 또는 Lys 이고; R₂₄는 D-Ala 또는 Ala 이고; R₂₅는 Glu 또는 Asp 이고; R₃₂는 D-His 또는 His 이고; R₃₈은 Met, Nle 또는 Leu 이고; R₃₉는 Glu 또는 Asp이고; R₄₁은 lie또는 Ala 이며; 단, 하기 잔기들 중 하나 이상은 존재한다: R₁₂는 D-Phe, R₂₀은 D-Glu, R₂₄는 D-Ala, 및 R₃₂는 D-His. 이들 펩티드의 무독성 부가염도 또한 사용될 수 있다. 바람직하게 12-위치의 D-Phe 및 20-위치의 D-Glu 모두가 존재하거나, 또는 적어도 하나는 존재한다. 이들 유사체는 N-말단에서 약간, 즉 약 6 잔기 이하의 서열만큼 단축되더라도 효능을 유지한다. 넓은 의미에서, 본 발명은 하기 식 (Ⅱ)의 CRF 유사체 및 이의 무독성염을 제공한다:

Y-R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-Ser-R₈-R₉-Leu-R₁₁-R₁₂-R₁₃-R₁₄-Leu-Arg-R₁₇-R₁₈-R₁₉-R₂₀-R₂₁-R₂₂-R₂₃-R₂₄-R₂₅-R₂₆-R₂₇-R₂₈-R₂₉-Gln-Ala-R₃₂-R₃₃-Asn-Arg-R₃₆-R₃₇-R₃₈-R₃₉-R₄₀-R₄₁-NH₂, 상기 식에서 Y는 7 이하의 탄소원자를 갖는 아실기 또는 수소이고; R₁은 Ser, D-Ser 또는 desR₁이고: R₂는 Glu, Gln, pGlu, D-pGlu 또는 desR₂이고; R₃는 Glu, Gly, D-Tyr 또는 desR₃이고; R₄는 Pro, D-Pro 또는 desR₄이고; R₅는 Pro 또는 desR₅이고; R₆는 Ile 또는 desR₆이고; R₈및 R₁₉는 Leu, Ile, Ala, Gly, Val, Nle, Phe 및 Gln으로 구성되는 군으로부터 선택되고; R₉는 Asp 또는 Glu 이고; R₁₁은 Thr 또는 Ser 이고, R₁₂는 Phe, D-Phe, Leu, Ala, Ile, Gly, Val, Nle 또는 Gln ol고; R₁₃은 His, Tyr 또는 Glu 이고; R₁₄는 Leu 또는 Met 이고; R₁₇은 Glu 또는 Lys 이고; R₁₈은 Val, Nle 또는 Met 이고; R₂₀은 His, D-Glu 또는 Glu 이고; R₂₁은 Arg, Met, Nva, Ile, Ala, Leu, Nle, Val, Phe 또는 Gln 이고; R₂₂2는 Ala, Thr, Asp 또는 Glu 이고; R₂₃은 Arg, Orn, Har 또는 Lys 이고; R₂₄는 Ala, D-Ala, Met, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Phe 및 Gln 이고; R₂₅는 Glu 또는 Asp 이고; R₂₆은 Gly, Gln, Asn 또는 Lys 이고; R₂₇은 Leu, Ile, Ala, Val, Nva, Met, Nle, Phe, Asp, Asn, Gln 또는 Glu 이고: R₂₈은 Ala, Arg 또는 Lys 이고; R₂₉는 Gln 또는 Glu 01고; R₃₂는 Leu, His, D-His, Gly, Tyr 또는 Ala 이고; R₃₃은 Ile, Ser, Asn, Leu, Thr 또는 Ala 이고: R₃₆은 Asn, Lys, Orn, Arg, Har 또는 Leu 이고; R₃₇은 Leu 또는 Tyr 이고; R₃₈은 Met, Nle 또는 Leu 이고: R₃₉는 Glu 또는 Asp 이고; R₄₀은 Ile, Thr, Glu, Ala, Val, Leu, Nle, Phe, Nva, Gly, Asn 또는 Gln of고; R₄₁은 Ile, Ala, Gly, Val, Leu, Nle, Phe 또는 Gln 이며, 단, 하기 잔기들 중 적어도 하나는 존재한다:

R₁₂는 D-Phe, R₂₀은 D-Glu, R₂₄는 D-Ala, 및 R₃₂는 D-His.

적어도 천연 CRF 만큼 효능이 있고 높은 알파-나선 형성 포텐셜을 갖는 잔기를 포함하는 이들 유사체의 하위 군은 하기 식 Ⅲ을 갖는다:

Y-R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-Ser-Leu-R₉-Leu-Thr-R₁₂-R₁₃-R₁₄-Leu-Arg-Glu-RIs-Leu-R₂₀-R₂₁-Ala-Lys-R₂₄-Glu-Gln-R₂₇-Ala-Glu-Gln-Ala-R₃₂-R₃₃-Asn-Arg-R₃₆-R₃₇-R₃₈-R₃₉-R₄₀-R₄₁-NH₂, 상기 식에서 Y는 7 이하의 탄소원자를 갖는 아실기 또는 수소이고; R₁은 Ser 또는 desR₁이고; R₂는 Glu, Gln 또는 desR₂이고; R₃는 Glu 또는 desR₃이고; R₄는 Pro 또는 desR₄ol고; R₅는 Pro 또는 desR₅이고; R₆는 Ile 또는 desR₆이고; R₉는 Asp 또는 Glu 이고; R₁₂는 Phe, D-Phe 또는 Leu 이고; R₁₃은 His 또는 Glu 이고; R₁₄는 Leu 또는 Met 이고; R₁₈은 Nle 또는 Met 이고; R₂₀은 His, D-Glu 또는 Glu 이고; R₂₁은 Met, Nle 또는 Ile 이고; R₂₄는 Ala 또는 D-Ala 이고; R₂₇은 Glu 또는 Leu 이고; R₃₂는 His, D-His 또는 Ala 이고; R₃₃은 Ser또는 Leu 이고; R₃₆은 Leu 또는 Lys 이고, R₃₇은 Leu 또는 Tyr 이고; R₃₈은 Leu 이고; R₃₉는 Glu 또는 Asp 이고; R₄₀은 Ile 또는 Glu 이고; R₄₁은 Ile, Ala 또는 Val 이며, 단, 하기 잔기들 중 적어도 하나는 존재한다: R₁₂가 D-Phe, R₂₀은 D-Glu, R₂₄는 D-Ala, R₃₂는 D-His. 식: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Sel-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH₂을 갖는 펩티드는 AHC(알파-나선CRF)로 언급된다. 네 개의 상기 D-이성질체 중 적어도 하나를 함유하는 AHC 유사체는 생물학적 효능을 나타내며, N-말단에서 약간, 즉 약 6 잔기 이하의 서열이 단축되더라도 효능을 유지한다.

펩티드는 전적으로 고체-상 기술, 부분 고체-상 기술, 단편 축합 또는 고전적 용액첨가와 같은 적합한 방법에 의해 합성된다. 펩티드의 화학 합성에서 일반적인 것은 적합한 보호기로 다양한 아미노산 부분의 불안정한 측쇄기를 보호하는 것이며, 이는 그 보호기가 궁극적으로 제거될 때까지 그 부위에서는 화학반응이 일어나지 않도록 할 것이다 또한, 보통 아미노산 또는 단편상의 알파-아미노기를 그것이 카르복실기에서 반응하는 동안 보호하고, 그 후 알파-아미노 보호기를 선택적으로 제거하여 그 위치에서 계속적으로 반응이 일어나게 하는 것이 일반적이다. 따라서, 합성의 일 단계로서 펩티드 사슬내의 바람직한 서열에 위치하는 아미노산 잔기 각각을 함유하고, 측쇄 보호기들이 적절한 잔기들에 연결되어 있는 중간체 화합물이 제조되는 것이 일반적이다.

따라서, 그러한 펩티드 유사체를 화학적으로 합성하면 식 (IA)의 중간체가 생산된다:

X¹-R₁(X²)-R₂(X⁴또는 X⁵)-R₃(X⁵)-R₄-R₅-Ile-Ser(X²)-Leu-Asp(X⁵)-Leu-Thr(X²)-R₁₂-His(X⁷)-Leu-Leu-Arg(X³)-Glu(X⁵)-Val-Leu-R₂₀(X⁵)-R₂₁-R₂₂(X²)-R₂₃(X³또는 X⁶)-R₂₄-R₂₅(X⁵)-Gln(X⁴)-Leu-Ala-Gln(X⁴)-Gln(X⁴)-Ala-R₃₂(X⁷)-Ser(X²)-Asn(X⁴)-Arg(X³)-Lys(X⁶)-Leu-R₃₈-R₃₉(X⁵)-Ile-R₄₁-X⁸(여 기서, R-기는상기한 바와 같음).

X¹은 수소 또는 알파-아미노 보호기 중 하나이다. X¹으로 나타내는 알파-아미노 보호기는 폴리펩티드의 단계식 합성에서 당 분야에서 유용한 것으로 알려진 것들이다. X¹에 포함되는 알파-아미노 보호기 중에는 (1) 바람직하게 N-말단에서만 사용되는 포르밀, 아크릴릴(Acr), 벤조일(Bz) 및 아세틸(Ac)과 같은 아실형 보호기; (2) 벤질옥시카르보닐(Z) 및 P-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p-메톡시벤질옥시카르보닐과 같은 치환된 Z와 같은 방향족 우레탄형 보호기: (3) t-부틸옥시카르보닐 (BOC), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐, 알릴옥시카르보닐과 같은 지방족 우레탄 보호기: (4) 플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC), 시클로펜털옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 (adamantyloxy-carbonyl) 및 시클로헥실옥시카르보닐과 같은 시클로알킬 우레탄형 보호기; 및 (5) 페닐티오카르보닐과 같은 티오우레탄형 보호기가 있다. 만일 합성이 알파-아미노 보호기의 산-촉매화 제거 방법을 이용한다면 바람직한 알파-아미노 보호기는 BOC 이지만; 염기-촉매화된 제거 전략을 이용하는 합성에 대해서는 FMOC가 바람직하며, 이 경우 BOC는 물론 t-부틸에스테르 또는 에테르를 포함하는 보다 산-불안정 측쇄 보호기가 사용될 수 있다.

X²는 Thr 및 Ser의 히드록실기에 대한 보호기이며, 일반적으로 BOC 전략이 사용될 경우 2,6-디클로로벤질(DCB), 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), t-부틸(t-Bu), 트리페닐메틸(트리틸), 테트라히드로피라닐 및 벤질에테르(Bzl)를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직한 보호기는 BOC 전략에 대해서는 Bzl 이고 FMOC 전략에 대해서는 t-Bu 이다. X²는 또한 수소일 수 있는데, 이는 히드록실기에 어떠한 보호기도 없음을 의미한다.

X³는 니트로, p-톨루엔술포닐(Tos), Z, 아다만틸옥시카르보닐 및 BOC를 포함하는 군으로부터 일반적으로 선택되는, Arg의 구아니디노기에 대한 보호기 또는 수소이다. Tos는 BOC 전략에 대하여 바람직하며 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐(MTR) 또는 펜타메틸크로만-6-술포닐(PMC)은 FMOC 전략에 대하여 바람직하다.

X⁴는 수소 또는 Asn 또는 Gln의 아미도기에 대한 보호기인데, 바람직하게는 크산틸(Xan)이다.

X⁵는 수소 또는 Asp 또는 Glu 의 β- 또는 γ-카르복실기에 대한 에스테르-형성 보호기이며, 일반적으로 시클로헥실(OChx), 벤질(OBzl), 2,6-디클로로벤질, 메틸, 에틸 및 t-부틸(Ot-Bu)의 에스테르를 포함하는 군으로부터 선택된다. OChx는 BOC 전략에 대해 바람직하며 Ot-Bu는 FMOC 전략에 대해 바람직하다.

X⁶는 수소 또는 Lys의 측쇄 아미노 치환체에 대한 보호기이다. 적합한 측쇄 아미노 보호기의 예는 2, 2-클로로벤질옥시카르보닐(2-Cl-Z), Tos, 1-아밀옥시카르보닐(Aoc), BOC 및 상기된 바와 같은 방향족 또는 지방족 우레탄형 보호기이다. 2-Cl-Z은 BOC 전략에 대해 바람직하며 BOC는 FMOC 전략에 대해 바람직하다.

X⁷은 수소이거나 Tos 또는 2,4-디니트로페닐(DNP)과 같은 His의 이미다졸 질소에 대한 보호기이다.

Met가 존재할 경우, 원한다면 황은 산소로 보호될 수 있다.

측쇄 아미노 보호기의 선택은 그것이 합성 중 알파-아미노기가 탈보호되는 동안 제거되지 않는 것이어야 한다는 점을 제외하고는 중요하지 않다. 따라서, 알파-아미노 보호기 및 측쇄 아미노 보호기는 같을 수 없다.

X⁵은 NH₂, 에스테르 또는 정착결합(anchoring bond)과 같은 보호기인데, 상기 보호기는 고체 수지 지지체, 바람직하게는 식. -NH-벤즈히드릴아민(BHA) 수지 지지체 및 -NH-파라메틸벤즈히드릴아민(MBHA) 수지 지지체로 표시되는 것에 결합되기 위해 고체상 합성에서 사용된다. BHA 또는 MBHA 수지로부터의 분리는 직접 CRF 유사체 아미드를 생성한다. 그러한 수지의 N-메틸-유도체를 사용함으로써, 메틸-치환된 아미드가 얻어질 수 있다.

중간체에 대한 식에 있어, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶및 X⁷중 적어도 하나는 보호기이다. 각 R-기에 대하여 선택된 특정 아미노산은 상술한 바와 같이 또한 일반적으로 당분야에 공지된 바와 같이 부착된 보호기가 있는지 여부를 결정한다. 펩티드 합성에 사용되는 특정의 측쇄 보호기를 선택함에 있어, 하기의 규칙을 따른다: (a) 보호기는 시약에 안정하여야 하고, 각 합성 단계에서 알파-아미노 보호기를 제거하기 위해 선택되는 반응조건하에서 안정해야 하며, (b) 보호기는 보호성질을 가져야 하고, 커플링 조건하에서 분리되지 않아야 하며, (c) 측쇄 보호기는 펩티드 사슬을 변경하지 않는 반응 조건하에서 바람직한 아미노산 서열을 함유하는 합성의 완료시 제거될 수 있어야 한다.

Y로 표시되는 N-말단에 있는 아실기에 대해, 아세틸, 포르밀, 아크릴릴 및 벤조일이 바람직하다. 또한, 앞서 지적된 바와 같이 N-말단은 생물학적 효능에 크게 영향을 미치지 않으면서 약간 단축될 수 있다.

따라서, (3) 적어도 하나의 보호기를 가지고 식 (IA) (여기서 X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶및 X⁷은 각각 수소 또는 보호기이고, X⁸은 보호기 또는 NH₂또는 수지 지지체에 대한 정착결합임)를 갖는 펩티드 중간체를 형성하고, (b) 식 (Ⅱ)의 상기 펩티드 중간체로부터 보호기 또는 보호기들 또는 정착 결합을 분리해 내고 (splitting off), (c) 원한다면, 결과로 생성된 펩티드를 그들의 무독성 부가염으로 전환시키는 것으로 구성되는 식 (I)로 정의된 화합물의 제조방법도 여기에 개시 된다.

펩티드가 화학 합성에 의해 제조될 경우, 당분야에 공지된 다른 균등한 화학 합성이 상술된 바와 같이 사용될 수 있지만, 펜티드들은 바람직하게 Merrifield의 J. Am. Chem. Soc., 85. p2149 (1964)에 기술된 바와 같이 고체상 합성을 사용하여 제조된다. 고체상 합성은 1981. 1, 21자 Rivier 일동에 의한 미합중국 특허 제 4,244,946호에 일반적으로 설명된 바와 같이 적합한 수지에 보호된 알파-아미노산을 커플링시킴으로써 펩티드의 C-말단으로부터 개시된다.

그러한 rCRF 유사체에 대한 출발물질은 BHA 수지에 알파-아미노-보호된 Ile를 부착시킴으로써 제조될 수 있다.

BOC에 의해 보호된 Ile 는 염화메틸렌 및 터메틸렌포름아미드(DMF)를 사용하여 BHA 수지에 커플링된다. 수지 지지체에 대한 BOC-Ile 의 커플링에 이어서, TFA 단독 또는 디옥산내 HCl 과 함께 염화메틸렌내의 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 알파-아미노 보호기는 제거된다. 바람직하게 염화메틸렌내의 TFA 50 부피% 가 1,2 에탄디티을 0-5 중량%와 함께 사용된다. 탈보호는 온도 약 0℃-실온에서 수행된다. 다른 표준 분리제(standard cleaving reagents) 및 특정의 알파-아미노 보호기의 제거를 위한 조건이 Schroder Lubke의 The Peptides, 1 pp 72-75(Academic Press 1965)에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.

Ile의 알파-아미노 보호기 제거 후, 잔여 알파-아미노- 및 측쇄-보호된 아미노산은 원하는 순서로 단계식으로 커플링되어 앞서 정의된 중간체 화합물을 얻도록 한다. 합성에서 각 아미노산을 따로 첨가하는 것에 대한 대안으로서, 그들 중 몇몇은 고체상 반응기에 첨가되기 전에 서로 커플링될 수 있다. 적절한 커플링제의 선택은 당분야의 기술내에 있다. 특히 커플링제로서 적합한 것은 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(DCC) 및 N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(DICI)이다.

펩티드의 고체상합성에 사용되는 활성제는 펩티드 분야에 잘 공지되어 있다. 적합한 활성제의 예로는 N,N'-디이소프로필 카르보디이미드 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드와 같은 카르보디이미드가 있다.

다른 활성제 및 펩티드 커플링에서의 그들의 용도는 상기 Schroder Lubke의 J. char. Sci., 59, Kapoor에 의한 제Ⅲ장, pp 127 (1970)에 기술되어 있다.

각각의 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 4배 과량으로 고체상반응기내로 도입되며, 커플링은 디메틸포름아미드(DMF) : CH₂Cl₂(1:1) 매질 또는 DMF 또는 CH₂Cl₂단독 내에서 수행된다. 커플링이 수동으로 수행되는 경우, 합성의 각 단계에서의 커플링 반응의 성공은 E. Kaiser 일동의 Anal. Biochem. 34, 595 (1970)에 기술된 대로 닌히드린 반응에 의해 모니터된다.

불완전한 커플링이 일어나는 경우, 다음의 아미노산 커플링에 앞서서 알파-아미노 보호기를 제거하기 전에 커플링 과정을 반복한다. Rivier 일동의 Biopolymers, 1978, 17, pp 1927-1938에 보고된 것과 같은 프로그램을 사용하여 Beckman 990 자동 합성기에서와 같이, 커플링 반응은 자동으로 수행될 수 있다.

원하는 아미노산 서열이 완결된 후, 중간체 펩티드는 액체 불화수소와 같은 시약으로 처리되어 수지 지지체로부터 제거되는데, 상기 시약은 펩티드를 수지로부터 분리시킬 뿐 아니라, 모든 잔여 측쇄 보호기 X², X³, X⁴, X⁵, X⁶및 X⁷및 알파-아미노 보호기 X^`1(이것이 아실기가 아니라면 최종 펩티드내에 존재할 것임)을 분리시켜 펩티드를 얻도록 한다. 분리를 위해 불화수소가 사용될 때, 아니졸 또는 크레졸 및 메틸에틸술파이드가 스캐빈저와 같이 반응 용기내에 포함된다. Met가 서열내에 존재할 경우, BOC 보호기는 수지로부터 펩티드를 분리하기 전에 트리플루오로아세트산(TFA)/에탄디티올을 사용하여 분리되어 S-알킬화 가능성을 제거할 수 있다.

하기 실시예는 고체상 기술에 의해 CRF 유사체를 합성하는 바람직한 방법을 설명한다.

[실시예 1]

식 : H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Arg-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH₂을 갖는 (D-Glu²⁰) -rCRF의 합성을 치환 범위 약 0.1-0.5^밀리몰/_그램수지를 갖는 Bachem, Inc. 로부터 입수 가능한 것과 같은 MBHA 염산 수지상에서 단계적 방식으로 수행한다. 바람직하게는 하기와 같은 적합한 프로그램을 사용하여 자동 Beckman 990B 펩티드합성기상에서 합성을 수행한다:

BOC-Ile의 커플링 결과 수지 g당 약 0.35mmo1 Ile의 치환이 야기된다.

사용되는 모든 용매는 바람직하지 않게 Met 잔기의 황을 산화시킬 수-있는 산소의 부재를 보장하기 위해, 바람직하게 불활성기체, 예컨대 헬륨 또는 질소로 살포함으로써 조심스럽게 기체를 제거시킨다.

탈보호 및 중화 후, 펩티드 사슬은 수지상에 단계적으로 형성된다. 일반적으로 수지 g당 염화메털렌내 BOC-보호된 아미노산 1-2mmol, 이에 더하여 염화메틸렌내 2몰 DCC 1당량이 2시간동안 사용된다. BOC-Arg(Tos)가 커플링될 경우, 50% DMF 및 염화메틸렌의 혼합물이 사용된다. Ser 및 Thr에 대한 히드록실 측쇄 보호기로서 Bzl을 사용한다. Asn 또는 Gln의 카르복실 단말을 활성화시키기 위해 p-니트로페닐 에스테르(ONp)를 사용할 수 있는 데 ; 예를 들면, DMF 및 염화메틸렌 50% 흔합물 내에서 HOBt 1당량을 사용하여 밤새 BOC-Asn(ONp)을 커플링시킬 수 있다. 활성 에스테르 방법 대신 DCC 커플링을 사용할 경우 Asn 또는 Gln 의 아미도기는 Xan 으로 보호된다.

Lys 측쇄에 대한 보호기로서 2-Cl-Z을 사용한다. Arg 의 구아니디노기 및 His 의 이미다졸기를 보호하는데 Tos 를 사용하며, Glu 또는 Asp 의 측쇄카르복실기를 OBzl 로 보호한다.

합성이 끝났을 때, 하기 조성물을 얻었다:

BOC-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Pro-Pro-Ile-Ser(Bzl)-Leu-Asp(OBzl)-Leu-Thr(Bzl)-Phe-His(Tos)-Leu-Leu-Arg(Tos)-Glu(OBzl)-Val-Leu-D-Glu(OBzl)-Met-Ala-Arg(Tos)-Ala-Glu(OBzl)-Glu(Xan)-Leu-Ala-Gln(Xan)-Gln(Xan)-Ala-His(Tos)-Ser(Bzl)-Asn(Xan)-Arg(Tos)-Lys(2-Cl-Z)-Leu-Met-Glu(OBzl)-Ile-Ile-수지 지지체. 알파-아미노 보호기를 탈블록시키는데 사용되는 TFA 처리로 Xan 은 부분적으로 또는 전적으로 제거되었다.

결과 생성된 보호된 펩티드-수지를 분리시키고 탈보호시키기 위해, 펩티드 수지 g당 먼저 -20℃에서 20분간, 이어서 0℃에서 30분간 아니솔 1.5㎖, 메틸 에틸 술파이드 0.5㎖ 및 불화수소(HF) 15㎖로 처리한다. 고진공하에서 HF를 제거시킨 후, 수지-펩티드를 건조 디에틸에테르 및 클로로포름으로 교대로 세척해준 다음, 펩티드를 기체를 제거시킨 2N 수성 아세트산으로 추출하고 여과로 수지로 부터 분리시킨다.

Marki 일동의 J. Am. Chem. Soc., 103, 3178 (1981); Rivier 일동의 J. Chromatography, 288, 303-328(1984); 및 Hoeger 일동의 Biochromatography, 2, 3, 134-142 (1987)에 기술된 바와 같은 겔투과 및 예비 HPLC 에 의해 펩티드를 정제한다. HPLC로 크로마토그라프 프랙션을 조심스럽게 모니터하고, 상당한 순도를 나타내는 프랙션만을 모은다.

정확한 서열이 얻어졌는가를 체크하기 위해, rCRF 유사체를 일정 비등의 HCI, 티오글리콜/㎖ 3㎕ 및 Nle 1nmol(내부 표준으로서)을 함유한 밀봉배기 튜브내에서 140℃에서 9시간동안 가수분해시킨다. Beckman 121 MB 아미노산 분석기를 사용한 가수분해물의 아미노산 분석은 41-잔기 펩티드 구조가-얻어지는 것을 확인해 주는 아미노산 비율을 나타낸다.

[실시예 2]

식 :H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Glu]-oCRF 를 실시예 1에서 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성했다.

상술된 방법으로 합성 및 정제된 hCRF 펩티드의 특정 광학 회전은Perkin Elmer Model 241 편광계 상에서 [α]D=-77.6±1.0 (1% 아세트산 내의 C=0.5)로 측정되었으며(HO 및 TFA의 존재에 대하여 보정됨); 그것은 순도 약 98.8%를 가진다.

펩티드는 얇은층 크로마토그라피 및 몇몇 서로 다른 용매 시스템을 사용하여 동질(homogeneous)의 것으로 판단된다. 펩티드는 특히 300Å 공극크기의 5㎛ C실리카로 팩킹된 0.46 × 25㎝ 칼럼을 갖는 Waters HPLC 시스템을 사용하여 반전-상(reversed-phase) 고압 액체 크로마토그래피에 적용된다.

사용되는 완충액 A는 용액 1000㎖ 당 TFA 1.0㎖ 로 구성된 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액이며, 완충액 B는 100% 아세토니트릴이다. 15.5% 완충액 B로부터 71.5% 완층액 B의 기울기로 실온에서 30분간 측정을 시행했다. 유동속도는 분당 1.8㎖ 이고, 체류 시간은 23.0분이다.

결과의 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다.

[실시예 3]

시험관내 및 생체 내에서의 ACTH 및 β-엔도르핀의 분비에 미치는 합성 펩티드 [D-Glu]-oCFR의 효과를 검토한다. 배양시킨 쥐의 뇌하수체세포에 의한 ACTH 및 β-엔도르핀의 분비를 촉진시키는데 있어서의 합성[D-Glu]-oCRF의 효능은 Endocrinology, 91, 562 (1972)에 일반적으로 설명된 공정을 사용하여 측정되며 합성 oCRF와 비교한다. 펩티드 [D-Glu]-oCRF 약 170 피코몰 농도에서 반-최대 응답이 측정되었는데, 반면 이러한 응답을 얻기 위해 약 250 피코몰의 oCRF 농도가 필요하다. [D-Glu]-oCRF 의 최대(1-5nM) 농도에 대한 분비 응답은 고원 레벨(plateau level)에서이며; 이는 천연 호르몬 보다 약 2배 효능인 것으로 생각된다 C. Rivier 일동의 Science, 218,377 (1982)에 설명된 일반 공정을 사용하여 생체내 시험을 수행하며 그 결과 더 긴 효능의 지속 및 상당한 혈압 강하를 나타냄을 알 수 있다.

[실시예 4]

식 : H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Met-Ala-Glu-Gln-Leu-ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [D-Phe, D-Glu]-rCRF(3-41)을 합성한다. 결과 얻어진 정제 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 39-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 Ⅲ에 설명된 일반적 공정에 따른 시험은 이것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-LI 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 5]

식 : H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Glu,Nle]-oCRF를 실시예 Ⅰ에 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성한다. 결과 얻어진 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 111에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 6]

식 : Ac-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Nle-Glu-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [아세틸-Ser, D-Phe, Nle]-rCRF 를 합성한다. 결과 얻어진 정제된 펩틴드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 7]

식 : Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg0Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp0Ile-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Phe]-oCRF 를 실시예 1에 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성한다.

전술된 방식으로 합성되고 정제된 hCRF 펩티드의 특정 광회전은 Perkin Elmer Model 241 편광계 상에서 [α]=-75.3±1.0 (1% 아세트산내 c=0.5) (HO 및 TFA의 존재에 대하여 보정됨)로서 측정되며; 그것은 순도 98% 이상을 가진다.

얇은층 크로마토그라피 및 몇몇 서로 다른 용매 시스템을 사용하여 펩티드가 동질의 것으로 판단된다. 구체적으로 그것은 300Å, 공극크기의 5㎛ C실리카로 팩킹된 0.46 × 25㎝ 칼럼을 갖는 Waters HPLC 시스템을 사용하여 반전-상 고압 액체크로마토그라피에 적용된다. 사용된 완충액 A는 용액 1000㎖당 TFA 1.0㎖ 로 구성된 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액이고 ; 완충액 B는 100% 아세토니트릴이다. 9% 완충액 B로부터 57.0% 완충액 B로의 기울기로 실온에서 30분에 걸쳐 측정을 시행한다. 유동속도는 분당 1.8㎖ 이고, 체류시간은 28.3분이다.

결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 렙티드 구조가 얻어짐을 확인한다.

[실시예 8]

식 : H-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-D-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [D-Phe, D-Ala]-rCRF(4-41)를 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 38-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 만찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 9]

식 : H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Phe, Nle]-oCRF 를 실시예 1에 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 Ⅲ에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 10]

식 : For-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Lys-Leu-Nle-Glu-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [포르밀-Ser, D-Phe, Nle, D-His]-rCRF 를 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예11]

식 : H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-D-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Ala]-oCRF 를 실시예 1에 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성한다.

전술된 방식으로 합성되고 정제된 hCRF 펩티드의 특정 광회전은 Perkin Elmer Model 241 편광계 상에서 [α]=-79.4±1.0 (1% 아세트산내 c=0.5)(HO 및 TFA의 존재에 대하여 보정됨)로서 측정되며 ; 그것은 순도 약 98.9%를 가진다.

얇은층 크로마토그라피 및 몇몇 서로 다른 용매 시스템을 사용하여 펩티드는 동질의 것으로 판단된다. 구체적으로, 그것은 300Å 공극크기의 5㎛ C실리카로 팩킹된 0.46 × 25㎝ 칼럼을 갖는 상술된 Waters HPLC 시스템을 사용하여 반전-상 고압 액체크로마토그라피에 적용된다. 사용된 완충액 A 는용액 1000㎖ 당 TFA 1.0㎖ 로 구성된 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액이고 ; 완충액 B 는 100% 아세토니트릴이다. 15.5% 완충액 B로부터 71.5% 완충액 B까지의 기울기로 실온에서 30분에 걸쳐 측정을 수행한다. 유동속도는 분당 1.8㎖ 이고, 체류시간은 21.9분이다.

결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다.

[실시예 12]

식 : H-pGlu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-D-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [pGlu,D-Phe, D-Ala]-rCRF(2-41)를 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 40-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 13]

식 : H-Ser-Gln-glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Nlee-Thr-Lys-D-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Nle-Asp-Ile-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Glu, D-Ala, Nle]-oCRF를 실시예 Ⅰ에 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다.

실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 14]

식 : Bz-Ser-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Seu-Nle-Glu-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [벤조일-Ser, D-Phe, Nle.,D-His]-rCRF 를 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다.

실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 15]

식 : H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-NH를 갖는 펩티드[D-His]-oCRF 를 실시예 1에 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성한다.

전술된 방식으로 합성되고 정제된 hCRF 펩티드의 특정 광회전은 Perkin Elmer Model 241 편광계 상에서 [α]D=-71.6±1.0 (1% 아세트산내 c=0.5)(HO 및 TFA의 존재에 대하여 보정됨)로서 측정되며 ; 그것은 순도 약 95.0%를 가진다.

얇은층 크로마토그라피 및 몇몇 서로 다른 용매 시스템을 사용하여 펩티드는 동질의 것으로 판단된다. 구체적으로, 그것은 300Å 공극크기의 5㎛ C실리카로 팩킹된 0.46 × 25㎝ 컬럼을 갖는 Waters HPLC 시스템을 사용하여 반전-상 고압 액체 크로마토그라피에 적용된다. 사용된 완충액 A는 용액 1000㎖당 TFA 1.0㎖ 로 구성된 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액이고; 완충액 B는 100% 아세토니트릴이다. 36% 완충액 B로부터 49% 완충액 B까지의 기울기로 실온에서 20분에 걸쳐 측정을 수행한다. 유동속도는 분당 1.8㎖이고, 체류시간은 17.2분이다.

[실시예 16]

식 : H-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Met-Ala-Arg-D-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [D-Phe, D-Glu,D-Ala, D-His]-rCRF (6-41) 을 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 36-잔기 렙티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 17]

식 : H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Nla-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Glu, Nle, D-His]-oCRF 를 실시예 I에 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 41-잔기 펩티드 구조가 얻어짐을 확인한다. 실

시예 피에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 18]

식 : Acr-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Nle-Glu-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [아크릴릴-Glu, D-Phe, Nle, D-His]-rCRF(2-41)를 합성한다. 결과적인, 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 펩티드에 대한 식과 일치하며 40-잔기 펩티드구조가 얻어짐을 확인한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 19]

식 : pGlu-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-D-Phe-Glu-Leu-Leu-Arg-Lys-Met-Ile-D-Glu-Ala-Arg-Lys-Gln-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Asp-Ile-Ile-NH을 갖는 펩티드 [D-Phe,D-Glu,Ala, Arg, Glu, Ile]-사우바진(Sauvagine)을 합성한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 20]

식 : H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nla-Leu-D-Glu-Nle-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-D-His-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH를 갖는 펩티드[Nle, D-Glu, D-His]-AHC 를 합성한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-ENB-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 21]

식 : H-Ser-Gln-Gln-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Ls-Ala-Glu-Gln-Glu-ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Ile-Asn-Arg-Asn-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-Nh을 갖는 펩티드[D-Pro, D-Phe, Nle, Ile, Asn]-AHC 를 합성한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 22]

식 : H-Ser-Gln-D-Tyr-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-DlGlu-Nva-Ala-Lys-D-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Tyr, Nle, Nva, D-Glu, D-Ala]-AHC를 합성한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 23]

식 : H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-Glu-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Met-Glu-Orn-Ala-Glu-Lys-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH을 갖는 펩티드[Glu, D-Phe, Nle, Orn]-AHC 을 합성한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 24]

식 : H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-Glu-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Lys-Tyr-Leu-Glu-Glu-Val-NH을 갖는 합성 펩티드[D-Phe, Glu, Ile, Lys, Tyr, Va1]-AHC 를 합성한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 25]

식 : H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-D-Glu-Arg-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH을 갖는 합성 펩티드[D-Phe, D-Glu, Arg]-AHC 를 실시예 1에 일반적으로 설명된 바와 같은 공정을 사용하여 합성한다.

실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압강하를 야기시킴을 보여준다.

[실시예 26]

식 : H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-D-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH을 갖는 펩티드[D-Phe, Nle, D-Ala]-AHC 를 합성한다. 실시예 3에 설명된 일반 공정에 따른 시험은 그것이 마찬가지로 ACTH 및 β-END-Ll 분비를 촉진시키고 매우 상당한 혈압 강하를 야기시킴을 보여준다.

CRF는 뇌하수체-부신피질 축을 충분히 자극하며, CRF 유사체는 낮은 내인성(endogenous) 부신당성 피질성 스테로이드군을 생성하는 유형의 환자에서 이러한 축의 기능을 자극하는데 유용해야 한다. 예컨대, CRF는 뇌하수체-부신피질 기능이 억압된 채로 남아 있는 외인성 부신당성 피질성 스테로이드군 치료를 받은 환자에 있어서 뇌하수체-부신 기능을 회복하는데 유용해야 한다.

대부분의 다른 조절 펩티드류는 중추 신경계 및 위장노에서 표과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다. ACTH 및 β-END 분비는 스트레스에 대한 포유동물의 반응에서 필요불가결의 것이기 때문에, CRF가 신체의 스트레스 응답의 조정기(mediator)로서 뇌에 상당한 영향을 미치는 것은 놀라운 것이 아니다. 예를 들면, 뇌 속의 CRF는 호흡속도를 증가시키는 것으로 보이며, 호흠침체(respiratory depression)를 치료하는데 유용하다. CRF 는 또한 분위기의 전환, 학습 및 정상인 개인 및 정신적으로 장해된 개인의 행동에서 적용성이 밝혀진다. CRF 유사체는 ACTH, β-END, β-리포트로핀, 다른 프로-오퍼오멜라 노코르틴 유전자 생성물 및 코르티코스테론의 수위를 향상시키기 때문에, 이것의 투여는 뇌 및 말초신경에 대한 그들의 효과를 유도함으로써, 기억, 분위기, 고통 감지 등 좀 더 구체적으로 경계, 침체 및/또는 근심에 영향을 미칠 수 있도록 사용될 수 있다. 예컨대, 심실로 투여될 경우 CRF는 활성을 증가시키고 쥐의 학습 수행을 향상시킴으로써 천연 흥분제로서의 기능을 할 수 있다.

CRF 유사체는 또한 포유동물, 특히 인간 및 다른 포유동물의 위장노로의 혈류를 중가시키기 위해 사용되어야 한다. 모든 CRF 관련 펩티드는 장간막 혈관상을 확장하는 것으로 밝혀진다. 또한, oCRF는 위산 생성을 억제하며, CRF 유사체 또한 포유동물에서 위산 생성을 감소시키고/거나 위장의 기능을 억제시킴으로써 위궤양의 치료에 효과적인 것으로 기대된다.

제약학적 조성물을 형성하기 위한 제약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체와 결합된 CRF 유사체 또는 그들의 무독성 부가염은 사람을 포함한 포유동물에 정맥내로, 피하로, 근육내로, 경피로, 예컨대 비(鼻)내로, 뇌척수내로 또는 경구로 투여될 수 있다. 펩티드는 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 98% 의 순도를 가져야하나, 낮은 순도도 유효하며 사람 이외의 포유동물에도 사용될 수 있다. 이러한 순도는 의도된 펩티드가 존재하는 모든 유사 펩티드 및 펩티드 단편의 언급된 중량%를 구성한다는 것을 의미한다. 사람에게의 투여는 의사에 의해 혈압을 낮추기 위해 또는 내인성 글루코-코르티코이드 생성을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 요구되는 투여량은 특별한 처리 조건, 조건의 엄격성 및 원하는 처리의 지속시간에 따라 변할 것이다.

이들 펩티드류는 또한 적절한 투여 및 이에 따른 신체 기능의 모니터링에 의해 의심스러운 내분비 또는 중추신경계 경로를 가진 포유동물에 있어서 시상하부의 뇌하수체 아드레날 기능을 평가하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 투여는 쿠싱(Cushing) 질환 및 감정적인 장해, 예컨대 우울병을 평가하는 진단 도구로서 사용될 수 있다.

이러한 펩티드들은 흔히, 예컨대 아연, 철, 칼슘, 바륨, 마그네슘, 알루미늄 등을 가진 산부가염 또는 금속 착화합물(본 출원의 목적상 부가염으로 간주됨)과 같은 제약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 무독성염의 형태로 투여된다. 대표적인 그러한 산부가염은 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 일살염, 탄닌산염, 옥살산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 알긴산염, 말레산염, 아세트산염, 시트르산염, 벤조산염, 숙신산염, 말산염, 아스코르브산염, 타르타르산염 등이다.

만일 활성 성분이 정제형으로 투여된다면, 정제는 트라가칸스, 옥수수 녹말 또는 젤라틴과 같은 결합제; 알긴산과 같은 붕해제; 및 마그네슘 스테아르산염과 같은 윤활제를 함유할 수 있다. 만일 액체 형태의 투여를 원하면, 감미제 및/또는 향미제가 사용될 수 있고, 등장 염수, 인산 완충액 등으로 정맥내 투여가 수행될수 있다.

펩티드류는 의사의 안내하에서 투여되어야 하고, 제약학적 조성물은 일반적으로 종래의 제약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체와 함께 펩티드를 함유할 수 있다. 일반적으로 투여량은 숙주 동물의 체중 ㎏당 펩티드 약 1-약 200㎍ 일 것이다. 어떤 경우, 이들 펩티드를 사용한 치료는 ACTH 또는 코르티코스테로이드의 투여 대신 수행될 수 있고, 그러한 경우에 약 10㎍/체중㎏ 정도로 낮은 투여량이 사용될 수 있다. 여기에서 사용되는 모든 온도는 ℃이고 모든 비는 부피비이다. 액체 물질의 %도 또한 부피비이다.

비록 본 발명이 발명자에게 현재 공지된 최적의 양식을 구성하는 바람직한 실시양태와 관련되어 기술될지라도, 당업자에게 명백한 다양한 변화 및 변형이 여기에 첨부된 특허청구의 범위에서 정해진 본 발명의 범위로부터 벗어남 없이 행해질 수 있다. 예컨대, CRF 펩티드 사슬내의 다른 위치에서의 치환 및 변형이 유사체의 효능의 손상없이 현재 또는 미래의 개발에 따라서 만들어질 수 있다. 약 7-41 위치의 아미노산 서열 또는 그들의 등가물이 합성 펩티드내에 존재하는 것이 중요해 보이는 반면, 분자의 나머지는 중요해 보이지 않는다.

예를들면, C-말단에서의 단순한 아미드 대신 저급 알킬-치환 아미드, 예컨대 메틸아미드, 에틸아미드 등이 사용될 수 있다. 마찬가지로 1 내지 10개의 추가 아미노산 잔기는 생물학적 효능에 크게 나쁜 영향을 줌이 없이 N-말단에서 포함될 수 있다. 그러한 펩티드류는 본 발명의 범위내에 포함되는 등가물로 간주된다.

본 발명의 다양한 양상은 하기 특허 청구의 범위에서 강조된다.

Claims

하기 식을 갖는 펩티드 또는 그의 무독성 부가염:

Y-R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-R₁₂-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-R₂₀-R₂₁-R₂₂-R₂₃-R₂₄-R₂₅-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-R₃₂-Ser-Asn-Arg-R₃₆-Leu-R₃₈-R₃₉-Ile-R₄₁-NH₂

(상기 식에서 Y는 7 이하의 탄소 원자를 갖는 아실기 또는 수소이고; R₁은 Ser 또는 desR₁이고; R₂는 Glu, Gln, pGlu 또는 desR₂이고; R₃는 Glu 또는 desR₃이고; R₄는 Pro 또는 desR₄이고: R₅는 Pro 또는 desR₅01고; R₆는 Ile 또는 desR₆이고; R₁₂는 D-Phe 또는 Phe이고; R₂₀은 D-Glu 또는 Glu이고: R₂₁은 Met 또는 Nle 이고; R₂₂는 Ala 또는 Thr 이고; R₂₃은 Arg 또는 Lys이고; R₂₄는 D-Ala 또는 Ala이고; R₂₅는 Glu 또는 Asp 이고; R₃₂는 D-His 또는 His이고; R₃₆은 Lys 또는 Leu 이고; R₃₈는 Met, Nle 또는 Leu이고; R₃₉는 Glu 또는 Asp이고; R₄₁은 Ile 또는 Ala 이며: 단 하기 잔기들 중 하나 이상은 존재함: R₁₂는 D-Phe, R₂₀는 D-Glu, R₂₄는 D-Ala, R₃₂는 D-His)
하기 식을 갖는 펩티드 또는 그의 무독성염:

Y-R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-Ser-R₈-R₉-Leu-R₁₁-R₁₂-R₁₃-R₁₄-Leu-Arg-R₁₇-R₁₈-R₁₉-R₂₀-R₂₁-R₂₂-R₂₃-R₂₄-R₂₅-R₂₆-R₂₇-R₂₈-R₂₉-Gln-Ala-R₃₂-R₃₃-Asn-Arg-R₃₆-R₃₇-R₃₈-R₃₉-R₄₀-R₄₁-NH2

(상기 식에서, Y는 7 이하의 탄소 원자를 갖는 아실기 또는 수소이고: R₁은 Ser, D-Ser 또는 desR₁이고: R2는 Glu, Gln, PGlu, D-pGlu 또는 desR₂이고; R₃는 Glu, Gly, D-Tyr 또는 desR₃이고; R₄는 Pro, D-Pro 또는 desR₄이고; R₅는 Pro 또는 desR₅이고; R₆는 Ile 또는 desR₆이고; R₈및 R₁₉는 Leu 또는 Ile이고; R₉는 Asp 이고; R₁₁은 Thr 또는 Ser 이고; R₁₂는 Phe 또는 D-Phe이고; R₁₃는 His 또는 Glu 이고; R₁₄는 Leu이고; R₁₇는 Glu 또는 Lys이고; R₁₈는 Val, Nle 또는 Met이고; R₂₀는 D-Glu 또는 Glu이고; R₂₁은 Arg, Met Nva, Ile, Ala 또는 Nle 이고; R₂₂는 Ala, Thr 또는 Glu 이고: R₂₃은 Arg, Orn 또는 Lys 이고; R₂₄는 Ala, D-Ala 또는 Gln 이고; R₂₅는 Glu 또는 Asp 이고; R₂₆은 Gln 또는 Lys 이고; R₂₇은 Leu 또는 Glu이고; R₂₈은 Ala또는 Lys이고; R₂₉는 Gln 또는 Glu이고; R₃₂는 His, D-His 또는 Ala 이고; R₃₃는 Ile, Ser, Asn 또는 Leu이고; R₃₆은Asn, Lys 또는 Leu 이고: R₃₇은 Leu 또는 Tyr이고; R₃₈은 Met, Nle 또는 Leu 이고, R₃₉는 Glu 또는 Asp이고: R₄₀은 Ile 또는 Glu 이고; R₄₁은 Ile, Ala 또는 Val 이며; 단 하기 잔기들 중 하나 이상은 존재함: R₁₂는 D-Phe, R₂₀는 D-Glu, R₂₄는 D-Ala, R₃₂는 D-His)
하기 식을 갖는 펩티드 또는 그의 무독성염:

Y-R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-Ser-Leu-R₈-Leu-Thr-R₁₂-R₁₃-R₁₄-Leu-Arg-Glu-R₁₈-Leu-R₂₀-R₂₁-Ala-Lys-R₂₄-Glu-Gln-R₂₇-Ala-Glu-Gln-Ala-R₃₂-R₃₃-Asn-Arg-R₃₆-R₃₇-R₃₈-R₃₉-R₄₀-R₄₁-NH2

(상기 식에서, Y는 7 이하의 탄소 원자를 갖는 아실기 또는 수소이고; R₁은 Ser또는 desR₁이고; R₂는 Glu, Gln 또는 desR₂이고; R₃는 Glu 또는 desR₃이고; R₄는 Pro 또는 desR₄이고; R₅는 Pro 또는 desR₅이고; R₆는 Ile 또는 desR₆이고; R₉는 Asp이고; R₁₂는 Phe 또는 D-Phe이고: R₁₃은 His 또는 Glu이고; R₁₄는 Leu이고; R₁₈는 Nle 또는 Met이고; R₂₀은 D-Glu 또는 Glu이고; R₂₁은 Met, Nle 또는 lie이고; R₂₄는 Ala 또는 D-Ala 이고; R₂₇은 Glu 또는 Leu이고; R₃₂는 His, D-His 또는 D-Ala 이고; R₃₃은 Ser 또는 Leu이고; R₃₆는 Leu 또는 Lys 이고; R₃₇은 Leu 또는 Tyr이고; R₃₈은 Leu 또는 Nle ol고; R₃₉는 Glu 또는 Asp이고; R₄₀은 lie 또는 Glu 이고; R₄₁은 Ile, Ala또는 Val 이며; 단 하기 잔기들 중 하나이상은 존재함: R₁₂는 D-Phe, R₂₀는 D-Glu, R₂₄는 D-Ala, R₃₂는 D-His)
제2항에 있어서, R₁₂가 D-Phe 인 펩티드
제2항에 있어서, R₂₁이 Nle인 펩티드
제2항에 있어서, R₂₀이 D-Glu 인 펩티드
제2항에 있어서, R₃₈이 Nle 인 펩티드.
제1항에 있어서, 하기 일반식:

H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH₂, 또는

H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH₂을 갖는 펩티드.