FI91074C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi - Google Patents

Description

i 91074

Menetelmå terapeuttisesti kåyttokelpoisen rengasrakenteen sisaltavan GRF-analogin valmistamiseksi Tåmå keksinto liittyy ihmisten ja inuiden elainten 5 aivolisåkkeen toimintaan vaikuttaviin peptideihin. Tåmå keksinto liittyy erityisesti peptideihin, jotka lisaåvåt aivolisakkeen kasvuhormonin vapautumista.

Fysiologien tiedossa on ollut jo pitkåån, ettå hy-potalamus (våliaivojen pohjaosa) ohjaa aivolisakkeen etu-10 lohkon eritystoimintoja erittåmållå tiettyja aineita, jotka kiihdyttåvat tai ehkåisevåt kunkin aivolisåkehormonin eritystå. Hypotalamuksen tuottama ehkåisevå tekija kuvat-tiin vuonna 1972 kasvuhormonin (GH) eritysta ehkåisevåna somatostatiinina. Ihmisen haimasta peråisin olevat vapaut-15 tamistekijat, joiden havaittiin lisåavåan aivolisakkeen GF:n vapautumista, eristettiin ihmisen haimakasvainuut-teista, puhdistettiin, luonnehdittiin, syntetisoitiin ja testattiin vuonna 1982. Kummatkin naista aivolisakkeen eritystoimintaan vaikuttavista tekijoista on pystytty val-20 mistamaan totaalisynteesillå ja rakenteeltaan luonnossa esiintyviå aineita vastaavat aineet on valmistettu syn-teettisesti. Ihmisen aivolisakkeen GH:a vapauttavalla te-kijalla on tåsmålleen tåma sama rakenne, minkå vuoksi jål-jempånå kåytetåån termiå hGRF.

25 Tåsså tyosså on valmistettu sellaisia synteettisiå polypeptidejå, jotka vapauttavat GH:a viljellyistå aivoli-såkesoluista, joilla on lisååntynyt vastustuskyky kehossa tapahtuvalle entsymaattiselle hajoamiselle, ja jotka oso-ittavat tehon hyvin huomattavaa kohoamista. Uskotaan, ettå 30 nåmå edulliset ominaisuudet johtuvat siitå, ettå peptidit ovat rengasrakenteisia, mistå aiheutuu parempi pysyvyys. Nåillå peptideillå on rengasrakenteen muodostava sidos mieluummin paikoissa 25 ja 29. Tåmå sidos on mieluummin joko D-Cys tai L-Cys -ryhmistå muodostuva kahden kysteii-35 niryhmån vålinen disulfidisidos. Rengasrakenteen muodostava sidos voi olla vaihtoehtoisesti nåiden kahden ryhmån 2 v&linen amidisidos aminosivuketjun ja karboksyylisivuket-jun kesken. Paikan 15 substituenttl on mieluummin Ala tal β-Ala, Nle on mieluummin paikassa 27. Paikan 8 substitu-entteina voivat mybs olla Lys, Arg, Ser, Glu tal Asp. Pep-5 tideissM vol olla paikassa 1 yksi seuraavista ryhmista: Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ja D-His, ja tama ryhma voi vaihtqehtoisesti sisaitaa metyy-lisubstituentin joko alfa-hiilessa tai alfa-aminoryhmassa. Alfa-aminoryhma voidaan my6s poistaa (des-amino); tai al-10 fa-aminoryhma voidaan my6s asyloida, mieluummin asetyylil-ia (Ac) tai formyylilia (For). Peptideilia voi vaihtoeh-toisesti olla D-Ala, NMA tai D-NMA paikassa 2 ja/tai D-Asp paikassa 3 ja/tai Arg paikassa 12 ja/tai Phe tai D-Tyr paikassa 10. Niilia voi mybs olla D-Met tai Nva tai muita 15 ryhmia Met:n tai Nle:n sijasta paikassa 27 ja/tai Asn voi olla paikassa 28. Ryhmat paikoissa 13 ja 22 voivat olla mitka tahansa seuraavista: Leu, Ile, Ala ja Val.

KeksinnOn mukaisiin farmaseuttisiin valmisteisiin kuuluvat sellaiset analogit, jotka ovat suunnilleen 29-44 20 ryhmån pituisia, tai minka tahansa n&iden myrkyttOmat suo-lat tehtyna dispersioksi farmaseuttisesti tai eiainiaakin-nailisesti hyvaksyttavaan nesteeseen tai kiinteaan kanta-ja-aineeseen. Tållaisia farmaseuttisia valmisteita voidaan kayttaa seka ihmisten etta eiainten kliinisesså laaketie-25 teessa annettavaksi terapeuttisiin tarkoituksiin, ja myOs diagnostisesti. Lisaksi niita voidaan kayttaa lisaamaan tasaiampOisten eiainten kasvua siipikarja mukaanlukien, ja kasvatettaessa vaihtolåmpOisia eiainlajeja vedessa, esim. kaloja, ankeriaita jne.

30 Peptidien kuvaamiseen kaytetty nimistb on teoksessa

Schroder & Lubke, "The Peptides", Academic Press (1965) esitetyn mukainen, missa normaalin esitystavan mukaan N-paan aminoryhma on vasemmalla ja C-paan karboksyyliryhma oikealla. Luonnollisella aminohapolla tarkoitetaan ylei-35 sia, luonnossa esiintyvia valkuaisaineiden aminohappoja,

II

91074 3 jotka kasittavat aminohapot Gly, Ala, Val, Leu, lie,

Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe,

Tyr, Pro, Trp ja His. Nle tarkoittaa norleusiinia ja Nva norvaliinia. Jos aminohapporyhmaiia on isomeereja, kysees-5 sa on aminohapon L-muoto, ellei toisin osoiteta. Pienelia kirjaimella alkavaa versiota kaytetaan tarkoittamaan sita, etta kyseessa voi olla joko D- tai L- isomeeri, esim. cys tarkoittaa D-Cys tai L-Cys; orn tarkoittaa D- tai L-orni-tiinia; dab tarkoittaa D- tai L- alfa, gamma-diaminobutyy-10 rihappoa; dap tarkoittaa D- tai L- alfa, -diaminopropioni- happoa; ja abu tarkoittaa alfa-aminovoihappoa. D-NMA tarkoittaa alaniinin D-isomeeria, missa alfa-aminoryhma on substituoitu metyyliryhmaiia; samoin NMT tarkoittaa N-me-tyylityrosiinia, jota myOs merkitaan kirjainyhdistelmaiia 15 NaMeTyr.

Tassa keksinnOssa on valmistettu yleisessa muodossa ilmoitettuna jakson (I) mukaiset synteettiset peptidit: (B)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-H13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-R21-R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-R29-20 Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43- R44, missa Ri on Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His tai D-His; B on H, C*Me, N*Me, desamino, Ac tai For; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; R3 on Asp tai D-Asp; Re on Ser, Asn, Lys, Arg, Asp tai Gin; R10 on Tyr, 25 D-Tyr tai Phe; R12 on Arg tai Lys; R13 on lie, Val, Leu tai Ala; R15 on Gly, Ala tai β-Ala; R18 on Ser tai Tyr; R2i on Lys, D—Lys, Arg tai D—Arg ' **22 on Leu, lie, Ala tai Val; R24 on Gin tai His; R25 on cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab tai dap; R27 on Met, D-Met, Ala, Nle, lie. Leu, 30 Nva tai Val; R28 on Asn tai Ser; R29 on cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab tai dap; R34 on Ser tai Arg; R38 on Arg tai Gin; R39 on Gly tai Arg; R40 on Ala tai Ser; R42 on Phe tai Ala; R43 on Asn tai Arg; R44 on luonnollinen aminohap-po, kuten Leu tai Val; edellyttaen kuitenkin, etta mika 35 tahansa C-paan jakso, joka alkaa ryhmasta R44 ja jatkuu 4 ryhmåan I^g asti, voidaan poistaa. Kun R25 on cys tai abu niin R2g on cys tai abu; kun R2g on asp tai glu niin sil-loin R2g on orn, lys, dab tai dap ja pain vastoin. C-paas-sa olevan aminohapporyhman karboksyyliosa vol olla mika 5 tahansa seuraavista ryhmista: -COOR, -CRO, -CONHNHR,- CON(R)(R') tai -CH2OR, jossa R ja R' on alempi alkyyli, fluoro-alempi alkyyli tai vety; metyyli, etyyli ja propyyli ovat etusijalla olevia alempia alkyyliryhmia.

N-paasta ryhmaan 29 asti ulottuvat fragmentit ovat 10 biologiselta teholtaan hyvia aiheuttamaan aivollsakkeen GH:n vapautumisen, ja sellaiset biologisesti aktliviset 29 tai 32 ryhman pituiset fragmentit, joilla C-paana on amidi tai substituoitu amidi, ovat eniten etusijalla. Erås ryhma erityisen etusijalla olevia peptideja ovat kaavan 15 (B )R1-R2-Rg-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-R13-Leu-

Rl5-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-R21-R22-Leu-His-R25-Ile-R27-Asn-R29-NH2 mukaisia, missa R^ on Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His tai D-His; B on H, CaMe, NaMe, desamino, Ac tai For; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; R^ 20 on Asp tai D-Asp; R^ on Ile, Val, Leu tai Ala; R^g on Gly, Ala tai β-Ala; R21 on Lys, D-Lys, Arg tai D-Arg; R22 on Leu, Ile, Ala tai Val; R2g on cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab tai dap; R27 on Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva tai Val; R2g on cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab tai dap. 25 Kun peptidin aminohapporyhmia on 40 tai enemmån, mikaan C-paan ryhmista ei ole selvåsti muita enemman etusijalla.

Peptidit syntetisoidaan tarkoitukseen sopivalla menetelmaiia, kuten yksinomaan kiintean faasin menetelmil-ia, osittaisella kiintean faasin menetelmilia, fragmentti-30 kondensaatiolla tai klassisella liuoskytkennaiia. Viime-aikoina kehitettya yhdistelma-DNA tekniikkaa voidaan kayt-taa valmistettaessa ainoastaan luonnollisia aminohappoja sisaitava analogin osa, joka voitaisiin sitten liittaa lyhyeen N- tai C- paan peptidiin. Esimerkiksi yksinomaan 35 kiintean faasin menetelmat on esitetty oppikirjassa "Solid-

II

91074 5

Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co.,

San Francisco, 1969, ja esimerkkeja niistS liiytyy Vale': lie ja muille mybnnetyssa US-patentissa 4105603, 8. elo-kuuta 1978. Klassinen liuossynteesi kuvataan yksityiskoh-5 taisesti oppikirjassa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch (toimit-taja) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Lansi-Saksa. Synteesin fragmenttikondensaatiomenetelmasta on esimerkkeja US-patentissa 3972859 (3. elokuuta 1976). Muista kay-10 tettavissa olevista synteeseista uvat esimerkkeina US-pa-tentit 3842067 (15. lokakuuta 1974) ja 3862925 (28. tammi-kuuta 1975).

Yhteista tailaisille kemiallisille synteeseille on erilaisten aminohapporyhmien pysymåtttimien sivuketjuryhmi-15 en suojaaminen sopivilla suojaavilla ryhmilia, jotka esta-vat kemiallisen reaktion tapahtumisen kyseisessa kohdassa siihen saakka kunnes ryhma lopullisesti poistetaan. Yhteista on usein mytts aminohapossa tai fragmentissa olevan alfa-aminoryhman suojaaminen silloin, kun tassa kokonai-20 suudessa reagoivana ryhmana on karboksyyliryhma, ja sita seuraava valikoiva alfa-aminosuojaryhmån poisto kyseisessa paikassa tapahtuvan mydhemman reaktion mahdollistamiseksi. T3man mukaisesti on tavallista, etta yhtena synteesin vai-heena tuotetaan vaiivaiheen yhdiste, joka sisaitaa kaikki 25 peptidiketjussa halutussa jarjestyksessa sijaitsevat ami- nohapporyhmat tarkoituksenmukaisiin ryhmiin liitettyine sivuketjuja suojaavine ryhmineen.

Kun tåman perusteella kaytetaan tailaisia kemial-lisia synteeseja tåmån keksinnbn peptidien valmistamiseen, 30 syntyy kaavan (II): (X1)(B)R1(X tai X2)-R2-R3(X3)-Ala-Ile-

Phe-Thr(X4) -Re( X8) -Ser(X4) -R10( X2) -Arg( X6) -R12( X6 tai X7)-R13-Leu-R15-Gln( X5) -Leu-R18( X2) -Ala-Arg( X6) -R21 (X6 tai X7)-R22-Leu-R24 (X tai X5)-R25 (X8)-Ile-R27-R28 (X4 tai X5)-R29(X8)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 tai X6)-Asn(X5)-35 _ -. f“ 6

Gin(X5) -Glu (X3) -R38 (X6 tai X5 )-R39(X6)-R40(X2 )-Arg(X6 )-R42-R43(X5 tai X6)-R44(X5)-X10 mukaisia vaiituotteita.

X1 on joko vety tai alfa-amino -suojaryhma. Xl:n mahdolliset alfa-amino -suojaryhmat ovat sellaisia, joiden 5 tiedetaan entuudestaan soveltuvan vaiheittaiseen polypep-tidisynteesiin. x2:na kaytettavaksi kelpaavien alfa-amino-suojaryhmien luokkien joukkoon kuuluvat (1) aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmat, kuten fluorenyylimetyyliok-sikarbonyyli- (Fmoc-), bentsyylioksikarbonyyli- (Z-) ja 10 substituoitu Z-, kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli-, ja p-nitrobentsyylioksikarbonyyli-, p-bromibentsyylioksi-karbonyyli-, ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyliryhma; (2) alifaattiset uretaanisuojaryhmat, kuten t-butyylioksikar-bonyyli- (BOC-), di-isopropyylimetyylioksikarbonyyli-, 15 isopropyylioksikarbonyyli-, etoksikarbonyyli-, allyyliok- sikarbonyyliryhma; ja (3) sykloalkyyliuretaanityyppiset suojaavat ryhmåt, kuten syklopentyylioksikarbonyyli-, ada-mantyylioksikarbonyyli- ja sykloheksyylioksikarbonyyliryh-ma. Eniten etusijalla oleva alfa-amino -suojaryhma on BOC, 20 jopa silloin, kun NaMe-substituoitua ryhmaa kaytetaan pai- kassa 1; tietenkin X1 on H, kun B on desamino-tai N*Me -ryhma.

X on vety tai His:n imidatsolitypen suojaryhma, kuten Tos -ryhma.

25 X2 voi olla sopiva suojaryhma Tyr:n fenolihydrok- syyliryhmaile, kuten tetrahydropyranyyli-, tert-butyyli-, trityyli-, Bzl-, CBZ-, 4Br-CBZ- ja 2,6-diklorobentsyyli-(DCB)ryhma. Etusijalla oleva suojaryhma on 2,6-dikloori-bentsyyliryhma. X2 voi olla vety, mika tarkoittaa, etta 30 tassa paikassa sijaitsevassa aminohapporyhmassa ei ole sivuketjun suojaryhmaa.

X3 on vety tai sopiva esterin muodostava suojaryhma Asp: n tai Glu:n karboksyyliryhmaile, kuten bentsyyli-(OBzl-), 2,6-diklooribentsyyli-, metyyli- ja etyyliryhma. 35 X4 voi olla sopiva suojaryhma Thr:n tai Ser:n hyd- ii 91074 7 roksyyliryhmaile, kuten asetyyli-, bentsoyyli-, tert-bu-tyyli-, trityyli-, tetrahydropyranyyli-, Bzl-, 2,6-dikloo-ribentsyyli-, ja CBZ ryhma. Suojaryhma on mieluiten Bzl -ryhma. X4 voi olla vety, mika tarkoittaa sita, etta hydrok-5 syyllryhmassa el ole suojaryhmaa.

X5 on vety tal soplva suojaryhma Asn:n tal Gln:n sivuketjun amidoryhmaile. Se on mieluiten ksantyyliryhma (Xan).

X6 on soplva suojaryhma Arg:n guanidoryhmaile, kuten 10 nitro-, Tos-, CBZ-, adamantyylioksikarbonyyli- ja BOC -ryhma tai on vety.

X7 on vety tai soplva suojaryhma Lys:n sivuketjun aminoryhmaile. Hyvia esimerkkeja sopivista sivuketjun ami-nosuojaryhmista ovat 2-klorobentsyylioksikarbonyyli- (2-15 C1-Z-), Tos-, t-amyylioksikarbonyyli- ja BOC- ryhma.

X8 on suojaryhma Cys:n sulfhydryyliryhmaile, mieluu-mmin p-metoksibentsyyli- (MeOBzl-), p-metyylibentsyy- li-, asetamidometyyli-, trityyli- tai Bzl- ryhma; tai soplva suojaryhma aminosivuketjulle, joka voidaan poistaa ilman, 20 etta samanaikaisesti poistettaisiin suojaryhmd X7, esim.

Fmoc -ryhman tapainen emaksessa vapautuva ryhma; tai sopi-va vapautuva suojaryhma karboksyylisivuketjulle, joka voidaan poistaa ilman, etta samanaikaisesti poistetaan suojaryhma X3, esim. OFm:n (fluorenyylimetyyliesterin) kaltainen 25 emaksessa vapautuva ryhma; tai on suora sidos ryhmien va-lilia paikoissa 25 ja 29, silloin kun rengasrakenne johtuu karba- tai dikarbasidoksesta.

X9 on vety tai edelia yleisesti maaritelty sopiva sivuketjun suojaryhma.

30 Met voidaan vaihtoehtoisesti suojata hapella, mutta mieluummin jatetaan suojaamatta.

Sivuketjun aminosuojaryhman valinta ei ole ratkai-seva, paitsi etta yleensa valitaan sellainen ryhma, jota ei poisteta alfa-aminosuojaryhman suojauksen poiston yh-35 teydessa synteesin aikana. Kuitenkaan joillekin aminoha-poille, esim. His:Ile, suojaus ei ole yleensa tarpeellista 8 sen jaikeen, kun sidos on valmis, ja suojaryhmat voivat olla samat.

X10 on sopiva suojaava ryhma C-paan karboksyyliryh-mSlle, kuten esterin muodostava ryhma X3, tai on kiinnitys-5 sidos, jota kaytetaan kiintedn faasin synteesissS sidoksen aikaansaamiseksi kiinteaan kantajahartsiin, tai on des-X10, missa tapauksessa C-paan ryhmana on karboksyylin sisaitava ryhma, joka on edelia tehtyjen maarittelyjen mukainen Y. Kun kaytetaan kiinteaa kantajahartsia, se voi olla mika 10 tahansa entuudestaan tunnettu kantaja, kuten sellainen, jolla on kaava: -0-CH2-kantajahartsi, -NH-bentshydryyliami-ini(BHA)kantajahartsi tai -NH-parametyylibentshydrylamii-ni(MBHA)kantajahartsi. Kun halutaan kayttaa substituoima-tonta amidia, kaytetaan mieluummin BHA- tai MBHA -hartsia, 15 koska irroitus muodostaa amidin suoraan. Jos halutaan kay-taa N-metyyliamidia, se voidaan saada N-metyyli-BHA-hart-sista. Jos halutaan kayttaa muita substituoituja amideja, voidaan kayttaa apuna patenttijulkaisua U.S. Patent No. 4569967, ja, jos muita kuin vapaita happoryhmia halu-taan 20 kayttaa C-paassa, voidaan mieluummin syntesisoida peptidi kayttamana klassisia menetelmia, kuten Hoyben-Weylin op-pikirjassa esitetaan.

Jos B on esimerkiksi asetyyliryhma, lopullisessa kaavassa on mahdollista kayttaa sita X1 -suojaryhmana mille 25 tahansa aminohapolle, joka on paikassa 1; kuitenkin sen seurauksena voi tapahtua rasemisoituminen, joka tekee kyseisen suojauksen vahemman halutuksi. Reaktion annetaan tapahtua mieluiten siten, etta peptidi on hartsissa (alfa-aminoryhman suojauksen poiston jaikeen sivuketjuryhmien 30 pysyessa suojattuina), esim. antamalla taman reagoida etikkahapon kanssa disykloheksyylikarbodi-imidin (DCC) lasna ollessa tai mieluummin etikkahapon anhydridin kanssa, tai jonkun muun entuudestaan tunnetun reaktion avulla.

vaiituotteen kaavassa ainakin yksi X-ryhmista on 35 suojaryhma tai sitten X10 -ryhmaan sisaltyy kantajahartsi.

II

91074 9 Tåten keksintd tarjoaa menetelman myds mulden haluttujen peptidien valmistamiseksi suorittamalla seuraavat vaiheet: (a) alnakin yhden suojaavan ryhmSn sisaitavån ja sellaisen kaavan (II) mukalsen peptidin valmistaminen, missa X, X1, 5 X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9 ovat kukin joko vety tal suojaryhmS ja X10 on joko suojaryhmå tal kantajahartslin kiinnittymista vaiittava sidos tal se on des-X10, missa tapauksessa C-paan ryhmana vol olla haluttu karboksiryhma; (b) suojaryhman tal -ryhmien tal kytkevan sidoksen pilkko-10 minen kaavan (II) mukalsesta peptidista; (c) joko ennen valhetta (b) tal taman jaikeen suoritettava ryhmien R25:n ja R29:n vaiisen rengasrakenteen muodostavan sidoksen val-mistus ellei tata jo ole; ja (d) haluttaessa tuloksena olevan peptidin muuttaminen taman myrkyttdmåksi suolaksi.

15 Peptidien synteesissa kaytettavan tietyn sivuketjun suojaryhman valinnassa noudatetaan seuraavia yleisia saan-tOja: (a) suojaryhman suojaavien ominaisuuksien tulisi mieluummin sailya eika taman tulisi pilkkoutua pois sidosten muodostusolosuhteissa, (b) suojaryhman tulisi olla 20 reagenssin suhteen pysyva, ja Xan -ryhmaa lukuunottamatta, sen tulisi mieluummin olla pysyva alfa-aminoryhman pois-toon valituissa reaktio-olosuhteissa synteesin kussakin vaiheessa, ja (c) halutun aminohappojakson valmistuttua synteesissa taytyy sivuketjun suojaryhman olla poistetta-25 vissa sellaisissa reaktio-olosuhteissa, jotka eivat muut-taisi peptidiketjua halutun tuloksen vastaisesti.

Silloin kun peptideja ei valmisteta yhdistelma-DNA-tekniikalla, ne mieluiten valmistetaan kayttamaiia Merri-field'in, Am. Chem. Soc.. 85, s. 2149 (1963) yleisesti 30 esittamaa kiintean faasin synteesia, vaikkakin muita vas-taavia tunnettuja kemiallisia synteeseja voidaan kayttaa, kuten aikaisemmin on mainittu. Kiintean faasin synteesi aloitetaan peptidin C-paasta liittamaiia suojattu alfa-aminohappo sopivaan hartsiin. Tailainen lahtOmateriaali 35 voidaan valmistaa kiinnittamaiia alfa-aminohappo esterisi- 10 doksella kloorimetyloituun hartsiin tai hydroksimetyyli-hartsiin, tai amidisidoksella BHA -hartsiin tai MBHA -hartsiin. Hydroksimetyylihartsin valmistus on kuvattu teok-sessa Bodansky ja muut, Chem. Ind. (Lontoo) 38, 1597-98 5 (1966). Klorometyloituja hartseja on kaupallisesti saata- villa yhtittista Bio Rad Laboratories, Richmond, California ja Lab. Systems, Inc. Tailaisen hartsin valmistus on kuvattu teoksessa Stewart ja muut, "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), kappale 1, s. 10 1-6. BHA- ja MBHA- kantajahartsia on kaupallisesti saata- villa ja niita kaytetaan yleensa vain, kun halutulla syn-tetisoitavalla peptidilia on substituoitumaton amidi C-paassa. c-paan aminohappo, esim Asn, joka on suojattu BOCrlla tai Xan:lla, voidaan kytkea kloorimetyloituun hart-15 siin artikkelissa Chemistry Letters, K. Horiki ja muut, 165-168 (1978) esitetyn menetelmdn mukaan, kayttamaiia KF:aa DMF:ssa noin 60 °C:ssa noin 24 tunnin ajan sekoit-taen, esimerkiksi syntetisoitaessa 43 ryhman mittaista rotan GRF (rGRF) -analogin vapaata happomuotoa. BOC-suo-20 jatun aminohapon kantajahartsiin kytkemisen jaikeen pois-tetaan alfa-aminosuojaryhmå kåyttåmaiia trifluorietikkahap-poa (TFA) metyleenikloridissa tai ainoastaan TFA:a. Suo-jauksen poisto tapahtuu 0 °C ja huoneeniammOn vaiisessa lårnpOtilassa. Muita sidosten pilkkomiseen kaytettavia 25 tavallisia reagensseja, kuten HC1 dioksaanissa, ja tietty-jen alfa-amino- suojaryhmien poistamiseen kaytettavia olo-suhteita voidaan kayttaa teoksessa Schroder & Lubke, "The Peptides", 1 s. 72-75 (Academic Press 1965) kuvatuilla tavoilla.

30 Alfa-amino- suojaryhman poistamisen jaikeen jaijelle jaaneet alfa-aminoryhmasta ja sivuketjuistaan suojatut aminohapot kytketaan vaiheittain haluttuun jarjestykseen, jotta saataisiin aikaisemmin kuvattu vaiituote, tai vaih-toehtona sille, etta kukin aminohappo lisataan erikseen 35 synteesiin voidaan jotkin niista kytkea toisiinsa ennen

II

91074 11 niiden lisaamista kiinteSn faasin reaktoriin. Sopivan kyt-kentareagenssin valinta on tavanomaiseen ammattitaitoon kuuluva tehtava. Erityisen sopiva kytkentareagenssi on N, N ’-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC).

5 Peptidien kiintean faasin synteesissa kaytetyt aktivoivat reagenssit ovat peptideilia entuudestaan tunnet tuja. Esimerkkeina sopivista aktivoivista reagensseista ovat karbodi-imidit, kuten N,N'-di-isopropyylikarbodi-imi-di ja N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi.

10 Muita aktivoivia reagensseja ja niiden kayttoa on kuvattu teoksessa Schroder & Lubke, ks. ylia, kappalessa III ja teoksessa Kapoor, JN. Phar. Sci.. 59, sivut 1-27 (1970).

Kukin suojattu aminohappo tai aminohappojakso lisa-tåSn kiinteSn faasin reaktoriin noin neli- tai useampiker-15 taisena ylimåarana, ja sitoutuminen voidaan suorittaa va-liaineessa, joka on dimetyyliformamidi(DMF):CH2C12 (1:1) tai DMF tai CH2C12 yksinaan. Tapauksissa, joissa sitoutuminen on ep&t&ydellinen, sitoutumisvaiheet toistetaan en-nen seuraavan aminohapon kytkemista edeltavaa alfa-amino-20 suojaryhman poistoa. Jos synteesi suoritetaan kasin, tar-kkaillaan kussakin vaiheessa sitoutumisreaktion onnistu-mista mieluiten ninhydriinireaktion avulla, kuten artikke-lissa E. Kaiser et al.. Anal. Biochem. 34, 595 (1970) ku-vataan. Sitoutumisreaktiot voidaan suorittaa automaatti-25 sesti, kuten Beckman 990 automaattisyntesisoijaa kayttaen, ja kayttaen artikkelissa Riviel et al. Biopolymers, 1978, 17, s. 1927-1938 selostetun kaltaista ohjelmaa.

Halutun aminohappo j akson valmistuttua voidaan kayn-nistaa rengasrakenteen muodostuminen tai vapaassa happo-30 muodossa olevan peptidin saamiseksi voidaan vaiivaiheen peptidi poistaa kantajahartsista kasittelemaiia sita rea-genssilla, kuten nestemaiselia fluorivedylia, joka ei ai-noastaan irrota peptidia hartsista vaan pilkkoo pois myOs kaikki jaijelia olevat sivuketjujen suojaryhmat X, X2, X3, 35 X4, X5, X6, X7, X8, X9, ja kiinnittavan sidoksen X10 seka 12 alfa-aminosuojaryhman X1, mikali tata oli kaytetty. Jos jaksoon sisaltyy Met, niin BOC-ryhma poistetaan mieluiten ensin kayttamaiia trifluorietikkahappo(TFA)/etaaniditiolia ennen kuin peptid! irrotetaan hartsista HF:11a mahdollisen 5 S-alkyloitumisen estamiseksi. Kun irrottamiseen kaytetaan fluorivetya, lisåtaan reaktioastiaan yhta tai useampaa sivutuotteiden sitojaa, kuten anisolia, kresolia, dimetyy-lisulfidia tai metyylietyylisulfidia.

Cys-ryhmien vaiista sidosta kaytettaessa rengasra-10 kenteen muodostuminen kaynnistetaan mieluummin suoraket-juisella peptidilia, painvastoin kuin silloin, kun pepti-din rengasrakenne muodostetaan taman ollessa osana pepti-di-hartsikompleksia. Tailaisen disulfidirengasrakenteen muodostavan sidoksen aikaansaamiseksi voidaan taysin suo-15 jattu peptidi irrottaa hydroksimetyloidusta tai klorome- tyloidusta hartsista ammonolyysilia entuudestaan hyvin tunnetulla tavalla, jotta saataisiin syntymaan taysin suo-jattu amidivaiituote, joka sen jalkeen sopivalla tavalla tehdaan rengasrakenteiseksi ja suojaukset poistetaan; 20 vaihtoehtoisesti niin suojauksen poistaminen kuin peptidin irrottaminen bentshydryyliamiinihartsista voivat tapahtua 0 eC:ssa fluorivetyhapossa. Joissakin valmistusmenetelmis-sa rengasrakenteen muodostaminen voidaan toteuttaa osit-tain suojatun peptidin ollessa hartsiin kiinnittyneena, 25 kuten esitetaan teoksessa A.M. Felix ja muut, Peptides, Proceedings of the Tenth American Peptide Symposium, tou-kokuu 1987, 465-467 (1988), missa kaytetaan amidirengasra-kenteen muodostavaa sidosta. Tailainen menetelma luo te-hokkaasti amidirengasrakenteen muodostavan sidoksen kahden 30 halutun sivuketjun vaiille samalla kun muut ryhmat, kuten Asp, Glu, ja/tai Lys sailyttavat sivuketjujensa suojauksen.

Rengasrakenteen muodostusvaihe GRF-peptidianalo-geilla riippuu tietenkin paikoissa 25 ja 29 olevien ryhmi-35 en vaiille halutun liitoksen tyypista. Kun D- tai L-Cys -ryhmat ovat seka paikassa 25 etta 29, on usein kaytannOl-

II

91074 13 lisempaa tehda rengasrakenteen muodostusvaihe hartsista irrottamlsen ja kaikkien peptidin suojaryhmien poiston jaikeen. Peptidin rengasrakenteinen muoto saadaan hapet-tamalla ferrisyanidiliuosta kayttamaiia, mieluiten artik-5 kelissa Rivier ja muut, Biopolymers, Vol. 17 (1978), 1927-38 kuvatulla tavalla, tai hapettamalla ilmassa tai jonkun muun tunnetun menetelman mukaan.

Kun rengasrakenne muodostetaan amidisidoksen våli-tykselia paikan 25 ryhmån sivuketjun aminoryhmån ja paikan 10 29 ryhman sivuketjun karboksyyliryhman vålille (mika voi olla parempi) tai pain vastoin, on edullisempi syntetisoi-da suojattu peptidi MBHA- tai BHA- hartsiin ja muodostaa kyseisen karboksyylihapposivuketjun bentsyyliesterista hydratsidijohdannainen peptidin ollessa yha kiinni hart-15 sissa ja sitten antaa taman reagoida sellaisen aminosivu-ketjun kanssa, josta suojaukset on valikoivasti poistettu, kuten 28. huhtikuuta 1987 myttnnetyssa US-patentissa 4661472 on esitetty. Rengasrakenteen muodostaminen tehdaan mieluiten kayttamaiia emaksessa vapautuvaa suojaryhmaa, 20 esim. OFm -ryhmåå, amidisidossiltaan osallistuvan ryhmån karboksyylisivuketjulle ja kayttamaiia Fmoc -ryhmaa suoja-ryhmana toisen osallistuvan ryhman aminosivuketjulle. Al-fa-amino -suojaryhma paikan 1 ryhmSsså, joka on tarkoitus asyloida tai jattaa asyloimatta, ja kaikki muut sivuket-25 jujen suojaryhmat pysyvat paikoillaan samalla kun kaksi emakselia vapautuvaa ryhmaa poistetaan kayttamaiia piperi-diinia tai tata vastaavaa reagenssia. Taman valikoivan poiston jaikeen rengasrakenteen muodostumisen aiheuttava reaktio suoritetaan BOP-kåsittelylia, jonka vaikutuksesta 30 amidisidos syntyy olennaisesti taydellisena. Rengasrakenteen muodostamisen jaikeen peptidin suojaukset poistetaan kokonaan ja tama irrotetaan hartsista HF:n tapaista reagenssia kayttamaiia. Vaihtoehtolsesti BOC-suojaryhma voi-daan poistaa ensin kayttamaiia TFA:a.

35 Rengasrakenteen muodostaminen peptideille tailais- ten amidisidosten avulla voidaan vaihtoehtoisesti suorit- 14 taa kayttamaiia apuna US-patentteja 4115554 (19. syyskuu-ta 1978); 4133805 (9. tammikuuta 1979); 4140767 (20. hel-mikuuta 1979); 4161521 (17. heinakuuta 1979); 4191754 (4. maallskuuta 1980); 4238481 (9. joulukuuta 1980); 4244947 5 (13. tanunlkuuta, 1981); ja 4261885 (14. huhtlkuuta 1981).

Nimitykselia dicarba viitataan GRF -analogeihin, jotka palkoissa 25 ja 29 sisaitavat modifioituja kysteii-niryhmia vastaavat ryhmat, joissa disulfidisidos on kor-vattu -CH2- -sidoksella. Jos alnoastaan yksl sulfhydryyli-10 ryhmista on korvattu CH2-ryhmaiia, siihen viitataan nimi-tykselia karba, eslm. [karba25, Cys29]-GRF. Lopullisen pep-tidin kannalta katsottuna paikka, jossa muuten ollsl Cys-ryhma slsaitaakln sen sijaan alfa-aminovoihappo (aBu-) -ryhman. Valmlstettaessa peptideja, joilla on tailalnen 15 karba-tal karba-S-liitos, kaytetaan mleluummln US-paten- tlssa 4161521 esitettya menetelmaa (kyselnen patenttijul-kaisu on llltetty tahan mukaan viitteena), niin etta kaa-van II vaiituotteessa X® on suora sidos tahan toiseen ryh- maan.

20 Seuraava esimerkki I esittaa etusijalla olevan me- netelman peptidien syntetisoimiseksi kiintean faasin mene-telmaiia. On tietysti huomattava, etta vastaavasti pidem-man peptidin synteesi suoritetaan samalla tavalla ainoas-taan lisaamaiia tarvittava maara aminohappoja ketjun C-25 paahan. Nykyaan vallitsee kasitys, etta biologisesti ak-tiivisten fragmenttien tulisi sisaitaa osoitettu jakso N-paassa, ja etta ryhmien lisåamista N-paahan ei pideta edullisena.

Esimerkki 1 30 Kaavan N*MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-

Arg-Arg-Ile-Leu-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Hls-D-Cys-Ile-Nle-Asn-Cys-NH2 mukaisen peptidin [N“MeTyrl, Ala15, D-Cys25, Nle27, Cys29]-rGRF(l-29)-NH2 synteesi suoritetaan vaiheittain kayttaen Beckman 990-peptidisyntetisoijaa ja 35

II

91074 15 kaupallisesti saatavilla olevaa MBHA-hartsia, kuten ylei-sestl kuvataan US-patenttijulkaisussa 4292313, Vale et al. BOC-Cys(MeOBzl):n kytkemisesså hartsiin saadaan noin 0,35 mmoolia Cys korvautumaan yhtå hartsigrammaa kohtl.

5 Suojauksen polston ja neutralisoinnin jélkeen pep- tidiketju muodostetaan vaiheittain hartsiin. Suojauksen polsto, neutralisolntl ja kunkln aminohapon lisdåminen suorltetaan yksityiskohdittain artlkkelissa RIvier, J, J. Arner. Chem. Soc., 96, 2986-2992 (1974) esitetyn menetelmSn 10 mukaan. Kaikista kSytetyista liuottimlsta poistetaan kaasu inertilia kaasulla, kuten heliumilla tal typelia kuplit-tamalla.

Suojauksen poisto suorltetaan mieluiten seuraavan aikataulun A mukaan:

15 AIKATAULU A

Reagenssi Sekoitusaika (min.) 1. 60% TFA/2% etaaniditioli 10 2. 60% TFA/2% etaaniditioli 15 20 3. IPA/1% etaaniditioli 0,5 4. Et3N (10%) CH2C12: ssa 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N (10%) CH2C12:ssa 0,5 7. MeOH (kahdesti) 0,5 25 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5

Sitoutumisreaktiot suorltetaan mieluiten seuraavan aikataulun B mukaan: 16

AIKATAULU B

Reagentti Sekoitusaika (min.)

9. DCC

10. Boc-aminohappo 50-90 5 11. MeOH (kahdesti) 0,5 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 (3 M) CHc12:ssa 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 10 16. CH2C12 0,5

Lyhyesti, kaytetaan yhdesta kahteen mmoolia BOC -suojattua aminohappoa metyleenikloridissa yhta hartsigram-maa kohti seka yksi ekvivalentti yksi molaarista DCC:ta metyleenikloridissa kahden tunnin ajan. B0C-Arg(Tos):n si-15 toutumisessa kaytetaan 50% DMF:n ja metyleenikloridin seo-sta. Bzl-eetteria kaytetaan hydroksyylisivuketjun suoja-ryhmana Ser- ja Thr -ryhmille. Asn:n tai Gln:n amidoryhma suojataan mieluiten Xan -ryhmaiia kaytettaessa DCC -sitou-tumista; suojaus voidaan kuitenkin myOs jattaa pois. p-20 nitrofenyyliesteria (ONp) voidaan myOs kayttaa Asn:n ja Gln:n karboksyylipaan aktivoimiseen, ja BOC-Asn(ONp) voidaan esimerkiksi kytkea yOn yli kayttamaiia yksi ekvivalentti H0Bt:a 50% seoksena DMF:n ja metyleenikloridin kan-ssa, missa tapauksessa DCC:ta ei lisata. 2-klooribentsyy-25 loksikarbonyylia (2C1-Z) kaytetaan suojaryhmana Lys-sivu-ketjulle. Tos -ryhmaa kaytetaan suojaamaan Arg:n guanido-ryhmaa ja His:n imidatsoliryhmaa, ja Asp:n sivuketjun kar-boksyyliryhma suojataan OBzl -ryhmaiia. MeOBzl -ryhmaa kaytetaan suojaryhmana Cys:n sulfhydryyliryhmaile. Tyr:n 30 fenolinen hydroksyyliryhma suojataan 2,6-diklooribentsyy-liryhmaiia (DCB). Synteesin lopussa on saavutettu seuraava kokoonpano: B0C-N*MeTyr (X2)-Ala-Asp (X3)-Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Ser (X4) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg( X6) -Arg( X6 )-Ile-Leu-Ala-Gln(x5) -Leu-Tyr (X2) -Ala-Arg( X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-His( X) -

II

91074 17 D-Cys(X8)-Ile-Nle-Asn(X5)-Cys(X8)-X10, missa X on Tos, X2 on DCB, X3 on OBzl, X4 on Bzl, X5 on Xan, X6 on Tos, X7 on 2C1-Z, X8 on MeOBzl ja Xl° on NH-MBHA-kantajahartsi. Xan -ryhma on voltu oslttaln tal kokonaan polstaa alfa-aminoryhmån 5 suojauksen polstoon kMytetylia TFA -kdsittelylia.

Suojauksia sisaltavdn peptidin ja kantajahartsln vålisen sidoksen pllkkomlseksl ja suojausten polstamlseksl kompleksi kaslteliaan liuoksella, jossa on 1,5 m anlsolla, 0,5 ml metyylietyylisulfldia ja 15 ml fluorivetya yhta 10 peptidl-hartsigrammaa kohtl, -20 °C:n lampiitilassa puolen tunnin ajan ja 0 eC:n lampdtllassa puolen tunnin ajan. HF poistetaan volmakkaassa tyhjiOssa, jonka jaikeen hartsi-peptidijaannOs pestaan vuorotellen kuivalla dietyylieet-terilia ja kloroformilla, sen jaikeen peptldl uutetaan 2N 15 etlkkahapon veslliuoksella, josta kaasu on poistettu, ja sitten peptid! erotetaan hartslsta suodattamalla.

Taman jaikeen peptidla hapetetaan ilmassa noln 48 tunnin ajan noln 4 eC:n lampdtilassa ja sitten viela noin 3 paivan ajan huoneeniammdssa (tal silhen asti kunnes Ell-20 man-kokeella — ks. Archives Blochem. Biophvs. 82. 1959, s. 70 — mitattu -SH on taysin havinnyt) disulfidisidoksen muodostamiseksi kysteiiniryhmien vaiille jokaisessa mole-kyylissa.

Sitten irrotettu, suojaukseton ja rengasrakenteinen 25 peptidi liuotetaan 0-5% etikkahappoon ja siile suorite-taan puhdistus, joka voi sisaitaa geelisuodatuksen hieno-jakoista Sephadex G-50 kayttaen.

Sitten peptidi puhdistetaan edelleen preparatiivi-sella tai puolipreparatiivisella HPCLrlla kuten kuvataan 30 teoksissa Rivier et al., J. of Chromatography. 288. 303-328 (1984); Rivier et al., Peptides: Structure and Biolo-oical Function. (1979) s. 125-8; ja Marki et al., J. Am.-Chem. Soc.103. 3178 (1981). Waters Assosiates prep LC500-:aan sopivat kasetit on pakattu Vydac 15-20 μ C18-Silical-35 la (300A). CH3CN:n gradientti TEAPrssa luodaan matalapaine 18 kayttOisellS Eldex -gradientintekijållS kuten artikkelissa Rivier J., J. Lig. Chromatography 1. 343-367 (1978) on ku-vattu. Kromatografisia jakeita tarkkaillaan huolellisesti HPLC:lia ja ainoastaan huomattavan puhtaiksi osoittautu-5 neet jakeet yhdistetaan. Toisistaan riippumatta puhtaudel-taan tarkistettujen puhdistettujen fraktioiden suolojen poisto tehdaån kayttamaiia CH3CN:n gradienttia 0.1% TFA:-ssa. Halutun peptidin saamiseksi otetaan kylm&kuivattavak-si keskiosasta jae, jonka puhtausaste voi olla yli 98 %. 10 Peptidi todetaan homogeeniseksi kayttamaiia ohut- levykromatografiaa ja useita erilaisia liuotinsysteemeja. Siile tehdaan erityinen kMånteisfaasi-korkeapaine-neste-kromatografia-analyysi kayttamaiia ylia kuvattua Watersin HPLC-systeemia, jossa on 0.21 x 15 cm:n pylvas taytettynå 15 5 pm Cie-silicalla, 300 Å:n huokoskoko; kaytetyt puskuri- liuokset olivat trietyyliammoniumfosfaatin vesiliuos, jonka pH oli 3.0, ja joka koostui 1.0 ml:sta HH3P04 ja 1.6 mlrsta trietyyliamiinia 1000 ml liuosta kohti, seka ase-tonitriili. Maaritys suoritettiin huoneenlammdssa. Puskuri 20 A sisalsi 5% CH3CN, kun taas puskuri B sisalsi 75% CH3CN. Virtausnopeus oli 0.6 ml minuutissa, alkaen 20% puskuria B ja suhteessa tapahtunut nousu 60 minuutin aikana saavutti 95% puskuri B:n. Retentioaika oli 34.45 minuuttia.

Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysin 25 tulokset ovat yhdenmukaiseen saadun valmisteen rakenteen kaavan kanssa, ja ne osoittavat seuraavat arvot kullekin ketjun aminohapolle: Asp(2,13), Thr(l,00), Ser(l,75),

Glu(1,06), Cys(1,83), Ala(4,00), CH3Tyr(1,17), Ile(2,71), Leu(4,33), Nle(1,28), Tyr(2,14), Phe(0,94), Lys(l,00), 30 His(l,04) ja Arg(3,20). Optinen kiertyminen mitataan valo- sahkOiselia polarimetrilia [α]£2 = -62,9±1 (c=l, 1 % etik-kahappo).

Eslmerkki IA

Esimerkki I:n synteesi toistetaan korvaamalla D-Cys 35 L-Cys:lia paikassa 25 ja korvaamalla L-Cys D-Cys:lia pai-

II

91074 19 kassa 29 kaavan NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Cys-Ile-Nle-Asn-D-Cys-NH2 mukalsen amidoidun peptidin syntetisoimiseksi. Peptidi todetaan homogeeniseksi kåyt-5 témaiia ohutlevykromatografiaa ja useita erilaisia liuo-tinsysteemeja. Se analysoidaan erityisesti kSMnteisfaasi-korkeapainenestekromatografialla kSyttårnålia ylia kuvattua Watersin HPLC-systeemia, jossa on 0,21 x 15 cm:n pylvas taytettyna 5 pm C18 -silikaa, 300A:n huokoskoko; kaytetyt 10 puskuriliuokset olivat 0,1 % trifluorietikkahapon vesi-liuos, joka koostui 1,0 ml:sta TFA 1000 ml:aa liuosta koh-ti, seka asetonitriili. Maaritys suoritettiin 37 eC:ssa. Puskuri A sisaisi 5 % CH3CN, kun taas puskuri B sisaisi 80 % CH3CN. Virtausnopeus oli 1,0 ml minuutissa, alkaen 10 % 15 puskuria B ja nousten suhteessa 30 minuutin aikana saavut-taen 95 % puskuria B. Retentioaika oli 20,68 minuuttia.

Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysin tulokset ovat yhdenmukaiset saadun valmisteen rakenteen kaavan kanssa, ja ne osoittavat, etta kullekin ketjun ami-20 nohapolle saadaan likimain kokonaislukuarvot. Optinen kierrtyminen mitataan valosåhkOiselia polarimetrilia [0]D22 = -79,2±1 (c=l, 1% etikkahappo).

Esimerkki II

Kaavan H-NaMeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-25 Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-

Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-daP-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 mukaisen 44 ryhmaa sisai-tavSn amidoidun peptidin c( 25-29) [N'MeTyr1, D-NMA2, Ala15,

Nle27, daP29]-hGRF( 1-44 )-NH2 synteesi suoritetaan vaiheit-30 tain Beckmann 990-peptidisyntetisoijaa ja MBHA-hartsia- kåyttåen esimerkin I yleiskuvauksen mukaisesti kaavan B0C-N“MeTyr(X2)-Ala-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Asn( X5) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg( X6) -Lys( X7) -Val-Leu-Ala-Gln- (X5) -Leu-Ser (X4) -Ala-Arg( X6) -Lys( X7) -Leu-Leu-Gln( X5) -Asp( OFm) -Ile-Nle-Ser 35 20 (X4)-daP( Fmoc) -Gln( X5) -Gln( X5) -Gly-Glu( X3)-Ser (X4)-Asn( X5) -Gln( X5) -Glu( X3) -Arg( X6) -Gly-Ala-Arg( X6) -Ala-Arg( X6) -Ala-Arg-(X6)-Leu-NH-MBHA-kantajahartsi mukaisen vSlituotteen saami-seksi, missa X2-X7 ovat esimerkissa annettujen maaritelmien 5 mukaisia. Valikoiva suojausten poisto ja rengasrakenteen muodostaminen suoritetaan seuraavalla tavalla.

4 g suojattua peptidyylihartsia (joka sisaltaa noin meq peptidia), 2,20 g (5 meg) BOP [bentsotriatsolyyli-N-oksitris(dimetyyliamino)fosfoniumheksafluorofosfaatti] j a 10 10 meq di-isopropyylietyyliamiinia suspendoidaan ja sekoi- tetaan kahden tunnin ajan huoneeniammOssa. Peptidihartsi suodatetaan, pestaan DMF:lia, MeOH:lla, CH2Cl2:lla ja MeOH:lla, ja lopuksi kuivataan.

4 g suojattua peptidihartsia kåsitellåån 60 %:isel-15 la TFA: 11a CH2Cl2:ssa BOC-suojaryhman poistamiseksi ja sit-ten 10-15 ml:11a tislattua HF, jossa on mukana anisolia epapuhtauksien sitojana, 0 °C:ssa 60 minuutin ajan jSljel-lS olevien suojaryhmien poistamiseksi ja peptidin irrotta-miseksi hartsista. HF poistetaan voimakkaassa tyhjidssa 20 ja peptidi saostetaan etyylieetterin anhydridin avulla.

Kiintea aine kerataan, liuotetaan 50 ml eraan CH3CN:H20 (1:1) j a kylmakuivataan. Sen j aikeen se puhdistetaan kayttamana RP-HPLC:ta, kuten esimerkissa I on kuvattu. Peptidi todetaan huomattavan puhtaaksi TLC:n ja HPLC:n 25 avulla.

Esimerkki III

KaavanH-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-His-D-Glu-Ile-Nle-Asn-Orn-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-30 Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH mukaisen peptidin c(25-29) [D-NMA2, D-Glu25, Nle27, Orn29] -rGRF( 1-43 )-OH synteesi suoritetaan vaiheittain kayttaen Beckmann 990-peptidisyntetisoijaa ja suorittaen kloorimetyloituun hartsiin tapahtuvan kiinni-tyksen alkuvaiheet aikakausjulkaisussa Chemistry Letters 35 (ks. ylia) esitetylia tavalla ja jatkamalla sen jaikeen esimerkissa II esitetyn yleiskuvauksen mukaisesti. Peptidi todetaan huomattavan puhtaaksi TLC:n ja HPLC:n avulla.

il 91074 21

Esimerkki IV

Kaavan NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Ly s-Val - Leu-Ala-Gin-Leu-Ser-Al a-Ar g - Ly s - Leu - Leu-GI η - D-Cys-Ile-Nle-Asn-Cys-NH-CH2CH3 mukaisen hGRF -analogin 5 [I^MeTyr1, Lys8, Ala15, D-Cys25, Nle27, Asn28, Cys29]-hGRF( 1-29)-NHEt synteesi suoritetaan vaiheittain kayttåm&lia Beckman 990-peptidisyntetisoijaa ja hartsia US-patentissa 4569967 kuvatulla tavalla. Suoraketjuinen peptidi poiste-taan hartsista HF-kasittelyllé ja rengasrakenteen muodos-10 taminen ja puhdistaminen tapahtuvat esimerkisså I esite-tylia tavalla. Analogi todetaan huomattavan puhtaaksi TLC:n ja HPLC:n avulla.

22

Esimerkki V

Kaavan (B)R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-R25-Ile-Nle-Asn-R29-NH2 mukaiset rGRF-analogit, joihin vii-5 tataan taulukossa I, valmistetaan k&yttaen edelia mainit-tua kiintean faasin menetelmaa.

TAULUKKO I

10 B R1 R25 R29 5 Ac His Cys aBu 6 " D-Phe aBu D-aBu

7 For Tyr Asp daP

15 8 " D-Tyr " D-daB

9 CaMe Phe daP D-Asp 10 " Met " Glu 11 " D-Met Orn " 12 Ac Leu daB D-Asp 20 13 NaMe pCl-Phe Cys D-Cys 14 Ac D-His Orn Asp 15 ·' D-Tyr daP " 16 desamino His 11 D-Glu

17 " Phe Glu daP

25

Peptidit, kuten numerot 5 ja 6 syntetisoidaan kMyt-taen apuna US-patentissa 4161521:ssa annettuja yleisia 30 ohjeita.

ii 91074 23

Esimerkki VI

rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa II, ja jotka ovat kaavan H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-Lys-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-R25-5 Ile-Nle-Ser-R29-NH2 mukaisia, valmistetaan edelia mainitun kiinteM faasi -menetelmAn avulla.

TAULUKKO II

10 R8 Rl3 R25 R29 18 Gin · Ala daP Asp 19 ·· He Orn " 20 Lys " daB Glu 15 21 " Val D-Lys Asp 22 " Leu daP " , ii <· D-Glu 23 Asn 24 " Ala daB 11 25 h lie " Asp 20 „ „ Lvs " 26 Ser

27 ·. Val D-Asp D-daP

28 Arg " Asp D“daB

29 '· Leu Glu " 30 ASP " aEu D-Cys

25 31 . · Ala Cys D_aBU

24

Esimerkki VII

rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa III, ja jotka ovat kaavan ^MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-R22_Leu-Leu-5 R^^-R^-I'le-Met-Asn-R^g-NH2 mukaisia, valmistetaan edelia mainitun kiinteSn faasin menetelmSn avulla.

TAULUKKO III

10 r21 R24 *25 *29

32 Lys His D-Asp daP

33 " " Cys Cys 15 34 D-Lys 11 " " 35 " Gin daP D-Asp 36 " " Orn Asp

37 " His Asp daP

38 Arg " " Lys 20 39 " " Glu D-Lys

40 D-Arg " " daP

41 " " daB Asp 42 Arg Gin " " 43 Lys His D-daB Glu 2g 44 " m " D-Glu

45 p-Lys M daP M

4 6 D-Arg " " Asp 47 ” Gin Cys Cys il 91074 25

Esimerkki VIII

rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa IV, ja a jotka ovat kaavan N MeTyr-R2“Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-5 Gln-R^g-Ile-R2^-Ser-R2g-Gln-Gln-Gly-Glu-R2^-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 mukaisia valmistetaan edel-lS mainitun kiintean faasin menetelmSn avulla.

TAULUKKO IV

10 R2 R25 R27 R29 R34 48 D-Ala D-Cys Nle Cys Ser 15 49 " Asp Met daB " 50 " « D-Met D-daP "

51 »i ·· Ala Orn M

52 Ala D-Asp Nle " Ar9 53 *· D-Glu He D-Orn " 20 54 " « Nle daB Ser 55 ·· » Val Lys " 56 NMA D-Glu Leu daP " 57 D-NMA Glu Nva " " 5g η ·· ” D-daP " 25 59 M " Ala D-Lys Arg 26

Esimerkki IX

rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa V, ja jotka ovat kaavan H-His-Ala-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-5 R^-ile-nle-Asn-R^-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-R44-Y mukaisia valmistetaan edelia mainitun kiintea faasin menetelmån avulla.

TAULUKKO V

10

R3 R25 R29 R44“Y

60 Asp Cys Cys NH2 , _ 61 " " aBu Val-NH, 62 D-Asp " Cys Leu-NH2

63 " " " OH

64 " " aBu NHCH2CH3 65 Asp " '· OH(asetaattisuola) 2Q 66 " aBu D-Cys NHCH3 67 " " aBu Ala-NH2 68 " Glu D-daB N(CH3)2 69 D-Asp » Orn NHNH2 7 0 " Asp daB OCH3

71 " " D-daP -CH^OH

25 *

72 ·" Cys Cys CHO

73 " " D-aBu NHCFH2 74 Asp " cys NHCF2CH3

75 " Asp D-daB OH

ii 91074 27

Esimerkki X

rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa VI, ja jotka ovat kaavan (B)Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-R22-Leu-5 Gln-R25-Ile-Nle-R2e-R29-Gln-Gln-Gly-Leu-NH2 mukaisia valmis-tetaan edell& mainitun kiinteSn faasin menetelrnSn avulla.

TAULUKKO VI

10 B R22 R25 R28 R29

76 Ac Leu Asp Asn D-daP

77 Ac " daP v Asp 78 Ac Ala D-Cys Ser Cys 79 Ac » Glu " D-Orn 80 H Val daP " Asp 81 desamino " " Asn D-Glu 82 " Ile Lys " " 83 For " D-daP " D-Asp 20 84 " ” Cys " aBu 85 NaMe Leu " Ser D-Cys 86 " " daB " Asp 87 H Ala " Asn Glu 25 28

Esimerkki XI

rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa VII, ja jotka ovat kaavan H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-R^Q-Arg-R12-He-Leu-R1g-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-5 His-F^25-Ile-Nle-Asn-R2^-NH2 mukaisia valmistetaan edella main!tun kiinteSn faasin menetelman avulla.

TAULUKKO VII

iO _ R10 R12 R15 R25 R29 88 D-Tyr Arg Ala Orn D-Glu gg i» π ·· · D-Orn Asp 90 " »' " daP’ " ^ 91 " " β-Ala " Glu 92 Tyr Lys " D—daP Asp 93 » « Gly D-Lys "

94 ti it ·« Glu D-daP

95 Phe " Ala " daB

20 96 " Arg " aBu D-Cys 97 μ it Gly 11 D—aBu 98 D-Tyr " " D-aBu cys 99 " '· β-Ala D-Orn Glu 100 " ” Ala D-Lys D-Asp 25 11 91074 29

Esimerkki XII

rGRF-analogit, joihin viitataan taulukossa VIII, ja jotka ovat kaavan H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R12~Leu~Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-5 R25 -He-Nle-Ser-R2g-NH2 mukaisia valmistetaan edellS maini- tun kiinteSn faasin menetelmån avulla.

TAULUKKO VIII

10 R13 R21 R25 R29 101 Val D-Lys Cys Cys 102 " " M aBu 15 103 " " aBu D-Cys 104 He " " D-aBu 105 " Lys " Cys 106 " " daP Glu 107 Ala " D-daB " 20 108 " " daP D-Glu 109 " " D-Orn "

110 lie » Asp daP

111 " D-Arg Glu Lys

112 " " » D-daP

25 113 Leu " D-Glu Lys 114 " Arg " D-Orn 115 ·' ” Asp D-Lys

116 Val " " daB

117 M D-Lys " D-daP

30 118 He " D-Asp daP

119 * " Cys aBu 120 " Lys " - D-Cys 121 M " daP Asp 122 Ala Arg " " 30

Verrattaessa esimerkeisså valmistettuja peptideja synteettiseen hGRF(1-40)-OH peptidiin in vitro kokeissa havaitaan niiden olevan yleensa vaikutusteholtaan GH:n eritykseen ja muihin samanlaisiin sisaisiin toimintoihin 5 tSta suurempia. Kaikkia naita peptideja voidaan pitaa biologisesti aktiivisina ja mahdollisesti hyOdyllisina aivolisakkeen GH:n vapautumista lisaavina aineina.

Tiettyjen edustavien synteettisten peptidien suh-teellisen tehokkuuden maarittamiseksi suoritetaan in vitro 10 kokeita kayttaen vakiona hGRF(1-40)-0H verrattaessa rin-nakkain taman ja syntetisoitujen analogien edustajiksi valittujen peptidien ekvimolaarisia liuoksia. Kaytetaan soluviljelmaa, joka on tehty 3-5 paivaa aikaisenunin irro-tetuista rotan aivolisakkeen soluista. Tailaisia viljel-15 mia pidetaan parhaimpina kasvuhormonin erityksen kannalta, ja niita kaytetaan vertaileviin kokeisiin, kuten on ylei-sesti kuvattu artikkelissa Vale et al., Endocrinology. 91. 562-572 (1972) ja kuten on tarkemmin kuvattu artikkelissa Vale et al., Endocrinology. 112. 1553-1555 (1983). Tes-20 tattavaa ainetta inkuboidaan 3-4 tuntia, jonka jalkeen elatusaineesta otetuista ja jatkokasitellyista nayte-eris-ta mitataan niiden sisaitaman immunoreaktiiviisen GH:n (ir GH) maara hyvin tunnetulla radioimmunomaaritykselia.

Ekvimolaaristen liuosten vertailevan kokeen tu-25 loksista kay ilmi, etta esimerkiksi peptidilia [N*Metyr,

Ala15, Cys25, Nle27, D-Cys29]-rGRF( 1-29 )-NH2 on noin kaksinker-tainen biologinen teho peptidiin hGRF(1-40)-OH verrattuna.

Hormonin erityksen tutkimiseen kaytettyjen in vitro kokeiden lisaksi in vivo kokeissa uretaanilla nukutettui-30 hin koirasrottiin ruiskutetaan suonensisåisesti synteetti- sia peptideja, jotta voitaisiin maarittaa niiden kyky lau-kaista GH:n eritys. Verinaytteita otetaan ennen ruisku-tusta ja 10, 45 ja 90 minuutin paasta sen jalkeen, ja GH -taso maaritetaan kussakin tapauksessa radioimmunomaarityk-35 selia.

91074 31

Tasta naiden synteettisten peptidien in vivo kokeesta kay ilmi, etta ne ovat biologiselta teholtaan huomattavasti parempia kuin hGRF(1-40)-OH; 1 pg:n annos esimerkin 1 pep-tidia ja 5 pg annos esimerkin IA peptidia saivat kumpikin 5 aikaan in vivo reaktion 10 minuutissa, kun taas tarvittiin 25 pg annos hGRF(1-40)-OH -peptidia vastaavan reaktion aikaansaamiseksi. Lisaksi naiden synteettisten rengasra-kenteisten peptidien vaikutus kestaa pitempaan verrattuna vastaaviin annoksiin hGRF(1-40)-OH:a, kuten kasvuhormonin 10 maarat veressa 45 minuutin kuluttua keksinnOn rengasra-kenteisten peptidien suonensisaisesta ruiskutuksesta osoittavat. Annoksia, jotka ovat 400 nanogramman ja 50 mikrogranunan vaiilia olevia annoksia painokiloa kohti, pidetaan riittavina kasvuhormonin erityksen aikaansaami-15 seksi.

Tailaiset synteettiset hGRF-analogit ja rGRF-analo-git ovat luultavasti hyddyllisia sellaisissa kayttdsovel-lutuksissa ihmisiin, joissa laakari haluaa lisata kasvuhormonin eritysta. Kasvuhormonin erityksen lisaaminen 20 tailaisilla analogeilla tulee kyseeseen potilailla, joilla on GRF:n liian vahaisesta sisaisesta tuotannosta aiheutuva taydellinen tai suhteellinen GH:n puutostila. On viela mahdollista, etta lisaantynytta GH:n eritysta ja sen ai-kaansaamaa kasvun lisaantymista voitaisiin aiheuttaa ih-25 misissa ja elaimissa, joilla on normaali GH -taso. Aineen antamisen tulisi muuttaa ruumiin rasvakoostumusta ja muun-taa aineenvaihdunnallisia, immunologisia ja kasvuproses-seja. Nama analogit voivat olla hyOdyllisia kiihdytetta-essa esimerkiksi ihmisissa tapahtuvia anabolisia prosesse-30 ja tietyissa tilanteissa, kuten palovammojen hoidossa.

Naita analogeja voidaan antaa kaupallisessa kaytdssa ole-ville tasaiampdisille elaimille, kuten kanoille, kalk-kunoille, sioille, vuohille, nautakarjalle ja lsunpaille, ja niita voidaan kayttaa kalaviljelmiin ja antaa muille 35 vaihtoiampdisille merieiaimille, esim. merikilpikonnille, ankeriaille ja sammakkoelaimille kasvun kiihdyttamiseen ja 32 rasvan ja valkuaisaineen suhteen nostamiseen, mihin pSås-taan antamalla tehoavia maaria peptidejS.

Naiden synteettisten peptidien puhtausaste tulisi olla våhintaan 93 %, mutta mieluiten ainakin 98 %, ennen 5 kuin niita annetaan ihmisille. Taman keksinndn tarkoituk-siin puhtaudella tarkoitetaan aiotun peptidin massaprosent-tia kaikista esiintyvista peptideista ja peptidifragmen-teista. Tailaisten synteettisten peptidien hyvaksyttava puhtausaste voi olla jopa niin alhainen kuin 5 % tai jopa 10 0,01 %, annettaessa naita kaupallisessa kaytdssa oleville tai muille eiaimille.

Naita synteettisia peptideja ja niiden myrkyttiimia suoloja voidaan antaa eiaimille, ihmiset mukaanluettuna, farmaseuttisen valmisteen muodossa, joka muodostuu pepti-15 dista ja farmaseuttisesta tai eiainiaaketieteellisesta kantaja-aineesta, joko suonensisaisesti, ihonalaisesti, lihaksensisaisesti, ihon kautta, esim. nenaontelon kautta, tai jopa suun kautta. Peptidin antamisen voi suorittaa laakari, jotta tailaista hoitoa tarvitsevan potilaan GH:n 20 vapautuminen lisaantyisi. Vaadittava maara vaihtelee hoi-dettavan tapauksen olosuhteista, tapauksen vakavuudesta ja tarvittavan hoidon pituudesta.

Tailaisia peptideita annetaan usein myrkyttiJmina suoloina, kuten happoadditiosuoloina tai metallikomplek-25 seina esim. sinkki- tai rautakomplekseina tai vastaavina (joita pidetaan taman keksinndn tarkoituksiin sopivina suoloina). Hyvia esimerkkeja tailaisista happoadditiosuo-loista ovat kloorivety, bromivety, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, 30 malaatti, askorbaatti, tartaatti ja vastaavat. Jos vaikut-tava ainesosa aiotaan antaa suun kautta tablettina, siinå voi olla sitoja-ainetta, kuten trakanttia, maissitarkkelys-ta tai gelatiinia; liuotinainetta, kuten algiinihappoa; ja voiteluainetta, kuten magnesiumstearaattia. Jos halutaan 35 antaa aine nestemaisena voidaan kayttaa makeutus- ja/tai li 91074 33 sessa suolaliuoksessa, fosfaattipuskurissa tai vastaavas-sa.

Peptidit tulisi antaa ihmisille laakarin valvonnan alaisena, ja farmaseuttiset liuokset yleensa sisaltavat 5 peptidia tavallisessa kiinteassa tai nestemaisessa farma-seuttisesti hyvaksyttavassa kantaja-aineessa. Yleensa an-nostus on noin 0,01-1 mikrogrammaa peptidia isannan paino-kiloa kohti.

Vaikka keksintG on kuvattu sellaisten sen puittei-10 siin kuuluvien tekijGiden suhteen, jotka taiia hetkelia ovat sen tekijGiden tiedossa, on ymmarrettavissa, etta tavanomaisen ammattitaidon omaavat voivat tehda erilaisia muutoksia ja muunnelmia keksintGGn ilman, etta nama poik-keavat keksinnGn kattamasta alueesta seuraavassa esitet-15 tyjen patenttivaatimusten puitteissa. Esimerkiksi pepti-diketjuun voidaan tehda tunnetuilla kokeellisilla menetel-milia muutoksia, varsinkin poistoja peptidin karboksyyli-paasta alkaen noin paikkaan 29 saakka, sellaisten peptidi-en tai peptidifragmenttien valmistamiseksi, joissa kaikki 20 tai hyvin olennaiset osat peptidin biologisesta tehosta ovat sailyneet. Tailaisia peptideja pidetaan keksinnGn puitteisiin kuuluvina. Lisaksi voidaan tehda lisayksia peptidin jompaankumpaan tai kumpaankin paahan, ja/tai yle-isesti vastaavia ryhmia voidaan korvata luonnossa esiinty-25 villa ryhmilia mulden analogien valmistamiseksi peptidike-miassa entuudestaan tunnetuilla tavoilla, ilman etta tai-lGin poikettaisiin keksinnGn tarkoituksesta. Lisaksi voidaan tehda muutoksia etusijalla olevaan -NH2 -ryhmaan C-paassa entuudestaan tunnetuilla tavoilla; esimerkiksi ta-30 vallisella aminohapporyhman karboksyyliosa C-paassa voi olla ryhma -C00R, -CRP, -CONHNHR, -C0N(R)(R') tai CH20R, missa R ja R' ovat alempia alkyyleita, alempia fluoroal-kyyleita tai vetyja niin, etta saadan aikaan keksinnGn piiriin kuuluvia vastaavia synteettisia peptideja.

35 KeksinnGn eri piirteita korostetaan seuraavissa pa- tenttivaatimuksissa.

Claims (8)

1. Menetelmå terapeuttisesti kåyttOkelpoisen 29-44 aminohapporyhmåå sisåltåvån GRF-analogin valmistamiseksi, 5 joka sisåltåå rengasrakenteen aminohappojen R25 ja R29 vå-lillå ja jonka N-terminaalisella sekvenssillå on kaava I: (B )R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Re-Ser-Tyr-Arg-R12-R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-Nle-R2e-R29- 10 jossa B on H tai C'tøe, R3 on Tyr tai His, R2 on Ala tai D-NMA, R8 on Ser, Lys tai Asn, R12 on Arg tai Lys, R13 on lie tai Val, R15 on Ala tai Gly, R18 on Tyr tai Ser, R24 on His tai Gin, R25 on Cys, D-Cys, D-Glu tai Asp, R28 on Asn tai 15 Ser ja R29 on Cys, D-Cys, Orn tai daP edellyttåen, ettå kun R25 on D-Cys tai Cys, R29 on itsenåisesti D-Cys tai Cys, ja kun R25 on Asp tai D-Glu, R29 on itsenåisesti Orn tai daP, ja jolloin mahdollisesti låsnå olevat aminohapot 30 - 44 tai niiden muodostaman sekvenssin C-terminaalista 1yhenne-20 tyt fragmentit vastaavat luonnollisen GRF:n rakennetta, ja sen farmaseuttisesti hyvåksyttåvån suolan valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå (a) muodostetaan peptidivålituote, jossa on våhintåån yksi suojaryhmå ja jonka N-terminaalisella sekvenssillå on kaa-25 va II: (X^iBjR^X tai X2) -R2-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -R8( X4, X5 tai X7) -Ser (X4 )-Tyr( X2 )-Arg( X6) -R12( X6 tai X7)-R13-Leu-R15-Gln (X5)-Leu-R18(X2 tai X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-R24(X tai 30 X5)-R25(X8)-Ile-Nle-R28(X5 tai X4)-R29(X8)—X10, jossa X, X1, X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin vety tai ta-vanomainen sivuketjun suojaryhmå, X® on Cys:n sulfhydryyl-iryhmån suojaryhmå tai sopiva aminosivuketjun suojaryhmå, 35 joka voidaan poistaa poistamatta samalla suojaryhmåå X7,tai II 91074 sopiva labiili karboksyylisivuketjun suojaryhma, joka voi- daan poistaa poistamatta samalla suojaryhmaa X3, --- osoit- taa etta muita aminohappoja vol olla lasna, ja X10 on pep-tidin kantajahartsiin ankkuroiva sidos, 5 (b) suojaryhma tai suojaryhmat tai ankkuroiva sidos pilko- taan kaavan II mukaisesta peptidivaiituotteesta, (c) muodostetaan ryhmien R25 ja R29 vaiille syklinen sidos, jos sellainen ei ole lasna, joko ennen vaihetta (b) tai sen jaikeen, ja 10 (d) haluttaessa muutetaan saatu peptidi sen myrkyttOmaksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R2 on NaMeTyr.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelma, 15 tunnettu siita, etta R25 on D-Cys ja R29 on Cys.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R25 on Asp ja R29 on daP.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R25 on D-Glu ja R29 on Orn.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R25 on Cys ja R29 on D-Cys.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta peptidilia on yksi kaavoista: