DK161096B - Hpgrf-analoge peptider, ikke toksiske salte heraf og midlet indeholdende disse - Google Patents
Hpgrf-analoge peptider, ikke toksiske salte heraf og midlet indeholdende disse Download PDFInfo
- Publication number
- DK161096B DK161096B DK012984A DK12984A DK161096B DK 161096 B DK161096 B DK 161096B DK 012984 A DK012984 A DK 012984A DK 12984 A DK12984 A DK 12984A DK 161096 B DK161096 B DK 161096B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- arg
- ala
- leu
- ser
- gln
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 125
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims description 12
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 title claims description 7
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 title claims description 7
- -1 Leu Chemical compound 0.000 claims description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 14
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 11
- 125000003295 alanine group Chemical class N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 10
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 9
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 2
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000000030 D-alanine group Chemical group [H]N([H])[C@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 55
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 55
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 43
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 40
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 23
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 23
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 23
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 14
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical group C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 4
- 101100338242 Drosophila virilis His1.1 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- ORNDKVCWLUZAQL-FOWIMTFFSA-N rgrf 43 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CN=CN1 ORNDKVCWLUZAQL-FOWIMTFFSA-N 0.000 description 4
- SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 239000003501 hydroponics Substances 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 108010036509 somatotropin releasing factor 40 Proteins 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- NXJOFTRBTBDSHB-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-1,4-diazepane-1-carbothioyl)sulfanyl 4-methyl-1,4-diazepane-1-carbodithioate Chemical compound C1CN(C)CCCN1C(=S)SSC(=S)N1CCN(C)CCC1 NXJOFTRBTBDSHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFFMLCVRJBZUDZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbutane Chemical group CC(C)C(C)C ZFFMLCVRJBZUDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006282 2-chlorobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Cl)=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- SCEVBRBKKQZTKM-UHFFFAOYSA-N 5-[[6-chloro-5-(1-methylindol-5-yl)-1H-benzimidazol-2-yl]oxy]-N-hydroxy-2-methylbenzamide Chemical compound ClC=1C(=CC2=C(NC(=N2)OC=2C=CC(=C(C(=O)NO)C=2)C)C=1)C=1C=C2C=CN(C2=CC=1)C SCEVBRBKKQZTKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000252073 Anguilliformes Species 0.000 description 1
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000270605 Chelonia Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-RFZPGFLSSA-N D-Isoleucine Chemical compound CC[C@@H](C)[C@@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-RFZPGFLSSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N D-valine Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122439 Hydroxylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100170937 Mus musculus Dnmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical compound [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 125000005075 adamantyloxy group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)O* 0.000 description 1
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 description 1
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000005740 oxycarbonyl group Chemical group [*:1]OC([*:2])=O 0.000 description 1
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
DK 161096 B
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte hpGRF-ana-loge peptider med formlen H-R^-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-R^ g-Arg-R^ 3-Leu-R^ ^-Gl n-Leu-R-^g-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu- R24-R25-11^^27-^28“Arg“Gln-Gln“Gly_Glu~R34-Asn_Gln-Glu_ 5 R38-R39-R40-Arg-R42~R43-R44-Y' N-terminale fragmenter heraf, hvor den kortest mulige sekvens består af aminosyrerne 1-27, samt farmaceutisk acceptable salte salte heraf, der fremmer frigørelsen af væksthormon fra hypofysekirtlen.
Fysiologer har længe erkendt, at hypothalamus styrer hele 10 sekretionsfunktionen af hypofysens forlap, idet hypothala mus producerer særlige polypeptider, der udløser sekretionen af hvert hypofysehormon. En inhiberende faktor er blevet karakteriseret, hvilken faktor inhiberer sekretionen af væksthormon (GH) og betegnes somatostatin.
15 En tilsvarende hypothalam frigørelsesfaktor for hypofysært GH er for nylig blevet isoleret fra en ekstrakt fra en human pancreassvulst, renset, karakteriseret, syntetiseret og afprøvet. Dette peptids sekvens er som følger:
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-2 0 Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-
Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu.
Den amiderede form af dette peptid antages at være og omtales i det følgende som hpGRF (for human pancreas svulst -25 GH-frigørelsesfaktor).
Et polypeptid er nu blevet isoleret fra rottehypothalamiske ekstrakter, renset, karakteriseret, syntetiseret og afprøvet, hvilket polypeptid frigører GH fra dyrkede hypofyseceller. Sekvensen i dette naturligt forekommende 43-30 rest-peptid er som følger: 2
DK 161096 B
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH.
5 Peptidet betegnes i det følgende som rhGRF (for rottehypo- thalamisk GH-frigørelsesfaktor).
Visse hpGRF-analoge er nu blevet syntetiseret og afprøvet, hvilke analoge er mere virksomme end hpGRF selv, af hvilke analoge mange har kortere længde. Nogle af disse analoge er baseret på substitutioner, der er i overensstemmelse med formlen for rhGRF, medens andre er baseret på andre substitutioner. Farmaceutiske midler ifølge opfindelsen indbefatter disse hpGRF-analoge eller et ikke-toksisk salt deraf, der er dispergeret i en farmaceutisk acceptabel 15 flydende eller fast bærer. Sådanne farmaceutiske midler kan anvendes inden for klinisk medicin, både human og veterinær, til administration med henblik på terapeutiske formål og også diagnostisk. De kan endvidere anvendes til at fremme væksten af varmblodede dyr indbefattende f jer-20 kræ samt inden for hydroponik til koldblodede dyr, f.eks.
fisk, ål etc..
Den til definering af peptidet benyttede nomenklatur er den af Schroder & Lubke anbefalede i "The Peptides", Academic Press (1965), hvori aminogruppen i overensstem-2 5 melse med kcnventionel angivelse ved N-terminalen forekom mer til venstre og carboxylgruppen ved C-terminalen forekommer til højre. Med naturlig aminosyre menes en af de almindeligt naturligt forekommende aminosyrer, der findes i proteiner, omfattende Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, 30 Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp og His. Når aminosyreresten har isomere former, er det aminosyrens L-form, der angives, medmindre andet udtrykkeligt anføres. Til den foreliggende ansøgnings formål betragtes rhGRF som værende en hpGRF-analog.
DK 161096 B
3
De hpGRF-analoge peptider ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at R^ er Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His eller His, 5 Rg er Ser eller Asn, R10 er Tyr, Phe eller D-Tyr, R12 er eHer Lys, R^g er Ile eller Val, R^g er Gly eller D-Ala, 10 Rjg er Tyr eller Ser, R24 er His eller Gin, r25 er Glu eller Asp, R27 er valgt blandt D- og L-isomerene af Ala, Nle, Ile,
Leu, Met og Val, 15 r28 er Ser, Asn eller D-ala, R34 er Arg eller Ser,
Rgg er Gin eller Arg,
Rgg er Arg eller Gly, R40 er Ser eller Ala,
DK 161096 B
4 R42 er Phe eller Ala, R43 er Asn eller Arg, R44 er en naturlig aminosyre eller des-R44, og Y betegner carboxyldelen af aminosyreresten ved C-afslut-5 ningen og er gruppen -COOR,-CRO,-CONHNHR,-CON(R)(R') eller -CH2OR, idet R og R' er lavere alkyl, fluor-lavere alkyl eller hydrogen, forudsat imidlertid, at når R-^ er Tyr, da er en eller flere af de følgende aminosyrer til stede: 10 R27 er andet end Met, Rg er Ser, R12 er Arg, R13 er
Ile, R18 er Tyr, R24 er His, R25 er Glu, R2g er Asn, R34 er Arg, R3g er Gin, R39 er Arg, R4Q er Ser, R42 er Phe og R43 er Asn.
Methyl, ethyl og propyl er de foretrukne lavere 15 alkylgrupper. Fragmenter af ovennævnte peptider har også biologisk virkningsstyrke, og det antages generelt, at peptidet i det mindste bør strække sig fra N-terminalen til aminosyrerest nr. 27. Når peptidfragmentet kun strækker sig til rest nr. 27 og 28, bør Y være NH2 eller et 20 substitueret amid, medens Y fortrinsvis er et amid eller substitueret amid, når fragmentet strækker sig til en af resterne 29 til 39.
hpGRF-analogene med en af de for Met nævnte substituenter i 27-stillingen udviser væsentlig større stabilitet, især 25 ved udsættelse for oxiderende betingelser. Hvis substi-tuenten er en D-isomer, kan enzymbestandighed endvidere forøges. De forbliver fuldt ud biologisk aktive, og visse analoge udviser overraskende forøget virkningsstyrke ved afprøvning in vitro. Substitution af His i 1-stillingen 5
DK 161096 B
tilvejebringer en overraskende høj virkningsstyrke. Endvidere bevarer substitution af en D-isomer aminosyre, f.eks. D-Tyr, et overraskende omfang af virkningsstyrke og kan være ganske værdifuld ved at gøre peptidet modstandsdygtigt 5 mod nedbrydning forårsaget af visse enzymer.
Peptiderne syntetiseres ved hjælp af en passende metode, såsom udelukkende ved hjælp af fastfase-teknik, ved hjælp af delvis fastfase-teknik, ved hjælp af fragmentkondensation, ved hjælp af klassiske opløsningskoblinger eller 10 ved anvendelse af for nylig udviklet DNA-rekombinations teknik. F.eks. er metoden til udelukkende fastfase-syntese angivet i lærebogen "Solid-Phase Peptide Synthesis",
Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, og den er eksemplificeret i USA-patentskrift nr. 4.105.603.
15 Fragmentkondensationssyntesemetoden er eksemplificeret i USA-patentskrift nr. 3.972.859. Andre til rådighed stående synteser er eksemplificeret i USA-patentskrifterne nr.
3.842.067 og nr. 3.862.925.
Syntese ved anvendelse af DNA-rekombinationsteknik skal 20 til ansøgningens formål forstås som indbefattende den be hørige anvendelse af et strukturelt gen, der koder for den ønskede form af hpGRF-analog eller et fragment deraf. Det syntetiske hpGRF-peptid kan opnås ved transformation af en mikroorganisme under anvendelse af en ekspressionsvektor 25 indeholdende en aktivator og operator sammen med et sådant strukturelt gen og ved at bringe en sådan transformeret mikroorganisme til at udtrykke eller manifestere (express) hpGRF-peptidet. Et dyr (ikke menneske) kan også anvendes til at producere hpGRF-peptidet ved hjælp af gen-dyrkning 30 under anvendelse af et sådant strukturelt gen og den gene- j relle teknik, der er angivet i USA-patentskrift nr. 4.276.282, j eller ved anvendelse af mikroindsprøjtning i fostre som ! beskrevet i WO83/01783 og WO82/04443. Det syntetiske hpGRF- !
DK 161096 B
6 peptid kan også produceres direkte i dyret, for hvilket accelereret vækst er tilsigtet, ved hjælp af den teknik, der er beskrevet i de to WO-publikationer.
Fælles for kemiske synteser er beskyttelsen af de forskel-5 lige aminosyremolekyldeles labile sidekædegrupper med egne de beskyttelsesgrupper, der vil hindre en kemisk reaktion i at finde sted på dette sted, indtil gruppen til sidst fjernes. Fælles er sædvanligvis også beskyttelsen af en α-aminogruppe på en aminosyre eller et fragment, medens 10 denne enhed reagerer ved carboxylgruppen, efterfulgt af selektiv fjernelse af α-aminobeskyttelsesgruppen for at gøre det muligt for efterfølgende omsætning at finde sted på dette sted. Følgelig er det fælles, som et trin i syntesen, at en intermediær forbindelse dannes, hvilken for-15 bindelse indeholder hver af aminosyreresterne placeret i dens ønskede rækkefølge i peptidkæden med sidekædebeskyt-telsesgrupper knyttet til de pågældende aminosyrerester.
Mellemprodukter kan have formlen: X^R^X eller X2) -Ala-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Rg (X4 20 eller X8)-Ser (X4)-R.^ (X2)-Arg (X^)-R^2 (X** eller X^)-R^“
Leu-R^g-Gln(X8)-Leu-R, g(X2)-Ala-Arg(X8)-Lys(X^)-Leu-Leu-R24(X eller X5)-R25(X5)-Ile-R27-R98(X4 eller X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 eller X6)-Asn(X5)-Gin(X5)-G1u(X3)-R38(X5 eller X6)-R3g(X§)-R4Q(X4)-Arg(X6)-R42-R43(X5 25 eller X6)-R44(X8)-X9, hvori X er enten hydrogen eller en a-aminobeskyttelses-gruppe. De med X3" betegnede α-aminobeskyttelsesgrupper er sådanne, der vides at være anvendelige til trinvis syntese af polypeptider. Til klasserne af α-aminobeskyΙ-ΙΟ telsesgrupper, der kan anvendes som x\ hører (1) aro matiske beskyttelsesgrupper af urethantype, såsom fluore=
DK 161096 B
7 nylmethyloxycarbonyl (PMOC), benzyloxycarbonyl (Z) og substitueret Z, såsom p-chlorbenzyloxycarbonyl, p-nitro-benzyloxycarbonyl, p-brombenzyloxycarbonyl og p-methoxy= benzyloxycarbonyl; (2) alifatiske urethan-beskyttelses-grupper, såsom t-butyloxycarbonyl (BOC), diisopropyl= methyloxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, ethoxycarbonyl, 5 allyloxycarbonyl; og (3) cykloalkyl-beskyttelsesgrupper af urethantype, såsom cyklopentyloxycarbonyl, adamantyloxy= carbonyl og cyklohexyloxycarbonyl. Den foretrukne a-amino-beskyttelsesgruppe er BOC.
X er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for imidazol-10 nitrogenet i His, såsom Tos.
2 X kan være en egnet beskyttelsesgruppe for den phenoliske hydroxylgruppe i Tyr, såsom tetrahydropyranyl, tert.-butyl, trityl, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ og 2,6-dichlorbenzyl (DCB). Den 2 foretrukne beskyttelsesgruppe er 2,6-dichlorbenzyl. X 15 kan være hydrogen, hvilket betyder, at der ikke findes nogen sidekædebeskyttelsesgruppe på aminosyreresten i den stilling.
3 X er hydrogen eller en egnet esterdannende beskyttelsesgruppe for carboxylgruppen i Asp eller Glu, såsom benzyl 20 (OBzl), 2,6-dichlorbenzyl, methyl ethyl.
4 X kan være en egnet beskyttelsesgruppe for hydroxylgrup- pen i Thr eller Ser, såsom acetyl, benzoyl, tert.-butyl, trityl, tetrahydropyranyl, Bzl, 2,6-dichlorbenzyl og CBZ.
4
Den foretrukne beskyttelsesgruppe er Bzl. X kan være hy= 25 drogen, hvilket betyder, at der ikke findes nogen beskyt- ' telsesgruppe på hydroxylgruppen. ' 5 ! X er hydrogen eller en egnet beskyttelsesgruppe for side- 5 kædeamidogruppen i Asn eller Gin. X er fortrinsvis xan= thyl(Xan).
DK 161096 B
8 g X er en egnet beskyttelsesgruppe for guanidinogruppen i Arg, såsom nitro, Tos, CBZ, adamantyloxycarbonyl og BOC, g eller også er X hydrogen.
7 X er hydrogen eller en egnet beskyttelsesgruppe for side-5 kædeaminogruppen i Lys. Eksempler på egnede sidekædeamino- beskyttelsesgrupper er 2-chlorbenzyloxycarbonyl (2-Cl-Z), Tos, t-amyloxycarbonyl og BOC.
g X er hydrogen eller en egnet sidekædebeskyttelsesgruppe som ovenfor generelt anført.
10 Met kan om ønsket være beskyttet med oxygen, men lades fortrinsvis være ubeskyttet.
Udvælgelsen af en sidekædeaminobeskyttelsesgruppe er ikke afgørende, med undtagelse af at der generelt vælges en, som ikke fjernes under afbeskyttelse af a-aminogrupperne 15 under syntesen. For nogle aminosyrer, f.eks. His, er be skyttelse imidlertid ikke generelt nødvendig efter at kobling er afsluttet, og beskyttelsesgrupperne kan være de samme.
9 X er en egnet beskyttelsesgruppe for C-terminal-carboxyl- 3 20 gruppen, såsom den esterdannende gruppe X , eller også er 9 X en forankrende binding, der benyttes ved fastfase-syntese 9 til tilknytning til en fast harpiksbærer, eller er des-X , i hvilket tilfælde resten ved C-terminalen har en carboxyl-molekyldel, som er Y som ovenfor defineret. Når en fast 25 harpiksbærer anvendes, kan den være enhver af de hidtil kendte, såsom en sådan med formlerne: -O-C^-harpiksbærer, -NH-benzhydrylamin (BHA)-harpiksbærer eller -NH-paramethyl-benzhydrylamin (MBHA)-harpiksbærer. Når det usubstituerede amid ønskes, foretrækkes anvendelse af BHA- eller MBHA-30 harpiks, fordi spaltning direkte fører til amidet. I til fælde af at N-methylamid ønskes, kan dette dannes ud fra
DK 161096 B
9 en N-methyl-BHA-harpiks. Hvis andre substituerede amider ønskes, eller hvis andre grupper end den frie syre ønskes ved C-endestillingen, kan det være ønskeligt at syntetisere peptidet under anvendelse af klassiske metoder, såsom 5 de i Houben-Weyl-lærebogen anførte.
I formlen for mellemproduktet er mindst én af X-grupperne ft en beskyttelsesgruppe, eller også indbefatter X harpiksbærer. Opfindelsen angår således også en fremgangsmåde til fremstilling af et interessant peptid ved (a) dannelse af et peptid med mindst én beskyttelsesgruppe samt formlen (II) : X1-^ (X eller X2) -Ala-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4)-Rg (X4 eller R5)-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-R12(X6 eller X7)-R13-Leu-Gly-Gln(X3)-Leu-R.g(X2)-Ala-Arg(X8)-Lys(X7)-Leu-Leu-15 r24(X eller X5)-R25 (X3)-Ile-R^-R (X4 eller X5)-Arg(X6)-
Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34 (X4 eller X6) -Asn (X5) -Gin ( X5)-Glu(X3)-R3g(X5 eller X6)-Rg9 (X6)-R4Q (X4)-Arg(X6)-R42> R43(X5 eller X§)-R44(X8)-X9, hvori X, χ\ X2, X3, X4, X5, X6, X7 og X8 hver er enten 9 20 hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, og X er enten en beskyttelsesgruppe eller en forankringsbinding til harpiks- 9 bærere eller des-X , i hvilket tilfælde resten ved C-ter-minalen har en carboxymolekyldel, som er Y, (b) fraspaltning af beskyttelsesgruppen eller beskyttelsesgrupperne eller for-25 ankringsbindingen fra nævnte peptid med formlen (II), og (c) om ønsket omdannelse af et resulterende peptid til et ikke-toksisk salt deraf.
Ved udvælgelse af en bestemt sidekædebeskyttelsesgruppe, der skal anvendes ved syntesen af peptiderne, følges følgen- ! 50 de regler: (a) beskyttelsesgruppen skal bevare sine beskyt- ! tende egenskaber og ikke blive fraspaltet under koblings- ! betingelser, (b) beskyttelsesgruppen skal være stabil over
DK 161096 B
10 for reagenset og, med undtagelse af Xan, skal være stabilt under de til fjernelse- af α-aminobeskyttelsesgruppen valgte reaktionsbetingelser på hvert trin i syntesen, og (c) side-kædebeskyttelsesgruppen skal efter afslutning af syntesen 5 indeholdende den ønskede aminosyresekvens kunne fjernes under reaktionsbetingelser, der ikke vil ændre peptidkæden .
Når peptider ikke fremstilles under anvendelse af DNA-rekombinationsteknologi, fremstilles de fortrinsvis ved 10 anvendelse af fastfase-syntese, såsom den generelt af
Merrifield beskrevne, J. Am.Chem. Soc., 85, side 2149 (1963), selv om andre ækvivalente kemiske synteser, der kendes på området, også kan anvendes som nævnt i det foregående. Fastfase-syntese påbegyndes fra C-terminalenden 15 af peptidet ved kobling af en beskyttet α-aminosyre til en egnet harpiks. Et sådant udgangsmateriale kan fremstilles ved via en esterbinding at knytte en a-aminobe-skyttet aminosyre til en chlormethyleret harpiks eller en hydroxymethylharpiks eller til en BHA-harpiks eller ΜΒΗΆ-20 harpiks via en amidbinding. Hvis et methyl-, ethyl- eller propylamid skal inkorporeres i det resulterende polypeptid, anvendes en chlormethyleret harpiks eller en hydroxymethylharpiks, og spaltning udføres hensigtsmæssigt ved anvendelse af den pågældende amin, 25 f.eks. ethylamin.
Til fremstilling af 40-rest-peptidet kobles f.eks. Ala, der er beskyttet med BOC, til den chlormethylerede harpiks i overensstemmelse med proceduren ifølge Monahan og Giion, Biopolymer 12, side 2513 - 2519, 1973. Efter 30 koblingen af BOC-Ala til harpiksbæreren fjernes a-amino- beskyttelsesgruppen, såsom ved anvendelse af trifluor-eddikesyre (TFA) i methylenchlorid, TFA alene eller HC1 i dioxan. Afbeskyttelsen udføres ved en temperatur mellem ca. 0°C og stuetemperatur. Andre standardspaltnings-
DK 161096 B
11 reagenser og betingelser til fjernelse af bestemte a-amino-beskyttelsesgrupper kan benyttes som beskrevet af Schroder & Lubke i "The Peptides", 1, side 72 - 75 (Academic Press 1965).
5 Efter fjernelse af Phe's α-aminobeskyttelsesgruppe kobles de resterende α-amino- og sidekædebeskyttede aminosyrer trinvis i den ønskede orden til opnåelse af den i det foregående definerede intermediære forbindelse, eller også kan som et alternativ til addition af hver aminosyre se-10 parat i syntesen nogle af dem kobles til hianden forud for addition til fastfase-reaktoren. Udvælgelsen af et passende koblingsreagens ligger inden for fagmandens kunnen.
Særlig egnet som koblingsreagens er N,N'-dicyklohexylcar= bodiimid (DCCI).
15 De ved fastfase-syntesen af peptiderne benyttede aktiverende reagenser er velkendte inden for peptidområdet. Eksempler på egnede aktiveringsreagenser er carbodiimider, såsom N,N1-diisopropylcarbodiimid og N-ethyl-N1-(3-dimethylamino= propyl)carbodiimid. Andre aktiveringsreagenser og deres 20 anvendelse inden for peptidkobling er beskrevet af Schroder & Lubke supra, i kapitel III, og af Kapoor i J. Phar. Sci., 59, side 1-27 (1970).
Hver beskyttet aminosyre eller aminosyresekvens indføres i fastfase-reaktoren i et ca. firdobbelt eller større over-25 skud, og koblingen kan udføres i et medium af dimethyl- formamid (DMF): CH2C12 (1:1) eller i DMF eller CH2C12 alene.
I tilfælde, hvor ufuldstændig kobling finder sted, gen- ! tages koblingsproceduren før fjernelse af α-aminobeskyt- | telsesgruppen forud for koblingen af den næste aminosyre.
30 Vellykketheden af koblingsreaktionen på hvert trin i syn tesen måles ved hjælp af ninhydrinreaktionen således som beskrevet af E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 ! (1970). Koblingsreaktionerne kan udføres automatisk, så-
DK 161096 B
12 som med en Beckman 990 automatisk syntetisator, ved anvendelse af et program som det af Rivier et al. omtalte i Biopolymers, 1978, 17, side 1927 - 1938.
Efter at den ønskede aminosyresekvens er blevet afsluttet, 5 kan det intermediære peptid fjernes fra harpiksbæreren ved behandling med et reagens, såsom flydende hydrogenfluorid, der ikke alene spalter peptidet fra harpiksen, men også fraspalter alle tilbageværende sidekædebeskyttelsesgrup- per X, X2, X2, X^, X^, X^, X^ og X^, forankringsbindingen 9 1 10 X samt α-aminobeskyttelsesgruppen X til opnåelse af peptidet i form af den frie syre. Hvis Met er til stede i sekvensen, fjernes BOC-beskyttelsesgruppen fortrinsvis først ved anvendelse af trifluoreddikesyre (TFA)/ethandithiol forud for spaltning af peptidet fra harpiksen med HF til 15 fjernelse af eventuel S-alkylering. Ved anvendelse af hydrogenfluorid til spaltning indføres anisol og methyl-ethylsulfid i reaktionsbeholderen til skylning.
Som én fremgangsmåde til fremstilling af de syntetiske peptider under anvendelse af DNA-rekombinationsteknologi 20 indføres fortrinsvis en Met-rest som en yderligere rest ved N-afslutningen, og Met bør ikke være til stede andetsteds i peptidet. På lignende måde skal alle de i peptidet benyttede rester være naturligt forekommende L-isomer-amino-syrer eller Gly. Som resultat dannes et foretrukket peptid-25 mellemprodukt med formlen: H-Met-R^-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Try-Arg-R^2~R^3“
Leu-Gly-Gln-Leu-R^g-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25~Ile-R27- R28~Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-Rgg-Rgg-R40-Arg- R42“R43~R44~Y' 30 hvori R1 er Tyr, Leu eller His, Rg er Ser eller Asn, R12 er Arg eller Lys, R^g er Ile eller Val, R-^g er Tyr eller Ser, R24 er His eller Gin, R25 er Glu eller Asp, er
DK 161096 B
13
Ala, Nle, Ile, Leu eller Val, R2g er Asn eller Ser, Rg4 er Arg eller Ser, R^g er Gin eller Arg, R^g er Arg eller Gly, R40 er Ser eller Ala, R42 er Phe eller Ala, R43 er Asn eller Arg, R44 er en naturlig aminosyre eller des-R44, 5 og hvori Y betegner carboxylmolekyldelen af C-afslutnings- resten og er enten -COOH eller CONH2.
Når først dette peptid udtrykkes eller manifesteres af en genetisk modificeret mikroorganisme, og mellemproduktet udvindes og renses ved anvendelse af kendte metoder, 10 behandles mellemproduktet med cyanogenbromid til fraspalt- ning af Met-resten ved N-afslutningen og dannelse af det biologisk aktive peptid. Selv om den ovenfor anførte formel angiver, at peptidet vil strække sig til stillingen 43 eller stillingen 44 som andetsteds heri anført, tilveje-15 bringes væsentlig biologisk aktivitet ved hjælp af peptider med så få som 27 - 29 rester, og sådanne kortere fragmenter betragtes som værende generelt ækvivalente til mange formål.
j j
De følgende eksempler angiver den foretrukne metode til 20 syntetisering af hpGRF-analoge ved hjælp af fastfase- teknikken. Det vil selvsagt forstås, at syntesen af et tilsvarende kortere peptidfragment udføres på samme måde ved blot at fjerne det krævede antal aminosyrer begyndende ' ved C-terminalen.
25 Eksempel I.
Syntesen af [Ile^]-hpGRF (1-40)-NH2 med formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-
DK 161096 B
14
Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-hydrochloridharpiks, såsom den, der kan fås fra Bachem, Inc., og har et sub-5 stitutionsinterval på ca. 0,1 - 0,5 mmol/g harpiks. Kob ling af BOC-Ala til harpiks udføres ved hjælp af den generelle procedure, der nedenfor er anført i skemaerne A og B, hvilken procedure anvendes gennem hele syntesen, og den resulterer i substitution af ca. 0,35 mmol Ala pr. g har-piks. Alle benyttede opløsningsmidler afgasses omhyggeligt ved gennembobling med en inert gas, f.eks. helium eller nitrogen, til sikring af fravær af oxygen, som på uønsket måde kunne oxidere svovlet i Met-resten.
Efter afblokering og neutralisering opbygges peptidkæden 15 trin for trin på harpiksen. Afblokering, neutralisering og tilføjelse af hver aminosyre udføres generelt i overensstemmelse med proceduren angivet af Vale et al. i USA-patentskrift nr. 4.292.313.
Afblokering udføres fortrinsvis i overensstemmelse med 20 følgende skema A:
Reagens Blandetid (min.) 1. 60% TFA/2% ethandithiol 10 2. 60% TFA/2% ethandithiol 15 3. IPA/1% ethandithiol 0,5 25 4. Et3N (10%) i CH2C12 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N (10%) i CH2C12 0,5 7. MeOH (to gange) 0,5 8. CH2C12 (to gange) 0,5.
30 Koblingerne udføres fortrinsvis som anført i det følgende skema B:
DK 161096 B
15
Reagens Blandetid (min.)
9. DCCI
10. Boc-aminosyre 50 - 90 11. MeOH (to gange) 0,5 5 12. CH2C12 (to gange) 0,5 13. Ac20 (3M) i CH2C12 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 16. CH2C12 (to gange) 0,5 10 Kort fortalt anvendes ét eller to mmol BOC-beskyttet amino syre i methylenchlorid pr. g harpiks plus ét ækvivalent 1,0 molær DCCI i methylenchlorid i 2 timer. Når BOC-Arg(TOS) kobles, anvendes en blanding af 50% DMF og methylenchlorid. Bzl-ether anvendes som hydroxyl-sidekædebeskyttelsesgrup-15 pen for Ser og Thr. p-nitrophenylester (oNp) anvendes til aktivering af carboxylenden af Asn eller Gin, og f.eks. kobles BOC-Asn(oNp) i løbet af natten ved anvendelse af ét ækvivalent HOBt i en 50% blanding af DMF og methylenchlorid, i hvilket tilfælde intet DCC tilsættes. Amido-20 gruppen i Asn eller Gin beskyttes med Xan, når DCC-kobling anvendes i stedet for aktiv ester-metoden. 2-chlorbenzyl= oxycarbonyl (2C1-Z) anvendes som beskyttelsesgruppen for Lys-sidekæden. Tos anvendes til at beskytte guanidino-gruppen i Arg, og Glu- eller Asp-carboxylgruppen beskyt-25 tes som Bzl-esteren (OBzl). Den phenoliske hydroxylgruppe i Tyr beskyttes med 2,6-dichlorbenzyl (DCB). Ved afslutningen af syntesen opnås følgende sammensætning: X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn(X5)-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln(X5)-Leu-Ser(X4)-30 Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gin(X5)-Asp(X3)-Ile-Ile-Ser(X4)-
Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-Ser(X4) -Asn(X5) -Gln(X5)-Glu (X3)-Arg (X6)-Gly-Ala-X8,
DK 161096 B
16 12 3 4 hvori X er BOC, X er DCB, X er benzylester, X er Bzl, X^ er Xan, X^ er Tos, yp er 2C1-Z, og X^ er -NH-harpiks- bærer. Xan kan være blevet delvis eller fuldstændig fjernet ved hjælp af TFA-behandling, som blev benyttet til af- 5 blokering af α-aminobeskytteIsesgruppen.
Efter at den sidste Tyr-rest er blevet koblet til harpiksen, fjernes BOC med 60% TFA i C^C^· Med henblik på spaltning og afbeskyttelse af den tilbageværende beskyttede peptid-harpiks, behandles denne med 1,5 ml anisol, 0,5 ml 10 methylethylsulfid og 15 ml hydrogenfluorid (HF) pr. g peptid-harpiks ved -20°C i 1/2 time og ved 0°C i 1/2 time. Efter fjernelse af HF under højvakuum vaskes det tilbageværende harpiks-peptid skiftevis med tør diethylether og chloroform, og peptidet ekstraheres derpå med afgasset 15 2N vandig eddikesyre og skilles fra harpiksen ved hjælp af filtrering.
Det fraspaltede og afbeskyttede peptid opløses derpå i 0-5% eddikesyre og underkastes rensning, som kan indbefatte filtrering på fin "Sephadex" G-50-gel.
20 Peptidet renses derpå yderligere ved hjælp af præparativ eller halvpræparativ HPLC som beskrevet af Rivier et al. i Peptides: Structure and Biological Function, (1979), side 125 - 128, og af Marki et al. i J. Am. Chem. Soc.
103, 3178 (1981). Sammenfattet pakkes hylstre tilpasset 25 Waters Associates prep LC-500 med 15 - 20 C^g-silica fra
Vydac (300A). En gradient af CH^CN i TEAP dannes ved hjælp af en Eldex-lavtryksgradientdanner som beskrevet af J.
Rivier i J. Liq. Chromatography 1, 343 - 367 (1978).
De kromatografiske fraktioner måles omhyggeligt ved hjælp 30 af HPLC, og kun de fraktioner, som udviser betydelig renhed, samles. Afsaltning af de rensede fraktioner, der uafhængigt er kontrolleret for renhed, opnås ved anvendelse af en gradient af CH^CN i 0,1% TFA. Midterportionen
DK 161096B
17 lyofiliseres derpå til opnåelse af det ønskede peptid, hvis renhed er højere end 98%.
Syntesen gentages under anvendelse af en chlormethyleret harpiks til fremstilling af det samme peptid i fri syre-5 form under anvendelse af procedurer, som generelt er be skrevet af J. Rivier i J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986 -2992 (1974).
Eksempel II.
Syntesen af [Val27, D-Ala28]-hpGRF(1-40)-NH2 med formlen: 10 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-D-Ala-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg- Gly-Ala-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks på den i eksem-15 pel I beskrevne måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel III.
Syntesen af hpGRF-analogen [D-Tyr1]-hpGRF(1-32)-NH2 med formlen: 20 H-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 udføres på trinvis måde ved anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks på den i eksem-25 pel I beskrevne måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter som [a]D =
DK 161096 B
18 -61/4° + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
Syntesen gentages under anvendelse af en chlormethyleret harpiks til fremstilling af det samme peptid i den frie syreform som generelt anført i det foregående.
5 Eksempel IV.
27
Syntesen af den afkortede hpGRF-analog [Nle ]-hpGRF(1-32)-NH2 med formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-10 Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-N^ udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks på den i eksempel I beskrevne måde. Denne analog bedømmes som værende i det væsentlige ren ved anvendelse af TLC og HPLC. Den 15 optiske drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter som 22 o [a]D = -57,8 + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret). Den 97 samme generelle syntese udføres til fremstilling af [Nle]-hpGKF(l-44)-NH2.
Eksempel V.
20 Syntesen af [Nle^]-hpGRF (1-27)-NH2 med formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle- NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 25 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks på den i eksem pel I beskrevne måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
19
Eksempel VI.
DK 1ό 1096 B
Syntesen af [Ile^]-hpGRF(1-32) -OH med formlen:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-5 Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH
udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en chlormethyleret harpiks på den i slutningen af eksempel I nævnte måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske drejning måles på et foto-elektrisk polarimeter som [a]^ = -61,7° + 1 (C=l, 1% ed dikesyre, ukorrigeret).
Syntesen gentages under anvendelse af en MBHA-harpiks til fremstilling af det samme peptid i amideret form.
15 Eksempel VII.
27
Syntesen af [D-Met ]-hpGRF(1-32)-NH2 med formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-
Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 20 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks på den i eksempel I beskrevne måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter som [a] =
q c O D
-54,5 + 1 (C—1, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
20
Eksempel VIII.
DK 161096 B
Syntesen af [His1]-hpGEF (1-32)-NH2 med formlen: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-5 Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks på den i eksempel I beskrevne måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske 10 drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter som [<*]_. ' = O ^ -58,7 + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
Syntesen gentages under anvendelse af Phe som den sidste rest til fremstilling af [Phe1]-hpGRF(1-32)-NH2. Den optiske drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter som 15 [a]D ' = ”58,2° + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret) .
Eksempel IX.
Syntesen af [Phe1®]-hpGRF(1-32)-NH2 med formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Phe-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-20 Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 udføres på trinsvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks på den i eksempel I beskrevne måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske 25 drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter som [α]^ = -59,5° + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
Eksempel X.
21
DK 161096 B
Syntesen af [Val2^]-hpGRF(1-32)-OH med formlen:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-5 Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH
udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en chlormethyleret harpiks på den i slutningen af eksempel I nævnte måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse 10 af TLC og HPLC. Den optiske drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter som [a]22 = -62,4° + 1 (0=1, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
Eksempel XI.
Syntesen af [His\ Nle2^] -hpGRF (1-32) “ΝΗ^ med formlen: 15 H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-
Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks på den i eksem- 20 pel I beskrevne måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske 22 drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter som [a] = -59,3° + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
Eksempel XII.
25 Syntesen af rhGRF(1-43)-OH med formlen: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-
DK 161096 B
22
Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-
Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-
Phe-Asn-OH
udføres på trinvis måde ved anvendes af en Beckman 990 5 peptidsyntetisator med en chlormethyleret harpiks med et substitutionsinterval på ca. 0,1 - 0,5 mmol/g harpiks på den i eksempel VI anførte måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske drejning måles på et fotoelektrisk O O r\ 10 polarimeter som [a]p = -50,8 + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
Syntesen gentages under anvendelse af en MBHA-harpiks til fremstilling af rhGRF(1-43)-NH2 ved anvendelse af en begyndelsesprocedure som generelt beskrevet af Vale et al. 15 i USA-patentskrift nr. 4.292.313 til at knytte Asn til MBHA-harpiksen. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske drej-ning måles på et fotoelektrisk polarimeter som [a]D = -51,7° + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
20 Eksempel XIII.
Syntesen af rhGRF (1-40) -NH2 med formlen: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-
Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-
Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-NH2 25 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks som generelt beskrevet i eksempel I. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent under anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske drejning måles på et fotoelektrisk polarimeter
DK 161096 B
23 2 2 som [<x]D = -56,5° + 1 (C=l, 1% eddikesyre, ukorrigeret) .
Eksempel XIV.
Syntesen af en hpGRF-analog, dvs. [Met1, Leu27]-rhGRF(1-43)-OH, med formlen: 5 H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-
Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Leu-
Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-
Phe-Asn-OH
udføres på trinvis måde ved anvendelse af en Beckman 990 10 peptidsyntetisator med en chlormethyleret harpiks på den i eksempel XII generelt beskrevne måde. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel XV.
27 15 Syntesen af en hpGRF-analog, dvs. [Nle ]-rhGRF(1-32-NH2, med formlen H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-
Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-
Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 20 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks som beskrevet i eksempel I. Denne analog bedømmes som værende i det væsentlige ren ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel XVI.
25 Syntesen af et fragment af en hpGRF-analog, dvs. [D-Tyr1^]- rhGRF(1-29)-NH2 , med formlen
DK 161096 B
24 H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-
Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-
Asn-Arg-NE^ udføres på trinvis måde ved anvendelse af en Beckman 990 5 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks som anført i eksem pel I. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Syntesen gentages under indføring af D-Tyr i stedet for His ved N-afslutningen til fremstilling af [D-Tyr^'^]-10 rhGRF(l-29)-NH2.
Eksempel XVII.
Syntesen af et hpGRF-analog-fragment, dvs. rhGRF(1-29)-NH2, med formlen: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-15 Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-
Asn-Arg-NH 2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks som anført i eksempel III. Peptidet bedømmes som værende i det væsent-20 lige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel XVIII.
Syntesen af [Nle27]-rhGRF(1-29)-NH2 med formlen: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-25 Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 25
DK 161096 B
990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks som anført i eksempel I. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC. Den optiske drejning måles 22 o på et fotoelektrisk polarimeter som [a]^ = -52,6° + 1 (C= 5 1, 1% eddikesyre, ukorrigeret).
Eksempel XIX.
Syntesen af en hpGRF-analog, dvs. [D-His^, D-Tyr^, D-Ala^]-rhGRF(l-29)-NH2, med formlen: H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-10 D-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg- nh2 udføres på trinvis måde ved anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks som nævnt i eksempel I. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved an-15 vendelse af TLC og HPLC.
Eksempel XX.
Syntesen af en hpGRF-analog, dvs. iThr^]-rhGRF(1-29)-NH2, med formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-20 Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg- nh2 udføres på trinvis måde ved anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator med en MBHA-harpiks som anført i eksempel X. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved 25 anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel XXI.
Syntesen af rhGRF-[Val44-NH2] med formlen:
DK 161096 B
26 H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-
Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-
Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Val- NH2 5 udføres på trinvis måde ved anvendelse af en Beckman 990 pep-tidsyntetisator med en MBHA-harpiks som nævnt i eksempel I. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Foruden de ovenfor specifikt opregnede analoge syntetiseres 10 de ovennævnte analoge også ved anvendelse af den samme fast-fase-synteseteknik som er anført i det foregående: [Ile27]-hpGRF(1-29)-NH2, [Ile27]-hpGRF(1-29)-0H, [D-Hi s1]-hpGRF(1-32)-NH2, 15 [D-Ala27]-hpGRF(1-32)-NH2, [D-Ala2 7]-phGRF(1-32)-NH2, [D-Tyr1, Nle27]-hpGRF(l-32)-NH2, [D-Tyr1, Nle27]-hpGRF(1-32)-OH, [D-Phe1, Val27]-hpGRF(1-40)-OH, 20 [His1, Phe10]-hpGRF(l-32)-NH2, [D-Tyr1, Nle27]-hpGRF(1-40)-OH, [D-Tyr1, Nle27]-hpGRF(1-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-OH, i i n ?7 [Phe1, Phe , Ile ]-hpGRF(1-32)-NH2, [D-His1, D-Ala15, Nle27]-hpGRF(1-32)-NH9, 25 [D-Phe , Phe , D-Met]-hpGRF(1-40)-OH, [Ile27]-hpGRF(1-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, [Ile27]-hpGRF(1-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-OH, [D-His1, D-Ala15, D-Ala28]-hpGRF(1-32)-NH2, [Phe1, Leu27, D-Ala28]-hpGRF(1-40)-OH, 1 9 7 9 ft 30 [His , D-Val , D-Ala ]-hpGRF(1-32)-NH„, 11027 Å [D-Tyr , Phe , D-Ile ]-hpGRF(l-39)-NH2, [Val27]-hpGRF(1-40)-OH, [Val27]-hpGRF(1-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-OH, og [D-Phe1, D-Ala15, D-Nle27, D-Ala28]-hpGRF(l-32)-NH2· 27
DK 161096B
De som beskrevet i forskellige af eksemplerne fremstillede syntetiske peptider sammenlignes med enten renset syntetisk hpGRF(1-40)-0H eller renset syntetisk hpGRF(1-40)-Phe-Gln-NH2 ved in vitro prøver til bestemmelse af deres effektivitet 5 til at fremme frigørelsen af væksthormon. Alle disse synte tiske analoge har betydelig virkningsevne til at bevirke frigørelse af GH.
In vitro prøverne udføres under anvendelse af den syntetiske hpGRF som en standard til sammenligning side om side med æk-10 vimolære koncentrationer af de forskellige syntetiserede ana loge. Der anvendes kulturer indbefattende celler af rotte-hypofysekirtler, som er fjernet 4-5 dage forinden. Kulturer, der anses for optimale til sekretion af væksthormon, anvendes til den sammenlignende afprøvning på den generelle måde, der 15 er beskrevet af Vale et al. i Endocrinology, 91, 562 - 572 (1972). Inkubation med det materiale, der skal afprøves, udføres i 3 - 4 timer, og aliquot mængder af dyrkningsmediet fjernes og behandles til måling af deres indhold af immuno-reaktivt GH (ir GH) ved hjælp af en velkarakteriseret radio-20 immunprøve.
Resultaterne af denne sammenlignende afprøvning under anvendelse af ækvimolære koncentrationer er vist i den efterfølgende tabel I: TABEL I♦ 25 In vitro *
Peptid Relativ virkningsstyrke [Nle27]-hpGRF(l-32-NH2 3,21 (2,02 - 5,43) [His1]-hpGRF(l-32)-NH2 2,15 (1,12 - 4,41) [Ile27]-hpGRF(1-32)-OH 0,20 (0,11 - 0,35) 30 [D-Tyr1]-hpGRF(1-32)-NH2 0,74 (0,47 - 1,14) [D-Met27]-hpGRF(1-32)-NH2 0,22 (0,13 - 0,36) [Phe1]-hpGRF(1-32)-NH2 0,13 (0,05 - 0,29) [Phe10]-hpGRF(l-32)-NH2 0,69 (0,26 - 2,63) 28
DK 161096B
Tabel I (fortsat).
In vitro *
Peptid Relativ virkningsstyrke [Val27]-hpGRF(1-32)-OH 0,31 (0,21 - 0,45) 5 [His1, Nle27]-hpGRF(1-32)-NH2 3,22 (2,12 - 5,33) i forhold til hpGRF(1-40)-Phe-Gln-NH2.
In vitro afprøvning af disse syntetiske peptider viser, at ECsø-værdien varierer fra 20 til 100 picomolær, og at den laveste effektive koncentration er 3 - 8 picomolær. Den mak-10 simale effektive koncentration var for hpGRF(1-40)NH2 1 nano-molær.
Resultaterne af denne sammenlignende afprøvning er for ækvi-molære koncentrationer af forskellige af hpGRF-analogene på basis af rhGRF vist i tabel II.
15 TABEL II.
Peptid Sammenligning %
hpGRF(1-40)-OH
(standard for dette forsøg) 100% rhGRF(1-43)-OH 300% 20 rhGRF(l-29)-NH9 1.100% in ^ [D-Tyr ]-rhGRF(1-29)-NH9 34% lin ^ [D-Tyr ']-rhGRF(1-29)-NH2 600% [Tyr1]-rhGRF(l-29)-NH2 920% [Nle27]-rhGRF(1-32)-NH2 1.390% 25 [Leu1, Nle27]-rhGRF(1-29)-NH2 480% [D-His1, D-Tyr10, D-Ala15]-rhGRF(1-29)-NH2 29% rhGRF-[Val44-NH2] 670%
In vitro afprøvning af disse syntetiske peptider viser, at ECsQ-værdien varierer fra 20 til 100 picomolær, og at den 29
DK 161096 B
laveste effektive koncentration er 3 - 8 picomolær. Den maksimale effektive koncentration er for rhGRF(1-43)-OH 1 nano-molær.
Foruden in vitro forsøgene til udsondring af væksthormon 5 foretages også in vivo forsøg ved indsprøjtning af det syn tetiske peptid i frit omløbende normale hanrotter via et indført kateder. Dyr forbehandles med FLA-63, som er en dopaminhydroxylaseinhibitor, som undertrykker spontan GH-sekretion uden at påvirke reaktionen på exogent GRF. Blod-10 prøver udtages gennem det samme kateder umiddelbart forud for og 5 og 20 minutter efter indsprøjtninger. GH-mængder i blod måles ved hjælp af radioimmunprøve. Resultaterne viser, at syntetiske hpGRF-analoge er kraftige stimulatorer af sekretionen af hypofyse-GH. Doser mellem ca. 20 15 nanogram og ca. 25 mikrogram pr. kg legemsvægt viser sig at være effektive.
Yderligere afprøvning viser, at de andre syntetiske hpGRF-analoge, der er syntetiseret ifølge de andre eksempler, udviser betydelige virkningsstyrker, og ud fra denne af-20 prøvning kan nogle generelle konklusioner drages: 1. C-terminalamidering synes ikke at forøge virkningen af GRF-peptider med en kædelængde på mere end 39 rester, men den forøger virkningsstyrken af peptider, der kortere end 39 rester i længde. F.eks. er [Ile27]-hpGRF(2-32)-NH9 27 Δ 25 mere virksom end [Ile ]-hpGRF(1-32)-OH, 1 27 [D-Tyr , Nle ]-hpGRF(1-32)-NH2 er mere virksom end [D-Tyr1, Nle27]-hpGRF(l-32)-OH, og [Ile27]-hpGRF(1-29)-NH9 27 Δ er mere virksom end (Ile ]-hpGRF(1-29)-OH. Imidlertid 27 har (Ile ]-hpGRF(1-44)-NH2 samme virkningsstyrke som 30 [Ile27]-hpGRF(1-44)-OH.
2. I rækken af amiderede peptider er analoge med 32 rester 30
DK 161096 B
i alt væsentligt lige så virksomme som de tilsvarende længere 27 analoge. F.eks. har [Nle ]-hpGRF(1-32)-NH9 ca. den samme 27 ^ virkningsstyrke som [Nle ]-hpGKF(1-44)-NE^ · 3. I rækken af peptider med frie carboxyafslutninger har 5 tilsvarende analoge med mere end 39 rester samme virkningsstyrke. F.eks. har [Val27]-hpGRF (1-40) -OH og [Val27]-hpGRF(1-44)-OH samme virkningsstyrke, ligesom dette er tilfældet for [D-Tyr\ Nle27]-hpGRF(1-40)-OH og [D-Tyr^,
Nle 2 7]-hpGRF(1-44)-OH.
10 Syntetiske hpGRF-analoge skulle kunne bruges til anvendelser, ved hvilke en læge ønsker at forøge GH-produktionen. Stimulation af GH-sekretion ved hjælp af hpGRF-analoge har interesse for patienter med fuldstændig eller relativ GH-mangel forårsaget af underproduktion af endogent GRF.
15 Det er endvidere sandsynligt, at forøget GH-sekretion og dennes ledsagende vækstforøgelse kunne opnås for mennesker eller dyr med normale GH-mængder. Endvidere skulle hpGRF-administration kunne ændre legemets fedtindhold og modificere andre GH-afhængige metaboliske, immunologiske og 20 udviklingsmæssige processer. F.eks. kan hpGRF-analoge være anvendelige som et middel til at stimulere anaboliske processer i mennesker under omstændigheder, såsom sådanne, der følger efter udsættelse for forbrændinger. I et andet eksempel kan hpGRF-analoge administreres til kommercielt 25 vigtige dyr, såsom høns, kalkuner, svin, geder, kvæg og får, til fremskyndelse af vækst og forøgelse af forholdet mellem opnået protein og fedt. De kan anvendes inden for hydroponik til opdræt af fisk og andre koldblodede marine dyr, f.eks. havskildpadder og ål samt amfibier. Til ad-30 ministration til mennesker bør syntetiske hpGRF-analoge have en renhed på mindst ca. 93% og fortrinsvis mindst 98%. Denne renhed betyder, at det tilsigtede peptid udgør den anførte vægt% af alle lignende tilstedeværende peptider
DK 161096B
31 og peptidfragmenter.
Til administration af syntetiske hpGRF-analoge til kommercielt vigtige dyr og andre dyr med henblik på fremme af vækst og formindske fedtindhold kan en renhed så lav 5 som ca. 5% eller endog så lav som ca. 0,001% være ac ceptabel. Hvis de fremstilles ved hjælp af gensplejsningsmetoder, kan analogene til at begynde med have meget lave renheder.
Syntetiske hpGRF-analoge eller de ikke-toksiske salte der--*·0 af kan i kombination med en farmaceutisk eller veterinært acceptabel bærer til dannelse af et farmaceutisk middel administreres til dyr inklusive mennesker enten intravenøst, subkutant, intramuskulært, intranasalt eller oralt. Administrationen kan af en læge anvendes til at stimulere 15 frigørelsen af GH, når den behandlede vært kræver en sådan terapeutisk behandling. Den krævede dosis vil variere med den pågældende tilstand, der behandles, med tilstandens alvorlighed og med varigheden af den ønskede behandling.
Midlet ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, at det om-20 fatter peptidet ifølge ethvert af kravene 1-10 eller et ikke-toksisk salt deraf samt en veterinært eller farmaceutisk acceptabel eller fast bærer derfor.
Sådanne peptider administreres ofte i form af farmaceutisk eller veterinært acceptable ikke-toksiske salte, såsom 25 syreadditionssalte eller metalkomplekser, f.eks. med zink, jern eller lignende (der betragtes som salte til denne ansøgnings formål). Eksempler på sådanne syreadditionssalte er hydrochlorid, hydrobromid, sulfat, phosphat, maleat, acetat, citrat, benzoat, succinat, malat, ascorbat, tar-
Claims (15)
10 Peptiderne bør administreres til mennesker under en læges vejledning, og farmaceutiske midler vil sædvanligvis indeholde peptidet i forbindelse med en konventionel farmaceutisk acceptabel bærer. Sædvanligvis vil den parenterale dosis være fra ca. 20 nanogram til ca. 25 mikrogram af pep-15 tidet pr. kg af værtens legemsvægt. Patentkrav. 1. hpGRF-analoge peptider med formlen H-R^-Ala-Asp- Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-R^ Q-Arg-R^ 2-κι3-Leu-R^“Gln-
20 Leu-R^ 8-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24~R2 5-11e-R2 7_R2 8-Arg_ G1n-Gln-Gly-Glu-Rg4-Asn-Gln-Glu-R3 g-Rgg-R4 Q-Arg-R42~ R43-R44-Y, N-terminale fragmenter heraf, hvor den kortest mulige sekvens består af aminosyrerne 1-27, samt farmaceutisk acceptable salte salte heraf, 25 kendetegnet ved, at R1 er Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His eller His, R0 er Ser eller Asn, O R10 er Tyr, Phe eller D-Tyr, DK 161096B R.^2 er Arg eller Lys, er He eller Val, R^,- er Gly eller D-ala, R^g er Tyr eller Ser,
5 R24 er His eller Gin, R25 er Glu eller Asp, R27 er valgt blandt D- og L-isomere af Ala, Nle, Ile, Leu, Met og Val, R2g er Ser, Asn eller D-Ala,
10 Rg4 er Arg eller Ser, Rgg er Gin eller Arg, Rgg er Arg eller Gly, R^q er Ser eller Ala, R^2 er Phe eller Ala,
15 R^ er Asn eller Arg, R44 er en naturlig aminosyre eller des-R^^, og Y betegner carboxylmolekyIdelen af aminosyreresten ved C-afslutningen og er gruppen -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') eller -C^OR, DK 161096 8 hvor R og R* er lavere alkyl, fluor-lavere alkyl eller hydrogen, forudsat imidlertid, at når er Tyr, da er en eller flere af de følgende aminosyrer til stede: R27 er andet end Met, Rg er Ser, R^2 er Arg, R^3 er 5 Ile, R-^g er Tyr, R24 er His, R2g er Glu, R2g er Asn, R34 er Arg, R3g er Gin, Rg9 er Arg, R4Q er Ser, R42 er Phe og R43 er Asn.
2. Syntetisk peptid med formlen ifølge krav 1, k endete g n e t ved, at R^ er His.
3. Syntetisk peptid med formlen ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at Y er CONH2·
4. Syntetisk peptid med formlen ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at R^ er Nle.
5. Syntetisk peptid med formlen ifølge ethvert af kravene 15 1-4, kendetegnet ved, at R^g er Tyr, R^g er Gly og R2g er Ser.
6. Syntetisk peptid med formlen ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at R^Q er Tyr, R-^ er D-Ala og R2g er D-Ala.
7. Syntetisk peptid med formlen ifølge krav 1, kende tegnet ved, at R^ er D-Tyr , og at R27 er Nle, Val eller Ile.
8. Syntetisk peptid med formlen ifølge krav 1 eller 7, kendetegnet ved, at er D-Ala, og at R2g 25 er D-Ala.
9. Syntetisk peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har sekvensen His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys- DK 161096 B Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn- Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn.
10. Syntetisk peptid ifølge ethvert af kravene 1-9, kendetegnet ved, at resterne 33 til 44 er 5 fjernet.
11. Middel til stimulation af frigørelsen af GH i et dyr, kendetegnet ved, at det omfatter peptidet ifølge ethvert af kravene 1-10 eller et ikke-toksisk salt deraf samt en veterinært eller farmaceutisk accep- 10 tabel flydende eller fast bærer derfor.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45786283 | 1983-01-13 | ||
| US06/457,862 US4529595A (en) | 1983-01-13 | 1983-01-13 | GRF Analogs |
| US48874883 | 1983-04-26 | ||
| US06/488,748 US4595676A (en) | 1983-04-26 | 1983-04-26 | Rat hypothalamic GRF |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK12984D0 DK12984D0 (da) | 1984-01-12 |
| DK12984A DK12984A (da) | 1984-07-14 |
| DK161096B true DK161096B (da) | 1991-05-27 |
| DK161096C DK161096C (da) | 1991-11-04 |
Family
ID=27038761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK012984A DK161096C (da) | 1983-01-13 | 1984-01-12 | Hpgrf-analoge peptider, ikke toksiske salte heraf og midlet indeholdende disse |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0117034B1 (da) |
| JP (1) | JPH0689033B2 (da) |
| KR (1) | KR900006713B1 (da) |
| AR (1) | AR241452A1 (da) |
| AU (1) | AU557046B2 (da) |
| BG (1) | BG40815A3 (da) |
| DD (1) | DD218371A5 (da) |
| DE (1) | DE3473764D1 (da) |
| DK (1) | DK161096C (da) |
| EG (1) | EG16824A (da) |
| ES (1) | ES528821A0 (da) |
| FI (1) | FI87080C (da) |
| GR (1) | GR81733B (da) |
| IE (1) | IE56568B1 (da) |
| IL (1) | IL70530A (da) |
| IN (1) | IN160129B (da) |
| MX (1) | MX161186A (da) |
| NO (1) | NO168362C (da) |
| OA (1) | OA07631A (da) |
| PL (1) | PL143842B1 (da) |
| PT (1) | PT77934B (da) |
| RO (1) | RO88702A (da) |
| SG (1) | SG67591G (da) |
| YU (1) | YU45587B (da) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4518586A (en) * | 1983-01-13 | 1985-05-21 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs III |
| DE3482387D1 (en) * | 1983-03-07 | 1990-07-05 | Hoffmann La Roche | Polypeptide. |
| US4732972A (en) * | 1983-03-07 | 1988-03-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polypeptides having growth hormone releasing activity |
| AU575843B2 (en) * | 1983-08-10 | 1988-08-11 | The Administrators Of The Tulane Eductional Fund | Growth hormone releasing peptides |
| PT79094B (en) * | 1983-08-29 | 1986-08-14 | Salk Inst For Biological Studi | Grf analogs |
| US4617149A (en) * | 1983-09-21 | 1986-10-14 | Eli Lilly And Company | Growth hormone release factor analogs |
| US4528190A (en) * | 1983-10-25 | 1985-07-09 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs IV |
| FR2567524B1 (fr) * | 1984-07-10 | 1987-11-27 | Sanofi Sa | Procede de synthese de la somatocrinine en phase liquide et peptides intermediaires |
| US4622312A (en) * | 1984-09-24 | 1986-11-11 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| US4649131A (en) * | 1984-09-24 | 1987-03-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| JPS61115098A (ja) * | 1984-11-09 | 1986-06-02 | Sumitomo Seiyaku Kk | ポリペプチド |
| CA1271600A (en) * | 1985-01-07 | 1990-07-10 | David Howard Coy | Growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith |
| US4734399A (en) * | 1985-08-06 | 1988-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| US4689318A (en) * | 1985-08-29 | 1987-08-25 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs |
| FR2599038B1 (fr) * | 1986-05-26 | 1990-06-29 | Sanofi Sa | Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires |
| US4914189A (en) * | 1987-02-05 | 1990-04-03 | The Adminstrators Of The Tulane Educational Fund | Synthetic GHRH analogs |
| EP0544706A4 (en) * | 1990-06-29 | 1993-10-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Histidine substituted growth hormone releasing factor analogs |
| ATE119916T1 (de) * | 1990-12-10 | 1995-04-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zur enzymatischen herstellung von grf(1-44)nh2. |
| CA2084061A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-10-10 | Arthur M. Felix | Growth hormone releasing factor analogs |
| JPH0578344U (ja) * | 1992-04-03 | 1993-10-26 | 合同製鐵株式会社 | 多ストランド連続鋳造装置 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3482387D1 (en) * | 1983-03-07 | 1990-07-05 | Hoffmann La Roche | Polypeptide. |
| AU575843B2 (en) * | 1983-08-10 | 1988-08-11 | The Administrators Of The Tulane Eductional Fund | Growth hormone releasing peptides |
| PT79094B (en) * | 1983-08-29 | 1986-08-14 | Salk Inst For Biological Studi | Grf analogs |
| US4617149A (en) * | 1983-09-21 | 1986-10-14 | Eli Lilly And Company | Growth hormone release factor analogs |
-
1983
- 1983-12-23 IL IL70530A patent/IL70530A/xx not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-01-04 AU AU23075/84A patent/AU557046B2/en not_active Expired
- 1984-01-04 AR AR84295336A patent/AR241452A1/es active
- 1984-01-09 PT PT77934A patent/PT77934B/pt unknown
- 1984-01-10 DE DE8484300150T patent/DE3473764D1/de not_active Expired
- 1984-01-10 EP EP84300150A patent/EP0117034B1/en not_active Expired
- 1984-01-11 GR GR73488A patent/GR81733B/el unknown
- 1984-01-11 NO NO840086A patent/NO168362C/no not_active IP Right Cessation
- 1984-01-12 MX MX200024A patent/MX161186A/es unknown
- 1984-01-12 IE IE62/84A patent/IE56568B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-01-12 DK DK012984A patent/DK161096C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-01-12 KR KR1019840000097A patent/KR900006713B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1984-01-12 JP JP59004235A patent/JPH0689033B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-12 PL PL1984245687A patent/PL143842B1/pl unknown
- 1984-01-12 ES ES528821A patent/ES528821A0/es active Granted
- 1984-01-12 DD DD84259373A patent/DD218371A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-01-12 FI FI840111A patent/FI87080C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-01-12 IN IN17/MAS/84A patent/IN160129B/en unknown
- 1984-01-13 BG BG8463874A patent/BG40815A3/xx unknown
- 1984-01-13 RO RO84113317A patent/RO88702A/ro unknown
- 1984-01-13 YU YU5284A patent/YU45587B/sh unknown
- 1984-01-14 EG EG27/84A patent/EG16824A/xx active
- 1984-02-12 OA OA58203A patent/OA07631A/xx unknown
-
1991
- 1991-08-19 SG SG675/91A patent/SG67591G/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI88402C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger | |
| CA1243016A (en) | Human grf peptide analogs | |
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| CA1271898A (en) | Grf analogs | |
| DK161096B (da) | Hpgrf-analoge peptider, ikke toksiske salte heraf og midlet indeholdende disse | |
| US5262519A (en) | GRF analogs XI | |
| FI91074B (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi | |
| US4595676A (en) | Rat hypothalamic GRF | |
| US5002931A (en) | GRF analogs VII | |
| EP0423322B1 (en) | Grf analogs viia | |
| US4703035A (en) | Human pancreatic GRF amidated fragments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |