Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydów wywierajacych wplyw na dzia¬ lanie przysadki mózgowej u ludzi i zwierzat, w szczególnosci ssaków. W szczególnosci przed¬ miotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydu, który pobudza uwalnianie hormonu wzrostu przez przysadke mózgowa.Fizjologom od dawna wiadomo, ze podwzgórze kontroluje cala czynnosc wydzielnicza gruczolowej czesci przysadki w ten sposób, ze podwzgórze wytwarza specjalne polipeptydy, któ¬ re wyzwalaja wydzielanie kazdego hormonu przysadki. Zidentyfikowano takze czynnik hamujacy, który hamuje wydzielanie hormonu wzrostu /GH - skrót od angielskiego terminu growth horraone/ i znany jest jako sornatostatyna.Z wyciagu z wystepujacego u ludzi nowotworu trzustki zostal ostatnio wyodrebniony, oczyszczony, zidentyfikowany, zsyntetyzowany i przebadany odpowiadajacy podwzgorzowy czynnik wyzwalajacy wydzielanie przysadkowego GH. Kolejnosc aminokwasów w tym peptydzie Jest naste¬ pujaca: Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys- Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu.Amidowana postaó tego peptydu okreslana jest w niniejszym opisie jako hpGRF /skrót od angiel¬ skiego terminu human pancreatio tumor GH releasing faotor, co oznacza czynnik wyzwalajacy wydzielanie GH nowotworu trzustki u ludzi/.Obecnie z wyciagów z podwzgórza szczurów zostal wyodrebniony, oczyszczony, zidenty¬ fikowany, zsyntetyzowany i przebadany peptyd, który uwalnia GH z wyhodowanych komórek przy¬ sadkowych. Kolejnosc aminokwasów w tym zawierajacym k3 reszty, wystepujacym w przyrodzie peptydzie jest nastepujacat H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly- Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ar^-Asn-Gln- -Glu-Gln-Arg-.Ser-Arg-Phe-Asn-OH. Peptyd ten Jest dalej w opisie okreslany Jako rhGRF 143 Sk22 1^3 842 /skrót od angielskiego terminu rat hypothalamic GH releasing faotor, oo oznacza szczurzy, podwzgórzowy czynnik wyzwalajacy wydzielanie GH/.Obecnie zsyntetyzowano i przebadano pewne analogi hpGRF, dzialajace silniej niz sam hpGRF, przy czym wiele z tych analogów ma krótszy lancuch. Niektóre z tych analogów bazuja na podstawieniach zgodnych ze wzorem rhGRF, podczas gdy inne bazuja na innych podstawieniach.Kompozyoje farmaceutyczne zawierajace peptydy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku zawieraja te analogi hpGRF lub ich nietoksyczne sole, zdyspergowane w farmaceutycznie dopuszczalnym nosniku cieklym lub stalym. Takie kompozycje farmaceutyczne mozna stosowac w. leczeniu kli¬ nicznym, tak w odniesieniu od ludzi jak i weterynaryjnym, zarówno do podawania w celach leczniczych, jak i w celach diagnostycznych. Ponadto mozna je stosowac dla pobudzania wzrostu zwierzat oieplokrwistych, wlacznie z drobiem i w gospodarce wodnej dla zwierzat zimnokrwis¬ tych, np. ryb, wegorzy itd.Dla okreslenia peptydu przyjeto nomenklature, jaka podali Schroder i Lubke w publi¬ kacji "The Peptides", Academic Press /1965A w której zgodnie z konwencjonalnym przedsta¬ wianiem grupa aminowa na koncowym atomie N znajduje sie po lewej stronie, podczas gdy grupa karboksylowa na koncowym atomie C znajduje sie po prawej stronie. Przez naturalny aminokwas rozumie sie jeden z pospolitych, wystepujacych w przyrodzie aminokwasów wystepujacych w bial¬ kach, takich jak Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp i His. W przypadku, gdy reszta aminokwasu posiada odmiany izomeryczne, to wystepuje odmiana L aminokwasu, jesli nie stwierdzono wyraznie inaczej. Dla celów ni¬ niejszego opisu rhGRF uwaza sie za analog hpGRF.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydów o wzorze 1: H-R -Ala-Asp- Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-R -Arg-R -R^-Leu-R -Gln-Leu-R1 g-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R^^-R^ -Ile- R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R3/l-Asn-Gln-Glu-R38-R39-Ri+0-Arg-R/l2-R43-R/lZl-Y, w którym R1 oznacza Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His lub His; Rg oznacza Ser lub Asn; R1Q oznacza Tyr, Phe lub D-Tyr; R12 oznacza Arg lub Lys; R „ oznacza Ile lub Val; R oznacza Gly lub D-Ala; R1R oznacza Tyr lub Ser; R^r oznacza His lub Qln; R2- oznacza Glu lub Asp; R27 wy¬ brany jest z grupy obejmujacej izomery D i L, Ala, Nie, Ile, Leu, i Val; R_fl oznacza Ser, Asn lub D-Ala; R«k oznacza Arg lub Ser; R«8 oznacza Gin lub Arg; R«Q oznacza Arg lub Gly; R.n oznacza Ser lub Ala; R, oznacza Phe lub Ala; Rk« oznacza Asn lub Arg; R, , oznacza reszte naturalnego aminokwasu lub des-R.., Y oznacza grupe -COOH lub -C0NH2 lub o dlugosci lancucha od R1 do co najmniej R27# który polega na tym, ze aminokwasy, w których przynaj¬ mniej grupy d, -aminowe sa zabezpieczone, sprzega sie ze soba w kolejnosci okreslonej wzo¬ rem 1 w lancuch o dlugosci od R1 do co najmniej R071 metoda syntezy na fazie stalej sto¬ sujac 1 do 2 milimoli zabezpieczonego aminokwasu na 1 g zywicy, w rozpuszczalniku, ko¬ rzystnie w chlorku metylenu lub dimetyloformamidzie lub w ich mieszaninie, po czym z wytwo¬ rzonego peptydu zawierajacego co najmniej jedna grupe zabezpieczajaca, o wzorze 2: X -R /X lub X2/-Ala-Asp/X3/-Ala-Ile-Phe-Thr/xV-R8/X lub X5/-Ser/X /-R1Q/X2/-Arg/X6/-R12-/X6 lub X7-/R13-Leu-R -Gln/X5/-Leu-Rl8A2/-Ala-Arg/X6/-Lys-/X7/-Leu-Leu-R2/l/X lub X5/-R25/X3/-Ile- R2 -R 8/X** lub X5/-Arg/X6/-Gln/X5/-Gln/X5/-Gly-Glu/X3/-R3/l/X2l lub X6/-Asn/X5/-Gln/X5/- GluAV-R38A5 lub X6/-R39/X6/-R4o/xV-Arg/X6AR/l2-RZl3/x5 lub X6/-R/ljlA8/-X9, w którym X1 oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe ^» -aminowa, korzystnie BOC, X oznacza 2 atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca azot imidazolu w His, korzystnie Tos, X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca fenolowa grupe hydroksylowa Tyr, korzystnie grupe 3 2,6-dichlorobenzylowa, X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe karboksylowa Asp lub Glu, korzystnie Bzl, X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca alkoholowa 5 grupe hydroksylowa Thr lub Ser, korzystnie grupe Bzl, X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca amidowa grupe bocznego lancucha Asn lub Gin, korzystnie grupe Xan, X ozna- 7 cza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe guanidynowa Arg, korzystnie Tos, X ozna¬ cza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe aminowa booznego lancucha Lys, korzystnie o grupe 2-chlorobenzyloksykarbonylowa, X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca boczny lancuch Jak okreslono powyzej, Xy oznacza -O-CH.-nosnik polimerowy lub -NH-nosnik1^3 842 3 polimerowy, a R1, RQ, R1Q, R12f R^, R^, R1gt R^, R^, R27, R2Q, R^, R^g, R^, R^, R/,2# Rk« i Rj.^ maja wyzej podane znaczenie lub z peptydu o dlugosoi lancucha od R* do co najmniej R^7 usuwa sie grupy zabezpieczajace i odszczepia sie peptyd zawierajacy co naj¬ mniej 27 reszt aminokwasów od nosnika polimerowego przy uzyciu kwasu trójfluorooctowego w rozpuszczalniku, korzystnie CH-Cl^, a nastepnie fluorowodoru ze zmiataozem, korzystnie anizolem lub sulfidem metylowo-etylowym lub ich mieszanina, w niskiej temperaturze, ko¬ rzystnie okolo 0°C-do-20°C, po czym rozpuszcza sie w rozpuszczalniku, korzystnie w kwasie octowym i oczyszcza sie znanym sposobem.Peptydy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, zarówno zawierajace kk aminokwasy Jak i ioh fragmenty, wykazuja czynnosc biologiczna i ogólnie przyjmuje sie, ze peptyd po¬ winien rozciagac sie co najmniej od koncowego atomu N poprzez reszte 27* Kiedy fragment peptydu rozciaga sie tylko do reszty 27 i 28, wówczas jako Y korzystnie wystepuje grupa NH2 lub podstawiona grupa amidowa, natomiast gdy fragment peptydu rozciaga sie do jednej z reszt od 29 do 39i Y korzystnie stanowi grupa amidowa lub podstawiona grupa amidowa.Analogi hpGRF zawierajace jeden z wymienionych aminokwasów zamiast Met w pozycji 27, wykazuja znacznie wyzsza stabilnosc, zwlaszcza w przypadku wystawienia na warunki utle¬ niajace; ponadto jesli podstawnikiem jest izomer D, moze uzyskac podniesienie odpornosci na dzialanie enzymów. Pozostaja one w pelni biologicznie czynne i niektóre analogi wykazuja zadziwiajaco zwiekszona czynnosc w toku badan in vitro. Bardzo wysoka aktywnosc wykazuja peptydy zawierajace His w pozycji 1. Ponadto izomer D aminokwasu, np. D-tyr, zapewnia wy¬ jatkowo wysoka aktywnosc oraz nadaje peptydom odpornosc na dzialanie niektórych enzymów.Synteze peptydów przeprowadza sie róznymi sposobami, takimi jak techniki wyko¬ rzystujace wylacznie faze stala, techniki wykorzystujace czesciowo faze stala, przez kon¬ densacje fragmentów, przez klasyczne sprzeganie w roztworze lub tez z zastosowaniem ostatnio opracowanych technik z rekombinowanym DNA, Teohniki syntezy wylacznie w fazie stalej omó¬ wione sa na przyklad w ksiazce "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart i Young Freeman and Co,, San Francisco, 1969 i przedstawione na przykladach ujawnionych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr k 105 603. Sposób syntezy wykorzystujacy kondensacje frag¬ mentów ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 972 859, zas inne znane sposoby syntezy ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3 842 067 i 3 862 925.Synteze z zastosowaniem technik z rekombinantem DNA dla celów niniejszego opisu nalezy rozumiec jako wlasciwe wykorzystanie kodowania genów strukturalnych dla uzyskania pozadanej postaci analogu hpGRF lub jego fragmentu. Syntetyczny peptyd hpGRF mozna uzyskac w wyniku transformacji mikroorganizmu z zastosowaniem przenosnika ekspresji zawierajacego promotor i operator wraz z takim genem strukturalnym i spowodowania, ze tak przeksztalcony mikroorganizm wydzieli peptyd hpGRF, Równiez zwierzeta mozna wykorzystywac do wytwarzania peptydu hpGRF poprzez hodowle genetyczna z zastosowaniem takiego genu strukturalnego i ogól¬ nych technik ujawnionych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr k 276 282, wzglednie wykorzystywania mikroiniekcji zarodków jak to opisano w Vo83/O1783 opublikowanym w dniu 26 maja 1983 i W082/04443 opublikowanym w dniu 23 grudnia 1982, Syntetyczny peptyd hpGRF mozna takze wytwarzac bezposrednio w zwierzeciu, którego wzrost pragnie sie przyspie¬ szyc, wykorzystujac techniki opisane- w tych dwu publikacjach WO, Elementem wspólnym dla syntez chemicznych jest zabezpieczenie nietrwalych grup w lancuchach bocznych róznych reszt aminokwasów za pomoca odpowiednich grup zabezpieczaja¬ cych, które beda zapobiegaly zajsciu reakcji chemioznej w tym miejscu, az do ostatecznego usuniecia tej grupy. Zwykle takze wspólne jest zabezpieczenie *6 -aminowej grupy aminokwasu lub fragmentu peptydu, gdy w reakcje z nastepnym aminokwasem wchodzi grupa karboksylowa, po czym selektywnie usuwa sie grupe zabezpieczajaca grupe aminowa w polozeniu ©£ , dla umozli¬ wienia przeprowadzenia dalszej reakcji w tym.miejscu. Równiez wspólnym elementem jest wy-k Ik3 842 twarzanie w syntezie zwiazku posredniego, który zawiera kazda z reszt aminokwasów umiesz¬ czona w pozadanej kolejnosci w lancuchu peptydu, z grupami zabezpieczajacymi lancuchy boczne zwiazanymi z odpowiednimi resztami.Grupy zabezpieczajace grupe aminowa w polozeniu °C , objete symbolem X , sa dobrze znane ze swej przydatnosci w stopniowej syntezie polipeptydów. Do klasy grup zabezpiecza¬ jacych grupe aminowa w polozeniu 06 y które mozna zastosowac jako X naleza: /1/ grupy zabez¬ pieczajace typu aromatycznych uretanówf takie jak fluorofenylometylokarbonylowa /FMOC/, benzyloksykarbonylowa /Z/ i podstawiona Z, taka jak p-chlorobenzyloksykarbonylowa, p-n±tro- benzyloksykarbonylowa, p-bromobenzyloksykarbonylowa i p-metoksybenzyloksykarbonylowa; /Z/ grupy zabezpieczajace typu alifatycznych uretanów, takie jak Illrz.-butyloksykarbony- lowa /BOC/, diizopropylometyloksykarbonylowa, izopropyloksykarbonylowa, etoksykarbonyIowa, alliloksykarbonylowa; oraz /3/ grupy zabezpieczajace typu uretanów cykloalkilowych, takie jak cyklopentylo- ksykarbonyIowa, adamantyloksykarbonylowa, oraz cykloheksyloksykarbonylowa. Korzystna grupa zabezpieczajaca grupe aminowa w polozeniu alfa jest grupa Illrz.-butyloksykarbonylowa /BOC/.X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca dla azotu imidazolu w His, taka jak Tos. o X moze byó odpowiednia grupa zabezpieczajaca dla fenolowej grupy hydroksylowej Tyr, taka jak grupa tetrahydropiranylowa, Illrz.-butylowa, tritylowa, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ i 2,6-dichlorobenzylowa /DCB/# Korzystna grupa zabezpieczajaca jest grupa 2,6-dichlorobenzy- Iowa* Jako X moze wystepowac atom wodoru, co oznacza, ze w tym polozeniu na reszcie ami¬ nokwasu nie wystepuje boczny lancuch grupy zabezpieczajacej* 3 X oznacza atom wodoru lub tez odpowiednia, tworzaca ester grupa zabezpieczajaca dla grupy karboksylowej Asp lub Glu, taka jak grupa benzylowa /OBzl/, 2,6-dichlorobenzylo¬ wa, metylowa i etylowa* X moze byc odpowiednia grupa zabezpieczajaca dla alkoholowej grupy hydroksylowej Thr lub Ser, taka jak grupa acetylowa, benzoilowa, Illrz,-butylowa, tritylowa, tetrahydro¬ piranylowa, Bzl, 2-6-dichlorobenzylowa i CBZ. Korzystna grupa zabezpieczajaca jest Bzl.Jako X moze wystepowac atom wodoru, co oznacza, ze na grupie hydroksylowej nie wystepuje grupa zabezpieczajaca.X5 oznaoza atom wodoru lub odpowiednia grupe zabezpieczajaca boczna grupe aminowa Asn lub Gin. Korzystnie jest to grupa ksantylowa /Xan/.X oznacza odpowiednia grupe zabezpieczajaca dla grupy guanidynowej Arg, taka jak grupa nitrowa, TOS, CBZ, adamantyloksykarbonylowa i BOC lub oznacza atom wodoru. 7 X oznacza atom wodoru lub odpowiednia grupe zabezpieczajaca dla bocznej grupy aminowej Lys. Przykladami odpowiednich grup zabezpieczajacych boczna grupe aminowa sa grupa 2-chlorobenzyloksykarbonylowa /2-C1-Z/, Tos, Ill-rz.-arayloksykarbonyIowa i BOC.Q X oznacza atom wodoru lub odpowiednia grupe zabezpieczajaca lancuch boczny, jak to ogólnie okreslono powyzej.Met mozna ewentualnie zabezpieczyc tlenem, ale korzystnie pozostawia sie ja bez zabezpieczenia.Wybór grupy zabezpieczajacej boczna grupe aminowa nie Jest krytyozny, z tym za¬ strzezeniem, ze zwykle wybiera sie taka grupe, która nie zostanie usunieta podczas usuwania zabezpieczenia grupy aminowej w polozeniu alfa w trakcie syntezy. Jednakze dla niektórych aminokwasów, np. His, po zakonczeniu sprzegania zabezpieczenie zwykle nie jest konieczne 1 wówczas grupy zabezpieczajace moga byc takie same.1^3 842 5 X^ oznacza odpowiednia grupe zabezpieczajaca dla grupy karboksylowej koncowego atomu C taka jak tworzaca ester grupa XJ lub wiazanie laczace stosowane w syntezie na fazie stalej, wiazace z nosnikiem w postaci stalej zywicy, wzglednie des-X , w którym to przypadku reszta na koncowym atomie C zawiera Yf która stanowi grupa karboksylowa, jak to okreslono powyzej..V sposobie wedlug wynalazku jako nosnik mozna stosowac dowolna stala zywice znana w technice, np. nosnik o wzorze zywica-CH^-O-, -NH-zywica benzhydryloaminowa /BHA/ lub -NH-zywica parametylobenzhydryloaminowa /MBHA/. W przypadku, kiedy pozadane jest uzyskanie niepodstawionego amidu, korzystne jest stosowanie zywioy BHA lub MBHA, poniewaz rozszcze¬ pienie bezposrednio daje amid. V przypadku, kiedy pozadane jest otrzymanie N-metyloamidu, mozna stosowac zywice N-metylo-BHA. W przypadkach, gdy pozadane jest otrzymanie innych podstawionych amidów, korzystne mozne okazac sie przeprowadzenie syntezy peptydu z zasto¬ sowaniem metod klasycznych, takich jak podane w publikacji Houben-Weyla.We wzorze zwiazku posredniego oo najmniej jedna z grup X jest grupa zabezpieczajaca.Przy dokonywaniu wyboru konkretnej grupy zabezpieczajacej lancuch boczny, która ma byc wykorzystana w trakcie syntezy peptydów, przestrzega sie nastepujacych zasad: a/ grupa zabezpieczajaca musi zachowywac swoje wlasciwosci zabezpieczajace i nie ulegac odszczepie- niu w warunkach sprzegania, b/ grupa zabezpieczajaca musi byc stabilna w warunkach dzia¬ lania reagentu i za wyjatkiem grupy Xan, powinna byc stabilna w warunkach reakcji dobra¬ nych dla usuwania grupy zabezpieczajacej grupe aminowa w polozeniu alfa na kazdym etapie syntezy oraz c/ grupa zabezpieczajaca lancuch boczny.musi dawac usuwac sie, po zakonczeniu syntezy peptydu zawierajacego pozadana kolejnosc aminokwasów, w warunkach reakoji, które nie beda powodowaly zmiany lancucha peptydu.Sposobem wedlug wynalazku peptydy wytwarza sie wykorzystujac synteze na fazie stalej, jak to ogólnie opisal Merrifield, J.Am. Chem. Soo., 85, s.21^9/1963/, jakkolwiek mozna takze stosowac inne, znane w technice równowazne syntezy chemiczne, jak to wspomniano powyzej. Synteze na fazie stalej zaczyna sie od tej strony peptydu, gdzie znajduje sie koncowy atom C, przez sprzegniecie zabezpieczonego °^ -aminokwasu z odpowiednia zywica..Taki material wyjsciowy mozna przygotowac przez przylaczenie *C -aminokwasu z zabezpie¬ czona grupa aminowa wiazaniem estrowym do chlorometylowanej zywicy lub hydroksymetylo¬ wej zywicy, albo tez wiazaniem amidowym do zywicy BHA lub zywicy MBHA. Jesli w wynikowym polipeptydzie ma wystepowac grupa metylo-, etylo- lub propyloamidowa, to stosuje sie zywice chlor ornetylowana lub hydroksymetylowa i rozszczepienie przeprowadza sie za pomoca odpowiedniej aminy, np. etyloaminy.Tak wiec na przyklad przy wytwarzaniu zawierajacego kO reszt aminokwasów peptydu, Ala zabezpieczone przy pomocy BOC sprzega sie z chlorometylowana zywica w sposób, jaki opisali Monahan i Gilon, Biopolymer 12, s. 2513-19, 1973. Po sprzegnieciu BOC-Ala z nos¬ nikiem w postaoi zywicy, usuwa sie grupe zabezpieczajaca grupe aminowa w polozeniu alfa, np. za pomoca kwasu trifluorooctowego /TFA/ w chlorku metylenu, samego TFA alba HC1 w dioksanie. Usuwanie zabezpieczenia przeprowadza sie zwykle w temperaturze pomiedzy okolo 0 C a temperatura pokojowa. Do usuwania konkretnych grup zabezpieczajacych grupe aminowa w polozeniu alfa mozna takze wykorzystywac inne standardowe odczynniki i warunki odszcze- piania, jak to opisano w ksiazce Schroder i Lubke "The Peptides", 1 str. 72-75 /Academio Press 1965/.Po usunieciu grupy zabezpieczajacej grupe aminowa w polozeniu alfa Phe, pozostale aminokwasy z zabezpieczonymi grupami aminowymi w polozeniu alfa i lancuchami bocznymi sprzega sie stopniowo w zadanej kolejnosci w oelu uzyskania okreslonego powyzej zwiazku posredniego, przy czym kazdy aminokwas mozna wprowadzac oddzielnie de syntezy badz sprze¬ gac je wzajemnie ze soba przed wprowadzeniem do reaktora z faza stala. Dobór odpowiedniego odczynnika sprzegajacego zalezy od doswiadczenia. Szczególnie dobrym odczynnikiem do sprzegania jest N,N*-dicykloheksylokarbodiimid /DCCI/.6 1*0 8*l2 srodki aktywujace stosowane w syntezie peptydów na fazie stalej sa dobrze znane w technice peptydów. Przykladami odpowiednich odczynników aktywujacych sa karbodiimidy, takie jak N,N*-diizopropylokarbodiimid oraz N-etylo-N%-/3-dimetyloarainopropylo/karbo- diimid. Inne odczynniki aktywujace oraz ich zastosowanie do sprzegania peptydów opisali j Schroder i Lubke, w/w ksiazka, rozdz, III oraz Kappor w J.Phar.Sci., 59, str. 1-27 /1970/. j Kazdy zabezpieczony aminokwas lub sekwencje aminokwasów wprowadza sie do reaktora j z faza stala w czterokrotnym lub wiekszym nadmiarze, a sprzeganie przeprowadza sie w sro- f dowisku skladajacym sie z mieszaniny dimetyloformamidu /DMF/ i CH2C12 /1:1/, wzglednie / w samym DMF lub CH^Cl^. V przypadku, gdy sprzeganie nie przebiega do konca, procedure } sprzegania powtarza sie przed usunieciem grupy zabezpieczajacej grupe aminowa w polozeniu i alfa przeprowadzanym przed sprzeganiem nastepnego aminokwasu. j.Prowadzenie reakcji sprzegania na kazdym etapie syntezy sprawdza sie reakcja nin- \ hydrynowa, jak to opisali E.Kaiser i in,. Anal. Blochem. 3^» 595 /1970/. Reakcje sprze¬ gania mozna przeprowadzac automatycznie, w automatyczynm syntetyzatorze model Beckman 990, wykorzystujac program taki jak opisali Rivier i inn. Biopolymers 1978, 17, str. 1927-1938.Po zakonozeniu pozadanej sekwencji aminokwasów, posredni peptyd usuwa sie z nos¬ nika w postaci zywicy przez dzialanie odczynnikiem takim jak ciekly fluorowodór, który nie tylko odszczepia peptyd od zywicy, ale zarazem odszczepia wszystkie pozostale grupy zabezpieczajace lanouohy boczne, a wiec grupy X, X , X , X , X5, X , X7 i X , wiazanie laczace X* i grupe zabezpiecza j%oa grupe aminowa w polozeniu alfa, w wyniku czego otrzy¬ muje sie peptyd w postaci wolnego kwasu. Jesli w lancuchu wystepuje Met, wówczas korzys¬ tnie usuwa sie najpierw grupe zabezpieczajaca BOC stosujac mieszanine kwasu trifluoroocto- wego /TFA/ i etanoditiolu, jeszcze przed oWszczepieniem peptydu od zywicy za pomoca HF, aby wyeliminowac potencjalne S-alkilowanie. V przypadku stosowania do odszczepiania fluoro¬ wodoru, do naczynia reakcyjnego wprowadza sie anizol i sulfid metylowo-etylowy celem zmiatania wolnych rodników.V jednym ze sposobów wytwarzania syntetycznych peptydów z zastosowaniem techniki z rekombinowanym DNA, korzystnie wprowadza sie reszte Mat jako dodatkowa reszte na kon¬ cowym atomie azotu i Met nie powinna wystepowac poza tym nigdzie indziej w peptydzie.Podobnie wszystkie reszty uzyte w peptydzie musza byc naturalnymi izomerami L aminokwasów lub Gly. V wyniku tego wytwarza sie korzystny posredni peptyd o wzorze: H-Met-Rj-Ala- Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Tyr-Arg-R12-R^-Leu-Gly-Gln-Leu-R1 g-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R^- R25-Ile-R2y-R28-Arg-Gln^Jln-^ly*Glu-R^-Asn-Gln-Glu-R^g-M^^R^-Arg-R^g-R^^-R^-Y, w którym R1 oznacza Tyr, Leu lub His, Rg oznacza Ser lub Asn, R.. 2 oznacza Arg lub Lys, R.^ oznacza Ile lub Val, R.n oznacza Tyr lub Ser, R^k oznacza His lub Gin, Rpe oznacza Glu lub Asp, R27 oznacza Ala, Nie, Ile, Leu lub Val, R_g oznacza Asn lub Ser, R^j, oznacza Arg lub Ser, R^q oznacza Gin lub Arg, R~g oznacza Arg lub Gly, R^ oznacza Ser lub Ala, R^ oznacza Phe lub Ala, R^o oznacza Asn lub Arg, R^j. oznacza naturalny aminokwas lub des-R.., zas Y oznacza czesc karboksylowa reszty C-koncowego aminokwasu i oznacza -COOH lub -C0NH2.Po wydzieleniu tego peptydu przez genetycznie zmodyfikowany mikroorganizm i wyodreb¬ nieniu oraz oczyszczeniu znanymi sposobami, na zwiazek posredni dziala sie bromowodorem i odszczepia sie reszte Met na koncowym atomie N otrzymujac biologicznie czynny peptyd.Jakkolwiek podany powyzej wzór wskazuje, ze peptyd ten rozciaga sie az do pozycji k$ lub nawet pozycji kkf to, jak juz stwierdzono powyzej, znaczna czynnosc biologiczna wykazuja Juz nawet peptydy zawierajace tylko 27 do 29 reszt.Syntetyozne peptydy wytworzone sposobem wedlug wynalazku porównywano z oczyszczo¬ nym syntetyoznym hpGRF/l-^0/-OH oraz z oczyszozonym syntetycznym hpGRF/l-^0/Phe-Gln-NH2, w toku badan in vitro, w celu okreslenia ich skutecznosci w pobudzaniu do wydzielania hormonu wzrostu. Wszystkie te syntetyczne analogi wykazuja znaczna aktywnosc w wywoly¬ waniu wydzielania GH.1^3 842 7 Badania In vitro przeprowadzano stosujac syntetyczny hpGRF jako wzorzec 1 porówny¬ wano z róznymi zsyntetyzowanymi analogami w równomolowych stezeniach. Stosowano w tym celu hodowle zawierajaoe komórki przysadki mózgowej szczurów, pobrane na cztery do pieciu dni wczesniej. Do badan porównawczych stosowano hodowle uwazane za optymalne w wydzie¬ laniu hormonu wzrostu, postepujac zgodnie ze sposobem9 jaki opisali Yale i in,. Endocri- nology, 91 562-572 /1972/. Przez 3 do k godzin prowadzi sie Inkubacje z badana substancja, a nastepnie pobiera sie próbki pozywki hodowli i przetwarza celem oznaczenia zawartosci dajacego odczyn odpornosciowy GH /ir GH = immunoreactive GH/f z zastosowaniem dobrze zna¬ nej techniki oznaczen radioimraunologicznych.Wyniki tych porównawczych badan z zastosowaniem równomolowych stezen podano ponizej w tabeli 1: Tabela 1 Peptyd Badania in vitro Wzgledna moc dzialania jNle2JJ-hpGRF/l-32/-NH2 3,21 /2,02 - 5,^3/ Jh1s1T -hpGRF/l-32/-NH2 2,15 /1 ,1 2 - k,kl/ [lle23-hpGRF/l-32/-OH 0,20 /0,11 - 0,35/ [p-Tyrl-hpGRF/l-32/-ra2 0,7**/0,^7 - 1,1V [lhe1J -hpGRF/l-32/-NH2 0,13 /0,05 - 0,29/ ^he13 -hpGRF/l-32/-NH2 0,69 /0,26 - 2,63/ [Val2,^-hpGRF/l-32/-0H 0,31 /0,21 - 0,^5/ [His1, Nle27J-hpGRF/l-32/-NH2 3f22 /2,12 - 5,33/ x oznaczana wzgledem hpGRF/l-4o/-Phe-Gln-NH2 Badania in vitro tych syntetycznych peptydów wykazuja, ze EC^ waha sie w zakresie 20-100 pikomoli, zas najnizsze skuteczne stezenie wynosi 3-8 pikomoli. Maksymalne sku¬ teczne stezenie hpGRF/l-4o/-NH2 wynosilo 1 nM.Wyniki tych badan porównawczych dla równomolowych stezen róznych analogów hpGRF bazujacych na rhGRF przedstawiono w tabeli 2.Tabela 2 Peptyd Porównanie, $ hpGRF/l-*lO/-OH /wzorzec dla tego badania/ 100$ rhGRF/1-*l3/-0H 300$ rhGRF/1 -2Q/-:NH2 1100$ [p-Tyr1J-rhGRF/1-29/-:NH2 34$ T)-Tyr1,13 -rhGRF/1-29/-NH2 600$ Tyr1] -rhGRF/1-29/-NH2 920$ Nle2U -rhGRF/1-32/^^ 1390$ [Leu1, Nie27] -rhGRF/1-29/-NH2 480$ [p-His1, D-Tyr10, D-Ala15J -rhGRF/1-29/-NH2 29$ taGRF- jjal^-NH^ 670$ Badania in vitro tych syntetycznych peptydów wykazuja, ze EC^0 waha sie w zakresie 20-100 pikomoli, zas najnizsze skuteczne stezenie wynosi 3-8 pikomoli. Maksymalne sku¬ teczne stezenie rhGRF/1-43/-OH wynosilo 1 nM.Oprócz tych badan wydzielania horj^nu wzrostu in vitro, przeprowadzono równiez bada¬ nia in vitro, wstrzykujac syntetyczny peptyd poprzez oewnik zalozony na stale swobodnie poruszajacym sie szczurom-samcom. Zwierzetom podano uprzednio Fl^A-63, inhibitor hydroksylazy dopaminy, który tlumi spontaniczne wydzielanie GH, bez wplywania na reakcje na zewnetrzny GRF.8 1^3 842 Próbki krwi pobierano przez ten sam cewnik bezposrednio przed oraz po uplywie 5 i 20 minut po wstrzyknieciach; poziomy GH we krwi mierzy sie przez oznaczenia radioimraunologiczne.Wyniki wykazuja, ze syntetyczne analogi hpGRF sa poteznymi stymulatorami wydzielania przy¬ sadkowego GH. Stwierdzono, ze skutecznie dzialaja dawki w zakresie od okolo 20 /ig do okolo 25 MS na kg wagi ciala.Dalsze badania wykazuja, ze znaczna czynnosc wykazuja równiez inne syntetyczne ana¬ logi hpGRF wytwarzane sposobem wedlug wynalazku i z tych badan mozna wyciagnac pewne ogólne wnioskit 1. Amidowanie koncowego atomu C nie wydaje sie zwiekszac aktywnosci peptydów GRF o dlugosci lancucha powyzej 39 reszt, natomiast zwieksza aktywnosc peptydów o dlugosci mniejszej niz 39 reszt. Tak wiec na przyklad [ile2?} -hpGRF/l-32/-NH2 wykazuje wieksza czynnosc niz [lle27j -hpGRF/l-32/-0H; [L-Tyr1,Nle27J -hpGRF/l-32/-NH2 wykazuje wyzsza czynnosc niz E-Tyr1,Nle27J -hpGRF/l-32/-OH; zas £lle27J -hpGRF/l-29/-NH2 wykazuje wyzsza czynnosc niz \±le272 -hpGRF/l-29/-OH. Natomiast £tle27J -hpGRF/l-4V-™2 ™ykazuJo taka sama czynnosc jak Jlle273 -hpGRF/l-^V-0H. 2. W szeregu amidowanych peptydów analogi o 32 resztach sa zasadniczo równie czynne jak odpowiadajace dluzsze analogi, na przyklad [Nie \J -hpGRF/l-32/-NH wykazuje w przy¬ blizeniu te sama czynnosc co prie 7J-hpGRF/l-44/-NH2. 3. V szeregu peptydów z wolna koncowa grupa karboksylowa, odpowiadajace analogi posiadajace wiecej ni9 39 reszt wykazuja jednakowa czynnosc. Tak wiec na przyklad [val27!l -hpGRF/l-^0/-0H i rVal27J -hpGRF/l-44/-OH wykazuja jednakowa czynnosc, podobnie jak fb-Tyr1, Nle27/]-hpGRF/l-4o/-OH oraz [p-Tyr1, Nie2!/ -hpGRF/l-4V-0H.Syntetyczne analogi hpGRF powinny byc przydatne w zastosowaniach, w których lekarz pragnie zwiekszyc wytwarzanie GH. Pobudzenie wydzielania GH przez analogi hpGRF jest pozadane w przypadku pacjentów, u których wystepuje calkowity lub tez wzgledny niedobór GH spowodowany przez niedostateczne wytwarzanie endogennego GRF. Jest ponadto rzecza prawdopodobna, ze zwiekszone wydzielanie GH i towarzyszace temu zwiekszenie wzrostu mozna byloby osiagnac takze u ludzi i zwierzat z normalnymi poziomami GH. Ponadto podawanie hpGRF mogloby zmienic ilosc tluszczu w organizmie i zmodyfikowac takze inne, uzaleznione od GH procesy metaboliczne, immunologiczne i rozwojowe.Tak wiec na przyklad analogi hpGRF moga byc uzyteczne jako srodki stymulujace procesy anaboliczne u ludzi w takich stanach, jak po przebytych oparzeniach. W innym przy¬ kladzie analogi hpGRF mozna podawac zwierzetom hodowlanym, takim jak kurczaki, indyki, swinie, kozy, owce i bydlo, w celu przyspieszenia wzrostu i podniesienia uzyskiwanego stosunku bialka do tluszczu. Mozna je takze stosowac w gospodarce wodnej do hodowli ryb oraz innych morskich zwierzat zimnokrwistych, np. zólwi morskich i wegorzy oraz zwierzat ziemnowodnych. Dla podawania ludziom syntetyczne analogi hpGRF powinny miec czystosc co najmniej okolo 93$ i korzystnie co najmniej 98/° • Czystosc taka oznacza, ze zadany peptyd wystepuje w ilosci odpowiadajacej # wagowym posród wszystkich obecnych podobnych pepty¬ dów i fragmentów peptydów.Dla podawania syntetycznych analogów hpGRF zwierzetom hodowlanych lub tez innym zwierzetom dla pobudzenia ich wzrostu i zmniejszenia zawartosoi tluszczu, dopuszczalna moze byc czystosc nawet okolo 5%$ lub tez nawet tak niska jak 0,001#. V przypadku wytwa¬ rzania metodami inzynierii genetyoznej analogi te moga poczatkowo miec bardzo niska czystosc, Syntetyozne analogi hpGRF lub tez ich nietoksyczne sole, w polaczeniu z farmaceuty¬ cznie lub weterynaryjnie dopuszczalnym nosnikiem tworzace kompozyoja farmaceutyczna, mozna podawac ludziom i zwierzetom dozylnie, podskórnie, domiesniowo, przez nos lub doustnie. Podawanie moze byc wykorzystywane przez lekarza w celu pobudzenia wydzielania GH wówczas, gdy leczony organizm wymaga takiego sposobu leczenia. Pozadane dawkowanie bedzie uzaleznione od konkretnego leczonego stanu, surowosoi przebiegu tego stanu i ozasu trwania przewidywanego leczenia.1^3 Sk2 9 Peptydy takie czesto podaje aie w postaci farmaceutycznie lub weterynaryjnie do¬ puszczalnej soli, takiej Jak sole addyoyjne z kwasami lub zwiazki kompleksowe z meta¬ lami, np. z cynkiem| zelazem lub podobnym pierwiastkiem /które dla celów niniejszego opisu uwaza sie za sole/. Przykladem takich soli addycyjnych z kwasami sa chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, fosforan, maleinian, octan, cytrynian, benzoesan, bursztynian, jablczan, askorbinian, winian itp. Jesli skladnik czynny ma byc podawany doustnie w po¬ staci tabletki, wówczas tabletka moze zawierac srodek wiazacy, taki Jak tragakanta, skrobia kukurydziana lub zelatyna; srodek dezintegrujacy, taki Jak kwas alginowy; oraz srodek smarny, taki Jak stearynian magnezu. Jesli pozadane Jest podawanie w cieklej po¬ staci, wówczas mozna stosowac srodki slodzace i/lub porawiajace smak; mozna takze sto¬ sowac podawanie dozylnie w soli fizjologicznej, roztworach buforów fosforanowych i po¬ dobnych roztworach.Peptydy nalezy podawac ludziom pod kontrola lekarza i kompozycje farmaceutyczne beda zwykle zawieraly peptyd w polaczeniu z konwencjonalnym, farmaceutycznie dopuszczal¬ nym nosnikiem. Zwykle dawka pozajelitowa bedzie wynosic od okolo 20 ug do okolo 25 ug peptyd u na kg wagi ciala organizmu.V podanych ponizej przykladach przedstawiono korzystny sposób przeprowadzenia syn¬ tezy analogów hpGRP z zastosowaniem techniki reakcji na fazie stalej.Przyklad I. Synteze /"ile 7_7-hpGRF/1-^0/-NH2 o wzorze: H-Tyr-Ala-Asp-Ala« Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile- Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH- przeprowadza sie stopniowo, wykorzystujao syntetyzator peptydów model Beckman 990, na przeprowadzonej w chlorowo¬ dorek zywicy MBHA, takiej jak dostarczana przez firme Bachem, Inc., posiadajaca zakres podstawienia do okolo 0,1 do 0,5 mmoli/g zywicy. Sprzeganie BOC-Ala z zywloa przepro¬ wadza sie wykorzystujac ogólny sposób opisany ponizej w Harmonogramach A i B, który wy¬ korzystuje sie w trakcie calej syntezy i który daje w wyniku podstawienie okolo 0,35 mmola Ala na gram zywicy. Wszystkie stosowane rozpuszczalniki starannie odgazowuje sie, przedmuchujao je gazem obojetnym, np. helem lub azotem, aby zapewnic nieobecnosc tlenu, którym móglby utleniac siarke z reszty Met.Po odblokowaniu i zobojetnieniu, na zywicy buduje sie stopniowo lancuch peptydu.Odblokowanie, zobojetnianie i dodawanie kazdego aminokwasu przeprowadza sie ogólnie bio¬ rac zgodnie z procedura przedstawiona szczególowo w opisie patentowym Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki nr k 292 313.Odblokowanie korzystnie przeprowadza sie wedlug przedstawionego ponizej Harmono¬ gramu A: Harmonogram A Odozynnik Czas mieszania /min/ 1. 60#TFA /2# etanoditiol 10 2. 60% TFA /Zf etanoditiol 15 3. IPA /1# etanoditiol 0,5 h. Et3N /10£/ wCILjC^ 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N /10#/ wCH2C12 0,5 7. MeOH/dwukrotnie/ 0,5 8. CH2C12 /dwukrotnie/ 0,5 Operaoje sprzegania korzystnie przeprowadza sie zgodnie z przedstawionym ponizej Harmonogramem Bi Harmonogram B Odczynnik Czas mieszania /min/ 9. DCCI 10. BOC - aminokwas 50-90 11. MeOH/dwukrotnie/ 0,510 1*3 8*l2 12. CH2C12 /dwukrotnie/ 0,5 13. Ao20 /3M/ w CH2C12 15,0 14. CHCl 0,5 15. MeOH 0,5 16. CH2C12 /dwukrotnie/ 0,5 V skrócie Jeden do dwu mmoli zabezpieczonego BOC aminokwasu w ohlorku metylenu sto¬ suje sie na gram zywicy, plus Jeden równowaznik 1,0 M DCCI w ohlorku metylenu na 2 godzirry.Podozas sprzegania BOC-Arg/Tos/ stosuje sie mieszanine 50$ EMF i chlorku metylenu. Jako grupe zabezpieozajaoa hydroksylowy lancuch boczny Ser i Thr stosuje sie eter Bzl. Do akty¬ wowania karboksylowego konca Asn lub Gin stosuje sie ester p-nitrofenylowy /ONp/ i na przyklad BOC-Asn/ONp/ sprzega sie przez noc, stosujac Jeden równowaznik HOBt w 50% mie¬ szaninie DMF i ohlorku metylenu, w którym to przypadku nie dodaje sie Juz DCC. V przypad¬ ku stosowania sprzegania DCC zamiast wykorzystywania aktywnego estru, grupe amidowa Asn lub Gin zabezpiecza sie Xan. Jako grupe zabezpieczajaca dla bocznego lancucha Lys sto¬ suje sie grupe 2-ohlorobenzyloksykarbonylowa /2-C1-Z/.Dla zabezpieczenia guanidynoweJ grupy Arg stosuje sie Tos, zas karboksylowa grupe Glu lub Asp zabezpiecza sie jako ester Bzl /OBzl/. Fenolowa grupe hydroksylowa Tyr zabez¬ piecza sie grupa 2,6-dlchlorobenzylowa /DCB/. Po zakonczeniu syntezy otrzymuje sie na¬ stepujacy zwiazek: X1-Tyr/X2/-Ala-Asp/X3/-Ala-Ile-Phe-Thr/xV-Asn/X5/-Ser/xV-Tyr/X2/- Arg/X6/-Lys/X7/-Val-Leu-Gly-Gln/X5/-Leu-Ser/xV-Ala-Arg/X6/-Lys/X7/-Leu-Leu-Gln/X5/-Asp /X3/-Ile-Ile-Ser/xV-Arg/X6/-Gln/X5/-Gln/X5/-Gly-Glu/X3/-SerAV-Asn/X5/-CJln/X5/-Glu/X3/- Arg/X /-Gly-Ala-X , w którym X oznaoza BOC, X oznacza DCB, XJ oznacza ester benzylowy, X oznaoza Bzl, X3 oznaoza Xan, X oznacza Tos, X/ oznacza 2-C1-Z, zas X oznacza grupe -NH- zywicy nosnika. Grupa Xan moze byc ozesciowo lub calkowloie usunieta w wyniku dzia¬ lania TFA uzytego dla odblokowania grup zabezpieczajacych grupy aminowe w polozeniu alfa.Po sprzegnieciu z zywioa konoowej reszty Tyr, BOC usuwa sie 60% TFA w CH2C12.V oelu odszozepienia i usuniecia grup zabezpieczajacych z pozostalego zabezpieczonego peptydu-zywioy, traktuje sie go 1,5 ml anizolu, 0,5 ml siarczku metylowoetylowego i 15 ml fluorowodoru /HF/ na gram peptydu-zywicy, przez pól godziny w temperaturze -20°C i przez pól godziny w 0 C. Po usunieciu HF w warunkach wysokiej prózni, pozostalosc peptydu- zywioy przemywa sie na przemian suchym eterem etylowym i ohloroformem, po czym peptyd ekstrahuje sie odgazowanym 2N wodnym roztworem kwasu octowego i oddziela sie od zywicy przez odsaczenie.Odszczepiony i uwolniony od grup zabezpieczajacych peptyd rozpuszcza sie nastepnie w 0-5$ kwasie octowym i poddaje oczyszczaniu, które moze obejmowac saczenie przez drobno¬ ziarnisty zel Sephadex G-50.Peptyd oczyszcza sie nastepnie wykorzystujao preparatywna lub semipreparatywna oleczowa chromatografie cisnieniowa, jak to opisali Rivier i in., Peptidest Structure and Biological Function, s. 125-8 /1979/ oraz Marki i in. , J.Am.Chem.Soc. 103, 3178 /1981/.Ykladki Yaters Associates prep LC-500 napelnia sie 15-20 C^g Silioa z f-my Vydac /300A/.Przy pomocy niskocisnieniowego wytwornika gradientu Eldei wytwarza sie gradient CH~CN w TEAP, Jak to opisal J.Rivier, J.Liq. Chromatography 1, 3^3-367 /1978/. Frakcje chroma¬ tograficzne kontroluje sie dokladnie metodami cieczowej chromatosrafii cisnieniowej i laozy sie jedynie frakoje wykazujaoe wysoka czystosc. Odsalanie oczyszczonych frakcji, badanych niezaleznie celem okreslenia ioh czystosci, przeprowadza sie z zastosowaniem gradientu CH CN w 0,1# TFA. Srodkowa frakcje poddaje sie nastepnie liofilizacji celem otrzymania pozadanego peptydu, którego ozystosó Jest wyzsza niz 98#.Synteze powtarza sie stosujac chlorometylowana zywice celem wytworzenia tego samego peptydu w postaci wolnego kwasu, jak to ogólnie opisal J.Rivier, J.Am.Chem.Soc., 96, 2986-2992 /197V.143 842 11 Przyklad II. Synteze /Val27f D-Ala28-7-hpGRP/l-40/-NH2 o wzorze: H-Tyr- Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-tSor-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu- Gln-Asp-Ile-Val-D-Ala-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-3er-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 przeprowadza sie stopniowo| wykorzystujac syntetyzator peptydów model Beckman 990, na zywicy MBHA w spo¬ sób opisany w przykladzie I# Wykorzystujac chromatografie cienkowarstwowa i cieczowa ohromatografie cisnieniowa okreslono peptyd jako zasadniczo biorac czysty* Przyklad III.Synteze skróconego analogu hpGRF^Nle277-hpGR?/l-32/-OT2 o wzorze:H-Tyr- Ala-Asp-Ala-Ile-Pbe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- -Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH^ przeprowadza sie stopniowo, wykorzystujac syntetyzator peptydów model Beckman 990, na zywicy MBHA sposobem opisanym w przykladzie I.Wykorzystujac chromatografie cienkowarstwowa i cieczowa chromatografie oisnianiowa okre¬ slono ten analog jako zasadniczo biorac czysty* Skrecalnosó optyczna zmierzono na pola¬ rymetrze fotoelektrycznym uzyskujac wartosc £*L _/- = -57,8 ? 1/C«1f l£ kwas octowy, ~ & 27 nieskorygowana/. Ta sama ogólna synteze wykorzystano dla otrzymania fole V-hpGRF/l-^^/-NH9. 2*7 Przyklad IV# Synteze /"Ile /_7-hpGRP/l-32/-OH o wzorze: H-Tyr-Ala-Asp- Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln^Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH przeprowadza sie stopniowo, wykorzystujac syntetyzator peptydów model Beckman 990, na chlorometylowanej zywicy, w sposób opisany na koncu przykladu I. Wykorzystujac chromatografie cienkowarstwowa i cieczowa chromatografie cis¬ nieniowa okreslono peptyd jako zasadniczo biorac czysty. Skrecalnosó optyczna zmierzono na polarymetrze fotoelektrycznym uzyskujac wartosc £4*]% =-6l,7°+1 /C=1, 1# kwas octowy, nieskorygowana/.Synteze powtórzono wykorzystujac zywice MBHA do wytworzenia tego samego peptydu w postaci amidowanej.Przyklad V. Synteze ^Bia]/-hpGRF/l-32/-NH2 o wzorze: H-His-Ala-Asp-Ala- Ile-Phe-Inr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 przeprowadza sie stopniowo, wykorzystujac syntetyzator pepty¬ dów model Beckman 990, na zywicy MBHA w sposób opisany w przykladzie I. Wykorzystujao chromatografie cienkowarstwowa i cieczowa chromatografie cisnieniowa okreslono peptyd jako zasadniczo biorac czysty. Skrecalnosó optyczna zmierzono na polarymetrze fotoelektrycz- nym, uzyskujac wartosc /c^/D = -58,7 ±1 /C=1, 1# kwas octowy, nieskorygowana/.Synteze powtórzono stosujac Phe jako ostatnia reszte celem wytworzenia /l*heV-hpGRF /l-32/-NH2. Skrecalnosó optyczna zmierzono na polarymetrze fotoelektrycznym uzyskujac wartosc /"od^/^s -58,2° ±1 /C =1, 1# kwas octowy, nieskorygowana/.Przyklad YI. Synteze /Phe1^7-hpGRF/l-32/-NH2 o wzorze: H-Tyr-Ala-Asi-Ala- Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Phe-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 przeprowadza sie stopniowo wykorzystujac syntetyzator pepty¬ dów model Beckman 990, na zywicy MBHA sposobem opisanym w przykladzie I. Wykorzystujac chromatografie cienkowarstwowa i cieczowa chromatografie cisnieniowa okreslono peptyd zasadniczo jako czysty. Skrecalnosó optyczna zmierzono na polarymetrze fotoelektryoznym i uzyskano wartosc [°tj\ = -59|5°±1 /C=1, 1# kwas octowy, nieskorygowana/.Przyklad VII. Synteze ^Val 7_7-hpGRF/l-32/-0H o wzorze: H-Tyr-Ala-Asp- -Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- -Asp-Ile-Val-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH przeprowadza sie stopniowo wykorzystujac syntety¬ zator peptydów model Beckman 990, na ohlorometylowanej zywicy, sposobem opisanym na koncu przykladu I. Wykorzystujac chromatografie cienkowarstwowa i oieczowa chromatogra¬ fie cisnieniowa okreslono peptyd zasadniczo jako czysty. Skrecalnosó optyczna zmierzono na polarymetrze fotoelektrycznym uzyskujac wartosc £^J^ =-62#4°*1/C=1, 1# kwas octowy, nieskorygowana/.12 1^3 842 Przyklad VIII. Synteze ^Eis1, Nle2^7-hpGRF/l-32/-NH2 o wzorze: H-His-Ala- -Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Ar^-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- -Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-XH2 przeprowadza sie stopniowo, wykorzystujac syntety¬ zator peptydow model Beckman 990, na zywicy MBHA sposobem opisanym w przykladzie I. Na drodze chromatografii cienkowarstwowej i cieczowej chromatografii cisnieniowej okreslono peptyd zasadniczo Jako czysty. Skrecalnosc optyczna zmierzona na polarymetrze fotoelektrycz- nym wynosila / Przyklad IX. Synteze analogu hpGRF, tzn. ^frle2^7-rhGRF-/l-32/-NH o wzorze: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-- -.Leu-Leu-His-Glu^Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 przeprowadza sie stopniowo, wykorzystu¬ jac syntetyzator peptydow model Beckman 990, na zywicy MBHA jak w przykladzie I. Wykorzy¬ stujac chromatografie cienkowarstwowa i cieczowa chromatografie cisnieniowa okreslono ten analog zasadniczo biorac jako czysty. Skreoalnosc optyczna, zmierzona na polarymetrze fotoelektrycznym, wynosi /czJD =-55,8^+l/C=1 , 1$ kwas octowy, nieskorygowana/.Przyklad X. Synteze fragmentu analogu hpGRF, tzn. /5-Tyr1^7-rhGRF/l-29/-NH2 o wzorzet H*His-Ala»Asp-Aia-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr- -Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 przeprowadza sie stopniowo, wykorzy¬ stujac syntetyzator peptydow model Beckman 990, na zywicy MBHA jak w przykladzie I. Wy¬ korzystujac chromatografie cienkowarstwowa i cieczowa chromatografie cisnieniowa okreslo¬ no peptyd Jako zasadniczo biorac czysty.Synteze powtórzono podstawiajac D-Tyr zamiast His na koncowym atomie N. Otrzymano nym uzyskujac wartosc fi^J =-b3,6 + J/C=1, 1% kwas octowy, nieskorygowana/.Przyklad XI. Synteze ^t?le2^7-rhGRF/l-29/-NH2 o wzorze: H-His-Ala-Asp-Ala- -Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-GIu- -Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 przeprowadza sie stopniowo, wykorzystujac syntetyzator peptydow model Beckman 990, na zywicy MBHA, jak w przykladzie I. Wykorzystujac chromato¬ grafie cienkowarstwowa i cieczowa chromatografie cisnieniowa okreslono peptyd jako za¬ sadniczo biorac ozysty. Skrecalnosc optyczna zmierzono na polarymetrze fotoelektrycznym^ uzyskujac wartosc /"«^/^2=-52,6°1/C=1 , 1# kwas octowy, nie skorygowana/.Przyklad XII. Synteze analogu hpGRF, tzn. ^D-His1, D-Tyr10, D-Ala1£#7-rhGRF/ /l-29/-NH2 o wzorze: H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-D-Ala- -Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2przeprowadza sie stopniowo, wykorzystujac syntetyzator peptydow model Beckman 990, na zywicy MBHA Jak w przykladzie I.Wykorzystujac chromatografie oienkowarstwowa i oieczowa chromatografie cisnieniowa okres¬ lono peptyd jako zasadniczo biorac czysty. Skrecalnosc optyczna zmierzona na polarymetrze fotoelektrycznym wynosi £^J^ =-64,5+1/0=1 , 1/o kwas octowy, nieskorygowana/.Przyklad XIII. Synteze analogu hpGRF, tzn. f^yr ^7-rhGRF-/l-29/-NH o wzorze: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys- -Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 przeprowadza sie stopniowo w syntetyzatorze pepty¬ dow model Beckman 990, na zywicy MBHA, Jak w przykladzie I. Wykorzystujac chromatografie oisnieniowa i cienkowarstwowa okreslono peptyd Jako zasadniczo biorac ozysty. Skrecalnosc optyczna zmierzona na polarymetrze fotoelektrycznym wynosi ficj^ =-^9,^1/0=1, 1/6 kwas octowy, nieskorygowana/.143 8kZ 13 Zastrzezenie. patentowe Sposób wytwarzania nowych biologicznie czynnyoh peptydów o wzorze 1: H-R-Ala-Asp- -Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-R10-Arff-R12-Rj~-Leu-R ~-Gln-Leu-R 8-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R2j- -R25-Ile-R27-R28-Arg^ln-Gln^ly-Glu-R3^-A^ w którym R1 oznacza Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His lub His; Rfl oznacza Ser lub Asn; R^0 oznacza Tyr,Phe lub D-Tyr;R12 oznacza Arg lub Lys; FU, oznacza Ile lub Val; R^oznacza Gly lub D-Ala;R1Q oznacza Tyr lub Ser;R24 oznacza His lub Gln;R2c oznacza Glu lub Asp;R2y wybrany jest z grupy obejmujacej izomery D i L Ala,Nie,Ile,Leu i Val;R2Q oznacza Ser,Asn lub D-Ala;R,^ oznacza Arg lubSer;R^8 oznacza Gin lub Arg;R^ oznacza Arg lub Gly-R^ oznacza Ser lub Ala; R^ oznacza Phe lub Ala; R^, oznacza Asn lub Arg; R^ oznacza reszte naturalnego aminokwasu lub des-R^jL; Y oznacza grupe -COOH lub -C0NH2 lub o dlugosci lancucha od R1 do oo najmniej R 7, znamienny tym, ze aminokwasy, w Których przynajmniej grupy *£ -aminowe sa zabezpieczone, sprzega sie ze soba w kolejnosci okreslonej wzorem 1 w lancuch o dlu¬ gosci od R. do co najmniej R27' m*toda syntezy na fazie stalej stosujac 1 do 2 milimoli zabezpieczonego aminokwasu na 1 g zywicy, w rozpuszczalniku, korzystnie w chlorku mety¬ lenu lub dimetyloformamidzie lub w ich mieszaninie, po czym z wytworzonego peptydu za- 1 2 wiaraJacego oo najmniej Jedna grupe zabezpieczajaca, o wzorze 2: X-R./X lub R /-Ala-Asp/- /X3/-Ala-Ile-Phe-Thr/xV-H8/X4 lub X5/-Ser/xV-R10/X2/-Arg/X6/-Rl2/X6 lub X7/-Rl3-L«u- -R15-Gln/X5/-Leu-Rt 8/X2/-Ala-Arg/X6/-Lys/X7/-Leu-Lou-R2^/x lub X5/-R25/X3/-Ile-R2?-R28/X2f lub X5/-Arg/X6/-Gln/X5-Gln/X5/-01y-Glu/X3/-R3il/XZf lub X6/-Asn/X5/-Gln/X5/-Glu/X3/-R38/X5 lub X6/-R3 /X6/-Ril0/xV-Arg/X6/-R42"R43/x5 lub ^/-Rj^/*8/-*9 w którym X1 oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe o<# -aminowa, korzystnie BOC, X oznacza atom wodo- 2 ru lub grupe zabezpieczajaca azot imidazolu w His, korzystnie Tos, X oznacza atom wodo¬ ru lub grupe zabezpieczajaoa fenolowa grupe hydroksylowa Tyr, korzystnie grupe 2,6-di- k lub Glu, korzystnie Bzl, X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca alkoholowa grupe hydroksylowa Thr lub Ser, korzystnie grupe Bzl, X* oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca amidowa grupe bocznego lanoucha Asn lub Gin, korzystnie grupe Xan, X 7 oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe guanidynowa Arg, korzystnie Tos, X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe aminowa bocznego lancucha Lys, ko- Q rzystnie grupe 2-chlorobenzyloksykarbonylowa, X oznacza atom wodoru lub grupe zabezpie¬ cz ozajaoa boczny lancuch, Jak okreslono powyzej, X7 oznacza -0-CH2-nosnik polimerowy lub -NH-nosnik polimerowy, a R1, RQt RAQt R12, R13, R15, RlQ, R^, R25, R2?, R2g, R^, R3Q, R3Q» RkOf Rk2' Rk1 * Rkk maJ^ wyzej podane znaczenie lub z peptydu o dlugosci lancucha od R1 do co najmniej R2~ usuwa sie grupy zabezpieczajace i odszczepia sie peptyd za¬ wierajacy co najmniej 27 reszt aminokwasów od nosnika polimerowego przy uzyciu kwasu trójfluorooctowego w rozpuszczalniku, korzystnie CH2C12, a nastepnie fluorowodoru ze zmiataczem, korzystnie anizolem lub sulfidem metyIowo-etylowym lub ich mieszanina, w nis¬ kiej temperaturze, korzystnie okolo 0 C do -20 C, po czym rozpuszcza sie w rozpuszczal¬ niku, korzystnie w kwasie octowym i oczyszcza sie znanym sposobem. PL PL