FI91074B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI91074B FI91074B FI893532A FI893532A FI91074B FI 91074 B FI91074 B FI 91074B FI 893532 A FI893532 A FI 893532A FI 893532 A FI893532 A FI 893532A FI 91074 B FI91074 B FI 91074B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ala
- leu
- arg
- cys
- asp
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- XKCWNEVAXQCMGP-RXMQYKEDSA-N (2R)-2-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoic acid Chemical compound CN(CCC[C@@H](N)C(O)=O)C(N)=N XKCWNEVAXQCMGP-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 6
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 64
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 48
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 48
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N D-Cysteine Chemical group SC[C@@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 16
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 16
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 11
- 230000004224 protection Effects 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 125000000028 D-cysteine group Chemical group [H]N([H])[C@@]([H])(C(=O)[*])C(S[H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 3
- 125000000031 ethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])N([H])[*] 0.000 claims description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims 2
- 125000002419 D-glutamo group Chemical group C(=O)(O)[C@@H](CCC(=O)O)N* 0.000 claims 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 claims 1
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 45
- -1 Met Chemical compound 0.000 abstract description 41
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Chemical group OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 abstract description 13
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 abstract description 12
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 abstract description 10
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 abstract description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 abstract description 10
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 abstract description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 abstract description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Chemical group CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 abstract description 5
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 abstract description 5
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical group NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- SGCGMORCWLEJNZ-UWVGGRQHSA-N His-His Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C([O-])=O)C1=CN=CN1 SGCGMORCWLEJNZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 abstract description 4
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 abstract description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 abstract description 2
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 abstract 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 23
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 21
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 20
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 20
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 20
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 12
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 101000825738 Rattus norvegicus Somatoliberin Proteins 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanoic acid Chemical compound CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AHLPHDHHMVZTML-SCSAIBSYSA-N D-Ornithine Chemical compound NCCC[C@@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000252073 Anguilliformes Species 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N D-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- IGRMTQMIDNDFAA-UWVGGRQHSA-N Lys-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IGRMTQMIDNDFAA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AXDLCFOOGCNDST-UHFFFAOYSA-N N-Methyltyrosine Chemical compound CNC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AXDLCFOOGCNDST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 2
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 2
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JQDFGZKKXBEANU-IMJSIDKUSA-N Ala-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JQDFGZKKXBEANU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AAIUGNSRQDGCDC-ZLUOBGJFSA-N Asp-Cys-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)O AAIUGNSRQDGCDC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N Asp-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 101100015199 Caenorhabditis elegans gly-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270617 Cheloniidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 125000002237 D-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)[C@]([H])(N([H])[H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002849 D-tyrosine group Chemical group [H]N([H])[C@@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical group SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N His-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- UWBDLNOCIDGPQE-GUBZILKMSA-N Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN UWBDLNOCIDGPQE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HQMLIDZJXVVKCW-REOHCLBHSA-N L-alaninamide Chemical compound C[C@H](N)C(N)=O HQMLIDZJXVVKCW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N L-leucinamide Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(N)=O FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- UGPVGRMTKQLUNS-YFKPBYRVSA-N Phospho lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)OP(O)(O)=O UGPVGRMTKQLUNS-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical group [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 159000000021 acetate salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940050390 benzoate Drugs 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003709 fluoroalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000000717 hydrazino group Chemical group [H]N([*])N([H])[H] 0.000 description 1
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010037248 lantibiotic Pep5 Proteins 0.000 description 1
- SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N lantibiotic pep5 Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N\C(=C(/C)S)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=O)CC SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- UBLQIESZTDNNAO-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;phosphoric acid Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC UBLQIESZTDNNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000003186 pharmaceutical solution Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O phosphonium Chemical compound [PH4+] XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Control Of El Displays (AREA)
Description
91074
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi Tämä keksintö liittyy ihmisten ja muiden eläinten 5 aivolisäkkeen toimintaan vaikuttaviin peptideihin. Tämä keksintö liittyy erityisesti peptideihin, jotka lisäävät aivolisäkkeen kasvuhormonin vapautumista.
Fysiologien tiedossa on ollut jo pitkään, että hypotalamus (väliaivojen pohjaosa) ohjaa aivolisäkkeen etu-10 lohkon eritystoimintoja erittämällä tiettyjä aineita, jotka kiihdyttävät tai ehkäisevät kunkin aivolisäkehormonin eritystä. Hypotalamuksen tuottama ehkäisevä tekijä kuvattiin vuonna 1972 kasvuhormonin (GH) eritystä ehkäisevänä somatostatiinina. Ihmisen haimasta peräisin olevat vapaut-15 tamistekijät, joiden havaittiin lisäävään aivolisäkkeen GF:n vapautumista, eristettiin ihmisen haimakasvainuut-teista, puhdistettiin, luonnehdittiin, syntetisoitiin ja testattiin vuonna 1982. Kummatkin näistä aivolisäkkeen eritystoimintaan vaikuttavista tekijöistä on pystytty val-20 toistamaan totaalisynteesillä ja rakenteeltaan luonnossa esiintyviä aineita vastaavat aineet on valmistettu synteettisesti. Ihmisen aivolisäkkeen GH:a vapauttavalla tekijällä on täsmälleen tämä sama rakenne, minkä vuoksi jäljempänä käytetään termiä hGRF.
25 Tässä työssä on valmistettu sellaisia synteettisiä polypeptidejä, jotka vapauttavat GH:a viljellyistä aivoli-säkesoluista, joilla on lisääntynyt vastustuskyky kehossa tapahtuvalle entsymaattiselle hajoamiselle, ja jotka osoittavat tehon hyvin huomattavaa kohoamista. Uskotaan, että 30 nämä edulliset ominaisuudet johtuvat siitä, että peptidit ovat rengasrakenteisia, mistä aiheutuu parempi pysyvyys. Näillä peptideillä on rengasrakenteen muodostava sidos mieluummin paikoissa 25 ja 29. Tämä sidos on mieluummin joko D-Cys tai L-Cys -ryhmistä muodostuva kahden kysteii-35 niryhmän välinen disulfidisidos. Rengasrakenteen muodostava sidos voi olla vaihtoehtoisesti näiden kahden ryhmän 2 välinen amidisidos aminosivuketjun ja karboksyylisivuket-jun kesken. Paikan 15 substituentti on mieluummin Ala tai β-Ala, Nle on mieluummin paikassa 27. Paikan 8 substitu-entteina voivat myös olla Lys, Arg, Ser, Glu tai Asp. Pep-5 tideissä voi olla paikassa 1 yksi seuraavista ryhmistä: Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ja D-His, ja tämä ryhmä voi vaihtoehtoisesti sisältää metyy-lisubstituentin joko alfa-hiilessä tai alfa-aminoryhmässä. Alfa-aminoryhmä voidaan myös poistaa (des-amino); tai al-10 fa-aminoryhmä voidaan myös asyloida, mieluummin asetyylil-lä (Ac) tai formyylillä (For). Peptideillä voi vaihtoehtoisesti olla D-Ala, NMA tai D-NMA paikassa 2 ja/tai D-Asp paikassa 3 ja/tai Arg paikassa 12 ja/tai Phe tai D-Tyr paikassa 10. Niillä voi myös olla D-Met tai Nva tai muita 15 ryhmiä Met:n tai Nle:n sijasta paikassa 27 ja/tai Asn voi olla paikassa 28. Ryhmät paikoissa 13 ja 22 voivat olla mitkä tahansa seuraavista: Leu, Ile, Ala ja Vai.
Keksinnön mukaisiin farmaseuttisiin valmisteisiin kuuluvat sellaiset analogit, jotka ovat suunnilleen 29-44 20 ryhmän pituisia, tai minkä tahansa näiden myrkyttömät suolat tehtynä dispersioksi farmaseuttisesti tai eläinlääkin-nällisesti hyväksyttävään nesteeseen tai kiinteään kantaja-aineeseen. Tällaisia farmaseuttisia valmisteita voidaan käyttää sekä ihmisten että eläinten kliinisessä lääketie-25 teessä annettavaksi terapeuttisiin tarkoituksiin, ja myös diagnostisesta. Lisäksi niitä voidaan käyttää lisäämään tasalämpöisten eläinten kasvua siipikarja mukaanlukien, ja kasvatettaessa vaihtolämpöisiä eläinlajeja vedessä, esim. kaloja, ankeriaita jne.
30 Peptidien kuvaamiseen käytetty nimistö on teoksessa
Schroder & Lubke, "The Peptides", Academic Press (1965) esitetyn mukainen, missä normaalin esitystavan mukaan N-pään aminoryhmä on vasemmalla ja C-pään karboksyyliryhmä oikealla. Luonnollisella aminohapolla tarkoitetaan ylei-35 siä, luonnossa esiintyviä valkuaisaineiden aminohappoja,
II
91074 3 jotka käsittävät aminohapot Gly, Ala, Vai, Leu, Ile,
Ser, Thr, Ly s, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe,
Tyr, Pro, Trp ja His. Nle tarkoittaa norleusiinia ja Nva norvaliinia. Jos aminohapporyhmällä on isomeerejä, kysees-5 sä on aminohapon L-muoto, ellei toisin osoiteta. Pienellä kirjaimella alkavaa versiota käytetään tarkoittamaan sitä, että kyseessä voi olla joko D- tai L- isomeeri, esim. cys tarkoittaa D-Cys tai L-Cys; orn tarkoittaa D- tai L-orni-tiinia; dab tarkoittaa D- tai L- alfa, gamma-diaminobutyy-10 rihappoa; dap tarkoittaa D- tai L- alfa, -diaminopropioni- happoa; ja abu tarkoittaa alfa-aminovoihappoa. D-NMA tarkoittaa alaniinin D-isomeeria, missä alfa-aminoryhmä on substituoitu metyyliryhmällä; samoin NMT tarkoittaa N-me-tyylityrosiinia, jota myös merkitään kirjainyhdistelmällä 15 NaMeTyr.
Tässä keksinnössä on valmistettu yleisessä muodossa ilmoitettuna jakson (I) mukaiset synteettiset peptidit: (B)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-H13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-R21-R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-R29-20 Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43- R44, missä Ri on Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His tai D-His; B on H, C*Me, N*Me, desamino, Ac tai For; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; R3 on Asp tai D-Asp; Re on Ser, Asn, Lys, Arg, Asp tai Gin; R10 on Tyr, 25 D-Tyr tai Phe; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile, Vai, Leu tai Ala; R15 on Gly, Ala tai S-Ala; R18 on Ser tai Tyr; R2i on Lys, D—Lys, Arg tai D—Arg ' **22 on Leu, Ile, Ala tai Vai; R24 on Gin tai His; R25 on cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab tai dap; R27 on Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, 30 Nva tai Vai; R28 on Asn tai Ser; R29 on cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab tai dap; R34 on Ser tai Arg; R38 on Arg tai Gin; R39 on Gly tai Arg; R40 on Ala tai Ser; R42 on Phe tai Ala; R43 on Asn tai Arg; R44 on luonnollinen aminohappo, kuten Leu tai Vai; edellyttäen kuitenkin, että mikä 35 tahansa C-pään jakso, joka alkaa ryhmästä R44 ja jatkuu 4 ryhmään R2g asti, voidaan poistaa. Kun R2g on cys tai abu niin R2g on cys tai abu; kun on asp tai glu niin silloin R2g on orn, lys, dab tai dap ja päin vastoin. C-pääs-sä olevan aminohapporyhmän karboksyyliosa voi olla mikä 5 tahansa seuraavista ryhmistä: -COOR, -CRO, -CONHNHR,- CON(R)(R') tai -CH2OR, jossa R ja R' on alempi alkyyli, fluoro-alempi alkyyli tai vety; metyyli, etyyli ja propyyli ovat etusijalla olevia alempia alkyyliryhmiä.
N-päästä ryhmään 29 asti ulottuvat fragmentit ovat 10 biologiselta teholtaan hyviä aiheuttamaan aivolisäkkeen GH:n vapautumisen, ja sellaiset biologisesti aktiiviset 29 tai 32 ryhmän pituiset fragmentit, joilla C-päänä on amidi tai substituoitu amidi, ovat eniten etusijalla. Eräs ryhmä erityisen etusijalla olevia peptidejä ovat kaavan 15 (B )R1-R2-R2-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-R13-Leu-
Rl5-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-R21-R22-Leu-His-R25-Ile-R27-Asn-R29-NH2 mukaisia, missä R^ on Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His tai D-His; B on H, CaMe, NaMe, desamino, Ac tai For; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; R^ 20 on Asp tai D-Asp; R^ on Ile, Vai, Leu tai Ala; R^g on Gly, Ala tai β-Ala; R21 on Lys, D-Lys, Arg tai D-Arg; R22 on Leu, Ile, Ala tai Vai; R2g on cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab tai dap; R2^ on Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva tai Vai; R2g on cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab tai dap. 25 Kun peptidin aminohapporyhmiä on 40 tai enemmän, mikään C-pään ryhmistä ei ole selvästi muita enemmän etusijalla.
Peptidit syntetisoidaan tarkoitukseen sopivalla menetelmällä, kuten yksinomaan kiinteän faasin menetelmillä, osittaisella kiinteän faasin menetelmillä, fragmentti-30 kondensaatiolla tai klassisella liuoskytkennällä. Viimeaikoina kehitettyä yhdistelmä-DNA tekniikkaa voidaan käyttää valmistettaessa ainoastaan luonnollisia aminohappoja sisältävä analogin osa, joka voitaisiin sitten liittää lyhyeen N- tai C- pään peptidiin. Esimerkiksi yksinomaan 35 kiinteän faasin menetelmät on esitetty oppikirjassa "Solid-
II
91074 5
Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co.,
San Francisco, 1969, ja esimerkkejä niistä löytyy Vale': lie ja muille myönnetyssä US-patentissa 4105603, 8. elokuuta 1978. Klassinen liuossynteesi kuvataan yksityiskoh-5 taisesti oppikirjassa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch (toimittaja) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Länsi-Saksa. Synteesin fragmenttikondensaatiomenetelmästä on esimerkkejä US-patentissa 3972859 (3. elokuuta 1976). Muista käy-10 tettävissä olevista synteeseistä Ovat esimerkkeinä US-pa-tentit 3842067 (15. lokakuuta 1974) ja 3862925 (28. tammikuuta 1975).
Yhteistä tällaisille kemiallisille synteeseille on erilaisten aminohapporyhmien pysymättömien sivuketjuryhmi-15 en suojaaminen sopivilla suojaavilla ryhmillä, jotka estävät kemiallisen reaktion tapahtumisen kyseisessä kohdassa siihen saakka kunnes ryhmä lopullisesti poistetaan. Yhteistä on usein myös aminohapossa tai fragmentissa olevan alfa-aminoryhmän suojaaminen silloin, kun tässä kokonai-20 suudessa reagoivana ryhmänä on karboksyyliryhmä, ja sitä seuraava valikoiva alfa-aminosuojaryhmän poisto kyseisessä paikassa tapahtuvan myöhemmän reaktion mahdollistamiseksi. Tämän mukaisesti on tavallista, että yhtenä synteesin vaiheena tuotetaan välivaiheen yhdiste, joka sisältää kaikki 25 peptidiketjussa halutussa järjestyksessä sijaitsevat ami- nohapporyhmät tarkoituksenmukaisiin ryhmiin liitettyine sivuketjuja suojaavine ryhmineen.
Kun tämän perusteella käytetään tällaisia kemiallisia synteesejä tämän keksinnön peptidien valmistamiseen, 30 syntyy kaavan (II): (X1)(B)R1(X tai X2)-R2-R3(X3)-Ala-Ile-
Phe-Thr(X4) -Re( X8) -Ser(X4) -R10( X2) -Arg( X6) -R12( X6 tai X7)-R13-Leu-R15-Gln(X5)-Leu-R18(X2)-Ala-Arg(X6)-R21(X6 tai X7)-R22-Leu-R24 (X tai X5)-R25 (X8)-Ile-R27-R28 (X4 tai X5)-R29(X8)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 tai X6)-Asn(X5)-35 6
Gin(X5) -Glu (X3) -R38 (X6 tai X5 )-R39(X6)-R40(X2 )-Arg(X6 )-R42-R43(X5 tai X6)-R44(X5)-X10 mukaisia välituotteita.
X1 on joko vety tai alfa-amino -suojaryhmä. Xl:n mahdolliset alfa-amino -suojaryhmät ovat sellaisia, joiden 5 tiedetään entuudestaan soveltuvan vaiheittaiseen polypep-tidisynteesiin. X1:nä käytettäväksi kelpaavien alfa-amino-suojaryhmien luokkien joukkoon kuuluvat (1) aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmät, kuten fluorenyylimetyyliok-sikarbonyyli- (Fmoc-), bentsyylioksikarbonyyli- (Z-) ja 10 substituoitu Z-, kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli-, ja p-nitrobentsyylioksikarbonyyli-, p-bromibentsyylioksi-karbonyyli-, ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyliryhmä; (2) alifaattiset uretaanisuojaryhmät, kuten t-butyylioksikar-bonyyli- (BOC-), di-isopropyylimetyylioksikarbonyyli-, 15 isopropyylioksikarbonyyli-, etoksikarbonyyli-, allyyliok- sikarbonyyliryhmä; ja (3) sykloalkyyliuretaanityyppiset suojaavat ryhmät, kuten syklopentyylioksikarbonyyli-, ada-mantyylioksikarbonyyli- ja sykloheksyylioksikarbonyyliryh-mä. Eniten etusijalla oleva alfa-amino -suojaryhmä on BOC, 20 jopa silloin, kun NaMe-substituoitua ryhmää käytetään pai kassa 1; tietenkin X1 on H, kun B on desamino-tai N*Me -ryhmä.
X on vety tai His:n imidatsolitypen suojaryhmä, kuten Tos -ryhmä.
25 X2 voi olla sopiva suojaryhmä Tyrrn fenolihydrok- syyliryhmälle, kuten tetrahydropyranyyli-, tert-butyyli-, trityyli-, Bzl-, CBZ-, 4Br-CBZ- ja 2,6-diklorobentsyyli-(DCB)ryhmä. Etusijalla oleva suojaryhmä on 2,6-dikloori-bent syy li ryhmä. X2 voi olla vety, mikä tarkoittaa, että 30 tässä paikassa sijaitsevassa aminohapporyhmässä ei ole sivuketjun suojaryhmää.
X3 on vety tai sopiva esterin muodostava suojaryhmä Asp: n tai Glu:n karboksyyliryhmälle, kuten bentsyyli-(OBzl-), 2,6-diklooribentsyyli-, metyyli- ja etyyliryhmä. 35 X4 voi olla sopiva suojaryhmä Thr:n tai Ser:n hyd- li 91074 7 roksyyliryhmälle, kuten asetyyli-, bentsoyyli-, tert-bu-tyyli-, trityyli-, tetrahydropyranyyli-, Bzl-, 2,6-dikloo-ribentsyyli-, ja CBZ ryhmä. Suojaryhmä on mieluiten Bzl -ryhmä. X4 voi olla vety, mikä tarkoittaa sitä, että hydrok-5 syyliryhmässä ei ole suojaryhmää.
X5 on vety tai sopiva suojaryhmä Asn:n tai Gin:n sivuketjun amidoryhmälle. Se on mieluiten ksantyyliryhmä (Xan).
X6 on sopiva suojaryhmä Arg:n guanidoryhmälle, kuten 10 nitro-, Tos-, CBZ-, adamantyylioksikarbonyyli- ja BOC -ryhmä tai on vety.
X7 on vety tai sopiva suojaryhmä Lys:n sivuketjun aminoryhmälle. Hyviä esimerkkejä sopivista sivuketjun ami-nosuojaryhmistä ovat 2-klorobentsyylioksikarbonyyli- (2-15 C1-Z-), Tos-, t-amyylioksikarbonyyli- ja BOC- ryhmä.
X8 on suojaryhmä Cys:n sulfhydryyliryhmälle, mieluummin p-metoksibentsyyli- (MeOBzl-), p-metyylibentsyy- li-, asetamidometyyli-, trityyli- tai Bzl- ryhmä; tai sopiva suojaryhmä aminosivuketjulle, joka voidaan poistaa ilman, 20 että samanaikaisesti poistettaisiin suojaryhmä X7, esim.
Fmoc -ryhmän tapainen emäksessä vapautuva ryhmä; tai sopiva vapautuva suojaryhmä karboksyylisivuketjulle, joka voidaan poistaa ilman, että samanaikaisesti poistetaan suoja-ryhmä X3, esim. OFm:n (fluorenyylimetyyliesterin) kaltainen 25 emäksessä vapautuva ryhmä; tai on suora sidos ryhmien välillä paikoissa 25 ja 29, silloin kun rengasrakenne johtuu karba- tai dikarbasidoksesta.
X9 on vety tai edellä yleisesti määritelty sopiva sivuketjun suojaryhmä.
30 Met voidaan vaihtoehtoisesti suojata hapella, mutta mieluummin jätetään suojaamatta.
Sivuketjun aminosuojaryhmän valinta ei ole ratkaiseva, paitsi että yleensä valitaan sellainen ryhmä, jota ei poisteta alfa-aminosuojaryhmän suojauksen poiston yh-35 teydessä synteesin aikana. Kuitenkaan joillekin aminohapoille, esim. His:lle, suojaus ei ole yleensä tarpeellista 8 sen jälkeen, kun sidos on valmis, ja suojaryhmät voivat olla samat.
X10 on sopiva suojaava ryhmä C-pään karboksyyliryhmälle, kuten esterin muodostava ryhmä X3, tai on kiinnitys-5 sidos, jota käytetään kiinteän faasin synteesissä sidoksen aikaansaamiseksi kiinteään kantajahartsiin, tai on des-X10, missä tapauksessa C-pään ryhmänä on karboksyylin sisältävä ryhmä, joka on edellä tehtyjen määrittelyjen mukainen Y. Kun käytetään kiinteää kantajahartsia, se voi olla mikä 10 tahansa entuudestaan tunnettu kantaja, kuten sellainen, jolla on kaava: -0-CH2-kantajahartsi, -NH-bentshydryyliami-ini(BHA)kantajahartsi tai -NH-parametyylibentshydrylamii-ni(MBHA)kantajahartsi. Kun halutaan käyttää substituoima-tonta amidia, käytetään mieluummin BHA- tai MBHA -hartsia, 15 koska irroitus muodostaa amidin suoraan. Jos halutaan käy-tää N-metyyliamidia, se voidaan saada N-metyyli-BHA-hart-sista. Jos halutaan käyttää muita substituoituja amideja, voidaan käyttää apuna patenttijulkaisua U.S. Patent No. 4569967, ja, jos muita kuin vapaita happoryhmiä halu-taan 20 käyttää C-päässä, voidaan mieluummin syntesisoida peptidi käyttämällä klassisia menetelmiä, kuten Hoyben-Weylin oppikirjassa esitetään.
Jos B on esimerkiksi asetyyliryhmä, lopullisessa kaavassa on mahdollista käyttää sitä X1 -suojaryhmänä mille 25 tahansa aminohapolle, joka on paikassa 1; kuitenkin sen seurauksena voi tapahtua rasemisoituminen, joka tekee kyseisen suojauksen vähemmän halutuksi. Reaktion annetaan tapahtua mieluiten siten, että peptidi on hartsissa (alfa-aminoryhmän suojauksen poiston jälkeen sivuketjuryhmien 30 pysyessä suojattuina), esim. antamalla tämän reagoida etikkahapon kanssa disykloheksyylikarbodi-imidin (DCC) läsnä ollessa tai mieluummin etikkahapon anhydridin kanssa, tai jonkun muun entuudestaan tunnetun reaktion avulla.
Välituotteen kaavassa ainakin yksi X-ryhmistä on 35 suojaryhmä tai sitten X10 -ryhmään sisältyy kantajahartsi.
Il 91074 9 Täten keksintö tarjoaa menetelmän myös muiden haluttujen peptidien valmistamiseksi suorittamalla seuraavat vaiheet: (a) ainakin yhden suojaavan ryhmän sisältävän ja sellaisen kaavan (II) mukaisen peptidin valmistaminen, missä X, X1, 5 X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9 ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja X10 on joko suojaryhmä tai kantajahartsiin kiinnittymistä välittävä sidos tai se on des-X10, missä tapauksessa C-pään ryhmänä voi olla haluttu karboksiryhmä; (b) suojaryhmän tai -ryhmien tai kytkevän sidoksen pilkko-10 minen kaavan (II) mukaisesta peptidistä; (c) joko ennen vaihetta (b) tai tämän jälkeen suoritettava ryhmien R25:n ja R29:n välisen rengasrakenteen muodostavan sidoksen valmistus ellei tätä jo ole; ja (d) haluttaessa tuloksena olevan peptidin muuttaminen tämän myrkyttömäksi suolaksi.
15 Peptidien synteesissä käytettävän tietyn sivuketjun suojaryhmän valinnassa noudatetaan seuraavia yleisiä sääntöjä: (a) suojaryhmän suojaavien ominaisuuksien tulisi mieluummin säilyä eikä tämän tulisi pilkkoutua pois sidosten muodostusolosuhteissa, (b) suojaryhmän tulisi olla 20 reagenssin suhteen pysyvä, ja Xan -ryhmää lukuunottamatta, sen tulisi mieluummin olla pysyvä alfa-aminoryhmän poistoon valituissa reaktio-olosuhteissa synteesin kussakin vaiheessa, ja (c) halutun aminohappojakson valmistuttua synteesissä täytyy sivuketjun suojaryhmän olla poistetta-25 vissa sellaisissa reaktio-olosuhteissa, jotka eivät muuttaisi peptidiketjua halutun tuloksen vastaisesti.
Silloin kun peptidejä ei valmisteta yhdistelmä-DNA-tekniikalla, ne mieluiten valmistetaan käyttämällä Merri-field'in, Am. Chem. Soc.. 85, s. 2149 (1963) yleisesti 30 esittämää kiinteän faasin synteesiä, vaikkakin muita vastaavia tunnettuja kemiallisia synteesejä voidaan käyttää, kuten aikaisemmin on mainittu. Kiinteän faasin synteesi aloitetaan peptidin C-päästä liittämällä suojattu alfa-aminohappo sopivaan hartsiin. Tällainen lähtömateriaali 35 voidaan valmistaa kiinnittämällä alfa-aminohappo esterisi- 10 doksella kloorimetyloituun hartsiin tai hydroksimetyyli-hartsiin, tai amidisidoksella BHA -hartsiin tai MBHA -hartsiin. Hydroksimetyylihartsin valmistus on kuvattu teoksessa Bodansky ja muut, Chem. Ind. (Lontoo) 38, 1597-98 5 (1966). Klorometyloituja hartseja on kaupallisesti saata villa yhtiöistä Bio Rad Laboratories, Richmond, California ja Lab. Systems, Inc. Tällaisen hartsin valmistus on kuvattu teoksessa Stewart ja muut, "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), kappale 1, s. 10 1-6. BHA- ja MBHA- kantajahartsia on kaupallisesti saata villa ja niitä käytetään yleensä vain, kun halutulla syntetisoitavalla peptidillä on substituoitumaton amidi C-päässä. C-pään aminohappo, esim Asn, joka on suojattu B0C:lla tai Xan:lla, voidaan kytkeä kloorimetyloituun hart-15 siin artikkelissa Chemistry Letters, K. Horiki ja muut, 165-168 (1978) esitetyn menetelmän mukaan, käyttämällä KF:ää DMF:ssä noin 60 °C:ssa noin 24 tunnin ajan sekoittaen, esimerkiksi syntetisoitaessa 43 ryhmän mittaista rotan GRF (rGRF) -analogin vapaata happomuotoa. BOC-suo-20 jatun aminohapon kantajahartsiin kytkemisen jälkeen poistetaan alfa-aminosuojaryhmä käyttämällä trifluorietikkahap-poa (TFA) metyleenikloridissa tai ainoastaan TFA:a. Suojauksen poisto tapahtuu 0 °C ja huoneenlämmön välisessä lämpötilassa. Muita sidosten pilkkomiseen käytettäviä 25 tavallisia reagensseja, kuten HC1 dioksaanissa, ja tiettyjen alfa-amino- suojaryhmien poistamiseen käytettäviä olosuhteita voidaan käyttää teoksessa Schroder & Lubke, "The Peptides", 1 s. 72-75 (Academic Press 1965) kuvatuilla tavoilla.
30 Alfa-amino- suojaryhmän poistamisen jälkeen jäljelle jääneet alfa-aminoryhmästä ja sivuketjuistaan suojatut aminohapot kytketään vaiheittain haluttuun järjestykseen, jotta saataisiin aikaisemmin kuvattu välituote, tai vaihtoehtona sille, että kukin aminohappo lisätään erikseen 35 synteesiin voidaan jotkin niistä kytkeä toisiinsa ennen
II
91074 11 niiden lisäämistä kiinteän faasin reaktoriin. Sopivan kyt-kentäreagenssin valinta on tavanomaiseen ammattitaitoon kuuluva tehtävä. Erityisen sopiva kytkentäreagenssi on N,N’-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC).
5 Peptidien kiinteän faasin synteesissä käytetyt aktivoivat reagenssit ovat peptideillä entuudestaan tunnettuja. Esimerkkeinä sopivista aktivoivista reagensseista ovat karbodi-imidit, kuten N,N’-di-isopropyylikarbodi-imi-di ja N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi.
10 Muita aktivoivia reagensseja ja niiden käyttöä on kuvattu teoksessa Schroder & Lubke, ks. yllä, kappalessa III ja teoksessa Kapoor, JN. Phar. Sei.. 59, sivut 1-27 (1970).
Kukin suojattu aminohappo tai aminohappojakso lisätään kiinteän faasin reaktoriin noin neli- tai useampiker-15 täisenä ylimääränä, ja sitoutuminen voidaan suorittaa väliaineessa, joka on dimetyyliformamidi(DMF):CH2C12 (1:1) tai DMF tai CH2C12 yksinään. Tapauksissa, joissa sitoutuminen on epätäydellinen, sitoutumisvaiheet toistetaan ennen seuraavan aminohapon kytkemistä edeltävää alfa-amino-20 suojaryhmän poistoa. Jos synteesi suoritetaan käsin, tarkkaillaan kussakin vaiheessa sitoutumisreaktion onnistumista mieluiten ninhydriinireaktion avulla, kuten artikkelissa E. Kaiser et ai.. Anal. Biochem. 34, 595 (1970) kuvataan. Sitoutumisreaktiot voidaan suorittaa automaatti-25 sesti, kuten Beckman 990 automaattisyntesisoijaa käyttäen, ja käyttäen artikkelissa Riviel et ai. Biopolymers, 1978, 17, s. 1927-1938 selostetun kaltaista ohjelmaa.
Halutun aminohappoj akson valmistuttua voidaan käynnistää rengasrakenteen muodostuminen tai vapaassa happo-30 muodossa olevan peptidin saamiseksi voidaan välivaiheen peptidi poistaa kantajahartsista käsittelemällä sitä rea-genssilla, kuten nestemäisellä fluorivedyllä, joka ei ainoastaan irrota peptidiä hartsista vaan pilkkoo pois myös kaikki jäljellä olevat sivuketjujen suojaryhmät X, X2, X3, 35 X4, X5, X6, X7, X8, X9, ja kiinnittävän sidoksen X10 sekä 12 alfa-aminosuojaryhmän X1, mikäli tätä oli käytetty. Jos jaksoon sisältyy Met, niin BOC-ryhmä poistetaan mieluiten ensin käyttämällä trifluorietikkahappo(TFA)/etaaniditiolia ennen kuin peptidi irrotetaan hartsista HF:lla mahdollisen 5 S-alkyloitumisen estämiseksi. Kun irrottamiseen käytetään fluorivetyä, lisätään reaktioastiaan yhtä tai useampaa sivutuotteiden sitojaa, kuten anisolia, kresolia, dimetyy-lisulfidia tai metyylietyylisulfidia.
Cys-ryhmien välistä sidosta käytettäessä rengasra-10 kenteen muodostuminen käynnistetään mieluummin suoraket-juisella peptidillä, päinvastoin kuin silloin, kun peptidin rengasrakenne muodostetaan tämän ollessa osana peptidi -hartsikompleksia. Tällaisen disulfidirengasrakenteen muodostavan sidoksen aikaansaamiseksi voidaan täysin suo-15 jattu peptidi irrottaa hydroksimetyloidusta tai klorome-tyloidusta hartsista ammonolyysillä entuudestaan hyvin tunnetulla tavalla, jotta saataisiin syntymään täysin suojattu amidivälituote, joka sen jälkeen sopivalla tavalla tehdään rengasrakenteiseksi ja suojaukset poistetaan; 20 vaihtoehtoisesti niin suojauksen poistaminen kuin peptidin irrottaminen bentshydryyliamiinihartsista voivat tapahtua 0 eC:ssa fluorivetyhapossa. Joissakin valmistusmenetelmissä rengasrakenteen muodostaminen voidaan toteuttaa osittain suojatun peptidin ollessa hartsiin kiinnittyneenä, 25 kuten esitetään teoksessa A.M. Felix ja muut, Peptides, Proceedings of the Tenth American Peptide Symposium, toukokuu 1987, 465-467 (1988), missä käytetään amidirengasra-kenteen muodostavaa sidosta. Tällainen menetelmä luo tehokkaasti amidirengasrakenteen muodostavan sidoksen kahden 30 halutun sivuketjun välille samalla kun muut ryhmät, kuten Asp, Glu, ja/tai Lys säilyttävät sivuketjujensa suojauksen.
Rengasrakenteen muodostusvaihe GRF-peptidianalo-geilla riippuu tietenkin paikoissa 25 ja 29 olevien ryhmi-35 en välille halutun liitoksen tyypistä. Kun D- tai L-Cys -ryhmät ovat sekä paikassa 25 että 29, on usein käytännöl-
II
91074 13 lisempää tehdä rengasrakenteen muodostusvaihe hartsista irrottamisen ja kaikkien peptidin suojaryhmien poiston jälkeen. Peptidin rengasrakenteinen muoto saadaan hapettamalla ferrisyanidiliuosta käyttämällä, mieluiten artik-5 kelissä Rivier ja muut, Biopolymers, Voi. 17 (1978), 1927-38 kuvatulla tavalla, tai hapettamalla ilmassa tai jonkun muun tunnetun menetelmän mukaan.
Kun rengasrakenne muodostetaan amidisidoksen välityksellä paikan 25 ryhmän sivuketjun aminoryhmän ja paikan 10 29 ryhmän sivuketjun karboksyyliryhmän välille (mikä voi olla parempi) tai päin vastoin, on edullisempi syntetisoida suojattu peptidi MBHA- tai BHA- hartsiin ja muodostaa kyseisen karboksyylihapposivuketjun bentsyyliesteristä hydratsidijohdannainen peptidin ollessa yhä kiinni hart-15 sissa ja sitten antaa tämän reagoida sellaisen aminosivu-ketjun kanssa, josta suojaukset on valikoivasti poistettu, kuten 28. huhtikuuta 1987 myönnetyssä US-patentissa 4661472 on esitetty. Rengasrakenteen muodostaminen tehdään mieluiten käyttämällä emäksessä vapautuvaa suojaryhmää, 20 esim. OFm -ryhmää, amidisidossiltaan osallistuvan ryhmän karboksyylisivuketjulle ja käyttämällä Fmoc -ryhmää suoja-ryhmänä toisen osallistuvan ryhmän aminosivuketjulle. Al-fa-amino -suojaryhmä paikan 1 ryhmässä, joka on tarkoitus asyloida tai jättää asyloimatta, ja kaikki muut sivuket-25 jujen suojaryhmät pysyvät paikoillaan samalla kun kaksi emäksellä vapautuvaa ryhmää poistetaan käyttämällä piperi-diiniä tai tätä vastaavaa reagenssia. Tämän valikoivan poiston jälkeen rengasrakenteen muodostumisen aiheuttava reaktio suoritetaan BOP-käsittelyllä, jonka vaikutuksesta 30 amidisidos syntyy olennaisesti täydellisenä. Rengasrakenteen muodostamisen jälkeen peptidin suojaukset poistetaan kokonaan ja tämä irrotetaan hartsista HF:n tapaista reagenssia käyttämällä. Vaihtoehtoisesti BOC-suojaryhmä voidaan poistaa ensin käyttämällä TFA:a.
35 Rengasrakenteen muodostaminen peptideille tällais ten amidisidosten avulla voidaan vaihtoehtoisesti suorit- 14 taa käyttämällä apuna US-patentteja 4115554 (19. syyskuuta 1978); 4133805 (9. tammikuuta 1979); 4140767 (20. helmikuuta 1979); 4161521 (17. heinäkuuta 1979); 4191754 (4. maaliskuuta 1980); 4238481 (9. joulukuuta 1980); 4244947 5 (13. tammikuuta, 1981); ja 4261885 (14. huhtikuuta 1981).
Nimityksellä dicarba viitataan GRF -analogeihin, jotka paikoissa 25 ja 29 sisältävät modifioituja kysteii-niryhmiä vastaavat ryhmät, joissa disulfidisidos on korvattu -CH2- -sidoksella. Jos ainoastaan yksi sulfhydryyli-10 ryhmistä on korvattu CH2-ryhmällä, siihen viitataan nimityksellä karba, esim. [karba25, Cys29]-GRF. Lopullisen peptidin kannalta katsottuna paikka, jossa muuten olisi Cys-ryhmä sisältääkin sen sijaan alfa-aminovoihappo (aBu-) -ryhmän. Valmistettaessa peptidejä, joilla on tällainen 15 karba-tai karba-S-liitos, käytetään mieluummin US-paten- tissa 4161521 esitettyä menetelmää (kyseinen patenttijulkaisu on liitetty tähän mukaan viitteenä), niin että kaavan II välituotteessa X® on suora sidos tähän toiseen ryhmään.
20 Seuraava esimerkki I esittää etusijalla olevan me netelmän peptidien syntetisoimiseksi kiinteän faasin menetelmällä. On tietysti huomattava, että vastaavasti pidemmän peptidin synteesi suoritetaan samalla tavalla ainoastaan lisäämällä tarvittava määrä aminohappoja ketjun C-25 päähän. Nykyään vallitsee käsitys, että biologisesti aktiivisten fragmenttien tulisi sisältää osoitettu jakso N-päässä, ja että ryhmien lisäämistä N-päähän ei pidetä edullisena.
Esimerkki 1 30 Kaavan N*MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-
Arg-Arg-Ile-Leu-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Hls-D-Cys-Ile-Nle-Asn-Cys-NH2 mukaisen peptidin [NaMeTyr2, Ala15, D-Cys25, Nle27, Cys29]-rGRF(l-29)-NH2 synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisoijaa ja 35
II
91074 15 kaupallisesti saatavilla olevaa MBHA-hartsia, kuten yleisesti kuvataan US-patenttijulkaisussa 4292313, Vale et ai. BOC-Cys(MeOBzl):n kytkemisessä hartsiin saadaan noin 0,35 mmoolia Cys korvautumaan yhtä hartsigrammaa kohti.
5 Suojauksen poiston ja neutralisoinnin jälkeen pep- tidiketju muodostetaan vaiheittain hartsiin. Suojauksen poisto, neutralisointi ja kunkin aminohapon lisääminen suoritetaan yksityiskohdittain artikkelissa Rivier, J, J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986-2992 (1974) esitetyn menetelmän 10 mukaan. Kaikista käytetyistä liuottimista poistetaan kaasu inertillä kaasulla, kuten heliumilla tai typellä kuplit-tamalla.
Suojauksen poisto suoritetaan mieluiten seuraavan aikataulun A mukaan:
15 AIKATAULU A
Reaaenssi Sekoitusaika (min.) 1. 60% TFA/2% etaaniditioli 10 2. 60% TFA/2% etaaniditioli 15 20 3. IPA/1% etaaniditioli 0,5 4. Et3N (10%) CH2C12: ssa 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N (10%) CH2C12:ssa 0,5 7. MeOH (kahdesti) 0,5 25 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5
Sitoutumisreaktiot suoritetaan mieluiten seuraavan aikataulun B mukaan: 16
AIKATAULU B
Reagentti Sekoitusaika (min.)
9. DCC
10. Boc-aminohappo 50-90 5 11. MeOH (kahdesti) 0,5 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 (3 M) CHcl2:ssa 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 10 16. CH2C12 0,5
Lyhyesti, käytetään yhdestä kahteen mmoolia BOC -suojattua aminohappoa metyleenikloridissa yhtä hartsigram-maa kohti sekä yksi ekvivalentti yksi molaarista DCC:tä metyleenikloridissa kahden tunnin ajan. B0C-Arg(Tos):n si-15 toutumisessa käytetään 50% DMF:n ja metyleenikloridin seosta. Bzl-eetteriä käytetään hydroksyylisivuketjun suoja-ryhmänä Ser- ja Thr -ryhmille. Asn:n tai Gin:n amidoryhmä suojataan mieluiten Xan -ryhmällä käytettäessä DCC -sitoutumista; suojaus voidaan kuitenkin myös jättää pois. p-20 nitrofenyyliesteriä (ONp) voidaan myös käyttää Asn:n ja Gin:n karboksyylipään aktivoimiseen, ja BOC-Asn(ONp) voidaan esimerkiksi kytkeä yön yli käyttämällä yksi ekvivalentti H0Bt:a 50% seoksena DMF:n ja metyleenikloridin kanssa, missä tapauksessa DCC:tä ei lisätä. 2-klooribentsyy-25 loksikarbonyyliä (2C1-Z) käytetään suojaryhmänä Lys-sivu-ketjulle. Tos -ryhmää käytetään suojaamaan Arg:n guanido-ryhmää ja His:n imidatsoliryhmää, ja Asp:n sivuketjun kar-boksyyliryhmä suojataan OBzl -ryhmällä. MeOBzl -ryhmää käytetään suojaryhmänä Cys:n sulfhydryyliryhmälle. Tyr:n 30 fenolinen hydroksyyliryhmä suojataan 2,6-diklooribentsyy-liryhmällä (DCB). Synteesin lopussa on saavutettu seuraava kokoonpano: B0C-N*MeTyr (X2)-Ala-Asp (X3)-Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Ser (X4) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg( X6) -Arg( X6 )-Ile-Leu-Ala-Gln(x5) -Leu-Tyr (X2) -Ala-Arg( X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-His( X) - il 91074 17 D-Cys(X8)-Ile-Nle-Asn(X5)-Cys(X8)-X10, missä X on Tos, X2 on DCB, X3 on OBzl, X4 on Bzl, X5 on Xan, X6 on Tos, X7 on 2C1-Z, X8 on MeOBzl ja Xl° on NH-MBHA-kantajahartsi. Xan -ryhmä on voitu osittain tai kokonaan poistaa alfa-aminoryhmän 5 suojauksen poistoon käytetyllä TFA -käsittelyllä.
Suojauksia sisältävän peptidin ja kantajahartsin välisen sidoksen pilkkomiseksi ja suojausten poistamiseksi kompleksi käsitellään liuoksella, jossa on 1,5 m anisolia, 0,5 ml metyylietyylisulfidia ja 15 ml fluorivetyä yhtä 10 peptidi-hartsigrammaa kohti, -20 °C:n lämpötilassa puolen tunnin ajan ja 0 eC:n lämpötilassa puolen tunnin ajan. HF poistetaan voimakkaassa tyhjiössä, jonka jälkeen hartsi-peptidi jäännös pestään vuorotellen kuivalla dietyylieet-terillä ja kloroformilla, sen jälkeen peptidi uutetaan 2N 15 etikkahapon vesiliuoksella, josta kaasu on poistettu, ja sitten peptidi erotetaan hartsista suodattamalla.
Tämän jälkeen peptidiä hapetetaan ilmassa noin 48 tunnin ajan noin 4 eC:n lämpötilassa ja sitten vielä noin 3 päivän ajan huoneenlämmössä (tai siihen asti kunnes Ell-20 man-kokeella — ks. Archives Blochem. Biophvs. 82. 1959, s. 70 — mitattu -SH on täysin hävinnyt) disulfidisidoksen muodostamiseksi kysteiiniryhmien välille jokaisessa molekyylissä.
Sitten irrotettu, suojaukseton ja rengasrakenteinen 25 peptidi liuotetaan 0-5% etikkahappoon ja sille suoritetaan puhdistus, joka voi sisältää geelisuodatuksen hienojakoista Sephadex G-50 käyttäen.
Sitten peptidi puhdistetaan edelleen preparatiivi-sella tai puolipreparatiivisella HPCLrlla kuten kuvataan 30 teoksissa Rivier et ai., J. of Chromatography. 288. 303-328 (1984); Rivier et ai., Peptides: Structure and Biolo-oical Function. (1979) s. 125-8; ja Marki et ai., J. Am.-Chem. Soc.103. 3178 (1981). Waters Assosiates prep LC500-:aan sopivat kasetit on pakattu Vydac 15-20 μ C18-Silical-35 la (300A). CH3CN:n gradientti TEAPrssa luodaan matalapaine 18 käyttöisellä Eldex -gradientintekijällä kuten artikkelissa Rivier J., J. Lig. Chromatography 1. 343-367 (1978) on kuvattu. Kromatografisia jakeita tarkkaillaan huolellisesti HPLC:llä ja ainoastaan huomattavan puhtaiksi osoittautu-5 neet jakeet yhdistetään. Toisistaan riippumatta puhtaudeltaan tarkistettujen puhdistettujen fraktioiden suolojen poisto tehdään käyttämällä CH3CN:n gradienttia 0.1% TFA:-ssa. Halutun peptidin saamiseksi otetaan kylmäkuivattavak-si keskiosasta jae, jonka puhtausaste voi olla yli 98 %. 10 Peptidi todetaan homogeeniseksi käyttämällä ohut- levykromatografiaa ja useita erilaisia liuotinsysteemejä. Sille tehdään erityinen käänteisfaasi-korkeapaine-neste-kromatografia-analyysi käyttämällä yllä kuvattua Watersin HPLC-systeemiä, jossa on 0.21 x 15 cm:n pylväs täytettynä 15 5 pm Cie-silicalla, 300 A:n huokoskoko; käytetyt puskuri- liuokset olivat trietyyliammoniumfosfaatin vesiliuos, jonka pH oli 3.0, ja joka koostui 1.0 ml:sta HH3P04 ja 1.6 mlrsta trietyyliamiinia 1000 ml liuosta kohti, sekä ase-tonitriili. Määritys suoritettiin huoneenlämmössä. Puskuri 20 A sisälsi 5% CH3CN, kun taas puskuri B sisälsi 75% CH3CN. Virtausnopeus oli 0.6 ml minuutissa, alkaen 20% puskuria B ja suhteessa tapahtunut nousu 60 minuutin aikana saavutti 95% puskuri B:n. Retentioaika oli 34.45 minuuttia.
Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysin 25 tulokset ovat yhdenmukaiseen saadun valmisteen rakenteen kaavan kanssa, ja ne osoittavat seuraavat aivot kullekin ketjun aminohapolle: Asp(2,13), Thr(l,00), Ser(l,75),
Glu(1,06), Cys(1,83), Ala(4,00), CH3Tyr(1,17), Ile(2,71), Leu(4,33), Nle(1,28), Tyr(2,14), Phe(0,94), Lys(l,00), 30 His(l,04) ja Arg(3,20). Optinen kiertyminen mitataan valo sähköisellä polarimetrillä [a]£2 = -62,9±1 (c=l, 1 % etik-kahappo).
Esimerkki IA
Esimerkki I:n synteesi toistetaan korvaamalla D-Cys 35 L-Cys:llä paikassa 25 ja korvaamalla L-Cys D-Cys:llä pai-
II
91074 19 kassa 29 kaavan NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Cys-Ile-Nle-Asn-D-Cys-NH2 mukaisen amidoidun peptidin syntetisoimiseksi. Peptidi todetaan homogeeniseksi käyt-5 tämällä ohutlevykromatografiaa ja useita erilaisia liuo-tinsysteemejä. Se analysoidaan erityisesti käänteisfaasi-korkeapainenestekromatografialla käyttämällä yllä kuvattua Watersin HPLC-systeemiä, jossa on 0,21 x 15 cm:n pylväs täytettynä 5 pm C18 -silikaa, 300A:n huokoskoko; käytetyt 10 puskuriliuokset olivat 0,1 % trifluorietikkahapon vesi-liuos, joka koostui 1,0 ml:sta TFA 1000 ml:aa liuosta kohti, sekä asetonitriili. Määritys suoritettiin 37 eC:ssa. Puskuri A sisälsi 5 % CH3CN, kun taas puskuri B sisälsi 80 % CH3CN. Virtausnopeus oli 1,0 ml minuutissa, alkaen 10 % 15 puskuria B ja nousten suhteessa 30 minuutin aikana saavuttaen 95 % puskuria B. Retentioaika oli 20,68 minuuttia.
Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysin tulokset ovat yhdenmukaiset saadun valmisteen rakenteen kaavan kanssa, ja ne osoittavat, että kullekin ketjun ami-20 nohapolle saadaan likimain kokonaislukuarvot. Optinen kierrtyminen mitataan valosähköisellä polarimetrillä [0]D22 = -79,2±1 (c=l, 1% etikkahappo).
Esimerkki II
Kaavan H-NaMeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-25 Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-
Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-daP-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 mukaisen 44 ryhmää sisältävän amidoidun peptidin c( 25-29) [N'MeTyr1, D-NMA2, Ala15,
Nle27, daP29]-hGRF( 1-44)-NH2 synteesi suoritetaan vaiheit-30 tain Beckmann 990-peptidisyntetisoijaa ja MBHA-hartsia- käyttäen esimerkin I yleiskuvauksen mukaisesti kaavan B0C-N*MeTyr (X2) - Ala-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Asn( X5) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg( X6) -Lys( X7) -Val-Leu-Ala-Gln- (X5) -Leu-Ser (X4) -Ala-Arg( X6) -Lys( X7) -Leu-Leu-Gln( X5) -Asp( OFm) -Ile-Nle-Ser 35 20 (X4)-daP( Fmoc) -Gln( X5) -Gln( X5) -Gly-Glu( X3)-Ser (X4)-Asn( X5) -Gln( X5) -Glu( X3) -Arg( X6) -Gly-Ala-Arg( X6) -Ala-Arg( X6) -Ala-Arg-(X6)-Leu-NH-MBHA-kantajahartsi mukaisen välituotteen saamiseksi, missä X2-X7 ovat esimerkissä annettujen määritelmien 5 mukaisia. Valikoiva suojausten poisto ja rengasrakenteen muodostaminen suoritetaan seuraavalla tavalla.
4 g suojattua peptidyylihartsia (joka sisältää noin meq peptidiä), 2,20 g (5 meg) BOP [bentsotriatsolyyli-N-oksitris(dimetyyliamino)fosfoniumheksafluorofosfaatti] ja 10 10 meq di-isopropyylietyyliamiinia suspendoidaan ja sekoi tetaan kahden tunnin ajan huoneenlämmössä. Peptidihartsi suodatetaan, pestään DMF:llä, MeOH:lla, CH2Cl2:lla ja MeOH:lla, ja lopuksi kuivataan.
4 g suojattua peptidihartsia käsitellään 60 %:isel-15 la TFA: 11a CH2Cl2:ssa BOC-suojaryhmän poistamiseksi ja sitten 10-15 ml:11a tislattua HF, jossa on mukana anisolia epäpuhtauksien sitojana, 0 °C:ssa 60 minuutin ajan jäljellä olevien suojaryhmien poistamiseksi ja peptidin irrottamiseksi hartsista. HF poistetaan voimakkaassa tyhjiössä 20 ja peptidi seostetaan etyylieetterin anhydridin avulla. Kiinteä aine kerätään, liuotetaan 50 ml erään CH3CN:H20 (1:1) ja kylmäkuivataan. Sen j äIkeen se puhdistetaan käyttämällä RP-HPLC:tä, kuten esimerkissä I on kuvattu. Peptidi todetaan huomattavan puhtaaksi TLC:n ja HPLC:n 25 avulla.
Esimerkki III
KaavanH-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-His-D-Glu-Ile-Nle-Asn-Orn-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-30 Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH mukaisen peptidin c(25-29) [D-NMA2, D-Glu25, Nle27, Orn29] -rGRF( 1-43 )-OH synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckmann 990-peptidisyntetisoijaa ja suorittaen kloorimetyloituun hartsiin tapahtuvan kiinnityksen alkuvaiheet aikakausjulkaisussa Chemistry Letters 35 (ks. yllä) esitetyllä tavalla ja jatkamalla sen jälkeen esimerkissä II esitetyn yleiskuvauksen mukaisesti. Peptidi todetaan huomattavan puhtaaksi TLC:n ja HPLC:n avulla.
il 91074 21
Esimerkki IV
Kaavan NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Ly s - Vai - Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ai a - Ar g - Ly s - Leu - Leu-G1 n - D-Cys-Ile-Nle-Asn-Cys-NH-CH2CH3 mukaisen hGRF -analogin 5 [I^MeTyr1, Lys8, Ala15, D-Cys25, Nle27, Asn28, Cys29]-hGRF( 1-29)-NHEt synteesi suoritetaan vaiheittain käyttämällä Beckman 990-peptidisyntetisoijaa ja hartsia US-patentissa 4569967 kuvatulla tavalla. Suoraketjuinen peptidi poistetaan hartsista HF-käsittelyllä ja rengasrakenteen muodos-10 taminen ja puhdistaminen tapahtuvat esimerkissä I esitetyllä tavalla. Analogi todetaan huomattavan puhtaaksi TLC:n ja HPLC:n avulla.
22
Esimerkki V
Kaavan (B)R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-R25-Ile-Nle-Asn-R29-NH2 mukaiset rGRF-analogit, joihin vii-5 tataan taulukossa I, valmistetaan käyttäen edellä mainittua kiinteän faasin menetelmää.
TAULUKKO I
10 B R1 R25 R29 5 Ac His Cys aBu 6 " D-Phe aBu D-aBu
7 For Tyr Asp daP
15 8 " D-Tyr " D-daB
9 CaMe Phe daP D-Asp 10 " Met " Glu 11 " D-Met Orn " 12 Ac Leu daB D-Asp 20 13 NaMe pCl-Phe Cys D-Cys 14 Ac D-His Orn Asp 15 ·' D-Tyr daP " 16 desamino His 11 D-Glu
17 " Phe Glu daP
25
Peptidit, kuten numerot 5 ja 6 syntetisoidaan käyttäen apuna US-patentissa 4161521:ssa annettuja yleisiä 30 ohjeita.
il 91074 23
Esimerkki VI
rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa II, ja jotka ovat kaavan H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-Lys-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-R25-5 Ile-Nle-Ser-R29-NH2 mukaisia, valmistetaan edellä mainitun kiinteä faasi -menetelmän avulla.
TAULUKKO II
10 Rg Ri3 R25 R29 18 Gin · Ala daP Asp 19 ·· Ile Orn "
20 Lys " daB GlU
15 21 " Val D-Lys Asp 22 " Leu daP " , n <· D-Glu 23 Asn 24 " Ala daB 11 25 n Ile " Asp 20 „ „ Lvs " 26 Ser
27 ·. Vai D-Asp D-daP
28 Arg " Asp D“daB
29 '· Leu Glu "
30 asp " °-CyS
25 31 . i' Ala cys P-aBu 24
Esimerkki VII
rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa III, ja jotka ovat kaavan ^MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-R22_Leu-Leu-5 R^^-R^^-Ile-Met-Asn-R^g-NH2 mukaisia, valmistetaan edellä mainitun kiinteän faasin menetelmän avulla.
TAULUKKO III
10 r21 R24 *25 *29
32 Lys His D-Asp daP
33 " " Cys Cys 15 34 D-Lys 11 " " 35 " Gin daP D-Asp 36 " " Orn Asp
37 " His Asp daP
38 Arg " " Lys 20 39 " " Glu D-Lys
40 D-Arg " " daP
41 " " daB Asp 42 Arg Gin " " 43 Lys His D-daB Glu 2g 44 " m " D-Glu
45 p-Lys M daP M
4 6 D-Arg " " Asp 47 ” Gin Cys Cys il 91074 25
Esimerkki Vili rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa IV, ja a jotka ovat kaavan N MeTyr-I^-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-5 Gln-R^g-Ile-R2^-Ser-R2g-Gln-Gln-Gly-Glu-R2^-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 mukaisia valmistetaan edellä mainitun kiinteän faasin menetelmän avulla.
TAULUKKO IV
10 R2 R25 R27 R29 R34 48 D-Ala D-Cys Nle Cys Ser 15 49 " Asp Met daB " 50 " « D-Met D-daP "
51 »i ·· Ala Orn M
52 Ala D-Asp Nle " Ar9 53 *· D-Glu Ile D-Orn " 20 54 " « Nle daB Ser 55 n « Vai Lys " 56 NMA D-Glu Leu daP " 57 D-NMA Glu Nva " " 5g « ·· ” D-daP " 25 59 M " Ala D-Lys Arg 26
Esimerkki IX
rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa V, ja jotka ovat kaavan H-His-Ala-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-5 R^-ile-nle-Asn-R^-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-R44-Y mukaisia valmistetaan edellä mainitun kiinteä faasin menetelmän avulla.
TAULUKKO V
10
R3 R25 R29 R44“Y
60 Asp Cys Cys NH2 , _ 61 " " aBu Val-NH, 62 D-Asp " Cys Leu-NH2
63 " " " OH
64 " " aBu NHCH2CH3 65 Asp " '· OH(asetaattisuola) 2Q 66 " aBu D-Cys NHCH3 67 " " aBu Ala-NH2 68 " Glu D-daB N(CH3)2 69 D-Asp » Orn NHNH2 7 0 " Asp daB OCH3
71 " " D-daP -CH^OH
25 *
72 ·" Cys Cys CHO
73 " " D-aBu NHCFH2 74 Asp " cys NHCF2CH3
75 " Asp D-daB OH
il 91074 27
Esimerkki X
rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa VI, ja jotka ovat kaavan (B)Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-R22-Leu-5 Gln-R25-Ile-Nle-R2e-R29-Gln-Gln-Gly-Leu-NH2 mukaisia valmistetaan edellä mainitun kiinteän faasin menetelmän avulla.
TAULUKKO VI
10 B R22 R25 R28 R29
76 Ac Leu Asp Asn D-daP
77 Ac " daP v Asp 78 Ac Ala D-Cys Ser Cys 79 Ac » Glu " D-Orn 80 H Vai daP " Asp 81 desamino " " Asn D-Glu 82 " Ile Lys " " 83 For " D-daP " D-Asp 20 84 " ” Cys " aBu 85 NaMe Leu " Ser D-Cys 86 " " daB " Asp 87 H Ala " Asn Glu 25 28
Esimerkki XI
rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa VII, ja jotka ovat kaavan H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-R^Q-Arg-R12-He-Leu-R1g-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-5 His-F^25-Ile-Nle-Asn-R2^-NH2 mukaisia valmistetaan edellä mainitun kiinteän faasin menetelmän avulla.
TAULUKKO VII
10 _
Ri0 Ri2 R15 R25 R29 88 D-Tyr Arg Ala Orn D-Glu g g n n ·· · D-Orn Asp 90 " »' " daP’ " ^ 91 «' " β-Ala " Glu 92 Tyr Ly s " D—daP Asp 93 » « Gly D-Lys "
94 n ti n Glu D-daP
95 Phe " Ala " daB
20 96 " Arg " aBu D-Cys 97 n n Gly 11 D—aBu 98 D-Tyr " " D-aBu cys 99 1' ·· β-Ala D-Orn Glu 100 " " Ala D-Lys D-Asp 25 11 91074 29
Esimerkki XII
rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa VIII, ja jotka ovat kaavan H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-5 R25 -He-Nle-Ser-R2g-NH2 mukaisia valmistetaan edellä maini tun kiinteän faasin menetelmän avulla.
TAULUKKO VIII
10 R13 R21 R25 R29 101 Vai D-Lys Cys Cys 102 " " M aBu 15 103 " " aBu D-Cys 104 Ile " " D-aBu 105 " Lys " Cys 106 " " daP Glu 107 Ala " D-daB " 20 108 " " daP D-Glu 109 " " D-Orn "
110 Ile " Asp daP
111 " D-Arg Glu Lys
112 " " » D-daP
25 113 Leu " D-Glu Lys 114 " Arg " D-Orn 115 " " Asp D-Lys
116 Vai " " daB
117 ·· D-Lys " D-daP
30 118 Ile " D-Asp daP
119 * " Cys aBu 120 " Lys " - D-Cys 121 M " daP Asp 122 Ala Arg " " 30
Verrattaessa esimerkeissä valmistettuja peptidejä synteettiseen hGRF(1-40)-OH peptidiin in vitro kokeissa havaitaan niiden olevan yleensä vaikutusteholtaan GH:n eritykseen ja muihin samanlaisiin sisäisiin toimintoihin 5 tätä suurempia. Kaikkia näitä peptidejä voidaan pitää biologisesti aktiivisina ja mahdollisesti hyödyllisinä aivolisäkkeen GH:n vapautumista lisäävinä aineina.
Tiettyjen edustavien synteettisten peptidien suhteellisen tehokkuuden määrittämiseksi suoritetaan in vitro 10 kokeita käyttäen vakiona hGRF(1-40)-0H verrattaessa rinnakkain tämän ja syntetisoitujen analogien edustajiksi valittujen peptidien ekvimolaarisia liuoksia. Käytetään soluviljelmää, joka on tehty 3-5 päivää aikaisemmin irrotetuista rotan aivolisäkkeen soluista. Tällaisia viljel-15 miä pidetään parhaimpina kasvuhormonin erityksen kannalta, ja niitä käytetään vertaileviin kokeisiin, kuten on yleisesti kuvattu artikkelissa Vale et ai., Endocrinology. 91. 562-572 (1972) ja kuten on tarkemmin kuvattu artikkelissa Vale et ai., Endocrinology. 112. 1553-1555 (1983). Tes-20 tattavaa ainetta inkuboidaan 3-4 tuntia, jonka jälkeen elatusaineesta otetuista ja jatkokäsitellyistä näyte-eristä mitataan niiden sisältämän immunoreaktiiviisen GH:n (ir GH) määrä hyvin tunnetulla radioimmunomäärityksellä.
Ekvimolaaristen liuosten vertailevan kokeen tu-25 loksista käy ilmi, että esimerkiksi peptidillä [N*Metyr,
Ala15, Cys25, Nle27, D-Cys29]-rGRF( 1-29 )-NH2 on noin kaksinkertainen biologinen teho peptidiin hGRF(1-40)-OH verrattuna.
Hormonin erityksen tutkimiseen käytettyjen in vitro kokeiden lisäksi in vivo kokeissa uretaanilla nukutettui-30 hin koirasrottiin ruiskutetaan suonensisäisesti synteetti siä peptidejä, jotta voitaisiin määrittää niiden kyky laukaista GH:n eritys. Verinäytteitä otetaan ennen ruiskutusta ja 10, 45 ja 90 minuutin päästä sen jälkeen, ja GH -taso määritetään kussakin tapauksessa radioimmunomäärityk-35 sellä.
91074 31 Tästä näiden synteettisten peptidien in vivo kokeesta käy ilmi, että ne ovat biologiselta teholtaan huomattavasti parempia kuin hGRF(1-40)-OH; 1 pg:n annos esimerkin 1 peptidiä ja 5 pg annos esimerkin IA peptidiä saivat kumpikin 5 aikaan in vivo reaktion 10 minuutissa, kun taas tarvittiin 25 pg annos hGRF(1-40)-OH -peptidiä vastaavan reaktion aikaansaamiseksi. Lisäksi näiden synteettisten rengasra-kenteisten peptidien vaikutus kestää pitempään verrattuna vastaaviin annoksiin hGRF(1-40)-OH:a, kuten kasvuhormonin 10 määrät veressä 45 minuutin kuluttua keksinnön rengasra-kenteisten peptidien suonensisäisestä ruiskutuksesta osoittavat. Annoksia, jotka ovat 400 nanogramman ja 50 mikrogramman välillä olevia annoksia painokiloa kohti, pidetään riittävinä kasvuhormonin erityksen aikaansaama-15 seksi.
Tällaiset synteettiset hGRF-analogit ja rGRF-analo-git ovat luultavasti hyödyllisiä sellaisissa käyttösovellutuksissa ihmisiin, joissa lääkäri haluaa lisätä kasvuhormonin eritystä. Kasvuhormonin erityksen lisääminen 20 tällaisilla analogeilla tulee kyseeseen potilailla, joilla on GRF:n liian vähäisestä sisäisestä tuotannosta aiheutuva täydellinen tai suhteellinen GH:n puutostila. On vielä mahdollista, että lisääntynyttä GH:n eritystä ja sen aikaansaamaa kasvun lisääntymistä voitaisiin aiheuttaa ih-25 misissä ja eläimissä, joilla on normaali GH -taso. Aineen antamisen tulisi muuttaa ruumiin rasvakoostumusta ja muuntaa aineenvaihdunnallisia, immunologisia ja kasvuprosesseja. Nämä analogit voivat olla hyödyllisiä kiihdytettäessä esimerkiksi ihmisissä tapahtuvia anabolisia prosesse-30 ja tietyissä tilanteissa, kuten palovammojen hoidossa.
Näitä analogeja voidaan antaa kaupallisessa käytössä oleville tasalämpöisille eläimille, kuten kanoille, kalkkunoille, sioille, vuohille, nautakarjalle ja lampaille, ja niitä voidaan käyttää kalaviljelmiin ja antaa muille 35 vaihtolämpöisille merieläimille, esim. merikilpikonnille, ankeriaille ja sammakkoeläimille kasvun kiihdyttämiseen ja 32 rasvan ja valkuaisaineen suhteen nostamiseen, mihin päästään antamalla tehoavia määriä peptidejä.
Näiden synteettisten peptidien puhtausaste tulisi olla vähintään 93 %, mutta mieluiten ainakin 98 %, ennen 5 kuin niitä annetaan ihmisille. Tämän keksinnön tarkoituksiin puhtaudella tarkoitetaan aiotun peptidin massaprosent-tia kaikista esiintyvistä peptideistä ja peptidifragmen-teista. Tällaisten synteettisten peptidien hyväksyttävä puhtausaste voi olla jopa niin alhainen kuin 5 % tai jopa 10 0,01 %, annettaessa näitä kaupallisessa käytössä oleville tai muille eläimille.
Näitä synteettisiä peptidejä ja niiden myrkyttömiä suoloja voidaan antaa eläimille, ihmiset mukaanluettuna, farmaseuttisen valmisteen muodossa, joka muodostuu pepti-15 distä ja farmaseuttisesta tai eläinlääketieteellisestä kantaja-aineesta, joko suonensisäisesti, ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, ihon kautta, esim. nenäontelon kautta, tai jopa suun kautta. Peptidin antamisen voi suorittaa lääkäri, jotta tällaista hoitoa tarvitsevan potilaan GH:n 20 vapautuminen lisääntyisi. Vaadittava määrä vaihtelee hoidettavan tapauksen olosuhteista, tapauksen vakavuudesta ja tarvittavan hoidon pituudesta.
Tällaisia peptideitä annetaan usein myrkyttöminä suoloina, kuten happoadditiosuoloina tai metallikomplek-25 seinä esim. sinkki- tai rautakomplekseina tai vastaavina (joita pidetään tämän keksinnön tarkoituksiin sopivina suoloina). Hyviä esimerkkejä tällaisista happoadditiosuo-loista ovat kloorivety, bromivety, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, 30 malaatti, askorbaatti, tartaatti ja vastaavat. Jos vaikuttava ainesosa aiotaan antaa suun kautta tablettina, siinä voi olla sitoja-ainetta, kuten trakanttia, maissitärkkelys-tä tai gelatiinia; liuotinainetta, kuten algiinihappoa; ja voiteluainetta, kuten magnesiumstearaattia. Jos halutaan 35 antaa aine nestemäisenä voidaan käyttää makeutus- ja/tai li 91074 33 sessa suolaliuoksessa, fosfaattipuskurissa tai vastaavassa.
Peptidit tulisi antaa ihmisille lääkärin valvonnan alaisena, ja farmaseuttiset liuokset yleensä sisältävät 5 peptidiä tavallisessa kiinteässä tai nestemäisessä farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantaja-aineessa. Yleensä annostus on noin 0,01-1 mikrogrammaa peptidiä isännän painokiloa kohti.
Vaikka keksintö on kuvattu sellaisten sen puittei-10 siin kuuluvien tekijöiden suhteen, jotka tällä hetkellä ovat sen tekijöiden tiedossa, on ymmärrettävissä, että tavanomaisen ammattitaidon omaavat voivat tehdä erilaisia muutoksia ja muunnelmia keksintöön ilman, että nämä poikkeavat keksinnön kattamasta alueesta seuraavassa esitet-15 tyjen patenttivaatimusten puitteissa. Esimerkiksi pepti-diketjuun voidaan tehdä tunnetuilla kokeellisilla menetelmillä muutoksia, varsinkin poistoja peptidin karboksyyli-päästä alkaen noin paikkaan 29 saakka, sellaisten peptidien tai peptidifragmenttien valmistamiseksi, joissa kaikki 20 tai hyvin olennaiset osat peptidin biologisesta tehosta ovat säilyneet. Tällaisia peptidejä pidetään keksinnön puitteisiin kuuluvina. Lisäksi voidaan tehdä lisäyksiä peptidin jompaankumpaan tai kumpaankin päähän, ja/tai yleisesti vastaavia ryhmiä voidaan korvata luonnossa esiinty-25 villä ryhmillä muiden analogien valmistamiseksi peptidike-miassa entuudestaan tunnetuilla tavoilla, ilman että tällöin poikettaisiin keksinnön tarkoituksesta. Lisäksi voidaan tehdä muutoksia etusijalla olevaan -NH2 -ryhmään C-päässä entuudestaan tunnetuilla tavoilla; esimerkiksi ta-30 vallisella aminohapporyhmän karboksyyliosa C-päässä voi olla ryhmä -C00R, -CRP, -CONHNHR, -C0N(R)(R') tai CH20R, missä R ja R' ovat alempia alkyyleitä, alempia fluoroal-kyyleitä tai vetyjä niin, että saadan aikaan keksinnön piiriin kuuluvia vastaavia synteettisiä peptidejä.
35 Keksinnön eri piirteitä korostetaan seuraavissa pa tenttivaatimuksissa .
Claims (8)
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen 29-44 aminohapporyhmää sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi, 5 joka sisältää rengasrakenteen aminohappojen R25 ja R29 välillä ja jonka N-terminaalisella sekvenssillä on kaava I: (B )R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Re-Ser-Tyr-Arg-R12-R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-Nle-R28-R29- 10 jossa B on H tai C'Me, R3 on Tyr tai His, R2 on Ala tai D-NMA, R8 on Ser, Ly s tai Asn, R12 on Arg tai Lys, R13 on Ile tai Vai, R15 on Ala tai Gly, R18 on Tyr tai Ser, R24 on His tai Gin, R25 on Cys, D-Cys, D-Glu tai Asp, R28 on Asn tai 15 Ser ja R29 on Cys, D-Cys, Orn tai daP edellyttäen, että kun R25 on D-Cys tai Cys, R29 on itsenäisesti D-Cys tai Cys, ja kun R25 on Asp tai D-Glu, R29 on itsenäisesti Orn tai daP, ja jolloin mahdollisesti läsnä olevat aminohapot 30 - 44 tai niiden muodostaman sekvenssin C-terminaalista lyhenne-20 tyt fragmentit vastaavat luonnollisen GRF:n rakennetta, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (a) muodostetaan peptidivälituote, jossa on vähintään yksi suojaryhmä ja jonka N-terminaalisella sekvenssillä on kaa-25 va II: (X^fBjR^X tai X2) -R2-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -R8( X4, X5 tai X7) -Ser (X4 )-Tyr( X2 )-Arg( X6) -R12( X6 tai X7)-R13-Leu-R15-Gln (X5)-Leu-R18(X2 tai X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-R24(X tai 30 X5)-R25(X8)-Ile-Nle-R28(X5 tai X4)-R29(X8)—X10, jossa X, X1, X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin vety tai tavanomainen sivuketjun suojaryhmä, X® on Cys:n sulfhydryyl-iryhmän suojaryhmä tai sopiva aminosivuketjun suojaryhmä, 35 joka voidaan poistaa poistamatta samalla suojaryhmää X7,tai II 91074 sopiva labiili karboksyylisivuketjun suojaryhmä, joka voidaan poistaa poistamatta samalla suojaryhmää X3, --- osoit taa että muita aminohappoja voi olla läsnä, ja X10 on peptidin kantajahartsiin ankkuroiva sidos, 5 (b) suojaryhmä tai suojaryhmät tai ankkuroiva sidos pilko taan kaavan II mukaisesta peptidivälituotteesta, (c) muodostetaan ryhmien R25 ja R29 välille syklinen sidos, jos sellainen ei ole läsnä, joko ennen vaihetta (b) tai sen jälkeen, ja 10 (d) haluttaessa muutetaan saatu peptidi sen myrkyttömäksi suolaksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2 on NaMeTyr.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että R25 on D-Cys ja R29 on Cys.
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R25 on Asp ja R29 on daP.
5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R25 on D-Glu ja R29 on Orn.
6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R25 on Cys ja R29 on D-Cys.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidillä on yksi kaavoista:
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22327788 | 1988-07-22 | ||
| US07/223,277 US5043322A (en) | 1988-07-22 | 1988-07-22 | Cyclic GRF analogs |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI893532A0 FI893532A0 (fi) | 1989-07-21 |
| FI893532A FI893532A (fi) | 1990-01-23 |
| FI91074B true FI91074B (fi) | 1994-01-31 |
| FI91074C FI91074C (fi) | 1994-05-10 |
Family
ID=22835815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI893532A FI91074C (fi) | 1988-07-22 | 1989-07-21 | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5043322A (fi) |
| EP (1) | EP0352014B1 (fi) |
| JP (1) | JP2739910B2 (fi) |
| KR (1) | KR0138907B1 (fi) |
| AT (1) | ATE103609T1 (fi) |
| DE (1) | DE68914205T2 (fi) |
| DK (1) | DK355889A (fi) |
| ES (1) | ES2055792T3 (fi) |
| FI (1) | FI91074C (fi) |
| IE (1) | IE892378L (fi) |
| IL (1) | IL90766A0 (fi) |
| NO (1) | NO892970L (fi) |
| ZA (1) | ZA895050B (fi) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU662731B2 (en) * | 1991-04-09 | 1995-09-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Growth hormone releasing factor analogs |
| US5262519A (en) * | 1991-05-15 | 1993-11-16 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs XI |
| US5371070A (en) * | 1992-11-09 | 1994-12-06 | The Salk Institute For Biological Studies | Bicyclic GnRH antagonists and a method for regulating the secretion of gonadotropins |
| US6008058A (en) * | 1993-06-18 | 1999-12-28 | University Of Louisville | Cyclic peptide mixtures via side chain or backbone attachment and solid phase synthesis |
| US5639598A (en) * | 1994-05-19 | 1997-06-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method and kit for identification of antiviral agents capable of abrogating HIV Vpr-Rip-1 binding interactions |
| US5780220A (en) * | 1994-05-19 | 1998-07-14 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for inhibiting HIV replication |
| US5942489A (en) * | 1996-05-03 | 1999-08-24 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | HGH-RH(1-29)NH2 analogues having antagonistic activity |
| CA2375502A1 (en) * | 1999-06-23 | 2000-12-28 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Novel pyrrhocoricin-derived peptides, and methods of use thereof |
| US7015309B1 (en) | 1999-06-23 | 2006-03-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Pyrrhocoricin-derived peptides, and methods of use thereof |
| CA2939778C (en) | 2007-01-31 | 2019-01-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stabilized p53 peptides and uses thereof |
| US8592377B2 (en) | 2007-03-28 | 2013-11-26 | President And Fellows Of Harvard College | Stitched polypeptides |
| WO2012021874A1 (en) | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Aileron Therapeutics, Inc. | Peptidomimetic macrocycles with thioether linkers |
| CA2822442C (en) | 2010-12-22 | 2021-03-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Cyclic crf antagonist peptides |
| MX358886B (es) * | 2011-10-18 | 2018-08-31 | Aileron Therapeutics Inc | Macrociclos peptidomimeticos. |
| CA2862038C (en) | 2012-02-15 | 2021-05-25 | Aileron Therapeutics, Inc. | Peptidomimetic macrocycles |
| US8987414B2 (en) | 2012-02-15 | 2015-03-24 | Aileron Therapeutics, Inc. | Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles |
| WO2014071241A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Aileron Therapeutics, Inc. | Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof |
| CN112245565A (zh) | 2014-09-24 | 2021-01-22 | 艾瑞朗医疗公司 | 拟肽大环化合物及其用途 |
| WO2016154058A1 (en) | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Aileron Therapeutics, Inc. | Peptidomimetic macrocycles and uses thereof |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4595676A (en) * | 1983-04-26 | 1986-06-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Rat hypothalamic GRF |
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| US4518586A (en) * | 1983-01-13 | 1985-05-21 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs III |
| US4626523A (en) * | 1983-09-13 | 1986-12-02 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs II |
| US4528190A (en) * | 1983-10-25 | 1985-07-09 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs IV |
| US4661472A (en) * | 1985-05-09 | 1987-04-28 | The Salk Institute For Biological Studies | GnRH antagonists IX |
| US4734399A (en) * | 1985-08-06 | 1988-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| US4689318A (en) * | 1985-08-29 | 1987-08-25 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs |
| US4784987A (en) * | 1987-01-13 | 1988-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs VI |
| IL84758A (en) * | 1987-01-13 | 1992-03-29 | Salk Inst For Biological Studi | Peptides stimulating the release of pituitary growth hormone in fish and amphibians,and pharmaceutical compositions containing them |
| EP0307860B1 (en) * | 1987-09-18 | 1994-06-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Cyclic GRF-analogs |
-
1988
- 1988-07-22 US US07/223,277 patent/US5043322A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-27 IL IL90766A patent/IL90766A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1989-07-03 ZA ZA895050A patent/ZA895050B/xx unknown
- 1989-07-13 AT AT89307089T patent/ATE103609T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-13 EP EP89307089A patent/EP0352014B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-13 DE DE68914205T patent/DE68914205T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-07-13 ES ES89307089T patent/ES2055792T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-18 DK DK355889A patent/DK355889A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-07-20 NO NO89892970A patent/NO892970L/no unknown
- 1989-07-21 FI FI893532A patent/FI91074C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-07-21 IE IE892378A patent/IE892378L/xx unknown
- 1989-07-21 KR KR1019890010373A patent/KR0138907B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-07-24 JP JP1191231A patent/JP2739910B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL90766A0 (en) | 1990-01-18 |
| FI91074C (fi) | 1994-05-10 |
| EP0352014B1 (en) | 1994-03-30 |
| EP0352014A2 (en) | 1990-01-24 |
| US5043322A (en) | 1991-08-27 |
| KR0138907B1 (ko) | 1998-04-30 |
| NO892970L (no) | 1990-01-23 |
| FI893532A0 (fi) | 1989-07-21 |
| IE892378L (en) | 1990-01-22 |
| DE68914205D1 (de) | 1994-05-05 |
| JPH0269499A (ja) | 1990-03-08 |
| EP0352014A3 (en) | 1991-07-03 |
| DK355889D0 (da) | 1989-07-18 |
| JP2739910B2 (ja) | 1998-04-15 |
| NO892970D0 (no) | 1989-07-20 |
| KR910002900A (ko) | 1991-02-26 |
| FI893532A (fi) | 1990-01-23 |
| ES2055792T3 (es) | 1994-09-01 |
| ZA895050B (en) | 1990-04-25 |
| DE68914205T2 (de) | 1994-07-07 |
| DK355889A (da) | 1990-01-23 |
| ATE103609T1 (de) | 1994-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| FI88402C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger | |
| CA1243016A (en) | Human grf peptide analogs | |
| FI91074B (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi | |
| US4626523A (en) | GRF analogs II | |
| US5262519A (en) | GRF analogs XI | |
| FI87080B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av grf -analoger. | |
| US4728726A (en) | GRF analogs IIIb | |
| US5002931A (en) | GRF analogs VII | |
| JP2974254B2 (ja) | Ｇｒｆ類似体ｖｉｉａ | |
| EP0274916A2 (en) | GRF analogs | |
| CS276972B6 (en) | Peptides, process of their preparation and pharmaceutical containing thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THE SALK INSTITUTE FOR BIOLOGICAL |