FI91413B - Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten CRF-analogien valmistamiseksi - Google Patents

Description

91413

Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten CRF-analogien valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu menetelmään farmaseuttises-5 ti käyttökelpoisen kortikotropiinia vapauttavan tekijän j ohdannai sen valmi stami seksi.

Keksinnön tausta

Hypotalamuksella on keskeinen osa adenohypofyysin kortikotrooppisten solujen eritystoimintojen säätelyssä.

10 Hypotalamuksen erittämät aineet kasvattavat aivolisäkkeen ACTH-erityksen nopeutta. Fysiologinen kortikotropiinia vapauttava aine (CRF), toisin sanoen lampaan (oCRF), karakterisoitiin vuonna 1981 ja yhdysvaltalaisessa patentissa n:o 4 415 558 sen kaavan ilmoitettiin olevan: H-Ser-15 Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-

Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2.

Rotan CRF:llä (rCRF) on esitetty olevan kaava: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-20 Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-

Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2 ja siihen voidaan vaihtoehtoisesti viitata nimellä rotan amu-niini. Ihmisen CRF:n kaavan on määritetty olevan ilmeisesti sama kuin rCRF:n. Synteettiset rCRF ja oCRF stimuloivat 25 ACTH- ja β-endorfiiniaktiivisuutta in vivo ja in vitro ja alentavat huomattavasti verenpainetta pitkäksi aikaa.

Keksinnön yhteenveto

Keksinnön mukaisesti valmistetuille CRF-peptidien analogeilla on ainakin olennaisesti sama edellä kuvattu 30 biologinen vaikutus kuin luonnon peptideillä.

Valmistettaviin farmaseuttisiin tuotteisiin kuuluvat tällaiset CRF-analogit tai niiden ei-toksiset additio-suolat sekoitettuha farmaseuttisesti tai eläinlääkinnälli-sesti hyväksyttävään nestemäiseen tai kiinteään kantajaan.

35 Tällaisia peptidejä tai farmaseuttisesti tai eläinlääkin- 2 nällisesti hyväksyttäviä additiosuoloja voidaan keksinnön mukaan antaa nisäkkäille, erityisesti ihmisille ACTH-, β-endorfiini-, β-lipotropiinierityksen, muiden pro-opiome-lanokortiinigeenin tuotteiden ja kortikosteronin erityksen 5 säätelemiseksi ja/tai verenpaineen alentamiseksi ja/tai mielentilaan, käyttäytymis- ja ruoansulatustoimintoihin ja autonomisen hermoston toimintaan vaikuttamiseksi. Edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen kuvaus

Peptidien määrittelyssä käytetty nimistö on Schro-10 derin & Lubken teoksessa "The Peptides", Academic Press (1965) erittelemä ja siinä on tavanomaisen esitystavan mukaisesti aminoryhmä vasemmalla ja karboksyyliryhmä oikealla puolella. Normaaleja 3-kirjaimisia lyhennyksiä käytetään alfa-aminohappotähteiden identifioimisessa, ja kun 15 aminohappotähteellä on isomeerimuotoja, tarkoitetaan aminohapon L-muotoa, ellei nimenomaisesti ole muuta esitetty, esimerkiksi Ser = L-seriini, Nle = L-norleusiini, Nva = norvaliini, Har homoarginiini, Orn = ornitiini jne. Lisäksi käytetään seuraavia lyhenteitä: leu = joko L-leusii-20 ni tai CaCH3-L-leusiini (CML) ja ala = joko L-alaniini tai CaCH3-L-alaniini (CMA).

Keksintö kohdistuu CRF-analogin valmistamiseen, jolla on kaava (I) H-^-Rj-Ra-R^-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-25 Arg-Glu-R18-Leu-Glu-R2X-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-

Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2, jossa Rx on Ser tai des Rx; R2 on Gin, tai des R2; R3 on Glu, D-Tyr tai des R3; R4 on Pro tai D-Pro; Rle on Nle tai Met; R21 on Met tai Nle.

30 On syntetoitu CRF-agonisteja, jotka ovat ainakin yhtä tehokkaita ja usein tehokkaampia kuin luonnon CRF. On edullista, että näissä analogeissa on seuraavat tähteet, joilla on suuri alfa-kierteen muodostustaipumus: Rx on Ser, R2 on Gin, R3 on Glu ja R4 on Pro. Erityisen tehokkaaksi on 35 havaittu analogi: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp- 91413 3

Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2, johon jäljempänä viitataan nimellä AHC ("alpha-helical CRF", alfa-kierteinen CRF); sen tehokkuus 5 säilyy, vaikka sitä lyhennetään N-päästä yhden - viiden tähteen verran. Jos sitä kuitenkin lyhennetään tähteiden 1-7, 1-8 tai 1-9 poistamiseksi, muodostuu CRF:n kilpailevia antagonisteja.

Peptidit syntetoidaan sopivaa menetelmää, kuten yk-10 sinomaan kiinteän faasin tekniikkaa, osittaista kiinteän faasin tekniikkaa, fragmenttikondensaatio- tai klassista liuoslisäysmenetelmää käyttäen. Eräitä CRF-analogeja, joissa ei ole D-isomeeri- tai epäluonnollisia aminohappotähteitä, voidaan syntetoida myös äskettäin kehitettyä 15 yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle CRF-analogien valmistamiseksi on tunnusomaista, että (a) muodostetaan peptidi, jossa on vähintään yksi suojaryhmä ja jolla on kaava (II) 20 X^RiU^-RjUM-RsiX5 tai X)-R4-Pro-Ile-Ser(X2) -Leu-Asp( X5) -Leu-Thr (X2) -Phe-His( X) -Leu-Leu-Arg( X3) -Glu( X5) -R18-Leu-Glu-(X5) -R21-Ala-Lys (X6) -Ala-Glu (X5) -Gin (X4) -Glu (X5) - Ala-Glu (X5) -Gln( X4)-Ala-Ala-Leu-Asn( X4 )-Arg( X3) -Leu( X6) -Leu-Leu-Glu( X5) -Glu(X5)-Ala-X7 ja jossa X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X6 ovat kukin 25 joko vety tai suojaryhmä ja X7 on joko suojaryhmä tai kanta jahartsiin ankkuroiva sidos tai NH2 ja (b) suojaryhmä tai -ryhmät tai ankkuroiva sidos lohkaistaan kaavan II mukaisesta peptidistä.

Yhteistä peptidien kemiallisille synteeseille on 30 eri aminohappoyksiköiden labiilien sivuketjuryhmien suojaus sopivilla suojaryhmillä, jotka estävät kemiallisen reak-tion siinä kohdassa kunnes rynmä lopuksi poistetaan. Tavallisesti yhteisenä piirteenä on myös aminohapon tai fragmentin alfa-aminoryhmän suojaus tämän kokonaisuuden 35 karboksyyliryhmän reagoidessa ja sitä seuraava alfa-amino- 4 ryhmän suojauksen selektiivinen poistaminen, jolloin seu-raava reaktio voi tapahtua siinä kohdassa. Tämän mukaisesti on yleistä, että synteesin jossain vaiheessa muodostuu välituote, jossa on kaikki aminohappotähteet halutussa 5 järjestyksessä peptidiketjussa ja useissa näistä tähteistä on sivuketjuja suojaavia ryhmiä.

Tämän keksinnön alaan katsotaan kuuluviksi myös kaavan (II) mukaiset välituotteet: X1-Rl(X2)-Ra(X4)-R,(X5 tai X) -R4-Pro-Ile-Ser (X*) -Leu-Asp{X5) -10 Leu-Thr (X2) -Phe-His (X) -Leu-Leu-Arg (X3) -Glu (Xs) -Rie-Leu-Glu- (Xs) -R^-Ala-Lys (X6)-Ala-Glu (Xs) -Gin (X4) -Glu (Xs) -Ala-Glu (X5) -Gin (X4) -Ala-Ala-Leu-Asn (X4) -Arg (X3) -Leu (X6) -Leu-Leu-Glu (X5) -Glu(X5)-Ala-X7 ja jossa X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X* ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja X7 on joko suojaryhmä tai kan-15 tajahartsiin ankkuroiva sidos tai NH2 ja R-ryhmät ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia.

X1 on joko vetyatomi tai α-aminoryhmää suojaava ryhmä. xSllä merkityt α-aminoryhmän suojaryhmät ovat polypep-tidien vaiheittaisissa synteesimenetelmissä hyödyllisiksi 20 tunnettuja. X3:n kattamiin α-aminoryhmien suojaryhmien luokkiin kuuluvat (1) asyylityyppiset suojaryhmät kuten formyyli-, akrylyyli(Acr)-, bentsoyyli(Bz)- ja asetyyli-ryhmä, joita on edullista käyttää ainoastaan N-päässä; (2) aromaattiset uretaani tyyppiset suojaryhmät kuten bent-25 syylioksikarbonyyli(Z)- ja substituoitu Z-ryhmä, kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli-, p-nitrobentsyylioksikar-bonyyli-, p-bromibentsyylioksikarbonyyli-, p-metoksibent-syylioksikarbonyyliryhmä; (3) alifaattiset uretaani-suoja-ryhmät, kuten t-butyylioksikarbonyyli(BOC)-, di-isopropyy-30 limetoksikarbonyyli-, isopropyylioksikarbonyyli-, etoksi- karbonyyli-, allyylioksikarbonyyliryhmä; (4) sykloalkyyli-tyyppiset uretaanityypin suojaryhmät, kuten fluorenyylime-tyylioksikarbonyyli(FMOC)-, syklopentyylioksikarbonyyli-, adamantyylioksikarbonyyli- ja sykloheksyylioksikarbonyyli-35 ryhmä; ja (5) tiouretaanityyppiset suojaryhmät, kuten fe- 91413 5 nyylitiokarbonyyliryhmä. Edullinen α-aminoryhmän suojaryh-mä on BOC.

X2 on Thr:n ja Ser:n hydroksyyliryhmän suojaryhmä ja se on edullista valita asetyyli(Ac)-, bentsoyyli(Bz)-, 5 tert-butyyli-, trifenyylimetyyli(trityyli)-, tetrahydro- pyranyyli-, bentsyylieetteri(Bzl)- ja 2,6-diklooribentsyy-li(DCB)ryhmästä koostuvasta luokasta. Edullisin suojaryhmä on Bzl. X2 voi olla vetyatomi, mikä tarkoittaa, että hyd-roksyyliryhmässä ei ole suojaryhmää.

10 X3 on Arg:n ja Har:n guanidiiniryhmän suojaryhmä ja se on edullista valita luokasta, joka koostuu nitro-, p-tolueenisulfonyyli(Tos)-, Z-, adamantyylioksikarbonyyli-ja BOC-ryhmästä, tai X3 on vetyatomi. Tos on edullisin.

X4 on vetyatomi tai Asn:n tai Gin:n amidoryhmän suo-15 jaryhmä, joksi on edullista valita ksantyyli(Xan)-ryhmä.

X5 on vetyatomi tai Asp:n tai Glu:n β- tai γ-karbok-syyliryhmän esterin muodostava suojaryhmä, joka on edullista valita bentsyyli-, 2,6-diklooribentsyyli-, metyyli-, etyyli- ja t-butyyliesteristä koostuvasta luokasta. OBzl 20 on edullisin.

X6 on vetyatomi tai Lys:n tai Orn:n sivuketjun ami-nosubstituentin suojaryhmä. Kuvaavia esimerkkejä sopivista sivuketjun aminosuojaryhmistä ovat Z-, 2-klooribentsyyli-oksikarbonyyli(2-C1-Z)-, Tos-, t-amyylioksikarbonyyli-25 (Aoc)-, BOC-ryhmä ja edellä eritellyt aromaattiset tai alifaattiset uretaanityyppiset suojaryhmät.

Kun His on mukana, X on vetyatomi tai imidatsoli-typen suojaryhmä, kuten esimerkiksi Tos- tai 2,4-dinitro-fenyyli(DNP)-ryhmä ja kun Tyr on mukana, X on vetyatomi 30 tai hydroksyylirynmän suojaryhmä, kuten esimerkiksi DCB- ryhmä. Kun Met on mukana, rikkiatomi voidaan haluttaessa suojata hapella.

Sivuketjun aminosuojaryhmän valinta ei ole kriittinen, paitsi että suojaryhmä ei saa poistua poistettaessa 35 a-aminoryhmien suojausta synteesin aikana, a-aminosuoja- 6 ryhmä ja sivuketjun aminoryhmää suojaava ryhmä eivät siten voi olla samoja.

X7 on NH2, suojaryhmä, kuten esimerkiksi esteri tai ankkuroivan sidoksen muodostava ryhmä, jollaista käytetään 5 kiinteän faasin synteesissä sitomaan peptidi kiinteään kantajahartsiin ja joksi on edullista valita toinen kaavojen: -NH-bentshydryyliamiini(BHA)-kantajahartsi ja -NH-pa-rametyylibentshydryyliamiini(MBHA)-kantajahartsi esittämistä ryhmistä. Lohkaisu BHA- tai MBHA-hartsista tuottaa 10 suoraan CRF-analogi-amidin. Käyttämällä tällaisen hartsin metyylijohdannaista voidaan valmistaa metyylisubstituoitu amidi.

Välituotteen kaavassa ainakin yksi ryhmistä X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X6 on suojaryhmä. Kutakin R-ryhmää vastaa-15 maan valittu nimenomainen aminohappo ratkaisee, onko siihen liitetty myös suojaryhmä edellä eriteltyyn ja alan menetelmistä yleisesti tunnettuun tapaan. Valittaessa tiettyä sivuketjun suojaryhmää käytettäväksi synteesissä noudatetaan seuraavia sääntöjä: (a) suojaryhmän tulee kes-20 tää α-aminosuojaryhmän poistamiseen valitun reagenssin vaikutusta ja sen tulee olla stabiili valituissa reaktio-olosuhteissa synteesin jokaisessa vaiheessa, (b) suojaryhmän tulee säilyttää suojausominaisuutensa eikä se saa irrota liitäntäolosuhteissa ja (c) sivuketjun suojaryhmä 25 täytyy voida poistaa halutun aminohapposekvenssin synteesin päätyttyä reaktio-olosuhteissa, jotka eivät aiheuta muutoksia peptidiketjussa.

Tämän keksinnön katsotaan siis koskevan kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistusmenetelmää, johon kuuluu 30 (a) ainakin yhden suojaryhmän sisältävän ja kaavan (II) mukaisen peptidin muodostaminen, jossa X, X1, X2, X3, X4, Xs ja X6 esittävät kukin joko vetyatomia tai suojaryhmää ja X7 on joko suojaryhmä tai kantajahartsiin ankkuroivan sidoksen muodostava ryhmä tai NH2-ryhmä ja (b) suojaryhmän tai 35 -ryhmien tai ankkuroivan ryhmän irrottaminen mainitusta * 7 91413 kaavan (II) mukaisesta peptidistä ja (c) näin saadun peptidin muuttaminen haluttaessa ei toksiseksi additiosuolak- seen.

Kun peptidit valmistetaan kemiallisella synteesil-5 lä, ne on edullista valmistaa kiinteän faasin synteesimenetelmää, kuten esimerkiksi Merrifieldin artikkelissa J.

Am. Chem. Soc., 85, s. 2149 (1964) kuvaamaa menetelmää käyttäen, vaikka muitakin vastaavia alalla tunnettuja kemiallisia synteesimenetelmiä voidaan käyttää kuten edellä 10 on mainittu. Kiinteän faasin synteesi aloitetaan peptidin C-päästä liittämällä suojattu α-aminohappo sopivaan hartsiin tavalla, joka on yleisesti esitetty 21. tammikuuta 1981 Rivierille et ai. myönnetyssä yhdysvaltalaisessa patentissa n:o 4 244 946, jonka julkaisu liitetään tähän 15 viitteenä. Tällainen lähtöaine rCRF-analogien valmistamista varten voidaan tehdä liittämällä α-aminosuojattu Ile BHA-hartsiin.

B0C:llä suojattu Ile liitetään BHA-hartsiin mety-leenikloridia ja dimetyyliformamidia (DMF) käyttäen. Kun 20 BOC-Ile on liitetty kantajahartsiin, α-aminosuojaryhmä poistetaan käyttäen esimerkiksi trifluorietikkahappoa (TFA) metyleenikloridissä, TFA:a yksin tai yhdessä HCl:n kanssa dioksaanissa. On edullista käyttää 50 tilavuus-% TFA: a metyleenikloridissa ja 0-5 paino-% 1,2-etaanidi-25 tiolia. Suojaus poistetaan noin 0 °C:n ja huoneen lämpötilan välillä olevassa lämpötilassa. Muita normaaleja spesifisten α-aminoryhmien poistamiseen tarkoitettuja lohkai-sureagensseja ja -olosuhteita voidaan käyttää Schroderin & Lubken teoksessa "The Peptides", 1 ss. 72-75 (Academic 30 Press 1965) kuvattuun tapaan.

Ile:n α-aminosuojaryhmän poistamisen jälkeen loput α-amino- ja sivuketjusuojatut aminohapot liitetään vaiheittain toisiinsa halutussa järjestyksessä edellä määritellyn välituoteyhdisteen valmistamiseksi. Sen sijaan, 35 että jokainen aminohappo lisättäisiin synteesissä erik- 8 seen, voidaan joitakin niistä vaihtoehtoisesti liittää toinen toisiinsa ennen niiden lisäämistä kiinteäfaasi-reaktoriin. Sopiva liitäntäreagenssi on alan hallitsevan valittavissa. Erityisen sopivia liitäntäreagensseja ovat 5 N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC1) ja N,N'-di-iso- propyylikarbodi-imidi.

Kiinteän faasin peptidisynteesissä käytetyt akti-vointireagenssit ovat alalla hyvin tunnettuja. Esimerkkejä sopivista aktivointireagensseista ovat karbodi-imidit, kulo ten esimerkiksi N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. Muita aktivointireagensseja ja niiden käyttöä peptidisynteesissä ovat kuvanneet Schroder & Lubke yllämainitun teoksen kappaleessa III ja Kapoor artikkelissa J. Phar. Sei., 59, ss. 15 1-27 (1970).

Jokaista suojattua aminohappoa tai aminohapposekvenssiä pannaan kiinteäfaasireaktoriin noin nelinkertainen ylimäärä ja ne liitetään toisiinsa liuoksessa, jossa on dimetyyliformamidia (DMF) ja CH2Cl2:a (1:1) tai pelkässä 20 DMFsssa tai CH2Cl2:ssa. Kun aminohapot tai -sekvenssit liitetään toisiinsa manuaalisesti, liitosreaktion onnistumista tarkkaillaan synteesin joka vaiheessa ninhydriinireak-tion avulla E. Kaiserin et ai. artikkelissa Anal. Biochem. 34, 595 (1970) kuvaamaan tapaan. Jos liitosreaktio ei on-25 nistu täydellisesti, liitosmenettely toistetaan ennen kuin a-aminosuojaryhmä poistetaan seuraavan aminohapon liittämistä edeltävänä vaiheena. Liitosreaktiot voidaan suorittaa automaattisesti esimerkiksi automaattisella Beckmann 990 -syntetointilaitteella käyttäen esimerkiksi Rivierin 30 et ai. artikkelissa Biopolymers, 1978, 17, ss. 1927-1938 esittämää ohjelmaa.

Sen jälkeen kun haluttu aminohapposekvenssi on saatu valmiiksi, välituotepeptidi poistetaan kantajahartsista käsittelemällä sitä jollain reagenssilla, esimerkiksi nes-35 temäisellä vetyfluoridilla, joka ei lohkaise ainoastaan 91413 9 peptidiä hartsista, vaan myös kaikki jäljellä olevat sivuketjujen suojaryhmät X2:n, X3:n, X4:n, X5sn ja X6:n ja a-aminosuojaryhmän Xx (ellei se ole asyyliryhmä, jonka on tarkoitus olla mukana tuotepeptidissä) peptidin valmista-5 miseksi. Kun vetyfluoridia käytetään lohkaisuun, anisolia tai kresolia ja metyylietyylisulfidia lisätään reaktioas-tiaan puhdistavaksi lisäaineeksi. Kun Met on mukana sekvenssissä, BOC-suojaryhmä voidaan lohkaista trifluorietik-kahapolla (TFA)/etaaniditiolilla ennen peptidin lohkaisua 10 hartsista S-alkylaation välttämiseksi.

Synteettisen hCRFsn on osoitettu olevan ACTH- ja β-END-LI-erityksen tehokas stimulaattori in vivo eri rotta-preparaateissa. Plasman ACTH- ja β-END-LI-taso on korkea ainakin 5-20 minuutin ajan sen jälkeen, kun nembutaalilla 15 nukutetuille urosrotille ja lepääville uros- tai naarasro-tille, joilla on laskimonsisäiset kanyylit, on annettu hCRF:ä laskimonsisäisesti. hCRF:llä on lisäksi havaittu olevan dramaattinen rottien ja koirien verenpainetta alentava vaikutus.

20 CRF-agonistit alentavat verenpainetta siinä määrin, että ne voivat olla erityisen arvokkaita korkean verenpaineen hoidossa ja myös tietyn tyyppisiin kirurgisiin operaatioihin joutuvien potilaiden hoidossa.

CRF stimuloi voimakkaasti aivolisäkkeen ja lisämu-25 nuaisen kuorikerroksen välistä akselia, ja CRF-analogien pitäisi olla hyödyllisiä tämän yhteyden toimintojen stimuloi jana eräissä potilastyypeissä, joiden endogeeninen glu-kokortikoidituotanto on vähäistä. CRF:n pitäisi esimerkiksi olla hyödyllinen palautettaessa entiselleen aivolisäke-30 lisämunuais-toiminta potilailla, joille on annettu ulkoista glukokortikoidihoitoa ja joiden aivolisäkkeen ja lisämunuaisen kuorikerroksen toiminnot ovat pysyvästi heikentyneet .

Useimmilla muilla säätelypeptideillä on havaittu 35 olevan vaikutusta keskushermostoon ja ruoansulatuskana- 10 vaan. Koska ACTH- ja β-END-eritys on nisäkkään stressivas-teen "sine qua non", ei ollut yllättävää, että CRF:llä on merkittävä vaikutus aivoihin ruumiin stressivasteen välittäjänä. Tämän mukaisesti aivoihin annettaville CRF-analo-5 geille pitäisi löytyä sovellutuksia normaalien ja mielisairaiden yksilöiden mielialan, oppimisen ja käyttäytymisen muuntelussa. Koska CRF-agonistit kohottavat ACTHs n, P-END:n, β-lipotropiinin, muiden pro-opiomelanokortiini-geenin tuotteiden ja kortikosteronin tasoa, niitä voidaan 10 antaa pyrittäessä vaikuttamaan aivoihin ja aivojen ääri-alueisiin ja siten muistiin, mielialaan, kivun tuntemiseen jne., ja tarkemmin valppauteen, masennukseen ja/tai ahdistukseen. Kun CRF:ä annetaan rottien aivokammioihin se lisää niiden aktiivisuutta ja oppimiskykyä, ja CRF-agonistit 15 voivat siten toimia luonnollisina stimulantteina.

CRF-analogien pitäisi olla myös käyttökelpoisia pyrittäessä kasvattamaan veren virtausta nisäkkäiden, erityisesti ihmisten ja muiden nisäkkäiden ruoansulatuskanavaan. Kaikkien CRF-sukuisten peptidien on osoitettu laa-20 jentävän suoliliepeen suonipatjaa. oCRF inhiboi myös vatsahapon tuottoa ja CRF-analogien oletetaan olevan myös tehokkaita mahahaavojen hoidossa, koska ne pienentävät nisäkkäiden vatsahapon tuottoa ja/tai inhiboivat niiden ruoansulatuskanavan toimintoja.

25 CRF-analogeja tai niiden ei-toksisia additiosuolo- ja, yhdistettynä farmaseuttisesti tai eläinlääketieteelli-sesti hyväksyttävään kantajaan farmaseuttisen tuotteen muodostamiseksi, voidaan antaa nisäkkäille, ihmiset mukaan lukien, joko laskimonsisäisesti, ihonalaisesti, lihaksen-30 sisäisesti, ihon kautta, esimerkiksi nenänsisäisesti, ai-vo-selkäytimen tai suun kautta. Peptidien tulisi olla vähintään noin 90 %:sti puhtaita ja olisi edullista, jos niiden puhtaus olisi vähintään noin 98 %; epäpuhtaammatkin tuotteet ovat kuitenkin tehokkaita ja niitä voidaan hyvin 35 käyttää muita nisäkkäitä kuin ihmisiä hoidettaessa. Puh- 91413 11 taus tarkoittaa tässä sitä, että haluttua peptidiä on esitetty paino-% -osuus kaikista mukana olevista samankaltaisista peptideistä ja peptidifragmenteista. Lääkäri voi antaa lääkettä ihmisille verenpaineen alentamiseksi tai en-5 dogeenisen glukokortikoidituotannon stimuloimiseksi. Tar vittava annos vaihtelee nimenomaisesta hoidettavasta tilasta, tilan vakavuudesta ja halutun hoidon kestosta riippuen.

Näitä agonisteja voidaan käyttää myös haluttaessa 10 arvioida hypotalamuksen, aivolisäkkeen ja lisämunuaisten keskinäistä toimintaa nisäkkäissä, joilla epäillään olevan sisäeritys- tai keskushermostosairaus antamalla lääkettä sopivalla tavalla ja tarkkailemalla ruumiintoimintoja sen jälkeen. Lääkkeen antamista voidaan käyttää esimerkiksi 15 diagnostisena välineenä Cushingin taudin ja affektiivisten sairauksien, kuten esimerkiksi masennussairauden perusteiden arvioimiseksi.

Tällaisia peptidejä annetaan usein farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttävinä ei-toksisina 20 suoloina kuten esimerkiksi happoadditiosuoloina tai esimerkiksi sinkki-, rauta-, kalsium-, barium-, magnesium-, alumiini- tai vastaavina metallikomplekseina (joita pidetään additiosuoloina tässä sovellutuksessa). Kuvaavia esimerkkejä tällaisista happoadditiosuoloista ovat hydroklo-25 ridi-, hydrobromidi-, sulfaatti-, fosfaatti-, tannaatti-, oksalaatti-, fumaraatti-, glukonaatti-, alginaatti-, male-aatti-, asetaatti-, sitraatti-, bentsoaatti-, sukkinaat-ti-, malaatti-, askorbaatti-, tartraatti- ja vastaavat suolat. Jos aktiivinen aines annetaan tablettimuodossa, 30 tabletti voi sisältää sideainetta, kuten esimerkiksi tra-ganttia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; hajottavaa ainetta, kuten esimerkiksi algiinihappoa; ja voiteluainetta, kuten esimerkiksi magnesiumstearaattia. Jos lääke halutaan antaa nesteenä, se voidaan makeuttaa ja/tai maustaa, ja 35 laskimonsisäisesti lääke voidaan antaa isotonisessa suo- 12 la-, fosfaattipuskuri- tai vastaavassa liuoksessa.

Peptidejä tulisi antaa lääkkeeksi lääkärin valvonnassa, ja farmaseuttiset tuotteet sisältävät peptidin tavallisesti tavanomaiseen farmaseuttisesti tai eläinlääke-5 tieteellisesti hyväksyttävään kantajaan yhdistettynä. Annostus on tavallisesti noin l:stä 200:een mikrogrammaa peptidiä hoidettavan eläimen ruumiinpainokiloa kohti. Joissain tapauksissa näitä peptidejä voidaan käyttää potilaiden hoidossa ACTH:n tai kortikosteroidien antamisen si-10 jasta, tällaisissa tapauksissa niinkin pientä annostusta kuin 10 ng/ruumiinpainokilo voidaan käyttää. Tässä käytetyt lämpötilat on kaikki esitetty °C:na ja kaikki suhteet ovat tilavuussuhteita. Nestemäisten aineiden prosenttiosuudet ovat myös tilavuusosuuksia.

15 Seuraavassa esimerkissä esitetään edullinen kiin teän faasin tekniikkaan perustuva CRF-analogien synteesi-menetelmä.

Vertailues imerkki

Kaavan H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-20 Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-

Glu-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2 mukaisen [ (Glu29) ]-rCRF:n synteesi suoritetaan vaiheittain esimerkiksi Bachem Incrstä saatavissa olevalla MBHA-vetykloridi -hartsilla, jonka substituutio-25 väli on noin 0,1-0,5 mmol/g hartsia.

Synteesi suoritetaan automaattisella Beckmann 990B peptidien syntetointilaitteella sopivaa, edullisesti seu-raavaa ohjelmaa käyttäen:

Vaihe Reaaenssit ia operaatiot_Sekoitusaiat min.

30 1 CHjClj-pesu - 80 ml (2 kertaa) 3 2 Metanoli(MeOH)-pesu - 30 ml (2 kertaa) 3 3 CH2Cl2-pesu - 80 ml (3 kertaa) 3 4 50 prosenttia TFAsa ja 5 prosenttia 1,2-etaa- niditiolia CH2Cl2:ssa - 70 ml (2 kertaa) 12 35 5 Isopropanolipesu - 80 ml (2 kertaa) 3 91413 13 6 12,5 prosenttia TEA:ta CH2Cl2:ssa - 70 ml (2 kertaa) 5 7 HeOH-pesu - 40 ml (2 kertaa) 2 8 CH2Cl2-pesu - 80 ml (3 kertaa) 3 5 9 BOC-aminohappoa (10 mmol) 30 ml:ssa joko DMF:a tai CH2Cl2:a, kyseisen suojattavan aminohapon liukoisuudesta riippuen (1 kerta) ja DCCI:ä (10 mmol) CH2Cl2:ssa 30-300 BOC-Ile:n liittämisestä on tuloksena substituutio, 10 joka on noin 0,35 mmol Ile:a grammaa hartsia kohti. Kaikista käytetyistä liuottimista poistetaan ilma huolellisesti, edullisesti suihkuttamalla inertillä kaasulla, esimerkiksi heliumilla tai typellä mahdollisesti Met-tähteen rikin ei-toivotusti hapettavan hapen poissaolon varmista-15 miseksi.

Suojauksen poiston ja neutraloinnin jälkeen pepti-diketju rakennetaan vaiheittain hartsille. Yleensä käytetään yhdestä kahteen mmol BOC-suojattua aminohappoa mety-leenikloridissa grammaa hartsia kohden ja lisäksi yksi 20 ekvivalentti 2-molaarista DCCI:ä metyleenikloridissa kahden tunnin aikäna. Kun B0C-Arg(Tos):a liitetään, käytetään seosta, jossa on 50 % DMF:a ja metyleenikloridia. Bzlsä käytetään Ser:n ja Thr:n hydroksyylisivuketjun suojaryh-mänä. p-nitrofenyyliesteriä (ONp) käytetään Asn:n tai 25 Gin:n karboksyylipään aktivointiin ja esimerkiksi BOC-Asn(0Np):a liitetään yli yön käyttäen yhtä ekvivalenttia HOBt:a seoksessa, jossa on 50 % DMF:a ja metyleenikloridia. Asn:n ja Gln:n amidoryhmä suojataan Xan:llä, kun DCCI-liitosmenetelmää käytetään aktiiviesteri-menetelmän 30 sijasta. 2-Cl-Z:ä käytetään Lys:n sivuketjun suojaryhmänä. Tos:ä käytetään Arg:n guanidiiniryhmän ja His:n imidatso-liryhmän suojaukseen, ja Glu:n tai Asp:n sivuketjun kar-boksyyliryhmä suojataan OBzl:llä. Synteesin päätyttyä saadaan seuraava tuote: BOC-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Pro-3 5 Pro-Ile-Ser(Bzl)-Leu-Asp(OBzl)-Leu-Thr(Bz1)-Phe-His(Tos)- 14

Leu-Leu-Arg(Tos)-Glu(OBzl)-Val-Leu-Glu(OBzl)-Met-Ala-Arg-(Tos )-Ala-Glu( OBzl) -Gln( Xan) -Leu-Ala-Glu( OBzl) -Gln( Xan) -Ala-His( Tos) -Ser( Bzl) -Asn( Xan) -Arg( Tos) -Lys (2-C1-Z ) -Leu-Met-Glu(OBzl)-Ile-Ile-kantajahartsi. o-aminosuojaryhmän 5 poistoon käytetty TFA-käsittely on saattanut osittain tai kokonaan poistaa Xan:n.

Peptidin lohkaisemiseksi suojattu peptidi - hartsi-yhdistelmästä ja peptidin suojauksen poistamiseksi yhdistelmää käsitellään 1,5 ml:11a anisolia, 0,5 ml:11a metyy-10 lietyylisulfidia ja 15 ml:11a vetyfluoridia (HF) grammaa peptidi-hartsi -yhdistelmää kohti ensin -20 eC:ssa 20 min ja sitten 0 eC:ssa puolen tunnin ajan. Sen jälkeen kun HF on poistettu suurtyhjössä hartsi-peptidi -yhdistelmää pestään vuorotellen kuivalla dietyylieetterillä ja klorofor-15 millä ja peptidit uutetaan sitten 2-N etikkahapon vesi-liuoksella, josta ilma on poistettu ja erotetaan hartsista suodattamalla.

Peptidi puhdistetaan geelipermeaatiolla ja sitä seuraavalla puolipreparatiivisella HPLC-ajolla Rivierin et 20 ai. teoksessa Peptides: Structure and Biological Function (1979), ss. 125-128 ja Rivierin et ai. artikkelissa J. Chromatography (1983) kuvaamaan tapaan. Kromatograafisia fraktioita tarkkaillaan huolellisesti HPLCrllä ja ainoastaan huomattavan puhtaaksi osoittautuneet fraktiot yhdis-25 tettiin.

Sen tarkistamiseksi, oliko saatu sekvenssi tarkalleen oikea, rCRF-analogia hydrolysoitiin suljetuissa tyh-jöputkissa, joissa oli jatkuvasti kiehuvaa HCl:a, 3 μΐ tioglykolia/ml ja 1 nmol Nle:a (sisäisenä standardina) 9 30 tunnin ajan 140 °C:ssa. Beckmanin 121 MB aminohappoanaly-saattorilla hydrolysaateista tehdyt aminohappoanalyysit antoivat tulokseksi seuraavat aminohapposuhteet: Asx(l,9), Thr(0,8), Ser(3,1), Glx(9,0), Pro(2,l), Ala(3,8),

Val(0,9), Met(1,9), Ile(2,6), Leu(7,0), Phe(0,9), 35 Lys(l,0), His(2,0) ja Arg(3,0), mikä vahvisti, että oli 91413 15 saatu olkea 41-tähteinen peptidi.

Esimerkki I

Kaavan: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-5 Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-

Glu-Glu-Ala-NH2 mukainen synteettinen peptidi AHC syntetoi-daan käyttäen yleisesti vertailuesimerkissä esitettyä menettelytapaa .

Edellä esitetyllä tavalla syntetoidun ja puhdiste-10 tun rCRF-peptidin spesifiseksi optiseksi kiertokulmaksi mitattiin Perkin Elmerin laitteella, malli 141, [a]^p o = -24,2 ± 1,0 (c=l 1 %:ssa etikkahapossa) (korjattu H20:n ja TFA:n mukanaolo huomioonottaen), ja sen puhtausaste oli noin 95 %.

15 Esimerkki II

Synteettisen peptidin AHC ja oCRF:n vaikutusta ACTH:n ja β-endorfiinin eritykseen tutkittiin in vitro ja myös in vivo. Synteettisen oCRFrn viljeltyjen rotan aivo-lisäkesolujen ACTH- ja β-endorfiinieritystä stimuloiva 20 vaikutus mitattiin käyttäen artikkelissa Endocrinology, 91, 562 (1972) yleisesti esitettyä menettelytapaa. Vaste, joka oli puolet maksimista, havaittiin peptidi AHC:n kon-sentraation ollessa noin 65 pikomol/1, kun synteettistä oCRFrä tarvittiin noin 250 pikomol/1 tämän vasteen saavut-25 tamiseksi. Eritysvaste maksimaalisiin (1-5 nM) AHC-kon- sentraatioihin on tasannetasolla. In vivo-testaus suoritetaan käyttäen C. Rivierin et ai. artikkelissa Science, 218, 377 (1982) esitettyä yleistä menettelytapaa.

Esimerkki III

30 Kaavan H-D-Tyr-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-

Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2 mukainen peptidi [D-Tyr3, D-Pro4, Nle18·21]-AHC(3-41) syntetoidaan. Esimerkissä II esitetyn yleisen 35 menettelytavan mukainen testaus osoittaa, että sen ACTH:n 16 ja p-END-LI:n eritystä stimuloiva vaikutus on noin 470 % oCRF:n vaikutukseen verrattuna ja että se alentaa myös ve- 22° renpainetta hyvin merkittävästi, [o] c =-12,8° ± 1,0 (c=I; 1 %:ssa etikkahapossa).

5 Esimerkki IV

KaavanH-D-Pro-Pro-lle-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2 mukainen peptidi [D-Pro4, Nle18 21]-AHC(4-41) syntetoidaan. 10 Esimerkissä II esitetyn yleisen menettelytavan mukainen testaus osoittaa, että sen ACTH:n ja p-END-LI:n eritystä stimuloiva vaikutus on noin 160 % oCRF:n vaikutukseen verrattuna ja että se alentaa myös verenpainetta hyvin merkittävästi. [a]^c = -7,1° ± 1,0 (c-1; 50 %:ssa etikkaha-15 possa).

Claims (5)

91413 17

1. Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kor-tikotroopiinia vapauttavan tekijän johdannaisen valmista- 5 miseksi, jolla on kaava (I) H-R1-R2-R3-R4-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-I.eu-Arg-Glu-Rie-Leu-Glu- R2i -Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2 jossa Rx on Ser tai des Rx; R2 on Gin, tai des R2; R3 on Glu, D-Tyr tai 10 des R3; R4 on Pro tai D-Pro; Rie on Nle tai Met; R21 on Met tai Nle; tunnettu siitä, että (a) muodostetaan peptidi, jossa on vähintään yksi suojaryhmä ja jolla on kaava (II) X1-R1(X2)-R2(X4)-R3(X5 tai X) -R4-Pro-Ile-Ser (X2)-Leu-Asp(X5)-15 Leu-Thr (X2) -Phe-His( X) -Leu-Leu-Arg( X3) -Glu( X5) -Rie-Leu-Glu- (X5) -R21-Ala-Lys (X6) - Ala-Glu (X5) -Gln( X4) -Glu (X5) -Ala-Glu (X5) -Gln( X4)-Ala-Ala-Leu-Asn( X4) -Arg( X3) -Leu( X6) -Leu-Leu-Glu( X5) -Glu(X5)-Ala-X7 ja jossa X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X6 ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja X7 on joko suojaryhmä tai kan-20 tajahartsiin ankkuroiva sidos tai NH2 ja (b) suojaryhmä tai -ryhmät tai ankkuroiva sidos lohkaistaan kaavan II mukaisesta peptidistä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla 25 on kaava H-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg- Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln- Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava H-D-Tyr-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu- Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu- Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. 18

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-5 Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. 91413 19