PT77934B - Process for the preparation of peptides having influence on the function of the gland pituitary - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO DO INVENTO
0 presente invento refere-se a um pêptido tendo influên cia na função da glândula pituitária em seres humanos e outros animais especialmente mamíferos. Em particular, o presente invento refere-se a um pêptido que estimula a libertação da hormo na do crescimento pela glândula pituitária.
Os fisiologistas reconheceram há muito que o hipotálamo controla toda a função de secreção da adenohipáfise, produzindo o hipotálamo polipéptidos especiais que provocam a secreção de cada hormona pituitária. Um factor de inibição tem sido evidenciado, o qual impede a secreção da hormona do crescimento (GH) e denomina-se somatostatin.
Foi isolado recentemente um factor de libertação hipota lâmico correspondente para a GH da pituitária, a partir de um extracto de um tumor pancreático humano, purificado, caracterizado, sintetizado e submetido a testes. A sequência desse pépti. do ê como se segue:
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu. A forma amida da desse pêptido é tida como sendo e referida a seguir como hpGRF (para o factor de libertação GH de tumor pancreático humano).
Isolou-se agora um polipéptido a partir de extractos hi potalâmicos do rato, foi purificado, caracterizado, sintetizado e submetido a testes, e que liberta GH a partir da células de pituitária em cultura. A sequência desse 43-resíduo de pêptido ocorrendo naturalmente ê como se segue:
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Glri -Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-QH. 0 pêptido é a seguir referido como rhGRF (para o factor de libertação GH, hipotalâmico do rato).
Foram agora sintetizados certos análogos de hpGRF e levados a testes e que são mais poderosos do que o hpGRF em si mesmo, muitos desses análogos são de menor extensão.
Alguns desses análogos baseiam-se em substituições compatíveis com a fórmula de rhGRF enquanto que outras se baseiam noutras substituições, Cfeprocessos de preparação das composições farmacêuticas de acordo com o invento incluem esses análo-
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-3de hpGRF ou um seu sal não tóxico, disperso num liquido farmaceuticamente aceitável ou veículo sólido. Essas composições farmacêuticas podem ser usadas em medicina tanto dos seres huma nos como em veterinária, para administração como fins terapêuti cos e tambám como meio de diagnóstico. Além disso, podem ser usadas para estimular o crescimento de animais de sangue quente incluindo aves domésticas e em aquicultura para animais de sangue frio, por exemplo peixe, enguias, etc.
A numenclatura usada para definir o péptido é a especificada por Schroder & Lubke, "The peptides", Academic Press (1965) em que de acordo com a representação convencional o grupo amino no N-terminal aparece para a esquerda e o grupo carboxil no C-terminal para a direita. Por amino ácido natural quer dizer-se um dos amino ácidos comuns que ocorrem naturalmente, encontrados em proteínas, incluindo Gly, Ala, Vai, Leu, lie,
Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp e His. Quando o resíduo amino ácido tem formas isoméricas, a L-forma do amino ácido está sendo representada, a não ser expressamente indicada de outro modo. Para fins dessa aplicação, o rhGRF ê considerado como um análogo do hpGRF.
0 invento provê análogos de péptido sintético, hpGRF tendo a fórmula seguinte: H-R^-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-RlQ-Arg-Ri^-Ri-j-Ceu-Ri^-Gln-Leu-Rig-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-f^^-R25-Ile-R27-R2a-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R3g-R39-R^g-Arg-R^-R^-R^-Y em que R^ é Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe,
40 a 42 43 44
Leu, D-His ou His; R R
B é Ser ou Asn, R^g é Tyr, Phe ou D-Tyr;
é 11b ou Vai;
R<
R; é se15 é Gly ou D-Ala; ..^g R,
R12 ê Al?9 0U LyS’ "13
é Tyr ou Ser; R24 ê His ou Gin; R^ ê Glu ou Asp; ? leccionado do grupo que consiste do D- e L- isómeros de Ala, Nle, lie, Leu, Met e Vai; R2g é Ser, Asn ou D-Ala; R^^ é Arg ê Ser ou
ou Ser; R^g ê Gin ou Arg; R^^ ê Arg ou Gly;
Ala; R/iO é Phe ou Ala; R^ é Asn ou Arg; R/)A ê um amino áci
40
42
44
do natural ou des-R^; e Y significa a metade carboxil do resíduo amino ácido no C-términus e ê o radical -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R’) ou -CH20R, sendo R e R' alquilo inferior, fluoro alquilo inferior cu hidrogénio, provendo-se contudo que, quando R^ ê Tyr, então R^y δ outro sem ser Met, RQ ê Ser, R^ ê A rg, R13 ê lie, R18 é Tyr,
R24 é His, R25 ê Glu, R28 ê Asn, R34 é Gin, R^g é Arg, R^g ê Ser, R^2 ê Phe ou R^ ê Asn;
é Arg, R
38
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-4provendo-se ainda que qualquer ou todos os resíduos de 28 a 44 podem ser retirados para se prover um fragmento biologicamente activo, ou um sal não tóxico do que foi mencionado acima. Meti, lo, etilo e propilo são os grupos alquilo inferior preferidos. Os fragmentos dos pêptidos mencionados antes também têm potência biológica e sente-se na generalidade que o péptido deve pelo menos prolongar-se do N-terminal até ao resíduo-27. Quando o fragmento de péptido se prolonga somente para o resíduo 27 e 28, Y deve ser NH^ ou um amida substituído; enquanto que, quan do o fragmento se prolonga para um dos resíduos de 29 a 39, Y é de preferência um amida ou amida substituído.
Os análogos de hpGRF tendo um dos substituintes mencionados para Met na 27-posição evidenciam uma estabilidade substancialmente maior, especialmente quando expostos a condições de oxidação; além disso, se o substituinte for um D-isómero, a resistência de enzimas pode ser realçada. Eles podem permanecer completa e biologicamente activos e certos análogos mostram de modo surpreendente potência aumentada quando experimentados in vitro. A substituição de His na 1-posição provê uma surpreendente alta potência.
Além disso a substituição de um D-isómero amino ácido, por exemplo D-Tyr, retém uma quantidade inesperada de potência e pode ser muito apreciável por tornar o péptido resistente à quebra por certos enzimas.
Os pêptidos são sintetizados por um processo conveniente, como seja por técnicas exclusivamente de fase sólida, por técnicas parciais de fase sólida, por condensação de fragmentos por acoplamentos clássicos de soluções ou pelo emprego de técnicas de recombinação DNA recentemente desenvolvidas. Por exemplo, as técnicas da síntese exclusivamente de fase-sólida estão evidenciadas no livro "Solid-Phase Péptido Syntesis", Steuiart ά Young, Freeman & Co, San Francisco, 1969 e estão exemplificadas pela descrição de patente dos E.U. n^. 4 105 603 publicada em 8 de Agosto de 1978 para Vale et al.. 0 processo de síntese de condensação de fragmentos está exemplificado na patente dos E. U. n2. 3 972 859 (3 de Agosto de 1976). Outras sínteses utilizáveis estão exemplificadas na patente dos E.U. n2. 3 842 067 (de 15 de Outubro de 1974) e patente dos E.U. nS. 3 862 925 (28 de Janeiro de 1975).
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A síntese pela utilização de técnicas de recombinação DNA para esta aplicação deve ser compreendida como incluindo o emprego apropriado de uma codificação estrutural de genes para a forma desejada de análogo hpGRF ou seu fragmento. 0 péptido sintético hpGRF pode ser obtido por transformação de um microorganismo usando um uector de expressão incluindo um estimulante e um operador juntos com esse gene estrutural e fazendo com que esse microorganismo transformado expresse o péptido hpGRF.
Também pode ser usado um animal não-humano para se produzir o péptido hpGRF por cultura de genes usando esses genes estruturais e as técnicas gerais expostas na patente dos E.U. n2. 4 276 282 publicada em 30 de Junho de 1981 ou usando microinjecção de embrião como se descreveu em W083/01783 publicado em 26 de Maio de 1983 e W082/04443publicado em 23 de Dezembro de 1982. 0 péptido sintético hpGRF também pode ser produzido
directamente no animal para o qual se deseja crescimento acelerado pelas técnicas descritas nas duas publicações W0.
Z comum nas sínteses químicas a protecção dos grupos de cadeia lateral lábil das várias metades aminoácidas com grupos de protecção convenientes que irão evitar que uma reacção quími ca ocorra naquele local até o grupo por fim ser retirado. Em geral também é comum a protecção de um grupo alfa-amino num ami no ácido ou num fragmento enquanto essa entidade reage no grupo carboxil, seguida pela retirada selectiva do grupo de protecção alfa-amino para permitir que a reacção subsequente se dÊ nesse local. Assim, é vulgar que, como etapa na síntese, se produza um composto intermédio o qual inclui cada um dos resíduos amino ácidos localizados na sua sequência desejada na cadeia do pépti. do com grupos de protecção de cadeia lateral ligados aos resíduos apropriados.
Também se consideram dentro do âmbito do presente invejn to os intermediários da fórmula:
X1-R1(X ou X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-R8(X4 ou X5)-Ser (X4)-R1Q(X2)-Arg(Xé)-R (X6 ou X7)-Ri;j-Leu-R15-Gln(X5)-Leu-R18
(X2)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-R24(X ou X5)-R2 (xMlle-R^-R2B(X4 qu X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X^)-R,4(X4 ou X6) -Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R:58(X5 ou X6)-R3g(X6)-R4Q(X^)-Arg(X6)~^42~^43^ °U em que: X^ é ou hidrogénio ou um
grupo de protecção -amino. Os grupos de protecção O( -amino
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referenciados com são aqueles muito conhecidos como úteis na arte da síntese por etapas de polipêtidos.
Entre as classes de grupos de protecção -amino que se podem empregar como estão (l) grupos de protecção do tipo uretano, como sejam fluorenilmetiloxicarbonil (FMQC), benziloxj. carbonil (Z) e Z substituído como sejam p-clorobenziloxicarbonil, p-nitrobenziloxicarbonil, p-bromobenziloxicarbonil, e p-metoxibenziloxicarbonil; (2) grupos de protecção uretano ali.
fático como sejam t-butiloxicarbonil (BOC), diisopropilmetiloxj. carbonil, isopropiloxicarbonil, etoxicarbonil, aliloxicarbonil; e (3) grupos de protecção do tipo cicloalquilo uretano, como s.e jam ciclopentiloxicarbonil, adamantiloxicarbonil e ciclohexiloxicarbonil. 0 grupo de protecção &( -amino preferido ê BOC.
X ê hidrogénio ou um grupo de protecção para o nitrogénio imidazole de His, como seja Tos.
2
X pode ser um grupo de protecção apropriado para o grtj
po hidroxil fenólico de Tyr, como seja tetrahidropiranil, tert-butil, tritil, Szl, CBZ, 4Br-CBZ e 2,6-diclorobenzil (DCB). 0 2
grupo de protecção preferido ê 2,6-diclorobenzil. X pode ser hidrogénio, o que quer dizer que não há grupo de protecção de ca deia lateral no resíduo amino ácido nessa posição.
X5 ê hidrogénio ou um grupo de protecção apropriado de formação de ésteres para o grupo carboxil de Asp ou Glu, como sejam benzil (OBzl), 2,6-diclorobenzil, metilo e etilo.
X^ pode ser um grupo de protecção apropriado para o gru po hidroxil de Thr ou Ser como sejam acetil, benzoil, tert-butil, tritil, tetrahidropiranil, Bzl, 2,6-diclorobenzil e CBZ. 0 grupo de protecção preferido ê Bzl.
X^ pode ser hidrogénio, o que quer dizer que não há gru po de protecção no grupo hidroxil.
X5 ê hidrogénio ou um grupo de protecção apropriado para o grupo amido de cadeia lateral de Asn ou Glu. E de preferêjj cia xantil (Xan).
X6 ê um grupo de protecção conveniente para o grupo gua
nidino de Arg como seja nitro, Tos, CBZ, adamantiloxicarbonil e
BOC ou é hidrogénio.
7
X é hidrogénio ou um grupo de protecção apropriado para o grupo amino de cadeia lateral de Lys. São demonstrativos de grupos de protecção amino de cadeia lateral apropriados o 262 239
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-7-clorobenziloxicarbonil (2-C1-Z), Tos, t-amiloxicarbonil e BOC.
ral apropriado como se especificou acima na generalidade.
Met pode, por opção, ser protegido por oxigénio, mas de
preferência é deixado desprotegido.
A selecção de um grupo de protecção amino de cadeia lateral não ê exacta, excepto que em geral é escolhido um que não seja retirado durante a desprotecção dos grupos -amino dura_n te a síntese. Contudo, para alguns amino ácidos, por exempla His, a protecção em geral não ê necessária após se ter completa do o acoplamento, e os grupos de protecção podem ser os mesmos.
boxil C-terminal como seja o grupo de formação de éster X ou é
uma ligação de ancoragem usada na síntese de fase sólida para o 9
encadeamento a um suporte sólido de resina ou é des-X e nesse
caso o resíduo no C-terminal tem uma metade carboxil que é Y, como se definiu antes.
Quando é usado um suporte sólido de resina, pode ser um
qualquer des conhecidos na arte, como seja algum que tenha as fórmulas: -Q-CH2-suporte de resina, -NH-benzidrilamina (BHA) s_u porte de resina ou -NH-parametilbenzidrilamina (MBHA) suporte de resina. Quando o amida não substituído ê aconselhável prefe re-se o uso de resina BHA ou MBHA porque a clivagem dá directamente o amida. No caso de se desejar N-metil amida isso pode ser gerado a partir de uma resina N-metil BHA. Caso se desejem outros amidas substituídos ou outros grupos sem ser □ ácido livre no C-terminus, pode ser preferível sintetizar o péptido usando os processos clássicos, como está exposto no teste Houben-Weyl .
Na fórmula para o intermediário pelo menos um dos X9
-grupos ê um grupo de protecção ou X inclui suporte de resina. Assim, o invento também provê um processo para a preparação de um péptido com interesse para (a) a formação de um péptido tendo pelo menos um grupo de protecção e a fórmula (ll):
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ΒδΟφΟσΤ
wSi
^6)-r42”Rô3^5 0U χ6)-Κ44^χ0)-χ9 em 9ue: x> χ1> χΖ» χ3» χ4> χ5>
X , X7 e X são cada um ou hidrogénio ou um grupo de protecção
g
e X é ou um grupo de protecção ou uma ligação de ancoragem a 9
um suporte de resina ou des-X , e nesse caso o resíduo no C-tejç minai tem uma metade carbóxi que ê Y; (b) separando o grupo ou grupos de protecção ou ligação de ancoragem do dito peptido da fórmula (ll); e (c) se se desejar convertendo um péptido resul tante num seu sal não tóxico.
Na selecção de um grupo especial de protecção de cadeia lateral a ser usado na síntese dos péptidos, seguem-se as seguin tes regras: (a) o grupo de protecção tem de reter as suas pro priedades de protecção e não se separar sob condições de acoplei mento, (b) o grupo de protecção deve ser estável ao reagente e, com excepção de Xan, deve ser estável sob condições de reacção seleccionadas para a retirada do grupo de protecção -amino em cada etapa da síntese, e (c) o grupo de protecção de cadeia lateral tem de ser removível, com o acabamento da síntese contendo a sequência desejada de amino ácido sob condições de reaç. ção que não irão alterar a cadeia péptido.
Quando os péptidos não estão preparados para a utilização da tecnologia de recombinação DNA, são preparados de preferência usando sintese de fase sólida, como seja a geralmente descrita por Merrifield, 3. Am. Chem. Soc., 85, p 2149 (l963) embora se possam usar também outras sínteses químicas equivale_n tes conhecidas na arte, como se mencionou anteriormente. A sin tese de fase sólida é começada a partir da extremidade C-terminal do péptido por acoplamento de um -amino ácido protegido a uma resina apropriada. Essa matéria inicial pode ser prepara da pela união de um amino ácido o( -amino protegido por um encadeado éster a uma resina clorometilada ou uma resina hidroximetil ou por uma ligação amida a uma resina BHA ou resina MBHA.
Se vai ser incorporado no polipéptido resultante urn metilo, eti lo ou propilamida, usa-se uma resina clorometilada ou hidroxime til, e efectua-se convenientemente a clivagem usando a amina apropriada, por exemplo etilamina.
Per exemplo, na preparação do péptido de 40-resíduo, Ala, protegido por 80C, ê acoplado à resina clorometilada de acordo com o procedimento de Monahan and Gilon, Biopolymer 12, pp 2513-19, 1973.
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-9Α seguir ao acoplamento de BOC-Ala ao suporte de resina o grupo de protecção -amino é retirado usando ácido trifluoroacético (TFA) em cloreto de metilene, TFA sozinho ou HC1 em dioxano. A desprotecção é efectuada a uma temperatura entre cerca de 02C e a temperatura ambiente. Podem usar-se outros reagentes de clivagem estandardizadas assim como outras condições para a retirada de grupos de protecção especificos-amino, como foi descrito em Schroder & Lubke "The peptides", 1 pp 72-75 (Academic Press 1965).
Após a retirada do grupo de protecção o( -amino de Phe, os restantes amino ácidos c/ -amino e protegidos de cadeia lateral são acoplados em etapas na ordem desejada para se obter o composto intermédio definido anteriormente ou, como alternativa ao adicionamento de cada amino ácido separadamente na síntese, alguns deles podem ser acoplados uns aos outros antes do adicio namento ao reactor de fase sólida. A selecção de um reagente de acoplamento apropriado está nos conhecimentos da arte. E especialmente apropriado como reagente de acoplamento o Ν,Ν'-diciclohexilcarbodiimida (DCCl).
Os reagentes de activação usados na síntese de fase sólida dos pêptidos são muito conhecidos na arte dos péptidos. São exemplos de reagentes de activação convenientes os carbodiimidas como sejam carbodiimida Ν,N'-diisopropil, N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Estão descritos outros reagentes de activação e o seu uso no acoplamento dos péptidos por Schroeder A Lubke supra, Capítulo III e por Kapoor, 0. Phar. 5ci. 59 pp 1-27 (1970).
Cada sequência de amino ácido protegido ou amino ácido ê introduzida no reactor de fase sólida cerca de quatro vezes mais ou um excesso maior, e o acoplamento pode ser efectuado num meio de dimetilformamida (DMF): Ch^Cl^ (l:l) ou em DMF ou CH2CI2 sozinho. Nos casos em que ocorre 0 acoplamento incomplje to, 0 procedimento do acoplamento é repetido antes da retirada do grupo de protecção -amino anteriormente ao acoplamento ao amino ácido seguinte, 0 sucesso da reacção de acoplamento em cada etapa da síntese é orientada pela reacção nihidrina, como está descrito por E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). As reacções de acoplamento podem ser efectuadas automa ticamente, como no sintetizado1, automático Beckman 990, usando
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-10um programa como o referido em Riuier et al. Biopolymers 1978,
17 pp 1927-1938.
Depois de se ter completado a sequência de arnino ácido desejada, o pêptido intermediário pode ser retirado do suporte de resina por tratamento com um reagente como seja fluoreto de hidrogénio liquido, que não só cliva o pêptido da resina mas também efectua a clivagem de todos os grupos de protecção de ca deia lateral restantes X, X2, X3, x\ X5, X6, X7 e X8, a ligação de ancoragem X ε o grupo de protecção -amino X , para se obter o pêptido na forma do ácido livre. Se Met estiver prjj sente na sequência, ê primeiramente retirado de preferência o grupo de protecção BOC, usando ácido trifluoroacêtico (TFA)/etja neditiol antes da clivagem do pêptido a partir da resina com HF para se eliminar a S-alquilação potencial. Quando se usa o flu oreto de hidrogénio para a clivagem, o anisole e o sulfureto de metiletil são incluídos no recipiente de reacção para lavagem.
Como achega para a preparação de peptidos sintéticos usando a técnica de recombinaçâo DNA, inclui-se de preferência um resíduo Met como resíduo adicional no N-terminus, e não deve estar presente Met de modo nenhum no pêptido. Da mesma maneira, em todos os resíduos empregados no pêptido têm de ocorrer naturalmente amino ácidos L-isámero ou Gly. Como resultado produz-se uma composição intermédia do pêptido, preferida, tendo a fórmula:
H-Met-R^-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Try-Arg-R^^-R^^-Leu-Gly-Gln-Leu-R^g-Alá-Arg-Lys-Leu-Leu-R2^-R25“'I-^Q“R27“R28"®r^“^'’"n"' -01η-Ε1ν-Ε1υ-Κ^^-Α3η-81η-Π1υ-Η·38-Π39-Π40-ΑΓ9-ΠΖΐ2“^43“^4Ζ(“Υ em que R^ é Tyr, Leu ou His; Rg ê Ser ou Asn, R·^ 6 Arg ou Lys;
ê Ile ou Uai; R^g ê Tyr ou Ser; R2Zt δ His ou Gin; R25 δ
Glu ou Asp; R2? δ Ala, Nle, Ile, Leu ou Uai; Rgg ê Asn ou
Ser; R·^ é Arg ou Ser; R^q δ Gin ou Arg; R3g ê Arg ou Gly;
R^g ê Ser ou Ala; R^ & Phe ou Ala; R^ ê Asn ou Arg; ê
um amino ácido natural ou des-R^, em que Y representa a metade carboxil do resíduo C-terminus e ou ê -CQOH ou CQft^.
Uma vez expresso este pêptido por um microorganismo geneticamente modificado e a composição intermédia recuperada e purificada usando processos conhecidos, o intermediário ê trata do com brometo cianogênio para efectuar a clivagem do resíduo Met no N-terminus e produzir o pêptido biologicamente activo.
)ΪΪ6ϊΟφ0.Ο^·
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Embora a fórmula exposta acima indique que o péptido se prolongará da posição 43 ou posição 44, como se mencionou noutro lugar aqui, ê provida uma actividade biológica substancial por péjq tidos tendo poucos resíduos como de 27 a 29 e esses fragmentos menores são considerados geralmente equivalentes para muitos fins e incluídos dentro do âmbito do intermediário preferido pelo invento e que se destina à produção da técnica de recombinação DNA.
0 exemplo seguinte evidencia o processo preferido para a sintetização de análogos hpGRF pela técnica da fase sólida. Notar-se-á é claro que a síntese de um fragmento de pêptido coj? respondentemente menor é efectuada da mesma maneira eliminando simplesmente o número necessário de amino ácidos começando no C-terminal.
EXEMPLO I
A síntese de Ile2^_7-hpGRF (l-40)-NH2 tendo a fórmula: H-T yr-Ala-Asp-Ala-Ue-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-l/al-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH^ é conduzida em ata pas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990 numa resina cloridrato MBHA, como seja a utilizada por Sachem. Inc. tendo uma gama de substituição de cerca de 0,1 a 0,5 mmoles/g resina.
0 acoplamento de BOC-Ala à resina é executado pelo procedimento geral exposto abaixo nas listas A e B e que ê usado em toda a síntese e dá origem à substituição de cerca de 0,35 mmol. Ala por grama de resina. Todos os solventes que são usadas são cuidadosamente desgaseifiçados por tratamento com um gás inerte por exemplo hélio ou nitrogénio, para assegurar a aii sSncia de oxigénio que podia indesejavelmente oxidar o enxôfre do resíduo Met.
Após desbloqueio e neutralização a cadeia péptido é construída etapa a etapa na resina.
Os desbloqueio, neutralização e adicionamento de cada amino ácido são executados de acordo com o procedimento exposto em detalhe em Vale et al. patente dos E.LJ. n9. 4 292 313.
0 desbloqueio ê efectuado de preferência de acordo com a lista A que se segue:
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-12LISTfl A
Reagente
1. 60% TFA/2% etaneditiol
2. 60% TFA/2% etaneditiol
3. IPA/l% etaneditiol
4. Et,N (10%) em CH Cl
5.. Me OH
6. EtjN (10%) em CH2C12
7. MeOH (duas vezes)
8. CH2C12 (duas vezes)
Cd acoplamentossão exposto na lista B que se
Reagente
9. DCCI
10. Boc-amino ácido
11. MeOH (duas vezes)
12. CH2C12 (duas vezes)
13. Ac20 (3M) em CH2C12
14. CH2C12
15. MeOH
16. CH2C12 (duas vezes)
efectuados
segue:
LISTA B
Tempo ds mistura (Min.)
10
15
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
de preferência como está
Tempo de mistura (Min.)
50-90
0,5
0,5
15,0
0,5
0,5
0,5
Resumindo, utilizam-se um a dois mmol de Boc-amino ácido protegido em cloreto de metilene por grama de resina, mais um equivalente de 1,0 molar DCCI em cloreto de metilene durante dq as horas. Quando o BQC-Arg (TOS) está sendo acoplado usa-se uma mistura de 50% DMF e cloreto de metilene. 0 éter Bzl ê usa do como grupo de protecção de cadeia lateral hidroxil para Ser e Thr. 0 P-nitrofenil éster (ONp) ê usado para activar a extre midade carboxil de Asn ou Gin e, por exemplo, BOC-Asn (ONp) ê acoplado toda a noite usando um equivalente de HOBt numa mistura de 50% de DMF e cloreto de metilene em cujo caso não se adiciona DCC. 0 grupo amido de Asn ou Gin é protegido por Xan quando é usado o acoplamento DCC em vez do processo de éster acti. vo. Usa-se o 2-clorobenziloxicarbonil (2C1-Z) como grupo de protecção para a cadeia lateral Lys. Tos ê usado para proteger o grupo guanidino de Arg ε o grupo Glu ou Asp carboxil é protegido como o éster (QBzl). 0 grupo hidroxil fenélico de Tyr é protegido com 2,6-diclorobenzil (DCB). No final da síntese
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obtém-se a composição saguinta:
X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn(X5)-Ser(X4)-Tyr (X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln(X5)-Leu-Ser(X4)-Ala-Arg (X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln(X3)-Asp(X3)-Ile-íle-Ser(X4)-Arg(X8)-Gln(X8)-Gln(X3)-Gly-Glu(X3)-Ser(X4)-Asn(X8)-Gln(X8)-Glu(X3)-Arg(X6)-Gly-Ala-X8 em qua X1 ê BOC, X2 ê DCB, X3 ê éster benzilo, X4 ê Bzl, X5 ê Xan, X6 é Tos, X7 é 2C1-Z e X8 é -NH-supor te de resina. Xan pode ter sido parcial ou totalmente retirado por tratamento TFA usado para desbloquear o grupo de protecção
-amino.
Após o resíduo final Tyr ter sido acoplado à resina, o BOC é retirado com 60% TFA em CH^Cl^·
Para a clivagem e desprotecção do peptido protegido-resina, restante, trata-se com 1,5 ml de anisole, 0,5 ml de metil. etilsulfureto e 15 ml de fluoreto de hidrogénio (HF) por grama de pêptido-resina, a -205C durante meia hora e a OSC durante meia hora. Após a eliminação do HF sob alto vácuo o restante ΐβ_ sina-pêptido é lavado alternativamente com éter dietil seco e clorofórmio e o péptido é depois extractado com ácido acético aquoso 2N desgaseifiçado e separado da resina por filtração.
0 péptido clivado e desprotegido é depois dissolvido em 0-5% de ácido acético e sujeito a purificação a qual pode inclu ir a filtração Sephadex G-50 de gel fino.
0 péptido ê depois então purificado por HPLC de prepara ção ou de semi-preparação como foi descrito em Rivier et al. Peptides, Structure and Bioloqical Function (1979) pp 125-8 e Marki et al. (0. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981). Em provimento de pequenos cartuchos as prep. Waters Associates LC-500 são embaladas com 15-20 Cj,g Silica de Vydac (300A). Uma graduação de CH^CN em TEAP ê gerada por um construtor de gradua ção Eldex de baixa pressão, como se descreve em Rivier, 0., 0.· Liq. Chromatoqraphy 1, 343-367 (1978). As fracçoes cromatográficas são cuidadosamente orientadas por HPLC e somente as fracções que mostram uma pureza substancial são recolhidas. A dessalinização das fracçoes purificadas, independentemente verificadas quanta a pureza é conseguida usando uma graduação de CH^CN em 0,1% TFA, A fracção central ê depois liofilizada para dar o péptido desejado cuja pureza é maior que 98%,
A síntese ê repetida usando uma resina clorometilada pa62 239
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ra produzir o mesmo péptido na forma de ácido livre usando procedimentos como os descritos na generalidade em Rivier, J.<T«Amer. Chem. Soo·., 96, 2986-2992 (1974).
EXEMPLO II
A síntese de /~Val^^, D-Ala^^_7hpGRF(l-4O)-NH2 tendo a
fórmula:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-G1n-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ual-D-Ala-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Nl·^ e conduzida em etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990 numa resina MBHA da maneira descrita no Exemplo I. 0 péptido ê considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC.
EXEMPLO III
A síntese do análogo hpGRF /~D-Tyr^_7-hpGRF(l-32)-NH2 teri do a fórmula:
H-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ual-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 ê conduzida em etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990 numa resina MBHA da maneira descrita no Exemplo
I. 0 péptido ê considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoelêctrico
Q O
como =-61,42 +_ 1 (C=l, 1/í ácido acético, não corrigido).
A síntese ê repetida usando uma resina clorometilada para produzir o mesmo péptido na forma de base livre como se indicou antes na generalidade.
EXEMPLO IV
A síntese do análogo hpGRF encurtada /~Nlez _7-hpGRF(l-32)-NH2 tendo a fórmula:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Giy-NH2 ê conduzida em etapas usando um sintetizador de p_ép tidos Neckman 990 numa resina MBHA da maneira descrita no Exemplo 1. Esse análogo é considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC. A rotação óptica ê medida num polarímetro fotoelêctricô como =“57,82 +_ 1 (C=l, 1/ ácido acético, não corri,
gido). A mesma síntese geral é usada para fazer /~Nle _7-hpGRF (l-44)-NH2.
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EXEMPLO V
A síntese de /~Nle27_7-hpGRF (l-27)-NH2 tendo a fórmula: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-NIe-NH2 é conduzida em etapas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa re sina MBHA da maneira descrita no Exemplo I» 0 péptido é considje rado substancialmente puro usando TLC e HPLC.
EXEMPLO VI
A síntese de /-Ile22_7“bpGRF(l-32)-0H tendo a fórmula: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Cly-Clu-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln- Gin -Gly-OH é conduzida em etapas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa resina clorometilada da maneira mencionada no final do Exemplo I. 0 péptido é considerado substancialmente p_u ro usando TLC e HPLC. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoelêctrico como ~ 61,79 _+ 1 (C=l, 1/í. Scido acético,
não corrigido).
A síntese é repetida usando uma resina MBHA para produzir o mesmo péptido na forma amidada.
EXEMPLO VII
A síntese de /~D-Met27_7-hpGRF(l-32)-NH2 tendo a fórmula: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Cly-Clri -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 é conduzida por etapas usando um sintetizador Beckman 990, d^péptidos, numa resina MBHA, da maneira descrita no Exemplo I. 0 péptido é considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoelé£ trico como Ό = -54,59 _+ 1 (C=l, 1% Scido acético, não cor
rigido).
EXEMPLO VIII
A síntese de /~Hisl_7-hpGRF(l-32)-NH2 tendo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 é conduzida em etapas usando um sintetizador de péje tidos Beckman 990 numa resina MBHA da maneira descrita no Exemplo I. 0 péptido ê considerado como substancialmente puro, usan
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-16-
do TLC e HPLC. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoelêctrico como Z~= -58,70 _+ l(C=l, l^ó ácido acático, não corrigido).
A síntese é repetida usando Phe como o áltimo resíduo para produzir /”Phe^_7-hpGRF(l-32)-NH?. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoelóctrico oura = -58,20 +. 1 (C=l,
1% ácido acético, não corrigido).
EXEMPLO IX
A síntese de /~P6e1^_y-hpGRF(l-32)-NH2 tendo a fórmula: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Phe-Arg-Lys-Ual-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-dy-Nl·^ é conduzida por etapas usando um sintetizador de péptidos Backman 990 descrito no Exemplo I. 0 péptido ê considq rado como substancialmente puro usando TLC e HPLC. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoeléctrico como Z"°(_7q2 =
= -59,50 (C=l, 1% ácido acético, não corrigido).
EXEMPLO X
A síntese de /_^al^'',_y”hpGRF(l-32)-0H tendo a fórmula: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH é conduzida por etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990 numa resina clorometilada da maneira meneio nada no final do Exemplo I. 0 péptido é considerado substancial mente puro usando TLC e HPLC. A rotação óptica ê medida num polarímetro fotoeléctrico como //X_7q2 - -62,40 +. 1 (C=l, l“o ácido acético, não corrigido).
EXEMPLO XI
A síntese de/~His^, Nle^2_7-hpGRF(l-32)-NH2 tendo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ual-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 é conduzida em etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990 numa resina MBHA, da maneira descrita no Exemplo I. 0 péptido é considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoeléctrico como - -59,32 _+ 1 (C=l, 1% ácido
acético, não corrigido).
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EXEMPLO XII
A síntese de rhGRF(l-43)-0H tendo a Fórmula: H-His-Ala-Asp-rtla-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-T yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH ê conduzida por etapas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa resina clorometilada tendo uma gama de substituição de cerca de 0,1 a 0,5 mmoles/g de resina da maneira indicada no Exemplo VI. 0 péptido ê considerado substancialmente puro usa_n do TLC e HPLC. A rotação óptica è medida num polarimetro fotoeléctrico como = -50,82 _+ l(C=l, 1% ácida acético, não
corrigido).
A sintese ê repetida usando uma resina MBHA para produzir rhGRF(l-43)-NH2 utilizando um procedimento inicial como o descrito na generalidade em Vale et al., patente dos E.U. n2.
4 292 313 para ligar Asn à resina MBHA. 0 péptido ê considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC. A rotação óptica é
BXEMPLO XIII
A síntese de rhGRF(l-4Q)-NH2 tendo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-T yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-NH2 á conduzida em etapas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa resina MBHA como foi descrita na generalidade no Exemplo I. 0 péptido
é considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC, A rota.— -722
ção óptica é medida num polarimetro fotoeléctrico como /_ °Í_/q = = -56,59 _+ l (C=l, 1% ácido acético, não corrigido).
EXEMPLO XIV
-rhGRF(l-43)-QH, tendo a fórmula: H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-rGln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH é conduzida em etapas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa resina clorometilada, da maneira descrita na generalidade no Exemplo XII. 0 péptido ê considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC.
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reeiQajio
IjHiW
EXEMPLO XV
27
A síntese de um análogo hpGRF, isto ê /~Nlez _7-rhGRF (l-32)-NH2 tendo a fórmula:
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH^ ê conduzida por etapas usando um sintetizador de páptidos Beckman 990 numa resina MBHA como no Exemplo I. Esse análogo á considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC. EXEMPLO XUI
A síntese do fragmento de análogo hpGRF isto é /"b-Tyr^D-/-rhGRF(l-29)-NH2 tendo a fórmula:
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-T yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Nl·^ á conduzida por etapas usando um sintetizador de páptidos Beckman 990 numa resina MBHA como no Exemplo I. 0 páptido á considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC.
A síntese ê repetida substituindo D-Tyr por His no N~ter minus para produzir /-D-Tyr'*’’'1'0_7-rhGRF(l-29)-NH2.
EXEMPLO XVII
A síntese de um fragmento de análogo hpGRF isto ê rhGRF (l-29)-NH2, tendo a fórmula: H-His-AÍa-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-T yr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-HÍ£ -Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 ê conduzida por etapas usando um sintetizador de páptidos Beckman 990 numa resina MBHA como no Exemplo III.
0 páptido ê considerado substancialmente puro usando TLC
e HPLC.
EXEMPLO XVIII
A síntese de /~Nle^^_7-^hGRF(l-29)-NH2 tendo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-T yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 ê conduzida por etapas usando um sintetizador de páptidos Beckman 990 numa resina MBHA como no Exemplo I.
0 páptido ê considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC. A rotação óptica ê medida num polarímetro fotoelᣠtrico como Z”= “52,63 _+ l(C=l, l/ó ácido acático, não corri, gido).
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File No. 42238
-19EXEMPLO XIX
A síntese de um análogo hpGRF isto á /f~D-His\ D-Tyr^, D-Ala'l'3_7“rhGRF(l-29)-NH2 tendo a fórmula: H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-D-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Nl·^ é conduzida por etapas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa resina MBHA como no Exemplo I. 0 péptido ê considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC.
EXEMPLO XX
A síntese de um análogo hpGRF isto é /_Tyr\_7_rhGRF(l-29)-NH2 tendo a fórmula:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-I\IH2 ê conduzida por etapas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa resina MBHA como no Exemplo I. 0 péptido é considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC.
EXEMPLO XXI
A síntese de ΓΗΕΗΓ-27"ν®1^^-ΝΗ2_7 tendo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Val-NH2 ê conduzida por eta pas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa resina MBHA como no Exemplo I. 0 péptido é considerado substancialmente puro usando TLC e HPLC.
Em adicionamento aos análogos anteriores enumerados espe, cificamente, os análogos anteriores também são sintetizados usari do as mesmas técnicas de síntese de fase sólida como se evidenci ou aqui já:
CIle27_7_hpGRF(1-29)-NH ,
/“ Ile27_7-hpGRF(l-29)-0H,
/_D-His1_7“hPGRF'(1-32)-NH2J
2“D-Ala27_7_hpGRF(l-32)-NH2,
zfD-Tyri,Nle27J7-hpGRF(l-32)-NH2,
CD-Tyr1,Nle27_7-hpGRF(l-32)-0H,
ΓD-Phe1, Val27_7-hpGRF(l-40)-0H,
/“His1, Phe10_7-hpGRF(l-32)-NH2,
62 239
File No. 42238 -20/"D-Tyr1, Nle27_7-hpGRF(l-40-0H,
/fD-Tyr1, Nle27_7-hpGRF(l-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-0H /"Phe1, Phe10, Ile27J7-hpGRF(l-32)-NH2,
/""o-His1, D-Ala15, Nle27_7-hpGRF(l-32)-NH2, yTD-Phe1, Phe10, D-Met27_7-hpGRF(l-40)-0H, /“lle27_7-hpGRF(l-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, /"He27_7-hpGRF(l-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-0H,
/“D-His1, D-Ala15, D-Ala28_7-hpGRF(l-32)-NH2,
CPhe1, Leu27, D-Ala28_7-hpGRF(l-40)-QH,
/“His1, D-Ual27, D-Ala28_7-hpGRF(l-32)-NH2,
/"D-Tyr1, Phe10, D-Ile27_7-hpGRF(l-39)-NH2, 2fVal27_7-hpGRF(l-40)-0H,
27Val27_7-hpGRF(l-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-QH e /“D-Phe1,D-Ala15,D-Nle27,D-Ala28_7-hpGRF(l-32)-NH2.
Os péptidos sintéticos preparados nos vário
comparados ou com hpGRF(l-40)-0H purificado sintético ou hpGRF(l-40)-Phs-Gln-NH2 purificado sintético em ensaios in vitro para d_e terminar a sua eficácia para estimular a libertação da hormona do crescimento. Todos estes análogos sintéticos têm uma potência substancial para originarem a libertação de GH.
Os ensaios in vitro são efectuados usando hpGRF sintético como um modelo na comparação lado-a-lado, com concentrações equimoleculares dos vários análogos sintetizados. São utilizadas culturas que incluem células de glândulas pituitárias dos ra tos retiradas previamente há quatro ou cinco dias. As culturas consideradas óptimas para a secreção da hormona do crescimento são usadas para o teste comparativo, da maneira geral descrita em Vale et al. Endocrinoloqy, 91, 562-572 (1972).
A incubação com a substância a ser levada a teste é efec: tuada durante 3 a 4 horas e as aliquotas do meio de cultura são retiradas e trabalhadas para a medição do seu conteúdo no GH imu no-reagente (GH ir) por um radio-imuno-ensaio muito conhecido.
Os resultados desse teste comparativa usando concentrações equimoleculares estão indicados na Tabela I que se segue:
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-21
TABELA I
IN VITRO
Péptido
£Nle27_7-hpGRF(l- 32)-NH
CHis1_7~hpGRF(1-32)-NH
CIle27_7-hpCRF(l-32)-QH
C D-Tyr^-hpGRFÍ 1-32 )-NH
/~D-Met27_7-hpGRF(l-32)-NH2
/“Phe1_7-bpGRF(1-32)-NH
/~Phe10_7-hpGRF(l-32)-NH2
/~Val27_7-hpGRF(l-32)-0H
£His1,NIe 27_7-hpGRF(1-32)-NH
x referente a hpGRF(l-40)-Phe-Gln-NH2
Os testes in vitro desses pêptidos
X
Potência Relativa 3,21(2,02-5,43) 2,15(1,12-4,41) 0,20(0,11-0,35) 0,74(0,47-1,14) 0,22(0,13-0,36) 0,13(0,05-0,29) 0,69(0,26-2,63) 0,31(0,21-0,45) 3,22(2,12-5,33)
sintéticos mostram
que o EC^g varia de 20-100 picomolares e a concentração efectiva menor é de 3-8 picomolares. A máxima concentração efectiva para
hpGRF(l-40)NH2 era 1 nanomolar.
Os resultados destes testes comparativos para concentrações equimoleculares dos vários análogos hpGRF baseados em rhGRF
estão indicados na Tabela II.
TABELA II
Péptido
hpGRF(1-40)-0H
(modelo para este teste)
rhGRF(l-43)-0H
rhGRF(l-29)-NH2
/"D-Tyr1 °_7-rhGRF(l-29)-NH2
/-D-Tyr1,1°_7-rhGRF(l-29)-NH2
rhGRF(l-29)-NH2
C Nle27_7-rhGRF(l-32)-NH2
/~Leu1,Nle27_7-rhGRF(l-29)-NH2
/“D-His1,D-Tyr1°,D-Ala15_7_rhGRF(i,29)-NH2
rhGRF/~Val4Zl-NH2_7
Comparação
22
100a/
300/
1100/
34/
600/
920/
1390/ 48 0/ 29/ 670/
Os testes in vitro desses pêptidos sintéticos mostram que o FCç.g varia de 20-100 picomolares e que a concentração efe£ tiva menor é de 3-8 picomolares. A concentração efectiva máxima para rhGRF(l-43)-0H ô 1 nanomolar.
Em adicionamento aos testes in vitro para a secreção da hormona do crescimento, as experiências in vivo também são leva-
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-22das a cabo injectando o péptido sintético através de um catêter sempre posto em ratos machos normais correndo livremente. Os ani. mais são previaments tratados com FLA-63, um inibidor dopamina hidroxilase que suprime a secreção GH espontânea sem afectar a resposta ao GRF exógeno. São tiradas amostras de sangue pelo mesmo catêter de imediatamente antes até 5 e 20 minutos apés as injecções; os níveis de GH no sangue são medidos por radio-imuno-ensaio. Os resultados mostram que os análogos sintéticos hpGRF são estimulantes poderosos da secreção da pituitária GH. Verifica-se que são eficazes doses entre cerca de 20 nanogramas e cerca de 25 microgramas por kg de peso do corpo.
Mais testes indicam que outros análogos hpGRF sintéticos, sintetizados nos outros Exemplos, evidenciam potências substanci. ais e deles podem tirar-se algumas conclusões gerais.
1. A amidação C-terminal não parece aumentar a activida de de péptidos GRF de um comprimento de cadeia maior que 39 resí. duos mas não aumenta a potência de péptidos menores que 39 resíduos de extensão.
Por exemplo, /7"lle27_7-hpGRF(l-32)-NH2é mais poderoso do que /"~Ile27_7-hpGRF(l-32)-0H;
/“D-Tyr1,Nle27_7-hpGRF(l-32)-NH2 ê mais poderoso do que
/"D-Tyr1,Nle27_7-hpGRF(l-32)-0H; e
/"lle27_7-hpGRF(l-29)-NH2 ê mais poderoso do que
/~Ile27_7-hpGRF(l-29)-0H. Contudo,
/“lle27_7-hpGRF(l-44)-NH2 ê tão poderoso como
/"Ile27_7-hpGRF(l-44)-0H.
2. Nas séries de péptidos amidados, os análogos de 32
resíduos são substancialmente tão poderosos como os análogos mais 2 7
longos correspondentes; por exemplo, /~Nlez _7-hpGRF(l-32)-NH„ tem mais ou menos a mesma potência que /~Nlez _7-hpGRF(l-44)-NH2·
3. Nas séries de péptidos com terminus de carbóxi livre, os análogos correspondentes tendo mais de 39 resíduos são igualmente poderosos. Por exemplo /~Val27__7-hpGRF(l-40)-0H e /"Val27__7_ -hpGRF(l-44)-0H são da mesma potência, como são /"D-Tyr1,Nle27_/-hpGRF(l-40)-0H e /"D-Tyr1,Nle27_7-hpGRF(l-44)-0H.
Os análogos sintéticos hpGRF devem ser úteis para aplica çães em que um médico deseja elevar a produção de GH. A estimulação de secreção GH por análogos hpGRF tem interesse em doentes com uma deficiência relativa ou completa de GH originada por sub
62 239
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-23produção de GRF endógeno. Além disso, ê provável que a secreção aumentada de GH e □ aumento acessório de crescimento se possa obter em seres humanos ou animais com níveis normais de GH. Além disso, a administração de hpGRF vai alterar o conteúdo de gordura do corpo e modificar outros processos dependentes de GH-metabólicos, imunológicos e de desenvolvimento. Por exemplo, os aná logos de hpGRF podem ser úteis como um meio para estimular processos anabólicos em seres humanos em circunstâncias como ocorrência de queimaduras. Num outro exemplo, os análogos de hpGRF podem ser administrados a animais comerciáveis como galinhas, p_e rús, porcos, cabritos, gado vacum e carneiros para acelerar o crescimento e aumentar a razão de proteínas em relação à gordura Podem ser usados em aquicultura para melhorar o peixe e outros animais marinhos de sangue-frio, por exemplo tartarugas do mar e enguias e anfíbios. Para administração a seres humanos os análo gos sintéticos hpGRF devem ter uma pureza de pelo menos cerca de 93/o e, de preferência pelo menos 98/. Essa pureza significa que o péptido desejado constitui o peso estabelecido em / de todos os péptidos semelhantes e fragmentos de péptidos presentes.
Para administração de análogos sintéticos hpGRF a animais comerciáveis ou outros animais, para se estimular o crescimento e reduzir o conteúdo de gordura pode ser aceitável uma pureza baixa como de 5% ou mesmo mais baixa como cerca de 0,001%. Se forem produzidos por processos de engenharia genética os análogos podem ter inicialmente purezas muito baixas.
Os análogos sintéticos hpGRF ou os seus sais não tóxicos combinados com um veículo farmacêutica ou veterinariamente aceitável para a formação de uma composição farmacêutica, podem ser administrados a animais, incluindo seres humanos por vias intravenosa, subcutânea, intramuscular, intranasal ou oral. A administração pode ser empregada por um clínico para estimular a libertação de GH quando o paciente que está a ser tratado requer uma tal terapia. A dose necessária irá variar com o estado esp.e ciai que vai ser tratado, com a gravidade da situação e com a d_u ração do tratamento desejado.
Tais péptidos são por vezes administrados na forma de sais não tóxicos, farmacêutica e veterinariamente aceitáveis, co mo sejam sais ácidos de adição ou complexos metálicos por exem62 239
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considerados sais pa
η ι
V
-24plo com zinco, Ferro ou semelhante (que são ra fins desta aplicação).
São demonstrativos desses sais ácidos de adição os clori drato, bromidrato, sulfato, fosfato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartrato e semelhantes.
3e o ingrediente activo á para ser administrado oraimente na forma de comprimidos, o comprimido pode conter um ligante, como seja goma arábica, amido de milho ou gelatina; um agente de desintegração como ácido algínico; e um lubrificante como esteara to de magnésio. Se se desejar a administração na forma liquida pode utilizar-se o adoçamento ou um elemento de sabor e pode efe£ tuar-se administração intravenosa em água salgada isoténica, em soluções amortecedoras de fosfato ou semelhantes.
Os péptidos devem ser administrados a seres humanos sob indicação de um clinico e as composiçães farmacêuticas conterão habitualmente o péptido em conjunto com um veiculo convencional farmaceuticamente aceitável. Geralmente a dose parentêrica irá de cerca de 20 nanogramas a cerca de 25 microgramas do péptido por quilograma do peso do corpo do doente.
Embora o invento tenha sido descrito com referência às representações preferidas e que constituem o melhor processo conhecido no presente pelos inventores, deve compreender-se que se podem fazer várias alterações e mudanças como será êbvio a uma pessoa habitualmente entendida na arte, isto sem se sair do âmbi to do invento que está exposto nas reivindicações juntas. Por exemplo, podem fazer-se modificações na cadeia do péptido especi. almente remoções começando no terminal carboxil do péptido, de acordo com as práticas experimentais conhecidas até agora para a criação de fragmentos que retenham partes muito substanciais ou toda a potência do péptido e esses péptidos são considerados como estando no âmbito do invento. Além disso, podem fazer-se ad_i cionamentos em qualquer terminal ou em ambos os terminais e/ou os resíduos geralmente equivalentes podem ser substituídos por resíduos que ocorrem naturalmente, como ê ,bem sabido em toda a arte da química dos péptidos, para se produzirem análogos tendo pela menos uma porção substancial da potência do polipéptido ori. ginário, sem desvio do âmbito do invento.
As várias características do invento estão descritas nas reivindicações juntas.
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Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES1 - Processo de preparação de compostos definidos pela fórmula (I): H-R^-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-R^g-Arg-R|2“-R .j-L eu-R 15-G1 n-Leu-R^g-A la-A rg-Lys-Leu-L 613^24-825“ ^-^-^27^28 -A rg-Gin-Gln-Gly-Glu-R ^-Asn-Gln-Gl u-Rjg-R-jg-R^ q-A ^-842^43-^44em que R^ ê Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His ou His; Rg é Ser ou Asn; R^g é Tyr, Phe ou D-Tyr; R.^ & Arg °u Lys; R^j ê Ile ou Vai; R^^ ê Gly ou D-Ala; R^g é Tyr ou Ser; R24 δ His ou Gin; R25 δ Glu ou Asp; R27 é seleccionado do grupo que consiste dc D- e L-jeómeros de Ala, Nle, Leu, Met e Vai; R2g é Ser, Asn ou D-Ala; R·^ δ Arg ou Ser; R^g é Gin ou Arg; R^^ é Arg ou Gly; R^g ê Ser ou Ala; R^ δ Phe ou Ala; R43 é Asn ou Arg; R44 ê um amino ácido natural ou des-R44, e Y significa a metade carboxil do resíduo arnino ácido no C-terminus e é 0 radical -CUOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') ou -CH20R, sendo R e R' alqui lo inferior, fluoro alquilo inferior ou hidrogénio, provendo-se contudo que quando R^ é Tyr, então R2^ δ outro sem ser Met, Rg ê Ser, R12 δ Arg, R^^ é Ile, R^g é Tyr, R24 δ His, R25 δ Glu, R28 é Asn, Rj4 ê Arg, R^g é Gin, R^^ ê Arg, R4Q δ Ser, R42 δ Phe ou R43 é Asn; provendo-se ainda que qualquer ou todos os resíduos de 28 a 44 possam ser retirados para se prover um fragmento biologicamente activo; ou um sal não tóxico do que foi mencionado anteriormente; incluindo (a) a formação de um pêptido tendo pelo menos um grupo protector e a fórmula (ll) : X -R.(X ou Xz)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Rg(X4 ou X5)-Ser(X J-R^X2)-Arg(Xó)-R (X6 ou X7)-R13-Leu-R15-Gln(X5)-Leu-R18(X2)-Ala-Arg (X^)-Lys(X'j-Leu-Leu-R„,(X ou X5)-ROI.(X3)-Ile-R„„-R„a(X4 ou X5)x c à ς-Arg(X )-Gln(X )-Gln(X )-Gly-Glu(X J-R^X ou X6)-Asn(X )-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X5 ou X6)-R3g(X6)-R (X4)-Arg(X6)-R42-R43(X5 ouX6)-R44(X8)-X9 em que: X, X1, X2, X3, X4, X5, Xé, X7 e Χθ são,cada um, ou hidrogénio ou um grupo protector e X^ ê ou um grupoprotector ou urna ligação de ancoragem para suporte de resina ou gdes-X , e nesse caso o resíduo no C-terminal tem uma metade carbóxi a qual é Y; (b) separando 0 grupo ou grupos protectores da ligação de ancoragem do dito pêptido da fórmula (ll) ; e (c) se se desejar, convertendo um pêptido resultante num seu sal não tóxico.2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, em que X"1é hidrogénio ou um grupo de protecção °( -amino; X é hidrogénio62 239File No. 42238-262cu um grupo de protecção para o nitrogénio imidazole de His; Xê hidrogénio ou um grupo de protecção para o grupo hidroxil fenólico de Tyr; X3 é hidrogénio ou um grupo de protecção para ogrupo carboxil de Asp ou Glu; X4 é hidrogénio ou um grupt/de pro 5tecção para o grupo hidroxil alcoólico de Ser e Thr; X é hicJrq gênio ou um grupo de protecção para o grupo amido de Asn ou Gin; X6 ê hidrogénio ou um grupo de protecção para o grupo guanidino7de Arg; X ê hidrogénio ou um grupo de protecção para o grupo de cadeia lateral amino de Lys.3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, em que X êhidrogénio ou Tos; X1 é BOC, X2 ê DCB, X3 é OBzl; X4 ê Bzl, X56 7 8ê Xan; X ê Tos, X ê 2-clorobenziloxicarbonil e X ê -NH-supor, te de resina.
4 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações a 3, em que R, é His. 5 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, em que Y é C0NH2 • 6 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que & Nle ' · 7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 6, em que Ryg é Tyr, Ry5 ê Gly e R28 ê Ser. 8 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 6, em que Ryg ê Tyr; R15 é D-Ala e R„g ê D-Ala. 9 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3, em que Ry ê ι D-Tyr e R 27 é Nle, Uai . ou Ile. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um péptido sintético tendo a sequência: His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn.11 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-10, ern que os resíduos de 33 a 44 são retirados.. o '·!!
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