JPH06500575A - Grf類似体 xi - Google Patents
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- JPH06500575A JPH06500575A JP5500150A JP50015093A JPH06500575A JP H06500575 A JPH06500575 A JP H06500575A JP 5500150 A JP5500150 A JP 5500150A JP 50015093 A JP50015093 A JP 50015093A JP H06500575 A JPH06500575 A JP H06500575A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/60—Growth-hormone releasing factors (GH-RF) (Somatoliberin)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
GRF類似体 Xl
本発明はヒトその他の動物の下垂体の機能に影響を及ぼすペプチドに関する。
特に、本発明は下垂体からの成長ホルモン(GH)の放出を促進するペプチドに
長い間、生理学者らは視床下部で産生される特殊な物質が下垂体ホルモンの分泌
を刺激または抑制して下垂体線部の分泌機能を調節していることを認めてきた。
視床下部の抑制性因子は、1972年にGHの分泌を抑制するソマトスタチンと
して同定された。1982年には、GH放出因子(GRF)がヒトの膵臓腫瘍の
抽出物から単離され、精製、同定、合成および試験が行われ、下垂体からのGH
の分泌を促進することが判明した。その後、ヒト視床下部GH放出因子は完全に
同一の構造を有していることが見いだされた。以下これをhGRF (1−44
)−NH2という。これは次の構造を有している。
(配列番号=1)
T yr−A 1a−A 5p−A la−11e−P he−T hr−A
sn−S er−T yr−A rg−L ys−Val−k eu−
G 1y−G 1n−Leu−3er−Ala−Arg−L ys−Leu−L
eu−G 1n−Asp−I le−Met−S er−A rg−G ln−
G 1n−G 1y−G lu−S er−A sn−G 1n−G 1u−A
rg−G 1y−A 1a−A r■|A 1a−
A rg−L eu
ここでC末端はアミド化されている。
後に発見されたラットGRF (1−43)−OHは次の構造を有している。
(配列番号:2)
H1s−A 1a−Asp−A la−I 1e−P he−T hr−S e
r−S er−Tyr−A rg−Arg−I 1e−L ■普|
G 1y−G ln−L eu−T yr−A 1a−A rg−L ys−L
eu−L eu−H1s−G lu−11e−Met−A@sn−
、A rg−G 1n−G 1n−G 1y−G 1u−A rg−A sn−
G 1n−G lu−G In−A rg−S er−A 窒■|P he−
Asn
これらの天然の構造の類似体が数多く合成されてきた。
培養下垂体細胞からGHを放出させる合成ペプチドが合成され試験されてきたが
、これは生体内での酵素による分解を受けにくく実質的効力が極めて高いもので
ある。このような長所を有しているのは、ペプチドが安定性の高いα−螺旋形を
しているためであると考えられる。これらのペプチドは、その8.16.24お
よび25位の残基の少なくとも1つに、無置換のまたはα−炭素原子がメチル基
で置換されている(C’MeまたはC’CH3)L−アラニンを有しており、好
ましくは少な(とも8位がそのように置換されている。α−炭素原子がメチル基
で置換されているAlaは、Aib(2−アミノ−イソブチル酸)と表記される
。
さらにこれらのペプチドは、天然ホルモンに見られるような上記以外の様々な残
基の置換基を有していてもよい。例えば、2位がD−AlaSN’CH3−D−
Ala(D−NMA)またはNMAで置換されていてもよく、これらはL−Al
aと等価であると考えられる。また、好ましくは、27位のMetの代わりにC
”MeLeu(CML)またはNleを有している。しかし、D−Metまたは
Nvaまたはその他の残基を存在させてもよく、これらも等価であると考えられ
ている。ペプチドは、さらに1位に次の残基を有していてもよい: Tyr、
D−TyrSPhe、 D−Phe。
HisおよびD−Hisoこれらの残基は、α−炭素原子上またはα−アミノ基
中にメチル置換を有していてもよいし、あるいは、α−アミノ基がな(でもよい
(desアミノ)。また、この残基のα−アミノ基はアシル化、好ましくはアセ
チル(Ac)またはホルミル(F or)化されていてもよい。これらのペプチ
ドはすべて、置換されていない残基と等価であると考えられる。また、当業者に
知られているその他の置換基を有していてもよい。例えば、3位にD−Asp、
12位にArg、10位にPheまたはD−Tyr、 15位にAla、28位
にAsnまたはA la、あるいはこれらの複数の置換を有していてもよく、こ
れらのペプチドはすべて等価であると考えられる。
本発明による医薬組成物は、長さ約29から44残基の上記の類似体またはそれ
らのいずれかの無毒性塩を含有し、薬学的または獣医学的に許容される液体また
は固体のキャリアに分散される。これらの医薬組成物はヒトおよび動物の臨床医
学の分野において使用され、治療または診断目的のために投与される。さらにこ
れらの医薬組成物は、鳥禽を含む温血動物の成長を促進するため、および農業に
おいて用いることができる。
好ましい態様の詳細な説明
ペプチドを定義するために用いる命名法はシュレーダー(5chroder)お
よびリュブケ(Lubke)の「ザ・ペプチド(Academic Press
、 1965)Jに記載されているものである。慣用的表示に従って、N末端の
アミノ基は左に、C末端のカルボキシル基は右に表わされる。天然アミノ酸とは
、蛋白質中に見いだされる普通の天然に存在するアミノ酸のうちの1種を意味し
、GlySAlaSVal、LeuSIleSSerSThr、 Lys、 A
rg、 Asp、 Asn、 GluSGin、 Cys、 Met、 Phe
、 Tyr、 Pro、 TrpおよびHisをいう。Nleはノルロイシンを
意味し、Nvaはノルバリンを意味する。アミノ酸残基が異性体を有する場合に
は、特に指定しない限り、表示されるアミノ酸のL体を意味する。D−NMAは
α−アミノ基がメチル置換されたアラニンのD−異性体を意味する。
本発明は一般に、次の式で表わされる合成ペプチド(配列番号=14)を提供す
るものである。Xaaの次の添字はN末端から数えた分子の位置を表わすために
用いられている。
Xaa−X aa−Xaa−A 1a−Xaa−P he−Thr−Xaa−X
aa−Xaa−A rg−Xaa−Xaa−L eu−X aa−X aa−L
eu−X aa−A la−A rg−X aa−X aa−L eu−X
aa−X aa−X aa−X a=|X aa−
A rg−G 1n−G In−G 1y−G lu−Xaa−A 5n−G
1n−G lu−Xaa−Xaa−Xaa−A rg−Xa=|
Xaa−Xaa
上式において、N末端にBが存在し、XaalはTyr、 D−Tyr、 Me
tSPhe。
D−Phe、 pcl−Phe、 Leu、 HisまたはD−Hisであり;
BはH,C’Me1N’Me、 desアミノ、AcまたはForであり: X
aa2はAlalD−AlaSNMAまたはD−NMAであり;Xaa3はAs
pまたはD−Aspであり; Xaa5はIleまたはLeuであり; Xaa
gはAla、 AibSSerまたはAsnであり; XaaBは5erSAl
aまたはAibであり;XaaHはTyrSD−TyrまたはPheであり;X
aaBはArgまたはLysであり;Xaa+sは1ieSVal、Leuまた
はAlaであり;XaauはGlyまたはAlaであり;Xaa、6はAla、
AibまたはGinであり;XaalgはSerまたはTyrであり; Xa
a2.はLysSD−Lys、ArgまたはD−Argであり: Xaa2□は
Leu、Ile。
AlaSAibまたはValであり; Xaa24はAla、 Aib、 Gl
nまたはHisであり:Xaa25はAlaS、Aib、 AspまたはGlu
であり; Xaa26はIleまたはLeuであり:Xaa、、はMet、 D
−Met、、AlaSNle、I le、 Leu、 NvaまたはValであ
り:Xaa2.はAsn、 Ala、 AibまたはSetであり; Xaa3
4はSerまたはArgてあり:XaassはArgまたはGlnであり:Xa
a3sはGlyまたはArgであり: Xaa4゜は、AlaまたはSerであ
り;Xaa4zはPhe、 AlaまたはValであり;Xaa4sはAsnま
たはArgであり;Xaa44はLeuまたはその他の天然アミノ酸のL−異性
体であり:C末端はアミド化されていてもよ(:ただしX aa g、Xaa、
6、Xaa24およびXaa25の少なくとも1つはAlaまたはAibである
。許容しうるC末端の短いペプチドは、C末端から始まって15残基まての配列
を除去することによって得ることができ、これらのペプチドは、特定されたAl
aまたはAib置換の2.3または4つすべてを有していてもよい。上述のペプ
チドの1つの好ましいサブクラスにおいては、Xaa5がIleであり、Xaa
lBがSerであり、Xaa24がGinであり、Xaa2sが、Aspであり
、Xaa2sがIleであり、Xaa34がSetであり、Xaa3BがArg
であり、Xaa3eがGlyであり、かつXaa4.がAlaである。このペプ
チドが44位まで伸びている場合には、好ましくは、Xaa44はLeuまたは
Valである。
このようなペプチドの好ましいサブクラスは、次の配列を有するグループである
(配列番号=15)。
X aa−Xaa−Xaa−A la−11e−P he−Thr−Xaa−S
er−Tyr−、A rg−Xaa−Xaa−L eu−Xaa−Xaa−L
eu−S er−A la−Arg−Xaa−L eu−L eu−Xaa−
Xaa−I 1e−Xaa−X aa−Arg
上式において、N末端にBが存在し: XaalはTyrSD−Tyr、 Ph
e、 D−PhelHisまたはD−Hisであり:BはH,C’MeまたはN
’Meであり;Xaa2はA la。
D−Ala、NMAまたはD−NMAであり: Xaa3はAspまたはD−A
spであり:Xaa@はAlaSAib、 SetまたはAsnであり;Xaa
、2は、ArgまたはLysであり:XaaI3はIleまたはValであり:
X aa lsはGlyまたはAlaであり;Xaa+sはA la。
AibまたはGinであり;XaanはLysまたはArgであり; Xaa2
.はAla、 Aib。
GinまたはHisであり; Xaa2sはAla、 Aib、 Aspまたは
Gluであり: Xaa27はMet、 D−MetSAlalNle、 I
le、 Leu、 NvaまたはValであり: Xaa28はAsnまたはS
erであり;C末端はアミド化されており;ただしXaaB、Xaa、6、Xa
a24またはXaa25の少なくとも1つはAlaまたはAibである。
これらのペプチドのいずれにおいても、C末端のアミノ酸残基のカルボキシル部
分はアミド化されていてもよく、または次のいずれがの基(これらはすべて等価
であると考えられる)であってもよいニーC0OR,−CRO。
−CONHNHR,C0N(RXR’)または CHxORoここで、Rおよび
R′は低級アルキル、フッ化低級アルキルまたは水素であり、好ましい低級アル
キルは、メチル、エチルおよびプロピルである。好ましくは−CONHRであり
、ここでRはHまたは低級アルキルである。
本発明によって提供されるさらに好ましいペプチドのサブクラスは次の式で表わ
されるものである(配列番号:16):Xaa−A 1a−A 5p−A la
−I le−P he−T hr−Xaa−S er−T yr−A rg−L
ys−Val−L@eu−
Xaa−Xaa−L eu−S er−A 1a−A rg−X aa−L e
u−L eu−Xaa−Xaa−11e−Xaa−X aa|
Arg−Gln−Gln−Gly
上式において、N末端にBが存在し;Xaa、はTyr、 D−Tyr、 Ph
elD−Phe。
HisまたはD−Hisであり;BはHまたはN’Meであり; XaagはA
laSAibまたはAsnであり;XaalBはctyまたはAlaであり;X
aaH6はAla、 AibまたはGinであり: Xaa2.はLysまたは
Argであり; Xaa24はAlaSAibまたはGinであり; Xaa2
5はAla、 AibまたはAspであり; XaattはNleであり;Xa
aHはAsnまたはSerであり;C末端にNHRが存在しくここでRはHまた
は低級アルキル基であり);ただしGly、 Gin−GlyまたはGln−G
in−GlyはC末端において除去されていてもよく、また、Xaa8、Xaa
、、、Xaa2.およびXaaHの少なくとも1つはAlaまたはAibであり
、2またはそれ以上のこのような置換がこれらの4つの位置に存在していてもよ
い。このサブクラスで特に好ましい1つのペプチドにおいては、Xaa2.がL
ysであり、かツXaa26がAsnである。
上で述べたように、N末端から29位の残基までのフラグメントは、下垂体によ
るGH分泌に効果を及ぼす生物学的効力を有している。このような生物学的効力
を有するフラグメントは、最も好ましくは、長さ29または32残基であって、
C末端がアミドまたは置換アミドである。
これらのペプチドは、完全な固相法、部分的な固相法、フラグメント縮合法また
は溶液カップリング法等の適当な方法により合成される。例えば、完全な固相合
成の技術は、テキスト「面相ペプチド合成(Solid−Phase Pept
ide 5ynthesis)、スチュワード(Stevart)およびヤング
(Young) 、Freeman & Co、 San Francisco
、 1969Jにおいて述べられ、ヴ工−ル(Vale)らの米国特許第4.1
05.603号(1978年8月8日)に例示されている。溶液合成法は論文「
有機化学的方法(Meth。
den der Organischen Chemie) 、ハウベンヴエイ
ル(Horben−Weyl) :ペプチド合成(Synthese von
Peptiden) 、ブンシ、 (E、 funsch)編集) 、Geor
g Thieme Verlag、 Stuttgart、西独)」において詳
述されている。フラグメント縮合合成法は、米国特許第3.972.859号(
1976年8月3日)に例示される。他の適用可能な合成は、米国特許第3.8
42.067号(1974年10月15日)および米国特許第3.862.92
5号(1975年1月28日)に例示される。
種々のアミノ酸部分の不安定な側鎖基を適当な保護基(その基が最終的に除去さ
れるまで、その部位で化学反応が起こるのを防ぐ)で保護することは、この種の
合成において一般的である。また、アミノ酸やフラグメントがカルボキシル基の
部位で反応する間、これらのα−アミノ基を保護し、その後α−アミノ保護基を
選択的に除去してその位置で次の反応を行わせることも一般的である。従って、
合成の一段階として、ペプチド鎖中に意図する配列で位置するアミノ酸残基のそ
れぞれに適当な側鎖保護基が結合している中間体化合物が生成することは、一般
的である。
この点から、次式(II)の中間体が与えられる。
XI−(B)Xaa、(XまたはX2)−Xaa2−Xaa、(XS)−Ala
−Xaa5−Phe−Thr(X’)−Xaa8(X’またはXS)−Xaas
(X’)−Xaa+o(X2)−Arg(X’)−Xaa+z(XIまたはX7
)−Xaas3−Leu−Xaas5−Xaau(XS)−Leu−Xaa+a
(X2またはX’)−Ala−Arg(X’)−Xaa2+(X’またはX7)
−Xaa2゜−Leu−Xaa24(X’またはX)−Xaa2s(XS)−X
aaza−Xaa27−Xaa28(X’またはXS)−Arg(X’)−Gi
n(X’)−Gin(XS)−Gly−Glu(XS)−Xaa3.(X’また
はX’)−Asn(X’)−Gin(XS)−Glu(XS)−Xaasa(X
’またはXS)−XaasyCX ’)−Xaa4a (X 2)−A rg(
X ’)−Xaa42−Xaa43(X ’またはXI)−Xaas4(X”)
−Xs
式中 Xlは水素またはα−アミン保護基である。Xlに包含されるα−アミノ
保護基は、ポリペプチドの逐次合成の分野において有用であると知られているも
のである。Xlとして用いられるα−アミノ保護基の種類には、(1)芳香族ウ
レタン型保護基、例えばフルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC) 、
ベンジルオキシカルボニル(Z)、およびp−クロルベンジルオキシカルボニル
、p−ニトロベンジルオキシカルボニル、p−ブロムベンジルオキシカルボニル
、およびp−メトキシベンジルオキシカルボニル等の、置換されたZ:(2)脂
肪族ウレタン型保護基、例えばt−ブチルオキシカルボニル(BOC) 、ジイ
ソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシ
カルボニル、およびアリルオキシカルボニル;および(3)シクロアルキルウレ
タン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカ
ルボニル、およびシクロへキンルオキシ力ルボニル;が含まれる。好ましいα−
アミノ保護基は、たとえN”Me−fi換アミノ酸残基が1位に存在するときで
も、BOCである。もちろんBがdesアミノの場合、XIはHである。
Xは水素原子またはHisのイミダゾール窒素のための保護基(例えばTos)
である。
X2はTyrのフェノール性ヒドロキシル基のための適当な保護基であり、例え
ばテトラヒドロピラニル、t−ブチル、トリチル、Bzl、CBZ、4Br−C
BZおよび2,6−ジクロルベンジル(DCB)である。好ましい保護基は、2
,6−ジクロルベンジルである。また、X2は水素原子であってもよく、この場
合はその位置のアミノ酸残基に側鎖保護基が存在しないことを意味する。
XSは水素原子、もしくはAspまたはGluのカルボキシル基のための適当な
エステル形成保護基、例えばベンジル(OBzl) 、 2.6−ジクロルベン
ジル、メチルおよびエチルである。
X4はThrまたはSerのヒドロキシル基のための適当な保護基であり、例え
ばアセチル、ベンゾイル、t−ブチル、トリチル、テトラヒドロピラニル、Bz
l、2.6−ジクロルベンジルおよびCBZである。好ましい保護基はBzlで
ある。X4はまた水素原子であってもよく、この場合はヒドロキシル基に保護基
が存在しないことを意味する。
XSは水素原子、もしくはAsnまたはGinの側鎖アミド基のだめの適当な保
護基、例えばキサンチル(Xan)である。XSが水素である場合には、Asn
またはGlnは、好ましくはヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の存在
下でカップリングされる。
XSはArgのグアニジノ基のための適当な保護基、例えばニトロ、Tos、C
BZ1アダマンチルオキシカルボニルおよびBOCであり、またXIは水素原子
であってもよい。
X7は水素原子、もしくはLysの側鎖アミノ基のための適当な保護基である。
適当な側鎖アミノ保護基の例は、2−クロルベンジルオキシカルボニル(2−C
1−Z)、TosSt−アミルオキシカルボニルおよびBOCである。
XSは水素原子、もしくは一般的に先に示した適当な側鎖保護基である。
Metは任意に酸素原子で保護しつるが、保護しない方が好ましい。
側鎖アミノ保護基の選択は、一般に合成中のα−アミノ保護基の除去の間に除去
されないものを選ぶということを除いて限定的でない。しかしながら、いくつか
のアミノ酸、例えばHisの場合はカップリング完了後に一般に保護を必要とせ
ず、従ってα−アミノ保護基と側鎖アミノ保護基は同じものであってもよい。
X9はエステル形成基X3等のC末端カルボキシル基に対する適当な保護基、あ
るいは固相合成において固体樹脂支持体への連結のために使用されるアンカー結
合、あるいはdes−X’ (この場合、C末端残基は先に定義したカルボキシ
ル部分Yを有する)である。固体樹脂支持体が使用される場合、X9は当業者に
周知の担体のいずれでもよく、例えば、O−CH2−樹脂支持体、−NH−ベン
ズヒドリルアミン(BHA)樹脂支持体または−NHNバーメチルベンズヒドリ
ルアミン(MBHA)樹脂支持体である。非置換アミドが望ましい場合には、切
断により直接該アミドを与えるBH,AあるいはMBHA樹脂の使用が好ましい
。N〜メチルアミドが望ましい場合には、N−メチルBHAから得ることができ
る。他の置換アミドが望ましい場合は、米国特許第4.569.967号の方法
を用いることができる。
また、C末端として遊離酸以外の他の基が望ましい場合は、前出のハウベンヴエ
イル(HoubenJeyl)のテキストにある溶液合成法を用いてペプチドを
合成するのが好ましい。
中間体の式において、X−基の少なくとも1つは保護基でありX9は樹脂支持体
を含む。このように、本発明はまた、目的とするペプチドを製造する以下の方法
を提供する。
(a) 少なくとも1つの保護基を有する式(If)のペプチド中間体を形成し
[ここでX、XI、X2、XS、X4、XS、XI、X7およびXSは各々水素
あるいは保護基であり、X9は保護基または樹脂支持体へのアンカー結合である
か、des−X’ (この場合、該残基はC末端において望ましいカルボキシル
基を有していてもよい)である] :
(b) 式(n)のペプチドから保護基またはアンカー結合を除去し:そして(
C) 望ましい場合には、得られた目的とするペプチドをその無毒性塩に転換す
る。
ペプチド合成において使用する特定の側鎖保護基の選択においては、次の一般規
則に従う。
(a) 好ましくは、保護基はカップリング条件下でその保護特性を保持し、切
断されない。
(b) 保護基は試薬に対して安定であるべきであり、Xanを除き、好ましく
は合成の各段階でα−アミノll!!護基の除去のために選ばれた反応条件下で
安定である。
(c) 側鎖保護基は、所望のアミノ酸配列を含む合成の完了時点において、ペ
プチドを変性させない反応条件下で除去できなければならない。
ペプチドは好ましくはメリーフィールド(輩errifield)の論文(J、
Am、 Chem。
Soc、、 85. p、2149 (1963乃に一般的に記述されるような
固相合成法を用いて製造される。しかし、先に述べたように当分野で知られた他
の同様の化学合成法も使用しうる。固相合成法は保護したα−アミノ酸を適当な
樹脂にカップリングすることによって、ペプチドのC末端から開始される。この
ような出発物質は、α−アミノ基が保護されたアミノ酸をクロルメチル化樹脂ま
たはヒドロキシメチル樹脂にエステル結合することによって結合するか、あるい
はBHA樹脂またはMBHA樹脂にアミド結合することによって製造することが
できる。ヒドロキシメチル樹脂の製法はボダンスキー(Bodansky)らの
論文(CheIl、 Ind、 (London) 33゜1597−1598
(1966))に記載されている。クロルメチル化樹脂はバイオラッド研究所
(Bio Rad Laboratories、 Richmond、 Ca1
ifornia)およびラブシステムズ社(Lab Systems、 Inc
、)から市販されている。この種の樹脂の製法はスチュヮーh (Stevar
t)らの「固相ペプチド合成(前出)」第1章1〜6頁に記載されている。BH
AおよびMBHA樹脂支持体は市販されており、一般に合成しようとする目的ポ
リペプチドがそのC末端に未置換アミド基を有する場合にのみ使用される。
29残基のペプチドを製造する場合には、C末端アミノ酸、例えばBOCおよび
Tosで保護されたArgは、まずヴ工−ル(Vale)らの米国特許第4.2
92.313号に記載されている一般的方法に従って、DMFおよび/またはC
H2Cl□中のDCCIを用いて2時間撹拌し、MBHA樹脂へカップリングさ
れる。樹脂支持体へのBOC保護アミノ酸のカップリングに続いて、塩化メチレ
ン中トリフルオロ酢酸(TFA)またはTFA単独を用いてα−アミノ保護基を
除去する。この脱保護は約O0Cから室温の間の温度で行われる。ジオキサン中
HCI等のその他の標準的な切断試薬、およびシュローダ−(Schurode
r)とリュブケ(Lubke)の「ザ・ペプチドJ (Vol、1. p72−
75.^cademic Press、 1965)に記載されるような、特定
のα−アミノ保護基の除去の条件を用いてもよい。
α−アミノ保護基の除去後、残りのα−アミノおよび側鎖保護アミノ酸を目的と
する順序で段階的にカップリングさせて、前述の中間体化合物を得ることができ
る。あるいは、合成において各アミノ酸を別々に付加する代わりに、いくつかの
アミノ酸を互いにカップリングさせてから固相反応器へ加えてもよい。適当な力
。
ブリング試薬の選択は当分野の技術の範囲内である。カップリング試薬として特
に適しているものは、N、 N’−ジシ知ヘキシル力ルポジイミド(DCCI)
である。
ペプチド固相合成に用いられる活性化試薬はペプチドの分野においてよく知られ
ている。適当な活性化試薬の例は、カルボジイミド類、例えばN、 N’−ジイ
ソプロピルカルボジイミドおよびN−エチル−N’−(3’−ジメチルアミノプ
ロピル)カルボジイミドである。その他の活性化試薬ならびにペプチドのカップ
リングにおけるそれらの使用は、シュレーダーとリュブヶの上記文献第■章およ
びカブール(Kapoor)の論文(J、 Phar、 Sci、、 59.1
−27 (1970))に記載されている。また、カップリング用にAsnまた
はGinのカルボキシル末端を活性化するために、p−ニトロフェニルエステル
(ONp)を用いることもできる。例えば、DMFと塩化メチジ2050%混合
物中1当量+71HOBtを用いて、BOC−Asn(ONり)を−晩カツブリ
ングさせることができ、この場合にはDCCIは加えない。
それぞれの保護アミノ酸またはアミノ酸配列は大体4倍以上の過剰量で固相反応
器へ導入され、カップリング反応はジメチルポルムアミド(DMF):CH2C
l□(1: 1)の混合媒体中で、あるいはDMFまたはCH2Cl□単独中l
付単独中。不完全なカップリングが起こった場合は、α−アミノ保護基を除去す
る前にそのカップリング反応を繰り返し、その後火のアミノ酸をカップリングさ
せる。合成の各段階でのカップリング反応の成就は、その合成が手動で行われる
場合には、好ましくは、カイザー(E、Kaiser)らの論文(Anal、
Biochem、 34.595 (1970))に記載されるようなニンヒド
リン反応でモニターする。カップリング反応は自動的に、例えばペックマン99
0自動合成機で、リビエール(Rivier)らの論文(Biopolymer
s、 1978.17.1927−1938)に報告されるようなプログラムを
用いて行うことができる。
目的とするアミノ酸配列が完成した後、液体フッ化水素等の試薬で処理して中間
体ペプチドを樹脂支持体から切り離す。その際、液体フッ化水素はペプチドを樹
脂から切り離すばかりでなく、残っているすべての側鎖保護基X5X2、X3、
X4、X5、X6、X7およびX8、アンカー結合X9、および、使用する場合
にはα−アミノ保護基XIをも切断して、遊離酸の形でペプチドが得られる。配
列中にMetが存在する場合には、起こりうるS−アルキル化を回避するために
、HFによる樹脂からのペプチド切断の前に、まずBOC保護基をトリフルオロ
酢酸(TFA)/エタンジオールを使用して除去する。切断にフッ化水素を使用
する場合、反応容器中にスキャベンジャ−としてアニソールおよびメチルエチル
スルフィドを加える。
次の実施例1は、固相法によるペプチド合成の好ましい方法を示すものである。
鎖のC末端において必要な数のアミノ酸を付加することにより、対応する長いペ
プチドを同じ方法で合成しうろことは容易に理解されるであろう。現在のところ
、N末端へ残基を付加することは有益とは考えられていないため、生物学的に活
性なフラグメントのN末端は特定の配列を有するべきであると感じられる。
実施例1
次式(配列番号:3):
Tyr−、八1a−Asp−Ala−T 1e−Phe−Thr−Ala−8e
r−Tyr−、Arg−Lys−Val−Leu−G 1y−G ln−L e
u−S er−A la−Arg−L ys−Leu−Leu−G 1n−As
p−I 1e−Xaa−S e秩|
Arg
(式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化されている)で表わされるペ
プチド[Ala’、 NLe27コーhGRF(1−29)−NH2を、ヴエー
ル(Vale)らの米国特許第4.292.313号に一般的に記載されるよう
に、ベックマン990ペプチド合成機を用いて、市販のMBHA樹脂上で段階的
方法により合成した。この樹脂へのB OC−Arg(Tos)のカップリング
により、樹脂1gあたり約0.35市o1のArgが置換された。
保護基を除去して中和した後、ペプチド鎖を樹脂上に一段ずつ付加していった。
保護基の除去、中和および各アミノ酸の付加は、一般にリビエール(J、 Ri
vier)の論文(J、 Amer、 Chem、 Soc、、 96.298
6−2992 (1974))に詳述される方法に従って行った。使用するすべ
ての溶媒はヘリウムや窒素等の不活性ガスを吹き込むことによって注意深くガス
抜きし、Met残基のイオウを酸化するおそれのある酸素を確実に除いた。
保護基の除去は下記のスケジュールAに従って行った。
1、60%TFA/2%エタンジチオール 102、60%TFA/2%エタン
ジチオール 153、 IPA/1%エタンジチオール 0.54、 CH2C
l□中のEt3N(10%)0.55、 MeOH0,5
5、CH2Cl2中のEt3N(10%)0.57、 MeOH(2回)0.5
8、 CH2Cl2 (2回)0.5
カンプリングは、好ましくは下記のスケジュールBに記載されるようにして行っ
た。
10、 Boc−アミノ酸 50〜9011、MeOH(2回)0.5
12、CH2Cl2 (2回)0.5
13、 CH2Cl2中のAC20(3M) 15.014、CH2Cl2 0
.5
15、MeOH0,5
16、CH2Cl2 (2回)0.5
簡単に述べれば、樹脂1gあたり塩化メチレン中のBOC−保護アミノ酸1〜2
+111101を使用し、塩化メチレン中の1.θモルDCCIを1当量加えて
2時間実施した。BOC−Arg (Tos)をカップリングするときには、5
0%DMFと塩化メチレンの混合物を使用した。SerおよびThrのヒドロキ
シル側鎖保護基としてBzlエーテルを使用した。AsnまたはGinのアミド
基はXanによって保護したが、好ましくは1当量のDCCIおよび2当量のH
OBtの存在下でカップリングした。Lys側鎖の保護基として2−クロル−ベ
ンジルオキシカルボニル(2C1−Z)を使用した。Argのグアニジノ基およ
びHisのイミダゾール窒素を保護するためにTosを使用し、GluまたはA
spの側鎖カルボキシル基は0Bzlで保護した。
Tyrのフェノール性ヒドロキシル基は2.6−ジクロルベンジル(DCB)で
保護した。合成終了時に次の組成の中間体が得られた。
B OC−Tyr(X 2)−Ala−Asp(X 3)−A la−I le
−Phe−Thr(X ’)−Ala−S er(X ’)|
Tyr(X ”)−Arg(N6)−L ys(X’)−Vat−Leu−G
1y−Gln−Leu−S er(X ’)−Ala−Arg(X’)−Lys
(X”)−Leu−L eu−G 1n−Asp(X 3)−11e−Nle−
S et(X’)−Arg(X’)−X’
(ここでN2はDCBであり、N3は0Bzlであり、N4はBzlであり、N
6はTosであり、N7は2C1−Zであり、N9はNH−MBHA−樹脂支持
体である。)保護ペプチド−樹脂を切り離して保護基を除去するために、ペプチ
ド−樹脂1gあたりアニソール1.5ml、メチルエチルスルフィドQ、 5m
lおよびフッ化水素(HF)15mlを用いて、−20°Cで30分間および0
°Cで30分間処理した。高真空下でHFを除去した後、樹脂−ペプチド残留物
を乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホルムで交互に洗い、次にペプチドをガス
抜きした2N水性酢酸で抽出し、濾過によって樹脂から分離し、凍結乾燥した。
切り離し、保護基を除去して凍結乾燥したペプチドを、次にリビエール(Riv
ier)らの「ペプチド:構造および生物学的機能J 125−8頁(1979
)およびマーキ(Marki)らの論文0. Am、 ChelIl、 Soc
、 103.3178 (1981))に記載されるように、分取または準分取
HPLCによって精製した。カートリッジを備えたウォーLiq、 Chrom
atography 1.343−367 (1978))に記載されるように
、低圧エルデックス(Eldex)勾配作成機を用いて、リン酸トリエチルアン
モニウム(TEAP)中のCH3CNの勾配を作成した。クロマトグラフ画分は
HPLCで注意深くモニターし、実質的純度を示す画分のみを集めた。精製され
た画分はそれぞれ別個に純度を調べ、0.1%TFA中のCH3CN勾配を用い
て脱塩した。次にセンターカットを凍結乾燥して、目的とするペプチドを得た。
この純度は約95%以上であった。さらに、質量分析(MS)および細管ゾーン
電気泳動により、純度を確認した。
この精製ペプチドの旋光度を、パーキンエルマー(Perkin−Elmer)
旋光針を用いて測定したところ、[α] 、=−61’±1 (c=1.1%酢
酸)であった。
実施例2
次式(配列番号=4):
Tyr−A 1a−A 5p−A la−11e−P he−Thr−A sn
−S er−T yr−A rg−L ys−Val−L ■普|
G 1y−A la−Leu−S er−A la−Arg−L ys−L e
u−L eu−G 1n−Asp−I 1e−Xaa−S ■秩|
Arg
(式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化されている)で表わされる2
9残基のアミド化されたペプチド[Ala”、Nle”] −hGRF(1−2
9)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用いて
MBHA樹脂上に段階的方法により合成した。MS、HPLCおよび細管ゾーン
電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋であることを確認した。
精製したペプチドの旋光度をパーキンエルマー旋光計を用いて測定したところ、
[α] o=−66°±1 (c=1,1%酢酸)であった。
実施例3
次式(配列番号:5):
Tyr−A 1a−Asp−A la−I le−P he−Thr−Asn−
S er−T yr−Arg−L ys−Val−L eu|
G 1y−G 1n−Leu−S er−A 1a−A rg−L ys−L
eu−Leu−A 1a−Asp−I 1e−Xaa−S ■秩|
Arg
(式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化されている)で表わされる2
9残基のアミド化されたペプチド[Ala”、Nle”] −hGRF(1−2
9)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用いて
MBHA梼脂上に段階的方法により合成した。MS、HPLCおよび細管ゾーン
電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋であることを確認した。
精製したペプチドの旋光度をパーキンエルマー旋光計を用いて測定したところ、
[αコ。=−67°±1 (c=1.1%酢酸)であった。
実施例4
次式(配列番号=6):
T yr−、A 1a−Asp−A la−11e−P he−Thr−A s
n−S er−Tyr−Arg−L ys−Val−L e普|
G 1y−G 1n−Leu−S er−Ala−A rg−L ys−Leu
−L eu−Gin−A la−I 1e−Xaa−S e秩|
Arg
(式中、XaaはNleてあり、C末端はアミド化されている)で表わされる2
9残基のアミド化されたペプチド[A1a25. Nle”l −hGRF(1
−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用
いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。MS、HPLCおよび細管ゾ
ーン電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋であることを確認した。
精製したペプチドの旋光度をパーキンエルマー旋光計を用いて測定したところ、
[α]D=−64°±1 (c=1.1%酢酸)であった。
実施例5
次式(配列番号ニア)。
Tyr−A la−、A 5p−A la−11e−P he−T hr−A
la−S er−T yr−Arg−L ys−V al−k eu−
Gly−Ala−Leu−3er−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−
Gln−Asp−I 1e−Xaa−5er−、Arg
(式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化されている)で表わされる2
9残基のアミド化されたペプチド[Ala”’、 N1e27コーhGRF(1
−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用
いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。MS、HPLCおよび細管ゾ
ーン電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋であることを確認した。
実施例6
次式(配列番号:8):
Tyr−A 1a−Asp−A la−11e−P he−Thr−、A 1a
−A、 1a−Tyr−A rg−L ys−Val−L ■普|
A 1a−G ln−L eu−S er−A la−Arg−L ys−A
la−L eu−G 1n−Asp−11e−Xaa−A 撃=|
Arg
(式中、N末端はN−メチルで置換されており、XaaはNleであり、C末端
はアミド化されている)
て表わされる29残基のアミド化されたペプチド[N CH3Tyr’。
Ala”9′3”2’、Nle”)−hGRF(1−29)−NH2を、実施例
1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的
方法により合成した。MS、HPLCおよび細管ゾーン電気泳動により、このペ
プチドが実質的に純粋であることを確認した。
精製したペプチドの旋光度をパーキンエルマー旋光計を用いて測定したところ、
[αコ。ニー57°±1 (c=1.1%酢酸)であった。
実施例7
次式(配列番号=9):
Tyr−A 1a−Asp−A la−11e−P he−T hr−A la
−S er−T yr−A rg−L ys−Val−L ■普|
Gly−G ln−Leu−S er−Ala−Arg−L ys−Leu−L
eu−Gin−A la−11e−Xaa−S er−Arg
(式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化されている)で表わされる2
9残基のアミド化されたペプチド[Ala”5. N1e27] −hGRF(
1−29)−NH2を、実施何重と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を
用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。MS、HPLCおよび細管
ゾーン電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋であることを確認した。
実施例8
次式(配列番号:10):
T yr−A 1a−Asp−A la−r le−P he−Thr−A l
a−S er−Tyr−A rg−L ys−Val−Le普|
G 1y−A la−Leu−5er−A la−Arg−L ys−Leu−
Leu−A 1a−Asp−I 1e−Xaa−S er−Arg
(式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化されている)で表わされる2
9残基のアミド化されたペプチド[Ala””’、 Nle2丁] −hGRF
(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機
を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。MS、HPLCおよび細
管ゾーン電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋であることを確認した。
実施例9
次式(配列番号・11)・
T yr−A 1a−A 5p−A la−I le−P he−Thr−A
la−S er−T yr−A rg−L ys−Val−k eu−
G 1y−A 1a−Leu−3er−A la−Arg−L ys−Leu−
Leu−G 1n−A la−I 1e−Xaa−S er|
Arg
(式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化されている)で表わされる2
9残基のアミド化されたペプチド[AlB81”5.Nle”] −hGRF(
1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を
用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。MS、l4PLCおよび細
管ゾーン電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋であることを確認した。
実施例10
次式(配列番号:12):
Tyr−A 1a−A 5p−A la−r le−P he−T hr−A
la−S er−Tyr−A rg−L ys−Val−L@eu−
G 1y−A la−L eu−S er−A 1a−A rg−L ys−L
eu−Leu−A 1a−A la−I 1e−Xaa−S@er−
Arg
(式中、XaaはN]、eてあり、C末端はアミド化されている)で表わされる
29残基のアミド化されたペプチド[A1811g、2445. N1e27]
−hGRF(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペ
プチド合成機を用いてM B HA樹脂上に段階的方法により合成した。MS、
HPLCおよび細管ゾーン電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋である
ことを確認した。
実施例11
次式(配列番号:13):
T yr−A 1a−Asp−A la−I le−P he−T hr−A
sn−S er−Tyr−A rg−L ys−Val−L@eu−
Gly−Ala−Leu−8er−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−
G 1n−Asp−I 1e−Xaa−3er−Arg
(式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化されている)で表わされる2
9残基のアミド化されたペプチド[AlB12.24.25. N1e27コー
hGRF(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチ
ド合成機を馬いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。MS、HPLC
および細管ゾーン電気泳動により、このペプチドが実質的に純粋であることを確
認した。
実施例12
40残基のアミド化されたペプチド[C’MeHis’、D−NMA2.Ala
”。
CML2)]−hGRF(1−40)−NHzを、ヴ工−ル(Vale)らの米
国特許第4.292゜313号に記載の方法と同様に、ベックマン990ペプチ
ド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例13
ペプチド[D−NMA”、Aib”、CML”コーrGRF(1−43)−0H
を、ケミストリーレターズ(Chemistry Letters、 5upr
a)に記載の方法に従って、最初のカップリングにクロルメチル化樹脂を用い、
その後は実施例1に記載の方法と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用
いて合成した。
実施例14
hGRF類似体[NMeTyr’、Lys’、Ala”’、CML27.Asn
28] −hGRF(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン9
90ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例15
hGRF類似体[NMeTyr’、Ala”、D−Lys”、CML27] −
hGRF(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチ
ド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例16
ペプチド[NMeHis’、D−NMA2.Aib8.D−Arg”、CML2
”] −hGRF(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン99
0ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例17
ペプチド[NMeTyr’、Ala’、C’Me−D−Tyr”、D−Lys”
、CML27] −hGRF(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベッ
クマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成し
た。
実施例18
ペプチド[D−NMA”、CML5.D−Lys”、Ala”、Nva27コー
rG RF (1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペ
プチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例19
ペプチド[D−Phe’、D−NMA”、Glu’、C’MeTyr”、l1e
I3.Ala”。
CML22−hGRF(1−32)−NHCH2CH3を、コーンライヒ(Ko
rnreich)らの米国特許第4.569.967号に記載された方法にした
がってN−エチルアミノメチル樹脂を用いた他は、実施例1と同様に、ベックマ
ン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例20
ペプチド[pCl−Phe’、D−NMA”、CMA”、Va122.Aib2
5.Ile”コーrGRF(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベック
マン990ペプチド合成機を用いてM B H、A樹脂上に段階的方法により合
成した。
実施例21
ペプチド[CML’、D−NMA2.D−、Asp3.Lys8.AlB16.
CMA”] −hGRF(1−32)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマ
ン990ペプチド合成機を用いてN・IBHA樹脂上に段階的方法により合成し
た。
実施例22
ペプチド[D−Tyr’、D−NMA2.D−Asp3.C’Me−D−Tyr
”、Ala”’。
D−、Arg21.CML22.D−Met27]−hGRF(1−29)−N
Hzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用いてMBHA
樹脂上に段階的方法にょペプチド[D−His’、D−NMA’、AlB827
.CML13] −rGRF(1−29)−NHzを、実施例1と同様に、ベッ
クマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成し
た。
実施例24
rGRF類似体フラグメント[NMeTyr’、D−NMA2.Glu8.CM
A13゜Aib+6.D−Arg”、C’Melle”]−rGRF(1−29
)−NHzを、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用いてM
BHA樹脂上に段階的方法によペプチド[CML’、D−NMA2.Leu”、
AlB16”、CMAI9”] −rGRF(1−29)−NHzを、実施例1
と同様に、ベックマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方
法により合成した。
実施例26
ペプチド[C’MePhe’、 NMA2. Lys”、 Arg12. li
e哀32)、CMA”。
Ala”コーhGRF(1−29)−NHzを、ヴエール(Vale)らの米国
特許第4.292.313号に記載の方法と同様に、ベックマン990ペプチド
合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例27
ペプチド[desアミノD−Tyr’、D−NMA2. Aib”、PheIO
lC’MeVal ” 。
Leu27. Asn”コーhGRF(1−29)−NHzを、ヴ工−ル(Va
le)らの米国特許第4.292.313号に記載の方法と同様に、ベックマン
990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例28
ペプチド[D−NMA2.C’MeTyr”、C’MeVal13.Ala”、
CML”。
N1e27.Asn”]−hGRF(1−29)−NH2を、ヴエール(’/a
le)らの米国特許第4.292.313号に記載の方法と同様に、べ・ツクマ
ン990ペプチド合成機を用(AてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した
。
実施例29
ペプチドしC″’MePbe’、D−NMA2.Ala’、C’MeTyr”、
C’Me11e13゜Va127コーrGRF(1−29)−NH2を、実施例
1と同様に、べ・ツクマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階
的方法により合成した。
実施例30
ペプチド[desアミノD−Met’、D−NMA2.C’MeTyr”、C”
MeVal”。
CMA19、Ala24.Asn”]−hGRF(1−44)−NHzを、ヴエ
ール(Vale)らの米国特許第4.292.313号に記載の方法と同様に、
ベックマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合
成した。
実施例31
ペプチド[NMeHis’、D−NMA2.Aib’、C’MeVa113.N
1e27] −hGRF(1−29)−NH2を、ヴ工−ル(Vale)らの米
国特許第4.292.313号;こ8己載の方法と同様に、ベックマン990ペ
プチド合成機を用しXてM B HA樹月旨上に段階的方法により合成した。
実施例32
ペプチド[NMeTyr’、Ala” ”、CML”、NLe27.Asn”]
−hGRF(1−29)−N H2ヲ、実施例1と同様に、ベックマン990
ペプチド合成機を用LNてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例33
ペプチド[NMeTyr’、Ala”52’、CML”、N1e27] −hG
RF(1−29)−NH2を、実施例1と同様に、べ・ツクマン990ペプチド
合成機を用LNでM B HA樹脂上に段階的方法により合成した。
ペプチド[NMeTyr’、CML13. Ala” 24. NLe27.
Asn”コーhGRF(1−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン
990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例35
ペプチド[NMeTyr’、 Ala9”、 Aib25. Nle”、 As
n28] −hGRF(1,−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマ
ン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例36
ペプチド[NMeTyr’、Ala””、CML’)、Nle”、Aib”]
−hGRF(1−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペプ
チド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例37
ペプチド[NMeTyr’、Ala81’、CML”、Nle”、Asn2♂]
−hGRF(1−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペ
プチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例38
ペプチド[NMeTyr’、Aib””、Ala15.Nle”、Asn”]
−hGRF(1−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペプ
チド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例39
ペプチド[NMeTyr’、CML5.AlaI51’、Nle”、Asn2B
] −hGRF(1−29)−NH,を、実施例1と同様に、ベックマン990
ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例40
ペプチド[NMeTyr’、Ala”””425.Nle”、Asn28] −
hGRF(1−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペプチ
ド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
ペプチド[NMeTyr’、Ala8I516”、 N1e27. Asn”コ
ーhGRF(1−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペプ
チド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
実施例42
ペプチド[NMeTyr’、 Ala81’ 16.N1e27.Asn”]
−hGRF(1−29)−NH2を、実施例1と同様に、ベックマン990ペプ
チド合成機を用いてMBHA樹脂上に段階的方法により合成した。
合成ペプチドの、成長ホルモンの放出を促進する相対的効力を決定するために、
標準として合成hpGRF(1−40)−0Hを用いて、等モル濃度の代表的な
合成類似体と並行比較することによりインビトロ検定を行った。試験の3から5
日前に摘出したラット下垂体細胞を含む培養物を使用した。このような培養物は
成長ホルモンの分泌に最適であると考えられる。この培養物を、ヴ工−ル(Va
le)らの論文(Endocrinology、 91.562−572 (1
972))に記載され、ヴエール(vale)らの論文(Endocrinol
ogy、112. 1553−1555 (1983))にさらに詳細に記載さ
れる一般的方法により、比較試験のために使用した。試験物質とのインキュベー
ションは3〜4時間行い、培地のアリコートを取り出して、それらの免疫反応性
GH(irG H)の含有量を周知のラジオイムノア・ンセイで測定した。
インビトロ検定によって、実施例で製造した合成ペプチドを合成hpGRF(1
−40)−OHと比較した。これらのペプチドは概して、GHの分泌および同様
の本質的な活性について、より高い効力を示していると考えられた。これらの合
成ペプチドはすべて生物学的に活性てあり、下垂体によるGHの放出を促進する
有用な化合物であると考えられた。
これらのペプチドの、等モル濃度における比較試験の結果を表1に示す。
hGRF(1−40)−08(標準)1.0実施例1(配列番号:3) 2.1
43 (1,178−4,065)実施例2(配列番号: 4) 1.502
(0,727−2,859)実施例3(配列番号: 5) 1.345 (0,
595−2,068)実施例4(配列番号:6) 0.34 (0,837−2
,190)実施例6(配列番号+8) 11.18 (8,25−15,17)
成長ホルモン分泌のインビトロ試験の他に、合成ペプチドをウレタンで麻酔した
雄ラットに静脈注射してインビボ試験をしたところ、外因性のGRFに対する反
応を維持したまま自発的なGH分泌が抑えられることが判明した。注射前、注射
後10分、30分、60分後直ちに血液サンプルを採取し、血液中のGHレベル
をラジオイムノアッセイで測定した。かかるインビボ試験によって、これらの合
成ペプチドはhpGRF (1−40)−OHに比べてより高い生物学的効力を
示した。また、これらのペプチドは、静脈注射後30分および60分後の血液中
の下垂体GHのレベルによって示されるように、実買的に効果がより長(持続し
た。以上の結果を確認するために、GH分泌を検出するのに効果的なものとして
知られる他のGRFインビボ試験を行った。これらのペプチドの、GH分泌を促
すのに効果的な投与量は、体重1kgあたり約500ナノグラムから約50マイ
クログラムであると考えられた。
このような合成hGRF類似体、およびおそらくはrGRF類似体も、医師がG
H産生を高めることを望む場合にヒトへ適用するのに有用であろう。このような
類似体によるGH分泌の促進は、内因性GRFの産生低下に起因する完全または
相対的GH欠乏症を有する患者を対象としている。さらに、正常のGHレベルを
有するヒトまたは動物において、増大したGH分泌およびそれに伴う成長増加が
可能であろう。また、投与は身体の脂肪含量を変化させ、GH依存性のその他の
代謝、免疫および発生過程を変化させるであろう。例えば、これらの類似体は火
傷を負ったような状況下にあるヒトの同化過程を促進する手段として有用であり
うる。他の例としてこれらの類似体は鶏、七面鳥、豚、ヤギ、牛および羊等の商
業用温血動物に投与し、または魚、冷血動物(ウミガメ、ウナギ等)および両生
類の養殖に用いて、有効量の本ペプチドを与えることにより成長を早め、かつ蛋
白質対脂肪の比率を高めることができる。
ヒトに投与する場合、これらの合成ペプチドは少なくとも約93%、好ましくは
少なくとも98%の純度を有するべきである。本明細書において純度とは、存在
するすべてのペプチドおよびペプチドフラグメントに対する、目的とするペプチ
ドの重量%を意味する。このような合成ペプチドを商業用その他の動物に成長促
進および脂肪含量低下の目的で投与する場合には、より低い純度も許容しつる。
これらの合成ペプチドまたはその無毒性塩は、医薬組成物を形成するために薬学
的または獣医学的に許容されるキャリアと混合されて、ヒトを含む動物に静脈内
、皮下、筋肉内、経皮的(例えば鼻腔内)、または経口的にさえ投与することが
できる。投与は、治療される受容者がこのような治療上の処置を必要とする場合
に、GHの放出を促進するために医師により行われる。必要な投与量は、治療さ
れるそれぞれの受容者の症状、その症状の程度、および治療の持続時間により変
化するであろう。
かかるペプチドは無毒性塩、例えば酸付加塩または亜鉛や鉄その他の金属との金
属錯体(本明細書においては金属錯体も塩として考える)の形でしばしば投与さ
れる。酸付加塩の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩
、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸
塩、酒石酸塩などである。活性成分を錠剤の形で経口的に投与する場合、錠剤は
トラガカント、コーンスターチ、ゼラチン等の結合剤、アルギン酸等の崩壊剤、
およびステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤を含んでいてもよい。液体での投与
が望まれる場合には甘味料や風味料を使用することができ、また等張生理食塩水
やリン酸緩衝液を用いて静脈内投与を行うこともできる。
このペプチドは医師の指導のもとてヒトに投与されるべきであり、医薬組成物は
通常、ペプチドとともに、薬学的に許容される慣用の固体または液体キャリアを
含むであろう。一般に、非経口投与量は受容者の体重1kgあたりペプチド約0
.01〜約1μgであるだろう。
かかるペプチドは、単回投与から1週間から1年の長期間にわたり投与すること
も好ましく、また除放性のデポ−製剤または埋め込み製剤とすることもできる。
例えば、投与製剤は、高分子塩基酸の酸付加塩、多価金属カチオンの塩またはこ
れらの塩を組み合わせたもの等の、体液に対する溶解性が低い化合物の薬学的に
許容しつる塩を含有することができる。比較的溶解性の低い塩はゲル(ステアリ
ン酸アルミニウムゲル等)中で製剤してもよい。投与に適切な除放性デポ−製剤
は、米国特許第3.773.919号等に記載されるポリ酢酸/ポリグリコール
酸等の、分解速度が遅い非毒性または非抗原性のポリマー内に分散またはカプセ
ル化したペプチドまたはその塩を含有していてもよい。これらの化合物はまた、
シラスティック埋め込み製剤中に入れてもよい。
あるいはまた、メイヤー(Meyer、 B、R,)らの論文(C1in、 P
harm、 & Therapeutics、 44.6.607−612 (
1988))に報告されているように、電流を使用して長時間ヒトに経皮的にペ
プチドを投与することも可能である。例えば、9ボルトのバッテリーを使用して
0.2ミリアンペアの電流をヒトの皮膚に流し、これによって表皮から血液中に
ペプチドを効果的に投与するようにした経皮パッチを使用してもよい。
本発明を、現在本発明者が認める最もよい方法である好ましい実施態様で説明し
てきたが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、当
分野での通常の知識を有する者にとって明らかな様々な変更および修正がなされ
うることを理解すべきである。例えば、ペプチド鎖の修飾、特に今までに知られ
た実験慣習に従って、ペプチドのカルボキシル末端から始まり大体29位までを
欠失させることができ、このことによってペプチドの生物学的効力の全であるい
は本質的部分を保持するペプチドやペプチドフラグメントを製造することができ
るが、このようなペプチドも本発明の範囲内に含まれると考えられる。さらに、
両末端あるいはそのいずれかにおける付加により、また、ペプチド化学の分野で
よく知られるように天然の残基の代わりにほぼ等価の残基を用いることにより、
本発明の範囲から逸脱することな(、特許請求の範囲に記載されたポ1ノペプチ
ドの効力の少なくとも本質的部分を有する他の類似体を製造すること力(できる
。さらに現在の技術によってC末端の好ましいNH2基に対する修飾を行っても
よしXo例えば、C末端のアミノ酸残基のカルボキシル部分は、−COOR,−
CRO。
−CONHNHR,−CON(RXR’)または−CH20R<ここでRおよび
R′は低級アルキル、フルオロ低級アルキルまたは水素である)とすること力(
でき、これらの修飾により等価のペプチドが得られることから、力1力)る修飾
も本発明の範囲を逸脱するものではない。
本発明の様々な特徴は、以下の特許請求の範囲にお0て強調される。
配列番号:1
配列の長さ:44
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニ一本鎖
トポロジー二不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser
Tyr Arg Lys Val Leu Gly G1nLeu Ser A
la Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met S
er Arg Gin Gin GlyGlu Ser Asn Gln Gl
u Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu配列番号=2
配列の長さ、43
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニ一本鎖
トポロジー:不明
配列の種類:ペプチド
配列:
His Ala Asp Ala Ile Phe Thr Ser Ser
Tyr Arg Arg Ile Leu Gly G1nLeu Tyr A
la Arg Lys Leu Leu His Glu Ile Met A
sn Arg Gin Gin GlyGlu Arg Asn Gin Gl
u Gin Arg Ser Arg Phe Asn配列番号:3
配列の長さ 29
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トボロジー:不明
配列の種類:ペプチド
配列。
Tyr^la Asp^la Ile Phe Thr Ala Ser Ty
r Arg Lys val Leu Gly G1nLeu Ser Ala
Arg Lys Leu Leu Gln Asp ILe Xaa Ser
Arg配列番号・4
配列の長さ・29
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr^la Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser T
yr Arg Lys Val Leu Gly Alal 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp
Ile Xaa Ser Arg配列番号:5
配列の長さ=29
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー二不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser
Tyr Arg Lys Val Leu Gly G1nLeu Ser A
la Arg Lys Leu Leu Ala Asp Ile Xaa S
er Arg配列番号:6
配列の長さ=29
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser
Tyr Arg Lys Val Leu Gly G1nLeu Ser A
la Arg Lys Leu Leu Gin Ala Ile Xaa S
er Arg配列番号ニア
配列の長さ:29
配列の型・アミノ酸
鎖の数・−重鎖
トポロジー・不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr^la Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser T
yr Arg Lys Val Leu Gly Alal 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp
Ile Xaa Ser Arg配列番号:8
配列の長さ=29
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:不明
配列の種類、ペプチド
配列:
Tyr^la Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ala T
yr Arg Lys Val Leu Ala G1nLeu Ser Al
a Arg Lys Ala Leu Gln 、Asp Ile Xaa A
la Arg配列番号・9
配列の長さ:29
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー二不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser
Tyr Arg Lys Val Leu Gly G1nLeu Ser A
la Arg Lys Leu Leu Gin^la Ile Xaa Se
r Arg配列番号=10
配列の長さ:29
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser
Tyr Arg Lys Val Leu Gly Alal 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Ala Asp
Ile Xaa Ser Arg配列番号=11
配列の長さ:29
配列の型二アミノ酸
鎖の数、一本鎖
トポロジー二不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr Aha Asp^la Ile Phe Thr^la Ser Ty
r Arg Lys Vat Leu Gly^1a1 5 10 ’ 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Ala
Ile Xaa Ser Arg配列番号:12
配列の長さ:29
配列の型・アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー・不明
配列の種類:ペプチド
配列・
Tyr Ala Asp ALa Ile Phe Thr Ala Ser
Tyr Arg Lys Val Leu Gly Alal 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Ala Ala
Ile Xaa Ser Arg配列番号:13
配列の長さ:29
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser
Tyr Arg Lys VaL Leu Gly Alal 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp
Ile Xaa Ser Arg配列番号=14
配列の長さ:44
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Xaa Xaa Xaa^la Xaa Phe Thr Xaa Xaa X
aa Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaal 5 10 15
Leu Xaa Ala Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Arg Gln Gln GlyGlu Xaa A
sn Gln Glu Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa X
aa配列番号=15
配列の長さ:29
配列の型二アミノ酸
鎖の数、一本鎖
トポロジー二不明
配列の種類:ペプチド
配列:
Xaa Xaa Xaa^la Ile Phe Thr Tyr Xaa S
er Tyr Arg Xaa Xaa Leu Xaa waa
l 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Xaa Leu Leu Xaa Xaa
Ile Xaa Xaa Arg配列番号:16
配列の長さ・32
配列の型・アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー二不明
配列の種類:ペプチド
配列。
Xaa Ala Asp Ala Ile Phe Thr Tyr Xaa
Ser Tyr Arg Lys Val Leu Xaa@Xaa
l 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Xaa Leu Leu Xaa Xaa
Ile Xaa Xaa Arg Gln Gin Glyフロントページの続
き
(72)発明者 ヴエール、ワイリー・ウォーカー、ジュニア
アメリカ合衆国カリフォルニア用92037゜う・ホーラ、ヴアルデズ 164
3
Claims (20)
- 1.配列番号:8の配列[式中、N末端はN−メチルで置換されており:Xaa はNleであり;C末端はアミド化されている]を有する合成ペプチド。
- 2.配列番号:16の配列[式中、N末端にBが存在し;Xaa1はTyrまた はD−Tyrであり;BはHまたはNaMeであり;Xaa8はAla、Aib またはAsnであり;Xa815はGlyまたはAlaであり:Xaa16はA la、AibまたはGlnであり;Xaa21はLysであり:Xaa24はA la、AibまたはGlnであり;Xaa25はAla、AibまたはAspで あり;Xaa27はNleであり;Xaa28はSerまたはAsnであり;C 末端にNHRが存在し(ここでRはHまたは低級アルキル基であり);ただし、 Xaa8、Xaa16、Xaa24およびXaa25の少なくとも1つはAla またはAibであり、C末端から3残基までは欠失していてもよい]を有する合 成ペプチドまたはその無毒性塩。
- 3.配列番号:3の配列[式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化され ている]を有する、請求項2記載のペプチド。
- 4.配列番号:4の配列[式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化され ている]を有する、請求項2記載のペプチド。
- 5.配列番号:5の配列[式中、XaaはN1eであり、C末端はアミド化され ている]を有する、請求項2記載のペプチド。
- 6.配列番号:6の配列[式中、XaaはNleであり、C末端はアミド化され ている]を有する、請求項2記載のペプチド。
- 7.配列番号:14の配列〔式中、N末端にBが存在し;Xaa1はTyr、D −Tyr、Met、Phe、D−Phe、pC1−Phe、Leu、Hisまた はD−Hisであり;BはH、CaMe、NaMe、desアミノ、Acまたは Forであり:Xaa2はAla、D−Ala、NMAまたはD−NMAであり :Xaa3はAspまたはD−Aspであり;Xaa5はIleまたはLeuで あり;Xaa8はAla、Aib、SerまたはAsnであり;Xaa9はSe r、AlaまたはAibであり;Xaa10はTyr、D−TyrまたはPhe でありXaa12はArgまたはLysであり:Xaa13はIle、Val、 LeuまたはAlaであり;Xaa15はGlyまたはAlaであり;Xaa1 6はAla、AibまたはGlnであり;Xaa18はSerまTyrであり; Xaa21はLys、D−Lys、ArgまたはD−ArgでありXaa22は Leu、Ile、Ala、AibまたはValであり:Xaa24はAla、A ib、GInまたはHisであり;Xaa25はAla、Aib、Aspまたは Gluであり;Xaa26はIleまたはLeuであり;Xaa27はNle、 Met、D−Met、Ala、Ile、Leu、NvaまたはValであり;X aa28はAsn、Ala、AibまたはSerであり;Xaa34はSerま たはArgであり;Xaa38はArgまたはGInであり;Xaa39はGl yまたはArgであり;Xaa40はAlaまたはSerであり:Xaa42は Phe、AlaまたはValであり;Xaa43はAsnまたはArgであり; Xaa44はLeuまたはその他の天然アミノ酸のL−異性体であり;C末端は アミド化されており;ただしXaa8、Xaa18、Xaa24およびXaa2 5の少なくとも1つはAlaまたはAibである。]を有する合成ペプチドまた はその無毒性塩。
- 8.Xaa27がNleであり、残基30から44が欠失している、請求項7記 載のペプチド。
- 9.Xaa15がAlaである、請求項7記載のペプチド。
- 10.Xaa28がAsnである、請求項7記載のペプチド。
- 11.Xaa8がAlaである、請求項7記載のペプチド。
- 12.Xaa18がAlaである、請求項7記載のペプチド。
- 13.Xaa24がAlaである、請求項7記載のペプチド。
- 14.Xaa25がAlaである、請求項7記載のペプチド。
- 15.Xaa8がAibである、請求項7記載のペプチド。
- 16.Xaa16がAibである、請求項7記載のペプチド。
- 17.Xaa24がAibである、請求項7記載のペプチド。
- 18.Xaa25がAibである、請求項7記載のペプチド。
- 19.請求項7記載のペプチドまたはその無毒性塩、および医学的または獣医学 的に許容しうる液体または固体のキャリアを含む、動物においてGHの放出を促 進するための組成物。
- 20.配列番号:16[式中、N末端にBが存在し;Xaa1はTyr、D−T yr、Phe、D−Phe、HisまたはD−Hisであり;BはH、CaMe またはNaMeでありXaa8はAla、AibまたはAsnであり;Xaa1 5はGlyまたはAlaであり;Xaa16はAla、AibまたはGlnであ り;Xaa21はLysまたはArgであり;Xaa24はAla、Aibまた はGlnであり;Xaa25はAla、AibまたはAspであり;Xaa27 はNleであり;Xaa28はAsnまたはSerであり;C末端にNHRが存 在し(ここでRはHまたは低級アルキル基であり);ただしC末端のGly、G ln−GlyまたはGln−Gln−Glyは欠失していてもよく、また、Xa a8、Xaa16、Xaa24またはXaa25の少なくとも1つはAlaまた はAibである]の配列を有するペプチドまたはその無毒性塩。
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