JPH0689033B2 - Ｇｒｆ類似体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトおよび他の動物（特に哺乳動物）の脳下垂
体の機能に影響を与えるペプチドに関する。より詳細に
は、本発明は脳下垂体による成長ホルモンの放出を促進
させるペプチドに関する。

発明の背景 生理学者は視床下部でつくられる脳下垂体ホルモンの分
泌を誘発させる特定のポリペプチドが腺下垂体の分泌の
全てを調節するということを長期にわたり認めてきてい
る。成長ホルモン（GH）の分泌を阻害する阻害因子も性
状決定がなされており、これはソマトスタチンと命名さ
れている。

脳下垂体GHのための対応する視床下部の放出因子は最近
ヒトの膵臓腫瘍からの抽出物から分離され、精製され、
性状決定がなされ、合成されて試験された。このペプチ
ドの配列は次のとおりである： Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr−
Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−
Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Arg−Gln−
Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−Arg−Gly−Ala−
Arg−Ala−Arg−Leu。

このペプチドのアミド化体が存在すると考えられ、これ
は今後hpGRF（ヒト膵臓腫瘍GH放出因子）と表示する。

発明の概要 今や、培養した脳下垂体細胞からGHを放出させるペプチ
ドがラツトの視床下部抽出物から分離され、精製され、
性状決定がなされ、合成されて試験された。この43個の
アミノ酸残基からなる天然に存在するペプチドの配列は
次のとおりである： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg−G
ln−Gln−Gly-Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg−Se
r−Arg−Phe−Asn−OH。

このペプチドは今後rhGRF（ラツト視床下部GH放出因
子）と表示する。

また、hpGRFそれ自体よりも効力が優れたhpGRF類似体
（これらのうちの多くはその長さがhpGRFよりも短か
い）が合成されて試験された。これらの類似体のいくつ
かはrhGRFの式に一致する置換を基準にしているが、他
の類似体は他の置換を基準にしている。本発明による医
薬組成物は薬学的に許容される液体または固体の担体中
に分散されたこれらのhpGRF類似体またはその無毒性塩
を含有する。このような医薬組成物はヒトおよび家畜の
治療目的のために投与される臨床薬剤として、あるいは
また診断用に使用される。さらに、それらは温血動物
（鶏を含む）の成長を促進させるために、また冷血動物
（例えば、魚やうなぎ）の養殖用に使用される。

発明の開示 ペプチドを定義するのに使用する命名法は SchroderおよびLubkeによる“The Peptides"アカデミツ
クプレス（1965年）に規定されたものであり、ここでは
一般的表示に従つてN-末端のアミノ基は左に、そしてC-
末端のカルボキシル基は右に記載される。天然アミノ酸
はGly,Ala,Val,Leu,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,Asp,Asn,Glu,
Gln,Cys,Met,Phe,Tyr,Pro,TrpおよびHisからなる蛋白質
中に見い出されて天然に存在する一般のアミノ酸のうち
の一種を意味する。アミノ酸残基が異性体形をもつ場
合、もし他に特定して指示されなければL-型のアミノ酸
を意味する。本出願にとつて、rhGRFはhpGRFの類似体で
あると考えられる。

本発明は次式で示される合成hpGRFペプチド類似体また
はその無毒性塩を提供する。

Ｈ−R₁−Ala−Asp−Ala−Ila−Phe−Thr−R₈−Ser−R₁₀
−Arg−R₁₂−R₁₃−Leu−R₁₅−Gln−Leu−R₁₈−Ala−Arg
−Lys−Leu−R₂₄−R₂₅−Lle−R₂₇−R₂₈−Arg−Gln−Gln
−Gly−Glu−R₃₄−Asn−Gln−Glu−R₃₈−R₃₉−R₄₀−Arg
−R₄₂−R₄₃−R₄₄−Ｙ 式中、R₁はTyr,Met,D−Tyr,Phe,D−Phe,Leu,D−Hisまた
はHis;R₈はSerまたはAsn;R₁₀Tyr,PheまたはＤ−Tyr;R₁₂
はArgまたはLys;R₁₃はIleまたはVal;R₁₅はGlyまたはＤ
−Ala;R₁₈はTyrまたはSer;R₂₄はHisまたはGln;R₂₅はGlu
またはAsp;R₂₇はAla,Nle,Ile,Leu,MetおよびValのD-お
よびL-異性体からなる群から選択される；R₂₈はSer,Asn
またはＤ−Ala;R₃₄はArgまたはSer;R₃₈はGlnまたはArg;
R₃₉はArgまたはGly;R₄₀はSerまたはAla;R₄₂はPheまたは
Ala;R₄₃はAsnまたはArg;R₄₄は天然アミノ酸またはデス
‐R₄₄；そしてＹはC-末端のアミノ酸残基のカルボキシ
ル部分を意味しかつ基−COOR,−CRO−CONHNHR,−CON
（Ｒ）（Ｒ′）または−CH₂ORであり、ここでＲおよび
Ｒ′は低級アルキル基、フルオロ低級アルキル基または
水素である。但し、R₁がTyrである時R₂₇はMet以外のも
の、R₈はSer、R₁₂はArg、R₁₃はIle、R₁₈はTyr、R₂₄はHi
s、R₂₅はGlu、R₂₈はAsn、R₃₄はArg、R₃₈はGlu、R₃₉はAr
g、R₄₀はSer、R₄₂はPheそしてR₄₃はAsnである。また残
基28〜44のいずれかまたは全部を削除して生物学的に活
性な断片を提供することができる。メチル基、エチル基
およびプロピル基が好ましい低級アルキル基である。前
記のペプチド断片はまた生物学的活性を有しており、そ
して一般にそのペプチドは少なくともN-末端から残基27
まで延びるべきものと考えられる。ペプチド断片が残基
27および28まて延びる場合にはＹはNH₂または置換アミ
ドであるべきであるが、その断片が残基29〜39のうちの
１つまで延びる場合にはＹは好ましくはアミドまたは置
換アミドである。

27-位のMetの代りに指定した置換基のうちの１つをもつ
hpGRFは、特に酸化条件にさらした時、実質的により大
きな安定性を示す。さらに、その置換基がD-異性体であ
る場合には酵素に対する抵抗性が高められるかも知れな
い。それらは十分に生物学的活性を残しており、そして
ある種の類似体は試験管内で試験した時驚くほどに増大
した効力を示す。1-位をHisで置換すると非常に強い効
力が得られる。その上、D-異性体アミノ酸（例えば、Ｄ
−Tyr）での置換は驚くべき効能を保持しており、そし
てある種の酵素による分解に対してそのペプチドに抵抗
性を付与することから極めて価値があるものである。

これらのペプチドは、例えば固相法のみで、部分的固相
法で断片縮合で、古典的な溶液カツプリングで、または
最近開発された組み換えDNA法のような適当な方法で合
成される。例えば、固相法のみの合成法はStewartおよ
びYoungによる“Solid-Phase Peptide Synthesis"、フ
リーマン社、サンフランシスコ（1969年）に説明されて
おり、そして1978年８月８日発行のVale等による米国特
許第4105603号明細書により例示される。断片縮合法は
米国特許第3972859号明細書（1976年８月３日）に例示
される。他の利用可能な合成法は米国特許第3842067号
（1974年10月15日）および同第3862925号（1975年１月2
8日）の各明細書により例示される。

組み換えDNA法の使用による合成は、本出願にとつて、h
pGRF類似体またはその断片の所望形体をコード化する構
造遺伝子の適当な使用を包含すると理解されるべきであ
る。合成hpGRFペプチドはこのような構造遺伝子と共に
プロモーターおよびオペレーターを含む発現ベクターを
使用して微生物を形質転換し、こうして形質転換した微
生物にhpGRFペプチドを発現させることにより得ること
ができる。ヒト以外の動物もまた、このような構造遺伝
子と米国特許第4276282号明細書（1981年６月30日）に
記載された一般方法を使用して、あるいは1983年５月26
日に発行されたWO83/01783および1982年12月23日に発行
されたWO82/04443に記載されたような発生初期の脊椎動
物の顕微注入を使用して、遺伝子操作することによりhp
GRFペプチドを産生させるのに使用できるかも知れな
い。合成hpGRFペプチドはさらに２冊のWO出版物に記載
された方法により成長促進が意図される動物中で直接生
産されてもよい。

各種アミノ酸部分の不安定な側鎖基を適当な保護基で保
護することは化学合成において一般的なことであり、そ
の保護基は保護基が最終的に除去されるまでのその部位
での化学反応の発生を妨げるだろう。アミノ酸または断
片がカルボキシル基の部位で反応する間これらのα‐ア
ミノ基もまた通常保護され、続いてそのアミノ基の部位
で反応を行うためにα‐アミノ保護基は選択的に除去さ
れる。従つて、適当な残基に結合された側鎖保護基をも
つペプチド鎖中に所望の配列で位置するアミノ酸残基を
含む中間体化合物が、合成の一段階として、製造される
ということは一般的なことである。

次式の中間体は本発明の範囲内であると考えられる。

X¹−R₁（ＸまたはX²）−Ala−Asp（X³）−Ala−Ile−Ph
e-Thr（X⁴）−R₈（X⁴またはX⁵）−Ser（X⁴）−R
₁₀（X²）−Arg（X⁶）−R₁₂（X⁶またはX⁷）−R₁₃−Leu−
R₁₅−Gln（X⁵）−Leu−R₁₈（X²）−Ala−Arg（X⁶）−Ly
s（X⁷）−Leu−Leu−R₂₄（ＸまたはX⁵）−R₂₅（X³）−I
le−R₂₇−R₂₈（X⁴またはX⁵）−Arg（X⁶）−Gln（X⁵）−
GIn（X⁵）−Gly−Glu（X³）−R₃₄（X⁴またはX⁶）−Asn
（X⁵）−Gln（X⁵）−Glu（X³）−R₃₈（X⁵またはX⁶）−R
₃₉（X⁶）−R₄₀（X⁴）−Arg（X⁶）−R₄₂−R₄₃（X⁵または
X⁶）−R₄₄（X⁸）−X⁹ 式中、X¹は水素原子またはα‐アミノ保護基である。X¹
により意図されるα‐アミノ保護基はポリペプチドの段
階合成法の技術において有用であることが広く知られて
いる保護基である。X¹として使用してもよいα‐アミノ
保護基の部類には（１）芳香族ウレタン型保護基、例え
ばフルオレニルメチルオキシカルボニル基（FMOC）、ベ
ンジルオキシカルボニル基（Ｚ）およびp-クロロベンジ
ルオキシカルボニル基、p-ニトロベンジルオキシカルボ
ニル基、p-ブロモベンジルオキシカルボニル基またはp-
メトキシベンジルオキシカルボニル基のような置換され
たベンジルオキシカルボニル基；（２）脂肪族ウレタン
型保護基、例えばt-ブチルオキシカルボニル基（BO
C）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル基、イソ
プロピルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基お
よびアリルオキシカルボニル基；並びに（３）シクロア
ルキルウレタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシ
カルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基および
シクロヘキシルオキシカルボニル基；が含まれる。好ま
しいα‐アミノ保護基はBOCである。

Ｘは水素原子またはTosのようなHisのイミダゾール窒素
のための保護基である。

X²はTyのフエノール性ヒドロキシル基のための適当な
保護基であつてよく、例えばテトラヒドロピラニル基、
t-ブチル基、トリチル基、Bzl,CBZ,4Br−CBZおよび2,6-
ジクロロベンジル基（DCB）である。好ましい保護基は
2,6-ジクロロベンジル基である。X²はその位置のアミノ
酸残基に側鎖保護基がないことを意味する水素原子であ
りうる。

X³は水素原子またはAspもしくはGluのカルボキシル基の
ための適当なエステル形成保護基、例えばベンジル基
（OBzl）2,6-ジクロロベンジル基、メチル基およびエチ
ル基である。

X⁴はThrまたはSerのヒドロキシル基のための適当な保護
基であつてよく、例えばアセチル基、ベンゾイル基、t-
ブチル基、トリチル基、テトラヒドロピラニル基、Bz
l、2,6-ジクロロベンジル基およびCBZである。好ましい
保護基はBzIである。X⁴はヒドロキシル基に保護基がな
いことを意味する水素原子でありうる。

X⁵は水素原子またはAsnもしくはGlnの側鎖アミド基のた
めの適当な保護基である。それは好ましくはキサンチル
基（Xan）である。

X⁶はArgのグアニジノ基のための適当な保護基、例えば
ニトロ基、Tos、CBZ、アダマンチルオキシカルボニル基
およびBOCであるか、あるいは水素原子である。

X⁷は水素原子またはLysの側鎖アミノ基のための適当な
保護基である。適当な側鎖アミノ保護基の例は2-クロロ
ベンジルオキシカルボニル基（２−Cl−Ｚ）、Tos、t-
アミルオキシカルボニル基およびBOCである。

X⁸は水素原子または上で一般的に詳述した適当な側鎖保
護基である。

Metは場合により酸素で保護されうるが、好ましくは保
護されないままである。

側鎖アミノ保護基の選択は、一般に合成中のα‐アミノ
基の保護基離脱の間に除去されない保護基が選ばれると
いうことを除いて、限定的ではない。しかしながら、い
くつかのアミノ酸（例えば、His）の場合にはカツプリ
ングが完了した後保護は一般に必要でなく、保護基は同
じであつてもよい。

X⁹はエステル形成基X³のようなC-末端カルボキシル基の
ための適当な保護基であるか、または固体の樹脂支持体
に結合させるために固相合成法で使用する定着結合であ
るか、もしくはデス‐X⁹であり、デス‐X⁹である場合に
Ｃ−末端の残基は先に定義したカルボキシル部分Ｙをも
つ。固体の樹脂支持体を使用する場合に、それは当該技
術分野で知られたもののいずれであつてもよく、例えば
−Ｏ−CH₂−樹脂支持体、−NH−ベンズヒドリルアミン
（BHA）樹脂支持体または−NH−パラメチルベンズヒド
リルアミン（MBHA）樹脂支持体のような式を有するもの
である。未置換アミドが望まれる場合にはBHAまたはMBH
Aの使用が好ましく、その開裂は直接アミドを与える。N
-メチルアミドが望まれる場合に、それはN-メチルBHA樹
脂から得られる。C-末端において他の適当なアミドまた
は遊離酸以外の基が望まれる場合には、Houben-Weylの
テキストに記載されたような古典的方法を使用してペプ
チドを合成することが適当かも知れない。

中間体のための式において、Ｘ基のうちの少なくとも１
つは保護基であるか、またはX⁹は樹脂支持体を含む。こ
うして、本発明はまた興味のあるペプチドの製造方法を
提供し、その方法は （ａ）式（II）で示される少なくとも１つの保護基を有
するペプチドを形成し； X¹−R₁（ＸまたはX²）−Ala−Asp（X³）−Ala−Ile−Ph
e−Thr（X⁴）−R₈（X⁴またはX⁵）−Ser（X⁴−Tyr（X²）
−Arg（X⁶）−R₁₂（X⁶またはX⁷）−R₁₃−Leu−Gly−Gln
（X⁵）−Leu−R₁₈（X²）−Ala−Arg（X⁶）−Lys（X⁷）
−Leu−Leu−R₂₄（ＸまたはX⁵）−R₂₅（X³）−Ile−R₂₇
−R₂₈（X⁴またはX⁵）−Arg（X⁶）−Gln（X⁵）−Gln
（X⁵）−Gly−Glu（X³）−R₃₄（X⁴またはX⁶）−Asn
（X⁵）−Gln（X⁵−Glu（X³）−R₃₈（X⁵またはX⁶）−R₃₉
（X⁶）−R₄₀（X⁴）−Arg（X⁶）−R₄₂−R₄₃（X⁵または
X⁶）−R₄₄（X⁸）−X⁹ （式中Ｘ、X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷およびX⁸は各々
水素原子または保護基であり、X⁹は保護基または樹脂支
持体への定着結合もしくはデス‐X⁹であり、デス‐X⁹で
ある場合にC-末端の残基はカルボキシル部分Ｙをもつ） （ｂ）式（II）のペプチドから保護基または定着結合を
分離し；そして （ｃ）所望により、生成したペプチドをその無毒性塩に
転化する； ことから成つている。

ペプチドの合成で使用する特定の側鎖保護基を選択する
場合、次の規則に従う；（ａ）保護基はその保護特性を
保有しなければならず、またカツプリング条件下で分離
されてはならない；（ｂ）保護基は試薬に対して安定で
あるべきであり、またXanを除いて、合成の各段階でα
‐アミノ保護基を除去するために選択された反応条件下
に安定であるべきである；そして（ｃ）側鎖保護基は、
所望のアミノ酸配列を含む合成の完了時点で、ペプチド
鎖を変化させない反応条件下に除去されなければならな
い。

ペプチドが組み換えDNA法を使用して製造されない場合
に、それらは好ましくはMerrifieldによるJ.Am.Chem.So
c.,85、2149ページ（1963年）に記載されたような固相
合成法を使用して製造されるが、当該技術分野において
知られた他の同様な化学合成法もまた先に述べたように
使用できる。固相合成法は保護されたα‐アミノ酸を適
当な樹脂にカツプリングすることによりペプチドのC-末
端から開始される。このような出発物質はα‐アミノ‐
保護アミノ酸をクロロメチル化樹脂またはヒドロキシメ
チル樹脂にエステル結合で結合させるか、あるいはBHA
樹脂またはMBHA樹脂にアミド結合で結合させることによ
り製造することができる。メチル、エチルまたはプロピ
ルアミドを生成されるポリペプチドに組み入れる場合に
はクロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂が使
用され、そして開裂は適当なアミン、例えばエチルアミ
ン、を使用して都合よく行われる。

例えば、40-残基ペプチドを製造する場合に、BOCで保護
されたAlaはMonahanおよびGilonによるBiopolymer,12,2
513〜2519ページ（1973年）に記載された方法に従つて
クロロメチル化樹脂にカツプリングされる。そのBOC-Al
aの樹脂支持体へのカツプリング後、α‐アミノ保護基
は塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（TFA）、TFA単独
またはジオキサン中のHClを使用して除去される。この
保護基離脱反応は約０℃ないし室温で実施される。特定
のα‐アミノ保護基を除去するための他の標準的な開裂
試薬および条件はSchroderおよびLubkeによる“The Pep
tides"、１、72〜75ページ、アカデミツクプレス（1965
年）に記載されたようなものが使用される。

Pheのα‐アミノ保護基の除去後、残つているα‐アミ
ノ‐および側鎖‐保護アミノ酸を所望の順序で一般ごと
にカツプリングさせて先に定義した中間体化合物を得る
か、あるいは各アミノ酸を合成中別々に加える代りに、
いくつかのアミノ酸を固相反応器に添加する前に互いに
カツプリングさせてもよい。適当なカツプリング試薬の
選択は当該技術分野の技術の範囲内である。N,N′‐ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（DCCI）はカツプリング
試薬として特に適している。

ペプチドの固相合成法で使用する活性化試薬はペプチド
技術分野においてよく知られている。適当な活性化試薬
の例はN,N′‐ジイソプロピルカルボジイミドやN-エチ
ル‐Ｎ′（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
のようなカルボジイミド類である。他の活性化試薬およ
びペプチドカツプリングにおけるそれらの使用はSchrod
crおよびLubkeによる同書第III章ならびにKapoorによる
J.Phar.Sci.,59、１〜27ページ（1970年）に記載され
る。

保護されたアミノ酸またはアミノ酸配列は各々約４倍も
しくはそれ以上の過剰量で固相反応器中に導入され、そ
してそのカツプリングはジメチルホルムアミド（DM
F）：CH₂Cl₂（1:1）の混合媒体中で、あるいはDMFまた
はCH₂Cl₂単独中で実施される。不完全なカツプリングが
生ずる場合には、次のアミノ酸のカツプリングに先立つ
α‐アミノ保護基の除去以前にそのカツプリング方法を
繰り返し行う。各合成段階でのカツプリング反応の成功
はE.Kaiser等によるAnal.Biochem.,34、595ページ（197
0年）に記載されたようなニンヒドリン反応により監視
される。カツプリング反応は、例えばRivier等によるBi
opolymers,17、1927〜1938ページ（1978）に報告された
ようなプログラムを使用して、ベツクマン（Beckman）9
90自動合成器で、自動的に行うことができる。

所望のアミノ酸配列が完了した後、中間体ペプチドはそ
のペプチドを樹脂から開裂させるばかりでなく残つてい
る全ての側鎖保護基X,X²，X³，X⁴，X⁵，X⁶，X⁷および
X⁸、定着結合X⁹ならびにα‐アミノ保護基X¹を開裂させ
て遊離酸形のペプチドを与える試薬（例えば、液状弗化
水素）で処理することにより樹脂支持体から分離され
る。Metがその配列に存在する場合、BOC保護基はS-アル
キル化の可能性を除外するためにHFでペプチドを樹脂か
ら開裂させる前にトリフルオロ酢酸（TFA）／エタンジ
チオールを用いて最初に除去することが好ましい。開裂
させるための弗化水素を使用する場合、アニソールおよ
びメチルエチルフイドが掃去剤として反応容器中に加え
られる。

合成ペプチドを組み換えDNA法で製造するための１つの
試みとして、Met残基はN-末端の追加のアミノ酸残基と
して含有されるのが好ましく、しかもMetはペプチドの
その他のどこにも存在しない方がよい。また、ペプチド
に使用するアミノ酸残基の全ては天然に存在するL-異性
体のアミノ酸またはGlyでなければならない。１つの結
果として、次式で示される好適なペプチド中間体化合物
が製造される。

Ｈ−Met−R₁−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−R₈−Ser
−Try−Arg−R₁₂−R₁₃−Leu−Gly−Gln−Leu−R₁₈−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−R₂₄−R₂₅−Ile−R₂₇−R₂₈−Arg
−Gln−Gln−Gly−Glu−R₃₄−Asn−Gln−Glu−R₃₈−R₃₉
−R₄₀−Arg−R₄₂−R₄₃−R₄₄−Ｙ 式中、R₁はTyr、LeuはHis;R₈はSerまたはAsn;R₁₂はArg
またはLys;R₁₃はIleまたはVal;R₁₈TyrまたはSer;R₂₄はH
isまたはGln;R₂₅はGluまたはAsp;R₂₇はAla、Nla、Ile、
LeuまたはVal;R₂₈はAsnまたはSer;R₃₄はArgまたはSer;R
₃₈はGlnまたはArg;R₃₉はArgまたはGly;R₄₀はSerまたはA
la;R₄₂はPheまたはAla;R₄₃はAsnまたはArg;R₄₄は天然ア
ミノ酸またはデス‐R₄₄；そしてＹはC-末端アミノ酸残
基のカルボキシル部分を表わし、−COOHまたは−CONH₂
である。

このペプチドが遺伝子的に変性された微生物により発現
されて既知方法を使用して回収および精製されると、そ
の中間体は臭化シアンで処理されたN-末端のMet残基を
開裂し、生物学的に活性なペプチドを生成する。上で説
明した式はペプチドが43-位または44-位まで延びている
ことを示しているが、前にも述べたように、実質的な生
物学的活性は27〜29残基程度に少ない残基をもつペプチ
ドにより与えられる。そして、このような短い断片は一
般に多くの目的に対して同等であり、かつ組み換えDNA
法による製造が予定される本発明により提供される好ま
しい中間体の範囲内に含まれると考えられる。

次の実施例は固相法によりhpGRF類似体を合成するため
の好ましい方法を説明する。対応するより短いペプチド
断片の合成は単にC-末端から始まる必要な数のアミノ酸
を除外することにより同じ方法で行うことができること
は当然認識されるだろう。

実施例Ｉ 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Ile−Ser−Arg−G
ln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−Arg−Gly−A
la−NH₂ で示される〔Ile²⁷〕‐hpGRF（１−40）−NH₂は、樹脂1
gあたり約0.1〜0.5ミリモルの置換範囲をもつBachem社
から入手可能なMBHA塩酸塩樹脂上で、ベツクマン990ペ
プチド合成器を使用して段階法により合成した。BOC−A
laの樹脂へのカツプリングは合成の間中使用される下記
の表Ａおよび表Ｂにおいて説明した一般方法により行わ
れ、そしてそれは樹脂1gあたり約035ミリモルのAlaの置
換をもたらした。使用する溶媒は、Met残基の硫黄を酸
化するかも知れない酸素を排除するために、ヘリウムや
窒素のような不活性ガスを散布して注意深くガス抜きし
た。

保護基の離脱および中和後に、ペプチド鎖は樹脂上に段
階的に増成された。保護基の離脱、中和および各アミノ
酸の添加は一般にVale等による米国特許第4292313号明
細書に詳細に説明された方法に従つて行つた。

保護基の離脱は次の表Ａに従つて有利に実施された。

カツプリングは次の表Ｂに説明したように実施された。

簡単に言えば、樹脂1gあたり、および塩化メチレン中1.
0モルDCCI1当量あたり塩化メチレン中のBOC-保護アミノ
酸１〜２ミリモルを２時間使用した。BOC−Arg（TOS）
をカツプリングする場合、50％DMFおよび塩化メチレン
の混合物を使用した。BzlエーテルはSerおよびThrのた
めのヒドロキシル側鎖保護基として使用した。p-ニトロ
フエニルエステル（ONp）はAsnまたはGlnのカルボキシ
ル端を活性化するのに使用し、例えばBOC−Asn（ONp）
はDMFと塩化メチレンの50％混合物中でHOBt1当量を使用
して一晩カツプリングさせ、この場合にDCCIは使用しな
かつた。AsnまたはGlnのアミド基は、活性エステル法の
代りにDCCIカツプリングを使用する場合、Xanで保護し
た。2-クロロ‐ベンジルオキシカルボニル基（2Cl−
Ｚ）はLys側鎖のための保護基として使用した。TosはAr
gのグアニジノ基を保護するのに使用し、GluまたはAsp
のカルボキシル基はBzlエステル（OBzl）として保護し
た。Tyrのフエノール性ヒドロキシル基は2,6-ジクロロ
ベンジル基（DCB）で保護した。合成の終りに、次の組
成のものが得られた。

X¹−Tyr（X²）−Ala−Asp（X³）−Ala−Ile−Phe−Thr
（X⁴）−Asn（X⁵）−Ser（X⁴）−Tyr（X²）−Arg（X⁶）
−Lys（X⁷）−Val−Leu−Gly−Gln（X⁵）−Leu−Ser（X
⁴）−Ala−Arg（X⁶）−Lys（X⁷）−Leu−Leu−Gln
（X⁵）−Asp（X³）−Ile−Ile−Ser（X⁴）−Arg（X⁶）
−Gln（X⁵）−Gln（X⁵）−Gly−Glu（X³）−Ser（X⁴）
−Asn（X⁵）−Gln（X⁵）−Glu（X³）−Arg（X⁶）−Gly
−Ala−X⁸ 式中、X¹はBOC、X²はDCB、X³はベンジルエステル、X⁴は
Bzl、X⁵はXan、X⁶はTos、X⁷は2Cl−ＺそしてX⁸は−NH−
樹脂支持体である。Xanはα‐アミノ保護基を離脱する
のに使用されるTFA処理で部分的にもしくは全部除去さ
れた。

最後のTyr残基が樹脂にカツプリングした後、BOCはCH₂C
l₂中60％TFAで除去した。残存する保護ペプチド‐樹脂
を開裂させかつ保護基の離脱を行わせるために、それを
ペプチド‐樹脂1gあたりアニソール1.5ml、メチルエチ
ルスルフイド0.5mlおよび弗化水素（HF）15mlを用い
て、−20℃で30分間および０℃で30分間処理した。高真
空下にHFを除いた後、樹脂−ペプチド残留物を乾燥ジエ
チルエーテルおよびクロロホルムで交互に洗浄し、次い
でそのペプチドをガス抜きした2N酢酸水溶液で抽出して
過により樹脂から分離した。

樹脂から開裂させかつ保護基を離脱させたペプチドはそ
の後０〜５％酢酸に溶解して精製（Sephadex G-50 微
細ゲルによる過を含む）にかけた。

そのペプチドはさらにRivier等によるPeptides：Struct
ure and Biological Function,125〜128ページ（1979
年）およびMarki等によるJ.Am.Chem.Soc.,103、3178ペ
ージ（1981年）に記載されたような調製用または半調製
用高圧液体クロマトグラフイー（HPLC）で精製した。要
約すると、Waters Associates prep LC-500に合うカー
トリツジにVydacからの15−20C₁₈シリカ（300A）を充填
した。TEAP中のCH₃CNの勾配はRivier,J.によるJ.Liq.Ch
romatography 1、343−367ページ（1978年に記載された
ような低圧力エルテツクスグレジエントメーカー（Elde
x gradient maker）によりつくつた。クロマトグラフイ
ーの分画は注意深くHPLCで監視して、実質的な純度を示
す分画のみを集めた。精製された分面（純度は別に検査
された）の脱塩は0.1％TFA中CH₃CNの勾配を使用して行
つた。その後、その中心部分（center cut）を凍結乾燥
して所望のペプチドを得、このペプチドの純度は98％以
上であつた。

この合成はクロロメチル化樹脂を用いて繰り返し行い、
Rivier,J.によるJ.Amer.Chem.Soc.,96、2986〜2992ペー
ジ（1974年）に一般的に記載された方法を使用して遊離
酸形の同じペプチドを製造した。

実施例II 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Val−Ｄ−Ala−Ar
g−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−Arg−Gl
y−Ala−NH₂ で示される〔Val²⁷,D-Ala²⁸〕‐hpGRF（１−40）−NH₂
の合成は実施例Ｉに記載した方法でMBHA樹脂上でベツク
マン990ペプチド合成器を使用して段階法により行われ
た。このペプチドはTLCおよびHPLCを使用して実質的に
純粋であることが判明した。

実施例III 式： Ｈ−Ｄ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ila−Phe−Thr−Asn−Se
r−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Al
a−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Ar
g−Gln−Gln−Gly−NH₂ で示されるhpGRF類似体の〔Ｄ−Tyr¹〕−hpGRF（１−3
2）−NH₂は実施例Ｉに記載した方法でMBHA樹脂上でベツ
クマン990ペプチド合成器を使用して段階法により合成
された。このペプチドはTLCおよびHPLCを使用して実質
的に純粋であることが判明した。旋光性は光電偏光計で
測定して▲〔α〕²² _D▼＝−61.4°±１（Ｃ＝１、１％
酢酸、未補正）であつた。

この合成はクロロメチル樹脂化を使用して繰り返し行
い、先に一般的に示したようにして遊離酸形の同じペプ
チドを製造した。

実施例IV 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−NIe−Ser−Arg−G
ln−Gln−Gly−NH₂ で示される短縮されたhpGRF類似体の〔Nle²⁷〕−hpGRF
（１−32）−NH₂は実施例Ｉに記載した方法でMBHA樹脂
上でベツクマン990ペプチン合成器を使用して段階法に
より合成された。この類似体はTLCおよびHPLCを使用し
て実質的に純粋であることが判明した。旋光性は光電偏
光計で測定して▲〔α〕²² _D▼＝−57.8°±１（Ｃ＝
１、１％酢酸、未補正）であつた。同じ一般合成法が
〔Nle²⁷〕−hpGRF（１−44）−NH₂を製造するのに使用
された。

実施例Ｖ 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−GIy-Gln−Leu−Ser−Ala−Ar
g−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Nle−NH₂ で示される〔Nle²⁷〕−hpGRF（１−27）−NH₂は実施例
Ｉに記載した方法でMBHA樹脂上でベツクマン990ペプチ
ド合成器を使用して段階法で合成された。このペプチド
はTLCおよびHPLCを使用して実質的に純粋であることが
判明した。

実施例VI 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Ile−Ser−Arg−G
ln−Gln−Gly−OH で示される〔Ile²⁷〕−hpGRF（１−32）−OHは実施例Ｉ
の最後に示した方法でクロロメチル化樹脂上でベツクマ
ン990ペプチド合成器を使用して段階法により合成され
た。このペプチドはTLCおよびHPLCを使用して実質的に
純粋であることが判明した。旋光性は光電偏光計で測定
して▲〔α〕²² _D▼＝−61.7°±１（Ｃ＝１、１％酢
酸、未補正）であつた。

この合成はMBHA樹脂を使用して繰り返し行い、同じペプ
チドのアミド化体を製造した。

実施例VII 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Ｄ−Met−Ser−Ar
g−Gln−Gln−Gly−NH₂ で示される〔Ｄ−Met²⁷〕−hpGRF（１−32）−NH₂は実
施例Ｉに記載した方法でMBHA樹脂上でベツクマン990ペ
プチド合成器を使用して段階法により合成された。この
ペプチドはTLCおよびHPLCを使用して実質的に純粋であ
ることが判明した。旋光性は光電偏光計で測定して▲
〔α〕²² _D▼＝−54.5°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未補
正）であつた。

実施例VIII 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Arg−G
ln−Gln−Gly−NH₂ で示される〔His¹〕−hpGRF（１−32）−NH₂は実施例Ｉ
に記載した方法でMBHA樹脂上でベツクマン990ペプチド
合成器を使用して段階法により合成された。このペプチ
ドはTLCおよびHPLCを使用して実質的に純粋であること
が判明した。旋光性は光電偏光計で測定して▲〔α〕²²
_D▼＝−58.7°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未補正）であ
つた。

この合成は最後のアミノ酸残基としてPheを使用して繰
り返し行い、〔Phe¹〕−hpGaF（１−32）−NH₂を製造し
た。旋光性は光電偏光計で測定して▲〔α〕²² _D▼＝−5
8.2°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未補正）であつた。

実施例IX 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−P
he−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Lle−Met−Ser−Arg−G
ln−Gln−Gly−NH₂ で示される〔Phe¹⁰〕−hpGRF（１−32）−NH₂は実施例
Ｉに記載した方法でMBHA樹脂上でベツクマン990ペプチ
ド合成器を使用して段階法により合成された。このペプ
チドはTLCおよびHPLCを使用して実質的に純粋であるこ
とが判明した。旋光性は光電偏光計で測定して▲〔α〕
²² _D▼＝−59.5°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未補正）で
あつた。

実施例Ｘ 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Lle−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Val−Ser−Arg−G
ln−Gln−Gly−OH で示される〔Val²⁷〕−hpGRF（１−32）−OHは実施例Ｉ
の最後に示した方法でクロロメチル化樹脂上でベツクマ
ン990ペプチド合成器を使用して段階法により合成され
た。このペプチドはTLCおよびHPLCを使用して実質的に
純粋であることが判明した。旋光性は光電偏光計で測定
して▲〔α〕²² _D▼＝−62.4°±１（Ｃ＝１、１％酢
酸、未補正）であつた。

実施例XI 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Nle−Ser−Arg−G
ln−Gln−Gly−NH₂ で示される〔His¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−32）−NH₂は
実施例Ｉに記載した方法でベツクマン990ペプチド合成
器を使用してMBHA樹脂上で段階法により合成された。こ
のペプチドはTLCおよびHPLCを使用して実質的に純粋で
あることが判明した。旋光性は光電偏光計で測定され、
▲〔α〕²² _D▼＝−59.3°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未
補正）であつた。

実施例XII 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg−G
ln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg−S
er−Arg−Phe−Asn−OH で示されるrhGRF（１−43）−OHは実施例VIに示した方
法でベツクマン990ペプチド合成器を使用して、樹脂1g
あたり約0.1〜0.5ミリモルの置換範囲をもつクロロメチ
ル化樹脂上で段階法により合成された。このペプチドは
TLCおよびHPLCを使用して実質的に純粋であることが判
明した。旋光性は光電偏光計で測定され、▲〔α〕²² _D
▼＝−50.8°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未補正）であつ
た。

この合成はMBHA樹脂を使用して繰り返し行われ、Asnを
そのMBHA樹脂に結合させるためにVale等による米国特許
第4292313号明細書に一般的に記載された初期方法を使
用してrhGRF（１−43）−NH₂を製造した。このペプチド
はTLCおよびHPLCを使用して実質的に純粋であることが
判明した。旋光性は光電偏光計で測定され、▲〔α〕²²
_D▼＝−51.7°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未補正）であ
つた。

実施例XIII 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg−G
ln−Gln−Gly−Glu−Ayg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg−S
er−NH₂ で示されるrhGRF（１−40）−NH₂は実施例Ｉに記載した
ようにしてベツクマン990ペプチド合成器を使用してMBH
A樹脂上で段階法により合成された。このペプチドはTLC
およびHPLCを使用して実質的に純粋であることが判明し
た。旋光性は光電偏光計で測定され、▲〔α〕²² _D▼＝
−56.5°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未補正）であつた。

実施例XIV 式： Ｈ−Met−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Leu−Asn−Arg−G
ln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg−S
er−Arg−Phe−Asn−OH で示されるhpGRF類似体、すなわち〔Met¹，Leu²⁷〕−rh
GRF（１−43）−OHは実施例XIIに記載した方法でベツク
マン990ペプチド合成器を使用してクロロメチル化樹脂
上で段階法により合成された。このペプチドはTLCおよ
びHPLCを使用して実質的に純粋であることが判明した。

実施例XV 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Nle−Asn−Arg−G
ln−Gln−Gly−NH₂ で示されるhpGRF類似体、すなわち〔Nle²⁷〕−rhGRF
（１−32）−NH₂は実施例Ｉのようにしてベツクマン990
ペプチド合成器を使用してMBHA樹脂上で段階法により合
成された。この類似体はTLCおよびHPLCを使用して実質
的に純粋であることが判明した。

実施例XVI 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−
Ｄ−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−A
la−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−A
rg−NH₂ で示されるhpGRF類似体断片、すなわち〔Ｄ−Tyr¹⁰〕−
rhGRF（１−29）−NH₂は実施例Ｉのようにしてベツクマ
ン990ペプチド合成器を使用してMBHA樹脂上で段階法に
より合成された。このペプチドはTLCおよびHPLCを使用
して実質的に純粋であることが判明した。

この合成はN-末端のHisの代りにＤ−Tyrを置換させて繰
り返し行い、〔Ｄ−Tyr¹,¹⁰〕−rhGRF（１−29）−NH₂
を製造した。

実施例XVII 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg−N
H₂ で示されるhpGRF類似体断片、すなわちrhGRF（１−29）
−NH₂は実施例IIIのようにしてベツクマン990ペプチド
合成器を使用してMBHA樹脂上で段階法により合成され
た。このペプチドはTLCおよびHPLCを使用して実質的に
純粋であることが判明した。

実施例XVIII 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Nle−Asn−Arg−G
ln−Gln−Gly−NH₂ で示される〔Nle²⁷〕−rhGRF（１−29）−NH₂は実施例
Ｉのようにしてベツクマン990ペプチド合成器を使用し
てMBHA樹脂上で段階法により合成した。このペプチドは
TLCおよびHPLCを使用して実質的に純粋であることが判
明した。旋光性は光電偏光計で測定され、▲〔α〕²² _D
▼＝−52.6°±１（Ｃ＝１、１％酢酸、未補正）であつ
た。

実施例XIX 式： Ｈ−Ｄ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Se
r−Ｄ−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Ｄ−Ala−Gln−Leu
−Tyr−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met
−Asn−Arg−NH₂ で示されるhpGRF類似体、すなわち〔Ｄ−His¹,D−Ty
r¹⁰,D−Ala¹⁵〕−rhGRF（１−29）−NH₂は実施例Ｉのよ
うにしてベツクマン990ペプチド合成器を使用してMBHA
樹脂上で段階法により合成された。このペプチドはTLC
およびHPLCを使用して実質的に純粋であることが判明し
た。

実施例XX 式： Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg−N
H₂ で示されるhpGRF類似体、すなわち〔Tyr¹〕−rhGRF（１
−29）−NH₂は実施例Ｉのようにしてベツクマン990ペプ
チド合成器を使用してMBHA樹脂上で段階法により合成さ
れた。このペプチドはTLCおよびHPLCを使用して実質的
に純粋であることが判明した。

実施例XXI 式： Ｈ−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg−G
ln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg−S
er−Arg−Phe−Asn−Val−NH₂ で示されるrhGRF−〔Val⁴⁴−NH₂〕は実施例Ｉのように
してベツクマン990ペプチド合成器を使用してMBHA樹脂
上で段階法により合成された。このペプチドはTLCおよ
びHPLCを使用して実質的に純粋であることが判明した。

前述の詳細に列挙した類似体に加えて、次の類似体が上
で説明したものと同じ固相合成法を使用して合成され
た： 〔Ile²⁷〕−hpGRF（１−29）−NH₂， 〔Ile²⁷〕−hpGRF（１−29）−OH, 〔Ｄ−His¹〕−hpGRF（１−32）−NH₂， 〔Ｄ−Ala²⁷〕−hpGRF（１−32）−NH₂， 〔Ｄ−Tyr¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−32）−NH₂， 〔Ｄ−Tyr¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−32）−OH, 〔Ｄ−Phe¹，Val²⁷〕−hpGRF（１−40）−OH, 〔His¹，Phe¹⁰〕−hpGRF（１−32）−NH₂， 〔Ｄ−Tyr¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−40）−OH, 〔Ｄ−Tyr¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−40）−Arg−Ala−Ar
g−Leu−OH 〔Phe¹，Phe¹⁰，Ile²⁷〕−hpGRF（１−32）−NH₂， 〔Ｄ−His¹,D−Ala¹⁵，Nle²⁷〕−hpGRF（１−32）−N
H₂， 〔Ｄ−Phe¹，Phe¹⁰,D−Met²⁷〕−hpGRF（１−40）−OH, 〔Ile²⁷〕−hpGRF（１−40）−Arg−Ala−Arg−Leu−NH
₂， 〔Ile²⁷〕−hpGRF（１−40）−Arg−Ala−Arg−Leu−O
H, 〔Ｄ−His¹,D−Ala¹⁵,D−Ala²⁸〕−hpGRF（１−32）−N
H₂， 〔Phe¹，Leu²⁷,D−Ala²⁸〕−hpGRF（１−40）−OH, 〔His¹,D−Val²⁷,D−Ala²⁸〕−hpGRF（１−32）−NH₂， 〔Ｄ−Tyr¹，Phe¹⁰,D−Ile₂₇〕−hpGRF（１−39）−N
H₂， 〔Val²⁷〕−hpGRF（１−40）−OH, 〔Val²⁷〕−hpGRF（１−40）−Arg−Ala−Arg−Leu−OH
and 〔Ｄ−Phe¹,D−Ala¹⁵,D−Nle²⁷,D−Ala²⁸〕−hpGRF（１
−32）−NH₂。

上記の実施例で製造した合成ペプチドは、成長ホルモン
の放出を促進するそれらの有効性を測定するために、精
製された合成hpGRF（１−40）−OHまたは精製された合
成hpGRF（１−40）−Phe−Gln−NH₂と試験管内検定で比
較された。これらの合成類似体は全てGHの放出をうなが
す点で実質的な効力を有していた。

試験管内検定は標準として合成hpGRFを使用して等モル
濃度の種々の合成類似体との並行比較により実施した。
培養物は４、５日前に取り出してラツトの脳下垂体細胞
を含むものを使用した。成長ホルモンの分泌に対して最
適であると考えられる培養物が比較試験用に、Vale等に
よるEndocrinology,91、562〜572ページ（1972年）に記
載された一般方法で、使用された。試験されるべき物質
とのインキユベーシヨンは３〜４時間行われ、その培養
培地のアリコートを取り出して、それらの免疫反応性GH
（irGH）の量をよく識別する放射線免疫検定法で測定す
るために処理した。

等モル濃度を使用した比較試験の結果を次の第Ｉ表に示
す。

これらの合成ペプチドの試験管内試験はEC₅₀が20〜100
ピコモルの間で変化し、そして最低有効濃度は３〜８ピ
コモルであることを示した。hpGRF（１−40）NH₂につい
ての最大有効濃度は１ナノモルであつた。

等モル濃度の各種のhpGRF類似体（rhGRFを基準にしたも
の）についてこの比較試験の結果を第II表に示す。

これらの合成ペプチドの試験管内試験はEC₅₀が20〜100
ピコモルの間で変化し、かつ最低有効濃度は３〜８ピコ
モルであることを示した。rhGRF（１−43）−OHについ
ての最大有効濃度は１ナノモルであつた。

成長ホルモンの分泌に関する試験管内試験に加えて、生
体内実験が自由に走行する正常の雄ラツトに導入された
カテーテルを介してその合成ペプチドを注入することに
より行われた。動物は外因性のGRFへの応答に影響を及
ぼすことなくGHの自然分泌を抑制するドパミンヒドロキ
シラーゼ阻害剤のFLA-63で前処理された。注入直前およ
び注入後５分と20分に同じカテーテルを介して血液試料
を採取し、血液中のGH量を放射線免疫検定法で測定し
た。この結果は合成hpGRF類似体が脳下垂体GHの分泌の
強力な刺激剤であることを示した。体重1Kgあたり約20
ナノグラムないし約25マイクログラムの投与量が有効で
あるとわかつた。

さらに、他の実験例で合成した他の合成hpGRF類似体も
実質的な効能を示すことが見い出され、これらの試験か
らいつくかの一般的結論が導き出された。

1.C-末端アミド化は39アミノ酸残基よりも鎖の長さが長
いGRFペプチドの活性を増加させないらしいが、鎖の長
さが39アミノ酸残基よりも短いペプチドの効力を増加さ
せる。例えば、〔Ile²⁷〕−hpGRF（１−32）−NH₂は〔I
le²⁷〕−hpGRF（１−32）−OHよりも効能があり、〔Ｄ
−Tyr¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−32）−NH₂は〔Ｄ−Ty
r¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−32）−OHよりも効能があり、
また〔Ile²⁷〕−hpGRF（１−29）−NH₂は〔Ile²⁷〕−hp
GRF（１−29）−OHよりも効能がある。しかしながら〔I
le²⁷〕−hpGRF（１−44）−NH₂は〔Ile²⁷〕−hpGRF（１
−44）−OHと効能が同じである。

2.一連のアミド化ペプチドにおいて、32アミノ酸残基の
類似体は対応するもつと鎖の長い類似体と実質的に同じ
効能であり、例えば、〔Nle²⁷〕−hpGRF（１−32）−NH
₂は〔Nle²⁷〕−hpGRF（１−44）−NH₂とだいたい同じ効
能をもつ。

3.遊離のカルボキシル末端をもつ一連のペプチドにおい
て、39以上のアミノ酸残基をもつ対応する類似体はそれ
ぞれ効能が同じである。例えば、〔Val²⁷〕−hpGRF（１
−40）−OHおよび〔Val²⁷〕−hpGRF（１−44）−OHは効
能が等しく、〔Ｄ−Tyr¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−40）−
OHおよび〔Ｄ−Tyr¹，Nle²⁷〕−hpGRF（１−44）−OHも
同じである。

合成hpGRF類似体は医者がGHの産生を高めることを望む
場合にそのような用途に対して有用であるだろう。hpGR
F類似体によるGH分泌の刺激は内因性GRFの産生低下によ
りひきおこされる完全なもしくは相対的GH不足の患者に
対して興味がある。その上に、おそらくGH分泌の増加お
よびそれに伴う成長増加は正常のGH量を有するヒトまた
は動物にもあらわれるだろう。さらに、hpGRFの投与は
体内の脂肪分を変化させかつ他のGH依存性の代謝、免疫
および発生作用を改変するだろう。例えば、hpGRF類似
体はやけどを被つたような状況下にあるヒトの同化作用
を刺激する手段として有用であるかも知れない。他の例
として、hpGRF類似体は鶏、七面鳥、ブタ、ヤギ、牛お
よびヒツジのような商業動物に成長を促進させかつ得ら
れる蛋白質対脂肪の比を増加させるために投与してもよ
い。それらは魚や他の冷血海生動物（例えば、ウミガメ
やウナギ類）および水陸両生動物を生産するための養殖
に使用してもよい。ヒトへの投与のために、合成hpGRF
類似体は少なくとも約93％、好ましくは少なくとも98
％、の純度を有するべきである。この純度は意図したペ
プチドが存在する全部の類似したペプチドおよびペプチ
ド断片の所定重量％を構成することを意味する。

成長を促進させかつ脂肪分を低下させるために商業動物
や他の動物に合成hpGRF類似体を投与するに際して、約
５％程度に低い純度、あるいは約0.001％程度に低い純
度さえも許容されるかも知れない。遺伝子操作法で製造
する場合、そのhpGRF類似体は最初非常に低い純度であ
りうる。

hGRF（１−44）−NH₂、hGFR（１−40）−NH₂およびhGRF
（１−40）−OHの急性毒性試験の結果は以下のとおりで
あった。

ラットにおけるhGRF（１−44）−NH₂の静脈内注射 使用動物：体重250〜1000gの雄および雌のスプラグドー
リーラット50匹以上 被験化合物:hGRF（１−44）−NH₂ １〜10mg/ml 0.9％生理食塩水 覚醒して自由に動き回っているラットに hGRF（１−44）−NH₂ 100μｇを静注してもラットの行
動に何ら明白な変化は見られなかった。月齢３か月ない
し22か月の若いラットをペントバルビタールナトリウム
塩で麻酔して、25μg/kgのhGRF（１−44）−NH₂を静注
しても正常に覚醒した。

ラットにおけるhGRF（１−40）−NH₂の静脈内注射 使用動物：体重250〜400gの雄および雌のスプラグドー
リーラット50匹以上 被験化合物:hGRF（１−40）−NH₂ １μg/ml 0.9％生理食塩水 覚醒して自由に動き回っているラットに hGRF（１−40）−NH₂ 100μｇを静注してもラットの行
動に何ら明白な変化は見られなかった。ペントバルビタ
ールナトリウム塩で麻酔して、50μg/kgのhGRF（１−4
0）−NH₂を静注しても、すべてのラットは正常に覚醒し
た。

マウスにおけるhGRF（１−40）−OHの静脈内注射 使用動物：体重17〜24gのマウス15匹 被験化合物:hGRF（１−40）−OH 1mg/ml（媒体） 媒体組成:0.9％NaCl、10％マンニトール、0.9％ベンジ
ルアルコール、1mMアスコルビン酸、10mM酢酸 すべてのマウスをエーテル麻酔し、外科的に露出させた
頸静脈に、75μｌ媒体のみ（７匹のマウス）、75μｇの
hGRF（１−40）−OH/75μｌの媒体（８匹のマウス）を
各々注射した。切り口をクリップで閉じて、マウスをケ
ージに戻した。ペプチドで処理された上記マウスは、≧
3mgペプチド/kg（体重）のペプチドを注射されたことに
なる。これらのマウスは、注射後１時間および24時間経
過した時点ですべて生きていた。

これらの結果から、本発明の合成ペプチドも同様に哺乳
動物に対して急性毒性を有していないものと考えられ
た。

医薬組成物を形成するために薬学的もしくは獣医学的に
許容される担体と組み合わせた合成hpGRF類似体または
その無毒性塩は動物（ヒトを含む）に静脈内に、皮下
に、筋肉内に、鼻腔内にまたは経口的に投与される。投
与はGHの放出を刺激するためにそのような治療処置を必
要とする患者に対して医者が行う。必要とされる投与量
は処置されるべき特定の症状、その症状の度合および希
望する処置期間により変化するだろう。

このようなペプチドはしばしば酸付加塩や金属錯体（例
えば、亜鉛、鉄またはこの用途の塩として考えられる同
様の金属）のような薬学的にもしくは獣医学的に許容さ
れる無毒性塩の形で投与される。そのような酸付加塩の
例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、マレイン
酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、
リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩および類似の
塩である。活性成分が錠剤の形体で経口的に投与される
場合、その錠剤はトラガカント、とうもこし澱粉または
ゼラチンのような結合剤；アルギン酸のような崩壊剤；
およびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含み
うる。液体での投与が望まれる場合には甘味剤および／
または風味剤を使用してもよく、また等張塩水、燐酸緩
衝液または類似のものでの静脈内投与が行われうる。

ペプチドは医者の指導の下でヒトに投与されるべきであ
り、そして医薬組成物は通常薬学的に許容される慣用担
体と共にペプチドを含むだろう。非経口投与量は通常患
者の体重1kgあたり約20ナノグラムないし約25マイクロ
グラムであるだろう。

本発明はその好適な実施態様（目下発明者が最もよい方
法であると認めるもの）に関して記載したが、当該分野
で通常の技術を有する者に明らかであるような種々の変
化ならびに改変が添付の特許請求の範囲で説明した本発
明の範囲から逸脱することなしになされるだろう。例え
ば、ペプチド鎖の改変（特にペプチドのカルボキシル末
端から始まる削除）はペプチドの効力の全部分または実
質的部分を保有する断片をつくるために今までに知られ
た実験上の慣行に従つて行うことができ、このようなペ
プチドは本発明の範囲内であると考えられる。さらに、
アミノ酸残基の付加はいずれか一方の末端で、もしくは
両方の末端で行うことができ、そして／またペプチド化
学の全分野でよく知られるように、天然に存在するアミ
ノ酸残基の代りに同等のアミノ酸残基で置換して、本発
明の範囲から逸脱することなしに天然ポリペプチドの効
力の少なくとも実質的部分を有する類似体を製造するこ
とが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨアヒム・シユピ−ス アメリカ合衆国カリフオルニア州エンシニ タス・サ−ロ・ストリ−ト271

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式： H-R₁‐Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈‐Ser-R₁₀‐Arg-R₁₂
   ‐R₁₃‐Leu--R₁₅‐Gln-Leu-R₁₈‐Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-
   R₂₄‐R₂₅‐Ile-R₂₇‐R₂₈‐Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄‐A
   sn-Gln-Glu-R₃₈‐R₃₉‐R₄₀‐Arg-Phe-Asn-Val-Y ［式中、R₁はTyr、D-Tyr、Phe、Leu、D-HisまたはHisで
   あり；R₈はSerまたはAsnであり；R₁₀はTyr、PheまたはD
   -Tyrであり；R₁₂はArgまたはLysであり；R₁₃はIleまた
   はValであり；R₁₅はGlyまたはD-Alaであり；R₁₈はTyrま
   たはSerであり；R₂₄はHisまたはGlnであり；R₂₅はGluま
   たはAspであり；R₂₇はNle、Met、Ile、D-MetまたはVal
   であり；R₂₈はSerまたはAsnであり；R₃₄はArgまたはSer
   であり；R₃₈はGlnまたはArgであり；R₃₉はArgまたはGly
   であり；R₄₀はSerまたはAlaであり；そしてＹはOHまた
   はNH₂である；ただしR₁がTyrであるときR₂₇はMet以外の
   ものであり；またＣ末端から１〜15個のアミノ酸残基は
   生物学的に活性な断片を提供するために削除されうる］ で表わされる合成ペプチドまたはその無毒性塩。
2. 【請求項２】R₁がHisである、特許請求の範囲第１項記
   載の合成ペプチド。
3. 【請求項３】ＹがNH₂である、特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の合成ペプチド。
4. 【請求項４】R₂₇がNleである、特許請求の範囲第１〜３
   項のいずれかに記載の合成ペプチド。
5. 【請求項５】R₁₀がTyrであり、R₁₅がGlyであり、かつR
   ₂₈がSerである、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか
   に記載の合成ペプチド。
6. 【請求項６】R₁がＤ−Tyrであり、R₂₇がNle、Valまたは
   Ileである、特許請求の範囲第１項記載の合成ペプチ
   ド。
7. 【請求項７】次の配列： His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Il
   e-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-
   Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gl
   n-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn を有する、特許請求の範囲第１項記載の合成ペプチド。
8. 【請求項８】アミノ酸残基32以降のアミノ酸残基がすべ
   て削除されている、特許請求の範囲第１〜７項のいずれ
   かに記載の合成ペプチド。
9. 【請求項９】動物において成長ホルモンの放出を刺激す
   る組成物であって、次式： H-R₁‐Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈‐Ser-R₁₀‐Arg-R₁₂
   ‐R₁₃‐Leu-R₁₅‐Gln-Leu-R₁₈‐Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R
   ₂₄‐R₂₅‐Ile-R₂₇‐R₂₈‐Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄‐As
   n-Gln-Glu-R₃₈‐R₃₉‐R₄₀‐Arg-Phe-Asn-Val-Y ［式中、R₁はTyr、D-Tyr、Phe、Leu、D-HisまたはHisで
   あり；R₈はSerまたはAsnであり；R₁₀はTyr、PheまたはD
   -Tyrであり；R₁₂はArgまたはLysであり；R₁₃はIleまた
   はValであり；R₁₅はGlyまたはD-Alaであり；R₁₈はTyrま
   たはSerであり；R₂₄はHisまたはGlnであり；R₂₅はGluま
   たはAspであり；R₂₇はNle、Met、Ile、D-MetまたはVal
   であり；R₂₈はSerまたはAsnであり；R₃₄はArgまたはSer
   であり；R₃₈はGlnまたはArgであり；R₃₉はArgまたはGly
   であり；R₄₀はSerまたはAlaであり；そしてＹはOHまた
   はNH₂である；ただしR₁がTyrであるときR₂₇はMet以外の
   ものであり；またＣ末端から１〜15個のアミノ酸残基は
   生物学的に活性な断片を提供するために削除されうる］ で表わされるペプチドまたはその無毒性塩、および獣医
   学的もしくは薬学的に許容される液体または固体の担体
   を含む組成物。
10. 【請求項１０】ヒト以外の動物において成長ホルモンの
    放出を刺激する方法であって、有効量の次式： H-R₁‐Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈‐Ser-R₁₀‐Arg-R₁₂
    ‐R₁₃‐Leu-R₁₅‐Gln-Leu-R₁₈‐Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R
    ₂₄‐R₂₅‐Ile-R₂₇‐R₂₈‐Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄‐As
    n-Gln-Glu-R₃₈‐R₃₉‐R₄₀‐Arg-Phe-Asn-Val-Y ［式中、R₁はTyr、D-Tyr、Phe、Leu、D-HisまたはHisで
    あり；R₈はSerまたはAsnであり；R₁₀はTyr、PheまたはD
    -Tyrであり；R₁₂はArgまたはLysであり；R₁₃はIleまた
    はValであり；R₁₅はGlyまたはD-Alaであり；R₁₈はTyrま
    たはSerであり；R₂₄はHisまたはGlnであり；R₂₅はGluま
    たはAspであり；R₂₇はNle、Met、Ile、D-MetまたはVal
    であり；R₂₈はSerまたはAsnであり；R₃₄はArgまたはSer
    であり；R₃₈はGlnまたはArgであり；R₃₉はArgまたはGly
    であり；R₄₀はSerまたはAlaであり；そしてＹはOHまた
    はNH₂である；ただしR₁がTyrであるときR₂₇はMet以外の
    ものであり；またＣ末端から１〜15個のアミノ酸残基は
    生物学的に活性な断片を提供するために削除されうる］ で表わされるペプチドまたはその無毒性塩、および獣医
    学的もしくは薬学的に許容される液体または固体の担体
    を含む組成物を該動物に投与することからなる方法。
11. 【請求項１１】該投与が、ヒト以外の温血動物の成長を
    促進するために行われる、特許請求の範囲第10項記載の
    方法。
12. 【請求項１２】該投与が、養殖における冷血動物の成長
    を促進するために行われる、特許請求の範囲第10項記載
    の方法。