KR970001510B1

KR970001510B1 - 합성 펩타이드 및 이를 포함한 제약학적 조성물

Info

Publication number: KR970001510B1
Application number: KR1019880000231A
Authority: KR
Inventors: 앤 본 죠; 스피이스 죠우아김; 에드워어드 프레드릭 리비어 지인; 워어커 베일 쥬니어 와일리
Original assignee: 더 솔크 인스티튜트 훠 바이올로 지칼 스터디이즈; 델버어트 어니스트 그랜즈
Priority date: 1987-01-13
Filing date: 1988-01-12
Publication date: 1997-02-11
Also published as: IL84758A; PH26896A; PT86544B; NO875461L; AU593973B2; DK14488A; NZ222951A; IL84758A0; NO875461D0; JPS63174999A; KR890005149A; PT86544A; AU1016688A; DK14488D0; EP0274916A3; EP0274916A2; JP2685195B2

Abstract

내용 없음.

Description

합성 펩타이드 및 이를 포함한 제약학적 조성물

본 발명은 어류, 조류 및 포유 동물안의 뇌하수체의 기능에 영향을 미치는 펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 뇌하수체에 의한 성장 호르몬의 방출을 촉진하는 펩타이드에 관한 것이다.

생리학자들은 각 뇌하수체 호르몬의 분비를 촉진하거나 또는 저해하는 특별한 물질을 생산하는 시상하부가 뇌하수체 선부의 분비 기능을 조절한다고 오랫동안 인식 해왔다. 시상하부의 저해 요소는 1972년에 성장 호르몬(GH)의 분비를 저해하는 소마토스타틴의 형태로 특징지워진다. 1982년, 인간 췌장(종양)의 방출 요소(hpGRF)를 인간 췌장 종양의 추출물로부터 분리하여, 정제하고, 특성을 부여하고, 합성하여 시험해서, 뇌하수체에 의해 GH의 방출을 촉진시킨다는 것을 알아냈다. 이러한 뇌하수체 유발의 요소 둘 모두는 총 합성에 의해 재생산되어 왔으며, 천연 구조를 갖는 유사체가 합성되었다. 인간의 시상하부 GH 방출 요소(GRF)는 종전에 같은 구조를 갖는다는 것이 예증되었다. 쥐 종, 돼지 종, 양 종, 및 소와 염소 종들로부터의 상응하는 시상 하부 GH 방출 요소(GRFs) 또한 특성이 부여되고 합성되었다.

배양된 뇌하수체 세포로부터 GH를 방출하고, 경골 어류 GRF의 서열에 근거하고 있으며 어류에서 매우본질적으로 증가된 효능을 나타내는 합성 폴리펩타이드가 이제 합성되고 시험되었다. 이런 펩타이드들은 길이에 있어서 27~45개의 잔기를 가질 수 있으며,(C-말단에서 시작되고 있는 원하는 서열을 제거시켜 짧게됨) 유리산 또는 아미드 형태일 수 있고, 5-위치 및 27-위치에 Nle, Leu, Val, Nva, Gln, Thr, Ile 또는 Met를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 제약학상 또는 수의학상 허용 가능한 액체 또는 고체 담체내에 분산된 약 27~44개의 잔기 길이를 갖는 펩타이드 또는 이러한 것들 중 어느 것의 비독성 염이라도 포함한다. 이러한 조성물은 가금을 포함한 온혈동물의 성장, 특히 냉혈 동물, 예컨대 어류, 뱀장어 등의 물속에서의 성장을 촉진시키는데 사용될 수 있다.

하나의 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있고, 어류 또는 다른 냉혈동물의 성장을 촉진시키는데 유용한 펩타이드를 제공하며, 이 펩타이드는 다음 일반식을 갖는다 :

R₁-R₂-R₃-Gly-R₅-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-R₁₅-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R₂₇-R₂₈-R₂₉-R₃₀-R₃₁-NHR

상기 식에서 R₁은 N-Me Tyr, N-Me His, N-Et Tyr, N-Et His, N-Ip His 또는 N-Ip Tyr이고; R₂는 Ala 또는 D-Ala이고; R₃는 Asp 또는 D-Asp이고; R₅는 Met, Nva 또는 Nle이고; R₁₅는 Gly 또는 Ala이고; R₂₇은 Nva또는 Nle이고; R₂₈은 Ala, Ser, Asn 또는 des-R₂₈이고; R₂₉은 Lys 또는 Arg 또는 des-R₂₉이고; R₃₀은 Arg 또는 Gln 또는 des-R₃₀이고; R₃₁은 Val 또는 Gln 또는 des-R₃₁이고; R은 H 또는 저급알킬이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있고, 어류 또는 다른 냉혈동물의 성장을 촉진시키는데 유용한, 다음 일반식을 갖는 펩타이드를 제공한다.

H-His-Ala-Asp-Gly-R₅-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gin-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R₂₇-R₂₈-R₂₉-R₃₀-R₃₁-NHR

상기 식에서 R₅는 Met, Nva 또는 Nle이고; R₂₇은 Nva 또는 Nle이고; R₂₈은 Ala, Ser, Asn 또는 des-R₂₈이고; R₂₉는 Lys 또는 Arg 또는 des-R₂₉이고; R₃₀은 Arg 또는 Gln 또는 des-R₃₁이고; R₃₁은 Val 또는 Gln이고; R은 H 또는 저급알킬이다.

하나의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있고, 어류 또는 다른 냉혈 동물의 성장을 촉진시키는데 유용한, 다음 일반식을 갖는 펩타이드를 제공한다:

H-His-Ala-Asp-Gly-R₅-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R₂₇-R₂₈-R₂₉-R₃₀-R₃₁-NH₂

상기 식에서 R₅는 Met, Ile 또는 Leu이고; R₂₇은 Met, Ile 또는 Leu이고; R₂₈은 Ala, Ser, Asn 또는 des-R₂₈이고; R₂₉는 Lys 또는 Arg 또는 des-R₃₀이고; R₃₀은 Arg 또는 des-R₃₀이고; R₃₁은 Val 또는 Gln 또는 des-R₃₁이다.

여전히 또 다른 바람직한 실시양태에서 있어서, 본 발명은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있고, 어류 또는 다른 냉혈 동물의 성장을 촉진시키는데 유용한, 다음 일반식을 갖은 펩타이드를 제공한다:

H-His-Ala-Asp-Gly-R₅-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R₂₇-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Ser-R₃₆-Ile-Glu-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-Y

상기 식에서 R₅는 R₂₇및 R₃₆은 Met 및 Leu로부터 선택되고 Y는 NH₂또는 OH이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 어류 또는 다른 냉혈 동물의 성장을 촉진시키는데 유용한, 다음 일반식을 갖는 펩타이드를 제공한다:

H-His-D-Ala-Asp-Gly-R₅-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R₂₇-R₂₈-R₂₉-R₃₀-R₃₁-NHR

상기 식에서 R₅는 Met, Nle, Ile 또는 Leu이고; R₂₇는 Met, Nle, Ile또는 Leu이고; R₂₈은 Ala, Ser, Asn 또는 des-R₂₈이고; R₂₉는 Lys 또는 Arg 또는 des-R₂₉이고; R₃₀은 Arg 또는 Gln 또는 des-R₃₀이고; R₃₁은 Val 또는 Gln 또는 des-R₃₁이고; R은 H 또는 저급알킬이다.

H-His-Ala-D-Asp-Gly-R₅-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R₂₇-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-R₃₆-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-NH₂

상기 식에서 R₅, R₂₇및 R₃₆은 Met, Nle 및 Leu로부터 선택된다.

펩타이드를 정의하는데 사용된 명명법는 쉬로데 및 루브케에 의해 펩타이드(The Peptides), 아카데믹 프레스(Academic Press)(1965)에 기재되어 있으며, 여기에서 통상적인 표현에 따라 N-말단의 아미노기는 왼쪽에, C-말단의 카르복실기는 오른쪽에 나타난다. 천연 아미노산들은 단백질 안에서 발견되는 자연적으로 생겨난 통상적인 아미노산으로 다음 허용된 약어로 불리운다 : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Ssp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His, Nle는 노를 류신을 의미하고, Nva는 노르발린을 의미한다. 아미노산잔기가 이성체형태를 갖는 경우, 달리 표현되어 지적되지 않는 한, 나타나는 것은 L-형태의 아미노산이다. Me는 메틸, Et는 에틸, Ip는 이소프로필을 의미한다. D-NMA는 N-Me D-Ala를 의미하고 저급알킬은 1-4개의 탄소원자를 갖는 탄소 사슬을 의미한다.

본 발명은 하기서열(I)을 갖는 펩타이드를 제공한다:

R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-Phe-R₇-R₈-R₉-Tyr-Arg-R₁₂-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln-Leu-R₁₈-Ala-Arg-Lys-R₂₂-Leu-R₂₄-R₂₅-R₂₆-R₂₇-R₂₈-R₂₉-R₃₀-R₃₁-Gly-R₃₃-R₃₄-R₃₅-R₃₆-R₃₇-R₃₈-R₃₉-R₄₀-R₄₁-R₄₂-R₄₃-R₄₄-Ser

상기 식에서, R₁는 N-Me Tyr, Tyr, des NH₂-Tyr, D-Tyr, N-Et Tyr, N-Ip Tyr, N-Me His, His, desNH₂-His, D-His, N-Et His 및 N-Ip His이고; R₂는 Ala, D-Ala 또는 D-NMA이고; R₃는 Asp 또는 D-Asp이고; R₄는 Gly 또는 Ala이고; R₅및 R₂₇은 Met, Leu, Val, Nva, Gln, Thr, Ile, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Nle, Lys, Phe, Pro, Ser, Tyr 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되며; R₇은 Asn 또는 Thr이고; R₈은 Lys, Asn 또는 Ser이고; R₉는 Ala 또는 Ser이고; R₁₂는 Lys 또는 Arg이고; R₁₃은 Ala, Val 또는 Ile이고; R₁₅는 Gly 또는 Ala이고; R₁₈은 Ser 또는 Tyr이고; R₂₂는 Tyr 또는 Leu이고; R₂₄는 His 또는 Gln이고; R₂₅는 Thr, Asp 또는 Glu이고; R₂₆은 Leu 또는 Ile이고; R₂₈은 Ala, Ser 또는 Asn이고; R₂₉는 Lys 또는 Arg이고; R₃₀은 Arg 또는 Gln이고; R₃₁은 Val 또는 Gln이고; R₃₃은 Gly 또는 Glu이고; R₃₄는 Gly, Arg 또는 Ser이고; R₃₅는 Ser 또는 Asn이고; R₃₆은 Met, Leu, Val, Nva, Gln, Thr, Ile 또는 Nle이고; R₃₇은 Ile 또는 Glu이고; R₃₈은 Glu, Gln 또는 Arg이고; R₃₉는 Asp, Arg 또는 Gly이고; R₄₀은 Asp, Ser 또는 Ala이고; R₄₁은 Asn, Arg 또는 Lys이고; R₄₂는 Glu, Phe, Ala 또는 Val이고; R₄₃은 Pro, Asn 또는 Arg이고; R₄₄는 Leu 또는 Ala이고; 그러나 단, 다음중 적어도 하나가 존재하며; R₇은 Asn이고, R₈은 Lys이고, R₁₃은 Ala이고, R₂₂는 Tyr이고, R₂₅는 Thr이다; 또한 단, R₂₇이후의 잔기중 어떤것 또는 모두가 빠질 수 있다. C-말단은 OH 또는 R이 H이거나 또는 저급알킬인 NHR인 것이 바람직하다.

잔기-27을 통해 N-말단에서부터 전개되는 펩타이드 서열(Ⅰ)의 단편은 뇌하수체에 의한 GH의 방출에 영향을 미치는 생물학적 효능을 가지며, 이런 생물학적으로 활성적인 단편은 총 발명의 영역안에 속하는 것으로 간주된다. 펩타이드 단편이 단지 잔기 27 또는 28로만 전개되는 경우, C-말단은 -NH₂또는 치환된 아미드여야만 한다. 단편이 잔기 29~39 중 어느 하나로 전개되는 경우, C-말단은 아미드 또는 치환된 아미드인 것이 바람직하며, 반면에 -OH일 수도 있다.

단편이 40개 또는 그 이상의 잔기를 갖는 경우, C-말단 부분에 대해서는 명백히 바람직한 것은 없다.

펩타이드들은 적절한 방법, 예컨대 전적으로의 고체-상기술, 부분적 고체-상 기술, 단편 축합 또는 종래의 용액 결합에 의해 합성된다. 최근 발달된 재조합 DNA 기술은 천연 아미노산 잔기만을 포함하는 펩타이드의 일부분을 제조하는 데 사용될 수 있으며, 그 다음 짧은 말단 펩타이드에 연결시킬 수 있다.

예를들어, 전적으로의 고체-상 합성 기술은 고체-상 펩타이드 합성(스튜어트영, 프리만Co., 샌프란시스코, 1969)이란 책자에 기재되어 있으며, 베일 일동에 의한 1978년 8월 8일에 발행된 미합중국 특허 제4,105,603호에 기재되어 예증되고 있다. 종래의 용액 합성은 Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl) : Synthese von Peptiden, 논문(E. Wunsch(편집자)(1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, W. Ger.)에 자세하게 기재되어 있다. 합성의 단편 축합 방법은 미합중국 특허 제3,972,859호(1976년 8월 3일)에 예증되어 있다. 다른 유용한 합성들은 미합중국 특허 제3,842,067호(1974년 10월 15일) 및 제3,862,925호(1975년 1월 28일)에 의해 예증되고 있다.

이런 합성들에서 통상적으로 일어나는 것은 여러가지 아미노산 부분들의 불안정한 측쇄기를 기가 결국 제거될 때까지의 그 위치에서 일어나는 화학 반응을 막아줄 적합한 보호기로 보호하는 것이다. 아미노산 또는 단편상의 알파-아미노기를 보호하는 것 또한 통상적인 일이며, 그동안 실재물은 카르복실기에서 반응하여 알파-아미노 보호기를 선택적으로 제거시켜 그 위치에서 연속적인 반응이 일어나게 한다. 따라서, 합성의 한 단계로서 적절한 잔기에 결합된 측쇄 보호기를 갖는 펩타이드 사슬안에 바람직한 서열속에 자리잡은 각 아미노산 잔기를 포함하는 중간 화합물이 생성되는 것은 통상적인 일이다.

또한 하기 일반식(Ⅱ)의 중간 물질을 형성하는 가공 처리가 본 발명의 영역내에 있다고 간주된다:

X-R₁(X¹또는 X²)-R₂-R₃(X³)-R₄-R₅(XX)-Phe-R₇(X⁴또는 X⁵)-R₈(X⁴, X⁵또는 X⁷)-R₉(X⁴)-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-R₁₂(X⁶또는 X⁷)-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln(X⁵)-Leu-R₁₈(X²또는 X⁴)-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-R₂₂(X²)-Leu-R₂₄(X¹또는 X⁵)-R₂₅(X³또는 X⁴)-R₂₆-R₂₇(XX)-R₂₈(X⁴또는 X⁵)-R₂₉-(X⁶또는 X⁷)-R₃₀(X⁵또는 X⁶)-R₃₁(X⁵)-Gly-R₃₃(X³)-R₃₄(X⁴또는 X⁶)-R₃₅(X⁴또는 X⁵)-R₃₆(X³또는 X⁴)-R₃₇(X³)-R₃₈(X³또는 X⁵또는 X⁶)-R₃₉(X³또는 X⁶)-R₄₀(X³또는 X⁴)-R₄₁(X⁵또는 X⁶또는 X⁷)-R₄₂(X³)-R₄₃(X⁵또는 X⁶)-R₄₄-Ser(X⁴)-X⁸

상기 식에서 X는 수소 또는 a-아미노 보호기중 하나다.

고려되는 a-아미노 보호기들은 폴리펩타이드의 단계적 합성 분야에 유용하다고 잘 알려진 것들이다. 사용될 수 있는 a-아미노 보호기의 부류중에는(1) 플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC)과 같은 방향족 우레탄-형태의 보호기, p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로 벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐과 같은 벤질옥시카르보닐(Z)및 치환된 Z; (2) t-부틸옥시카르보닐(BOC), 디이소프로필 메틸옥시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시 카르보닐, 알릴옥시카르보닐과 같은 지방족 우레탄 보호기; 및 (3) 시클로펜틸옥시카르보닐, 에더멘틸옥시카르보닐 및 시클로헥실옥시카르보닐과 같은 시클로알킬우레탄-형태의 보호기가 있다. 바람직한 a-아미노 보호기는 BOC이다.

X₁은 수소 또는 벤질옥시메틸 또는 Tos와 같은 His의 아미다졸 질소에 대한 보호기이다.

X₂는 테트라히드로피라닐, 삼차-부틸, 트리틸, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ 및 2,6-디크로로벤질(DCB)과 같은 Tyr이 페놀 히드록실기에 대한 적합한 보호기일 수 있다. 바람직한 보호기는 2,6-디클로로벤질이다. X²는 수소일 수 있는데, 이는 바로 그 위치에서 아미노산 잔기상에 어떤 측쇄 보호기도 없는 것을 의미한다.

X³는 수소 또는 벤질(Bzl), 2,6-디클로로벤질, 메틸, 시클로헥실 또는 에틸과 같은 Asp 또는 Glu의 카르복실기에 대한 적합한 에스테르를 형성하는 보호기이다.

X⁴는 아세틸, 벤조일(Bz), 삼차-부틸, 트리틸, 테트라히드로피라닐, Bzl, 2,6-디클로로벤질 및 CBZ와 같은 Thr또는 Ser의 히드록실기에 대한 적합한 보호기일 수 있다. 바람직한 보호기는 Bzl이다. X⁴는 수소일 수 있는데, 이는 히드록시기 상에 어떤 보호기도 없다는 것을 의미한다.

X⁵는 수소 또는 Asn 또는 Gln의 측쇄 아미노기에 대한 적합한 보호기이다. 바람기한 것은 키산틸(Xan)이다. X⁶는 수소 또는 니트로, Tos, CBZ, 에더멘틸옥시시카르보닐 및 BOC와 같은 Arg의 구아니도기에 대한 적합한 보호기이다.

X⁷은 수소 또는 Lys의 측쇄 아미노기에 대한 적합한 보호기이다. 적합한 측쇄 아미노 보호기의 예로는 2-클로로벤질옥시카르보닐(2-Cl-Z), Tos, t-아밀옥시카르보닐 및 BOC가 있다.

XX는 상기로부터 선택된 적합한 측쇄 보호기 또는 수소이다.

Met는 산소에 의해 임의로 보호될 수 있지만, 왼쪽은 보호되지 않는 것이 바람직하다.

합성하는 동안 a-아미노기의 탈보호 동안 제거되지 않는 것이 일반적으로 선택되는 것을 제외하곤, 측쇄아미노 보호기의 선택은 중요한 것이 아니다. 그러나, 예컨대 His와 같은 몇몇 아미노산에 있어서, 결합이 이루어진 후에 일반적으로 보호가 반드시 필요한 것은 아니며, 보호기도 마찬가지일 수 있다.

X⁸은 에스테르를 형성하는 기 X³와 같은 C-말단카르복실기에 대한 적합한 보호기이거나 또는 고체 수지지지체에 연결하기 위해 고체-상 합성에서 사용되는 정착 결합이거나, 또는 des-X⁸이며, 이 경우 C-말단부의 잔기는 상기와 같은 카르복실 부분(Y), 즉 유리 산, 아미드 또는 치환된 아미드를 갖는다. 고체 수지 지지체가 사용되는 경우, 이는 다음 식을 갖는 것과 같은, 당분야에 알려진 모든 것일 수 있다:-O-CH₂-수지지지체, -NH-벤즈히드릴아민(BHA) 수지 지지체 또는 -NH-파라메틸벤즈히드릴 아민(MBHA) 수지 지지체, 비치환된 아미드가 바람직한 경우, 직접적인 분열이 아미드를 생성하기 때문에, BHA또는 MBHA 수지의 사용이 바람직하다. N-메틸 아미드가 바람직한 경우에, 이는 N-메틸 BHA 수지로부터 생성될 수 있다. 다른 치환된 아미드는 Int. J. Peptide Protein Res., 25(1985) 414-420(W.Kornreich 일동)에 기재된 절차에 의해 합성될 수 있다.

유리기가 아닌 다른 기들이 C-말단부에서 바람직하다면, Houben-Weyl 책자에 기재된 것과 같은 전통적인 방법을 사용하여 펩타이드를 합성하는 것이 바람직할 수 있다.

중간 물질에 대한 일반식에 있어서, X-기들 중 적어도 하나는 수지 지지체를 포함하는 X⁸또는 보호기이다.

이처럼, 본 발명은 또한 (a) 적어도 하나의 보호기 및 일반식(Ⅱ)(여기에서 X, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷및 XX는 각각 수소 또는 보호기중 하나이고, X⁸은 보호기 또는 수지 지지체와의 정착 결합 또는 des-X⁸이며, 이 경우 C-말단부의 잔기는 카르복시 부분(Y)를 갖는다.)를 갖는 펩타이드를 형성하고; (b) 일반식(Ⅱ)의 펩타이드로부터 보호기 또는 기들 또는 정착 결합을 끊고; (c)원한다면, 결과 생성된 서열(Ⅰ)의 펩타이드를 그의 비독성 염으로 전환시키므로써 관심 대상의 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하고 있다.

펩타이드의 합성에 사용되는 특정의 측쇄 보호기를 선택하는데 있어서, 다음(a)-(c)의 일반 법칙이 따른다:(a) 보호기는 보호성질을 보존하는 것이 바람직하며, 결합 조건하에서는 분리되지 않고; (b) 보호기는 시약에 안정해야만 하며, Xan을 제외하곤, 합성의 각 단계에서 a-아미노 보호기를 제거시키기 위해 선택된 반응 조건하에서 안정한 것이 바람직하며, (c) 펩타이드 사슬을 바람직하지 못하게 변경시키지 않을 반응 조건하에, 원하는 아미노산 서열의 합성을 이룸에 따라, 측쇄 보호기는 제거될 수 있어야만 한다.

펩타이드가 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조되지 않는 경우, 당분야에 알려진 다른 동등한 화학적 합성이전에 언급된 바와 같이 또한 사용될 수 있다 하더라도, J. Am. Chem. Soc., 85,p2149(1963)(메티필드)에 일반적으로 기재된 것과 같은, 고체 상 합성을 사용하여 제조되는 것이 바람직하다. 보호된 a-아미노산을 적합한 수지에 결합시키므로써 펩타이드의 C-말단부로부터 고체-상 합성이 시작된다. 이러한 출발 물질은 a-아미노가 보호된 아미노산을 에스테르 결합에 의해 클로로메틸화된 수지 또는 히드록시메틸 수지에 결합시키므로써, 또는 BHA 수지 MBHA 수지에 아미드 결합에 의해 결합시키므로써 제조될 수 있다. 히드록시메틸수지의 제조는 Chem. Ind. (런던) 38, 1597-98(1966)(보단스키 일동)에 기재되어 있다. 클로로메틸화된 수지는 바이오 래드 러보러 토리이즈, 리치몬드, 캘리포니아 및 Lab. Systems, Inc. 로부터 상업적으로 구입이 가능하다. 이런 수지의 제조는 고체상 펩타이드 합성(스튜와트 일동, 피어스 케미컬) Co., 록포드, 일리노이스(1984), 1장)에 기재되어 있다. 이 책자에 기재되어 있는 바와 같이, BHA 및 MBHA 수지 지지체는 상업적으로 구입 가능하며, 합성되는 원하는 펩타이드가 C-말단부에 비치환된 아미드를 갖는 경우에만 일반적으로 사용된다.

BOC에 의해 보호되는 C-말단의 아미노산, 예컨대, 44-잔기 펩타이드에 있어서의 Leu 또는 45-잔기 펩타이드에 있어서의 Ser은 케미스트리 레터(Chemistry Letters)(K. Horiki 일동) 165-168(1978)에 기재된 절차에 따라 약 60℃에서 24시간 동안 휘저어 섞어 주면서 DMF 내 KF를 사용하여, 클로로메틸화된 수지에 먼저 결합될 수 있으며, 이 경우 44-잔기 펩타이드 유리 산이 합성된다. 뒤이어 수지 지지체에 BOC로 보호된 아미노산을 결합시키고, 염화 메틸렌 내트리플루오로아세트산(TFA)또는 TFA만을 사용하여 α-아미노 보호기를 제거한다. 탈보호는 약 0℃-실온의 온도에서 수행된다. 디옥산내 HC1과 같은 다른 표준 분리제 및 특정한 α-이미노 보호기의 제거를 위한 조건들은 펩타이드(The Peptides)(쉬로더루브케)1pp72-75(아카데믹 프레스 1965)에 기재된 대로 이용될 수 있다.

α-아미노 보호기를 제거시킨 후에, 상기 중간 화합물을 얻기 위해 원하는 순서로 단계적으로 남아있는 α-아미노-및 측쇄-보호 아미노산을 결합시키거나 또는 합성에 있어서 각각의 아미노산을 첨가시키는 대안으로서, 이들중 약간을 고체상 반응기에 첨가시키기 전에 서로 서로 결합시킬 수 있다.

적절한 결합체의 선택은 당 분야의 기술에 속한다. 특히 결합제로서 적합한 것은 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCCI)이다.

펩타이드의 고체 상 합성에서 사용된 활성제는 펩타이드 분야에 잘 알려져 있다. 적합한 활성제의 예로는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노 프로필)카르보디이미드와 같은 카르보디이미드들이다 다른 활성제 및 펩타이드 결합에서의 이들의 사용이 Ⅲ장(쉬로더 루부케 수프라) 및 J. Phar. Soi., 59, pp-1-27(1970)(카푸어)에 기재되어 있다.

각각의 보호된 아미노산 또는 아미노산 사열은 고체상 반응기에 약 4배 또는 그 이상으로 도입되며, 결합은 디메틸 포름아미드(DMF): CH₂Cl₂(1:1)의 매체안 또는 DMF안에서 또는 HC₂Cl₂단독으로 수행될 수 있다. 불완전한 결합이 생겨나는 경우, 다음 아미노산을 결합시키기에 앞서 α-아미노 보호기의 제거전에 결합 절차를 반복한다. 각합성 단계에서 결합 반응의 성취 여부는, 만약 손으로 수행되는 경우, Anal. Biochem. 34,595(1970)(E.Kaiser 일동)에 기재된 닌히드린 반응에 의해 조사되는 것이 바람직한다.

결합 반응은 Biopolymers, 1978,17, pp1927-1938(리비에르 일동)에 기재된 프로그램을 사용하여, 벡크만990 자동 합성기 상에서 자동적으로 수행될 수 있다.

원하는 아미노산 서열이 완성된 후에, 수지로부터 펩타이드를 분리시킬 뿐만 아니라, 모든 남아 있는 측쇄보호기 X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶및 X⁷과 정착 결합 X⁸및 또한 사용된다면 α-아미노 보호기를 분리시키는, 액체 불화 수소와 같은 시약으로 처리하여 수지 지지체로부터 중간 펩타이드를 제거하여 유리산의 형태로 있는 펩타이드를 얻는다. 만일 Met가 서열안에 나타나는 경우, 잠재적인 s-알킬화 반응을 없애기 위해 HF로 수지로부터 펩타이드를 분리시키기에 앞서 트리플루오로아세트산(TFA)/에탄디티올을 사용하여 BOC 보호기를 먼저 제거하는 것이 바람직하다. 분리시키기 위해 불화 수소를 사용하는 경우, 아니솔, p-크레졸, 황화 메틸에틸 및/또는 다른 알려진 스캐빈저들이 반응 용기안에 포함되는 것이 바람직하다.

하기 실시예는 고체-상 기술에 의해 펩타이드를 합성하는 바람직한 방법을 설명하고 있다. 상당하게 보다 짧은 펩타이드 단편은 사슬의 양끝에서 필요한 수의 아미노산들을 단순히 제거시키므로서 같은 방식으로, 행된다고 물론 인식될 것이나, 이제는 생물학적 활성 단편들은 N-말단부에서 지시된 서열을 포함해야만 된다고 알고 있다.

실시예 Ⅰ

약 0.1-0.5mmoles/g. 수지의 치환 범위를 갖는 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Oly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tys-Arg-Lrs-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-NH₂을 갖는 44-잔기 펩타이드의 합성을 수행한다. 2시간 동안 휘저어 섞으면서 활성화 시약으로서 DCC와 함께 CH₂Cl₂안에서 3배 정도의 과량을 사용하며, 미합중국 특허 제4,292,313호(Vale 일동)에 기재된 일반 절차에 의해 BOC-Leu를 수지에 결합시켜 준다. 이는 약 0.2~0.6mmol. Leu/ 수지 g의 치환을 초래한다.

탈블록킹 및 중화 후에, 펩타이드 사슬을 수지상에 단계적으로 만들어나간다. J. Amer Chem. Soc., 96,2986-2992(1074)(Rivier, J.)에 자세하게 설명된 절차에 따라 일반적으로 탈블록킹, 중화 및 각 아미노산의 첨가가 수해된다. 헬륨 또는 질소와 같은 불활성 기체를 불어 넣음으로써 사용된 모든 용매를 주의 깊게 탈기시켜 Met 잔기의 황을 바람직하지 못하게 산화시킬지도 모르는 산소를 확실하게 없애준다.

다음의 스케쥴 A에 따라 탈블록킹을 수행하는 것이 바람직하다 :

다음의 스케쥴 B에 설명된 대로 결합을 수행하는 것이 바람직하다 :

간단히, 수지 g당 염화 메틸렌 내 1~2mmol의 BOC로 보호된 아미노산에 덧붙여 2시간 동안 염화 메틸렌내 1.0몰 DCCI의 1당량이 사용된다. BOC-Arg(Tos)가 결합되는 경우, 50%DMF 및 염화 메틸렌의 혼합물이 사용된다. Bzl에테르는 Ser및 Thr에 대한 히드록실 측쇄 보호기로서 사용된다. DCC 결합이 바람직하다고 사용되는 경우 Asn 또는 Gln의 아미노기는 Xan에 의해 보호된다. Asn 또는 Gln의 카르복실 말단부를 활성화시키는데 p-니트로페닐 에스테르(ON_P)또한 사용될 수 있으며, 예컨대, DMF및 염화 메틸렌의 50% 혼합물내 1당량의 HOBt를 사용하여 밤새도록 BOC-Asn(ON_p)를 결합시킬 수 있으며, 이경우 DCC는 첨가되지 않는다. 2-클로로-벤질 옥시카르보닐(2C1-z)는 Lys 측쇄에 대한 보호기로서 사용된다. Arg의 구아니디노기 및 His의 이미다졸 질소를 보호하기 위해 Tos를 사용하며, Glu 또는 Asp 측쇄 카르복실기는 OBzl로 보호한다. Tyr의 페놀 히드록실 기는 2,6-디클로로-벤질(DCB)로 보호한다. 합성 말기에, 다음 조성물을 얻는다: BOC-His(X¹)-Ala-Asp(X³)-Gly-Met-Phe-Asn(X⁴)-Lys(X⁷)-Ala-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Ala-Leu-Gly-Gln(X⁵)-Leu-Ser(X⁴)-Ala-Arg(X⁶)-Lys-(X⁷)-Tyr(X²)-Leu-His(X¹)-Thr(X⁴)-Leu-Met-Ala-Lys(X⁷)-Arg(X⁶)-Val-Gly-Gly-Gly-Ser(X⁴)-Met-Ile-Glu(X³)-Asp(X³)-Asp(X³)-Asn(X⁴)-Glu(X³)-Pro-Leu-X⁸

상기 X¹은 Tos, X²은 DCB, X³는 Bzl, X⁴는 Bzl, X⁵는 Xan, X⁶은 Tos, X⁷은 2C1-z이고 X⁸은-NH-수지지지체이다. a-아미노 보호기를 탈블록킹시키는데 사용된 TFA 처리로 Xan을 부분적 또는 전적으로 제거시킬 수 있었다.

보호된 펩타이드-수지를 분리시키고 탈보호시키기 위해서, -20℃에서 30분 동안, 그리고 0℃에서 30분 동안 펩타이드-수지의 g당 아니솔 1.5ml 메틸에틸설파이드 0.5ml 및 불화수소(HF)15ml로 처리한다. 고 진공하에 HF를 제거시킨 후에, 남아있는 수지-펩타이드를 건도 디에틸 에테르와 클로로포름으로 번갈아가며 세척한 다음, 탈기시킨 2N 수성 아세트산 또는 물로 펩티이드를 추출하고, 여과에 의해 수지로부터 분리시킨다.

분리되고, 탈보호된 펩타이드를 0~5% 아세트산 안에 용해시키고 세파덱스(Sepha dex) G-50의 미세한 겔 여과를 포함할 수 있는 정제에 놓이게 한다.

그 다음 펩타이드 : 구조 및 생물학적 기능(리비에르 일동)(1979) pp125-8 및 J. Am. Chem. Soc.(마키일동) 103,3178(1981)에 기재된 바와 같이 예비적 또는 반예비적 HPLC에 의해 펩타이드를 더 정제한다. Waters Associates 예비 LC-500이 장치되어 있는 카아트리지에 Vydao(300A)로 부터의 C₁₈실리카 15~20μ를 충전시킨다.

J. 액체. 크로마토그래피 1, (리비에르, 제이) 343-367(1978)에 기재된 바와 같이 저 압력 엘덱스(Eldex)성분 제조업자에 의해 TEAP 내 CH₃CN 성분을 생성한다.

크로마토그래피의 분류물을 HPLC에 의해 주의깊게 조사하고, 본질적인 순도를 보여주는 분류물 만을 함께모은다.

순도에 대해 독립적으로 조사된, 정제시킨 분류물을 0.1% TFA 내 CH₃CN 성분을 사용하여 탈염시킨다. 중앙의 커트(cut)를 냉동 건조시켜 순도가 98%보다 더 클수 있는, 원하는 펩타이드를 생성한다. 클로로메틸화된 수지를 사용하여 합성을 반복하여 유리 산 C-말단을 갖는 같은 펩타이드를 생산하고, Chemistry Letters(supra)에 일반적으로 기재된 초기 절차를 이용하여 수지에 Leu를 연결시킨다.

최종적으로 HF 및 아니솔을 사용하여 펩타이드를 분리시키고 탈보호시켜 C-말단의 유리 산을 생성한 다음 상기와 같이 정제한다.

실시예 IA

Chemistry Lettors(supra)에 일반적으로 기재된 바와 같이 클로로메틸화된 수지상에서 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음 식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Pho-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-OH을 갖는 45-잔기 펩타이드의 합성을 수행하고, 수지에 BOC-Ser(Bzl)을 연결시킨다.

TLC 및 HPLC를 이용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다. 선광도는 광전기의 편광계로 측정하며 [α]_D=-62.9 (C=1, 1% 아세트산)로 나타난다.

실시예 IB

미합중국 특허 제4,292,313호(Vale 일동)에 일반적으로 기재된 바와 같이 MBHA 수지상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음 식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-NH₂을 갖는 45-잔기 아미드화된 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 Ⅱ

미합중국 특허 제4,292,313호(Vale 일동)에 일반적으로 기재된 바와 같이 MBHA 수지상에 벡크만 990펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-NH₂을 갖는 29-잔기의 아미드화된 펩타이드의 합성을 수행한다.

TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다. 선광도는 광전기의 편광계로 측정하며, [α]_D=-53.8°(C=1, 1% 아세트산)으로 나타난다.

실시예 Ⅲ

클로로메틸화된 수지상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Arg-Ala-OH을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅢA

클로로메틸화된 수지상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Arg-Ala-Ser-OH을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 Ⅳ

실시예 Ⅰ에서와 같이, MBHA 수지상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 Ⅴ

실시예 Ⅰ에서와 같이, MBHA 수지상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Asn-Met-Ile-Glu-Arg-Ser-Arg-Val-Asn-NH₂을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 Ⅵ

1986년 2월 11일 W. D. Kornreich 일동의 이름으로 발행된 미합중국 특허 제4,569,967호에 기재된 바와 같이, N-알킬아민 수지(N-에틸 아미노메틸수지(NEAM 수지)라고도 또한 부름)를 사용하는 것을 제외하곤, 실시예 Ⅰ에 설명된 것과 같은 일반적인 절차를 이용하여 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-NHCH₂CH₃을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. 실시예 Ⅰ의 약 10g의 클로로메틸화된 수지를 약 24시간 동안 약 4℃에서 계속적으로 휘저어 섞어주면서 100ml의 에틸아민과 반응시켜 a-클로로벤질기를 N-에틸 a-아미노벤질기로 변화시키고, 이에 따라 초기의 치환된 아미드 결합을 통해 펩타이드를 만든다.

원하는 펩타이드 서열을 완성함에 따라, 0℃에서 먼저 휘저어 섞어주면서 스캐빈저로서 아니솔과 HF로 처리하여 수지로부터의 탈보호 및 분리를 수행한 다음, 휘저어 섞은 혼합물을 약 3시간에 걸쳐 실온으로 서서히 가열시킨다.(이 절차는 에틸 아미드로서 수지로부터 펩타이드를 분리한다)아미노산 분석으로 원하는 펩타이드 구조가 얻어지는 것을 보여준다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 Ⅶ

펩타이드를 형성함에 따라 N-메틸 아미노메틸 수지(NMAM 수지)를 형성하기위해 에틸아민 대신 메틸아민을 사용하는 것을 제외하곤 실시예 Ⅵ에 설명된 바와 같이 일반 절차를 이용하여 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-NHCH₃을 갖는 펩타이드를 합성한다. HF를 사용하여 분리 및 탈보호시켜 탈보호된 N-메틸아미드를 생성한다. 아미노산 분석으로 원하는 펩타이드 구조가 얻어진다는 것을 보여준다.

실시예 Ⅷ

펩타이드를 형성함에 따라 N-트리플루오로에틸아미노메틸 수지(NTFEAM 수지)를 형성하기 위해 에틸아민 대신 트리플루오로에틸아민. HC1을 사용하는 것을 제외하곤 실시예 Ⅵ에 설명된 바와 같은 일반 절차를 이용하여 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-NHCH₂CF₃을 갖는 펩타이드를 합성한다. HF를 사용하여 분리 및 탈보호시켜 탈보호된 N-트리플루오로에틸 아미드를 생산한다. TLC및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 Ⅸ

미합중국 특허 제4,292,313호(Vale 일동)에 일반적으로 기재된 바와 같이 MBHA 수지상에 벡크 만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음 식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys -Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Leu-Glu-Gln-Arg-Ala-Arg-Val-Asn-Leu-NH₂을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다. 그다음 물안에 펩타이드를 용해시키고 1N 아세트산을 첨가시킴으로서 아세트산 염을 제조한다. 결과 생성된 용액을 냉동 건조시켜 아세트산염을 생산한다.

실시예 Ⅹ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Val-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사펩타이드의 합성을 수행한다. TLC및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅠ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅡ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-lle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NH₂을 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 베타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅢ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Val-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Gln-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅣ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Gln-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Thr-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅤ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Nva-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅥ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅦ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Thr-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nva-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅧ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Val-Ser-Lys-NH₂의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅨ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Lys-Arg-Gln-Gly-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Val-Ala-Lys-Gln-Val-Gly-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅠ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Arg-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅡ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nva-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅢ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Ile-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Asn-Ile-Ile-Glu-Arg-Ser-Arg-Val-Ser-NH₂을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다. 그 다음 펩타이드를 물안에 용해시키고 아세트 산 안에 첨가시킴으로써 아세트산 염을 제조한다. 결과 생성된 용액을 냉동건조시켜 아세트산 염을 생산한다.

실시예 ⅩⅩⅣ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : N-Me-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-NH₂을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅤ

미합중국 특허 제4,292,313호(Vale 일동)에 일반적으로 기재된 바와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : N-Et-Tyr-Ala-D-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-NH₂을 갖는 29-잔기의 아미드화된 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅥ

클로로메틸화된 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : N-Et-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Arg-Ala-OH을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅦ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : N-IP-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRP 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅧ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-D-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Asn-Met-Ile-Glu-Arg-Ser-Arg-Val-Asn-NH₂을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅨ

N-에틸 아미노 메틸 수지를 사용하여, 실시예 Ⅵ에 설명된 절차를 이용하여 다음식 : N-Me-Tyr-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-NHCH₂CH₃을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. 아미노 산 분석으로 원하는 펩타이드 구조가 얻어진다는 것을 보여준다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅩ

펩타이드가 형성됨에 따라 N-메틸아미노메틸 수지(NMAN 수지)를 형성하기 위해 에틸아민 대신 메틸아민을 사용하는 것을 제외하곤 실시예 Ⅵ에 설명된 것과 같은 일반 절차를 사용하여 다음식 : N-Et-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-NHCH₃을 갖는 펩타이드 합성한다. HF를 사용하여 분리시키고 탈보호시켜 탈보호된 N-메틸아미드를 생성한다. 아미노 산 분석으로 원하는 펩타이드 구조가 얻어진다는 것을 보여준다.

실시예 ⅩⅩⅩⅠ

펩타이드가 형성됨에 따라 N-트리플루오로 에틸아미노메틸수지(NTFEAM 수지)를 형성하기 위해 에틸 아민 대신 트리플루오로에틸 아민 HCl을 사용하는 것을 제외하곤 실시예 Ⅳ에 설명된 것과 같은 일반절차를 이용하여 다음식 : H-His-Ala-Asp-Ala-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-NHCH₂CF₃을 갖는 펩타이드로 합성한다. HF를 사용하여 분리시키고 탈보호시켜 탈보호된 N-트리플루오로에틸아미드를 생성한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅡ

미합중국 특허 제4,292,313호(Vale 일동)에 일반적으로 기재된 대로 MBHA 수지상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Leu-Glu-Gln-Arg-Ala-Arg-Val-Asn-Leu-NH₂을 갖는 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

그 다음 물안에 펩타이드를 용해시키고 1_N아세트 산을 첨가시키므로써 아세트산 염을 제조한다. 결과 생성된 용액을 냉동 건조시켜 아세트산 염을 생성한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅢ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Tyr-Leu-Leu-His-Thr-Leu-Val-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다.

TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 평가한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅣ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-Gln-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다.

TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅤ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Glu-Leu-Ile-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅥ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : desNH-His-Ala-Asp-Gly-Val-Phe-Asn-Lys-Ala-Try-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Gln-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅥ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : N-Me-His-D-NMA-Asp-Gly-Pro-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Thr-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅦ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : N-Me-His-D-NMA-Asp-Gly-Pro-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅧ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-D-NMA-Asp-Gly-Nva-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Phe-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 ⅩⅩⅩⅨ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-D-His-D-Ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Lys-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XL

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nva-Ala-Lys-Arg-Val-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XLⅠ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : N-Et-His-Ala-Asp-Gly-Asn-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-His-Thr-Leu-Val-Ser-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XLⅡ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-Asp-Gly-Asp-Phe-Asn-Ser-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Try-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Lys-Arg-Gln-Gly-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XLⅢ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : N-Me-His-D-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Gln-Val-NH₂을 갖는 GRF유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XLⅣ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-D-Ala-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Arg-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 꿸타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XLⅤ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : H-His-Ala-D-Asp-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Leu-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-NH₂을 갓는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XLⅥ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990펩타이드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 다음식 : desNH₂-Tyr-Ala-Asp-Leu-Gly-Leu-Phe-Asn-Lys-Ala-Try-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-Gln-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XLⅦ

실시예 Ⅰ에서와 같이 MBHA 수지 상에 벡크만 990펩타이드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 다음식 : N-Ip-Tyr-D-NMA-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Glu-Leu-lle-Ala-Lys-Ayg-Val-Gly-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 판단한다.

실시예 XLⅧ

실시예 I에서와 같이 MBHA수지 상에 벡크만 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 다음식 : desNH₂-Tyr-D-NMA-Asp-Gly-Val-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Gln-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 평가한다.

실시예 ⅠL

실시예 Ⅰ에서와 같이, MBHA 수지 상에 벡크안 990 펩타이드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 다음식 : D-Tyr-D-NMA-Asp-Gly-Pro-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Thr-Ala-Lys-NH₂을 갖는 GRF 유사 펩타이드의 합성을 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩타이드가 본질적으로 순수한지를 평가한다.

실시예들에서 제조된 모든 합성 펩타이드들은 생물학적으로 활성적이며, 뇌하수체에 의한 GH의 방출을 촉진시키는데 잠재적으로 유용하다고 생각하고 있다. 실시예의 펩타이드들에 대한 최소 유효 농도는 약 1pmol이다.

생체내 실험에서, 혈액 샘플을 취한 후에 합성 펩타이드를 금붕어에 주사하고, 주사한지 10분 및 30분 후에 부가적인 혈액 샘플을 취한다. 방사면역 분석 시험에 의해 측정된 혈액내의 GH정도는 IV 주사 이후 10분에 측정한 경우의 플라스마 GH 정도를 높이는 데 활성적이다. 몸체중량 kg당 이런 펩타이드의 약 50~5μg 적용량은 GH 분비를 일으키는데 특히 효과적인 것으로 생각되고 있다. 시험관내에서, 주요 배양에 있어서 금붕어의 뇌하수체 세포를 사용하여 또한 시험을 수행한다.

이런 펩타이드에 의한 GH 분비의 촉진은 보통의 GH 정도를 갖는 어류 및 다른 동물들에 대한 성장에 있어 수반되는 증가의를 초래한다. 더구나, 투여로 인해 몸체의 지방 성분을 변경시키고 다른 GH에 따른 신진대사의, 면역학적 및 진화적인 과정을 변화시켜야 한다. 이런 펩타이드들은 어류 및 다른 냉혈의 해양동물, 예컨대 바다 거북 및 뱀장어와 양성류들을 키우는 수배양에 있어 특히 유용하다고 생각된다. 이런 GRF 유사체 또한 포유 동물안에서 매우 낮은 활성을 갖기 때문에, 인간 또는 다른 포유동물에 의해 소비될 상업적 어류들의 성장을 촉진시키는데 특히 적합하며 이런 펩타이드들은 어류에 남아있는 펩타이드가 소비종들에 생물학적인 영향을 미칠지도 모르는 가능한 문제를 제거시키게 한다.

이러한 합성적 펩타이드 또는 이들의 비독성 염을 제약학적 또는 수의적으로 허용가능한 담체와 결합시켜 정맥내, 피하, 근육내, 경피적으로, 예컨대 아가미를 통해 비강내로 또는 경구적으로 동물에게 투여할 조성물을 형성할 수 있다.

필요한 투여량은 찾고 있는 특정 목표에 따라 달라질것이다.

더구나, 원하는 GRF 펩타이드를 나타내게 하는 유전자 서열을 포함시키기 위해 제조합 DNA기술을 사용하여 변형된 박테리아는 어류가 자라는 연못안에서 성장하여 이런 GRF 펩타이드가 어류의 성장을 향상시키도록 해준다.

이런 펩타이드들은 종종 산부가염 또는 금속 복합체, 예컨대, 아연, 철등(이런 투여 목적을 위한 염으로서 고려됨)과 같은 비독성 염의 형태로 투여된다. 이런 산부가염의 예로는 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레 산염, 아세트 산염, 시트로 산염, 벤조 산염, 숙신산염, 말린산염, 아스크로빈산 염, 타르타르 산염 등이 있다. 만약 활성 성분이 고체 형태로 경구적으로 투여된다면, 트라가칸드, 옥수수전분 또는 젤라틴과 같은 결합제 및 알긴산과 같은 붕해제가 사용될 수 있다.

펩타이드들은 또한 당분야에 알려진 모든 적합한 시약을 사용하여 지연 방출 배합물로 투여될 수 있다. 일반적으로, 사용되는 투여량은 숙주의 몸체 중량 kg당 펩타이드의 약 0.01~1μg일 것이다.

발명자들에게 현재 알려진 가장 좋은 방식으로 구성도어 있는, 바람직한 실시양태에 관해서 본 발명이 설명하고 있다. 하더라도, 본 분야에 있어서 통상의 기술을 가지고 있는 사람에게 명백한 바와같은 여러 가지 변화 및 변형은 여태껏 첨부된 청구 범위에 기재된 본 발명의 영역에서 이탈되지 않고 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야만 한다. 예를들어, 펩타이드 사술에서의 변형, 특히 펩타이드의 카르복실 말단부에서 시작되어 약 27위치에 이르기까지의 결실은 알려진 실험 실습에 다라 현재까지 수행되어 펩타이드의 생물학적 효력의 모두 또는 매우 본질적인 부분을 유지시켜 주는 펩타이드들 또는 펩타이드의 단편들을 생성시키며, 이런 펩타이드들은 본 발명의 영역에 드는 것으로 간주되고 있다.

더구나, 말단부, 또는 양 말단부에서 첨가가 이루어질 수 있으며/또한 펩타이드 화학의 전 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 일반적으로 동등한 잔기들은 자연적으로 생거난 잔기들에 대해 치환되어, 본 발명의 영역으로부터 이탈됨에 없이 청구된 펩타아드의 효력의 적어도 본질적인 부분을 지니는 다른 유사체를 형성할 수 있다.

더구나, 오늘날 본 분야의 건지에 따라 C-말단부의 바람직한 -NH₂기에서 변형이 일어날 수 있는데, 예컨서 이탈됨이 없이, R 및 R'가 저급 알킬, 플루오로저급알킬 또는 수소인 라디칼 -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') 또는 -CH₂OR일 수 있다.

본 발명의 여러 특징들은 다음의 청구범위에서 강조되고 있다.

Claims

하기 서열을 갖는 펩타이드 또는 그의 비독성염 : His-Ala-Asp-Gly-R₅-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Glu-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Len-His-Thr-Len-R₂₇-R₂₈-R₂₉-R₃₀-R₃₁-Gly-R|₃₃-R₃₄-R₃₅-R₃₆-R₃₇-R₃₈-R₃₉-R₄₀-R₄₁-R₄₂-R₄₃-R|₄₄-Ser(상기 식에서, R₅및 R₂₇은 Met, Leu, Val, Nva, Gln, Thr, Ile 및 Nle으로 이루어진 군으로부터 선택되며; R₂₈은 Ala, Ser 또는 Asn이고; R₂₉는 Lys 또는 Arg이고; R₃₀은 Arg 또는 Gln이고; R₃₁은 Val 또는 Gln이고; R₃₃은 Gly 또는 Glu이고; R₃₄는 Gly, Arg 또는 Ser이고; R₃₅는 Ser 또는 Asn이고; R₃₆은 Met, Leu, Val, Nva, Gln, Thr, Ile 또는 Nle이고; R₃₇은 Ile 또는 Glu이고; R₃₈은 Glu, Gln 또는 Arg이고; R₃₉는 Asp, Arg 또는 Gly이고; R₄₀은 Asp, Ser 또는 Ala이고; R₄₁은 Asn, Arg 또는 Lys이고; R₄₂는 Glu, Phe, Ala 또는 Val이고; R₄₃은 Pro, Asn 또는 Arg이고; R₄₄는 Leu 또는 Ala이며; 다만, R₂₇이후의 잔기 모두, 또는 C-말단에서 시작하는 잔기서열은 어떤 것이라도 삭제될 수 있다).
제1항에 있어서, R₅가 Nle이고, R₂₇도 Nle이며, R₃₆도 Nle인 펩타이드.
제1항에 있어서, 다음 식 중 하나를 갖는 펩타이드 : H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-NH₂, H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-Ser-OH, H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Len-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-NH₂, H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Len-Met-Ala-Lys-NH₂, 또는 H-His-Ala-Asp-Gly-Nle -Phe -Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Len-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Arg-Ala-OH, H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Leu-Ala-Lys-Arg-Gln-Gly-NH₂, H-His-Ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Met-Ala-Lys-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Ile-Glu-Asp-Asp-Asn-Glu-Pro-Leu-NH₂, 또는 H-His-Ala-Asp-Gly-Nle-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-Nle-Ala -Lys-NHCH₂CH₃.
제1항에 있어서, 펩타이드가 다음 식을 갖는 펩타이드 또는 이들의 비독성염 : H-His-Ala-Asp-Gly-R₅-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Thr-Leu-R₂₇-R₂₈-R₂₉-R₃₀-R₃₁-NHR (상기 식에서, R₅는 Met, Leu, Val, Nva, Gln, The, Ile 또는 Nle이며: R₂₇은 Met, Leu, Val, Nva, Gln, Thr, Ile 또는 Nle이고; R₂₈은 Ala, Ser, Asn 또는 des-R₂₈이며; R₂₉는 Arg 또는 Lys 또는 des-R₂₈이고; R₃₀은 Arg 또는 Gln 또는 des-R₃₀이며; R₃₁은 Val 또는 Gln 또는 des-R₃₁이고; R은 H 또는 저급알킬이다).
제4항에 있어서, R₅와 R₂₇은 Nle이고, R₃₀은 des-R₃₀이며, R|₃₁은 des-R₃₁이고, R은 H 또는 에틸인 펩타이드.