PT86544B - Processo para a preparacao de peptideos analogos de grf - Google Patents
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-
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Description
A presente invenção refere-se a péptidos que exercem influência na função ãa glândula pituitária ncs peixes, aves e mamíferos. Sm particular, a presente invenção refere-se a um péptido que promove a libertação da hormona de crescimento, pela glândula pituitária
ANTECEDE?7TES DA INVSFÇÃO
Os fisiologistas sabem há muito tempo que o hipotálamo con trola as funções da secreção da aaeno-hipófise, produzindo c hi potálamo substâncias especiais que inibem ou estimulam a secreção de cada hormona de pituitária. Um factcr de inibição do hi potálamo foi caracterizado em 1972 sob a forma de somatostatina que inibe a secreção da hormona de crescimento (GH). Em 1982 isolaram-se os factores de libertação pancreáticos (tumor), humanos (hp GRF), a partir de extractos de tumores pancreáticos humanos, purificados, caracterizados, sintetizados e testados, que se verificou promoverem a libertação de GH pela pituitária. Têm-se reproduzido estes factores hipofisiotrópicos por síntese total e têm-se sintetizado análogos das estruturas nativas. Demonstrou-se que o factor de libertação de GH hipotalâmico huma no (GRF) tem precisamente a mesma estrutura. Têm-se também caracterizado e sintetizado os correspondentes factores de libertação de GH hipotalamica (GRFs) das espécies das ratazanas, das espécies suínas, das espécies ovinas e das espécies bovinas e caprinas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Sintetizaram-se e testaram-se agora polipéptidos sintéticos que libertam a GH a partir de células da pituitária cultivadas os quais têm por base a sequência do GRF dos peixes teleos teos e exibem nos peixes uma proteína muito substancialmente aumentada. Estes péptidos podem possuir entre 27 a 45 resíduos, em comprimento, (sendo encurtados por eliminação de uma sequên
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cia desejada começando no terminal C), podem existir sob a forma de ácidos ou amidas livres e podem possuir Mie, Leu, Vai, ATva, Gin, Thr, 11° ou Met na posição 5 θ na posição 27·
As composições de acordo com a invenção incluem tais pépti dos que possuem entre 27 e 44 resíduos, em comprimento, ou um sal não tóxico de qualquer deles, disperso num veículo sólido ou líquido veterinária ou farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser utilizadas para promover o crescimento de animais de sangue quente, incluindo aves e particularmente em aquicultura de animais de sangue frio, por exemplo, peixes, enguias, etc..
Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um péptido que pode ser preparado por síntese química e que é eficaz a acelerar 0 crescimento ae peixes, cu de outros animais
-Me Tyr, N-Me His, N-Et Tyr, N-Et His, N-Ip His ou N-Ip Tyr;
Numa outra forma de realização preferida a invenção proporciona um péptido que pode ser preparado por síntese química e que é eficaz a acelerar o crescimento de peixes, ou de outros animais de sangue frio, péptido que tem a formula:
H-His-Ala-Asp-Gly-Rr-Phe-Asn-Lys-AlaTyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-
Ainda numa outra forma de realização preferida, a invenção proporciona péptidos que podem ser preparados por métodos de ADN recombinante e que são eficazes a acelerar o crescimento de peixes, ou de outros animais de sangue frio, péptidos que têm a
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-5f órmula: H-Hi s- Ala-A sp- Gly-R^- Phe-A sn-Ly s- Ala- Tyr-Arg-Ly s-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-R^-R^-R^p-R^r-h-T-NH^ em que Rr é Met, Ile ou Leu: Rnl7 é Met, Ile ou Leu; R2g é ~R29’ R3C -r31.
Ainda numa outra forma de realização preferida, a invenção proporciona péptidos, que podem ser preparados por métodos de ADN recombinante e que é eficaz a acelerar o crescimento de peixes, ou de outros animais ae sangue frio, péptidos que têm a fór mula: H-His-Ala-Asp-Gly-Rcf-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R^-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-R^-Ile-Glu-Asp-Asp-A sn-Glu-Pro-Leu-Ser-Y em que Rr·, e R,z são seleccionados de entre Met e Leu e Y é 5’ 27 3^
HH2 ou OH.
Ainda numa outra forma de realização preferida, a invenção proporciona péptidos que são eficazes a acelerar 0 crescimento de peixes, ou de outros animais de sangue frio, péptidos que têm a fórmula: H-His-D-Ala-Asp-Gly-R^-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R^ -R25-49-R^q-R^i-NHR em que R^ é Met, Nle, Ile ou Leu; Rg? & Met, Nle, Ile ou Leu; R2g é Ala, Ser, Asn ou des-R^g; R^ é Lys ou Arg ou des-R2^; R^Q é Arg ou Gin ou des-R^; R^ é Vai ou Gin ou des-R^; e R é H Numa outra forma de tidos que são eficazes a outros animais de sangue H-His-Ala-D-Asp-Gly-4-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R^-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-R^^-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-31u-Pro-Leu-Ser-NH2 em que R^, R2? e R^g são seleccionados de entre Met, Nle e Leu.
é Met, Nle, Ile ou Leu R^g é Ála, Ser, Asn ou des-R, t é Arg ou Gin ou des-R^;
ou alquilo inferior, realização, a invenção acelerar o crescimento frio, péptidos que têm proporciona pépde peixes, ou de a fórmula:
DESCRIÇÃO DETALHADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS
A nomenclatura utilizada para definir os péptidos é a especificada por Schroder & Lubke, The Peptides”, Academic Press (1965), na qual de acordo com a representação convencional, o
IF
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-6cas q representado na expressamente indicado etilo e Ip isopropilo. inferior significa uma átomos de carbono.
forma L o ccntráD-N1L1 cadeia de grupo amino no N-terminal aparece à esquerda e o grupo carboxilo no C-terminal à direita. São amincácidos naturais os comuns que ocorrem naturalmente nas proteínas, e que são referidos pelas abreviaturas: Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp e His. Nle significa norleucina e Nva norvalina. Quando o resíduo de aminoácido apresenta formas isoméri do aminoácido a menos que seja rio. Me significa metilo, Et, significa N-Me B-Ala e alquilo carbonos possuindo entre 1 a 4
A invenção proporciona péptidos que possuem a seguinte sequência (I) : R^-R2-R^-R4-R^-Phe-Rr,-Rg-R^-Tyr-Arg-R^2-R^^-Leu-R1^-Gln-Leu-R1g-Ala-Arg-Lys-R22-Leu-R24-R25-R2g-R2r7-R2g-R2^-R^0',R31Gly”R33R34~R35*’R36“R37~R38“R39R40R41“R42'‘R43‘’R44“Ser“ em que Rj é N-Me Tyr, Tyr, desNH2-Tyr, D-Tyr, N-Et Tyr, N-Ip Tyr N-Me His, His, desNH2-His, D-His, N-Et His, e N-Ip His; R2 é Ala, D-Ala ou D-NMA; R^ é Asp ou D-Asp; R4 é Gly ou Ala; R^
Ile, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, Ser, Tyr e Trp; R? é Asn ou Thr; , é Ala ou Ser; R^2 é Lys ou Arg;
Tyr; Glu; Arg;
R34 e N-Ip His;
,β & λisp v>m. u—A&jjj R^ e Gly ou Ala; seleccionados de entre o grupo que consiste em Met
Nva, Gin, Thr
Lys, Phe,
Asn
Ala, Vai ou
Tyr ou Leu;
Leu ou Ile;
Arg ou Gin;
e R22 são
Leu, Vai,
His, ITle,
Rg é Lys, é
é é
z e
Arg ou Ser; R
Thr, Ile ou Nle;
R39 ou Lys; R^ θ Glu
R.. é Leu ou Ala;
’ guintes grupos esteja presente:
R22 é Tyr e R^ ou todos os resíduos após R,,? possam ser deleccionados. 0 terminal C é de preferência OH ou NHR sendo R hidrogénio ou alquilo inferior.
Os fragmentos da sequência.do péptido (I) que se prolongam
----,
Phe ou Ser;
Ile;
R24 R28 R31 8 ; R37 é Asp, Arg ou Gly; R^ç é Asp, Ser ou Ala; R^ é Asn, Arg R42 é Glu, Phe, Ala ou Vai; R^ é Pro, Asn ou Arg;
com a condição de que pelo menos um dos seR? é Asn, Rg é Lys, R·^ é Ala, é Thr; e ainda com a condição de que qualquer possam ser deleccionados.
Pro, I R9 é Gly ou Ala;
His ou Gin;
Ala, Ser ou Asn; Vai ou Gin;
— 5
R.
é é
é
Ser ou Asn; R_z ’ 3o é Ile ou Glu;
S40
Ala ou Vai;
R25
R33 e Gly ou é Met, Leu
R^g é Glu é Asp, Ser ou Ala;
ou R13 R22 R2ó R30 é Gly,
Gin,
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-7desde o terminal N até ao resíduo 27 possuem capacidade biológica para efectuar a libertação aa GH pela pituitária e essss fragmentos biologicamente activos são considerados como estando dentro do âmbito da invenção. Quanoo o fragmento de péptido se pro longa apenas até ao resíduo 2? ou 28, o terminal C aeverá ser -NH^ ou uma amida substituída. Quando o fragmento se prolonga até um dos resíduos 29 a 39, o terminal C é de preferência uma amida ou uma amida substituída, mas pode ser -CH. Quando o frag mento tem 40 ou mais resíduos não há nenhuma preferência para o grupo no terminal C.
Os péptidos são sintetizados por um método apropriado, tal como, por exemplo, exclusivamente por técnicas fase-sólida, parcialmente por técnicas fase-sólida, por condensação de fragmento ou por ligações clássicas, em solução. A utilização das técnicas de ADN recombinante desenvolvidas recentemente pode ser usada para preparar uma porção de um péptido que contém apenas resíduos de aminoácidos naturais, que podem depois ser ligados a péptidos de terminal curto. Por exemplo, as técnicas de síntese exclusivamente ae fase-sólida são descritas no livro^texto ”solid-Phase Peptide Synthesis”, Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, θ são exemplificadas por descrição na paten te Americana n® 4 105 603, publicada em 8 de Agosto de 197θ, para Vale et al. A síntese em solução, clássica é descrita em detalhe na obra Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl)í Synthese von Peptiden, E. Wunsch (editor) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, W. Ger. 0 método de condensação do fragmento é exemplificado na patente Americana ne 3972859 (3 de Agosto de 1976). Outras sínteses apropriadas são exemplificadas na patente Americana n® 3642067 (15 de Outubro de 1974) e na patente Americana ns 3^62925 (28 de Janeiro de 1975)·
Comum a essas sínteses é a protecção dos grupos de cadeia lateral lábeis das várias porções de aminoácidos com grupos pro tectores apropriados que evitarão a ocorrência de reacção química nesse local até que c grupo seja finalmente removido. É normalmente também comum a protecção de um grupo alfa-amino num aminoácido ou num fragmento quando esta entidade reage no grupo carboxilo seguindo-se a remoção selectiva do grupo pro
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-8tector alfa-amino para permitir que a reacção subsequente tome lugar nesse local. Por consequência é comum, que como um passo da síntese, se produza um composto intermediário, que inclui cada um dos resíduos de aminoácidos na sequência desejada da cadeia de péptido com os grupos protectores da cadeia lateral ligados aos resíduos apropriados.
Consideram-se também dentro do âmbito da presente invenção os processos que formam intermediários da fórmula (II): X-R^-CX1 ou X2)-R2-R3(X3)-R4-R5(XX)-Phe-R7(X4 ou X^)-Rg(X4, X' ou X7)-R9(X4)-Tyr(X2)-Arg(X°)-R12(Xò ou X^-R-^-Leu-R^-ClníX^)-Leu-R18(X2 ou X4)-Ala-Arg(X6)-Lys (X7)-R22(X2)-Leu-R24(X1 ou xb-R2^(X3 ou X4)-R26-R27(XX)-R2q(X4 ou xb-R29-(X6 ou X7)-R3O (X^ ou X6)-R31(xb-Gly-R33(X3)-R34(X4 ou X^R^ÍX4 ou X^-R^ (X3 ou X4)-R37(X3)-R3g(X3 ou X? ou X6)-R39(X3 ou X°)-R40(X3 ou X4)-R4i(X^ ou X6 ou X7)-R42(X3)-R43(X5 ou X6)-R44~Ser(X4)-X8 em que:
X é quer hidrogénio quer um grupo protector alfa-amino. Os grupos protectores alfa-amino contemplados são os grupos eficazes bem conhecidos do estado da técnica da síntese de polípéptidos jaor passos. De entre as classes de grupos protectores alfa-amino utilizados salientam-se (1) os grupos protectores do tipo ureI tano aromáticos, tais como fluorenil-metiloxi-carbonilo (FMOC), benziloxi-carbonilo (Z) e Z substituído, tal como p-cloro-benziloxi-carbonilo, p-nitrobenziloxi-carbonilo, p-bromobenziloxi-carbonilo e p-metoxi-benziloxi-carbonilo; (2) grupos protectores de uretano alifáticos, tais como t-butiloxi-carbonilo (BOC), di-isopropil-metiloxi-carbonilo, isopropiloxi-carbonilo, etoxi-carbonilo, aliloxi-carbonilo; e (3) grupos protectores do tipo uretano cicloalquilos tal como ciclopentiloxi-carbonilo, adamantiloxi-carbonilo e ciclo-hexiloxi-carbonilo. 0 grupo protector alfa-amino preferido é BOC.
χΐ é hidrogénio ou um grupo protector para o azoto do imidazol de His, tal como benziloximetilo ou Tos.
X pode ser um grupo protector apropriado para o grupo hidroxilo fenólico de Tyr tal como tetra-hidro-piranilo, butilo
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-9terciário, tritilo, Bzl, CBZ, 4Br-CBz e 2,6-dicloro-benzilo (DCB). 0 grupo protector preferido é 2,6--diclorobenzilo. X^ pode ser hidrogénio c que significa que nãc existe nenhum grupe protector de cadeia lateral no resíduo de aminoácido nessa pesi ção.
X-3 é hidrogénio ou ura grupo protector, formador de éster, apropriado para o grupe carboxilo de Asp ou Glu, tal como benzilo (Bzl), 2,6-diclorobenzilo, metilo, ciclo-hexilo cu etilo.
X pode ser um grupo protector apropriado para o grupo hidroxilo cie Thr ou Ser tal como acetilo, benzoílo (Bz), butilo, terciário, tritilo, tetra-hidrc-piranilo, Bzl, 2,6-diclcro-benz 4 zilo e CBZ. 0 grupo protector preferido e Bzl. X pode ser hidrogénio o que significa que nãc há nenhum grupo protector no grupo hidrcxilc.
X^ é hidrogénio ou um grupo protector apre^priado para o grupo amido de cadeia lateral de Asn ou Gin. Prefere-se o grupo xantilo (Xan).
X^ é um grupo protector apropriado para o grupo guanido de Arg tal como nitro, Tos, CBZ, adamantiloxi-carbonilo e BOC, ou é hidrogénio.
X é hidrogénio ou um grupo protector apropriado para o grupo amino de cadeia lateral de Lys. Grupos ilustrativos protectores de amino de cadeia lateral apropriados são 2-cloro-benziloxi-carbonilo (2-C1-Z), Tos, t-amiloxicarbonilo e BOC.
XX é um grupo protector de cadeia lateral apropriado,seleccionado de entre os descritos atrás ou é hidrogénio
Met pode ser protegido opcionalmente por exigénio, mas está de preferência desprotegido.
A selecçãc de um grup.G protector amino de cadeia lateral não é crítica excepto que geralmente se escolhe um grupo que não é removido durante a desprotecção dos grupos alfa-amino durante a síntese. Contudo, para alguns aminoácidos, por exemplo, His, a protecção não é geralmente necessária após se ter completado a ligação e os grupos protectores podem ser os mesmos.
Xo é um grupo protector apropriado para o grupo carboxilo
O dc terminal C, tal como o grupo XJ formador de éster ou é uma ligação de fixação utilizada na síntese de fase-sólida para
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File ΝΒ 46744 ligar a um suporte sólido de resina ou é des-X° em que o resíduo no terminal C tem um grupe carboxilo (Y) como se definiu artes, isto é, ácido livre, amiaa ou arnica substituída. Quando se utiliza um suporte sólido de resina, pode ser qualquer um acs que se conhece da técnica, tal como os que possuem a fórmula:
-C-CEL-suporte de resina, -NH-benzidrilamina (BHA) suporte de resina ou -NH-parametil-benzidrilamina (MBHA) suporte de resina. Quando se deseja a amida não substituída, prefere-se a utilização da resina ΣΉΑ cu IffiHA, porque a clivagem dá a amida directamente. TTc caso de se desejar a F-metil amida, esta pode ser formada a partir de uma resir.a N-metil BHA. Outras amidas substituídas podem ser sintetizadas pelo processo descrito em T. Kornreich et al. Int. J. Peptice Protein Res., 25 (1985) 414 -420. Quando se desejam grupos diferentes de ácido livre, no terminal C, deve-se, de preferência, sintetizar o péptido utilizando métodos clássicos como se descreve no texto de Houben-Weyl.
Na fórmula do intermediário um dos grupos X, pelo menos, é um grupo protector ou Xo inclui um suporte de resina. Deste modo, a invenção também proporciona um método para a preparação de um péptido de interesse por (a) formação de um péptido possuindo, pelo menos, um grupo protector e a fórmula (II) em que X, x\ X^, χ3, χ4, X^, X6,X7 e XX são cada um hidrogénio ou um grupo protector e Χθ é um grupo protector ou uma ligação de fixação a um suporte de resina ou é des-Χθ, em que o resíduo no terminal C tem o grupo carboxi (Y); (b) separação do grupo ou grupos protectores ou ligação de fixação a partir do péptido da fórmula (II); e (c) se se desejar, conversão do péptido resultante de sequência (I) num sal correspondente não tóxico.
Ao seleccionar um grupo protector de cadeia lateral específica para ser utilizado na síntese de péptidos seguem-se 'as seguintes regras gerais: (a) o grupo protector retém, de preferência, as suas propriedades protectoras e não é separado sob condições de acoplamento, (b) o grupo protector deve ser estável ao reagente e com a excepção de Xan, prefere-se estável sob condições de reacção seleccicnadas para remover o grupo protector alfa-amino em cada passo da síntese e (c) o grupo protector de cadeia lateral deve ser removível, após se ter completado a sín
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-11tese da sequência de aminoácido desejada sob condições de reacção que não devem alterar de forma indesejável a cadeia do péptido.
Quando os péptidos não se preparam utilizando tecnologia de ADN recombinante, são preparados, de preferência, utilizando a síntese de fase sólida, tal como a descrita, geralmente, por Merrifield, J.Am. Chem. Soc., 85, p 2149 (1963), embora outras sínteses químicas, equivalentes, conhecidas da técnica possam também ser utilizadas como se mencionou previamente. A’ síntese de *
fase solida é iniciada a partir do terminal C do péptido por acoplamento de um ácido alfa-amino protegido a uma resina apropriada. Tal material inicial pode ser preparado por ligação de um aminoácido alfa-amino protegicic por uma ligação éster a uma resina clorometilada ou a uma resina de hidroximetilo ou por una ligação amida a uma resina BHA ou a uma resina MBHA. A preparação da resina de hidroximetilo é descrita por Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38? 1597-98 (1966). As resinas clorometiladas estão comercialmente disponíveis a partir de Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia e a partir de Lab. Systems, Inc., A preparação de tal resina é descrita por Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis’1, Pierce Chemical Co., Rockford, 1111nois (1984), chapter 1. Como se especificou neste texto os suportes de resina BHA e KBHA estão comercialmente disponíveis e são geralmente utilizados apenas quando o péptido desejado, a ser sintetizado, tem uma amida não substituída no terminal C.
aminoácido do C-terminal, por exemplo Leu, para um péptido cora 44 resíduos ou Ser para um péptido com 45 resíduos, protegido por BOC, pode ser, em primeiro lugar, acoplado à resina clorometilada de acordo com o processo descrito em Chemistry Letters, K. Horiki et aL 165-168 (1978), utilizando KF em DMF a cerca de 6o°C durante 24 horas com agitação quando se vai sintetizar 0 péptido com 44 resíduos isento de ácido. A seguir ao acoplamento do aminoácido protegido com BOC ao suporte de resina, o grupo protector alfa-amino é removido, utilizando ácido trifluoroacético (TFA) em cloreto de metileno ou TFA isoladamente. A desprotecção é levada a efeito a uma temperatura compreendida entre cerca de 0°C e a temperatura ambiente. Outros rea-
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gentes de clivagem padrão tal como HC1 em dioxano e condições de remoção de grupos protectores alfa-amino específicos podem ser utilizados como se descreveu em Schroder Lubke, The Peptides, 1 pag 72-75 (Academic Press 1965).
Após remoção do grupo protector alfa-amino, os aminoácidos de cadeia lateral protegida e alfa-amino restantes sãc· acoplados passo a passo na ordem desejada para se obter o composto intermediário definido antes ou como alternativa para se adicionar cada aminoácido separadamente na síntese, alguns dos quais podem ser acoplados uns aos outros antes da adição ao reactor de fase solida. A selecção ae um reagente de acoplamento apropriado está ao alcance de um perito da especialidade. Particularmente apropriado como reagente de acoplamento é Ν,Ν’-diciclc-hexil-carbo-diimida (DCCI).
Os reagentes de activação utilizados na síntese de fase sólida dos péptidos são bem conhecidos na técnica dos péptidos. Exemplos de reagentes de activação apropriados são carbodiimidas tais como N,N’-di-isoprcpil-carbodiimida e N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida. Outros reagentes de activação e a sua utilização no acoplamento de péptidos são descritos por Schroder & Lubke supra, no capítulo III e por Kapoor, J. Phar. Sei., 59, pag 1-27 (1970).
Cada aminoácido, ou sequência de aminoácido protegido é introduzido no reactor de fase sólida num excesso de 4 vezée ou mais e o acoplamento pode ser levado a efeito num meio de dimetilformamida (DMFhCHgC^ (1:1) ou em DMF ou em CH2C12, isoladamente. Nos casos em que ocorre acoplamento incompleto, o processo de acoplamento é repetido antes da remoção do grupo protector alfa-amino, antes do acoplamento do aminoácido seguinte. 0 sucesso da reacção de acoplamento em cada passo da síntese, se processada manualmente, é, de preferência, controlado pela reacção de ninidrina como descreveu E. Kaiser et al., Anal. Blochem. 34, 595 (1970)· As reacções de acoplamento podem ser realisadas automaticamente, como num sintetizador automático 990 de Beckman, utilizando um programa como c descrito em Rivier et al. Biopolymers, 1978, 17, pag. 1927-1938.
Após se ter completado a sequência de aminoácidos desejada,
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-13o péptido intermediário pode ser removido do suporte de resina por tratamento com um reagente, tal como ácido fluorídrico líquido, que não só cliva o péptido da resina mas também cliva todos os grupos protectcres de cadeia lateral restantes X^, X^? x4* X^, X^ e X? e a ligação de fixação Χθ e também o grupo protector alfa-amino X,se se usar algum,p?ra se obter o péptido na forma de ácido livre. Se Met estiver presente na sequência, o grupo protector BOC é, de preferência, removido em primeiro lugar utilizando ácido trifluoroacético (TFA)/etanoditicl antes de clivar o péptido da resina com HF para eliminar a S-alquilação potencial. Quando se utiliza o ácido fluorídrico para clivagem, o anisol, p-cresol, sulfureto de metiletilc e/cu outros depuradores são incluídos,de preferência, no vaso da reacção.
Os exemplos a seguir apresentam um método preferido para a síntese dos péptiaos per técnicas de fase sólida. Pretender-se-à, certamente, que a síntese de um fragmento de péptido correspondentemente mais curto seja efectuada do mesmo modo por se eliminar, meramente, o número de aminoácidos necessário em cada extremidade da cadeia; contudo, deve-se notar que os fragmentos biologicamente activos devem conter a sequência indicada no terminal-N.
Exemplo 1
A síntese do péptido com 44 resíduos possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Fro-Leu-NH2 θ conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 Beckman sobre uma resina MBHA que possui uma gama de substituição de cerca de 0,1 a 0,5 moles/g resina. 0 acoplamento de Boc-Leu à resina realiza-se pelo processo geral descrito em Vale et al. patente americana ns 4292313» utilizando uma quantidade 3 vezes em excesso, em C^C^, com ECC como reagente de activação durante 2 horas, com agitação. Isto resulta na substituição de cerca de 0,2 - 0,6 mmoles de Leu por grama de resina.
Após o desbloqueamento e a‘neutralização, a cadeia do pép
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File Ks 46744
-14tido é construída passo a passo sobre a resina. 0 desbloqueamen to, a neutralização e a adição de cada aminoácido realizam-se, em geral, de acorde ccm o processo descrito, em detalhe, em Rivier, J, J. Amer. Ohern. Scc., 96, 29θό-2992 (1974). Todos os solventes utilizaucs sãc cuidadosamente desgaseifiçados por aspersão com um gás inerte, por exemplo, hélio cu nitrogénio, para assegurar a ausência de oxigénio que pode oxidar de modo inoesejável 0 enxofre do resíduo Met.
C úesbloqueamento é levado a efeito, de preferência, de acordo com a escala A que se segue:
Escala A
Tempo de mistura (min)
Reagente
| 1. | 6ϋ/ TFA/2% etanoditiol |
| 2. | 6c/ TFA/2% etanoditiol |
| 3. | IPA/1% etanoditiol |
| 4. | Et^N (10%) em CH2C12 |
| 5» | MeOH |
| 6. | Et^N (10/) em CH2C12 |
| 7. | MeOH (duas vezes) |
8. CH2C12 (duas vezes) c,5 o,5 o,5 c,5
0,5
Os acoplamentos são de preferência levados a efeito como se descreve na escala B que se segue:
Escala B
| Reagente | Tempo de mistura (min.) |
| 9. | DCCI | - |
| 10. | Boc-aminoácido | 50-90 |
| 11. | MeOH (duas vezes) | c,5 |
| 12. | CH2C12 (duas vezes) | o,5 |
| 13. | Ac20 (3M) em CIi2Cl2 | 15,0 |
| 14. | 0¾¾ | |
| 15. | MeOH | o,5 |
| 16. | CH2C12 (duas vezes) | o,5 |
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-15Resumidamente, utiliza-se, uma ou duas mmol de aminoácido protegido com BOC, em cloreto de metileno, por grama de resina, mais um equivalente de DCCI 1,0 molar em cloreto de metileno durante duas horas. Quando BCC-Arg (Tos) está a ser acoplado, utiliza-se uma mistura de 5C> IÁIF e cloreto de metileno. Utiliza-se éter de Bzl como grupo protector ue cadeia lateral hidroxilo para Ser e Thr. 0 grupo amido ue Asn ou Gin é protegido por Xan quando se utiliza c acoplamento de DCC, de preferência. 0: éster de p-nitrcfenil (ONpj poae ser utilizaco também para activar a extremidade carboxilo ue Asn ou Gin e, per exemplo, ) EOC-Asn (GNp) pode ser acoplaao durante a noite utilizando um equivalente de HCBt numa mistura de 505 αθ IXJF e cloreto de metilenc, em que não se adiciona nenhuma quantidade de DCC. Utiliza-se 2-cloro-benziloxicarbonilo (2 Cl-z) como grupo protector para a cadeia lateral Lys. Utiliza-se Tos para proteger o grupo guanidino de Arg e o nitrogénio do imidazol de His e o grupo carboxilo da cadeia lateral de Glu ou Asp é protegido com OBzl. 0 grupo hidroxilo fenólico de Tyr é protegido com 2,6-dicloro -benzilo (DCB). No fim da síntese obtém-se a seguinte composição: BOC-His(X1)-Ala-Asp(X3)-Gly-Met-Phe-Asn(X4)-Lys(X7) -Ala-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Ala-Leu-Gly-Gln(X^)-Leu-Ser(X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Tyr(X2)-Leu-His(X1)-Thr(X4)-Leu-Met-Ala-Lys(X7)-Arg(X6)-Val-Gly-Gly-Gly-Ser(X4)-Met-Ile-Glu(X3)-Asp(X3£ | -Asp(X3)-Asn(X4)-Glu(X3)-Pro-Leu-X8 em que X1 é Tos, X2 é DCB,
X3 é Bzl, X4 é Bzl, X^ é Xan, X6 é Tos, X7 é 2C1-Z e X8 é -NHsuporte de resina. Xan pode ter sido parcial ou totalmente removido por tratamento com TFA utilizado para desbloquear o grupo protector alfa-amino.
Com vista a clivar e desproteger, a resina do péptido protegido esta é tratada com 1,5 ml de anisol, 0,5 ml de sulfureto de metiletilo e 15 ml de ácido fluorídrico (HF) por grama de re sina de péptido, a 20 °C durante meia hora e a 0°C durante meia hora. Após eliminação do HF sob vácuo o péptido-resina restante é lavado alternativamente com éter dietílico anidro e clorofórmio e o péptido é depois extraído com ácido acético aquoso 2N desgaseifiçado, ou água, e separado da resina por filtração.
G péptido clivado e desprotegido é depois dissolvido em
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-16ácido acético 0-5$ © submetido a purificação que pode incluir filtração por gel fino G-5C Sejhadex.
péptido é depois ainda purificado através de HPLC preparativa ou semi-preparativa como se descreve em Rivier et al., Peptides: Structure and Biological Functicn, (1979) pag 125-8 e Marki et al. J. Am. Chem. Soe. 103, 317θ (1981). Embalam-se cartuchos servindo no prep LC-5C0 da 7’aters Associates com sílica C1P de 15-20 micra de Vydac (360 A). Um gradiente de CH^CH em TEAP é originado por um preparador de gradiente de baixa pres são Eldex como descreveu Rivier, J., J. Lig. Cromatography 1, 343-367 (1973). As fraeções resultantes da cromatografia são cuidadosamente controladas por HPLC e apenas as fraeções que mostram pureza substancial são reunidas. A dessalificação das fraeções purificadas, independentemente da pureza testada é con seguida utilizando um gradiente de CH^CN em TFA a 0,1$. A parte central é depois liofilizada para produzir o péptido desejado, podendo ser a pureza superior 98$.
Repete-se a síntese utilizando uma resina clorometilada para produzir 0 mesmo péptido que possui um terminal G com ácido livre utilizando um processo inicial como geralmente se descreve em Chemistry Letters, supra, para ligar Leu à resina. 0 péptido é por fim clivado e desprotegido utilizando HF e anisol, produzindo o terminal C com ácido livre que é depois purificado como se descreveu atrás.
Exemplo IA
A síntese de um péptido com 45 resíduos possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Ket-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-OH é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre resina clorometilada como geralmente se descreve em Chemistry Letters, supra, para ligar BOC-Ser(Bzl) à resina. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoeléctrico e encontra-se o valor ZXZ = -62,9 (0=1,
ff·1· ·
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-17ácido acético a 1%).
Exemplo IB
A síntese de um péptido amidado com 45 resíduos possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Eer-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Prc-Leu-Ser-MH^ ® conduzida passo a passo num sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como geralmente se descreve em Vale et al., patente americana ns 4 292 313· Considera-se 0 péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo II
A síntese de um péptido amidado com 29 resíduos possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como geral mente se descreve em Vale et al., patente americana ns 4 292 313 Considera-se o péptido substancialmente puro por TLC e HPLC. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoeléctrico e verifica-se que possui o valor = -53,θ° (0=1, ácido acético a 1%).
Exemplo III
A síntese de um péptido possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp -Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-LTle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Arg-Ala-OH ê conduzida pas so a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina clorometilaaa. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
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-18Exemplo ΙΙΙΑ
A síntese de um péptido possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Arg-Ala-Ser-OH é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman scbre uma resina clorometilada. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo IV
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo 1. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo V
A síntese de um péptido possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala- Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Asn-Met-Ile-Glu-Arg-Ser-Arg-Val-Asn-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo VI
A síntese de um péptido possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser -Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-ITle-Ala-Ly s-NHCH^H^ é conduzida utilizando o mesmo processo descrito no exemplo 1, mas uti lizando uma resina N-alquilamina, também chamada resina M-eti-
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-19laminometil (resina TTEAM) como se uescreve na patente Americana n£4 569 967 publicada em 11 de Fevereiro de 1986 para ?'.D. Kornreich et al.. Faz-se reagir cerca de 1C gramas da resina clorometilada ao exemplo I com 100 ml ae etilamina a cerca de 4°C durante cerca de 24 horas, com agitação contínua, para modificar os grupos alfa-clorobenzilo em grupos N-etil-alfa-aminobenzilo após o que o péptido é depois construído via uma ligação amida substituída inicial.
Após se ter completado a sequência do péptido desejado, a desprotecção e a clivagem da resina são efectuadas por tratamento com HF, com anisol como um agente depurador, agitando em primeiro lugar a 0 C e permitindo depois a mistura agitaca arrefecer à temperatura ambiente aurante cerca de 3 heras. 0 processo provoca a clivagem do péptido da resina sob a forma de etilamida. A análise aos amincácidos mostra ^ue se obtém a estrutura do pép tido desejado. Considera-se o péptiuo substancialmente puro utizando TLC e HPLC.
Exemplo VII
Sintetiza-se 0 péptido possuindo a fórmula:H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-NHCH^utilizando o mesmo processo geral descrito no exemplo VI, empregando contudo, metilamlna em vez de etilamina para formar a resina de N-met11-amino -etil (resina NMAM) após o que se obtém o péptido. A clivagem e a desprotecção utilizando HF produz N-metilamida desprotegida. A análise de amincácidos mostra que se obtém a estrutura do péptido desejado.
Exemplo VIII
Sintetiza-se o péptiao possuindo a fórmula:H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala -Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-HHCH^CF^ utilizando o mesmo processo geral descrito no exemplo VI, empregando contudo trifluoro-etilamina.HCl em vez de etilamina para formar a resina de N-trifluoro-etilamino-metll (resina NTFEAM) sobre a qual se obtém o péptido.A clivagem e a desprotecção utilizando HF produz a N-trifluoro-etilamida desprotegida. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
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Exemplo IX
A síntese de um péptido possuinao a fórmula:H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyi’-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Leu-Glu-Gln-Arg-Ala-Arg-Val-Asn-Leu-NH2 é conduziua passo a passo utilizanao um sintetizaaor de péptiacs 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como geralmente se descreve em Vale et al, patente americana n®4 292 313*0onsidera-se o péptido substancialmente puro utilizanao TLC e HPLC.O sal ae acetato é uepois„preparado, dissolvendo c péptido em água e adicionando ácido acético IN. A solução resultante é liofilizaaa para produzir c sal de acido acético.
Exemplo X
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fcrmula:H-Hi s-Ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-Val-Ala-Lys-NH2 θ condu zida passo a passo utilizando um sintetizador ae péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MEHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XI
A síntese do péptido análogo de GRF' possuindo a fórmulaíH-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly -NH2 conduzido passo a passo utilizando um sintetizador de pép tidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I .Con sidera-se o péptido substancialmente puro, utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XII
A síntese do péptido análogo ae GRF’ possuindo a fórmula:
H-His-Ala-Asp-Gly-llet-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Ile-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NH2 é conduzida passo a passo utilizanao um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
pr
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-21Exemplo XIII
A síntese ao péptido análogo ue GRF pcssuinuc a fórmula:
H-His-Ala-Asp-Gly-Val-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Glr.-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Gln-Ala-Lys-NHg θ conduzida passo a passo utilizando um sintetizauor ae péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptiuc substancialmente puro utilizanao TLC e HPLC.
Exemplo XIV
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Gln-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-GlyGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Thr-Ala-Lys-NH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 d® Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XV
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Nva-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-NH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XVI
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Lys-Arg-Val-NH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
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File Ns 46744
-22Exemplo XVII
A síntese ao péptido análogo ue GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Thr-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nva-Ala-Lys-Arg-Val-NH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina LÍBHA como no exemplo I. Considera-se c péptiao substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemple XVIII
A síntese do péptiao análogo ae GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Val-Ser-Lys-NH^ é conduziaa passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera- se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XIX
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Lys-Arg-Gln-Gly-NH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no eexemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro, utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XX
A síntese do péptido análogo ue GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Ly s-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-V al-Ala-Ly s- GlnVal-Gly-NH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utili-
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File Νδ 46744
-23zando TLC e HPLC.
Exemplo XXI
A síntese ao peptíáo análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Leu- Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Arg-NHo é conduzida passo a passo utilizando ura sintetizador ue péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXII
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nva-Ala-Lys-Arg-Val-NHg é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXIII
A síntese de um péptido possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Ile-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Asn-Ile-Ile-Glu-Arg-Ser-Arg-Val-Asn-Ser-HHg é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC. 0 sal acetato é depois preparado por dissolução do péptido em água e adição em ácido acético. A solução resultante é liofilizada para produzir o sal do ácido acético.
Exemplo XXIV
A síntese do péptido possuindo a fórmula: N-iíe-His-Ala-
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-24-Asp-Gly-LIet-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser -Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-iíet-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly -Ser-Eet-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Prc-Leu-Ser-NHL é conduzida pas so a passo utilizando um sintetizauor ae péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXV
A síntese de um péptido amidado com 29 resíduos possuindo a fórmula: N-Et-Tyr-Ala-D-Asp-Gly-iviet-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met -Ala-Lys-NH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptiaos 990 de Beckman sobre uma resina HBHA como geralmente se descreveu em Vale et al., patente americana N6 4 292 313. Ccnsiaera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXVI
A síntese de um péptido possuindo a fórmula: N-Et-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Arg-Ala-OH é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina clorometilada. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXVII
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: N-Ip-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
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File Νδ 46744
Exemplo XXVIII
A síntese ue um péptido possuindo a fórmula: H-His-D-Ala-Asp-Gly-Fle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-..Iet-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Asn-Met-Ile-Glu-Arg-Ser-Arg-Val-Asn-NH^, é conduzida passo a passo utilizanao um sintetizaaor de péptiaos 990 de Beckman sobre uma resina hEHA como no exemplo I. Considera-se c péptiao substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXIX
I
A síntese de um péptido possuindo a fórmula: N-Me-Tyr-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-NHCELjCH^ é conduzida utilizando o processo descrito no exemplo VI empregando uma resina de N-etil-aminometil. A análise de aminoácidos mostra que se obtém a estrutura dos péptidos desejada. Considera-se 0 péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXX
Sintetizou-se o péptido possuindo a fórmula: N-Et-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-NHCH^ utilizando o mesmo processo geral descrito no exemplo VI, empregando, contudo,metilamina em vez de etilamina para formar a resina N-metilamino-metil (resina OAM) após o que se obtém o péptido. A clivagem e a aesprotecção utilizando HF produz a N-metilamida desprotegida. A análise de aminoácidos mostra que se obtém a estrutura do péptido desejado.
Exemplo XXXI
Sintetizou-se o péptido possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Ala-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-NHCH
utilizando o mesmo processo geral descrito no exemplo VI,
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File Nc 46744
-26empregando contudo trifluoroetilamina.HCl em vez de etilamina para formar a resina KT-trifluoro-etilaminometil (resina NTFEAM) após o que se obtém c péptido. A clivagem e a desprctecção utilizando HF prcuuz IT-trifluoro-etilamida desprotegida. Considera-se o péptido substancialmente ^uro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXXII
A síntese de um péptido possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-PherAsn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-GluI -Ser-Asn-Leu-Glu-Gln-Arg-Ala-Arg-Val-Asn-Leu-NH2 θ conauzida passo a passo utilizando um sintetizauor de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como geralmente se descreveu em Vale et al., patente americana Ns 4 292 313· Considera-se o péptido substancialmente puro, utilizando TLC e HPLC. 0 sal de acetato é depois preparado por dissolução do péptido em água e adição de ácido acético 1 N. A solução resultante é liofilizada para produzir o sal de ácido acético.
Exemplo XXXIII
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-GlyI -Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Thr-Leu-Val-Ala-Lys-Mí2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXXIV
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-Gln-Thr-Leu-ITle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina de MBHA come no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro uti lizando TLC e HPLC.
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Exemplo XXXV
A síntese oo péptiuc análogo ue Ghl·' possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Glu-Leu-Ile-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-VHb) é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptiaos 990 de Beckman sobre uma resina MBH4 como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXXVI
A síntese ao péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: d e sNH2-H1s-Ala-A sp-Gly-Val-Phe-A sn-Ly s-Ala-Tyr-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Gln-Ala-Lys-NH2 é conduzida passo a passo utilizanac um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXXVII
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: N-Me-His-D-NMA-Asp-Gly-Pro-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Thr-Ala-Lys-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XXXVIII
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula:
H-His-D-NMA-Asp-Gly-Nva-Phe-A sn-Ly s-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly
-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Phe-Ala-Lys-Arg-Val-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo
I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
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File Ne 46744
-28Exemplo XXXIX
A síntese ao péptidc análogo de GRr possuindo a fórmula:
H-D-His-jj-Ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Lys-Ala-Lys-Arg-Val-NH2 θ conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptiaos 990 de Beckman sobre uma resina M13HA como no exemplo I. Considera-se o péptiuo substancialmente puro utilizando TLC e xiPLC.
Exemplo XL )
A síntese do péptiao análogo de GRF possuindo a fórmula:
H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nva-Ala-Lys-Arg-Val-NH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XLI
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: N-Et-His-Ala-Asp-Gly-Asn-Phe-A sn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Val-Ser-Lys-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptidc substancialmente puro utilizanuo TLC e HPLC.
Exemplo XLII
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Gly-Asp-Phe-Asn-Ser-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Lys-Arg-Gln-Gly-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre umaresina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
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-29Exemplo XLIII
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: N-He-His-D-Ala-Asp-Gly-met-Pne-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Hle-Ala.-Lys-Gln-Val-NH2 é conauzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina L1BHA como no exemplo I. Considera-se o péptiao substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XLIV
A síntese do péptido análogo de GRi* possuindo a fórmula: H-His-D-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Arg-MH^ é conduzida passo a passo utilizando um sintetizadcr de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XLV
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: H-His-Ala-D-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-V al-Gly-Gly-Gly-Ser-Leu-11e-Glu-A sp-A sp-A sn-Glu-Pro-Leu-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina ilBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente purc utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XLVI
A síntese do péptido análogo possuindo a fórmula: des-NH2-Tyr-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-Gln-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NH2 é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina LíBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente purc utilizando TLC e HPLC.
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Exemplo XLVII
A síntese ao péptiao análogo ue GRF possuindo a fórmula: N-Ip-Tyr-D-IUA-Asp-Gly-Jet-Phe-Asn-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Glu-Leu-Ile-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NHg é conuuzida passo a passo utilizanao um sintetizadcr de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Consiuera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
*·»
Exemplo XLVIII
A síntese ao péptiao análogo ue GRF possuindo a fórmula: desNH^-Tyr-B-NI/A-Asp-Gly-Val-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyi-árg-Arg-V al-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-Gln-Ala-Lys-NHg é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Exemplo XIj IX
A síntese do péptido análogo de GRF possuindo a fórmula: D-Tyr-D-NMA-Asp-Gly-Pro-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly -Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Thr-Ala-Lys-NHg é conduzida passo a passo utilizando um sintetizador de péptidos 990 de Beckman sobre uma resina MBHA como no exemplo I. Considera-se o péptido substancialmente puro utilizando TLC e HPLC.
Todos os péptidos sintéticos preparados nos exemplos são considerados biologicamente activos e potencialmente eficazes para estimular a libertação da GH pela pituitária. A concentração eficaz mínima para os péptidos dos exemplos é de cerca de 1 picomolar.
Nos testes in vivo injectam-se péptidos sintéticos em peixes dourados, após se terem extraído amostras sanguíneas, e extraiem-se amostras de sangue adicionais 10 e 36 minutos após as injecções. Os níveis de GH, no sangue, medidos por radio-imunoensaio, mostram que os péptidos sintéticos são activos para ele-
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-31var os níveis de GH do plasma quando medidos 10 minutos após a injecção i.v.. As dosagens entre cerca de % nanogramas e cerca de 5 micrcgramas destes péptidos por kg de peso de corpo são particularmente eficazes em provocar a secreção cie GH. Os testes in vitro são também levauos a efeito utilizando células da pituitária ae peixes acurados em culturas primárias.
A estimulação da secreção de GH por esses péptidos resulta ria num aumento esperado do crescimento de peixes e outros animais com níveis de GH normais. Além ao mais, a administração deveria alterar o conteúdo de gcruura do corpo e modificar outros processos metabólicos, imunológicos e de crescimento aepen dentes de GH. Estes péptidos são particularmente eficazes em aquicultura para aumentar a reprodução de peixes e outros animais marinhos de sangue frio, por exemplo, trutas, enguias, e anfíbios. Porque os análogos de GRF também possuem muito baixa actividade nos mamíferos, estes péptidos são particularmente apropriados para estimular o crescimento em peixes comerciais que serão consumidos por seres humanos ou outros mamíferos devido ao facto da eliminação do problema dos péptidos residuais nos peixes poder ter um efeito biológico sobre as espécies de consumo.
Estes péptidos sintéticos ou os sais não tóxicos correspondentes podem estar combinados com um veículo farmacêutica ou veterinarlamente aceitável para formar uma composição para adminis tração a animais por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, percutânea, por exemplo, por via intranasal através de branquías ou mesmo oralmente. A aosagem necessária deverá variar com o objectivo particular a ser visaao. Além do mais, as bactérias que têm sido transformadas utilizanao tecnologia de ADN recombinante para incluir sequências de genes que provocam a expressão do péptido de GRF desejado podem ser desenvolvidas em tanques nos quais os peixes são reproduzidos para proporcionar esses péptidos de GRF de forma a aumentar o crescimento dos peixes.
Esses péptidos são muitas vezes administrados na forma de sais não tóxicos, tais como sais de adição de ácido ou complexos de metal, por exemplo, com zinco, ferro ou análogos (que são considerados como sais para fins deste pedido ). Exemplos
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-32desses sais de adição õe ácidos são os cloriaratos, bromidratos, sulfatos, fosfates, maleatos, acetatos, citratos, benzoatos, succinatos, malatos, asccrbatcs, tartaratos e análogos. Se o ingreuiente activo é auministrado sob a forma sólida, pode-se utilizar um ligante tal como tragacanta, amiuo de milhe ou gelatina e agente de desintegração tal como ácido alginico. Os péptidos podem também ser administrados em formulações de libertação retardada utilizando agentes apropriauos conhecidos nesta técnica. A aesagem utilizada será, normalraente, entre cerca de 0,01 a cerca de 1 micrograma uo péptido por quilograma de peso do corpo do hospedeiro.
Embora a invenção tenha sido aescrita com vista às formas de realização preferidas o que constitui a melhor maneira presen temente conhecida para os inventores, seria compreensível que várias modificações e alterações seriam óbvias para qualquer perito da especialidade sem se afastar do âmbito da invenção que está descrita nas reivindicações apensas. Por exemplo, as modificações na cadeia peptídica, particularmente eliminações começando no terminal carboxilo do péptido e estendendo-se até cerca da posição 27 podem ser feitas de acordo com práticas experimentais conhecidas dos dias de hoje para criar péptidos ou fragmentos de péptidos que retenham todas ou muitas porções substanciais da potência biológica do péptido, considerando-se que esses péptidos estão dentro do âmbito da invenção. Além do mais, as adições podem ser feitas em qualquer terminal ou em ambos os terminais e/ou normalmente os resíduos equivalentes podem ser substituídos por resíduos que ocorram naturalmente como é bem conhecido da técnica da química dos péptidos, para prouuzir outros análogos possuinuo, pelo menos, u.va porção substancial da potência dos péptidos reivindicados sem desvio do âmbito da invenção. Além do mais as modificações podem ser feitas para o gru po -NH2 preferido, no terminal C de acordo com o estado da técnica dos dias de hoje, por exemplo, a porção carboxilo do resíduo aminoácido no terminal C, pode ser o radical -CCOR, -CRO, -CONHNHR, -C0N(R)(R’) ou -CHgOR, com R e R1 representando um grupo alquilo inferior, fluoro-alquilo inferior ou hidrogénio.
Essas modificações dão origem a péptidos sintéticos equivalentes,
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-33sem nos desviarmos da invenção.
Realçam-se vários aspectos da invenção, nas reivindicações que se seguem.
Claims (9)
- - REIVINDICAÇÕES 1®. - Processo para a preparação ae um peptídeo de fórmula geral (I): R1-Rg-R3-R4-R5-Phe-R7-R8-Rg-Tyr-Arg-R12-RL3-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-R22-Leu-H24-R2^-R2^-R2r7-R2g-R2g-R.0-R^1-Gly-R^^-Rg4.-Rg^-k2g“Rg7-Rg8”^39^4C-^41''^42”^43”^44'^er~^’ em ^ue ^1 N-Me Tyr, Tyr, desNH^Tyr, D-Tyr, N-Et Tyr, N-Ip Tyr, N-Me His, His, desNH2-His, D-His, N-Et His, e N-Ip His; R2 é Ala, D-Ala ou D-NMA; R^ é Asp ou D-Asp; R^ é Gly ou Ala; R^ e R^ são selec cionados de entre os grupos que consistem em Met, Leu, Vai, Nva, Gin, Thr, Ile, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Nle, Lys, Phe, Pro, Ser, Tyr, e Trp; R? é Asn ou Thr; Rg é Lys, Asn ou Ser; Rg é Ala ou Ser; R12 é Lys ou Arg; R^^ é Ala, Vai ou Ile; R^^ é Gly ou Ala; R-^g é Ser ou Tyr; R22 é Tyr ou Leu; R24 é His ou Gin; R^ é Thr, Asp, ou Glu; R^ é Leu ou Ile; R2g é Ala, Ser ou Asn; R^ é Lys ou Arg; R^q é Arg ou Gin; R^ é Vai ou Gin; R^ é Gly ou Glu; R^4 é Gly, Arg ou Ser; R^ é Ser ou Asn; R^g é Met, Leu, Vai, Nva, Gin, Thr, Ile ou Nle; R^ é Ile ou Glu; R^g é Glu, Gin, ou Arg; R^g é Asp, Arg ou Gly; R4C é Asp, Ser ou Ala; R41 é Asn, Arg ou Lys; R42 é Glu, Phe, Ala ou Vai; R^ é Pro, Asn ou Arg; R44 é Leu ou Ala e Y é OH ou NHR, com R sendo H ou alquilo inferior; desde que pelo menos um dos seguintes grupos esteja presente: R? é Asn, Rg é Lys, R^^ é Ala, R^ é Tyr e R^ é Thr; e ainda desde que qualquer um dos resíduos, ou todos, depois de R2? possa ser eliminado, caracterizado por: (a) se formar um peptídeo intermediário que possui pelo menos um grupo protector e que tem a fórmula geral (II): X-R^(X^ ou X2)-R2-R3(X3)-R4-R5(XX)-Phe-R?(X4 ou X^)-Rg(X4, ou X7)-Rg(X4) -Tyr(X2)-Arg(X6)-R12(X6 ou X^-R-^-Leu-R^-GlnCX^)-Leu-Rlg(X2ou X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-R22(X2)-Leu-R24(X1 ou X^)-R^(X3 ou X4) -R26-R27(XX)-R28(X4 ou X^)-R29-(X6 ou X7)-R (X* ou X6)-R31(X?)-Gly-R33(X3)-R34(X4 ou X^-R^CX4 ou X^)-R 6(X3 ou X4)-R3?(X3)-R3g(X3 ou X^ ou X6)-R39(X3 ou X6)-R4q(X3 ou X4)-R41(X^ ou X6 ou X7)-R42(X3)-R43(X^ ou X^)-R44~Ser(X4)-X^ ou uma sua versão1 2 apropriadamente encurtada, correspondente, em que: X, X , X ,67 071File Ns 46744-35X3, X4, X^ Xò, X7 e XX são cada um hidrogénio cu um grupo protector e X e un grupo protector cu uma ligação de protecção a um suporte ue resina ou Y; (b) se separar o grupo ou grupos protectcres e/ou ligação de protecção do peptídeo intermediário da fórmula (II); e (c) se converter, se se desejar, o peptídeo resultante num seu sal não tóxico.
- 2®. - Processo de acorao com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um peptídeo ae fórmula geral (I) em que R^ éNle.
- 3®. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracte rizado por se obter um pe é Met.e formula geral (I) em que R,
- 4®. - Processe cie acordo com qualquer uma das reivindicações
- 5®. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações
- 6®. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 caracterizado por se obter um peptídeo em que R^ é seleccionado de entre os grupos: N-líe His, N-Me Tyr, N-Et Tyr, N-Et His e N-Ip His.
- 7®. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 caracterizado por se obter um peptídeo em que R2 é D-NMA.
- 8®. - Processo de acordo ccm qualquer uma das reivindicações 1-6 caracterizauo por se obter um peptídeo em que R^ é D-Ala e R^ é D-Asp.
- 9®. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter um peptídeo com uma forma seleccionada de entre as seguintes: H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Iúet-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-NH2,H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg67 071File Νδ 46744-36-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-OH,H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu—le-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Ket-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu.-Prc-Leu-NH2, H-His-Ala-Asp-Gly-^et-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-iIet-Ala-Lys-NH2, H-His-Ala-A sp-Gly-Fle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Glr.-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Kle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Arg-Ala-OH, H-His-Ala-A sp-Gly-iíet-Phe-Asn-Lys-Àl a-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-- Gln-Leu- Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-L.eu-Hí s-Thr-Leu-ieu-Ala-Lys-Arg-Val -νή2, H-His-Ala-Asp-Gly-i7íet-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-- Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Het-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-NH2, H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-NHCíL·,ch3,N-Me-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Ly s-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-líe t-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-nh2,N-Et-Tyr-Ala-D-Asp-Gly-Met-Phe--Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Ly s-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-nh2,H-His-Ala-D-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Leu-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Prc-Leu-HH2, K-ile-Tyr-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-- Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Ly s-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-Nle-Ala-Ly s-NHCH2CH3,H-His-D-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Ly s-Ala-Leu-Gly-- Gln-Leu- Ser- Ala- Arg-Ly s-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-A sn-Met-IIe-Glu-Arg-Ser-Arg-Val-Asn-KH2, e N-Et-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-- Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Ly s-Tyr-Leu-Hi s-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-NIICH^.
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