NO310027B1 - Peptid med organbeskyttende aktivitet - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår nye peptider med høy biologisk aktivitet av samme type som kjente naturlige forbindelser BPC, men med kortere aminosyrekjeder.

Bakgrunn.

Et biologisk aktivt protein med organ-beskyttende aktivitet isolert fra menneske- eller dyrekropper og navngitt BPC (Body Protecting Compound) er beskrevet i EP 432400 og publisert: P.Sikiric et al., Exp. Clin. Gastroenerol., 1,15-26, 1991. Dette proteinet har en høy molvekt på omlag 40 000 ± 5000 Daltons, hvorved bare deler av strukturen er bestemt. Denne forbindelsen har et svært bredt spekter av biologiske aktiviteter, slik som ulcera-beskyttende, leverbeskyttende, antiviral, antiedematøs, generell antiinflammatorisk aktivitet, antimalignant aktivitet med flere. Det kan anvendes i terapi for de omtalte sykdommer, og videre i terapi for sykdommer og forstyrrelser i nervesystemet, forstyrrelser i dopaminergisk etiologi, kirurgi, stomatologi, til helbredelse av fertilitet og i veterinær-medisin. Men dette brede spektret av aktiviteter kan sannsynligvis være en konsekvens av den ubestemte struktur eller selv utilstrekkelig renhet eller homogenitet av den isolerte forbindelse BPC.

Oppfinnelsen.

Det er oppdaget syntetiske peptider med kun 8 til 15 aminosyrerester i kjeden med molvekt mellom 90 og 1600 Daltons, som har biologisk aktivitet lik den naturlige kropps-beskyttende forbindelse BPC, men med økt selektivitet. De nye peptidene framstilles mer økonomisk og er mindre utsatt for effekten fra sidereaksjoner på grunn av at de inneholder mindre aminosyrerester enn BPC.

I henhold til ett aspekt ved oppfinnelsen er det framskaffet en klasse av syntetiske peptider som oppviser overraskende høy biologisk aktivitet, særlig med hensyn til beskyttelse av kroppen. I alle tilfelle har disse syntetiske forbindelsene med veldefinert struktur store fordeler sammenlignet med kun delvis bestemt høymolekylært protein BPC, som kan framskaffes kun fra en usikker naturlig kilde.

Nærmere bestemt er oppfinnelsen rettet mot en ny klasse biologisk svært aktive peptider, omfattende fra 8 til 15 aminosyrerester representert ved følgende grunnleggende strukturformel ved bruk av de tre aminosyrebokstavkodene og tallhenvisning under hver animo-syrerest som viser til restens posisjon i peptidkjeden: der en eller flere aminosyrerester er skiftet ut. Substituentene Xaa, Yaa og Zaa som kan anvendes er vist i etterfølgende tabell I.

Foretrukne peptider er som følger:

I henhold til et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen er det framskaffet analoge peptider i amid- eller karboksy-terminert form ved C terminus, med strukturformel som angitt foran, og der minst en og maksimalt 7 aminosyrerester i området 1-15 er utelatt og minst en av ;ie gjenværende aminosyrerestene kan skiftes ut i henhold til substitusjoiisskjemaet beskrevet i tabell I.

Foretrukne peptider er som følger:

I henhold til en annen utførelse blir peptider med strukturformel illustrert ovenfor og der minst en av aminosyrerestene kan utelates og minst en av de gjenværende aminosyrerestene kan skiftes ut som indikert i tabell I, transformert i syklisk form ved dannelse av en ny CO-NH-binding mellom den første og siste aminosyreresten i molekylet. Foretrukne peptider er som følger:

Oppfinnerne har funnet at ved anvendelse av peptider som angitt foran, oppviser slike peptider biologisk aktivitet tilsvarende eller bedre enn basisproteinet BPC.

Farmasøytisk prøvning av de beskrevne peptidene er utført på ulike vanlige modeller "in vitro" og "in vivo" og følgende farmakologiske egenskaper ble funnet:

1. ) Magesår indusert av stress

Albino Wistar (d") rotter (180-200 g) ble brukt i forsøkene. Alle dyrene var blitt immobilisert i en likeglad-tilstand i 48 timer ved romtemperatur. Umiddelbart etter ble de ofret og undersøkt mht. lesjoner. Peptidene med sekvensnr. 4, 6 og 2 ble anvendt i doser på 10 |ig eller 10 ng/kg kroppsvekt, i.p. eller i.g. 1 time før belastningsprosedyren.

Anvendelsene av både i.g. og i.p. var sterkt beskyttende, selv i slike lave doser som 10 ng/kg kroppsvekt.

2. ) Cysteamin- modell av magesår.

Albino Wistar (?) rotter (180-200 g) ble brukt i forsøkene. Cysteamin-hydroklorid (oppløst i destillert vann) i doser på 400 mg/kg kroppsvekt, s.c. ble anvendt. 24 timer senere ble dyrene ofret. Peptidsekvens nr. 4 ble anvendt i doser på 1.0 jag, 100 ng og 50 ng/kg kroppsvekt, i.p. og i.g. En sterk og doseavhengig beskyttelse ble oppnådd. Den samme aktivitet ble funnet for både i.p. og for intragastrisk administrering.

3. ) Terpentin- indusert ødem i munnhulen

Dyr: Wistar hannrotter (180-240 g), N=10 i hver gruppe. Terpentin ble gitt gjennom slimhinnen i en mengde av 0.02 ml/rotte. Kontroll: 0.9% saltløsning gjennom slimhinnen (0.02 ml/rotte, 2 x). Peptidsekvens nr. 2 og 4 ble anvendt i doser på 10 ug og 10 ng/kg, i.p. og i.g., 1 time før terpentin. Munnhuleødem ble målt 24 timer etter indusering av ødem. Statistisk analyse: Mann-Whitney-test. De undersøkte peptidene var effektive i doser på 10 ug/kg kroppsvekt.

4. ) Kirurgi: effekten på hudinnsnitt.

Albinorotter (cf) (10 for hvert eksperiment, 200-250 g kroppsvekt) ble brukt i forsøkene. Rottene med sår i huden ble holdt individuelt i separate bur. På hvert dyr ble det under lett eter-anaestesi laget 3 cm lange paralelle innsnitt i baken 1.5 cm på hver side av midtlinja. Ett sår ble deretter dekket med to kirurgiske klemmer, og de andre forble ubehandlet. Peptidsekvens nr. 4 oppløst i saltvann i doser på 1.0 ^g og 1.0 ng/kg kroppsvekt, eller saltvann 0.5 ml/kg kroppsvekt i kontroll, ble tilført gjennom huden mellom sårene umiddelbart etter skaden.

En framtredende effekt av det undersøkte peptid ble avdekket både på sårene med kirurgiske klemmer og de som ikke ble underlagt noen kirurgisk behandling. Etter 5 dager oppviste de behandlete gruppene et lavere antall betente celler og vesentlig bedre utviklete retikulinfibre enn kontroll-individene.

5. ) Effekt på testforbrenning.

Hann-albinorotter, Wistar-rasen (N=10, 200-250 g kroppsvekt) ble brukt i forsøkene. Under lett eteranaestesi ble neseslimhinnen eksponert overfor et glødende brennjern i 5 sekunder. Peptidsekvens 4 ble brukt i doser på 10 n.g/kg kroppsvekt, i.p. 1 time før skaden ble indusert. Kontroll: 5.0 ml saltvann/kg kroppsvekt i.p. Den anvendte prosedyren produserte vanligvis en framtredende oppsvelling av snuten og har vanligvis vært fatal for kontrollindividene (men ikke for de behandlete dyrene!) innen ni dager etter skade. I motsetning til kontrollindividene ble det observert kun svært beskjeden oppsvelling av snuten etter skade. Som en følge av dette var den normale neserespirasjonen påvirket i bare liten grad og overlevelsesevnen uforstyrret.

6. ) Effekt på bruddhelbredelse.

Hann-albinorotter av rasen Wistar (270-300 g kroppsvekt) ble brukt i forsøkene. Venstre skinnebein ble brutt manuelt i den midtre del av beinet under eteranaestesi. Det ble ikke brukt noen immobilisering, og dyrene fikk bevege seg fritt i burene. Dyrene ble ofret på dag nr. 5, 8, 12 og 30 etter skade.

Peptidsekvens nr. 4 ble gitt i doser på 10.0 ug/kg kroppsvekt, i.p, 1 time før skade og deretter en gang daglig (siste anvendelse 24 timer før ofring). Kontrollgrupper mottok samtidig et like stort volum av saltvann (0.9%, 5.0 ml/kg kroppsvekt, i.p.). En vesentlig forbedret helbredelsesrate ble registrert i alle peptidbehandlete individer i hvert av de undersøkte intervaller. Det er verdt å legge merke til at alle de behandlete dyrene oppviste konsekvent lavere lokal blodansamling enn kontrollindividene og de gjenvant sin skadete funksjon langt raskere.

7.) Antiviral aktivitet

Antiviral aktivitet ble undersøkt på nyfødte mus, B ALB-C-rasen, 24 timer gamle, begge kjønn.

ARBO-virus: TBE (=Tick Borne Encephalitis), Bhania, Dengue 1,2,3,4, Sinbis, West-Nile, Calovo, Hepatitt A, LCM (Lymfatisk choriomeningitt) og Herpes type I ble anvendt som virus-suspensjon i fortynning IO"<2> (0.02 ml/mus), framstilt på vanlig måte og injisert intracerebralt (i.c.) eller oralt (p.o.) (Hepatitt A). I lys av forskjellene i giftighet ble dosene justert på en slik måte at de ble sammenlignbare mht. LD100 i 0.02 ml i.c. (eller p.o., Hepatitt A) vaksine i en 10~<2->fortynning. På denne måten var en i stand til å sammenlikne forløpet av de ulike virusinfeksjonene, uten hensyn til mulig injisering av ulike viruskonsentrasj oner.

Peptidsekvens nr. 4 ble anvendt i konsentrasjon på 20.0 ug/ml i 0.9% saltløsning og anvendt kun en gang i dose på 2.0 ug/kg kroppsvekt, i.c. eller i.p.:

a) 2 timer før tilførsel av virus (-2<h>)

b) samtidig med infisering (0).

Kontroll: det samme volum av saltløsning i.c. eller i.p. Resultatene er sammenfattet i tabell

II.:

tallene i tabellen indikerer perioden (dager) inntil alle virusinfiserte mus i peptid- eller saltløsnings- (kontroll) behandlete grupper bukket under.

8. Antiberoligende aktivitet

For å avdekke en antiberoligende aktivitet ble det brukt tvungen svømmetest i henhold til Porsolt et.al., EurJ.harmacol., 47, 379-391 (1978).

Hann-Wistar-rotter (180-240 g kroppsvekt) ble brukt i dette forsøket. Den undersøkte peptidsekvens nr. 4 ble gitt på første dag etter samling før test og på andre dag 1 time før forsøket (i.p.). Kontrollgruppe: salt, i.p.

Dyrene ble observert i 5 minutter. Tiden for ubevegelighet ble målt (T;).

Tj i kontrollgruppa var omlag 150 sekunder, i den peptidbehandlete gruppa var den kun 60-70 sekunder. Denne effekten hadde lang varighet: etter 16 dager var den fremdeles tilstede.

Dose-respons: 10 ug til 10 ng/kg: full effekt

10 pg/kg: effekt fremdeles tilstede

1 pg/kg: effekt i ferd med å forsvinne.

9.) Effekt på former av parkinsons sykdom

For å undersøke de velkjente former for parkinsons sykdom ble det brukt (Karakola S. et al., Pharmacol. Toxicol., 67, 95-100 (1990)): reserpin-form og MPTP-form.

Det ble brukt mus av arten NMPJ-Hannover (cf) (for MPTP-form) eller begge kjønn (for reserpin-form).

a) MPTP ble tilført i doser på 30 mg/kg kroppsvekt, i.p. en gang daglig i seks påfølgende dager, og deretter i neste fire dager i en større dose på 50 mg/kg kroppsvekt. Den

undersøkte peptidsekvens nr. 4 ble tilført i dose på 1.5 ug og 15.0 ng/kg kroppsvekt, i.p., 15 minutter før hver MPTP-administrering eller 15 minutter etter MPTP-administrering.

b) Reserpin ble tilført i doser på 5 mg/kg kroppsvekt, i.p. Det testede peptidet ble tilført i doser på 10 ug eller 10 ng/kg kroppsvekt, i.p. 15 minutter før reserpin eller 24 timer etter

reserpin-administrering i samme dose. Kontroll: et like stort volum av saltløsning, 5 ml/kg kroppsvekt i.p.

En vesentlig reduksjon av hypokinesi, stivhet (katalepsi) og skjelving ble observert etter for-behandlingen med peptid.

I MPTP-modellen opphevet forbehandlingen med dette peptidet katalepsi-utviklingen sterkt og reduserte opptreden av akinesi og skjelving.

Etterbehandling (etter 15 minutter) forhindret sterkt ytterligere utvikling av MPTP-katalepsi og reduserte markant akinesi og skjelving. En ordinært høy dødelighet (50%) registrert etter kun en tilførsel av MPTP var redusert både hos for-behandlete og etter-behandlete (peptid) individer.

10. ) Effekt av peptid- administrering i haemorragisk sjokk

Voksne hunn-albinorotter av rasen Wistar (150-180 g) ble brukt i alle forsøkene. Effektene på haemorragisk sjokk ble undersøkt i to forsøksserier.

a) Dyrene ble blodtappet (1 ml i 3 mintter, 2 minutter for det resterende) inntil de døde. Det fjemete blodvolumet som førte til dødelig utgang ble undersøkt hos dyr for-behandlet med

peptidsekvens nr. 4 (10.0 ug eller 10 ng/kg kroppsvekt, i.p.) eller saltløsning (5.0 ml/kg kroppsvekt, i.p.) 15 minutter før blodtapping. Et vesentlig høyere fatalt blodvolumtap sammenliknet med kontrollverdiene ble registrert konsekevent i grupper behandlet med de større peptiddosene. b) Blodtrykket ble senket ved kontrollert fjerning av blodvolum og deretter opprettholdt ved verdiene 30-35 mm Hg i 5 minutters periode.

Deretter ble peptidsekvens nr. 4 (10.0 ug eller 10.0 ng/kg kroppsvekt) eller saltløsning (kontroll, 3.0 ml/kg kroppsvekt) tildelt intravenøst. I motsetning til kontrollene ble det registrert vesentlig økt og stabilt blodtrykk og bortfall av død for de peptidbehandlete dyrene.

Det ser derfor ut til at det undersøkte peptidet er svært effektivt i å forbedre konsekvensene ved blodtap.

11. ) Innvirkning på dødelig stråling

NMRI-Hannovermus, 5-6 uker gamle, av begge kjønn (18-22 g kroppsvekt) ble brukt i forsøkene. Syntetisk peptidsekvens nr. 4 ble tilført i doser på 20 ug/kg kroppsvekt, i.p. 1 time før eller etter bestråling. Kontroll-individene mottok samtidig et like stort volum av 0.9% saltløsning i.p. (5.0 ml/lg). Native friske dyr holdt i vanlig kondisjon, ikke behandlet med preparater eller bestrålt tjente som friske kontrollindivider.

Bestråling: Teatron 80 (Co 60, 2200 Ci). De ubedøvde musene i bur, 16 mus per gruppe, ble eksponert over hele kroppen for stråling med en overdødelig dose på 9 Gy i bestrålings-området 20 x 20 cm, i avstand på 80 cm.

Død ble registrert to ganger daglig i 30 dager.

Alle kontrollindividene døde innen 7-12 dager (LD100/12).

Det ble ikke registrert noen dødelighet hos friske (ubestrålte) kontrollindivider.

I forhold til kontrollverdiene ble det ikke observert noen forskjell i grupper behandlet med peptid 1 time etter bestråling. Det ble imidlertid registrert en betydelig overlevelse når forbindelsen ble tilført 1 time før bestråling. Det kunne registreres en 70% økning i LD100 sammenliknet med kontrollindividene.

12.) Innvirkning på induserte misdannelser

NMRI-Hannover-rotter (?), to måneder gamle, 25 g kroppsvekt, men ikke tidligere eksponert for paring, ble brukt i alle forsøkene. Hunnmusene i brunstfasen ble paret over natta med erfarne friske hannmus. Musene ble ofret etter 20 dagers svangerskap.

Vitamin A ble tilført i en dose på 15700 U/kg kroppsvekt, i.m., ved den tiende dag i svangerskapet (0.05 ml/kg kroppsvekt). Peptidsekvens nr. 4 ble gitt samtidig i doser på 10 ug eller 10 ng/kg kroppsvekt, i.p.

Kontroll: saltløsning 5.0 ml/kg kroppsvekt, i.p.

Dyr som ikke var behandlet med vitamin A mottok på samme tid i.p. saltløsning eller peptid 4 i samme dose og tjente som friske kontrollindivider. Det ble ikke registrert noen misdannelser i friske (saltløsning) eller peptidbehandlete grupper. Resultatene vist i tabell III viser overraskende nok en vesentlig og doseavhengig beskyttende effekt av det under-søkte peptid overfor vitamin A-induserte misdannelser.

13.) Akutt giftighet

Akutt giftighet av syntetiske peptider ble bestemt i hunnmus (vekt omlag 20 g). Grupper på 6 individer ble brukt for hvert forsøk og kontroll.

Peptidsekvens nr. 2, 3, 4 og 6 ble anvendt i doser på 8, 25 og 50 mg/kg kroppsvekt, intravenøst. Kontrollgruppa ble behandlet med saltløsning (0.9%, 5.0 ml/kg kroppsvekt). Dyrene ble observert mht. tegn på giftighet i de neste 15 dagene.

I de anvendte dosene ble det ikke observert noen tegn på giftighet eller død. Et interessant fenomen ble observert ved økt mobilitet og livlighet i varighet på 2 timer etter tildeling av peptidene.

Ut fra resultatene fra farmakologisk undersøkelse oppviser disse peptidene aktivitet ved å beskytte organismen mot belastning og sykdommer, generelt til å normalisere de organiske funksjoner.

Bruken av disse bør også være effektiv til forebyggelse og terapi mot flere sykdommer og forstyrrelser hos mennesker eller dyr. Nærmere bestemt vil disse forbindelsene bli brukt til behandling av:

- stress-induserte forstyrrelser og sykdommer

- magesår av ulike årsaker

- inflammasjon og ødem av ulike årsaker

- sår, brannskader, benbrudd og generelt innen kirurgi

- virusinfeksjoner

- sjokk

- parkinson's sykdom

- beskyttelse mot stråleskader

- beskyttelse mot misdannelser

Generelt kan de beskrevne peptidene også anvendes i et bredt spekter av farmasøytiske preparater i kombinasjon med en ugiftig bærer eller bindemiddel, slik som fyllmateriale, ugiftig buffer, eller fysiologisk saltløsning. Slike farmasøytiske blandinger kan anvendes lokalt eller systemisk, og kan være i enhver passende form, slik som væske, fast stoff, halvfast, injiserbar løsning, tablett, salve, krem, kapsler, "lingualett" eller liknende.

Disse peptidene vil generelt administreres i en dose fra IO'<5> til IO"<2> mg/kg kroppsvekt, når anvendt systemisk. Når anvendt lokalt vil de anvendes i høyere konsentrasjoner, f.eks. 0.1% til 0.5%.

Et svært gunstig trekk er fraværet av ethvert tegn på giftighet inntil doser på 50 mg/kg kroppsvekt samt god aktivitet hos forbindelser administrert oralt (intragastrisk).

Peptidene beskrevet foran kan syntetiseres ved bruk av trinnvis kondensasjon av beskyttete aminosyrer i homogene væskesystem eller fortrinnsvis ved bruk av fast-fase-metoden. For framstilling av sykliske peptider behandles delvis beskyttete lineære peptider med ønsket lengde som med alkylestergruppe på C terminus, som omsettes til azid, etterfulgt av kopling og fjerning av beskyttelse. Alternativt kan delvis beskyttete lineære peptider med frie endegrupper syklidiseres med difenylfosforylazid i svært fortynnet løsning.

Oppfinnelsen er i det etterfølgende beskrevet i lys av eksempler.

Eksempel 1. Peptidsyntese ved bruk av Boc-strategi.

Peptidsyntese ble utført ved å starte med 100 mg Boc-Val-PAM-harpiks for å framstille C-terminal karboksypeptid (PAM levert fra Applied Biosystems, erstatning 0.56 meq/g er et amino-acyl-4-(oksymetyl)-fenyleddiksyre-derivat av aminpolystyren). Boe aminosyrer (Boe = tert-butoksykarbonyl-) ble kondensert en etter en på polymerbærer ved bruk av diisopropylkarbodiimid (DIPC) som kondensasjonsreagens. I hvert trinn ble Boc-gruppen fjernet med 50% løsning av trifluoreddiksyre (TFA) i diklormetan. Aminogruppa ble deretter deproteinisert med diisopropyletylamin.

Omsetningen i hvert trinn bør være større enn 99.5%. Dersom dette ikke var tilfelle ble kondensasjonen gjentatt. Etter fullendt syntese ble det utført en oppsplitting ved bruk av HF-prosedyre (2 timer ved 0°C). Anisol ble brukt som karbnionoppsamler. HF ble fordampet med en strøm av nitrogen. Uforedlet råpeptid ble deretter oppnådd ved å helle av oljeaktig rest i tørr eter.

Deretter ble råpeptidet renset ved reversert fase HPLC ved bruk av 5x150 mm kolonne fylt med silikagel RP-18, gradvis utvasking med løsningsmiddelsystem: 0.1% TF A i vann/ acetonitril. Deteksjon: UV-absorpsjon ved 225 nm.

Syntesen av peptidet med sekvensnr. 4 er skissert i figur 1.

Eksempel 2. Peptidsyntese ved bruk av Fmoc-strategi.

Standard Fmoc-beskyttete aminosyrer ble brukt i syntesen (Fmoc = 9-fluorenylmetyl-oksy-karbonyl-). Sidekjede-funksjonene ble beskyttet som O-tert-butylester )Asp, Apm, Glu, Aad) og som Boc-derivater (Lys). Første aminosyre (Val) ble bundet på polymerisk bærer-BHA-harpiks (BHA=benzhydrilaminoharpiks) ved bruk av diisopropylkarbodiimid som koplingsreagens. I hvert trinn ble den Fmoc-beskyttende gruppen fjernet med piperidin. Deretter ble den andre og alle etterfølgende aminosyrer introdusert ved bruk av samme metode inntil syntensen var ferdig. Splittingen ble utført ved bruk av en blanding av TFA/TFMSA/anisol = 2:17:52 (vol).

Peptidet ble deretter renset ved bruk av HPLC-metoden beskrevet i eksempel 1. Syntesen av peptidet med sekvensnr. 2 er illustrert i figur 2.

Eksempel 3. Peptidsyntese ved bruk av Ddz-strategi

Alle aminosyrer ble brukt i beskyttet tilstand ved deres a-aminofunksjon med Ddz (= a, a-dimetyl-3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl-). Sidefunksjonene ble beskyttet med Z-gruppe (=benzyloksykarbonyl-) for lysin og O-t-Bu-gruppe (t-butylester) for asparaginsyre og glutaminsyre.

En Merrifield-bærer (kryssbundet klormetylert polystyrengel) med kapasitet 1.4 mmol/g ble brukt til binding av den første Ddz-aminosyren via dens cesiumsalt. Etter kondensering med disykloheksylkarbodiimid (DCC) ble Ddz-gruppen fjernet i hvert trinn med 5% TFA i diklormetan, etterfulgt av vasking og deproteinisering med 10% trietylamin i diklormetan. Etter deproteinisering ble det neste koplingstrinnet dannet ved bruk av samme framgangs-måte. Disse koplingstrinnene ble gjentatt inntil peptidsekvensen var fullstendig.

Til slutt ble peptidet splittet fra den polymeriske bæreren ved bruk av en blanding av HBr/TFA/anisol. Etter fordamping av den flyktige del ble kun det splittete peptidet bunnfelt fra tørr eter og tørket. Råpeptidet ble deretter renset med HPLC-metoden beskrevet i eksempel 1. Syntesen av peptidet med sekvensnr. 6 er illustrert i figur 3.

Eksempel 4. Syntese av syklisk peptid.

Peptid i delvis beskyttet form:

ble dannet tidligere i henhold til framgangsmåtene beskrevet i eksempel 1 eller 2.

Den 0.0005 molare løsning av dette peptidet i dimetylformamid ble syklidisert etter tilsats av difenylfosforylazid og trietylamin ved 20 °C i 12 timer.

Deretter ble denne blandingen hydrogenert med hydrogen/palladium aktivt kull-katalysator ved 25 °C i 8 timer.

Løsningsmidlet ble forsiktig fordampet og uforedlet produkt renset ved bruk av HPLC-metoden beskrevet i eksempel 1.

Syklisk peptid med sekvensnr. 10:

ble oppnådd med et utbytte på 10%.

Eksempel 5. Syntese av lineære og sykliske peptider via Ddz-strategi.

Den samme strategi med Ddz-beskyttende grupper ble brukt for å framskaffe lineære og sykliske peptider. Sidefunksjonene ble beskyttet med Z-gruppe (lysin) og med O-benzyl-estergrupper - OBzl - (glutamin- og aspariginsyre).

Polymerisk bærer var HYCRAM<®->harpiks (handelsnavn for ORPEGEN, Heidelberg, Tyskland), som er 4-bromcrotonyl-P-alanyl-amidometyl-polystyren. Den første aminosyren (Ddz-valin) ble bundet på polymerbæreren via dens cesiumsalt.

Deretter ble Ddz-gruppen fjernet ved bruk av trifluoreddiksyre (5%) i diklormetan og aminogrupper deproteinisert med diisopropylamin.

I det neste trinnet ble Ddz-glycin koplet til valinresten i polymermatrisen ved bruk av diisopropylkarbodiimid (D1PC) i nærvær av 1-hydroksybenzotriasol.

Disse trinnene ble gjentatt inntil peptidkjeden var fullstendig. Det syntetiserte peptidet i beskyttet form ble deretter splittet forsiktig fra HYCRAM-bæreren med tetrakis-(trifenyl-fosfon)-palladium (0) oppløst i vannfri tetrahydrofuran i fravær av oksygen. Et additiv slik som morfolin ble brukt som akseptormolekyl for allyliske grupper.

Polymerbæreren ble filtrert fra og vasket med tetrahydrofuran. Løsningen av peptid ble deretter filtrert gjennom en kort kolonne av silikagel for å fjerne palladiumkatalysatoren.

Eluatet som inneholdt det delvis beskyttete peptidet 4a ble tørket etter fordamping av løsningsmidlet i vakuum.

Syntese av lineært peptid med sekvensnr. 4.

Delvis beskyttet peptid 4a ble løst opp i 2,2,2-trifluoretanol og hydrogenert i nærvær av palladium og aktivt kull (10%) med hydrogengass ved 30°C. Katalysatoren ble filtrert fra og løsningsmidlet fordampet i vakuum. Det uforedlete residuet ble deretter renset ved bruk av HPLC-metoden som beskrevet i eksempel 1. Etter rensing ble peptidet med sekvensnr. 4 oppnådd. Produktet var identisk med forbindelsen oppnådd i eksempel 1.

Syntese av syklisk peptid med sekvensnr. 9.

Delvis beskyttet peptid 4a ble løst opp i dimetylformamid/diklormetan (1:1) for å danne 0.00IM løsning. For syklidisering ble løsningen tilsatt DIPC og HOBt og hensatt ved 20°C i 10 timer. Deretter ble løsningen konsentrert til et lite volum, fortynnet med 2,2,2-trifluoretanol og renset ved å føre den gjennom en kolonne fylt med Sephadex LH-20. Fraksjoner med innhold av det delvis beskyttete sykliske peptidet 9a ble samlet og hydrogenert med katalysator (palladium på aktivt kull (10%)) ved 30°C ved hydrogengjennombobling og intensiv risting i 8 timer.

Deretter ble katalysatoren fjernet ved filtrering og løsningen tørket ved fordamping av løsningsmidlet i vakuum. Det uforedlete råpeptidet ble renset ytterligere med HPLC ved bruk av metoden beskrevet i eksempel 1. Det oppnådde rene sykliske peptidet ble identifisert som peptid med sekvensnr. 9.

Syntesen på HYCAM-polymer-bærer ved bruk av Ddz-strategi og syklidisering er illustrert i figur 4 og 5. Alle de syntetiserte peptidene ble sjekket mht. renhet med HPLC-metoden ved bruk av en kolonne med silikagel RP-18 (oktadecyl-silanisert), eluert med en blanding av løsningsmidler bestående av vann/acetonitril/trifluoreddiksyre, gradvis på vanlig måte. I alle tilfellene var renheten høyere enn 95%.

Peptider ble karakterisert med aminosyreanalyser (verdier var innen 10% av teoretisk), sekvensanalyse, molvekt bestemt med massespektrometri (FAB), UV- og IR-spektrum (fig.

6 og 7).

Claims (15)

1. Biologisk høyaktivt peptid, karakterisert ved at det omfatter 8-15 aminosyrerester og som er representert ved den generelle formel: der Xaa betegner en nøytral alifatisk aminosyrerest, slik som Ala, b Ala, Leu, Ile, Val, Nie, Nva; Yaa betegner en basisk aminosyrerest, slik som Lys, Arg, Orn, His; Zaa betegner en sur aminosyrerest, slik som Glu, Asp, Aad eller Apm; hvorved minst en av restene Xaa eller Zaa kan utelates.

2. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at molekylet er syklidisert med amidbinding mellom første og siste aminosyrerest.

3. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

4. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

5. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

6. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

7. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

8. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

9. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

10. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

11. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

12. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

13. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved formelen:

14. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at i det minste 1 og maksimalt 7 aminosyrerester i området 1-15, kan utelates.

15. Terapeutisk blanding, karakterisert ved at den inneholder en eller flere av forbindelsene ifølge krav 1-14 i blanding med en farmasøytisk akseptabel fast eller væskeformig bærer.