KR900006713B1 - Grf 유사체 펩티드의 제법 - Google Patents

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KR900006713B1 KR1019840000097A KR840000097A KR900006713B1 KR 900006713 B1 KR900006713 B1 KR 900006713B1 KR 1019840000097 A KR1019840000097 A KR 1019840000097A KR 840000097 A KR840000097 A KR 840000097A KR 900006713 B1 KR900006713 B1 KR 900006713B1
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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
GRF 유사체 펩티드의 제법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 인간 및 기타동물 특히 포유동물에 뇌하수체선의 기능에 영향을 미치는 펩티드에 관한 것이다. 특히 본 발명은 뇌하수체선에 의한 성장호르몬 분비를 촉진시키는 펩티드에 관한 것이다.
생리학자들은 오래전부터 시상하부가 각 뇌하수체호르몬의 분비를 유발하는 특수 폴리펩티드를 생성함으로써 뇌하수체 전엽의 모든 분비 기능을 조절하는 것으로 생각해 왔다. 억제인자는 성장호르몬(GH)의 분비를 억제하는 것으로 소마토스타틴(somatostatin)이라 불리운다.
상응하는 시상하부성 뇌하수체 방출인자가 근래 인간 췌장암으로부터 추출된 추출물로부터 단리되어, 정제, 확인, 합성 및 시험되었다. 이 펩티드의 서열은 다음과 같다.
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu. 이 펩티드 아미드 형태를 이후 hpGRF로 약칭 한다.
(인간 췌장암 GH 방출인자)
이제 쥐의 시상하부 추출물로부터 폴리펩티드가 단리되고 정제되고 확인되고 합성되었으며 이것이 배양된 뇌하수체 세포로부터 GH를 방출시키는가 검사하였다. 이 43-잔기 천연산 펩티드의 서열은 다음과 같다.
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Mer-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Glu-Gln-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH. 이 펩티드를 이후 rhGRF로 약칭한다.
(쥐 시상하부 GH 방출인자)
이제 몇몇 hpGRF 유사체가 합성되었으며 검사결과 이들중 몇몇은 hpGRF 자체보다 더 역가가 높았으며 이들 유사체중 많은 것들이 길이가 더 짧았다. 이를 유사체중 몇몇은 rhGRF 구조와 일치하는 치환을 기본으로 한 것이며 반면 다른 것들은 다른 치환을 기본으로 한 것이다. 본 발명에 따른 약제 조성물은 이들hpGRF 유사체들 또는 그의 무독성염이 제약상 허용되는 액체나 고체담체에 분산되어 있는 것을 포함한다. 이런 약제 조성물은 인간 및 동물의 임상약제로 사용될 수 있으며 치료목적이나 진단 목적으로 투여된다. 또한 이들은 가금을 포함한 온혈동물의 성장을 촉진시키고 냉혈동물 예컨대 물고기, 뱀장어등을 기르는데 사용될 수 있다.
펩티드를 정의하는데 사용된 명명법은 문헌 "펩티드(Schroder ＆ Lubke, "The Peptides", Academic Press(1965))에 준하여 통상적인 명명법에 따라 N-말단의 아미노기를 왼쪽에 C-말단의 카복실기를 오른쪽에 나타냈다. 천연 아미노산이란 단백질 중에서 발전된 통상적인 천연적으로 생기는 아미노산을 의미하는 것으로 Gly, Ala, Val,
Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His 등이 있다. 아미노산 잔기가 이성체를 가질 경우 따로 언급하지 않은한 L-아미노산을 나타낸다. 본 발명에서는 rhGRF를 hpGRF의 유사체로 간주한다.
본 발명은 하기 구조식의 합성 hpGRF 펩티드 유사체 또는 그의 무독성염을 제공한다:
H-R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44-Y.
여기서 R1은 Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His 또는 His이며 , R8은 Ser 또는 Asn이며 , R10은 Tyr, Phe 또는 D-Tyr이며 : R12는 Arg 또는 Lys이며 , R13은 Ile 또는 Va1이며 , R15는 Gly 또는 D-Ala이며 : R18은 Tyr 또는 Ser이며 : R24는 His 또는 Gln이며 , R25는 Glu 또는 Asp이며, R27은 D-및 L-이성체 형태의 Ala, Nle, Ile, Leu, Met 및 Val으로 구성된 군으로부터 선택되며 : R28은 Ser, Asn 또는 D-Ala이며 , R34는 Arg 또는 Ser이며 , R38은 Gln 또는 Arg이며 , R39는 Arg 또는 Gly이며 ; R40은 Ser 또는 Ala이며 ; R42는 Phe 또는 Ala이며 ; R43은 Asn 또는 Arg이며 ; R44는 천연아미노산 또는 des-R44이며 ; Y는 C-말단에 있는 아미노산 잔기의 카복실 부분을 나타내며 라디칼-COOR,-CRO,-CONHNHR,-CON(R)(R') 또는-CH2OR이며(여기서 R과 R'는 저급 알킬, 플루오로저급알킬 또는 수소임); 그러나 단 R1이 Tyr인 경우 R27은 Met이외의 것이며, R8은 Ser, R12는 Arg, R13은 Ile, R18은 Tyr, R24는 His, R25는 Glu, R28은 Asn, R34는 Arg, R38은 Gln, R39는 Arg, R40은 Ser, R42는 Phe 또는 R43은 Asn인 것이 적어도 하나가 존재하며 ; 또한 잔기 28-44 모두가 또는 일부가 탈락된 생물학적으로 활성인 분절을 얻을 수도 있다. 메틸, 에틸 및 프로필이 바람직한 저급 알킬기이다.
앞서 언급한 펩티드 분절 또한 생물학적 역가를 가지며 일반적으로 펩티드는 N-말단으로부터 적어도 잔기-27까지는 연결되어야 하는 것으로 생각된다. 펩티드 분절이 오직 잔기 27 및 28까지만 연결된 경우 Y는 NH2이거나 치환된 아미드여야 하며 분절이 잔기 29-39까지 연장된 경우 Y는 아미드 또는 치환아미드인 것이 바람직하다.
27-위치에 있는 Met에 명명된 하나의 치환분을 갖고 있는 hpGRF 유사체는 특히 산화조건에 노출되었을때 실질적으로 더큰 안정성을 나타내며 치환체가 D-이성체인 경우 효소저항성이 더 증가될 수 있다. 이들은 생물학적으로 완전히 활성인 상태로 남아있으며 몇몇 유사체들은 시험관내 시험으로 검사시 놀라웁게도 역가가 증가된 것으로 나타났다. l-위치에 있는 His의 치환은 놀라웁게도 더 높은 역가를 제공해준다. 또한 D-이성체 아미노산 예컨대 D-Tyr의 치환에 의해 놀라운 양의 역가가 얻어지며 펩티드가 몇몇 효소에 의해 파괴되지 않게 해줌으로써 아주 가치가 있다.
펩티드류는 전체고상법 (so1id-phase technique}, 부분고상법, 분절축합법, 전통적 인 용액 커플링법, 또는 근래 개발된 재조합 DNA법과 같은 적당한 방법으로 합성된다. 예컨대 전체 고상합성법은 하기 교재(Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart ＆
Young, Freeman ＆ CO., San Francisco,1969)설명되어있으며 미국특허 번호 4,105,603(1978. 8. 8. 특허됨 Vale일행)에 예시설명되어 있다. 분절 축합법은 미국특허 번호 3,972,859(1976. 8. 3.)에 예시되어 있다. 기타 다른 합성법은 미국특허 번호.3,842,067(1974. 10. 14.)과 미국특허번호 3,862,925(1975. 1. 28. )에 예시되어 있다.
재조합 DNA법을 이용한 합성에서는 바라는 형태의 hpGRF 유사체 또는 그의 분절을 위해서 구조 유전자 암호를 적당히 사용해야 한다. 합성 hpGRF 펩티드는 프로모터 및 오퍼레이터를 포함한 발현(expresion)벡터를 구조유전자와 함께 사용하여 미생물을 형질전환시킨 후 이 형질전환원 미생물이 hPGRF 펩티드를 발현해 내게 함으로써 얻어질 수 있다. 또한 구조유전자 및 미국특허 번호 4,276,282,(1981. 6. 30.)에 기술된 일반적 방법을 사용하거나 또는 배자의 마이크로 인젝숀법(W0.83/01783, 1983.5. 26 WO 82/04443, 1982.12.23.)을 사용한 유전자 사육법으로 hPGRF 펩티드를 만드는데 인간이외의 동물이 사용될 수도 있다. 합성 hpGRF펩티드는 또한 두개의 WO공보에 설명된 방법으로 성장을 촉진시키고자 하는 동물내에 직접 생성시킬 수도 있다.
각종 아미노산 부분의 불안정한 측쇄기를 적당한 보호기로 보호하여 기가 궁극적으로 제거될때까지 그 위치에서 화학반응이 일어나는 것을 막아주는 것은 화학합성에 통상적인 것이다. 또한 카복실기에서 반응이 일어나는 동안 α-아미노산 또는 분절상의 α-아미노기를 보호한후 α-아미노보호기를 선택적으로 제거하여 그 부위에서 다음 반응이 일어나게 하는 것도 보편적인 것이다. 따라서 합성의 한 단계로서 적당한 잔기에 결합된 측쇄보호기를 가진 펩티드쇄중 바라는 서열에 위치한 아미노산 잔기들을 각기 포함하는 중간체화합물이 생성되는 것이 보통이다.
하기 구조식의 중간체를 또한 본 발명의 범위내인 것으로 간주된다 :
X1-R1(X 또는 X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-R8(X4또는 X5)-Ser(X4)-R10(X2)-Arg(X6)-R12(X6또는 X7)-R13-Leu-R15-Gln(X5)-Lal-R18(X2)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-R24(X 또는 X5)-R25(X3)-Ile-R27-R28(X4또는 X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4또는 X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X5또는 X6)-R39(X6)-R40(X4)-Arg(X6)-R42-R43(X5또는 X6)-R44(X8)-X9
여기서 X1은 수소 또는 α-아미노보호기이다.
X1으로 표시되는 α-아미노보호기는 폴리펩티드의 단계적 합성분야에 유용한 것으로 잘 알려진 것들이다 X1으로 사용될 수 있는 α-아미노 보호기 부류중에 (1) 방향족 우레탄-형태의 보호기 예컨대 플루오레닐메틸 옥시카보닐(FMOC) 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 Z 즉 p-클로로벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐 및 p-메톡시벤질옥시카보닐(2) 지방족 우레탄-형태의 보호기 예컨대 t-부틸옥시카보닐(BOC), 디이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐, 알릴옥시카보닐 및 (3) 사이클로알킬 우레탄 형태의 보호기 예컨대 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐 및 사이클로헥실옥시카보닐이 있다. 바람직한 α-아미노보호기는 BOC이다.
X는 수소 또는 His의 아미다졸 질소 보호기로 예컨대 Tos같은 것이다.
X2는 Tyr의 페놀성 하이드록실기의 적당한 보호기로서 예컨데 테트라하이드로피라닐, t-부틸, 트리틸, Bz1, CBz, 4Br-CBZ 및 2,6-디클로로벤질(DCB) 같은 것이다. 바람직한 보호기는 2,6-디클로로벤질이다. X2는 수소일 수 있으며 이것은 그 위치에 있는 아미노산 잔기상에 어떤 측쇄보호기도 없음을 의미한다.
X3는 수소 또는 Asp나 Glu의 카복실기의 적당한 에스테르-형성 보호기로서 예컨대 벤질(OBz1), 2,6-디클로로벤질, 메틸 및 에틸 같은 것이다.
X4는 Thr 또는 Ser의 하이드록실기의 적당한 보호기로서 예컨대 아세틸, 벤조일, t-부필, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, Bz1, 2,6-디클로로벤질 및 CBZ같은 것이다. 바람직한 보호기는 Bz1이다. X4는 수소일수 있으며 이것은 하이드록실기상에 어떤 보호기도 없음을 의미한다.
X5는 수소 또는 Asn이나 Gln의 측쇄아미도기의 적당한 보호기이다. 이것은 바람직하게는 크산틸(Xan)이다.
X6는 수소 또는 Arg의 구아니디노기의 적당한 보호기로서 예컨대 니트로, Tos, CBZ, 아다만틸옥시카보닐, 및 BOC같은 것이다.
X7은 수소 또는 Lys 측쇄아미노기의 적당한 보호기이다. 적당한 측쇄 아이노보호기는 예컨대 2-클로로벤질옥시카보닐(2-Cl-Z), Tos, t-아밀옥시카보닐 및 BOC이다.
X8은 수소 또는 앞서 언급한 적당한 측쇄 보호기이다. Met는 임의로 산소에 의해 보호될 수 있으나 보호되지 않은채 남아있는 것이 바람직하다.
측쇄 아미노 보호기의 선택은 이것이 합성중 아미노기의 탈보호중 제거되지 않는 것이 아닌한 한정적인것은 아니다. 그러나 몇몇 아미노산의 경우 예컨대 His의 경우 커플링이 완결된 후 보호는 필요치 않으며 보호기가 동일할 수 있다.
X9는 C-말단 카르복실기의 적당한 보호기 예컨대 에스테르 형성기 X3같은 것이나 또는 고상합성법의 경우 고형 수지 지지체에 결합되는데 사용되는 고정 결합이거나, 또는 앞서 언급한 바와 같이 C-말단에 잔기가 카복실 부분 즉 Y를 가지고 있는 경우 des-X9이다. 고형 수지 지지체가 사용되는 경우 이것은 하기구조식을 갖는 것과 같이 이 분야에 공지된 어떤 것도 될수 있다 :-O-CH2-수지 지지체,-NH-벤즈히드릴아민(BHA)수지 지지체 또는-NH-파라메틸벤즈 히드릴아민(BHA) 수지 지지체 또는-NH-파라메틸벤즈 히드릴아민(MBHA)수지 지지체. 비치환된 아미드가 바람직한 경우 BHA 또는 MBHA 수지를사용하는 것이 바람직하며 이것은 분해에 의해 직접 아미드를 생성하기 매문이다. N-메틸아미드가 바람직한 경우 이것은 N-메틸 BHA수지로부터 생성될 수 있다. 다른 치환된 아미드가 바람직한 경우나 또는 유리산이외의 다른기가 C-말단에 있는 것이 바람직한 경우 후벤-웨일 교재에 설명된 바와 같이 종래의 방법을 사용하여 펩티드를 합성하는 것이 바람직하다.
중간체들의 구조에서는 적어도 하나의 X-기가 보호기이며 또는 X9는 수지 지지체를 포함한다. 따라서 본 발명은 또한 (a) 적어도 하나의 보호기와 하기 구조식(II)를 갖는 펩티드를 형성한 후, X1-R1(X 또는X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-R8(X4또는 X5)-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-R12(X6또는 X7)-R13-Leu-Gly-Gln(X5)-Leu-R18(X2)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-R24(X 또는X5)-R(X3)-Ile-R27-R28(X4또는 X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4또는X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X5또는 X6)-R39(X6)-R40(X4)-Arg(X6)-R42-R43(X5또는X6)-R44(X8)-X9
여기서 X, Xl, X2, X3, X4, X5, X6, X7및 X8은 각기 수소 또는 보호기이며 X9는 보호기 또는 수지 지지체에 대한 고정 결합이거나 des-X9(이때는 C-말단에 있는 잔기가 카복시 Y를 갖고 있다)이다 : (b) 상기 구조식(II)의 펩티드로부터 보호기, 기들, 또는 고정결합을 제거한후 : (c) 소망에 따라 결과 생성된 펩티드를 그의 무독성염으로 전환시켜 관심의 대상이 되는 펩티드를 제조하는 방법도 제공한다.
펩티드 합성에 사용되는 특수 측쇄 보호기를 선택하는데 있어 하기 규정을 따른다 : (a) 보호기는 그의 보호성질이 남아 있어야 하며 커플링 조건하에서 떨어져 나가서는 안된다.
(b) 보호기는 시약에 안정해야 하며 Xan의 경우를 제외하곤 합성각 단계에서 α-아미노보호기를 제거하기 위해 선택된 반응 조건하에서 안정해야 한다.
(c) 측쇄보호기는 바라는 아미노산 서열을 함유하는 합성이 완결된 후 펩티드쇄를 변경시키지 않는 반응 조건하에서 제거될 수 있어야 한다.
펩티드가 제조합 DNA 법으로 제조되지 않는 경우 문헌(Mettifield, J. Am. Chem. Soc., 85, p2149(1963))에 설명된 바와 같은 고상합성법을 사용하여 제조하는 것이 바람직하며 물론 이 분야에 공지된 다른 상응하는 화학합성법도 미리 언급한 바와 같이 사용될 수 있다. 고상 합성은 보호된 α-아미노산을 적당한 수지에 커플링시킴으로써 펩티드의 C-말단으로부터 시작된다. 이런 출발물질은 α-아미노보호아미노산을 에스테르 결합으로 클로로메필화수지 또는 하이드로시메틸수지에 결합시키거나 또는 아미드결합으로 BHA수지 또는 MBHA수지에 결합시켜 제조할 수 있다. 메틸, 에틸 또는 프로필아미드가 결과 생성된 폴리팝티드에 들어 있는 경우 클로로에틸화수지 또는 하이드록시메틸수지가 사용되며 분해는 적당한 아민 예컨대 에틸아민을 사용하여 적당히 수행된다.
예컨대 40-잔기 펩티드를 제조하는데 있어 BOC에 의해 보호된 Ala을 모나한과 길론의 방법(Biopolymer 12, pp 2513-19,1973)에 따라 클로로에틸화 수지에 커플링시킨다. BOC-Ala을 수지 지지체에 커플링시킨후 α-아미노보호기는 트리플루오로아세트산(TFA)를 염화베틸렌중에서 사용하거나 또는TFA 단독으로 또는 HC1을 디옥산중에서 사용하여 제거한다. 탈보호는 실온-0℃에서 수행퇸다. 특수 α-아미노보호기를 제거하기 위한 기타 표준분해 시약과 조건들은 "펩티드"(Schroder＆Lubke,1 pp 72-75(Academic Press 1965))에 설명된 것과 같이 사용될 수 있다.
Phe의 α-아미노보호기를 제거한 후 남은 α-아미노 및 측쇄-보호 아미노산을 바라는 순서로 단계적으로 커플링하여 앞서 정의한 바와 같은 중간체 화합물을 얻거나 또는 각 아미노산을 따로 합성중 첨가하는대신 이들중 몇몇은 고상 반응기에 첨가하기전에 미리 서로 커플링시킬 수 있다. 적당한 커플링 시약은 N'-N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCCI)이다.
펩티드의 고상합성에 사용되는 활성화 시약은 펩티드화학분야에 공지되어 있다. 적당한 활성화 시약의 예는 N, N'-디이소프로필 카보디이미드 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이이드와 같은 카보디이미드이다. 기타 활성화 시약 및 펩티드 커플링에서의 그들의 사용은 문헌에 설명되어 있다.(Schroder ＆ Lubke의 상기저서, Chapter III 및 Kapoor의, J.Phar.S ci., 59, pp l-27(1970)).
각 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 4배 또는 그 이상 과량 고상반응기에 도입시키며 커플링은디메틸포름아미드(DMF) : CH2C12(1:1) 또는 DMF중에서 또는 CH2C12단일 매체중에서 수행될 수 있다. 불완전 커플링이 일어난 경우 다음 아미노산을 거플링 하기에 앞서 α-아미노보호기를 제거하기 전에 커플링 과정을 반복한다. 합성 각 단계에서의 커플링 반응의 성공 여부는 닌히드린 반응으로 확인한다(E. Kaiser 일행., Anal. Biochem.34,595(1970)). 커플링 반응은 리비에 등에 의해 보고된 바와 같은 프로그램을 사용하여 벡크만 990 자동합성장치 상에서 자동적으로 일어날 수 91다.(Biopolymers,1978.17, pp 1927-l938).
바라는 아이노산 서열이 이루어진후 수지로부터 펩티드를 분해할 뿐 아니라 남은 모든 측쇄 보호기들 X, X2. X3, X4, X5, X6, X7및 X8과 고정결합 X9및 α-아미노보호기 X1을 분해하는 액체 불화수소와 같은 시약으로 처리하여 중간체 펩티드를 수지 지지체로부디 제거하여 유리산 형태의 펩티드를 얻을 수 있다. 서열내 Met가 존재하는 경우 잠재적 S-알킬화 가능성을 막기 위해 HF를 사용하여 수지로부터 펩티드를 분해시키기에 앞서 BOC 보호기를 우선 트리플루오로아세트산(TFA)/에탄디올을 사용하여 제거하는 것이 바람직하다. 분해시약으로 불화수소를 사용하는 경우 아니솔, 메틸에틸 설파이드를 스캐빈져 반응로에 포함시킨다.
재조합 DNA법을 사용하여 합성 펩티드를 제조하는데 있어 Met 잔기는 N-말단에 첨가된 또 다른 잔기로서 포함되어 있는 것이 바람직하며 Met는 펩티드중 그밖의 다른 곳에 존재해서는 안된다. 유사하게 펩티드에 사용되는 모든 잔기들은 천연산 L-이성체 아미노산이거나 Gly이어야 한다. 그 결과 바람직한 펩티드중간체 조성물은 하기 구조식을 갖는 것이다 :
H-Met-R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Try-Arg-R12-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39- R40-Arg-R42-R43-R44-Y
여기서 Rl은 Tyr, Leu 또는 His이며 , R8은 Ser 또는 Asn이며 ; R12는 Arg 또는 Lys이며 , R13은 Ile또는 Va1이며 , R18은 Tyr 또는 Ser이며 , R24는 His 또는 Gln이며 , R25는 Glu 또는 Asp이며; R27은Ala, Nle,Ile,Leu 또는 Va1이며: R28은 Asn 또는 Ser이며 ; R34는 Arg 또는 Ser이며 ; R38은 Gln 또는 Arg이며: R39는 Arg 또는 Gly이며; R40은 Ser 또는 Ala이며 : R42는 Phe 또는 Ala이며: R43은Asn 또는 Arg이며 ; R44는 천연아미노산 또는 des-R44이며 여기서 Y는 C-말단잔기의 카복실부분이거나-COOH 또는 CONH2를 나타낸다.
일단 유전자적으로 변형된 미생물에 의해 이 펩티드가 발현되면 이 중간체 조성물을 회수하여 기지의 방법으로 정제한 후 이 중간체를 브롬화시안으로 처리하여 N-말단에 있는 Met 잔기를 분해하고 생물학적으로 활성인 펩티드를 얻는다. 비록 앞서 구조식에서 펩티드가 43 또는 44위치까지 연장될 수 있으나 앞서 따로 지적한 바와 같이 실질적인 생물학적 활성은 27-29잔기만큼 작은 잔기를 갖는 펩티드에 의해 얻어지며 이런 짧은 분필은 많은 목적에서 동등한 효과를 나타내는 것으로 여겨지며 본 발명에 의해 제공된 바람직한 중간체의 범위내 포함되며, 재조합 DNA법에 의해 생성되어진다.
하기 실시예는 고상법(solid-phase technique.)에 의해 hpGRF 유사체를 합성하는 바람직한 방법을 설명한 것이다. 물론 상응하는 짧은 펩티드 분절의 합성도 같은 방법으로 수행할 수 있으며 단지 C-말단에서 시작되는 아이노산의 필요한 수를 줄이면 된다.
[실시예 I]
하기 구조식의 [Ile27]-hpGRF(1-40)-NH2의 합성 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2.
MBHA 염산수지(예 ; Bachem,Inc.,제품, 치환범위가 약 0.1-0.5m몰/수지 g인것)상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적으로 수행한다. BOC-Ala을 수지에 커플링 시키는 것은 하기에 스케쥴 A와 B로(이것은 합성 전체를 통해 사용됨) 언급된 일반법에 따라 수행되며 그 결과 수지 g당 약 0.35m몰의 Ala이 치환되었다. 사용되는 모든 용매는 헬륨이나 질소같은 불활성기체를 통해주어 유의하여 기체를 제거하여 Met 잔기의 유황을 바람직하지 않게 산화시킬지도 모르는 산소가 없도록 했다.
탈보호 및 중화에 이어 펩티드쇄를 수지상에 단계적으로 붙여간다. 탈보호, 중화 및 각 아미노산의 첨가는 미국특허 No.4,292,313(Vale 일행.)에 상세히 설명되어 있는 일반법에 따라 수행한다.
탈보호는 하기 스케쥴 A에 따라 수행하는 것이 바람직하다.
Figure kpo00001
커플링은 하기 스케쥴 B에 따라 수행하는 것이 바람직하다.
Figure kpo00002
요약하면 1-2m 몰의 BOC-보호 아미노산의 염화메틸렌 용액이 수지 g당 염화메틸렌중 1.0몰 DCCI 1당량과 함께 2시간 동안 사용된다. BOC-Arg(Tos)이 커플링되는 경우 50% DMF와 염화메틸렌 혼합물이 사용된다. Ser 및 Thr의 하이드록실 측쇄 보호기로는 Bz1 에테르가 사용된다. Asn 또는 Gln의 카복실말단을 활성화 시키는데는 p-니트로페닐 에스테르(ONp)가 사용되며 예컨대 BOC-Asn(ONp)는 DMF와 염화메틸렌 50% 혼합물중에서 1당량의 HoBt를 사용하여 밤새 커플링시키며 이경우 DCC는 사용하지 않는다.
Asn 또는 Gln의 아미도기는 DCC 커플링이 활성에 스테르법 대신 사용되는 경우 Xan에 의해 보호된다. 2-클로로벤질옥시카보닐(2 C1-Z)은 Lys 측쇄 보호기로서 사용된다.
Tyr가 Arg의 구아니디노기를 보호하는데 사용되는 경우 Glu 또는 Asp 카복실기는 Bz1 에스테르(OBz1)으로서 보호된다. Tyr의 페놀성하이드록실기는 2,6-디클로로벤질(DCB)에 의해 보호된다. 합성 마지막에 하기조성물이 얻어진다 ; X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn(X5)-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg (X6)-Lys(X7)-Va1-Leu-Gly-Gln(X5)-Leu-Ser (X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln(X5)-Asp(X3)-Ile-Ile-Ser(X4)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-Ser(X4)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-Gly-Ala-X8.
여기서 X1은 BOC, X2는 DCB, X3는 벤질 에스테르 X4는 Bz1, X5는 Xan, X6는 Tos, X7은 2 C1-Z이며 X8은-NH-수지 지지체이다. Xan은 α-아미노보호기를 탈보호하는데 사용되는 TFA 처리에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 제거될 수 있다.
최종 Tyr 잔기를 수지에 커플링시킨후 BOC는 CH2C12중 60% TFA를 사용하여 제거한다. 남은 보호된 펩티드-수지를 분해하고 탈보호하기 위해-20℃에서 30분간,0℃에서 30분간 펩티드-수지 g당 1.5m1 아니솔, 0.5ml ap틸에틸설파이드, 15m1 불화수소(HF)fh-처리한다. 고진공하에서 HF를 제거한후 수지-펩티드 잔여물을 무수 디에틸 에테르 및 클로로포름으로 교대로 세척하고 펩티드를 기체를 제거한 2N 수성초산으로 추출한후 여과하여 수지로 부터 분리시킨다.
이어 분해되고 탈보호된 펩티드를 0-5% 초산에 용해한후 정제하며 세파덱스 G-50 화인겔여과법이 포함될 수 있다.
이어 펩티드를 문헌에 설명된 바와 같이 예비 HPLC 또는 반예비 HPLC로 더 정제한다(Rivier 일행., Peptides: Structrue and Biological Function,(1979) pp125-8 and Malki 일행.J.Am Chem Soc 103,3178(1981)). 요약하면 워터스 어소시에이츠 PreP LC-500을 갖춘 카트리지를 15-20 C18실리카(Vydac(300Å)제품)로 충전시킨다. TEAP중 CH3CN의 구배는 저압 엘덱스 구배 장치로 한다.(Rivier J.,J.Liq Chromatography 1,343-367(1978)). 크로마토그래프 분획물을 HPLC로 유의하여 관찰한후 실질적인 순도를 가진 분획물만 모았다. 정제된 분획물들 순도를 각기 확인한 것들의 탈염은 0.1% TFA 중 CH3CN의 구배를 사용하여 수행한다. 중간철취물을 동결건조하여 순도가 98% 이상인 바라는 펩티드를 얻는다.
하기문현에 설명된 방법으로 클로로에틸화 수지를 사용하여 합성을 반복하여 유리산 형태의 동일한 펩티드를 생성한다.(Rivier,J.J.Amer.Chem.Soc ,96,2986-2992(1974)).
[실시예 II]
하기 구조식의 [Va127,D-Ala28]-hpGRF(1-40)-NH2의 합성 : H-Tyr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arh-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Ala-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2
실시예 I에서와 같은 방식으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성장치를 사용하여 단계적으로 수행한다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한가 판단한다.
[실시예 III]
하기 구조식의 hpGRF 유사체인 [D-Tyr1]-hpGRF(1-32)-NH2의 합성 . H-D-Tyr-Ala-Asp-AIa-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-VaI-Leu-GIy-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2
실시예 I 에서와 같은 방식으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단제적으로수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한가 판단한다.
광전 선광계상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00003
앞서 언급한 바와 동일한 유리산 형태의 펩티드를 생성하기 위해 클로로메틸화수지를 사용하여 합성을 반복한다.
[실시예 IV]
하기 구조식의 단쇄의 hpGRF 유사체[Nle27]-hpGRF(1-32)-NH2의 합성 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-Ile-NIe-SeT-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2
실시예 1에서와 같은 방식으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적으로 수행된다. 이 동족체를 TLC와 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한가 판단한다. 선광도 광전 선광계상에서 측정한다.
Figure kpo00004
동일한 일반합성법을 사용하여 [Nle27]-hpGRF(1-44)-NH2를 제조한다.
[실시예 V]
하기 구조식의 [Nle27]-hpGRF(1-27)-NH2의 합성 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg -Lys -Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-NH2
실시예 I에서와 같은 방식으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적으로수행한다. TLC와 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한가 판단한다.
[실시예 VI]
하기 구조식의 [Ile27]-hpGRF(1-32)-OH의 합성 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ser-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln -Gly-OH
실시예 I 마지막 부분에 언급한 것과 같은 방식으로 클로로메틸화수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성장치를 사용하여 단계적으로 수행한다. TLC와 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. 선광도는 광전 선광계상에서 측정한다.
Figure kpo00005
MBHA 수지를 사용하여 합성을 반복하여 아미드화된 형태의 동일한 펩티드를 생성한다.
[실시예 VlI]
하기 구조식의 [D-Met27]-hpGRF(1-32)-NH2의 합성 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GLn-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2
실시예 I에서 설명한 방법으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적으로 수행한다 TLC와 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. 광전 선광계상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00006
[실시예 Ⅷ]
하기 구조식의 [His1]-hpGRF(1-32)-NH2의 합성 : H-His-Ala-Asr-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2
실시예 I에 언급된 방법으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. 선광도는 광선선광계상에서 측정한다.
Figure kpo00007
마지막 잔기로서 Phe를 사용하여 합성을 반복하여 [Phel]-hpGRF(l-32)-NH2를 생성한다, 광전 선상계상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00008
[실시예 IX]
하기 구조식의[Phe10-hpGRF(1-32)-NH2의 합성 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Pahe-Arg-Lys-Val-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2
실시예 I에 언급된 방법으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 확인한다. 광전 선광계상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00009
[실시예 X]
하기 구조식의 [Va127]-hpGRF(l-32)-OH의 합성 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-Ser-Arg-Gln-Gln-GIy-OH
실시예 I의 마지막에 언급된 방법으로 클로로메틸화수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성장치를 사용하여 단계적으로 수행한다. TLC와 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판만한다. 광전 선광계상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00010
[실시예 XI]
하기 구조식의 [His1,Nle27]-hpGRF(1-32)-NH2의 합성 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2
실시예 I에 언급된 방법으로 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다. TLC와 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. 광전선광계 상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00011
[실시예 XII]
하기 구조식의 rhGRF(1-43)-OH의 합성 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Leu-Tyr-Ala- Arg-Lyr-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH
실시예 VI에 언급된 방법으로 약 0.1-0.5m몰/g 수지의 치환범위를 가진 클로로메틸화 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. 광전선광계상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00012
Asn을 MBHA 수지에 결합시키기 위해 미국 특허 No,4,292,313(Vale 일행)에 일반적으로 설명된 바와같은 초기 과정을 이용하여 MBHA 수지를 사용하여 합성을 반복하여 rhGRF(1-43)-NH2를 얻는다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. 광전선광계상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00013
[실시예 XⅢ]
하기 구조식의 rhGRF(I-40)-NH2의 합성 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Mer-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-NH2
실시예 I에 일반적으로 언급된 바와 같이 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. 광전선광계상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00014
[실시예 XⅣ]
하기 구조식의 hpGR 유사체 즉[Metl, Leu27]-rhGRF(1-43)-OH의 합성 : H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-G1y-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH
실시예 XII에 일반적으로 언급된 방법으로 클로로ap틸화수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성장치를 사용하여 단계적으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다.
[실시예 XV]
하기 구조식의 hpGRF 유사체, 즉 [Nle27-rhGRF(1-32)-NH2의 합성 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Glv-NH2
실시예 I에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
TLC 및 HPLC를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한가 판단한다.
[실시예 XVI]
하기 구조식의 hpGRF 유사체 분절 즉 [D-Tyr10]-rhGRF(1-29)-NH2의 합성 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2
실시예 I에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. N-말단에 His 대신에 D-Tyr을 치환하여 합성을 반복하여 [D-Tyr1.10]-rhGRF(1-29)-NH2를 생성한다.
[실시예 XVII]
하기 구조식의 hpGRF 유사체 분절 즉 rhGRF(1-29)-NH2의 합성 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2
실시예 III에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다.
[실시예 XVIII]
하기 구조식의 [Nle27]-rhGRF(1-29)-NH2의 합성 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gly-NH2
실시예 I에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡그만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다. 광전선광계 상에서 선광도를 측정한다.
Figure kpo00015
[실시예 XIX]
하기 구조식의 hpGRF 유사체 즉[D-His1, D-Tyr10, D-Ala15]-rhGRF(1-29)-NH2의 합성 : H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-D-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2
실시예 I에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 확인한다.
[실시예 XX]
하기 구조식의 hpGRF 유사체 즉 [Tyr1]-rhGRF(1-29)-NH2의 합성 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-NH2
실시예 I에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다.
[실시예 XXI]
하기 구조식의 rhGRF-[Val44-NH2]의 합성 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-His-Gly-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Va1-NH2
실시예 I에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성 장치를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한가 판단한다.
앞서 특별히 언급한 많은 유사체외에 하기 유사체들 또한 앞서 언급한 바와 동일한 고상합성법을 사용하여 합성한다.
[Ile27]-hpGRF(1-29)-NH2, [Ile27]-hpGRF(1-29)-OH, [D-His1]-hpGRF(1-32)-NH2, [D-Ala27]-hpGRF(1-32)-NH2, [D-Tyrl, Nle27]-hpGRF(1-32)-NH2, [D-Tyrl, Nle27]-hpGRF(1-32)-OH, [D-Phel,Val27]-hpGRF(1-40)-OH,[His1,Phe10]-hpGRF(1-32)-NH2,[D-Tyrl,Nle27]-hpGRF(1-40)-OH,[D-Tyrl,Nle27]-hpGRF(1-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-OH,[Phel,Phe10,Ile27]-hpGRF(1-32)-NH2, [D-His1,D-Ala15,Nle27]-hpGRF(1-32)-NH2, [D-Phel, Phel0,D-Met27]-hpGRF(1-40)-OH, [Ile27]-hpGRF(1-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, [Ile27]-hpGRF(1-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-OH, [D-His1,D-Ala15, D-Ala28]-hpGRF(1-32)-NH2, [Phel, Leu10-Ala27]-hpGRF(1-40)-OH,[His1,D-Va127,D-Ala28]-hpGRF(1-32)-NH2,[D-Tyrl, Phel0, D-Ile27-hpGRF (1-39)-NH2, [Va127-hpGRF (1-40)-OH, [Va127-hpGRF (1-40 )-Arg-Ala-Arg-Leu-OH 및 [D-Phel, D-Ala15, D-Nle27, D-Ala28]-hpGRF(1-32)-NH2.
여러 실시예에서 제조된 합성 펩티드를 순수한 합성 hpGRF(1-40)-OH 또는 순수한 합성 hpGRF(1-40)-Phe-Gln-NH2와 시험관내 검정법으로 비교하여 그들의 성장호르몬 분비 촉진 효과를 검사했다. 이들 모든 합성 유사체들은 GH의 분비를 일으키는 실질적인 역가를 가지고 있다.
시험관내 검정법은 표준으로 합성 hpGRF를 사용하여 합성된 각종 유사체 동물농도와 각각 비교하여 수행했다. 배양액으로는 4-5일 전 미리 제거한 쥐의 뇌하수체선의 포를 함유하는 것을 사용했다. 비교 시험을 위해 성장호르몬 분비에 최적이라 생각되는 배양액을 사용하여 문헌 Vale일행 Endocorno1ogy 91, 562-572(1972)에 설명된 일반적인 방법으로 시험했다. 시험될 물질을 3-4시간 배양한후 배양배지 일부를 취하여 방사선면역 검정법으로 면역반응성 GH(ir GH)로 그들의 농도를 측정했다.
동물 농도를 사용한 비교시험 결과를 하기 표 I에 나타냈다.
Figure kpo00016
*hpGRF(1-40)-Phe-Gln-NH2에 대해 비교한 것
이를 합성 펩티드들을 시험관내 시험한 결과 EC50치는 20-100×1012몰이었으며 가장 낮은 유효농도는;-8×10-l2몰이었다. hpGRF(1-40)NH2에서의 최대유효농도는 1×10-9몰이었다.
rhGRF를 기본으로한 각종 hpGRF유사체를 동몰농도로 비교시험한 결과를 하기 표 II에 나타냈다.
Figure kpo00017
시험관내 시험에서 이들 합성 펩티드는 EC50치가 20-100×10-12몰이었으며 최저 유효농도는 3-8×10-12몰이었다. rhGRF(l-43)-OH의 최대 효과 농도는 1×10-9몰이었다.
성장 호르몬 분비에 대한 시험관내 시험외에 합성펩디드를 유치 카테테르를 통해 자유롭게 움직이는 정상수쥐에 주입하는 생체 시험도 하였다. 동물들을 FLA-63, 외인성 GRF에 대한 반응에 영향을 미치지 않으면서 자발적 GH분비를 억제하는 도파민 하이드록실라제 억제제로 전처리하였다. 주입 전, 5분후, 20분후 동일카테테르로부터 혈액 샘플을 채취하여 방사선면역 검정법으로 혈액중 GH농도를 측정했다. 그 결과 합성 hpGRF유사체가 뇌하수체 GH분비를 촉진 시키는 강력한 촉진제인 것으로 나타났다. 투여량은 약 20×10-9g-25μg/체중 kg이 효과적인 것으로 나타났다.
또다른 시험에서 그밖의 실시예에서 합성된 기타 합성 hpGRF유사체들 역시 실질적인 역가를 나타냈으며 이 시험으로부터 얻은 몇가지 결론을 요약하면 다음과 같다.
1. C-말단아미드화는 쇄의 길이가 39잔기보다 긴 GRF펩티드의 활성은 증가시키지 않았으나 길이가 39잔기보다 짧은 펩티드들의 역가는 증가시킨다. 즉 [Ile27]-hp[GRF(1-32)-NH2는 [Ile27]-hpGRF(1-32)-OH보다 역가가 높으며 [D-Tyrl,Nle27]-hpGRF(1-32)-NH2는 [D-Tyrl,Nle27]-hpGRF(1-32)-OH보다 역가가 높으며 [Ile27]-hpGRF(1-29)-NH2는 [Ile27]-hpGRF(1-29)-OH보다 역가가 높았으나 [Ile27]-hpGRF(1-44)-NH2는 [Ile27]-hpGRF-OH와 거의 동등했다.
2. 일련의 아미드화펩티드에서 32잔기의 유사체들은 상응하는 이보다 긴 쇄의 유사체와 거의 역가가 같았다. 즉 [Nle27]-hpGRF(1-32)-NH2는 [Nle27]-hpGRF(1-44)-NH2과 역가가 거의 같았다.
3. 유리카복시 말단을 갖고 있는 일련의 펩티드의 경우 잔기가 39잔기보다 큰 상응하는 유사체들은 역가가 동일했다. 예컨대 [Va127]-hpGRF(1-40)-OH와 [Val27]-hpGRF(1-44)-OH가 같았으며, [D-Tyrl,Nle27]-hpGRF(1-40)-OH와 [D-Tyrl, Nle27]-hpGRF(1-44)-OH가 같았다.
합성 hpGRF유사체들은 의사들이 GH 생성을 촉진시키기를 원하는 곳에 적용하기 유용해야 한다. hpGRF유사체에 의한 GH분비 촉진은 내인성 GRF분비 부족에 의해 야기된 절대 또는 상대 GH결핍증환자에서 관심의 대상이 되고 있다. 더우기 이것은 증가된 GH분비와 함께 그에 수반되는 성장증가를 정상 GH치를 가진 인간이나 동물에서 얻을 수 있다. 또한 hpGRF투여는 체지방함량을 바꿔줄 수 있으며 기타 GH-의존성 대사 면역 및 성장과정이 변경된다. 예컨대 hpGRF유사체는 예컨대 불치화상에 수반되는 상태하에 있는사람에서 동화 작용의 촉진 수단으로 이용될 수 있다.
또다른 예로 hpGRF유사체는 닭, 칠면조, 돼지, 염소, 소, 양 같은 가축의 성장을 촉진시키고 증가된 단백의 지방에 대한 비를 증가시킬 목적으로 이들에 투여될 수 있다. 이들은 또한 생선이나 기타 냉혈바다 동물 예컨대 바다거북, 뱀장어, 양서류 같은것을 기르는데 사용될 수도 있다. 사람에 투여하기위해 합성hpGRF는 적어도 93%이상, 바람직하게는 적어도 98%이상의 순도를 가져야 한다. 이 순도는 상기 언급된 %만큼 펩티드내 동일펩티드 및 펩티드 분절이 존재해야 함을 의미한다.
합성 hpGRF유사체를 가축이나 기타 동물들의 성장 촉진 및 지방 함량 감소 목적으로 투여할 경우 약5% 정도로 낮은 또는 약 0.001%정도까지 낮은 순도의 것도 사용할 수 있다. 유전 공학법에 의해 생성된 경우 유사체는 처음에 매우 낮은 순도를 가질 수 있다.
합성 hpGRF유사체 또는 그의 무독성염은 약제담체나 수의과 용담체와 함께 약제 조성물을 형성할 수 있으며 이것은 인간을 포함한 동물에 정맥내, 피하, 근육내, 비강내 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 투여법은 의사가 이런 치료르 필요로 하는 환자에 GH분비를 촉진시킬 목적으로 사용될 수 있다. 바라는 용량은 처리될 특정상태, 상태의 심한정도, 바라는 치료기간 등에 따라 달라진다.
이들 펩티드는 산부가염이나 예컨대 아연, 철과 같은 것과의 금속착화합물(본 발명에서 염으로 간주됨)과 같이 제약상 또는 수의학상 허용되는 무독성염 형태로 자주 투여된다. 이런 산부가염에는 예컨대 염산염,취화수소산염, 황산염, 인산염, 말레인산염, 초산염. 구연산염, 벤조산염, 석신산염, 말산염, 아스코르빈산염, 주석산염등이 있다. 활성성분이 정제형태로 경구투여되는 경우 정제는 트라가칸트, 옥수수전분 또는 젤라틴과 같은 결합제 : 알킬산과 같은 붕해제 및 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제를 함유할 수 있다. 만일 액체형태로 투여하는 것이 바람직한 경우 감미제 및/또는 향미제가 사용될 수 있으며, 등장식염수 인산 완충액 같은데 녹여 정맥내 투여할 수 있다.
펩티드는 사람에게 투여시는 의사지시에 따라야하며 약제조성물은 보통 펩티드와 함께 통상적인 제약상허용되는 담체를 함유한다. 일반적으로 비경구용량은 펩티드 약 20mg-25μg/사용체 체중 kg이다.
비록 본 발명을 발명자가 현재 최상이라고 알고 있는 바람직한 구체예로 설명하였으나 첨부된 청구범위에 나타난 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는한 이 분야에 숙련된 자에 명백한 기타 변경 및 수정이 가능하다. 예컨대 펩티드쇄의 변경 특히 펩티드의 카복실기 말단에서 시작되는 탈락은 펩티드 역가를 모두 또는 아주 실질적인 몫만큼 갖고 있는 분절을 만드는데 현재까지 알려진 실험법에 따라 이루어질 수 있으며 이런 펩티드는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 여겨진다. 더우기 각 말단에서 또는 양쪽 말단 모두에서 첨가가 일어날 수 있으며/또는 펩티드화학분야에 잘 알려진 방법으로 천연산 잔기를 일반적으로 등가의 잔기로 치환해주어 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 천연폴리펩티드의 적어도 실질직인 몫의 역가를 갖고 있는 유사체를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 각종 특징을 하기 청구범위에 중심적으로 강조해 놓았다.

Claims (15)

  1. 하기 구조식의 합성 펩티드 또는 그의 N-말단에서 시작하여 적어도 R27까지 연장하는 완전한 서열의 형태의 생물학적으로 활성인 분절 또는 그의 무독성 염.
    H-R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44-Y
    여기서 R1은 Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His 또는 His이며 ; R8은 Ser 또는 Asn이며 ; R10은 Tyr, Phe 또는 D-Tyr이며 ; R12는 Arg 또는 Lys이며 ; R13은 Ile 또는 Va1이며 , R15는 Gly또는 D-Ala이며 , R18은 Tyr 또는 Ser이며 , R24는 His 또는 Gln이며: R25는 Glu 또는 Asp이며 ; R27은 D-및 L-이성체 형태의 Ala, Nle, Ile, Leu, Met 및 Val으로 구성된 군으로부터 선택되며, R28은 Ser, Asn 또는 D-Ala이며 ; R34는 Arg 또는 Ser이며 : R38은 Gln 또는 Arg이며 ; R39는 Arg 또는 Gly이며 ; R40은 Ser 또는 Ala이여 ; R42는 Phe 또는 Ala이며 ; R43은 Asn 또는 Arg이며 ; R44는 천연아미노산 또는 des-R44이며 ; Y는 C-말단에 있는 아미노산 잔기의 카복실 부분을 나타내며 라디칼-COOR,-CRO,-CONHNHR,-CON(R)(R') 또는-CH2OR이며(여기서 R과 R'는 저급알킬, 플루오로저급알킬 또는 수소임) ; 그러나 단 R1이 Tyr인 경우 R27은 Met 이외의 것이며, R8은 Ser, R12는 Arg, R13은 Ile, R18은 Tyr, R24는 His, R25는 Glu, R28은 Asn, R34는 Arg, R38은 Gln, R39는 Arg, R40은Ser, R42는 Phe 또는 R43은 Asn인 것이 적어도 하나가 존재한다.
  2. 제1항에있어서, Rl이 His인 합성펩티드.
  3. 제1항 또는 제 2 항에 있어서, Y가 CONH2인 합성펩티드.
  4. 제l항 또는 제2항에 있어서, R27이 Nle인 합성펩티드.
  5. 제1항 또는 제 2 항에 있어서, R10이 Tyr, R15가 Gly이고 R28이 Ser인 합성펩티드.
  6. 제1항 또는 제 2 항에 있어서, R10이 Tyr, R15가 D-Ala이고 R28이 D-AIa인 합성펩티드.
  7. 제1항에 있어서, R1이 D-Tyr이고, R27이 NIe, VaI 또는 Ile인 합성펩티드.
  8. 제1항 또는 제 7 항에 있어서, R15가 D-Ala이고 R28이 D-Ala인 합성펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 하기 서열을 가지는 합성펩티드.
    His-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Ang-Lys-Leu-Leu-His-Glu-IIe-Met-Asn-Arg-GIn-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn.
  10. 제1항에 있어서, 하기 서열을 가지는 합성펩티드.
    Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu .
  11. 제1항에 있어서, 하기 서열을 가지는 합성펩티드.
    Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-A1a-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu .
  12. 제1항에 있어서, 하기 서열을 가지는 합성펩티드.
    Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu .
  13. 제1항에 있어서, 하기 서열을 가지는 합성펩티드.
    Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu .
  14. 하기 구조식의 합성펩티드 또는 그의 무독성염.
    H-Rl-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-IIe-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Y
    여기서 R1은 Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His 또는 His이며 ; R8은 Ser 또는 Asn이며, R10은 Tyr, Phe 또는 D-Tyr이며 ; R12는 Arg 또는 Lys이며 ; R13은 Ile 또는 Val이며 ; R15는 Gly또는 D-Ala이며 ; R18은 Tyr 또는 Ser이며 ; R24는 His 또는 GIn이며 ; R25는 Glu 또는 Asp이며 ; R27은 D-및 L-이성체 형태의 AIa, NIe, IIe, Leu, Met 및 VaI으로 구성된 군으로부터 선택되며 ; R28은 Ser, Asn 또는 D-Ala이며 ; Y는 C-말단에 있는 아미노산 잔기의 카복실 부분을 나타내며 라디칼-COOR,-CRO,-CONHNHR,-CON(R)(R') 또는-CH2OR이며(여기서 R과 R'는 저급알킬, 플루오로저급알킬 또는 수소임) ; 그러나 단 R1이 Tyr인 경우 R27은 Met이외의 것이며, R8은 Ser, R12는 Arg, R13은 Ile, R18은 Tyr, R24는 His, R25는 GIu, R28은 Asn인 것이 적어도 하나가 존재한다.
  15. 동물의 GH의 분비 촉진용 조성물로서 제1항 또는 제14항의 펩티드 또는 그의 무독성염과 수의학상 또는 제약상 허용되는 액체 또는 고체 담체로 구성되는 조성물.
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