KR100236413B1 - Grf(쥐이알에프) 유사체 xi - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람을 포함하는 동물에서 뇌하수체 GE의 방출을 자극하는데 극히 효능있고 체내에서 효소 분해에 저항하는 합성 펩티드를 제공한다. 적절한 특정 펩티드는 하기식 (서열정체 번호 : 16)을
Arg-Y, 이때 Xaa1은 Tyr, D-Tyr, Phe D-Phe, His 또는 D-His이고, B는 H 또는 NαMe이고, Xaa8은 Ala, Aib 또는 Asn이고, Xaa15는 Gly 또는 Ala이고, Xaa16은 Ala, Aib 또는 Gln이고, Xaa24는 Ala, Aib 또는 Gln이고, Xaa24는 Ala, Aib 또는 Gln이고, Xaa25는 Ala, Aib 또는 Asp이고, Xaa28은 Ser 또는 Asn이고, Y는 NHR이고 R은 H 또는 저급 알킬이되, 단 Xaa8, Xaa16, Xaa24및 Xaa25중 적어도 하나는 Ala 또는 Aib이다.
Description
본 발명은 사람 및 다른 동물에서 뇌하수체의 기능에 영향을 미치는 펩티드에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 뇌하수체에 의한 성장호르몬 방출을 촉진하는 펩티드에 관한 것이다.
발명의 배경
생리학자들은 시상하부가 각각의 뇌하수체 호르몬의 분비를 자극하거나 억제하는 특별한 물질을 생산하므로써 뇌하수체 전엽의 분비기능을 시상하부가 조절함을 오랫동안 인식해왔다.
시상하부의 억제인자는 성장호르몬(GH)의 분비를 억제하는 소 마토스타틴의 형태로 1972년에 특성결정되었다. 1982년에, 성장 호르몬 방출인자(GRF)를 사람의 췌장종양 추출물로 부터 분리하고, 정제하고, 특성결정하고, 합성하고 시험하여, 그들이 뇌하수체에 의한 GH방출을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 이후에 사람의 시상하부 GH방출인자는 다음 식을 갖는 용어 hGRF(1-44)-NH2로 현재 불리는 정확히 동일한 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다:
여기에서 C-말단은 아미노화된다. 이후에 쥐의 GRF(1-43)-OH는 다음식을 갖는 것으로 밝혀졌다 : (서열 정체 번호 : 2) His-
이들 천연 구조물의 많은 유사체가 합성되었다.
발명의 요약
배양된 뇌하수체 세포로부터 GH를 방출시키고, 체내에서 효소 분해에 대해 증가된 내성을 가지며, 매우 실질적으로 증가된 효능을 타내는 합성 폴리펩티드가 이제 합성되고 시험되었다. 이 유리한 성질은 증가된 안정성의 알파-나선형태를 가진 펩티드로부터 기인되며, 이 펩티드는 그의 알파 탄소원자 상에서 치환되지 않거나 메틸기로 치환된(CαMe 또는 CαCH3)위치 8,16, 24 및 25중의 하나이상에 L-알라닌을 가지며, 바람직하게는 적어도 8-위치가 상기와 같이 치환된다. 메틸기로 치환된 알파 탄소원자를 가진 Ala는 약자 Alb(2-아미노-이소부티르산)로 표시된다.
상기뿐 아니라, 펩티드는 천연 호르몬에서 발견되는 여러가지 잔기 대신 다른 치환물을 가질 수 있다. 예컨대, D-Ala, NαCH3-D-Ala(D-NMA) 또는 NMA는 2-위치에서 치환될 수 있고, 이들은 L-Ala의 등가물인 것으로 간주된다.
CαMeLeu(CML) 또는 Nle가 27-위치에 Met대신에 바람직하게 존재하나, D-Met 또는 Nwa 또는 다른 잔기들이 존재할 수 있고 등가물로 간주된다. 펩티드는 또한 1위치에 다음 잔기들 중 임의의 것을 가질 수 있다 : Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, His 및 D-His, 이 잔기는 알파-탄소상에 또는 알파-아미노기에 메틸치환물을 임의로 가질 수 있거나, 알파-아미노기는 결실될 수 있고(데스 아미노); 이 잔기는 또한 바람직하게 아세틸(Ac)또는 포르밀(For)에 의해 아실화된 그의 알파-아미노기를 가질 수 있고, 이들 전부는 치환안된 잔기와 등가물인 것으로 간주된다.
펩티드는 당 분야에서 알려진 바와 같은 다른 치환물, 예컨대 3-위치에 D-Asp 및/또는 12-위치에 Arg 및/또는 10-위치에 Phe 또는 D-Tyr 및/또는 15-위치에 Ala 및/또는 28-위치에 Asn 또는 Ala를 임의로 가질 수 있고, 이들 전부는 등가물로 간주된다.
본 발명에 따른 약제조성물은 제약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 액체 또는 고체 운반체에 분산된, 길이 약29내지 44잔기인 상기 유사체, 또는 이들의 임의의 무독성염을 포함한다. 상기 약제조성물은 치료목적을 위해서 및 또한 진단적으로 투여하기위해, 사람 및 가축 둘다의 임상의학에서 사용될 수 있다. 더욱이, 그들은 가금을 포함하는 온혈동물 및, 양식어업에서 성장을 촉진시키는데 사용될 수 있다.
적절한 구체예의 상세한 설명
펩티드를 정의하는데 사용되는 명명법은 쉬로더 및 루브케, "펩티드", Academic Press(1965) 에 의해 상술된 것이며, 이때 통상적인 표시에 따라서 N-말단의 아미노기는 왼쪽에 그리고 C-말단의 카르복시기는 오른쪽에 나타낸다. 천연 아미노산은
및 His로 구성되는 단백질에서 발견되는 보통의, 천연적으로 존재하는 아미노산중 하나를 의미한다. Nle는 노르로이신을 의미하고, Nva는 노르발린을 의미한다. 아미노산 잔기가 이성질체 형태를 갖는 경우, 달리 표시되어 나타내지 않는 한 나타낸 것은 아미노산의 L형이다. D-NMA는 알파-아미노기가 메틸에 의해 치환된 알라닌의 D-이성질체를 나타낸다.
본 발명은 일반적으로 다음 식(서열 정체 번호 : 14)을 갖는 합성 펩티드를 제공하며 이때 Xaa 다음의 첨자는 N-말단에서 시작하는 분자에서의 그의 위치를 나타내는데 사용된다 :
이때 B는 N-말단에 존재하고, Xaa1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCL-Phe, Leu, His 또는 D-His이고 ; B는 H, CαMe, NαMe, 데스아미노, Ac 또는 For 이고 ; Xaa2는 Ala, D-Ala, Nma 또는 D-NMA이고 ; Xaa3는 Asp 또는 D-Asp 이고; Xaa5는 Ile 또는 Leu이고 ; Xaa8는 Ala, Aib, Ser 또는 Asn 이고 ; Xaa9는 Ser, Ala 또는 Aib 이고 ; Xaa10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe 이고 ; Xaa12는 Arg 또는 Lys이고 ; Xaa13는 Ile, Val, Leu 또는 Ala 이고 ; Xaa15는 Gly 또는 Ala이고 ; Xaa16는 Ala, Aib 또는 Gln이고 ; Xaa18는 Ser 또는 Tyr 이고 ; Xaa21는 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg 이고 ; Xaa22는 Leu Ile, Ala, Aib 또는 Val 이고 ; Xaa24는 Ala, Aib, Gln 또는 His 이고 ; Xaa25는 Ala, Aib, Asp 또는 Glu이고 ; Xaa26는 Ile 또는 leu이고 ; Xaa27는 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val 이고 ; Xaa28는 Asn, Ala, Aib 또는 Ser 이고 ; Xaa34는 Ser 또는 Arg이고 ; Xaa38는 Arg 또는 Gln 이고 ; Xaa39는 Gly 또는 Arg 이고 ; Xaa40는 Ala 또는 Ser 이고 ; Xaa42는 Phe, Ala 또는 Val이고 ; Xaa43는 Asn 또는 Arg 이고 ; Xaa44는 leu 또는 다른 L-이성질체 천연아미노산이고 ; C-말단은 아미노화될 수 있되 ; 단 Ala 또는 Aib는 Xaa8, Xaa16, Xaa24및 Xaa25중 적어도 하나에 존재한다. 허용가능한 C-말단 단축된 펩티드 변형은 C-말단에서 시작하여 15잔기까지의서열을 결실함으로써 제공될 수 있고, 이들은 특정한 Ala 또는 Aib 치환물을 2, 3 또는 전부인 4개 가질 수 있다. 상기의 적절한 한 아류에서, Xaa5는 Ile, Xaa18는 Ser, Xaa24는 Gln, Xaa25는 Asp, Xaa26는 Ilem Xaa34는 Ser, Xaa38는 Arg, Xaa39는 Gly 및 Xaa40는 Ala이다. 펩티드가 위치44까지 연장되면, Xaa44는 바람직하게 Leu 또는 Val이다.
상기 펩티드의 적절한 아류는 다음 식(서열 정체 번호 : 15)을 갖는 군이다 :
이때 B는 N-말단에 존재하고 ; Xaa1는 Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, His 또는 D-His 이고 ; B는 H, CαMe 또는 NαMe이고 ; Xaa2는 Ala, D-Ala, NMA 또는 D-NMA이고 ; Xaa3는 Asp 또는 D-Asp 이고 ; Xaa8는 Ala Aib, Ser 또는 Asn 이고 ; Xaa12는 Arg 또는 Lys 이고 ; Xaa13는 Ile 또는 Val 이고 ; Xaa15는 Gly 또는 Ala 이고 ; Xaa16는 Ala, Aib 또는 Gln 이고 ; Xaa21는 Lys 또는 Arg이고 ; Xaa24는 Ala, Aib, Gln 또는 His 이고 ; Xaa25는 Ala, Aib, Asp 또는 Glu 이고 ; Xaa27는 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val 이고 ; Xaa28는 Asn 또는 Ser이고 C-말단은 아미노화되되, 단, Xaa8, Xaa16, Xaa24또는 Xaa25중 적어도 하나는 Ala 또는 Aib이다.
이들 임의의 펩티드에서, C-말단의 아미노산 잔기의 카르복시성분은 아미노화될 뿐 아니라 임의의 다음기(전부 등가물인 것으로 간주됨)일 수 있다 : -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') 또는 -CH2OR, R 및 R' 은 저급 알킬, 플루오로 저급알킬 또는 수소이고 ; 메틸, 에틸 및 프로필의 적절한 저급알킬이다. 바람직하게는 -CONHR이고, R은 H 또는 저급알킬이다.
본 발명에 의해 제공되는 또 다른 적절한 아류의 펩티드는 다음 식(서열 정체 번호 : 16)에 따른 것이다 :
이때 B는 N-말단에 존재하고 ; Xaa1는 Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, His 또는 D-His 이고 ; B는 H 또는 NαMe 이고 ; Xaa8는 Ala, Aib 또는 Asn 이고 ; Xaa15는 Gly 또는 Ala이고 ; Xaa16은 H1d, Aib 또는 G17이고; Xaa21은 Lys 또는 Arg이고 ; Xaa24는 Ala, Aib 또는 Gln 이고 ; Xaa25는 Ala, Aib 또는 Asp 이고 ; Xaa27는 Nle이고; Xaa28는 Asn 또는 Ser 이고 ; NHR은 C-말단에 존재하고, R은 H 또는 저급알킬이되 ; 단 Gly, Gln-Gly 또는 Gln-Gln-Gly 은 C-말단에서 결실 될 수 있고, 단, Xaa8, Xaa16, Xaa24및 Xaa25중 적어도 하나는 Ala 또는 Aib이고, 둘 이상의 상기 치환물이 이들 4위치에 존재할 수 있다. 이 아류로부터의 특히 적절한 한 펩티드 군에서, Xaa21은 Lys이고, Xaa28은 Asn이다.
전술한 바와같이, N 말단으로부터 잔기 29까지 연장되는 단편은 뇌하수체에 의한 GH방출을 달성하는데, 생물학적 효능을 가진다. 아미드 또는 치환된 아미드인 C-말단을 가진, 길이 29 또는 32 잔기의 상기 생물학적으로 유효한 단편이 가장 적절하다.
펩티드는 단독의 고체상 기술에 의해서, 부분적인 고체상 기술에 의해서, 단편 축합에 의해서 또는 용액 결합에 의해서와 같은 적당한 방법에 의해서 합성된다. 예컨대, 단독의 고체상 합성 기술은 교과서 "고체상 펩티드 합성", 스튜워트 및 영, Freeman & Co., 샌프란시스코, 1969에서 상술되며 배일 일동에게 1978년 8월 8일에 특허된 미합중국 특허 제4, 105, 603호의 설명서에 의해 예시된다.
용액합성은 논문 "유기 화학의 방법(하우벤-베일) : 펩티드의 합성 ", 에. 분쉬(편집자)(1974) Georg Thieme Verlag, 스투트 가르트, 서독에서 상세히 설명된다. 단편 축합 합성 방법은 미합중국 특허 제 3, 972, 859호(1976년 8월 3일)에서 예시된다. 다른 이용 가능한 합성은 미합중국 특허 제3, 842, 067호(1974년 10월 15일) 및 미합중국 제3, 862, 925호(1975년 1월 28일)에 의해 예시된다.
기가 완전히 제거될 때까지 그 부위에서 화학반응이 일어나지 못하게 할 적당한 보호기에 의한 여러가지 아미노산 성분의 불안정한 측쇄기의 보호가 상기 합성에 대해 공통이다. 보통 그 본체가 카르복시기에서 반응한 후, 알파-아미노 보호기를 선택적으로 제거하여 후속반응이 그 위치에서 일어나게 하는 동안에 아미노산 또는 단편상의 알파-아미노기의 보호가 또한 공통이다. 따라서, 합성단계로서 적당한 잔기에 연결된 측쇄보호기를 가진, 펩티드 사슬에서 원하는 서열에 위치한 각각의 아미노산 잔기를 포함하는 중간 화합물이 생성되는 것이 보통이다.
이점에서, 다음 식(II)를 가진 중간체가 생성 될 수 있다 :
이때 X1은 수소 또는 알파-아미노 보호기이다. X1에 의해 고려되는 알파-아미노 보호기는 폴리펩티드의 단계적 합성기술에서 유용한 것으로 잘 알려진 것들이다. X1으로서 사용될 수 있는 알파-아미노 보호기 종류중에는 (1) 플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC), p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐 같은 벤질옥실카르보닐(Z) 및 치환 Z 같은 방향족 우레탄형 보호기 ; (2) t-부틸옥시카르보닐(BOC), 디이소프로필메틸옥시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐, 알릴옥시카르보닐 같은 지방족 우레탄 보호기 ; 및 (3) 시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 및 시크로헥실옥시카르보닐 같은 시클로알킬 우레탄형 보호기가 있다. NαMe-치환 잔기가 1-위치에 사용될 때에도, 적절한 알파-아미노 보호기는 BOC이며, 물론 B가 데스아미노일때 X1은 H이다.
X는 수소 또는 Tos 같은 His의 이미다졸 질소를 위한 보호기이다.
X2는 테트라하이드로피라닐, 3차부틸, 트리틸, Bm1, CBZ, 4Br-CBZ 및 2, 6-디클로로벤질(DCB)같은, Tyr의 페놀 히드록시기에 적당한 보호기일 수 있다. 적절한 보호기는 2, 6-디클로로 벤질이다. X2는 그 위치의 아미노산 잔기상에 어떠한 측쇄 보호기도 없음을 의미하는 수소일 수 있다.
X3는 수소 또는, 벤질(OB%1), 2, 6-디클로로벤질, 메틸 및 에틸같이 Asp 또는 Glu의 카르복시기에 적당한 에스테르 형성 보호기이다.
X4는 아세틸, 벤조일, 3차부틸, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, B%1, 2, 6-디클로로벤질 및 CBZ 같이, Thr 또는 Ser의 히드록시기에 적당한 보호기일 수 있다. 적절한 보호기는 B%1이다. X4는 수소일 수 있고, 이것은 히드록시기 상에 보호기가 없음을 의미한다.
X5는 수소 또는, 크산틸(Xan)같이 Asn 또는 Gln의 측쇄 아미도기에 적당한 보호기이다. Asn 또는 Gln은 X5가 수소일때 히드록시벤조트리아졸(HOBt)존재 하에서 바람직하게 결합된다.
X6은 니트로, Tos, CBZ, 아다만틸옥시카르보닐 및 BOC같이 Arg의 구아니도기에 적당한 보호기이거나 수소이다.
X7은 수소 또는, Lys의 측쇄 아미노기에 적당한 보호기이다. 적당한 측쇄 아미노 보호기의 예는 2-클로로벤질옥시카르보닐(2-C1-Z), Tos, t-아밀옥시카르보닐 및 BOC이다.
X8은 수소 또는 상기에서 일반적으로 상술된 바와 같은 적당한 측쇄 보호기이다.
Met는 산소에 의해 임의로 보호될 수 있으나, 바람직하게는 보호되지 않은 채로 존재한다.
측쇄 아미노 보호기의 선택은 일반적으로 합성동안에 알파-아미노기의 탈보호동안 제거되지 않는 것이 선택되는 것을 제외하고는 중요하지 않다. 그러나, 몇몇 아미노산, 예컨대 His의 경우, 결합이 완료된 후 보호는 일반적으로 필요하지 않고, 보호기는 동일할 수 있다.
X9는 에스테르 형성기 X3같이, C-말단 카르복시기에 적당한 보호기이거나, 고체수지 지지체에 연결하기 위해 고체상 합성에서 사용되는 고정결합이거나, 데스-X9이고, 이경우에 C-말단의 잔기는 전술한 바와같이, X인 바르복시성분을 가진다.
고체수지 지지체가 사용될 때, 그것은 식-O-CH2-수지 지지체, -NH-벤즈히드릴아민(BHA)수지 지지체 또는 -NH-파라메틸벤즈히드릴아민(MBHA)수지 지지체를 갖는 것과 같이, 당 분야에서 알려진 임의의 것일 수 있다. 치환안된 아미드가 바람직할 때는, 절단이 직접 아미드를 제공하기 때문에, BHA 또는 MBHA의 사용이 적절하다. N-메틸 아미드가 바람직한 경우, 그것은 N-메틸 BHA 수지로 부터 생성될 수 있다. 다른 치환 아미드가 바람직하면, 미합중국 특허 제 4, 569, 967호의 지침을 사용할 수 있고, 또한 C-말단에 유리산외에 다른 기가 바람직하면 하우벤-베일 교재에서 상술한 바와같은 용액합성법을 사용하여 펩티드를 합성하는 것이 바람직할 수 있다.
중간체에 관한 식에서, 적어도 하나의 X기는 보호기이거나 X9는 수지 지지체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 (a)적어도 하나의 보호기 및 식(II)를 가진 중간체 펩티드를 형성하고, 이때 X, X1, X2,X3,X4,X5,X6,X7및 X8은 각각 수소 또는 보호기이고 X9는 보호기 또는 수지 지지체에 대한 고정결합이거나 데스-X9이고, 이 경우에 C-말단의 잔기는 바람직한 카르복시 성분을 가질 수 있고 ; (b) 보호기 또는 기들 또는 고정결합을 식(II)의 펩티드로 부터 분단시키고 ; (c)원하면, 관심사가 되는 결과의 펩티드를 그이 무독성염으로 전환시킴으로써 관심사가 되는 펩티드의 제조 방법을 제공한다.
펩티드의 합성에서 사용될 특별한 측쇄 보호기를 선택함에 있어서, 다음의 일반적인 규칙을 따른다 : (a) 보호기는 바람직하게 그의 보호성질을 보유하고 결합조건 하에서 분단되지 않는다.
(b) 보호기는 시약에 대해 안정해야 하며, Xan을 제외하고는, 각 합성단계에서 알파-아미노 보호기를 제거하기 위해 선택되는 반응조건하에서 바람직하게 안정하고, (c) 측쇄 보호기는 원하는 아미노산 서열을 갖는 합성의 완료시, 펩티드 사슬을 바람직하지 않게 변경시키지 않을 반응조건 하에서 제거될 수 있어야 한다.
당 분야에서 알려진 다른 동등한 화학 합성도 전술한 바와 같이 사용 할 수 있지만, 펩티드는 일반적으로 메리필드, J. Am. Chem. Soc., 85, p2149(1963)에 의해 설명된 것과 같은 고체상 합성을 사용하여 바람직하게 제조한다. 고체상 합성은 보호된 알파-아미노산을 적당한 수지에 결합시켜 펩티드의 C-말단으로부터 시작된다.
상기 출발물질은 알파-아미노 보호 아미노산을 에스테르 결합에 의해 클로로 메틸화 수지 또는 히드록시메틸 수지에, 또는 아미드 결합에 의해 BHA 수지 또는 MBHA 수지에 부착시켜 제조 할 수 있다. 히드록시메틸 수지의 제법은 보단스키 일동, Chem. Ind. (런던)38, 1597-98(1966)에 의해서 설명된다. 클로로메틸화 수지는 Bio Rad Laboratories(리치몬드, 캘리포니아) 및 Lab. system, Inc 로부터 상업적으로 입수가능하다. 상기 수지의 제법은 스튜워트 일동, "고체상 펩티드 합성"(Freeman & Co., 샌프란시스코 1969), 1과, pp1-6에 의해 설명된다. BHA 및 MBHA 수지 지지체는 상업적으로 입수가능하고 합성되는 원하는 폴리펩티드가 C-말단에 치환안된 아미드를 가질때에만 일반적으로 사용된다.
29잔기 변형의 펩티드를 제조하기 위하여, BOC에 의해서 및 Tos에 의해 보호된 C-말단 아미노산, 예컨대 Arg은 먼저 2시간 동안 교반 하에 DMF 및/또는 /CH2Cl2내의 DCCI를 사용하여, 배일 일동의 미합중국 특허 제4, 292, 313호에서 상술된 일반적인 절차에 따라 MBHA수지에 결합시킬 수 있다. 수지 지지체에 BOC보호 아미노산의 결합 후, 염화메틸렌 내의 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 TFA 단독을 사용하여 알파-아미노 보호기를 제거한다. 탈보호는 약0℃내지 실온의 온도에서 수행한다. 디옥산 내의 HCl같은 다른 표준 절단시약, 및 특정 알파-아미노 보호기의 제거 조건이 쉬로 더 및 루브케, "펩티드", 1,pp72-75(Academic Press 1965)에서 설명한 바와 같이 사용될 수 있다.
알파-아미노 보호기 제거 후, 남아 있는 알파-아미노-및 측쇄 보호 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 결합시켜 전술한 중간체 화합물을 얻거나, 합성에서 각각의 아미노산을 따로따로 첨가하는 것의 대안으로서, 그들중 얼마를 고체상 반응기에 첨가하기 전에 서로 결합시킬 수 있다. 적당한 결합 시약의 선택은 당 분야의 기술범위내에 있다. N, N'-디시클로헥실 카르보디아미드(DCCI)가 결합시약으로서 특히 적당한다.
펩티드의 고체상 합성에서 사용되는 활성화 시약은 펩티드 기술에서 잘 알려져 있다. 적당한 활성화 시약의 예는 N, N'-디이소프로필카르보디이미드 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 같은 카르보디이미드이다. 다른 활성화 시약 및 펩티드 결합에서 그들의 사용은 쉬로더 및 루브케, 상기 참조, III과에 의해서 및 카푸어, J. Phar. Sci., 59, pp 1-27(1970)에 의해서 설명된다. 또한 p-니트로페닐 에스 테르(ONp)를 사용하여 결합을 위해 Asn 또는 Gln의 카르복시 말단을 활성화할 수 있다. 예컨대, BOC-Asn(ONp)은 DMF 및 염화메틸렌의 50%혼합물내의 HOBt 1당량을 사용하여 하룻밤동안 결합시킬 수 있고, 이 경우에 DCCI가 첨가된다.
각각의 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 4배 초과로 고체상 반응기로 투입하고, 결합은 디메틸포름 아미드(DMF) : CH2Cl2(1 : 1)의 매질에서 또는 DMF 또는 CH2Cl2단독에서 수행 할 수 있다. 불완전 결합이 일어나는 경우에, 다음 아미노산의 결합전의 알파-아미노 보호기의 제거 전에 결합 절차를 반복한다.
수동으로 수행되면, 각각의 합성단계에서 결합단계에서 결합반응의 성공은 바람직하게 이이. 카이저 일동, Anal. BioChem. 34, 595(1970)에 의해서 설명되는 바와 같이, 닌히드린 반응에 의해서 검사한다. 결합 반응은 리비에 일동, Biopolymers , 1978, 17, pp 1927-1938에서 보고된 것과 같은 프로그램을 사용하여, 벡크만(Beckman)990 자동합성기 상에서와 같이 자동수행될 수 있다.
원하는 아미노산 서열이 완결된 후, 중간체 펩티드는 수지로부터 펩티드를 절단할 뿐 아니라 모든 남아 있는 측쇄 보호기 X0,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8및 X8및 고정결합 X9및 또한 사용되면 알파-아미노 보호기 X1을 절단하는 액체 플루오르화수소같은 시약으로 처리함으로써 수지 지지체로부터 제거하여 유리산 형태로 펩티드를 얻는다. Met가 서열에 존재하면, BOC 보호기는 먼저 바람직하게 HF로 펩티드를 수지로부터 절단하기 전에 트리플루오로 아세트산(TFA)/에탄디티올을 사용 제거하여 가능한 S-알킬화를 제거 한다. 절단을 위해 플루오로화수소를 사용할 때, 아니솔 및 황화 메틸에틸이 반응용기에 스캐빈저로서 포함된다.
다음 실시예1은 고체상 기술에 의해 펩티드를 합성하기에 적절한 방법을 상술한다. 물론 상응하는 더 긴 펩티드의 합성은 사슬의 C-말단에 단지 필요한 아미노산수를 첨가함으로써 동일한 방법으로 수행됨을 알 것이다. 현재 생물학적으로 유효한 단편은 잔기의 N-말단으로의 첨가가 유리하지 않다고 생각되기 때문에 N-말단에 표시된 서열을 가져야 함을 느낀다.
식(서열 정체 번호 : 3)
Ser-Arg(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 펩티드 [Ala8, Nle27]hGRF(1-29)-NH2의 합성은 배일 일동의 미합중국 특허 제4, 292, 313호에서 일반적으로 설명된 바와 같이 상업적으로 입수가능한 MBHA수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. 수지에 대한 BOC-Arg(Tos)의 결합은 수지 그람당 약 0.35mmol. Arg의 치환을 결과시킨다.
탈봉쇄 및 중화 후, 펩티드 사슬은 수지 상에서 한 단계씩 건조된다.각 아미노산의 탈봉쇄, 중화 및 첨가는 리비에, 제이., J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986-2992(1974)에서 상세히 상술한 절차에 따라서 일반적으로 수행된다. 사용되는 모든 용매는 불활성 기체, 예컨대 헬륨 또는 질소로 살포함으로써 조심스럽게 탈포하여, 잔기의 황을 바람직하지 않게 산화시킬 수 있는 산소의 부재를 확실히 한다.
탈봉쇄는 바람직하게 다음의 목록 A의 따라서 수행한다 :
결합은 바람직하게 다음의 목록 B에서 상술된 바와 같이 수행한다 :
요컨대, 염화메틸렌 내의 1 내지 2mmol의 Boc -보호 아미노산을 수지 그람당 사용하고, 게다가 염화메틸렌내의 1.0몰 DCCI 1당량을 2시간동안 사용한다. BOC-Arg(Tos)가 결합될 때, 50% DMF 및 염화메틸렌의 혼합물이 사용된다. Bzl에테르가 Ser 및 Thr의 히드록시 측쇄 보호기로서 사용된다. Asn 또는 Gln의 아미도기는 Xan에 의해 보호될 수 있으나, 그것은 바람직하게 DCCI 1당량 및 HOBt 2당량 존재 하에서 결합된다. 2-클로로-벤질옥시카르보닐(2Cl-Z)은 Lys 측쇄의 보호기로서 사용된다. Tos는 사용되어 Arg의 구 아니도기 및 His 의 이미다졸 질소를 보호하고, Glu 또는 Asp 측쇄 카르복시기는 OBzl로 보호된다. Tyr의 페놀 히드록시기는 2, 6-디클로로벤질(DCB)로 보호한다. 합성의 끝에서, 다음 조성물을 얻는다 :
이때 X2는 DCB, X3는 OBzl, X4는 Bzl, X6는 Tos, X7은 2Cl-Z 및 X9는 NH-MBHA-수지 지지체이다.
보호 펩티드-수지를 절단하고 탈보호가기 위하여, 펩티드-수지 그람당 아니솔 1.5ml, 메틸에틸설파이드 0.5ml 및 플루오르화수소(HF)15ml로 -20℃에서 30분동안 및 0℃에서 30분동안 처리한다. 높은 감압 하에서 HF의 제거 후, 수지-펩티드 잔류물을 건조 디에틸에테르 및 클로로포름으로 교대로 세척한 다음, 펩티드를 탈포된 2N 수성 아세트산으로 추출하고 여과에 의해 수지로부터 분리하고, 동결 건조시킨다.
그런다음 절단되고, 탈보호되고 동결건조된 펩티드를 리비에 일동, 펩티드 : 구조 및 생물학적 기능, (1979) pp 125-8 및 마아키 일동, J. Am. Chem. Soc. 103, 3178(1981)에서 설명된 바와 같이 제조용 또는 반제조용 HPLC에 의해 정제한다. Water Associates 프레프 LC-500에 맞는 카트리지를 Vydac(300A)으로부터의 15-20<C18실리카로 채운다. 트리에틸암모늄 포스페이트(TEAP)내의 CH3CN 기울기는 리비에, 제이., J. Liq. Chroamatography 1, 343-367(1978)에서 설명한 바와 같이 저압 엘덱스(Eldex) 기울기 표지에 의해 발생된다. 크로마토그래피 획분을 HPLC에 의해 조심스럽게 검사하고, 실질적인 순도를 나타내는 획분만을 모은다. 순도에 관해 독립적으로 조사된, 정제된 획분의 탈염은 0.1% TFA내의 CH3CN 기울기를 사용하여 달성한다. 그런다음 중앙 절단부를 동결건조하여 원하는 펩티드를 산출하며, 이것의 순도를 측정하여 약 95%이상임을 밝힌다. 순도는 질량 분광광도계(MS)및 모세띠 전기이동법에 의해 부가적으로 확인된다.
정제된 펩티드의 광회전은 퍼킨-엘머 편광계를 사용하여 측정하고 [α]D=-61±1(c=1, 1% 아세트산) 임을 밝힌다.
[실시예 2]
식(서열 정체 번호 : 4):
(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29잔기의 아미노화 펩티드[Ala16, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 MBHA수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세 띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
정제된 펩티드의 광회전은 퍼킨-엘머 편광계를 사용하여 측정하고 [α]D=-66°±1(C=1, 1% 아세트 산)임을 밝힌다.
[실시예 3]
식(서열 정체 번호 : 5) :
(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29잔기의 아미노화 펩티드 [Ala24, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이, 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 MBHA수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세 띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
정제된 펩티드의 광회전은 퍼킨-엘머 편광계를 사용하여 측정하고 [α]D=-67°±1(C=1, 1% 아세트 산)임을 밝힌다.
[실시예 4]
(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29 잔기의 아미노화 펩티드 [Ala25, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이, 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 MBHA수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세 띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
정제된 펩티드의 광회전은 퍼킨-엘머 편광계를 사용하여 측정하고 [α]D=-64°±1(C=1, 1% 아세트 산)임을 밝힌다.
[실시예 5]
(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29잔기의 아미노화 펩티드[Ala8, 16, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이, 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 MBHA 수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세 띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
[실시예 6]
식(서열정체 번호 : 8) :
(이때 N-말단은 N-메틸로 치환되고, Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29잔기의 아미노화 펩티드 [NCH3Tyr1, Ala8, 9, 15, 22, 28, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이, 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 MBHA수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세 띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
정제된 펩티드의 광회전은 퍼킨-엘머 편광계를 사용하여 측정하고 [α]D=-57°±1(C=1, 1% 아세트 산)임을 밝힌다.
[실시예 7]
식(서열정체 번호 : 9) :
(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29잔기의 아미노화 펩티드 [Ala8, 25, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이, 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 MBHA수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세 띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
[실시예 8]
식(서열정체 번호 : 10) :
(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29 잔기의 아미노화 펩티드 [Ala8, 16, 24, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이 베그만 990펩티드 합성기를 사용하여 MBHA 수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
[실시예 9]
[실시예 10]
식(서열정체 번호 : 12) :
(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29 잔기의 아미노화 펩티드[Ala8,16, 24, 25, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 MBHA수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세 띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
[실시예 11]
(이때 Xaa는 Nle이고 C-말단은 아미노화됨)을 갖는 29 잔기의 아미노화 펩티드[Ala16, 24, 25, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 일반적으로 실시예 1에서와 같이 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 MBHA수지 상에서 단계적인 방법으로 수행한다. 펩티드는 MS, HPLC 및 모세 띠 전기이동법을 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판정한다.
[실시예 12]
4°잔기의 아미노화 펩티드 [CαMeHis1, D-NMA2, Ala8, CML27]-hGRF(1-40)-NH2의 합성은 일반적으로 배일 일동, 미합중국 특허 제4, 292, 313호에서 설명한 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 13]
[D-NMA2, Aib16, CML27]-rGRF(1-43)-OH의 합성은 Chemistry Letters, 상기 참조에서 설명된 바와같이 초기 결합을 가진 클로로메틸화 수지를 사용하여, 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로, 및 이후에 일반적으로 실시예 1에서 설명한 방법으로 수행한다.
[실시예 14]
hGRF 유사체[NMeTyr1, Lys8, Ala15, 24, CML27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 15]
hGRF 유사체[NMeTyr1, Ala16,D-Lys21,CML27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 16]
[NMeTyr1, D-NMA2, Aib8, D-Arg21, CML27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 17]
[NMeHis1, Ala8, CαMe-D-Tyr10, D-Lys21, CML27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 18]
[D-NMA2, CML5, D-Lys21, Ala25, Nva27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 19]
[D-Phe1, D-NMA2, Glu8, CαMeTyr10, Ile13, Ala16, CML22]-hGRF(1-32)-NHCH2CH3의 합성은 실시예 1에서 설명된 바와 동일한 일반적인 절차를 사용하나 콘레이흐 일동의 미합중국 특허 제 4, 569, 967호에서 일반적으로 설명된 바와 같이 N-에틸 아미노 메틸 수지를 사용하여 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 20]
[pCl-Phe1, D-NMA2, CMA19, Val22, Aib25, Ile27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서 일반적으로 설명된 방법으로 MBHA수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 21]
[CML1, D-NMA2, D-Asp3, Lys8, Ala16, CMA22]-hGRF(1-32)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 22]
[D-Tyr1, D-NMA2, D-Asp3, CαMe-D-Tyr10, Ala15, 24, D-Arg21, CML22, D-Met27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 23]
[D-His1, D-NMA2, Ala8, 27, CML13]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서 일반적으로 설명된 방법으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 24]
rGRF 유사체 단편, 즉, [NMeTyr1, D-NMA2, Glu8, CMA13, Aib16, D-Arg21, CαMeIle22]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 25]
[CML1, D-NMA2, Leu13, Ala16, 27, CMA19, 22]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 26]
[CαMePle1, NMA2, Lys8, Arg12, Ile13, 27, CMA19, Ala24]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 배일 일동의 미합중국 특허 제 4, 292, 313호에서 일반적으로 설명한바와 같이 MBHA수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 27]
[데스아미노 D-Tyr1, D-NMA2, Aib8, Phe10, CαMeVal13, Leu27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 배일 일동의 미합중국 특허 제 4, 292, 313호에서 일반적으로 설명한 바와 같이 MBHA수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 28]
[D-NMA2, CαMeTyr10, Ca MeVal13, Ala16, CML22, Nle27, Asn28]-HGRF(1-29)-NH2의 합성은 배일 일동의 미합중국 특허 제4,292,313호에서 일반적으로 설명한 바와 같이 MBHA수지 상에서 벡크만990펩트디 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 29]
[CαMePhe1, D-NMA2, Ala8, CαMeTyr10, CαMeIle13, Val27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 30]
[데스아미노 D-Met1, D-NMA2, CαMeTyr10, CαMeVdl13, CMA19, Ala24, Asn28]-hGRF(1-44)-NH2의 합성은 배일 일동의 미합중국 특허 제 4, 292, 313호에서 일반적으로 설명한 바와 같이 MBHA수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 31]
[NMeHis1,D-NMA2, Aib8, CαMeVal13, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 배일일동의 미합중국 특허 제 4, 292, 313호에서 일반적으로 설명한바와같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 32]
[NMeTyr1, Ala15, 16, CML26, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 33]
[NMeTyr1, Ala8, 15, 28, CML23, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 34]
[NMeTyr1, CML13, Ala15, 24, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 35]
[NMeTyr1, Ala9, 15, Aib25, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 36]
[NMeTyr1, Ala15, 16,CML17, Nle27, Aib28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 37]
[NMeTyr1, Ala8, 15, CML22, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 38]
[NMeTyr1, Aib8, 9, 13, Ala15, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 39]
[NMeTyr1, CML5, Ala15, 16, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 40]
[NMeTyr1, Ala8, 15, 16, 24, 25, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 41]
[NMeTyr1, Ala8, 15, 16, 24, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 42]
[NMeTyr1, Ala8, 15, 16, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
성장 호르몬의 방출을 촉진하는 합성펩티드의 상대적 유효성을 결정하기 위하여, 생체외 분석은 표준물로서 합성 hpGRF(1-40)-OH를 사용하여 등몰 농도의 합성된 대표적인 유사체와 나란히 비교하여 수행한다. 약 3 내지 5일 이전에 제거된 쥐의 뇌하수체 세포를 포함하는 배양물을 사용한다. 상기 배양물은 성장호르몬의 분비에 최적인 것으로 간주되며 배일 일동의 Endocrinology, 91, 562, 572(1972)에서 설명된 일반적인 방법으로 및 배일 일동의 Endocrinology, 112, 1553-1555(1983)에서 보다 구체적으로 설명된 바와 같이 비교시험을 위해 사용한다. 시험할 물질과의 배양은 3 내지 4시간동안 수행하고, 세포배지의 부분표본을 제거하고 처리하여 잘 특성결정된 방사면역분석법에 의해 면역반응성 GH(ir GH)에서 그들의 함량을 측정한다.
실시예에서 제조된 합성 펩티드를 생체외 분석으로 합성 hpGRF(1-40)-OH와 비교할 수 있다. 전부 GH 분비 및 유사한 고유활동도에 관해 일반적으로 보다 큰 효능을 나타내는 것으로 간주된다. 이들 합성펩티드 전부는 생물학적으로 활성이 있고 뇌하수체에 의한 GH의 방출을 자극하는 데 잠재적으로 유용한 것으로 간주된다.
이들 펩티드 중 몇몇의 등몰 농도에 관한 상기 비교시험의 결과는 표 I에 나타낸다.
[표 I]
성장호르몬 분비에 관한 생체외 시험뿐 아니라, 생체내 실험은 합성펩티드를 우레탄 마취된 수컷 쥐에 정맥에 주사하고 그들이 외래성 GRF에 대한 반응을 페지함없이 자연적인 GH분비를 억제함을 결정한다. 혈액시료를 주사직전, 및 주사 후 10분, 30분 및 60분에 취하고, 혈액내 GH수준은 방사면역분석에 의해 측정한다. 이들 합성펩티드의 이 생체내 시험은 각각이 hpGRF(1-40)-OH에 의해 나타난 것보다 큰 생물학적 효능을 가지며 실질적으로 보다 긴 유효성 지속기간을 가짐을 나타내며, 이 유효성 지속기간은 IV 주사후 30 및 60 둘다에서 측정 할때 혈액의 뇌하수체 GH량으로 나타난다. GH의 분비를 검출하는데 효과적인 것으로 알려진 다른 알려진 GRF생체내 시험을 사용하여 이들 결과를 확인한다. 체중 kg당 이들 펩티드 약 500ng 내지 약 50㎍의 투약량이 GH분비를 일으키는데 효과적인 것으로 간주된다.
상기 합성 hGRF유사체 및 아마도 rGRF유사체는 의사가 GH생성을 상승시키기 원하는 사람 사용에 유용한 것으로 간주된다. 상기 유사체에 의한 GH분비의 자극은 내인성 GRF의 저생산에 의해 생기는 완전 또는 상대적인 GH 결핍을 갖는 환자에게 중요하다. 더욱이, 증가된 GH 분비 및 그의 수반되는 성장의 증가가 정상 GH 수준을 갖는 사람 또는 동물에서 얻을 수 있을 것 같다. 더욱이, 투여는 체내의 지방함량을 변경시키고 다른 GH의존적 대사, 면역학적 및 발육과정을 변형시킬 것이다. 예컨대, 이들 유사체는 화상 발생 후와 같은 상황하의 사람에 있어서 동화공정을 자극하는 수단으로서 유용할 수 있다. 다른 예로서, 이들 유사체는 닭, 칠면조, 돼지, 염소, 소 및 양과 같은 상업적 온혈동물에게 투여될 수 있고, 어류 및 다른 냉혈 해양동물, 예컨데 바다 거북 및 뱀장어, 및 양서류를 사육하기 위한 양식에서 사용되어, 성장을 촉진시키고 유효량의 펩티드를 섭취시킴으로써 얻어지는 단백질 대 지방의 비율을 증가시킬 수 있다.
사람에게 투여할 경우, 이들 합성펩티드는 적어도 약 93% 및 바람직하게는 적어도 98%의 순도를 가져야한다. 이 사용 목적을 위한 순도는 언급한 중량%의 존재하는 모든 펩티드 및 펩티드 단편을 구성하는 의도된 펩티드를 말한다. 성장을 촉진하고 지방함량을 감소시키기 위하여 상업적인 및 다른 동물에게 상기 합성펩티드의 투여의 경우, 더 낮은 순도가 허용가능 할 수 있다.
제약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 운반체와 합하여 약제 조성물을 형성하는 이들 합성펩티드 또는 그의 무독성염은 사람을 포함하는 동물에게, 정맥내, 피하로, 근육내, 피부관통으로, 예컨대 비내 또는 심지어 경구적으로 투여될 수 있다.
투여는 의사에 의해 사용되어 처리되는 숙주가 상기 치료 처치를 필요로 하는 GH의 방출을 자극할 수 있다. 피룡한 투약량은 처리되는 특별한상태에 따라, 상태의 심각성에 따라 및 원하는 처리 지속기간에 따라 달라질 것이다.
상기 펩티드는 종종 산 부가염 또는 예컨데 아연, 철 등(이 사용 목적을 위한 염으로 간주됨)과의 금속 착체와 같은 무독성염 형태로 투여된다. 상기 간부 가염의 예는 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트산염, 구연산염, 숙신산염, 능금산염, 아스코르브산염, 주석산염등이다. 활성성분이 정제 형태로 경구 투여되면, 정제는 형태로 경구 투여되면, 정제는 트라가칸트, 옥수수 전분 또는 젤라틴같은 결합제 ; 알긴산 같은 붕해제 ; 및 스테아린산 마그네슘 같은 윤활제를 함유할 수 있다. 액체 형태의 투여가 바람직하면, 감미 및/또는 풍미가 사용될 수 있고 등장염수, 인산염 완충용액등 내의 정맥내 투여가 수행될 수 있다.
의사의 지시 하에 펩티드가 사람에게 투여되어야 하며, 약제조성물은 보통 통상의 고체 또는 액체, 제약학적으로 허용가능한 운반체와 함께 펩티드를 함유할 것이다. 보통, 비경구 투약략은 숙주 체중 kg당 펩티드 약 0.01 내지 약 1㎍ 일 것이다.
또한 연장된 기간, 예컨대 1회 투여로부터 1주 내지 1년의 기간 동안 상기 펩티드를 방출하는 것이 바람직할 수 있고, 서방출, 데포우 또는 이식제 투약형태가 사용될 수 있다. 예컨대, 투약형태는 체액에서 낮은 용해도를 갖는 제약학적으로 허용가능한 상기 화합물의 무독성염, 예컨대, 다염기산과의 산부 가염, 다가 금속양이온과의 염 ; 또는 두 염의 조합물을 함유 할 수 있다. 또한 비교적 불응성인 염은 겔, 예컨대 스테아린산 알루미늄 겔에 배합될 수 있다.
또한 주사를 위한 적당한 서방출 데포우 배합물은 예컨대, 미합중국 특허 제 3, 773, 919호에서 설명한 바와 같이, 폴리유산/폴리글리콜산 중합체와 같은 서분해, 무독성 또는 비항원성 중합체에 분산되거나 봉입된 펩티드 또는 그의 염을 함유할 수 있다.
이들 화합물은 또한 실라스틱 이식제로 배합될 수 있다.
또한 메이어, 비이. 알. 일동, Clin. Pharm. & Therapeutics, 44, 6, 607-612(1988)에서 보고된 바와같이, 전류를 사용하여 연장된 기간동안 펩티드를 사람에게 피부간 투여하는 것이 가능하다. 예컨대, 9볼트 전지를 사용하여 약 0.2밀리암페어 전류를 사람피부에 연속적으로 적용하여 펩티드를 표피를 통해 혈류로 효과적으로 운반하는 피부간 패치를 사용할 수 있다.
본 발명은 본 발명자들에게 알려진 현재의 가장 우수한 방식을 구성하는 적절한 구체예에 관하여 설명했지만, 당 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람에게 명백한 바와같은 여러가지 변화 및 변형이 여기에 첨부되는 청구범위에서 상술된 본 발명의 범위를 벗어남없이 수행될 수 있음을 이해해야 한다. 예컨대, 펩티드 사슬의 변형, 구체적으로 펩티드의 카르복시 말단에서 시작하여 약 위치 29까지 연장되는 결실이 지금까지 알려진 실험실행에 따라 수행되어 전부 또는 매우 실질적인 분량의 생물학적 효능의 펩티드를 보유하는 펩티드 또는 펩티드 단편을 생성할 수 있고, 상기 펩티드는 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주된다. 더욱이, 참가는 한쪽 말단에, 또는 양쪽 말단에 대해 수행될 수 있고 /또는 일반적으로 동등한 잔기가 펩티드 화학의 전체 분야에서 잘 알려진 바와같이, 천연적으로 존재하는 잔기대신 치환되어, 본 발명의 범위를 벗어남없이 청구되는 폴리펩티드 효능의 적어도 실질적인 분량을 갖는 다른 유사체를 생성할 수 있다. 더욱이, 오늘날 이 분야의 상태에 따라서 C-말단에서 적절한 -NH2기로 변형이 수행될 수 있다. 예컨대 C-말단에서 아미노산 잔기의 카르복시 성분은 -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') 또는 -CH2OR 기일 수 있고, R 및 R'은 저급 알킬, 플루오로 저급알킬 또는 수소이고, 본 발명을 벗어남없이, 상기 변형은 동등한 합성 펩티드를 결과시킨다.
본 발명의 여러가지 특징은 다음의 청구범위에서 강조된다.
서열 일람표
(1) 일반적인 정보 ;
(i) 출원인 : 진 이이 에프 리비어, 위리 다블유 배일 쥬니어
(ii) 발명의 명칭 : GRF 유사체 XI
(iii) 서열의 수 : 16
(iv) 통신 주소 :
(A) 수신인 : 피치, 에븐, 레빈 및 플라네리
(B) 스트리이트 : 수우트 900, 사우스 라살레 스트리이트 135
(C) 시 : 시카고
(D) 주 : 일리노이
(E) 국 : 미합중국
(F) 우편번호 : 60603
(v) 컴퓨터 판독 가능 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : 호환성 IBM PC
(C) 오퍼레이팅 시스템 : PC-DCS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, 버젼 # 1.25
(vi) 현재의 출원 자료 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(vii) 종래의 출원 자료 :
(A) 출원 번호 : US 07/701,414
(B) 출원일 : 1991-5-15
(viii) 변호사/대리인 정보 :
(A) 성명 : 제임스 제이 슈만
(B) 등록 번호 : 20,856
(C) 참고/사건 번호 : 51337PCT
(ix) 원거리 전기통신 정보 :
(A) 전화 : 619-552-1311
(B) 팩시밀리 : 619-552-0095
(C) 텔렉스 : 20 6566 PATIAW CGO
(2) 서열 정체 번호 : 1에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 44 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열 정체 번호:1 :
(2) 서열 정체 번호 : 2에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 43 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열 정체 번호 : 2 :
(2) 서열 정체 번호 : 3에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열 정체 번호 : 3 :
(2) 서열 정체 번호 : 4에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열 정체 번호 : 4 :
(2) 서열 정체 번호 : 5에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 5 :
(2) 서열정체 번호 : 6에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 6 :
(2) 서열정체 번호 : 7에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 7 :
(2) 서열 정체 번호 : 8에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 8 :
(2) 서열 정체 번호 : 9에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 9 :
(2) 서열 정체 번호 : 10에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 10 :
(2) 서열 정체 번호 : 11에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 11 :
(2) 서열 정체 번호 : 12에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 12 :
(2) 서열 정체 번호 : 13에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 13 :
(2) 서열 정체 번호 : 14에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 44 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 14 :
(2) 서열 정체 번호 : 15에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 15 :
(2) 서열 정체 번호 : 16에 관한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : 펩티드
(xi) 서열 설명 : 서열정체 번호 : 16 :
Claims (4)
- 하기 서열을 갖는 합성 펩티드 또는 그의 무독성염;(B)R1-R2-R3-Ala-R5-Phe-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-Leu-R15-R16-Leu-R18-Ala-Arg-R21-R22-Leu-R24-R25-R26-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44이 때, R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His이고; B는 H, CαMe, NαMe, 데사미노, Ac 또는 For이고; R2는 Ala, D-Ala, NMA 또는 D-NMA이고; R3는 Asp 또는 D-Asp이고; R5는 Ile 또는 Leu이고; R8는 Ala, Aib, Ser 또는 Asn이고; R9는 Ser, Ala 또는 Aib이고; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe이고; R12는 Arg 또는 Lys이고; R13는 Ile, Val, Leu 또는 Ala이고; R15는 Gly 또는 Ala이고; R16은 Ala, Aib 또는 Gln이고; R18은 Ser 또는 Tyr이고; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg이고; R22는 Leu, Ile, Ala, Aib 또는 Val이고; R24는 Ala, Aib, Gln 또는 His이고; R25는 Ala, Aib, Asp 또는 Glu이고; R26은 Ile 또는 Leu이고; R27은 Nle, Met, D-Met, Ala, Ile, Leu, Nva 또는 Val이고; R28는 Asn, Ala, Aib 또는 Ser이고; R34는 Ser 또는 Arg이고; R38은 Arg 또는 Gln이고; R39는 Gly 또는 Arg이고; R40은 Ala 또는 Ser이고; R42는 Phe, Ala 또는 Val이고; R43은 Asn 또는 Arg이고; R44는 ;Leu 또는 다른 L-이성체 천연 아미노산이나, 단 Ala 또는 Aib는 하나 이상의 R8, R16,R24및 R25에 존재하고; 또한, 상기 서열은 15개 이하의 잔기가 C-말단에서 결실될 수 있다.
- 제1항에 있어서, 하기 식을 갖는 합성 펩티드 또는 그의 무독성염; (B)R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-R15-R16-Leu-Ser-Ala-Arg-R21-Leu-Leu-R24-R25-Ile-Nle-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Y이 때, R1은 Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, His 또는 D-His이고; B는 H, CαMe 또는 NαMe이고; R8은 Ala, Aib 또는 Asn이고; R21은 Lys 또는 Arg이고; R24는 Ala, Aib 또는 Gln이고; R25는 Ala, Aib 또는 Asp이고; R28은 Asn 또는 Ser이고; Y는 R이 H 또는 저급 알킬인 NHR이나, 단 Gly, Gln-Gly 또는 Gln-Gln-Gly가 C-말단에서 결실될 수 있다.
- 제2항에 있어서, 하기 식을 갖는 합성 펩티드 또는 그의 무독성염; (B)R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-R15-R16-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-Nle-R28-Arg-Y이 때, R1은 Tyr 또는 D-Tyr이고, B는 H 또는 NαMe이다.
- 제1항에 있어서, 하기 식 중 어느 하나를 갖는 합성 펩티드 또는 그의 무독성염;[NCH3Tyr1, Ala8, 9, 15, 22, 28, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2;[Ala8, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2;[Ala8, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2;[Ala8, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2; 및[Ala8, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2;
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